KR20130142186A - 진핵세포에서 유전독성 물질의 고효율 스크리닝을 위한 인비트로 방법 - Google Patents
진핵세포에서 유전독성 물질의 고효율 스크리닝을 위한 인비트로 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20130142186A KR20130142186A KR1020137029566A KR20137029566A KR20130142186A KR 20130142186 A KR20130142186 A KR 20130142186A KR 1020137029566 A KR1020137029566 A KR 1020137029566A KR 20137029566 A KR20137029566 A KR 20137029566A KR 20130142186 A KR20130142186 A KR 20130142186A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- eukaryotic cells
- promoter
- dna
- pcdh
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Abandoned
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/142—Toxicological screening, e.g. expression profiles which identify toxicity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
본 발명은 진핵세포들에서 다양한 유전독소의 고효율 탐지를 위한 새로운 방법에 관한 것이며 진핵세포 기반 도구는 유전독소 시그널링 사건들의 넓은 스펙트럼을 탐지하는 능력과 간단하며 재생가능한 분석 기술을 결합한다. 본 발명은 발현 카세트, 벡터 및 이를 위한 진핵세포주들을 더 포함한다.
Description
본 발명은 일반적으로 분자 생물학과 독성학 분야에 관한 것이며 구체적으로 DNA 손상의 탐지를 위한 다중 구성요소 리포터 시스템을 가진 분자 조작 세포주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 약물 발견 분야와 밀접한 관련성이 있고 탈표적 유전독성 효과를 가진 가능성 있는 약물에 대한 필터로서 작용한다.
세포독성은 일반적으로 DNA와의 화학적 상호작용을 통해 직접적으로 또는 세포 구조 또는 효소 장치와의 간섭을 통해 간접적으로 유발된 세포의 DNA의 무결성에 대한 임의의 손상으로 정의되며, 그 세포에 의해 운반된 유전 정보에 유전적 결함을 유도하는 잠재력을 가진다. 유전독성 또는 DNA 손상은 자외선, 자유 라디칼, 메틸화제 및 다른 돌연변이 화합물과 같은 다양한 물질에 의해 유발될 수 있다. 이런 DNA 손상 물질은 유전독소라고 알려져 있다. 미생물에서 이런 돌연변이는 미생물의 새로운 바람직하지 않은 균주의 진화를 유도할 수 있다. 예를 들어, 항생제 또는 제초제 내성 박테리아가 발생할 수 있다. 동물들에서 이런 돌연변이는 암 발생을 유도할 수 있거나 배우자를 손상시켜 새끼에게 선천적 결함을 발생시킬 수 있다.
따라서, 이런 DNA 손상 물질들은 DNA를 포함하는 뉴클레오티드를 화학적으로 변형시키고 뉴클레오티드를 연결하는 포스포다이에스터 결합을 파괴하거나 염기들(T-A 또는 C-G) 사이의 결합을 파괴할 수 있다. 이런 DNA 손상 물질의 효과를 상쇄하기 위해서, 세포들은 메커니즘(mechanism)의 수를 진화시켰다. 예를 들어, 대장균에서 SOS 반응은 손상된 DNA를 회복시키는 DNA 회복 효소를 포함하는 일련의 단백질이 발현되는 DNA 손상에 의해 유도된 특성이 잘 묘사된 세포 반응이다. 진핵세포들은 또한 DNA 회복을 허용하는 뉴클레오티드 절삭 회복, 염기 절삭 회복, 비 상동성 말단 결합, 상동성 재조합 및 세포 주기 정지와 같은 메커니즘을 나타낸다.
따라서, 어떤 물질들이 DNA 손상을 일으키거나 강력하게 하는지를 확인하는 것이 중요하다. 예를 들어, 이런 물질들을 탐지하는 방법은 관심 화합물이 DNA 손상을 유도하는지를 평가하기 위해 후보 의약, 식품 첨가제 또는 화장품인 화합물들을 선별하기 위한 돌연변이 분석법으로 사용될 수 있다. 선택적으로, DNA 손상 물질들을 탐지하는 방법들은 돌연변이 화합물들을 포함하는 오염원들에 의한 물 공급원의 오염을 관찰하는데 사용될 수 있다.
규제성 독성 테스팅에 사용된 대부분의 유전독성 분석법들은 1970년대에 개발되었다. 이들의 처리량은 현재의 약물 발견 필요조건의 필요조건을 충족하지 못했다(Krishna et al., 1998). 대부분의 경우에, 연구중인 화합물에 의해 유전독성이 발생되는 위치와 메커니즘은 알려지지 않았다. 테스트 시스템에서 표적 위치는 새로운 화학적 존재들의 독성 작용의 동일한 표적 위치가 아닐 수 있는 것이 발생할 수 있다.
현재 유전독성을 탐지하는 다양한 인비보 및 인비트로 분석법이 존재한다. 인비트로 분석법은 Ames 테스트, 인비트로 소핵 테스트, 인비트로 염색체 변형 테스트, 혜성 분석법 및 생쥐 림프종 분석법을 포함한다. 인비보 분석법은 약물들에 노출될 때 동물 모델에서 종양 질량의 크기의 측정을 포함한다. 모든 이런 상기 분석법들은 수일로부터 수주까지 샘플들을 배양하는 것을 필요로 하는 반면, 더 짧은 시간 프레임에서 유전독성 데이터를 얻는 것이 바람직하다. "Ames 테스트"와 같은 분석법들은 지속하는 DNA 손상을 종점(단편 DNA 형태로 돌연변이 DNA 또는 회복되지 않은 손상)으로 고려한다. 그러나, 이런 상태들은 회복 메커니즘이 소진되는 심각한 경우에만 일어난다. 대부분의 경우에, DNA 손상은 이런 종점이 측정될 수 있기 전에 회복된다. 한편 이런 분석법들은 시간이 소요되고 상대적으로 덜 민감하다. 또한, 심지어 사전 스크린을 위한 동물들의 관여는 유전독성 존재들을 걸러내는 새로운 도구들을 설계하고 실행하기 위한 즉각적 필요를 정당화한다.
일부 짧은 기간 방법들이 umu 테스트 및 SOS 크로모테스트(chromotest)와 같은 유전독성 화합물들을 선별하는데 사용될 수 있다. umu 테스트 및 SOS 크로모테스트에서 숙주 미생물은 테스트할 샘플의 존재하에서 배양되며 뒤이어 숙주 미생물은 파열된다. 이런 테스트들은 Ames 테스트의 장기간 문제를 극복한다; 그러나 이들은 고유한 단점들을 가진다. 민감성이 낮으며 특히 나이트로아렌과 폴리사이클릭 방향족 탄화수소의 탐지 민감성이 낮다. 또한 탐지 방법은 많은 수의 작용과 다양한 시약들의 첨가를 필요로 하여 방법을 복잡하고 비싸게 만든다. 세포는 임의의 유도의 탐지를 실행하기 위해서 파열돼야 한다는 사실 때문에, 세포에 1회 측정을 실행하는 것만 가능하다.
세포들의 유전독성 물질들에 대한 노출은 손상 반응 유전자들의 수의 조절을 일으킨다. DNA 손상에 대한 이런 유전자들의 발현에서 변화는 세포에서 초기 유전독성 반응들을 탐지하는 분석법을 개발하는데 사용될 수 있다. 유전독성 스트레스에 의해 유도된 잘 특징화된 사건들 중 하나는 p53 시그널링 경로의 활성화이다. 종양 억제 유전자 p53은 DNA 손상에 대한 초기 반응으로 사이클린-의존성 키나아제 억제제 p21WAF1/Cip1 유전자 프로모터의 활성화를 통한 세포 주기 정지를 유도함으로써 지놈 안정성을 유지한다. p53은 다양하지만 아마도 상호관련된 메커니즘들에 의해 p21WAF1/Cip1 및 GADD와 같은 이의 표적 유전자들의 발현을 활성화한다고 제안되었다.
유전독성 물질들에 의한 포유류 세포들의 치료는 다수의 '손상 반응' 유전자의 mRNA 수준에 증가를 일으킬 수 있다(홀브륵 및 포나스에 의해 검토). 이런 유전자들 중 여럿이 포르볼 에스터 처리에 의해 유도될 수 있다. 포르볼 에스터 처리에 반응하지 않는 것들 중에서, 일부는 WAF1 및 GADD45와 같은 종양 억제 유전자 p53에 의해 활성화될 수 있다. 그러나, 활성화 신호가 알려지지 않은 여러 DNA 손상 유도 유전자들이 존재하며 GADD153은 이런 유전자들의 중 하나이다. GADD153은 특히 관심대상인데 이는 세포 손상 이후 GADD153 mRNA의 증가 정도가 대부분의 다른 '손상 반응' 유전자들보다 크기 때문이다.
GADD153는 W-처리된 중국 햄스터 난소 세포들 대 증식하는 중국 햄스터 난 소세포들의 감산 혼성화(subtractive hybridization)에 의해 최초로 복제되었다. GADD153 유전자는 UV-조사 및 열충격 또는 포르볼 에스터 처리에 의하지 않은 다른 형태의 DNA 손상에 의해 유도된 유전자들의 서브세트 중 하나이었다. 유전자들의 이런 서브세트는 DNA를 손상시키거나 세포 주기 저지를 유도하는 여러 물질들에 의해 조화를 이루게 제어되는 것으로 발견되었다. GADD153은 포유류 종들 중에서 높게 보존되며; 햄스터 GADD153은 인간 엑손과 78% 뉴클레오티드 서열 동일성을 공유하며(Park et al., 1992) 및 생쥐 엑손과 >85% 뉴클레오티드 서열 동일성을 가진다(Ron and Habener, 1992). Gadd153은 돌연변이 또는 결핍 p53을 가진 세포들에서 DNA 손상 물질들에 의해 유도되며 유도는 p53 wt 세포에서보다 크다(Hollander and Fornace, 1995). 포유류 세포들에서 과다 발현된 햄스터 GADD153 유전자 프로모터는 MMS 및 TPA로 처리될 때 더 좋은 상대적 배수 유도(fold induction)를 나타내었다는 것이 입증되었다(Luethy et al., 1990).
US 특허 No 6,344,324는 GFP(녹색 형광 단백질)을 암호화하는 DNA 서열에 연결된 넓은 범위의 세포 스트레스 조건에 반응하여 유전자 발현을 활성화하는 햄스터 GADD153 상류 프로모터 지역의 조절 요소를 포함하는 재조합 DNA 분자를 개시한다. 이런 리포터 시스템은 사람 머리와 목 편평세포암주 세포주에서 실행된다. 그러나, 이런 리포터 시스템과 관련된 문제들은 10% 미만 세포 생존을 초래하는 테스트 물질 농도에서 적어도 4일의 처리기간을 필요로 한다는 것이다. 또한, 이런 수준의 독성에서 물질들로 테스트할 때 임의의 유전자 유도의 생물학적 관련성은 탐지가능하다. 게다가, 이런 개발은 DNA 손상을 일으킬 수 있거나 강력하게 할 수 있는 물질들의 존재를 특이적으로 관찰하는 수단을 개시하지 않으며 GADD153 유도의 메커니즘은 불분명하다. 한편, 이런 시스템은 인간 DNA 손상 바이오센서로서 매우 제한적으로 사용된다.
다른 특허, WO2010/112821은 인간 GADD45a 유전자 프로모터 및 인간 GADD45α 유전자 조절 요소에 작동가능하게 연결된 가우시아 루시페라제(GLuc) 리포터 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 개시한다. 이 특허는 지놈 손상에 반응하여 가우시아 루시페라제(GLuc) 리포터 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 발현을 활성화하도록 설계된다. 이런 시스템의 장점은 GLuc가 분비됨에 따라 분석 동안 세포들의 용해를 필요로 하지 않는다는 것이다. 리포터 분석법으로서 발광(luminescence)을 사용하는 장점은 형광(fluorescence) 기반 분석법에서 필요로 하는 것과 같은, 입사광을 필요로 하지 않는다는 것이다. 한편, GFP 리포터 단백질로부터의 신호를 차단할 수 있는 원치않는 형광은 피할 수 있다. 따라서 발광의 사용은 착색되고 형광인 테스트 화합물들을 스크리닝하는 것을 허용한다. 상기 분석법들은 특정 DNA 손상 반응 경로를 유발하는 테스트 화합물들을 동정할 수 있는 스크린이 되는 것에 한정된다.
상기한 이유 때문에, 화학발광 분석법과 연관된 단순함을 유지하면서, 진핵 포유류 세포에서 다양한 범위의 유전독성 물질을 탐지할 수 있는 고효율 인비트로 분석법에 대한 요구가 존재한다. 본 발명은 다른 현재 이용가능한 분석법과 비교하여 본 발명을 더욱 민감하고 효율적으로 만드는 단일 세포에서 3개의 유전독성 초기 반응 유전자 프로모터를 사용한다.
본 발명은 다양한 유전독성 스트레스 시그널링 사건들을 탐지하기 위해 DNA 손상-반응 유전자 프로모터의 하나 이상의 형태의 사용을 개시한다. 유전자 프로모터들은 포유류 세포주들에서 안정하게 발현되며 유전자들을 이소성으로(ectopically) 전달하는 렌티바이러스 시스템을 사용한다. 렌티바이러스-기반 안정한 세포주 생성은 유전자 전달의 뛰어난 효율과 호스트의 지놈 속으로 유전자의 안정한 포함을 혼합한다.
제 1 양태에 따라, 본 발명은 유전자 프로모터와 작동가능하게 연결된 리포터 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 3개의 발현 카세트(expression cassettes)를 제공한다. 제 1 발현 카세트는 인간 p21 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질로서 레닐라 루시페라제(RLuc)를 암호화하는 DNA 서열 및 이의 유도체를 더 포함한다. 제 2 발현 카세트는 햄스터 GADD153 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질로서 인간화 반딧불이 루시페라제(hFLuc)를 암호화하는 DNA 서열 및 이의 유도체를 포함한다. 제 3 발현 카세트는 p53 반응 요소 및 프로모터로서 폴리오마 바이러스 UTR에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질로서 베타 갈락토시다아제(Bgal)를 암호화하는 DNA 서열 및 이의 유도체를 포함한다. 이 시스템은 지놈 손상에 반응하여 리포터 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 발현을 활성화하는 방식으로 배열된다.
제 2 양태에 따라, 본 발명은 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터들을 제공한다.
제 3 양태에 따라, 본 발명은 본 발명의 제 2 양태에 따라 재조합 벡터들을 포함하는 안정한 세포주의 생성 방법을 제공한다.
제 4 양태에 따라, 본 발명은 세포주를 유전독성 물질에 노출시키고 세포로부터 리포터 단백질을 방출하는 빛의 발현을 관찰하는 단계를 포함하여 DNA 손상을 일으키거나 강력하게 하는 유전독성 물질의 존재를 탐지하는 방법을 제공한다. 제 3 양태에 따른 유전독성 화합물의 스크리닝 방법은 약학 산업 또는 유전독성에 대한 테스팅 물질을 필요로 하는 다른 분야를 위한 화합물들의 사전 제어적 스크리닝을 제공하는데 사용될 수 있는 신규한 비용 효율적이며, 고효율, 빠른 유전독성 분석법을 나타낸다. 게다가, 유전독성 화합물들의 스크리닝은 간 마이크로솜 또는 S9 분획의 존재하에서 실행될 수 있는데 이는 이의 첨가가 선유전독소(progenotoxin) 또는 신진대사적으로 활성인 유전독성 화합물을 측정하는 민감성을 증가시키기 때문이다. 본 발명은 현존하는 인비트로 및 인비보 포유류 유전독성 분석법보다 더 낮은 화합물 소비를 가지며 다양한 범위의 유전독소에 민감한 고효율 분석법을 기술한다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 1은 RLuc 및 hFLuc를 포함하는 프로메가(Promega)로부터의 벡터 psiCHECK 2의 제한지도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 2는 벡터 pCDH-puro-RLuc의 제한 지도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 3은 벡터 pCDH-puro-hFLuc의 제한 지도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 4는 벡터 pCDH CMV-MCS-PGK-hygro의 제한 지도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 5는 벡터 pCDH-puro-p21-RLuc의 제한 지도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 6은 벡터 pCDH-puro-GADD13-hFLuc의 제한 지도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 7은 벡터 pCDH-hygro-p53의 제한 지도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 8은 벡터 pCDH-hygro-p53-Bgal의 제한 지도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 9는 상이한 농도의 메틸 메테인설포네이트로 처리된 HCT116-p21RLuc-GADD153hFLuc-p53Bgal 세포들의 리포터 유도 및 백분율 세포 생존가능성을 나타낸다(직접 작용 유전독소).
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 10a는 상이한 농도의 사이클로포스프아마이드로 처리된 HCT116-p21RLuc-GADD153hFLuc-p53Bgal 세포들의 리포터 유도 및 백분율 세포 생존가능성을 나타낸다(선유전독소).
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 10b는 S9 분획으로 선처리된 상이한 농도의 사이클로포스프아마이드로 처리된 HCT116-p21RLuc-GADD153hFLuc-p53Bgal 세포들의 리포터 유도 및 백분율 세포 생존가능성을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 2는 벡터 pCDH-puro-RLuc의 제한 지도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 3은 벡터 pCDH-puro-hFLuc의 제한 지도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 4는 벡터 pCDH CMV-MCS-PGK-hygro의 제한 지도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 5는 벡터 pCDH-puro-p21-RLuc의 제한 지도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 6은 벡터 pCDH-puro-GADD13-hFLuc의 제한 지도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 7은 벡터 pCDH-hygro-p53의 제한 지도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 8은 벡터 pCDH-hygro-p53-Bgal의 제한 지도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 9는 상이한 농도의 메틸 메테인설포네이트로 처리된 HCT116-p21RLuc-GADD153hFLuc-p53Bgal 세포들의 리포터 유도 및 백분율 세포 생존가능성을 나타낸다(직접 작용 유전독소).
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 10a는 상이한 농도의 사이클로포스프아마이드로 처리된 HCT116-p21RLuc-GADD153hFLuc-p53Bgal 세포들의 리포터 유도 및 백분율 세포 생존가능성을 나타낸다(선유전독소).
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라, 도 10b는 S9 분획으로 선처리된 상이한 농도의 사이클로포스프아마이드로 처리된 HCT116-p21RLuc-GADD153hFLuc-p53Bgal 세포들의 리포터 유도 및 백분율 세포 생존가능성을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들에 따라 표 1은 유전독소 분석법을 사용하여 스크린된 화합물들을 나열한다.
달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해된 의미를 가진다. 당업자는 본 발명에 기술된 것과 유사하거나 동일한 여러 방법 및 재료를 인식할 것이며, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 기술된 방법 및 재료에 결코 제한되지 않는다. 명확하게 하도록, 다음 정의가 본 발명에 사용된다.
용어 '작동가능하게 연결된'은 프로모터가 DNA 손상에 반응하여 개별 리포터 단백질들의 발현은 유도할 수 있다는 것을 의미한다.
'지놈 손상'은 히스톤 탈아세틸화 억제제를 포함하는 DNA의 구조 요소에 영향을 미치는 물질들(예를 들어, 히스톤), 핵 및 세포 분할의 메커니즘(예를 들어, 방추체 형성) 또는 위상이성질화효소(topoisomerases) 및 폴리머중합효소와 같은 지놈 유지 시스템 및 DNA 회복 시스템, 뉴클레오티드의 임의의 화학적 변형, 뉴클레오티드의 임의의 삽입/결실/치환, 염색체 수의 변형 및 DNA 합성에 의해 유발된 DNA 손상을 의미한다.
'리포터 단백질'은 세포에서 발현될 때 세포가 형광 또는 인광 신호와 같은 탐지가능한 레이블, 분석법에서 탐지가능한 효소 활성 또는 특정 균주, 항체 또는 렉틴에 의해 세포 상에서 또는 내에서 탐지가능한 항원을 나타내게 하는 임의의 핵산 서열을 의미한다.
용어 '레닐라 루시페라제(RLuc) 리포터 단백질 및 이의 유도체'는 발현될 때 루시페라제 분석법에 의해 탐지되는 바다 팬지(Renilla reniformis, Sea pansy)로부터 유도된 단백질을 포함한다. RLuc의 유도체들은 발광 활성을 보유하는 RLuc의 폴리펩타이드 유사체 또는 폴리펩타이드 단편을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. RLuc 단백질을 암호화하는 핵산 서열들은 여러 다른 회사로부터 구입가능하다; 예를 들어, 프로메가로부터의 PsiCHECK2. 이런 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 여러 다른 공급원으로부터 얻을 수 있다; 예를 들어 진뱅크 수탁번호 M63501.1.
용어 '반딧불이 루시페라제(FLuc) 리포터 단백질 및 이의 유도체'는 발현될 때 루시페라제 분석법에 의해 탐지되는 개똥벌레(Photinus pyralis, common eastern fly)로부터 유도된 단백질을 포함한다. FLuc의 유도체들은 발광 활성을 보유하는 FLuc의 폴리펩타이드 유사체 또는 폴리펩타이드 단편을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. FLuc 단백질을 암호화하는 핵산 서열들은 여러 다른 회사로부터 구입가능하다; 예를 들어, 프로메가로부터의 PsiCHECK2. 이런 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 여러 다른 공급원으로부터 얻을 수 있다; 예를 들어 진뱅크 수탁번호 M15077.1.
용어 '베타 갈락토시다아제(Bgal) 리포터 단백질 및 이의 유도체'는 베타 갈락토시다아제의 모노사카라이드로의 가수분해에 촉매작용을 미치는 갓분해 효소를 포함한다. Bgal 단백질들을 암호화하는 핵산 서열들은 여러 다른 화사로부터 구입할 수 있다. 이런 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 여러 다른 공급원으로부터 얻을 수 있다; 예를 들어 진뱅크 수탁번호 AF105229.1.
본 발명은 다른 통상적인 유전독성 분석법과 비교하여 본 발명을 더욱 민감하고 효율적으로 만드는 동일한 세포에서 여러 유전독성 초기 반응 유전자 프로모터의 활용을 제공한다. 우리의 분석법에 사용된 테스트 화합물들은 매우 덜 발광성이며 따라서 덜 제어된 반응이 요구되며 이는 더 큰 수의 테스트 화합물이 유사하게 분석될 수 있다는 것을 의미한다. 비록 생물학적발광 분석법들이 384-웰 미세 적정판을 사용하여 실행될 수 있으나 이런 384-웰 미세 적정판은 유사한 형광 기반 리포터 분석법에 대해 사용될 수 없다. 만일 사용된 경우, 감소된 부피의 분석 액체를 포함하며, 이는 감소된 수의 세포 따라서 나쁜 '신호 대 잡음' 비율을 의미한다. '신호 대 잡음' 비율이 낮으면 테스팅 시스템은 덜 민감해진다. 따라서 생물학적발광 기반 유전독성 분석법은 형광 기반 분석법보다 더 높은 효율의 스크리닝 시스템에 더욱 쉽게 사용될 수 있다.
생물학적발광은 에너지가 빛 방출의 형태로 화학적 반응에 의해 방출되는 화학적발광의 자연적으로 발생하는 형태이다. 생물학적발광은 살아있는 유기체에 의한 빛의 생산과 방출이다. 개별 진화 히스토리를 통해 유래된 생물학적발광의 여러 별개의 종류가 존재한다. 이런 종류들은 화학적 특성들이 매우 불일치하나, 모두 유사한 화학적 반응, 즉 다이옥세테인 구조의 형성과 파괴를 경험한다. 종류들은 모두 발광 기재 루시페린과 효소 루시페라제의 상호작용을 기초로 한다. 루시페린은 산소와 반응하여 빛을 만들어낸다. 루시페라제는 촉매로 작용하여 때때로 칼슘 이온 또는 ATP와 같은 보조 인자에 의해 매개되는 반응의 속도를 높인다. 루시페라제 유전자들은 박테리아, 딱정벌레(예를 들어, 반딧불이 및 방아벌레), 레닐라, 해파리, 바다 반딧불이, 고니아우락스(Gonyaulax)(와편모충류) 및 갑각류를 포함하는 매우 넓은 범위의 상이한 유기체들로부터 복제되었다. 현재 레닐라 루시페라제(RLuc), 반딧불이 루시페라제(FLuc)와 같은 생물학적발광 분석법에 사용하는데 이용할 수 있는 여러 상이한 루시페라제 효소가 있다. 반딧불이 루시페라제(FLuc)가 가장 일반적으로 사용된 생물학적발광 리포터 단백질이다.
발광 화학 반응에서, 빛은 루시페린(색소)의 산화에 의해 생산된다. 예를 들어, 레닐라 루시페라제(RLuc) 리포터 단백질은 발광 반응:
코엘렌테라진 + O2 → 코엘렌테라미드 + CO2 + 포톤광, 에서 코엘렌테라진(coelenterazine)의 산화에 촉매작용을 미쳐, 방출이 측정가능한 발광이 되게 한다.
반딧불이 루시페라제(FLuc) 리포터 단백질은 빛을 생산하는 화학 반응에서 루시페린의 산화에 촉매작용을 미친다. 마그네슘이 보조 인자로서 이 반응:
루시페린 + ATP + O2 → 옥시루시페린 + AMP + 빛, 에 필요하며, 방출이 측정가능한 발광이 되게 한다.
베타 갈락토시다제 리포터 유전자 활성은 갈락톤 스타와 같은 화학발광 기질을 사용하여 측정될 수 있다. 베타 갈락토시다제는 기질로부터 갈락토시드 모이어티를 절단하며 중간체는 빛의 동시 방출과 함께 추가로 분해되는 중간체가 생산된다. 이런 빛 방출은 갈락톤 스타 가수분해 및 베타 갈락토시다제 활성의 정량 측정을 제공한다. 베타 갈락토시다제 리포터 유전자 활성은 또한 o-나이트로페닐-β-D-갈락토피라니시드와 같은 기질을 사용하여 420nm에서의 흡수도에 의해 측정될 수 있다. β-갈락토시다제가 ONPG를 절단할 때, o-나이트로페놀이 방출된다. 이 화합물은 노란색을 가지며, 420nm 빛을 흡수한다. β-갈락토시다제 활성을 측정하기 위해서 노란색의 축적(420nm 흡수도 증가)/분이 관찰된다.
RLuc는 높은 양자 수율의 빛을 생산하며, ATP를 필요로 하지 않는 반면 FLuc는 ATP를 필요로 하며, 이런 리포터 단백질 모두는 구입가능한 발광분석기에 의해 탐지될 수 있다. RLuc 및 FLuc는 두 상이한 기질을 사용하고 이들의 빛 방출은 상이한 시간 동역학을 따르기 때문에, 이들은 어떠한 이중 리포터 시스템에서도 이상적인 쌍이다. RLuc 및 FLuc 리포터 단백질을 암호화하는 DNA 분자들은 지놈 손상을 일으키거나 강력하게 하는 물질들을 탐지하는데 사용될 수 있다.
'인간화' 레닐라 루시페라제(hRLuc) 리포터 단백질 또는 인간화 반딧불이 루시페라제(hFLuc)를 암호화하는 핵산 서열은 인간 세포주에서 발현에 최적화되어있다. 이를 얻기 위한 여러 공급원이 존재하는데, 예를 들어: 클로닝 벡터 pGL3-프로모터(진뱅크 수탁번호 U47298) 또는 프로메가 구조체 pRL-TK, hFLuc(1650bp) 또는 두 코돈이 포유류 세포 발현에 최적화되어있는 hRLuc(933bp) cDNA를 포함하는 pHGCX 구조체(Promega, Madison, WI, USA).
또한, 본 발명의 제 1 양태에 따른 프로모터 리포터 시스템을 포함하는 발현 카세트는 세포주에서 리포터 단백질의 안정한 발현을 위한 렌티바이러스 시스템을 통해 전달된다. 안정한 단일 세포 클론들은 세포들의 동형 집단을 얻도록 생성된다. 또한, 이런 세포들은 테스트 물질 또는 화합물에 노출될 수 있고 이 세포에서 리포터 단백질의 발현은 테스트 물질이 지놈 손상을 일으키는지를 나타낸다.
따라서, 본 발명은 인간 p21, 햄스터 GADD153 및 인간 p53 반응 요소(p53RE)를 암호화하는 3개의 DNA의 사용을 기술하며, 폴리오마바이러스 비번역 지역(UTR) 유전자 프로모터들이 3개의 리포터 단백질, RLuc, FLuc 및 Bgal에 작동가능하게 연결되어, 본 발명의 제 1 양태에 따른 카세트를 형성하며 본 발명의 제 4 양태에 따른 유전독성 테스트에 추가로 사용된다.
바람직하게는, 인간 p21 유전자 프로모터 및/또는 햄스터 GADD153 유전자 프로모터 및/또는 p53 반응 요소 서열들은 RNA 폴리머중합효소가 DNA 분자에 결합하여 리포터 단백질, RLuc 및/또는 FLuc 및/또는 Bgal을 암호화하는 DNA를 전사하는 것을 시작하도록 유도한다. 인간 p21의 프로모터 서열들은 도 5에 예시된, pCDH-puro-p21-RLuc 플라스미드로부터 얻을 수 있고, 햄스터 GADD153은 도 6에 예시된, pCDH-puro-GADD153-hFLuc 플라스미드로부터 얻으며 인간 p53은 도 8에 예시된, pCDH-hygro-p53-Bgal 플라스미드로부터 얻어진다. 인간 p21 유전자 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 1961 내지 4456으로 나타내어지며, 햄스터 GADD153 유전자 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3의 1961 내지 2741로 나타내어지며 폴리오마 UTR을 가진 p53 반응 요소의 뉴클레오티드 서열은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 7의 1932 내지 2380으로 나타내어진다. 프로모터는 상기한 염기들의 각각을 포함할 수 있고 선택적으로 이의 기능성 유도체 또는 기능성 단편일 수 있다. 기능성 유도체들 및 기능성 단편들은 전사효소가 추정 프로모터 지역에 결합할 것인지 아닌지 그런 후에 마커 단백질의 전사를 유도할 것인지를 분석함으로써 쉽게 확인될 수 있다. 선택적으로 이런 기능성 유도체들 및 단편들은 상기 프로모터에 대한 돌연변이 연구를 수행함으로써 검사될 수 있다.
한편, 본 발명의 제 1 양태에 따른 바람직한 발현 카세트는 레닐라 루시페라제(RLuc) 리포터 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 인간 p21 유전자 프로모터, 반딧불이 루시페라제(FLuc)를 암호화하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 햄스터 GADD153 유전자 프로모터 및 베타 갈락토시다제(Bgal)를 암호화하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 폴리오마 바이러스 UTR 프로모터를 가진 인간 p53 반응 요소를 포함한다.
본 발명의 제 2 양태에 따라, 재조합 벡터는 렌티바이러스 벡터, pCDH(System Biosciences)일 수 있다. 이런 재조합 벡터들은 안정한 세포주의 생성에 매우 유용하다. 이런 복제 벡터들은 변형체에서 DNA 분자의 여러 복제물을 발생시킬 수 있고 따라서 과다 발현 동안 유용하며 이에 의해 Luc 리포터 단백질들의 빛 방출을 증가시켰다. 벡터가 적어도 하나의 선택가능한 마커를 포함하는 것은 바람직하다. 선택가능한 마커는 항생제, 예를 들어, 푸로마이신, 하이그로마이신 또는 네오마이신에 대한 내성을 부여할 수 있다.
한 바람직한 실시태양에서, 재조합 벡터는 바람직하게는 도 5, 6 및 8에 예시한 대로, pCDH-puro-p21-RLuc, pCDH-puro-GADD153-hFLuc 및 pCDH-hygro-p53-Bgal이다.
본 발명의 제 3 양태에 따라, 본 발명의 발현 카세트 또는 재조합 벡터는 세포 내에 포함된다. 세포들은 진핵세포 및 세포주일 수 있는 것이 바람직하다. 바람직한 포유류 세포들은 인간, 영장류, 설치류 또는 개과 세포들을 포함한다. 숙주 세포들은 생쥐 림프종 세포들과 같은 림프종 세포들 또는 1차 세포들 또는 세포주들일 수 있다. 본 발명자들은 어떠한 가설들에 의해 제한되길 원치 않으며, 본 발명자들은 HCT116 인간 대장암 세포들이 본 발명의 방법에 따라 사용하기에 특히 바람직한 세포주들이라는 것을 발견하였다.
비록 불안정하게 형질감염된(일시적) 세포들이 배제되지 않지만, DNA 분자에 의해 암호화된 단백질의 발현에 사용된 숙주 세포들은 이상적으로 안정하게 형질감염된다. 본 발명의 제 3 양태에 따른 형질감염된 세포들은 실시예에 기술된 다음 절차들에 따라 형성될 수 있다. 세포는 이상적으로 인간 세포주, 예를 들어, HCT116이다. 이런 안정하게 형질도입된 세포들은 물질들이 DNA 손상을 유도하나 강력하게 하는지를 분석하기 위해 본 발명의 제 4 양태의 방법에 따라 사용될 수 있다. RLuc 및 FLuc 발현은 DNA 손상에 반응하여 유도되며 RLuc 및 FLuc에 의해 방출된 빛은 공지된 적절한 기술들을 사용하여 쉽게 측정될 수 있다. 본 발명의 제 3 양태에 따른 가장 바람직한 세포들은 렌티바이러스 시스템에 의해 안정적으로 형질도입된 HCT116 세포들이다. 이런 세포들은 본 발명에서 HCT116-p21RLuc-GADD153FLuc-p53Bgal로 불린다.
본 발명의 제 4 양태에 따라, 저농도에서 지놈 손상을 유도하는 물질들을 탐지하는데 특히 유용한 방법이 기술된다. 이 방법은 식품 첨가제, 후보 의약 또는 화장품에 사용된 화합물들이 DNA 손상을 유도하는지를 선별하기 위한 돌연변이 분석법으로 사용될 수 있다. 이 방법은 또한 살아있는 유기체, 특히 인간이 이런 화합물들에 노출되는 것이 안전한 지를 분석하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 제 4 양태의 방법은 물공급 및 환경에서 유전독소를 탐지하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법들은 오염에 노출된 사람 또는 다른 유기체들에서 증가된 지놈 손상을 유도할 수 있는 오염원들의 존재에 대한 산업용 오수를 관찰하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 본 발명의 제 2 양태에 따른 재조합 벡터로 형질감염된 세포들을 성장시키고, 세포들을 소정의 시간 동안 지놈 손상을 유발하는 것으로 추정되는 물질로 배양하고 처리된 세포들의 샘플로부터 RLuc 및/또는 FLuc 수용체 및/또는 베타 갈락토시다제 단백질들의 활성을 관찰함으로써 실행된다. 발광/흡수도 탐지 및 정량화의 적절한 방법들은 당업자에게 공지될 것이며 한 방법이 실시예에 기술된다.
본 발명의 방법의 한 바람직한 실시태양에 따라, 발광 리딩은 미세판 웰에서 약물 처리 이후 HCT116-p21RLuc-GADD153FLuc-p53Bgal 세포 용해물로부터 기록될 수 있다. 적절한 미세판의 한 예는 96-웰, 흰색, 투명 바닥의 살균 미세판이다(Nalgene Nunc 카달로그 no. 136101이 최적 성능을 위해 권장된다). 발광 및 흡수도 측정은 적절한 미세판 리더, 예를 들어, BioTek 판 리더를 사용하여 기록될 수 있다. 본 발명의 제 4 양태의 방법을 수행하기 위한 가장 바람직한 프로토콜들은 첨부된 실시예에 기술된다.
본 발명의 제 4 양태에 따른 바람직한 방법들은 본 발명의 제 3 양태에 따른 세포들(예를 들어, HCT116-p21RLuc-GADD153FLuc-p53Bgal)을 이용할 것이다. 바람직하게는 본 발명의 제 4 양태의 방법에서, RLuc, FLuc 및 Bgal 리포터 단백질들의 발현은 테스트 화합물에 대한 노출로부터 8 내지 24시간 후; 가장 바람직하게는 16시간 후 관찰된다.
본 발명에 기술된 특징들(임의의 첨부된 청구항, 요약 및 도면을 포함)의 전부 및/또는 개시된 임의의 방법 또는 절차의 단계들의 전부는 이런 특징들 및/또는 단계들의 적어도 일부가 상호 배타적인 경우를 제외하고, 임의의 조합으로 상기 양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있다.
본 발명이 더욱 잘 이해되기 위해서, 다음 예비의 테스트 실시예들이 설명된다. 이런 실시예들은 단지 설명을 위한 것이며 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예
1
다음 실시예는 본 발명의 제 1, 제 2 및 제 3 양태에 따른 DNA 손상을 탐지하기 위해 HCT116-p21RLuc-GADD153FLuc-p53Bgal 안정한 세포주의 구조를 예시한다. 또한 실시예는 어떻게 이런 안정한 세포주가 유전독성 물질, 예를 들어, 본 발명의 제 4 양태에 기술된 방법에 따라 사용될 때 에톱시드를 테스트하기 위해 사용되는지를 약술한다.
이 시스템의 구성요소:
1) 프로모터 - 인간 p21, 햄스터 GADD153 및 인간 p53
2) 리포터 유전자 - 레닐라 루시페라제(RLuc), 반딧불이 루시페라제(FLuc) 및 베타 갈락토시다제(Bgal)
바이오센서 리포터 카세트를 암호화하는 렌티벡터의 제조:
단계 1: 리포터 단백질의 복제 -
레닐라
루시페라제
(
RLuc
), 반딧불이 루시페라제(
FLuc
).
RLuc의 원료는 도 1에 나타낸 pSiCHECK2(Promega)이다. RLuc는 Nhe I(5') 및 Not I(3') 부위로 측면화하였다. 이것을 (System Biosceinces로부터의) 벡터 pCDH-CMV-MCS-EF1-puro 속에 삽입하였고 최종 플라스미드는 도 2에 나타낸 pCDH-puro-RLuc로 불렀다. FLuc를 도 1에 나타낸 pSiCHECK2 (Promega)로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 프라이머들의 서열은 SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO.4로서 서열 목록에 나타내어진다. Fluc는 Nhe I(5') 및 EcoRI I(3') 부위로 측면화한다. 이것을 (System Biosceinces로부터의) 벡터 pCDH-CMV-MCS-EF1-puro 속에 삽입하였고 최종 플라스미드는 도 3에 나타낸 pCDH-puro-hFLuc로 불렀다.
단계 2:
렌티벡터
속에
하이그로마이신
선택
마커의
복제
PGK 프로모터와 함께 하이그로마이신 내성 마커 유전자를 측면화 효소 부위(flanking enzyme sites) Not I(5') 및 Sal I(3')로 합성하였다. 이런 카세트를 절단하여 EF1-푸로마이신 지역을 대체하는 벡터 pCDH-CMV-MCS-EF1-puro(System Biosceinces) 속에 복제하였다. 최종 구조체는 도 4에 나타낸 pCDH-CMV-MCS-PGK-hygro로 불렀다.
단계 3: 프로모터 - 인간
p21
, 햄스터
GADD153
및
p53
반응 요소의 복제
인간 p21 프로모터는 SEQ ID No.1 및 SEQ ID No.2로서 서열 목록에 나타낸 프라이머들을 사용하여 HEK 293 세포들로부터 증폭하였다. 이 프로모터는 Cla I(5') 및 Nhe I(3') 부위로 측면화한다. 이것을 pCDH-puro-RLuc 속에 삽입하였다. 이것이 렌티벡터로부터 CMV 프로모터의 제거를 초래하였다. 플라스미드는 도 5에 나타낸 pCDH-puro-p21-RLuc로 불렀다. 햄스터 GADD153을 합성하여 도 6에 나타낸 pCDH 벡터 속에 복제하였다. GADD153 프로모터는 Cla I (5') 및 Xba I-Nhe I (3') 부위로 측면화하였다. 이 프로모터를 pCDH-puro-hFLuc 속에 삽입하였다. 이것이 렌티벡터로부터 CMV 프로모터의 제거를 초래하였다. 이런 플라스미드는 도 6에 나타낸 pCDH-puro-GADD153-hFLuc로 불렀다. 폴리오마 UTR 서열과 함께 p53 반응 요소를 합성하였다. 이런 서열은 Cla I(5') 및 Xba I-Nhe I(3')로 측면화하였다. 이 구조체를 pCDH-CMV-PGK-hygro-벡터 속에 삽입하였다. 이것이 이런 렌티벡터로부터 CMV 프로모터의 제거를 초래하였다. 플라스미드는 도 7에 나타낸 pCDH-hygro-p53로 불렀다. 리포터 유전자 베타 갈락토시다제를 측면화 효소 부위 Xba I-Nhe I(5') 및 Not I(3')로 합성하여 pCDH-Hygro-p53 속에 복제하여, 도 8에 도시된 대로 pCDH-hygro-p53-Bgal 벡터를 생산하였다.
HEK 293 세포주로부터 인간 p21 유전자 프로모터를 증폭하는데 사용된 프라이머들은 SEQ ID No.1 및 SEQ ID No.2로서 서열 목록에 나타내어진다. 플라스미드 pCDH-puro-p21-RLuc, pCDH-puro-GADD153-hFLuc 및 pCDH-hygro-p53-Bgal에서 발현 카세트의 각각의 DNA 서열들은 각각 SEQ ID No. 5, 6 및 7로서 서열 목록에 나타내어진다.
단계 4: 바이오센서 리포터 카세트를 발현하는 안정한 세포주 조작
pPACK 플라스미드(System Biosciences)를 패키징, 형질도입 및 발현에 필요한 유전 요소들을 포함하는 발현 구조체 pCDH-puro-p21-RLuc를 가진 HEK 293T 생산 세포들 속에 공동 형질감염시켰고, ('패키징' 또는 '생산' 세포들로 불리는) 세포들은 발현 구조체를 고 형질도입성 VSV-G-유사형태(pseudotyped) 렌티바이러스 입자들 속에 효율적으로 포장하였다. 렌티바이러스 입자들을 초원심분리 기술로 농축하고 HCT116 세포주, 인간 결장암 세포주를 형질도입하는데 사용하였다. 바이오센서 리포터 카세트를 보유하는 단일 세포 클론들을 푸로마이신(2㎍/ml) 하에서 2주 동안 선택하였다. pCDH-puro-p21-RLuc로 형질변환된 HCT116 세포들은 본 발명에서 HCT116-p21RLuc로 부른다.
pPACK 플라스미드(System Biosciences)를 패키징, 형질도입 및 발현에 필요한 유전 요소들을 포함하는 발현 구조체 pCDH-puro-GADD153-hFLuc를 가진 HEK 293T 생산 세포들 속에 공동 형질감염시켰고, ('패키징' 또는 '생산' 세포들로 불리는) 세포들은 발현 구조체를 고 형질도입성 VSV-G-유사형태(pseudotyped) 렌티바이러스 입자들 속에 효율적으로 포장하였다. 렌티바이러스 입자들을 초원심분리 기술로 농축하고 HCT116-p21RLuc를 형질도입하는데 사용하였다. 두 바이오센서 리포터 카세트, p21-RLuc 및 GADD153-hFLuc를 보유하는 단일 세포 클론들을 푸로마이신(2㎍/ml) 하에서 2주 동안 선택하였다. 최종 안정한 세포주들은 본 발명에서 HCT116-p21RLuc-GADD153hFLuc로 부른다.
pPACK 플라스미드를 패키징, 형질도입 및 발현에 필요한 유전 요소들을 포함하는 발현 구조체 pCDH-hygro-p53-Bgal를 가진 HEK 293T 생산 세포들 속에 공동 형질감염시켰고, ('패키징' 또는 '생산' 세포들로 불리는) 세포들은 발현 구조체를 고 형질도입성 VSV-G-유사형태(pseudotyped) 렌티바이러스 입자들 속에 효율적으로 포장하였다. 렌티바이러스 입자들을 초원심분리 기술로 농축하고 HCT116-p21RLuc-GADD153hFLuc를 형질도입하는데 사용하였다. 모두 3개 바이오센서 리포터 카세트, p21-RLuc, GADD153-hFLuc 및 p53-Bgal를 보유하는 단일 세포 클론들을 하이그로마이신(0.2mg/ml) 하에서 2주 동안 선택하였다. 최종 안정한 세포주들은 본 발명에서 HCT116-p21RLuc-GADD153hFLuc-p53Bgal로 부른다.
본 발명은 프로모터, p21, GADD153 및 p53을 가지는 세포주 HCT116-p21RLuc-GADD153FLuc-p53Bgal를 사용하여 테스트 화합물의 유전독성을 측정하는 바람직한 분석법을 기술한다. 이 분석법은 발광 리딩할 수 있는 미세판 리더를 사용하여 96-웰 판 상에서 실행된다.
실시예 2
미세판
제조
분석법은 96-웰, 흰색, 투명 바닥의 미세판에서 실행된다. 예를 들어 Nalgene Nunc, USA로부터의 F96 MicroWellTM Plates, Cat. No. 136101. 미세판들은 다채널 피펫을 사용하여 효과적으로 채워진다.
분석법 프로토콜
발명자들에게 표준화된 분석법 프로토콜이 본 발명에 기술된다. 테스트 화합물의 원료를 2% v/v 용매(DMSO 또는 PBS를 포함하나 이에 제한되지 않음)에서 제조하며 이 원료는 분석법을 위한 연속 희석하는데 사용한다. 화합물들의 최대 테스트 복용량은 용해도 또는 세포독성에 의한 제한되는 경우 1mM 또는 500㎍/ml로 설정한다. 테스트 화합물은 표준 세포 생존가능성/세포독성 분석법(예를 들어 그래프들에 도시된 대로 MTT 분석법)에 의해 세포 생존가능성에 대해 분석된다.
MTT 분석법은 PBS(5mg/ml)에 용해된 MTT 시약(Sigma)을 사용하여 실행한다. 간략하게, 96-웰 미세판에 테스트 화합물의 10배 연속 희석에 의해 유전독성 센서 세포들을 배양한다. 24h의 배양 후, 10㎕의 MTT 용액을 96-웰 판의 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 배지를 (품후드(fume hood)에) 버리고 100㎕ DMSO를 웰들에 첨가한다. 판을 10분 동안 흔들고 540nm에서 흡수도를 측정한다.
유전독성 분석법을 위해서, 화합물 처리 16시간 전에, 조작된 안뎀 지노톡스 (anthem's Genotox) 센서 세포들을 96-웰 미세판(웰당 10,000 세포)에 씨드한다. 미처리된 세포들, (희석액 흡수도의 결여를 확인하기 위해) 1% DMSO 단독, 어떠한 오염의 결여를 확인하기 위해 성장 배지 단독, 부형제 대조군(용매 대조군) 및 연속 희석에서 양성 테스트 대조군과 같은 대조군이 포함된다. 테스트 화합물을 2배 연속 희석액에 첨가하고 미세판을 실험 필요조건에 따라 37C, 5% CO2 및 95% 습도에서 24 또는 48h 동안 배양한다.
세포들을 웰당 60㎕의 용해 버퍼로 24 또는 48h 후 용해한다(용해 버퍼 조성물은 루시페라제 및 베타 갈락토시다제 분석법과 혼용가능하도록 안뎀 바이오사이언스에서 최적화되었고; 50ml의 용해 버퍼는 pH 8.0에서 7.5ml의 1M HEPES, 125㎕의 트리톤 X 100, 50mg의 돼지 젤라틴, 5ml의 글리세롤 및 25㎕의 소포제를 포함한다). 루시페라제 분석법들의 각각(레닐라 및 반딧불이 루시페라제)의 경우 10㎕의 용해물이 사용되는 반면 베타 갈락토시다제 분석법의 경우 30㎕의 용해물이 사용되고 전체 단백질은 브래드포드 시약에 의해 잔존하는 10㎕의 용해물을 사용하여 측정한다.
레닐라 루시페라제 분석법은 1㎍/웰 코엘렌트라진(100% 메탄올에서 제조된 1mg/ml 원료)를 포함하는 루시페라제 분석법 버퍼(0.5 M NaCl, 0.1 M 인산칼륨 버퍼 pH 7.2, 1 mM 다이 소듐 EDTA, 1 mg/mL 돼지 젤라틴, 50 mM 요오드화칼륨)을 사용하여 실행한다. 반딧불이 루시페라제 분석법은 100μM D 루시페린, 150μM ATP 및 80μM 보조효소 A를 포함하는 동일한 루시페라제 분석법 버퍼로 실행한다. (각 웰의 내용물을 완전히 혼합하기 위해서) 분석판을 미세판 교반기 상에서 10분 동안 부드럽게 흔든다. 그런 후에 판을 미세판 리더에 옮기고 미세판들로부터의 발광 데이터를 수집한다. 발광 기능성을 가진 미세판 리더를 선택한다(예를 들어, BioTek으로부터의 시너지 HT 다중탐지 미세판 리터). 발광 데이터는 10초의 통합 시간(integration time)과 2초의 지연으로 수집한다.
베타 갈락토시다제 분석법은 Z 분석법 버퍼(50ml 버퍼는 0.4265g의 Na2HPO4, 0.275g의 NaH2PO4, 500㎕의 1M KCl, 50㎕의 1M MgSO4를 포함하며; 각 10ml 당, 27㎕의 베타 머캡토에탄올이 첨가된다) 및 기질 o-나이트로페닐-β-D-갈락토시다제 ONPG(1ml의 10X ONPG 원료-20mg/ml)로 실행한다. 일단 노란색이 나타나면, 50㎕ 1M Na2CO3를 웰당 첨가하고 A420에서 리딩을 시작한다.
발광 및 흡수도 데이터를 마이크로소프트 엑셀 스프레트시트에 옮기고 리포터 유전자 발현에 배수 변화를 부형제 처리된 대조군 웰들로부터의 데이터로 정규화함으로써 계산한다. 그래프는 X축에 테스트 화합물 농도, Y축에 (MTT 분석법으로부터의) 세포 생존가능성 백분율 및 제 2 Y축에 리포터 유전자 배수 유도에 의해 좌표로 나타낸다. 세포 생존가능성 역치는 80%로 설정하고 세포독성 LEC는 미처리된 대조군과 비교하여 20% 세포 생존가능성을 감소시킨 최저 유효 테스트 농도로 정의한다. 유전독성 역치는 1.5배 변화로 설정한다(즉, 부형제 처리된 대조군보다 50% 이상). 유전독성 LEC는 1.5 역치 이상의 리포터 유전자 유도들 중 적어도 하나를 일으킨 최저 유효 테스트 농도이다. 유전독성 역치는 50% 세포 생존가능성 미만을 초래하는 테스트 농도에 대해 계산되지 않는다.
본 발명은 또한 S9 분획으로 화합물들을 처리함으로써 돌연변이전구물질 또는 유전독소전구물질의 탐지를 위한 분석법을 포함한다. S9 분획은 간에서 화합물들로부터 발생된 대사 산물들의 탐지를 허용하는 (당업자에게 공지된) 간 추출물이다.
테스트 화합물들의 대사 산물들의 유전독성 잠재성은 Moltox, Cat # 11-101.5로부터 구입한 아로클로(Aroclor) 1254-처리된 쥐(1% 믹스)의 S9으로 3시간 동안 안덴 지노톡스 센서 세포들에서 화합물을 배양하여 분석한다. S9 분획은 효소 보조인자들(예를 들어: 5mM의 글루코스-6-포스페이트 및 0.5mM의 β-니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트)와 조합으로 사용된다. S9 믹스는 분석 미세판에서 1% v/v에서 사용된다. 세포들을 PBS로 3시간 세척한 후 S9 분획을 제거하고 24시간 후 세포독성에 대해 테스트한다. 분석 조건, 분석 시간 지점, S9에 대한 노출 시간, S9 분획의 원료는 테스트 화합물과 실험에 따라 변경될 수 있다.
신진대사 활성화 분석법은 항상 양성 대조군(사이클로포스파미드, 공지된 돌연변이전구물질) 및 용매 대조군을 포함한다. 상기한 대로, 유전독성 역치는 용매 대조군에 대한 리포터 유전자(들) 발현(들)의 1.5배 유도(즉, 50% 증가)로 설정한다. 리포터 유전자(들) 유도(들)가 1.5배 이상일 때 테스트 화합물은 양성 유전독소인 것으로 결론내린다. 표 1은 이 분석법을 사용하여 선별한 화합물들의 샘플을 도시하며 '+'는 유전독성에 대해 양성; '-'는 유전독성에 대해 음성; MA: S9 분획 믹스를 사용하는 신진대사 활성화.
따라서 본 발명은 다중 리포터 유전자 단백질들의 발현을 일으키는 하나 이상의 DNA-손상 유도성 유전자 프로모터를 발현하는 방법을 특징으로 한다. 다양한 유전독성 시그널링 경로들이 유전독성 외상에 반응하는 것으로 알려진 한 형태 이상의 프로머터의 잠재력을 이용함으로써 탐지될 수 있다. 한편, 본 발명은 고효율 스크리닝 보조물로서 역할하도록 만들어질 수 있는 플랫폼(platform)을 기술한다.
실시예
3
공지된 유전독소를 사용하는 바이오센서의 유도
리포터 유도의 한 실시예로서, 상이한 농도의 메틸 메테인설포네이트(직접 작용하는 유전독소) 및 사이클로포스파미드(유전독소전구물질)로 처리된 HCT116-p21RLuc-GADD153hFLuc-p53Bgal 세포들이 도 9, 10a 및 10b에 도시된다. 이런 두 화합물은 유전독소 물질로 당업자에게 공지되어 있고 본 발명의 방법을 사용할 때 양성 대조군으로 사용될 수 있다.
10% FBS를 가진 100㎕의 맥코이 배지에서 각 웰당 103 세포들 씨드하고 96-웰 판(두 세트로서)에서 밤새 배양하였다(37℃, 5% CO2, 100% 습도). 다음날, 세포들을 1% v/v 수성 DMSO에 용해된 MMS 및 사이클로포스파미드의 연속 2배 희석으로 24시간 동안 배양하였다. 사이클로포스파미드로 처리한 세포들을 상기한 대로 3시간 동안 S9 분획 믹스로 배양하고 나중에 PBS로 세척하였다. 24시간의 배양 후, 세포들을 PBS에 세척하고 MTT 분석법을 한 세트의 판들에 실행하여 세포 생존가능성을 분석하였다. 다른 세트의 판들에 있는 세포들을 100㎕의 용해 버퍼으로 용해하였다(50ml의 용해 버퍼는 pH 8.0의 7.5ml의 1M HEPES, 125㎕의 트리톤 X 100, 50mg의 돼지 젤라틴, 5ml의 글리세롤 및 25㎕의 소포제를 포함한다). 10㎕의 세포 용해물을 96-웰 흰색 미세판에서 100㎕의 루시페라제 분석법 버퍼(루시페라제 분석법 버퍼 조성물: 0.5 M NaCl, 0.1 M 인산칼륨 버퍼 pH 7.2, 1 mM 다이 소듐 EDTA, 1 mg/mL 돼지 젤라틴, 50 mM 요오드화칼륨)와 혼합하였다. 각 웰에 1㎍의 RLuc 기질, 코엘렌트라진(1mg/ml 코엘렌트라진 원료 용액은 100% 메탄올에서 제조되어 -80℃ 냉동고에 저장한다)을 첨가한다. 판을 미세판 교반기 상에서 10분 동안 부드럽게 흔들고 미세판 리더에 옮겨 발광 리딩을 얻는다. 10㎕의 세포 용해물을 96-웰 흰색 미세판에서 100㎕의 FLuc 분석법 버퍼와 혼합하였다. 반딧불이 루시페라제 분석법은 10㎕의 세포 용해물 및 100μM D 루시페린, 150μM ATP 및 80μM 보조효소 A를 포함하는 100㎕의 루시페라제 분석법 버퍼로 실행한다. 베타 갈락토시다제 분석법은 Z 분석법 버퍼(50ml 버퍼는 0.4265g의 Na2HPO4, 0.275g의 NaH2PO4, 500㎕의 1M KCl, 50㎕의 1M MgSO4를 포함하며; 각 10ml 당, 27㎕의 베타 머캡토에탄올이 첨가된다) 및 기질 o-나이트로페닐-β-D-갈락토시다제 ONPG(1ml의 10X ONPG 원료-20mg/ml)로 실행한다. 일단 노란색이 나타나면, 50㎕ 1M Na2CO3를 웰당 첨가하고 A420에서 리딩을 시작한다.
이것을 3회 반복하고 평균 유도 및 표준 편차를 계산하였다. 결과는 도 9 및 10a 및 10b에 예시된다.
| 화합물 | 화합물의 종류 | 안뎀 지노톡스 분석법: 결과(분석시간(h)), LEC(㎍/ml), 유도된 프로모터(s) |
| 2-아세트아미도플루오렌 | 간 발암물질 | + (24h), 6.977, GADD153 |
| 4,4-옥시다이아닐린 | 폴리머 수지 | + (24h), 100.12, p21 및 GADD153 |
| 아라C 아리비노시드(AraC arabinoside) | 화학요법제 | + (24h), 0.785, p21 |
| 사이클로포스파미드 | 화학요법제 | + (24h, MA), >55.82, p21 |
| D-만니톨 | 비 세포독성 대조군 | - |
| DMSO | 분석법에 사용된 용매 | - |
| 에톱시드 | 토모아이소모라제 (Topoisomerase) 억제제 | + (24h), 6.25, p21 |
| 메틸 메테인설포네이트 | 직접 작용 유전독소 | + (24h), 6.2, GADD153 및 p53 |
| 오플록사신 | 항균제 | + (24h), 750.0, p53 및 p21 |
| 케르세틴 | 플라보노이트 | + (24h), 6.25, GADD153 |
SEQUENCE LISTING
<110> Anthem Biosciences Pvt Ltd
<120> An in vitro method for high throughput screening of genotoxic agents in mammalian cells
<160> 6
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213>
<220>
<400> 1
gatcgtacat cgatagccac cactgagcct tcc 33
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213>
<220>
<400> 2
gtacgatcgc tagcctccgg ctccacaagg aact 34
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213>
<220>
<400> 3
gatcgctagc gccgccacca tggccgatgc taagaacatt a 41
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213>
<220>
<400> 4
gatcgaattc ttacacggcg atcttgccgc 30
<210> 5
<211> 10510
<212> DNA
<213>
<220>
<400> 5
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420
cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900
taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960
acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020
cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080
ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140
tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200
gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260
aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320
gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380
aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
________________________________________
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggttaacttt 1800
taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag acataatagc 1860
aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaaattcaaa attttatcga 1920
tagccaccac tgagccttcc tcacatcctc cttcttcagg cttgggcttt ccacctttca 1980
ccattcccct accccatgct gctccaccgc actctgggga gggggctgga ctgggcactc 2040
ttgtccccca ggctgagcct ccctccatcc ctatgctgcc tgcttcccag gaacatgctt 2100
gggcagcagg ctgtggctct gattggcttt ctggccatca ggaacatgtc ccaacatgtt 2160
gagctctggc atagaagagg ctggtggcta ttttgtcctt gggctgcctg ttttcaggga 2220
ggaaggggat ggtaggagac aggagacctc taaagacccc aggtaaacct tagcctctta 2280
ctctgaacag ggtatgtgat ctgccagcag gatccttgcg acagggctgg gatctgatgc 2340
atgtgtgctt gtgtgagtgt gtgctgggag tcagattctg tgtgtgactt ttaacagcct 2400
gctcccttgc cttcttcagg gcagaagtcc tcccttagag tgtgtctggg tacacattca 2460
agtgcatggt tgcaaacttt tttttttaaa gcactgaata gtactagaca cttagtaggt 2520
acttaagaaa tattgaatgt cgtggtggtg gtgagctaga agttataaaa aaaattcttt 2580
cccaaaaaca acaacaaaaa gaattatttc attgtgaagc tcagtaccac aaaaattcat 2640
tacaataatt cattacaagc ctttattaaa aaaaattttc tccccaaagt aaacagacag 2700
acaatgtcta gtctatttga aatgcctgaa agcagagggg cttcaaggca gtgggagaag 2760
gtgcctgtcc tctgctggac atttgacaac cagccctttg gatggtttgt atgtatagga 2820
gcgaaggtgc agacagcagt ggggcttaga gtggggtcct gaggctgtgc tgtggccctt 2880
ctggggttta gccacaatcc tggcctgact ccagggcgag gcaggccaag ggggtctgct 2940
gctgtgtcct cccaccccta cctgggctcc catccccaca gcagaggaga aagaagcctg 3000
tcctccccga ggtcagctgc gttagaggaa gaagactggg catgtctggg cagagatttc 3060
cagactctga gcagcctgag atgtcagtaa ttgtagctgc tccaagcctg ggttctgttt 3120
ttcagtggga tttctgttca gatgaacaat ccatcctctg caatttttta aaagcaaaac 3180
tgcaaatgtt tcaggcacag aaaggaggca aaggtgaagt ccaggggagg tcaggggtgt 3240
gaggtagatg ggagcggata gacacatcac tcatttctgt gtctgtcaga agaaccagta 3300
gacacttcca gaattgtcct ttatttatgt catctccata aaccatctgc aaatgagggt 3360
tatttggcat ttttgtcatt ttggaaccac agaaataaag gatgacaagc agagagcccc 3420
gggcaggagg caaaagtcct gtgttccaac tatagtcatt tctttgctgc atgatctgag 3480
ttaggtcacc agacttctct gagccccagt ttccccagca gtgtatacgg gctatgtggg 3540
gagtattcag gagacagaca actcactcgt caaatcctcc ccttcctggc caacaaagct 3600
gctgcaacca caggggtttc ttctgttcag gtgagtgtag ggtgtaggga gattggttca 3660
atgtccaatt cttctgtttc cctggagatc aggttgccct tttttggtag tctctccaat 3720
tccctccttc ccggaagcat gtgacaatca acaactttgt atacttaagt tcagtggacc 3780
tcaatttcct catctgtgaa ataaacggga ctgaaaaatc attctggcct caagatgctt 3840
tgttggggtg tctaggtgct ccaggtgctt ctgggagagg tgacctagtg agggatcagt 3900
gggaatagag gtgatattgt ggggcttttc tggaaattgc agagaggtgc atcgttttta 3960
taatttatga atttttatgt attaatgtca tcctcctgat cttttcagct gcattgggta 4020
aatccttgcc tgccagagtg ggtcagcggt gagccagaaa gggggctcat tctaacagtg 4080
ctgtgtcctc ctggagagtg ccaactcatt ctccaagtaa aaaaagccag atttgtggct 4140
cacttcgtgg ggaaatgtgt ccagcgcacc aacgcaggcg agggactggg ggaggaggga 4200
agtgccctcc tgcagcacgc gaggttccgg gaccggctgg cctgctggaa ctcggccagg 4260
ctcagctgct ccgcgctggg cagccaggag cctgggcccc ggggagggcg gtcccgggcg 4320
gcgcggtggg ccgagcgcgg gtcgcctcct tgaggcgggc ccgggcgggg cggttgtata 4380
tcagggccgc gctgagctgc gccagctgag gtgtgagcag ctgccgaagt cagttccttg 4440
tggagccgga gctagccacc atggcttcca aggtgtacga ccccgagcaa cgcaaacgca 4500
tgatcactgg gcctcagtgg tgggctcgct gcaagcaaat gaacgtgctg gactccttca 4560
tcaactacta tgattccgag aagcacgccg agaacgccgt gatttttctg catggtaacg 4620
ctgcctccag ctacctgtgg aggcacgtcg tgcctcacat cgagcccgtg gctagatgca 4680
tcatccctga tctgatcgga atgggtaagt ccggcaagag cgggaatggc tcatatcgcc 4740
tcctggatca ctacaagtac ctcaccgctt ggttcgagct gctgaacctt ccaaagaaaa 4800
tcatctttgt gggccacgac tggggggctt gtctggcctt tcactactcc tacgagcacc 4860
aagacaagat caaggccatc gtccatgctg agagtgtcgt ggacgtgatc gagtcctggg 4920
acgagtggcc tgacatcgag gaggatatcg ccctgatcaa gagcgaagag ggcgagaaaa 4980
________________________________________
tggtgcttga gaataacttc ttcgtcgaga ccatgctccc aagcaagatc atgcggaaac 5040
tggagcctga ggagttcgct gcctacctgg agccattcaa ggagaagggc gaggttagac 5100
ggcctaccct ctcctggcct cgcgagatcc ctctcgttaa gggaggcaag cccgacgtcg 5160
tccagattgt ccgcaactac aacgcctacc ttcgggccag cgacgatctg cctaagatgt 5220
tcatcgagtc cgaccctggg ttcttttcca acgctattgt cgagggagct aagaagttcc 5280
ctaacaccga gttcgtgaag gtgaagggcc tccacttcag ccaggaggac gctccagatg 5340
aaatgggtaa gtacatcaag agcttcgtgg agcgcgtgct gaagaacgag cagtaattct 5400
aggcgatcgc tcgagcccgg gaattcgttt aaacctagag cggccgcaag gatctgcgat 5460
cgctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 5520
ggaggggtcg gcaattgaac gggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 5580
gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 5640
gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca gctgaagctt 5700
cgaggggctc gcatctctcc ttcacgcgcc cgccgcccta cctgaggccg ccatccacgc 5760
cggttgagtc gcgttctgcc gcctcccgcc tgtggtgcct cctgaactgc gtccgccgtc 5820
taggtaagtt taaagctcag gtcgagaccg ggcctttgtc cggcgctccc ttggagccta 5880
cctagactca gccggctctc cacgctttgc ctgaccctgc ttgctcaact ctacgtcttt 5940
gtttcgtttt ctgttctgcg ccgttacaga tccaagctgt gaccggcgcc tacgctagat 6000
gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg 6060
caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg 6120
ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat 6180
cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag 6240
cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc 6300
ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc 6360
cgcgtggttc ctggccaccg tcggcgtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag 6420
cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga 6480
gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga 6540
cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgagt 6600
cgacaatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt 6660
tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc 6720
ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga 6780
gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc 6840
cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct 6900
ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg 6960
gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct 7020
gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc 7080
cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg 7140
tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcctggtac 7200
ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg 7260
ggggactgga agggctaatt cactcccaac gaaaataaga tctgcttttt gcttgtactg 7320
ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 7380
tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 7440
gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 7500
gtagtagttc atgtcatctt attattcagt atttataact tgcaaagaaa tgaatatcag 7560
agagtgagag gaacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca 7620
caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca 7680
tcaatgtatc ttatcatgtc tggctctagc tatcccgccc ctaactccgc ccagttccgc 7740
ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc 7800
ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag acttttgcag 7860
agacggccca aattcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct 7920
cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg 7980
agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 8040
gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 8100
gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 8160
ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 8220
aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 8280
ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 8340
________________________________________
gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 8400
cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 8460
gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 8520
tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 8580
cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 8640
cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 8700
gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 8760
agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 8820
cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 8880
tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 8940
tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag 9000
ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat 9060
cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc 9120
cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat 9180
accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag 9240
ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg 9300
ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc 9360
tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca 9420
acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg 9480
tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc 9540
actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta 9600
ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc 9660
aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg 9720
ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc 9780
cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc 9840
aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat 9900
actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag 9960
cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc 10020
ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa 10080
taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 10140
acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 10200
agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc 10260
atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 10320
aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg 10380
gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag 10440
gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag 10500
tgccaagctg 10510
<210> 6
<211> 9496
<212> DNA
<213>
<220>
<400> 6
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
________________________________________
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420
cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900
taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960
acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020
cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080
ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140
tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200
gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260
aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320
gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380
aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggttaacttt 1800
taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag acataatagc 1860
aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaaattcaaa attttatcga 1920
tacaggaatt ctggcgtgca gtgggcgact cagaaacgcc caaaggtgct cccccgagac 1980
aagcggtcgg actaccatgg aaatgccagg acctcagcct ctgggaagcg ttaggaggtt 2040
aaaagagatg agatcccttc taaagggctg gagaagatgt cagtccaggt aggactaatg 2100
gaaactttat cgcggttcca ggggcctcgg cccgactgag ctgggagggg ccgggaagct 2160
gggagtctgg atggaggacg aagttggagg tgatgggagg tgggtgggca gaccgcagct 2220
cctgggcaga caagttcagg aaggacagcc gttggggccg ttggatactg ggagctggcg 2280
ctccgccctc ttccctctca tccccccacc cgcgcctccc accaccgtcg gcggcccctg 2340
cgcgtgcgcg cgcgcagaca ccggttgcca aacattgcat catccccgcc ccccgtcatc 2400
cctccctcgc cgcactctcc ttcgcccgcc cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg cgcgcgcatg 2460
actcactcac ctcctccgcg gagcctcgtg acccaaagcc acttccgggt ccaagacaac 2520
gtagctctcc agccagaggg cggggcggag gcgggggccg agggggctcc tgagtggcgg 2580
atgtaggggt ggggcggagt cagtgccagc gtgccgcttt ctgattggca ggctcctggg 2640
tcccgccccc caaaagaggg gacgggcccg cataaaatat cttctctcgg cgctgcagag 2700
gtcagacgaa gtgtgagact caggctacgt ctagagctag cgccgccacc atggccgatg 2760
ctaagaacat taagaagggc cctgctccct tctaccctct ggaggatggc accgctggcg 2820
agcagctgca caaggccatg aagaggtatg ccctggtgcc tggcaccatt gccttcaccg 2880
atgcccacat tgaggtggac atcacctatg ccgagtactt cgagatgtct gtgcgcctgg 2940
ccgaggccat gaagaggtac ggcctgaaca ccaaccaccg catcgtggtg tgctctgaga 3000
actctctgca gttcttcatg ccagtgctgg gcgccctgtt catcggagtg gccgtggccc 3060
ctgctaacga catttacaac gagcgcgagc tgctgaacag catgggcatt tctcagccta 3120
ccgtggtgtt cgtgtctaag aagggcctgc agaagatcct gaacgtgcag aagaagctgc 3180
ctatcatcca gaagatcatc atcatggact ctaagaccga ctaccagggc ttccagagca 3240
tgtacacatt cgtgacatct catctgcctc ctggcttcaa cgagtacgac ttcgtgccag 3300
agtctttcga cagggacaaa accattgccc tgatcatgaa cagctctggg tctaccggcc 3360
tgcctaaggg cgtggccctg cctcatcgca ccgcctgtgt gcgcttctct cacgcccgcg 3420
accctatttt cggcaaccag atcatccccg acaccgctat tctgagcgtg gtgccattcc 3480
accacggctt cggcatgttc accaccctgg gctacctgat ttgcggcttt cgggtggtgc 3540
________________________________________
tgatgtaccg cttcgaggag gagctgttcc tgcgcagcct gcaagactac aaaattcagt 3600
ctgccctgct ggtgccaacc ctgttcagct tcttcgctaa gagcaccctg atcgacaagt 3660
acgacctgtc taacctgcac gagattgcct ctggcggcgc cccactgtct aaggaggtgg 3720
gcgaagccgt ggccaagcgc tttcatctgc caggcatccg ccagggctac ggcctgaccg 3780
agacaaccag cgccattctg attaccccag agggcgacga caagcctggc gccgtgggca 3840
aggtggtgcc attcttcgag gccaaggtgg tggacctgga caccggcaag accctgggag 3900
tgaaccagcg cggcgagctg tgtgtgcgcg gccctatgat tatgtccggc tacgtgaata 3960
accctgaggc cacaaacgcc ctgatcgaca aggacggctg gctgcactct ggcgacattg 4020
cctactggga cgaggacgag cacttcttca tcgtggaccg cctgaagtct ctgatcaagt 4080
acaagggcta ccaggtggcc ccagccgagc tggagtctat cctgctgcag caccctaaca 4140
ttttcgacgc cggagtggcc ggcctgcccg acgacgatgc cggcgagctg cctgccgccg 4200
tcgtcgtgct ggaacacggc aagaccatga ccgagaagga gatcgtggac tatgtggcca 4260
gccaggtgac aaccgccaag aagctgcgcg gcggagtggt gttcgtggac gaggtgccca 4320
agggcctgac cggcaagctg gacgcccgca agatccgcga gatcctgatc aaggctaaga 4380
aaggcggcaa gatcgccgtg taagaattcg aatttaaatg gatccgcggc cgcaaggatc 4440
tgcgatcgct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag 4500
ttggggggag gggtcggcaa ttgaacgggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg 4560
gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata 4620
agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacagctg 4680
aagcttcgag gggctcgcat ctctccttca cgcgcccgcc gccctacctg aggccgccat 4740
ccacgccggt tgagtcgcgt tctgccgcct cccgcctgtg gtgcctcctg aactgcgtcc 4800
gccgtctagg taagtttaaa gctcaggtcg agaccgggcc tttgtccggc gctcccttgg 4860
agcctaccta gactcagccg gctctccacg ctttgcctga ccctgcttgc tcaactctac 4920
gtctttgttt cgttttctgt tctgcgccgt tacagatcca agctgtgacc ggcgcctacg 4980
ctagatgacc gagtacaagc ccacggtgcg cctcgccacc cgcgacgacg tccccagggc 5040
cgtacgcacc ctcgccgccg cgttcgccga ctaccccgcc acgcgccaca ccgtcgatcc 5100
ggaccgccac atcgagcggg tcaccgagct gcaagaactc ttcctcacgc gcgtcgggct 5160
cgacatcggc aaggtgtggg tcgcggacga cggcgccgcg gtggcggtct ggaccacgcc 5220
ggagagcgtc gaagcggggg cggtgttcgc cgagatcggc ccgcgcatgg ccgagttgag 5280
cggttcccgg ctggccgcgc agcaacagat ggaaggcctc ctggcgccgc accggcccaa 5340
ggagcccgcg tggttcctgg ccaccgtcgg cgtctcgccc gaccaccagg gcaagggtct 5400
gggcagcgcc gtcgtgctcc ccggagtgga ggcggccgag cgcgccgggg tgcccgcctt 5460
cctggagacc tccgcgcccc gcaacctccc cttctacgag cggctcggct tcaccgtcac 5520
cgccgacgtc gaggtgcccg aaggaccgcg cacctggtgc atgacccgca agcccggtgc 5580
ctgagtcgac aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa 5640
ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat 5700
tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta 5760
tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc 5820
aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt 5880
ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg 5940
ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc 6000
ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 6060
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 6120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 6180
tggtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag 6240
aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaacgaaa ataagatctg ctttttgctt 6300
gtactgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga 6360
acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc 6420
tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct 6480
ctagcagtag tagttcatgt catcttatta ttcagtattt ataacttgca aagaaatgaa 6540
tatcagagag tgagaggaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 6600
gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 6660
aactcatcaa tgtatcttat catgtctggc tctagctatc ccgcccctaa ctccgcccag 6720
ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc 6780
cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctagactt 6840
ttgcagagac ggcccaaatt cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta 6900
________________________________________
tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc 6960
ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 7020
aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 7080
tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 7140
gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 7200
cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 7260
gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 7320
aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 7380
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 7440
cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 7500
ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 7560
cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 7620
agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 7680
gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct 7740
gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 7800
tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 7860
agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 7920
agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 7980
atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 8040
cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 8100
actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 8160
aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 8220
cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 8280
ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 8340
cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 8400
ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 8460
cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 8520
ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 8580
tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 8640
ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 8700
aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 8760
gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 8820
gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 8880
ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 8940
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 9000
atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta 9060
taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa 9120
cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag 9180
cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta 9240
tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag 9300
atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg 9360
ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc 9420
tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac 9480
ggccagtgcc aagctg
Claims (15)
- 진핵세포를 위한 다중 구성요소 유전자 발현 리포팅 시스템으로서, 인간 p21 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질로서 레닐라 루시페라제(RLuc)를 암호화하는 DNA 서열 및 이의 유도체를 더 포함하는 제 1 발현 카세트; 햄스터 GADD153 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질로서 인간화 반딧불이 루시페라제(hFLuc)를 암호화하는 DNA 서열 및 이의 유도체를 포함하는 제 2 발현 카세트; 및 p53 반응 요소 및 프로모터로서 폴리오마 바이러스 UTR에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질로서 베타 갈락토시다아제(Bgal)를 암호화하는 DNA 서열 및 이의 유도체를 포함하는 제 3 발현 카세트를 포함하는 것인 진핵세포를 위한 다중 구성요소 유전자 발현 리포팅 시스템.
- 제 1 항에 있어서,
시스템은 지놈 손상에 반응하여 리포터 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 발현을 활성화하는 방식으로 배열되는 것인 진핵세포를 위한 다중 구성요소 유전자 발현 리포팅 시스템. - 제 1 항에 있어서,
인간 p21 유전자 프로모터 및/또는 햄스터 GADD153 유전자 프로모터 및/또는 p53 반응 요소 서열들은 RNA 폴리머중합효소가 DNA 분자에 결합하여 리포터 단백질, RLuc 및/또는 FLuc 및/또는 Bgal을 암호화하는 DNA를 전사하는 것을 시작하도록 유도하는 것인 진핵세포를 위한 다중 구성요소 유전자 발현 리포팅 시스템. - 제 3 항에 있어서,
인간 p21의 프로모터 서열은 pCDH-puro-p21-RLuc 플라스미드로부터 얻어지는 것인 진핵세포를 위한 다중 구성요소 유전자 발현 리포팅 시스템. - 제 3 항에 있어서,
햄스터 GADD153은 pCDH-puro-GADD153-hFLuc 플라스미드로부터 얻어지는 것인 진핵세포를 위한 다중 구성요소 유전자 발현 리포팅 시스템. - 제 3 항에 있어서,
인간 p53은 pCDH-hygro-p53-Bgal 플라스미드로부터 얻어지는 것인 진핵세포를 위한 다중 구성요소 유전자 발현 리포팅 시스템. - 제 4 항에 있어서,
인간 p21 유전자 프로모터를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2의 위치 1961 내지 4456에 나타나는 것인 진핵세포를 위한 다중 구성요소 유전자 발현 리포팅 시스템. - 제 5 항에 있어서,
햄스터 GADD153 유전자 프로모터를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3의 위치 1961 내지 2741에 나타나는 것인 진핵세포를 위한 다중 구성요소 유전자 발현 리포팅 시스템. - 제 6 항에 있어서,
인간 p53 유전자 프로모터를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7의 위치 1932 내지 2380에 나타나는 것인 진핵세포를 위한 다중 구성요소 유전자 발현 리포팅 시스템. - 제 1 항에 있어서,
유전자들을 이소성으로 전달하는 렌티바이러스 시스템을 사용하는 것인 진핵세포를 위한 다중 구성요소 유전자 발현 리포팅 시스템. - 3개의 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터로서, 제 1 발현 카세트는 인간 p21 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질로서 레닐라 루시페라제(RLuc)를 암호화하는 DNA 서열 및 이의 유도체를 더 포함하며; 제 2 발현 카세트는 햄스터 GADD153 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질로서 인간화 반딧불이 루시페라제(hFLuc)를 암호화하는 DNA 서열 및 이의 유도체를 포함하며; 및 제 3 발현 카세트는 p53 반응 요소 및 프로모터로서 폴리오마 바이러스 UTR에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질로서 베타 갈락토시다아제(Bgal)를 암호화하는 DNA 서열 및 이의 유도체를 포함하는 것인 재조합 벡터.
- 제 11 항에 있어서,
재조합 벡터는 푸로마이신, 하이그로마이신 또는 네오마이신을 포함하는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 선택가능한 마커를 포함하는 렌티바이러스 벡터인 재조합 벡터. - 제 12 항에 있어서,
pCDH-puro-p21-RLuc, pCDH-puro-GADD153-hFLuc 및 pCDH-hygro-p53-Bgal을 포함하는 것인 재조합 벡터. - 제 11 항에 있어서,
재조합 벡터는 세포에 포함되며, 이 세포는 포유류 유래 세포인 재조합 벡터. - 세포주를 유전독성 물질에 노출하는 단계 및 세포로부터 발광 리포터 단백질의 발현을 관찰하는 단계를 포함하여 DNA 손상을 일으키는 유전독성 물질들의 존재를 탐지하는 고효율 스크리닝 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IN1239CH2011 | 2011-04-08 | ||
| IN1239/CHE/2011 | 2011-04-08 | ||
| PCT/IB2012/051729 WO2012137186A1 (en) | 2011-04-08 | 2012-04-07 | An in vitro method for high throughput screening of genotoxic agents in eukaryotic cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20130142186A true KR20130142186A (ko) | 2013-12-27 |
Family
ID=46968670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020137029566A Abandoned KR20130142186A (ko) | 2011-04-08 | 2012-04-07 | 진핵세포에서 유전독성 물질의 고효율 스크리닝을 위한 인비트로 방법 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9285358B2 (ko) |
| EP (1) | EP2694687B1 (ko) |
| JP (1) | JP5954883B2 (ko) |
| KR (1) | KR20130142186A (ko) |
| CN (1) | CN103582704A (ko) |
| WO (1) | WO2012137186A1 (ko) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060241580A1 (en) | 2003-06-10 | 2006-10-26 | Neomedix Corporation | Device and methods useable for treatment of glaucoma and other surgical procedures |
| US9872799B2 (en) | 2012-04-24 | 2018-01-23 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Intraocular device for dual incisions |
| JP6054514B2 (ja) | 2012-04-24 | 2016-12-27 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイトＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＯＬＯＲＡＤＯ，ａ ｂｏｄｙ ｃｏｒｐｏｒａｔｅ | 改変された二重ブレード切断システム |
| US10682254B2 (en) | 2012-04-24 | 2020-06-16 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Intraocular device for dual incisions |
| US10093960B2 (en) | 2015-07-24 | 2018-10-09 | Molecular Devices, Llc | Luminescence measurement of biological samples utilizing dual reagents |
| WO2017112893A1 (en) | 2015-12-23 | 2017-06-29 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | An ophthalmic knife and methods of use |
| US10779991B2 (en) | 2015-12-23 | 2020-09-22 | The Regents of the University of Colorado, a body corporated | Ophthalmic knife and methods of use |
| BR112019017027A2 (pt) | 2017-02-16 | 2020-04-14 | Neomedix Corp | dispositivos, sistemas e métodos para cirurgia de glaucoma minimamente invasiva |
| WO2020020438A1 (de) * | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Wacker Chemie Ag | Neue bakterielle lpp-mutante und deren verwendung zur sekretorischen herstellung von rekombinanten proteinen |
| DE102020111571A1 (de) | 2020-03-11 | 2021-09-16 | Immatics US, Inc. | Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren |
| WO2023177761A2 (en) | 2022-03-16 | 2023-09-21 | Sight Sciences, Inc. | Devices and methods for intraocular tissue manipulation |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3509100B2 (ja) * | 1993-01-21 | 2004-03-22 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 哺乳動物のストレスプロモーターを利用する化合物の毒性測定方法および診断用キット |
| US6344324B2 (en) | 2000-01-07 | 2002-02-05 | Research Development Foundation | Quantification of cellular injury using expression of a fluorescent protein under the control of the GADD153 promoter |
| EP1360326A2 (en) * | 2000-10-27 | 2003-11-12 | President And Fellows Of Harvard College | Cell based triple readout assay systems for identifying compounds that affect transcription |
| GB0905410D0 (en) * | 2009-03-28 | 2009-05-13 | Gentronix Ltd | Genotoxicity testing |
-
2012
- 2012-04-07 KR KR1020137029566A patent/KR20130142186A/ko not_active Abandoned
- 2012-04-07 EP EP12768664.0A patent/EP2694687B1/en not_active Not-in-force
- 2012-04-07 US US14/110,302 patent/US9285358B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-04-07 JP JP2014503271A patent/JP5954883B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-04-07 CN CN201280027041.9A patent/CN103582704A/zh active Pending
- 2012-04-07 WO PCT/IB2012/051729 patent/WO2012137186A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US9285358B2 (en) | 2016-03-15 |
| EP2694687B1 (en) | 2018-01-31 |
| CN103582704A (zh) | 2014-02-12 |
| US20140148360A1 (en) | 2014-05-29 |
| EP2694687A1 (en) | 2014-02-12 |
| JP5954883B2 (ja) | 2016-07-20 |
| EP2694687A4 (en) | 2014-11-19 |
| WO2012137186A1 (en) | 2012-10-11 |
| JP2014515608A (ja) | 2014-07-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20130142186A (ko) | 진핵세포에서 유전독성 물질의 고효율 스크리닝을 위한 인비트로 방법 | |
| Steinmann et al. | Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles | |
| CN110938652A (zh) | 打靶载体及构建白喉毒素调控清除巨噬细胞的f4/80-dtr转基因小鼠的方法和应用 | |
| CN103937836A (zh) | 水通道蛋白-4自身抗体的检测方法及融合表达病毒载体和应用 | |
| CN101405389A (zh) | 新型蛋白质表达系统 | |
| KR101478373B1 (ko) | 분비성 루시페라아제를 이용하는 생물 발광 검사 | |
| CN113957174A (zh) | 一种特异性识别免疫分型为hlaa11的ebv病毒肽段的tcr引物组及其应用 | |
| CN108456688A (zh) | 一种基于t7启动子的重组表达质粒、转化子及其应用 | |
| US5976807A (en) | Eukaryotic cells stably expressing genes from multiple transfected episomes | |
| CN112680477A (zh) | 一种基于无缝克隆技术的h9n2亚型禽流感病毒的拯救方法 | |
| CN114606151B (zh) | 一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组毕赤酵母及构建方法和应用 | |
| US20230102794A1 (en) | Vector set for measuring transposase activity, kit, transposase activity measuring method, and cell separation method | |
| CN114774298B (zh) | 合成樱花素的重组菌株及其构建方法和发酵合成樱花素的方法及应用 | |
| US20050260624A1 (en) | Novel nucleic acid complexes and detection thereof | |
| CN113652405B (zh) | pSFV-p54复制子颗粒及其制备方法与应用 | |
| CN114796526B (zh) | 一种仿生双特异性纳米编辑系统及其用途 | |
| KR102178022B1 (ko) | Fgf21 반응성 리포터 유전자 세포주 | |
| CN111979133A (zh) | 一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用 | |
| KR20230154039A (ko) | 재조합 aav9 비리온의 제조 방법 | |
| CN108531495A (zh) | 一种光控基因表达系统及其应用 | |
| KR20200104343A (ko) | 라싸 백신 | |
| KR20230136172A (ko) | 자기-관용을 파괴하기 위한 백신 조성물 | |
| CN115707776A (zh) | 重组柯萨奇病毒a6病毒样颗粒及其用途 | |
| KR101620141B1 (ko) | 불멸화된 돼지 신장유래 세포주 및 이를 이용한 돼지써코 바이러스 2형의 증식방법 | |
| CN110522907B (zh) | 一种海藻酸钠/穿膜肽/质粒三元纳米复合物疫苗及其制备和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0105 | International application |
Patent event date: 20131107 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20150221 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Final Notice of Reason for Refusal Patent event date: 20150925 Patent event code: PE09021S02D |
|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20160303 |
|
| PC1904 | Unpaid initial registration fee |