KR20130043121A

KR20130043121A - 눈 상태의 예방 및/또는 치료를 위한 siRNA 및 방법에 있어서 이의 용도 및 조성물

Info

Publication number: KR20130043121A
Application number: KR1020127034124A
Authority: KR
Inventors: 마르타 로페즈-프라가; 아나 이사벨 히메네즈; 타마라 마르티네즈 발카렐
Original assignee: 실렌티스 에스.에이.유.
Priority date: 2010-05-27
Filing date: 2011-05-27
Publication date: 2013-04-29
Anticipated expiration: 2031-05-27
Also published as: KR101585036B1; LT2576782T; TR201909158T4; CY1121787T1; CN102918157A; CA2800412C; EP2390327A1; AU2011256978B2; AU2011256978A1; CN102918157B; US20130079389A1; SI2576782T1; HRP20191144T1; DK2576782T3; JP2013528382A; RS58912B1; MX2012012501A; ES2732351T3; CA2800412A1; JP2016198104A

Abstract

본 발명은 바닐로이드-1 수용체(vanilloid-1 receptor)(TRPV)의 높은 수준의 발현의 및/또는 활성에 관련된 눈 상태의 예방 및/또는 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

눈 상태의 예방 및/또는 치료를 위한 siRNA 및 방법에 있어서 이의 용도 및 조성물{siRNA and their use in methods and compositions for the treatment and/or prevention of eye conditions}

본 발명은 RNA 간섭(interference)을 사용한 transient receptor potential vanilloid (TRPV1)의 높은 발현 수준 및/또는 활성에 관련된 눈 상태 예방 및/또는 치료에 관한 siRNA 산물, 방법에 있어서 이의 용도 및 조성물에 관한 것이다. 그 밖에, 안구의 불편함, 굴절(refractive) 수술에 따르는 각막(cornea)의 감도 변화, 콘택트 렌즈의 사용, 안구 건조증(dry eye syndrome), 쇼그렌증(Sjogren's syndrome)과 같은 안구(ocular) 통증과 관련된 눈 상태를 완화(mitigated)하는 것이다.

RNA 간섭(RNA interference;RNAi)은 상동성-의존적 유전자 침묵현상(silencing)에 직접적인 작은 이중 가닥 RNA(double stranded RNA;dsRNA) 분자를 사용하는 대부분 진핵(eukaryotic) 세포의 자연적으로 일어나는 조절 기작이다. 예쁜 꼬마선충(C. elegans)에서 Fire 및 Mello에 의해서 발견(Fire, 1998)된 이러한 현상은 2006년에 노벨상을 수상했다. 이러한 현상의 첫 설명 이후 곧, 또한, RNAi는 포유류 세포에서 긴 dsRNA를 통하지 않고 21개 뉴클레오타이드 길이 이중-가닥인 작은 간섭 RNAs(double-stranded small interfering RNAs;siRNAs)에 의해 발생하는 것으로 나타났다(Elbashir, 2001).

RNA 간섭의 과정은 후전사적(post-transcriptional) 유전자 침묵현상으로 불리우는 것을 포함하는 다양한 문(phyla) 및 플로라(flora)에 의해서 일반적으로 공유되고 외부 유전자의 발현을 방지하는데 사용되는 진화로 보존된(evolutionarily-conserved) 세포 방어 기작이 될 것으로 생각된다. RNAi 기작의 발견 이후 작은 분자 또는 단백질을 수반하는 전통적인 약학적 접근을 갖는 비약리(undruggable)한 것과 달리 지정된 표적에 의한 인간 질병을 치료하기 위한 새로운 방법과 같은 선택적으로 유전자 발현을 변화시킬 수 있는 새로운 화합물을 알아내기 위한 연구가 급증했다.

최근 지식에 의해서, RNAi의 기작은 긴 이중 가닥 RNA가 다이서(Dicer)로 알려진 RNA분해효소 III-유사(RNase III-like) 단백질에 의해 처리될 때 개시된다. 상기 단백질 다이서는 일반적으로 N-말단(N-terminal) RNA 헬리카제(helicase) 도메인, RNA-결합 소위(so-called) Piwi/Argonaute/Zwille (PAZ) 도메인, 두 개 RNA분해효소(RNase) III 도메인 및 이중-가닥 RNA 결합 도메인(dsRBD)을 포함하고(Collins,2005) 이것의 활성은 2 염기가 3' 돌출부 및 5' 인산(phosphate) 및 3' 히드록실(hydroxyl group)을 갖는 21-24개 뉴클레오타이드 이중 가닥 siRNAs에 긴 이중 가닥 RNAs의 가공을 야기한다. 상기 결과된 siRNA 이중체(duplexes)는 그 다음 역방향(antisense) 또는 siRNA의 인식하는 RISC를 인도하는 가닥인 RNA-유도한 침묵현상 복합체(RNA-induced silencing complex;RISC)처럼 알려진 효과기 복합체(effector complex)에 결합되었고 RNA 헬리카제(helicase) 활성을 통한 이중-가닥화 siRNA 분자의 아데노신-삼인산(adenosine-triphosphate;ATP)-의존적 풀림(unwinding) 위에 있는 표적 mRNA 서열들(Elbashir,2001)을 절단했다(Nykanen,2001). mRNA의 분해(degradation)를 야기하는 RISC의 촉매적 활성은 엔도뉴클레아제(endonuclease) Argonaute 2(AGO2)에 의해서 매개된다(Liu,2004;Song,2004). AGO2는 매우 보존된 단백질의 Argonaute 계열에 속한다. Argonaute 단백질은 PIWI 및 PAZ 도메인으로 명명된 두 개의 일반적인 도메인을 포함하는 ~100 KDa의 매우 기본적인 단백질이다(Cerutti,2000). PIWI 도메인은 다이서(Dicer) 상호작용에 결정적이고 mRNA 절단을 위한 반응하는 핵산분해효소(nuclease) 활성을 포함한다(Song,2004). AGO2는 상보적인 서열을 포함하는 메신저 RNA를 찾는 것을 인도하는 것처럼 siRNA 이중체의 한가닥을 사용하고 인도(guide) 가닥에 5` 말단에 관련된 염기 10 및 11 사이의 포스포디에스터(phosphodiester) 골격을 잘랐다(Elbashir,2001). RISC의 활성하는 동안 중요한 과정은 복합체로부터 이러한 가닥을 제거하는 AGO2에 의해서 순반향(sense) 또는 승객(passenger) 가닥의 절단이다(Rand,2005). 결정학(Crystallography) 연구는 siRNA 인도 가닥과 RISC에 의해서 직접적으로 표적화하는 mRNA을 인식하는 종 서열(seed sequence)을 구성하는 단지 뉴클레오타이드 2에서 8로 나타나는 PIWI 도메인 사이의 상호작용을 분석했고 분자의 침묵현상에 능력에 절대적으로 영향을 주는 상기 서열에 있어서 단일 뉴클레오타이드의 일치를 목적했다(Ma,2005;Doench2004;Lewis,2003). mRNA는 절단되었기 때문에, 단편들에서 보호되지 않은 RNA 말단의 존재 때문에, mRNA는 더욱 절단되었고 세포 내부의 핵산분해효소에의해서 분해되고 RISC는 그 다음 순회(rounds)를 위해 재생될 것이지만(Hutvagner,2002) 더 이상 단백질로 바꾸어지지(translated) 않을 것이다(Orban,2005). 이것은 특이적 mRNA 분자들과 연관된 단백질들의 선택적 감소를 야기하는 촉매적 과정을 이룬다. 이것은 그것들이 RISC를 활성화하고 강함(potent)을 생산하고 표적 mRNA의 특이적 침묵현상을 포함하는 세포 또는 조직에 직접적으로 전달된 siRNA 효과인자(effectors)에 의한 선택의 조절되는 어떤 유전자의 목적을 갖는 유전자 침묵현상을 위한 이러한 본래의 기작을 개발하는 것이 가능하다.

많은 연구들은 siRNA는 최대 효과, 관련(regarding) 길이, 구조, 화학적 구성요소 및 서열을 갖는 고유한 특징들을 설명하는 것을 게재(published)하였다. siRNA 설계를 위한 초기 매개변수(parameters)는 비록 많은 부가적 연구들, 알고리즘(algorithms) 및/또는 개선들이 그 다음 이래로 게재되었지만 선행 특허 WO02/44321에서 Tuschl 및 동료들(co-workers) 의해서 설정되었다.

또한, 이것을 생물학적 유체(fluids)에서 RNA들의 편재된 원형(ubiquitous nature)을 주는 siRNA에 기초한 치료를 위한 주요한 장애의 하나처럼 이해된 것과 같이 siRNA 안정성을 증가시키는 것에 수많은 노력을 들였다. 안정성 증가하는 데 따르는 중요한 전략들의 하나는 2-O-메틸 뉴클레오타이드, 2-아미노 뉴클레오타이드, 2-O 또는 4-C 메틸렌 연결좌(bridges)를 포함하는 뉴클레오타이드같은 변형된 뉴클레오타이드의 사용이다. 또한, 인접한 뉴클레오타이드를 연결하는 리보뉴클레오타이드(ribonucleotide) 골격의 변형은 주로 포스포로시오에이트(phosphorothioate) 변형 뉴클레오타이드의 소개에 의해서 설명했다. 이것은 종종 효과에 역비례(inversely proportional)하는 증가된 안정성으로 보인다(Parish, 2000). 그리고 단지 어떤 수, 위치 및/또는 변형된 뉴클레오타이드의 조합은 안정적 침묵 화합물을 결과한다. 이것은 siRNA-기초한 치료에 중요한 장애물인 것처럼, 제 EP1527176호, 제 WO2008/050329호, 제 WO2008/104978호 또는 제 WO2009/044392호를 포함하는 이와 같은 예시들(examples)은 좋은 결과를 나타내는 어떤 변형 패턴을 설명해서 다른 연구들은 게재하였다.

Transient Receptor Potential Vanilloid-1 (TRPV1), 소위 바닐로이드 수용체 1(vanilloid Receptor 1(VR-1)은 1997년에 처음으로 발견된 켑사이신(capsaicin)-반응적 리간드-통과 양이온 채널이다(Caterina, 1997). TRPV1는 감각 뉴런(sensory neurons) 위에 주로 발현하고 열, 켑사이신(capsaicin), 양성자(protons) 및 엔도바닐로이드(endovanilloids)를 위한 분자적 검출자처럼 여겨진다(Caterina, 2001; Montell, 2002; Baumann, 2000). 또한, 하지만, 본 발명의 발명자들은 눈물샘(lacrimal gland) 및 모양체 전체(ciliary body)의 조직에서 TRPV1 발현을 발견했다.

TRPV1은 열, 산독증(acidosis), 지질산화효소(lipoxygenase) 산물 또는 아난드아마이드(anandamide), 칼슘과 같은 다른 인자들 및 켑사이신과 같은 길항제에 의해서 활성될 때 세포에 진입하고 통증 신호전달이 개시된다. 채널의 활성은 통증, 신경 염증 및 때때로 평활 근육 수축과 기침에 있어서 통증의 감각에 결과하는 중앙 및 말초 감각 신경 말단으로부터 신경 펩타이드(neuropeptide) 분비를 유도한다. 사실상, 최근 증거들은 통증, 기침, 천식 및 요실금(urinary incontinence)에 있어서 TRPV1의 역할을 제안한다(Jia, 2005). 사실, TRPV1은 통증 자극에 반응에 있어서 통각상실증(analgesia)에 치료를 위한 표적으로 알려졌다. 더욱더, 치료는 통증의 치료에 중점을 갖는 선행특허 제 WO2004/042046호 또는 Schubert(2005)에 설명된 것을 또한 갖는 다른 기술을 사용해서 TRPV1의 발현수준을 감소시키는 것을 설계했다.

다봉형 통각수용기(Polymodal nociceptors)는 매우 풍부한 통각수용기 형태가 각막에서 발견했다. 그것들의 켑사이신(capsaicin), 열 및 산에 반응하기 때문에 그것들의 수용체 파이버(fibers)가 TRPV1 수용체를 발현하는 약학적 증거가 존재한다. 더욱이, 켑사이신의 높은 투여량은 영향받지 않는 것으로 남아있는 기작적인 반응을 포함하는 열 및 산에 대한 각막의 다봉형 통각수용기의 반응을 불활성한다. 이것은 선택적으로 불활성화하는 각막 다봉형 신경 말단에 TRPV1 수용체의 존재를 제안한다. 그러므로, 이것은 각막 상처에 급성 통각 반응의 중요한 부분일 확률이 크고 염증을 동반한 통증 감각들은 지속되고 이러한 조직에서 자극적으로 처리되는 것은 TRPV1 활성에 의해서 매개된다.

더욱더, 제 WO 2007/045930호는 안구 통증 및 안구 건조증에 관련된 병원성(pathologies)의 치료를 위한 TRPV1 특이적 siRNAs의 용도를 설명한다. 그러나, 본 발명은 TRPV1 발현 및 결과로 생기는 안구 불편함의 감소를 위한 개선된 생산물을 제공한다. siRNA 생산물과 전통적 화학적 억제제를 가지고 이러한 상태 치료하는 것의 장점은 긴 지속 효과를 가지는 siRNA에 기초를 둔 치료이다. 이러한 결과는 효과 분자가 더 이상 세포 막 온전한 것 위의 수용체들의 수준을 남기는 전통적인 치료법을 포함하는 찰과(scratch)로부터 새로운 수용체를 합성하는 세포가 존재하고 있지 않기 때문인 사실에 기인한다.

최근 생활-스타일 때문에, 안구 감도 변화에 관계된 안구 병원체들 의해서 영향을 받는 사람 수가 매우 높고 군집의 노화가 증가하는 것이 기대된다. 굴절 수술 및 콘텍트 렌즈 사용은 종종 환자에게서 각막 감도 및 건조된 눈의 감각의 변화를 야기한다. 이것은 컴퓨터 스크린을 바라보는 긴 근로 시간과 보통 조금더 실내공기(atmosphere)를 건조시키는 공기-상태조절 시스템의 사용에 의해서 좀더 악화된다. 또한, 눈물의 양 및 질은 나이에 따라 감소된다. 안구 건조증(dry eye syndromes)을 수반한 증후군은 소양증(itching), 화상(burning) 및 안구 조직의 과민증(irritation)을 포함한다. 건조된 눈의 조금 더 심각한 형태는 쇼그렌 증(Sjogren's syndrome)을 갖는 환자에서 발생한다. 이러한 감각(sensations)의 하나 또는 다른 조합의 존재(presence)는 본문의 의미함에 있어서 안구 통증을 말한다. 본 안구 건조증은 천만 이상 미국인들이 영향을 받는 것으로 추산된다.

[비특허문헌 1] Baumann TK & Martenson ME.(2000). "Extracellular protons both increase the activity and reduce the conductance of capsaicin-gated channels." J Neurosci 20:RC80. [비특허문헌 2] Caterina et al.(1997). "The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway." Nature 389(6653):816-24. [비특허문헌 3] Caterina et al.(2001). "The vanilloid receptor: a molecular gateway to the pain pathway." Annu Rev Neurosci.24:487-517. [비특허문헌 4] Cerutti, L., N. Mian, et al.(2000). "Domains in gene silencing and cell differentiation proteins: the novel PAZ domain and redefinition of the Piwi domain." Trends Biochem Sci 25(10): 481-2. [비특허문헌 5] Collins, R. E. and X. Cheng(2005). "Structural domains in RNAi." FEBS Lett 579(26): 5841-9. [비특허문헌 6] Doench, J.G. Sharp, P.A. "specificity of microRNA target selection in translational repression." Genes Dev. 18, 504-511; 2004. [비특허문헌 7] Elbashir, S. M., W. Lendeckel, et al.(2001). "RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs." Genes Dev 15(2): 188-200. [비특허문헌 8] Fire, A., S. Xu, et al.(1998). "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans." Nature 391(6669): 806-11. [비특허문헌 9] Gonzalez, G. G., Garca, P. et al.(1993). "Reduction of capsacin-induced ocular pain and neurogenic inflammation by calcium antagonists." Invest Ophthalmol Vis Sci34(12):3329-3335. [비특허문헌 10] Hutvagner, G. and P. D. Zamore(2002). "A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex." Science 297(5589): 2056-60. [비특허문헌 11] Jia et al. (2005). "TRPV1 receptor: a target for the treatment of pain, cough, airway disease and urinary incontinence." Drug News Perspect 18(3):165-71. [비특허문헌 12] Lewis, B.P., ShihI. Et al. "prediction of mammalian microRNA targets." Cell 115:787-798;2003 [비특허문헌 13] Liu, J., M. A. Carmell, et al.(2004). "Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi." Science 305(5689): 1437-41. [비특허문헌 14] Ma, J. B., Y. R. Yuan, et al.(2005). "Structural basis for 5'-end-specific recognition of guide RNA by the A. fulgidus Piwi protein." Nature 434(7033): 666-70. [비특허문헌 15] Montell et al.(2002). "Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells." Genes Dev 16(8):948-58. [비특허문헌 16] Nykanen, A., B. Haley, et al.(2001). "ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway." Cell 107(3): 309-21. [비특허문헌 17] Orban, T. I. and E. Izaurralde(2005). "Decay of mRNAs targeted by RISC requires XRN1, the Ski complex, and the exosome." Rna 11(4): 459-69. [비특허문헌 18] Parrish, S., J. Fleenor, et al.(2000). "Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference." Mol Cel l6(5): 1077-87. [비특허문헌 19] Rand, T. A., S. Petersen, et al.(2005)."Argonaute 2 cleaves the anti-guide strand of siRNA during RISC activation." Cell 123(4): 621-9. [비특허문헌 20] Reynolds, A., Leake, D., et al.(2004). "Rational siRNA design for RNA interference." Nat Biotechnol 22(3):326-30. [비특허문헌 21] Schubert, S. et al.(2005). "Local RNA target structure influences siRNA efficacy: systematic analysis of intentionally designed binding regions." J Mol Biol 348:883-893. [비특허문헌 22] Song, J. J., S. K. Smith, et al.(2004). "Crystal structure of Argonaute and it simplications for RISCs licer activity." Science 305(5689): 1434-7. [비특허문헌 23] Ui-Tei, K., Naito, Y., et al.(2004). "Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference." Nucleic Acids Res 32(3): 936-48.

도 1은 본 발명에 서열번호 2로 기재된 화합물, 서열번호 7로 기재된 다른 부위를 표적화하는 앞서 설명한 화합물 및 서열번호 17 내지 서열번호 20으로 기재된 TRPV1을 표적화하게 설계된 다른 4개의 siRNA 그리고 음성 대조군처럼 사용한 혼합(scramble) 서열 TRPV1을 표적화하는 다른 siRNA를 가지고 HeLa 세포주에 형질전환(transfection) 후, 정량-PCR(Qrt-PCR)을 사용한 TRPV1의 일시적인 발현 프로필(profile)을 나타내는 도표이다. 명료하게 이해하기 위해서 동일한 결과들의 두 개의 대체 표현(alternative representations)을 나타냈다.
도 2는 본 발명에 서열번호 2에서 서열번호 6, 서열번호 8에서 서열번호 16 및 음성 대조군처럼 사용한 혼합(scramble) 서열의 다른 siRNAs를 가지고 HeLa 세포주에 형질전환 후, 정량-PCR을 사용해서 TRVP1의 일시적인 발현 프로필을 나타내는 도표이다.
도 3은 켑사이신(capsaicin)을 가지고 자극 후, 본 발명의 서열번호 2로 기재된 화합물을 가지고 처리한 것과 TRPV1 의존 통증을 위한 용인된 특이적 진통제(analgesic)인 켑사제핀(capsazepine)에 비교함에 있어서 토끼에서 눈의 밀리리미터(mm) 단위로 측정한 눈꺼풀의 열림을 갖는 시간표를 나타냈다.
도 4는 본 발명에서 서열번호 2로 기재된 화합물 및 켑사제핀(capsazepine)을 가지고 치료함에 있어서 결과하는, 켑사이신을 가지고 통증 유발 후, 눈꺼풀 열림의 예비 시험 수치에 기대를 갖는 비율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 5는 24시간동안 10% 플라즈마(plasma)에 노출된 후 남은 온전한 산물(%)의 양을 나타내는 그래프이다.

첫 번째 관점에 있어서, 본 발명은 세포에 도입이 되었을 때 서열번호 1을 특이적으로 표적화 및 TRPV1 유전자의 발현을 감소시키는 분자를 포함하는 siRNA의 제공에 관련한다.

본 발명에 있어서 siRNA에 의해서 유전자는 "표적화된다"라 했을 때, 예를 들면, 상기 siRNA 분자는 유전자의 발현을 선택적으로 감소하거나 억제한다. 상기 "선택적으로 감소시키거나 억제한다"는 이러한 경우 TRPV1에 있어서 유전자 하나의 발현에 영향이 있는 siRNA를 포함하는 것처럼 사용한다. 그렇지 않으면, siRNA는 siRNA가 엄중한(stringent) 조건 아래에서 유전자 전사체, 예를 들면, 유전자의 mRNA에 혼성화 되었을 때 유전자를 표적화한다. 상기 "엄중한 조건 아래에서" 혼성화 하는 것은, 표준 조건 아래에서, 예를 들어, 높은 온도 및/또는 낮은 혼성화를 꺼리는(disfavor) 경향이 있는 염 구성, 표적 mRNA 지역에 어닐링(annealing)을 의미한다. 적합한 방법(0.1×SSC, 68℃에서 2시간 동안)은 Maniatis, T., et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, pages 387-389.에서 설명하였다.

핵산 서열은 지시되지 않는 한 5' 에서 3' 방향에 기록된 것을 포함해서 인용하였다. 상기 "핵산"이라는 용어는 각 DNA 또는 RNA 또는 이를 이용한 DNA(adenine;A ,cytosine;C, guanine;G, thymine;T) 또는 RNA(adenine;A, cytosine;C, guanine;G, uracil;U)에서 퓨린(purine) 또는 피리미딘(pyrimidine) 염기로 나타내는 변형된 형태를 말한다. 간섭된 RNA는 T 염기를 구성하는 것을 포함하는 것을 제공한다. 3' 말단에 예를 들면, 심지어 T 염기는 RNA에서 자연적으로 발생하지 않는다. 몇몇의 경우 이러한 염기들은 리보뉴클레오타이드의 사슬에 나타나있는 데옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotides)를 구별하는 dT처럼 나타난다.

상기와 같이 정의된 표적 서열은 그와 같이 정의된 RNA 서열들로 사용될 특이적 화합물을 포함하는 설계된 siRNA의 목적을 위해 사용한 데이터베이스에서 전사체 다양성의 정의처럼 사용된 것과 같은 표적 DNA 서열처럼 설명하였다.

다른 전사체 다양성은 정의된 TRPV1에 연관된다. 유전자 은행 등록 번호(GenBank Accession Numbers)는 대체가능한 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 생산된 4개 TRPV1 전사체에 연관된다:NM_080704(NM_080704.3, GI:117306161), NM_018727(NM_018727.5, GI:117306160), NM_080706(NM_080706.3, GI:117306163) 및 NM_080705(NM_080705.3, GI:117306162). 더욱이, ENSEMBL(MBL-EBI/Wellcome Trust Sanger Institute)는 TRPV1 전사체 5개를 더 게재하였다:ENST00000174621, ENST00000310522, ENST00000344161, ENST00000399752, ENST00000399756, ENST00000399759, ENST00000425167.

본 발명은 이미 밝혀진 최신기술에 비교해서 특별히 효율적인 것이 되는 TRPV1 유전자 발현을 억제하는 siRNA를 제공한다. 상기 특별히 효율적인 것은 높은 억제의 정도 및/또는 동시에 좀더 지속적인 효과를 이루는 것이다.

이러한 신규한 siRNAs는 상기 언급에서 설명된 TRPV1의 모든 전사체 다양성에 일반적인 표적 서열에 맞서서 설계되었다. 그리고 그래서 TRPV1 단백질을 인코딩하는 세포에 있는 모든 mRNAs 존재의 RISC-매개 분해를 매개한다.

본 발명에 의해서 정의되어 상기 언급된 표적화 지역은 서열번호 1(5'-AAGCGCATCTTCTACTTCA-3')로 정의하였다.

결론적으로, 본 발명에 의한 siRNA는 서열번호 1에 대체로 상보적인 RNA 서열을 구성하는 역방향(antisense) 가닥인 이중 가닥 RNA분자를 구성하는 것이 바람직하고 뉴클레오타이드 사이에 쌍을 이루는 표준 염기에 의해서 혼성화하는 가닥 둘다 포함하는 역방향 가닥에 상보적인 RNA 서열을 구성하는 정방향(sense) 가닥을 구성한다.

본 발명에서 표적 mRNA 서열에 "대체로 상보적"을 의미함에 있어서, 또한 표적 서열로 언급함에 "대체로 정의된" 것처럼 이해되었다. "일치(Identity)"처럼 분야의 통상적 기술의 하나로 알려져있는 것, 서열 사이 뉴클레오타이의 순서 및 정체에 일치에 의해서 결정된 것과 같은 뉴클레오타이드 서열간의 서열 관련성의 정도이다. 하나의 구현(embodiment) 있어서 80%를 갖는 siRNA의 역방향(antisense) 가닥과 80% 이상 100% 사이 상보성, 예를 들면, 85%, 90% 또는 95% 상보성은 표적 mRNA 서열에 대체적으로 상보적인 것으로 여겨지고 본 발명에 있어서 사용되었다. 상보성의 비율은 두 번째 핵산 분자에 있어서 인접한 뉴클레오타이드의 세트를 갖는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 순방향에 있어서 염기 쌍이 가능한 첫번째 핵산 분자에 있어서 인접한(contiguous) 뉴클레오타이드의 비율을 설명한다.

기술 분야로부터 알려져 있는 것처럼, 많은 다른 구조들이 RNA 간섭을 이루기 위해서 제안되었다. 일반적으로 이러한 이중 가닥 분자는 약 19개 내지 약 25개의 뉴클레오타이드 길이이고 돌출부(overhangs)를 가질 뿐만 아니라 평활 말단(blunt-ended) 구조를 포함한다. 돌출부는 장점이 된다고 설명하였고 RNA에 의해서 인식을 감소시키는 것과 같은 양쪽 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단 위에 나타나고 다이서(Dicer)의 자연적 부산물을 모방한다. 몇몇의 저자는 하나 돌출부가 되기에 충분하다고 생각되는 것들인 분자의 3' 말단 양쪽을 포함하는 것을 권한다. 다른 것들은 특이적 변형 양식을 갖는 평활 말단의 구조의 사용을 설명하였다(제 EP1527176호, 제 WO2008/104978호 및 많은 다른 것들).

1 및 5 뉴클레오타이드 사이로 구성된 돌출부, 일반적으로 돌출부는 디뉴클레오타이드로 만들어진다. 이 분야에서 사용된 전통적인 분자들은 Tuschl에 의한 초기 연구에서 가르친 것처럼 바람직하게 데옥시뉴클레오타이드로 구성된 3' 디뉴클레오타이드 돌출부를 좀더 구성하는 19개 뉴클레오타이드 이중 가닥 분자로 구성된다(WO02/44321). 이러한 돌출부는 핵산분해효소(RNase) 분해에 저항성이 조금더 증가시킨다고 한다. 이에, Kim et al.(2005)은 21-머(mer) 생산물(디뉴클레오타이드 돌출부를 포함한)은 RISC에 싣기 위해 필요하다고 설명한다. 더욱이, Bramsen et al.(2009)은 침묵현상을 좀더 증가시키기 위한 돌출부에 가능한 불안정한 변형의 소개를 설명한다.

이처럼, 본 발명의 바람직한 전형(embodiment)은 적어도 하나의 돌출부로 구성된 서열번호 1을 표적화하는 siRNA 분자에 관한 것이다.

또 다른 본 발명의 대체가능한 전형은 평활-말단 분자를 제공한다.

아울러, 본 발명의 바람직한 전형은 서열번호 1을 표적화하는 19개 뉴클레오타이드 이중-가닥 구조로 이루어진 또는 구성된 siRNA를 나타낸다. 놀랍게도, 19개 뉴클레오타이드 이중-가닥 RNA는 도 5에서 보는 바와 같이 21개 뉴클레오타이드 및 3' 돌출부를 갖는 앞서서 설명한 생산물보다 분해에 있어서 더욱 저항하는 것을 제공한다.

본 발명의 특별한 전형은 서열번호 1에 대하여 표적화하는 19개 뉴클레오타이드 이중-가닥 평활-말단 siRNA을 나타낸다. 조금 더 특별한 전형 이 화합물은 서열번호 2(5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3')처럼 정의하였다. 조금더 바람직한 전형에 있어서, 상기 siRNA의 역방향 가닥은 적어도 80%이다, 바람직하게 적어도 90%, 서열번호 1에 상보적이다.

더욱이, 배경 기술을 언급한 부분에 있어서 설명한 것과 같이, siRNA분자가 갖는 중요한 이슈는 RNA분해효소의 편재된 자연에 기인하는 생물학적 유체(fluids)에서 그들의 불안정성이다. 그 결과, 뉴클레오타이드에 많은 다른 화학적 변형의 사용은 증가된 화합물 안정성의 목적을 가지고 설명하였다.

또 다른 siRNA 분자의 내재하는 문제는 어떤 사이토카인, 예를 들면, IL-12, IL-6 및/또는 TNF-alpha 뿐만 아니라 I 형 및 또는 II 형 인터페론 생산의 상향 조절을 포함하는 선천적 면역 체계의 비특이적 활성을 유도해서 발견되는 siRNA에 의한 그들의 면역원성(immunogenicity)이다. 이러한 효과들의 기원은 siRNA에 의한 TLR7, TLR8, 및/또는 TLR3과 같은 톨 유사(Toll-like) 수용체의 활성하는 것을 생각한다.

이러한 효과들 둘 다, RNA 분해효소에 의한 인식 및 면역원성, 또한 서열-의존적이라고 설명하였다.

RNA에 감수성을 감소시키는 것에 의한 화합물 안정성을 증가하는 화학적 변형의 몇몇은 잇따른 반응의 면역 인식의 유도 감소함이 또한 가능하다. 그러나, siRNA에 있어서 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드의 삽입은 또한 앞선 부분에서 설명한 것과 같이, 침묵현상효과 감소하는 결과이고 그러므로 신중하게 접근을 해야한다.

따라서, 본 발명의 바람직한 전형에 있어서, siRNA는 화학적 변형을 갖는 적어도 하나 뉴클레오타이드를 좀더 구성한다.

안정성을 증가시키고 면역원적 효과를 감소시키는 바람직한 화학적 변형은 2-O-메틸 뉴클레오타이드, 2-플루오로 뉴클레오타이드 2-아미노 뉴클레오타이드, 2-데옥시뉴클레오타이드, 2-O 또는 4-C 메틸렌 열결좌(methylene bridges)를 포함하는 뉴클레오타이드를 포함한다.

또한, 리보뉴클레오타이드 골격의 변형은 포스포로시오에이트 변형 뉴클레오트이드의 소개에 의해서 인접한 뉴클레오타이드와 연결된다. 본 발명의 의미함에 있어서 좀더 바람직한 화학적 변형은 데옥시사이미딘(deoxythymidine (deoxyribonucleotides)을 갖는 유라실 리보뉴클레오타이드(uracyl ribonucleotides)의 치환(substitution)에 관련된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 전형에 있어서, 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드는 정방향 가닥위, 역방향 가닥 위 또는 siRNA의 두 가닥 위에 있다.

따라서, 하나의 전형에 있어서, siRNA는 서열번호 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16로부터 선택된다.

상기 설명된 것과 같이 siRNA분자는 기술에 있어서 잘 알려진 방법을 사용해서 그들의 본래 구조에 있어서 세포 내부에 전달된다. 예를 들면, 생체 외(in vitro) 유전자 침묵현상을 연구할 때, 이러한 화합물들은 표준 형질전환 조성물을 사용해서 투여하였다. 생체 내(in vivo) 효과를 확인하기 위해서 또한 그대로 또는 예를 들면 리포솜, 특이적 일부(moiety)를 가지고 결합 등과 같은 전달 증가 조성물을 사용해서 투여하였다. 비록 많은 다른 대체물들이 이 기술에 있어서 있지만, 그리고 체내에 원하는 표적 부위에 다르게 의존하는 것을 사용하였다.

그렇지 않으면, 본 발명의 siRNA는 진핵세포 프로모터(promoter)로부터 세포 안에 발현될 수 있다. 재조합 벡터 siRNA 분자 발현의 능력은 전달될 수 있고 표적세포에 있어서 지속될 수 있다. 대신에, 벡터는 핵산분자의 상시적 발현을 위해 제공하는 것을 사용될 수 있다. 이같은 벡터는 필요에 따라 연속적으로 투여할 수 있다. 발현했을 때, siRNA 분자는 표적 mRNA와 상호작용하고 RNA 간섭 반응을 활성한다. 이러한 방법에 있어서 생산된 siRNA 분자는 종종 shRNA(short hairpin RNA)를 의미한다. 그들의 정방향 및 역방향 가닥는 뉴클레오타이드의 작은고리에 의해서 결합된다. siRNA 분자 발현 벡터의 전달은 정맥 또는 근육-내 투여, 실험대상에 재도입에 잇달아 실험대상에 외식된(ex-planted) 표적 세포에 투여 또는 원하는 표적 세포에 도입을 위해 허락한 어떤 다른 방법에 의한 것과 같이 전신적으로 할 수 있다.

본 발명의 추가적 관점은 TRPV1의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 것에 의한 눈 상태의 특성화의 치료 방법에 있어서 사용을 위한 의약제의 준비에 있어서 서열번호 1을 표적화하는 siRNA의 사용에 관련된다. 상기 방법은 환자에 있어서 TRPV1의 발현 억제하는 것으로 구성한다. 상기 억제라는 것은 발현 또는 활성의 감소 또는 하향조절을 지시하는 것에 사용된다. 바람직하게, 상기 눈 상태는 안구 통증(ocular pain)이다. 하나의 전형에 있어서, 눈 상태는 안구의 불편함, 굴절(refractive) 수술에 따르는 각막(cornea)의 감도 변화, 콘텐트 렌즈의 사용, 안구 건조증(dry eye syndrome), 쇼그렌증(Sjogren's syndrome) 및 다른 눈의 병원성으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

TRPV1 mRNA 대하여 직접적인 siRNA를 가지고 치료적 처리는 적은 빈도의 투여와 큰 환자의 수용상태(compliance)를 허락함에 따라서 효과가 관찰된 시간의 길이가 증가된 것에 의한 작은 분자 국소(topical) 안구 점적에 걸쳐 유리한 것을 기대된다. 이것은 안구 건조증과 감막의 감도 변화와 같은 경우에 있어서 종종 만성 상태인 것과 같이 특히 중요하다.

이와 같은 의약품의 준비에 명심해야 할 것은, 본 발명의 siRNA는 공식화된 것이다. 바람직하게는, 언급된 siRNA의 구성 및 공식은 원하는 기관에 국소적으로 투여한다. 눈에 국소 투여를 위해 공식화된 조금 더 바람직한 전형은, 바람직하게 눈의 각막 표면이다. 각막 표면에 적용은, 예를 들면, 눈 점적, 겔, 로션, 크림 또는 안구 삽입의 형태이다. 또 다른 눈에 투여형태는 눈에 주입(injecting)을 포함한다.

본 발명의 좀 더 바람직한 전형은 앞선 항목에 있어서 설명된 것과 같이 TRPV1의 발현 및/또는 활성 증가에 의한 특징된 눈 상태의 치료를 위한 의약품처럼 사용을 위한 서열번호 1을 특이적으로 표적화하는 siRNA에 관련된다. 상기에 설명한 것과 같이, 서열번호 1을 표적화하는 19개 뉴클레오타이드 이중-가닥 구조로 구성되거나 이루어진 siRNA이다. 이러한 siRNA는 평활 말단이다. 바람직하게, siRNA는 서열번호 2로 기재한다. 본 발명에 있어서 사용을 위한 다른 siRNA는 서열번호 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16으로부터 선택되었다.

본 발명의 맥락(context)에 있어서, "특이적으로 표적화(specifically target)"에 본 발명의 siRNA 서열은 적어도 동일한 종(seed) 서열을 구성해야 한다. 그래서, 서열번호 1에 특이적으로 표적화하는 본 발명에 의한 어떤 서열은 역방향 가닥의 2-8 위치에 있어서 결정되어야 한다.

상기에도 불구하고, 본 발명의 siRNA는 눈 이외의 조직에서 TRPV1 발현 침묵현상에 사용된다. 결론적으로, siRNA라 함은 그에 따라 제조된다.

예를 들면, siRNA 분자는 대상에 투여를 위한 리포좀을 포함한 전달 운반체를 구성할 수 있다. 운반체 및 희석제 및 이들의 염은 약학적으로 적합한 제조에 존재할 수 있다. 핵산 분자는 분야에 기술을 포함하지만 제한하지 않는 이온토포레시스(iontophoresis)에 의한 리포좀에 캡슐화, 또는 생분해성 폴리머, 하드로겔, 시클로덱스트린(cyclodextrins) 폴리(lactic-co-glycolic) 산(PLGA) 및 PLCA 마이크로스피어(microspheres), 생분해성 나노캡슐, 및 생접착 마이크로스피어와 같은 다른 운반체에 혼성(incorporation)에 의한 또는 단백질 벡터에 의한 알려진 방법의 다양성에 의해서 세포에 투여될 수 있다. 또한, 또 다른 전형에 있어서, 본 발명의 핵산 분자는 폴리에틸레네민(polyethyleneimine) 및 이의 유도체, 폴리에틸레네민-폴리에틸레네글리콜-N-아세틸갈락토사민(polyethyleneimine-polyethyleneglycol-N-acetylgalactosamine;PEI-PEG-GAL) 또는 폴리에틸레네민-폴리에틸레네글리콜-트리-N-아세틸갈락토사민(polyethyleneimine-polyethyleneglycol-tri-N-acetylgalactosamine;PEI-PEG-triGAL) 유도체 같은 것을 가지고 제조 또는 혼합될 수 있다.

본 발명의 siRNA 분자는 막 붕괴제 및/또는 양이온성(cationic) 지질 또는 협력(helper) 지질 분자를 가지고 혼합된다.

본 발명이 갖는 전달 체계는, 예를 들면, 수용성 및 비 수용성 겔, 그림, 다중 이멀젼, 마이크로이멀젼, 리포좀, 연고, 수용성 및 비수용성 용액, 로션, 에어로졸, 하이드로카본 염 및 분말을 포함하는 것을 사용하고 수화제, 침투 증가제(예를 들면, 지방산, 지방산 에스터, 지방 알코올 및 아미노산) 및 친수성 폴리머(예를 들면, 폴리카보필 및 폴리비닐피로리돈)을 포함할 수 있다. 하나의 전형에 있어서, 약학적 적합한 운반체는 리포좀 또는 경피성 증가제이다.

본 발명의 약학적 제조는 투여에, 인간 표본을 위한 것을 포함하는 세포 또는 대상에, 예를 들면, 전신적 또는 국소 투여, 적합한 형태에 있다. 적합한 형태는, 부분적, 진입 경로, 예를 들면 경구, 경피 또는 주입 또는 그 사용에 의존한다. 이 기술에 있어서 알려진 다른 인자는 독성과 같은 고려사항을 포함하고 본 발명의 구성 또는 이것의 효과에 미치는 것으로부터 제조한 형태이다.

또한, 본 발명은 저장 또는 약학적으로 적합한 운반체 또는 희석제에 있어서 원하는 화합물의 약학적 효과적 양을 포함하는 투여를 위해 준비된 구성을 포함한다. 치료적 용도를 위한 적합한 운반체 또는 희석제는 약학적 분야에 있어서 잘 알려져 있다. 예를 들면, 보존제, 안정데, 염색 및 향미제를 제공될 수 있다. 이러한 것들은 염화 벤조산, 소르비산 및 p-하이드록시벤조산의 에스터를 포함한다. 게다가, 항산화제 및 중지제가 사용될 수 있다.

약학적 효과적 투여량은 발생을 예방, 억제 또는 질병 단계를 치료(어떤 범위에 증후를 완화, 바람직하게 증후의 모두를)함에 요구되는 투여량이다. 약학적 효과적 투여량은 질병의 형태, 조성물의 사용, 투여경로, 포유류 처리의 형태, 특이적 포유류 고려 아래의 신체적인 특징, 병행 약품 및 의학 분야에 이러한 것들을 기술함을 인식할 다른 인자들에 의존한다.

제조 또는 본 발명의 siRNA 및 여기에 설명은 종래의 비 독성 약학적으로 적합한 운반체, 보조제(adjuvants) 및/또는 매개물을 포함하는 단위 투여 제조에 있어서 투여될 수 있다. 제조는 경구 사용에 적합한 형태로 될 수 있다. 예를 들어, 정제, 트로키(troches), 사탕, 수성 또는 유성 희석, 분산시킬 수 있는 분말 또는 과립, 유화, 하드 또는 소프트 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭시르제(elixirs). 경구 사용을 위해 만들어진 조성물은 및 약학적 조성의 제조에 대한 기술에 알려진 방법에 따라 준비할 수 할 수 있고 이 같은 조성물은 약학적으로 훌륭함과 맛좋은 준비를 제공하기 위해 하나 또는 그 이상의 감미제, 향미제, 착색제 또는 보존제를 포함할 수 있다.

정제(Tablets)는 정제 제조를 위해 적합한 비-독성 약학적 적합한 보조제를 가지고 첨가혼합에 활성 분획물을 포함한다.

이러한 부형제는, 예를 들면, 칼슘 카보네이트, 염화 카보네이트, 락토즈, 칼슘 포스페이트 또는 염화 포스페이트와 같은 활성없는(inert) 희석제, 과립제 및 붕해제, 예를 들면, 옥수수 녹말 또는 알긴산, 결합제, 예를 들면 녹말, 젤라틴 또는 아카시아 및 윤활제, 예를 들면 마그네슘 스테아레이트, 스테아산 또는 활석이 될 수 있다

정제는 코팅되지 않을 수 있거나 알려진 기술에 의해서 코팅될 수 있다. 코팅과 같은 몇몇 경우에 있어서 위장관에 흡수 및 분해를 지연하기 위한 알려진 기술에 의해서 준비될 수 있고 이 때문에 긴 기간에 걸쳐 지속된 활성을 제공한다. 예를 들면, 글리세릴 모노스테아레이트 도는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질은 사용할 수 있다.

또한, 경구 사용을 위한 제조는 삽입 고형 희석제를, 예를 들면, 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스포네이트 또는 카오린, 가지고 혼합된 활성 분획을 포함하는 강화 젤라틴 캡슐 또는 물 또는 기름 배지를, 예를 들면 땅콩 기름, 파라핀 또는 올리브 오일, 가지고 혼합된 활성분획을 포함하는 연성 젤라틴 캡슐처럼 제현 할 수 있다.

수용성 희석의 취급을 위한 적합한 부형제를 갖는 혼합물에 있어서 수용성 희석은 활성 재료를 포함한다. 이와 같은 부형제는 희석제, 예를 들면 염화 카복시메틸셀루로스, 메틸셀루로스, 하이드로프로필-메틸셀루로스, 염화 알지네이트, 폴리비닐피로리돈, 껌 트래거캔스 및 껌 아카시아이다; 분산제 또는 습윤제 자연적으로-생성한 포스파티드, 예를 들면, 레세틴, 또는 지방산을 갖는 알킬렌 옥사이드의 응축 생산물, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 긴 사슬 지방족 알코올을 갖는 에틸렌 옥사이드의 응축 생산물, 예를 들면 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 지방산으로부터 유도된 부분적 에스터를 갖는 에틸렌 옥사이드의 응축 생산물 및 폴리록시에틸렌 소비톨 모노올레이트와 같은 헥시톨, 또는 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분적 에스터를 갖는 에틸렌 옥사이드의 응축 생산물, 예를 들면 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레이트일 수 있다.

유층 희석은 식물성 오일을 유효성분으로 희석에 의해서 제조될 수 있다. 예를 들면, 아라키스 오일, 올리브 오일, 참깨(sesame) 오일 또는 코코넛 오일, 또는 액상 파라핀과 같은 미네랄 오일에 상기 유층 희석은 농후제(thickening) 예를 들면, 꿀벌 왁스, 강화 파라핀 도는 세틸 알콜을 포함할 수 있다. 감미제 및 향미제는 입맛에 맞는(palatable) 경구제 제공함에 있어서 첨가될 수 있다. 이러한 조성물은 아스코르브산과 같은 항-산화제 첨가에 의해서 저장될 수 있다.

물의 첨가에 의한 수용성 희석의 준비에 적합한 분산 파우더 및 과립제는 에 분산제 또는 습윤제, 희석제 및 하나 또는 그 이상의 보존제를 갖는 혼화제에 있어서 유효 성분을 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 또는 희석제는 상기 이미 언급된 것에 의해서 비교하였다. 또한, 첨가적 부형제가, 예를 들면 감미제, 향미제 및 착색제, 존재할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 물-안에-오일 이멀젼의 형태가 될 수 있다. 오일 상태는 식물성 오일 또는 미네랄 오일 또는 이러한 것들의 혼합이 될 수 있다. 적합한 이멀젼화 반응물은 자연적으로-생성된 껌이 될 수 있다. 예를 들면, 아카시아 껌 또는 트래거캔스 고무 껌, 자연적으로-생성된 포스파티드, 예를 들면 대두, 레시틴 및 에스터 또는 지방상으로부터 유도된 에스터 일부 및 헥시톨, 무수물(anhydrides), 예를 들면 소르비탄 모놀레이트 및 에틸렌 옥사이드를 갖는 에스터 부분 언급함의 응축 생산물, 예를 들면 폴리옥스에틸렌 소르비탄 모놀레이트. 상기 이멀젼은 감미제 및 향미제를 포함할 수 있다.

시럽 및 엘릭시르제(elixirs)는 감미제를 가지고 제조될 수 있다. 예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소피톨, 글루코스 또는 수크로스. 이와 같은 제조물은 또한 완화제(demulcent), 보존제, 향미제 및 착색제를 포함할 수 있다. 이런 약학적 조성물 또는 본 발명의 siRNA 및 셜명된 것을 포함하는 멸균된 주입물 수용성 또는 유성 희석의 형태가 될 수 있다.

이러한 희석은 상기에 언급된 이것에 적합한 분산제 또는 습윤제 반응물 및 희석 반응물을 사용하는 알려진 기술에 의해서 제조될 수 있다.

또한, 멸균된 주입물 준비는 비-독성 비경(parentally) 적합한 희석제 또는 예를 들면, 1,3-부타네디올(1,3-butanediol)에 용액과 같은 용매 안에 멸균된 주입 용액 또는 희석이 될 수 있다. 적합한 운반제 및 용매 사이는 물, 링거 용액 및 등장(isotonic) 염화 나트륨 용액이 사용될 수 있다. 게다가, 멸균, 고정 오일은 일반적으로 용매 또는 희석된 배지를 사용한다. 이러한 목적을 위해서, 합성된 모노-또는 디글리세라이드(diglycerides)를 포함하는 어떤 부드러운 고정된 오일을 사용될 수 있다. 게다가, 올레산과 같은 지방산은 주입물 준비에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 핵산 분자는 좌약의 형태로, 예를 들면, 약의 직장 투여를 위한, 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 일상적인 온도에서 고형화되지만 직장의 온도에서 액상이고 직장에서 그것들이 녹으면 약물을 분비하는 적합한 비-흥분성 첨가제를 가지고 약물의 혼합에 의해서 준비될 수 있다. 이 같은 물질들은 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycols)을 포함한다.

본 발명의 핵산분자는 멸균된 배지에 비 경구적으로 투여될 수 있다. 약물은, 전달체 및 농도 사용에 의존하는, 운반체에 용해되거나 희석될 수 있다. 유리하게, 국소 마취제, 보존제 및 완충 반응제와 같은 보조제는 운반체에 용해될 수 있다.

이에, 본 발명의 조금 더 바람직한 전형은 앞선 단락에서 설명한 적어도 서열번호 1을 표적화하는 상기 siRNA로 구성된 조성물을 포함하는 약학적 조성물로 간주된다.

이것은 연령, 체중, 일반적인 건강상태, 성별, 식이, 투여 시간, 투여경로, 및 배설률, 약물 조합 및 치료를 진행하는 특정 질병의 중증도 특정 화합물에 쓰이는 활성을 포함하는 인자의 다양성에 의존적인 어떤 특정한 대상을 위한 특이적 투여용량 수준으로 이해되었다.

또한, 본 발명의 핵산 분자는 전반적인 치료효과를 증가시키기 위해서 대상에 다른 치료용 화합물과 같이 투여될 수 있다. 치료에 있어서 지시를 위한 다중적 화합물의 사용은 부작용의 있음이 감소하는 동안 유리한 효과를 증가할 수 있다.

이하, 본 발명을 이에 한정되지 않는 실시예에 따라 구체적으로 설명한다.

< 실시예 1> 생체 외( in vitro ) 분석

TRPV1(유전자 발현의 중요한 억제를 포함하는) 침묵에 siRNA를 위한 특별하게 표적화 서열을 찾기 위해서, 6개의 다른 siRNAs를 실험했다. 상기 siRNAs는 서열번호 2, 7 및 서열번호 17 에서 20기재된 것처럼 설명한다. 서열번호 2는 본 발명에서 다음과 같은 서열을 갖는 것에 의한 서열번호 1을 표적화하는 siRNA이다:

Sense: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'

Antisense: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

서열번호 7(5'-UCGCCACGACAUGCUCUUGdTdT-3')은 TRPV1을 효과적으로 표적화하고 켑사이신(capsaicin) 자극에 안구 반응을 감소시키는 것에 관한 선행특허 제 2007/045930호에 앞서 설명된 전통적인 siRNA 분자(데옥시사이미딘(deoxythymidine)을 만드는 3` 돌출부(overhangs)를 포함하는 21 뉴클레오타이드 길이)와 일치한다. 서열번호 17에서 서열번호 19는 Reynolds et al. 2004 또는 Ui-Tei et al 2004 및 다른 사람들에 의해서 설명된 것과 같은 기술에 있어서 가능한 다른 알고리즘(algorithms)에 의해서 TRPV1에 대하여 설계된 siRNA들과 일치한다. 서열번호 20은 Ambion에 의해서 제공된 일반적으로 가능한 siRNA이고 TRPV1 대하여 설계되었다.

서열번호 17

Sense: 5'-CGCAUCUUCUACUUCAACU-3'

Antisense: 5'-AGUUGAAGUAGAAGAUGCG-3'

서열번호 18

Sense: 5'-GCGCAUCUUCUACUUCAAC-3'

Antisense: 5'-GUUGAAGUAGAAGAUGCGC-3'

서열번호 19

Sense: 5'-AAAGCCAUGCUCAACCUGC-3'

Antisense: 5'-GCAGGUUGAGCAUGGCUUU-3'

서열번호 20

Sense: 5'- UGAUCGCAGGAGUAUCUUUdTdT-3'

Antisense: 5'- AAAGAUACUCCUGCGAUCAdTdT-3'

상기에서 설명된 siRNA의 유효성을 시험하기 위한 모델로써 HeLa(인간 자궁경부 아데노암종;human cervix adenocarcinoma) 세포 배양을 사용했다. HeLa 세포주는 100nM의 다른 화합물을 가지고 트랜스펙션(transfected)했고 리포펙타민(Lipofectamine) 2000을 형질전환체(transfectant) 반응물처럼 사용했다. 모든 형질전환은 표준화된 제조사의 지시서에 조건에 따라서 수행했다. 동일한 형질전환(transfection)에서 다른 혼합 siRNA는 대조군처럼 사용했다. 24, 48 및 72시간에 선별된 세포 펠렛(pellets)은 단백질 수준에서 가능한 차이를 평가했고 실시간-PCR(real-time PCR)에 의해서 처리했다. 정량을 위해서 상기 결과를 실시간 정량-PCR에 의해서 얻었다. 본 발명은 역치 비교(Comparative Threshold) 방법을 사용했다.

그 결과, 도 1에 나타난 것처럼, 서열번호 1로 기재된 표적 서열에 대하여 직접적인 siRNA는 TRPV1 유전자 침묵에 있어서 앞서서 설명한 것과 같은 유전자의 다른 지역에 대한 siRNA 산물에 직접적인 것보다 매우 더 효과적이다. 더욱더, 이러한 효과는 형질전환 후 mRNA 수준의 여전히 유의적으로 하향조절하는 72시간처럼 시간적 유지된다. 이러한 효과의 지속은 예견되지 못한 것이고 서열 특이적이다.

좀더 개선된 산물을 제공된 것의 목적함을 가지고, 다른 화학적 변화(modifications)는 상기 산물에 있어서 하기와 같이 설명함에 의해서 소개되었다:

서열번호 3,

Sense: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'

Antisense: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

서열번호 4,

Sense: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'

Antisense: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

서열번호 8,

Sense: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'

Antisense: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

서열번호 9,

Sense: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'

Antisense: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

서열번호 10,

Sense: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'

Antisense: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

서열번호 11,

Sense: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'

Antisense: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

상기 밑줄은 2-오메틸(2-O methyl) 군을 구성하는 염기를 나타내는 것을 포함한다.

서열번호 5,

Sense: 5'-AAGCGCAdTCdTdTCdTACdTdTCA-3'

Antisense: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

서열번호 6,

Sense: 5'-AAGCGCAdTCdTdTCdTACdTdTCA-3'

Antisense: 5'-dTGAAGdTAGAAGAdTGCGCdTdT-3'

서열번호 12,

Sense: 5'-AAGCGCAdTCUdTCdTACdTdTCA-3'

Antisense: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

서열번호 13,

Sense: 5'-AAGCGCAdTCUdTCdTACUdTCA-3'

Antisense: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

서열번호 14,

Sense: 5'-AAGCGCAdTCUUCdTACUdTCA-3'

Antisense: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

서열번호 15,

Sense: 5-AAGCGCAdTCUUCUACUdTCA-3

Antisense: 5-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3

서열번호 16,

Sense: 5'-AAGCGCAdTCUUCUACUdTCA-3'

Antisense: 5'-UGAAGdTAGAAGAdTGCGCUU-3'

상기 어떤 또는 모든 유라실(uracyl) 뉴클레오타이는 데옥시사이미딘(deoxythymidine) 뉴클레오타이드를 위해 치환된 것을 포함한다.

이러한 화합물은 면역원성(immunogenicity) 분석법에 있어서 서열번호 2(어떠한 변화된 뉴클레오타이드가 없는 동일 화합물)로 기재된 것을 가지고 실험했다. 결과는 모든 이러한 화합물들은 유의미하게 말초성 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells)에 있어서 면역반응의 유도를 감소하는 것을 나타냈다. 더욱이, 그것의 최고수준의 반응이 유도된 대부분의 화합물은 대조군처럼 분석을 포함하는 인간 임상 시도(bevasiranib 및 Sirna-027)를 통해 개선된 siRNA에 의해서 생산된 것이 낮았다.

변형의 변화된 정도는 siRNA의 유전자 침묵 활성 변화할 수 있는 것과 같이, 이들 화합물들은 좀더 그들의 HeLa 세포주에 도입해서 형질전환(transfection)을 통해서 RNA 간섭 정도를 위해서 실험했고 TRVP1 mRNA 수준은 앞선 그래프에서 셜명한 방법에 대한 측정된 결과를 나타냈다.

도 2에서 기재된 것과 같이, 모든 화합물들은 변화된 정도에 있어서 TRPV1 mRNA 수준을 효과적으로 감소시키는 활성을 유지한다.

도 5에서 기재된 것과 같이, 더욱더 기대하지 않은 유리한 효과가 RNA분해효소에 의한 분해(degradation)에 대한 그들의 저항성이 증가된 상기 설명된 화합물로부터 유도되었다.

이러한 실험들을 위해서, 화합물들은 PBS에 있는 10% 인간 플라즈마(plasma)에 2 mM의 최종 농도로 희석되었고 37℃에서 24시간 동안 반응하였다. 샘플들은 그 다음에 HPLC-UV를 사용해서 분석했고 온전한 산물(intact product)의 남아있는 양을 결정했다. 도 5에서 관찰한 것과 같이, 서열번호 2(어떠한 화학적 변형이 없는)의 19개 뉴클레오타이드 이중 가닥 화합물은 앞서 설명한 3' 돌출부를 구성하고 있는 서열번호 21(5'-CAAGAUCGCACAGGAGAGCdTdT-3', 또한 제 WO 2007045930호로 설명된) 대부분 3배 이상 분해에 대한 저항성이 있다. 이러한 효과들은 앞선 그래프에서 설명된 것과 같이 어떤 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함한 서열번호 3의 화합물에 있어서 좀더 증가되었다.

< 실시예 2> 생체 내( in vivo ) 분석

안구 건조 동물 모델 및 결막 통증은 토끼를 사용해서 자주 만든다. 본 발명에서는 뉴질랜드 백색 토끼(New Zealand White rabbits)를 사용했다. 이러한 끝에, 본 발명의 siRNA의 큰 장점은 다른 동물의 서열들에 걸쳐서 TRPV1 유전자의 높게 보존된 지역인 서열번호 1 표적화 서열이다. 사실, 상기 서열은 인간과 본 발명의 질환을 말함의 연구를 위해서 특별히 적합한 동물모델을 제작한 토끼사이에 동일하다.

실험은 하기에 설명된 것으로 이 분야에 숙련자에게 알려진 안구(ocular) 통증의 표준 모델을 사용해서 수행했다(Gonzalez et al. 1993). 간략히, 통증은 1% capsaicin(TRPV1의 길항제로 알려진)의 용액 30ml을 적합한 마이크로파이펫(micropipette)을 사용해서 눈에 점적주입법(instillation)을 사용해서 유발했다.

윤리적인 고려를 위해서, 동물은 capsaicin 길항제로 알려진 capsazepine 5mM의 투여량 또는 실험하는 화합물을 포함하는 용액 40 ml을 앞서서 투여된 capsaicin를 가지고 처리했다. 그래서, 진통(analgesic) 효과는 참고 처리처럼 capsazepine를 비교해서 측정했다.

실험 및 참조 아이템은 1일에서 3일 하루에 한번 점적주입(instilled)했고 4일(걸음짐작으로(pace out) 60분)째는 하루에 두 번 우측 눈에 주입했다. 4일째, 최종 점적주입 후 15분, 결막 통증은 capsaicin 1%의 단회(single) 점적주입으로 동물의 우측 눈에 유도되었다. 반대쪽(contralateral) 눈은 인산완충용액(PBS)를 가지고 본 연구 및 대조군처럼 점적주입했다.

통증의 반응을 측정하기 위해서, 눈커풀 열림(palpebral opening)을 측정했다. 이것은 눈이 통증에 반응해서 닫히는 것으로 생각되고 통증의 감각 저하(subside)하면 눈커풀 열림이 정상 수준으로 돌아가 증가할 것이다. 상기 안구 열림은 처리전(정상수준;baseline), 통증 유발 시험 직전 및 통증 유발 후 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30분에 측정했다.

도 3 및 도 4에 기재된 것처럼, 본 발명의 시험된 화합물은, 특히 서열번호 2로 기재된 화합물, capsazepine(눈커풀 열림의 정도에 의해서 측정된 눈 회복)보다 높은 진통효과를 유발을 관찰했다. 그러므로 상기 화합물은 안구 불편함을 위한 효과적인 치료적 처리법을 제공했다.

또한, 다른 생체 내(in vivo) 실험은 선행특허 제 WO 2007045930호에 있는 앞서 설명한 서열번호 21을 가지고 한 것을 따라본 발명의 토끼 눈에 투여된 서열번호 2, 4 및 5로 기재된 화합물로 수행했다. 이 경우에 있어서, 토끼(처리 군당 6마리 동물)는 연속적인(consecutive) 3일 동안 화합물의 투여는 매일 투여되었다. 3일째, 최종 점적주입 두 시간 후, 동물은 부검되었다. 상기 회복된 토끼로부터 수득한 안구 조직 및 TRPV1 특이적 mRNA는 RT-PCR을 사용해서 분석했다. 하기와 같이 기재된 표는 TRPV1 유전자 참묵현상의 수준은 수득한 조직에서 나타난 서열번호 21로 기재된 화합물 참고를 가지고 수행된 억제의 %의 비율처럼 나타냈다.

이러한 결과를 명확하게 하기 위해서, 본 발명의 화합물은 앞서 설명된 화합물들보다 안구 조직에서 TRPV1 유전자 발현이 침묵했을 때 조금 더 효과적이다. 본 발명의 화합물의 긴 지속 효과와 함께 높은 효과는 특별하게 개선된 환자의 삶의 질을 영유하는 더 많은 시간을 허락하는 것과 같은 유효한 투여 방법(regimes)을 제공한다.

<110> Sylentis S.A.U. <120> siRNA and their use in methods and compositions for the treatment and/or prevention of eye conditions <130> 12fpi-10-09 <150> PCT/GB2011-051007 <151> 2011-05-27 <160> 41 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aagcgcatct tctacttca 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 2 aagcgcaucu ucuacuuca 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> uracil has a 2'-O methyl group <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> uracil has a 2'-O methyl group <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> uracil has a 2'-O methyl group <400> 3 aagcgcaucu ucuacuuca 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> adenine has a 2'-O methyl group <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> adenine has a 2'-O methyl group <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> adenine has a 2'-O methyl group <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> adenine has a 2'-O methyl group <400> 4 aagcgcaucu ucuacuuca 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n=deoxythymidine <400> 5 aagcgcancn ncnacnnca 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n=deoxythymidine <400> 6 aagcgcancn ncnacnnca 19 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n=deoxythymidine <400> 7 ucgccacgac augcucuugn n 21 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> uracil has a 2'-O methyl group <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> uracil has a 2'-O methyl group <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> uracil has a 2'-O methyl group <400> 8 aagcgcaucu ucuacuuca 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> uracil has a 2'-O methyl group <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> uracil has a 2'-O methyl group <400> 9 aagcgcaucu ucuacuuca 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> adenine has a 2'-O methyl group <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> adenine has a 2'-O methyl group <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> adenine has a 2'-O methyl group <400> 10 aagcgcaucu ucuacuuca 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> adenine has a 2'-O methyl group <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> adenine has a 2'-O methyl group <400> 11 aagcgcaucu ucuacuuca 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n=deoxythymidine <400> 12 aagcgcancu ncnacnnca 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n=deoxythymidine <400> 13 aagcgcancu ncnacunca 19 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n=deoxythymidine <400> 14 aagcgcancu ucnacunca 19 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n=deoxythymidine <400> 15 aagcgcancu ucuacunca 19 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n=deoxythymidine <400> 16 aagcgcancu ucuacunca 19 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 17 cgcaucuucu acuucaacu 19 <210> 18 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 18 gcgcaucuuc uacuucaac 19 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 19 aaagccaugc ucaaccugc 19 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n=deoxythymidine <400> 20 ugaucgcagg aguaucuuun n 21 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n=deoxythymidine <400> 21 caagaucgca caggagagcn n 21 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 22 ugaaguagaa gaugcgcuu 19 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 23 ugaaguagaa gaugcgcuu 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 24 ugaaguagaa gaugcgcuu 19 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 25 ugaaguagaa gaugcgcuu 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n=deoxythymidine <400> 26 ngaagnagaa gangcgcnn 19 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n=deoxythymidine <400> 27 caagagcaug ucguggcgan n 21 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 28 ugaaguagaa gaugcgcuu 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 29 ugaaguagaa gaugcgcuu 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 30 ugaaguagaa gaugcgcuu 19 <210> 31 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 31 ugaaguagaa gaugcgcuu 19 <210> 32 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 32 ugaaguagaa gaugcgcuu 19 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 33 ugaaguagaa gaugcgcuu 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 34 ugaaguagaa gaugcgcuu 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 35 ugaaguagaa gaugcgcuu 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n=deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n=deoxythymidine <400> 36 ugaagnagaa gangcgcuu 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 37 aguugaagua gaagaugcg 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 38 guugaaguag aagaugcgc 19 <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <400> 39 gcagguugag cauggcuuu 19 <210> 40 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n=deoxythymidine <400> 40 aaagauacuc cugcgaucan n 21 <210> 41 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against TRPV1 <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n=deoxythymidine <400> 41 gcucuccugu gcgaucuugn n 21

Claims

서열번호 1을 특이적으로 표적화하는 분자인 TRPV1의 발현 및/또는 활성 증가를 특징으로 갖는 눈 상태의 치료함에 있어서 siRNA의 용도.
제 1항에 있어서, 상기 눈 상태는 각막(ocular)의 통증인 siRNA의 용도.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 눈 상태는 굴절(refractive) 수술에 따르는 감도 변화, 콘텐트 렌즈의 사용, 안구 건조증(dry eye syndrome) 및 쇼그렌증(Sjogren's syndrome)으로부터 선택된 siRNA의 용도.
상기(preceding) 청구항에 있어서, 상기 siRNA는 19개 뉴클레오타이드 이중-가닥(stranded) 구조로 구성된 siRNA의 용도.
제 4항에 있어서, 상기 siRNA는 평활-말단(blunt-ended)인 siRNA의 용도.
서열번호 1을 특이적으로 표적화하는 분자 및 세포에 도입될 때 TRPV1 유전자의 발현이 감소하고 19개 뉴클레오타이드 평활-말단 이중-가닥 구조로 구성된 siRNA인 siRNA 분자.
상기 청구항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 2로 기재된 siRNA 분자.
상기 청구항에 있어서, 상기 적어도 하나의 뉴클레오타이드는 화학적 변형(modification)으로 구성된 siRNA 분자.
제 8항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드의 화학적 변형은 2-O 메틸레이션(2-O Methylation) 및 데옥시사이미딘(deoxythymidine) 뉴클레오타이드 및 이의 관한 조합을 갖는 우라실 리보즈(uracyl ribose) 뉴클레오타이드의 치환으로부터 선택된 siRNA 분자.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 화학적 변형은 순방향 가닥, 역방향 가닥 또는 두 방향 모두 위에 있는 siRNA 분자.
제 8항에서 제 10항 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 3 내지 서열번호 6 및 서열번호 8 내지 서열번호 16으로 기재된 siRNA 분자.
상기 어느 한 항에 있어서, TRPV1의 발현 및/또는 활성의 증가에 의해서 특징을 갖는 눈 상태의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 siRNA의 용도.
제 12항에 있어서, 상기 눈 상태는 안구 통증인 용도.
제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 눈 상태는 감도의 굴절(refractive) 수술에 따르는 감도 변화, 콘텐트 렌즈의 사용, 안구 건조증(dry eye syndrome) 및 쇼그렌증(Sjogren's syndrome)으로부터 선택된 용도.
제 6항 내지 제 11항에 기재된 적어도 어느 하나의 siRNA로 구성된 조성물을 포함하는 약학적 조성물.