KR20140068259A

KR20140068259A - 바이러스 벡터 정제 시스템

Info

Publication number: KR20140068259A
Application number: KR1020147011842A
Authority: KR
Inventors: 키아라 보볼렌타; 안나 스토르나이유올라
Original assignee: 몰메드 에스피에이
Priority date: 2011-10-05
Filing date: 2012-10-05
Publication date: 2014-06-05
Also published as: EP2764094A1; IL231876A0; JP2014528729A; BR112014008225A2; ZA201401481B; CN103842501B; RU2607044C2; CN103842501A; WO2013050523A1; CA2848939A1; US20140248695A1; RU2014117466A; AU2012320480A1; IN2014CN03368A; NZ623092A

Abstract

본 발명은, 바이러스 벡터의 새로운 정제 방법, 구체적으로는 세포 표면 마커를 암호화하는 외인성 유전자의 벡터를 생성시키는 패키징 세포주에서의 발현에 기초하는, 레트로비리다에(Retroviridae) 과에 속하는 것의 정제 방법에 관한 것이다. 벡터의 바이러스 엔벨로프 내의 세포 표면 마커의 혼입은 면역학적 방법으로의 정제를 허용한다.

Description

바이러스 벡터 정제 시스템{VIRAL VECTORS PURIFICATION SYSTEM}

본 발명은 바이러스 벡터(viral vector)(VV), 구체적으로는 레트로비리다에(Retroviridae) 과에 속하는 것의 효율적인 정제 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 패키징(packaging) 세포주에서 외인성 세포 표면 마커의 발현에 기초하는 면역학적 방법에 의한 VV의 정제에 관한 것이다.

바이러스 벡터는 유전 물질을 표적 세포들 내에 전달하는 데 통상적으로 사용되고 있다. 최근, VV는 유전 요법 용도들에서 치료 유전자들을 환자 내에 비히클하는 데(vehicle) 사용된다. 임상적 용도들에서, 규제 기관들에 의해 부가되는 요건들을 충족하기 위하여 고품질 VV를 개발할 것이 요구되고 있다. 구체적으로는, 큰 바이러스 스톡(stock)을 얻기 위하여 대규모 생산 공정들에서 사용되는 더욱 안전한 프로듀서(producer) 세포주를 개발할 것이 요구되고 있다. 한편, 인간에게 투여되는 임상 등급의 바이러스 입자들의 생산을 위하여 비용-효율적이고 확장 가능한 정제 공정들이 필수적이다.

VV 제조물의 정제에서는 벡터 성분들, 세포 및 배지 오염물, 예컨대 혈청으로 인한 독성, 염증 또는 면역 반응을 방지하는 것이 의무적이다(Baekland et al., 2003; Tuschong et al., 2002). 이상적으로는, 정제 공정에서는 바이러스 감염성(안정성)의 관리, 바이러스 입자의 높은 회수, 형질도입(transduction)의 억제제, 단백질 및 DNA와 같은 오염물들의 제거, 바이러스 상청액을 농축시키는 가능성, 및, 더불어, 공정의 확장성(scalability)을 보장하는 것이 필요하다(Andreatis et al., 1999; Lyddiatt and O'Sullivan, 1998).

오늘날과 같이, 여러 기술들, 구체적으로는 원심분리 기반의 방법들, 막 분리 공정들, 크로마토그래피, 또는 염 및 중합체를 사용하는 침전에 기반된 다른 방법들, 예컨대 PEG에 기초하여, 레트로바이러스(retroviral) 벡터의 정제에 대한 여러 절차들이 개발되어 왔다. 최근 제안된 정제 계획들에서는 낮은 회수(대략 30%)를 초래한다(Rodrigues et al., 2007). 이들 방법들 모두는 원래는 단백질 제조를 위해 개발되었으며, 이들은 VV의 정제에 대해 추가로 채택되어 왔다. 바이러스 입자들의 정교성과 복합성으로 인해, 높은 생산성과 높은 출력을 얻으면서, 최종 생성물의 생체 활성을 특히 감염성과 관련하여 유지시키기 위하여, 정제 방법들을 개선시킬 것이 요구된다.

추가적이고 더욱 최근의 예는, 비스코트-올드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome)의 치료를 위한 파일롯(pilot) 유전자 요법 임상 시도에 대하여 사용되는, 대규모로 GMP 조건들 하에서 렌티바이러스(lentiviral) 벡터의 제조 방법을 개시하고 있는 Merten et al., 2011에 보고되어 있다. 개시된 공정에는 렌티바이러스 입자의 정제를 위한 제조 및 다운스트림(downstream) 공정들 둘다가 포함된다. 구체적으로는, 정제는 음이온 교환 및 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피를 포함하는 몇몇 크로마토그래피 및 막 기반의 공정 단계들을 조합시킨 다단계 계획에 기초하고 있다. 최종 제조물들에서 제조율과 관련된 매우 우수한 결과 및 DNA 및 단백질 오염물의 부재에도 불구하고, 정제 공정의 최종 수율은 종래 개시된 방법들의 범위 내(30% 미만)이고, 최종 샘플 내의 바이러스 벡터의 감염성은 감소된다.

바이러스 및 세포 단백질들 둘다는 바이러스 성숙 도중과 숙주 세포로부터의 방출 도중, 특히는 소위 버딩(budding) 공정 도중 바이러스 엔벨로프(envelope) 내로 혼입된다(Arthur et al., 1992). 예를 들면, 다수의 내인성 숙주 세포 단백질은 인간 림프구 항원, (HLA) 클래스 I 및 II, CD44, 보체 제어(complement control) 단백질 및 기타 물질들을 포함하는 HIV-1 엔벨로프 내에 혼입되는 한편, CXCR4, CCR5 및 CCR3과 같은 기타의 것은 배제된다. 이 관찰에 기초하여, 세포 유형 특이적 항원들은 HIV-1 복제의 세포 기원의 마커로서 작용할 수 있음이 제안되었다(Roberts et al., 1999). 더욱이, 림프구 유도된 및 대식세포 유도된 증식 HIV 바이러스 사이를 식별할 수 있는 면역자성 바이러스 캡쳐 검정(immunomagnetic viral capture assay)이 개발되었다(Lawn et al., 2000). 구체적으로, Lawn et al.은 CD26와 결합할 수 있는 항체를 사용하여 T-세포-유도된 HIV 바이러스를 격리시킬 수 있고, 이를 대식세포-유도된 HIV-1 바이러스로부터 식별할 수 있으며, 이는 다시 안티 CD36 항체들을 사용하여 캡쳐될 수 있다고 제시하였다. CD26 및 CD36 둘다는 각각 T-세포 및 대식세포 내에서 HIV-1 감염 동안 과발현되는 내인성 숙주 세포 단백질이다. 단백질 둘다는 또한 바이러스 엔벨로프 내에 혼입되며, 따라서 바이러스의 선택적 격리가 허용된다. Lawn et al.은, 성공적인 것들을 동정하기 전에 숙주 세포 특이적 항원들과 결합할 수 있는 항체들의 패널을 시험하였다. 흥미롭게도, 대식세포들에 의해 고도로 내인성 발현된 항원들(CD32, CD64, CD88 및 CD89)과 결합할 수 있는 몇몇 항체들은 그 대신에 바이러스를 캡쳐할 수 없으며, 따라서 숙주 세포의 표면에 대한 특정 마커의 과발현이 바이러스를 캡쳐하는 데 필수적이기 하지만 충분하지는 않은 조건인 것으로 나타난다. Lawn et al.은, 숙주에 의해 발현된 외인성 단백질들이 바이러스 엔벨로프 내에 성공적으로 혼입될 수 있으며, 후속적으로는 기능적으로 활성인 바이러스 입자들의 정제에 사용될 수 있음을 제시하지는 않는다.

특정의 개질된 세포 표면 마커는 형질전환된 세포들의 정제에 사용될 수 있는 것이 제시되어 왔다. 구체적으로는, WO/9506723에서는 진핵성 (포유류) 세포를 마킹하는 방법으로서 이들 세포에서 그리고 세포 표면에서 추가로 제공되는 세포 표면 수용체를 암호화하는 핵산을 발현시키는 방법을 개시하고 있다. 이 세포 선택 공정은, 표면에 제공된 수용체가 그의 결합 파트너에 대한 결합 후에 임의의 신호 형질전환에 영향을 미칠 수 없도록 하는, 수용체의 세포 내 도메인이 완전하게 또는 부분적으로 삭제되거나 또는 개질되어 있는 핵산의 사용을 특징으로 한다. 개시된 공정에서 사용된 세포 표면 수용체는 세포 내 도메인이 삭제되어 있는 절단 형태(truncated form)의 저신경성장인자수용체(Low Nerve Growth Factor Receptor)(LNGFR)이다. 생성된 절단된 세포 표면 수용체는 ΔLNGFR로 지칭된다. ΔLNGFR 단백질의 존재는 단핵 항체 및 자성 비드의 사용을 통하여 유전적으로 개질된 세포들의 시험관 내 면역선택(immunoselection)을 허용한다.

ΔLNGFR은 형질전환된 세포들의 선택을 위해 유전자 요법에서 최근 사용되는 절단된 세포 표면 마커이다. 예를 들면, 혈액암(hematological malignancy)의 치료를 위한 안전한 일배수동종(haploidentical) 조혈모 줄기세포 이식(haemopoietic stem cell transplantation)(HSCT)을 가능하게 하는 HSV-TK 유전자 요법 접근에 사용되고 있다. TK 요법은 자살 유전자 HSV-TK 및 마커 유전자 ΔLNGFR 둘다를 갖는 레트로바이러스 벡터를 사용한다(Verzeletti et al., 1998).

지금까지는 ΔLNGFR 수용체가 VV의 정제에 사용되지 않았다.

임상적 용도들을 위해 정제된 VV를 제조하고자 하는 필요성으로 인해, 안정성과 관련하여 여전히 우수한 품질을 갖는 충분하게 안전한 벡터들의 생성과 더불어 VV의 우수한 회수를 허용하는 효율적인 정제 방법들을 얻고자 하는 일부 시도들이 있어 왔다. 최근 사용되는 방법들에서는 낮은 회수를 얻게 되며, 임의의 경우에는 일부 제한사항을 갖는 데, 이는 이들이 재조합 단백질들의 제조를 위해 개발되고 VV 정제에 부합되게 채택된 다운스트림 공정들로부터 유도되기 때문이다. 따라서, 유전자 요법을 위한 벡터들의 대규모 제조에 사용되며 이로 인해 높은 감염성을 관리하는 우수한 회수 및 안전한 바이러스 입자들을 얻을 수 있는 VV를 위한 효율적이고 신속하게 확장 가능한 정제 방법들에 대한 요구가 있다.

WO/9506723

본 발명은 VV의 정제 분야, 구체적으로는 레트로비리다에 과에 속하는 것의 정제 분야에 관한 것이다. VV의 정제에 최근 사용되는 다운스트림 공정들은 재조합 단백질에 통상적으로 적용된 방법들에 기초한다. VV는 기초 연구 및 유전자 요법 임상적 시도들에서 사용되는 특유한(peculiar) 입자들이며, 후자의 경우 임상적 등급의 제조를 필요로 한다. 따라서, 정제는 의무적이지만, VV의 특유성(peculiarity)으로 인해, 충족해야 하는 일부 요건들이 존재한다. 정제 공정에서는, 효율적이고 신속해야 하는 데 이는 VV가 환경 조건들에 대해 민감하기 때문이고, 확장 가능해야 하는 데 이는 임상적 용도들에서 큰 배치(batch)들이 요구되기 때문이다.

본 발명은 바이러스 입자들의 정제를 위한 새로운 전략을 제공하며, 이는 세포 혈장 막 내에 매립된 숙주 세포 단백질들을 그들의 외부 엔벨로프 내에 혼입하도록 하는 입자의 성질의 이용(exploitation)에 기초한 것이다. 정제 방법은 VV의 제조를 위한 패키징 세포주에서 세포 표면 마커를 암호화하는 외인성 유전자의 발현에 있다. 이러한 마커는 패키징 세포들의 세포막 위에 노출된다. 바이러스 입자의 제조 과정에서, 성숙 단계 동안, 세포 표면 마커는 버딩 공정을 통해 바이러스 엔벨로프 내에 혼입된다. 바이러스 엔벨로프 내에 혼입되는 경우, 마커는 사실상 바이러스 표면 마커이지만, 본 출원인은 상기 마커를 "세포 표면 마커"로서 계속적으로 지칭할 것이다. 그 다음, 바이러스 입자들은 이러한 마커를 인지할 수 있는 항체와 함께 항온처리될 수 있으며, 면역학적 방법들을 통해 정제될 수 있다. 패키징 세포들, 구체적으로는 패키징 상피(epithelial) 세포들에 대해 외인성인 세포 표면 단백질 모두는 본 발명에서 세포 표면 마커로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 세포 표면 마커는 예컨대 CD26, CD36, CD44, CD3, CD25, 및 세포 내 도메인이 삭제되어 있는 저신경성장인자수용체(Low Nerve Growth Factor Receptor)(ΔLNGFR)일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 정제 공정에 사용되는 세포 표면 마커는 ΔLNGFR이다.

개발된 정제 방법은 극히 다양한 데, 이는 버딩 공정을 통해 성숙 동안 숙주 세포막의 단백질들을 혼입시키는 임의의 VV, 예컨대 레트로바이러스, 렌티바이러스, 알파 바이러스[예컨대, 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus)(SFV), 신디비스 바이러스(Sindibis virus)(SIN)], 라브도바이러스[예컨대, 베시큘라 스토마티티스 바이러스(vesicular stomatitis virus)(VSV)], 및 오르쏘믹소바이러스[예컨대, 인플루엔자 A 바이러스]에 적용 가능하기 때문이다. 더욱이, 정제 방법은 제조방법과 연결되어 있는 데, 이는 이것이 패키징 세포주에서의 마커의 발현을 요구하며 따라서 제조 및 다운스트림 공정들이 동일한 출발물질(패키징 세포주) 위에 구축되는 통합된 접근을 허용하기 때문이다. 이와 관련하여, 정제에 필요한 세포 표면 마커를 암호화하는 추가의 외인성 유전자뿐만 아니라, VV의 제조에 필요한 모든 요소들을 함유하는 안정한 패키징 세포주들을 생성시킬 수 있다. 이 양태는 확장성 및 효율성 둘다에 특히 유용하다.

방법은 상청액으로부터 VV를 분리시키기 위하여 세포 표면 마커와 결합할 수 있는 리간드의 용도에 기초한다. 바람직하게는, 리간드는 항체이며, 바이러스 입자들의 분리는 면역학적 방법들에 의해 수득된다. 더욱 바람직하게는, 방법은 면역자성 선택을 사용한다. 본 발명의 방법은 쉽게 대규모화(scale-up) 및 자동화될 수 있는 데, 이는 면역자성 선택의 성능을 위한 몇몇 장비들이 존재하기 때문이다.

더욱이, 제안된 방법은 편리하고, 매우 신속하고, 극도로 효율적이며; 정제 효율성은 최근 사용되는 방법들, 예컨대 DEAE 및 SEC 칼럼을 사용하는 것과 같은 크로마토그래피 방법들로 수득된 것보다 높다.

또한, 본 발명의 정제 방법이 높은 회수를 허용하는 데, 이는 이 방법을 통해 정제된 벡터들의 역가(titer) 수율이 대부분의 소규모 실험들에서 적어도 85% 또는 심지어 그 이상(120%)이기 때문인 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 본 발명의 방법으로 정제된 렌티바이러스 벡터의 감염성의 상당한 증가가 소규모 실험들에서 얻어졌다(일시적 및 안정한 제조에 대해 각각 43% 및 60%). 이러한 역가 수율 및 감염성 증가는 최종 결과들에 영향을 미치는 다른 단계들을 고려하지 않고서 본 발명의 정제 방법의 단일한 주요 단계, 즉 복합 바이러스 벡터-리간드의 분리로 달성된다.

대규모 실험들이 또한 실행되며, 매우 우수한 결과들이 수득되었다. 사실상, 복합 바이러스 벡터-리간드의 분리의 단일 단계를 사용하는, 바이러스에 대한 회수는 60%이다. 분리 단계를 시작하기 전, 오염물 및 형질전환 억제제들을 대략적으로 제거하는 예비 여과 및 원심분리 단계들을 통해 그리고 또한 수용체의 리간드를 사용하는 항온처리를 통해, 바이러스 상청액은 그의 바이러스 역가에 있어서 풍부하다(rich). 완전한 다단계 정제 공정 후의 최종 역가 수율(수확(harvest) 바이러스 상청액 대 최종 정제된 생성물)은 100%보다 높은 것을 나타낸다. 이들은 문헌에 개시된 완전한 정제 공정들의 역가 수율이 약 30%(Rodrigues et al. 2007)이거나, 또는 심지어 대규모 제조에서는 더 낮다(Merten et al. 2011)는 것을 고려하면 매우 우수한 결과들이다. 더욱이, 본 발명의 방법에 따라 대규모로 정제된 VV는 감염성의 3배 증가, 심지어는 동일한 소규모 방법으로 수득된 것보다 높은 증가를 갖는 것으로 나타난다. 이는 매우 중요하며 예기치않은 이점인 데, 이는 문헌에서 통상의 방법들로 정제에 덧붙여 감염성의 감소를 기재하고 있기 때문이다(Merten et al. 2011).

본 발명의 제 1 양태에 따라, (i) 세포 표면 마커(marker)를 암호화하는 외인성 유전자 및 관심 유전자(gene of interest)(GOI)를 패키징 세포주 내에 도입하는 단계; (ii) 이렇게 수득된 프로듀서(producer) 세포주를 배양하는 단계; (iii) 그들의 외부 엔벨로프(envelope) 위에 상기 세포 표면 마커를 갖는 바이러스 벡터 입자들을 함유하는 상청액을 수거하는 단계; (vi) 상기 세포 표면 마커에 결합할 수 있는 리간드와 함께 상기 상청액을 항온처리하는 단계; (v) 복합 리간드-바이러스 벡터를 분리하는 단계; (vii) 정제된 바이러스 벡터 입자들을 수득하는 단계를 포함하는 바이러스 벡터의 정제 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 양태에서, 그들의 외부 엔벨로프 위에 세포 표면 마커를 갖는 바이러스 벡터 입자들을 함유하는 상청액은 여과되고, 선택적으로는 농축된 후, 세포 표면 마커에 결합할 수 있는 리간드와 함께 항온처리된다.

바람직하게는, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 알파 바이러스 벡터[예컨대, 셈리키 포레스트 바이러스(SFV), 신디비스 바이러스(SIN)로부터 수득된 벡터], 라브도바이러스 벡터[예컨대, 베시큘라 스토마티티스 바이러스(VSV)로부터 유도된 벡터], 및 오르쏘믹소바이러스 벡터[예컨대, 인플루엔자 A 바이러스로부터 유도된 벡터]이다. 더욱 바람직하게는, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터이다.

하나의 실시양태에서, 세포 표면 마커는 패키징 세포주, 바람직하게는 상피 패키징 세포주에 대해 외인성인 임의의 세포 표면 마커이다. 바람직하게는, 세포 표면 마커는 CD26, CD36, CD44, CD3, CD25 또는 ΔLNGFR로부터 선택된다.

더욱 바람직하게는, 세포 표면 마커는 ΔLNGFR이다.

본 발명의 하나의 양태에서, 세포 표면 마커의 발현은 일시적이다.

본 발명의 다른 양태에서, 세포 표면 마커의 발현은 안정하다.

하나의 실시양태에서, GOI 및 세포 표면 마커는 동일한 전달(transfer) 벡터에서 발현된다.

다른 실시양태에서, GOI 및 세포 표면 마커는 별도의(separate) 벡터들에서 발현된다.

바람직하게는, 리간드는 작용제, 길항제, 펩타이드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 항체, 항체 단편(fragment), 어피바디(affibody)로부터 선택된 화학적 또는 생체학적 완성체(entity)이다.

본 발명의 추가의 양태에서, 리간드는 상청액으로부터 분리될 수 있는 잔기(moiety)에 연결된다.

바람직하게는, 리간드는 항체이다.

더욱 바람직하게는, 항체는 자성 비드들에 접합되며(conjugate), 복합 항체-바이러스 벡터가 함유된 용액에 자기장을 적용함으로써 분리가 된다.

바람직하게는, 바이러스 벡터는 자기장을 제거함으로써 수득된다. 더욱 바람직하게는, 복합 항체-바이러스 벡터의 분리가 칼럼 위에서 실시되며, 바이러스 벡터는 자기장을 제거하고 이들을 칼럼으로부터 추가로 용출시킴으로써 수득된다.

하나의 실시양태에서, 바이러스 벡터는 세포 표면 마커-항체 결합을 분할시킴으로써 항체로부터 분리된다.

본 발명의 다른 양태에서, 상기 패키징 세포주에 의해 생성된 바이러스 벡터들의 정제에 사용하기 위한, 패키징 세포주에서 발현된 외인성 세포 표면 마커가 제공된다.

세포 표면 마커는 패키징 세포주, 바람직하게는 상피 패키징 세포주에 대해 외인성인 임의의 세포 표면 마커이다. 바람직하게는, 세포 표면 마커는 CD26, CD36, CD44, CD3, CD25 및 ΔLNGFR로부터 선택된다.

더욱 바람직하게는, 세포 표면 마커는 ΔLNGFR이다.

도 1은 안티-ΔLNGFR-Ab-기반 정제 공정의 전략의 개략적 도면이다.
도 2는 본 발명의 실험 절차의 개략적 도면이다.
도 3은 소규모의 실험 데이터를 요약한 그래프이다.

본 발명의 바람직한 특징 및 실시양태의 상세한 설명은 비제한적인 예를 통해 설명될 것이다.

본 발명은, 달리 언급하지 않는 한, 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술들을 이용하는 통상의 기술자에 의해 실시될 수 있다. 이러한 기술 모두는 공개된 문헌에 개시 및 설명되어 있다. 예를 들면, J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); Current Protocols in Immunology, ch. 12, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical. Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press. 이들 공개문헌들 모두는 참고로 인용되고 있다.

정제 방법

본 발명은 VV에 대한 새로운 정제 방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 감마 레트로바이러스(원형: 몰로니 뮤린 류케미아 바이러스(Moloney murine leukemia virus), Mo-MLV), 렌티바이러스(원형: HIV), 알파 바이러스[예컨대, 셈리키 포레스트 바이러스(SFV), 신디비스 바이러스(SIN)], 라브도바이러스 벡터[예컨대, 베시큘라 스토마티티스 바이러스(VSV)], 및 오르쏘믹소바이러스 벡터[예컨대, 인플루엔자 A 바이러스]를 포함하는 VV의 정제 방법에 관한 것이다. 제안된 정제 방법은 바이러스의 성숙 단계들 중 하나에 기초한 것이다. 바이러스 입자는, 바이러스 프로듀서 세포들로부터 유도된 혈장 막으로 프로세스 바이러스 캡시드(process viral capsid)를 둘러싸는 버딩 공정을 통해 숙주 세포들로부터 분비된다. 이와 같이 실행하는 데 있어서, 바이러스는 세포 혈장 막 내에 정상적으로 매립되어 있는 일부 숙주 세포 단백질을 그들의 외부 엔벨로프에서 혼입시킨다.

일시적 또는 안정한 패키징 시스템에 의해 제조된 VV는 동일한 방식으로 패키징 세포들로부터 방출된다. 본 발명의 방법은, VV가 외인성 숙주 혈장 막 단백질에 대항하는 항체를 사용함으로써 특이적으로 정제될 수 있다는 가정에 기초한 것이다.

본 발명의 제 1 양태에 따라, 패키징 세포주에서 세포 표면 마커를 암호화하는 외인성 유전자의 발현에 기초하는, VV의 정제 방법이 제공된다. 세포 표면 마커는 세포 막 위에서 발현되는 패키징 세포에 대해 외인성인 단백질이다. 일단 발현되면, 이러한 마커는 패키징 세포 막 위에 장착되며, 따라서 VV의 성숙 동안 상기 패키징 세포들에 의해 제조된 VV의 외부 엔벨로프 위에 장착된다. 본 발명의 방법에 따라, 그들의 엔벨로프 위에서 세포 표면 마커를 매립하는 바이러스 입자들을 함유하는 상청액은 수거되며, 이러한 마커를 인지할 수 있는 리간드와 함께 항온처리된다. 선택적으로는, 특히 큰 부피가 취급 및 정제되어야 하는 대규모 VV의 정제를 위해, 상청액은 여과 및 농축된 후, 재현탁되며, 리간드와 함께 항온처리된다. 이들 예비 단계들 모두는 오염물 및 형질전환 억제제들의 대략적 제거를 허용하며, 따라서 중간 제조물들에서 발견되는 바이러스 역가에서의 풍부함(enrichment)에 기여하며, 결국은 정제된 바이러스 입자들의 최종 역가에 기여하게 된다. 이들 예비 단계들에 덧붙여, 복합 리간드-VV는 배지로부터 분리된 후, VV가 수득된다. 분리 단계는 본 발명에 따른 정제 방법의 주요 단계이다. VV는 리간드와 세포 표면 마커 사이의 결합의 분할에 따라 리간드로부터 분리될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 리간드는 항체이다.

본 발명의 방법은 하기 주요 5개의 단계들로 요약될 수 있다:

1) VV를 위한 패키징 세포주에서의 세포 표면 마커의 발현

2) 바이러스 입자들의 제조

3) 세포 표면 마커를 인지할 수 있는 리간드와 함께 항온처리

4) 복합 리간드-수용체의 분리

5) 정제된 바이러스 입자들의 회수

마커의 발현 및 바이러스 입자의 제조

본 발명의 정제 방법은 VV를 위한 패키징 세포주에서 외인성 세포 표면 마커의 발현에 기초한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 세포 표면 마커는 상피 패키징 세포에 대해 외인성이다. 바람직하게는, 세포 표면 마커는 CD26, CD36, CD44, CD3, CD25, 및 세포 내 도메인(intracellular domain)이 누락된 저신경성장인자수용체의 절단된 형태(ΔLNGFR)로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 세포 표면 마커는 ΔLNGFR이다. 세포 표면 마커의 발현은 몇몇 방식들로 수득될 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 세포 표면 마커는 패키징 세포주에서 일시적으로 발현될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 세포 표면 마커 및 치료 유전자 둘다는 동일한 전달 벡터에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 세포 표면 마커 및 치료 유전자는 별도의 벡터에서 발현된다.

본 발명의 다른 양태에서, 세포 표면 마커의 발현은 안정하다. 따라서, 본 발명은, 세포 표면 마커와 함께, VV, 예컨대 바이러스 gag/pol, rev, 선택적으로는 tat 및 관심 엔벨로프 단백질의 제조에 필수적인 모든 구조적 요소들을 함유하는 패키징 세포주를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 이들 유전자들 모두는 안정한 패키징 세포주에서 안정적으로 통합된다. 다른 실시양태에서, VV의 제조에 필수적인 요소들은 일시적으로 발현된다. 패키징 세포주는 GOI를 함유하는 전달 벡터의 도입에 덧붙여 VV를 제조하는 데 사용될 수 있다. 이 패키징 세포주는 VV의 제조에 필수적인 모든 요소들을 함유하고 신속하고 안정하고 효율적인 정제 방법을 허용하는 통합된 기술적 용액을 나타낸다.

전달 벡터의 도입에 덧붙여, 안정하게 통합된 또는 일시적으로 발현된 세포 표면 마커를 함유하는 패키징 세포주를 배양함으로써 제조된다. 바이러스 입자들은 버딩 공정 동안 세포 표면 마커를 그들의 엔벨로프 내에 혼입시키며, 이들은 상청액에서 방출된다. 정제된 바이러스 입자들은 앞서 기재된 바와 같이 외인성 세포 표면 마커의 존재를 활용함으로써 수득될 것이다.

다른 실시양태에서, 세포 표면 마커와 함께, VV, 예컨대 바이러스 gag/pol, rev, 선택적으로는 tat, 관심 엔벨로프 단백질 및 GOI의 제조에 필수적인 모든 구조적 요소들을 함유하는 프로듀서 세포주가 제공된다. 프로듀서 세포의 배양에 덧붙여, 세포 표면 마커를 함유하는 바이러스 입자들은 상청액에서 방출되고, 이들은 앞서 기재된 바와 같이 외인성 세포 표면 마커의 존재를 활용하여 정제된다.

리간드와의 항온처리 및 복합 리간드 -세포 표면 마커의 분리

그들의 엔벨로프 내에 혼입된 세포 표면 마커를 함유하는 바이러스 입자들은 격리될 수 있다. 본 발명의 정제 방법에 따라, VV를 함유하는 상청액은 세포 표면 마커를 인지할 수 있는 리간드와 함께 항온처리된다. 다른 실시양태에서, VV를 함유하는 상청액은 우선 여과 및 농축된 후, 리간드와 함께 항온처리된다. 리간드는 상청액으로부터의 분리를 허용하고, 결국에는 리간드-VV 복합체의 격리를 허용하는 다른 구조체에 연결된다. 본 발명에 사용될 수 있는 리간드는 작용제, 길항제, 펩타이드, 펩티도미메틱, 항체, 항체 단편, 어피바디를 포함하지만 이에 국한되지 않은 화학적 또는 생체학적 완성체이다.

바람직하게는, 리간드는 항체이며, 본 발명의 방법은 복합 항체-VV의 분리를 위한 면역선택을 포함한다. 이 경우, 그들의 엔벨로프 위에 세포 표면 마커를 함유하는 VV는, 안티-세포 표면 마커 항체들과의 그들의 반응성에 기초하여 선택될 수 있다.

더욱 바람직하게는, 본 발명의 방법은 면역자성 선택을 포함한다. 면역자성 선택은 자석에 의해 항원성 구조들의 분리를 가능하게 하는 파라마그네틱(paramagnetic) 미세구(비드)에 대한 항체들의 커플링을 지칭한다. 예를 들면, 세포 표면 마커를 그들의 엔벨로프 내에 혼입시키는 VV를 함유하는 상청액은 주요 IgG 안티-세포 표면 수용체 항체와 함께 항온처리될 수 있다. 그 다음, 레트로바이러스 상청액은 안티-IgG 세컨더리(secondary) Ab로 코팅된 면역자성 비드와 함께 항온처리될 수 있으며, 마커를 갖는 레트로바이러스 벡터들을 분리시키기 위하여 자석에 적용될 수 있다. 레트로바이러스 상청액으로부터의 분리 후, 격리된 벡터들은 자기장을 제거함으로써 회수될 수 있다. 대안적으로, 안티-세포 표면 수용체 항체들은 자성 비드에 직접적으로 접합될 수 있다. 이 경우, 단일 항온처리 단계 직후, 자기장은 용액에 적용된다.

본 발명에 사용되는 파라마그네틱 미세구들은 당해 분야에 공지되어 있으며, 이들은 밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec)에서 상업적으로 입수 가능한 MACS(등록상표) 마이크로비드와 같은 50 nm의 작은 크기로부터 인비트로젠(Invitrogen)에서 상업적으로 입수 가능한 Dynabeads(등록상표)와 같은 0.5-500 μm의 더욱 큰 입자까지 중합체 입자이다. 파라마그네틱 미세구는 VV 엔벨로프 내로 혼입된 세포 표면 마커와 결합할 수 있는 특이적 관심 항체에 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 파라마그네틱 비드에 대한 항체의 접합 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예컨대 가교결합, 작용기 위의 공유결합의 형성, 바이오틴-애비딘 시스템(biotin-avidin system) 등을 포함한다. 바이러스 상청액으로부터 VV의 분리는 항체 접합된 파라마그네틱 비드들로 이루어지며 세포 표면 마커에 연결된 복합체를 함유하는 용액에 자기장을 적용함으로써 수득될 것이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 면역자성 선택은 칼럼 위에서 실시된다. 특히는, VV를 함유하는 상청액은 세포 표면 마커를 인지할 수 있는 항체와 함께 직접적으로 항온처리될 수 있으며, 이러한 항체는 파라마그네틱 비드에 접합되어 있다. 다른 실시양태에서, VV를 함유하는 상청액은 우선적으로 여과되고, 선택적으로는 농축된 후, 앞서 기재된 바와 같이 항온처리된다. 항온처리 후, 상청액 또는 여과된 및 선택적으로는 농축된 용액은, 자기장 덕분에 칼럼 내에 잔존하는 바이러스 입자들의 분리 및 불순물들의 제거를 위한 자성 세퍼레이터 내에 위치하는 칼럼 위에 적용된다.

정제된 입자들의 회수

본 발명의 방법에 따라, 공정의 최종 단계는 정제된 바이러스 입자들의 회수이다. 이러한 회수는 자기장으로부터 바이러스 입자들을 제거하여 수득된다. 정제가 칼럼 위에서 실시된다면, 회수는 자기장을 제거함으로써 수득된다. 그 다음, 바이러스 벡터는 리간드와 세포 표면 마커 사이의 결합을 분할시킴으로써 리간드로부터 분리될 수 있다. 상기 결합을 분할시키는 방법들은 당해 분야에 공지되어 있으며, 효소들을 함유하는 적절한 용액들의 사용 또는 치환(displacement) 리간드들의 사용을 포함한다. 리간드의 속성 및 수용체의 속성 및 그들의 결합에 의존하여, 적절한 방법이 사용된다.

효율, 확장 및 자동화

본 발명의 방법은 극도로 효율적이고 간단하며 신속하다. 최근 제안된 정제 방법들에서는 회수가 대략 30%로 허용된다. 현저하게도, 본 발명의 방법은 대부분의 소규모 실험들에서 적어도 85% 또는 심지어 그 이상(120%)의 역가 수율을 수득하도록 허용한다. 이 경우, 역가 수율은 본 발명의 방법의 주요 단계를 참조하여 계산되었다: 복합 바이러스 벡터-리간드의 분리. 앞서 언급된 역가 수율은, 외인성 수용체의 리간드와 함께 항온처리된 미정제된 입자들의 역가와 정제된 입자들의 역가 사이의 비율로부터 초래된다. 소규모 실험들에서의 미정제된 입자들은 예비 여과 단계를 통해 VV 상청액으로부터 수득된 후, 외인성 수용체의 리간드와 함께 항온처리된다. 결과들에서는 본 발명의 방법을 사용하는 바이러스 역가에 대한 회수가 매우 높은 것으로 나타난다.

바이러스 입자들은 극히 연약하며, 환경 조건들에 대해 민감하다. 구체적으로는, VV의 엔벨로프 위의 세포 표면 마커의 존재는 주로 이러한 엔벨로프의 조성에 영향을 미치며, 뿐만 아니라 다시 벡터의 트로피즘(tropism)에 영향을 미치고 결국에는 바이러스 역가와 감염성에 대한 문제를 야기시키는 바이러스 엔벨로프 단백질의 수용 가능성 및 그의 구조에 영향을 미친다. 반면, 본 발명의 방법을 사용하면, 역가는 영향이 미치지 않거나 또는 심지어 증가되며, 현저하게는 이러한 방법으로 정제된 렌티바이러스의 감염성은 소규모에서 증가된다(일시적 및 안정한 제조에 대해 각각 43% 및 60%). 이들 결과는 놀라운 것인 데, 이는 벡터의 감염성 및 트로피즘에 대해 가능하게는 부정적으로 영향을 미치는 구조적 요소들의 존재 때문이다.

본 발명의 추가의 이점은 방법이 간단하게 확장되고 자동화될 수 있다는 것이다. VV가 면역자성 선택을 사용하여 정제되는 경우를 고려하면, 자동화된 선택을 실시할 수 있는 기계(예컨대, 밀테니이 바이오텍으로부터의 CliniMacs(등록상표) Plus 장비)를 사용할 수 있다. 이러한 기계들은 칼럼과 같은 고체 지지체 위의 액체 교환 그리고 자기장의 생성을 통해 면역자성 선택을 실시할 수 있다. 자동화는 이것이 다량의 바이러스 상청액의 정제를 허용하기 때문에 큰 VV 스톡의 제조를 돕는다. 본 발명의 방법으로 대규모의 VV의 정제는 특이적 주요 분리 단계에서 적어도 60% 역가 수율을 수득하게 허용한다(수용체의 리간드와 함께 항온처리된 미정제된 입자의 역가 대 정제된 입자의 역가). 대규모 실험들에서 미정제된 입자들은 예비 정제 단계들, 예컨대 여과, 선택적으로는 농축을 통해 VV 상청액으로부터 수득된 후, 외인성 수용체의 리간드와 함께 항온처리된다. 이들 단계들 각각은, 분리를 겪는 샘플의 바이러스 역가에서의 점진적 풍부화와 함께, 오염물 및 형질전환 억제제의 대략적 제거를 초래한다. 대규모의 전체 공정의 역가 수율(수확 바이러스 상청액의 역가 대 정제된 입자들의 역가)은 100% 초과인 것으로 나타난다. 이들은 VV의 전체 정제 공저의 역가 수율이 대략 30%(Rodrigues et al. 2007) 또는 심지어 대규모 제조의 경우에는 이보다 낮은 것(Merten et al. 2011)으로 기록되는 것을 고려하면 매우 중요한 결과이다. 본 발명의 방법을 사용하는 대규모 정제는 분리 후의 미정제된 입자들보다 약 3배 많게 감염되는 것으로 나타나는 VV의 감염성의 증가를 허용한다. 또한, 본 발명의 정제 방법으로 수득되는 제조물의 품질의 아이디어를 갖기 위하여, 렌티바이러스 감염성 입자들(바이러스 역가로부터 유래 가능한 형질감염 유닛(Transfecting Unit))의 갯수 대 전체 물리적 입자의 갯수를 계수할 수 있다(Salmon and Trono, 2006에서 보고된 바와 같이, p24Gab 1 ng가 10⁷ 물리적 입자들에 상응하는 통상의 방정식으로부터 수득 가능함). 매우 흥미롭게도, 본 발명의 방법으로는, 예컨대 5,318 전체 물리적 입자들로부터 1 감염성 입자를 함유하는 상청액(매우 불량한 시작 물질)으로부터 시작하는 표 4의 실험 2에서 제시된 바와 같이, LV 제조물의 품질과 작용성에 대하여 매우 우수한 풍부함을 갖는, 250 전체 물리적 입자들로부터 1 감염성 입자를 함유하는 정제된 제조물을 수득할 수 있었음이 주지된다.

이후, 하기와 같이 첨부된 도면을 참고하고 비제한적인 실시예에 의해 본 발명의 추가의 바람직한 특징들과 실시양태들이 기재될 것이다.

도면의 설명

도 1은 안티-ΔLNGFR-Ab-기반 정제 공정의 전략의 개략적 도면이다. "구조체"는 정제될 VV를 일시적으로 또는 안정적으로 제조하는 데 필수적인 플라스미드 또는 벡터를 나타낸다(단계 1). 선택 마커 ΔLNGFR의 카세트(cassette)는 패키징 세포로부터 일시적으로 또는 안정적으로 발현된 여러 플라스미드에 또는 전달 벡터 구조체 내에 혼입될 수 있다. VV는 자성 비드에 커플링된 후 자성 칼럼 내에 리트레인되고(retrain)(단계 2) 최종적으로 용출되는(단계 3) 안티-ΔLNGFR Ab에 의해 정제된다. 정제된 VV는 부착된 비드와 함께(단계 3.1) 또는 부착된 비드의 제거 후에(단계 3.2) 사용될 수 있다.

도 2는 본 발명의 실험 절차의 개략적 도면이다. 절차는 3개의 간단한 단계들로 나뉜다: 1) 실온에서 30분 동안 안티-ΔLNGFR Ab 접합된 마이크로비드 현탁액과의 상청액의 항온처리로 이루어진 VV의 자성 표지화; 2) 자성 세퍼레이터 내에 배치된 자성 칼럼 내에 샘플의 적용에 있는 VV의 자성 분리; 모든 샘플 성분들(즉, 오염물, 단백질 및 과도한 Abs)은 플로우-쓰루(flow-through)를 겪고 추가로 몇몇 세척에 의해 추가로 제거되고; 3) 자성 세퍼레이터로부터 칼럼의 제거 및 정제된 VV의 수거에 있는 VV의 용출. 정제된 VV는 부착된 비드와 함께(단계 3.1) 또는 부착된 비드의 제거 후에(단계 3.2) 사용될 수 있다.

도 3은 소규모의 실험 데이터를 요약한 그래프이다. VV 역가의 수율은 정제된 VV의 역가 대 샘플을 칼럼 내에 적재하기 전의 자성 표지화된 VV의 것의 백분율로서 계산되었다. 값들은, RD114-TR 엔벨로프를 갖는 RD2-MolPack-Chim3.14 패키징 클론에 의해 안정하게 제조된 렌티바이러스 벡터에 대한 5 실험(안정한 LV, RD114-TR); VSV-G 엔벨로프를 갖는 HEK-293T의 일시적 형질감염에 의해 제조된 렌티바이러스 벡터에 대한 6 실험(Trans. Transf. LV, VSV-G); Ampho 엔벨로프를 갖는 AM12-SFCMM-TK 클론 48로부터 제조된 렌티바이러스 벡터에 대한 5 실험(안정한 RV, Ampho)의 중간(means)이다.

실시예

실시예 1: VV 의 제조

MLV 레트로바이러스 벡터( RV )의 안정한 제조

뮤린 NIH-3T3-유도된, e4070-슈도타입(pseudotyped) AM12-SFCMM-TK 클론 48 패키징 세포들을 37℃ 5% C0₂ 분위기에서 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(BioWhittaker(상표명) 캠브렉스 바이오 사이언스 워커스빌 인코포레이티드(Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.) Walkersville, MD) 또는 10% FBS로 보충된 X-VIVO 15(BioWhittaker(상표명)) 및 2 mM 글루타민 중에서 성장시켰다. ORF의 뉴클레오타이드 330에서 단일 침묵 돌연변이(silent mutation)를 특징으로 하는 HSV-TK 유전자의 개질된 형태를 암호화하는 구조체 FCMM-3 Mut2의 형질전환 후에 AM12-SFCMM-TK 클론 48을 수득하였다(WO 2005/123912). Aml2-SFCMM-3 Mut 2 세포의 안티-ΔLNGFR mAb를 사용하여 형질전환된 세포를 면역 선택한 후, 제한 희석액(limiting dilution)(0.3 세포/웰)에 의해 클로닝시켰다. AM12-SFCMM-TK 클론 48은 SFCMM-3 Mut2 벡터의 2개의 복제(copy)을 함유한다. GMP-등급(grade) 레트로바이러스 벡터 상청액 로트(lot)를 1% 글루타민, 10% PBS 및 아이소류신/트립토판/Na 시트레이트의 존재 하에서 X-VIVO 15 배지에서 패킹된-베트 32-리터 생체반응기 내 또는 롤러 보틀(roller bottle) 내에서 제조하였다.

렌티바이러스 벡터( LV )의 안정한 제조

인간 HEK-293T 및 그의 유도체 RD2-MolPack-Chim3 패키징 세포들을 10% FCS 및 PSG로 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에서 증식시켰다. RD2-MolPack-Chim3.14 및 Chim3.25 클론들은 안티-HIV 유전자 요법 접근을 위한 제 2 세대 LV를 안정적으로 제조하였다. 통합 벡터들을 사용하여 전달 벡터와 패키징 구조체의 연속적 통합에 의해 클론을 수득하였다. 요약하면, HEK-293T 세포들을 아데노-연관된 바이러스(adeno-associated virus)(AAV) Rep-78 단백질을 암호화하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시킨 후, 하이브리드 베큘로바이러스-AAV 벡터로 감염시켰으며, 여기서 베큘로바이러스 주쇄는 HIV-1 구조 gag, pol, 규제(regulatory) rev 및 AAV 역방위 말단반복(inverted terminal repeat)(ITR) 서열에 의해 플랭킹된(flank) 하이그로-내성 유전자(hygro-resistance gene)를 발현시키는 통합 카세트를 함유한다(국제 특허출원 WO 2012/028680). ITR-플랭킹된 카세트의 HEK-293T 게놈 내로의 Rep78-매개 통합을 허용하는 이 시스템은, PK-7로서 지칭되는 제 1 중간 클론을 생성시켰다. PK-7 클론으로부터, HIV-1 규제 tat 및 키메릭(chimeric) RD114-TR 엔벨로프 유전자를 발현시키는 SIN-LV 및 안티-HIV Vif 도미넌트 네거티브 트랜스진(dominant negative transgene) Chim3을 발현시키는 Tat-의존성 LV 벡터의 연속적 통합에 의해 RD2-MolPack-Chim3.14 및 Chim3.25 패키징 클론을 수득하였다(국제 특허출원 WO 2012/028681). 96-웰 플레이트에서 제한 희석액에서 세포를 씨딩함으로써 클론들을 수득하였다(0.1 내지 0.3 세포/웰). 각 세포 유형 클로닝 실험에서, 적어도 5 내지 10 개별 클론 또는 그 이상을 광학 현미경 하에서의 가시적 검사에 의해 선택하고 점진적으로 확대하였다. RD2-MolPack-Chim3으로부터 유도된 LV를 T25 또는 T75 플라스크에서 소규모 배양액에 의해 및 T162 플라스크에서 대규모로 수득하였다.

LV 의 일시적 제조

하기 플라스미드의 일시적 동시-형질감염에 의해 HEK-293T 세포로부터의 슈도타입 LV를 수득하였다: 패키징 구조체 CMV-GPRT, VSV-G 구조체 및 2^nd-gen. PΔN-Chim3 전달 벡터(국제 특허출원 WO 2012/028681). 패키징:엔벨로프:전달 벡터의 비율은 6.5:3.5:10 μg DNA에 상응하였다. 유사한 결과를 획득하는 제조업자의 지시사항(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)을 따라 표준 Ca2⁺-P04 방법 또는 FugeneTM 6 시스템으로 일시적 형질감염을 실시하였다. 형질감염한 지 48시간 후에 상청액을 수확하였으며, 0.45-μm 필터를 통해 여과시켰다.

실시예 II : 안티 - LNGFR Abs 에 의한 소규모 VV 의 정제

VV의 소규모 정제는 다음과 같이 실시하였다. 0.5% BSA가 함유된 PBS로 1:5(vol/vol)로 VV가 함유된 상청액을 희석시킨 후, 0.45 μm 필터로 여과시켰다. 희석된 상청액 1 내지 5 ml를 안티-LNGFR Ab 접합된 마이크로비드 현탁액(CD271 Microbeads Miltenyi Biotec, GmbH, Germany cat. #130-091-330)으로 1:40 비율(vol/vol)로 항온처리하였다. 그 다음, 회전 휠 위에서 30분 동안 실온(RT)에서 샘플을 항온처리하였다. 자성 표지화된 샘플을 자성 세퍼레이터 내에 배치된 칼럼 위에 적재하였다(Miltenyi, MS Columns cat. #130-042-201). 플로우-쓰루를 분석을 위해 수거하고, 세척 완충액 0.5 ml로 3회 세척(2% FCS 및 0.5% BSA가 함유된 PBS)을 실시한 후, 칼럼을 자성 세퍼레이터로부터 제거하고, 정제된 VV를 수거하였다.

실시예 III : 역가 계산

SupTl 세포에 대해서 이들을 폴리브렌(polybrene) 8 μg/ml의 존재 하에서 1시간 동안 1,240 x g에서 1회 사이클의 스피노큘레이션(spinoculation)에 의해 이들을 형질도입시킴으로써 VV 역가를 계산하였다(Sigma-Aldrich, St Louis, MO). FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Inc., Ashland, OR)를 사용하여 Porcellini et al., 2009 & 2010에 기재된 바와 같이, ΔLNFGR 발현의 유동 세포분석(flow cytometry analysis)(FACS Ca libur BD Bioscience, San Jose, CA)에 의해 형질도입 효율을 모니터링하였다. 오직 5 내지 20% 포지티브 세포의 형질도입 값들만 사용하여 다음 식에 따른 역가를 계산하였다. TU = [세포의 갯수 x (% 포지티브 세포/100)]/vol sup(ml).

실시예 IV : 소규모 제조에서 미정제된 VV 에 대한 정제된 VV 의 포텐시( potency )의 분석

뚜렷한 엔벨로프와 함께 여러 양식(modality)과 슈도타입에 의해 제조된 VV의 3가지 유형을 사용하여 표 1 및 표 2에 요약된 바와 같이 일부 실험들을 실시하였다. 실시예 I에서 보고된 바와 같이 안정한 패키징 세포주 RD2-MolPack-Chim3.14로부터 또는 HEK-293T 세포의 일시적 형질감염에 의해, Chim3 트랜스진을 발현시키는 2세대 LV를 제조하였다. 제 1 조건에서, 고양이 내인성 레트로바이러스 RD114 엔벨로프의 세포 외 및 막횡단(trans-membrane) 도메인 및 A-MLVenv 4070A의 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)(TR)로 이루어진, 키메라 RD114-TR 엔벨로프로 LV를 슈도타입화시킨 한편(Sandrin et al., 2002), 제 2 조건에서는, 베스큘라 스토마티티스 바이러스 글리코프로틴(vesicular stomatitis virus glycoprotein) G(VSV-G) 엔벨로프로 실시하였다. γRV를 AM12-SFCMM-TK 클론 48로부터 제조하였으며, MLV e4070 엔벨로프를 가졌다.

각 실험을 하기 조건들에서 실시하였다: 1) 희석된 상청액 부피(PBS/2% FCS/0.5% BSA로 1:5 희석된 상청액 1 ml); 2) 상청액:마이크로비드 현탁액(vol:vol) 비율 1:40; 3) 자성 비드에 직접 커플링된 안티-LNGFR Abs(CD271 마이크로비드). 분석의 출력은 미정제된 자성 표지화된 VV의 것과 비교되는 정제된 VV의 역가 수율의 백분율(도 3A) 및 감염성의 증분의 백분율(도 3B) 둘다에 상응한다. 실시예 III에 상세하게 기재된 바와 같이 SupT1 세포에 대해 역가 계산을 실시하였다. 현저하게도, 안정하게 제조된 LV에 대한 수율은 100%에 이르는 우수한 것이며(평균 121%), 일시적으로 제조된 LV의 것은 90%이었다. 이는 LV의 정제가, 이들이 장착되는 엔벨로프의 유형과 관계없이, 역가 값들을 감소시키는 다른 오염물 또는 혈청 단백질을 감소시키는 데 매우 효과적임을 의미한다. γRV의 정제 수율은 LV의 것보다 약간 불량하다(85%). 더욱이, 본 발명의 방법으로 정제된 렌티바이러스 벡터의 감염성의 상당한 감소가 수득되었다(각각 일시적 및 안정한 제조에 대해 43% 및 60%).

실시예 V: 대규모 안티 - LNGFR Abs 에 의한 VV 의 정제

VV의 대규모 정제는 다음과 같이 실시하였다. LV(800 ml)가 함유된 여과된 상청액(0.45μm)을 냉각 벤치 탑 원심분리(refrigerated bench top centrifuge)에서 +4℃에서 16시간 동안 저속(3,400xg)에서 원심분리에 의해 8배 농축시켰다. VV 펠릿(pellet)을 100 ml 완충액 PBS/EDTA 0.5% 인간 혈청 알부민(human serum albumin)(HSA) 중에서 재현탁시킨 후, 150-ml 전달 bag 중에서 1:40 비율(vol/vol)에서 안티-LNGFR Ab 접합된 마이크로비드 현탁액(CD271 Microbeads, Miltenyi Biotec, cat. #130-091-330)으로 항온처리하였다(Miltenyi Biotec cat. #183-01). 그 다음, 샘플을 오비탈 쉐이커(orbital shaker) 위에서 30분 동안 RT에서 항온처리하였다. 자성 표지화된 샘플들을 CliniMacs(등록상표) Plus Instrument 위에 적재하고, 자동화된 분리 프로그램(automated separation programme) Enrichment 3.2를 시작하였다. 정제된 LV를 40 ml로 회수하고, 분취물을 포텐시 계산에 의해 정제 성능에 대하여 평가하였다.

실시예 VI : 대규모 제조에서 미정제된 VV 에 대한 정제된 것의 포텐시의 분석

안정한 패키징 세포주 RD2-MolPack-Chim3.25로부터 제조된 Chim3 트랜스진을 발현시키는 2세대 LV를 사용하여 2개의 실험을 실시하였다. 결과를 표 3 및 4에 요약한다. 실시예 V에서 기재된 바와 같이 각 실험을 실시하였다. 분석의 출력은, 자성 비드에 접합된 안티-LNGFR Ab에 결합된 미정제된 바이러스 입자들의 것과 비교되는(표 3) 또는 상청액의 것과 비교되는(표 4) 정제된 LV의 역가 수율의 백분율 및 감염성의 증분의 백분율 둘다에 상응한다. 실시예 III에 상세하게 기재된 바와 같이 SupT1 세포에 대해 역가 계산을 실시하였다. 대규모 정제의 역가 수율(표 3, EL/입력)은 복합 바이러스 벡터/리간드의 단일 분리 단계에서 약 60%이었다. 분리 단계를 시작하기 전에, 바이러스 상청액은, 오염물 및 형질도입 억제제를 대략적으로 제거하는 예비 여과 및 원심분리 단계들을 통해 및 또한 수용체의 리간드와의 항온처리를 통해 그의 바이러스 역가가 풍부하다. 완전한 다단계 정제 공정 후의 최종 역가(수확 바이러스 상청액 대 최종 정제된 생성물)(표 4, EL/Sup)는 100%보다 높으며; 실험 1에 대해서는 118%이고, 실험 2에 대해서는 231%이었다. 가장 중요하게는, 정제된 입자들의 감염성은 미정제된 것과 관련하여 3배 격정적으로 증가되며, 심지어는 대규모 및 자동화가 VV의 작용성에 대하여 공정의 수율을 추가로 증가시키는 것을 나타내는 소규모 실험들과 비교되는 더욱 높은 풍부함을 나타낸다.

약어: LV, 렌티바이러스 벡터; RV, 레트로바이러스 벡터; RD114-TR, 고양이 내인성 레트로바이러스로부터의 키메라 엔벨로프 및 MLV env의 TR 도메인; VSV-G, 베스큘라 스토마티티스 바이러스 엔벨로프 글리코프로틴 G

^a수율은 자성 칼럼 내에 적재된 전체 TU 입력에 대해 회수된 전체 TU의 %로서 계산되었다.

^b감염성은 입력 VV에 대한 정제된 것의 감염성의 증분의 %로서 계산되었다.

^c일시적 형질감염은 본원에서 기재된 바와 같이 HEK293T 세포에 대해 실시되었다.

^a 적재 및 용출된 VV의 전체 양의 역가

^b ng로서 표기된 p24Gag의 전체 양

^c TU/ng p24Gag로서 표기된 감염성

^d 입력 VV의 전체 역가 및 p24Gag에 대한 플로우 쓰루 물질에서의 전체 역가 및 p24Gag의 백분율

^e 입력 VV의 감염성에 대한 플로우 쓰루 물질에서의 감염성의 변이(variation)의 백분율

^f 입력 VV의 전체 역가 및 p24Gag에 대한 용출된 물질에서의 전체 역가 및 p24Gag의 백분율

^g 입력 VV의 감염성에 대한 용출된 물질에서의 감염성의 변이의 백분율

nd: 결정되지 않음

^a 적재 및 용출된 LV의 전체 양의 역가

^b ng로서 표기된 p24Gag의 전체 양

^c TU/ng p24Gag로서 표기된 감염성

^d 전체 감염성 입자 대 물리적 입자 사이의 비율

^e 입력 LV의 전체 역가 및 p24Gag에 대한 용출된 물질에서의 전체 역가 및 p24Gag의 백분율, rec 회수

^f 입력 LV의 감염성에 대한 용출된 물질에서의 감염성의 변이의 백분율, var 변이

^a 시작 및 용출된 LV의 전체 양의 역가

^b ng로서 표기된 p24Gag의 전체 양

^c TU/ng p24Gag로서 표기된 감염성

^d 전체 감염성 입자 대 물리적 입자 사이의 비율

참고문헌

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15 Patrick Salmon and Didier Trono, (2006) Current Protocols in Neuroscience Supplement 37: 4.21.1-4.21.24, John Wiley & Sons, Inc.

Claims

(ii) 세포 표면 마커(marker)를 암호화하는 외인성 유전자 및 관심 유전자(gene of interest)를 패키징(packaging) 세포주 내에 도입하는 단계;
(iii) 이렇게 수득된 프로듀서(producer) 세포주를 배양하는 단계;
(iv) 그들의 외부 엔벨로프(envelope) 위에 상기 세포 표면 마커를 갖는 바이러스 벡터 입자들을 함유하는 상청액을 수거하는 단계;
(v) 상기 세포 표면 마커에 결합할 수 있는 리간드와 함께 상기 상청액을 항온처리하는 단계;
(vi) 복합 리간드-바이러스 벡터를 분리하는 단계;
(vii) 정제된 바이러스 벡터 입자들을 수득하는 단계
를 포함하는
바이러스 벡터의 정제 방법.
제1항에 있어서,
상기 바이러스 벡터가 레트로바이러스(retroviral) 벡터, 렌티바이러스(lentiviral) 벡터, 알파 바이러스(alpha viral) 벡터, 라브도바이러스(rhabdoviral) 벡터 및 오르쏘믹소바이러스(orthomyxoviral) 벡터로부터 선택되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 세포 표면 마커가 CD26, CD36, CD44, CD3, CD25 또는 저신경성장인자수용체(Low Nerve Growth Factor Receptor)의 절단된 형태(truncated form)(ΔLNGFR)로부터 선택되는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 표면 마커가 저신경성장인자수용체의 절단된 형태(ΔLNGFR)인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 표면 마커의 발현이 일시적(transient)인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 표면 마커의 발현이 안정한(stable) 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 관심 유전자 및 상기 외인성 유전자가 동일한 전달(transfer) 벡터에서 발현되는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 관심 유전자 및 상기 외인성 유전자가 별도의(separate) 벡터들에서 발현되는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리간드가 작용제, 길항제, 펩타이드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 항체, 항체 단편, 어피바디(affibody)로부터 선택된 화학적 또는 생체학적 완성체(entity)인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리간드가 상청액으로부터 분리될 수 있는 잔기(moiety)에 연결되는 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 리간드는 자성 비드들에 접합된 항체이며,
복합 항체-바이러스 벡터가 함유된 용액에 자기장을 적용함으로써 분리가 되는 방법.
제11항에 있어서,
상기 자기장을 제거함으로써 정제된 VV를 수득하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복합 항체-바이러스 벡터의 분리가 칼럼 위에서 실시되는 방법.
패키징 세포주에 의해 생성된 바이러스 벡터들의 정제에 사용하기 위한, 패키징 세포주에서 발현된 외인성 세포 표면 마커.
제14항에 있어서,
상기 마커가 CD26, CD36, CD44, CD3, CD25 또는 저신경성장인자수용체의 절단된 형태(ΔLNGFR)로부터 선택되는 외인성 세포 표면 마커.
제14항 또는 제15항에 있어서,
상기 마커가 ΔLNGFR인 외인성 세포 표면 마커.