KR20140033370A

KR20140033370A - 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20140033370A
Application number: KR1020137031103A
Authority: KR
Inventors: 헤먼트 케이. 로이; 라메시 케이. 월리; 다난자이 쿤테
Original assignee: 노스쇼어 유니버시티 헬스시스템
Priority date: 2011-04-27
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2014-03-18
Also published as: US20140050724A1; JP2014513103A; EA201301205A1; BR112013027369A2; ZA201308892B; EP2702030A1; AR086207A1; CA2834395A1; AU2012249494A1; CN103619792A; EP2702030A4; WO2012149302A1; TW201311255A; MX2013012337A

Abstract

폴리에틸렌글리콜(PEG)를 포함하는 조성물을 두경부 편평세포암종 (두경부 편평세포암종)의 예방 및 치료를 위하여 개시한다. 유효한 양의 PEG 투여를 포함하는 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료에 대한 방법을 개시한다. 또한 PEG를 이용한 EGFR의 표면 발현 억제를 위한 방법 및 조성물을 개시한다.

Description

조성물 및 방법{Compositions and Methods}

본 발명은 두경부 편평세포암종(head and neck squamous cell carcinoma) (HNSCC)과 같은 편평세포암종의 예방(prophylaxis) 및 치료에서 사용하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이런 암종의 예방(preventing) 및/또는 치료방법에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명의 목적 및 장점은 아래의 설명으로부터 명백해 질 것이다.

두경부 암은 2010년에 미국에서 대략 7900 명의 사망원인이었던 것으로 추정된다 (Pfister D.G et al; J. Natl. Compr. Canc. Netw. 2011; 9:596-650). 이 질병 발병의 일반적인 위험 요소는 흡연이나 담배 씹기, 알코올의 소비, 빈랑 열매 씹기 및/또는 인체 유두종바이러스(human papillomavirus) (HVP)의 감염을 포함한다.

두경부 편평세포암종은 미국에서 대략 모든 암의 3%를 차지한다. 본 발명에서 사용된 것 같이, 용어 “두경부 편평세포암종”은 편평세포에서 시작하는 두경부의 어느 암 (조직, 눈, 다양한 내부 장기, 및 일부 샘(gland)의 속빈 장기(hollow organs)와 관(duct)의 내층(linin)의 표면을 형성하는 가늘고 평평한 세포)을 포함한다.

두경부 편평세포암종은 높은 사망률 및 이환률(morbidity)과 연관되어 있다. 이 공격적인 상피 악성 종양은 구강(oral cavity), 경구인두(oropharynx) 및 후두(larynx)를 포함하는 상부 호흡소화관(aerodigestive track)의 점막벽(mucosal lining)에 내포한다.

심지어 치유력이 있는 치료 후에도, 환자는 항상 두경부 폐 영역에서, 새로운 두 번째 암 발병으로 인한 상승된 생명 위험을 여전히 가지고 있다. 생존자의 약 30%가 두 번째 악성 종양이 발병하는 동안, 두경부 편평세포암종의 발병의 초기 위험 요인이 구강백반증(oral leukoplakia)이다.

원발암(primary cancer)의 재발을 경험하지 않은 환자일지라도 “구역 암화(field cancerization)”로 또한 알려진, 선행 전암성 암 영역의 결과로서 두 번째 암이 재발할 높은 위험성을 가지고 있다.

두경부 편평세포암종의 화학예방, 예를 들어, 비스테로이드성 항 염증성 약물 (NSAIDS), 레티노산(retinoic acid), 베타 카로틴(beta-caroten)은-최소한의 효능이 나고 독성이 손상되는 날짜를 기록해야만 한다. 광범위한 치료 선택권에도 불구하고, 두경부 편평세포암종의 5년 생존율은 지난 4-5년간 크게 개선되지 않았다. 또한, 질병의 심각성과 그 다음의 과격한 수술 관리의 결과로써, 두경부 편평세포암종 환자는 얼굴 모양, 말하기, 삼키기와 호흡에서 심신을 약하게 하는 변화때문에 삶의 질이 나빠지고 있다.

따라서, 이 질병의 예방 및/또는 치료 개선에 대한 필요성이 아직 존재한다.

본 발명의 목적은 유효한 양의 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 두경부 편평세포암종(head and neck squamous cell carcinoma) (HNSCC)의 예방 및/또는 치료방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 두경부 편평세포암종(head and neck squamous cell carcinoma) (HNSCC)의 예방 및/또는 치료하는데 있어서 상기 폴리에틸렌글리콜의 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 최종 목적은 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료용 의약의 제조에 있어서 폴리에틸렌글리콜의 용도를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 유효한 양의 폴리에틸렌글리콜을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 두경부 편평세포암종(head and neck squamous cell carcinoma) (HNSCC)의 예방 및/또는 치료방법을 제공한다.

또한 본 발명의 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료하는데 있어서 상기 폴리에틸렌글리콜의 조성물을 제공한다.

나아가 본 발명의 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료용 의약의 제조에 있어서 폴리에틸렌글리콜의 용도를 제공한다.

본 발명에 의하면, 유효한 양의 폴리에틸렌글리콜 및/또는 추가 치료제(방사선 치료 또는 항암제)를 대상에게 병용-투여하여 종양의 개수와 크기를 감소시키는 효과를 나타내는 조성물 및 용도로서 제공될 수 있다.

도 1은 두경부 편평세포암종에 대한 모델인 생체외(in vitro) SCC-25 세포에서 PEG 8000의 항증식 활성을 설명하는 그래프이다. SCC-25 세포는 96-웰 플레이트(96-well plate)에 분주한 후, PEG 8000의 다른 농도(0.62mM (0.5% w/v) 내지 12.5 mM(10% w/v))로 24 시간 동안 처리하였다. 세포 증식의 변화(세포 숫자)는 표준 WST-1 분석(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)을 사용하여 분석되었다. 실험은 3번의 결정에 대하여 3회씩 수행하였다. 데이타는 대조군(vehicle alone)과 비교하여 평균 ± S.D.;

p<0.05, ★p<0.001로 표시된다.
도 2는 SCC-9 및 SCC-25 세포에 있는 표피 성장 인자 수용체 (epidermal growth factor receptor; EGFR) 발현 수준에서 PEG 3350 또는 8000의 효과를 설명하는 그래프이다. SCC-10과 SCC-25 세포는 PEG 3350의 5% w/v 용액, 또는 PEG 8000의 5% w/v 용액으로 처리되었다. 세포는 트립신처리되었고, EGFR의 표면 발현 염색 및 유동 세포측정 분석(flow cytometric analysis)을 받았다. 실험은 3번의 결정에 대하여 3회씩 수행하였다. 데이타는 해당 대조군(control)과 비교한 평균 ± S.D.; ×p<0.01, *p<0.001로 표시된다.
도 3은 두경부 편평세포 암의 래트(rat) 4-니트로퀴놀린-1-옥사이드(4NQO) 모델에서 종양 진행 억제에 대한 PEG-8000의 생체내(in vivo) 국소 투여의 결과를 설명하는 그래프이다. 이러한 생체내 모델을 개발하기 위해서, 래트는 4NQO (20 PPM)-보충용 물에 자유로운(ad libitum) 접근이 주어졌다. 14주 후, 래트는 일반 물로 전환되었고 똑같이 PEG 또는 비히클(vehicle)-처리된 대조군으로 임의로 추출되었다. 래트는 매일 (3 내지 4분) 구강(혀, 구강 바닥/지붕)의 10% PEG 8000 또는PBS (비히클 대조군)의 국소 적용을 받았다. 래트는 14주 후 안락사되었다. 혀는 절제되었고 종양 개수(도 3 상단 패널)와 종양 부피 (도 3 하단 패널) 모두를 평가하는, 종양 부하량의 거시적 평가(macroscopic assessment)를 받았다. 데이타는 평균 ± S.D.로 표시된다.
도 4는 단지 4NQO (상단(top) 패널, 왼쪽에서 오른쪽), 또는 4NQO 및 PEG 8000 모두 (아래 패널, 왼쪽에서 오른쪽)에 노출된 동물의 구개와 혀를 비교하는 일련의 사진이다. 사진은 도 3에 설명된 것 같이 비히클(vehicle) 처리된 래트에 비해 PEG 8000 처리된 조직에서 감소된 종양 부피를 반영한다.
도 5는 전암상태의 상피 과다증식위에 PEG 8000의 경구 국부 적용의 효과를 나타내는 4NQO-처리된 래트 혀의 면역 조직 염색 부분의 현미경 사진의 시리즈이다. 경구/혀 조직의 병리학적 등급을 평가하기 위해, 포르말린(formalin)-고정 및 H & E 염색 절편은 병리학적 평가를 받게되었다. (상단 패널)에서 보여진것 같이, 4NQO-처리된 래트로부터 H&E 염색된 부분에서, PEG 8000 처리된 래트로 표준화된 경도에서 중등도(mild-to-moderate) 상피 형성이상의 국부적인 영역의 수를 보였다. 4NQO-처리된 래트의 혀/경구 부위의 점막 증식위에 PEG 8000 적용 효과를 더 연구하기 위해, 조직 절편은 증식의 명확한 마커(well-defined marker)인, 핵 항원 Ki67의 면역조직화학 분석을 실시하였다 (아래 패널). 도 5에서 나타낸 바와 같이, 발암물질 없는 대조군에 비해, 4NQO-처리는 대조군에 비해 Ki67-표지된 세포/광학 분야 (p <0.01)의 증가된 수에 의해 설명된 대로 혀 점막의 증식을 증가시켰다. 그러나 발암 물질-개시(carcinogen-initiated)된 래트가 PEG 8000의 국소 적용에 노출되었을때, 4NQO 군에 비해 Ki-67 양성 세포 수의 감소됨이 관찰되었다(p <0.01). 대조군과 비교되었을 때, 발암물질 투여군에서 높은 비율의 세포가, 층상 편평 혀 상피(stratified squamous tongue epithelium)의 기초 구획위에(supra-basal compartment) Ki-67 양성인 것으로 나타났다. PEG 8000 치료는 대조군에서 볼수 있는 것처럼 주로 기저층(basal layer)에 발현을 제한하는, 기초 구획에 Ki-67 양성 세포 수를 감소시킨다.
도 6은 EGFR 발현상에 PEG 8000의 국소 적용의 효과를 설명하는 현미경 사진이다. 대조군 (발암물질-비처리) 및 PEG-8000 처리 또는 4NQO-비처리된 래트로부터 포르말린-고정 혀 절편은 EGFR발현의 면역조직화학 평가를 받았다. 설명된 것처럼, 4NQO 래트의 혀 점막의 기준치 EGFR의 발현은 대조군 (비발암물질 처리) 래트 EGFR의 발현보다 훨씬 높았다(P <0.00001). 그러나, 4NQO 래트에 PEG 8000의 국소 적용은, PEG-비처리된 4NQO-래트에 비해 EGFR 발현에 상당한 감소를 일으켰다(p <0.005). 4NQO 절편이 EGFR에 대해 심하게 염색되는 반면, 대조군 및 4NQO-PEG 절편들은 EGFR에 대해 거의 또는 전혀 염색이 되지 않았다.
도 7, 8 및 9는 SCC-25 세포에서 상이한 PEG 제제(PEG 3350, PEG 4000 및 PEG 8000)에 의한 감소된 세포의 증식 및 EGFR 표현을 설명하는 그래프이다. 세포는 96-웰 플레이트(96-well plates)(WST-1 분석) 또는 60 mm 세포 배양 접시(cell culture dishes)(EGFR 및 PCNA 발현)에 분주되었다. 세포는 24 시간 동안 별도로 PEG 3350(도 7), PEG 4000(도 8) 및 PEG 8000(도 9)로 처리되었다. 세포 증식은 WST-1 분석과 웨스턴 블롯팅(Western blotting)에 의한 세포 증식 마커(marker)인 증식 세포 핵 항원(Proliferating Cell Nuclear Antigen; PCNA)을 모두 측정하여 결정되었다. EGFR의 발현은 웨스턴 블롯팅에 의해 결정되었다. 모든 실험은 실험 당 3회 수행하였다. WST-1 분석을 위해서 각 실험은 12번의 측정을 가졌고, 반면에 EGFR 및 PCNA 측정을 위해서 각각 3번의 측정을 했다. 데이타는 각각의 바이오 마커 (WST-1, EGFR 및 PCNA) ± S.E.M., *p <0.05 및 ×p <0.0001에 대한 대조군의 평균 %(PEG 비처리)로 표시된다.
도 10은 SCC-9 세포에서 상이한 PEG 제제들(PEG 3350, PEG 4000 및 PEG 8000)에 의한 EGFR의 표면 발현의 억제를 설명하는 그래프이다. 본 연구를 위해서, SCC-9 세포는 24 시간 동안 10% w/v PEG로 처리되었고, EGFR표면의 발현을 측정하기 위해서 유동 세포측정 분석을 받았다. 막대그래프는 EGFR의 표면 발현에 대한 대조군(PEG-비처리)의 %로 표시된다. 상기 실험은 각각 4번 측정(4 determinations)에서 한 번 측정 당 3회씩 반복 수행하였다. 데이타는 대조군의 평균 % ± S.E.M.; *p <0.001로 나타냈다.
도 11 및 12는 인체 유두종바이러스 (HPV)(-) 및 HPV(+) 세포에서 EGFR 증식 및 발현 상에 PEG 8000의 효과를 설명하는 그래프이다. EGFR 발현 및 증식 상에 PEG 8000의 효과에 HVP 상태의 역할을 연구하기 위하여, HPV (-) OKF 6 세포(도 11) 또는 HPV (+) HOK 세포(도 12)는 24 시간 동안 PEG 8000의 상이한 농도로 처리되었다. 세포 증식은 WST-1 분석과 웨스턴 블롯팅(Western blotting)에 의한 세포 증식 마커인 PCNA을 모두 측정하여 결정되었다. EGFR발현은 웨스턴 블롯팅에 의해 또한 측정되었다. 모든 실험은 3회씩 수행되었다. WST-1 분석을 위해서 각각의 실험은 12번의 측정을 했고, 반면에 EGFR 및 PCNA 측정을 위해서 각각 3번의 측정을 했다. 데이타는 각각의 바이오 마커(WST-1, EGFR 및 PCNA) ± S.E.M..; * p <0.05 및 ×p<0.0001에 대한 대조군의 평균 %(PEG 비처리)로 표시된다.
도 13, 14 및 15는 종양성장의 퇴화에 대한 PEG의 효과를 연구하기 위하여, 약 1 백만 SCC-25 세포를 무흉선 마우스(athymic mice)의 혀 부위 근처에 직접 이식하는 동소 모델(orthotopic model)이 활용되었다. 2주후 마우스는 무작위로 각각12 마리씩 두 군으로 나뉘고 Q-팁을 사용하여 매일마다 10% w/v PEG 8000 또는 PBS의 경구 국소 적용이 실행되었다. 마우스는 처리 후 19 내지 20일째에 안락사 되었고 종양은 절제되고 중량이 재어졌다. PEG-8000은 대조군에 비해 종양의 무게에 상당한 감소를 일으키는 원인이 되었다(29.8%; *p<0.05, 도 13). 또한 혀 절편에 Ki-67 증식 마커 및 EGFR 면역염색을 평가하였다. PEG 8000은 대조군에 비해 PEG-처리된 군에서 증식 지수(31.5%; *p　<0.002, 도 14) 및 EGFR 염색(42.4%; *p　< 0.005, 도 15)을 상당히 감소시켰다. 데이타는 평균 ± S.E.M.으로 나타낸다.

본 발명은, 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 두경부 편평세포암종에 항증식 활동을 나타내는 관찰에, 적어도 부분적으로, 근거를 둔다.

본 발명에 따르면, 편평세포암종, 특히 대상에 있는 두경부 편평세포암종을 예방 및/또는 치료하는 방법, 즉, 유효한 양의 폴리에틸렌글리콜 (PEG)을 대상에게 투여를 포함하는 방법이 제공된다. 상기 방법에서 사용되는 조성물도 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 유효한 양의 PEG를 대상에게 투여를 포함하는 대상의 두경부 편평세포암종을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법을 위한 적합한 PEG는 바람직하게 약1000 달톤(daltons)과 20,000 달톤 사이, 더 바람직하게는 약 2000 달톤과 9,000 달톤 사이, 더욱 더 바람직하게는, 약 3000 과 8000 사이, 가장 바람직하게는 약 3350, 4000 또는 8000의 평균 분자량을 가진다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 본 명세서의 다양한 측면과 실시형태에서 설명된 바와 같이, 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료를 위한 유효한 양의 PEG (예를 들면, 단독 치료적 활성성분으로써)를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 본 명세서에서 설명된 대로 평균 분자량을 갖는 PEG를 포함할 수 있다.

일실시형태에서, 본 발명은 유효한 양의 PEG를 언급된 대상에 국소 투여를 포함하는 대상의 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 사용된 조성물도 제공된다.

또 다른 실시형태에 따르면, 본 발명은 두경부 편평세포암종 및/또는 전암성병터(pre-malignant lesion) 및/또는 구강백반증(oral leukoplakia)으로 고통받는 대상의 부위에 유효한 양의 PEG를 국소적으로 투여하는 것을 포함하는 대상의 두경부 편평세포암종 초기 및/또는 증식을 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 사용된 조성물도 또한 제공된다.

또 다른 실시형태에 따르면, 본 발명은 유효한 양의 PEG를 대상에게 국소이동적(locoregionally)으로 투여하는 것을 포함하는 두경부 편평세포암종의 예방 및 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 사용된 조성물도 제공된다.

또한 본 발명은 상기 언급된 질병으로 고통받는 대상의 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료에서 국소이동적으로 사용하는 유효한 양의 PEG를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시형태에서, 대상의 두경부 편평세포암종을 예방 및/또는 치료하는 방법, 즉, 유효한 양의 PEG를 하루에 1 내지 5번, 바람직하게는 하루에 2 내지 4번, 더욱 바람직하게는 3번 대상에게 투여되는 방법이 또한 고려된다. 상기 방법을 위한 조성물도 제공된다

일실시형태에서, 본 발명은 대상의 1 또는 그 이상의 경구술(lip), 구강 (혀, 구강 점막(buccal mucosa), 치조 융선(alveolar ridge), 구후삼각(retromolar trigone), 잇몸(gum), 경구의 바닥(floor of mouth), 경구개(hard palate)를 포함), 침샘(salivary glands), 비강(nasal cavity) (비인두(nasopharynx) 포함), 부비강(paranasal sinuses), 인두(pharynx) (예를들어, 혀의 아래부분, 부드러운 구개, 편도 기둥(tonsillar pillar) 및 뼈구멍(fossa)같은 입인두(oropharnyx)를 포함), 후두인두(hypopharnyx)(이상동(pyriform sinus), 측면 인두 벽(lateral pharyngeal wall), 후부 인두 벽(posterior pharyngeal wall), 후윤 인두(postcricoid pharynx)를 포함), 및 후두(larynx)(성문상(supraglottis)(예: 가성대(false cords), 피열연골(arytenoids), 후두개(epiglottis), 피열연골후두개 주름(arytenoepiglottic fold)), 성문(glottis), 하부성문(subglottis)을 포함): 을 갖는 대상에게 유효한 양의 PEG를 투여하는 것을 포함하는 대상의 두경부 편평세포암종의 증식을 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은, 본 명세서의 다양한 측면과 실시형태들에서 설명된 것처럼 대상의 1 또는 그 이상의 경구술(lip), 구강 (혀, 구강 점막(buccal mucosa), 치조 융선(alveolar ridge), 구후삼각(retromolar trigone), 잇몸(gum), 경구의 바닥(floor of mouth), 경구개(hard palate)를 포함), 침샘(salivary glands), 비강(nasal cavity) (비인두(nasopharynx) 포함), 부비강(paranasal sinuses), 인두(pharynx) (예를들어, 혀의 아래부분, 부드러운 구개, 편도 기둥(tonsillar pillar) 및 뼈구멍(fossa)같은 입인두(oropharnyx)를 포함), 후두인두(hypopharnyx)(이상동(pyriform sinus), 측면 인두 벽(lateral pharyngeal wall), 후부 인두 벽(posterior pharyngeal wall), 후윤 인두(postcricoid pharynx)를 포함), 및 후두(larynx)(성문상(supraglottis)(예: 가성대(false cords), 피열연골(arytenoids), 후두개(epiglottis), 피열연골후두개 주름(arytenoepiglottic fold)), 성문(glottis), 하부성문(subglottis)을 포함)에서 통증을 갖는 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료를 위해 유효한 양의 PEG를 대상의 통증부위에 투여하는 것을 포함하는 방법을 또한 제공한다. 상기 방법을 위한 조성물도 제공된다.

본 발명의 바람직한 실시형태는 구강(또는 이들의 해부학적 위치)에 통증을 갖는 두경부 편평세포암종을 갖는 대상에게 유효한 양의 PEG를 구강에 투여(예를 들어 국소이동적으로 투여)하는 것을 포함하는 대상의 두경부 편평세포암종 예방 및/또는 치료하는 방법이다. 상기 방법을 위한 조성물도 제공된다.

추가적인 실시형태에 따르면, 본 발명은 상기 대상의 두경부 편평세포내의 표피생장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR) 표면 발현 및/또는 수용체(receptor)의 인산화(phosphorylation)의 감소 또는 억제를 위해, 유효한 양의 PEG를 대상에게 투여를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법을 위한 조성물도 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 상기 대상의 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료를 위해 대상에게 유효한 양의 PEG와 유효한 양의 1 또는 그 이상의 추가 치료제를 병용-투여하는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 선택적으로 1 또는 그 이상의 추가 치료제를 더 포함하고, 유효한 양의 PEG를 포함하는 본 발명을 위한 조성물도 또한 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에서 상기 대상의 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료를 위해 (a) 항-EGFR제 (예를 들면, 유효한 양의 세틱주맙(cetixumab)과 같은 항-EGFR 항체)와 같은 유효한 양의 치료제; (b) 유효한 양의 PEG: 를 언급된 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 측면의 일부 실시형태에서, 단계 (a)는 단계 (b) 전에 발생한다. 본 발명의 측면의 다른 실시형태에서, 단계 (a)는 단계 (b) 이후에 발생한다. 본 발명의 추가적인 실시형태에서, 단계 (a) 및 (b)는 동시에 발생한다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 두경부 편평세포암종의 경감(remission)에 있어서 유효한 양의 PEG를 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상의 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료 방법이 제공된다. 상기 대상은 부분적 또는 완전한 경감이 될 수 있다. 본 발명을 위한 조성물도 또한 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기 질병의 경감에 있어서 상기 대상의 두경부 편평세포암종의 경감을 개선(예를 들면 예방)하기 위한 유효한 양의 PEG를 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 본 발명을 위한 조성물도 또한 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 유효한 양의 PEG를 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상의 전이성 두경부 편평세포암종을 예방 및/또는 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명에 사용되는 조성물도 또한 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 유효한 양의 PEG를 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상의 국부적 진행성 두경부 편평세포암종을 예방 및/또는 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명에 사용되는 조성물도 또한 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에서 (a) 유효한 양의 PEG를 투여하는 것을 포함하는 대상의 편평세포암종을 퇴화시키는 방법이 제공된다. 본 발명에서 사용한 조성물은, 본 발명에서 설명된 대로, 또한 제공된다. 본 발명의 이러한 측면의 일부 실시형태에서, 편평세포암종은 두경부 편평세포암종이다. 바람직하게는, 편평세포암종은 EGFR를 과발현시킨다. 편평세포암종의 EGFR 발현 상태는 본 발명에 설명된 바와 같이 표준방법, 기술 및 키트(kits)에 따라서 결정될 수 있다.

본 발명의 이러한 측면의 실시형태에서, 상기 방법은 (b) 편평세포암종을 절제 및/또는 제거 및/또는 유효한 양의 치료제 투여를 추가적으로 포함한다. 본 발명의 이러한 실시형태에서, 단계 (b)는 단계 (a) 이후에 발생할 수 있다. 편평세포암종의 퇴화에 의하여, 본 발명은 이후의 치료과정에서 발생하는 대상의 정신적 외상(trauma) 또는 치료와 관련된 부작용의 정도를 줄일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 다음을 포함하는 대상의 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료방법을 제공한다;

(a) 1 또는 그 이상의 두경부 편평세포암종 암종들을 절제 및/또는 제거하는 단계;

(b) 유효한 양의 PEG를 대상에게 투여하는 단계.

본 발명의 이러한 측면의 실시형태에서, 단계 (a)는 단계 (b) 이전에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 단계 (b)는 단계 (a) 이전에 존재한다.

본 발명은 두경부 편평세포암종의 치료 및/또는 예방을 위해서 의약제조용 유효한 양의 PEG, 예를 들면, 본 발명에서 설명된 조성물의 용도를 추가적으로 제공한다.

본 발명은 두경부 편평세포암종같은 편평세포암종의 퇴화를 위해서 의약제조용 유효한 양의 PEG, 예를 들면, 본 발명에서 설명된 조성물의 용도를 추가적으로 제공한다.

본 발명의 조성물

본 발명의 조성물은 단독 치료적 활성 성분인 유효한 양의 PEG를 포함할 수 있고 또는 아래에 더욱 자세히 설명한 것처럼 1 또는 그 이상의 치료제 (특히 항암제)를 포함할 수 있다. 용어 “폴리에틸렌글리콜”(PEG), 아니면, 폴리(옥시에틸렌)(poly(oxyethylene)) 또는 폴리(에틸렌옥사이드)(poly(ethylene oxide)) (PEO)로 알려진 폴리에틸렌 글리콜은, 에틸렌옥사이드의 고분자를 의미한다. 비록, 에틸렌옥사이드 보다 적은 양의 알킬렌옥사이드를 포함하는 말단캡(end-capped)의 구조와 폴리에틸렌 같은 다른 폴리에틸렌글리콜 화합물이 사용될 수 있지만, 본 발명에서 사용된 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 일반식 H-(OCH₂CH₂)_nOH를 가지고 있다.

본 발명에서 사용된 폴리에틸렌글리콜은 1000, 2000, 3000, 4000, 6000으로 구성된 군으로부터 선택되는 하한; 및 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 12,000, 15,000, 20,000으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 상한:의 범위내의 평균 분자량(예를들면, 중량 평균 분자량)을 가지고 있다. 바람직한 범위는 하한범위는 3000 또는 4000이고, 상한범위는 5000, 6000, 7000, 8000 또는 9000중에서 독립적으로 선택된다.

예를 들면, 일부 국가 또는 지역의 약전(pharmacopeias)에 정의된 대로 PEG는 PEG 3350, PEG 4000 또는 PEG 8000일수 있다. 일추가적으로 적당한 PEG의 실시형태는 마크로골 (Macrogols), 예를 들면 마크로골 3350, 마크로골 4000, 마크로골 8000를 포함하는 일부 국가 또는 지역의 약전에서 인정되고 있다. 바람직하게는, 대상에게 국소적으로 투여될 때 PEG는 체계적으로 의미있는 정도로 흡수되지 않는다.

본 발명의 조성물은 또 다른 치료제(아래 참조), 및 1 또는 그 이상의 첨가제 같은 다른 성분을 추가적으로 포함한다. 첨가제의 실시형태들은 소디윰 클로라이드(sodium chloride), 포타슘 클로라이드(potassium chloride), 소듐 바이카보네이트(sodium bicarbonate), 설페이트(sulphate)(예: 소듐 설페이트(sodium sulphate))같은 1 또는 그 이상의 전해질을 포함한다. 일실시형태에서, 본 발명의 조성물은 소듐 클로라이드와 포타슘 클로라이드 및 선택적으로 소듐 바이카보네이트를 포함한다. 본 발명의 조성물은 1 또는 그 이상의 감미료 (예를 들면, 아스파탐(aspartame), 아세설팜 포타슘(acesulfame potassium) (아세설팜 K), 수크랄로우즈(sucralose)와 사카린(saccharine) 및 이들의 조합물) 및 1 또는 그 이상의 향료 (예를 들면, 오렌지, 레몬-라임, 레몬, 시트러스(citrus), 쵸콜렛, 열대 과일, 알로에 베라, 차(tea), 딸기, 자몽(grapefruit), 까막까치밥열매(blackcurrant), 파인애플 및 바닐라)를 포함할 수 있다. 조성물은 추가적으로 아스코르브산염(ascorbate) 및/또는 구연산염(citrate)을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 추가적으로 보존료 및 다른 첨가물, 예를 들면, 항미생물제(antimicrobials), 항-산화제(anti-oxidants), 담체(carriers), 킬레이트(chelating agents), 및 불활성 기체(inert gases)와 허용하는 갈레노스의 연습(galenic practice)으로 알려지거나 불려지는 것을 포함한다. 바람직하게는, 상기 담체는 약학적으로 허용되는 담체이다. 담체는, 종래 사용되는 중의 어느 것이 될 수 있고 화학적-물리적(chemico-physical) 고려사항, 예를 들면, 용해도와 PEG 및/또는 다른 치료제 (있는 경우) 및 투여 경로에 의한 반응성의 부족,에 의해서만 제한된다. 약학적으로 허용되는 담체는 당업자에게 잘 알려져 있고 쉽게 사용할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 활성제에게 화학적으로 불활성이고 사용조건하에서 어떤 해로운 부작용이나 독성이 없는 것으로 바람직하다.

본 발명의 조성물은 다양한 제조를 나타낸다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 수용액(aqueous solution) 또는 현탁액(suspension) (예를 들면 구강청결제), 유화액(emulsion), 페이스트(paste) (예: 치약), 크림, 밤(balm) (예: 립밤(lip balm)), 연고(ointment), 거품(foam), 스폰지, 젤, 츄잉 껌, 스프레이, 약용 캔디(lozenge), 알약(troche), 시럽 (예: 끈적거리는 시럽), 액체기침약(linctus), 슬러리(slurry), 필름 (예: 오로디스퍼서블 필름(orodispersible film)), 타블렛(tablet) (예: 구강분산성 정제 (orodispersible tablet)), 캡슐(예: 액체-젤 캡슐(liquid-gel capsule)), 과립(granule), 캐플릿(caplet), 구강 패치(buccal patch) 의 형태로 제조된다. 특히, 본 발명의 조성물의 바람직한 제조는 수용액, 현탁액, 액체기침약(linctus) 및 페인트를 포함한다.

본 발명의 조성물의 의도하는 용도에 따라, 특정 제조는 특히 적절할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 입술에 투여하고자 할 경우, 본 조성물은 립밤(lip balm) 또는 크림으로 제조될 수 있다. 구강 점막 영역에 조성물을 투여하고자 할 경우에, 구강 청결제, 스프레이 또는 약용 캔디(lozenge)가 특히 적합할 수 있다. 제조가 구강 청결제일 경우, 삼키거나 내뱉기 전에 입 주위에 가글(gargled) 또는 소용돌이(swirled)로 돌게할 수 있다. 본 발명의 조성물은 특히 코, 볼 및 경구 인두 투여를 위해, 연무질(aerosol) 제조로 준비될 수 있다. 본 발명의 조성물은 비압력을 가한 제조로써, 예를 들면, 의료용 분무기(nebulizer) 또는 분무기(atomizer)안에서와 같이 제조할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 이 분야에서 당업자에 의해 잘 알려진 형태로 제조된 액체기침약일 수 있다. 이 형태는 PEG와 표적 조직(예: 인두 및/또는 후두 점막) 사이의 접촉 시간 증가에 도움이 되고 이러한 해부학적 위치에서 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료에 특히 적합할 수 있다.

일실시형태에서, 본 발명의 조성물은 대상에게 국소적으로 투여된다. 국소 투여, 본 발명의 맥락에서, 대상의 신체 표면에 본 발명의 조성물을 적용하는것을 의미한다. 국소 투여는 대상의 내부 표면, 예를 들면 구강 점막에 적용하는 것을 포함한다. 본 발명의 조성물은 표적 영역 (예: 종양) 및 이들의 국부지역 (본 명세서와 배경기술에서 종종 “국소이동적으로 투여”로 언급됨)으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 입술, 혀, 구강 점막 (예: 볼 바닥 및/또는 천장), 비강, 인두, 후두 및 이들의 해부학적 위치에서 통증을 가지는 두경부 편평세포암종에 노출된 대상의 신체의 표면에서 접근할 수 있는 종양 영역에 적용된다. 국소 투여는 본 발명의 조성물의 경구(per os) 투여를 포함할 수 있다. 예를 들어, 국소 투여는 본 발명의 조성물을 삼키는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물과 종양 (있는 경우)의 부위가 노출된 표면 사이의 접촉은 인두를 통해 위장으로 전달되는 조성물로써 가능하게 한다.

예를 들면, 치료적으로 쓰여지는 유효한 양의 PEG는 치료상 및 치료 목적 (예: 예방 또는 치료 또는 둘 다), 투여 경로, 연령, 신체 질량, 치료나 요법(therapy)하에 있는 대상의 상태 (예를 들면, 대상의 성능 상태 결정에 의해), 종양 (있는 경우에)의 단계 및/또는 공격성(예: TNM 점수), 대상에게 제공되는 어느 보조(auxiliary) 또는 보조 요법(adjuvant therapies), 및 대상에게 있어서 본 발명의 조성물을 이용한 요법에 대한 이전의 반응 (적당한 경우)에 따라 달라질 것이다. 유효한 양의 PEG는 표적 조직 (예를 들어, 두경부 편평세포암종 종양)에서 EGFR의 표면 발현의 원하는 감소에 의해, 적어도 부분적으로, 결정될 수 있다. 본 발명에 따르면, 유효한 양의 PEG는 표적 조직에 있는 적어도 30% (또는 대략 그 정도), 예를 들면, 적어도 40%, PEG와 접촉하기 전에 관찰되었던 발현과 비교하여, EGFR 발현 감소 결과를 나타낼 수 있다.

종양 같은 표적 조직에서 EGFR의 표면 발현의 감소는 PEG와 표적 조직 사이의 접촉 시간에 의해 영향을 받을 수 있다. 일반적으로, 표적 조직에서 EGFR의 표면 발현의 큰 감소는 증가된 접촉 시간으로 관찰될 수 있다. 예를 들어, PEG와 표적 조직 사이의 접촉 시간은 5초 내지 10분, 예를 들면, 2 내지 3분 같은 1 내지 5분, 일 수 있다. 그러므로 유효한 양의 PEG는 그에 따라서 적정될 수 있다.

EGFR 감소의 정도는 본 명세서의 실시예에서 설명된 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 특히, EGFR 감소의 정도는 아래에 설명된 대로 유동 분석법(flow cytometry)을 사용하여 확인할 수 있다.

표적 조직의 EGFR 발현 상태는 표준 방법과 키트(kits)를 사용하여 측정할 수 있다 (예를 들면, Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark 로부터 사용가능한 EGFR pharmDx^TM).

두경부 편평세포암종의 예방에 사용되는 유효한 양의 PEG는 두경부 편평세포암종의 치료에 사용되는 두경부의 치료에 사용하기 위한 유효한 양의 PEG와 다를수 있다. 일실시형태로, 예방 환경에서, 일반적으로 치료 환경에서 사용되는 것보다 적은 양의PEG가 필요하다. PEG는 이미 널리 의료 분야에서 사용되고 잘 용납되어 있기 때문에, 심각한 부작용의 위험이 낮은 것으로 간주된다. 본 발명자들이 PEG가 농도 의존적으로 생체외(in vitro) 두경부 편평세포암종의 증식을 억제할 수 있음을 증명했기 때문에 (아래 참조), 위에서 설명한 사항에 따라 유효한 양의 PEG 를 확인하는 일반적으로 숙련된 사람의 권한 내에 있다.

본 발명의 조성물은 유효한 양의 PEG를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 수용액(예: 구강 청결제)은 PEG의 7.5% w/v 또는 그 이상(예를 들면 10%w/v 또는 이상)을 포함할 수 있다. 유효한 양의 PEG를 포함하는 본 발명의 조성물은 하루에 한 번 또는 그 이상, 예를 들면, 하루 두 번, 하루 세 번, 네 번 또는 다섯 번 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물로 치료하는 기간은 위에서 주어진 고려사항에 따라, 부분적으로, 의존한다. 이러한 고려사항은 담당의사 또는 의료 전문가의 권한내에 있다.

치료제

유효한 양의 PEG를 포함하는 본 발명의 조성물은 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료를 위해 1 또는 그 이상의 치료제와 함께 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 1 또는 그 이상의 치료제과 함께 병용-투여될 수 있다. 용어 “병용-투여”는 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료하기 위해 1 또는 그 이상의 치료제와 함께 본 발명의 조성물의 협력된 투여(coordinated administration)를 의미한다. 본 발명의 조성물과 1 또는 그 이상의 치료제 사이의 협력 투여는 동시적(simultaneous), 연속적(sequential) 또는 분리적(separate)일 수 있다.

본 발명의 조성물과 함께 사용되는 치료제의 실시예는 방사선 치료(radiation therapy) 및 항암제이다. 용어 “항암제”는 편평세포암종, 특히 두경부의 암종같은 암세포에서 초기(initiation) 및/또는 암증식을 억제 및/또는 세포 사멸(예: 아폽타시스(apoptosis))을 촉진하는 능력을 가진 치료제를 의미한다. 이러한 치료제는 사용 국가 또는 지역 규제 기관에 의해 승인된 것을 포함한다.

항암제의 실시예는 본 명세서에서 “항-EGFR제”라고 언급된 EGFR 발현 및/또는 기능 (예를 들면 EGFR의 신호 기능 억제에 의해)을 표적하는 제제(agent)를 포함한다. 항-EGFR제의 실시예는 세틱주맙(cetixumab), 판니투무맙(panitumumab), 잘루투맙(zalutumab), 니모투주맙(nimotuzumab)같은 항-EGFR항체를 포함한다. 다른 항-EGFR제는 에를로티닙(Erlotinib), 게피티닙(Gefitinib), 라파티닙(Lapatinib), BIBW-2992를 포함한다.

항암제의 실시예는 VEGFR발현 및/또는 기능 (“항-EGFR제”)를 표적하는 제제(agent)를 포함한다. 항-VEGFR제의 실시예는 베바시주맙(bevacizumab), 소라페닙(sorafenib), 수니티닙(sunitinib), 반데타닙(vandetanib)을 포함한다.

항암제의 실시예는 IGF-1R 발현 및/또는 기능 (“항-IGF-IR제”)를 표적하는 제제(agent)를 포함한다. 항-IGF-1R제의 실시예는 피그투무맙(figitumumab) 및 식투무맙(cixtumumab)을 포함한다.

항암제의 실시예는 라파마이신(rapamycin) (“mTOR제”)의 포유동물 표적을 억제하는 제제를 포함한다. 이러한 mTOR제의 실시예는 템시롤리무스(Temsirolimus), 에비코리무스(Everolimus)를 포함한다.

항암제의 추가적인 실시예는 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin)같은 플래티네이팅제(platinating agents); 파클리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel)같은 탁산(taxanes); 플루오로우라실(fluorouracil), 메토트렉세이트(methotrexate)같은 폴레이트(folate) 항-대사물질(metabolites)을 포함한다.

다른 항암제의 실시예는 다사티닙(Dasatinib), 이오나파닙(Ionafarnib) 및 보테조밉(Bortezomib)을 포함한다.

일부실시형태에서, 본 발명의 조성물은 상기에서 설명한 것 같이 유효한 양의 1 또는 그 이상의 항암제와 함께 유효한 양의 PEG(예를 들면 친밀한 물리적 혼합물에서)를 포함한다. 바람직하게는, 상기 PEG는 항암제와 결합되지 않는다. 상기에서 설명한 1 또는 그 이상의 항암제와 함께 각각의 PEG의 조합물로 가정할 수 있는 특징을 읽는 독자는 본 발명의 실시형태처럼 개별적이고 구체적으로 고려된다.

유효한 양의 1 또는 그 이상의 치료제가 유효한 양의 PEG처럼 같은 중량을 필요로 하지않는 것은 명백하게 될 것이다. 또한 방사선 치료와 관련하여 용어 “유효량”을 고려할 때, 적절한 용량 단위 (예를 들어 그레이(gray(gy)) 또는 래드(rad))를 사용해야만 하는 것은 명백하게 될 것이다.

본 발명의 다른 실시형태에서, 상기에서 언급된 것처럼 1 또는 그 이상의 항암제의 적어도 하나의 조성물과 함께 본 발명의 조성물을 포함하는 키트(kit)가, 선택적으로 사용하기 위한 지침과 함께 제공된다.

치료방법 및 상기 방법에 사용되는 조성물

본 발명은 유효한 양의 PEG 투여를 포함하는 대상의 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 대상의 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료에서 사용하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물 및 치료방법은 EGFR이 표면에 과발현된 두경부 편평세포암종 갈은 편평세포암종 치료에 특정적으로 사용될 수 있다. 대상의 편평세포암종의 EGFR 발현 상태는 표준방법과 키트 (예를 들면 Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark으로부터 구입가능한 EGFR pharmDx^TM)에 따라서 결정될 수 있다.

일실시형태에서, 상기 방법은 두경부 편평세포암종예방에 관한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 두경부 편평세포암종치료에 관한 것이다. 추가적인 실시형태에서, 상기 방법은 두경부 편평세포암종예방 및 치료에 관한 것이다

동의어 “예방(prophylaxis)”과 “예방(preventing)”및 이들의 문법적 변화는 두경부 편평세포암종의 초기단계를 억제 (또는, 식도암 같은 경우에서) 및/또는 상피의 전암성 병적상태(pre-malignant pathology) (예: 구강백반증) 및/또는 초기단계 암종에서 말기단계 암종으로 진행의 억제를 의미한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 예방(prophylaxis)은 두경부 편평세포암종의 양성 진단을 하기전에 수행된다.

용어 “치료(treat)”와 이들의 문법적 변화는 두경부 편평세포암종의 증식억제 (또는, 식도암 같은 경우처럼) 및/또는 두경부 편평세포암종에서 세포사멸 (또는, 식도암 같은 경우처럼)의 촉진을 의미한다. 일부 실시형태에서, 용어 치유가 반드시 악성 종양과 관련된 건강의 완전한 복원을 의미하지 않지만, 치료는 “치유(cure)”를 포함한다. 당업자는 치료(treatment)가 치유력이 있는 효과의 다양한 정도를 가질 수 있고 용어“치료(treat)”에 의해 포함되는 것을 인식한다.

본 발명은, 본 발명의 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 질병의 경감에 있어서 대상의 두경부 편평세포암종의 예방에 대한 방법을 추가적으로 제공한다. 상기 경감은 전체적 또는 부분적일 수 있다. 이러한 방법에 사용하는 조성물은 또한 제공된다.

본 발명은, 본 발명의 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상의 두경부 편평세포암종의 국부적 진행성(locally advanced) 및/또는 전이성을 치료하는 방법을 추가적으로 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 두경부 편평세포암종 발병에 민감한 대상의 두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료방법을 제공한다. 이러한 대상은 담배(tobacco) (흡연 및/또는 씹기), 과량의 알코올 섭취, 빈랑 씹기(betel nut chewing): 에서 이력 및/또는 동시행위를 가진 대상들을 포함한다. 이러한 대상은 HPV 감염 (특히 HVP 16 혈청형과 같이) 및/또는 면역손상으로 감염 및/또는 두경부 편평세포암종 발병 이전 또는 가족력(또는 성향)으로 감염되는 대상을 포함한다. 본 발명은, 본 발명의 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 HVP 음성(HPV negative)인 대상의 두경부 편평세포암종 예방 및/또는 치료방법을 추가적으로 제공한다. 이러한 방법에 사용하는 조성물은 또한 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 구강 백반증 및/또는 홍색판으로 고통받는 대상의 두경부 편평세포암종을 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에 사용하는 조성물은 또한 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 상단호흡소화관(upper aerodigestive tract)의 상피에 전암성 손상(alterations)으로 고통받는 대상의 두경부 편평세포암종을 예방하는 방법을 제공한다. 전암성 손상은 “영역암 발생(field cancerization)”의 결과로써 일어날 수 있다. 영역암 발생은 상피변형이 주된 요인인 상피가 손상 (서로 다수적 및 독립적일 수 있음)이 되어가는 과정을 언급한다. 이러한 손상은 상피의 혈관구조(epithelium vasculature), 세포의 형성이상(cellular dysplasia) 및 상피의 다른 분자 변화의 미묘한 변화에서 증거가 될 수 있다. 본 실시형태는 두경부 편평세포암종 이전의 이력 (또는 성향)과 함께 대상의 두경부 편평세포암종을 예방하는데 있어서 특히 적절할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서 아래 방법을 구성하는 대상의 두경부 편평세포암종과 같은 편평세포암종을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다:

(a) 방사선 치료 및/또는 항암제 (예: 항-EGFR제 (예를 들면 세틱주맙 같은 항-EGFR항체)) 같은 유효한 양의 치료제를 언급된 대상에게 투여하는 단계;

(b) 유효한 양의 PEG를 언급된 대상에게 투여하는 단계.

본 발명의 이런 측면의 일실시형태에서, 상기 단계 (b) 와 단계 (a)는 동시에 일어난다. 또 다른 실시형태에서, 단계 (b)는 단계 (a) 이후에 발생한다. 또 다른 실시형태에서, 단계 (b)는 단계 (a) 이전에 발생한다. 본 발명의 이런 측면의 또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 유효한 양의 치료제, 예를 들면, 방사선 치료 및/또는 항-EGFR제 (예: 세틱주맙 같은 항-EGFR 항체)같은 항암제를 투여하는 단계 (c)를 추가적으로 포함한다. 본 실시형태에서, 단계 (b)는 단계 (a) 이후와 단계 (c) 이전에 발생할 수 있다. 그러므로, 유효한 양의 PEG는 다른 치료제, 특히, 방사선 및/또는 항암제와 함께 치료 주기(cycles of treatment) 사이에 투여될 수 있다. 상기 단계 (a)와 단계 (b)의 치료제가 반드시 동일할 필요는 없다. 상기 단계 (a)와 단계 (b)의 치료제가 동일할 경우에는, 단계 (a)와 단계 (c)에서 따르는 약량학이 반드시 동일할 필요는 없다.

또 다른 실시형태에서, 유효한 양의 PEG는 두경부 편평세포암종암종의 절제 및/또는 제거와 함께 대상의 두경부 편평세포암종치료에 사용될 수 있다. 따라서, 다음 단계를 구성하는 대상의 두경부 편평세포암종치료에 대한 방법을 제공한다:

(a) 적어도 하나의 두경부 편평세포암종을 절제 및/또는 제거하는 단계;

(b) 유효한 양의 PEG를 투여하는 단계.

단계 (a)는 단계(b) 이전 또는 단계 (a) 이후 둘 중에 하나에서 일어날수 있다. 본 발명의 이런 측면의 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 설명한 유효한 양의 치료제를 투여하는 단계를 포함하는 단계 (c)가 있을 수 있다. 단계 (c)는 단계 (a) 이후와 이전, 단계 (b) 이후 또는 동시에 일어날 수 있다.

본 발명의 이런 측면의 일부 실시형태에서, 유효한 양의 PEG는 수술적 절제/제거 위치 및 국부지역에 투여될 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 유효한 양의 PEG는 (예: 국소이동적으로 투여) 두경부 편평세포암종으로부터 고통받는 두경부 병변에 투여될 수 있다.

본 발명은 두경부 편평세포암종의 다수-모델 치료방법 (즉, 두경부 편평세포암종을 치료하기 위해 적어도 두 가지 상이한 양상을 포함하는 치료, 예: 수술, 방사선 치료, 항암화학요법)과 함께 유효한 양의 PEG 투여를 포함하는 방법을 추가적으로 제공한다.

또 다른 실시형태에 따르면, 본 발명은 유효한 양의 PEG를 대상에게 투여함으로써, 대상의 두경부의 편평세포에서 EGFR 발현 및/또는 인산화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다. 복용량과 사용기간은 원하는 EGFR 발현 또는 인산화 감소의 양에 따라 달라진다. 바람직하게는, 본 발명의 실시형태에 따라서, PEG는 적어도 1 내지 14일 동안 대상에게 투여되지만, PEG는 오랜기간 또는 편평세포 조직에서 EGFR의 발현 및/또는 인산화의 감소가 달성될때까지 투여될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따라서 유효한 양의 PEG를 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상의 식도암을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기에서 언급된 본 방법에서 사용하는 조성물도 또한 제공된다.

본 발명의 추가적인 측면에 따르면 유효한 양의 PEG를 대상에게 투여하는 것을 포함하는 두경부 편평세포암종같은 편평세포암종으로 고통받는 대상에서 종양 부하량(tumor burden) (예: 종양 개수와 부피)를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 사용한 조성물도 또한 제공된다.

본 발명의 방법에서 언급된 대상은 어느 대상이 될 수 있다. 바람직하게는, 대상은 포유동물이다. 본 명세서에서 사용된 것처럼, 용어 “포유동물(mammal)”은 마우스와 햄스터와 같은 쥐목(order Rodentia)의 포유류, 토끼와 같은 중치류(order Logomorpha)의 포유류를 포함하는 어느 포유동물을 의미하지만 제한된 것은 아니다. 상기 포유동물은 고양이과(Felines)(고양이) 및 개과(Canines)(개)를 포함하는, 식육목(order Carnivora)출신이 바람직하다. 더욱 바람직한 포유동물은 소과(Bovines (cows))와 돼지과(Swines (pig))를 포함하는 우제류(order Artiodactyla) 또는 말(Equines (hoese))을 포함하여 말과(order Perssodactyla)이다. 가장 바람직한 포유동물은 영장류(order Primates), 세보이드(Ceboids), 또는 시모이드(Simoids (monkeys)), 또는 유인원류(order Anthropoids)(인간 및 원숭이)이다. 특히 선호하는 포유류는 남성 인간으로, 인간이다.

실시예

다음의 실시예들은 추가적으로 발명을 설명하지만, 그 범위를 제한하는 방법으로 해석되어서는 안된다.

동물 연구 및 종양 유도

모든 동물 프로토콜(protocol)은 동물 보호 기관 (Institutional Animal Care)및 노스쇼어 대학 건강시스템(Northshore University HealthSystem)의 사용위원회(Use Committee) 의해 검토 및 승인되었다.

4 NQO 두경부 편평세포 발암 모델:

수컷 24마리 피셔 래트(Fisher rats) (F 344; 150-200 g; Harlan, Indianapolis, IN)는 플라스틱 케이지(plastic cage)에 3마리씩, 기후 통제가 주도되는 환경 (25 ℃, 60%의 습도 및 12 시간 빛/일 주기)에서 길러졌다. 16마리의 동물은 래트 음식물과 4-니트로퀴놀린 1-옥사이드(4-nitroquinoline 1-oxide) (4NQO, 20PPM, Sigma Chemicals, St. Louis, MO)가 보충된 식수가 자유롭게 제공되었다. 갓 준비한 4NQO 강화된 물은 일주일에 두 번 보충되는 색깔있는 (불투명 라이트(light opaque)) 병으로 래트에게 제공되었다. 나머지 8마리 래트는 깨끗한 식수로 제공되었다 (대조군). 14주 후, 4NQO 보충된 물은 보통 물로 대체되었고 래트들은 두 개의 처리 그룹으로 무작위로 추출되었다. 첫 번째 군 (8마리)은 매일 구강에 PEG-8000의 국소적용을 받았다. 이것은 적어도 2 내지3분 동안, 생리 식염수에 있는10% w/v PEG 용액을 검은 담비 솔(sable brush) #4를 사용하여 래트의 구강 바닥/천장 칠함으로써 완수되었다. 대조군 역할을 하는 두 번째 그룹 (8마리 래트)은, 단지 생리 식염수를 칠했다. 이 요법은 추가적으로 14주 동안 계속되었다. 래트를 주기적으로 돌출된 혀와 구강에 있는 총 형태 변경의 존재에 대해 조사하였다. 14주의 마지막에서, 대조군 동물은 안락사 되었고 CO₂ 노출/양쪽 개흉술(exposure/bilateral thoracotomy)이 시행되었다. 부검시에 래트 혀는 절제되고 거시적(macroscopic) 종양 평가를 받았다. 혀 절편은 조각으로 잘려지고, 포르말린 고정, 파라핀 박아넣기, 절편화 되고 조직학적 및 면역조직화학 과정을 받았다.

절개된 래트의 혀는 명백한 종양의 유무에 대해 조사되었다. 각 혀에 있는 종양의 총 개수 (> 0.2 cm)를 세었고 종양 부피 (크기)는 가로 x 세로 x 높이 x π/6 공식에 따라서 재었다 (Tomayko M.M. and Reynolds C.P., Cancer Chemother . Pharmacol., 24:148-154 (1989)). 관여하지 않은 혀 조직에 있는 상피 이형성 및 형성 이상의 존재에 대한 조직학적 평가는 헤마톡실린과 에오신(hematoxylin and eosin)으로 염색한 후 수행되었다.

두경부 동소 편평세포암종 모델.

본 이종이식(xenograft) 모델에서, 편평세포 (SCC-25)는 국부 종양 성장을 모방하기 위해 구강에서 원래의 해부학적 위치 근처에 직접 이식되었다. 본 모델은 종양 성장의 퇴화에 PEG의 효과를 연구할 수 있다. B-세포 결핍 무흉선(athymic) (nu/nu) 마우스(mice)는 찰스 리버(Charles River (MA))로부터 입수하였다. SCC-25 세포 [DMEM F12 배지 (ATCC)의 50ml 에 1X 10⁶ 세포]는 마우스의 혀 상단부위에 직접 주입되었다. 2주 후, 종양이 나타나기 시작했을 때, 마우스들은 무작위로 각각12 마리씩 두 군으로 나뉘고 Q-팁(Q-tip)을 사용하여 10% w/v PEG 8000 또는 PBS의 경구 국소 적용을 매일-1회씩 받았다. 마우스는 CO₂ 노출/양쪽 개흉술(exposure/bilateral thoracotomy)하에서 처리 후 19 내지 20일째에 안락사되었고, 종양은 절제되고 무게가 재어졌다. 종양과 혀 조직은 헤마톡실린과 에오신 염색전에 포르말린 고정되고, 파라핀 박아넣기/장착하기(paraffin embedded/mounted)를 했다. 병리조직학적 평가는 종양의 원래의 편평성을 확인시켰다. 또한, 평가된 것은 혀 절편의 면역염색에 의한 증식 마커 Ki-67 및 EGFR이었다.

면역조직화학 ( IHC ) 분석

조직 절편들은 증식 마커 Ki-67 및 EGFR의 발현에 대한 PEG 8000의 효과를 결정하기 위해 IHC 분석을 받았다. 4개의 마이크론 파라핀(micron paraffin-embedded) 절편들은 수퍼프로스트(Superfrost⁺) 슬라이드 (Vector Laboratories, Burlingame, CA)위에 장착(mounted)되고 1시간 동안 55-60 ℃에서 굽기(baking)에 의해 우선 탈파라핀 시킨후 자일렌(xylem)에서 5분간 2번 세척을 받았다. 조직 절편은 등급 시리즈의 에탄올 세정에서 수화되었다. 항원결정부(epitope) 검색은 항원이 알려진 용액(Vector Laboratories)에 초단파(microwaving) (NordicWare, Minneapolis, MN)압력을 가하여 조직 슬라이드에 의해 수행되었다. 내인성 과산화 활성은 10분 동안 메탄올에 3% H₂O₂로 처리하여 중단되었고, 비특이적 결합은 조직 절편을 상온에서 2시간 동안 5% 말 혈청에 배양하여 차단되었다. 절편은 일차 항체(primary antibodies) 항-Ki-67(RB-9043-P, 1:300 Thermo Scientific UK), 및 항-EGFR(SC-03, 1:200 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)로 4시간 동안 4 ℃에서 배양한후, 적절한 바이오틴화된 이차 항체에 의해 따랐다. PBS 세척을 반복한 후에, 항원-항체 복합체는 크로마겐(chromagen) (Invitrogen, CA)으로 3, 3’-디아미노벤지딘 (3, 3’-diaminobenzidine (DAB))을 사용하여 벡타스타틴 엘리트 ABC 키트 (Vectastatin Elite ABC kit (Vector Laboratories))로 검출되었다. 음성 대조군을 위해서, 절편은 일차 항체의 부재에서 행하여졌다. 견본은 길 헤마톡 실린(Gill? hematoxylin) 용액에서 대비염색 되었고, 푸른색은 포화된 리튬 카보네이트 (1 g/100 ml)에서 20초간 세척에 의해 안정화되었다. 면역조직화학적 염색(IHC)는 치료계획에 대한 사전지식 없이 병리학자에 의해 득점되었다. 반정량적 스케일은 기저 편평 상피 세포의 면역 반응을 평가하기 위해 사용되었다. 염색의 범위는 0, 음성 염색; 1+, <10% 반응성; 2+, 10-50% 반응; 및 3+, > 50% 양성반응;으로 등급되어지고 점수가 매겨졌다.

세포배양

SCC-25와 SCC-9 세포 (American Type Tissue Culture, Rockville, MD)는400ng/ml의 하이드로콜티슨(hydrocortisone) (Sigma/Adrich), 10% v/v FBS (ATCC), 및 0.5% v/v 펜/스트렙(Pen/Strep) (ATCC)가 보충된 DMEM/F-12 배지 (2.5 mM L-글루타민(glutamine), 15 mM 헤페스(HEPES), 0.5 mM 소듐 파루베이트(sodium pyruvate), 및 1200 mg/l 소듐 바이오카보네이트(sodium bicarbonate)를 포함)에서 배양되었다. OKF-6 (HPV-)와 HOK (HPV+) 세포는 각질세포-SFM 배지 (Life Technologies)에서 배양되었다. PEG의 효과를 평가하기 위해, 이들 세포는 아래의 예제에서 설명된대로 24시간 동안 다양한 PEG제제 또는 비히클 (PBS)로 처리되었다. 세포는 세포 증식 (WST-1) 또는 웨스턴 블롯 및/또는 유동 세포측정 분석이 실시되었다.

웨스턴 블롯 분석

웨스턴 블롯은 기본 기술을 사용하여 적용되었다. 간단히, 단백질 30 ㎍은 SDS-PAGE에서 내려졌고, 폴리비닐리덴 다이플루오라이드 멤브레인(polyvinylidene difluoride membrane) (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)으로 옮겨졌고, 5% 블롯토(blotto) (TBS 버퍼에5% milk, 0.05% tween 첨가)으로 차단된 후 증식 세포 핵 항원 (PCNA, SC-56, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology)과 상피 성장 요인 수용체 (EGFR, SC-03, 1:750, Santa Cruz Biotechnology)에 대한 특정 항체로, 기본 기술에 의하여, 검출되었다. 제로그램즈(Xerograms)는 향상된 화학발광(chemiluminescence) (Santa Cruz Biotechnology)로 현상되었다. 이미지는 UVP 바이오-이미징 시스템(Bio-imaging Systems)을 통해 얻었고 랩워크(Labworks) 4.6 소프트웨어(UVP, LLC, Upland, CA)를 사용하여 분석 하였다. 로딩한 단백질의 균일성은 항-베타액틴(anti-βactin) (SC-1615 HRP, 1:2000 Santa Cruz Biotechnology)으로 멤브린에 검출후에 표준화(normalization)에 의해서 얻어졌다.

세포 증식 분석( WST -1)

세포 개수는 제조 업체(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)의 지침에 따라 포르마잔(formazan)에 테트라졸리움 솔트(tetrazolium salt) WST-1 (4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1, 3-benzene disulfonate)의 절단을 측정함으로써 평가되었다. 간단히, 세포는 최종 부피 100 ㎕가 되도록 96 웰 플레이트에서 성장된 후 습도 5% CO₂ 배양기에서 37 ?, 30 분 동안 WST-1제의 10 ㎕와 같이 배양되었다. 테트라졸리움 솔트의 포르마잔으로의 전환은 분광광도법적(spectrophotometrically)으로 흡광도 440nm (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)에서 결정되었다.

유동 세포측정 분석

다음의 기술은 PEG로 처리된 SCC-25 및 SCC-9 세포에서 EGFR의 표면 발현을 측정하는데 사용되었다. 세포 (60-70% 밀집도)는 상기에서 설명한대로 PEG로 처리된 후 30분간 4% 버퍼화된 포름알데하이드(buffered formaldehyde)에서 고정되었다. 세포는 PBS(pH 7.4; 2% 소태아혈청(fetal bovine serum), 0.2% 소혈청알부민(bovine serum albumin) 및 0.02% 소듐 아자이드(sodium azide)를 포함) 로 두번 세척되었고 항-EGFR 클론 528(anti-EGFR clone 528) (1:200; Dr. H. Band로부터 제공 받음)으로 1 시간 동안 상온에서 배양되었다. PBS에서 세척한 후, 세포는 두 번째 항체인 알렉사 488 녹색 F11을 붙인 항-마우스(Alexa 488 Green FI1-labeled anti-mouse)로 40분간 배양되었다. 세포는 다음으로 PBS로 세척되었고 유동세포 측정 분석(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)을 받았다.

통계분석

데이타는 스튜던트 테스트(Student’s t-test)에 의해 분석되었고 평균 ± S.D. 또는 S.E.M.으로 표현되었다. 차이는 p <0.05에서 유의한 것으로 고려되었다.

실시예 1

본 실시예는 PEG가 생체외(in vitro)에서 편평 암세포에서 세포증식의 억제를 나타낸다.

두경부 편평세포암종에서 PEG의 항증식 활성을 보여주기 위하여, SCC-25 세포(2,000 cells/well)가 96-웰-플레이트(96-well plate)에 분주된 후 WST-1 분석법을 사용해서 분석되었다. 도 1에서 보여진것 처럼, SCC-25 세포 증식에서 농도의존적으로 감소를 보였다 (

p<0.05; ★p<0.001, 단지 비히클(vehicle)과 비교함). 성장에서 최대 감소 (43% 감소)는, 10% w/v PEG 8000 (테스트된 최고 농도)로 얻어졌기 때문에, 이 농도는 생체내(in vivo) 실험에서 사용되었다. SCC-25 세포에 PEG의 전처리 또는 존재는 세포증식을 상당히 감소시켰다.

실시예 2

본 실시예는 PEG의 상이한 제제가 생체외 SCC-9 및 SCC-25 세포에서 EGFR 발현을 억제함을 나타낸다.

본 연구에서, SCC-9 및 SCC-25 세포에서 세포막(membrane) (예: 표면(surface)) EGFR발현 정도에 대하여 PEG효과를 조사했다. 6개의 실험군이 설치되었다. 두 가지SCC-9 및 SCC-25 세포에 아무것도 처리하지 않은 (비처리)된 대조군, 5% w/v PEG 3350용액으로 처리된 SCC-9 및 SCC-25 세포군 및 5% w/v solution of PEG 8000 용액으로 처리된 SCC-9 및 SCC-25 세포군으로 나누었다. 24시간 후에 세포는 트립신처리(trypsinized)되었고 세포막(예: 표면) EGFR발현을 위해서 유동 세포측정 분석(Becton Dickinson Labware)이 수행되었다. 본 결과는 PEG처리된 두개의 군에서 SCC-9 및 SCC-25 세포 모두에 있는 세포막(예: 표면) EGFR발현의 양을 상당히 감소시킴을 나타낸다.

실시예 3

본 실시예는 PEG 8000 투여가 편평세포암의 래트 4NQO 모델에서 종양 진행을 억제함을 보여준다.

본 연구에서 사용된, 래트 4NQO-유도된 경구발암 모델은 인간의 두경부 암과 비교하여 조직-병리학적으로(histo-pathologically) 다수의 특징을 가진다. 식수에 4NQO의 시스템적 투여에 의한, 본 모델은 종양발현전(preneoplastic) 및 신생 병변의 범위를 생산하고 암화학예방 연구에 사용되어져 왔다. 4-NQO 처리(식수에 20ppm) 14주 후에, 래트는 추가적으로 연속적인 14주 동안 (a) 대조군(PBS) 또는 (b) PEG-8000 (10% w/v)의 매일 경구 국소 적용(3 내지 4분까지 검은 담비 솔(sable brush) #4를 사용하여 래트의 구강 바닥/천장 칠함)을 받으면서, 두 군으로 무작위로 추출되었다. 부검시에 전체 혀, 인두 및 식도가 제거되었다. 본 연구에서 사용된 전체적인 발암요법은 래트의 일반적인 건강에 쇠약효과 없이 진행되었다. 도 3에서 보여진것 처럼, 부검시에 (발암물질 마지막 처리 후 14주), 4NQO 처리된 래트는 형태상으로 다수의 큰 별개의 병변 또는 혀로부터 기원된 종양(대조군에 비해, p<0.05)을 나타냈다. 반대로, 4NQO 처리 후 14주 동안 PEG-8000의 경구 국소 적용을 받은 래트는 상당히 작은 종양 및 거의 없는 종양/거의 종양을 함유하지 않은 래트를 나타냈다 (도 3B; 대조군에 비해 p<0.01). 부검시에 두 군을 비교한 사진이 도 4에 제공되었다. PEG 8000은 종양 부하량(종양 개수 및 종양 부피 모두)을 상당히 감소시키고 사라지게 했다. 본 결과는 PEG 8000이 본 모델에서 암의 초기 및/또는 진행을 늦추는 효과를 가진다는 것을 내포한다.

실시예 4

본 실시예는 PEG 8000가 상피 세포 과다증식을 억제하는 방법을 설명한다.

상기 실시예 3에서 4NQO 처리된 래트로부터 혀 상피에 대한 현미경 평가는 순함에서 보통의 상피 형성이상의 적은 수의 국부 영역을 밝혔다.

나아가, 이전에 본 모델에서 보고된 것처럼 4NQO-처리된 래트의 혀 상피에서 세포 과다증식이 일반화되었다 (도 5 상단 패널). 확산된 세포 증식의 정확한 임시 경구 및 공간 규정은 종양발현전의 암 발달의 초기특성에서 중요하고, 따라서 PEG의 암화학적예방 효과의 접근에 있어서 중요한 표적일 수 있다. 발암물질 처리된 래트에서 PEG 8000의 항증식 효과를 이해하기 위해서, 잘 알려진 증식 마커인, Ki-67의 면역조직화학 발현이 조사되었다. Ki-67-표지된 상피세포의 개수는 발암물질 없는 대조군에 비해서 4NQO 군에서 상당히 높았다 (각각 30+8 vs. 14+6 ; p<0.01, 데이타는 보여지지 않음). 그러나, 발암물질이 개시된(carcinogen-initiated) 래트는 PEG 8000의 국소 적용을 받았고, Ki-67 양성 세포 개수에서 상당한 감소가 관찰되었다 (데이타는 보여지지 않음). 본 연구를 위하여, 총 1000개의 상피세포가 400 x 확대율의 6 내지 7 영역에서 평가 되었고, 모든 값은 표지계수로 사용되었다. 발암물질 투여군에서, 층상 편평 혀 상피(stratified squamous tongue epithelium)의 기초 구획(supra-basal compartment)에서 대조군과 비교했을때, 높은 비율의 세포가 Ki-67 양성으로 발견 되었다. PEG 8000 처리는 기초 구획에 있는 Ki-67 세포의 개수를 감소시킨다; 대조군 그룹에서 볼 수 있는 것처럼 나머지 Ki-67 세포는 기저층에 주로 제한되었다 (도 5 아래 패널). 본 결과들은 PEG의 경구 국소 적용이 4NQO로 유도된 경구 발암 동안에 상피 과다증식을 억제함을 나타낸다.

실시예 5

본 실시예에서 PEG 8000 다운 발암 물질로 개시된 래트의 혀 절편에서 EGFR을 하향 조절하는 방법을 보여준다.

실시예 3에서 래트의 혀를 절편하였고, EGFR에 대한 항체로 염색하고 위에서 설명한 대로 IHC 분석을 실시하였다. PEG 8000의 처리는 절편에서 관찰된 것처럼 EGFR발현을 상당히 감소시켰다. 도 6에서, 4NQO 절편은 심하게 EGFR에 대해 염색된 반면, 대조군 및 4NQO-PEG 절편들은 EGFR에 대해 거의 또는 전혀 염색이 되지 않았다. 본 결과는 조직학적으로, PEG처리가 래트 4NQO 모델에서 EGFR 발현을 하향-조절 시킨것으로 나타난다.

실시예 6

본 실시예는 식도종양의 발달에 PEG 8000의 국소 경구 적용의 잠재적인 화학적 예방 효과를 보여준다.

경구 발암에 국소 PEG 8000 적용의 화학적예방 효과에 대한 연구뿐만 아니라, PEG 8000가 식도종양의 발달에 대한 이차 보호를 제공할 수 있는지 여부를 조사하였다. 본 조사는 식도로 PEG의 일부 타액 세척에 의한 것으로 예상될 수 있다. 본 연구를 위하여, 머리및 목 암의 4-NQO (4-nitroquinoline 1-Oxide) 래트(rat) 모델은 실시예3, 4 및 5에서처럼 활용되었다. 본 모델은 식도 종양이 개시된 것으로 알려져 있다. 식도는 매우 신중하게 기도로부터 분리되었고 종양의 개수를 세었다. 종양을 가지는 래트 마우스식도종양이 4 NQO (n=6)군의 2.2 로부터 4 NQO-PEG (n=5)군의 1.5로 감소 (~32% 감소)된 결과를 보였다. 비록 결과는 통계적 유의성을 지원하지 않았지만 (p = 0.2397 －윌콕슨(Wilcoxon) 두 개의 샘플 테스트; p = 0.225 －치-스퀘어테스트(Chi-Square test)), PEG와 식도 사이의 접촉은 더 직접적인 적용보다 부분적 타액 세척의 결과가 본 실험의 결과이며, 그럼에도 불구하고 식도암 발달에 대한 PEG의 잠재적 보호 효과를 보여준다.

실시예 7

본 실시예는 SCC-25 세포에서 세포 증식과 EGFR의 발현에 대한 다른 PEG 제제의 비교 효과에 관한 것이다.

세포의 증식과 EGFR의 발현에 대한 다른 PEG 제제의의 비교 효과를 결정하기 위해서, 편평암세포(SCC-25)은 96-웰 플레이트 (WST-1 분석) 또는 60 mm 세포 배양 디쉬 (웨스턴 블롯팅)에 분주되었다. 이 세포들은 24시간 동안 0내지 10% w/v 농도 범위를 이용하여 PEG 3350, PEG 4000 및PEG 8000으로 처리되었다 (각각 도 7, 8 및 9). 배양은 24시간 동안 37 ℃의 습도 5% CO₂ 배양기에서 수행되었다. 세포 증식 (세포 수의 변화)는 실시예 1에서 설명된 WST-1 분석 또는 증식 마커인 증식 세포 핵 항원 (Proliferating Cell Nuclear Antigen; PCNA)에 대하여 웨스턴 블롯팅을 하여 분석되었다. EGFR발현도 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가되었다. 본 결과는 사용되는 제제에 상관없이 PEG의 농도 증가에 따른 세포 증식 및 EGFR 발현의 선형 감소를 보여준다.

실시예 8

본 실시예는 SCC-9 세포에서 EGFR의 표면 발현상에 다른 PEG 제제의 효과를 설명한다.

본 연구는 편평 암종 SCC-9 세포를 사용하여 EGFR의 표면 발현상에 다른 PEG 제제의 비교 효과를 결정하기 위해 수행되었다. SCC-9 세포는 24시간 동안 10% w/v PEG (PEG 3350, PEG 4000, 또는 PEG 8000)으로 처리되었다. 처리 후, 세포는 트립신 처리되고 EGFR의 세포막(표면) 발현을 위해서 유동 세포측정 분석을 받았다. 테스트된 모든 PEG 제제로 처리된 세포에서 EGFR의 표면 발현에 매우 상당한 감소 결과를 나타냈다 (도 10). 또한 이러한 결과는 PEG의 항증식 속성이 해당 항-EGFR 활성과 관련있다는 가설을 지원한다.

실시예 9

본 실시예는 두경부 편평세포암종병인으로 이질적(etiologically heterogeneous)에 대한 PEG 8000의 효과에 관한 것이다.

담배 및 알코올 소비는 두경부 편평세포암종 발달을위한 주요 위험 요인이지만, 최근 고위험 인체유두종 바이러스 (human papilloma virus; HPV)의 감염이 HNCC의 또 다른 부분집합(subset)의 발달과 병인으로 연결될 수 있다는 것을 보여주고 있다. 병인적으로 이질적 조건에서 PEG의 효과를 연구하기 위해, 세포주는 EGFR 하향조절 및 세포 증식에 PEG의 효과를 연구한 다른 HPV 상태를 가지는 것이 활용되었다. 본 실험에서 사용된 두가지 세포주는 HPV 음성인 전암상태의 hTERT-무한증식(immortalized) 세포 [HPV (-) OKF-6; 도 11] 및 E6를 나타내는 전암상태의 HPV 감염된 무한증식 인간 경구 각질세포 (HOK) [HPV (+) HOK; 도 12]이다. 이 세포들은 24시간 동안 다른 농도의 PEG 8000으로 처리되었고 실시예 1 및 실시예 7에서 논의된 다른 생체마커 평가를 받았다. PEG 8000이 HPV (+) 세포 (도 12)가 아닌 HPV (-) 세포 (도 11)에서 특히 EGFR 하향-조절뿐만 아니라 세포증식(WST-1 및PCNA) 을 상당히 감소시키는 효과가 있는 결과를 보였다. HPV 상태가 이전에 두경부 편평세포암종에서 EGFR에 중요한 역관계(inverse relationship)를 보여온것 처럼 PEG에 따른 차등결과는 HPV (+) 부분에서 EGFR의 낮은 발현에 기인할 수 있다. HPV (+) 대상의 예후가 HPV (-) 대상의 예후와 비교하여 더 호의적일 수 있다는 제안하는 증거가 있다. 본 결과는 PEG가 예측으로 덜 유리한 HVP (-) 대상에 대한 더 나은 전략을 제공할 수 있음을 나타낸다.

실시예 10

본 실시예는 무흉선 마우스(athymic mice)에서 동소(orthotopic) 종양의 발달에서 PEG 8000의 국소 적용의 효과에 관한 것이다.

종양 성장의 억제에 대한 PEG 8000의 효과를 연구하기 위해, 편평세포암종 (SCC-25, 대략 1백 만개)에서 활용된 동소 모델을 직접 무흉선 마우스(면역 손상, B-세포 결핍)의 혀 영역 근처에 직접 이식되었다. 접종 2주 후, 마우스는 무작위로 두 그룹(각각 12마리 마우스)으로 분할되었고 Q-팁 (2-3 분)을 사용하여 매일 10% w/v PEG 8000 또는 PBS (vehicle)의 경구 국소 적용하였다. 처리기간 동안, PEG 8000은 대조군에 비해 체중에 어떤 중요한 변화가 발생하지 않았다 (데이타 표시되지 않음). 부검시 (처리 후 19-20일), 종양은 절제되고 무게가 재어졌다. 모든 종양에 대한 조직 병리학은 편평세포암종에 대해 양성이었다. 결과는 PEG 8000 적용은 대조군에 비해 종양의 무게에 상당한 감소를 일으키는 원인이 되었다는 것을 나타낸다 (29.8%; p<0.05; 도 13). PEG가 종양의 퇴화에 항증식 및 항-EGFR 역할을 했는지를 더욱 이해하기 위하여, Ki-67 및 EGFR 마커에 대한 IHC가 수행되었고 대조군에 비해 PEG 8000 투여군에서 증식 지수(31.5%; p<0.002) 와 EGFR 염색(42.4%; p< 0.005) 모두에서 상당한 감소가 관찰되었다 (각각 도4 및 도 15). 이러한 결과는 예방뿐만 아니라, PEG가 자리잡은 종양의 퇴화 원인일 가능성이 있는 것으로 나타난다. 이 효과는 세포의 증식과 EGFR의 하향-규제(down-regulation)에 대한 전반적인 효과로 인해 발생할 수 있다. 본 발명은 앞으로의 두경부 편평세포암종 치료 전략 개발에 매우 중요한 도구를 제공한다.

만약 그렇지 않으면 여기에 지시하거나 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는다면,본 발명을 설명하는 문맥에서 사용한 용어 “a”와 “an”와 “the”와 유사한 지시 대상은 (특히 다음의 청구들의 문맥에서) 단수(singular)와 복수(plural) 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 용어 “구성하는(comprising)”, “가지는(having)”, “포함하는(including)”, 및 “함유하는(containing)”은, 별도로 언급을 하지 않는 한, 오픈-엔드 용어(open-ended terms) (예: “포함하지만, 그러나 제한되지 않는”)으로 해석된다. 만약 그렇지 않으면 여기에 지시되거나 문맥에 의해 모순되지 않는다면, 본 명세서에서 설명된 모든 방법은 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 어느(any) 및 모든(all) 실시예의 사용 또는 실시예적인 언어 (예: “such as”)는 단지 본 발명을 조명하기 위한 것이고 만약 주장하지 않는 한, 본 발명의 범위에 제한을 제기하지 않는다.

본 발명의 바람직한 실시형태는, 발명을 수행하기 위해 발명가에게 잘 알려진 방식을 포함하여, 본 명세서에서 설명되었다. 바람직한 실시형태의 변화는 전술한 설명을 읽음에 따라 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 발명자는 숙련된 장인이 적절하게 변형을 고용할 것으로 기대하고, 발명자는 특히 그렇지 않으면 여기에 설명 된대로 연습할 발명을 하려고 한다. 따라서, 본 발명은 적용 가능한 법률이 허용하는 첨부된 청구에 있어서 다시 인용된 주제의 모든 수정 사항과 동등성을 포함한다. 또한, 여기에 표시하거나 그렇지 않으면 문맥에 의해 명확하게 상황에 모순되지 않는 한, 이들의 모든 가능한 변형에 있어서 상기에서 설명한 요소의 어느 조합은 본 발명에 의해 포함된다.

Claims

유효한 양의 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 두경부 편평세포암종(head and neck squamous cell carcinoma) (HNSCC)의 예방 및/또는 치료방법.
제1항에 있어서, 상기 PEG가 국소적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PEG가 대상 조직(target tissue)에 국소 이동적(locoregionally)으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
전항 중 어느 항에 있어서, 상기 두경부 편평세포암종은 대상의 1 또는 그 이상의 경구술(lip), 구강 (혀, 구강 점막(buccal mucosa), 치조 융선(alveolar ridge), 구후삼각(retromolar trigone), 잇몸(gum), 경구의 바닥(floor of mouth), 경구개(hard palate)를 포함), 침샘(salivary glands), 비강(nasal cavity) (비인두(nasopharynx) 포함), 부비강(paranasal sinuses), 인두(pharynx) (예를들어, 혀의 아래부분, 부드러운 구개, 편도 기둥(tonsillar pillar) 및 뼈구멍(fossa)같은 입인두(oropharnyx)를 포함), 후두인두(hypopharnyx) (이상동(pyriform sinus), 측면 인두 벽(lateral pharyngeal wall), 후부 인두 벽(posterior pharyngeal wall), 후윤 인두(postcricoid pharynx)를 포함), 및 후두(larynx) (성문상(supraglottis) (예: 가성대(false cords), 피열연골(arytenoids), 후두개(epiglottis), 피열연골후두개 주름(arytenoepiglottic fold)), 성문(glottis), 하부성문(subglottis)을 포함): 에 고통을 주는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 두경부 편평세포암종은 구강 (또는 이들의 해부학적 구조)에 고통을 주는 것을 특징으로 하는 방법.
전항 중 어느 항에 있어서, 상기 대상은 두경부 편평세포암종이 경감되는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 경감은 전체적 또는 부분적인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 두경부 편평세포암종의 재발을 방지하는 것을 특징으로 하는 방법.
전항 중 어느 항에 있어서, 상기 두경부 편평세포암종은 국부적으로 진행(locally advanced)되는 것을 특징으로 하는 방법.
전항 중 어느 항에 있어서, 상기 두경부 편평세포암종은 전이성인 것을 특징으로 하는 방법.
전항 중 어느 항에 있어서, 1 또는 그 이상의 두경부 편평세포암종을 절제(resecting) 및/또는 제거(ablating)하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 1 또는 그 이상의 두경부 편평세포암종을 절제 및/또는 제거하는 단계;
(b) 유효한 양의 PEG를 투여하는 단계를 포함하는 제11항의 방법.
제12항에 있어서, 상기 단계 (a)가 상기 단계 (b) 이전에 수행되는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 단계 (b)가 상기 단계 (a) 이전에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
전항 중 어느 항에 있어서, 상기 PEG는 1 또는 그 이상의 치료제과 함께 병용-투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 치료제는 방사선 치료(radiation therapy) 및/또는 항암제(anti-cancer agent)인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 PEG는 1 또는 그 이상의 치료제와 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 PEG는 1 또는 그 이상의 치료제가 투여되기 전에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 PEG는 1 또는 그 이상의 치료제가 투여 후에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 PEG는 1 또는 그 이상의 치료제의 첫 번째 투여 후와 1 또는 그 이상의 치료제의 두 번째 투여 전에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 1 또는 그 이상의 치료제의 첫 번째 투여는 1 또는 그 이상의 치료제의 두 번째 투여와 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 1 또는 그 이상의 치료제의 첫 번째 투여는 1 또는 그 이상의 치료제의 두 번째 투여와 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 내지 제22항에 있어서, 상기 치료제는 방사선 치료인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 내지 제22항에 있어서, 상기 치료제는 항암제인 것을 특징으로 하는 방법.
제24항에 있어서, 항-EGFR제, 항-VEGFR제, 항-IGF-IR제, mTOR제, 플래티네이팅제(platinating agents), 탁산(taxanes), 폴레이트(folate) 항-대사물질(metabolites), 플루오로우라실(fluorouracil), 메토트렉세이트(methotrexate): 로 이루어지는 군으로부터 선택된 항암제를 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 항-EGFR제는 예를 들어 세틱주맙(cetixumab)과 같은 항-EGFR 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
전항 중 어느 항에 있어서, 상기 대상은 두경부 편평세포암종 발병에 민감한 것을 특징으로 하는 방법.
제27항에 있어서, 상기 민감한 대상은 하기의 담배(tobacco) (흡연 및/또는 씹기), 과량의 알코올 섭취, 빈랑 씹기(betel nut chewing): 중에서 1 또는 그 이상의 이력 및/또는 동시 사용을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 대상은 두경부 편평세포암종 발병의 가족력 또는 이전의 이력이 있거나 및/또는 HPV 감염되거나 및/또는 면역력이 저하된 대상인 것을 특징으로 하는 방법.
제27항 내지 제29항 중 어느 항에 있어서, 상기 대상은 구강 백반(oral leukoplakia) 및/또는 홍색판(erythoplakia)으로 고통받는 것을 특징으로 하는 방법.
전항 중 어느 항에 있어서, 상기 대상은 포유동물인 것을 특징으로 하는 방법.
제31항에 있어서, 포유동물은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
전항 중 어느 항에 따른 방법을 위한 조성물.
제33항에 있어서, 상기 PEG는 1000, 2000, 3000, 4000, 6000으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하한; 및 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 12,000, 15,000, 20,000으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 상한의 범위내의 평균 분자량 (예를 들면 중량 평균 분자량)을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제34항에 있어서, 하한범위는 3000 또는 4000이고 상한범위는 5000, 6000, 7000, 8000 또는 9000중에서 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제34항 또는 제35항에 있어서, PEG는 3350, 4000, 8000의 중량 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제33항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 유효한 양의 PEG를 포함하는 조성물.
제33항 내지 36항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG는 자체의 유일한 치료적 활성 성분인 것을 특징으로 하는 조성물.
제33항 내지 제37항 중의 어느 한 항에 있어서, 제25항 또는 제26항에 따른 1 또는 그 이상의 치료제를 유효량으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제33항 내지 제39항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 전해질, 1 또는 그 이상의 감미료, 1 또는 그 이상의 향료, 약학적으로 허용 가능한 담체: 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 부형제(excipient)를 더 포함하는 조성물.
제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 수용액(aqueous solution) 또는 현탁액(suspension) (예를 들면 구강청결제), 유화액(emulsion), 페이스트(paste) (예: 치약), 크림, 밤(balm) (예: 립밤(lip balm)), 연고(ointment), 거품(foam), 스폰지, 젤, 츄잉 껌, 스프레이, 약용 캔디(lozenge), 알약(troche), 시럽 (예: 끈적거리는 시럽), 액체기침약(linctus), 슬러리(slurry), 필름(예: 구강붕해 필름(orodispersible film)), 정제(tablet) (예: 구강분산성 정제 (orodispersible tablet)), 캡슐, 캐플릿(caplet), 구강 패치(buccal patch), 과립(granule)의 형태로 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
두경부 편평세포암종의 예방 및/또는 치료용 의약의 제조에 있어서 PEG의 용도.
제42항에 있어서, 상기 의약은 제33항 내지 41항 중 어느 한 항에 따른 조성물인 것을 특징으로 하는 용도.