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KR20130059390A - 카테콜 ｏ―메틸트랜스퍼라아제 조절제의 확인 방법 - Google Patents

카테콜 ｏ―메틸트랜스퍼라아제 조절제의 확인 방법 Download PDF

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KR20130059390A
KR20130059390A KR1020137002095A KR20137002095A KR20130059390A KR 20130059390 A KR20130059390 A KR 20130059390A KR 1020137002095 A KR1020137002095 A KR 1020137002095A KR 20137002095 A KR20137002095 A KR 20137002095A KR 20130059390 A KR20130059390 A KR 20130059390A
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KR
South Korea
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comt
catechol
substrate
sam
fluorescence
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Application number
KR1020137002095A
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Inventor
틸로 엔데를레
도리스 로트
Original Assignee
에프. 호프만-라 로슈 아게
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Publication date
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Abstract

본 발명은 카테콜 O-메틸트랜스퍼라아제 (COMT) 효소 활성의 조절제의 확인 방법에 관한 것이다.

Description

카테콜 Ｏ―메틸트랜스퍼라아제 조절제의 확인 방법 {METHOD FOR THE IDENTIFICATION OF CATECHOL O-METHYLTRANSFERASE MODULATORS}
본 발명은 카테콜 O-메틸트랜스퍼라아제 효소 활성의 조절제의 확인 방법에 관한 것이다.
카테콜 O-메틸트랜스퍼라아제 (COMT) 는 카테콜 부분을 갖는 기질의 O-메틸화를 촉매화시킨다. COMT 에 의한 메틸화에서의 메틸 공여체는 S-아데노실메티오닌 (SAM) 이다. COMT 는 내인성 카테콜아민 신경전달물질, 카테콜에스트로겐 및 생체이물성 분자의 이화작용에 대해 중요한 역할을 한다. COMT 의 저해는 파킨슨병에서의 새로운 치료법을 개발하기 위한 중요한 접근 방식이다.
W.F. Herblin (Analytical Biochemistry 51, 19-22, 1973) 은 COMT 활성에 대한 비색 검정을 설명한다. 상기 검정은 COMT 에 대한 메틸 수용기로서 니트로카테콜을 사용한다. 니트로카테콜은 산성 pH 에서의 수 중 황색 용액으로서 존재한다 (최대 흡수 350 nm). 약간의 알칼리 pH 에서 파라 (para) 히드록실의 이온화는 용액을 오렌지색으로 변화시킨다 (λ최대 = 430 nm). 더 강한 알칼리에서 메타 히드록실의 이온화는 선홍색 용액을 유도한다 (λ최대 = 520 nm). 상기 검정은 니트로카테콜이 COMT 에 의해 메틸화되며 메틸화된 니트로카테콜이 더 이상 두 번째 이온화로 인한 선홍색을 나타내지 않는다는 관찰을 기반으로 한다. 이러한 검정에서, 기질 (니트로카테콜) 및 SAM 은 민감도를 제한하는 Km 이상인 μM 농도 범위 내에 있어야 한다.
G. Zuercher 및 M. Da Prada (Journal of Neurochemistry, Vol. 38, No. 1, 1982) 는 COMT 활성에 대한 단일 단계 방사화학적 검정을 설명한다. 이러한 검정에서, 카테콜은 COMT 를 [3H]메틸 SAM, Mg2 + 및 아데노신 데아미나아제와 함께 인큐베이션함으로써 매우 낮은 극성의 화합물인 삼중 수소화 (tritiated) 구아자콜로 전환된다. 구아자콜은 낮은 극성의 매질, 예를 들어 톨루엔을 사용하여 추출되며, 섬광계수기에서 계수된다.
상기 기재한 검정은 제한된 민감도 (비색 검정) 또는 검정 설정 (방사화학적 검정에서의 추출 단계) 으로 인해, 다수의 화합물을 그의 COMT 조절제 활성에 대해 자동 스크리닝하는데 적합하지 않다.
그러므로, 다수의 화합물을 그의 COMT 조절 활성에 대해 스크리닝하기에 적합한 민감하고, 균질한 검정법이 필요하다.
본 발명의 제 1 목적에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 카테콜 O - 메틸 트랜스퍼라아제 효소 (COMT) 의 활성 조절제의 확인 방법을 제공한다:
a) 형광 염료에 공유 결합된 COMT 기질을 제공하는 단계,
b) 단계 a) 의 분자를 카테콜 O - 메틸 트랜스퍼라아제 효소 (COMT), S-아데노실메티오닌 (SAM) 및 후보 화합물과 접촉시키는 단계, 및
c) 단계 b) 의 혼합물의 형광 판독을 측정하는 단계 (이때, 블랭크와 비교하여 후보 화합물의 존재 하 변경된 형광 판독은 카테콜 O-메틸 트랜스퍼라아제 효소 (COMT) 의 조절제의 표시임).
바람직한 구현예에서, 상기 방법은 COMT 저해제의 확인 방법이며, 이때 블랭크와 비교하여 단계 c) 에서의 감소된 형광 판독은 COMT 저해제의 표시이다.
추가의 바람직한 구현예에서 COMT 기질은 4-니트로카테콜이다.
추가의 바람직한 구현예에서 형광 염료는 Alexa Fluor® 488 이다.
추가의 바람직한 구현예에서 단계 c) 에서의 형광 판독은 속도 (kinetic) 판독이다.
추가의 바람직한 구현예에서 COMT 는 인간 COMT 이다.
추가의 바람직한 구현예에서 상기 방법은 고처리량 스크리닝 방법이다.
추가의 바람직한 구현예에서 상기 방법은 마이크로타이터 플레이트에서 수행된다.
추가의 바람직한 구현예에서 COMT 의 최종 농도는 약 25 nM 이다.
추가의 바람직한 구현예에서 COMT 기질의 최종 농도는 약 200 nM 이다.
추가의 바람직한 구현예에서 SAM 의 최종 농도는 약 500 nM 이다.
제 2 목적에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 카테콜 O - 메틸 트랜스퍼라아제 효소 (COMT) 의 기질의 확인 방법을 제공한다:
a) 형광 염료에 공유 결합된 COMT 기질 및 S-아데노실메티오닌 (SAM) 을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계,
b) 단계 a) 의 혼합물을 상이한 농도의 후보 화합물과 접촉시키는 단계,
c) 단계 b) 의 혼합물을 카테콜 O - 메틸 트랜스퍼라아제 효소 (COMT) 와 접촉시키는 단계, 및
d) 단계 c) 의 혼합물의 속도 형광 판독을 측정하는 단계 (이때, 후보 화합물 농도 증가의 함수로서 형광 판독 정체기 (plateau) 감소는 카테콜 O - 메틸 트랜스퍼라아제 효소 (COMT) 의 기질의 표시임).
바람직한 구현예에서 COMT 기질은 4-니트로카테콜이다.
추가의 바람직한 구현예에서 형광 염료는 Alexa Fluor® 488 이다.
도 1 은 4-니트로카테콜에 공유 결합된 Alexa Fluor® 488 의 화학적 구조를 나타낸다.
도 2 는 니트로카테콜 (청색), 2-메톡시-5-니트로페놀 (적색) 및 1,2-디메톡시-4-니트로벤젠 (녹색) 에 대한 스턴 볼머 플롯 (Stern Volmer Plot) 을 나타내고; 20 nM 자유 Alexa Fluor 488 을 높은 - 25 mM 까지 - 농도의 니트로카테콜, 2-메톡시-5-니트로페놀 및 1,2-디메톡시-4-니트로벤젠과 각각 혼합하였다. 니트로카테콜에 대해서만, Alexa Fluor® 488 의 형광 세기 변화 (I0/I) 가 관찰되며, 메틸화 산물은 Alexa Fluor® 488 의 형광 세기에 영향을 미치지 않는다.
도 3 은 본 발명의 형광 검정에서의 Alexa Fluor 488-니트로카테콜의 COMT 촉매화된 메틸화의 효소 반응 속도론을 나타낸다.
도 4a 는 다양한 농도의 COMT 저해제 톨카폰 (Tolcapone) 의 존재 하 형광 세기 변화의 속도 측정을 나타낸다.
도 4b 는 도 3a 의 속도 측정의 기울기로부터 계산한 톨카폰에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 5 는 COMT 의 천연 기질인 도파민의 존재 하 형광 검정을 나타낸다. 정체기 감소는 도파민 농도 증가로 이루어졌다. 도파민이 기질이기 때문에 이는 메틸화되며 Alexa Fluor® 488-니트로카테콜 기질 또한 메틸화된다. SAM 의 유용성은 제한되어 (500 nM), 높은 도파민 농도에서 Alexa Fluor® 488-니트로카테콜 기질은 더 이상 완전히 메틸화될 수 없다.
도 6 은 Alexa Fluor® 488-니트로카테콜 기질 추가 전 화합물 및 SAM 의 1 시간 예비-인큐베이션의 존재 및 부재 하 저 (500 nM) 및 고 (200 μM) SAM 농도를 갖는 기질 및 각각의 SAM 농도에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다. 저 SAM 으로의 예비-인큐베이션은 용량 반응 곡선을 낮은 IC50 으로 이동시키는데, 이는 화합물이 SAM 을 소모하기 때문이다. SAM 이 제한되지 않기 때문에 고 SAM 농도에서는 예비-인큐베이션의 존재 및 부재 사이에 차이가 없으며, 용량 반응 곡선은 낮은 SAM 과 비교하여 높은 IC50 으로 이동되는데, 이는 화합물이 소모되기 때문이다.
도 7 은 SAM 경쟁 화합물의 SAM 과의 화합물의 1 시간 예비-인큐베이션의 존재 및 부재 하 저 (500 nM) 및 고 (200 μM) SAM 농도로의 용량 반응 곡선을 다시 보여준다. SAM 경쟁 화합물에 대해서 예비-인큐베이션의 존재 및 부재는 각각의 SAM 농도에 대한 IC50 에 영향을 주지 않으나, 높은 SAM 농도로는 IC50 이 더 큰 값으로 이동된다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 검정은 COMT 기질에 공유 결합된 형광 염료, 예를 들어 니트로카테콜에 공유 결합된 Alexa Fluor® 488 이 분자내 소광 (quenching) 으로 인한 형광 감소를 나타내며, COMT 에 의한 COMT 기질-형광 염료 복합체에서의 COMT 기질의 메틸화가 형광 소광을 없앤다는, 즉 COMT 기질-형광 염료 복합체에서의 COMT 기질의 메틸화가 비 (non)-메틸화 복합체와 비교하여 형광을 증가시킨다는 발견을 기반으로 한다.
용어 "COMT" 는 임의의 동물, 예를 들어 포유류 종 (인간 포함) 으로부터의 자연적 서열 COMT, 및 COMT 변이체 (하기에 추가로 정의함) 를 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. COMT 폴리펩티드는 인간 조직 유형을 포함하는 다양한 근원으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 및/또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.
천연 또는 재조합적으로 생성된 COMT 를 이러한 검정에서 사용할 수 있다. "재조합 단백질" 은 이종 세포에서의 발현에 의해 단리되고, 정제되거나 확인된 단백질이며, 상기 세포는 숙주 세포에서의 단백질 발현을 유도하도록 조작된 재조합 발현 벡터로 일시적 또는 안정적으로 형질도입 (transduced) 되거나 트랜스펙션된다. 재조합 COMT 는 원핵 세포, 예를 들어 대장균 (E. coli), 효모, 예를 들어 S. 폼베 (S. pombe) 또는 진핵 세포, 예를 들어 HEK 293, Sf9 곤충 세포에서 생성될 수 있다. 바람직하게는, Sf9 곤충 세포가 재조합 COMT 의 고발현에 사용된다. 검정에 사용한 COMT 는 정제될 수 있다. 본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "정제된" 은 그의 천연 환경으로부터, 또는 재조합체 생성원으로부터 제거되는, 단리 또는 분리된 폴리펩티드를 지칭하며, 이들이 자연적으로 연관되는 다른 성분, 예를 들어 멤브레인 및 마이크로솜이 60% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상 없다.
"자연적 서열 COMT" 는 그의 제조 방식에 관계없이 자연적으로 발생하는 COMT 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 자연적 서열 COMT 는 자연으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 및/또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 용어 "자연적 서열 COMT" 는 COMT 의 자연 발생적 절단 또는 분비 형태, 자연 발생적 변이체 형태 (예를 들어, 대안적으로 스플라이싱된 형태) 및 자연 발생적 대립형질 변이체를 특히 포함한다. NCBI 데이터베이스에서의 인간 COMT 폴리펩티드의 식별자는 AAA68927 (Seq. Id. No. 1) 이다.
용어 "COMT 변이체" 는 자연적 서열 내에 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 함유하는 자연적 서열 COMT 의 아미노산 서열 변이체를 지칭한다. 아미노산 서열 변이체는 자연적 서열 COMT 와 일반적으로 약 75% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는다.
용어 "화합물" 은 본 발명의 검정과 관련하여 기재된 "시험 화합물" 또는 "약물 후보 화합물" 의 맥락으로 본원에서 사용된다. 그로서, 이들 화합물은 합성적으로 유도되거나 천연 근원으로부터의 유기 또는 무기 화합물을 포함한다. 화합물은 무기 또는 유기 화합물 예컨대 폴리뉴클레오티드, 지질 또는 호르몬 유사체 (상대적으로 저분자량을 특징으로 함) 를 포함한다. 다른 생중합성 유기 시험 화합물은 약 2 내지 약 40 개 아미노산을 포함하는 펩티드 및 약 40 내지 약 500 개 아미노산을 포함하는 큰 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 항체 컨쥬게이트를 포함한다.
용어 "속도 판독" 은 효소 반응의 선형 부분에서의 2 개의 특정 시간 지점에서 측정된 형광 신호의 차이를 지칭한다. 효소 반응의 시초 (시작점) 에 제 1 측정을 수행하고 인큐베이션 시간 후 제 2 판독을 수행하였다 (종말점). 최종 신호는 이후 (rfu(종말점) - rfu(시작점)) / 인큐베이션 시간으로서 rfu/분으로 계산한다 (rfu: 상대 형광 단위).
본 발명의 방법은 효소 카테콜 O-메틸트랜스퍼라아제 (COMT) 를 저해하는 화합물을 확인하는데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 확인된 COMT 저해제는 COMT 에 의한 신경외 카테콜아민의 불활성화가 역할을 하는 질병의 치료, 예방 또는 제어 방법, 예를 들어 우울증의 예방 또는 제어에 사용될 수 있다. 이러한 경우 본 발명의 화합물은 개별적 화합물로서 또는 질병의 전개에 유리하게 영향을 주는 다른 치료적 활성 물질과 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 시험 화합물로 처리된 동물의 조직 샘플에서의 COMT 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 검정은 시험 화합물 (COMT 조절제) 로 처리된 동물, 예를 들어 마우스 및 랫트로부터의 뇌 및 간 조직 샘플에서의 COMT 활성을 측정하기에 적합하다.
실험 부분
4- 니트로카테콜 - Alexa Fluor ® 488 의 합성
1% 트리에틸아민을 함유하는 DMSO 중 아미노에틸-니트로-브렌즈카테킨 [1] 의 10 mM 용액을 1% 트리에틸아민을 갖는 DMSO 중 Alexa Fluor® 488 카르복실산 숙시니미딜 에스테르 [2] (Invitrogen Corporation, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008) 의 10 mM 용액과 1:1 화학량론적 비로 혼합하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 부드럽게 혼합하고, Akta Explorer 100 역상-HPLC 상에서 정제하였다. 생성물을 동결건조하고 DMSO 에 재현탁하였다.
Figure pct00001
형광 검정 프로토콜
하기 검정 프로토콜, 시약 및 재료를 본 발명의 실시예에서 사용하였다. 실시예의 결과를 도 1 - 7 에 기재한다.
마이크로타이터 플레이트:
384-웰 마이크로타이터 플레이트 - Corning 블랙, 평평하고 투명한 바닥, 비-결합 표면, 폴리스티렌 (참조번호 3655)
시약 및 완충제 저장 용액:
ㆍ 완충제 저장 용액:
- M 포스페이트 완충제 pH 7.6 (Na2HPO4 Fluka 71644, NaH2PO4 Merck 6346.0500) (4℃ 에서 보관)
- 580 mM MgCl2 (Merck 1.0833.0250) (RT 에서 보관)
- 1 M CaCl2 (4℃ 에서 보관)
- 65 mM DTT (Sigma D-0632) (-20℃ 에서 보관)
ㆍ 재조합 인간 COMT: 내부 (in house) 제조 (-80℃ 에서 보관)
ㆍ 4-니트로카테콜-Alexa Fluor 488: 내부 제조, DMSO 중 1.3 mM (암환경 하에 RT 에서 보관)
ㆍ S-아데노실-메티오닌: H2O 중 10 mM (Sigma-Aldirch A2804) (-20℃ 에서 보관)
시약 및 완충 용액:
ㆍ 검정 완충제 (최종 농도):
- 40 mM 포스페이트 완충제 pH 7.6
- 2.88 mM MgCl2
- 0.9 mM DTT
- 0.25 mM CaCl2
ㆍ 화합물 희석: 100% DMSO (Sigma 41640) 에 희석, 6.25% DMSO 최종 검정 농도
ㆍ 재조합 인간 COMT: 검정 완충제 중 80 nM, 25 nM 최종 검정 농도
ㆍ 4-니트로카테콜-Alexa Fluor® 488: 검정 완충제 중 320 nM, 200 nM 최종 검정 농도
ㆍ S-아데노실-메티오닌: 검정 완충제 중 800 nM, 500 nM 최종 검정 농도
검정 방법:
10 μl hCOMT (인간 COMT)
2 μl 시험 화합물
진탕기에서 1 분
20 μl 기질-SAM-혼합물
진탕기에서 5 분
판독: 플레이트에서 속도 측정: vision TM 판독기 (여기 475(40) nm, 방출 535(45) nm, 세기 7.5%, 노출 시간 1 초).
<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Method for the identification of catechol O-methyltransferase modulators <130> 26600 WO <150> EP10170957.4 <151> 2010-07-27 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 271 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Glu Ala Pro Pro Leu Leu Leu Ala Ala Val Leu Leu Gly Leu 1 5 10 15 Val Leu Leu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Arg His Trp Gly Trp Gly 20 25 30 Leu Cys Leu Ile Gly Trp Asn Glu Phe Ile Leu Gln Pro Ile His Asn 35 40 45 Leu Leu Met Gly Asp Thr Lys Glu Gln Arg Ile Leu Asn His Val Leu 50 55 60 Gln His Ala Glu Pro Gly Asn Ala Gln Ser Val Leu Glu Ala Ile Asp 65 70 75 80 Thr Tyr Cys Glu Gln Lys Glu Trp Ala Met Asn Val Gly Asp Lys Lys 85 90 95 Gly Lys Ile Val Asp Ala Val Ile Gln Glu His Gln Pro Ser Val Leu 100 105 110 Leu Glu Leu Gly Ala Tyr Cys Gly Tyr Ser Ala Val Arg Met Ala Arg 115 120 125 Leu Leu Ser Pro Gly Ala Arg Leu Ile Thr Ile Glu Ile Asn Pro Asp 130 135 140 Cys Ala Ala Ile Thr Gln Arg Met Val Asp Phe Ala Gly Val Lys Asp 145 150 155 160 Lys Val Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Gln Asp Ile Ile Pro Gln Leu 165 170 175 Lys Lys Lys Tyr Asp Val Asp Thr Leu Asp Met Val Phe Leu Asp His 180 185 190 Trp Lys Asp Arg Tyr Leu Pro Asp Thr Leu Leu Leu Glu Glu Cys Gly 195 200 205 Leu Leu Arg Lys Gly Thr Val Leu Leu Ala Asp Asn Val Ile Cys Pro 210 215 220 Gly Ala Pro Asp Phe Leu Ala His Val Arg Gly Ser Ser Cys Phe Glu 225 230 235 240 Cys Thr His Tyr Gln Ser Phe Leu Glu Tyr Arg Glu Val Val Asp Gly 245 250 255 Leu Glu Lys Ala Ile Tyr Lys Gly Pro Gly Ser Glu Ala Gly Pro 260 265 270

Claims (14)

  1. 하기 단계를 포함하는, 카테콜 O - 메틸 트랜스퍼라아제 효소 (COMT) 의 활성 조절제 확인 방법:
    a) 형광 염료에 공유 결합된 COMT 기질을 제공하는 단계,
    b) 단계 a) 의 분자를 카테콜 O - 메틸 트랜스퍼라아제 효소 (COMT), S-아데노실메티오닌 (SAM) 및 후보 화합물과 접촉시키는 단계, 및
    c) 단계 b) 의 혼합물의 형광 판독을 측정하는 단계 (이때, 블랭크와 비교하여 후보 화합물의 존재 하 변경된 형광 판독은 카테콜 O-메틸 트랜스퍼라아제 효소 (COMT) 의 조절제의 표시임).
  2. 제 1 항에 있어서, COMT 저해제 확인을 위한 방법이며 블랭크와 비교하여 단계 c) 에서의 감소된 형광 판독이 COMT 저해제의 표시인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, COMT 기질이 4-니트로카테콜인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 염료가 Alexa Fluor® 488 인 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c) 에서의 형광 판독이 속도 (kinetic) 판독인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, COMT 가 인간 COMT 인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 고처리량 스크리닝 방법인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로타이터 플레이트에서 수행하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, COMT 의 최종 농도가 약 25 nM 인 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, COMT 기질의 최종 농도가 약 200 nM 인 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, SAM 의 최종 농도가 약 500 nM 인 방법.
  12. 하기 단계를 포함하는, 카테콜 O - 메틸 트랜스퍼라아제 효소 (COMT) 의 기질 확인 방법:
    a) 형광 염료에 공유 결합된 COMT 기질 및 S-아데노실메티오닌 (SAM) 을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계,
    b) 단계 a) 의 혼합물을 상이한 농도의 후보 화합물과 접촉시키는 단계,
    c) 단계 b) 의 혼합물을 카테콜 O - 메틸 트랜스퍼라아제 효소 (COMT) 와 접촉시키는 단계, 및
    d) 단계 c) 의 혼합물의 속도 형광 판독을 측정하는 단계 (이때, 후보 화합물 농도 증가의 함수로서 형광 판독 정체기 (plateau) 감소는 카테콜 O - 메틸 트랜스퍼라아제 효소 (COMT) 의 기질의 표시임).
  13. 제 12 항에 있어서, COMT 기질이 4-니트로카테콜인 방법.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 형광 염료가 Alexa Fluor® 488 인 방법.
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