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KR20140043398A - 인간 제대 조직-유래된 세포 및 하이드로겔을 이용한 추간판 퇴화의 치료 - Google Patents

인간 제대 조직-유래된 세포 및 하이드로겔을 이용한 추간판 퇴화의 치료 Download PDF

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KR20140043398A
KR20140043398A KR1020137033719A KR20137033719A KR20140043398A KR 20140043398 A KR20140043398 A KR 20140043398A KR 1020137033719 A KR1020137033719 A KR 1020137033719A KR 20137033719 A KR20137033719 A KR 20137033719A KR 20140043398 A KR20140043398 A KR 20140043398A
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브라이언 씨. 크레이머
로라 제이. 브라운
안토니 제이. 킴
Original Assignee
디퍼이 신테스 프로덕츠, 엘엘씨
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Abstract

IVD 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 갖는 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 본 방법은 인간 제대 조직으로부터 수득된 세포를 투여하거나, 또는 이러한 세포를 포함하거나 또는 이러한 세포 및 하이드로겔로부터 제조된 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 세포를 투여하면 환자에 있어서 퇴화된 IVD 조직의 복구 및 재생이 촉진된다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 약학 조성물과, 본 방법을 실시하기 위한 키트도 제공된다.

Description

인간 제대 조직-유래된 세포를 이용한 추간판 퇴화의 치료{TREATMENT OF INTERVERTEBRAL DISC DEGENERATION USING HUMAN UMBILICAL CORD TISSUE-DERIVED CELLS}
본 발명은 일반적으로 세포 기반의 치료제 분야에 관한 것이다. 일부 태양에서, 본 발명은 제대 조직-유래된 세포를 사용하여 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 것에 관한 것이다.
특허, 공개된 특허 출원, 기술 논문 및 학술 논문을 비롯한 다양한 간행물이 본 명세서 전체에 걸쳐 인용된다. 이들 인용된 간행물 각각은 전체적으로, 그리고 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참고로 포함된다.
하부 요통은 가장 일반적인 장애 중 하나이며, 침범된 개체에 있어서 상당한 신체적 및 감정적 불편함을 야기한다. 추간판(intervertebral disc; IVD)의 구조의 열화는 하부 요통의 선두적 원인들 중 하나이다. IVD는 더욱 연성의 젤라틴성 수핵을 둘러싸고 있는 섬유질 외부 섬유륜으로 형성된다. 섬유륜의 섬유는 척수의 추체의 종판에 부착되어 수핵을 포획하여 등비중 환경을 생성한다. 축방향 하중 하에서, 수핵은 압축되어 상기 하중을 섬유륜에 방사상으로 전달한다. 섬유륜의 라미네이트되는(laminated) 성질은 이것에 높은 인장 강도를 제공하며, 따라서 이것이 이러한 전달된 하중에 응답하여 방사상으로 확장되게 한다.
건강한 IVD에서, 수핵 내의 세포는 부피 기준으로 디스크 조직의 대략 약 1%만을 형성한다. 이들 세포는 높은 백분율의 프로테오글리칸을 함유하는 세포외 매트릭스(extracellular matrix; ECM)를 생성한다. 프로테오글리칸은 물을 보유하는 설페이트화(sulfated) 작용기를 함유하며, 이럼으로써 수핵에 그의 완충 특성(cushioning quality)을 제공한다. 수핵 세포는 또한 소량의 사이토카인 및 매트릭스 메탈로프로테이나아제(matrix metalloproteinase; MMP)를 분비할 수 있으며, 이는 수핵 세포의 대사의 조절을 돕는다.
IVD 질환의 일부 사례에서, IVD의 점진적인 퇴화는 척추의 다른 부분들에서의 기계적 불안정성에 의해 야기된다. 이들 사례에서, 수핵에 대한 증가된 하중 및 압력은 디스크 내부의 세포 (또는 침입 대식세포)가 정상적인 양보다 더 많은 양의 상기 사이토카인을 방출하게 한다. IVD 질환의 다른 사례에서, 유전 인자 또는 아폽토시스(apoptosis)는 디스크 세포의 수의 감소 및/또는 독성량의 사이토카인 및 MMP의 방출을 야기할 수 있다. 일부 사례에서, 디스크의 펌핑 작용은 (예를 들어, 수핵 내의 프로테오글리칸 농도의 감소로 인하여) 오작동하고, 이럼으로써 디스크 외부로의 노폐물의 유동뿐만 아니라 디스크 내부로의 영양소의 유동도 지연시킬 수 있다. 영양소를 세포에 제공하고 노폐물을 제거하는 능력의 이러한 감소는 세포 생존성 및 대사를 감소시킬 수 있으며, 이는 신경 자극 및 통증을 야기할 수 있는 고수준의 독소의 축적과 함께 ECM을 추가로 분해시킨다.
IVD 퇴화가 진행됨에 따라, 수핵에 존재하는 독성 수준의 사이토카인 및 MMP가 ECM을 분해하기 시작한다. 특히, (사이토카인에 의해 매개되는 바와 같이) MMP가 프로테오글리칸의 수분 보유 부분을 절단하기 시작하고, 이럼으로써 그의 수분 보유 능력을 감소시킨다. 이러한 분해는 가요성이 덜한 수핵에 이르게 되고, 이는 디스크 내에서의 하중 패턴을 변화시키며, 이는 다시 섬유륜의 탈층에 이르게 될 수 있다. 이들 변화는 더 많은 기계적 불안정성을 야기하며, 이는 세포가 더욱 더 많은 사이토카인을 방출하게 하여 MMP를 상향조절할 수 있다. 이러한 파괴적 캐스케이드(cascade)가 계속되고 IVD 퇴화가 진행됨에 따라, 디스크는 팽출되기 시작하고 ("추간판 탈출증"), 그 후 궁극적으로 파열되어, 수핵이 척수와 접촉되게 하고 통증을 생성하게 된다.
현재, IVD 퇴화의 일차적인 치료법으로는 퇴화된 디스크를 절제하거나 또는 이웃하는 디스크와 융합시키는 외과적 개입이 있다. 외과적 치료법은 IVD 퇴화의 통증 및 다른 증상을 완화시키는 것을 목표로 하지만, 병든 IVD를 복구하거나 또는 재생시키는 것은 하지 않는다. 퇴화된 IVD 세포 및 조직을 치료하는 하나의 접근법은 세포 기반의 치료법의 이용이며, 여기서, 살아있는 세포를 투여하여 병든 조직을 복구하고/하거나, 대체하고/하거나 리모델링한다. 몇몇 최근의 연구에서는 퇴화성 IVD 병태의 세포 기반 치료법의 이용이 조사되었다. 예를 들어, 미국 특허 제6,352,557호 ("페리(Ferree)") 및 미국 특허 제6,340,369호 ("페리 II")에는 살아있는 IVD 세포를 환자로부터 수확하는 것, 세포를 배양하는 것 및 상기 세포를 침범된 IVD 내에 이식하는 것이 교시되어 있다. 이와 유사하게, 문헌[Alini, Eur. Spine J., 2002: 11(Supp.2): S215-220]에는 세포를 수핵으로부터 단리 및 배양하고, 상기 세포를 바이오매트릭스(biomatrix) 내에 매립하고, 그 후, 매립된 세포를 환자 내에 주사하여 침범된 IVD의 기능성을 회복시키는 것이 기재되어 있다. 이들 접근법은 유망하기는 하지만, 퇴화된 IVD의 복구에서 한정된 유효성을 나타냈으며, 세포 공여자와 수여자 사이의 면역학적 불상용성에 의해 야기되는 합병증으로 고통 받는다.
대안적인 세포 기반의 치료적 접근법은 줄기 세포의 사용인데, 상기 세포는 병든 조직에 포함되는 세포로 분열 및 분화하는 능력을 갖는다. 줄기 세포의 이식은 표적 조직을 재구성하는 임상 도구로서 이용되고 이럼으로써 생리적인 그리고 해부학적인 기능성을 회복시킬 수 있다. 줄기 세포 기술의 적용은 광범위한 것이며, 이는 조직 엔지니어링(tissue engineering), 유전자 치료적 전달, 및 세포 치료제, 즉, 생물학적 치료제(biotherapeutic agent)를 외래 공급된 살아있는 세포 또는 상기 에이전트를 생성하거나 또는 함유하는 세포 성분을 통하여 표적 위치에 전달하는 것을 포함한다 (개관에 대해서는, 문헌[Tresco, P. A. et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 2000; 42:2-37] 참조). 줄기 세포의 확인은 재생 의약용의 특정 세포 유형의 선택적 생성을 목표로 하는 연구를 촉진하였다. 줄기 세포 기술의 치료적 잠재력의 실현의 하나의 장애물은 충분한 수의 줄기 세포를 얻는 것의 어려움이었다. 배아 또는 태아 조직은 줄기 세포의 하나의 공급원이다. 배아 줄기 세포 및 전구 세포는 인간을 비롯하여 다수의 포유류 종으로부터 단리되었으며, 몇몇의 이러한 세포 유형은 자기재생 및 확장과, 다수의 상이한 세포 계통으로의 분화가 가능한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 배아 및 태아 공급원으로부터의 줄기 세포의 유도는 많은 윤리적인 그리고 도덕적인 쟁점을 불러 일으켰으며, 이는 배아 줄기 세포 치료제의 추가의 개발을 방지하였다.
따라서, 본 기술 분야에서 배아 및 태아 줄기 세포를 둘러싼 상기 쟁점들을 피하는 줄기 세포 기반의 치료제에 대한 필요성이 있다. 분만후 조직, 예를 들어 제대 및 태반이 다능성 또는 만능성 줄기 세포의 대안적인 공급원으로서 관심을 일으켰다. 예를 들어, 태반의 관류 또는 제대 혈액 또는 조직으로부터의 수집에 의한 줄기 세포의 회수 방법이 개시되었다. 이들 방법으로부터의 줄기 세포 조달의 한계는 부적당한 부피의 제대혈 또는 수득된 세포의 양과, 상기 공급원으로부터 수득된 세포 집단에 있어서의 이질성, 또는 상기 세포 집단의 특성의 결여였다.
따라서, 내인성 IVD 세포와 표현형이 유사한 세포로 분화되는 능력을 갖는 줄기 세포의 사실상 균질한 집단의 신뢰성 있는, 특성 확인이 잘 된, 그리고 풍부한 공급이 IVD 세포의 복구, 재생 및/또는 대체를 위한, 그리고 IVD 조직의 재건 및/또는 리모델링을 위한 다양한 진단 응용 및 치료 응용에서 유리할 것이다.
일 태양에서, IVD 퇴화 (IDD)와 관련된 질환 또는 병태의 치료 방법이 본 발명에서 제공된다. 본 방법은 제대 조직-유래된 세포를 상기 질환 또는 병태를 치료하기에 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 세포가 수득되는 제대 조직은 바람직하게는 혈액이 사실상 없다. 제대 조직-유래된 세포는 바람직하게는 배양 중 자기 재생 및 확장이 가능하며, 예를 들어 IVD 세포 표현형으로 분화되는 잠재력을 갖고; 성장을 위하여 L-발린을 필요로 하며; 약 5% 이상의 산소에서 성장할 수 있고; CD117 또는 HLA-DR 또는 텔로머라아제를 생성하지 않으며; 알파 평활근 액틴을 발현하고; 인간 섬유모세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여 증가된 수준의 산화 인터류킨 8 및 레티큘론 1을 발현한다.
다른 태양에서, IVD 퇴화와 관련된 질환 또는 병태 치료용의 약학 조성물이 제공되고, 본 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와, 상기 질환 또는 병태를 치료하기에 효과적인 양의 제대 조직-유래된 세포를 포함하며, 세포가 수득되는 제대 조직은 혈액이 사실상 없고, 상기 세포는 배양 중 자기 재생 및 확장이 가능하며 예를 들어 IVD 세포로의 분화 잠재력을 갖고; 성장을 위하여 L-발린을 필요로 하며; 약 5% 이상의 산소에서 성장할 수 있고; CD117 또는 HLA-DR 또는 텔로머라아제를 생성하지 않으며; 알파 평활근 액틴을 발현하고; 인간 섬유모세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여 증가된 수준의 산화 인터류킨 8 및 레티큘론 1을 발현한다.
다른 태양에 따르면, IVD 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 갖는 환자 치료용의 키트가 제공되고, 본 키트는 IVD 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 있어서 키트 사용에 대한 설명서, 약학적으로 허용가능한 담체, 및 상기 질환 또는 병태를 치료하기에 효과적인 양의 제대 조직-유래된 세포를 포함하며, 세포가 수득되는 제대 조직은 혈액이 사실상 없고, 상기 세포는 배양 중 자기 재생 및 확장이 가능하며 예를 들어 IVD 세포로의 분화 잠재력을 갖고; 성장을 위하여 L-발린을 필요로 하며; 약 5% 이상의 산소에서 성장할 수 있고; CD117 또는 HLA-DR 또는 텔로머라아제를 생성하지 않으며; 알파 평활근 액틴을 발현하고; 인간 섬유모세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여 증가된 수준의 산화 인터류킨 8 및 레티큘론 1을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에서 제공되는 키트는 세포 배양을 위한 적어도 하나의 시약 및/또는 설명서를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에서 제공되는 키트는 세포가 시험관 내에서 예를 들어 수핵 세포 표현형 및/또는 섬유륜 세포 표현형을 나타내는 세포로 적어도 부분적으로 분화되도록 유도하는 것에 대한 설명서를 포함한다.
다양한 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법, 조성물 및/또는 키트에서 사용되는 제대 조직-유래된 세포는 산화된 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3, 및/또는 과립구 주화성 단백질 2를 발현한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 제대 조직-유래된 세포는 CD10, CD13, CD44, CD73 및 CD90을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 제대 조직-유래된 세포는 섬유륜 및/또는 수핵 세포로 분화되는 능력을 갖는다.
다양한 실시 형태에서, IVD 퇴화와 관련된 질환 또는 병태는 연령, 외상, 자가면역, 염증 반응, 유전자 결함, 면역 복합체 침착 및/또는 이들의 조합에 의해 야기되거나 또는 유발될 수 있다. 치료를 목표로 하는 IVD는 온전하거나 또는 임의의 병기의 손상 또는 퇴화일 수 있다. 예를 들어, 치료를 목표로 하는 IVD는 탈출되고/되거나, 파열되고/되거나, 탈층되고/되거나 달리 손상되거나 또는 퇴화될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에서 제공된 방법은 미분화된 제대 조직 유래된 세포 또는 세포 유도체의 투여를 포함한다. 인간 제대 조직 유래된 세포는 사이토카인, 성장 인자, 프로테아제 저해제, 내인성 IVD 선구 세포 또는 전구 세포의 생존, 성장 및 분화를 촉진하는 세포외 매트릭스 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 유익한 영양 인자를 생성한다. 본 명세서에 기재된 영양 인자는 숙주 환경에서, 이식된 인간 제대 조직 유래된 세포에 의해 직접적으로 분비될 수 있다. 영양 인자 또는 다른 세포 유도체는 생체외(ex vivo)에서 인간 제대 조직-유래된 세포로부터 수집되고 후속적으로 환자 내로 도입될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 제대 조직-유래된 세포는 이 세포의 투여 전, 투여 후 또는 투여와 동시에, 시험관 내에서 연골세포 계통의 세포로, 및/또는 섬유륜 세포, 수핵 세포 및/또는 다른 IVD-유사 세포의 표현형을 나타내는 세포로 분화되도록 유도된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 본 발명에서 제공된 방법은 제대 조직-유래된 세포를 시험관 내에서 적어도 부분적으로 분화되도록 유도하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 제대 조직-유래된 세포는 IVD 조직의 복구 및/또는 재생을 촉진하는 유전자 생성물과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 유전자 생성물을 발현하도록 유전자 엔지니어링될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 제대 조직-유래된 세포는 영양 인자 또는 다른 유전자 생성물을 발현하도록 유전자 엔지니어링된다. 일부 실시 형태에서, 유전자 생성물은 영양 효과를 발휘하거나 또는 달리 제대 조직-유래된 세포, 제대 조직-유래된 세포와 함께 투여된 추가의 세포 유형, 내인성 IVD 세포 및/또는 다른 내인성 세포를 조정한다. 일부 실시 형태에서, 유전자 생성물은 세포외 매트릭스의 성분 또는 세포외 매트릭스를 조정하는 에이전트이다. 일부 실시 형태에서, 유전자 생성물은 하나 이상의 세포외 매트릭스 단백질의 발현을 촉진한다.
일부 실시 형태에서, 제대 조직-유래된 세포는 섬유륜 세포, 수핵 세포, 섬유모세포, 연골세포, 중간엽 줄기 세포, 지방 조직 유래된 세포, 또는 다른 다능성 또는 만능성 줄기 세포 유형과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 다른 세포 유형과 함께 투여된다. 상기 적어도 하나의 다른 세포 유형은 제대 조직-유래된 세포와 동시에, 제대 조직-유래된 세포 전에 또는 제대 조직-유래된 세포 후에 투여될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 제대 조직-유래된 세포는 적어도 하나의 에이전트와 함께 투여된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 제대 조직-유래된 세포는 TGF-베타, GDF-5, TIMP-1, 및 PDGF-BB와 같은 그러나 이에 한정되지 않는 영양 인자와 함께 투여된다. 다양한 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 에이전트는 제대 조직-유래된 세포에 대하여 영양 효과를 발휘하거나 또는 달리 제대 조직-유래된 세포, 제대 조직-유래된 세포와 함께 투여된 하나 이상의 추가의 세포 유형, 내인성 IVD 세포 및/또는 다른 내인성 세포를 조정한다. 일부 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 에이전트는 하나 이상의 세포외 매트릭스 단백질의 발현을 촉진한다. 다른 에이전트는 항염증제, 세포 생존제, 통증 감소제 및 면역조정제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 에이전트는 제대 조직-유래된 세포와 동시에, 제대 조직-유래된 세포 전에 또는 제대 조직-유래된 세포 후에 투여될 수 있다.
다양한 태양에서, 세포는 예를 들어 퇴화된 IVD의 수핵 및/또는 섬유륜을 포함하는 IVD 내로 주사에 의해 투여되거나, 투여되도록 지시되거나 또는 투여되도록 제형화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포는 이식가능한 장치 내에 세포가 봉지되도록 또는 세포를 포함하는 장치 또는 매트릭스의 임플란트에 의해 투여되거나, 투여되도록 지시되거나 또는 투여되도록 제형화된다.
본 발명의 다른 실시 형태는 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 적어도 (1) 하이드로겔 및 (2) 인간 제대 조직으로부터 수득되는 단리된 균질한 세포 집단을 포함하는 약학 조성물을 상기 질환 또는 병태를 치료하기에 효과적인 양으로 추간판에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 제대 조직에는 혈액이 사실상 없고, 상기 단리된 균질한 세포 집단은 배양 중 자기 재생 및 확장이 가능하며, 분화 잠재력을 갖고, CD117 및/또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 단리된 균질한 세포 집단은 하기 특성들 중 임의의 것을 추가로 가질 수 있다: (a) 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3 및 과립구 주화성 단백질을 발현하는 것; (b) CD31, CD34 및 HLA-DR을 생성하지 않는 것; (c) 인간 섬유모세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여 증가된 수준의 산화 인터류킨 8 및 레티큘론 1을 발현하는 것; 및 (d) CD10, CD13, CD44, CD73 및 CD90을 발현하는 것. 본 발명의 다른 실시 형태에서, 단리된 균질한 세포 집단은 산화된 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3, 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현한다. 조성물은 주사에 의해 투여될 수 있다. 일 실시 형태에서, 조성물은 (a) (예를 들어 영양 인자와 같은) 적어도 하나의 외인성 유전자 생성물을 발현하도록 엔지니어링될 수 있는 적어도 하나의 다른 세포 유형, 및/또는 (b) 예를 들어 영양 인자(예를 들어 TGF-베타, GDF-5, PDGF-BB 및 TIMP1)와 같은 적어도 하나의 에이전트를 추가로 포함한다. 다른 실시 형태에서, 조성물은 퇴화된 추간판, 예를 들어 추간판의 수핵 내에 또는 섬유륜 내에 투여된다. 단리된 세포 집단은 투여 전에 시험관 내에서 분화되도록 적어도 부분적으로 유도될 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 단리된 균질한 세포 집단은 섬유륜 세포 표현형을 나타내는 세포 또는 수핵 세포 표현형을 나타내는 세포로 분화되도록 유도된다.
본 발명의 또 다른 실시 형태는 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 하이드로겔 및 인간 제대 조직으로부터 수득되는 단리된 균질한 세포 집단을 상기 질환 또는 병태를 치료하기에 효과적인 양으로 추간판에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 제대 조직에는 혈액이 사실상 없고, 상기 단리된 균질한 세포 집단은 배양 중 자기 재생 및 확장이 가능하며, 분화 잠재력을 갖고, CD117 및/또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 단리된 균질한 세포 집단은 하기 특성들 중 임의의 것을 추가로 가질 수 있다: (a) 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3 및 과립구 주화성 단백질을 발현하는 것; (b) CD31, CD34 및 HLA-DR을 생성하지 않는 것; (c) 인간 섬유모세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여 증가된 수준의 산화 인터류킨 8 및 레티큘론 1을 발현하는 것; 및 (d) CD10, CD13, CD44, CD73 및 CD90을 발현하는 것. 다른 실시 형태에서, 단리된 균질한 세포 집단은 산화된 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3, 및 과립구 주화성 단백질을 발현한다. 하이드로겔 및 단리된 균질한 세포 집단은 주사에 의해 투여될 수 있다. 하이드로겔은 인간 제대 조직으로부터 수득되는 상기 단리된 균질한 세포 집단과 동시에, 또는 그 전에, 또는 그 후에 투여된다. 일 실시 형태에서, 단리된 균질한 세포 집단은 이식가능한 장치 내에 투여된다. 다른 실시 형태에서, 본 방법은 적어도 하나의 다른 세포 유형을 인간 제대 조직으로부터 수득되는 상기 단리된 균질한 세포 집단과 동시에, 또는 그 전에, 또는 그 후에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 적어도 하나의 다른 세포 유형은 적어도 하나의 외인성 유전자 생성물 (예를 들어 하나 이상의 세포외 매트릭스 단백질의 발현을 조정하는 외인성 유전자 생성물 또는 영양 인자)을 발현하도록 엔지니어링될 수 있다.
본 방법은 인간 제대 조직으로부터 수득되는 단리된 균질한 세포 집단에 대하여 영양 효과를 발휘할 수 있는, 예를 들어 영양 인자 (예를 들어 TGF-베타, GDF-5, PDGF-BB 및 TIMP1)와 같은 적어도 하나의 에이전트의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 단리된 균질한 세포 집단 및 하이드로겔은 퇴화된 추간판, 예를 들어 추간판의 수핵 또는 추간판의 섬유륜 내에 투여된다. 다른 실시 형태에서, 인간 제대 조직으로부터 수득되는 상기 단리된 균질한 세포 집단은 시험관 내에서 적어도 부분적으로 분화되도록 유도된다. 단리된 균질한 세포 집단은 섬유륜 세포 표현형을 나타내는 세포 또는 수핵 세포 표현형을 나타내는 세포로 분화되도록 유도될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 형태에서, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 하이드로겔을 상기 질환 또는 병태를 치료하기에 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하는 것이 있다. 본 기술 분야에 공지된 임의의 하이드로겔 (예를 들어, 본 명세서에 개시된 것)이 이 방법에 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 하이드로겔은 피브리노겐 및 트롬빈을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 하이드로겔은 예를 들어 에비셀(EVICEL)(등록상표) 피브린 글루(fibrin glue) (에비셀(등록상표) 피브린 밀봉제 (인간), 옴릭스 파마슈티칼즈, 리미티드(Omrix Pharmaceuticals, Ltd.)와 같은 피브린 글루를 포함한다.
본 발명의 상기 및 다른 특징들과 이점들은 첨부 도면에 도시된 바와 같은 본 발명의 바람직한 실시예들의 하기의 보다 구체적인 설명으로부터 명백할 것이다.
전술한 발명의 내용과, 본 발명의 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시하기 위하여, 도면은 본 발명의 실시 형태들을 보여준다. 그러나, 본 발명이 도시된 정확한 배열, 예 및 수단에 한정되지 않음을 이해하여야 한다.
<도 1 및 도 2>
도 1 및 도 2는 요추 MRI (실시예 12 참조)를 나타낸다. 정중시상면 T2 가중 MRI는 대조군에서 건강하게 보이는 디스크를 나타낸다. 천자된 군에서의 디스크는 퇴화를 겪는다 (흑화 및 높이 손실). 처리된 군의 디스크는 천자된 군에서의 디스크보다 덜한 퇴화 증거를 겪는다. 특히, 도 1 및 도 2는 0(륜 천자(annular puncture) 이전), 3주(주사 수술 이전), 6주 및 12주(희생 이전)의 시점에서 L1-2 내지 L5-6의 샘플 T2 가중 정중시상면 요추 MRI 영상을 나타낸다. 천자된 디스크(L2-3, L3-4, 및 L4-5)는 박스에 의해 외곽선을 나타낸다 (상부로부터 하부로 L2-3, L3-4, 및 L4-5). 천자되지 않은 대조 디스크(L1-2 및 L5-6)는 어떠한 퇴화 증거도 나타내지 않는다. 대조 시편의 디스크는 예상되는 바와 같이, 퇴화되지 않았다 (도 1a). 천자된 디스크 (도 1b)는 시점들에 걸쳐서 더욱 작아지고 더욱 어두워지게 되며, 이는 퇴화를 시사한다. 천자되고, 그 후 담체 (도 1c), 세포 + 완충제 (도 2a), 및 세포 + 담체 (도 2b)로 처리된 디스크는 천자된 디스크 (도 1b)와 비교하여 시점들에 걸쳐서 덜한 퇴화 증거를 보여준다.
<도 3>
도 3은 T2 가중 MRI (디스크 면적 및 MRI 인덱스)를 나타낸다 (실시예 12 참조). 특히, 0의 시점의 값의 퍼센트로서 표현되는, 각각의 토끼 군에 있어서 L2-3, L3-4, 및 L4-5 (처리된 디스크)를 조합한 평균 NP MRI 면적 (도 3a) 및 MRI 인덱스 (도 3b)는 천자된 군이 시점들에 걸쳐서 면적 및 인덱스의 최대 감소를 겪는 반면, 천자되고 후속적으로 담체, 완충제 중 세포 (B+C), 또는 담체 중 세포 (C+C)로 처리된 군은 면적 및 인덱스의 더욱 적은 감소를 겪음을 보여준다. 도 3에서, ‡는 대조군과 비교한 유의도를 나타내며, *는 천자된 것과 비교한 유의도를 나타낸다. 또한, 도 3에서 MRI 인덱스는 하기와 같이 결정된다:
MRI 인덱스 = NP 면적 × 신호 강도
<도 4>
도 4는 12주 후 포팅된(potted) L3-4 FSU의 정규화된 표준 전체 대체 (램프기(ramp phase) + 크리프(creep)) 곡선을 나타낸다 (실시예 12 참조). 일정 하중 하에서의 시간 의존적 치환은 특유하게 보이는 크리프 곡선을 생성한다. 완충제 + 세포는 오히려 천자된 것에 가깝게 거동하며, 담체 + 세포는 오히려 대조군에 가깝게 거동하며, 담체 단독은 그 사이의 어딘가에 있다. 평균 크리프 곡선을 각각의 조건에 대하여 생성하였다. 축 시험은 초기 시험 시기(0 내지 200초의 시간)에서 특유하게 보이는 크리프 곡선을 생성한다. 점으로 된 경계는 측정의 표준 오차를 나타낸다. 대조군 및 담체 + 세포에 대하여 곡선을 생성한 바와 같이, 천자 및 완충제 + 세포에 대하여 곡선을 생성하였다. 이들 군 각각은 담체 군에 대하여 생성된 곡선과는 별개로 보인다.
<도 5, 도 6 및 도 7>
도 5, 도 6 및 도 7은 각각의 처리군에 있어서 12주에서의 희생 후 수득되고, H&E로 염색되고, 20배 및 100배로 확대된 디스크 L4-5의 조직학적 시상 슬라이스를 나타낸다 (실시예 12 참조). 도 5a는 대조군에 있어서 디스크 L4-5의 조직학적 시상 슬라이스를 나타낸다. 도 5b는 천자 군에 있어서 디스크 L4-5의 조직학적 시상 슬라이스를 나타낸다. 도 6a는 담체 군에 있어서 디스크 L4-5의 조직학적 시상 슬라이스를 나타낸다. 도 6b는 완충제 및 세포 군에 있어서 디스크 L4-5의 조직학적 시상 슬라이스를 나타낸다. 도 7은 담체 및 세포 군에 있어서 디스크 L4-5의 조직학적 시상 슬라이스를 나타낸다.
본 발명의 방법 및 다른 태양과 관련된 다양한 용어가 본 명세서 및 특허청구범위 전체에 걸쳐 사용된다. 이러한 용어는 달리 나타내지 않으면 본 기술 분야에서의 그의 일상적인 의미로 주어진다. 다른 특정하게 정의된 용어는 본 명세서에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석된다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"라는 지시 대상은 2개 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 측정가능한 값, 예를 들어 양, 일시적인 지속 기간 등을 말할 때 용어 "약"은 특정한 값으로부터 ± 20% 또는 ± 10%, 더 바람직하게는 ± 5%, 더욱 더 바람직하게는 ± 1%, 그리고 더욱 더 바람직하게는 ± 0.1%의 편차를 포함하며, 그 이유는 이러한 편차가 개시된 방법을 수행하는 데 적절하기 때문이다.
"유래된"은 세포가 그의 생물학적 공급원으로부터 수득되어 성장되거나, 배양 중 확장되거나, 불사화되거나, 또는 달리 시험관 내에서 조작되었음을 나타내는 데 사용된다.
"단리된"은 "사람의 손으로" 천연 상태로부터 변경됨을 의미한다. 분자 또는 조성물이 자연에서 나타날 경우, 이것이 그의 원래 환경으로부터 변화되었거나 또는 꺼내졌거나, 또는 이들 둘 모두였다면, 이것은 "단리"되었다.
핵산 분자 또는 유전자의 "발현하다", "발현된" 또는 "발현"이라는 용어는 유전자 생성물의 생합성, 예를 들어 폴리펩티드의 생합성을 말한다.
"영양 인자"는 세포의 생존, 성장, 분화, 증식 및/또는 성숙을 촉진하거나 또는 세포의 생물학적 활성 증가를 자극하는 물질이다. 세포 유도체는 세포로부터 수득될 수 있는 임의의 물질이며, 세포 조절 배지, 세포 용해물, 세포외 매트릭스 단백질, 영양 인자, 세포 분획, 세포 막을 포함한다.
"퇴화"는 IVD에 대한 임의의 신체적 위해, 상해, 퇴화 또는 외상을 말한다.
"병상(pathology)"은 본 기술 분야에서 적합한 임의의 수단에 의해 측정할 때, 세포, 조직, 기관 또는 시스템의 정상 상태로부터의 임의의 구조적 또는 기능적 일탈 징후를 말한다.
"질환"은 본 기술 분야에서 적합한 임의의 수단에 의해 측정할 때, 대체로 세포, 조직, 기관, 시스템, 또는 유기체의 건강, 상태, 또는 기능으로부터의 임의의 일탈 또는 그의 장애이다.
"치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 증상의 경감, 완화, 감소와 같은, 또는 질환, 손상 또는 병태가 환자가 더욱 견딜 만한 것이 되게 하거나, 퇴화 또는 쇠퇴 속도를 늦추거나, 퇴화의 최종점이 심신 쇠약을 덜 하게 만들거나, 또는 대상의 신체적 또는 정신적 웰빙(well-being)을 향상시키는 임의의 객관적인 또는 주관적인 파라미터를 비롯한, 질환, 손상 또는 병태의 약화 또는 개선의 임의의 성공 또는 성공 징후를 말한다. 증상의 치료 또는 개선은 객관적인 또는 주관적인 파라미터를 기반으로 할 수 있으며; 이는 신체 검사, 신경학적 검사 및/또는 정신 감정의 결과를 포함한다.
"효과적인 양" 또는 "치료적으로 효과적인 양"은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 본 명세서에 개시되거나, 기재되거나 또는 예시된 생물학적 결과와 같은 그러나 이에 한정되지 않는 특정한 생물학적 결과를 성취하기에 효과적인 것으로 본 명세서에 기재된 화합물, 물질 또는 조성물의 양을 말한다. 이러한 결과는 본 기술 분야에서 적합한 임의의 수단에 의해 결정할 때, 대상에서의 IVD 질환 또는 손상의 치료를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
"약학적으로 허용가능한"은 약리학적/독물학적 관점에서 환자에게 허용가능하고 조성물, 제형, 안정성, 환자 용인 및 생물학적 이용가능성과 관련하여 물리적/화학적 관점에서 제조 약사에게 허용가능한 특성 및/또는 물질을 말한다. "약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분(들)의 생물학적 활성의 유효성을 간섭하지 않으며 이것이 투여되는 숙주에게 유독하지 않은 매질을 말한다.
추간판(IVD) 퇴화와 관련된 질환 및 병태는 본 명세서에 기재된 바와 같이 제대 조직-유래된 세포를 투여함으로써 치료될 수 있음이 발견되었다. 유리하게는, 본 명세서에 제공된 방법, 조성물 및 키트는 퇴화된 IVD의 복구 및 재생을 촉진하며, 이럼으로써 IVD 퇴화와 결부된 하나 이상의 증상을 완화시킨다. 따라서, 일 태양에서, IVD 퇴화와 관련된 질환 또는 병태의 치료 방법이 제공되며, 이는 제대 조직-유래된 세포를 상기 질환 또는 병태를 치료하기에 충분한 양으로 IVD에 투여하는 단계를 포함한다.
다양한 실시 형태에서, IVD 퇴화와 관련된 질환 또는 병태는 연령, 외상, 자가면역, 염증 반응, 유전자 결함, 면역 복합체 침착 (예를 들어, 반흔 조직의 형성) 및/또는 이들의 조합에 의해 야기되거나 또는 유발될 수 있다. 치료를 목표로 하는 IVD는 온전하거나 또는 임의의 병기의 손상 또는 퇴화일 수 있다. 예를 들어, 치료를 목표로 하는 IVD는 탈출되고/되거나 (예를 들어, 섬유륜의 일부분이 팽출 또는 다른 돌출을 가짐), 파열되고/되거나 (예를 들어, 섬유륜의 적어도 일부분이 파열되어 수핵의 압력 및/또는 부피의 감소로 이어짐), 탈층되고/되거나 (예를 들어, 섬유륜의 2개 이상의 층이 분리됨) 달리 손상되거나 퇴화될 수 있다 (예를 들어, 섬유륜이 열구, 금(crack), 인열 등을 갖고/갖거나, 세포외 매트릭스가 분해되거나 또는 변경됨).
다양한 실시 형태에서, 제대 조직-유래된 세포는 예를 들어 매트릭스-세포 복합체로서 이식하거나, 임플란트하거나, 주사하거나 또는 제공함에 의해, 주사에 의해, 또는 세포 치료법을 제공하기 위한 본 기술 분야에 공지된 임의의 다른 수단에 의해, 퇴화된 IVD에 투여된다. 일부 실시 형태에서, 세포는 IVD의 섬유륜 및/또는 수핵에 직접적으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 세포는 IVD에 간접적으로 투여된다. 예를 들어, 세포는 수성 담체 중에 존재하거나, 장치 내에 봉지되거나, 또는 매트릭스 내에 접종될 수 있으며, 이는 그 후 퇴화된 IVD 내에 또는 그 근처에 이식된다. 수성 담체는 생리학적 완충액, 예를 들어 완충 염수, 인산염 완충 염수, 행크 균형 염 용액(Hank's balanced salts solution), 트리스 완충 염수(Tris buffered saline), 및 헤페스 완충 염수(Hepes buffered saline)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다양한 실시 형태에서, 장치, 매트릭스 또는 다른 세포 저장체(depot)는 이것이 섬유륜의 외벽에 부착되거나, 섬유륜의 벽 외부에 그러나 그에 인접하여 위치하거나, 또는 IVD를 둘러싸고 있는 추체의 종판에 인접하여 위치되도록 이식될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 세포는 매트릭스-세포 복합체와 같은 장치의 형태로 투여된다. 장치 재료는 생체 재흡수성 재료, 예를 들어 콜라겐, 35/65 폴리(엡실론-카프로락톤)(PCL)/폴리(글리콜산) (PGA), 파나크릴(PANACRYL)™ 생체 흡수성 제작물, 비크릴(VICRYL)™ 폴리글락틴 910, 및 자기-조립 펩티드 및 비-재흡수성 재료, 예를 들어 플루오로중합체 (예를 들어, 테플론(TEFLON)(등록상표) 플루오로중합체), 플라스틱 및 금속을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 매트릭스는 생체흡수성이든지 아니든지 간에 생체적합성 스캐폴드(scaffold), 격자, 자기-조립 구조체 등, 액체, 겔 또는 고체를 포함한다. 이러한 매트릭스는 치료적 세포 치료, 외과적 복구, 조직 엔지니어링 및 창상 치유 분야에 공지되어 있다. 바람직하게는, 매트릭스는 치료적 세포로 전처리된다. 더 바람직하게는, 매트릭스는 매트릭스 또는 그 공간에 긴밀하게 결부된 세포가 거주한다. 세포는 매트릭스에 유착될 수 있거나 또는 매트릭스 공간 내에 포획되거나 또는 함유될 수 있다. 세포가 매트릭스와 긴밀하게 결부되어 성장 중이고, 치료적으로 사용될 때, 환자 그 자신의 IVD 세포의 성장, 복구 및/또는 재생이 촉진 및 지지되고, 적당한 혈관신생이 유사하게 촉진되거나 지지되는 매트릭스-세포 복합체가 가장 바람직하다. 매트릭스-세포 조성물은 본 기술 분야에 공지된 임의의 방식으로 환자의 신체 내에 도입될 수 있으며, 이는 주입, 주사, 외과적 부착, 다른 조직을 이용한 이식 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 생체 내 또는 더욱 더 바람직하게는 원위치의 매트릭스 형태, 예를 들어 원위치 중합성 겔이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 이러한 겔의 예는 본 기술 분야에 공지되어 있다.
일 실시 형태에서, 제대 조직-유래된 세포는 하이드로겔을 포함하는 조성물의 일부로서 퇴화된 IVD에 투여된다. 다른 실시 형태에서, 제대 조직-유래된 세포는 하이드로겔과 함께 퇴화된 IVD에 투여된다.
본 명세서에 기재된 세포는 또한 3차원 매트릭스, 예를 들어 스캐폴드 상에 접종되고, 생체 내 이식될 수 있는데, 여기서 접종된 세포는 상기 프레임워크(framework) 상에서 또는 프레임워크 내에서 증식하거나, 또는 다른 세포의 협력을 이용하거나 또는 이용하지 않고서 생체 내에서 대체 조직을 확립하는 것을 도울 수 있다. 3차원 프레임워크 상에서의 제대 조직-유래된 세포의 성장은 바람직하게는 3차원 조직의 형성, 또는 이의 토대로 이어지며, 이는 예를 들어 손상된 또는 병든 조직의 복구 및/또는 재생을 위하여 생체 내에서 이용될 수 있다.
세포는 3차원 프레임워크 또는 매트릭스, 예를 들어 스캐폴드, 폼, 정전기적 스펀(electrostatically spun) 스캐폴드, 부직 스캐폴드, 다공성 또는 비다공성 미세 미립자, 또는 하이드로겔 상에 접종되고 그에 따라 투여될 수 있다. 프레임워크는 다양한 형상, 예를 들어 사실상 평평하거나, 사실상 원통형 또는 관형으로 구성될 수 있거나, 또는 완전히 자유로운 형태일 수 있는데, 이는 고려 중인 교정 구조체에 필요하거나 또는 요구될 수 있는 바와 같다. 2개 이상의 사실상 평평한 프레임워크는 다른 것 위에 놓여지고, 필요할 경우 함께 고정되어 다층 프레임워크를 생성할 수 있다.
이러한 3차원 프레임워크 상에서, 세포는 다른 세포 유형, 또는 줄기 세포를 포함하는 다른 연조직 유형의 선구체와 함께 동시 투여될 수 있다. 3차원 시스템에서 성장될 때, 증식 중인 세포는 적당하게 성숙 및 분리되어 생체 내에서 자연적으로 발견되는 대응물과 유사한 성체 조직의 성분을 형성할 수 있다.
본 명세서에 기재되고 예시된 매트릭스는 매트릭스 구조체가 후속적인 분해 없이 제대 조직-유래된 세포를 지지하거나, 조직 이식체가 숙주 조직에 의해 리모델링될 때까지 접종 시점으로부터 세포를 지지하거나, 또는 접종된 세포가 부착되게 하고, 증식되게 하고, 시험관 내에서 그 자신을 지지하기에 충분한 기계적 완전성을 갖는 조직 구조로 발달하게 하도록 디자인될 수 있는데, 상기 시점에서 매트릭스는 분해된다.
본 발명에서의 사용용으로 고려되는 매트릭스, 스캐폴드, 예를 들어, 폼, 부직물, 정전기적 스펀 구조체, 미세 미립자 및 자기-조립 시스템은 본 발명의 세포에 더하여, 임의의 하나 이상의 세포, 성장 인자, 약물, 또는 다른 성분, 예를 들어 조직의 치유, 재생, 복구, 또는 내부 성장(in-growth)을 촉진하거나, 또는 이의 혈관 형성 또는 신경 분포를 자극하거나 또는 달리 본 발명의 실시 또는 치료 결과를 향상시키거나 또는 개선시키는 생물활성제와 조합되어 이식될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 세포는 배양 중 자유롭게 성장하고, 배양물로부터 꺼내지고, 3차원 프레임워크 상에 접종될 수 있다. 1 밀리리터당 예를 들어 대략 106 내지 5 × 107개의 세포의 농도로 3차원 프레임워크를 접종하면 바람직하게는 상대적으로 더 짧은 기간 후에 3차원 지지체가 확립된다. 더욱이, 일부 응용에서, 요구되는 결과에 따라 다소간의 수의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 태양에서, 세포가 생체 내에서 체내 이식 전에 성장하거나 또는 시험관 내에서 사용되는 정도가 달라질 수 있도록, 배양 중, 생체 내에서 발견되는 세포 미세 환경을 재생성하는 것이 유용하다. 세포는 체내 이식에 요구되는 형상, 예를 들어 로프, 튜브, 필라멘트 등을 형성하기 전 또는 후에 프레임워크 상에 접종될 수 있다. 프레임워크 상에의 세포의 접종 이후, 프레임워크는 바람직하게는 적절한 성장 배지에서 인큐베이션된다. 인큐베이션 기간 동안, 접종된 세포는 성장하여 프레임워크를 감쌀 것이며, 예를 들어 그 안의 임의의 사이 공간을 가교시키거나 또는 부분적으로 가교시킬 수 있다. 세포를 적절한 정도로 성장시키는 것이 바람직하지만, 이는 필요한 것은 아닌데, 이는 복구되거나 또는 재생되는 조직의 생체 내 세포 밀도를 반영한다. 다른 실시 형태에서, 프레임워크 상의 심지어 적은 수의 세포의 존재는 내인성의 건강한 세포의 내부 성장을 장려하여 예를 들어 손상되거나 또는 상해를 입은 조직의 치유를 용이하게 한다.
본 발명의 태양에 사용될 수 있는 매트릭스, 예를 들어 스캐폴드의 예예는 매트, 다공성 또는 반다공성 폼, 자기-조립 펩티드 등이 포함된다. 부직 매트는 예를 들어 천연 또는 합성 중합체로 이루어진 섬유를 사용하여 형성될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 상표명 비크릴™ (미국 뉴저지주 서머빌 소재의 에티콘, 인크.(Ethicon, Inc.))로 판매되는 글리콜산과 락트산의 흡수성 공중합체(PGA/PLA)를 사용하여 매트를 형성한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,355,699호에 논의된 바와 같이, 냉동 건조 또는 동결 건조와 같은 방법에 의해 형성되는 폴리(엡실론-카프로락톤)/폴리(글리콜산)(PCL/PGA) 공중합체로 구성된 폼이 또한 스캐폴드로서의 역할을 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 겔이 또한 적합한 매트릭스를 형성한다. 겔의 예에는 주사가능한 겔, 원위치 중합성 겔 및 하이드로겔이 포함되며; 겔은 자기-조립 펩티드로 구성될 수 있다. 이들 재료는 조직의 성장을 위한 지지체로서 빈번하게 사용된다. 예를 들어, 주사가능한 겔로서 사용될 때, 겔은 물, 염수 또는 생리학적 완충액 및 겔화 물질로 이루어질 수 있다. 겔화 물질은 단백질, 예를 들어 콜라겐, 엘라스틴, 트롬빈, 피브로넥틴, 젤라틴, 피브린, 트로포엘라스틴, 폴리펩티드, 라미닌, 프로테오글리칸, 피브린 글루, 피브린 응괴(fibrin clot), 혈소판 풍부 혈장(platelet rich plasma; PRP) 응괴, 혈소판 결핍 혈장(platelet poor plasma; PPP) 응괴, 자기-조립 펩티드 하이드로겔 및 아텔로콜라겐; 다당류, 예를 들어 펙틴, 셀룰로오스, 산화된 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 아가로스, 하이알루론산; 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 리보핵산, 데옥시리보핵산, 및 다른 것, 예를 들어 알기네이트, 가교결합된 알기네이트, 폴리(N-아이소프로필아크릴아미드), 폴리(옥시알킬렌), 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드)의 공중합체, 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴레이트, 모노스테아로일 글리세롤 코-석시네이트/폴리에틸렌 글리콜(MGSA/PEG) 공중합체 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일 실시 형태에서, 겔화 물질(즉, 하이드로겔)은 피브리노겐(인자 I), 예를 들어 재조합 피브리노겐 또는 혈액으로부터 정제된 피브리노겐을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 하이드로겔은 피브리노겐 및 트롬빈을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 겔은 에비셀(등록상표) 피브린 글루(에비셀(등록상표) 피브린 밀봉제 (인간), 옴릭스 파마슈티칼즈, 리미티드) (BAC2 (피브리노겐) 및 트롬빈)이다.
일반적으로, 하이드로겔은 특유한 3차원 구조를 유지하면서 물에서 그의 중량의 20% 초과를 흡수할 수 있는 가교결합된 중합체 물질이다. 게다가, 하이드로겔은 산소, 영양소 및 다른 수용성 대사 산물에 대하여 높은 투과성을 갖는다. 이 정의는 수-팽윤된 물질 뿐만 아니라 수성 환경에서 팽윤될 건조 가교결합 중합체도 포함한다. 친수성 중합체의 호스트(host)는, 상기 중합체가 생물학적 기원의 것이든지, 반합성 중합체이든지 또는 전체적 합성 중합체이든지 간에, 하이드로겔을 생성하도록 가교결합될 수 있다. 하이드로겔은 합성 중합체 물질로부터 생성될 수 있다. 이러한 합성 중합체는 일련의 특성 및 예측가능한 로트-투-로트(lot-to-lot) 균일성이 되도록 맞추어질 수 있으며, 일반적으로 면역원성에 대한 염려가 없는 물질의 신뢰성 있는 공급원을 대표할 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 하이드로겔은 개시 내용이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,670,483호 및 미국 특허 제5,955,343호, 미국 특허 공개 제2002/0160471호, 국제특허 공개 WO 02/062969호에서 논의된 것과 같이 자기-조립 펩티드로부터 형성된다.
본 발명에서 하이드로겔이 매트릭스로서 특히 가치 있게 만드는 특성은 평형 팽윤도, 흡착 동역학, 용질 투과도, 및 하이드로겔의 생체 내 성능 특성을 포함한다. 화합물에 대한 투과성은 부분적으로는 팽윤도 또는 수분 함량 및 생물 분해 속도에 따라 달라진다. 겔의 기계적 특성은 팽윤도에 직접적으로 비례하여 감소하기 때문에, 하이드로겔을 기재에 부착시킬 수 있어서 상기 복합 시스템이 기계적 강도를 향상시키도록 하는 것이 또한 충분히 본 발명의 고려 이내이다. 대안적인 실시 형태에서, 하이드로겔은 하이드로겔의 유용한 전달 특성과 함께, 기재의 기계적 강도를 얻기 위하여, 다공성 기재 내에 함침될 수 있다.
원위치-형성 분해성 네트워크가 또한 본 발명에서 사용하기에 적합하다 (예를 들어, 문헌[Anseth, K.S. et al., J. Controlled Release, 2002; 78:199-209]; 문헌[Wang, D. et al., Biomaterials, 2003; 24:3969-3980]; 헤(He) 등의 미국 특허 공개 제2002/0022676호 참조). 이들 물질은 주사에 적합한 유체로서 제형화되며, 그 후 다양한 수단 (예를 들어, pH, 온도 변화, 광에의 노출)에 의해 원위치에서 또는 생체 내에서 분해가능한 하이드로겔 네트워크를 형성하도록 유도될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 프레임워크는 생체흡수성 재료, 예를 들어 PGA, PLA, PCL 공중합체 또는 블렌드, 또는 하이알루론산으로 만들어진 다중필라멘트 얀으로 이루어질 수 있는 펠트일 수 있다. 얀은 권축, 절단, 카딩(carding) 및 니들링(needling)으로 이루어진 표준 텍스타일 가공 기술을 이용하여 펠트로 만들어진다. 본 발명의 세포는 복합 구조체일 수 있는 폼 스캐폴드 상에 접종될 수 있다. 게다가, 3차원 프레임워크는 복구되거나, 대체되거나 또는 증대될 IVD 내에서 또는 그 주위에서 특정 구조체와 같은 유용한 형상으로 성형될 수 있다.
프레임워크는 세포 부착을 향상시키기 위하여 본 발명의 세포의 접종 이전에 처리될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포로 접종하기 이전에, 나일론 매트릭스는 0.1 몰랄의 아세트산으로 처리되고, 폴리라이신, PBS, 및/또는 콜라겐 중에서 인큐베이션하여 나일론을 코팅할 수 있다. 폴리스티렌을 황산을 이용하여 유사하게 처리할 수 있다.
게다가, 3차원 프레임워크의 외부 표면은 프레임워크의 플라스마 코팅 또는 하나 이상의 단백질 (예를 들어, 콜라겐, 탄성 섬유, 세망 섬유), 당단백질, 글리코사미노글리칸 (예를 들어, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 더마탄 설페이트, 케라틴 설페이트), 세포 매트릭스 및/또는 특히 젤라틴, 알기네이트, 한천, 아가로스, 식물성 검과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 다른 물질의 부가에 의한 것과 같이, 세포의 부착 또는 성장 및 조직의 분화가 개선되도록 개질될 수 있다.
스캐폴드는 스캐폴드가 혈전-비형성성이 되게 하는 물질로 이루어지거나 또는 상기 물질로 처리될 수 있다. 이들 처리제 및 물질은 또한 내피 성장, 이동 및 세포외 매트릭스 침착을 촉진하고 지속시킬 수 있다. 이들 물질 및 처리제의 예에는 천연 물질, 예를 들어 기저막 단백질, 예를 들어 라미닌 및 제IV형 콜라겐, 합성 물질, 예를 들어 ePTFE, 및 세그먼트형(segmented) 폴리우레탄우레아 실리콘, 예를 들어 푸르스판(PURSPAN)(등록상표) (미국 캘리포니아주 버클리 소재의 더 폴리머 테크놀로지 그룹, 인크.(The Polymer Technology Group, Inc.))이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이들 물질은 스캐폴드가 혈전-비형성성이 되도록 추가로 처리될 수 있다. 이러한 처리제는 항혈전제, 예를 들어 헤파린, 및 플라스마 코팅과 같이 물질의 표면 전하를 변경시키는 처리제를 포함한다.
예를 들어 프레임워크 상에 침착된 상이한 비율의 다양한 유형의 콜라겐은 조직 특이적 세포 또는 다른 세포 - 이는 이후에 프레임워크 상에 접종될 수 있거나 또는 생체 내에서 상기 구조체 상에서 성장할 수 있음 - 의 성장에 영향을 줄 수 있다. 대안적으로, 프레임워크는 요구되는 적절한 콜라겐 유형을 합성하는 세포들의 혼합물로 접종될 수 있다. 배양할 조직에 따라, 프레임워크 상에 접종될 또는 그 위에 접종된 세포에 의해 생성될 적절한 콜라겐 유형은 선택될 수 있다. 예를 들어, 프레임워크 내에 존재하는 콜라겐 및 탄성 섬유의 상대적인 양은 초기 접종물에서 엘라스틴-생성 세포에 대한 콜라겐-생성 세포의 비를 제어함으로써 조정될 수 있다.
접종되거나 또는 이노큘레이션된(inoculated) 본 발명의 3차원 프레임워크는 매트릭스로부터 수득된 배양된 세포 또는 생체 내에서의 배양된 매트릭스 그 자신의 이식 또는 체내 이식을 위한 것일 수 있다. 본 발명에 따르면, 3차원 스캐폴드를 이용하여 기존의 조직을 대체하거나 또는 증대시키거나, 새로운 또는 변경된 조직을 도입하거나, 인공 삽입물을 변경시키거나, 또는 생물학적 조직들 또는 구조체들을 함께 연결시킬 수 있다.
일부 실시 형태에서, 세포는 니들, 예를 들어 작은 내경(bore)의 니들을 통하여 IVD 내로 투여될 (예를 들어 주사될) 수 있다. 일부 실시 형태에서, 니들은 약 22 게이지 이하의 내경을 가져서, IVD를 탈출할 가능성을 경감시킨다. 부피를 수핵 내로 주사할 때, 전달될 약물의 부피는 약 3 ml 이하, 바람직하게는 약 1 ml 이하, 더 바람직하게는 약 0.1 내지 약 0.5 ml인 것이 바람직하다. 이러한 더욱 적은 양으로 주사될 때, 부가된 부피는 수핵 내에서 감지가능한 압력 증가를 야기하지 않을 것으로 믿어진다. 제형의 직접적 주사 부피가 수핵을 과다가압한다는 염려를 야기하기에 충분히 높다면, 수핵의 적어도 일부분을 직접적 주사 이전에 제거하는 것이 바람직하다. 일부 실시 형태에서, 제거되는 수핵의 부피는 주사될 제형의 부피와 사실상 유사하다. 예를 들어, 제거되는 수핵의 부피는 주사될 제형의 부피의 약 80-120% 이내일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제대 조직-유래된 세포는 투여되기 전에 농축된다.
본 발명에서 제공된 방법, 조성물 및 키트에서 유용한 세포는 만기 임신 또는 조산 임신시에 또는 그 종료 직후에, 예를 들어 출산 후 축출 이후에 또는 제왕 절개 후 외과적 제거 이후에 회수되는 포유류 제대로부터 유래될 수 있다. 혈액 및 잔사는 세포의 단리 이전에, 예를 들어 임의의 적합한 배지 또는 완충제를 이용한 세척에 의해 제대 조직으로부터 제거된다.
세포는 기계력에 의해 또는 효소적 소화에 의해 제대 조직으로부터 단리될 수 있다. 바람직한 효소는 메탈로프로테아제, 중성 프로테아제 및 뮤코다당류 분해(mucolytic) 프로테아제이다. 예를 들어, 콜라게나아제, 디스파아제 및 하이알루로니다아제의 다양한 조합을 이용하여 세포를 제대 조직으로부터 해리시킬 수 있다. 당업자라면, 많은 이러한 효소 처리제가 다양한 조직 공급원으로부터의 세포 단리용으로 본 기술 분야에 공지되어 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 리버라아제(LIBERASE)(등록상표) 블렌드자임(Blendzyme) (로슈(Roche)) 시리즈의 효소 조합은 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합하다. 효소의 다른 공급원이 공지되어 있으며, 당업자라면 또한 이러한 효소를 그의 천연 공급원으로부터 직접적으로 수득할 수 있다. 또한 당업자라면 새로운, 또는 추가의 효소 또는 효소 조합을 본 발명의 세포의 단리에 있어서의 그 유용성에 대하여 평가하는 데 준비가 잘 되어 있다. 바람직한 효소 처리제는 0.5, 1, 1.5, 또는 2시간 걸리거나, 또는 이보다 더 길다.
단리된 세포를 사용하여 세포 배양을 개시할 수 있다. 단리된 세포를 세포외 매트릭스 또는 리간드, 예를 들어 라미닌, 콜라겐 (천연, 변성, 아텔로(atello), 또는 가교결합), 젤라틴, 피브로넥틴, 및 다른 세포외 매트릭스 단백질로 코팅되거나 비코팅된 살균 조직 배양 용기로 옮긴다. 제대 조직-유래된 세포는 DMEM (고 또는 저 글루코스), 고등(advanced) DMEM, DMEM/MCDB 201, 이글 기본 배지(Eagle's basal medium), 햄 F10 배지(Ham's F10 medium; F10), 햄 F-12 배지(F12), 헤이플릭 배지(Hayflick's Medium), 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's modified Dulbecco's medium), 중간엽 줄기 세포 성장 배지(MSCGM), DMEM/F12, RPMI 1640, 및 셀-그로-프리(CELL-GRO-FREE)와 같은 그러나 이에 한정되지 않는, 세포의 성장을 지속시킬 수 있는 임의의 배양 배지에서 배양된다. 배양 배지에는 예를 들어 소 태아 혈청, 바람직하게는 약 2-15% (v/v); 말 혈청; 인간 혈청; 송아지 태아 혈청; 베타-메르캅토에탄올, 바람직하게는 약 0.001% (v/v); 하나 이상의 성장 인자, 예를 들어, 혈소판-유래된 성장 인자(platelet-derived growth factor; PDGF), 상피 성장 인자(epidermal growth factor; EGF), 섬유모세포 성장 인자(fibroblast growth factor; FGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 인슐린-유사 성장 인자-1(insulin-like growth factor-1; IGF-1), 백혈구 저해 인자(leukocyte inhibitory factor; LIF) 및 에리트로포이에틴; L-발린을 포함하는 아미노산; 및 예를 들어 단독의 또는 조합된 페니실린 G, 스트렙토마이신 설페이트, 암포테리신 B, 젠타마이신 및 니스타틴과 같은 미생물 오염 제어를 위한 하나 이상의 항생제 및/또는 항진균제를 포함하는 하나 이상의 성분이 보충될 수 있다.
세포는 세포 성장을 허용하는 밀도로 배양 용기에 접종된다. 일 실시 형태에서, 세포는 공기 중 약 0 내지 약 5 부피%의 CO2에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 세포는 공기 중 약 2 내지 약 25%의 O2, 바람직하게는 공기 중 약 5 내지 약 20%의 O2에서 배양된다. 바람직하게는 세포는 약 25 내지 약 40℃에서 배양되며, 더 바람직하게는 37℃에서 배양된다. 배양 용기 중 배지는 정적이거나 또는 예를 들어 생물반응기를 이용하여 교반될 수 있다. 제대 조직-유래된 세포는 바람직하게는 낮은 산화 스트레스 (예를 들어, 글루타티온, 비타민 C, 카탈라아제, 비타민 E, N-아세틸시스테인의 첨가에 의해) 하에 성장되며, 이는 배양 세포에 대한 자유 라디칼 손상이 전혀 없거나 또는 최소임을 의미한다.
제대 조직-유래된 세포는 처음에 사용된 것과 동일하거나 또는 상이한 유형의 신선한 배지를 함유하는 별도의 배양 용기로 계대되거나 또는 옮겨질 수 있으며, 여기서, 세포 집단은 유사 분열에 의해 확장될 수 있다. 본 발명의 세포는 계대 0 내지 노쇠기의 임의의 시점에서 사용될 수 있다. 세포는 바람직하게는 약 3 내지 약 25회 계대되며, 더 바람직하게는 약 4 내지 약 12회 계대되며, 바람직하게는 10 또는 11회 계대된다. 클로닝 및/또는 서브클로닝을 수행하여 세포의 클론 집단이 단리되었음을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 세포는 미세 담체 상에서 성장될 (확장될) 수 있다. 미립담체는 배양 중 고정 의존성 세포의 부착 및 성장에 유용한 입자, 비드 또는 펠렛이다. 미립담체는 중실이거나, 다공성이거나 또는 다공성 코팅을 갖는 중실 코어일 수 있다. 예시적인 적합한 미립담체에는 사이토덱스(Cytodex) 1(등록상표), 사이토덱스 2(등록상표), 사이토덱스 3(등록상표) (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 지이 헬스케어 라이프 사이언시즈(GE Healthcare Life Sciences)) 또는 힐렉스(HILLEX)(등록상표) (미국 미시간주 앤 아버 소재의 솔로힐 엔지니어링, 인크.(SoloHill Engineering, Inc.))가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 적합한 미립담체 및 미립담체 구성요소는 미국 특허 공개 제2008/0166328호에 개시되어 있으며, 그 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
제대 조직에 존재하는 상이한 세포 유형은 하위 집단으로 분획화될 수 있다. 이는 효소 처리; 특정 세포 유형의 클로닝 및 선발, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만 형태적 및/또는 생화학적 마커를 기반으로 한 선발; 요구되는 세포의 선택적 성장 (양성 선발), 원하지 않는 세포의 선택적 파괴 (음성 선발); 예를 들어 대두 응집소에서와 같이 혼합된 집단에서 차별적 세포 응집성을 기반으로 한 분리; 동결-해동 절차; 혼합된 집단에서의 세포의 차별적 유착 특성; 여과; 통상적인 띠 원심분리; 원심 세정 (역류 원심분리(counter-streaming centrifugation)); 단위 중력 분리(unit gravity separation); 역류 분배; 전기영동; 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting; FACS) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 표준 세포 분리 기술을 이용하여 달성될 수 있다.
제대 조직으로부터 단리된 세포의 예는 2004년 6월 10일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 기탁되었으며, 다음과 같이 ATCC 등록 번호가 할당되었다: (1) 주(strain) 표기명 UMB 022803 (P7)은 등록 번호 PTA-6067이 할당되었으며; (2) 주 표기명 UMB 022803 (P17)은 등록 번호 PTA-6068이 할당되었다.
제대 조직-유래된 세포는 예를 들어 성장 특성 (예를 들어, 집단 배가 능력, 배가 시간, 노쇠기까지의 계대), 핵형 분석 (예를 들어, 정상 핵형; 모성 또는 신생 계통), 유세포 분석법 (예를 들어, FACS 분석법), 면역조직화학적 및/또는 면역세포화학적 검사법 (예를 들어, 에피토프 검출을 위한 것), 유전자 발현 프로파일링 (예를 들어, 유전자 칩 어레이(array); 폴리머라아제 연쇄 반응 (예를 들어, 역전사 효소 PCR, 실시간 PCR 및 통상적인 PCR)), 단백질 어레이, 단백질 분비 (예를 들어, 혈장 응고 분석 또는 PDC-조절 배지의 분석에 의해, 예를 들어 효소 결합된 면역흡착 분석법(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA)에 의해), 혼합 림프구 반응 (예를 들어, PBMC의 자극의 척도로서), 및/또는 본 기술 분야에 공지된 다른 방법에 의해 특성 확인될 수 있다.
다양한 태양에서, 제대 조직-유래된 세포는 하기 성장 특징들 중 하나 이상을 갖는다: 배양 중 성장을 위하여 L-발린을 필요로 함; 약 5% 내지 적어도 약 20%의 산소를 함유하는 분위기에서 성장할 수 있음; 노쇠기에 도달하기 전에 배양 중 약 40회 이상의 배가 잠재력을 가짐; 및/또는 젤라틴, 라미닌, 콜라겐, 폴리오르니틴, 비트로넥틴 또는 피브로넥틴의 코팅을 포함하는 코팅된 조직 배양 용기 또는 비코팅된 조직 배양 용기 상에 부착되어 확장됨.
일부 실시 형태에서, 세포는 정상 핵형을 가지며, 이는 세포가 계대됨에 따라 유지된다. 핵형 분석(karyotyping)은 태반으로부터 유래된 모성 세포로부터 신생 세포를 확인하고 구별하는 데 특히 유용하다. 핵형 분석 방법은 당업자가 이용가능하며, 당업자에게 공지되어 있다.
일부 실시 형태에서, 세포는 소정 단백질의 생성에 의해 특징지워질 수 있으며, 이는 조직 인자, 비멘틴 및 알파-평활근 액틴 중 적어도 하나의 생성; CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-알파, PD-L2 및 HLA-A,B,C 세포 표면 마커 중 적어도 하나의 생성을 포함하는데, 이것은 예를 들어 유세포 분석법에 의해 검출되는 바와 같다. 다른 실시 형태에서, 세포는 유세포 분석법과 같은 임의의 적합한 수단에 의해 검출되는 바와 같이, CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G, 및 HLA-DR, HLA-DP, 및/또는 HLA-DQ 세포 표면 마커 중 적어도 하나의 생성의 결여를 특징으로 할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조직 인자, 비멘틴 및 알파-평활근 액틴 중 2가지 이상을 생성하는 세포가 바람직하다. 일부 실시 형태에서, 모든 3가지의 단백질, 조직 인자, 비멘틴 및 알파-평활근 액틴을 생성하는 세포가 바람직하다.
일부 실시 형태에서, 본 세포는 섬유모세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포인 인간 세포에 비하여, 인터류킨 8; 레티큘론 1; 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (흑색종 성장 촉진 활성, 알파); 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 6 (과립구 주화성 단백질 2); 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 3; 종양 괴사 인자, 알파-유도 단백질 3 중 적어도 하나를 코딩하는 유전자의 증가된 발현을 갖는다.
또 다른 실시 형태에서, 본 세포는 섬유모세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포인 인간 세포에 비하여, 쇼트 스태쳐 호메오박스(short stature homeobox) 2; 열충격 27 kDa 단백질 2; 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (간질 세포-유래된 인자 1); 엘라스틴 (판상부대동맥협착증, 윌리암스-보이렌 증후군(Williams-Beuren syndrome)); 호모 사피엔스(Homo sapiens) mRNA; cDNA DKFZp586M2022 (클론 DKFZp586M2022 유래의 것); 간엽 호메오 박스 2 (성장 정지-특이적 호메오 박스); 사인 오쿨리스 호메오박스(sine oculis homeobox) 상동체 1 (드로소필라(Drosophila)); 크리스탈린(crystallin), 알파 B; 디쉐벨드 어소시에이티드 액티베이터 오브 모포게네시스(disheveled associated activator of morphogenesis) 2; DKFZP586B2420 단백질; 시밀러 투 뉴랄린(similar to neuralin) 1; 테트라넥틴 (플라스미노겐 결합 단백질); src 호몰로지 3(src homology three; SH3) 및 시스테인 풍부 도메인; 콜레스테롤 25-하이드록실라아제; runt-관련 전사 인자 3; 인터류킨 11 수용체, 알파; 프로콜라겐 C-엔도펩티다아제 인핸서(enhancer); 프리즐드 상동체(frizzled homolog) 7 (드로소필라); 가상 유전자 BC008967; 콜라겐, 제VIII형, 알파 1; 테나신 C (헥사브라키온); 이로쿼이(iroquois) 호메오박스 단백질 5; 헤파에스틴; 인테그린, 베타 8; 시냅스 소포 당단백질 2; 신경모세포종, 종양 형성 억제 1; 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2, 36kDa; 호모 사피엔스 cDNA FLJ12280 fis, 클론 MAMMA1001744; 사이토카인 수용체-유사 인자 1; 칼륨 중간체/작은 전도도의 칼슘-활성화 채널, 하위 패밀리 N, 구성원 4; 인테그린, 베타 7; PDZ-결합 모티프를 갖는 전사 동시 활성자 (TAZ); 사인 오쿨리스 호메오박스 상동체 2 (드로소필라); KIAA1034 단백질; 소포-결부된 막 단백질 5 (미오브레빈); EGF-함유 피불린-유사 세포외 매트릭스 단백질 1; 초기 성장 응답 3; 디스탈-레스 호메오박스(distal-less homeo box) 5; 가상 단백질 FLJ20373; 알도-케토 리덕타아제 패밀리 1, 구성원 C3 (3-알파 하이드록시스테로이드 데하이드로게나아제, 제II형); 바이글리칸; PDZ-결합 모티프를 갖는 전사 동시 활성자 (TAZ); 피브로넥틴 1; 프로엔케팔린; 인테그린, 베타-유사 1 (EGF-유사 반복 도메인을 포함함); 호모 사피엔스 mRNA 전장 인서트 cDNA 클론 유로이미지(EUROIMAGE) 1968422; EphA3; KIAA0367 단백질; 나트륨이뇨 펩티드 수용체 C/구아닐레이트 사이클라아제 C (심방 나트륨이뇨 펩티드 수용체 C); 가상 단백질 FLJ14054; 호모 사피엔스 mRNA; cDNA DKFZp564B222 (클론 DKFZp564B222 유래의 것); BCL2/아데노바이러스 E1B 19kDa 상호작용 단백질 3-유사; AE 결합 단백질 1; 및 사이토크롬 c 옥시다아제 서브유닛 VIIa 폴리펩티드 1 (근육) 중 적어도 하나를 코딩하는 유전자의 감소된 발현을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 세포는 MCP-1, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1b, RANTES, 및 TIMP1 중 적어도 하나의 분비를 특징으로 할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포는 ELISA에 의해 검출할 때, TGF-베타2, ANG2, PDGFbb, MIP1a 및 VEGF 중 적어도 하나의 분비의 결여를 특징으로 할 수 있다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 세포는 상기에 열거된 성장, 단백질/표면 마커 생성, 유전자 발현 또는 물질-분비 특성 중 2가지 이상을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 특성들 중 3가지, 4가지 또는 5가지 이상을 포함하는 세포가 바람직하다. 일부 실시 형태에서, 상기 특성들 중 6가지, 7가지 또는 8가지 이상을 포함하는 세포가 바람직하다. 일부 실시 형태에서, 상기 특성 전부를 포함하는 세포가 바람직하다. 다른 실시 형태에서, 제대-유래된 세포는 미국 특허 제7,510,873호 및 미국 특허 제7,524,489호에 개시된 특성들 중 임의의 것을 가지며, 상기 미국 특허의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명의 다양한 태양에서 사용하기에 바람직한 세포 중에는 상기에 기재된 특성을 갖는 세포, 그리고 더욱 특히는 정상 핵형을 가지며 계대에 의해 정상 핵형을 유지하는 세포, 및 추가로 마커 CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-알파, 및 HLA-A,B,C 각각을 발현하는 세포가 있으며, 여기서 세포는 열거된 마커에 상응하는 면역학적으로 검출가능한 단백질을 생성한다. 또한, 전술한 것에 더하여, 유세포 분석법과 같은 본 기술 분야에서 적합한 임의의 수단에 의해 검출할 때, 마커 CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, 또는 HLA-DR,DP,DQ 중 임의의 것에 상응하는 단백질을 생성하지 않는 세포가 바람직하다. CD117 또는 HLA-DR 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는 세포가 매우 바람직하다.
일부 바람직한 태양에서, 방법은 인간 제대 조직으로부터 수득되거나 또는 단리된 세포를 퇴화된 IVD에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 배양 중 자기-재생 및 확장이 가능하고, 성장을 위하여 L-발린을 필요로 하며, 약 5% 이상의 산소에서 성장할 수 있고, CD117 또는 HLA-DR 또는 텔로머라아제를 생성하지 않으며, 알파 평활근 액틴을 발현하고, 인간 섬유모세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포에 비하여 증가된 수준의 인터류킨 8 및 레티큘론 1을 발현한다. 인간 제대 조직으로부터 단리된 세포는 투여 이전에 배양 중 확장될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 인간 제대 조직으로부터 수득된 세포는 섬유륜 세포 표현형 또는 수핵 세포 표현형과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 IVD 표현형의 세포로 분화되는 잠재력을 갖는다. 제대 조직-유래된 세포는 환자의 IVD 내로 통합될 수 있거나, 또는 대안적으로, 천연적으로 존재하는 IVD 줄기 세포에 대하여 분화되도록 자극 또는 성장의 지지를 제공할 수 있다. 투여된 세포의 생존은, IVD 퇴화와 관련된 질환 또는 병태 및/또는 종합적인 환자 건강의 개선이 있는 상기 세포의 사용의 성공 또는 결과를 결정하는 것은 아니다. 일부 실시 형태에서, 세포는 환자에 있어서 적어도 부분적으로 통합되거나, 번식하거나 또는 생존한다. 일부 실시 형태에서, 환자는 당해 치료법에서, 예를 들어 IVD 및/또는 주위 조직에 존재하는 줄기 세포 또는 전구 세포를 비롯한 다른 세포의 성장을 지지하는 세포의 능력에서, 조직 내부 성장 또는 조직의 혈관 형성에서, 및/또는 유익한 세포 인자, 케모카인, 사이토카인 등의 존재에서 이득을 경험하지만, 세포는 환자에서는 통합되지 않거나 또는 번식하지 않는다. 일부 태양에서, 환자는 본 세포를 이용한 치료적 치료에서 이득을 얻지만, 세포는 환자에 있어서 장시간 동안 생존하지 못한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 세포는 점진적으로 수, 생존능 또는 생화학적 활성이 감소한다. 일부 실시 형태에서, 이러한 감소는 활성의 기간, 예를 들어 성장, 분열 또는 생화학적 활성의 뒤에 올 수 있다. 일부 실시 형태에서, 노쇠 세포, 생존가능하지 않은 세포 또는 심지어 죽은 세포도 유익한 치료 효과를 가질 수 있다.
다양한 표현형에 이르게 되는 방식으로 분화되는 잠재력을 갖는 소정 세포는 불안정하며, 따라서 자발적으로 분화될 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 자발적으로 분화되지 않는 세포가 바람직하다. 예를 들어, 성장 배지에서 성장시킬 때, 일부 바람직한 세포는 그 표면 상에서 생성되는 세포 마커와 관련하여, 그리고 다양한 유전자의 발현 패턴과 관련하여 사실상 안정한데, 예를 들어 이는 예를 들어 핵산 또는 폴리펩티드 어레이를 사용한 유전자 발현 프로파일링을 이용하여 결정되는 바와 같다. 이러한 세포는 다수의 집단 배가를 통하여 계대시에 예를 들어 그 표면 마커 특성이 사실상 일정하게 남아 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에서 제공되는 방법은 IVD 세포 경로를 따라서 IVD 세포 표현형, 또는 전술한 것의 선구체 또는 더욱 원시적인 친척 쪽으로의 제대 조직-유래된 세포의 분화를 유도한다. 제대 조직-유래된 세포는 환자의 IVD 내로 통합될 수 있거나, 또는 대안적으로, 천연적으로 존재하는 IVD 줄기 세포에 대하여 분화되도록 자극 또는 성장의 지지를 제공할 수 있다. 투여된 세포의 생존은, IVD 퇴화와 관련된 질환 또는 병태 및/또는 종합적인 환자 건강의 개선이 있는 상기 세포의 사용의 성공 또는 결과를 결정하는 것은 아니다. 일부 실시 형태에서, 세포는 환자에 있어서 적어도 부분적으로 통합되거나, 번식하거나 또는 생존한다. 일부 실시 형태에서, 환자는 당해 치료법에서, 예를 들어 IVD 및/또는 주위 조직에 존재하는 줄기 세포 또는 전구 세포를 비롯한 다른 세포의 성장을 지지하는 세포의 능력에서, 조직 내부 성장 또는 조직의 혈관 형성에서, 및/또는 유익한 세포 인자, 케모카인, 사이토카인 등의 존재에서 이득을 경험하지만, 세포는 환자에서는 통합되지 않거나 또는 번식하지 않는다. 일부 태양에서, 환자는 본 세포를 이용한 치료적 치료에서 이득을 얻지만, 세포는 환자에 있어서 장시간 동안 생존하지 못한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 세포는 점진적으로 수, 생존능 또는 생화학적 활성이 감소한다. 일부 실시 형태에서, 이러한 감소는 활성의 기간, 예를 들어 성장, 분열 또는 생화학적 활성의 뒤에 올 수 있다. 일부 실시 형태에서, 노쇠 세포, 생존가능하지 않은 세포 또는 심지어 죽은 세포도 유익한 치료 효과를 가질 수 있다.
일부 태양에서, 본 발명의 방법은 IVD의 구조 및/또는 기능의 개선 및/또는 종합 건강의 개선에 대하여 환자를 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 평가는 본 명세서에 기재되고 예시된 것을 비롯하여 본 기술 분야에서 적합한 임의의 수단에 따라 진행될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 제대 조직-유래된 세포는 다른 다능성 또는 만능성 세포, 또는 연골세포, 연골모세포, 골세포, 조골세포, 파골세포, 골 표면 세포(bone lining cell), 또는 골수 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 다른 세포 유형과 함께 투여된다. 상이한 유형의 세포는 투여 직전에 제대 조직-유래된 세포와 혼합될 수 있거나, 또는 이들은 투여 이전에 소정의 기간 동안 함께 동시 배양될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제대 조직-유래된 세포의 집단은 제대 조직-유래된 세포와 함께 투여되는 하나 이상의 다른 세포 유형의 생존, 증식, 성장, 유지, 성숙, 분화 및/또는 증가된 활성을 지지하고/하거나 그 역도 또한 같다.
일부 실시 형태에서, 제대 조직-유래된 세포는 그와 함께 투여되는 다른 세포 유형에 영양적 지지를 제공하고/하거나, 그 역도 또한 같다. 일부 실시 형태에서, 제대 조직-유래된 세포 및 동시 배양 세포는 접촉한 상태로 있는 것이 바람직하다. 이는 예를 들어 적합한 배양 기재 상에 또는 배양 배지 내에 이종 세포 집단으로서 세포를 접종함으로써 성취될 수 있다. 대안적으로, 제대 조직-유래된 세포를 먼저 융합(confluence)까지 성장시키고, 동시 배양 세포를 위한 기재로서 이용할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 동시 배양 세포는 제대 조직-유래된 세포의 세포 용해물, 세포외 매트릭스 및/또는 조절 배지와 접촉한 상태로 배양될 수 있다.
다양한 실시 형태에서, 제대 조직-유래된 세포는 생물학적 활성제, 예를 들어 증식, 분화 및/또는 다른 세포 활성을 조정하는 에이전트와 함께 투여될 수 있다. 에이전트는 제대 조직-유래된 세포 전에, 그 후에 또는 그와 동시에 투여될 수 있다. 선택되는 특정 에이전트는 환자의 치료를 지시하는 전문 의료진의 재량대로일 수 있으며, 환자의 특정한 필요성 또는 상태에 따라 달라질 수 있다. 선택된 에이전트는 세포의 투여를 용이하게 하는 것, IVD의 복구 및/또는 재생을 향상시키는 것, 환자의 종합 건강을 개선시키는 것, 통증을 감소시키는 것, 이식된 세포의 거부를 감소시키거나 또는 방지하는 것 등과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 다양한 목적에 사용될 수 있다.
제대 조직-유래된 세포와 함께 투여될 수 있는 에이전트의 예에는 비타민 및 다른 영양 보충제; 항혈전제; 항아폽토시스제(anti-apoptotic agent); 항염증제; 면역억제제 (예를 들어, 사이클로스포린, 라파마이신); 산화방지제; 호르몬; 당단백질; 피브로넥틴; 펩티드 및 단백질; 탄수화물 (단순 및/또는 복합); 프로테오글리칸; 올리고뉴클레오티드 (센스 및/또는 안티센스 DNA 및/또는 RNA); 골형성 단백질(bone morphogenetic protein; BMP); 분화 인자; 항체 (예를 들어, 감염 에이전트, 종양, 약물 또는 호르몬에 대한 항체); 및 유전자 치료법용 시약이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 에이전트는 IVD 퇴화와 관련된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 완화시키는 진통제, 항염증제, 진정제, 근육 이완제 또는 이들의 조합과 같은 물질이다.
일부 실시 형태에서, 추가의 에이전트는 제대 조직-유래된 세포에 대하여, 제대 조직-유래된 세포와 함께 투여되는 추가의 세포에 대하여, 내인성 IVD 세포 (예를 들어, 섬유륜 세포, 수핵 세포)에 대하여, 및/또는 다른 내인성 세포 (예를 들어, 결합 조직 전구 세포)에 대하여 영양 효과를 발휘하는 다른 에이전트 또는 영양 인자이다. 일부 실시 형태에서, 영양 인자는 제대 조직-유래된 세포에 의해 분비되는 것이며, 이 경우, 영양 인자는 이러한 제대 조직-유래된 세포의 제제로부터 또는 다른 공급원으로부터 유래될 수 있다. 이러한 인자 또는 에이전트의 예에는 산성 및 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-1 및 FGF-2) 및 FGF-4를 포함하는 섬유모세포 성장 인자 패밀리의 구성원; PDGF-AB, PDGF-BB 및 PDGF-AA를 포함하는 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF) 패밀리의 구성원; IGF-I 및 -II를 포함하는 인슐린-유사 성장 인자(IGF) 패밀리의 구성원, EGF; 케라틴 세포 성장 인자, 간세포 성장 인자, 엔도텔린, 안지오게닌(들), 유골-유도 인자(osteoid-inducing factor; OIF) 및 TGF-베타1, 2 및 3 (MP-52를 포함함)을 포함하는 TGF-베타 수퍼패밀리; 골형성 단백질(BMP) 패밀리의 구성원, 예를 들어 BMP-1, BMP-3, BMP-2, OP-1, BMP-2A, BMP-2B, BMP-4, BMP-7 및 BMP-14; HBGF-1 및 HBGF-2; 성장 분화 인자(growth differentiation factor; GDF); 인도(indian), 소닉(sonic) 및 사막(desert) 헤지호그(hedgehog)를 포함하는 헤지호그 패밀리의 단백질의 구성원; ADMP-1; GDF-5; TIMP-1과, CSF-1, G-CSF, 및 GM-CSF를 포함하는 콜로니 자극 인자(colony-stimulating factor; CSF) 패밀리의 구성원; 및 이들의 유사체 및 아이소형(isoform)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 성장 인자는 TGF-베타, TGF-베타1, FGF, bFGF 및 IGF-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 성장 인자는 수핵의 재생을 촉진하고, 연골세포의 증식 및/또는 분화를 자극하고, 세포외 매트릭스 분비를 촉진하는 것으로 믿어진다. 일부 실시 형태에서, 성장 인자는 TGF-베타이다. 더 바람직하게는, TGF-베타는 약 10 ng/ml 내지 약 5000 ng/ml, 예를 들어 약 50 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 예를 들어 약 100 ng/ml 내지 약 300 ng/ml의 양으로 투여된다.
일부 실시 형태에서, 혈소판 농축물이 추가의 치료제로서 제공된다. 일부 실시 형태에서, 혈소판 농축물은 자가 혈소판 농축물이다. 일부 실시 형태에서, 혈소판 농축물은 혈소판 풍부 혈장(PRP)이다. PRP는, 이것이 ECM의 성장을 재자극할 수 있는 성장 인자를 함유하기 때문에, 그리고 그의 피브린 매트릭스가 새로운 조직의 성장에 적합한 스캐폴드를 제공하기 때문에 유리하다. 일부 실시 형태에서, 추가의 에이전트는 세포 용해물, 용해성 세포 분획, 막-풍부화된 세포 분획, 세포 배양 배지 (예를 들어, 조절 배지), 또는 제대 조직-유래된 세포 또는 다른 세포로부터 유래된 세포외 매트릭스이다.
일부 실시 형태에서, 제대 조직-유래된 세포는 HMG-CoA 리덕타아제 저해제와 함께 투여되며, 이는 심바스타틴, 프라바스타틴, 로바스타틴, 플루바스타틴, 세리바스타틴 및 아토르바스타틴을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 제대 조직-유래된 세포는 본 명세서에 기재된 추가의 치료제들 중 하나 이상과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 에이전트를 발현하도록 유전자 엔지니어링된다. 본 발명의 세포는 임의의 다양한 벡터를 사용하여 엔지니어링될 수 있으며, 상기 벡터는 통합 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터; 비통합 복제 벡터, 예를 들어 파필로마 바이러스 벡터, SV40 벡터, 아데노바이러스 벡터; 또는 복제-결함 바이러스 벡터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. DNA를 세포 내로 도입하는 다른 방법은 리포좀, 전기천공, 입자 총(particle gun)의 사용 또는 직접적 DNA 주입에 의한 것을 포함한다.
숙주 세포는 바람직하게는 선발가능 마커, 및 특히 프로모터 또는 인핸서 서열, 전사 종결 서열, 폴리아데닐화 부위와 같은 하나 이상의 적절한 발현 조절 요소에 의해 조절되는 또는 상기 발현 조절 요소와 작동적으로 결부된 DNA로 형질전환되거나 또는 형질감염된다.
외래 DNA의 도입 이후, 엔지니어링된 세포를 풍부화된 배지에서 성장시키고, 그 후 선발 배지로 스위칭할 수 있다. 외래 DNA 내의 선발가능 마커는 선발에 대한 내성을 부여하며, 세포가 예를 들어 플라스미드 상에서와 같이 외래 DNA를 그의 염색체 내에 안정하게 통합시키고 성장하여 세포소(foci)를 형성하게 하는데, 이는 다시 클로닝되고 세포주로 확장될 수 있다. 이 방법은 유리하게는 세포주의 엔지니어링에 사용될 수 있는데, 상기 세포주는 유전자 생성물을 발현한다.
삽입된 유전자의 발현을 구동시키기 위하여 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 프로모터는 CMV 프로모터/인핸서, SV40, 파필로마바이러스, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 또는 엘라스틴 유전자 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 관심대상의 유전자의 발현의 조절에 사용되는 조절 요소는, 생성물이 생체 내에서 필요할 때에만 합성되도록 유전자의 조절된 발현을 허용하여야 한다. 일시적 발현이 요구될 경우, 바람직하게는 구성적(constitutive) 프로모터가 비통합 및/또는 복제-결함 벡터에서 사용된다. 대안적으로, 필요할 경우, 삽입된 유전자의 발현을 구동시키기 위하여 유도성 프로모터가 사용될 수 있다. 유도성 프로모터는 메탈로티오네인 및 열충격 단백질과 결부된 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 세포는 이식 부위에서 염증 또는 거부를 촉진하는 인자의 발현을 "넉아웃(knock out)" 또는 "넉다운(knock down)"시키도록 유전자 엔지니어링될 수 있다. 표적 유전자 발현 수준 또는 표적 유전자 생성물 활성 수준을 감소시키는 음성 조정 기술은 하기에 논의되어 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "음성 조정"은 조정적 처리의 부재 하에서의 표적 유전자 생성물의 수준 및/또는 활성에 비하여 표적 유전자 생성물의 수준 및/또는 활성의 감소를 말한다. 유전자의 발현은 예를 들어 상동 재조합 기술을 사용한 유전자의 완전한 불활성화 (일반적으로 "넉아웃"으로 칭해짐)에 의한 발현의 저해를 비롯한 다수의 기술을 이용하여 감소되거나 또는 넉아웃될 수 있다. 일반적으로, 단백질의 중요한 영역을 코딩하는 엑손 (또는 상기 영역에 대하여 5'인 엑손)은 양성 선발가능 마커, 예를 들어 neo가 개재되며, 이는 표적 유전자로부터의 정상 mRNA의 생성을 방지하여 이 유전자를 불활성화시킨다. 또한 유전자는 유전자의 일부에서의 결실의 생성에 의해 또는 전체 유전자의 결실에 의해 불활성화될 수 있다. 게놈 내의, 멀리 떨어져 있는, 표적 유전자에 대하여 상동성인 두 영역을 포함하는 제작물을 사용함으로써, 상기 두 영역에 개재된 서열을 결실시킬 수 있다 (문헌[Mombaerts et al., Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1991; 88:3084-3087]).
또한, 표적 유전자의 발현을 저해하는 안티센스, 작은 간섭 RNA, DNAzyme, 및 리보자임 분자가 표적 유전자 활성의 수준의 감소를 위하여 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 주요 조직적합성 유전자 복합체(histocompatibility gene complexes; HLA)의 발현을 저해하는 안티센스 RNA 분자는 면역 응답과 관련하여 가장 다재다능한 것으로 밝혀졌다. 또한 추가로, 삼중 나선 분자가 표적 유전자 활성 수준의 감소에서 이용될 수 있다.
이들 및 다른 기술은 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[L. G. Davis et al. (eds),Basic Methods In Molecular Biology, 2nd ed., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. (1994)]에 상세하게 기재되어 있다.
IL-1은 연골세포에 의한 염증 매개자의 생성의 그리고 연골 재흡수의 강력한 자극제이다 (문헌[Campbell et al., J. Immun., 1991; 147(4):1238-1246]). 전술한 기술들 중 임의의 것을 사용하여, IL-1의 발현을 본 발명의 세포에서 넉아웃시키거나 또는 넉다운시켜 본 발명의 세포에 의한 염증 매개자의 생성 또는 이식된 연골의 재흡수의 위험을 감소시킬 수 있다. 이와 마찬가지로, MHC 클래스 II 분자의 발현은 이식된 조직의 거부의 위험을 감소시키기 위하여 넉아웃되거나 또는 넉다운될 수 있다.
일단 본 발명의 세포가 유전자 엔지니어링되었으면, 이 세포를 환자 내로 직접적으로 이식하여 IVD 퇴화와 관련된 질환 또는 병태의 치료를 허용할 수 있으며, 이는 예를 들어 상기 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상에 대하여 치료 효과를 갖는 생성물, 예를 들어 항염증성 유전자 생성물을 생성함에 의한 것이다. 대안적으로, 유전자 엔지니어링된 세포를 사용하여 시험관 내에서 새로운 조직을 생성할 수 있으며, 이는 그 후 대상 내에 이식되고, 이는 본 명세서에 기재된 바와 같다.
일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 제대 조직-유래된 세포와, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 본 발명에서 제공되는 약학 조성물은 제대 조직-유래된 세포가 IVD 세포 경로 또는 계통을 따라 분화되도록, 예를 들어 수핵 세포 표현형 및/또는 섬유륜 세포 표현형을 나타내도록 유도될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에서 제공되는 약학 조성물은 내인성 IVD 세포 및/또는 주위 조직의 세포의 세포 과정을 조정하며, 상기 세포 과정은 세포 분열, 분화 및 유전자 발현을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에서 제공되는 약학 조성물은 퇴화된 IVD의 복구 및 재생을 촉진한다.
또한 본 발명에 따르면 본 발명의 방법을 실시하는 키트를 특징으로 한다. 일 태양에서, 적어도 하나의 IVD의 질환 또는 상기 IVD에 대한 손상을 갖는 환자를 치료하는 키트가 제공된다. 본 키트는 약학적으로 허용가능한 담체, 본 명세서에 기재되고 예시된 세포와 같은, 질환 또는 병태를 치료하기에 효과적인 양으로 인간 제대 조직으로부터 수득된 세포, 및 IVD 퇴화의 질환 또는 상기 퇴화와 관련된 병태를 갖는 환자를 치료하는 방법에서의 키트의 사용 설명서를 포함한다. 본 키트는 세포 배양을 위한 적어도 하나의 시약 및 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 본 키트는 적어도 하나의 다른 세포 유형의 집단 및/또는 적어도 하나의 에이전트를 추가로 포함할 수 있다.
일부 태양에서, 본 키트는 약학적으로 허용가능한 담체, 인간 제대 조직으로부터 수득된 세포로부터 제조된 조절 배지, 세포외 매트릭스 또는 용해물을 포함하는데, 상기 세포는 본 명세서에 기재되고 예시된 특성을 갖는다. 본 키트는 손상되거나 병든 IVD의 복구 및/또는 재생을 용이하게 하는 데 유용성을 갖는다.
하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위하여 제공된다. 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것으로서, 본 발명을 한정하고자 하는 것이 아니다. 부가적으로, 하기 실시예 및 본 명세서의 다른 곳에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 방법에서 유용한 제대 조직-유래된 세포는 전체적으로 참고로 포함된 미국 특허 제7,510,873호 및 미국 특허 제7,524,489호에 따라 단리되고 특성 확인될 수 있으며, 그 이유는 상기 미국 특허들이 제대 조직-유래된 세포의 설명, 단리 및 특성 확인에 관련되기 때문이다.
실시예 1
제대 조직-유래된 세포의 단리
제대를 NDRI(National Disease Research Interchange, 미국 펜실베이니아주 필라델피아 소재)로부터 획득하였다. 조직을 정상 분만 후 획득하였다. 세포 단리 프로토콜을 층류 후드에서 무균적으로 수행하였다. 혈액 및 잔사를 제거하기 위하여 제대를 항진균제 및 항생제 (100 단위/밀리리터의 페니실린, 100 마이크로그램/밀리리터의 스트렙토마이신, 0.25 마이크로그램/밀리리터의 암포테리신 B)의 존재 하에 인산염 완충 염수(PBS; 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen))에서 세척하였다. 그 후, 조직이 미세 펄프로 다져질 때까지, 150 ㎠의 조직 배양 플레이트에서, 50 밀리리터의 배지 (DMEM-저 글루코스 또는 DMEM-고 글루코스; 인비트로겐)의 존재 하에 기계적으로 해리시켰다. 쵸핑된(chopped) 조직을 50 밀리리터 코니칼 튜브(conical tube) (튜브당 대략 5 그램의 조직)로 옮겼다. 그 후, 조직을 DMEM-저 글루코스 배지 또는 DMEM-고 글루코스 배지에서 소화시켰는데, 상기 배지 각각은 상기에 기재된 바와 같이 항진균제 및 항생제를 함유하였다. 일부 실험에서, 콜라게나아제와 디스파아제의 효소 혼합물을 사용하였다 ("C:D;" 콜라게나아제 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마(Sigma)), 500 단위/밀리리터; 및 디스파아제 (인비트로겐), 50 단위/밀리리터, DMEM:-저 글루코스 배지 중). 다른 실험에서, 콜라게나아제, 디스파아제 및 하이알루로니다아제의 혼합물 ("C:D:H")을 사용하였다 (콜라게나아제, 500 단위/밀리리터; 디스파아제, 50 단위/밀리리터; 및 하이알루로니다아제 (시그마), 5 단위/밀리리터, DMEM:-저 글루코스 중). 조직, 배지 및 소화 효소를 함유하는 코니칼 튜브를 회전식 진탕기 (미국 뉴욕주 브루클린 소재의 인바이런(Environ))에서, 225 rpm에서 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
소화 후, 조직을 150 × g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 흡인하였다. 펠렛을 20 밀리리터의 성장 배지 (DMEM: 저 글루코스 (인비트로겐), 15 % (v/v)의 소 태아 혈청 (FBS; 규정된 소 혈청; 로트 번호: AND18475; 미국 유타주 로건 소재의 하이클론(Hyclone)), 0.001% (v/v)의 2-메르캅토에탄올 (시그마), 100 밀리리터당 1 밀리리터의 상기에 기재된 항생제/항진균제)에 재현탁시켰다. 세포 현탁물을 70 마이크로미터의 나일론 세포 스트레이너(strainer) (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences))를 통하여 여과시켰다. 성장 배지를 포함하는 추가의 5 밀리리터 린스를 스트레이너에 통과시켰다. 그 후, 세포 현탁물을 40 마이크로미터의 나일론 세포 스트레이너 (비디 바이오사이언시즈)에 통과시키고, 추가의 5 밀리리터의 성장 배지의 린스로 추적하였다.
여과물을 성장 배지 (총 부피: 50 밀리리터)에 재현탁시키고, 150 × g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고, 세포를 50 밀리리터의 신선한 성장 배지에 재현탁시켰다. 이 공정을 2회 더 반복하였다.
최종 원심분리시에 상청액을 흡인하고, 세포 펠렛을 5 밀리리터의 신선한 성장 배지에 재현탁시켰다. 생존가능한 세포의 수를 트립판 블루(Trypan Blue) 염색을 이용하여 결정하였다. 그 후, 세포를 표준 조건 하에 배양하였다.
제대로부터 단리한 세포를 상기에 기재된 바와 같이 항생제/항진균제를 포함하는 성장 배지 중에, 젤라틴-코팅된 T-75 ㎠ 플라스크 (미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝 인크.(Corning Inc.)) 상에 5,000개의 세포/㎠로 접종하였다. 2일 후 (다양한 실험에서, 세포를 2-4일 동안 인큐베이션함), 사용된 배지를 플라스크로부터 흡인하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하여 잔사 및 혈액-유래된 세포를 제거하였다. 그 후, 세포에 성장 배지를 보충하고, 상기 세포를 계대 1까지 융합이 되도록 성장시켰다 (계대 0으로부터 약 10일). 후속적인 계대시에 (계대 1 내지 2 등), 세포는 4-5일 후에 서브컨플루언스(sub-confluence)(75-85%의 융합)에 도달하였다. 이들 후속 계대에 있어서, 세포를 5000개의 세포/㎠로 접종하였다. 세포를 5%의 이산화탄소 및 대기중 산소를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37℃에서 성장시켰다.
실시예 2
유세포 분석법에 의한 인간 분만후-유래된 세포 표면 마커의 평가
제대 조직을 유세포 분석법을 이용하여 특성 확인하여 이로부터 수득된 세포의 확인을 위한 프로파일을 제공하였다.
세포를 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 성장 배지 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코(Gibco))에서 배양하였다. 세포를 혈장 처리된 T75, T150, 및 T225 조직 배양 플라스크 (미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝)에서 융합될 때까지 배양하였다. 플라스크의 성장 표면은 실온에서 20분 동안 2% (w/v) 젤라틴 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)의 인큐베이션에 의해 젤라틴으로 코팅하였다.
플라스크 내의 유착성 세포를 PBS에서 세척하고, 트립신(Trypsin)/EDTA로 떼어 냈다. 세포를 수확하고, 원심분리하고, 1 밀리리터당 1×107개의 세포 농도로 PBS 중 3% (v/v) FBS에 재현탁시켰다. 제조업자의 설명서에 따라, 관심대상의 세포 표면 마커에 대한 항체 (하기 참조)를 100 마이크로리터의 세포 현탁물에 첨가하고, 상기 혼합물을 암소에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고, 원심분리하여 미결합 항체를 제거하였다. 세포를 500 마이크로리터의 PBS에 재현탁시키고, 유세포 분석법으로 분석하였다. 유세포 분석법에 의한 분석을 FACScalibur 기기 (미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 벡턴 디킨슨(Becton Dickinson))를 이용하여 수행하였다.
세포 표면 마커에 대한 하기 항체를 사용하였다:
Figure pct00001
세포를 계대 8, 15, 및 20에서 분석하고, 상이한 공여체로부터의 제대 조직-유래된 세포를 서로와 비교하였다. 게다가, 젤라틴-코팅된 플라스크 상에서 배양한 세포를 비코팅된 플라스크 상에서 배양한 세포와 비교하였다.
제대 조직-유래된 세포는 CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-알파 및 HLA-A, B, C의 양성 발현을 나타냈으며, 이는 IgG 대조군에 비하여 증가된 형광 값으로 나타났다. 이들 세포는 CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, 및 HLA-DR, DP, DQ의 검출가능한 발현에 대하여 음성이었으며, 이는 IgG 대조군에 비견되는 형광 값으로 나타났다. 양의 곡선의 형광 값의 변동이 설명되었다. 양의 곡선의 평균 (즉, CD13) 및 범위 (즉, CD90)는 약간의 변동을 나타냈지만, 상기 곡선은 정상적인 것으로 보였으며, 이는 균질한 집단을 확인해 주는 것이었다. 둘 모두의 곡선은 개별적으로 IgG 대조군보다 더 큰 값을 나타냈다.
계대 8, 15, 및 20의 세포 전부는 CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-알파 및 HLA-A, B, C를 발현하였으며, 이는 IgG 대조군에 비하여 증가된 형광으로 나타났다. 이들 세포는 CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, 및 HLA-DR, DP, DQ에 대하여 음성이었으며, 이는 IgG 대조군과 일치하는 형광 값으로 나타났다.
별도의 공여체로부터의 단리체 각각은 CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-알파 및 HLA-A, B, C의 양성 발현을 나타냈으며, 이는 IgG 대조군에 비하여 증가된 형광 값에 반영되었다. 이들 세포는 CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, 및 HLA-DR, DP, DQ의 발현에 대하여 음성이었으며, 이때 형광 값은 IgG 대조군과 일치하였다.
젤라틴 및 비코팅 플라스크 상에서 확장시킨 세포 전부는 CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-알파 및 HLA-A, B, C의 발현에 대하여 양성이었으며, 이때 형광 값은 IgG 대조군에 비하여 증가하였다. 이들 세포는 CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, 및 HLA-DR, DP, DQ의 발현에 대하여 음성이었으며, 이때 형광 값은 IgG 대조군과 일치하였다.
따라서, 제대 조직-유래된 세포는 CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-알파, HLA-A,B,C에 대하여 양성이며, CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 및 HLA-DR, DP, DQ에 대하여 음성이다. 이러한 아이덴티티는 공여체, 계대, 및 배양 용기 표면 코팅을 비롯한 변수에 있어서의 변동들 사이에서 일관성이 있었다. 개별적인 형광 값 히스토그램 곡선 평균 및 범위에 있어서의 일부 변동이 관찰되었지만, 시험한 모든 조건 하에서의 모든 양의 곡선은 보통의 것이었으며, IgG 대조군보다 더 큰 형광 값을 나타냈고, 이럼으로써 세포가 양성 마커 발현을 갖는 균질한 집단을 포함함을 확인해 주었다.
실시예 3
세포 표현형의 면역조직화학적 특성 확인
인간 제대 조직을 수확하고, 4% (w/v) 파라포름알데히드에서 4℃에서 하룻밤 침지 고정시켰다. 면역조직화학적 검사법을 하기 에피토프에 대하여 유도된 항체를 사용하여 수행하였다: 비멘틴 (1:500; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마), 데스민 (1:150, 토끼에 대하여 생성; 시그마; 또는 1:300, 생쥐에 대하여 생성; 케미콘(Chemicon), 미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재), 알파-평활근 액틴 (SMA; 1:400; 시그마), 사이토케라틴 18 (CK18; 1:400; 시그마), 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor; vWF; 1:200; 시그마), 및 CD34 (인간 CD34 클래스 III; 1:100; 미국 캘리포니아주 카핀테리아 소재의 다코사이토메이션(DAKOCytomation)). 게다가, 하기 마커를 시험하였다: 항인간 GRO알파 - PE (1:100; 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)), 항인간 GCP-2 (1:100; 미국 캘리포니아주 샌타크루즈 소재의 샌타크루즈 바이오테크(Santa Cruz Biotech)), 항인간 산화 LDL 수용체 1 (ox-LDL R1; 1:100; 샌타크루즈 바이오테크), 및 항인간 NOGO-A (1:100; 샌타크루즈 바이오테크). 고정시킨 시편을 메스로 트리밍하고(trimmed), 에탄올을 함유하는 드라이아이스조에서 OCT 매립 컴파운드(embedding compound) (티슈-텍 오씨티(Tissue-Tek OCT); 미국 캘리포니아주 토란스 사쿠라 소재) 내에 두었다. 그 후, 냉동 블록을 표준 저온 유지 장치(cryostat) (라이카 마이크로시스템즈(Leica Microsystems))을 사용하여 박편화하고 (10 ㎛의 두께), 염색을 위하여 유리 슬라이드 상에 탑재하였다.
면역조직화학적 검사법을 이전 연구와 유사하게 수행하였다 (문헌[Messina et al., Exper . Neurol ., 2003; 184:816-29]). 간략하게는, 조직 박편을 인산염 완충 염수(PBS)로 세척하고, PBS, 4% (v/v) 염소 혈청 (미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재의 케미콘), 및 0.3% (v/v) 트리톤(Triton) (트리톤 X-100; 시그마)을 함유하는 단백질 차단 용액에 1시간 동안 노출시켜 세포내 항원에 접근하였다. 관심대상의 에피토프가 세포 표면 (CD34, ox-LDL R1) 상에 위치하는 경우, 트리톤을 이 절차의 모든 단계에서 제외시켜 에피토프 손실을 방지하였다. 더욱이, 일차 항체를 염소 (GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A)에 대하여 생성하는 경우에, 3% (v/v) 당나귀 혈청을 이 절차 전체에 걸쳐 염소 혈청 대신 사용하였다. 그 후, 차단 용액에서 희석시킨 일차 항체를 실온에서 4시간의 기간 동안 상기 박편에 적용하였다. 일차 항체 용액을 제거하고, 배양물을 PBS로 세척한 후, 차단액을 염소 항생쥐 IgG - 텍사스 레드(Texas Red) (1:250; 미국 오리건주 유진 소재의 몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes)) 및/또는 염소 항토끼 IgG - 알렉사(Alexa) 488 (1:250; 몰레큘러 프로브즈) 또는 당나귀 항염소 IgG - FITC (1:150; 샌타크루즈 바이오테크)와 함께 함유하는 이차 항체 용액을 적용하였다 (실온에서 1시간). 배양물을 세척하고, 10 마이크로몰의 DAPI (몰레큘러 프로브즈)를 10분 동안 적용하여 세포 핵을 가시화하였다.
올림푸스(Olympus) 도립 epi-형광 현미경 (미국 뉴욕주 멜빌 소재의 올림푸스)에서 적절한 형광 필터를 사용하여 형광을 가시화하였다. 대조군 염색보다 더 많은 형광 신호는 양성 염색을 나타냈다. 대표적인 영상을 디지털 컬러 비디오 카메라 및 이미지-프로(Image-Pro)(등록상표) 소프트웨어 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 메디아 사이버네틱스(Media Cybernetics))를 사용하여 포착하였다. 삼중 염색된 샘플에 있어서, 각각의 영상을 한 번에 단지 하나의 방사 필터를 사용하여 촬영하였다.
비멘틴, 데스민, SMA, CK18, vWF, 및 CD34 마커가 제대 내에서 발견되는 세포의 하위세트(subset)에서 발현되었다. 특히, vWF 및 CD34 발현은 제대 내에 함유된 혈관에 제한되었다. CD34+ 세포는 가장 안쪽의 층 (세포내강측)에 있었다. 비멘틴 발현이 제대의 혈관 및 매트릭스 전체에 걸쳐 발견되었다. SMA는 동맥 및 정맥의 외벽 및 매트릭스에 한정되었지만, 혈관 그 자신에 포함되지는 않았다. CK18 및 데스민이 단지 혈관 내에서 관찰되었으며, 데스민은 중간층 및 외층에 제한되었다. GRO알파, GCP-2, ox-LDL R1, 및 NOGO-A의 발현은 제대 조직 내에서 관찰되지 않았다.
실시예 4
올리고뉴클레오티드 어레이 분석
어피메트릭스 진칩(Affymetrix GeneChip)(등록상표) 어레이를 사용하여 제대 조직-유래된 세포의 유전자 발현 프로파일을 섬유모세포, 인간 중간엽 줄기 세포, 및 인간 골수로부터 유래된 다른 세포주와 비교하였다. 이 분석은 분만후-유래된 세포의 특성을 제공하였으며, 이들 세포에 있어서 독특한 분자 마커를 확인하였다.
인간 제대를 환자의 동의를 얻어 정상 만삭 분만으로부터, NDRI (미국 펜실베이니아주 필라델피아 소재)로부터 획득하였다. 조직을 수령하고, 세포를 단리하였으며, 이는 상기에 기재된 바와 같았다. 세포를 성장 배지 (DMEM-LG를 사용함)에서, 젤라틴-코팅된 조직 배양 플라스틱 플라스크에서 배양하였다. 배양물을 5 % CO2를 이용하여 37℃에서 인큐베이션하였다.
인간 피부 섬유모세포를 캄브렉스 인코포레이티드(Cambrex Incorporated) (미국 메릴랜드주 워커스빌 소재; 로트 번호: 9F0844) 및 ATCC CRL-1501 (CCD39SK)로부터 구매하였다. 상기 둘 모두의 세포주를 10% (v/v) 소 태아 혈청 (하이클론) 및 페니실린/스트렙토마이신 (인비트로겐)을 포함하는 DMEM/F12 배지 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐)에서 배양하였다. 세포를 표준 조직-처리 플라스틱에서 성장시켰다.
인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)를 캄브렉스 인코포레이티드 (미국 메릴랜드주 워커스빌 소재; 로트 번호: 2F1655, 2F1656 및 2F1657)로부터 구매하고, 제조업자의 설명서에 따라 MSCGM 배지 (캄브렉스)에서 배양하였다. 세포를 5% CO2를 이용하여 37℃에서 표준 조직 배양 플라스틱에서 성장시켰다.
인간 장골능 골수를 환자의 동의를 얻어 NDRI로부터 수령하였다. 상기 골수를 호(Ho) 등이 약술한 방법에 따라 프로세싱하였다 (국제특허 공개 WO 2003/025149호). 상기 골수를 용해 완충제 20부에 대하여 골수 1부의 비로 용해 완충제(155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 및 0.1 mM EDTA, pH 7.2)와 혼합하였다. 세포 현탁물을 와동시키고, 주위 온도에서 2분 동안 인큐베이션하고, 500 × g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 세포 펠렛을 10% (v/v) 소 태아 혈청 및 4 mM 글루타민이 보충된 최소 필수 배지-알파 (인비트로겐)에 재현탁시켰다. 세포를 다시 원심분리하고, 세포 펠렛을 신선한 배지에 재현탁시켰다. 생존가능한 단핵 세포를 트립판-블루 배제 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)를 이용하여 계수하였다. 단핵 세포를 조직 배양 플라스틱 플라스크에 5 × 104개의 세포/㎠로 접종하였다. 표준 대기중 O2 또는 5% O2에서, 5% CO2를 이용하여 37℃에서 세포를 인큐베이션하였다. 세포를 배지 교환 없이 5일 동안 배양하였다. 배지 및 비유착성 세포를 5일의 배양 후 제거하였다. 유착성 세포를 배양 중 유지하였다.
활발하게 성장 중인 세포 배양물을 냉 PBS에서 세포 스크래퍼(scraper)를 이용하여 플라스크로부터 제거하였다. 상기 세포를 300 × g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 신선한 PBS에 재현탁시키고, 다시 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포 펠렛을 즉시 냉동시키고, -80℃에서 보관하였다. 세포 mRNA를 추출하고, cDNA로 전사시키고, 그 후 이를 cRNA로 전사시키고, 바이오틴-표지하였다. 바이오틴-표지된 cRNA를 HG-U133A 진칩 올리고뉴클레오티드 어레이 (미국 캘리포니아주 산타클라라 소재의 어피메트릭스)를 이용하여 혼성화시켰다. 혼성화 및 데이터 수집을 제조업자의 설명서에 따라 수행하였다. 분석을 "마이크로어레이의 유의도 분석(Significance Analysis of Microarrays; SAM)" 버전 1.21 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 수행하였다 (문헌[Stanford University; Tusher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002; 98:5116-21]).
14가지의 상이한 세포 집단을 분석하였다. 계대 정보와 함께인 세포, 배양 기재 및 배양 배지가 표 1에 열거되어 있다.
Figure pct00002
세포에서 차별적으로 발현된 290가지의 유전자를 분석하여, 주성분 분석에 의해 데이터를 평가하였다. 이 분석은 집단들 사이의 유사성에 대한 상대적인 비교를 허용한다. 표 2는 세포쌍 비교용으로 계산된 유클리드 거리(Euclidean distance)를 나타낸다. 유클리드 거리는 세포 유형들 사이에서 차별적으로 발현된 290가지의 유전자를 기반으로 한 세포의 비교를 기초로 하였다. 유클리드 거리는 290가지의 유전자의 발현 사이의 유사성에 반비례한다 (즉, 상기 거리가 커질수록 더 적은 유사성이 존재함).
Figure pct00003
하기 표 3 및 표 4는 제대 조직-유래된 세포에서 증가된 유전자의 발현 (표 3), 및 제대 조직-유래된 세포에서 감소된 유전자의 발현 (표 4)을 나타낸다. 표제가 "프로브 세트 ID"인 컬럼은, 특정한 등록 번호 ("NCBI 등록 번호" 컬럼)로 NCBI (젠뱅크(GenBank)) 데이터베이스 내에서 발견될 수 있는 서열을 포함하는, 명명된 유전자 ("유전자명" 컬럼)에 혼성화하는, 칩 상의 특정 부위 상에 위치된 몇몇 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트에 대한 제조업자의 식별 부호를 나타낸다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
표 5, 표 6, 및 표 7은 인간 섬유모세포 (표 5), ICBM 세포 (표 6), 및 MSC (표 7)에서 증가된 유전자의 발현을 나타낸다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
전술한 분석은 3가지의 상이한 제대 및 2가지의 상이한 피부 섬유모세포주, 3가지의 중간엽 줄기 세포주 및 3가지의 장골능 골수 세포주로부터 유래된 세포를 포함하였다. 이들 세포에 의해 발현된 mRNA를 22,000가지의 유전자에 대한 프로브를 포함하는 올리고뉴클레오티드 어레이를 사용하여 분석하였다. 결과에 의하면, 290가지의 유전자가 이들 5가지의 상이한 세포 유형에서 차별적으로 발현됨이 나타났다. 이들 유전자는 제대 조직-유래된 세포에서 특정적으로 증가된 7가지의 유전자를 포함한다. 54가지의 유전자는, 다른 세포 유형과 비교하여, 제대 조직-유래된 세포에서 특정적으로 더욱 낮은 발현 수준을 가짐이 밝혀졌다. 선택된 유전자의 발현을 PCR로 확인하였다. 이들 결과는 제대 조직-유래된 세포가 예를 들어 골수-유래된 세포 및 섬유모세포와 비교하여, 특유한 유전자 발현 프로파일을 가짐을 입증한다.
실시예 5
제대 조직-유래된 세포에서의 세포 마커
상기에 나타낸 바와 같이, 다음의 "특징(signature)" 유전자를 분만후-유래된 세포에 대하여 확인하였다: 산화 LDL 수용체 1, 인터류킨-8, 레닌, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3 (CXC 리간드 3), 및 과립구 주화성 단백질 2 (GCP-2). 이들 "특징" 유전자는 분만후-유래된 세포에서 상대적으로 높은 수준으로 발현되었다.
이 실시예에서 설명한 절차를 행하여 마이크로어레이 데이터를 검증하고, 유전자 및 단백질 발현 사이의 일치/불일치를 찾아내며, 이외에도, 제대 조직-유래된 세포의 독특한 확인자의 검출을 위한 일련의 신뢰성 있는 분석법을 확립하였다.
제대 조직-유래된 세포 (4개의 단리체) 및 정상 인간 피부 섬유모세포 (Normal Human Dermal Fibroblast, NHDF; 신생아 및 성인)를 젤라틴-코팅된 T75 플라스크에서 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 성장 배지에서 성장시켰다. 중간엽 줄기 세포(MSC)를 중간엽 줄기 세포 성장 배지 불렛(Bullet) 키트 (MSCGM; 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 캄브렉스)에서 성장시켰다.
IL-8 프로토콜에 있어서, 세포를 액체 질소로부터 해동시키고, 젤라틴-코팅된 플라스크에 5,000개의 세포/㎠로 도말하고, 성장 배지에서 48시간 동안 성장시키고, 그 후 10 밀리리터의 혈청 고갈 배지 (DMEM -저 글루코스 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코), 페니실린/스트렙토마이신 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코) 및 0.1% (w/v)의 소 혈청 알부민 (BSA; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마))에서 추가로 8시간 동안 성장시켰다. 이 처리 후, RNA를 추출하고, 상청액을 150 × g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 잔사를 제거하였다. 그 후, 상청액을 ELISA 분석을 위하여 -80℃에서 냉동시켰다.
인간 신생아 포피로부터 유래된 인간 섬유모세포 뿐만 아니라, 제대로부터 유래된 분만후 세포도 젤라틴-코팅된 T75 플라스크에서 성장 배지에서 배양하였다. 세포를 액체 질소에서 계대 11에서 냉동시켰다. 세포를 해동시키고, 15 밀리리터 원심분리 튜브로 옮겼다. 150 × g에서 5분 동안 원심분리 후, 상청액을 버렸다. 세포를 4 밀리리터 배양 배지에 재현탁시키고, 계수하였다. 세포를 15 밀리리터의 성장 배지를 함유하는 75 ㎠ 플라스크에서 플라스크당 375,000개의 세포로 24시간 동안 성장시켰다. 배지를 8시간 동안 혈청 고갈 배지로 교환하였다. 혈청 고갈 배지를 인큐베이션 마지막에 수집하고, 14,000 × g에서 5분 동안 원심분리하였다 (그리고 -20℃에서 보관하였다).
각각의 플라스크에서의 세포의 수의 개산을 위하여, 2 밀리리터의 트립신/EDTA (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코)를 각각의 플라스크에 첨가하였다. 세포를 플라스크로부터 떼어낸 후, 트립신 활성을 8 밀리리터의 성장 배지로 중화시켰다. 세포를 15 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고, 150 × g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 1 밀리리터의 성장 배지를 각각의 튜브에 첨가하여 세포를 재현탁시켰다. 세포수를 혈구 계산기를 사용하여 개산하였다.
세포에 의해 혈청 고갈 배지 내로 분비되는 IL-8의 양을 ELISA 분석법 (미국 미네소타주 미니애폴리스 소재의 알앤디 시스템즈(R&D Systems))을 이용하여 분석하였다. 모든 분석물을 제조업자가 제공한 설명서에 따라 시험하였다.
RNA를 융합 제대 조직-유래 세포 및 섬유모세포로부터 추출하거나 또는 IL-8 발현을 위해서는 상기에 기재된 바와 같이 처리한 세포로부터 추출하였다. 세포는 제조업자의 설명서에 따라 베타-메르캅토에탄올 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)을 함유하는 350 마이크로리터의 완충제 RLT를 이용하여 용해시켰다 (알엔이지(RNeasy)(등록상표) 미니 키트(Mini Kit); 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠(Qiagen)). RNA를 제조업자의 설명서에 따라 추출하고 (알엔이지(등록상표) 미니 키트; 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠), DNase 처리 (2.7 U/샘플) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)를 가하였다. RNA를 50 마이크로리터의 DEPC-처리된 물로 용출시키고, -80℃에서 보관하였다.
또한 RNA를 인간 제대 조직으로부터 추출하였다. 조직 (30 밀리그램)을 2-메르캅토에탄올을 함유하는 완충제 RLT 700 마이크로리터에 현탁시켰다. 샘플을 기계적으로 균질화하고, 제조업자의 설명서에 따라 RNA 추출을 진행하였다. RNA를 50 마이크로리터의 DEPC-처리된 물로 추출하고, -80℃에서 보관하였다. RNA를 탁맨(TaqMan) 역전사 시약 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 이용하여 25℃, 10분; 37℃, 60분; 및 95℃, 10분에서 랜덤 헥사머를 사용하여 역전사시켰다. 샘플을 -20℃에서 보관하였다.
분만후 세포에서 독특하게 조절되는 것으로 cDNA 마이크로어레이에 의해 확인된 유전자 (특징 유전자 - 산화 LDL 수용체, 인터류킨-8, 레닌 및 레티큘론을 포함함)를 실시간의 그리고 통상적인 PCR을 사용하여 추가로 조사하였다.
PCR을 어세이즈-온-디맨드(Assays-on-Demand)™ 유전자 발현 생성물을 사용하여 cDNA 샘플에서 수행하였으며, 즉 산화 LDL 수용체 (Hs00234028); 레닌 (Hs00166915); 레티큘론 (Hs00382515); CXC 리간드 3 (Hs00171061); GCP-2 (Hs00605742); IL-8 (Hs00174103); 및 GAPDH (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈)를 제조업자의 설명서 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈)에 따라 cDNA 및 탁맨 범용 PCR 마스터 믹스(master mix)와 혼합하였는데, 이는 ABI 프리즘(Prism) 7000 SDS 소프트웨어 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈)를 갖춘 7000 서열 검출 시스템을 이용하였다. 서멀 사이클(Thermal cycle) 조건은 처음에 50℃, 2 min 및 95℃, 10 min, 이어서 95℃, 15 sec 및 60℃, 1 min의 40 사이클이었다. PCR 데이터를 제조업자의 설명서 (ABI 프리즘 7700 서열 검출 시스템을 위한 어플라이드 바이오시스템즈로부터의 사용자 불레틴 #2)에 따라 분석하였다.
통상적인 PCR을 ABI 프리즘 7700 (미국 매사추세츠주 보스턴 소재의 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템즈(Perkin Elmer Applied Biosystems))을 사용하여 수행하여 실시간 PCR로부터의 결과를 확인하였다. PCR을 2 마이크로리터의 cDNA 용액, 1ㅧ 앰플리탁 골드(AmpliTaq Gold) 범용 믹스 PCR 반응 완충제 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈) 및 94℃에서의 5분 동안의 초기 변성을 이용하여 수행하였다. 증폭을 각각의 프라이머 세트에 대하여 최적화하였다. IL-8, CXC 리간드 3, 및 레티큘론의 경우 (94℃, 15초; 55℃, 15초 및 72℃, 30초, 30 사이클); 레닌의 경우 (94℃, 15초; 53℃, 15초 및 72℃, 30초, 38 사이클); 산화 LDL 수용체 및 GAPDH의 경우 (94℃, 15초; 55℃, 15초 및 72℃, 30초, 33 사이클). 증폭에 이용한 프라이머가 표 8에 열거되어 있다. 최종 PCR 반응물 중 프라이머 농도는 0.5 마이크로몰인 GAPDH를 제외하고는 1 마이크로몰이었다. GAPDH 프라이머는, 제조업자의 탁맨 프로브를 최종 PCR 반응물에 첨가하지 않은 것을 제외하고는 실시간 PCR과 동일하였다. 샘플을 2% (w/v) 아가로스 겔 상에서 진행시켰으며, 에티듐 브로마이드 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)로 염색하였다. 초점 거리 폴라로이드(Polaroid) 카메라 (미국 뉴저지주 사우스 플레인필드 소재의 브이더블유알 인터내셔널(VWR International))를 사용하여 667 범용 트윈팩(Twinpack) 필름 (미국 뉴저지주 사우스 플레인필드 소재의 브이더블유알 인터내셔널)을 사용하여 영상을 포착하였다.
Figure pct00010
세포를 냉 4% (w/v) 파라포름알데히드 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치)를 이용하여 실온에서 10분 동안 고정하였다. 계대 0(P0)의 하나의 단리체 (단리 직후) 및 계대 11(P11)의 2개의 단리체와, 섬유모세포 (P11)를 사용하였다. 면역조직화학적 검사법을 하기 에피토프에 대하여 유도된 항체를 사용하여 수행하였다: 비멘틴 (1:500, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마), 데스민 (1:150; 시그마 - 토끼에 대하여 생성함; 또는 1:300; 미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재의 케미콘 - 생쥐에 대하여 생성함), 알파-평활근 액틴 (SMA; 1:400; 시그마), 사이토케라틴 18 (CK18; 1:400; 시그마), 폰 빌레브란트 인자(vWF; 1:200; 시그마), 및 CD34 (인간 CD34 클래스 III; 1:100; 미국 캘리포니아주 카핀테리아 소재의 다코사이토메이션). 게다가, 하기 마커를 계대 11의 분만후 세포에서 검사하였다: 항인간 GRO 알파 - PE (1:100; 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤 디킨슨), 항인간 GCP-2 (1:100; 미국 캘리포니아주 샌터크루즈 소재의 샌터크루즈 바이오테크), 항인간 산화 LDL 수용체 1 (ox-LDL R1; 1:100; 샌터크루즈 바이오테크), 및 항인간 NOGA-A (1:100; 샌터크루즈 바이오테크).
배양물을 인산염 완충 염수(PBS)로 세척하고, PBS, 4% (v/v) 염소 혈청 (미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재의 케미콘), 및 0.3% (v/v) 트리톤 (트리톤 X-100; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)을 함유하는 단백질 차단 용액에 30분 동안 노출시켜 세포내 항원에 접근하였다. 관심대상의 에피토프가 세포 표면 (CD34, ox-LDL R1) 상에 위치하는 경우, 트리톤 X-100을 이 절차의 모든 단계에서 제외시켜 에피토프 손실을 방지하였다. 더욱이, 일차 항체를 염소 (GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A)에 대하여 생성하는 경우에, 3% (v/v) 당나귀 혈청을 이 전체에 걸쳐 염소 혈청 대신 사용하였다. 그 후, 차단 용액에서 희석시킨 일차 항체를 실온에서 1시간의 기간 동안 상기 배양물에 적용하였다. 일차 항체 용액을 제거하고, 배양물을 PBS로 세척한 후, 차단액을 염소 항생쥐 IgG - 텍사스 레드 (1:250; 미국 오리건주 유진 소재의 몰레큘러 프로브즈) 및/또는 염소 항토끼 IgG - 알렉사 488 (1:250; 몰레큘러 프로브즈) 또는 당나귀 항염소 IgG - FITC (1:150, 샌터크루즈 바이오테크)와 함께 함유하는 이차 항체 용액을 적용하였다 (실온에서 1시간). 그 후, 배양물을 세척하고, 10 마이크로몰의 DAPI (몰레큘러 프로브즈)를 10분 동안 적용하여 세포 핵을 가시화하였다.
면역염색 후, 올림푸스 도립 epi-형광 현미경 (미국 뉴욕주 멜빌 소재의 올림푸스)에서 적절한 형광 필터를 사용하여 형광을 가시화하였다. 모든 경우에, 양성 염색은 대조군 염색보다 더 많은 형광 신호를 나타냈으며, 여기서 일차 항체 용액의 적용을 제외하고는 상기에 약술된 전체 절차를 따랐다. 대표적인 영상을 디지털 컬러 비디오 카메라 및 이미지-프로()(등록상표) 소프트웨어 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 메디아 사이버네틱스)를 사용하여 포착하였다. 삼중 염색된 샘플에 있어서, 각각의 영상을 한 번에 단지 하나의 방사 필터를 사용하여 촬영하였다. 그 후, 어도비 포토샵(Adobe Photoshop) 소프트웨어 (미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 어도비(Adobe))를 사용하여 층상 몽타주를 작성하였다.
플라스크 내의 유착성 세포를 인산염 완충 염수 (PBS) (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코)에서 세척하고, 트립신/EDTA (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코)로 떼어 냈다. 세포를 수확하고, 원심분리하고, 1 밀리리터당 1×107개의 세포 농도로 PBS 중 3% (v/v) FBS에 재현탁시켰다. 100 마이크로리터의 분취물을 코니칼 튜브로 전달하였다. 세포내 항원에 대하여 염색된 세포를 투과/세척(Perm/Wash) 완충제 (미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재의 비디 파밍젠)로 투과화하였다. 제조업자의 설명서에 따라 항체를 분취물에 첨가하고, 세포를 암소에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고, 원심분리하여 여분의 항체를 제거하였다. 이차 항체를 필요로 하는 세포를 100 마이크로리터의 3% FBS에 재현탁시켰다. 제조업자의 설명서에 따라 이차 항체를 첨가하고, 세포를 암소에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고, 원심분리하여 여분의 이차 항체를 제거하였다. 세척된 세포를 0.5 밀리리터의 PBS에 재현탁시키고, 유세포 분석법으로 분석하였다. 하기 항체를 사용하였다: 산화 LDL 수용체 1 (sc-5813; 샌터크루즈 바이오테크), GROa (555042; 미국 매사추세츠주 베드포드 소재의 비디 파밍젠), 생쥐 IgG1 카파 (P-4685 및 M-5284; 시그마), 염소 IgG에 대한 당나귀 (sc-3743; 샌터크루즈 바이오테크). 유세포 분석법에 의한 분석을 FACScalibur (미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 벡톤 디킨슨)를 이용하여 수행하였다.
실시간 PCR로부터 수득된 데이터를 ΔΔCT법으로 분석하고, 로그 스케일로 표현하였다. 레티큘론 및 산화 LDL 수용체의 발현은 다른 세포와 비교하여 제대 조직-유래된 세포에서 더 높았다. CXC 리간드 3 및 GCP-2의 발현 수준의 유의한 차이는 분만후-유래된 세포와 대조군 사이에서 발견되지 않았다. 실시간 PCR의 결과를 통상적인 PCR로 확인하였다. PCR 생성물의 서열결정은 이들 관찰을 추가로 인증하였다. CXC 리간드 3의 발현 수준의 유의한 차이는 상기에 열거된 통상적인 PCR CXC 리간드 3 프라이머들을 사용하면 분만후-유래된 세포와 대조군 사이에서 발견되지 않았다.
분만후 세포에서의 사이토카인 IL-8의 생성은 성장 배지-배양된 세포 및 혈청-고갈된 분만후-유래된 세포 둘 모두에서 상승하였다. 모든 실시간 PCR 데이터를 통상적인 PCR을 이용하여 그리고 PCR 생성물의 서열결정에 의해 인증하였다.
무혈청 배지에서 성장시킨 세포의 상청액을 IL-8의 존재에 대하여 조사할 때, 태반 세포의 일부 단리체 및 제대 세포로부터 유래된 배지에서 최고의 양이 검출되었다 (표 9). IL-8은 인간 피부 섬유모세포로부터 유래된 배지에서는 검출되지 않았다.
Figure pct00011
계대 0의, 인간 제대 조직으로부터 유래된 세포를 면역세포화학적 분석에 의해, 선택된 단백질의 생성에 대하여 프로빙하였다. 단리 직후 (계대 0), 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 하기 6가지의 단백질에 대한 항체에 노출시켰다: 폰 빌레브란트 인자, CD34, 사이토케라틴 18, 데스민, 알파-평활근 액틴, 및 비멘틴. 제대 조직-유래된 세포는 알파-평활근 액틴 및 비멘틴에 대하여 양성이었으며, 이때 염색 패턴은 계대 11까지 일관되었다.
마이크로어레이 및 PCR (실시간 PCR 및 통상적인 PCR 둘 모두)에 의해 측정한 유전자 발현 수준들 사이의 일치가 하기 4가지의 유전자에 대하여 확립되었다: 산화 LDL 수용체 1, 레닌, 레티큘론, 및 IL-8. 이들 유전자의 발현은 PPDC에서 mRNA 수준에서 차별적으로 조절되었으며, 이때 IL-8도 단백질 수준에서 차별적으로 조절되었다. 계대 0의, 인간 제대 조직으로부터 유래된 세포를 알파-평활근 액틴 및 비멘틴의 발현에 대하여 프로빙하였으며, 이들 둘 모두에 대하여 양성이었다. 염색 패턴은 계대 11까지 보존되었다.
실시예 6
분만후-유래된 세포의 시험관 내에서의 면역학적 평가
분만후-유래된 세포 (PPDC)는, 만약에 있다면, 이들 세포가 생체 내 이식시에 유발하였을 면역학적 응답을 예측하려는 노력으로 그의 면역학적 특성에 대하여 시험관 내에서 평가하였다. PPDC를 HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86, 및 B7-H2의 존재에 대하여 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 이들 단백질은 항원-제시 세포(antigen-presenting cell; APC)에 의해 발현되며, 나이브(
Figure pct00012
) CD4+ T 세포의 직접적인 자극에 필요하다 (문헌[Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 5th Ed. (Saunders, Philadelphia, 2003; p. 171)]). 또한 상기 세포주들을 HLA-G (상기 문헌[Abbas & Lichtman, 2003]]), CD 178 (문헌[Coumans, et al., Journal of Immunological Methods, 1999; 224:185-196]), 및 PD-L2 (상기 문헌[Abbas & Lichtman, 2003]; 문헌[Brown, et. al., The Journal of Immunology, 2003; 170:1257-1266])의 발현에 대하여 유세포 분석법으로 분석하였다. 태반 조직에 있는 세포에 의한 이들 단백질의 발현은 자궁 내에서 태반 조직의 면역-특권 상태를 매개하는 것으로 생각된다. 태반-유래된 세포주 및 제대 조직-유래된 세포주가 생체 내에서 면역 응답을 유발하는 정도를 예측하기 위하여, 상기 세포주들을 일방 혼합 림프구 반응 (MLR)에서 시험하였다.
2% 젤라틴(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)으로 코팅된 T75 플라스크 (미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝)에서 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 성장 배지에서 융합될 때까지 세포를 배양하였다.
세포를 인산염 완충 염수 (PBS) (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코)에서 세척하고, 트립신/EDTA (미국 미주리주 칼스배드 소재의 깁코)로 떼어 냈다. 세포를 수확하고, 원심분리하고, 1 밀리리터당 1×107개의 세포 농도로 PBS 중 3% (v/v) FBS에 재현탁시켰다. 항체 (표 10)를 제조업자의 설명서에 따라 100 마이크로리터의 세포 현탁물에 첨가하고, 암소에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고, 원심분리하여 미결합 항체를 제거하였다. 세포를 500 마이크로리터의 PBS에서 재현탁시키고, FACSCalibur 기기 (미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 벡톤 디킨슨)를 사용하여 유세포 분석법으로 분석하였다.
Figure pct00013
세포주 A로 표지한, 계대 10의 제대 조직-유래된 세포의 저온보존된 바이알을 드라이아이스 상에서 CTBR (캐나다 퀘벡주 센느빌)로 보내서 CTBR SOP 번호 CAC-031을 사용하여 혼합 림프구 반응을 행하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 다수의 남성 및 여성 자원 공여체로부터 수집하였다. 자극 (공여체) 알러지성 PBMC, 자가 PBMC, 및 분만후 세포주를 마이토마이신 C로 처리하였다. 자가 및 마이토마이신 C-처리된 자극 세포를 응답 (수령)PBMC에 첨가하고, 4일 동안 배양하였다. 인큐베이션 후, [3H]티미딘을 각각의 샘플에 첨가하고, 18시간 동안 배양하였다. 세포의 수확 후, 방사성 표지된 DNA를 추출하고, [3H]-티미딘 혼입량을 신틸레이션 카운터(scintillation counter)를 사용하여 측정하였다.
동종이계 공여체의 자극 지수(stimulation index for the allogeneic donor; SIAD)는 수령체 + 마이토마이신 C-처리된 동종이계 공여체의 평균 증식률을 수령체의 기저선 증식률로 나눈 것으로 계산하였다. PPDC의 자극 지수는 수령체 + 마이토마이신 C-처리된 분만후 세포주의 평균 증식률을 수령체의 기저선 증식률로 나눈 것으로 계산하였다.
6가지의 인간 자원 혈액 공여체를 스크리닝하여, 다른 5가지의 혈액 공여체와의 혼합 림프구 반응에서 강한 증식 응답을 나타낼 하나의 동종이계 공여체를 확인하였다. 이 공여체를 동종이계 양성 대조 공여체로서 선발하였다. 나머지 5명의 혈액 공여체를 수령체로서 선발하였다. 동종이계 양성 대조 공여체 및 태반 세포주를 마이토마이신 C-처리하고, 5가지의 개별 동종이계 수령체와의 혼합 림프구 반응에서 배양하였다. 반응은 플레이트당 3가지의 수령체를 포함하는 2개의 세포 배양 플레이트를 사용하여 삼중으로 수행하였다 (표 11). 평균 자극 지수는 6.5 (플레이트 1) 내지 9 (플레이트 2)의 범위였으며, 동종이계 공여체 양성 대조군은 42.75 (플레이트 1) 내지 70 (플레이트 2)의 범위였다 (표 12).
Figure pct00014
Figure pct00015
IgG 대조군과 일치하는 형광 값으로 나타내어지는 바와 같이, 유세포 분석법에 의해 분석된 제대 조직-유래된 세포의 히스토그램은 HLA-DR, DP, DQ, CD80, CD86, 및 B7-H2의 음성 발현을 나타내며, 이는 제대 세포주가 CD4+ T 세포를 직접적으로 자극하는 데 필요한 세포 표면 분자가 결여됨을 나타내는 것이다. 유세포 분석법에 의해 분석된 제대 조직-유래된 세포의 히스토그램은 IgG 대조군에 비하여 증가된 형광 값으로 나타내어지는 양성 PD-L2 발현, 및 IgG 대조군과 일치하는 형광 값으로 나타내어지는 음성 CD178 및 HLA-G 발현을 나타낸다.
제대 조직-유래된 세포주를 이용하여 행해진 혼합 림프구 반응에서, 평균 자극 지수는 6.5 내지 9의 범위였으며, 동종이계 양성 대조군의 것은 42.75 내지 70의 범위였다. 유세포 분석법에 의해 측정되는 바와 같이, 제대 조직-유래된 세포주는 자극 단백질 HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86, 및 B7-H2의 발현에 대하여 음성이었다. 유세포 분석법에 의해 측정되는 바와 같이, 제대 조직-유래된 세포주는 면역-조절 단백질 HLA-G 및 CD178의 발현에 대하여 음성이었으며, PD-L2의 발현에 대하여 양성이었다. 동종이계 공여체 PBMC는 HLA-DR, DQ, CD8, CD86, 및 B7-H2를 발현하는 항원 제시 세포를 함유하며, 이럼으로써 나이브 CD4+ T 세포의 자극을 허용한다. 태반-유래된 세포 및 제대 조직-유래된 세포 상에서의 항원-제시 세포 표면 분자의 부재는 나이브 CD4+ T 세포의 직접적 자극에 필요하였으며, 면역조절 단백질인 PD-L2의 존재는 동종이계 대조군과 비교하여 MLR에서 이들 세포가 나타내는 낮은 자극 지수를 설명할 수 있다.
실시예 7
제대 조직-유래된 세포에 의한 영양 인자의 분비
선택된 영양 인자의, 제대 조직-유래된 세포로부터의 분비를 측정하였다. 검출용으로 선택된 인자는 하기를 포함하였다: (1) 혈관 신생 활성을 갖는 것으로 공지된 것, 예를 들어 간세포 성장 인자(HGF) (문헌[Rosen et al., Ciba Found. Symp., 1997; 212:215-26]), 단핵구 주화성 단백질 1(monocyte chemotactic protein 1; MCP-1) (문헌[Salcedo et al., Blood, (2000; 96:34-40]), 인터류킨-8 (IL-8) (문헌[Li et al., J. Immunol., 2003; 170:3369-76]), 케라틴 세포 성장 인자(KGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF) (문헌[Hughes et al., Ann. Thorac. Surg., 2004; 77:812-8]), 매트릭스 메탈로프로테이나아제 1(TIMP1), 앙기오포이에틴 2 (ANG2), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF-bb), 트롬보포이에틴(TPO), 헤파린-결합 표피 성장 인자(HB-EGF), 간질-유래된 인자 1알파(SDF-1알파); (2) 신경영양/신경보호 활성을 갖는 것으로 공지된 것, 예를 들어 뇌-유래된 신경영양 인자(brain-derived neurotrophic factor; DNF) (문헌[Cheng et al., Dev. Biol., 2003; 258:319-33]), 인터류킨-6(IL-6), 과립구 주화성 단백질-2(GCP-2), 형질전환 성장 인자 베타2 (TGF베타2); 및 (3) 케모카인 활성을 갖는 것으로 공지된 것, 예를 들어 대식 세포 염증성 단백질 1알파(macrophage inflammatory protein 1alpha; MIP1a), 대식 세포 염증성 단백질 1베타(MIP1b), 단핵구 화학유인자-1(monocyte chemoattractant-1; MCP-1), Rantes (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted), I309, 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine; TARC), 에오탁신(Eotaxin), 대식 세포-유래된 케모카인(macrophage-derived chemokine; MDC), IL-8.
인간 신생아 포피로부터 유래된 인간 섬유모세포 뿐만 아니라 제대로부터의 세포도 젤라틴-코팅된 T75 플라스크에서 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 성장 배지에서 배양하였다. 세포를 계대 11에서 저온보존하고, 액체 질소에서 보관하였다. 세포의 해동 후, 성장 배지를 세포에 첨가하고, 이어서 15 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고, 세포를 150 × g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버렸다. 세포 펠렛을 4 밀리리터 성장 배지에 재현탁시키고, 세포를 계수하였다. 세포를 15 밀리리터의 성장 배지를 함유하는 75 ㎠ 플라스크당 375,000개의 세포로 접종하고, 24시간 동안 배양하였다. 배지를 무혈청 배지 (DMEM-저 글루코스 (깁코), 0.1% (w/v) 소 혈청 알부민 (시그마), 페니실린/스트렙토마이신 (깁코))로 8시간 동안 교환하였다. 조절된 무혈청 배지를 14,000 × g에서 5분 동안 원심분리함으로써 인큐베이션 마지막에 수집하고, -20℃에서 보관하였다. 각각의 플라스크에서의 세포의 수의 개산을 위하여, 세포를 PBS로 세척하고, 2 밀리리터의 트립신/EDTA를 사용하여 떼어 냈다. 트립신 활성을 8 밀리리터의 성장 배지의 첨가에 의해 저해하였다. 상기 세포를 150 × g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 1 밀리리터의 성장 배지에 재현탁시켰다. 세포수를 혈구 계산기를 사용하여 개산하였다.
세포를 5% 이산화탄소 및 대기중 산소에서 37℃에서 성장시켰다. 또한, 태반-유래된 세포 (배치 101503)를 5% 산소 또는 베타-메르캅토에탄올(BME)에서 성장시켰다. 각각의 세포 샘플에 의해 생성된 MCP-1, IL-6, VEGF, SDF-1알파, GCP-2, IL-8, 및 TGF-베타 2의 양을 ELISA 분석법에 의해 측정하였다 (미국 미네소타주 미니애폴리스 소재의 알앤디 시스템즈). 모든 분석을 제조업자의 설명서에 따라 수행하였다.
케모카인 (MIP1a, MIP1b, MCP-1, Rantes, I309, TARC, 에오탁신, MDC, IL8), BDNF, 및 혈관 신생 인자 (HGF, KGF, bFGF, VEGF, TIMP1, ANG2, PDGF-bb, TPO, HBF-EGF)를 서치라이트(등록상표) 프로테옴 어레이즈(Proteome Arrays) (피어스 바이오테크놀로지 인크.(Pierce Biotechnology Inc.))를 사용하여 측정하였다. 프로테옴 어레이즈는 웰당 2 내지 16가지의 단백질의 정량적 측정을 위한 다중 샌드위치 ELISA이다. 상기 어레이는 96웰 플레이트의 각각의 웰 내에 4 내지 16가지의 상이한 포착 항체의 2 × 2, 3 × 3, 또는 4 × 4 패턴의 스포팅(spotting)에 의해 생성된다. 샌드위치 ELISA 절차 이후에, 전체 플레이트를 플레이트의 각각의 웰 내에서 각각의 스폿(spot)에서 발생된 화학발광 신호를 포착하도록 영상화한다. 각각의 스폿에서 발생된 신호의 양은 원래의 표준물 또는 샘플 중 표적 단백질의 양에 비례한다.
MCP-1 및 IL-6은 제대 조직-유래된 세포 및 피부 섬유모세포에 의해 분비되었다 (표 13). SDF-1알파는 섬유모세포에 의해 분비되었다. GCP-2 및 IL-8은 BME 또는 5% O2의 존재 하에 배양된 제대 조직-유래된 세포에 의해 분비되었다. GCP-2도 인간 섬유모세포에 의해 분비되었다. TGF-베타2는 ELISA 분석에 의해서는 검출가능하지 않았다.
Figure pct00016
TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MIP1b, MCP1, RANTES, I309, TARC, MDC, 및 IL-8이 제대 조직-유래된 세포로부터 분비되었다 (표 14 및 표 15). Ang2, VEGF, 또는 PDGF-bb는 전혀 검출되지 않았다.
Figure pct00017
Figure pct00018
제대 조직-유래된 세포는 다수의 고도로 유익한 영양 인자를 분비하였다. 이들 영양 인자들 중 일부, 예를 들어 이화 저해제인 TIMP1은 매트릭스 메탈로프로테아제에 의한 세포외 매트릭스 분해의 방지에 있어서 결정적인 역할을 한다. HGF, bFGF, MCP-1 및 IL-8은 세포 생존 및 세포 분화 기능에서 중요한 역할을 한다. 다른 영양 인자, 예를 들어 BDNF 및 IL-6은 신경 재생에서 중요한 역할을 한다.
실시예 8
HMG-CoA 리덕타아제 저해제에 의한, 확장된 인간 제대 조직-유래된 세포 상에서의 HLA-DR, DP, DQ의 IFN-감마-유도 발현의 저해
배양-확장된 인간 제대 조직-유래된 세포 (022803 P4) 를 6웰 조직 배양 플레이트 내에 접종하고, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)-저 글루코스, 15% 소 태아 혈청(FBS), 페니실린/스트렙토마이신 (P/S), 베타메르캅토에탄올(BME)에서 대략 70% 융합도로 배양하였다. 그 후, 세포를 10 mM의 각각의 HMG-CoA 리덕타아제 저해제 (DMSO 중 10 mM 스톡 시약으로 제형화된 심바스타틱산 (스위스 라우젠 소재의 알렉시스 바이오케미칼즈(Alexis Biochemicals)) 또는 DMSO 비히클 - 0.1% (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)를 함유하는 배지로 처리하고, 하룻밤 인큐베이션하였다. 배지를 흡인에 의해 제거하고, 500 U/ml의 rhIFN-감마 (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 비디 파밍젠) 및 10 mM의 각각의 HMG-CoA 리덕타아제 저해제를 함유하는 배지로 대체하고, 3일 동안 인큐베이션하였다. 3일에, 세포를 트립신을 이용하여 수확하였다.
수확된 세포를 PBS로 1회 세척하고, 20 ml의 FITC-표지 HLA-DR,DP,DQ (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 비디 바이오사이언시즈) 또는 FITC-표지 IgG 항체 (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 비디 바이오사이언시즈)를 포함하는 PBS 중 3% FBS 100 ml에 재현탁시키고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS에서 1회 세척하고, 500 ml의 PBS에서 재현탁시키고, FACSCalibur 유세포 분석기 (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 비에스 바이오사이언시즈(BS Biosciences))에서 분석하였다.
Figure pct00019
표 16에 나타낸 바와 같이, 염증성 사이토카인 IFN-감마와 함께 인큐베이션시킨, 비처리된 그리고 0.1% DMSO 비히클 대조군 인간 제대 조직-유래된 세포는 유세포 분석법에 의해 검출되는 증가된 형광에 의해 관찰되는 바와 같이 HLA-DR, DP, DQ 발현의 증가를 나타냈다. HMG-CoA 리덕타아제 저해제로 전처리하고, 후속적으로 IFN-감마와 함께 인큐베이션한 인간 제대 조직-유래된 세포는 비처리된 대조군 및 비히클 대조군과 유사한 HLA-DR, DP, DQ 발현을 나타냈다.
이 데이터는 HMG-CoA 리덕타아제가 인간 제대 조직-유래된 세포에서 HLA-DR, DP, DQ의 염증성 사이토카인-매개된 발현을 저해함을 나타낸다.
실시예 9
추간판 퇴화의 토끼 모델에서의 인간 제대 조직-유래된 세포(hUTC)의 효능
인간 제대 조직-유래된 세포(hUTC)가 추간판(IVD) 퇴화의 토끼 모델에서 효과적인지를 결정하기 위하여 연구를 행하였다. 세포를 상해 부위에 주사하고, 디스크 치수를 X선 영상화에 의해 평가하였다. 조직의 분석을 검시로 수행하였다.
추간판(IVD) 퇴화에 대한 인간 제대 조직-유래된 세포(hUTC)의 영향을 평가하기 위하여, hUTC를 천자된 IVD 내에 주사하였다. 격주로 X선을 수득하고, 상해를 입은 비히클 처리된 대조군과 비교하여 디스크 높이의 변화에 대하여 분석하였다. hUTC를 이용한 처리는 비히클 대조군과 비교하여 회복률을 증가시킬 뿐만 아니라 디스크 높이도 증가시켰다.
디스크 퇴화 모델의 생성: 6개월령의 암컷 NZW 토끼를 어떠한 체계적 편향도 없이 선택하였다. 동물을 태그하고(tagged), 등록 이전에 그리고 검시 직전에 칭량하였다. 토끼는 글리코파이롤레이트 (0.01 내지 0.02 ㎎/㎏ SQ)를 받은 후 진정제 투여를 하여서 마취와 결부된 서맥을 줄이고 구기관(orotracheal) 분비를 감소시켰다. 부프레노르핀 (부프레노르핀 HCI 0.03 ㎎/㎏)을 선행 진통제로서 수술 전에 주었다. 토끼를 케타민 하이드로클로라이드 (25 ㎎/㎏) 및 아세프로마진 말레에이트 (1 ㎎/㎏, 10 ㎎/ml)의 투여에 의해 마취시켜 기관내 삽관을 용이하게 하였다. 수술전 X선 촬영을 기저선 대조군으로서 하였다. 수술전 방사선 사진을 완료한 후 5 ㎎/㎏의 자일라진을 피하 또는 근육내 제공하였다. 동물을 아이소플루란 흡입에 의해 유지하였다 (2-3%에서 유도하고, 0.5-2%에서 유지하였다).
토끼 (3.5 ㎏으로 칭량됨)를 측복와위(lateral prone position)로 두었다. 프레핑(prepping) 및 드레이핑(draping) 후, 요부(lumbar) IVD를 요근의 둔적 박리에 의해 후측방 복막후 접근을 통하여 노출시켰다. 3개의 연접 요부 IVD (L2/3, L3/4 및 L4/5)의 전방 표면을 노출시켰다. 니들이 5 ㎜의 깊이까지 갈 수 있게 하는 정지 장치를 갖춘 18G 니들을 이용하여, L2/3 및 L4/5 수준에서 섬유륜을 복부 방향으로 천자하여 수핵 내로 들어갔다. 혈관 스테이플 및 봉합사를 마커로서 L3/4 수준에서 요근 상에 두었다. 생성된 외과적 창상을 겹겹이 회복시켰다. 피부를 스테이플을 사용하여 봉하였다.
수술 후, 수술 후 X선 촬영을 하여 천자의 수준을 확인하였다. 1.5 ㎎의 멜록시캄을 경구로 제공하였다 (수술 1일 전 및 수술한지 2-3일 후). 필요할 경우, 수의과 스태프와 협의하여 진통제 (부프레노르핀 HCl 0.01 - 0.03 ㎎/㎏)를 2-3일 동안 매일 최대 2회 제공하였다. 마취로부터의 회복 후, 토끼를 그의 케이지로 되돌리고, 임의로 움직이게 하였다. 토끼 재킷을 토끼에 사용하여 토끼가 외과적 절개부에 도달하여 이를 건드리는 것/열개되게 하는 것을 못하게 하고 스테이플을 제거하는 것을 못하게 하였다.
처리의 평가: 처음 수술 (륜 천자)을 한 지 4주 후, 유사한 외과적 절차를 반대면에서 하여 제1 수술로부터 형성된 반흔으로부터 출혈이 되지 않게 하였다. 일단 외과적 퇴화 디스크를 X선 및 시각적 검사로 확인하였으면, PBS, 1,000,000개 또는 100,000개의 세포를 각각의 토끼에 있어서 L2/3 및 L4/5 둘 모두의 수준에서 28G 니들을 사용하여 미세시린지를 이용하여 수핵 영역 내로 디스크내로 주사하였다. L3/4를 천자하지 않은 비처리된 대조군으로 남겨 두었다. 외과적 창상의 회복 후, 토끼를 그의 케이지로 되돌리고, 면밀히 모니터링하였다. 이전에 기재한 바와 같이, 항생제 및 진통제를 3일 동안 투여하였다. 각각의 토끼는 1.5 ㎎의 멜록시캄을 경구로 받았다 (수술 1일 전 및 수술한지 2-3일 후). 거동, 식욕 및 체중 변화를 면밀히 모니터링하고, 수의과 스태프 및 조사자는 수술 후 스트레스를 모니터링하였다.
모든 주사 물질을 살균 조건 하에 제조하였다. 연구 등급 hUTC (로트 Q030306)를 살균성, 마이코플라스마, 핵형, 및 병원체에 대하여 평가한 것을 이 연구에 사용하였다. 극저온 보관된 세포를 신속하게 해동시키고, PBS에서 희석시켰다. 세포를 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 세포를 PBS에 재현탁시키고, 계수하여 마이크로리터당 100,000개 또는 10,000개의 세포의 최종 세포 농도를 성취하였다. 트립판 블루를 사용하여 생존능을 평가하였다. 10 마이크로리터의 세포를 예비 살균한 미세시린지 내에 로딩하고, IVD 내에 주사하였는데, 이는 상기에 설명한 바와 같았다.
천자 후 2주, 4주, 6주, 8주, 10주, 12주, 14주 및 16주에, 그리고 천자 후 16주에서의 희생시에, IVD 높이를 측정하기 위한 X선 촬영을 케타민 하이드로클로라이드 (25 ㎎/㎏) 및 아세프로마진 말레에이트 (1 ㎎/㎏)의 투여 후에 하였다.
처음의 륜 천자 후 16주에 (이는 주사 (세포) 후 12주에 상응함), 각각의 군 내의 8마리의 토끼를 케타민 하이드로클로라이드 (25 ㎎/㎏) 및 아세프로마진 말레에이트 (1 ㎎/㎏)로 마취시키고, 과도한 용량의 펜토바르비탈 (90 ㎎/㎏, 안락사용 B 용액: 미국 뉴욕주 멜빌 소재의 헨리 쉐인 인크.(Henry Schein Inc.))을 이용하여 안락사시켰다.
천자 전, 천자 후 각 시점, 및 안락사에서 획득한 X선 필름을 디지털화하고, 추체 높이 및 디스크 높이를 측정하였다. IVD 높이를 공개된 방법에 따라 DHI로서 표현하였다 (문헌[Chujo et al., Spine, 2006; 31:2909-17]; 문헌[Masuda et al., Spine, 2006; 31:742-54]). 처리군을 알지 못하는 정형외과 연구자는 독립적으로 모든 X선 영상을 해석하였다. 디지털화된 X선, 추체 높이 및 IVD 높이를 포함하는 측정치를 MATLAB 소프트웨어 (미국 매사추세츠주 소재의 나틱(Natick))용의 주문 프로그램을 이용하여 분석하였다. 데이터를 엑셀(Excel) 소프트웨어로 전송하고, IVD 높이를 디스크 높이 인덱스(DHI = IVD 높이 / 인접 IVD체 높이)로서 표현하는데, 이는 문헌[Lu et al., Spine, 22:1828-34 (1997)]의 방법을 약간 변경시킨 것을 기초로 하였다. 평균 IVD 높이 (DHI)는 IVD의 전방, 중간 및 후방 부분으로부터 수득된 측정치들을 평균하고 이를 인접 추체 높이들의 평균치로 나눔으로써 계산하였다. DHI (%)를 (수술 후 DHI/수술 전 DHI) × 100으로 표현하였다. 더욱이, DHI (%)를 대조 수준으로서 L3/4 수준을 이용하여 정규화하였다. 정규화된 DHI (%) = (실험 수준의 DHI (%) / L3/4의 DHI (%)) × 100이다. 또한 회복률을 하기와 같이 계산하였다: (DHI (%) (시점) - DHI (%) (4W [천자])) / (100 - DHI (%) (4W [천자])).
X선 측정치에서의 데이터의 평균들의 차이의 유의도를 사후 검정으로서 이원 반복 측정 ANOVA, 또는 일원 ANOVA 및 피셔(Fisher) PLSD에 의해 분석하였다. 모든 데이터를 평균 ± 표준 오차로서 표현하였다. 통계 분석을 스탓뷰(Statview) (버전 5.0, SPSS, 미국 일리노이주 시카고) 프로그램 패키지를 사용하여 수행하였으며, 이때 유의도 수준은 p<0.05였다.
디스크 높이 인덱스를 상기에 설명한 바와 같이 격주로 평가하였다. 결손율이 10% 미만인 디스크를 이 연구에서 배제시켰다. 데이터 (표 17에 나타냄)는, 이식 후 2-12주 (천자 후 6-16주) (p<0.05, hUTC (1,000,000개) 대 hUTC (100,000개), 이식 후 2, 4, 6, 및 14주; p<0.01, 이식 후 8주) 사이에서 대조군과 비교하여 회복률이 100,000개의 세포의 hUTC 용량에 의해 증가하였으며, 1,000,000개의 세포의 용량에 의해 감소하였음을 나타낸다.
Figure pct00020
회복률을 상기에 기재한 바와 같이 측정하였다. 결손율이 10% 미만인 디스크를 이 연구에서 배제시켰다. 데이터 (표 18에 나타냄)는, 이식 후 2-12주 (천자 후 6-16주) 사이에서 대조군과 비교하여 회복률이 100,000개의 hUTC 용량에 의해 증가하였으며, 1,000,000개의 용량에 의해 감소하였음을 나타낸다. (p<0.05, 대조군 대 hUTC (100,000개의 세포), 이식 후 2 내지 14주; p<0.01, 이식 후 12주).
Figure pct00021
따라서, IVD 퇴화에 대한 hUTC의 영향은 천자된 IVD 내에 hUTC를 주사당 1,000,000 및 100,000개의 세포의 용량으로 주사함으로써 IVD 퇴화의 토끼 모델에서 평가하였다. 격주 X선을 수득하고, 비처리된 천자된 대조군과 비교하여 디스크 높이의 변화에 대하여 분석하였다. 데이터는, 100,000개의 농도의 hUTC를 이용한 처리가 디스크 높이를 증가시키고, 여기서 1,000,000개의 농도로 처리하면 PBS-처리된 대조군과 비교하여 디스크 높이가 감소함을 나타냈다 (표 17). 데이터의 추가의 분석은, hUTC (100,000개)로 처리한 디스크의 회복률 (회복량/정규화된 DHI (%)의 총 감소율)이 대조군의 것보다 더 높음을 나타냈다 (표 18).
실시예 10
시험관 내에서의 인간 제대 조직-유래된 세포에 의한 세포외 매트릭스 단백질의 발현
시험관 내에서 hUTC에 의한 3가지 세포외 매트릭스 단백질, 아그레칸, 콜라겐 I 및 콜라겐 II의 발현 정도를 결정하기 위하여 연구를 행하였다. 세포를 단독으로 그리고 영양 인자, TGF-베타, GDF-5 및 PDGF-BB를 이용한 자극 후 시험하였다.
인간 제대 조직-유래된 세포(hUTC; 로트: 120304)의 배양물을 표준 조건 하에 배양 중 상태로 유지하였다. 간략하게는, 세포를 T-플라스크 내에 제곱 cm당 5000개의 세포로 접종하였으며, 이때 3-4일마다 계대 및 재접종하였다. 영양 인자 실험용 세포를 알기네이트 비드 내에 봉지하고, 인자들을 표준 성장 배지에 첨가한 것으로 처리하였다. 배양물에 100 ㎍/ml의 아스코르브산을 보충하였다. 시험한 인자들은 10 ng/ml의 PDGF-BB, 5 ng/ml의 TGF베타-1 및 200 ng/ml의 GDF-5였다. 5개의 처리군, hUTC 단독, hUTC + GDF-5, hUTC + TGF-베타1, hUTC + PDGF-BB 및 hUTC + TGF-베타1 및 GDF-5를 생성하였다.
배양 중 2주 후, 세포를 알기네이트로부터 방출시키고, 세척하고, 펠렛화하고, 냉동시켰다. RNA를 단리하고, 역전사를 수행하여 cDNA를 생성하였다. 아그레칸, 콜라겐 제I형 및 제II형의 발현에 대하여 샘플을 실시간 PCR로 분석하였다.
실시간 PCR 분석으로부터의 결과는 5가지의 상이한 배양 조건 하에서의 발현을 나타낸다. 결과를 표 19에 나타내며, 성장 인자 처리를 하지 않은 hUTC에 대한 상대적인 발현으로서 표현한다. PDGF-BB 및 GDF-5 + TGF-베타1로 처리한 배양물은 아그레칸, 콜라겐 I 및 콜라겐 II의 비견되는 발현을 나타냈다. TGF-베타1로 처리한 세포는 콜라겐 I 및 콜라겐 II의 약간의 유도 및 대략 10-20배의 아그레칸을 나타냈다. 최고 유도는 GDF-5 처리에 의해 관찰되었다. 세포는 대략 50배의 아그레칸 및 제I형 콜라겐의 증가 및 300배 초과의 제II형 콜라겐 발현 증가를 나타냈다.
Figure pct00022
실시예 11
제대-유래된 세포에서의 텔로머라아제 발현
텔로머라아제는 염색체의 완전성을 보호하고 세포의 복제 수명을 연장시키는 역할을 하는 말단 소립 반복체를 합성하는 기능을 한다 (문헌[Liu, K, et al., PNAS, 1999; 96:5147-5152]). 텔로머라아제는 2개의 구성요소, 텔로머라아제 RNA 주형 (hTERT) 및 텔로머라아제 역전사효소 (hTERT)로 이루어진다. 텔로머라아제의 조절은 hTERT가 아니라 hTERT의 전사에 의해 결정된다. 따라서 hTERT mRNA를 위한 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)은 세포의 텔로머라아제 활성을 결정하는 용인된 방법이다.
세포 단리. 실시간 PCR 실험을 수행하여 인간 제대 조직-유래된 세포의 텔로머라아제 생성량을 결정하였다. 인간 제대 조직-유래된 세포를 상기에 기술한 실시예에 따라 준비하였다. 일반적으로, 정상 분만 후 NDRI (미국 펜실베이니아주 필라델피아 소재)로부터 획득한 제대를 세척하여 혈액 및 잔사를 제거하고, 기계적으로 해리시켰다. 그 후, 조직을 37℃에서 배양 배지 중에서 콜라게나아제, 디스파아제 및 하이알루로니다아제를 포함하는 소화 효소와 함께 인큐베이션하였다. 인간 제대 조직-유래된 세포를 상기 실시예에 기술한 방법에 따라 배양하였다. 중간엽 줄기 세포 및 정상 피부 섬유모세포 (cc-2509 로트 번호 9F0844)를 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 캄브렉스로부터 획득하였다. 만능성 인간 고환 태생성 암종 (기형종) 세포주 nTera-2 세포 (NTERA-2 cl.Dl), (문헌[see, Plaia et al., Stem Cells, 2006; 24(3):531-546] 참조)를 ATCC (미국 버지니아주 매너서스 소재)로부터 구매하고, 상기에 기술한 방법에 따라 배양하였다.
전체 RNA 단리. RNA를 알엔이지(등록상표) 키트 (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)를 사용하여 세포로부터 추출하였다. RNA를 50 마이크로리터의 DEPC-처리된 물로 용출시키고, -80℃에서 보관하였다. RNA를 탁맨(등록상표) 역전사 시약 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈)을 이용하여 25℃, 10분; 37℃, 60분; 및 95℃, 10분에서 랜덤 헥사머를 사용하여 역전사시켰다. 샘플을 -20℃에서 보관하였다.
실시간 PCR. 제조업자의 설명서 (어플라이드 바이오시스템즈)에 따라, 어플라이드 바이오시스템즈 어세이즈-온-디맨드™ (탁맨(등록상표) 진 익스프레션 어세이즈(Gene Expression Assays)로도 공지됨)를 사용하여 cDNA 샘플에서 PCR을 수행하였다. 이 상업적 키트는 인간 세포에 있어서 텔로머라아제에 대하여 분석하는 데 널리 사용된다. 간략하게는, hTERT (인간 텔로머라아제 유전자) (HsOO162669) 및 인간 GAPDH (내부 대조군)를 cDNA 및 탁맨(등록상표) 범용 PCR 마스터 믹스와 혼합하였는데, 이는 ABI 프리즘 7000 SDS 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템즈)를 갖춘 7000 서열 검출 시스템을 이용하였다. 서멀 사이클(Thermal cycle) 조건은 처음에 50℃, 2분 및 95℃, 10분, 이어서 95℃, 15초 및 60℃, 1분의 40 사이클이었다. PCR 데이터를 제조업자의 설명서에 따라 분석하였다.
인간 제대 조직-유래된 세포 (ATCC 등록 번호 PTA-6067), 섬유모세포, 및 중간엽 줄기 세포를 hTERT 및 18S RNA에 대해 분석하였다. 표 20에 나타낸 바와 같이, hTERT, 및 따라서 텔로머라아제는 인간 제대 조직-유래된 세포에서 검출되지 않았다.
Figure pct00023
인간 제대 조직-유래된 세포 (단리체 022803, ATCC 등록 번호 PTA-6067) 및 nTera-2 세포를 분석하였고, 그 결과는 2 로트의 인간 제대 조직-유래된 세포에서 텔로머라아제의 발현을 나타내지 않았지만, 기형종 세포주는 높은 수준의 발현을 나타내었다 (표 21).
Figure pct00024
그러므로, 본 발명의 인간 제대 조직-유래된 세포는 텔로머라아제를 발현하지 않는 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 12
수핵 내로의 인간 제대 조직 유래된 세포의 주사는생체 내에서 추간판 퇴화의 과정을 변화시킨다.
이 실시예는 IVD 퇴화의 외과적 생체 내 모델에서 인간 제대 조직-유래된 세포(hUTC)를 수핵(NP) 내로 직접 주사하는 것의 유용성을 조사한다. hUTC를, 하이드로겔 담체를 이용하거나 이용하지 않고, 주사하였다. 이러한 연구는 이러한 퇴화 모델에서의 처리에 대한 MRI 및 생체역학적 응답을 조사하는 최초의 것들 중 하나이다.
방법
하기에 더욱 상세하게 기재된 바와 같이, 30마리의 골격 성숙(skeletally mature) 뉴질랜드 화이트 토끼 (대조군 n=6, 천자 n=6, 하이드로겔 담체 n=6, 세포 + PBS 완충제 n=6, 세포 + 하이드로겔 담체 n=6)를 추간판 퇴화에 대해 미리 인증된 토끼 섬유륜절제(annulotomy) 모델에서 사용하였다 (문헌[Sobajima et al. Spine. 2005; 30(1):15-24] 참조). 디스크 L2-3, L3-4, 및 L4-5를, 16G 니들을 사용하여 천자하여 퇴화를 유발한 다음, 후속적으로 하이드로겔 담체를 이용하거나 이용하지 않고 인간 제대 조직 유래된 세포로 처리하였다. 3T 무릎 코일을 사용하여 0, 3, 6, 및 12주에 얻은 연속 척추 MRI를 미리 인증된 방법론에 따라 퇴화의 증거에 대해 분석하였다. 토끼들을 12주에 희생시키고 디스크 L4-5를 조직학적으로 분석하였다. 단축 하중-정규화 변위 검정(uniaxial load-normalized displacement testing)을 사용하여 L3-4 디스크의 점탄성 특성을 분석하였다. 미리 인증된 2상 지수 모델(two-phase exponential model)에 따라 크리프 곡선을 수학적으로 모델링하였다.
토끼
30마리의 건강한 골격 성숙 뉴질랜드 화이트 토끼를 이 연구에 사용하였다 (암컷, 연령 1살, 체중 5㎏). 이들을 비천자 대조군 (n=6), 천자 (n=6), 천자 후에 담체만 주사 (n=6), 천자 후에 PBS 완충제 중 세포를 주사 (n=6), 및 천자 후에 담체 중 세포를 주사 (n=6)로 나누었다.
샘플 제조
질 분만 또는 제왕절개 분만을 겪은, 동의를 얻은 공여체로부터 인간 제대 조직을 얻었다. 인간 제대 조직-유래된 세포(hUTC)를 단일 공여체의 제대로부터 단리하고 확장시켰다. 간략하게는, 제대를 손으로 잘게 다지고, 0.5 단위/ml 콜라게나아제 (노르드마크(Nordmark)), 5.0 단위/ml, 디스파아제 (로쉐 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics), 및 2 단위/ml 하이알루로니다아제 (아이에스티에이 파마슈티칼스(ISTA Pharmaceuticals))의 혼합물을 사용하여, 거의 완전히 소화될 때까지 소화시켰다. 세포 현탁물을 체에 통과시켜 소화되지 않은 조직을 제거하고, 세포를 원심분리하고, 성장 배지 1 (DMEM-저 글루코스 (캄브렉스/SAFC 바이오사이언시즈(Biosciences)), 15% (vol/vol) 규정 소 태아 혈청(FBS; 하이클론, 미국 유타주 로간 소재), 0.001% 베타메르캅토에탄올 (시그마), 50 U/ml 페니실린 및 50 ㎍/ml 스트렙토마이신 (론자(Lonza))) 중에서, 돼지 젤라틴-코팅된 플라스크 상에 5,000개의 세포/㎠로 접종하였다. 37°에서 대기중 산소와 5% 이산화탄소 중에서 표준 조직 배양 조건 하에, 세포를 5회 집단 배가 (PD)에 도달할 때까지 정적 T-플라스크에서 확장시키고, 은행화하였다(banked). 이어서, 정적 T-플라스크에서 세포를 성장 배지 2 (DMEM-저 글루코스, 15% (vol/vol) 규정 소 태아 혈청 (FBS; 하이클론), 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 (인비트로겐)) 중에서 대략 12 누적 PD로 확장시키고, 은행화하였다. 이어서, 세포를 성장 배지 2 중에서 스피너(spinner) 플라스크 (미국 뉴욕주 소재의 코닝(Corning)) 내의 힐렉스(Hillex)(등록상표) II 마이크로캐리어 (솔로힐 엔지니어링(SoloHill Engineering)) 상에서 추가로 확장시켰다. 세포가 담긴 스피너 플라스크를 60 rpm으로 설정된 스피너 플레이트 상에 놓고, 대략 25 내지 30회의 총 누적 집단 배가에 도달할 때까지, 37 ℃에서 대기중 산소와 5% 이산화탄소 중에서 표준 조건 하에 세포를 배양하였다. TrypLE™ (인비트로겐)을 사용하여 마이크로캐리어로부터 세포를 수확하고, 저온보존하고, 극저온 온도에서 보관하였다. 안전성 및 아이덴티티를 보장하기 위해, 생존성, 회수율, 살균성, 내독소, 마이코플라스마, 핵학 및 세포 표면 마커 면역표현형 분석을 포함하는 특성 시험을 위해 세포 은행의 분취물을 해동시켰다. PCR-기반 방법에 의한 바이러스 병원체에 대한 초기 계대에서 세포를 시험하여 HIV-1, HIV-2, CMV, HBV, HCV, HTLV 및 EBV에 특이적인 핵산 서열을 검출하였다. 세포는, 전달 직전에 주사를 위해 사용 및 준비될 때까지 극저온 온도에서 보관하였다. 동물에 주사하기 직전에, 세포 바이알을 37℃ 수조에서 해동시킨 다음, PBS로 세척하였다. 세포 현탁물의 분취물을 꺼내고 트립판 블루와 혼합하고 혈구 계산기로 계수하였다. 전달을 위한 적절한 밀도로 세포 농도를 조정하였다. 담체 용액은 PBS, 또는 에비셀(EVICEL)(등록상표) 피브린 글루 (에비셀(등록상표) 피브린 글루(인간), 옴릭스 파마슈티칼즈, 리미티드)의 성분으로부터 유래된 원위치 형성 하이드로겔 담체 중 어느 하나였다. 세포를 하이드로겔 중에 로딩하기 위해서, 세포를 PBS 중 인간 피브리노겐 (6.8 내지 10.6 ㎎/ml)과 혼합하였다. 이러한 시약을 PBS 중 인간 트롬빈 (0.4 내지 0.6 U/ml)과 혼합하였다. 혼합 직후에 겔화가 발생하였다.
천자 수술
수의사 수술실에서, 살균 외과적 조건 및 일반적인 마취 하에, 좌측 전외측 접근으로부터 토끼의 요추를 노출시켰다. L4-5 추간판을, 장골능에 대한 그의 위치에 기초하여 확인하였고, 16 게이지 니들을 사용하여 5 ㎜의 깊이로 천자하여 니들의 팁이 디스크의 중앙에 오게 하였다. 니들은 머리 쪽으로 향해 비스듬한 종판에 평행하게 디스크로 들어갔다. 직접적인 시각화 및 촉진에 의해 디스크 L3-4 및 L2-3을 후속적으로 확인하였고, 상기와 같이 천자하였다. 수술 후에, 토끼를 비제한적인 운동이 허용되는 큰 프라이빗 케이지에 수용하였다. 이러한 방법에 의한 토끼의 IVD의 섬유륜 절제는, 연속 T2 가중 MRI에 의해 입증되는, 느리고 신뢰성 있으며 재생가능한 퇴화 캐스케이드를 유도한다 (문헌[Masuda et al. Spine. 2005; 30(1):5-14] 참조).
주사 수술
처리 군의 토끼를 초기 천자 수술 3주 후에 수술실로 돌려보냈다. 척추를 우측 전외측 접근으로부터 노출시켰다 (이전의 천자 수술에 대해 대측성). 해밀턴(Hamilton) 100 마이크로리터 시린지 (1710TPLT; 품번 81041) 및 플라스틱 허브를 갖는 해밀턴 30 게이지 샤프 팁 니들 (KF 730 NDL 6/pack, 30G/2"; 품번 90130)을 NP의 중심 내로의 치료적 주사를 위해 사용하였다. 담체군에 대해서는, 15 마이크로리터의 하이드로겔을 시린지 내로 끌어당겨 넣고, 이어서, 각각의 디스크 내로 천천히 주사하였다 (겔화 전 액체 주사를 용이하게 하기 위해 4.5분 미만으로). 세포 + 완충제 (인산염 완충 염수) 군의 경우에는, 15 마이크로리터의 살균 PBS 중 105 세포를 각각의 디스크 내로 주사하였다. 담체 중 세포 군의 경우에는, 15 마이크로리터의 하이드로겔 담체 중 105 세포를 주사하였다. 니들이 디스크의 중심에 오는 것을 확인하기 위해서, 주사는 c-암(arm) 가이던스 하에 수행하였다. 디스크 압력의 신속한 증가 및 후속적인 물질의 분출을 피하기 위해, 모든 주사는 1분 동안에 걸쳐 신중하게 느리고 일정한 속도로 수행하였다. 천자 수술에 대해 기재된 바와 같이 토끼를 가두고, 회복시키고, 돌봤다.
자기 공명 영상
시간 0 (륜 천자 이전), 3주 (주사 수술 이전), 6주, 및 12주 (희생 이전)에 시상면 MRI를 얻었다. 3 테슬라 지멘스 자석 및 표준 인간 무릎 코일을 사용하여 T1 가중 영상 (TR = 650 ms, TE = 14 ms, 슬라이스 두께 = 0.6 ㎜) 및 T2 가중 영상 (TR = 3800 ms, TE = 114 ms, 슬라이스 두께 = 0.6 ㎜)을 얻었다. 토끼를 진정시키고 반듯이 누운 자세로 무릎 코일 내에 넣었다. T1 가중 영상은, 척추에서의 임의의 골이상을 정성적으로 확인하는 데 사용하였다. T2 가중 영상은 디스크에서의 퇴화의 양을 정량하는 데 사용하였다. 훈련된 의사에 의해 추체, 척수, 및 극돌기의 폭에 기초하여 T2 가중 시퀀스의 정중-시상면 슬라이스를 확인하였다. 이전에 인증된 자동화 분할법(automated segmentation)을 이용하여 관심 영역으로서의 NP를 확인하였다 (문헌[Bechara et al. Am J Neuroradiology. 2010; 31(9):1640-1644] 참조). MRI 인덱스는 관심 영역 내의 각각의 픽셀에 대한 픽셀 면적과 픽셀 강도를 곱한 것을 합계하여 계산하였다. 3개의 관심 디스크에 걸쳐 0주에서의 대조군 값에 대한 백분율 NP 면적 및 MRI 인덱스를 평균하고 시점들에 대해 플롯하였다. 스튜던트 T-시험을 사용하여 통계적 유의도를 계산하였다 (p<0.05).
희생 및 샘플 처리
초기 천자 수술 12주 후에 (최종 MRI를 얻은 후에) 모든 토끼를 희생시켰다. 사망 직후에, 척추를 블록으로(en block) 절단하였다. 조직학적 분석을 위해 디스크 L4-5를 준비하였다. 디스크를 고정하고, 데칼시파이어(Decalcifier) I(등록상표) (서지패스 메디칼 인더스트리얼, 인크.(Surgipath Medical Indus., Inc.))를 사용하여 2주 동안 탈회시키고, 이어서, 조직학적 조직 프로세서에서 탈수시키고 파라핀 내에 박아넣었다. 다음으로, 디스크를 시상면에서 5 ㎛의 두께로 박편화하였다. 표준 조직학 프로토콜을 사용하여 박편을 헤마톡실린(Hematoxylin) 및 에오신(Eosin) (H&E) (시그마)으로 염색하고, 니콘(Nikon) E800 현미경을 사용하여 촬영하였다.
생체역학
희생 후에, 생체역학적 분석을 위해 디스크 L3-4를 기능적 척추 단위 (FSU, 골-디스크-골)로서 절단하였다. 샘플에서 후방 요소들을 세정하고, 샘플을 에폭시 수지 내에 담고, 커스텀 고정구를 사용해 샘플을, 매트랩(Matlab; 매트랩 R2008a, 미국 매사추세츠주 나틱 소재의 더 매스워크스, 인크(The Mathworks, Inc.)) 퍼지 로직 프로그램으로 제어되는 축 시험 기계에 장착하였다. 모든 디스크를 염수로 적신 거즈로 감싸서 탈수를 최소화하였고, 희생과 동일자에 시험을 수행하였다. 시편을 20 주기의 압축 하중 (0 내지 1.0 ㎫, 0.1 ㎜/s)으로 예비 컨디셔닝하고 이어서 1100초 동안 일정한 압축 (1.0 ㎫)을 겪게 하였다. 이러한 하중 목표는 일상 생활의 활동 중에 인간 IVD가 겪는 압력에 비견되기 때문에 선택되었다 (더 작은 크기의 토끼 디스크를 위해 조정됨) (문헌[Wilke et al. Spine. 1999; 24(8):755-762]). 초기 램프 기는 시험의 처음 200 마이크로초로서 정의되는 한편, 크리프 기는 시험의 나머지로서 정의된다. 시험 후에, 2기 지수 모델,
Figure pct00025
[여기서, d(t)는 시간에 걸친 축 변위이고, L 0 은 가해진 축 하중이고, S 1 및 S 2 는 탄성 감쇠 계수 (N/㎜)이고, η 1 및 η 2 는 다양한 감쇠 계수 (Ns/㎜)임]을 사용하여 크리프 곡선을 피팅하였다. 평균 곡선을 생성하고 각각의 조건에 대해 지수 모델을 사용하여 피팅하였다.
결과
토끼
처리의 결과로서 어떠한 군에서도 유해 효과가 관찰되지 않았다.
MRI
L2-3, L3-4, 및 L4-5 디스크의 T1 가중 정중시상면 MRI는 유의한 변화 또는 골극(osteophyte) 형성을 나타내지 않았다. T2 가중 정중시상면 MRI에 의하면, 비천자된 군과 비교하여, 천자된 군의 디스크는 퇴화되었다 (0 내지 12주에 흑화되고 붕괴된 ROI). 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이 3가지 처리군 모두는 천자된 군보다 정성적으로 더 적은 퇴화를 나타내었다. 천자된 (및 처리되지 않은) 디스크는, 시점들에 걸친 NP 면적의 59% 감소 및 MRI 인덱스의 64% 감소로, 최대의 퇴화를 나타내었다. 3가지 처리 군 모두는, 총 NP 면적 및 MRI 인덱스 둘 모두에 기초하여, 천자된 군보다 더 적은 퇴화를 나타내었다. 처리 군 중에서도 담체 + 세포 군은 면적 및 MRI 인덱스에 있어서 최소로 감소되었으며 대조군과 가장 밀접하게 유사하였다 (도 3). 0 및 3주에는, MRI 인덱스 또는 면적에 있어서 대조군과 3가지 처리 군 중 어느 것 및 천자 군 사이, 또는 천자 군과 처리 군들 사이에 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 6 및 12주에는, MRI 인덱스 또는 면적 둘 모두에 있어서 대조군과 천자 군 사이의 차이가 통계적으로 유의하였으며, 이는 유효 퇴화 모델에서 예상된 바와 같다. 대조군 및 담체 군은 6 및 12주에는 MRI 인덱스에 있어서, 그리고 12주에는 면적에 있어서 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다. 대조군 및 완충제 + 세포 군은 12주에 MRI 인덱스에 있어서 통계적으로 유의하게 상이하였다. 대조군 및 담체 + 세포 군은 6 및 12주 둘 모두에 MRI 인덱스 및 면적 둘 모두에 있어서 통계적으로 유의하게 상이하였다. 천자 군 및 담체 군은 시점들에 걸친 MRI 특성에 있어서 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다. 천자 군 및 완충제 + 세포 군은 6 및 12주 둘 모두에 MRI 인덱스 및 면적 둘 모두에 있어서 통계적으로 유의하게 상이하였다. 천자 군 및 담체 + 세포 군은 12주에 MRI 인덱스 및 면적에 있어서 유의하게 상이하였다.
생체역학
총 하중-정규화 변위 (초기 램프 기 및 후속적인 크리프 기)를 나타내는 곡선이 도 4에 제공되어 있다. 군들 사이의 차이에 대한 경향이 있다. 구체적으로, 대조군에 의해 생성되는 곡선은 담체 + 세포 군과 유사하며, 천자된 군은 완충제 + 세포 군과 유사하고, 담체 군은 이러한 군들 사이에 놓인다. 군들 사이의 변산도(variability)의 대부분은 초기 램프 기에 의한 것이다. 이러한 경향에도 불구하고, 2기 지수 모델을 사용하여 곡선의 크리프 기를 피팅하는 경우, 초기 및 후기 점성 및 탄성 감쇠 계수는 임의의 통계적으로 유의한 차이를 가져오지 않았다 (데이터는 도시되지 않음).
조직학
디스크 L4-5의 대표적인 시상 절단물을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하고 20x 및 100x 배율로 검사하였다 (도 5, 6 및 7). 대조 디스크는 그의 구조를 유지하였다. 예상되는 바와 같이, 천자된 디스크는 NP에서 섬유증 및 세포충실성(cellularity)의 손실을 나타내었으며, 이는 퇴화를 시사한다. 하이드로겔 담체로 처리된 천자된 디스크는 세포충실성의 일부 손실을 가져왔으나 튼튼한 세포외 기질을 유지하였다. 세포 + 완충제를 사용한 처리는 NP 면적의 상대적인 보존을 나타내었지만, 유의한 섬유증이 관찰되었다. 세포 + 담체를 사용한 처리는 천자된 디스크와 비교하여 개선된 세포충실성 및 구조를 야기하였다.
논의
이러한 실시예는, 추간판 퇴화 (IDD)를 정량할 뿐만 아니라, 디스크 퇴화에 대해 목표된 처리에 대한 응답을 나타내도록, 신규한 MRI 기술 및 생체역학을 포함하는 넓고 다양한 범위의 결과 측정을 포함한다. 이러한 실시예에서 상세하게 논의된 바와 같이, 처리 군들은 대조군 및 천자된 군의 값들과 구별되는 점탄성 특성을 나타내었다.
MRI, 조직학적, 및 생체역학적 기준에 기초하면, IDD를 겪는 토끼 요추 디스크 (IVD)에 대한 담체 중 hUTC의 주사는, 담체 단독 또는 세포 + 완충제 단독과 비교하여 유리한 효과를 갖는다. 3가지 처리 모두가 비처리된 천자된 디스크와 비교하여 유리한 것으로 나타났다. MRI 상에서, 3가지 처리 군 모두에 대한 수핵 (NP) 면적 및 인덱스는 대조군 (퇴화되지 않음)과 천자된 (가장 퇴화된) 조건 사이에 있었으며, 이는 그러한 처리가 디스크 높이 및 신호 강도 변화를 지연시키는 데 부분적으로 도움이 되었음을 나타낸다. 축 하중은 각각의 조건에 대해 별개로 나타나는 변위 곡선을 발생시켰다. 조직학은 처리에 의한 디스크 구조 및 세포충실성의 가변적 회복을 나타내었다.
세포 + PBS 군은 대조군과 천자된 군의 값들 사이에 있는 MRI 데이터를 발생시켰으며, 담체 군의 MRI 데이터와 매우 유사하게 나타났다. 그러나, 이러한 군의 변위 곡선은 천자된 상태와 가장 유사하였으며, 이는 이러한 처리가 MRI 상의 NP 면적과 신호 강도를 회복하는 데 부분적으로 도움을 주었지만, 디스크의 본래의 기계적 특성을 회복하는 데 매우 효과적이지는 않았음을 시사한다.
담체 단독 군은 천자된 군과 비천자된 군의 값들 사이에 오는 MRI 데이터를 발생시켰다. 본 실시예에서, 하이드로겔 군에 대한 변위 곡선은 또한 천자된 상태와 비천자된 상태 사이에 오며, 이는 하이드로겔 담체가 본래의 또는 이식된 세포에 의한 임의의 세포외 기질 합성과는 별개로 디스크에 대한 일부 기계적 특성을 회복할 수 있었음을 나타낸다. 담체 군으로부터의 조직학은 비세포 처리로부터 예상되는 것보다 큰 세포충실성을 가지며, 이는 아마도 하이드로겔이 본래의 세포가 자랄 수 있는 피난처를 제공하였음을 나타낸다.
세포 + 담체 군은 다른 두 군의 세포 이식체 및 하이드로겔 주사 둘 모두를 포함하였다. 이 군은 다른 두 처리 군보다 우수한 MRI 퇴화 측정에서의 일관되나 비-유의한 경향을 가졌다 (대조군 상태와 가장 유사하지만, 대조군 값들과는 여전히 유의하게 구분됨). 이 군은 또한 대조군 곡선과 가장 유사한 변위 곡선을 가졌으며, 이는 최적의 기계적 응답을 시사한다. 이 군으로부터의 조직학은 천자된 군과 비교하여 세포충실성에 있어서 현저한 증가를 가졌으며 상대적으로 구조를 보존하였으나, 섬유증의 증거가 있다.
토끼 디스크 내로의 인간 세포의 이식으로 인해 발생하는 면역 응답의 조직학적 증거는 없었다. 처리된 토끼 중 어느 것도 병의 징후를 나타내지 않았으며, 염증 응답의 조직학적 증거가 없었다.
인간 분만후 제대 조직은, 배아 줄기 세포 또는 태아 세포와 관련된 윤리적 문제 없이 공여체 조직이 즉시 입수가능하며 세포가 용이하게 수확되기 때문에, 치료적 세포에 대한 매력적인 공급원이다.
요약하면, 천자된 군은 비천자된 대조군과 비교하여 예상된 바와 같은 MRI 및 조직학적 퇴화 증거를 나타내었다. 처리 군들은 천자된 군보다 더 적은 MRI 및 조직학적 퇴화 증거를 나타내었다. 처리 군들은 대조군 및 천자된 군의 값들과 구별되는 점탄성 특성을 나타내었다. 이러한 연구는, 퇴화를 겪는 천자된 토끼 요추 IVD에 대한 (a) hUTC 및 (b) 하이드로겔의 주사가 IVD 퇴화 과정을 늦춘다는 것을 나타낸다. 하이드로겔 중 세포의 주사는 (a) hUTC 단독 또는 (b) 하이드로겔 단독 중 어느 하나보다 퇴화의 진행을 더욱 늦춘다. 따라서, 이러한 연구는, 하이드로겔 담체 용액을 이용하거나 이용하지 않고 인간 제대 조직 유래된 세포 (hUTC)를 사용한 천자된 토끼 추간판의 처리가 MRI, 조직학적, 및 생체역학적 특성들을 비천자된 대조군과 근접한 값으로 회복시키는 데 도움을 준다는 것을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> DEPUY SYNTHES PRODUCTS, LLC <120> TREATMENT OF INTERVERTEBRAL DISC DEGENERATION USING HUMAN UMBILICAL CORD TISSUE-DERIVED CELLS <130> 18668-332000 (0244C1WO) <150> US 13/111,933 <151> 2011-5-19 <160> 10 <170> KopatentIn 1.7 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 gagaaatcca aagagcaaat gg 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 agaatggaaa actggaatag g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 tcttcgatgc ttcggattcc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 gaattctcgg aatctctgtt g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 ttacaagcag tgcagaaaac c 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 agtaaacatt gaaaccacag cc 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 tctgcagctc tgtgtgaagg 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 cttcaaaaac ttctccacaa cc 22 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 cccacgccac gctctcc 17 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 tcctgtcagt tggtgctcc 19 3727711

Claims (35)

  1. 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 하이드로겔 및 인간 제대 조직으로부터 수득되는 단리된 균질한 세포 집단을 포함하는 약학 조성물을 상기 질환 또는 병태를 치료하기에 효과적인 양으로 추간판에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 제대 조직에는 혈액이 사실상 없고, 상기 단리된 균질한 세포 집단은 배양 중 자기 재생 및 확장이 가능하며, 분화 잠재력을 갖고, CD117 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단리된 세포 집단은 하기 특성들 중 하나 이상을 갖는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법:
    (a) 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현하는 것;
    (b) CD31, CD34 및 HLA-DR을 생성하지 않는 것;
    (c) 인간 섬유모세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여 증가된 수준의 산화 인터류킨 8 및 레티큘론 1을 발현하는 것; 및
    (d) CD10, CD13, CD44, CD73 및 CD90을 발현하는 것.
  3. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물을 주사에 의해 투여하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 적어도 하나의 다른 세포 유형 및/또는 적어도 하나의 에이전트(agent)를 추가로 포함하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 적어도 하나의 에이전트는 영양 인자인, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 영양 인자는 TGF-베타, GDF-5, PDGF-BB 및 TIMP1로 이루어진 군으로부터 선택되는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다른 세포 유형은 적어도 하나의 외인성 유전자 생성물을 발현하도록 엔지니어링되는(engineered), 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 외인성 유전자 생성물은 영양 인자인, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물을 퇴화된 추간판 내에 투여하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 약학 조성물을 추간판의 수핵 내에 또는 섬유륜 내에 투여하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 인간 제대 조직으로부터 수득되는 상기 단리된 균질한 세포 집단을 시험관 내에서 적어도 부분적으로 분화되도록 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단리된 균질한 세포 집단을 섬유륜 세포 표현형을 나타내는 세포로 분화되도록 유도하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 단리된 균질한 세포 집단을 수핵 세포 표현형을 나타내는 세포로 분화되도록 유도하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  14. 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 하이드로겔 및 인간 제대 조직으로부터 수득되는 단리된 균질한 세포 집단을 상기 질환 또는 병태를 치료하기에 효과적인 양으로 추간판에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 제대 조직에는 혈액이 사실상 없고, 상기 단리된 균질한 세포 집단은 배양 중 자기 재생 및 확장이 가능하며, 분화 잠재력을 갖고, CD117 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단리된 세포 집단은 하기 특성들 중 하나 이상을 갖는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법:
    (a) 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3 및 과립구 주화성 단백질을 발현하는 것;
    (b) CD31, CD34 및 HLA-DR을 생성하지 않는 것;
    (c) 인간 섬유모세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여 증가된 수준의 인터류킨 8 및 레티큘론 1을 발현하는 것; 및
    (d) CD10, CD13, CD44, CD73 및 CD90을 발현하는 것.
  16. 제14항에 있어서, 상기 단리된 균질한 세포 집단 및 상기 하이드로겔을 주사에 의해 투여하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 하이드로겔을 인간 제대 조직으로부터 수득되는 상기 단리된 균질한 세포 집단과 동시에, 또는 그 전에, 또는 그 후에 투여하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 단리된 균질한 세포 집단을 이식가능한 장치 내에 투여하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  19. 제14항에 있어서, 적어도 하나의 다른 세포 유형을 인간 제대 조직으로부터 수득되는 상기 단리된 균질한 세포 집단과 동시에, 또는 그 전에, 또는 그 후에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다른 세포 유형은 적어도 하나의 외인성 유전자 생성물을 발현하도록 엔지니어링되는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 외인성 유전자 생성물은 영양 인자인, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 외인성 유전자 생성물은 하나 이상의 세포외 매트릭스 단백질의 발현을 조정하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  23. 제14항에 있어서, 적어도 하나의 에이전트를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 적어도 하나의 에이전트는 영양 인자인, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 영양 인자는 TGF-베타, GDF-5, PDGF-BB 및 TIMP1로 이루어진 군으로부터 선택되는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 영양 인자는 인간 제대 조직으로부터 수득된 상기 단리된 균질한 세포 집단에 영양 효과를 발휘하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  27. 제14항에 있어서, 상기 단리된 균질한 세포 집단 및 하이드로겔을 퇴화된 추간판 내에 투여하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 단리된 균질한 세포 집단 및 하이드로겔을 상기 추간판의 상기 수핵 내에 투여하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 단리된 균질한 세포 집단 및 하이드로겔을 상기 추간판의 상기 섬유륜 내에 투여하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  30. 제14항에 있어서, 인간 제대 조직으로부터 수득되는 상기 단리된 균질한 세포 집단을 시험관 내에서 적어도 부분적으로 분화되도록 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 단리된 균질한 세포 집단을 섬유륜 세포 표현형을 나타내는 세포로 분화되도록 유도하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 단리된 균질한 세포 집단을 수핵 세포 표현형을 나타내는 세포로 분화되도록 유도하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  33. 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 하이드로겔을 상기 질환 또는 병태를 치료하기에 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 하이드로겔은 피브리노겐 및 트롬빈을 포함하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 하이드로겔은 피브린 글루(fibrin glue)를 포함하는, 추간판 퇴화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
KR1020137033719A 2011-05-19 2012-05-17 인간 제대 조직-유래된 세포 및 하이드로겔을 이용한 추간판 퇴화의 치료 Expired - Fee Related KR101914918B1 (ko)

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