KR20140036144A

KR20140036144A - 고수율 현탁세포주, 시스템 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20140036144A
Application number: KR1020137020564A
Authority: KR
Inventors: 가브리엘라 디. 씨. 데닝; 리차드 이. 거트니
Original assignee: 익스프레션 테라퍼틱스 엘엘씨
Priority date: 2011-01-05
Filing date: 2012-01-05
Publication date: 2014-03-25
Also published as: CA2823639A1; MX2013007551A; CN103764815A; EP2661488A1; AU2012204328A1; BR112013017281A2; US20120171724A1; JP2014504870A; EA201370151A1; WO2012094532A1; ZA201304903B

Abstract

숙주세포를 현탁 세포배양에 적응시키는 시스템 및 방법과, 그렇게 함으로써 생산된 현탁세포주를 제공한다. 본 방법은 세포군집이 시각화될 때까지 희석되지 않은 배양세포를 표면적 위에 연속적으로 리플레이팅(replating)하고 세포군집을 형성하자마자 세포를 현탁 배양시스템으로 옮기는 것을 포함한다.

Description

고수율 현탁세포주, 시스템 및 그 제조방법{High yield suspension cell line, system, and method for making same}

본 발명은 고수율 현탁세포주, 시스템 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 출원은 2011년 1월 5일자로 출원된 미국 가특허 출원 제 61/429,931호의 35 U.S.C.§119(e)에 의거 이점을 주장하며, 그 출원의 개시내용이 본 명세서에 참조로서 통합되어 있다.

재조합 단백질 기반의 바이오의약품(biopharmaceutical)의 제조는 복잡할 뿐만 아니라 노동과 자본이 집약된다. 현재는 대부분의 인간 단백질을 생산하기 위해 동물 세포(mammalian cells)를 이용하고 있다. 동물 세포는 보통 변형과정이 없는 원핵생물(prokaryotes) 및 단세포 진핵생물(single-celled eukaryotes)에서는 일어나지 않을 광범위한 번역 후 변형(post-translational modifications)과정을 포함한다. 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cells) 또는 베이비 햄스터 신장 세포(Baby hamster kidney cells)와 같은 동물 세포는 대부분의 인간 단백질을 충분히 생합성 할 수 있으나 그 효율은 세균 또는 효모 세포를 이용하는 것보다도 매우 낮다.

현재 시판중인 재조합 단백질 중에 fⅧ는 제조과정에서의 효율성이 가장 낮고 지금까지 단위질량당 가격이 가장 비싸다(도 1). 재조합 fⅧ는 선천성 X-연관 출혈성 질환인 혈우병 A(hemophilia A) 환자를 위한 제1 치료수단이다. 한 주에 2∼3회 재조합 fⅧ을 정맥 내 주입하는 치료법은 연간 10만∼30만 달러의 비용이 필요하여(Bohn RL, Avorn J, Glynn RJ, Choodnovskiy I, Haschemeyer R, Aledort LM, Prophylactic use of factor Ⅷ: an economic evaluation. Thromb Haemost. 1998;79(5):932-7) 전세계의 혈우병A 환자의 1/3 미만으로 치료기회가 제한된다. 그동안 연구, 개발 및 제조비용이 높은 이유로 fⅧ의 공급은 충분하지 않고 가격은 지나치게 비쌌다. 단백질 대체치료를 통해 치료할 수 있는 다른 단일 유전질환을 비롯하여 혈우병 A의 관리를 향상시킬 수 있는 한 가지 방법은 더욱 효율적인 재조합 단백질의 제조방법을 개발하는 것이다.

최신의 재조합 h-fⅧ 제제는 보통 대규모의 발효 바이오리액터(fermenting bioreactor)에서 BHK-21 또는 중국 햄스터 난소 세포와 같은 동물 세포를 이용하여 생산된다. 재조합 h-fⅧ의 생산을 최대화하기 위해서 (1) DHFR/methotrexate selection을 통한 h-fⅧ 전이유전자의 증폭, (2) 배지(예를 들어 소/인간 알부민 또는 vWf의 co-expression)에 fⅧ 안정제 첨가, (3) 계속 관류액을 주입한 발효를 통해 세포 성장/밀도 최대화의 여러 기술이 사용될 수 있다. FⅧ은 일련의 여과, 면역친화성, 크기 배제 및 이온교환 크로마토그래피 단계를 이용하여 조건배양액에서 정제될 수 있다. 안전을 위해 종종 바이러스 불활성화 절차가 정제 프로토콜에 포함된다. 정제가 되자마자 대부분의 fⅧ 물질은 안정제와 배합될 수도 있고 포장되기 전에 동결건조될 수도 있다. 상기 표준 제조공정은 Boedeker BG(2001)에서 검토된 것을 이용하였다(Boedeker BG, Production processes of licensed recombinant factor Ⅷ preparations, 2001;27(4):385-94, Semin Thromb Hemost).

1세대 재조합 fⅧ 제제는 이론적으로 바이러스 오염물질이 번식가능한 인간 혈청 알부민을 이용하여 안정화되었다. 바이러스 오염물질의 위험도를 줄이기 위해서 2세대 및 3세대 fⅧ 제제는 “animal-product free”를 감안하여 수크로즈 및 다른 첨가제로 대신 안정화되었다. 혈장유래 및 1세대 제제를 포함하여 새로운 세대 재조합 제제에 관하여 개선된 안전 프로필을 인식하게 되어 전에 치료받았던 많은 환자들 및 치료받지 않았던 환자들의 대부분이 2세대 및 3세대 fⅧ 제제로 전환하였다. 이런 수요로 인해 다수의 fⅧ 제제가 부족해져서 임시로 fⅧ 공급하는 전략이 시행되었다(Garber K, rFactor Ⅷ deficit questioned, NatBiotechnol. 2000;18(11):1133).

여러 자료에서는 재조합 인간 fⅧ 생산의 표준농도가 <1unit/10⁶ cells/day 라고 명시하고 있다(Kaufman RJ, Pipe SW, Tagliavacca L, Swaroop M, Moussalli M. Biosynthesis, assembly and secretion of conagulation factor Ⅷ, Blood CoagulFibrinolysis, 1997;8 Suppl 2:S3-14). 일반적으로 최종 재조합 인간 fⅧ 제제는 mg protein 당 4,000∼10,000 unit 사이의 비활성(specific activity)을 가지고 1회 치료에 70kg 성인 기준으로 2,500∼5,000달러의 비용이 필요하다. 현재 fⅧ 제제는 전 세계시장의 1/3 미만으로 분배가 제한됨에도 불구하고 연간 60∼80억 달러의 시장을 형성한다.

따라서 본 발명의 목적은 숙주세포를 현탁 세포배양에 적응시키는 방법 및 시스템을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 생산된 세포주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 부착세포주를 현탁에 적응시키는 단계와; 상기 단계에서 수득한 BHK-M 클론에서 생산되는 ET-801을 측정하고 부착세포의 ET-801과 비교하는 단계와; 동물모델을 이용하여 ET-801의 능력을 평가하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명은 부모세포주 및/또는 부착세포주보다 생산수율이 높은 효과가 있으며 바이오치료제를 생산하는 데 걸리는 시간과 자원을 절약하여 치료기회를 넓힐 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 바이오의약품 제조분야의 현재 상황을 도시한 그래프이다.
도 2는 BHK-M 세포의 BHK-Ms 세포로의 전환을 나타낸 사진도이다. BHK-M 세포는 부착된 BHK-M 세포들의 일련의 리플레이팅(replating)을 포함하는 특허출원중인 방법을 이용하여 현탁에 적응된다.
도 3은 무혈청 배지의 BHK-Ms 세포로부터 재조합 fⅧ의 발현을 나타낸 그래프이다.
도 4는 부착된 HEK-293T 세포의 현탁으로의 전환을 나타낸 사진도이다.
도 5는 현탁적응된 세포로부터 고농도 fⅧ 발현의 증거를 보여주는 그래프이다.
도 6은 최적화된 배지공급(feeding) 스케쥴의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명을 이용하여 현탁에 적응된 추가 클론을 특징으로 하는 그래프이다.
도 8은 본 발명을 이용하여 현탁에 적응된 추가 클론의 농도 및 생존도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명을 이용하여 현탁된 클론의 농도 대비 fⅧ의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명을 이용하여 GFP 형질도입한 GFP 바이러스 생산세포를 현탁에 적응시킨 사진도이다.
도 11은 BHK-M(부착) 및 BHK-Ms(현탁) 배양 플랫폼(platform)으로부터 재조합 fⅧ 생산을 비교한 도표이다.

본 발명자들은 롤러 병(roller bottle)과 같은 이전에 부착생산 배양시스템으로 제한되었던 동물 세포주를 현탁 세포배양에 적응시키는 신규한 방법을 제공한다. 또, 본 발명자들은 재조합 단백질의 현탁배양하는 데 있어서 (공지된 시스템 및 방법과 비교하여) 높은 생산성을 보이는 BHK-MS-310, BHK-MS-P14, SC-293T로 지정된 신규한 세포주를 제공한다. 게다가 본 발명자들은 현탁 세포 바이러스 생산을 위한 신규한 방법 및 세포주를 제공한다. 본 발명의 방법, 시스템 및 세포주는 모두 적응력이 있고 무혈청(serum-free) 및 혈액단백질 없는(blood-protein free) 현탁배양 환경에 적응된다.

본 발명의 신규성 및 중요성은 제대로 평가되어야 한다. 인간(및 동물)의 건강 및 복지에 필수적인 바이오치료제가 많으나 겉보기에 극복할 수 없는 커다란 제조상의 어려움 때문에 이용할 수 없거나 공급이 매우 제한된다. 이러한 단백질을 생산하기 위한 최적의 세포주는 부착세포 생산으로 제한될 수 있다. 부착세포 생산은 대량 생산의 바이오 제조업에 있어서 현탁 세포배양과 같은 다른 방법보다 덜 효율적이고 덜 균형잡히며 그 외에 덜 바람직할 수 있다. 따라서 부착세포주를 통상적으로 현탁 세포배양에 적응시키는 능력은 중요한 달성이다(부착세포주는 앞서 공지된 방법에 의해 적응에 저항을 가짐). 게다가 본 발명 방법 및 시스템은 부착세포를 현탁 세포배양에 적응시키는데 이전에 성공적으로 사용되었던 방법에 대한 신규한 대안이다.

재조합 인간 fⅧ는 제조하기 매우 어려운 바이오 치료제 중의 하나이다. 현재 시판 중인 재조합 인간 fⅧ 제제는 단일클론항체와 같은 다른 재조합 바이오 치료제보다 100∼1000배 낮은 수준으로 생산된다. fⅧ 발현의 낮은 수율은 제제의 가격결정 및 유효성에 강한 영향을 미친다. 사실상 재조합 fⅧ는 그람 당 약국 가격이 천만 달러이며 연간 세계 총 생산량이 0.5 kg 미만인 주요 바이오약품들 중에서 최대 기준 소매가격 및 최저 연간 생산량을 가진다.

낮은 fⅧ 발현 효율의 결과, 전세계 혈우병 A 환자의 1/3 미만이 fⅧ치료를 받는다. 치료를 받지 못한 사람들에 있어서 혈우병 A는 10대 사망률의 중간 순위를 차지하는 치명적인 질병이다.

fⅧ와 같은 바이오 치료제를 제조하는 데 있어 어려움을 해소하기 위해 제조시스템의 구성요소는 구성물(construct), 발현벡터(expression vector), 세포주(cell line), 세포 배양조건(cell culture conditions) 등으로 최적화될 수 있다. 이를 설명하기 위해 본 발명자들은 세포단위당 인간 fⅧ보다 더욱 효율적으로 생합성되는 신규한 재조합 fⅧ 구성물을 규정하여 특허를 받았다(미국특허 제7,635,763호 참조, Spencer HT, Denning G, Gautney RE, Dropulic B, Roy AJ, Baranyi L,et al. Lentiviral Vector Platform for Production of Bioengineered Recombinant Coagulation Factor Ⅷ. 2010. Mol Ther.참조). 본 발명자들은 재조합 fⅧ 분자를 ET-801로 나타내었다. ET-801은 미국특허 제7,635,763의 SEQ ID NO:19와 최소 약 93% 일치하는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드이다.

본 발명자들은 BHK-M 세포가 ET-801을 포함하는 재조합 fⅧ의 생산을 위해서 흔히 사용되는, 예를 들어 중국햄스터 난소 세포주 DG44 또는 BHK-21와 같은 다른 동물 세포주를 생산력에서 능가할 수 있다는 것을 발견하였다. 그러나 BHK-M은 부착되는 조건에서만 성장이 허용되는 부모 세포주(ATCC PTA-4506)로부터 유래한다. 본 발명에 따라 현탁 세포배양에 BHK-M 세포를 적응시키는 것은 대규모 바이오 제조공정에서 생산 효율, 범용성 및 유용성을 증가시킬 수 있다.

본 발명자들은 단독 또는 복합 바이오치료제를 위한 현탁세포 기반의 바이오제조 플랫폼으로 부착세포주를 적응시키는 방법을 제공한다. 또, 본 발명자들은 복합 바이오치료제를 고수율로 생산하기 위해(현재 공지된 시스템과 비교하여) 최적화한; 현탁 세포배양에서 재조합 단백질의 생산 및 바이러스의 생산을 증가시킨(현재 공지된 시스템과 비교하여) 시스템 및 그 방법을 제공한다. 게다가 재조합 단백질 및 바이러스를 고수율로 생산하기 위한 세포주를 제공한다.

공개된 데이터에 의해 증명된 바와 같이, 본 발명 신규한 시스템 및 방법은 공지된 시스템을 넘어서는 현저한 성과를 나타내었다. 예를 들어 본 발명자들은 상기 시스템, 방법 및 세포주가 현재 공지된 제조 방법보다 최소 5% 에서 1000% 까지 생산력에서 능가함을 증명하였다.

본 발명의 실시 예는 본 발명 신규한 시스템 및 방법이 fⅧ의 제조용량 및 범용성을 증가시킬 수 있음을 증명하였으나, 본 발명 신규한 방법, 시스템 및 세포주는 다른 단백질의 수율, 제조용량 및 범용성을 증가시키기 위해 적용될 수 있음이 분명하다(GFP 증명). 본 발명자들은 상기 플랫폼이 응고인자 Ⅸ 및 Ⅶa와 같은 대체 재조합 바이오 의약품을 제조하기 위해 본 발명자 및 다른 이들에 의해 활용될 수 있기를 기대한다.

게다가 본 발명자들이 베이비 햄스터 신장-유래(BHK-M) 세포주(BHK-Ms로 지정함) 및 HEK-293T 세포주를 이용한 방법의 적용을 성공적으로 증명한 반면 본 발명 신규한 방법, 시스템은 다른 세포주의 수율, 제조용량 및 범용성을 증가시키기 위해서도 적용될 수 있다(그 세포주가 이전에 현탁배양할 수 있었는지 여부와 관계없이). 본 발명의 방법 및 시스템은 혈청 및 혈액-구성성분을 함유하지 않은 생산배지를 이용하는 배양시스템과 같은 현탁 배양시스템에서 2개월까지 및/또는 무한정 유지될 수 있는 현탁세포주가 된다.

실시 예에서 숙주세포를 현탁배양에 적응시키기 위한 방법 및 시스템은 하기 단계로 구성된 방법에 의해 수행될 수 있다:

a. 하나 이상의 부착된 숙주세포를(예를 들어 성장서포팅배지에서) 일차 배양접시(예를 들어 표면적을 가진 배양접시) 상에서 성장시키는 단계와;

b. 상기 세포를 20%-100%, 30%-100%, 40%-100%, 50%-100%, 60%-100%, 70%-100%, 80%-100%, 및/또는 100% 증식(confluency) 수준으로 성장시키는 단계와;

c. 상기 세포를 배양접시에서 분리하는 단계와;

d. 상기 세포를 성장서포팅배지에서 재현탁시키는 단계와;

e. 배양접시 상에 리플레이팅(replating)하고 성장서포팅배지 안에서 세포를 성장시키는 단계와;

f. 상기 세포가 군집을 형성할 때까지 (a)-(e)단계를 반복하는 단계와;

g. 상기 세포를 스피너(spinner) 또는 진탕 플라스크(shaker flask)와 같은 현탁배양으로 옮기는 단계와;

h. 상기 세포를 흔들거나 저어서 교반하는 단계로 구성된 방법에 의해 수행될 수 있다.

다른 실시 예에서 숙주세포를 현탁 세포배양에 적응시키기 위한 방법 및 시스템은 하기 단계에 따라 수행될 수 있다:

a. 하나 이상의 숙주세포를 성장서포팅배지를 넣은 일차 배양접시 상에서 성장시키는 단계와;

b. 숙주세포가 배양접시상에 약 60%-100% 증식(confluency)수준에 도달할 때까지 성장시키는 단계와;

c. 숙주세포가 일정 증식수준에 도달하면 세포로부터 성장서포팅배지를 제거하는 단계와;

d. 상기 세포를 선택적으로 버퍼(예를 들어 등장완충액(isotonic buffer), 인산완충식염수(Phosphate-Buffered Saline) 또는 기타 다른 버퍼)를 이용하여 세척하는 단계와;

e. 상기 세포를 배양접시에서 분리하는 단계, 예를 들어 유효량의 세포분리용액을 세포에 첨가(예를 들어 트립신 또는 EDTA), 기계적으로 분리(예를 들어 세포 스크랩퍼(cell scraper), 피펫(pipet) 등) 또는 다른 기계적, 화학적, 효소적 또는 기타 방법으로;

f. 세포를 배양접시에서 분리할 때까지 약 37℃, 5% CO₂의 성장서포팅조건에서 상기 세포를 배양하는 단계와;

g. 유효량의 성장서포팅배지에서 상기 세포를 재현탁하는 단계와;

h. 일차 배양접시와 동일한 표면적을 가진 새 배양접시, 선택적으로 또는 추가적으로 일차 배양접시보다 크거나 작은 표면적을 가진 배양접시에 상기 재현탁된 세포를 플레이팅(plating)하는 단계와;

i. 상기 세포를 약 1시간 내지 24시간, 또는 약 1시간 내지 48시간 동안 약 37℃, 5% CO₂의 성장서포팅조건에서 성장시키는 단계와;

j. 상기 세포가 뚜렷한 군집을 형성할 때까지(도 2의“Day10”, 도 4(e) 및 4(f)의 뚜렷한 군집의 예와 같이) (c)에서 (i)단계를 적어도 1회 반복하는 단계와;

k. 상기 세포를 스피너 또는 진탕 플라스크와 같은 현탁배양으로 옮기는 단계와;

l. 상기 세포를 흔들거나 저어서 교반하는 단계.

숙주세포는 COS, CHO, HeLa, BHK-M, BHK-21, HEK-293T, 쥐 골수종(murine myelomas) 뿐 아니라 형질전환된 단일세포계(primary cell lines), 혼성세포(hybridomas), 정상 2배체 세포(normal diploid cells) 및 단일조직의 in vitro 배양 유래 세포주와 같은 어느 형태의 동물세포 일 수 있다. 이전에 현탁세포배양에 적응할 수 있던 어느 동물세포든지 본 발명에서 이용될 수 있다. 게다가 본 발명은 이전에 현탁배양에 적응되지 않아서 BHK-M과 같이 부착증식으로 제한되었던 세포주를 성공적으로 적응시키는 것을 보였다.

동물세포는 관심 있는 재조합 폴리펩티드 및/또는 재조합 바이러스를 발현하는 유전적으로 변형된 동물세포일 수 있다. 예를 들어 동물세포 BHK-Ms의 유전적 변형은 다른 방법들 중에 전기영동, 양이온성 리포좀(cationic liposome), 양이온성 폴리머(cationic polymer) 및 렌티바이러스-매개 형질도입(lentiviral vector-mediated transduction)을 이용하여 수행될 수 있다. 유전적 변형은 현탁에 적응하기 전 또는 적응한 후에 숙주세포상에서 수행될 수 있다. 현탁에 적응하기 전에 세포를 변형하는 것은 최적의 클론을 확실히 선택할 수 있는 장점을 가진다.

성장서포팅배지(growth supporting medium)는 진핵세포를 성장 및 유지시키는 영양액을 나타낼 수 있으며 하기 범주 중 하나 이상을 제공할 수 있다: (1) 배지의 삼투질 농도에 기여하는 염(예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등); (2) 포도당 같은 탄수화물 형태의 에너지원; (3) 필수아미노산이 일부 또는 전부 포함된 아미노산; (4) 비타민 및/또는 다른 유기화합물; 및 (5) 미량원소, 예를 들면 극소량(예를 들어 마이크로몰 범위)으로 필요한 무기화합물. 성장서포팅용액은 선택적으로 하기 범주의 하나 이상 화합물로 보충될 수 있다: (1) 동물혈청; (2) 호르몬 및 다른 성장인자 예를 들면 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferring) 및 세포재생인자(epidermal growth factor); 및 (3) 식물, 효모의 가수분해물, 및/또는 조직, 그의 단백질 가수분해물.

추가적으로 또는 대안으로, 성장서포팅배지는 무혈청 배지(serum-free medium), 화학적 구명배지(chemically-defined medium), 또는 동물유래 원료물질이 배재된 배지(medium lacking animal derived components)일 수 있다. 화학적 구명배지는 모든 구성성분의 화학적 구조를 알고 있는 배지이다. 화학적 구명배지는 시그마(Sigma)사 및 기브코(Gibco)사와 같은 제조업체에서 구할 수 있다. 본 발명에 제공되는 조건 하에 세포의 성장 및 유지를 지원하는 어떤 성장서포팅배지든지 사용될 수 있다. 당업자라면 누구나 적합한 배양배지 뿐만 아니라 기타 변수에 대해 선택할 수 있을 것이다(Mather J.P 등, 1999, Culture media, animal cells, large scale production, Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, Vol.2: 777-785).

세포 분리(cell dissociation)는 유효량의 세포 분리용액(예를 들어 트립신(trypsin) 또는 EDTA)을 세포에 첨가하는 방법, 기계적으로 분리시키는 방법(예를 들어 세포 스크랩퍼(scraper), 피펫(pipette) 등) 또는 다른 기계적, 화학적, 효소적 또는 기타 방법으로 달성될 수 있다.

세포 분리 효소(cell dissociation enzyme)는 카오트로픽 물질(chaotropic agent) 또는 효소 또는 둘 다 포함될 수 있다. 세척 단계는 선택적으로 제외할 수도 있고 프로토콜의 일부 라운드에서 수행될 수 있으나 다른 단계에는 적용되지 않는다. 세척 단계를 할지는 세척 단계가 세포 군집의 형성을 망가뜨릴 수도 있음을 고려하여 사례별로 결정되므로 중단되거나 생략될 수도 있다.

각 분리 단계 사이에 세포가 성장하여 없어지는데 걸리는 시간은 출발물질인 부착세포주의 특성에 따라 다양할 수 있다. 중요한 요인은 세포가 뚜렷한 군집(도 2의 Day10”, 도 4(e) 및 4(f))을 형성할 때까지 세포는 분리되고 재현탁되는 점이다.

하기 실시예는 100∼1000mL 스피너 플라스크 범위의 BHK-Ms 및 HEK-293T 세포유래의 시스템에서 부착세포주를 현탁에 적응시키고 성장 및 생산 특징을 강화시킨 본 발명 시스템 및 방법을 뒷받침하는 데이터를 제공한다. 본 실시예는 예시로서 설명한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.

실시 예1

실시 예1에서 본 발명자들은 본 발명의 변형예를 제공한다. 본 발명자들은 부착세포주를 현탁액에 적응시키고 실시예에서 성장 및 생산을 증가시키는 방법을 설명하는 데이터를 제공한다. 상기 비제한적 실시 예에서 숙주세포는 현탁에 적응되자마자 BHK-Ms로 지정되는, ET-801을 발현하는 100-1000mL 스피너 플라스크의 BHK-M 세포(부모세포주(ATCC PTA-4506)에서 유래함)에서 유래한다. 본 실시예에서 ET-801을 발현하는 BHK-Ms 세포는 본 발명 방법에 따라 현탁상태에서 성장한다. 그 결과로 발생하는 fⅧ 생산을 측정하고 부착세포 기반의 fⅧ 생산과 비교한다.

ET-801 생산을 위해서 신규한 렌티바이러스 발현시스템을 이용하여 숙주세포를 제조하였다(Spencer HT, Denning G, Gautney RE, Dropulic B, Roy AJ, Baranyi L, et al. Lentiviral Vector Platform for Production of Bioengineered Recombinant coagulation Factor Ⅷ. Mol Ther. 2010. 이하 “Spencer 2010”으로 표시함). 상기 실시 예를 통하여 재조합 Ⅷ(ET-801)을 평균 160 units/10⁶ cells/24 hr 농도로 발현시키는, 3-10으로 지정된 BHK-M 클론(clone)을 수득하였다. 예비실험에서 본 발명자들은 소규모 생산에 의하여 클론 3-10(Spencer 2011에 기술된 방법에 따라)을 현탁에 적응시키기 위하여 신규한 시스템 및 방법을 이용하는 놀라운 단백질 생산결과를 나타내었다.

부착의존성 BHK-M 세포를 부피기준 10% 소태아 혈청(Fetal Bovine Serum(FBS), Invitrogen #10082), 1% GlutaMAX-I(Invitrogen #35050) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin, Invitrogen #15140)을 보충한 10mL 어드밴스드 둘베코 변형 이글 배지/F12(Advanced Dulbecco's Modified Engle's Medium/F12, Invitrogen #10082)를 넣은(이후로 DMEM Complete 또는 DMEM:F12 Complete로 나타냄) 100mm× 20mm 세포배양접시(Corning #430167) 상에서 37℃ 5% CO₂에서 성장시켰다. 세포가 100% 증식수준(confluency)까지 자랐을 때 DMEM Complete 배지를 제거하고 세포를 3mL (1x) 둘베코 인산완충 식염수(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline(dPBS), Invitrogen #14190)으로 1회 세척하였고 500μL TrypLE Express(Invitrogen #12605)를 접시에 고르게 첨가하여 37℃ 5% CO₂에서 5분 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 세포를 5mL DMEM Complete에 약하게 재현탁하고 모든 세포(희석이나 분열 없이)를 일차 접시와 동일한 표면적을 가진 새 접시에 옮기고 25mL DMEM Complete를 추가하고 배양기의 37℃ 5% CO₂에서 밤새 성장시켰다. 세포밀도가 증가하여 세포가 단일층으로 자리잡는데 접시상의 표면적이 부족해져서 세포가 3차 구조를 형성하기 시작할 때까지(도 2) 상기 플레이팅(plating)과정은 4일 동안 매일 반복되었다.

이때 상기 세포를 현탁배양으로 옮겼다. 추가로 1.25 mL Pluronic F-68(10% 용액, Invitrogen 24040)을 보충한 120mL DMEM Complete를 125mL 스피너 플라스크(spinner flask, Corning #3152)에 채웠다. 세포를 dPBS로 세척하고 TrypLE를 함유한 배양접시에서 떼어내어 전과 같이 약하게 재현탁하여 배양한 다음 상기 스피너 플라스크에 옮기고 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 60rpm로 교반하였다. 죽은 세포를 Trypan Blue(STEMCELL Technologies #07050)로 염색함으로써 세포 생존도를 매일 관찰하였다. 3일마다 80 mL의 남아있는 배지를 제거하고 85mL의 850μL의 Pluronic F-85를 보충한 85mL의 신선한 DMEM Complete로 교체함으로써 플라스크 안의 배지를 교환하였다.

상기 예비실험에서 본 발명자들은 부착된 BHK-M 세포의 순차적인 리플레이팅(re-plating)을 포함하는 본 발명을 이용하여 BHK-M 세포를 현탁에 적응시킬 수 있음을 증명하였다. 순차적인 리플레이팅을 진행하는 10일 동안 37℃, 95% 습도, 5% CO₂조건에서 배양하면서 세포는 조직배양 용기 안에서 고도의 군집 상태가 되고 세포성장은 표면부착공간과 무관해진다. 이때 상기 세포를 쉐이커(shaker) 또는 스피너 플라스크(spinner flask)로 옮기고 동일한 배양조건하에서 중간회전 속도(60-75rpm)로 원심 분리하면서 유지하였다. 현탁배양 1-2일 내에 세포는 24-48시간의 분열시간 동안 늘어나기 시작한다. 상기 세포는 현탁배양에 적응되고 "BHK-Ms"세포로 지정되며 혈청 포함한 또는 무혈청 배지에서 경험적으로 결정한 2달보다 길게(거의 무기한) 유지될 수 있다.

도 2는 상기 공개된 실험 방법에 의해 BHK-M세포에서 BHK-Ms로의 전환을 시각적으로 나타낸다. BHK-M 세포는 부착된 BHK-M 세포의 순차적인 리플레이팅(replating)을 포함하는 본 발명을 이용하여 현탁에 적응된다. 10일간의 순차적인 리플레이팅을 진행하는 동안 세포는(도 2에서 보다시피) 군집상태를 이루고 세포성장은 조직배양 용기 내에서 표면부착 공간에 무관해진다. 이때 세포는 중간속도(60-75rpm) 회전하게 되는 쉐이커 또는 스피너 플라스크 안으로 씨드(seed)될 수 있다. 현탁배양 1~2일 내에 세포는 24~48 시간의 분열시간 동안 팽창하기 시작한다.

본 실험의 변형에서 결과로 발생하는 BHK-Ms 클론(clone) 3~10은 40일 넘게 1리터 크기에서 활발하고 지속적으로 팽창하는 것이 증명되었다. 무혈청 생산 단계 동안 상기 시스템으로부터 대략 100만 unit의 fⅧ를 채취하였다. 이것은 유의적으로 최적화되지 않은 시판중인 재조합 인간 fⅧ 생산 시스템보다 대략 50배 개선되었음을 나타낸다.

도 3은 본 발명에 의해 발생한 BHK-Ms 세포로부터 수득한 재조합 fⅧ의 발현의 결과 50배 개선되었음을 증명한다. 완전배지(complete media) 교환은 매일 실행되었고 각 콜렉션(collection)의 fⅧ 활성농도는 일단계 응고검정(one-stage coagulation assay)으로 결정되었다. 본 발명에 따라 가로선은 ET-801의 무혈청 fⅧ 생산수준의 평균을 나타낸다(선 위의 ET-801으로 나타냄). hfⅧ로 나타낸 가로선은 재조합 인간(h) factor Ⅷ의 공개된 생산수준의 평균을 나타낸 것이다.

결과로 발생한 세포주는 BHK-MS-310으로 지정되고 발명자 및/또는 양수인에게 연락하여 이용가능하다. 상기 세포주는 증가된 생산수율, 현탁배양 내 증식능력 및 부모세포주를 능가하는 증가된 바이러스 생산능력을 제공한다.

실시 예2

실시 예2에서 본 발명자들은 현탁에 적응하여 HEK-293T 부착세포에서 증가된 증식특징을 얻기 위한 방법 및 시스템의 이용을 설명하는 데이터 및 방법의 변형 예를 제공한다. 본 실시 예에서 지정된 조건하에 변형된 방법에 따라 HEK-293T 세포는 현탁에 적응된다. 하기 방법으로부터 생긴 세포주는 HEK-SC-293T로 지정된다. HEK-SC-293T 세포주는 증가된 생산수율, 현탁배양에서 성장능력 및 부모 세포주를 능가하는 바이러스 생산능력을 제공한다.

본 실시 예에 따른 방법은 하기와 같다:

a. 동결된 순수 HEK-293T 부착세포주를 준비한다.

b. 10mL DMEM-F12 완전배지(5% Glutamax, 10% FBS 포함)를 넣은 corning 10cm 접시 상에서 37℃, 5% CO₂로 녹인다.

c. DMEM/F-12 complete와 같은 유효량의 성장서포팅 배지를 넣은 10cm 접시에서 세포를 증식시킨다(1-2일).

d. 플레이트 표면에 부착되지 않은 군집이 형성될 때까지 하기 단계를 날마다 반복하여 세포를 엉기게 한다:

i. 배지를 전부 제거한다.

ⅱ. PBS로 세포를 세척한다(이 단계는 선택사항이고 첫 2회 사이클 후에는 중지되었다).

ⅲ. 700μL TrypLE 첨가한다(트립신 유사화합물, Invitrogen #12605)

ⅳ. 37℃, 5% CO₂에서 5분 동안 배양한다.

ⅴ. 세포군집을 건드리지 않도록 하면서 세포밀도에 따라 DMEM/F-12 완전배지의 양을 늘려가면서 새로운 10cm 접시로 모든 세포를 조심스럽게 옮긴다.

ⅵ. 37℃, 5% CO₂에서 밤새 배양한다.

ⅶ. 세포가 군집을 형성할 때까지 (i) 내지 (vi)단계를 반복한다.

ⅷ. 세포의 군집형성 후 1% v/v Pluronic F-68을 보충한 50 mL 배지(DMEM/F12 완전배지)를 넣은 스피너 플라스크(Corning #3152) 125 mL에 세포를 옮긴다.

ⅸ.중간속도로(60rpm) 회전하면서 37℃, 5% CO₂에서 밤새 배양한다.

e. 매일 배지교환은 세포를 400×g로 5~10분 동안 펠릿화하고, 사용한 배지를 제거하고, 1% v/v Pluronic F-68로 보충된 100mL 배지에 세포를 재현탁한 다음 중간속도로(60rpm) 회전하면서 37℃, 5% CO₂에서 밤새 배양한다.

f. bicinchoninic acid assay (BCA assay) kit를 이용하여(Thermo Scientific #23225, kit protocol) RLA(Promega #Z3051)로 용해한 세포군집 부분표본의 단백질 수준을 비군집세포의 공지된 세포밀도에서 단백질 수준의 표준곡선에 비교함으로써 세포밀도를 측정한다.

도 4(a)-4(f)는 사진문서 조사를 통하여 변형예에서 신규한 방법의 효과를 증명한다. 도 4(a)는 출발물질, 융합성 부착성 HEK-293T 세포를 나타낸다. 도 4(b)는 순차적 리플레이팅 1-2일째 세포밀도가 증가하고 세포파일링(cell piling)이 관찰되었다. 도 4(c)는 계속되는 리플레이팅 2-3일째 더 많은 세포파일링이 관찰되었다. 도 4(d)는 순차적 리플레이팅 3-4일째 부착세포 단층 위로 세포 응집물이 자라기 시작하였다. 도 4(e)는 순차적 리플레이팅 4-5일째 세포응집물이 커지기 시작하였다. 도 4(f)는 순차적 리플레이팅 5-8일째 세포응집물은 부착 비의존적으로 되었다.

매일 세포분획(보통 80%까지)을 재현탁하면서 펠렛팅 단계를 반복함으로써 배양이 무한정 유지될 수도 있다.

실시 예2에 따라 세포를 현탁에 적응시킨 후 옮겼다.

상기 방법은 다수의 부착세포주로부터 현탁세포주를 제조하는 데 이용될 수 있는 반면, 상기 기재한 특정 변수에 따라 본 실시예로부터 수득한 세포주는 HEK-SC-293T로 지정되며 발명자 또는 양수인에게 연락함으로써 이용할 수 있다. 상기 세포주는 증가된 생산수율, 현탁배양에서의 증식능력, 및 부모세포주를 능가하는 바이러스 생산능력을 제공한다.

실시 예3

실시 예 3에서 본 발명자들은 재조합 바이러스 생산방법에서 수득한 세포주의 능력을 나타내는 방법 및 데이터의 변형 예를 제공한다. 역가를 위한 형질도입은 공지기술 또는 참조문헌으로 포함된 Spencer 2011에 기술된 대로 수행될 수 있다.

추가 변형 예에서 본 발명자들은 본 발명에 따라 관심 있는 바이러스를 세포주에 형질도입함으로써 고수율로 바이러스 생산을 위한 방법 및 세포주를 제공한다. 하기 예는 본 발명에 따라 현탁액에 적응된 세포로부터 3세대 렌티바이러스의 생산 및 농도를 설명한다. 컨테이너 크기 및 모든 함량은 생산을 확대 또는 감소시키기 위해 변형 및 조정될 수 있다. 본 방법은 하기 단계에 의해 증명될 수 있다:

a. 형질주입을 위한 세포 씨딩(seeding) 단계:

i. 50mL의 DMEM:F12 완전배지에 1×10⁶ cells/mL(BCA 검정에 의해 결정됨)의 밀도로 HEK-SC-293T 현탁세포를 포함하는 새로운 플라스크를 준비한다.

ii. 상기 세포를 37℃, 5% CO₂, 60rpm에서 배양한다.

b. 형질주입(transfecting) 단계(1일째):

i. 15mL 코니칼 튜브에 플라스미드 DNA 총량(표 1참조)과 최종부피 5mL의 OPTI-MEMⅠ(Gibco) 또는 유사한 제품을 혼합한다. 0.22μm 필터를 통과시켜서 새로운 15mL 코티칼 튜브에 넣는다.

플라스미드	플라스미드DNA/트리플플라스크 (mg)	스피너플라스크 번호	플라스미드DNA총량(mg)	플라스미드 농도(mg/mL)	플라스미드DNA 총 부피(mL)
Transfer Plasmid	80	1	80
pKgagpol (pLTG1294)	52	1	52
pKg (pLTG1292)	28	1	28
pKrev (pLTG1293)	20	1	20
합계	180	N/A	180	N/A	N/A

ii. 독립된 15mL 코니칼 튜브에 10 mg/mL농도의 폴리에틸렌이민(polyethlyemeimine(PEI)) 144μL(PEI 계산은 표2 참조)를 OPTI-MEMⅠ 또는 유사한 제품 5mL와 혼합하였다. 0.22μm 필터를 통과시켜서 새로운 15mL 코티칼 튜브(conical tube)에 넣었다.

PEI Stock 농도	플라스미드DNA mg당 PEI량	플라스미드DNA의 총량(mg)	PEI의 총량(mL)
10 mg/mL	0.8 mL	180	144

ⅲ. 플라스미드 DNA와 PEI 혼합물을 혼합하고 상온에서 20분 동안 배양한다.

ⅳ.50mL 코니칼 튜브 안의 HEK-293T 현탁세포와 같은 현탁세포를 1500rpm으로 10분동안 펠릿화한 후 조정배지는 버린다.

ⅴ. 펠릿화 중에 DNA/PEI 혼합물을 50mL의 신선한 DMEM:F12 완전배지(1% 페니실린/스트렙토마이신 결핍)에 최종부피 60mL가 될 때까지 첨가하고 균질한 혼합물이 되도록 완전히 혼합한다.

ⅵ. HEK-293T 현탁세포와 같은 현탁세포를 스피너 플라스크에 담긴 배지를 이용하여 재현탁한다.

ⅶ. 상기 세포를 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 60rpm으로 배양함으로써 밤새 형질주입한다.

c. 형질주입 후 단계(2일째):

i. 앞서 나타낸 대로 형질주입된 현탁세포를 펠릿으로 만들고 세포로부터 형질주입 배지를 옮겨 부은 다음 50mL의 DMEM:F12 완전배지로 교체한다.

ⅱ. 상기 세포를 37℃, 5% CO₂배양기에서 계속 배양한다.

d. 바이러스 수집/채취(3일 내지 4일째)

i. 형질도입 증거에 관하여 세포상태를 검사한다. 예를 들어 형광현미경 하에서 세포를 GFP 세포와 함께 검사한다. fⅧ에 관하여는 클롯 타임즈(clot times)에 관하여 배지를 검사할 수 있다.

ⅱ. 세포가 발현하는 바람직한 산물이 상기 증거를 나타낸다면 하기와 같이 진행한다:

1. 세포를 1,500rpm으로 10분 동안 펠릿화한다(cell debris 제거하기 위해서).

2. 바이러스를 함유한 배지를 살균한 원심분리용 병에 옮겨 붓고 예를 들어 HEK-293T 현탁세포를 50mL 신선한 DMEM:F12 완전배지가 들어있는 스피너 플라스크에 재현탁하고 37℃, 5% CO₂, 60rpm 배양기에서 계속 세포를 배양한다.

3. 바이러스를 함유한 배지를 예를 들어 0.45mm 필터를 통과하여 거르고 바이러스 농도가 준비될 때까지 4℃에 저장한다(최대 4일까지).

4. 상기 단계를 반복하면서 2일동안 바이러스를 수집한다.

ⅲ. 선택적으로 바이러스를 농축, 재현탁 및 저장한다.

ⅳ. 하기 [표 3]은 기능성 바이러스를 생산하기 위해 본 발명에 따라 Spencer 2011에 보고된 대로 형질도입된 BHK-M 세포의 전이유전자(transgene) 복제개수(copy number)를 qPCR로 측정되는 현탁에 적응시킨 세포주의 능력을 나타낸 것이다. 수집된 바이러스는 연속되는 날짜에 실행한 바이러스 수집에 의해 세분되었고 비농축 바이러스 함유 배지의 평균역가는 매일 계산되었다. 추산된 농축역가(concentrated titer)는 비농축 역가(non-concentrated titer)와 농축률(concentration rate)을 곱함으로써 계산되었다:

바이러스 수집일	바이러스 샘플(μL)	평균 QTY	복제수 (copies)	바이러스 (mL)	역가 (TU/mL)	농축역가	평균역가	평균농축역가
	mock	0.2	2.4E-05	0	N/A	N/A	N/A	N/A
1일차	50	1.89	2.3E-04	0.05	3361.310452	8.40E+05
	100	10.02	1.2E-03	0.1	8910.140406	2.23E+06	6.45E+03	1.61E+06
	200	15.95	1.9E-03	0.2	7091.653666	1.77E+06
2일차	50	1.19	1.4E-04	0.05	2116.380655	5.29E+05
	100	3.57	4.3E-04	0.1	3174.570983	7.94E+05	3.14E+03	7.85E+05
	200	9.29	1.1E-03	0.2	4130.49922	1.03E+06
3일차	50	0.656	7.9E-05	0.05	1166.677067	2.92E+05
	100	1.21	1.5E-04	0.1	1075.975039	2.69E+05	1.35E+03	3.37E+05

실시 예4

하기 실시 예와 관련 데이터는 본 발명에 따라 현탁에 적응시킨 세포의 고농도의 fⅧ 발현을 증명한다. 하기 실시 예는 예시를 목적으로 할 뿐 본 발명을 특정 크기 또는 양으로 제한하지 않는다.

본 발명에 따라 3-10으로 지정한 ET-801 발현 BHK-M 클론을 무혈청 현탁배지에 적응시켜서 본 발명자들이 지정한 BHK-Ms 세포가 되었다. BHK-M 클론은 1리터 크기에서 30일 동안 팽창하고 증식되었고 fⅧ 농도를 측정하고 도 5에 나타내었다. 각 데이터 포인트는 1리터의 완전배지로부터 채취한 fⅧ 농도를 나타낸다. 상기 조건하에서 세포생존이 불명확함을 암시하는 세포생존율의 변화는 없었다. 상기 생산이 이루어지는 동안 fⅧ 활성을 가진 총 백만 이상의 유닛(unit)이 수집되었다. 출발물질에서 ET-801의 고농도로 인해 단일 양이온 교환 크로마토그래피 과정을 이용하여 처음으로 고도로 정제된 물질을 수득하는 것이 가능하였다. 대략 4.9 mg의 고도로 정제된 ET-801이 830배 정제로 분리되었다. 최종물질은 예상되는 티로신(tyrosine), 트립토판(tryptophan) 및 시스테인(cysteine) 함량을 근거로 하여 280nm의 파장에서 254,955M^-1 cm^-1의 몰흡광계수를 이용하여 3,000 units/nmol 또는 17,700 units/mg의 비활성을 가지는 것으로 계산되었다.

ET-801의 순도는 SDS-PAGE에 의해 평가되었고 재조합 BDD 인간 fⅧ과 비교되었다. 트롬빈(thrombin)에 의한 절단에 민감한 단일사슬물질이 소량 존재하였다. 주요한 오염물질은 발견되지 않았다. 정제된 ET-801은 글리코실화(glycosylation), vWf와의 상호작용 및 트롬빈에 의한 활성화에 이은 활성소멸(activity decay)을 통하여 평가되었다. 트롬빈 및 엔도글리코시다제(endoglycosidase) PNGase F로 ET-801을 처리하는 것은 A1 및 A3-C1-C2(경사슬) 단백질 절편에서의 Mr의 변화를 야기하였다. A2의 Mr에서는 PNGase F 처리에 이어 어떤 변화도 발견되지 않았다. 이러한 데이터는 재조합 BDD 인간 및 BDD 돼지 fⅧ에 관하여 앞서 설명한 것과 일관되는 ET-801의 글리코실화 패턴(glycosylation pattern)을 암시한다(Doering et al. Journal of Biological Chemistry.2004.279(8):6546-6552).

제조된 ET-801의 기능성을 in vivo에서 확인하기 위해 혈우병 A 쥐에 식염수 또는 ET-801을 1회 복용량으로 290 units/kg을 주입했으며 이는 순환하는 fⅧ 활성을 정상 쥐 수준에 가까이 회복하기 위해 경험적으로 결정된 수치이다. 식염수 또는 ET-801의 투여 후에 쥐의 꼬리를 절개하여 지혈충격을 하였고 전체 혈액 손실양을 40분 동안 측정하였다. 식염수만 주입한 혈우병 A 쥐는 체중g당 29.6 mg의 평균혈액 손실이 발생하였다. 대조적으로 ET-801을 주입한 쥐는 체중g당 0.1mg의 혈액손실이 나타났으며 이는 대조군(P=0.029)보다 유의적으로 적은 값이다.

상기 방법을 이용하여 여러 부착세포주로부터 현탁세포주를 제조하는 반면, 상기 특정 예로부터 수득한 결과 발생한 세포주는 BHK-MS-310-ET801로 지정되었으며 발명자 및/또는 양수인과 연락함으로써 이용가능하다. 상기 세포주는 증가된 생산수율, 현탁배양에서 증식하는 능력, 부모세포주를 능가하는 증가된 바이러스 제조능력을 제공한다.

실시 예5

하기 실시 예와 관련 데이터는 최적화된 배지공급 스케쥴에 따른 세포밀도에 관한 효과를 나타낸다. 본 실시 예에서 현탁 세포는 이전 실시 예에 나타낸 24-48시간 대신 12시간마다 신선한 배지를 재공급하였다. 12시간 공급스케쥴을 이용하여 본 발명자들은 도 6에 나타낸 바와 같이 더 높은 세포밀도가 수득되고 유지되는 것을 증명하였다.

실시 예6

하기 데이터는 P14로 지정한 현탁에 적응된 추가의 BHK-M 클론의 특징을 나타내는데 유전적으로 폴리머에 의해 변형되어 동물 발현 플라스미드의 형질주입, 재조합 fⅧ 전이유전자를 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 이용한 연속적인 형질도입을 용이하게 하며 그 산물은 ET-3으로 나타내었다(ET-3은 미국 특허번호 제7,635,763호의 SEQ ID NO:19와 최소 99% 일치하는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드이다).

본 실시예에 기술된 방법 및 Spencer 2011의 방법을 결합하여 발생한 세포주 결과를 BHK-MS-P14으로 지정하였고 발명자 및 양수인에게 연락함으로써 구할 수 있다. 본 세포주는 증가된 생산수율, 현탁배양에서 성장능력 및 부모세포주에 비하여 증가된 바이러스 생산능력을 제공한다.

도 7은 배양밀도에 따른 fⅧ 활성(ET-3)을 나타낸다.

도 8은 BHK-MS-P14 현탁 배양의 장기 성장 및 안정성을 나타낸다. 밀도결정은 bicinchoninic acid(BCA) 단백질 검정을 이용하여 총 단백질 농도를 측정하여 공지된 BHK 단백질/세포 표준수치와 비교함으로써 실행하였다.

도 9는 P14 클론이 무혈청 배지 또는 혈액유래의 또는 재조합 알부민(recombinant albumin)이 보충된 화학적으로 규명된 배지와 같은 다양한 배지에서 효율적인 fⅧ 생산을 할 수 있음을 나타낸다.

실시 예7

본 실시 예에서 본 발명에 의해 현탁에 적응시킨 세포는 재조합 fⅧ 분자 외에 외부 전이유전자, 예를 들어 GFP를 발현하기 위해 유전적으로 변형될 수 있음을 증명한다.

본 발명에 따른 BHK-Ms 세포의 수치를 증명하기 위해, 본 발명자들은 예를 들어 다양한 재조합 단백질을 발현하기 위해 쉽게 유전적으로 변형될 수 있음을 나타내었다. 따라서 표준 형질주입 조건하에서 양이온 폴리머 PEI를 이용하여 BHK-Ms 유전자 변형의 효율성을 나타내었다. 도 10은 PEI와 리포터 유전자로서 녹색형광단백질(green fluorescent protein(GFP))를 암호화하는 플라스미드를 이용하여 HEK-SC-293T 현탁세포의 유의적인 유전자 변형을 증명한다. 도 10은 본 발명에 따라 GFP 형질주입된, 현탁에 적응시킨 GFP 생산 HEK-293T이다.

실시 예8

하기는 시험생산을 위한 본 발명의 제안된 변형예이다. 예를 들어 시험생산을 위해서 본 발명에 의해 현탁에 적응시킨 부착세포주, 예를 들어 ET-801 발현 BHK-Ms 클론은 10리터의 BHK-Ms 생산배지를 포함하는 50리터 바이오리액터(예를 들어 Xcellex)로 대형화될 수 있다. 5내지 10리터의 조건배양액은 매일 채취하여 여과하고 -80℃에서 냉동할 수 있다. ET-801은 본 발명자들이 앞서 기술한(Spencer HT, Denning G, Gautney RE, Dropulic B, Roy AJ, Baranyi L, et al. Lentiviral Vector Platform for Production of Bioengineered Recombinant Coagulation Factor Ⅷ. Mol Ther. 2011) 신규한 단일 단계의 이온교환 크로마토그래피 프로토콜(protocol)을 이용하여 조건배양액으로부터 정제될 수 있다. 시판하는 전체길이 재조합 인간 fⅧ의 정제는 정제과정에서 다른 생물학적 약제, 예를 들어 항-인간 fⅧ 단일클론의 면역 글로불린항체의 존재 때문에 확인과정을 복잡하게 하는 면역친화 단계를 포함할 수 있다. Spencer 2011에 기재한 정제과정은 제조비를 감소시킴으로써 원가를 줄일 수 있다. fⅧ 제제는 순도, 가공, 비활성 및 하기 트롬빈 활성화 소멸의 운동학에 관하여 분석될 수 있다(Spencer HT, Denning G, Gautney RE, Dropulic B, Roy AJ, Baranyi L, et al. Lentiviral Vector Platform for Production of Bioengineered Recombinant Coagulation Factor Ⅷ. Mol Ther. 2011).

신규성에 관한 추가사항

실시 예 및 공개한 내용에 따라 본 발명자들은 부착세포를 현탁배양에 적응시키는 방법을 증명한다. 본 발명자들은 본 발명에 의해 생산된 신규 세포주를 제공하고 본 발명에 의해 생산된 현탁세포주의 우수한 생산능력을 증명한다. 놀라운 생산결과를 설명하기 위해 여기 공개된 결과는 현재 시장에서 주요 fⅧ 제조사에 의해 얻은 결과와 비교될 수 있다. 규모 및 생산성에서의 비교를 위해 벡스터( Baxter.Inc) 사는 2003-2004년에 미국 식품의약국(FDA) 및 유럽연합 집행위원회의 승인을 받은 이래로, 3세대 재조합 h-fⅧ 제제의 누적판매가 10억unit(대략 100g)을 뛰어넘는다고 2006년 1월에 발표했다. 도 1에서 나타낸 대로 시판되는 각 재조합 fⅧ 제제의 연생산량은 100~200g이다.

이와 비교하여 BHK-Ms 클론 3-10을 1리터 스피너 플라스크에 씨딩(seeding) 함으로써 본 발명의 중간시험 규모의 fⅧ 생산을 수행할 수 있고 대략 10⁶ cells/mL 의 밀도로 증식할 수 있다. 그 다음 전체 배지는 10리터 BHK-Ms 생산배지를 함유하는 50 리터 바이오리액터(예로 Xcellerx)에 씨드(seed) 하기 위해 이용될 수 있다. 생산단계에서 예상되는 세포밀도 2×10⁶ cells/mL에 근거하여 본 발명자들은 하기 계산을 이용하여 일일 ET-801 생산을 추산하였다:

따라서 본 발명자들은 30일의 생산과정 내내 대략 6천만unit의 fⅧ 활성을 포함하는 300 리터의 조건배양액을 수집할 수 있다. 이전에 측정한 비활성 17,700 units/mg(Spencer 2011)을 고려하여 본 발명자들은 생산수율이 3g을 초과할 것으로 예상한다.

증명한 바와 같이 1회의 30일 1L 작동에서 본 발명자들은 100만units 이상의 fⅧ을 수집하였다. 본 발명에 따라 생물공학 규모(예를 들어 바이엘은 언제든지 10 또는 200L 이상의 바이오리액터를 동시에 작동시킨다)로 생산을 대형화시킨 세포는 30일 1000L 작동에서 10억units을 생산할 수 있다. 다시 말해, 바이엘사가 거의 3년을 들여 비싼 제조기기 및 직원으로 성취한 것을 본 발명은 30일 1000L 작동으로 달성할 수 있다.

따라서 본 발명의 방법, 시스템 및 세포주는 상당히 비용을 감소시키고 fⅧ 같은 긴급하게 필요한 바이오치료제의 가용성을 증가시킨다. 다른 실시예로서 바이엘사는 버클리(Berkeley) 지역에서 다량의 fⅧ 제제, KOGENATE FS를 제조하기 위해 1000명 이상의 인원이 대략 250일을 필요로 한다고 발표하였다. 이것은 제품 200g에 해당한다. 본 발명은 적은 자원을 이용하여 적은 시간 안에 더 많은 제품을 생산할 수 있다. 예를 들면 추산된 fⅧ 연생산량은 100~200g이다. 본 발명자들은 실험실 규모에서 매우 제한된 자원으로 30일 안에 추산된 fⅧ의 연생산량의 1/10 이상을 생산할 수 있음을 증명하였다.

도 11은 두 개의 제조계획을 나타내는데 그 중 하나는 ET-801의 롤러병 생산을 기본으로 하고, 다른 하나는 단일탱크 바이오리액터를 기본으로 한다. 이것은 재조합 단백질 제조에서 현탁세포 증식의 장점을 두드러지게 한다. 적게 잡아도 BHK-Ms를 기본으로 하는 제조는 BHK-M을 기본으로 하는 롤러병 제조보다 생산수율을 2배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 이러한 중요한 개발은 재조합 단백질 제약시장으로의 기술적이고 경제적인 진입장벽을 극복할 수 있고 현재 치료받지 못하는 혈우병 A 환자 2/3로의 fⅧ 공급을 증가시킬 수 있다.

fⅧ 제품을 특징으로 하는 실험 프로토콜 공개

ET-801을 생합성하는 BHK-Ms의 정제 및 생화학 분석: 최근 기술한 대로(Spencer 2011) 여러 가지 기술 중에 원-스텝 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 재조합 ET-801을 정제하였다. fⅧ 포함하는 분획은 일단계 응고분석 및 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)에 이은 은염색법(silver staining)에 의해 확인될 수 있다. ET-801의 비활성은 예상되는 티로신(tyrosine), 트립토판(tryptophan) 및 시스테인(cysteine) 함량 및 280nm 에서 흡광도로부터 결정된 몰흡광계수를 이용하여 계산될 수 있다(Pace CN, Vajdos F, Fee L, Grimsley G, Gray T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 1995;4(11):2411-23).

최종물질의 비활성은 280nm에서 흡광도가 0.08미만이거나 활성지수가 20미만임을 입증한 분획을 제외하고 fⅧ 피크분획의 비활성 가중평균으로서 정의될 수 있다. ET-801 제제의 순도는 다양한 생화학적/물리적 기술을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어 SDS-PAGE 및 은 염색법은 순도 및 프로세싱(processin)을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명자들은 예비 데이터를 기본으로 하여 PACE/퓨린(furin) 세포내 프로세싱에 특유한 헤테로다이머(중사슬/경사슬) 형태로 존재하는 95% 이상의 정제된 단백질을 예상한다. 또, 본 발명자들은 인간, 돼지 및 인간/돼지 하이브리드 fⅧ 제제에서 보통 관찰되는 소량의 프로세스 되지 않은 단일 사슬 물질을 관찰할 수 있다(Spencer HT, Denning G, Gautney RE, Dropulic B, Roy Aj, Baranyi L, et al. Lentivial Vector Platform for Production of Bioengineered Recombinant Coagulation Factor Ⅷ. Mol Ther. 2011; Doering C, Parker ET, Healey JF, Craddock HN, Barrow RT, Lollar P. Expression and characterization of recombinant murine factor Ⅷ. Thromb Haemost. 2002;88(3):450-8; Doering CB, Healey JF, Parker ET, Barrow RT, Lollar P. Identification of porcine coagulation factor VIII domains responsible for high level expression via enhanced secretion. J Biol Chem. 2004;279(8):6546-52).

ET-801은 또한 완벽한 활성상태 및 헤테로트리머(heterotrimeric) fⅧa를 나타내는 A1, A2 및 A3-C1-C2 밴드의 존재를 확인하기 위해 SDS-PAGE에 앞서 트롬빈으로 배양될 수 있다. ET-801 제제는 펩티드 질량 핑거프린팅(peptide mass fingerprinting)으로 특징지어질 수 있다(Mann M, Hendrickson RC, Pandey A. Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry. Annu Rev Biochem. 2001;70:437-73). 간단히, 단백질 제제는 소화되고 펩티드 분자이온의 질량이 결정되어 펩티드 질량 스펙트럼을 산출할 수 있다. 더욱 확정하는 확인은 선택된 펩티드 이온의 질량 분광분석적인 실험을 수행함으로써 달성될 수 있다. 수득한 데이터는 ET-801의 아이덴티티(identity)를 확인하고 제제 내에 포함된 잠재적인 오염가능성을 발견하며 존재하는 번역 후 변형(post-translational modifications)의 특징을 나타내기 위해 이용될 수 있다.

고분자량의 fⅧ 응집물 형성은 fⅧ 정제의 문제점을 야기한다(Grillo AO, Edwards KL, Kashi RS, Shipley KM, Hu L, Besman MJ, et al. Conformational origin of the aggregation of recombinant human factor Ⅷ. Biochemistry. 2001;40(2):586-95). 여러 방법 중에 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography(HPLC))가 큰 fⅧ 응집물의 존재에 관하여 ET-801 제제를 실험하기 위해 이용될 수 있다.

트롬빈 활성상태에 이은 활성화 ET-801의 안정성:정제된 ET-801은 재조합 인간, 돼지 ET-801, 다양한 인간/돼지 하이브리드 Ⅷ 구성물 및 쥐 fⅧ의 특징에 관하여 앞서 설명한 프로토콜을 이용하여 A2 서브유닛(subunit) 해리비율에 관해 가려낼 수 있다(Doering CB, Parker ET, Healey JF, Craddock HN, Barrow RT, Lollar P. Expression and Characterization of Recombinant Murine Factor Ⅷ. ThrombHaemost. 2002;88(3):450-8; Doering CB, Healey JF, Parker ET, Barrow RT, Lollar P. Identification of porcine coagulation factor VIII domains responsible for high level expression via enhanced secretion. J Biol Chem. 2004;279(8):6546-52; Doering CB, Healey JF, Parker ET, Barrow RT, Lollar P. High-level expression of recombinant porcine coagulation factor Ⅷ. JBioChem. 2002;277(41):38345-9; Parker ET, Doering CBk Lollar P. A1 subunit-mediated regulation of thrombin-activated factor Ⅷ subunit dissociation. JBiolChem. 2006).

예를 들어 ET-801은 0.15M NaCl, 0.02 HEPES, 2mM CaCl₂에 1, 20, 50 또는 100 nM로 희석되고 100 nM 트롬빈으로 30초동안 활성화될 수 있다. FⅧ 활성은 색소생산성 실험(chromogenic assay)에 따라 측정될 수 있다. 이러한 조건하에 fⅧ는 30초 동안 완전히 활성화되고 실험에서 손실된 활성은 전적으로 fⅧa 소멸로 인한 것이다(Fay PJ, Smudzin TM. Characterization of the interaction between the A2 subunit and A1/A3-C1-C2 dimer in human factor Ⅷa. JBiolChem.1992;267(19):13246-50; Lollar P, Parker CG. pH-dependent denaturation of thrombin-activated porcine factor Ⅷ. jBiolChem.1990;265(3):1688-92; Lollar P, Parker ET. Structural basis for the decreased procoagulant activity of human factor Ⅷ compared to the porcine homolog.JBiolChem.1991;266(19):12481-6; Lollar P, Parker ET. Fay PJ. Coagulant properties of hybrid human/porcine factor Ⅷ molecules. JBioChem.1992;267(33):23652-7).

혈우병 A 쥐 모델에서의 ET-801 효능 결정: 본 발명자들은 E16 혈우병 A 쥐의 꼬리절개에 이어 사망률 또는 혈액손실을 감소시키는 fⅧ 능력을 평가하기 위해 효능모델을 준비하였다(Parker ET, Lollar P. A quantitative measure of the efficacy of factor Ⅷ in hemophilia A mice. Thromb Taemost. 2003;89(3):480-5). 상기 모델에서 혈우병 A 쥐가 꼬리절개에 앞서 fⅧ를 투여받지 않는다면 사망률은 90% 이상이다. 본 발명은 50% 유효용량(ED₅₀)을 나타낼 측정치 양을 측정함으로써 재조합 p-fⅧ 및 돼지혈장 유래의 fⅧ의 비교 능력을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 상기 모델은 in vivo에서 ET-801의 ED₅₀을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 간단히, E16 혈우병 A 쥐는 처음에 1.5mg/kg 드로페리돌/ 75mg/kg 케타민의 마취제를 복강내 주사로 투여받을 수 있다. 그 다음에 꼬리정맥을 확장시키기 위해 60와트(watt) 램프 하에서 3분 동안 데울 수 있다. 이중 블라인드 실험기법으로 다양한 용량의 ET-801, BDD p-fⅧ, BDD h-fⅧ 또는 식염수를 꼬리정맥으로 정맥투여하였다. 주사한지 15분 후에 쥐를 50mL의 코니칼 튜브(conical restraint tube) 안에 두고 꼬리의 먼 1cm를 절개하여 남은 부분을 37℃의 워터바쓰(water bath)에서 유지한 7.5 mL의 150 mM NaCl을 포함하는 13×100 mm 테스트 튜브(test tube)안에 두었다. 살아남은 쥐는 2, 4, 6 및 24시간째에 무게를 쟀다. 급속한 혈액손실의 양적인 대리측정으로서 체중손실은 가변적인 2차 효능으로서 이용될 것이다. ED₅₀은 승강법(up-and-down method)을 이용하여 결정될 수 있다(Dixon WJ. Staircase bioassay: the up-and-down method. Neurosci Biobehav Rev.1991;15(1):47-50). 사망률 같은 실무율적 반응(all-or-none response)에서 표준편차는 프로비트 분석(probit analysis)를 이용하여 측정될 수 있다.

결론

요컨대, 본 발명에 따라 현탁액에 적응시킨 세포, 예를 들어 BHK-Ms 세포 및 HEK-293T 세포는 바이오치료제 제조분야 및 바이러스 생산분야에서 중요하고 기술적인 발전을 나타낸다.

ET-801은 혈우병 A 치료제 개발에 있어서 환자에게 가해지는 치료의 주요장벽, 즉 fⅧ제제의 가격을 극복하는 신규한 제제이다. 예비자료에 근거하여 본 발명자들은 ET-801과 같은 중요한 바이오치료제를 현재 시판되는 h-fⅧ 제제보다 상당히 높은 생산 수준으로 수득하기 위해 사용될 수 있는 방법, 시스템 및 세포주를 제공한다. fⅧ 구성요소의 고농도 발현, 렌티바이러스 중심의 유전자 형질전환 및 유전자 발현, 제조를 위한 BHK-Ms 세포 플랫폼의 이용 등의 기술적인 발전의 혼합을 통하여 ET-801은 시판되는 fⅧ 제제보다 낮은 가격으로 시장이 형성될 수 있고 따라서 혈우병 A 환자들은 더 좋은 치료를 받을 수 있는 반면 이후의 감소된 의료지원 비용을 통해 경제적인 이익을 줄 수 있게 되었다.

본 발명자들은 본 발명이 다양한 부착세포주를 현탁배양으로 변형시키는데 일반적으로 이용될 수 있음을 증명하였다. 본 발명자들은 그 결과로 발생한 세포주가 부모세포주 및/또는 부착세포주를 능가하는 높은 생산수율의 특징이 있음을 나타내었다. 또 본 발명자들은 본 발명에 의해 제조된 세 가지의 특정 세포주 BHK-MS-310, BHK-MS-P14 및 HEK-SC-293T의 특징을 나타내었다. 상기 세포주 각각은 다른 곳(location)에서도 발명자 및/또는 양수인(assignee)에게 연락함으로써 이용가능하다.

본 발명은 여러 이유로 공지된 방법을 넘어서는 신규한 방법이다. 부착된 동물 세포주로부터 현탁세포를 준비하는 공지된 방법은 주로 마이크로비드(microbead), 마이크로캐리어(microcarrier) 및 다른 유사한 장치를 필요로 한다. 게다가 혈청제거가 일부 동물세포주를 현탁으로 형질전환시킬 수 있다고 보고된 바 있다. 본 발명의 결과로 발생한 현탁 세포주는 군집상태를 보인다(군집된 상태의 시각적 예시는 도 2("Day10"으로 표시) 및 도 4(e) 및 4(f) 참조). 본 발명자들은 현재 알려진 단일세포 현탁을 넘어서는 군집된 세포 현탁의 장점을 나타내었다.

게다가 본 발명은 마이크로비드 및/또는 혈청제거를 이용하는 방법보다 시간과 물질을 절약할 수 있다. 본 발명자들은 순차적인 혈청제거 단계(예를 들어 혈청의 양이 점차 감소되는 배지로 세포를 이동시키는 것, 예를 들어 10%, 다음에 8%, 다음에 4%등. 혈청이 0%가 될 때까지)에 대한 필요없이 혈청 포함배지에서 무혈청배지로 바로 통과할 수 있는 본 발명 세포의 신규한 특징을 증명하였다. 혈청제거에 대한 필요성을 제거한 것은 시간과 자원을 절약하는 새롭고 놀라운 장점이다. 게다가 마이크로비드 및 마이크로캐리어는 매우 비싸므로 마이크로비드 및/또는 마이크로캐리어를 필요로 하지 않는 본 발명은 여러 장점들 중에서도 마이크로캐리어 및/또는 마이크로비드를 필요로 하는 다른 방법들보다 가격을 줄일 수 있는 장점이 있다.

앞서 설명한 본 발명의 실시예들은 당업계의 숙련된 사람이 최선의 실시형태로 이용할 수 있으며 본 발명의 범주 내에서 실시될 수 있는 변화 및 변형은 당업계의 숙련된 사람에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 앞서 기술된 실시예 및 방법에 의해 제한되어 해석되지 않는다.

Claims

하나 이상의 숙주세포를 표면적을 가진 일차 배양접시에서 성장시키는 단계와;
(a) 성장서포팅배지를 제거하는 단계와;
(b) 배양접시에서 세포를 분리시키는 단계와;
(c) 상기 세포를 배양하는 단계와;
(d) 상기 세포를 성장서포팅배지에 재현탁하는 단계와;
(e) 상기 재현탁한 세포를 플레이팅(plating)하는 단계와;
(f) 상기 세포가 배양접시에 재부착될 때까지 세포를 성장시키는 단계와;
(g) (a)~(f)단계를 적어도 1회 반복하는 단계와;
(h) 상기 세포를 현탁배양 플라스크에 옮기는 단계와;
(i) 상기 세포를 교반하는 단계.
로 구성되는 숙주세포를 성장 및 유지시키는 성장서포팅배지를 이용하는 단계
로 이루어지는 것을 특징으로 하는 숙주세포를 현탁 세포배양에 적응시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 적어도 하나의 BHK-M 또는 HEK-293T세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포를 현탁 세포배양에 적응시키는 방법.
제2항 기재의 방법에 따라 생산되는 것을 특징으로 하는 세포주.
제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 HEK-293 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항 기재의 방법에 따라 생산되는 것을 특징으로 하는 세포주.
제2항 기재의 방법에 따라 생산되는 것이 특징인 ET-801 발현하는 세포주로 구성되는 현탁 세포배양, 시스템에서 적어도 하나의 폴리펩티드 및 바이러스를 생산하는 방법.
제4항 기재의 방법에 따라 생산되는 것이 특징인 ET-3 발현하는 세포주로 구성되는 제제의 고수율 생산용 시스템.