KR20130096338A - Ｍｇ53-ｕｂｅ2ｈ 상호작용을 이용한 제2형 당뇨 치료제의 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 UBE2H (ubiquitin-conjugating enzyme E2H) 및 MG53 (mitsugumin 53) 상호작용을 억제하는 약제를 제2형 당뇨 치료제로 결정함으로써, 제2형 당뇨 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. MG53 및 UBE2H 의 상호작용을 억제하는 약제는 IRS-1의 양을 증가시켜 인슐린 민감성을 증가시킴으로써 제2형 당뇨를 치료할 수 있다.
Description
본 발명은 UBE2H (ubiquitin-conjugating enzyme E2H) 및 MG53 (mitsugumin 53) 상호작용을 억제하는 약제를 제2형 당뇨 치료제로 결정함으로써, 제2형 당뇨 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. MG53 및 UBE2H 의 상호작용을 억제하는 약제는 IRS-1의 양을 증가시켜 인슐린 민감성을 증가시킴으로써 제2형 당뇨를 치료할 수 있다.
당뇨병은 고혈당을 특징으로 하는 일련의 대사 질환군으로 만성적인 고혈당은 적절한 치료를 하지 않으면 대혈관합병증, 미세혈관합병증, 당뇨병성 신경병증 및 신장 질환과 같은 합병증을 야기하게 된다. 당뇨병은 크게 두 가지 유형으로 구분되는데, 제1형 당뇨병 (type 1 diabetes mellitus)은 혈액 내의 포도당 조절 호르몬인 인슐린의 분비 결핍으로 야기되며, 주로 10 내지 20대의 젊은 연령층에서 발병되기 때문에 소아 당뇨병 (juvenile diabetes)이라 불리기도 한다. 제2형 당뇨병 (type 2 diabetes mellitus)은 주로 40대 이후에 발병되며, 우리나라 당뇨병 환자의 대부분을 차지한다. 제1형과는 달리 성인형 당뇨병이라 불리며 발병 원인은 아직 명확히 밝혀져 있지 않으나, 유전적인 요인과 환경적 요소가 함께 관여되어 발생하는 것으로 알려져 있다. 제2형 당뇨병의 병인으로 췌장베타세포에서 인슐린 분비의 장애와 표적세포에서 인슐린 작용의 결함 (인슐린 저항성)이 모두 관찰된다.
당뇨병의 치료법으로는 일반적으로 약물요법과 식이요법, 운동요법을 병행하는데, 치료 목표는 지속적으로 혈당을 정상치에 가깝게 유지하여 당뇨병성 합병증을 예방하고 지연하는 것이다. 그러나 현재까지 당뇨병의 완치법은 확립되어 있지 않고, 경구용 혈당 강하제는 다양한 부작용이 보고되고 있으므로 보다 안전한 제2형 당뇨병 치료제의 개발에 관심이 모아지고 있다. 제2형 당뇨병은 탄수화물, 지질대사 과정 및 인슐린 신호 전달계에서 발생하는 다양한 문제점으로 인해 발병하므로 새로운 치료제 개발을 위해서는 이러한 신호전달 및 대사 과정을 전반적으로 조절하는 새로운 타겟 단백질의 발굴이 절실하다.
한편, 본 발명자들은 이전의 연구에서 (국내특허등록 제10-1048316호), MG53 이 근육 분화의 음성적 조절자임을 최초로 규명한 바 있으며, MG53 의 과발현이 근육 형성을 억제시키고 MG53의 발현 억제가 근육 형성을 촉진시키므로, MG53을 타겟으로 하는 약제 또는 유전자 치료가 골격근의 분화 및 비대를 촉진시켜 근육강화제 또는 심장 강화제로 개발될 수 있음을 개시한 바 있다.
이후, 본 발명자들은 MG53 넉아웃 마우스에서 가자미근 (soleus muscle)의 크기가 30% 증가하고, IRS-1의 양이 증가하여 인슐린 신호전달이 증폭되며, 고지방식을 먹여도 인슐린 저항성이 일어나지 않는다는 것을 확인하였으며, MG53 이 근육 분화 및 인슐린 신호 전달에 작용하는 메커니즘을 규명하는 과정에서 UBE2H-MG53-IRS-1 복합체를 발견하였다. 또한, MG53 의 작용에 UBE2H 와의 상호작용이 필수적으로 수반되며, UBE2H 및 MG53 상호작용을 억제하는 약제가 IRS-1의 양을 증가시켜 인슐린 민감성을 증가시킴으로써 제2형 당뇨 치료제로 개발될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 (a) MG53 및 UBE2H 를 발현하는 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 세포에서 MG53 및 UBE2H 의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 제2형 당뇨 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 (a') 분리된 MG53 및 분리된 UBE2H 의 혼합물에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및 (b') MG53 및 UBE2H 의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 제2형 당뇨 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 UBE2H 및 MG53 상호작용을 억제하는 약제를 제2형 당뇨 치료제로 결정함으로써, 제2형 당뇨 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 MG53 이 근육 분화 및 인슐린 신호 전달에 작용하는 메커니즘을 규명하는 과정에서, MG53 의 작용에 UBE2H 와의 상호작용이 필수적으로 수반되며, UBE2H 및 MG53 상호작용을 억제하는 약제가 IRS-1의 양을 증가시켜 인슐린 민감성을 증가시킴으로써 제2형 당뇨 치료제로 개발될 수 있음을 최초로 규명하였다.
우선, 본 발명에서는 C2C12 근육모세포 (myoblast) 분화 과정에서 MG53과 함께 UBE2H의 mRNA 및 단백질 발현량이 점차적으로 증가하며 (도 1a-d), 인 비트로 결합 분석을 통해, MG53 이 UBE2H 와 강하게 결합하고 있는 것을 확인하였다 (도 2a). MG53 및 UBE2H 간의 분자적 상호작용은 C2C12 근육대롱세포 (myotube) 에서의 상호 내생적 면역침전분석 (reciprocal endogenous immunoprecipitation)과 MG53 및 UBE2H이 과발현된 HEK 293 세포에서의 외생적 면역침전분석 (exogenous immunoprecipitation) 에 의해 재확인되었다 (도 2b 및 도 3a). 따라서, UBE2H 와 MG53 이 상호작용함을 알 수 있었다.
또한, UBE2H 를 넉다운한 후 미오신 중사슬 면역형광분석, 근육분화 색인, 및 면역탁본 분석에 의해 C2C12 세포 근육 분화 정도를 조사한 결과, C2C12 근육모세포의 분화가 증가하였고 (도 2c-e), C2C12 근육대롱세포 (myotube) 에서 IRS-1 발현이 증가하고 유비퀴틴화가 저해되었음을 확인하였다 (도 2e, f). 근육 분화 과정에서 MG53 의 저해가 UBE2H 넉다운에 의한 것인지 알아보기 위하여, HA-MG53을 si-control 및 si-UBE2H 와 함께 C2C12 근육모세포에 공동 트랜스펙션한 후 근육대롱세포로 분화시키면서 HA 및 미오신 중사슬로 면역형광분석 및 근육분화 색인을 측정한 결과, MG53에 의해 유도되는 근육 분화가 UBE2H 넉다운에 의해 저해되었다 (도 2g, h). 또한, UBE2H이 과발현된 HEK 293 세포에서 MG53-유도된 IRS 유비퀴틴화가 증가하였다 (도 3b). 이러한 결과는 UBE2H 가 MG53 에 대한 E2 효소이며 IRS-1 을 타겟으로 한다는 것을 뒷받침한다.
또한, 본 발명자들은 MG53 넉아웃 마우스에서 MG53 이 근섬유 (muscle fiber) 의 크기를 조절하는 효과를 조사해본 결과, MG53 넉아웃 마우스의 가자미근이 야생형 마우스에 비해 약 27% 무게가 증가하였고 (도 4a), 종단면의 면적이 유의적으로 증가하였다 (도 4b, c).
또한, MG53이 IGF-1 신호 전달 뿐 아니라, IRS-1 유비퀴틴화 및 분해를 유도하여 인슐린 신호 전달도 저해한다는 것을 입증하기 위하여, MG53-과발현된 C2C12 근육모세포에서 인슐린에 의한 IRS-1, Akt 및 ERK1/2 인산화를 확인한 결과, MG53 과발현에 의하여 인슐린에 의한 IRS-1, Akt 및 ERK1/2 활성이 현저하게 감소하였다 (도 5a). 이러한 결과는 MG53 이 IGF-1 신호 전달 뿐 아니라 인슐린 신호 전달을 음성적으로 조절한다는 것을 나타낸다. 또한, MG53 넉아웃 마우스에 인슐린을 혈관 주사한 후 가자미근, 장딴지근 및 족저근에서의 인슐린 신호 전달을 분석한 결과, 야생형 마우스에 비해 인슐린에 의한 IRS-1, Akt 및 ERK1/2 활성이 증가하고 IRS-1 발현량이 현저하게 증가하였다 (도 5b-d).
또한, 고설탕 고지방 식이한 MG53 넉아웃 마우스는 당부하 및 인슐린 부하 실험에서 포도당 처리율 (glucose disposal rate)이 증가하였고 (도 6a, b), 고설탕 고지방 식이한 야생형 마우스에 비해 혈중 중성지방, 자유 지방산 및 총 콜레스테롤 함량이 현저하게 감소하였으며 (도 6c-e), 인슐린 및 렙틴의 혈중 농도가 감소하였다 (도 6f, g). 이러한 결과는 MG53 넉아웃에 의해 고설탕 고지방 식이에 의해 유도된 당뇨 표현형이 개선되었음을 나타낸다.
이상의 결과를 종합하였을 때, MG53이 제2형 당뇨 치료를 위한 타겟 단백질이며, 나아가 MG53 의 작용에 반드시 필요한 UBE2H 와의 상호작용을 이용하여 제2형 당뇨 치료제를 효과적으로 선별할 수 있음을 알 수 있다.
따라서, 하나의 양태로서 본 발명은
(a) MG53 및 UBE2H 를 발현하는 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 세포에서 MG53 및 UBE2H 의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는,
제2형 당뇨 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은
(a') 분리된 MG53 및 분리된 UBE2H 의 혼합물에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및
(b') MG53 및 UBE2H 의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는,
제2형 당뇨 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 MG53 및 UBE2H 에 후보 화합물을 처리하는 단계를 포함하며, 이 때, 후보 화합물을 MG53 및 UBE2H 를 발현하는 세포에 처리하거나, 분리된 MG53 및 분리된 UBE2H 의 혼합물에 후보 화합물을 직접적으로 처리할 수 있다.
본 발명에서 용어, "MG53 (mitsugumin 53)"은 근육 분화의 음성적 조절자 역할을 하는 단백질로, TRIM72 (tripartite motif-containing 72)라고도 명명되며, RING 영역, B 박스, Coiled-coil 영역 및 SPRY 영역으로 구성된다. 마우스 MG53 유전자의 염기서열 및 단백질의 아미노산 서열은 NCBI의 등록번호 NM_001079932 및 NP_001073401 에서 얻을 수 있으며, 상기 마우스의 MG53 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 1로 나타내었다. 인간 MG53 유전자의 염기서열 및 단백질의 아미노산 서열은 NCBI의 등록번호 NM_001008274 및 NP_001008275 에서 얻을 수 있으며, 상기 인간 MG53 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 2로 나타내었다.
본 발명에서 용어, "UBE2H (ubiquitin-conjugating enzyme E2H)" 는 단백질의 유비퀴틴화에 관여하는 유비퀴틴 결합 효소인 E2 효소의 하나로, 그 유전자의 염기서열 및 단백질의 아미노산 서열은 NCBI의 등록번호 NM_003344 및 NP_003335 에서 얻을 수 있으며, UBE2H 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 3으로 나타내었다.
본 발명에서 용어, "후보 화합물" 이란 MG53 및 UBE2H 의 상호작용을 저해시킬 것으로 예상되는 후보 물질을 의미한다. 이러한 후보 물질에는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물뿐만 아니라, 단백질, 탄수화물, 핵산분자 (RNA, DNA 등) 및 지질과 같은 고분자 화합물 및 복수의 화합물의 복합체 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어, "처리" 란 후보 화합물이 MG53 및 UBE2H 중 어느 하나 이상에 직접적으로 접촉하는 것뿐 아니라, 물질이 세포막에 영향을 미치고 그 세포막으로부터 발생한 신호가 MG53 및 UBE2H 중 어느 하나 이상에 접촉하거나 영향을 미치는 경우도 포함한다. 따라서 본 발명에 있어서, 상기 후보 화합물에는 세포막 투과성인 물질 뿐만 아니라, 세포막에 불투과성인 물질도 포함된다. 이 때, 후보 화합물은 유효량의 범위 내에서 처리하도록 한다. "유효량" 이란 반응을 유도하기에 충분한 양을 의미하는 것으로, 유효량 범위 이하에서는, 정확한 결과를 얻을 수 없으므로, 유효량 범위 내에서 억제능을 측정하는 것이 바람직하다.
후보 화합물을 MG53 및 UBE2H 를 발현하는 세포에 처리하는 경우, 본 발명은
(a) MG53 및 UBE2H 를 발현하는 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 세포에서 MG53 및 UBE2H 의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 제2형 당뇨 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
MG53 및 UBE2H 를 발현하는 세포는, 본래 MG53 및 UBE2H 를 포함하는 세포이거나, 의도적으로 MG53 및 UBE2H 를 발현하는 벡터를 세포에 트랜스펙션하여 제조한 것일 수 있다. 또한, MG53 및 UBE2H 를 발현하는 벡터의 경우 하나의 벡터에 MG53 및 UBE2H 에 대한 서로 다른 프로모터를 포함하고 있어 하나의 벡터로부터 각각 발현될 수도 있고, MG53 를 발현하는 벡터 및 UBE2H 를 발현하는 벡터를 공동 트랜스펙션하여 제조할 수도 있다.
상기 세포는 인간 또는 소, 염소, 돼지, 생쥐, 토끼, 햄스터, 시궁쥐, 기니피그 등의 동물 기원의 모든 세포를 포함하며, 일차세포, 이차세포, 불멸화된 세포 등을 이용할 수 있다. 또한, MG53 및/또는 UBE2H 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 사용하여 세포 내에서 MG53 및/또는 UBE2H 가 세포 내에서 안정적으로 또는 일시적으로 과발현되도록 조작된 세포를 사용할 수 있다.
나아가, MG53 및 UBE2H 의 상호작용을 저해시키는 물질의 검출은, 세포 수준 뿐만 아니라 생쥐, 토끼, 햄스터, 시궁쥐, 기니피그 등의 실험 동물을 이용하여 생체 내에서 수행할 수 있다.
본 발명의 상기 단계 (b) 에서, MG53 및 UBE2H 의 상호작용이 저해되는지 여부는, 단백질-단백질간 또는 단백질-화합물간의 반응 여부를 확인하기 위하여 당업계에서 통상 사용되는 기술들을 적용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 면역학적 분석법, 형광 분석법, 효모 이중 혼성법 (yeast two-hybrid), MG53 또는 UBE2H에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리 등을 이용한 HTS (high throughput screening), 드럭 히트 HTS 또는 세포 기반 스크리닝 (cell-based screening) 등을 이용하는 스크리닝 방법 등을 사용할 수 있으나, 이러한 방법에 제한되는 것은 아니다.
바람직한 하나의 구현예로, MG53 또는 UBE2H 에 특이적인 항체를 이용하여 MG53 및 UBE2H 의 상호작용이 저해되는지 여부를 검출할 수 있다. 예를 들어, 생성된 항원-항체 복합체 형성량을 후보 물질을 처리하지 않은 대조군에서의 항원-항체 복합체 형성량과 비교하여 저해 여부를 결정할 수 있다. 항원-항체 복합체 형성량의 절대적 또는 상대적 차이는 분자생물학적 또는 조직학적 분석으로 확인 가능하며, 이러한 분석법에는 면역탁본, 면역침전 및 면역염색 등이 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항원-항체 반응을 이용한 검출 방법에서 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 본 발명에서 용어, "검출 라벨"은 분광분석적 (spectroscopic), 광화학적 (photochemical), 생화학적 (biochemical), 면역화학적 (immunochemical), 화학적 (chemical), 다른 물리화학적 (physical) 수단에 의해 검출될 수 있는 조성물을 말한다. 이러한 검출 표지체에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.
바람직한 또 하나의 구현예로, MG53 또는 UBE2H 에 각각 리포터 단백질과 연결한 후 상기 리포터 단백질의 신호 크기에 의하여 MG53 및 UBE2H 의 상호작용이 저해되는지 여부를 검출할 수 있다.
상기 리포터 단백질은 루시퍼라제, 클로람페니콜아세틸트랜스퍼라제, 베타-글루쿠로니다제, 베타-갈락토시다제, 알칼라인 포스파타아제, 또는 형광 단백질일 수 있으며, 이 때 형광 단백질은 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein), 적색 형광 단백질 (red fluorescent protein), 청색 형광 단백질 (blue fluorescent protein), 황색 형광 단백질 (yellow fluorescent protein), 남색 형광 단백질 (cyan fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein), 증강된 적색 형광 단백질, 증강된 청색 형광 단백질, 증강된 황색 형광 단백질 또는 증강된 남색 형광 단백질일 수 있다.
상기 리포터 단백질을 MG53 및 UBE2H 과 각각 연결된 형태로 발현시키기 위하여, MG53 를 코딩하는 유전자 및 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 벡터, 그리고 UBE2H 를 코딩하는 유전자 및 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 벡터를 세포에 공동 트랜스펙션할 수 있다.
리포터 단백질이 형광 단백질일 경우 형광 현미경을 이용하여 리포터 단백질의 형광 크기를 측정함으로써 MG53 및 UBE2H 의 상호작용이 저해되는지 여부를 확인할 수 있으며, 리포터 단백질로 루시퍼라제와 같은 발광 효소를 사용하는 경우 공지된 루시퍼라제 활성 측정법 내지는 루시퍼라제 발광에 따라 MG53 및 UBE2H 의 상호작용이 저해되는지 여부를 확인할 수 있다. 또한, 리포터 단백질로 클로람페니콜아세틸트랜스퍼라제, 베타-글루쿠로니다제, 베타-갈락토시다제, 알칼라인 포스파타아제 등과 같이 기질을 검출 가능한 광을 발광하는 발색 산물로 전환시킬 수 있는 효소를 사용하는 경우 발색 기질을 이용한 효소 반응에 의하여 얻어지는 광 신호에 의해 MG53 및 UBE2H 의 상호작용이 저해되는지 여부를 확인할 수 있다.
한편, 후보 화합물을 분리된 MG53 및 분리된 UBE2H 의 혼합물에 처리하는 경우,본 발명은
(a') 분리된 MG53 및 분리된 UBE2H 의 혼합물에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및 (b') MG53 및 UBE2H 의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 제2형 당뇨 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "분리된 (isolated)"이란 세포에서 발현되어 분리된 단백질을 의미하고, 당업계에서 공지된 일반적인 분리 기술을 적용하여 분리 가능하다. 세포에서 발현된 단백질을 분리 정제하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 분리된 MG53 및 분리된 UBE2H 은 세포 내가 아니라 시험관 내에서 후보 화합물과 직접적으로 작용하여 반응할 수 있다.
MG53 및 UBE2H 의 상호작용이 저해되는지 여부를 확인하는 방법은 상술한 바와 같다.
본 발명의 스크리닝 방법으로 획득된 MG53 및 UBE2H 의 상호작용을 억제하는 약제는 IRS-1의 양을 증가시켜 인슐린 민감성을 증가시킴으로써 제2형 당뇨를 치료할 수 있다.
본 발명은 UBE2H 및 MG53 상호작용을 저해시키는 물질을 스크리닝함으로써 제2형 당뇨 치료제를 효과적으로 선별 및 개발할 수 있다.
도 1a 는 C2C12 세포의 근육 분화 과정에서 MBP-MG53, UBE2H, UBE2R1, UBE2D2, UBE2E1, UBE2C, UBE2M 및 UBE2N 의 발현량을 SDS-PAGE 로 확인한 결과를 나타낸다.
도 1b 는 C2C12 세포의 근육 분화 시작일로부터 5일 동안 UBE2H, UBE2R1, UBE2D2, UBE2E1, UBE2L3, UBE2L6, UBE2C, UBE2M, UBE2N, Cav-3, MyHC, MyoD 및 GAPDH 의 mRNA 발현량을 실시간 정량적 PCR로 측정한 결과를 나타낸다. GAPDH는 로딩 대조군을 나타낸다.
도 1c 는 C2C12 세포의 근육 분화 시작일로부터 5일 동안 UBE2H mRNA 에 대한 실시간 정량적 PCR 결과를 GAPDH mRNA 결과에 대하여 표준화한 결과를 나타낸다 (*p<0.01, **p<0.05).
도 1d는 C2C12 세포의 근육 분화 시작일로부터 5일 동안 UBE2H, MG53, Mgn, IRS-1 및 Cav-3 의 발현을 면역탁본법으로 확인한 결과를 나타낸다. 액틴은 로딩 대조군을 나타낸다.
도 2a는 MG53 및 다양한 E2 효소 (UBE2H, UBE2R1, UBE2D2, UBE2E1, UBE2C, UBE2M 및 UBE2N) 와의 생체 외 단백질 결합 어세이 결과를 나타낸다.
도 2b는 분화 시작 4일째의 C2C12 세포에서 상호 내생적 면역침전법 (reciprocal endogenous immunoprecipitation)에 의하여 MG53와 UBE2H 간의 분자적 결합을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2c-e는 C2C12 근육모세포에서 siRNA를 이용하여 UBE2H의 발현을 억제시킨 후, 근육분화 정도를 면역형광법 (c), 근육 분화 색인 (d), 분화 표지 단백질에 대한 면역탁본법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 2f 는 C2C12 근육모세포에서 siRNA를 이용하여 UBE2H의 발현을 억제시킨 후, MG132를 처리하여 IRS-1의 유비퀴틴화를 면역침전법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 2g-h는 C2C12 근육모세포에 UBE2H siRNA 및 MG53를 과발현시킨 후, 분화정도를 면역형광법 (g) 및 HA-양성 세포 내 핵 (nuclei)의 수 (h)를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 3a 는 Myc-Mg53 및 Flag-UBE2H이 공동 트랜스펙션된 HEK293 세포에서, MG53 및 UBE2H 간의 분자적 상호작용을 상호 면역침전법 (reciprocal immunoprecipitation)으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 3b 은 Flag-IRS-1, HA-MG53 WT, Myc-UBE2H 및 His-Ubiquitin 이 공동 트랜스펙션된 HEK293 세포에 MG132 을 12시간 처리한 경우, 항-Flag 항체를 이용한 면역침전 및 항-His 항체를 이용한 면역탁본법에 의하여 IRS-1 유비퀴틴화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4a 는 야생형 마우스 및 MG53 넉아웃 마우스에서 가자미근 무게를 비교한 결과를 나타낸다.
도 4b 및 c는 MG53 넉아웃 마우스의 가자미근의 종단면의 모양과 종단면적의 분포를 면역형광법에 의하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 5a는 MG53를 과발현시킨 C2C12 근육모세포에 인슐린을 처리한 후, 신호전달물질들의 인산화를 면역탁본법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5b는 야생형 마우스 및 MG53 넉아웃 마우스에 인슐린을 혈관 주사 후, 장딴지근 (gastrocnemius muscle) 및 족저근 (plantaris muscle)에서 인슐린 신호전달물질의 단백질 양 및 및 IRS-1 의 타이로신 인산화를 면역탁본법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5c 및 d 는 야생형 마우스 및 MG53 넉아웃 마우스의 가자미근, 장딴지근 및 족저근에서 IRS-1 발현, IRS-1 인산화 및 Akt 인산화를 통계적으로 분석한 결과를 나타낸다 (*p<0.01 및 **p<0.05).
도 6a 및 b는 10주 동안 고설탕-고지방 사료를 섭취한 MG53 넉아웃 마우스에서 당부하검사 (a) 및 인슐린부하검사 (b)를 수행한 결과를 나타낸다. AUC는 곡선 아래의 면적을 나타낸다.
도 6c 부터 g는 상기 비만 및 당뇨를 유도시킨 MG53 넉아웃 마우스의 혈액 내 중성지방 (c), 자유 지방산 (d), 전체 콜레스테롤 (e), 인슐린 (f) 및 렙틴 (g)의 농도를 정량분석한 결과를 나타낸다 (* p<0.01 및 ** p<0.05).
도 7을 MG53 이 근육 분화 및 인슐린 신호 전달을 조절하는 기작을 설명한 그림이다.
도 1b 는 C2C12 세포의 근육 분화 시작일로부터 5일 동안 UBE2H, UBE2R1, UBE2D2, UBE2E1, UBE2L3, UBE2L6, UBE2C, UBE2M, UBE2N, Cav-3, MyHC, MyoD 및 GAPDH 의 mRNA 발현량을 실시간 정량적 PCR로 측정한 결과를 나타낸다. GAPDH는 로딩 대조군을 나타낸다.
도 1c 는 C2C12 세포의 근육 분화 시작일로부터 5일 동안 UBE2H mRNA 에 대한 실시간 정량적 PCR 결과를 GAPDH mRNA 결과에 대하여 표준화한 결과를 나타낸다 (*p<0.01, **p<0.05).
도 1d는 C2C12 세포의 근육 분화 시작일로부터 5일 동안 UBE2H, MG53, Mgn, IRS-1 및 Cav-3 의 발현을 면역탁본법으로 확인한 결과를 나타낸다. 액틴은 로딩 대조군을 나타낸다.
도 2a는 MG53 및 다양한 E2 효소 (UBE2H, UBE2R1, UBE2D2, UBE2E1, UBE2C, UBE2M 및 UBE2N) 와의 생체 외 단백질 결합 어세이 결과를 나타낸다.
도 2b는 분화 시작 4일째의 C2C12 세포에서 상호 내생적 면역침전법 (reciprocal endogenous immunoprecipitation)에 의하여 MG53와 UBE2H 간의 분자적 결합을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2c-e는 C2C12 근육모세포에서 siRNA를 이용하여 UBE2H의 발현을 억제시킨 후, 근육분화 정도를 면역형광법 (c), 근육 분화 색인 (d), 분화 표지 단백질에 대한 면역탁본법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 2f 는 C2C12 근육모세포에서 siRNA를 이용하여 UBE2H의 발현을 억제시킨 후, MG132를 처리하여 IRS-1의 유비퀴틴화를 면역침전법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 2g-h는 C2C12 근육모세포에 UBE2H siRNA 및 MG53를 과발현시킨 후, 분화정도를 면역형광법 (g) 및 HA-양성 세포 내 핵 (nuclei)의 수 (h)를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 3a 는 Myc-Mg53 및 Flag-UBE2H이 공동 트랜스펙션된 HEK293 세포에서, MG53 및 UBE2H 간의 분자적 상호작용을 상호 면역침전법 (reciprocal immunoprecipitation)으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 3b 은 Flag-IRS-1, HA-MG53 WT, Myc-UBE2H 및 His-Ubiquitin 이 공동 트랜스펙션된 HEK293 세포에 MG132 을 12시간 처리한 경우, 항-Flag 항체를 이용한 면역침전 및 항-His 항체를 이용한 면역탁본법에 의하여 IRS-1 유비퀴틴화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4a 는 야생형 마우스 및 MG53 넉아웃 마우스에서 가자미근 무게를 비교한 결과를 나타낸다.
도 4b 및 c는 MG53 넉아웃 마우스의 가자미근의 종단면의 모양과 종단면적의 분포를 면역형광법에 의하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 5a는 MG53를 과발현시킨 C2C12 근육모세포에 인슐린을 처리한 후, 신호전달물질들의 인산화를 면역탁본법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5b는 야생형 마우스 및 MG53 넉아웃 마우스에 인슐린을 혈관 주사 후, 장딴지근 (gastrocnemius muscle) 및 족저근 (plantaris muscle)에서 인슐린 신호전달물질의 단백질 양 및 및 IRS-1 의 타이로신 인산화를 면역탁본법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5c 및 d 는 야생형 마우스 및 MG53 넉아웃 마우스의 가자미근, 장딴지근 및 족저근에서 IRS-1 발현, IRS-1 인산화 및 Akt 인산화를 통계적으로 분석한 결과를 나타낸다 (*p<0.01 및 **p<0.05).
도 6a 및 b는 10주 동안 고설탕-고지방 사료를 섭취한 MG53 넉아웃 마우스에서 당부하검사 (a) 및 인슐린부하검사 (b)를 수행한 결과를 나타낸다. AUC는 곡선 아래의 면적을 나타낸다.
도 6c 부터 g는 상기 비만 및 당뇨를 유도시킨 MG53 넉아웃 마우스의 혈액 내 중성지방 (c), 자유 지방산 (d), 전체 콜레스테롤 (e), 인슐린 (f) 및 렙틴 (g)의 농도를 정량분석한 결과를 나타낸다 (* p<0.01 및 ** p<0.05).
도 7을 MG53 이 근육 분화 및 인슐린 신호 전달을 조절하는 기작을 설명한 그림이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 동물 실험 준비
MG53-/- 마우스는 이전에 기술된 바에 따라 제조하였다 (Lee, C. S. et al., Cell Death Differ 17, 1254-65, 2010). 역교배 (backcross)를 위하여, MG53+/- 마우스를 C57BL/6 마우스와 7 세대 동안 번식시키고, 물과 음식 공급이 자유로운 플라스틱 케이지에서 12:12h light-dark photoperiod 조건으로 배양하였다. 10주간 고설탕-고지방 식이 (Research diet, D12330)로 제2형 당뇨를 유도하였고, 당부하 (Glucose tolerance) 및 인슐린부하 (insulin tolerance) 검사를 이전에 기술된 바에 따라 수행하였다 (Yadav, H. et al., Cell Metab 14, 67-79, 2011). Biovision 에서 얻은 비색분석 키트 (colorimetric assay kit)를 사용하여 중성지방, 자유 지방산, 및 총 콜레스테롤양을 측정하였다. Bio-Plex ProTM 마우스 당뇨 분석 키트 (Bio-Rad)를 사용하여 인슐린 및 렙틴의 혈중 수준을 결정하였다. 실험 동물은 실험동물 보호 원칙 (NIH Publication No. 85-23, revised 1985)에 따라 취급하였고, 고려대학교 동물실험윤리위원회에서 승인된 프로토콜을 준수하였다.
실시예
2. 세포배양
C2C12 세포를 ATCC에서 구입한 후, 2% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신과 10% (v/v) 우태아혈청이 보충된 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 37℃, 5% (v/v) CO2 인큐베이터 내 배양하였다. Confluent C2C12 근육모세포 (myoblasts)를 상기 항생제와 2% (v/v) 말 혈청이 보충된 DMEM 배지에서 배양하여 근육대롱세포 (microtubes)로 분화시켰다. 48시간 경과 시 마다 근육대롱세포에 2%의 말 혈청을 포함하는 신선한 DMEM을 공급하였다. 발생 12.5 일째 MG53+/+ 및 MG53-/- 배아로부터 마우스 배아 섬유아세포 (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) 를 수득하였다. 배아로부터 머리 및 내부 장기를 분리하고, 남은 부위는 갈아서 트립신/EDTA 에 37℃ 에서 30분간 분산시켰다. 트립신 처리된 조직은 100 μM 세포 여과기 (cell strainer) 를 통과시키고 여과물을 1000 x g 로 원심분리하였다. 세포 펠렛은 성장 배지에 재현탁하였다.
실시예
3. 면역탁본 (
immunoblotting
,
IB
), 면역침전 (
immunoprecipitation
,
IP
) 및
면역형광
(
immunofluorescence
assay
,
IFA
)
면역탁본 및 면역형광법은 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다 (Kim, K. B. et al. Proteomics 6, 2444-53, 2006). 면역침전반응을 위해서, 세포를 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 137 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 20 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 mM Na3VO4, 1% (v/v) NP-40, 1 mM PMSF 및 protease inhibitor cocktail (Roche) 가 포함된 버퍼에 용해시켰다. 총 세포 용해물 (50 μl protein)을 90분간 특이적 항체들로 인큐베이트한 후 90분 동안 50 μl의 Protein A-세파로스 또는 G-아가로스 비드 (50%) slurry로 인큐베이트하였다. 이 후 면역침전물을 면역탁본법으로 분석하였다. 골격근 단백질의 면역탁본법을 위하여, 근육 섬유를 10 mM KH2PO4 (pH 7.4), 프로테아제 저해제 혼합물 (protease inhibitor cocktail) 을 포함하는 저염버퍼로 용해시켰다. 면역탁본법, 면역침전 및 면역형광에 사용한 항체를 표 1 및 표 2에 기재하였다.
| 단백질 | 제조사 | 숙주 (클론 넘버) | 실험방법 (희석률) |
| Flag | Sigma | Mouse Monoclonal (M2) | IB (1:1,000), IFA (1:100) |
| Santa Cruz Biotechnology |
Rabbit Polyclonal | IP (1:100), IB (1:1,000) | |
| MyHC | Developmental Studies Hybridoma Bank | Mouse Monoclonal (MF-20) | IB (1:1,000), IFA (1:100) |
| IRS-1 | Millipore | Rabbit Polyclonal | IP (1:200), IB (1:1,000) |
| Transduction laboratories | Mouse, Monoclonal (6/IRS-1) | IB (1:1,000) | |
| Actin (beta) | Santa Cruz Biotechnology |
Mouse Monoclonal (C4) | IB (1:1,000) |
| Actin (alpha) | Santa Cruz Biotechnology |
Mouse Monoclonal (?-SR1) | IB (1:1,000) |
| pAkt (T308) | Cell Signaling | Rabbit Polyclonal | IB (1:1,000) |
| Akt | Millipore | Mouse Monoclonal (skb1) | IB (1:1,000) |
| pY (Tyrosine phosphorylation) |
Transduction laboratories | Mouse Monoclonal (PY20) | IB (1:1,000) |
| Myc | Santa Cruz Biotechnology |
Mouse Monoclonal (Clone 90000000000) |
IB (1:1,000) |
| Rabbit Polyclonal | IP (1:100), IB (1:1,000) | ||
| His | Santa Cruz Biotechnology |
Mouse Monoclonal (AD1.1.10) | IP (1:100), IB (1:1,000) |
| Ubiquitin | Cell Signaling | Mouse Monoclonal (P4D1) | IB (1:1,000) |
| HA | Santa Cruz Biotechnology |
Rabbit Polyclonal | IP (1:100), IFA (1:100) |
| Mouse Monoclonal (F-7) | IB (1:1,000) | ||
| MyoD | Santa Cruz Biotechnology |
Mouse Monoclonal (5.8A) | IB (1:1,000) |
| ERK | Santa Cruz Biotechnology |
Rabbit Polyclonal | IB (1:1,000) |
| pERK | Santa Cruz Biotechnology |
Mouse Monoclonal (E-4) | IB (1:1,000) |
| β-Dystroglycan | Santa Cruz Biotechnology |
Mouse Monoclonal (4F7) | IFA (1:100) |
| MBP | NEB | Mouse Monoclonal | IB (1:5,000) |
| 항체명 | 제조사 | 숙주 | 실험방법 (희석률) |
| HRP-conjugated Anti-mouse IgG | Pierce | Goat polyclonal | IB (1:20,000~40,000) |
| HRP-conjugated Anti-mouse IgM | Pierce | Goat polyclonal | IB (1:20,000) |
| HRP-conjugated Anti-Rabbit IgG | Pierce | Goat polyclonal | IB (1:20,000~40,000) |
| Alexa Fluor 488-conjugated Anti-mouse IgG | Invitrogen | Goat polyclonal | IFA (1:100) |
| FITC-conjugated Anti-mouse IgG | Abcam | Rabbit polyclonal | IFA (1:100) |
| Rhodamine-conjugated Anti-Rabbit IgG | Abcam | Goat polyclonal | IFA (1:100) |
실시예
4. 조직학 (
histology
)
골격근을 4% 파라포름알데히드에 고정시키고, 냉동된 2-메틸부탄 내에 동결시킨 후, cryomicrotome 으로 절단하였다. 골격근 절편을 근섬유막 (sarcolemma)에 대한 항-β-디스트로글리칸 항체 및 핵에 대한 DAPI 로 염색하였다. 근육 섬유에서 근섬유의 단면적을 Multigauge software (Fuji Photo Film Co.) 로 결정하였다. 각 그룹에서 6 마리 동물로부터 9개의 분리된 슬라이드를 사용하였다.
실시예
5. 근육분화 색인 (
myogenic
index
) 측정
분화된 C2C12 세포 또는 MEF 를 항- 미오신 중사슬 항체 및 DAPI 로 염색하고, 세포 영상을 형광 현미경 (Olympus)으로 관찰하였다. 염색된 부위에서 총 핵 (nuclear)의 수에 대한 미오신 중사슬-양성 근육대롱세포 내 핵의 수의 비율을 근육분화 색인으로 나타내었다.
실시예
6.
RNA
간섭 (
RNA
interference
)
MG53 을 표적으로 하는 siRNA 올리고머 (si-MG53) 또는 UBE2H 를 표적으로 하는 siRNA 올리고머 (si-UBE2H), 및 스크램블 올리고머 (si-control) 을 Ambion 에서 제작하였다. MG53 의 표적 서열은 5'-AAGCACGCCUCAAGACACAGCtt-3' (서열번호 4)이고, UBE2H 의 표적 서열은 5'-CUAUGAUCUUACCAAUAUAtt-3' (서열번호 5)이다. si-control, si-MG53 또는 si-UBE2H 을 전기천공법을 사용하여 제조자 (Digital Bio) 의 프로토콜에 따라 C2C12 myoblasts에 트랜스펙션하였다.
실시예
7. 인 비트로 결합 분석 (
In
vitro
binding
assay
)
인간 MG53 유전자 (잔기 7-470) 를 pMAL-c2x 벡터 (NEB)에 클로닝하였다. E. coli C41 (DE3) 를 MBP-MG53 발현을 위한 숙주로 사용하였다. 발현된 단백질을 PBS (phosphate-buffered saline) 버퍼로 미리 평형화된 아밀로스 레진에 인큐베이트하였다. 레진을 PBS 로 세척하고, MBP-융합된 단백질을 용출 버퍼 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT 및 10 mM 말토오스)를 사용하여 레진으로부터 용출시켰다. 추가 정제를 위해, 용출된 단백질을 버퍼 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0 and 1 mM DTT)로 평형화된 HiTrap Q Fast Flow 칼럼에 로딩하였다. MBP-MG53 를 150-250 mM NaCl 로 용출하였다. 정제된 단백질은 사용할 때까지 -80℃ 에 보관하였다. 20 μl의 아밀로스 레진, 50 μg의 MBP-MG53 및 100 μg 의 히스티딘-태그된 E2 효소를 함유하는 1ml 의 분석 버퍼 (1X PBS and 1 mM DTT)를 사용하여 4℃ 에서 1시간 동안 Pull-down assay 를 수행하였다. 히스티딘-태그된 E2 효소는 Boston Biochem 및 LifeSensors 에서 구입하였다. 결합하지 않은 E2 효소를 제거하기 위하여, 레진을 최소한 5회 이상 분석 버퍼로 세척하였다. 결합된 MBP-MG53:E2 효소 복합체를 용출하기 위하여, 35 μl의 용출 버퍼 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT 및 10 mM 말토오스) 를 1분간 레진에서 인큐베이트하였다. 원심분리 후에, 30 μl의 각 용리액을 5 X SDS 샘플 버퍼와 혼합하고 3분간 가열하였다. 항-히스티딘 및 항-MBP 항체를 사용한 면역탁본법으로 MG53 및 E2 효소 간의 상호작용을 측정하였다.
실시예
8.
RT
-
PCR
랜덤 헥사머 프라이머 및 M-MLV 역전사효소 (Invitrogen)를 사용한 역전사 반응에 의하여, DNase1 이 처리된 RNA (1μg) 로부터 cDNA 을 합성하였다. PCR 은 처음에는 24-38 사이클 범위로 수행하고, 28-36 사이클 수행된 2 μl 의 1:4-희석된 cDNA (12.5 ng/50 μl PCR reaction) 를 획득하였다. RT-PCR 반응에 사용한 프라이머는 다음과 같다.
| 유전자 | 정방향 (5'->3') | 역방향 (5'->3') | 서열번호 |
| MG53 | TCCCTGTTGTCAGGCATCTAC | TTCTTCCACACCTGGAATTTG | 6,7 |
| MyoD | CTCCTTTGAGACAGCAGACGACTT | AAATCGCATTGGGGTTTGAGCCTG | 8,9 |
| MyHC | AGAAGGAGGAGGCAACTTCTG | ACATACTCATTGCCGACCTTG | 10,11 |
| α-actin | GAAGAGCTATGAGCTGCCTGA | CTCATCGTACTCCTGCTTGCT | 12,13 |
| UBE2H | AAGGAACACCATATGAAGGCG | GCGTACTTCTGGATGTACTCTTTAA | 14,15 |
| UBE2R1 | TGCCAAGCTCGCAGAAGGCG | CCACCGCTCTGAGGGCAGCT | 16,17 |
| UBE2D2 | GCCCTCAGCTCGTCTGATCCG | TGATAGGGGCTGTCATTTGGCCC | 18,19 |
| UBE2E1 | TGCCTGGTTAATAGTTGCTGTTGCT | CACTGCAGTTTGGCGGAGGGT | 20,21 |
| UBE2L3 | AAGGGGCAGGTCTGTCTGCC | CCTGCTTTGCGGGGTGTCTGA | 22,23 |
| UBE2L6 | AGCTGCCGCCATACCTTCGC | GCAAGTTCCAGACGCACAGGCT | 24,25 |
| UBE2C | AAACCGCGACCCAGCTGCTG | GCCCTGGGTGTCCACGTTGG | 26,27 |
| UBE2M | AGGGCAGCAGCAAGAAGGCG | GGCAGACGTTGCCCTCGAGG | 28,29 |
| UBE2N | ATGTGGTCATTGCTGGCCCCC | GCAGAACAGGAGAAGTGGTGTACAC | 30,31 |
| GAPDH | TGGCAAATTCCATGGCACC | AGAGATGATGACCCTTTTG | 32,33 |
실시예
9. 실시간 정량적
PCR
(
Quantitative
real
-
time
PCR
)
단일 가닥 cDNA 및 유전자-특이적 올리고뉴클레오티드를 사용하여 Lightcycler 480 SYBR Green I Master Mix (Roche Diagnostics GmbH) 의 존재 하에서 실시간 정량적 PCR 분석을 수행하였다. Lightcycler PCR 조건은 다음과 같다: 초기 변성 95℃ 에서 10분에 이어서, 변성 95℃ 에서 10초, 어닐링 57℃ 에서 10초 및 신장 72℃ 에서 30초를 35-45 사이클 수행. quality control 을 위하여 각 PCR 산물에 대하여 용해 곡선 (melting curve) 을 분석하였다.
실시예
10. 화학적 가교 결합 (
Chemical
cross
-
linking
)
HEK 293 세포를 PBS 내에서 옥틸-β-D-글루코피라노시드로 수집하였다. 전체 세포 용해물을 글루타르알데히드와 혼합하고 37℃ 에서 20분간 배양하였다. 1.5 M Tris-HCl (pH 7.4) 를 처리하여 가교결합 반응을 정지시키고 SDS-PAGE 상에서 단백질을 분리하였다.
실시예
11. 통계 분석 (
Statistical
analysis
)
통계치는 평균±SEM (standard error of the mean) 으로 나타내었다. p 값을 계산하기 위하여 two-tailed Student' s test 를 사용하였다.
결과 1.
MG53
에 의한
IRS
-1
유비퀴틴화에
UBE2H
가 필요함
MG53를 통한 IRS-1 유비퀴틴화에 어떤 E2 연결효소가 필요한지 확인하기 위하여, C2C12 근육모세포의 분화 과정에서 다양한 E2 효소의 mRNA 및 단백질량 증가 여부를 알아보았다. 먼저, 도 2a에서 사용되는 MBP (maltose binding protein) 태그된 MG53와, His (histidine) 태그된 E2 효소 UBE2H, UBE2R1, UBE2D2, UBE2E1, UBE2C, UBE2M 및 UBE2N 단백질을 SDS-PAGE 젤 상에서 쿠마시-염색하여 확인하였다 (도1a). 그 결과, UBE2H 의 발현량이 증가함을 확인할 수 있었다. C2C12 근육모세포의 근육 분화 시작일로부터 5일 동안 UBE2H, UBE2R1, UBE2D2, UBE2E1, UBE2L3, UBE2L6, UBE2C, UBE2M, UBE2N, Cav-3, MyHC 및 MyoD 의 mRNA 증가량을 실시간 정량적 PCR로 측정한 결과, 근육 분화가 진행될수록 UBE2H 의 mRNA 발현량이 점차 증가된다는 것을 확인할 수 있었으며 (도 1b), 이 중 UBE2H mRNA 에 대한 실시간 정량적 PCR 결과를 GAPDH mRNA 결과에 대하여 표준화한 결과 UBE2H 의 mRNA 발현량이 점차 증가된다는 것을 재확인할 수 있었다 (도 1c). 또한, C2C12 세포의 근육 분화 시작일로부터 5일 동안 UBE2H, MG53, Mgn, IRS-1 및 Cav-3 의 발현을 면역탁본법으로 확인한 결과, 근육 분화가 진행될수록 UBE2H 단백질 발현량이 점차 증가된다는 것을 확인할 수 있었다 (도 1d).
또한, UBE2H와 MG53이 직접적으로 상호작용한다는 것을 입증하기 위하여, MG53 및 다양한 E2 효소 (UBE2H, UBE2R1, UBE2D2, UBE2E1, UBE2C, UBE2M 및 UBE2N) 와의 생체 외 단백질 결합 분석을 수행하였다. 이를 위하여, MBP-MG53 및 His-E2 효소들을 혼합하여 아밀로스 레진 상에 고정시킨 후 면역탁본법으로 그 상호작용을 분석한 결과, UBE2H와 MG53가 단백질-단백질 결합을 하고 있음을 확인할 수 있었다 (도 2a). 또한, 분화 시작 4일째의 C2C12 세포에서 상호 내생적 면역침전법 (reciprocal endogenous immunoprecipitation)에 의하여 MG53와 UBE2H 간의 분자적 상호작용을 재확인하였다 (도 2b).
또한, C2C12 세포에 si-control 및 si-UBE2H를 각 50 nM씩 24시간 처리하여 UBE2H 를 넉다운시키고 48시간 분화시킨 후, 근육세포 분화 양상을 DAPI 염색을 통한 미오신 중사슬 면역형광 (도 2c), 근육분화 색인 (도 2d) 및 면역탁본법을 통한 근육분화마커 단백질의 발현량 (도 2e)으로 조사한 결과, UBE2H 넉다운으로 인해 근육 분화가 강화되었으며 특히 IRS-1의 발현량이 증가되었음을 확인할 수 있었다. 이는 UBE2H가 IRS-1의 분해에 관여하고 있음을 보여주는 것이다. 또한, si-UBE2H를 처리하여 UBE2H를 넉다운시킨 C2C12 근육모세포에 MG132를 12시간 처리하여 IRS-1의 유비퀴틴화를 내생적 (endogenous) 면역침전법으로 확인한 결과, UBE2H 넉다운으로 인해 IRS-1의 유비퀴틴화를 저해되었음을 확인하였다 (도 2f).
또한, C2C12 근육모세포에 si-UBE2H 또는 si-control을, HA-MG53과 동시에 처리하고 48시간 동안 분화시킨 후, 근육 분화 정도를 조사하기 위하여 DAPI 를 이용하여 HA 및 MyHC 면역형광법으로 분석하고 (도 2g), HA-양성 세포 내 핵 (nuclei)의 수를 세 개의 독립적인 현미경 사진으로 확인한 결과 (도 2h), MG53이 존재하여도 UBE2H가 존재하지 않으면 IRS-1의 유비퀴틴화가 일어나지 않고 근육분화가 잘 일어난다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, Myc-Mg53 및 Flag-UBE2H 각 2 μg을 HEK293 세포에 48시간 공동 트랜스펙션시킨 후, MG53 및 UBE2H 간의 분자적 상호작용을 상호 면역침전법 (reciprocal immunoprecipitation)으로 모니터한 결과, MG53 및 UBE2H 의 상호작용을 확인할 수 있었으며 (도 3a), Flag-IRS-1, HA-MG53 WT, Myc-UBE2H 및 His-Ubiquitin 을 HEK293 세포에 공동 트랜스펙션시키고, MG132 10 μM 을 12시간 처리한 후, 항-Flag 항체를 이용한 면역침전 및 항-His 항체를 이용한 면역탁본법에 의하여 IRS-1 유비퀴틴화를 확인한 결과, HEK293 세포에서 UBE2H 과발현에 의하여 IRS-1 유비퀴틴화가 강하게 유도된다는 것을 확인할 수 있었다 (도 3b).
따라서, 상기 데이터들을 통하여 MG53이 IRS-1의 유비퀴틴화를 유도하기 위해서 UBE2H가 필요하다는 것을 알 수 있다.
결과 2.
MG53
넉아웃
마우스는 골격근의 비대 및 인슐린 민감성을 보임
MG53가 IGF 신호전달을 음성적으로 조절하기 때문에 MG53 넉아웃 마우스는 더 발달된 근육을 가질 것으로 예상하여, 실제로 8주령의 수컷 야생형 마우스 및 MG53 넉아웃 마우스 (각 그룹에서 n=7)에서 가자미근 (soleus muscle)을 분리하여 무게를 조사한 결과, MG53 넉아웃 마우스에서 가자미근의 무게가 30% 정도 증가함을 확인할 수 있었다 (도 4a). 또한, MG53 넉아웃 마우스의 가자미근을 DAPI-염색 및 베타-디스트로글리칸 면역형광염색 후 가자미근의 모양과 종단면 면적의 분포를 조사한 결과, MG53 넉아웃 마우스에서 종단면적의 비율과 분포가 높았다 (도 4b 및 4c).
다음으로, MG53는 IRS-1의 유비퀴틴화를 유도하여 IGF 신호전달만이 아니라 인슐린 신호전달을 음성적으로 조절한다는 것을 증명하기 위하여, 아데노바이러스 벡터를 이용하여 MG53를 C2C12 근육모세포에 과량발현시킨 후 6시간동안 혈청이 없는 상태를 유지하였다. 인슐린 100 nM 을 시간대별 (0, 5, 10분)로 처리하고, 면역탁본법으로 MG53, pAkt, Akt, pERK1/2, ERK1/2 및 actin 의 발현을 측정하여 인슐린에 의한 신호전달을 조사하였다. IRS-1 의 타이로신 인산화는 면역침전 후 항-인산-타이로신 항체를 이용한 면역탁본법으로 확인하였다. 그 결과, MG53는 IRS-1, Akt, Erk의 인산화를 방해한다는 것을 확인할 수 있었다 (도 5a). 또한, 8주령의 야생형 마우스 및 MG53 넉아웃 마우스에 인슐린을 혈관 주사 하고 (10분, 5 U/kg), 5분 후 장딴지근 (gastrocnemius muscle) 및 족저근 (plantaris muscle)을 분리하고 인슐린 신호전달물질 pAkt, total Akt, pERK1/2, 총 ERK1/2 및 actin 의 단백질 양 및 IRS-1 의 타이로신 인산화를 면역탁본법으로 확인하였다. IRS-1 의 타이로신 인산화는 항-IRS-1 을 이용한 면역침전 및 항-인산-타이로신 항체를 이용한 면역탁본법으로 확인하였다. 그 결과, 야생형 마우스에 비해서 넉아웃 마우스의 근육에서 IRS-1의 발현량이 증가하였고 인슐린에 의한 IRS-1, Akt, Erk의 인산화가 더 잘 일어남을 확인할 수 있었다 (도 5b). 또한, 8주령의 야생형 마우스 및 MG53 넉아웃 마우스의 가자미근, 장딴지근 및 족저근에서 IRS-1 발현, IRS-1 인산화 및 Akt 인산화를 통계적으로 분석한 결과, 넉아웃 마우스의 근육에서 IRS-1의 발현량이 증가하였고 인슐린에 의한 IRS-1 및 Akt의 인산화가 더 잘 일어남을 재확인할 수 있었다 (도 5c 및 d).
결과 3.
MG53
넉아웃
마우스는 인슐린 저항성을 보이지 않음
10주간 고설탕-고지방식으로 비만 및 당뇨를 유도시킨 4주령의 수컷 야생형 마우스 및 MG53 넉아웃 마우스에 (각 그룹당 n=6) 각각 당부하검사 (glucose tolerance test) 및 인슐린부하검사 (insulin tolerance test)를 수행한 결과, 야생형 마우스에 비해 MG53 넉아웃 마우스의 경우 빠른 혈당 감소를 보여주었다 (도 6a와 b). 또한, 상기 비만을 유도시킨 MG53 넉아웃 마우스의 혈액에서 중성 지방 및 자유 지방산, 전체 콜레스테롤, 인슐린 및 렙틴의 농도를 측정한 결과, 야생형 마우스에 비해 MG53 넉아웃 마우스는 혈중 지방성분 및 대사관련 호르몬의 농도가 정상마우스와 비슷하였다 (도 6c-6g). 이는 MG53이 제2형 당뇨 치료를 위한 타겟 단백질임을 강력하게 보여주는 것이며, 나아가 MG53 의 작용에 반드시 필요한 UBE2H 와의 상호작용을 이용하여 제2형 당뇨 치료제를 효과적으로 선별할 수 있음을 뒷받침한다.
<110> Korea University Research and Business Foundation
<120> Screening method using MG53-UBE2H interaction for the treatment
of type 2 diabetes
<130> DPP20117102KR
<160> 33
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 477
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(477)
<223> MG53 (Genbank accession No. NP_001073401)
<400> 1
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu Arg Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ile Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45
Gly Thr Val Ala Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ser Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Thr Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala Gln Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Met Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Thr Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Met Phe Leu Ala Ala Leu Glu Ser Ser Leu Asp Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Phe Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ser Glu Ser Pro
245 250 255
Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Val Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270
Lys Phe Gln Val Trp Lys Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu
275 280 285
Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
290 295 300
Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Asp Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320
Ala Gly Glu Asp Thr Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335
Gln Gln Leu Leu Ser Gln Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly
340 345 350
Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Met Ala Ala Asp Ala Ser Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Asp Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Pro Pro Ala Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415
Leu Ser Phe Ala Asp Gly Val Leu Ala Phe Tyr Asp Ala Ser Asn Pro
420 425 430
Asp Val Leu Thr Pro Ile Phe Ser Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445
Val Tyr Pro Ile Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gln Glu Gln Ala
465 470 475
<210> 2
<211> 477
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(477)
<223> MG53 (Genbank accession No. NP_001008275)
<400> 2
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Gly Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45
Gly Thr Val Leu Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ser Pro
245 250 255
Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270
Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu
275 280 285
Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
290 295 300
Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320
Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335
His Gln Gln Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Asp Val Gly
340 345 350
Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Ala Ala Glu Ala Pro Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415
Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
420 425 430
Asp Ala Leu Val Pro Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Arg Pro
435 440 445
Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gly Ala Glu Ala
465 470 475
<210> 3
<211> 183
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(183)
<223> UBE2H (Genbank accession No.NP_003335)
<400> 3
Met Ser Ser Pro Ser Pro Gly Lys Arg Arg Met Asp Thr Asp Val Val
1 5 10 15
Lys Leu Ile Glu Ser Lys His Glu Val Thr Ile Leu Gly Gly Leu Asn
20 25 30
Glu Phe Val Val Lys Phe Tyr Gly Pro Gln Gly Thr Pro Tyr Glu Gly
35 40 45
Gly Val Trp Lys Val Arg Val Asp Leu Pro Asp Lys Tyr Pro Phe Lys
50 55 60
Ser Pro Ser Ile Gly Phe Met Asn Lys Ile Phe His Pro Asn Ile Asp
65 70 75 80
Glu Ala Ser Gly Thr Val Cys Leu Asp Val Ile Asn Gln Thr Trp Thr
85 90 95
Ala Leu Tyr Asp Leu Thr Asn Ile Phe Glu Ser Phe Leu Pro Gln Leu
100 105 110
Leu Ala Tyr Pro Asn Pro Ile Asp Pro Leu Asn Gly Asp Ala Ala Ala
115 120 125
Met Tyr Leu His Arg Pro Glu Glu Tyr Lys Gln Lys Ile Lys Glu Tyr
130 135 140
Ile Gln Lys Tyr Ala Thr Glu Glu Ala Leu Lys Glu Gln Glu Glu Gly
145 150 155 160
Thr Gly Asp Ser Ser Ser Glu Ser Ser Met Ser Asp Phe Ser Glu Asp
165 170 175
Glu Ala Gln Asp Met Glu Leu
180
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> si-MG53
<400> 4
aagcacgccu caagacacag c 21
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> si-UBE2H
<400> 5
cuaugaucuu accaauaua 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for MG53
<400> 6
tccctgttgt caggcatcta c 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for MG53
<400> 7
ttcttccaca cctggaattt g 21
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for MyoD
<400> 8
ctcctttgag acagcagacg actt 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for MyoD
<400> 9
aaatcgcatt ggggtttgag cctg 24
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for MyHC
<400> 10
agaaggagga ggcaacttct g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for MyHC
<400> 11
acatactcat tgccgacctt g 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for a-actin
<400> 12
gaagagctat gagctgcctg a 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for a-actin
<400> 13
ctcatcgtac tcctgcttgc t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for UBE2H
<400> 14
aaggaacacc atatgaaggc g 21
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for UBE2H
<400> 15
gcgtacttct ggatgtactc tttaa 25
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for UBE2R1
<400> 16
tgccaagctc gcagaaggcg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for UBE2R1
<400> 17
ccaccgctct gagggcagct 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for UBE2D2
<400> 18
gccctcagct cgtctgatcc g 21
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for UBE2D2
<400> 19
tgataggggc tgtcatttgg ccc 23
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for UBE2E1
<400> 20
tgcctggtta atagttgctg ttgct 25
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for UBE2E1
<400> 21
cactgcagtt tggcggaggg t 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for UBE2L3
<400> 22
aaggggcagg tctgtctgcc 20
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for UBE2L3
<400> 23
cctgctttgc ggggtgtctg a 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for UBE2L6
<400> 24
agctgccgcc ataccttcgc 20
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for UBE2L6
<400> 25
gcaagttcca gacgcacagg ct 22
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for UBE2C
<400> 26
aaaccgcgac ccagctgctg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for UBE2C
<400> 27
gccctgggtg tccacgttgg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for UBE2M
<400> 28
agggcagcag caagaaggcg 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for UBE2M
<400> 29
ggcagacgtt gccctcgagg 20
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for UBE2N
<400> 30
atgtggtcat tgctggcccc c 21
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for UBE2N
<400> 31
gcagaacagg agaagtggtg tacac 25
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for GAPDH
<400> 32
tggcaaattc catggcacc 19
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for GAPDH
<400> 33
agagatgatg acccttttg 19
Claims (8)
- (a) MG53 (mitsugumin 53) 및 UBE2H (ubiquitin-conjugating enzyme E2H)를 발현하는 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 세포에서 MG53 및 UBE2H 의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는,
제2형 당뇨 치료제를 스크리닝하는 방법.
- (a') 분리된 MG53 및 분리된 UBE2H 의 혼합물에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및
(b') MG53 및 UBE2H 의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는,
제2형 당뇨 치료제를 스크리닝하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 MG53 및 UBE2H 의 상호작용을 MG53 또는 UBE2H 에 특이적인 항체를 이용하여 검출하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 MG53 및 UBE2H 의 상호작용을 면역탁본법, 면역침전법 또는 면역염색법에 의해 검출하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 MG53 및 UBE2H 는 각각 리포터 단백질 연결된 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 리포터 단백질은 클로람페니콜아세틸트랜스퍼라제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제 또는 형광 단백질인 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein), 적색 형광 단백질 (red fluorescent protein), 청색 형광 단백질 (blue fluorescent protein), 황색 형광 단백질 (yellow fluorescent protein), 남색 형광 단백질 (cyan fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein), 증강된 적색 형광 단백질, 증강된 청색 형광 단백질, 증강된 황색 형광 단백질 또는 증강된 남색 형광 단백질인 방법.
- 제5항에 있어서, MG53 및 UBE2H 의 상호작용을 리포터 단백질의 신호 크기에 의해 검출하는 것인 방법.
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