KR20130135340A - Composition and method for regeneration of connective tissue - Google Patents
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Abstract
본 발명은 결합조직 재생용 조성물 및 결합조직을 재생하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 히아루론산과 피브리노겐을 아텔로콜라겐 또는 골수세포와 혼합하여 결합조직 손상 부위에 주입함으로써 손상 부위의 결합조직을 재생시킬 수 있는 결합조직 재생용 조성물 및 결합조직을 재생하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 결합조직 재생용 조성물은 결합조직의 손상 부위를 효과적으로 재생시킬 수 있으며, 특히 낮은 재생 활성을 갖는 연골 재생에 유효한 효능을 나타낸다. 또한, 천연물질을 사용하므로 인체에 무해하며, 자연 연골과 유사한 조직공학적 연골을 재생하여 손상된 연골조직을 효과적으로 수복할 수 있는 연골 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a composition for regenerating connective tissue and a method for regenerating connective tissue. More specifically, hyaluronic acid and fibrinogen may be mixed with atelocollagen or bone marrow cells to be injected into the connective tissue injury site to regenerate connective tissue at an injury site. The present invention relates to a composition for regenerating connective tissue and a method for regenerating connective tissue. The composition for connective tissue regeneration according to the present invention can effectively regenerate a damaged part of the connective tissue, and particularly exhibits an effective effect on cartilage regeneration with low regeneration activity. In addition, since it is a natural material, it is harmless to the human body and can be usefully used as a cartilage treatment agent that can effectively repair damaged cartilage tissue by regenerating histological cartilage similar to natural cartilage.
Description
본 발명은 히아루론산과 피브리노겐을 아텔로콜라겐 또는 골수세포와 혼합하여 결합조직 손상 부위에 주입함으로써 손상 부위의 결합조직을 재생시킬 수 있는 결합조직 재생용 조성물 및 결합조직을 재생하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for regenerating connective tissue and a method for regenerating connective tissue that can regenerate connective tissue at an injury site by injecting hyaluronic acid and fibrinogen with atelocollagen or bone marrow cells and injecting the connective tissue injury site.
일반적으로 척추동물의 관절을 이루는 연골 조직에는 혈관, 신경 및 임파조직이 없어서 한번 손상되게 되면 정상적으로 생체 내에서 재생이 되지 않는다. 이러한 관절의 연골조직이 손상될 경우 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한을 받게 되며, 만성화될 경우 치명적인 퇴행성 관절염을 유발하게 되어 정상적인 생활이나 직업적인 활동을 방해하게 된다. 그러므로 손상된 관절연골은 스스로 회복 및 재생이 매우 제한될 수 밖에 없다. 의학적으로 여러 가지 방법이 도모되지만 아직 관절연골인 초자 연골을 자연과 같은 상태로 회복하기에는 부족한 실정이다.In general, cartilage tissue that forms the joints of vertebrates lack blood vessels, nerves and lymphoid tissues, so once damaged, they do not normally reproduce in vivo. If the cartilage tissue of such a joint is damaged, severe pain and restriction on daily activities, and if chronic, will lead to fatal degenerative arthritis, which interferes with normal living or professional activities. Therefore, damaged articular cartilage can not be very limited in the recovery and regeneration itself. Medically, various methods are promoted, but it is not enough to restore the articular cartilage, which is still articular cartilage, to its natural state.
임상적으로 연골을 재생시키는 수술 방법으로는 ① 줄기세포의 연골세포로의 분화유도를하는 방법, ② 골 연골 이식술(osteochondral transplantation)로 자가 혹은 동종의 연골조직을 연골 결손 부위에 이식하는 방법, ③미세 골절술(microfracture)로 손상된 연골을 잘 긁어내어 제거하고 연골하 골이 노출되면 여기에 일정한 간격으로 구멍을 뚫고 이를 통해서 흘러나온 골수세포가 연골 조직으로 재생되는 것을 도모하는 방법, ④ 연골세포 이식술(chondrocyte transplantation)로 연골 결손부위에 연골세포를 이식함으로써 연골 재생을 유도하는 방법 등이 사용되고 있다.Clinically, surgical methods for regenerating cartilage include: ① inducing differentiation of stem cells into chondrocytes, ② transplanting autologous or homogenous cartilage tissue into cartilage defects by osteochondral transplantation, ③ Microfracture scrapes the damaged cartilage well and removes it. When the subchondral bone is exposed, holes are drilled at regular intervals, and the bone marrow cells flowing through it are regenerated into cartilage tissue. ④ Chondrocyte transplantation The method of inducing cartilage regeneration by transplanting chondrocytes into cartilage defects by (chondrocyte transplantation) has been used.
미세 골절술(microfracture)은 가장 일반적으로 사용되는 방법이며, 그 대표적 방법인 관절경적 시술은 소형카메라가 장착된 관절경(arthroscopy)을 1㎝ 미만의 작은 구멍을 통해 관절강 내에 삽입하여, TV 모니터를 통해 관절 속을 확대 관찰하면서 진단 및 수술을 동시에 수행하는 방법이다. 그러나 미세 골절술(microfracture)은 실제의 관절에 필요한 초자연골(hyaline cartilage)이 아니라 섬유연골(fibro-cartilage)이 주로 생성되기 때문에, 기능적인 측면에서 볼 때는 만족할 만한 효과를 거두지 못하고 있다.Microfracture is the most commonly used method, and arthroscopy, a typical method, involves inserting an arthroscopy with a small camera into the joint cavity through a small hole of less than 1 cm, allowing the TV monitor to It is a method of performing diagnosis and surgery at the same time while expanding the joint inside. However, the microfracture is not a hyaline cartilage required for the actual joints, but fibro-cartilage is mainly produced, and in terms of function, it is not satisfactory.
골 연골 이식술은 환자의 정상부위에서 이미 생성되어 있는 연골과 연골하골 부분을 함께 채취하여, 손상된 연골 부위에 적당한 구멍을 파고 이식하여 초자연골을 생성하는 방법이다. 그러나 상기 방법은 이식된 부위와 원래 조직 사이에 틈이 남는 문제 등이 있어 완전한 치료 방법이라 하기 어려우며, 그나마 자가이식(autolaugous transplantation)이 가능한 환자만을 대상으로 시행할 수 있어 보편적인 방법이 될 수 없다.Bone cartilage transplantation is a method of producing supernatural bone by extracting the cartilage and subchondral bone parts that have already been generated in the normal part of the patient, digging a proper hole in the damaged cartilage area and transplanting them. However, this method is not a complete treatment method because there is a gap between the grafted site and the original tissue, and it can not be a universal method because it can be performed only for patients capable of autolaugous transplantation .
최근, 손상된 관절 연골의 치료를 위해 조직 공학에 기초를 둔 새로운 치료법으로서 자기유래 연골세포 이식술이 각광받고 있다. 이는 무릎 관절 연골이 손상된 환자의 연골 부위 중 사용이 많지 않은 연골을 채취한 후 연골 세포를 분리하고, 상기 연골 세포를 배양하여 연골 결손 부위를 치료할 만큼의 연골 세포수를 획득하며, 배양된 연골세포를 환자의 연골 결손 부위에 이식하여 환자의 관절 연골을 복원시키는 방법이다.Recently, self-derived chondrocyte transplantation has been spotlighted as a new treatment based on tissue engineering for the treatment of damaged articular cartilage. This is to extract cartilage that is not used much in the cartilage area of patients with damaged knee joint cartilage, to separate cartilage cells, and to culture the cartilage cells to obtain the number of cartilage cells to treat cartilage defects. It is a method of restoring the joint cartilage of the patient by implanting the cartilage defects of the patient.
상기 방법은 이미 생성된 연골조직을 손상부위에 주입하는 골 연골 이식술에 비해, 이식된 연골세포가 손상된 부위 내에서 직접 증식하면서 손상부위를 채우게 되므로, 이식된 부위와 정상 부위가 비교적 잘 융합되며, 초자연골을 재생할 가능성 또한 많다. 그러나 연골세포를 채취할 때, 그리고 체외에서 배양된 연골세포를 다시 관절연골손상 부위에 이식할 때 각각 수술이 필요하므로, 결국 2차례에 걸친 수술에 의해 환자의 고통, 후유증 및 경제적 부담이 크며, 시술 과정 또한 복잡하다. 또한, 채취된 연골세포는 대부분은 이미 성장이 다 이루어진 성인으로부터 얻은 것이므로, 채취된 세포의 증식 및 생장이 왕성하지 않아 세포의 체외 배양시 이식에 필요한 만큼의 세포 수를 얻기까지 상당한 기간이 걸리며, 세포가 분화능력을 잃어 아예 증식하지 않는 경우에는 치료 자체가 이루어질 수 없고, 연골세포를 체외에서 배양하기 때문에 세포의 발현형이 변화되곤 하는 문제점이 있을 수있다.Compared to bone cartilage transplantation, in which the cartilage tissue is already injected into the damaged area, the method can fill the damaged area by directly proliferating the transplanted chondrocytes in the damaged area, so that the transplanted site and the normal site are relatively fused. There are also many possibilities for playing supernatural bones. However, surgery is required when the chondrocytes are harvested and when the chondrocytes cultured in vitro are transplanted to the articular cartilage injuries. Therefore, the patient suffers from pain, sequelae and economic burden by two operations. The procedure is also complicated. In addition, since most of the collected chondrocytes are from adults that have already grown, the proliferation and growth of the collected cells are not so strong that it takes a considerable period of time to obtain as many cells as needed for transplantation in vitro. If the cells lose their differentiation capacity and do not proliferate at all, the treatment itself cannot be achieved, and there may be a problem that the phenotype of the cells is changed because the chondrocytes are cultured in vitro.
상기 방법을 응용하여 자가 유래 골수(bone marrow), 근육, 피부 등의 간엽 조직으로부터 연골세포(chondrocyte)의 전구모세포(precursor cell)인 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)를 얻고, 체외에서 증식시켜 고분자와 함께 관절연골손상 부위에 주입하는 방법이 보고된 바 있다. 상기와 같이 성숙한 개체에서 얻은 간엽줄기세포를 이용하여 연골손상을 치료하는 방법은 자기유래연골세포 이식술에 비해, 보다 미분화된 세포를 얻어 체외 배양하므로 세포증식력이 다소 높아지는 것으로 나타났다. 그러나 상기 방법 역시 다양한 연골 손상을 충분히 치료하기에는 여전히 미약한 수준의 세포증식력을 나타내고 있다.The method is applied to obtain mesenchymal stem cells (MSCs), which are precursor cells of chondrocytes, from mesenchymal tissues such as bone marrow, muscle, and skin, and proliferate in vitro. Has been reported to inject into the joint cartilage damage site with a polymer. As described above, the method of treating cartilage damage by using mesenchymal stem cells obtained from mature individuals has been shown to increase cell proliferation slightly because of in vitro culture to obtain more undifferentiated cells compared to autologous chondrocyte transplantation. However, the method still shows a weak level of cell proliferation to sufficiently treat various cartilage damage.
이러한 미약한 세포증식력을 개선하기 위하여, 최근에는 제대혈 유래 줄기세포를 관절연골 손상부위에 주입하는 방법이 연구되고 있으나(대한민국공개특허 제10-2003-069115호), 연골 재생 효과 면에서 아직 미흡한 점이 많고, 실제 관절연골 구조를 고려한 지지체에 대한 연구는 아직 없다. In order to improve such weak cell proliferation, a method of injecting umbilical cord blood-derived stem cells into articular cartilage injuries has recently been studied (Korea Patent Publication No. 10-2003-069115). There are many studies on the scaffolding considering the actual articular cartilage structure.
이상으로 볼 때, 연골을 형성하기 위해서는 연골 형성능력이 있는 조직이어야 하고, 기질형성에 필요한 외적 요소를 갖추어야 하며 성장에 필요한 충분한 영양조건을 갖추어야 한다.In view of the above, in order to form cartilage, cartilage forming ability should be a tissue, should have the external elements necessary for the formation of substrate and sufficient nutritional conditions necessary for growth.
따라서, 최근에 손상되었거나 기능을 상실한 환자 자신의 조직이나 장기에서 세포를 일부 채취하여 생체적합성 고분자 지지체를 이용해 체외에서 배양한 다음 체내의 원래 위치에 이식하여 조직이나 장기를 복원, 재생 또는 대체하는 조직공학이 크게 각광을 받고 있다.Thus, tissues that are partially harvested from recently damaged or dysfunctional patients' own tissues or organs, cultured in vitro using biocompatible polymer scaffolds, and transplanted to their original locations in the body to restore, regenerate, or replace tissues or organs. Engineering is in the limelight.
이러한 조직 공학을 이용하여 손상된 연골을 재생하고자 하는 다양한 연구들이 진행되고 있으며, 연골 제조와 관련하여서는 시험관, 배양기 등과 같은 인공적 환경인 차원 담체 구조체에서 제작하거나, 지지체/세포 혼합물을 이용하여 생물체 내(in vivo)에서 제작하는 것이 연구된 바 있다.Various studies have been conducted to regenerate damaged cartilage using this tissue engineering, and in relation to cartilage production, it is manufactured in a dimensional carrier structure, which is an artificial environment such as a test tube, an incubator, or in a living body using a support / cell mixture. In vivo production has been studied.
그러나, 연골 조직을 재생하기 위해서는 앞에서도 서술한 바와 같이 연골 재생층 단독만으로는 한계점이 있다. 연골은 발생학적으로 경골조직과 같은 중배엽에서 기원한 조직으로, 뼈와 함께 내골격을 형성한다. 이처럼 연골과 뼈는 유기적으로 작용하는 조직이지만 종래의 연골과 뼈의 조직공학적 치료는 이들을 각각 치료하였다. 또한 연골 손상이 심한 경우 연골 뿐만 아니라 연골 밑의 골조직 까지 손상을 입는 경우도 있다.However, in order to regenerate cartilage tissue, as described above, the cartilage regeneration layer alone has a limitation. Cartilage is a tissue originated from mesoderm, such as tibial tissue, and forms an endoskeleton with bone. As described above, cartilage and bone are organic tissues, but conventional tissue and cartilage treatment of cartilage and bone treated each of them. In addition, cartilage damage is severely damaged not only cartilage but also bone tissue under the cartilage.
또한, 이런 점을 개선하여 뼈와 연골을 동시에 치료할 수 있는 지지체 개발에 대한 연구가 일부 진행되었으나(대한민국 특허출원 제10-2006-0054236호), 우수한 효과를 가지는 뼈와 연골의 복합 재생용 지지체의 개발이 여전히 요구되고 있는 실정이다.In addition, some studies have been conducted to develop a scaffold that can simultaneously treat bone and cartilage by improving this point (Korean Patent Application No. 10-2006-0054236). Development is still required.
이에 본 발명자들은 히아루론산과 피브리노겐을 아텔로콜라겐 또는 골수세포와 혼합하여 결합조직 손상 부위에 주입하면 효과적으로 손상 부위의 조직을 재생시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors completed the present invention by confirming that hyaluronic acid and fibrinogen were mixed with atelocollagen or bone marrow cells and injected into the connective tissue damage site, thereby effectively regenerating the tissue at the damaged site.
따라서 본 발명의 목적은 결합조직의 손상 부위의 조직, 특히 낮은 재생 활성을 갖는 연골을 효과적으로 재생시킬 수 있는 결합조직 재생용 조성물을 제공하고자 하는 것이다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a composition for connective tissue regeneration that can effectively regenerate tissues, particularly cartilage having low regeneration activity, of damaged sites of connective tissue.
본 발명의 다른 목적은 상술한 결합조직 재생용 조성물 이용하여 결합조직을 재생하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for regenerating connective tissue using the above-described composition for regenerating connective tissue.
나아가 본 발명의 또 다른 목적은 상술한 결합조직 재생용 조성물을 포함하는 결합조직 손상 치료용 조성물을 제공하고자 하는 것이다.Furthermore, another object of the present invention is to provide a composition for treating connective tissue damage, including the composition for connective tissue regeneration described above.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피브리노겐 용액과 히아루론산 용액으로 이루어진 응고인자 용액; 및 트롬빈 용액과 골형성 증진제로 이루어진 가교활성 촉매용액을 포함하는 결합조직 재생용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is a coagulation factor solution consisting of fibrinogen solution and hyaluronic acid solution; And it provides a composition for regenerating connective tissue comprising a cross-linking catalyst solution consisting of a thrombin solution and a bone formation enhancer.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 응고인자 용액과 상기 가교활성 촉매용액은 생체 내에서 혼합될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the coagulation factor solution and the cross-linking catalyst solution may be mixed in vivo.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골형성 증진제는 아텔로콜라겐 또는 골수일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the bone formation enhancer may be atelocollagen or bone marrow.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피브리노겐 용액은 동결건조 피브리노겐에 아프로티닌을 주입하여 용해시킨 용액일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the fibrinogen solution may be a solution dissolved by injecting aprotinin to lyophilized fibrinogen.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피브리노겐 용액은 Factor ⅩⅢ을 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the fibrinogen solution may comprise Factor ⅩIII.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 트롬빈 용액은 동결건조된 트롬빈에 염화칼슘을 주입하여 용해시킨 용액일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the thrombin solution may be a solution dissolved by injecting calcium chloride into the lyophilized thrombin.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 응고인자 용액은 피브리노겐 용액과 히아루론산 용액을 7 : 3 ~ 9 : 1의 혼합비율로 혼합할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the coagulation factor solution may be mixed with a fibrinogen solution and a hyaluronic acid solution in a mixing ratio of 7: 3 ~ 9: 1: 1.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가교활성 촉매용액은 트롬빈 용액과 골형성 증진제를 1 : 9 ~ 5 : 5의 혼합비율로 혼합할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the crosslinking active catalyst solution may be mixed with a thrombin solution and a bone formation enhancer in a mixing ratio of 1: 9 ~ 5: 5.
또한, 본 발명은,Further, according to the present invention,
피브리노겐 용액과 히아루론산 용액을 혼합하여 응고인자 용액을 제조하는 단계;Preparing a coagulation factor solution by mixing a fibrinogen solution and a hyaluronic acid solution;
트롬빈 용액과 골형성 증진제를 혼합하여 가교활성 촉매용액을 제조하는 단계; 및Preparing a crosslinking catalyst solution by mixing a thrombin solution and a bone formation promoter; And
상기 응고인자 용액과 가교활성 촉매용액을 손상 조직부위에 주입하여 3 ~ 10분간 겔화시키는 단계를 포함하는 결합조직을 재생하는 방법을 제공한다.It provides a method for regenerating connective tissue comprising the step of injecting the coagulation factor solution and the crosslinking active catalyst solution into the damaged tissue gelling for 3 to 10 minutes.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피브리노겐 용액은 동결건조 피브리로겐에 아프로티닌을 주입하고 용해시켜 제조할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the fibrinogen solution may be prepared by injecting and dissolving aprotinin in lyophilized fibrinogen.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 트롬빈 용액은 동결건조된 트롬빈에 염화칼슘을 주입하고 용해시켜 제조할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the thrombin solution may be prepared by injecting and dissolving calcium chloride in lyophilized thrombin.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 응고인자 용액은 피브리노겐 용액과 히아루론산 용액을 7 : 3 ~ 9 : 1의 혼합비율로 혼합할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the coagulation factor solution may be mixed with a fibrinogen solution and a hyaluronic acid solution in a mixing ratio of 7: 3 ~ 9: 1: 1.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가교활성 촉매용액은 트롬빈 용액과 골형성 증진제를 1 : 9 ~ 5 : 5의 혼합비율로 혼합할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the crosslinking active catalyst solution may be mixed with a thrombin solution and a bone formation enhancer in a mixing ratio of 1: 9 ~ 5: 5.
나아가 본 발명은 본 발명에 따른 결합조직 재생용 조성물을 포함하는 결합조직 손상 치료용 조성물을 제공한다.Furthermore, the present invention provides a composition for treating connective tissue damage, comprising the composition for connective tissue regeneration according to the present invention.
본 발명에 따른 결합조직 재생용 조성물은 결합조직의 손상 부위를 효과적으로 재생시킬 수 있으며, 특히 낮은 재생 활성을 갖는 연골 재생에 유효한 효능을 나타낸다. 또한, 천연물질을 사용하므로 인체에 무해하며, 자연 연골과 유사한 조직공학적 연골을 재생하여 손상된 연골조직을 효과적으로 수복할 수 있는 연골 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.The composition for connective tissue regeneration according to the present invention can effectively regenerate a damaged part of the connective tissue, and particularly exhibits an effective effect on cartilage regeneration with low regeneration activity. In addition, since it is a natural material, it is harmless to the human body and can be usefully used as a cartilage treatment agent that can effectively repair damaged cartilage tissue by regenerating histological cartilage similar to natural cartilage.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 아텔로콜라겐을 이용한 결합조직 재생용 조성물을 준비하는 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 골수를 이용한 결합조직 재생용 조성물을 준비하는 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 3은 토끼를 대상으로 연골조직의 손상을 유도한 모습을 나타낸 것으로서, a는 4mm의 직경 및 2mm의 깊이를 갖는 둥근홀을 제조한 것을 나타낸 사진이고, b는 23-게이지의 주사를 사용하여 연공하천공술(microfracture)을 수행한 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 결합조직 재생용 조성물을 함유한 2개의 주사기 및 각 주사기에 함유된 성분을 모식하여 나타낸 것이다. 도 5는 히아루론산, 피브린 및 골수세포가 혼합된 혼합용액(MBH), 히아루론산과 피브린이 혼합된 혼합용액(MH) 및 아무것도 처리하지 않은 대조군(M) 그룹의 조직 모습을 사진으로 나타낸 것이다.
도 6은 히아루론산, 피브린 및 골수세포가 혼합된 혼합용액(MBH)을 처리한 후, 사프라닌 O 염색(a), 톨루딘 블루 염색(b), 항-콜라겐 타입 I항체를 사용한 면역조직염색법(c) 및 항-콜라겐 타입 II 항체를 사용한 면역조직염색법으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 7은 히아루론산과 피브린이 혼합된 혼합용액(MH)을 처리한 후, 사프라닌 O 염색(a), 톨루딘 블루 염색(b), 항-콜라겐 타입 I항체를 사용한 면역조직염색법(c) 및 항-콜라겐 타입 II 항체를 사용한 면역조직염색법으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 8은 아무것도 처리하지 않은 대조군(M)에 대해 사프라닌 O 염색(a), 톨루딘 블루 염색(b), 항-콜라겐 타입 I항체를 사용한 면역조직염색법(c) 및 항-콜라겐 타입 II 항체를 사용한 면역조직염색법으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 9는 히아루론산, 피브린 및 골수세포가 혼합된 혼합용액(MBH)을 처리한 후 군의 경우 히아루론산과 피브린의 혼합에 의해 다양한 폴리머화가 생성된 모습을 SEM으로 분석한 사진을 나타낸 것으로서, a)는 조성물의 외부를, b)~f)는 조성물 내부에서 형성된 다공 구조를 나타낸 것이다. 또한 b) 및 c)에 표시된 화살표시는 세포가 구조물의 표면에 부착된 것을 나타낸 것이고, e) 및 f)에 표시된 화살표시는 200~1000nm 크기의 직경을 갖는 섬유형 구조물이 벽-유사 구조 안에 관찰된 것을 나타낸 것이다.
도 10에서 a)~c)는 히아루론산과 피브린이 혼합된 혼합용액(MH)에 의한 구조를 TEM으로 관찰한 것을 나타낸 것이고, d)~f)는 히아루론산, 피브린 및 골수세포가 혼합된 혼합용액(MBH)에 의한 구조를 TEM으로 관찰한 것을 나타낸 것이며, 다공 구조에 대해 a)는 저배율로 b)는 고배율로 관찰한 것으로 나타낸 것이고, 박스 표시 부분은 밀집된 부위를 나타낸 것이며, e) 및 f)는 세포들이 본 발명의 조성물에 의한 구조체에 도입되는 것은 나타낸 것이고, g) 및 h)는 새로 합성된 콜라겐 분자를 나타낸 것이다.
도 11은 관절경 수술 과정을 나타낸 것으로서, a)는 대퇴골 내과의 연골 손상 부위에서의 연골하천공술을 나타낸 것이고, b)는 수술 전 모습을, c)는 수술 후 1년 이 경과한 이후의 모습을 나타낸 것이며, c)는 활차 연골 손상에 대한 연골하천공술을 나타낸 것으로서, d)는 수술 전 모습을, c)는 수술후 1년이 지난 이후의 모습을 나타낸 것이다.1 is a schematic diagram illustrating a process of preparing a composition for connective tissue regeneration using atelocollagen according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 shows a schematic diagram illustrating a process for preparing a composition for connective tissue regeneration using bone marrow according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 shows the induction of cartilage damage in rabbits, a is a photograph showing the production of a round hole having a diameter of 4mm and a depth of 2mm, b is a 23-gauge injection The photo shows the microfracture.
Figure 4 schematically shows two syringes containing the composition for connective tissue regeneration of the present invention and the components contained in each syringe. Figure 5 shows a photograph of the tissue of the mixed solution (MBH) mixed with hyaluronic acid, fibrin and bone marrow cells, the mixed solution (MH) mixed with hyaluronic acid and fibrin and the control (M) group treated with nothing.
Figure 6 is treated with a mixed solution (MBH) mixed with hyaluronic acid, fibrin and bone marrow cells, immunostaining method using safranin O staining (a), toludine blue staining (b), anti-collagen type I antibody (c) and photographs observed by immunohistostaining using anti-collagen type II antibodies are shown.
Figure 7 is treated with a mixed solution (MH) mixed with hyaluronic acid and fibrin, immunostaining method using safranin O staining (a), toludine blue staining (b), anti-collagen type I antibody (c) And pictures taken by immunohistostaining using anti-collagen type II antibodies.
FIG. 8 shows safranin O staining (a), toludine blue staining (b), immunohistostaining using anti-collagen type I antibodies (c) and anti-collagen type II for the untreated control (M) The photographs observed by immunohistostaining using antibodies are shown.
9 is a SEM image of various polymerizations generated by mixing hyaluronic acid and fibrin in the case of a group treated with a mixed solution (MBH) mixed with hyaluronic acid, fibrin and bone marrow cells, a) Outside of the composition, b) to f) show the porous structure formed inside the composition. In addition, the arrows indicated in b) and c) indicate that the cells are attached to the surface of the structure, and the arrows indicated in e) and f) show that the fibrous structure having a diameter of 200 to 1000 nm is present in the wall-like structure. It shows what was observed.
In Figure 10 a) ~ c) shows the structure observed by TEM mixed solution of hyaluronic acid and fibrin (MH), d) ~ f) is a mixed solution (hyaluronic acid, fibrin and bone marrow cells mixed) MBH) shows the structure observed by TEM, a) shows a low magnification and b) shows a high magnification for the porous structure, and a box-marked part shows a dense site, and e) and f) It is shown that cells are introduced into the construct by the composition of the present invention, and g) and h) represent newly synthesized collagen molecules.
Figure 11 shows the arthroscopic procedure, a) shows the cartilage perforation at the site of cartilage damage in the femoral condyle, b) before the operation, c) after 1 year after surgery C) shows the cartilaginous perforation of the trochlear cartilage injury, d) before the operation, c) after 1 year after surgery.
본 발명은 결합조직 재생용 조성물 및 이를 이용하여 결합조직을 재생하는 방법에 관한 것으로, 결합조직 재생용 조성물은 피브리노겐, 히아루론산, 트롬빈 및 아텔로콜라겐 또는 골수를 포함하며, 이들을 혼합하여 결합조직, 특히 연골의 손상 부위에 주입함으로써 손상 조직을 효과적으로 재생시킨다는 점에 그 특징이 있다.The present invention relates to a composition for regenerating connective tissue and a method for regenerating connective tissue using the same, wherein the composition for regenerating connective tissue includes fibrinogen, hyaluronic acid, thrombin, and atelocollagen or bone marrow, It is characterized by effective regeneration of damaged tissue by injection into the damaged area of cartilage.
본 발명에서 “결합조직”은 다세포동물의 몸을 구성하는 조직의 일종으로, 세포성분보다 세포간물질이 차지하는 부분 쪽이 많고, 여러 가지 조직, 기관 등의 사이에서 이들을 연결하는 역할을 담당한다. 상기 세포간물질은 섬유성분과 무구조의 기질로 구성하며, 섬유성분은 교원, 세망, 탄성의 3종류의 섬유로 구별할 수 있다. 교원섬유는 특징적인 아미노산배열을 나타내는 3개의 포리펩티드사슬의 3중 나선으로 구성된 교원분자가 일정 간격씩 어긋나게 회합한 교원섬유가 다발을 이룬 것으로, 장력에 대한 강한 저항성을 나타낸다. 망섬유도 교원섬유와 마찬가지로 교원으로 구성되지만 단위가 되는 세섬유의 수, 배열양식과 수식단백질의 차이 등으로 또한 은염에서 강하게 염색되는 것으로 구별할 수 있다. 체내의 분포도 교원섬유는 널리 분포하는 데 비하여 세망섬유는 림프조직, 조혈조직 등 일정한부위에서만 나타난다. 탄성섬유는 엘라스틴을 주성분으로 하며 신장성이 큰 섬유로 기질은 히알루론산, 콘드로이틴황산, 테르마탄황산, 케라탄황산 등을 포함한 글리코사미노글리칸, 혹은 그것이 단백질의 심에 결합한 프로테오글리칸으로 구성한다. 글리코사미노글리칸은 그 분자 내의 부적 전하에 의해 크게 넓어진 형태를 취하고, 친수성이므로 전체적으로 수화한 겔을 형성한다. 이 부분은 결합조직 내의 영양, 노폐물이나 호르몬 등의 확산경로가 되는 것 외에도 이동성인 세포의 통로가 되기도 한다. 세포성분은 상술한 세포간물질을 생산하는 고정세포와 이동성이 있는 유주세포를 크게 나눌 수 있다. 결합조직의 기능으로는 기계적 지지, 혈액과 조직 간의 대사물질의 교환, 지방세포로서의 에너지 저장, 감염예방, 손상후회복 등을 들 수 있다. 결합조직의 고정세포는 발생적으로는 간엽유래이지만 같은 지지조직에 포함되는 골조직의 골세포, 연골조직의 연골세포, 간엽유래의 평활근세포 등을 모두 포함할 수 있다.In the present invention, "connective tissue" is a kind of tissue constituting the body of a multicellular animal, and more intercellular materials occupy than cellular components, and play a role of connecting them among various tissues and organs. The intercellular material is composed of a fibrous component and a non-structured matrix, and the fibrous component can be distinguished into three types of fibers: collagen, reticulum, and elasticity. Collagen fibers are bundles of collagen fibers in which the three molecules of the three-peptides of the three-peptide chains showing characteristic amino acid sequences are alternately arranged at regular intervals, and exhibit a strong resistance to tension. Network fibers, like collagen fibers, are composed of teachers, but can also be distinguished by strong dyeing from silver salts due to the number of fine fibers that are units, differences in alignment patterns, and modified proteins. Distribution in the body Collagen fiber is widely distributed, while reticulum fiber appears only in certain areas such as lymphoid tissue and hematopoietic tissue. Elastic fiber is composed of elastin and is a highly stretchable fiber whose substrate is composed of glycosaminoglycans including hyaluronic acid, chondroitin sulfate, termatan sulfate, keratan sulfate, or proteoglycan bound to the core of the protein. Glycosaminoglycans take a greatly broadened form due to negative charges in their molecules, and are hydrophilic to form a fully hydrated gel. In addition to being a pathway for diffusion of nutrients, waste products, and hormones in connective tissue, this part also serves as a pathway for mobile cells. The cellular component can be largely divided into fixed cells that produce the above-described intercellular materials and mobile cells. Functions of connective tissue include mechanical support, exchange of metabolites between blood and tissue, energy storage as fat cells, prevention of infection, recovery from injury, and the like. The fixed cells of the connective tissue are derived from the mesenchymal, but may include all of the bone cells of the bone tissue, the chondrocytes of the cartilage tissue, and the smooth muscle cells derived from the mesenchymal tissue contained in the same support tissue.
본 발명에서 상기 “연골”은 연골세포와 그것을 둘러싸는 다량의 기질로 된 뼈로 이것에 대해 보통 말하는 뼈는 경골이다. 기질의 구성성분에 따라 초자연골, 탄성연골, 섬유연골로 나눈다. 연골의 작용에는 관절의 골단을 덮는 관절연골에서 볼 수 있는 것처럼 골단의 마찰을 방지하는 외에 기관, 귓바퀴와 같이 탄력을 유지하거나, 늑연골, 치골결합 연골과 같이 압력에 대한 저항력을 주는 것 등을 들 수 있다.In the present invention, the "cartilage" is a bone made of chondrocytes and a large amount of substrate surrounding the bone, which is commonly referred to as tibia. Depending on the composition of the substrate, it is divided into supernatural bone, elastic cartilage, fibrocartilage. The effects of cartilage include the prevention of friction of the tip, as seen in the joint cartilage that covers the end of the joint, as well as maintaining elasticity, such as the trachea and the auricle, or resistance to pressure, such as the costal cartilage and pubic cartilage. Can be.
초자연골에서는 기질이 반투명하고, 언뜻 보아 균일하며 무구조로 보이나 수분이 많고(60 ~ 80%), 황산콘드로이틴을 가지는 복합단백질(무코이드)을 포함하며, 늑연골, 비연골, 후두연골, 관절연골, 기관연골 등이 속한다. 탄성연골은 기질 중에 탄성섬유가 들어 있어 쉽게 만곡되며, 귓바퀴 연골, 외이도, 후두개 등이 속한다. 섬유연골에는 많은 교원질섬유가 들어 있어, 추간원판연골, 치골결합연골, 관절원판(악관절, 흉쇄관절에 있음) 등이 속한다. In supernatural bone, the substrate is translucent, at first glance uniform and non-structured, but rich in moisture (60 to 80%), and contains complex protein (cooid) with chondroitin sulfate. Organ cartilage, etc. belong. Elastic cartilage is easily curved because it contains elastic fibers in the substrate, the ear cartilage, the ear canal, the larynx, etc. belong. Fibrous cartilage contains a lot of collagen fibers, intervertebral disc cartilage, interosseous cartilages, articular discs (in the jaw joint, sternal joint), etc. belong.
이러한 결합조직이 손상될 경우 스스로 회복 및 재생이 매우 제한되며, 의학적으로 여러 가지 방법이 시도되고 있지만 아직 관절연골인 초자 연골을 자연과 같은 상태로 회복하기에는 부족한 실정이다.When the connective tissue is damaged, recovery and regeneration of the self is very limited, and medically various methods have been tried, but it is still insufficient to restore the articular cartilage, which is the articular cartilage, to a natural state.
따라서 본 발명에서는 응고인자와 세포기질 안정제로 이루어진 응고인자 용액과, 응고인자를 응고물질로 가수분해하는 가교활성 촉매제와 골형성 증진제로 이루어진 가교활성 촉매용액을 포함하는 결합조직 재생용 조성물을 개발하였다.Therefore, the present invention has developed a composition for connective tissue regeneration comprising a coagulation factor solution consisting of a coagulation factor and a cell substrate stabilizer, a crosslinking activity catalyst solution for hydrolyzing the coagulation factor into a coagulation material, and a crosslinking activity catalyst solution comprising a bone formation enhancer. .
이에 본 발명은 보다 구체적으로 피브리노겐 용액과 히아루론산 용액으로 이루어진 응고인자 용액; 및 트롬빈 용액과 골형성 증진제로 이루어진 가교활성 촉매용액이 혼합되어 형성되는 것을 특징으로 하는 조직 재생용 조성물을 제공한다. 여기서 조성물을 구성하는 상기 응고인자 용액과 상기 가교활성 촉매용액은 액체 상태로 생체에 주입되어 생체 내에서 혼합되는 것이 바람직하다.The present invention is more specifically coagulation factor solution consisting of fibrinogen solution and hyaluronic acid solution; And it provides a composition for tissue regeneration characterized in that the cross-linking catalyst solution consisting of a thrombin solution and a bone formation enhancer is mixed. Here, the coagulation factor solution constituting the composition and the crosslinking active catalyst solution are preferably injected into the living body in a liquid state and mixed in the living body.
본 발명에서 상기 피브리노겐(fibrinogen)은 응고인자 역할을 하며, Factor ⅩⅢ을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 피브리노겐 용액으로 동결 건조 피브리노겐에 아프로티닌 용액을 넣어 녹인 용액을 사용할 수 있다.In the present invention, the fibrinogen serves as a coagulation factor, and preferably includes Factor III. As the fibrinogen solution, a solution in which an aprotinin solution is dissolved in freeze-dried fibrinogen may be used.
또한, 본 발명에서는 세포기질 안정제로서 생체적합성의 천연 고분자인 히아루론산(hyaluronic acid)을 사용할 수 있다. 히아루론산은 생체고분자 물질로 분자량이 5만 내지 1,300만 달톤에 이르는 무색 투명한 점도의 선형 다당류이며, β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 교대로 결합되어 있다. 이러한 히아루론산은 생체 결합조직의 기본물질로, 생체적합성을 갖으며, 조직 생성 시 세포의 이동에 유리하고 생체 내 효소에 의해 완전 분해되는 특성을 갖는다. 천연 히알루론산은 분자량에 비례한 다분성이지만, 종간 특이성을 갖지 않으며 또한 조직이나 장기특이성을 갖지 않아, 그 유래에 관계없이 생체에 이식 또는 주입한 경우에 우수한 생체적합성을 나타내는 것으로 알려져 있다. In addition, in the present invention, hyaluronic acid, which is a biocompatible natural polymer, may be used as the cell substrate stabilizer. Hyaluronic acid is a biopolymer, a colorless transparent viscosity linear polysaccharide with a molecular weight of 50,000 to 13 million daltons, and β-D-N-acetylglucosamine and β-D-glucuronic acid are alternately bonded. Such hyaluronic acid is a basic material of bio-connective tissue, has biocompatibility, is advantageous for cell migration during tissue generation, and is completely degraded by enzymes in vivo. Although natural hyaluronic acid is multi-modal in proportion to molecular weight, it does not have species specificity and has no tissue or organ specificity, and is known to exhibit excellent biocompatibility when implanted or injected into a living body regardless of its origin.
본 발명에서 사용가능한 히아루론산은 분자량이 150만 내지 300만 달톤인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고 분자량에 상관없이 사용할 수도 있으며, 히아루론산에 특정 잔기가 치환된 히아루론산 유도체 또는 히아루론산의 염 형태로 사용될 수 있다.The hyaluronic acid usable in the present invention preferably has a molecular weight of 1.5 million to 3 million daltons, but is not limited thereto, and may be used regardless of molecular weight, and may be used in the form of a hyaluronic acid derivative or a salt of hyaluronic acid in which a specific residue is substituted for hyaluronic acid. .
본 발명에 있어서 상기 “생체적합성”은 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성 및 혈액적합성을 의미하며, “생체적합성 고분자”란 이러한 생체적합성을 갖추고 있는 고분자를 의미한다. In the present invention, the term " biocompatible " means tissue compatibility and blood compatibility that do not cause tissue necrosis or blood coagulation by contacting with living tissue or blood, and " biocompatible polymer " means a biocompatible polymer it means.
본 발명에서 가교활성 촉매제로서 트롬빈을 사용할 수 있으며, 상기 트롬빈용액으로 동결 건조된 트롬빈에 염화칼슘(CaCl2)을 넣어 녹인 용액을 사용할 수 있다.In the present invention, thrombin may be used as a crosslinking catalyst, and a solution obtained by dissolving calcium chloride (CaCl 2 ) in lyophilized thrombin with the thrombin solution may be used.
상기 트롬빈은 혈액 응고에 관계되는 단백질 분해효소의 일종으로, 혈장 속에서는 프로트롬빈으로 존재하며, 출혈 시에 혈소판이 파괴되어 트롬보플라스틴이 혈장 중에 나오면 혈액의 칼슘이온의 존재 하에 활성화되어 트롬빈이 된다. 또한, 혈액 응고의 본질인 혈액 속의 가용성 피브리노겐을 가수분해하여 불용성인 피브린으로 변화시키는 반응을 촉매한다. 피브리노겐에 대한 기질 특이성이 매우 높고 피브리노겐의 4개의 펩티드 결합을 자르는데, 그 곳은 아르지닌과 글리신 잔기 사이이다. 최적 pH는 중성 또는 약알칼리성 부근이다. 주성분은 단백질로 최소분자량은 8,000이며 중합하기 쉬운 성질을 갖는다. The thrombin is a kind of proteolytic enzyme related to blood coagulation, and exists in the plasma as prothrombin. When platelets are destroyed during bleeding and thromboplastin comes out of plasma, thrombin is activated in the presence of calcium ions in the blood to become thrombin. It also catalyzes the reaction of hydrolyzing soluble fibrinogen in the blood, which is the essence of blood coagulation, to change to insoluble fibrin. The substrate specificity for fibrinogen is very high and the four peptide bonds of fibrinogen are cut, between the arginine and glycine residues. The optimum pH is near neutral or slightly alkaline. Its main component is protein, which has a minimum molecular weight of 8,000 and is easy to polymerize.
본 발명에서 골형성 증진제로는 아텔로콜라겐(atelocollagen)을 사용할 수 있으며, 상기 아텔로콜라겐은 중량 평균 분자량이 1,000 ~ 20,000 정도인 것을 사용하는 것이 바람직하나, 분자량에 상관없이 사용할 수 있다. In the present invention, as the bone formation enhancer, atelocollagen (atelocollagen) may be used, and the atelocollagen preferably has a weight average molecular weight of about 1,000 to 20,000, but may be used regardless of molecular weight.
상기 아텔로콜라겐은 콜라겐의 면역 반응을 일으키는 강력한 항원성이 있는 분자 말단에 존재하는 펩티드인 텔로 부분을 제거하여 체내 면역반응을 일으키는 요소를 제거한 것으로, 항원성이 없고, 생체적합성이 좋으며 단기간에 대사, 흡수되어 조직 생성 시 세포의 부착에 유리하고, 물리적 골격을 유지하게 된다.The atelocollagen is a peptide that is present at the terminal of the molecule having a strong antigenicity that causes the immune response of collagen, and removes the element that causes the body's immune response. It is absorbed and is advantageous for adhesion of cells during tissue formation, and maintains a physical skeleton.
한편, 본 발명에서는 골형성 증진제로 아텔로콜라겐 대신에 채취한 골수를 사용할 수도 있다. 골수는 통상적으로 사용하는 방법으로 채취할 수 있으며, 골수를 채취하는 주사기에는 항혈전제(헤파린, 시트릭산 등)가 포함되지 않아야 하는데, 이는 HyFibTM 시술시 피브린 응고반응을 방해할 수 있기 때문이다.Meanwhile, in the present invention, bone marrow collected in place of atelocollagen may be used as a bone formation enhancer. Bone marrow can be harvested by conventional methods, and syringes from which bone marrow is to be taken should not contain antithrombotic agents (heparin, citric acid, etc.), as they may interfere with the fibrin coagulation reaction during HyFib ™ .
본 발명에서는 피브리노겐 용액과 히아루론산 용액이 혼합되어 형성된 응고인자 용액은 피브리노겐 용액과 히아루론산 용액을 7 : 3 ~ 9 : 1로 혼합할 수 있다.In the present invention, in the coagulation factor solution formed by mixing the fibrinogen solution and the hyaluronic acid solution, the fibrinogen solution and the hyaluronic acid solution may be mixed at 7: 3 to 9: 1.
또한, 응고인자를 응고물질로 가수분해하는 가교활성 촉매제와 골형성 증진제가 혼합되어 형성된 가교활성 촉매용액은 트롬빈 용액과 골형성 증진제를 1 : 9 ~ 5 : 5로 혼합할 수 있다. 여기서, 골형성 증진제로 아텔로콜라겐을 사용하는 경우에는 트롬빈 용액과 아텔로콜라겐을 3 : 7 ~ 5 : 5로 혼합할 수 있으며, 골수를 사용하는 경우에는 트롬빈 용액과 골수를 1 : 9 ~ 3 : 7로 혼합할 수 있다.In addition, the crosslinking activity catalyst solution formed by mixing a crosslinking activity catalyst and a bone formation enhancer which hydrolyzes the coagulation factor to a coagulation material may mix the thrombin solution and the bone formation enhancer in a ratio of 1: 9 to 5: 5. Here, in the case of using atelocollagen as the bone formation enhancer, the thrombin solution and the atelocollagen may be mixed at 3: 7 to 5: 5, and when the bone marrow is used, the thrombin solution and the bone marrow may be 1: 9 to 3 : Can be mixed with 7.
나아가 본 발명에 따른 결합조직 재생용 조성물은 항균성 부여를 위해 항생제를 추가로 포함할 수도 있다. 항생제는 당업계에 세균의 생육과 활성을 저지 또는 억제할 수 있다고 알려진 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있으며, 대표적인 예로는 암피실린(ampicillin), 젠타마이신(gentamicin), 메틸파라벤(methyl paraben), 에틸파라벤(ethyl paraben), 페니실린(penicillin), 세팔로스포린(cephalosporin), 모노박탐(monobactam), 카바페넴(carbapenem), 아미노글리코사이드(aminoglycoside), 마크롤라이드(macrolide), 테트라사이클린(tetracycline), 클로르암페니콜(chloramphnicol), 퀴놀론(quinolone), 반코마이신(vancomycin), 테이코플라닌(teicoplanin), 린코사미드(lincosamide), 메트로니다졸(metronidazole), 설폰아미드(sulfonamide), 트리메소프림(trimethoprim) 및 이들의 염이 포함되고, 이들은 단독으로 또는 2종 이상의 혼합물 형태로 사용될 수 있다. 이때 항생제는 각 항생제가 표적으로 하는 세균의 생육 및 활성을 저지하거나 억제하는데 최적으로 알려진 농도로 사용할 수 있다.Furthermore, the composition for connective tissue regeneration according to the present invention may further include an antibiotic for imparting antimicrobial activity. Antibiotics can be used as long as they are known in the art to inhibit or inhibit the growth and activity of bacteria, and representative examples are ampicillin, gentamicin, methyl paraben, ethyl paraben, and ethyl paraben. paraben, penicillin, cephalosporin, monoobactam, carbapenem, aminoglycoside, macrolide, tetracycline, chloramphenyline Chloramphnicol, quinolone, vancomycin, teicoplanin, teicoplanin, lincosamide, metronidazole, sulfonamide, trimethoprim and their Salts are included and they can be used alone or in the form of mixtures of two or more. Antibiotics may be used at concentrations best known to inhibit or inhibit the growth and activity of the bacteria targeted by each antibiotic.
한편, 본 발명은 결합조직을 재생하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 결합조직을 재생하는 방법은 피브리노겐 용액과 히아루론산 용액을 혼합하여 응고인자 용액을 제조하는 단계; 트롬빈 용액과 골형성 증진제를 혼합하여 가교활성 촉매용액을 제조하는 단계; 및 상기 응고인자 용액과 가교활성 촉매용액을 손상 조직부위에 주입하여 3 ~ 10분간 겔화시키는 단계를 포함한다.On the other hand, the present invention provides a method for regenerating connective tissue. Method for regenerating connective tissue according to the present invention comprises the steps of mixing the fibrinogen solution and hyaluronic acid solution to prepare a coagulation factor solution; Preparing a crosslinking catalyst solution by mixing a thrombin solution and a bone formation promoter; And gelling for 3 to 10 minutes by injecting the coagulation factor solution and the crosslinking active catalyst solution into the damaged tissue.
상기 피브리노겐 용액은 동결건조 피브리로겐에 아프로티닌을 주입해 녹여 제조할 수 있으며, 상기 트롬빈 용액은 동결건조된 트롬빈에 염화칼슘을 주입해 녹여 제조할 수 있다.The fibrinogen solution may be prepared by injecting and melting aprotinin into lyophilized fibrinogen, and the thrombin solution may be prepared by injecting calcium chloride into lyophilized thrombin.
나아가 본 발명은 피브리노겐 용액과 히아루론산 용액으로 이루어진 응고인자 용액; 및 트롬빈 용액과 골형성 증진제로 이루어진 가교활성 촉매용액이 혼합되어 형성되는 것을 특징으로 하는 조직 재생용 조성물을 포함하는 결합조직 손상 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 결합조직 손상 치료용 조성물은 두개안면, 귓바퀴, 코, 관절 등의 외상, 선천기형, 이물 제거부, 노화에 따른 변성 등에 의해 발생된 연골 결손부의 수복에 유용하게 사용될 수 있다.Furthermore, the present invention provides a coagulation factor solution consisting of a fibrinogen solution and a hyaluronic acid solution; And it provides a composition for treating connective tissue damage comprising a composition for tissue regeneration characterized in that the mixture is formed of a cross-linking catalyst solution consisting of a thrombin solution and a bone formation enhancer. The composition for treating connective tissue damage according to the present invention can be usefully used for repairing cartilage defects caused by trauma of the skull, auricle, nose, joints, congenital malformations, foreign body removal, degeneration due to aging, and the like.
본 발명에 따르면 결합조직의 손상 부위, 특히 낮은 재생 활성을 갖는 연골을 효과적으로 재생시킬 수 있으며, 천연물질을 사용하므로 인체에 무해하며, 자연 연골과 유사한 조직공학적 연골을 재생하여 손상된 연골조직을 효과적으로 수복할 수 있는 연골 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.According to the present invention, it is possible to effectively regenerate damaged areas of the connective tissue, in particular cartilage having a low regeneration activity, harmless to the human body by using natural materials, and effectively repair damaged cartilage tissue by regenerating histological cartilage similar to natural cartilage. It can be usefully used as a therapeutic agent for cartilage.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to these examples.
<< 실시예Example 1> 1>
<1-1> 응고인자 용액의 준비<1-1> Preparation of Coagulation Factor Solution
아프로티닌 용액 1mL을 동결건조된 피브리노겐 병에 주입하여 녹인 후(100mg/1mL), 주사기 A에 용해된 피브리노겐 용액 0.8mL을 흡입하여 채운다. syringe connector를 이용하여 히아루론산 0.2mL을 새로운 3mL 주사기에 충진하고, syringe connector가 장착된 상태에서 히아루론산이 들어있는 3mL 주사기를 주사기 A와 결합시킨 후 10회 이상 왕복시켜 용액을 완전히 혼합한 다음 모든 용액을 주사기 A로 옮긴다. 이렇게 준비가 끝난 주사기 A를 two-way applicator에 장착하였다.Inject 1 mL of aprotinin solution into the lyophilized fibrinogen bottle to dissolve it (100 mg / 1 mL), and then inhale and fill 0.8 mL of the fibrinogen solution dissolved in Syringe A. Fill a new 3 mL syringe with 0.2 mL of hyaluronic acid using the syringe connector, combine the 3 mL syringe containing hyaluronic acid with syringe A with the syringe connector, and reciprocate at least 10 times to thoroughly mix the solution, and then Transfer to syringe A. Thus prepared syringe A was mounted in a two-way applicator.
<1-2> <1-2> 가교활성Crosslinking activity 촉매용액의 준비 Preparation of Catalyst Solution
다음으로, CaCl2 용액 1mL을 동결건조된 트롬빈 병에 주입하여 녹인 후, 주사기 B에 용해된 트롬빈 용액 0.4mL을 흡입하여 채운다. syringe connector를 이용하여 아텔로콜라겐 0.6mL을 새로운 3mL 주사기에 충진하고, syringe connector가 장착된 상태에서 아텔로콜라겐이 들어있는 3mL 주사기를 주사기 B와 결합시킨 후 10회 이상 왕복시켜 용액을 완전히 혼합한 다음 모든 용액을 주사기 B로 옮긴다. 이렇게 준비가 끝난 주사기 B를 two-way applicator에 장착하였다.Next, 1 mL of CaCl 2 solution is injected into a lyophilized thrombin bottle to dissolve, followed by inhaling 0.4 mL of the thrombin solution dissolved in the syringe B. Fill the new 3 mL syringe with 0.6 mL of atelocollagen using the syringe connector. Combine the 3 mL syringe containing atelocollagen with syringe B with the syringe connector and reciprocate at least 10 times to thoroughly mix the solution. Then transfer all solution to syringe B. Thus prepared syringe B was mounted on a two-way applicator.
<1-3> 연골 조직에 주입<1-3> injection into cartilage tissue
다음으로, Long needle을 장착하고 주사기 A와 B의 용액을 연골 손상 부위에 주입하고, 5분 후 겔화 정도를 확인하였다.Next, a long needle was mounted and the solutions of the syringes A and B were injected into the cartilage damage site, and after 5 minutes, the degree of gelation was confirmed.
<< 실시예Example 2> 2>
<2-1> 응고인자 용액의 준비<2-1> Preparation of Coagulation Factor Solution
아프로티닌 용액 1mL을 동결건조된 피브리노겐 병에 주입하여 녹인 후(100mg/1mL), 주사기 A에 용해된 피브리노겐 용액 0.8mL을 흡입하여 채운다. syringe connector를 이용하여 히아루론산 0.2mL을 새로운 3mL 주사기에 충진하고, syringe connector가 장착된 상태에서 히아루론산이 들어있는 3mL 주사기를 주사기 A와 결합시킨 후 10회 이상 왕복시켜 용액을 완전히 혼합한 다음 모든 용액을 주사기 A로 옮긴다. 이렇게 준비가 끝난 주사기 A를 two-way applicator에 장착하였다.Inject 1 mL of aprotinin solution into the lyophilized fibrinogen bottle to dissolve it (100 mg / 1 mL), and then inhale and fill 0.8 mL of the fibrinogen solution dissolved in Syringe A. Fill a new 3 mL syringe with 0.2 mL of hyaluronic acid using the syringe connector, combine the 3 mL syringe containing hyaluronic acid with syringe A with the syringe connector, and reciprocate at least 10 times to thoroughly mix the solution, and then Transfer to syringe A. Thus prepared syringe A was mounted in a two-way applicator.
<2-2> <2-2> 가교활성Crosslinking activity 촉매용액의 준비 Preparation of Catalyst Solution
다음으로, CaCl2 용액 1mL을 동결건조된 트롬빈 병에 주입하여 녹인 후, 주사기 B에 용해된 트롬빈 용액 0.2mL을 흡입하여 채운다. syringe connector를 이용하여 채취한 골수 0.8mL을 새로운 3mL 주사기에 충진하고, syringe connector가 장착된 상태에서 골수가 들어있는 3mL 주사기를 주사기 B와 결합시킨 후 10회 이상 왕복시켜 용액을 완전히 혼합한 다음 모든 용액을 주사기 B로 옮긴다. 이렇게 준비가 끝난 주사기 B를 two-way applicator에 장착하였다.Next, 1 mL of CaCl 2 solution is injected into a lyophilized thrombin bottle to dissolve, followed by inhaling 0.2 mL of the thrombin solution dissolved in the syringe B. Fill the new 3 mL syringe with 0.8 mL of bone marrow collected using the syringe connector, combine the 3 mL syringe containing bone marrow with syringe B with the syringe connector, and reciprocate at least 10 times to thoroughly mix the solution. Transfer the solution to syringe B. Thus prepared syringe B was mounted on a two-way applicator.
<2-3> 연골 조직에 주입<2-3> injection into cartilage tissue
다음으로, Long needle을 장착하고 주사기 A와 B의 용액을 연골 손상 부위에 주입하고, 5분 후 겔화 정도를 확인하였다.Next, a long needle was mounted and the solutions of the syringes A and B were injected into the cartilage damage site, and after 5 minutes, the degree of gelation was confirmed.
<< 실시예Example 3> 3>
본 발명에 따른 결합조직 재생용 조성물의 처리Treatment of the composition for connective tissue regeneration according to the present invention
본 발명자들은 본 발명에 따른 결합조직 재생용 조성물에 의한 연골손상 회복력을 확인하기 위해 다음과 같이 동물모델을 대상으로 실험을 수행하였다.The present inventors performed experiments on animal models as follows to confirm the cartilage damage resilience by the composition for connective tissue regeneration according to the present invention.
<3-1> 동물모델 준비<3-1> Animal Model Preparation
6주령 된 4kg의 뉴질랜드 화이트 토끼 21마리를 모두 동일 조건 하에서 사육시킨 후, 이중 7 마리는 히아루론산과 피브린이 혼합된 혼합용액(MH)을 사용하여 연골시술 하였고, 다른 7마리는 히아루론산, 피브린 및 골수세포가 혼합된 혼합용액(MBH)을 사용하여 연골시술 하였으며, 다른 7마리는 대조군으로 사용하기 위해 아무 처리를 하지 않았다. 상기 실험에 사용한 동물들은 Institutional Review Board의 승인하게 수행하였고, 모든 실험은 ILAR(Institute of Laboratory animal resources) 지침에 따라 수행하였다.All 21 6-week-old 4 kg New Zealand white rabbits were bred under the same conditions, and 7 of them were cartilage-treated using a mixed solution of hyaluronic acid and fibrin (MH), and the other 7 were hyaluronic acid, fibrin and bone marrow. Cartilage was performed using a mixed solution (MBH) mixed with cells, and the other seven were not treated for use as a control. Animals used in the experiments were performed with the approval of the Institutional Review Board, and all experiments were performed according to the Institute of Laboratory Animal Resources (ILAR) guidelines.
<3-2> 수술방법<3-2> Surgical Method
상기 <3-1>에서 준비된 동물들은 35mg/kg의 케타민 하이드로클로라이드(ketamine hydrochloride) 및 5mg/kg의 xylazine의 혼합액을 사용하여 마취시킨 후, 등을 바닥에 위치시켰다. Animals prepared in <3-1> were anesthetized using a mixture of 35 mg / kg ketamine hydrochloride and 5 mg / kg xylazine, and the back was placed on the floor.
이후 모두 마취시킨 후 통증을 못느끼는 상태에서, 종단으로 중간 피부를 절개하고 경골 무릎 뼈 위쪽으로 3cm정도 되도록 확장시킨 다음, 피부 절개 라인에 따라 피하조직을 절개하였다. 이후 대퇴사 두근건(quadriceps tendon), 슬개골의 내측연 (medial border of the patella) 및 슬개건의 내측연 (medial border of the patella tendon)을 따라 절개를 하고나서 슬개골을 외측으로 탈구 시켜서 대퇴골의 원위 관절면이 보이도록 하였다. After all of the anesthesia, the pain was not felt, the middle skin was dissected to the end and extended to about 3cm above the tibial knee bone, and the subcutaneous tissue was dissected along the skin incision line. After the incision along the quadriceps tendon, the medial border of the patella, and the medial border of the patella tendon, the distal joint surface of the femur is dislocated outward. Made it visible.
<3-2-1> 손상부위 제조<3-2-1> Damaged Part Manufacturing
상기 준비된 동물을 대상으로 도 3에 나타낸 바와 같이, 연골조직의 손상을 유도하였는데, 약 4mm의 직경 및 2mm의 깊이로 연골 하골에 손상 분위를 만들었다(도 3a 참조). 그리고 23 G-바늘을 이용하여 3개의 구명을 연골 하골에 만들었다(도 3b 참조).As shown in FIG. 3 of the prepared animals, damage to the cartilage tissue was induced, and an injured portion of the cartilage was made at a diameter of about 4 mm and a depth of 2 mm (see FIG. 3A). And three life preservers were made in the cartilage lower bone using 23 G-needle (see Figure 3b).
<3-2-2> 히아루론산 및 피브린 혼합물의 주입<3-2-2> Injection of Hyaluronic Acid and Fibrin Mixture
히아루론산 및 피브린 혼합물 주입에 의한 연골 손상 회복을 관찰하기 위해, 먼저 손상된 상기 동물 모델의 연골 하골 부위에 2개의 1ml 주사기 및 Y-형태의 믹싱 카테터를 사용하여 수행하였는데, 먼저 1ml의 주사기에는 피브리노겐을 채우고, 다른 1ml의 주사기에는 0.2ml의 히아루론산 및 0.8ml의 트롬빈을 채웠다(도 4에서 a 도면 참조). 이후 히아루론산과 피브리노겐을 채운 상기 2개의 주사기 속의 용액을 손상 부위에 천천히 주입시켰다. 또한 이때 상기 용액이 흘러 넘치지 않게 하기 위해 손상 부위에서 상기 용액을 주입을 5분 동안 유지시켰다. 이후 손상 부위는 피부 조직으로 덮었고, 이식 실패 여부의 측정은 무릎의 굽힘과 펴기 동작을 3회 반복수행하여 측정하였다.In order to observe the repair of cartilage damage by injection of a mixture of hyaluronic acid and fibrin, it was first performed using two 1 ml syringes and a Y-shaped mixing catheter in the injured cartilage area of the damaged animal model, first of which 1 ml syringe was filled with fibrinogen and Another 1 ml syringe was filled with 0.2 ml of hyaluronic acid and 0.8 ml of thrombin (see figure a in FIG. 4). Then, the solution in the two syringes filled with hyaluronic acid and fibrinogen was slowly injected into the damaged area. In addition, the solution was maintained for 5 minutes at the site of injury so that the solution did not overflow. After that, the damaged area was covered with skin tissue, and the measurement of graft failure was performed by performing three times of bending and straightening of the knee.
<3-2-3> 히아루론산 및 골수세포의 혼합물 주입<3-2-3> Injection of a mixture of hyaluronic acid and bone marrow cells
상기 동물모델을 대상으로 한 실험을 통해 노출된 경골의 내측면으로부터 3ml의 골수세포를 18 게이지 바늘을 이용하여 빠르게 10ml의 주사기로 흡입시켰다. 이후 수득한 상기 골수세포는 동일 부피의 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline; Gibco, NY, USA)와 혼합하였다. 이후 골수세포가 함유된 용액을 재 현탁시킨 다음, Ficoll-Plaque Premium(density 1.0777g/ml; GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, 스웨덴) 위에 천천히 로딩한 후, 1153g의 속도로 20분 동안 4℃에서 원심분리 하였다. 이후 적혈구를 제외한 세포와 혈장층을 얻었다. 그런 뒤, 2개의 주사기를 대상으로 1개의 주사기에는 0.8ml의 피브리노겐 및 0.2ml의 히아루론산 용액을 채우고, 다른 1개의 주사기에는 0.8ml의 상기 방법으로 수득한 골수유래 적혈구를 제외한 세포와 혈장층 및 0.2ml의 트롬빈으로 채웠다. 즉, 본 발명에서 사용한 상기 골수세포는 단순한 골수세포가 아니라 토끼로부터 추출된 골수를 대상으로 원심분리하여 적혈구를 제외한 세포와 혈장층으로 이루어진 것을 사용하였다. 상기 2개의 주사기 안에 함유된 용액은 천천히 연골 손상 부위에 주입하였다(도 4에서 b 도면 참조).Through experiments with the animal model, 3ml of myeloid cells were rapidly aspirated with a 10ml syringe using an 18 gauge needle from the medial side of the exposed tibia. The obtained bone marrow cells were then mixed with the same volume of DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline; Gibco, NY, USA). After resuspending the solution containing the bone marrow cells, and then slowly loaded on Ficoll-Plaque Premium (density 1.0777g / ml; GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, Sweden), 4 ℃ for 20 minutes at a rate of 1153g Centrifugation at Since cells and plasma layers except red blood cells were obtained. Then, one syringe is filled with 0.8 ml of fibrinogen and 0.2 ml of hyaluronic acid solution in one syringe, and the other syringe contains cells and plasma layer and 0.2 except bone marrow-derived erythrocytes obtained by the above method. Filled with ml thrombin. That is, the bone marrow cells used in the present invention were not simply bone marrow cells, but were composed of cells and plasma layers except for red blood cells by centrifugation for bone marrow extracted from rabbits. The solution contained in the two syringes was slowly injected into the cartilage injury site (see b diagram in FIG. 4).
<< 실시예Example 4> 4>
본 발명에 따른 결합조직 재생용 조성물 처리에 따른 연골손상 부위의 회복력 분석Analysis of resilience of cartilage damage in accordance with the treatment composition for connective tissue regeneration according to the present invention
앞서 수행한 연골 조직이 손상된 토끼모델을 대상으로 본 발명에 따른 결합조직 재생용 조성물을 처리한 후, 상기 조성물 처리에 의해 연골손상 부위가 회복되는지를 확인하기 위해 다음과 같은 실험들을 수행하였다.After treating the composition for connective tissue regeneration according to the present invention in the rabbit model of the cartilage tissue in which the cartilage tissue was damaged, the following experiments were performed to determine whether the cartilage damage site was recovered by the composition treatment.
<4-1> 관찰 분석<4-1> Observational Analysis
상기 실시예 <3-1>에서 3개의 그룹으로 나눈 토끼들을 대상으로 8주, 12주 및 24주 동안 각 조성물을 처리하고 사육한 다음, 그룹당 2마리씩을 치사시키고, 연골 손상 부위와 정상 조직 부분을 각각 적출한 후, 조직의 변화 정도를 관찰하였다. 새로 발생된 연골은 정상 조직과 비교하였다. The rabbits divided into three groups in Example <3-1> were treated and bred for 8, 12, and 24 weeks of each composition, and then killed 2 animals per group, and the cartilage damage site and the normal tissue part. After each extraction, the degree of tissue change was observed. Newly developed cartilage was compared with normal tissue.
그 결과, 본 발명에 따른 히아루론산, 피브린 및 골수세포가 혼합된 혼합용액(MBH)을 처리한 군의 경우 손상된 연골 조직이 거의 온전하게 회복되는 것으로 나타났고, 조직 표면도 균일한 모양인 것으로 관찰되었으며, 정상 조직과 잘 연결되어 있는 것으로 나타났고, 연골의 색깔도 정상과 유사한 색을 띄는 것으로 나타났다(도 5의 a~c 참고). 또한, 히아루론산과 피브린이 혼합된 혼합용액(MH)을 처리한 군의 경우, 비록 조직 표면이 조금 불규칙 적이지만 연골 손상부위가 회복되는 것으로 나타났다(도 5의 d~f 참고). 반면, 연골 손상된 부위에 아무것도 처리하지 않은 대조군의 경우 새로운 조직에 의한 손상 조직의 회복은 전혀 일어나지 않는 것으로 나타났고, 새로 형성된 조직은 표면이 불규칙한 흰색의 섬유 형태인 것으로 관찰되었다(도 5의 g~i 참조).As a result, in the group treated with the mixed solution (MBH) mixed with hyaluronic acid, fibrin and bone marrow cells according to the present invention, the damaged cartilage tissue was recovered almost intact, and the tissue surface was observed to have a uniform shape. It was shown to be well connected to normal tissue, and the color of cartilage was also shown to have a color similar to that of normal (see Fig. 5a ~ c). In addition, in the case of the group treated with the mixed solution (MH) mixed with hyaluronic acid and fibrin, although the surface of the tissue is a little irregular, the cartilage damage site was found to recover (see d ~ f of Figure 5). On the other hand, in the control group treated with nothing at the site of cartilage damage, the recovery of damaged tissue by the new tissue did not occur at all, and the newly formed tissue was observed to have a irregular white fiber form (Fig. 5 g ~). i).
<4-2> 조직학적 점수 분석<4-2> Histological Score Analysis
연골 조직이 손상된 토끼 모델들을 대상으로 본 발명에 따른 조성물을 각각 주입시키고 24시간 동안 사육한 상기 토끼들을 대상으로, 조직손상의 정도를 연골조직의 색깔 및 조직표면의 평탄함(smoothness)을 관찰하여 분석하였고, 신생연골의 두께를 측정하였다.In rabbit models in which cartilage tissues were injured and injected with the composition according to the present invention, and reared for 24 hours, the extent of tissue damage was analyzed by observing the color of the cartilage tissue and the smoothness of the tissue surface. The thickness of the new cartilage was measured.
분석결과, 상기 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이, MBH와 M을 처리한 군의 경우 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났으며, 특히, 본 발명에 따른 히아루론산, 피브린 및 골수세포가 혼합된 혼합용액(MBH)을 처리한 군에서는 조직의 색깔, 표면 평탄함, 및 신생 연골의 두께가 거의 완벽하게 회복되는 것으로 나타났다(도 6 참조). 반면, 대조군의 경우 모든 평가항목에서 손상된 조직이 회복되지 않는 것으로 나타났다(도 8 참조). 히아루론산과 피브린이 혼합된 혼합용액(MH)을 처리한 군은 MBH에 의한 효과에 미치지는 못하지만 손상된 조직이 회복되는 것으로 나타났다(도 7 참조). As a result of the analysis, as shown in Table 1 and Table 2, there was a significant difference in the group treated with MBH and M, in particular, the mixed solution of hyaluronic acid, fibrin and bone marrow cells mixed according to the present invention In the group treated with (MBH), the color of the tissue, the surface flatness, and the thickness of the new cartilage were found to almost completely recover (see FIG. 6). On the other hand, in the control group, it was found that the damaged tissues did not recover in all evaluation items (see FIG. 8). The group treated with the mixed solution (MH) mixed with hyaluronic acid and fibrin was found to recover the damaged tissues, although not affected by the effects of MBH (see FIG. 7).
<4-3> 조직염색법에 의한 분석<4-3> Analysis by tissue staining method
상기 실시예에서 사용한 각 그룹별 토끼들로부터 신생연골과 정상연골을 각각 적출한 후, 3.7%의 중성 포르말린 용액에 고정시켰다. 이후 각 연골 샘플들은 포름산:질산:H2O=25:5:70으로 혼합된 용액에 침지시켜 칼슘을 제거하였다. 이후 50% 소듐 설페이트 용액(sodium sulfite solution)에서 중성화 시키고 물로 세척하였다. 이후 50, 60, 70, 80, 90 및 95%의 에탄올 용액에서 1시간 동안 순차적으로 각각 침지시키고 100% 에탄올 용액을 이용하여 탈수시켰다. 그런 뒤 크실렌 용액에 담그고 파라핀이 스며들게 한 다음, 절편화 시켰고 절편들은 조직염색법으로 염색하였다. 즉, 각 절편들은 헤마토크실렌 및 에오신을 사용하여 염색함으로써 조직의 형상을 관찰하였고, 톨루딘 블루 및 사프라닌 O를 사용하여 GAG 함량 뿐만 아니라 연골의 콜라겐을 관찰하였다. 총 5개 항목인 세포모양(형태), 매트릭스 염색, 표면 균일성, 신생연골의 두께 및 이식된 조직의 온정성에 대해 측정하였다.New cartilage and normal cartilage were extracted from the rabbits of each group used in the above example, and then fixed in 3.7% neutral formalin solution. Each cartilage sample was then immersed in a solution mixed with formic acid: nitric acid: H 2 O = 25: 5: 70 to remove calcium. It was then neutralized in 50% sodium sulfite solution and washed with water. Subsequently, each of them was sequentially immersed in 50, 60, 70, 80, 90 and 95% ethanol solution for 1 hour and dehydrated using 100% ethanol solution. It was then immersed in xylene solution, paraffin infiltrated, sectioned and sections were stained by tissue staining. That is, each section was stained with hematoxylene and eosin to observe the shape of the tissue, and toludine blue and safranin O were used to observe collagen of cartilage as well as GAG content. A total of five items, cell shape (morphology), matrix staining, surface uniformity, thickness of new cartilage and warmth of transplanted tissue were measured.
그 결과, MBH 및 MH 용액을 주입한 군은 신생연골이 생겨나는 것으로 나타났고 신생연골의 두께도 인접한 관절연골과 거의 유사한 정도인 것으로 관찰되었다. 또한, 이식된 연골 및 원래 존재하였던 연골 간에도 부서짐과 격차없이 순조롭게 이행되는 것으로 나타났다(도 6 및 도 7 참조).As a result, the group injected with MBH and MH solution showed that new cartilage was formed and the thickness of the new cartilage was observed to be almost similar to that of adjacent articular cartilage. In addition, the transplanted cartilage and the cartilage that originally existed were found to be smoothly performed without breakage and gap (see FIGS. 6 and 7).
반면, 아무것도 처리하지 않은 대조군의 경우, 손상된 조직에서 조직회복이 일어나지 않는 것으로 나타났고 손상된 상태 그대로 존재하고 있는 것으로 나타났다(도 8 참조). 또한 톨루딘 블루 염색 방법으로 통해 확인한 결과, 대조군의 경우 단지 이식된 부위가 매우 적게 염색된 것으로 나타난 반면, MBH 및 MH 용액을 주입한 군은 정상 연골과 유사하게 염색된 부분이 확장되어 있는 것으로 나타났다.On the other hand, the control group was not treated with anything, it was shown that tissue recovery does not occur in the damaged tissue and remained intact (see FIG. 8). In addition, the control group showed that only the transplanted area was stained very little in the control group, whereas the group injected with MBH and MH solution had an enlarged portion similar to normal cartilage. .
<4-4> <4-4> 면역조직염색화학법에In immunohistostaining chemistry 의한 분석 Analysis
상기 <4-3>에서 수행한 샘플과 동일한 샘플을 대상으로 면역조직염색화학법을 수행하였는데, 콜라겐 타입 I에 대한 항체로 IH11을, 콜라겐 타입 II에 대한 항체로 CIIC1을 사용하였다. IH11 및 CIIC1은 각각 10% DMEM 배지를 이용하여 반응시켰으며 배양 배지는 원심분리하여 분리하였다. 닷-블롯 분석을 이후 수행하였는데 이는 적절한 항체의 반응 농도를 결정하기 위해 수행한 것이다. 또한 유니버셜 항체인 ABC 키트(Vector, Burlingame, UK)를 이차 항체로 사용하엿으며, DAB 시약을 사용하여 발색 관찰하였다.Immunohistochemical staining was performed on the same sample as in <4-3>, using IH11 as an antibody against collagen type I and CIIC1 as an antibody against collagen type II. IH11 and CIIC1 were each reacted with 10% DMEM medium and the culture medium was separated by centrifugation. Dot-blot analysis was then performed to determine the reaction concentration of the appropriate antibody. In addition, the universal antibody ABC kit (Vector, Burlingame, UK) was used as a secondary antibody, and color development was observed using DAB reagent.
그 결과, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 콜라겐 타입 I은 모든 샘플에서 발현되지 않는 것으로 나타났고, 단지 콜라겐 타입 II만이 발현되는 것으로 관찰되었는데, 새로 형성된 연골 조직에서는 콜라겐 타입 II가 살짝 감소된 것으로 나타났다.As a result, as shown in FIGS. 6 and 7, collagen type I was found not to be expressed in all samples, and only collagen type II was observed, and collagen type II was slightly reduced in newly formed cartilage tissue. Appeared.
<< 실시예Example 5> 5>
본 발명의 결합조직 재생용 조성물에 의한 미세구조(Microstructure by the composition for regenerating connective tissue of the present invention ( microstructuremicrostructure )의 전자현미경 분석Electron microscope analysis
나아가 본 발명자들은 본 발명에 따른 결합조직 재생용 조성물로 형성된 조직의 미세구조(microstructure;MSC)에 대해 전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 이를 위해 먼저 본 발명에 따른 히아루론산, 피브린 및 골수세포가 혼합된 혼합용액(MBH)을 24웰 플레이트에 주입하고 이후 0.5ml의 연골분화배지를 첨가하였다. 연골분화배지는 10mg의 TGF-3, 25g/ml의 아스코르브산, 25M의 아스코르브산-2-포스페이트, 100U/ml페니실린, 100g/ml스트렙토마이신 및 1%(v/v)ITS 플러스를 포함하는 DMEM-HG (Dulbecco's modified, Eagle's medium-ho호 glucose)배지로 이루어져 있다. 24웰 플레이트는 5일 동안 배양하였고, 상기 혼합물들은 전자현미경을 통해 관찰하였다. 또한, 히알루론산 및 피브린을 포함하는 MSC의 형태 분석을 위해 SEM(Scanning electron microscopy) 및 TEM(transmission electron microscopy)를 사용하였는데, 상기 혼합물을 4% 파라포름알데히드 및 2.5% 글루타알데히드가 함유된 0.1M 포스페이트 버퍼 상에서 밤새도록 고정시키고, 0.1M 포스페이트 버퍼로 세척한 후, 1% osmium teroxide가 포함된 상기 동일 버퍼로 추가 고정시켰다. 이후 에틸 알콜 및 아세톤을 사용하여 탈수 처리하고, TEM 작업을 위해 Epon 812(에폭시 레진)로 임베드하였다. 미세 두께의 절편은(70~80nm)은 울트라마이크로톰(Leica Ultracut UCT, Germany)를 사용하여 얻었고, 유라닐(uranyl) 아세테이트/리드 시트레이트로 이중 염색한 후, 60kV에서 JEM 1010 유닛을 사용하여 분석하였다. 탈수처리 후, 각 샘플은 HMDS(hexametyldisilazane)로 옮기고 SEM 분석을 위해 공기중에서 건조시켰다. 이후 모든 샘플들은 sputter coater로 금을 코팅시켰고 JSM-5410LV 유닛으로 분석하였다. SEM은 15kV에서 수행하였다.Furthermore, the present inventors observed by using an electron microscope for the microstructure (MSC) of the tissue formed from the composition for connective tissue regeneration according to the present invention. To this end, first, a mixed solution (MBH) mixed with hyaluronic acid, fibrin and bone marrow cells according to the present invention was injected into a 24-well plate, and then 0.5 ml of cartilage differentiation medium was added. Cartilage differentiation medium contains 10 mg TGF-3, 25 g / ml ascorbic acid, 25 M ascorbic acid-2-phosphate, 100 U / ml penicillin, 100 g / ml streptomycin and 1% (v / v) ITS plus -HG (Dulbecco's modified, Eagle's medium-ho glucose) medium. 24-well plates were incubated for 5 days and the mixtures were observed via electron microscopy. In addition, scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) were used for the morphology analysis of MSCs including hyaluronic acid and fibrin, the mixture containing 0.1% containing 4% paraformaldehyde and 2.5% glutaaldehyde. Fixed overnight on M phosphate buffer, washed with 0.1 M phosphate buffer and then further fixed with the same buffer containing 1% osmium teroxide. It was then dehydrated with ethyl alcohol and acetone and embedded into Epon 812 (epoxy resin) for TEM operation. Fine-thick sections (70-80 nm) were obtained using Ultramicrotome (Leica Ultracut UCT, Germany), and double stained with uranyl acetate / lead citrate and analyzed using JEM 1010 units at 60 kV. It was. After dehydration, each sample was transferred to hexametyldisilazane (HMDS) and dried in air for SEM analysis. All samples were then coated with gold with a sputter coater and analyzed on a JSM-5410LV unit. SEM was performed at 15 kV.
분석 결과, 도 9 에 나타낸 바와 같이, SEM 분석을 통해 본 발명에 의해 주입된 골수세포는 구조물의 다공 표면에 잘 부착하는 것으로 나타났고, 200~1000nm의 직경을 갖는 섬유형 폴리머 구조물이 기공 내부에 존재하는 것으로 관찰되었다. 이러한 섬유형, 다공형의 구조는 피브린이 히아루론산과 다양한 폴리머화에 의해 형성되는 것이다. As a result, as shown in Figure 9, through the SEM analysis, the bone marrow cells injected by the present invention appeared to adhere well to the porous surface of the structure, the fibrous polymer structure having a diameter of 200 ~ 1000nm inside the pores It was observed to exist. This fibrous, porous structure is one in which fibrin is formed by various polymerization with hyaluronic acid.
또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, TEM 분석 결과, 새로이 합성된 콜라겐 분자와 세포들은 지지체 안에 잘 도입되는 것으로 나타났고, 지지체 내부에서 세포의 미세 운동도 관찰되었으며 이것은 활동성 콜라겐의 형성이 이루어졌음을 나타낸다.In addition, as shown in FIG. 10, TEM analysis showed that newly synthesized collagen molecules and cells were well introduced into the support, and micromovement of the cells was observed inside the support, indicating that active collagen was formed. .
<< 실시예Example 6> 6>
임상실험을 통해 본 발명의 결합조직 재생용 조성물의 손상조직 회복력 분석Damaged tissue recovery of the connective tissue regeneration composition of the present invention through clinical trials
본 발명자들은 본 발명에서 제공하는 결합조직 재생용 조성물이 정말 손상된 조직 회복력이 있는지 확인하기 위해 연골 손상된 41세의 남성 환자를 대상으로 히아루론산, 피브린 및 골수세포가 혼합된 혼합용액(MBH)을 주입하고, 손상조직의 회복력을 관찰하였다. 여기서 상기 골수세포는 사람 유래의 골수(약 25ml)를 대상으로 원심분리한 다음, 세포층과 혈장층을 합쳐 약 1ml 정도를 취한 후, 이 중 약 0.8ml을 사용하였다. MBH의 주입을 보다 상세히 설명하면, 먼저 2개의 주사기를 대상으로 1개의 주사기에는 0.8ml의 피브리노겐 및 0.2ml의 히아루론산 용액을 채우고, 다른 1개의 주사기에는 상기 방법으로 수득한 골수유래 세포층과 혈장층(즉, 본 발명에 따른 조성물에 함유된 골수세포) 0.8ml 및 0.2ml의 트롬빈으로 채웠다. 이후 상기 2개의 주사기를 사용하여 주사기 안에 함유된 용액을 천천히 연골 손상 부위에 주입하였다. The present inventors injected a mixed solution (MBH) mixed with hyaluronic acid, fibrin and bone marrow cells to a 41-year-old male patient with cartilage injury to determine whether the composition for regenerating connective tissue provided by the present invention is really damaged tissue. The recovery of damaged tissues was observed. Here, the bone marrow cells were centrifuged from human-derived bone marrow (about 25 ml), and then, about 1 ml of the cell and plasma layers were combined, and about 0.8 ml was used. In more detail, the injection of MBH is performed by first filling two syringes with 0.8 ml of fibrinogen and 0.2 ml of hyaluronic acid solution, and the other syringe with bone marrow-derived cell layer and plasma layer obtained by the above method. That is, the bone marrow cells contained in the composition according to the present invention) were filled with 0.8 ml and 0.2 ml of thrombin. The two syringes were then used to slowly inject the solution contained in the syringe into the cartilage injury site.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 수술전 처리로 본 발명의 조성물을 처리하고 1년의 시간이 경과한 후, 손상 부위를 관찰한 결과 손상 부위에 새로 형성된 연골 조직이 채워져 있는 것으로 나타났다.As a result, as shown in Fig. 11, after one year of treatment with the composition of the present invention by preoperative treatment, the damage site was observed and the newly formed cartilage tissue was filled in the damage site.
따라서 이러한 결과들을 통해 본 발명자들은 본 발명에서 제공하는 결합조직 재생용 조성물의 경우, 연골 손상 조직을 매우 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 알 수 있었다.Therefore, these results show that the present inventors can treat cartilage damaged tissue very effectively in the case of the composition for connective tissue regeneration provided by the present invention.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far I looked at the center of the preferred embodiment for the present invention. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.
Claims (14)
트롬빈 용액과 골형성 증진제로 이루어진 가교활성 촉매용액을 포함하는 결합조직 재생용 조성물.A coagulation factor solution consisting of a fibrinogen solution and a hyaluronic acid solution; And
A composition for connective tissue regeneration comprising a crosslinking catalyst solution consisting of a thrombin solution and a bone formation enhancer.
상기 응고인자 용액과 상기 가교활성 촉매용액은 생체 내에서 혼합되는 것을 특징으로 하는 결합조직 재생용 조성물.The method of claim 1,
The coagulation factor solution and the cross-linking catalyst catalyst solution is characterized in that the composition is mixed in vivo.
상기 골형성 증진제는 아텔로콜라겐 또는 골수인 것을 특징으로 하는 결합조직 재생용 조성물.The method of claim 1,
The bone formation enhancer is atelocollagen or bone marrow composition for connective tissue regeneration characterized in that.
상기 피브리노겐 용액은 동결건조 피브리노겐에 아프로티닌을 주입하여 용해시킨 용액인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 결합조직 재생용 조성물.The method of claim 1,
The fibrinogen solution is a composition for connective tissue regeneration, characterized in that the solution is dissolved by injecting aprotinin into lyophilized fibrinogen.
상기 피브리노겐 용액은 Factor ⅩⅢ을 포함하는 것을 특징으로 하는 결합조직 재생용 조성물.The method of claim 1,
The fibrinogen solution is a composition for connective tissue regeneration, characterized in that it comprises Factor ⅩIII.
상기 트롬빈 용액은 동결건조된 트롬빈에 염화칼슘을 주입하여 용해시킨 용액인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 결합조직 재생용 조성물.The method of claim 1,
The thrombin solution is a composition for connective tissue regeneration, characterized in that the solution dissolved by injecting calcium chloride into the lyophilized thrombin.
상기 응고인자 용액은 피브리노겐 용액과 히아루론산 용액을 7 : 3 ~ 9 : 1의 혼합비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 결합조직 재생용 조성물.The method of claim 1,
The coagulation factor solution is a composition for connective tissue regeneration, characterized in that to mix the fibrinogen solution and hyaluronic acid solution in a mixing ratio of 7: 3 to 9: 1: 1.
상기 가교활성 촉매용액은 트롬빈 용액과 골형성 증진제를 1 : 9 ~ 5 : 5의 혼합비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 결합조직 재생용 조성물.The method of claim 1,
The crosslinking activity catalyst solution is a composition for regenerating connective tissue, characterized in that the mixture of thrombin solution and the bone formation enhancer in a ratio of 1: 9 ~ 5: 5.
트롬빈 용액과 골형성 증진제를 혼합하여 가교활성 촉매용액을 제조하는 단계; 및
상기 응고인자 용액과 가교활성 촉매용액을 손상 조직부위에 주입하여 3 ~ 10분간 겔화시키는 단계를 포함하는 결합조직을 재생하는 방법.Preparing a coagulation factor solution by mixing a fibrinogen solution and a hyaluronic acid solution;
Preparing a crosslinking catalyst solution by mixing a thrombin solution and a bone formation promoter; And
And injecting the coagulation factor solution and the crosslinking active catalyst solution into the damaged tissue to gelate for 3 to 10 minutes.
상기 피브리노겐 용액은 동결건조 피브리로겐에 아프로티닌을 주입하고 용해시켜 제조하는 것을 특징으로 하는 결합조직을 재생하는 방법.10. The method of claim 9,
The fibrinogen solution is a method for regenerating connective tissue, characterized in that prepared by injecting and dissolving aprotinin in lyophilized fibrinogen.
상기 트롬빈 용액은 동결건조된 트롬빈에 염화칼슘을 주입하고 용해시켜 제조하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 결합조직을 재생하는 방법.10. The method of claim 9,
The thrombin solution is a method of regenerating connective tissue, characterized in that the calcium chloride is prepared by injecting and dissolving the lyophilized thrombin.
상기 응고인자 용액은 피브리노겐 용액과 히아루론산 용액을 7 : 3 ~ 9 : 1의 혼합비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 결합조직을 재생하는 방법.10. The method of claim 9,
The coagulation factor solution is a method for regenerating connective tissue, characterized in that the mixing ratio of the fibrinogen solution and hyaluronic acid solution 7: 7: 3 to 1: 1.
상기 가교활성 촉매용액은 트롬빈 용액과 골형성 증진제를 1 : 9 ~ 5 : 5의 혼합비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 결합조직을 재생하는 방법.10. The method of claim 9,
The crosslinking activity catalyst solution is a method for regenerating connective tissue, characterized in that the mixture of thrombin solution and the bone formation enhancer in a mixing ratio of 1: 9 ~ 5: 5.
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