KR20140079571A - 얌빈 추출물을 이용한 피부 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 얌빈 추출물을 이용한 피부 외용제 조성물을 개시한다. 구체적으로 본 발명은 피부 재생 촉진, 콜라겐 생합성 촉진, 주름 생성 억제, 미백 및/또는 보습 용도로 유용하게 사용될 수 있는 얌빈 추출물을 이용한 피부 외용제 조성물을 개시한다.

Description

얌빈 추출물을 이용한 피부 외용제 조성물{Composition for External Application to the Skin Using an Extract of Pachyrhizus erosus}

본 발명은 얌빈(Pachyrrhizus erosus) 추출물 및 그것의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명은 얌빈 추출물을 이용한 콜라겐 생합성 촉진, 미백 및 보습용 조성물에 관한 것이다.

얌빈은 열대 아프리카의 가장 중요한 덩굴성 콩과작물의 하나이다. 보통 가나와 나이지리아에서 얌과 함께 부작물로 경작된다. 6월이나 7월에 심으며 노쇠한 얌을 지주로 삼아 자란다. 9월 말에서 10월부터 열매가 달리기 시작한다. 크고 밝은 자줏빛 꽃이 20개의 알이 들어찰 수 있는 기다란 꼬투리가 된다.

알곡과 덩이줄기는 아프리카인의 식량으로 엄청난 경제적 중요성을 지닌 두 가지의 주요한 기관이다. 아프리카 얌빈의 44가지 유전자형의 영양학적 평가를 한 연구자들(Uguru and madukaife 2001)은 그 작물이 필수 아미노산이 잘 균형 잡혀 있고, 비둘기콩과 동부 bambara 땅콩보다 더 많은 아미노산이 함유 되어 있다고 보고했다. 아프리카 얌빈의 알곡에 함유된 단백질은 21~29% 정도의 범위이고, 덩이줄기에는 감자의 약 2~3배 정도의 양이 함유되어 있다(Uguru and madukaife 2001, Okigbo 1973).

본 발명은 얌빈 추출물의 피부 재생 촉진 활성, 콜라겐 생성 촉진 활성, 피부 미백 활성, 보습 활성 등을 개시한다.

본 발명의 목적은 얌빈 추출물의 피부 재생 촉진 활성, 콜라겐 생성 촉진 활성, 미백 활성, 보습 활성 등에 기초하여 얌빈 추출물을 이용한 피부 외용제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 기타의 목적이나 구체적인 양태는 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이 얌빈의 에탄올추출물과 물 추출물이 PPAR-α 활성을 촉진하고 콜라겐의 생합성을 촉진하며 자외선 조사에 의해 그 발현이 유도된 MMP(matrixmetalloproteinase, MMP)-1의 발현을 억제할 뿐 아니라, 항산화 활성과 멜라닌 생성 억제 활성을 가지고 보습 활성을 가짐을 확인함으로써 완성된 것이다.

각질형성세포에 존재하는 상기 PPAR(Peroxisome Proliferator Activated Receptor)-α은 그 리간드(ligand)와 결합하여 활성화되면 각질형성세포의 분화를 촉진시켜 손상된 피부 장벽을 재구성하는 효과가 있다고 알려져 있고(J. Invest. Dermatol., 110, pp368-375, 1998; J. Invest. Dermatol., 115, pp353-360, 2000), 상기 MMP-1은 콜라겐을 기질로 하는 콜라게나제로서 자외선, 산화적 스트레스 등에 의하여 그 발현이 활성화될 경우 피부 탄력 유지력과 수분 보유력을 가진 콜라겐이 분해되어 피부 주름이 발생하고 피부가 건조하고 거칠어지게 되는 것으로 알려져 있으며(J Ginseng Res 31(2):86-92, 2007; Toxicol Appl Pharmacol 195: 298-308, 2004), 산화적 스트레스는 세포막, 단백질, DNA, 효소 등을 손상시키는 등 세포와 조직에 해로운 반응을 일으켜 암 및 동맥경화 등의 질병을 유발하고 MMP-1의 발현을 유도하여 콜라겐 분해를 촉진할 뿐만 아니라 멜라닌 생성에 있어서의 자동 산화 반응에 관여하여 멜라닌 생성을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Age 16: 55-58, 1993; Biol. Pharm. Bull. 30: 719-723, 2007)

전술한 바는 얌빈 추출물이 피부 재생 촉진, 콜라겐 생합성 촉진, 주름 생성 억제, 미백 및 보습 용도로 유용하게 사용될 수 있음을 보여주는 것이라 할 수 있다.

따라서 본 발명의 피부 외용제 조성물은 얌빈 추출물을 유효성분으로 포함하되, 그 용도는 피부 재생 촉진, 콜라겐 생합성 촉진, 주름 생성 억제, 미백 및/또는 보습 용도로 파악될 수 있다.

또 본 명세서에서 "얌빈 추출물"은 추출 대상인 얌빈의 알곡, 덩이줄기, 잎, 꽃, 뿌리 또는 이들의 혼합물을 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 알콜, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 물, 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 추출물과 그 추출물에서 상기 열거된 용매로 더 정제된 분획물을 포함하는 의미로서 이해된다. 여기서 추출 방법은 추출 대상을 추출 용매에 침지시키는 방법과 추출 대상을 추출 용매로 증류시키는 방법을 모두 포함한다. 또한 침지를 통한 추출 방법에는 냉침, 가온, 초음파, 환류 등 임의의 방식이 적용될 수 있다. 그럼에도 상기 "추출물"은 바람직하게는 그 추출 대상을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출(침지 또는 증류)하여 얻어진 것을 의미하며, 더 바람직하게는 에탄올 함량이 60% 내지 100%의 에탄올 수용액을 의미한다. 상기에서 %는 부피 백분율에 의한 농도(v/v) 표현으로서, 당업계에 알려진 바와 같이 일정 부피의 용액 중에 녹아 있는 일정 부피의 용질을 의미한다. 예컨대 30%(v/v)는 용액 100㎖에 용질 30㎖가 용해되어 있다는 것이 된다. 또 본 명세서의 "추출물"의 의미에는 여과 등을 통하여 정제된 형태의 추출물, 추출 용매가 제거된 액상의 농축된 추출물 그리고 추출 용매가 제거된 분말상의 추출물이 포함된다.

또 본 명세서에서, 상기 "유효성분"의 의미는 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

한편 본 발명의 피부 외용제 조성물은 그 유효성분인 얌빈 추출물을 피부 재생 촉진, 콜라겐 생합성 촉진, 주름 생성 억제, 미백 및/또는 보습 활성을 나타낼 수 있는 한 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 20.000 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 피부 재생 촉진, 콜라겐 생합성 촉진, 주름 생성 억제, 미백 및/또는 보습 활성을 나타낼 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 피부 외용제 조성물(이하 "본 발명의 조성물")은 구체적인 양태에 있어서 화장료 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로서 파악될 경우, 그 화장료 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 그 유효성분을 포함하는 이외에 화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다.

여기서 "화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장료 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 50 중량% 내지 약 99 중량 %로 포함될 수 있다.

그러나 상기 비율은 화장료의 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다.

상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에 알려진 항균성 물질, 항아토피 활성 물질, 항여드름 활성 물질 등 기능성 물질을 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 피부 세정제 조성물로도 파악할 수 있다.

본 발명의 피부 세정제 조성물은 고형상 또는 액상으로 제조될 수 있으며, 바디용 비누, 핸드용 비누, 세안제 등으로 제품화될 수 있다.

본 발명의 피부 세정제에는 그 유효성분인 얌빈 추출물의 피부 재생 촉진, 콜라겐 생합성 촉진, 주름 생성 억제, 미백 및/또는 보습 활성을 저해하지 않은 한, 당업계에서 세정제의 제조에 사용되는 임의의 성분을 포함할 수 있다.

이러한 임의의 성분으로서는 예컨대, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 등의 음이온 계면활성제, 아민 옥시드, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 등의 비이온 계면활성제, 유분, 실리콘류, 저급 또는 고급 알코올 등의 알코올류, 라놀린 유도체, 단백 유도체, 아크릴 수지 분산액, 양이온 성 폴리머, 음이온성 폴리머, 비이온 성 폴리머, 비타민 등의 약제, 살균제, 방부제, pH 조정제, 산화 방지제, 금속 봉쇄제, 자외선 흡수제, 동식물 추출물 또는 그 유도체, 색소, 항료, 안료, 무기물 분체, 점토 광물, 나일론, 폴리에틸렌 등의 수불용성 폴리머 분체, 프로필렌 글리콜, 에틸알콜, 글리세린, 물 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 국소형 제형 예컨대 크림, 로션, 연고(반고형의 외용약), 마이크로로에멀젼, 젤, 페이스트, 경피제제(TTS)(예컨대 패치제, 붕대 등) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등), 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어 비누 조성물로서 파악될 수 있다.

본 발명의 조성물이 비누 조성물로서 파악될 경우에, 본 발명의 비누 조성물은 비누 기재에 그 유효성분을 포함하여 제조될 수 있으며, 첨가제로서 피부 보습제, 유화제, 경수연화제 등을 포함하여 제조될 수 있다.

상기 비누 기재로서는 야자유, 팜유, 대두유, 파마자유, 올리브유, 팜핵류 등의 식물유지 또는 우지, 돈지, 양지, 어유 등의 동물유지 등이 사용될 수 있고, 상기 피부 보습제로서는 글리세린, 에리트리톨, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실글리콜, 이소프로필미리스테이트, 실리콘 유도체, 알로에베라, 솔비톨 등이 사용될 수 있으며, 상기 유화제로서는 천연오일, 왁스 지방알콜, 탄화수소류, 천연식물 추출물 등이 사용될 수 있고, 상기 경수연화제로서는 테트라소듐 이디티에이 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 비누 조성물은 또한 첨가제로서 항균제, 분산제, 거품억제제, 용매, 물때 방지제, 부식 방지제, 향료, 색소, 금속 이온봉쇄제, 산화방지제, 방부제 등을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 첨가제는 당업계에 공지되어 있으며, 공지된 것 중 임의의 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 비누 조성물에 있어서, 비누 기재나 첨가제는 당업계에 일반적으로 사용되고 있는 함량으로 포함될 수 있는데, 비누 기재는 일반적으로 비누 조성물의 전체의 함량을 기준으로 하였을 때 99.9 중량 % 내지 10.0 중량 %로 첨가될 수 있으며, 첨가제는 0.01 중량 % 내지 20.00 중량 %로 첨가될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 피부 재생 촉진, 콜라겐 생합성 촉진, 주름 생성 억제, 미백 및/또는 보습 용도로 유용하게 사용될 수 있는 얌빈 추출물을 이용한 피부 외용제 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 화장품, 약품, 비누 등으로 제품화될 수 있다.

[도 1]은 얌빈 추출물이 PPAR-α의 촉진 활성을 보여주는 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 얌빈의 추출물 제조

<실시예 1> 얌빈의 에탄올 추출물 제조

건조된 얌빈 1kg에 70% 에탄올을 10L 가한 후 24시간 동안 상온에서 교반하면서 추출하였다. 80메쉬의 체를 이용하여 고형분을 제거한 후 남은 여액을 다시 여과하고 감압 농축기를 이용하여 여액 중의 용매를 증류 제거하여 약 68g의 갈색의 고형분을 얻었다.

<실시예 2> 얌빈의 물 추출물 제조

건조된 얌빈 1kg을 물 1L를 가한 후 분쇄기로 파쇄한 후 다시 물 9L를 첨가하고 80메쉬의 체를 이용하여 고형분을 제거한 후 남은 여액을 다시 여과하고 감압 농축기를 이용하여 여액 중의 용매를 증류 제거하여 약 32그램의 암갈색의 고형분을 얻었다.

< 실험예 > 피부세포 분화 촉진 활성, 콜라겐 생합성 촉진 활성, 미백 활성, 피부 보습 활성 실험

<실험예 1> 피부세포 분화 촉진 활성 실험 - PPAR -α 활성 촉진 실험

아프리카 원숭이 신장 상피 세포주인 CV-1세포(ATCC CCL 70)를 10% 우태아 혈청과 100unit/㎖ 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco Modified Eagle's

Medium)에 넣고 37℃, 5% CO2에서 계대배양하였고, 페놀 레드(phenol red)의 에스트로겐에 의한 효과를 제거하기 위해 무-페놀 레드 배지를 사용하였다.

플라스미드는 일반적인 배양 조건에서도 발현되는 유니버셜 프로모터(universal promoter) 뒤에 PPAR-α 유전자를 지닌 플라스미드, 리간드 결합형의 PPARs가 결합하여 활성화되는 PPARs 반응 요소((PPARs Response Element, “PPRE”)를 프로모터로 가지고 뒤에 리포터로서 역할을 하는 반디불(firefly) 루시퍼라제(luciferase) 유전자를 지닌 것, 참조(reference)로 사용될 유니버설 프로모터에 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase) 유전자가 결합된 플라스미드를 사용하였다.

CV-1 세포를 9x10⁴cells/cm²의 농도로 24웰형 플레이트에 분주한 후 24시간 배양하고 상기 세 종류의 플라스미드 유전자를 일시적 주입법(transient transfection)으로 트랜스펙션시켰다. 그 후 24시간 배양하고 1×PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척한 후, 상기 실시예의 각 시료를 1ppm 및 10ppm의 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 다음 1×PBS로 세척하고, 1×PLB(Passive Lysis Buffer)로 세포를 파괴하고 세포 용출액을 마이크로 튜브로 옮긴 다음 12,000rpm으로 3분간 원심분리하여 세포 잔여물을 분리하고 순수한 세포 용출액을 얻었다. 세포 용출액에 루시퍼라제 기질(Luciferase substrate, Promega)을 처리한 후 Dual-Luciferase Reporter Assay System kit를 사용하여 시료 처리군와 참조의 루시퍼라제 활성을 측정하였으며, 시료 처리군의 PPAR-α 활성도는 시료 처리군의 트랜스펙션 효율을 나타내는 참조의 루시퍼라제 활성도를 통하여 보정하였다.

본 실험에서 양성 대조군은 PPAR-α의 리간드 중 가장 강력한 것으로 알려진 Wy-14,643을 사용하였고, 음성 대조군은 시료들을 녹일 때 사용한 에탄올 처리군과 무처리군으로 구분하였다.

결과를 [도 1]에 나타내었다. [도 1]을 참조하여 보면, 실시예의 얌빈 추출물은 음성 대조군에 비하여 PPAR-의 활성화 정도가 뚜렷하게 높게 나타났으며, 얌빈 추출물 중에서는 <실시예 1>의 얌빈 에탄올 추출물이 얌빈 물 추출물에 비하여 조금 높은 PPAR-의 활성화도를 보임을 확인할 수 있다.

상기 결과는 얌빈 추출물이 피부 세포의 분화 촉진 활성이 있음을 보여준다고 할 수 있다.

<실험예 2> 콜라겐 생합성 촉진 활성 실험

<실험예 2-1> 실험에 사용할 세포 분리 배양

정상표피의 지방층을 제거하고 잘게 잘라 콜라게나제(collagenase)로 표피와 진피를 분리한 후, 표피와 진피조직을 각각 0.25% 트립신(trypsin) 용액에 넣고 37, 5% CO₂ 배양기에서 10분간 처리하였다. 이후 보텍스(vortex)를 시행하여 각질형성세포와 섬유아세포를 각각 유리시켰다. 유리된 세포를 모아 세척한 후 각질형성세포는 KGM(keratinocyte growth medium, Clonetics, USA)에 1 10⁴cells/cm²농도로 배양하였으며, 섬유아세포는 10% 우태아혈청(FBS)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 70~80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대 배양한 세포를 실험에 이용하였다.

<실험예 2-1> 프로콜라겐 정량

세포의 프로콜라겐의 양을 측정하기 위하여 섬유아세포를 48 웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후 하루 동안 기아(starvation)상태로 하였다.자외선 조사 없이 상기 각 실시예의 시료를 각각 0.001 및 0.01%(w/v)로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐 타입-1 C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

결과를 음성 대조군(무처리군) 대비 백분율로 아래의 [표 1]에 나타내었다.

프로콜라겐의 생성량(%)

구분	0.001% 처리	0.01% 처리
실시예 1	107	113
실시예 2	114	125
음성대조군	100	100

상기 [표 1]의 결과는 얌빈 추출물이 프로콜라겐 생성 촉진 활성이 있음을 보여준다. 얌빈 추출물 중에서는 <실시예 2>의 물 추출물의 활성이 더 높은 것으로 나타났다.

<실험예 2-2> MMP -1 정량

세포의 MMP-1 양을 측정하기 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후 하루 동안 기아(starvation)상태로 하였다. 이후 PBS로 2회 세척한 다음 PBS를 100㎕씩 넣어준 상태에서 플레이트(plate)의 뚜껑을 열고 자외선 A(UVA 필터가 장치된 Dermlight cube 401, UVAtec, USA)를 15J/cm²로 조사하였다. 조사 직후 다시 PBS로 1회 세척하였다. 이후 상기 각 실시예의 시료가 각각 0.001, 0.01%(w/v) 포함되고 우태아 혈청은 포함되지 아니한 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배지 중에 유리된 MMP-1의 양을 MMP-1 인간 ELISA 시스템(human ELISA system)(RPN2610, Amersham Pharmacia Biothch, UK)을 이용하여 측정하였고, 섬유아세포의 총 단백질 양으로 보정 하였다. 이때 자외선 A를 조사하지 않고 추출물도 처리하지 않은 군을 음성 대조군으로 하였다.

결과를 음성 대조군 대비 백분율로 아래의 [표 2]에 나타내었다.

MMP-1 발현량(%)

구분	0.001% 처리	0.01% 처리
실시예 1	78	64
실시예 2	89	83
대조군(UVA 처리)	128	130
대조군	100	100

상기 [표 2]의 결과는 실시예의 얌빈 추출물이 MMP-1의 발현을 억제함을 보주며, 얌빈 추출물 중에서는 <실시예 1>의 에탄올 추출물의 활성이 더 높음을 보여준다.

<실험예 3> 미백 활성 실험

<실험예 3-1> 항산화 활성 실험

상기 각 실시예의 얌빈 추출물이 자외선에 의해 생성되는 활성산소 생성 억제 효과를 아래와 같은 방법으로 측정하였다.

실험에 사용한 세포주는 독일 암연구센터의 퓌세니그 박사(Dr. Fusenig)로부터 분양받은 인간 각질세포 HaCaT 세포주(Human keratinocytes HaCaT cell line)로서 이를 형광측정용 96 웰 블랙 플레이트(well black plate)에 웰당 2.0 × 10⁴cells로 분주하고, 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 첨가된 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10%, Gibco, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 1일간 배양한 후, 상기 각 실시예의 시료를 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125%(w/v) 농도로 처리하였다. 그 후 24시간 배양한 후 HCSS(HEPES-buffered control salt solution, Gibco, USA)로 세척하여 남아있는 배지를 제거한 다음, HCSS에 20μM로 준비된 DCFH-DA(2',7'-dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, USA)를 100㎕ 가하고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 20분간 배양하였다. 이후 각 시료가 농도별로 처리된 HCSS를 100㎕ 가한 후 초기에 활성산소로 산화된 DCF(dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트 리더(Ex=485nm, Em=530nm)로 측정하였다. 이후 UVB(30mJ/cm2)를 조사하고 처리 직후 및 처리 3시간 후의 형광도를 형광플레이트 리더(Ex=485nm, Em=530nm)로 측정하였다. 시료와 UVB를 모두 처리하지 않은 군을 음성 대조군으로 하였다.

음성 대조군 대비 백분율로 처리 직후의 결과를 [표 3]에, 처리 3시간 후의 결과를 [표 4]에 각각 나타내었다.

처리 직후(%)

구분	0.5%	0.25%	0.125%	0.0625%	0.03125%
실시예 1	72.57	75.20	78.43	80.75	81.05
실시예 2	85.6	88.50	89.50	92.20	93.01
대조군(UVA 처리)	135	136	133	134	135
대조근	100	100	100	100	100

처리 3시간 후(%)

구분	0.5%	0.25%	0.125%	0.0625%	0.03125%
실시예 1	64.21	68.62	72.79	75.27	77.73
실시예 2	73.41	75.61	79.42	82.27	85.08
시료 무처리 + UVB	135	136	133	134	135
음성 대조군	100	100	100	100	100

상기 [표 3] 및 [표 4]의 결과는 실시예의 얌빈 추출물이 항산화 활성이 있음을 보여주며, 얌빈 추출물 중에서는 <실시예 1>의 에탄올 추출물이 더 활성이 우수함을 보여준다.

<실험예 3-2> 멜라닌 생성 억제 활성 실험

상기 실시예의 얌빈 추출물의 멜라닌 생성 억제 활성을 아래와 같은 방법으로 측정하였다.

B16/F10 흑색종 세포(한국세포주은행)를 10% 우태아혈청이 함유된 DMEM으로 6 웰 플레이트에 2×10⁴cell/웰(최종 부피 3ml)로 넣고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터(MCO-20AIC, Sanyo)에서 24시간 배양하였다.

이후 배지를 제거하고, 10% FBS, 2μM α-MSH(Melanocyte stimulating hormone), 2mM 테오필린이 함유된 DMEM 배지로 교체한 다음 배지에 각 실시예의 시료를 첨가하여 3일간 매일 처리하였다. 5일째에 6 웰 플레이트에서 배양된 배지를 제거하고 0.25% 트립신-EDTA(Sigma Chemical Co.) 용액을 처리하여 세포 펠렛을 회수하고 1.5ml 튜브로 옮겨 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 얻어진 펠렛을 60℃에서 건조시킨 후 1N NaOH 100μl를 넣어 세포 내 멜라닌을 녹였다. 이 용액을 PBS로 희석시킨 다음 ELISA 판독기 475nm에서 흡광도를 측정하여 시료의 멜라닌 생성저해율을 구하였다. 상기 추출물을 첨가하지 않은 세포를 음성대조군으로 하여 대조군에서의 멜라닌 함량과 비교하여 시험물질의 멜라닌 생성 저해 정도를 측정하여 미백효과를 측정하였다.

결과를 α-MSH의 처리군 대비 백분율로 아래의 [표 5]에 나타내었다. 코지산 및 멜라솔브는 양성 대조군으로 사용되었다.

멜라닌 생성 억제 활성(%)

구분	0.001% 처리	0.01% 처리
실시예 1	26.7	33.4
실시예 2	19.6	24.9
코지산	39.2	51.3
멜라솔브	44.7	54.9
α-MSH의 처리군	100	100

상기 [표 5]의 결과는 실시예의 얌빈 추출물이 멜라닌 생성 억제활성을 가짐을 보여준다.

<실험예 4> 피부 보습 활성 실험

얌빈 추출물의 사용에 따른 피부 내 수분량 증가 정도 측정하여 보습 활성을 확인하였다.

피부 내 수분 증가 측정 실험은 탈모 기니피그(hairless Guinea pig) 50마리를 4개 조로 나누고, 실시예의 각 시료, 비히클(프로필렌글리콜(PG):EtOH) 및 글리세롤을 사용하여 이들을 각 조에 나누어 도포하고 결과를 측정하였다.

구체적으로, 핀(Finn) 챔버를 이용하여 아세톤으로 30분간 시험 동물들의 옆구리에 패취하여 피부 장벽을 손상시킨 다음, 패취한 자리에 시험물질을 각각 20㎕씩 도포하였으며, 수분량 측정기(Corneometer)를 이용하여 각질층의 수분량을 측정하여 평가하였다. 기기측정은 아세톤 패치 제거 직후 및 패취 제거 후 6시간, 12시간, 24시간, 48시간에 측정하였다. 아세톤 처리 직후의 값을 100으로 하여 피부 내 수분량 변화를 관찰하였으며 그 결과를 [표 6]에 나타내었다.

보습 활성(%)

측정 시기	아세톤 처리 직후	시료 도포 후
		6시간	12시간	24시간	48시간
비히클 (PG:EtOH=8:2)	100	96	93	91	85
글리세롤	100	109	114	116	118
실시예 1	100	104	107	108	109
실시예 2	100	109	111	117	119

상기 [표 6]에서 보는 바와 같이, 실시예의 얌빈 추출물이 비히클(프로필렌글리콜:에탄올=8:2)에 비하여 피부 내 수분량을 증가시키는 효과가 현저하게 높았으며, 피부 수분량을 증가시키는 것으로 공지되어 있는 글리세롤과 유사한 효과를 나타내었다. 얌빈 추출물 중에서는 <실시예 1>의 에탄올 추출물의 활성이 더 높게 나타났다.

Claims (10)

1. 얌빈 추출물을 포함하는 피부 외용제 조성물.
   
2. 얌빈 추출물을 포함하는 피부 재생 촉진용 피부 외용제 조성물.
   
3. 얌빈 추출물을 포함하는 콜라겐 생합성 촉진용 피부 외용제 조성물.
   
4. 얌빈 추출물을 포함하는 주름 생성 억제용 피부 외용제 조성물.
   
5. 얌빈 추출물을 포함하는 미백용 피부 외용제 조성물.
   
6. 얌빈 추출물을 포함하는 보습용 피부 외용제 조성물.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 얌빈 추출물은 얌빈을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
   
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조성물은 화장품 조성물인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
   
9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
   
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 비누 조성물인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
    
    
    
    

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