KR20130005285A

KR20130005285A - 세포 골격 구조물

Info

Publication number: KR20130005285A
Application number: KR1020127026430A
Authority: KR
Inventors: 존 더블유. 루드로우; 켈리 아이. 거스리; 케니 존슨; 앤드류 티. 브루스
Original assignee: 텐젼, 인코포레이티드
Priority date: 2010-03-09
Filing date: 2011-03-08
Publication date: 2013-01-15
Also published as: CA2791736A1; JP2013521882A; US20110224800A1; EP2544726A1; AU2011224448A1; WO2011112626A1; NZ601919A; CN103221076A

Abstract

본 발명은 골격과 복막 조직으로부터 유래된 세포들을 이용하여 장기 또는 조직 구조의 재생, 재건, 수리, 확대 또는 대체에 관한 것이다.

Description

세포 골격 구조물 {CELL-SCAFFOLD CONSTRUCTS}

본 발명은 복막 조직 원천으로부터 수득한 세포들을 살포한 골격(scafold)를 이용한, 박판 조직화된 내강형(luminal) 장기 또는 조직 구조의 재생, 재구성, 확대 또는 대체에 관한 것이다.

몇 가지 이형(anomalies)은 방광이 비정상적으로 발달하는 원인이 될 수 있으며, 외과적인 확대(surgical augmentation)가 필요할 수 있다. 둔부 요도 판막(posterior urethral valves), 쌍방 비정상적인 위치의 수뇨관(bilateral ectopic ureters), 방광외반(cloacal extrophy), 총배설강 외번증(cloacal extrophy), 그리고 척추 피열(spina bifida) (예를 들면, 척추수막류)과 같은 이상은 방광이 제대로 기능을 하지 못하게 하는 원인이 될 수 있고, 작은 용량의 방광이 되어 고압을 초래할 수 있다. 임상적으로, 비뇨생식계내의 고압으로 인하여 신부전의 위험이 증가되면서 환자는 실금을 겪게 하는 원인이 된다. 이들 소아 환자들을 위한 현재 표준 치료는 방광확대성형술(enterocystoplasty)을 통하여 방광을 확대하는 것이다(Lewis et al . Br . J. Urol . (1990); 65:488-491). 방광 확대는 환자의 대장의 일부를 제거하고 그 다음 이 조직을 기존 방광에 연결시켜 순응성을 증가시키고, 압력을 감소시키고, 그리고 용량을 개선하는 것과 관련된다. 수술은 상대적으로 복잡하고 비용이 많이 든다. 양호한 기술적 결과를 얻은 환자의 경우에도 이 수술 과정은 직접적인 상당한 위험 및 만성 합병증이 연루된다. 이러한 침습성이며, 고비용의 그리고 합병증이 있는 외과술은 극도로 심각한 방광 결함에만 사용이 제한된다. 많은 경우 방광암의 결과로 방광 대체를 요하는 성인에서 유사한 외과 수술이 실시된다. 성인의 경우, 전체 방광을 절제해내고, 대장으로 대체한다. 부작용의 위험에도 불구하고, 미국에서 선천적 이상을 가진 어린이중 약 10%와, 방광암과 같은 후천적 장애를 가진 성인 90%를 포함하여, 이 시술은 매년 대략 10,000회 실행된다. 현재 표준 관리와 연관된 부작용을 제거하거나 또는 적어도 실질적으로 감소시킬 수 있는 개선된 방법이 명백하게 의학적으로 요구된다.

인간의 비뇨기 방광은 골반 강의 전면 부분에 위치한, 소변 저장기로 기능하는 근층막성(musculomembranous) 주머니로서, 수뇨관을 통하여 소변을 받아들이고, 그리고 요도를 통하여 배설한다. 인간에서, 방광은 골반 뼈 뒤 골반(치골 결합부(pubic symphysis))에 있으며 그리고 신체의 외부로 빠져나가는 요도라고 불리는 배약관이 상위 후부에 연결되어 있다. 비뇨기 방광은 환자에서 비뇨기 방광을 악화시키는 원인이 되는 다양한 병과 손상을 받게 된다. 예를 들면, 방광 악화는 감염성 질환들, 신생물 그리고 발달성 기형으로 인한 것일 수 있다. 더욱이, 방광 악화는 예를 들면, 차 사고 및 운동 손상과 같은 트라우마의 결과로 또한 일어날 수 있다. 방광 암 환자들에게는 비뇨기 전환이 흔히 필요하다. 미국에서 매년 54,000건 이상의 새로운 방광암이 발생한다. 대부분의 방광 암은 상피 기원이며, 그리고 세계적으로 매년 대략 336,000건의 새로운 요로상피종양 (이행 세포 암종(TCC))이 발생된다(Kakizoe (2006) Cancer Sci . 97(9) 821).

비뇨기 전환(diversion)은 비뇨기 체계가 손상되거나 기능을 못하여 소변을 배출할 수 없을 때 신체로부터 소변을 내보내는 방식이다. 일반적으로, 소변의 흐름을 차단하고, 수뇨관 및/또는 신장내 압력을 증가시키는 임의의 상태는 비뇨기 전환이 필요할 수 있다. 전환이 필요한 일부 공통적인 징후는 방광절제를 요하는 방광암, 신장 기능에 영향을 주는 신경성 방광, 방광에 방사능 손상, 여성에서 발생하는 난치성 실금, 그리고 만성 골반 통증 증후군을 포함한다. 일반적으로, 비뇨기 전환에는 두 가지 주요 방법이 있다: 요루(urostomy)와 요자제형 전환(continent diversion). 요루는 복부에 기공(stoma)을 만들고, 이 기공은 소장 점막하조직 (SI)의 짧은 부분, 예를 들면, 회장, 결장 또는 공장과 같은 신체 내부 도관에 연결시키는 것을 포함한다. 이 과정에서, 짧은 SI의 또 다른 말단은 신장으로부터 방광으로 소변을 정상적으로 옮기는 수뇨관에 연결된다. 소변은 수뇨관을 통하여 짧은 SI로 그리고 기공을 나와 외부 수거 저장소로 이동한다. 이 과정의 대안은 기공에 직접적으로 수뇨관을 부착시키는 것으로, 요관루조성술(ureteristomy)이라고도 한다. 요자제형 전환은 위장 또는 소장 또는 대장의 구역으로부터 신체의 내부에 주머니 또는 저장소를 만드는 것과 관련되며, 기공의 사용이 필요할 수도 또는 필요없을 수도 있다. 예를 들면, 창자의 일부분을 얻고, 이를 좀더 구형의 모양으로 변형시킴으로써 요자제형 피부 요저장소(continent cutaneous reservoir)를 만들 수 있다. 변형된 부분의 한 단부는 수뇨관에 연결하고, 다른 단부는 기공에 연결하여 외부 수거 저장소로 안내된다. 끝으로, 정위성 전환술(orthotopic diversion)은 본래의 방광을 대신하여 재-성형된 부분의 한 단부를 수뇨관에, 그리고 다른 단부를 요도에 연결함으로써 실시할 수 있는데, 개인은 기공을 통하는 대신 요도로 뇨를 배출할 수 있도록 하는 것이다.

비록 소장 점막하조직 (SI)이 비뇨기 전환에 이용될 수 있지만, 점막 및 점막하조직의 제거는 장(intestinal) 부분의 수축을 유도할 수 있다고 보고된 바 있다(예를 들면, Atala , A., J. Urol . 156:338 (1996) 참고). 방광 외과술에서 위장 특정 부분의 사용으로 돌 형성, 점액 생산 증가, 신조직형성, 감염, 대사 방해, 장기(organ) 긴장 및 재흡수를 포함하는 다른 문제점들이 보고되었다. 비뇨기 전환을 위한 천연 재질의 이용은 특이적 근 탄성 성질 및 요상피 불투과성 기능을 가진 방광 조직을 용이하게 대체할 수 없다는 것을 보여주었다. 게다가, 비뇨기 전환을 위하여 환자 자신의 장(bowel) 부분을 사용하려면 적어도 두 가지 상이한 외과 과정을 요구하는데, 첫 번째 외과술은 장 부분을 떼내는 것이며, 두 번째 외과술은 비뇨기 전환을 설치하는 것이다. 다중 외과술이 요구된다는 점은 과정의 전체 비용을 증가시키고, 환자 및 환자의 전반적인 편안함에 대한 위험을 증가시킨다.

따라서, 비뇨기 전환을 위한 위장 부분의 이용 및 다중 외과적 과정의 요구와 관련된 다중 복잡성으로 인하여, 비뇨기 전환 시스템을 필요로 하는 환자에게 이 시스템을 제공하는 방법 및 장비들이 필요하다.

요실금은 전체 지역 사회 및 의료 환경 모두에서 모든 연령대 및 신체적 건강 수준의 사람들에게 영향을 주는 만연한 문제이다. 의학적으로 요실금은 환자가 요로 감염, 욕창(pressure ulcers), 회음부 발진(perineal rashes), 그리고 요로성폐혈증(urosepsis)에 걸리기 쉽도록 만든다. 사회적으로 그리고 심리적으로, 요실금은 당황, 사회적 비난, 우울과 연관되며, 그리고 특히 노년의 경우, 요양시설에 수용될 위험의 증가와 관련있다(Herzo et al ., Ann . Rev . Gerontol . Geriatrics , 9:74 (1989)). 경제적 비용도 상당한데, 미국에서만 내년 100억불이상이 실금 관리에 소요된다.

실금은 진성 긴장성 요실금(방광 및 요도 운동기능항진), 내인성 괄약근 실조 ("ISD"), 또는 이 둘 모두가 원인일 수 있다. 실금은 여성에 특히 흔하고, 어린이(특히, ISD)와 그리고 근치적 전립샘 적출술(radical prostatectomy)을 받은 남성에서도 그 정도가 좀 덜하지만 존재한다.

긴장성(Stress) 실금은 기침, 재채기, 웃음, 또는 운동과 같은 복부 내 압력을 증가시키는 물리적 활동 동안 발생하는 본의아닌 소변 방출이다. 사람들은 한가지 또는 두 가지 유형의 실금에 시달릴 수 있는데, 이들 모두를 겪는 경우, 복합형(mixed) 실금이라고 한다. 실금과 관련된 모든 지식에도 불구하고, 절박성(urge) 실금의 대부분은 특발성(idiopathic)으로, 이는 특별한 원인이 확인되지 않는다는 것을 말한다. 절박성 실금은 임의의 나이에 누구에게나 발생될 수 있지만, 여성 및 노인에게 좀더 흔하다.

배뇨근(detrusor)은 방광으로부터 소변을 배출하기 위하여 수축하는 방광 벽 근육이다. 과반사증(hyperreflexia)과 같은 배뇨근 이상기능의 결과는 빈약한 방광 순응(compliance), 높은 방광 내압, 그리고 방광 용량의 감소를 포함하는데, 이들 모두 상부 요로의 악화를 초래할 수 있다.

절박성 실금에 대한 한 가지 현행 치료는 보틀리늄 독소, 예를 들면, Botox와 같은 신경 독소의 주사다. 보틀리늄 독소는 방광 벽의 배뇨근 근육을 무력화시키거나 또는 방광내 구심성 경로들에게 영향을 주고, 그리고 요상피하 신경에 감각 수용체들을 감소시킴으로써 방광 과다반응에 영향을 주는 것으로 간주된다. 보틀리늄 독소 분자의 큰 크기는 방산되는 능력을 제한할 수 있고, 따라서 구심성 그리고 원심성 신경 섬유 모두에 도달하는 것을 방해한다. 그 결과, 과민성 방광 (OAB)에 대한 현행 투여 방법은 예를 들면, 방광 근육 벽으로 보틀리늄 독소를 여러차례(일반적으로 20 내지 50회) 주사해야 하며, 따라서, 병원 방문 횟수가 늘어나며, 관련 치료 비용도 증가된다. 더욱이, 방광으로부터 감각 신경전달물질 방출의 만성적 장기 억제의 안전성에 대해 아직 확인되지 않고 있다.

요실금의 치료를 위한 추가 방법은 방광 이완 성질을 가진 약물, 이러한 약물의 버팀을 제시하는 항콜린성 약물의 투여와 관련된다. 예를 들면, 프로판테린 브롬화물과 같은 항콜린작용제, 그리고 라셈체 옥시부티닌과 디시클로민과 같은 복합 평활근 이완/항콜린작용제는 절박성 실금을 치료하는데 이용되었다. (예를 들면, A. J. Wein , Urol . Clin . N. Am ., 22:557 (1995) 참고). 그러나, 흔히 이러한 약물 요법은 모든 부류의 요실금 환자에서 완벽한 치료를 얻지 못하고, 그리고 대개 환자들에게서 심각한 부작용을 초래한다.

약물 요법이외에, 본 발명 이전에 당업자가 이용하는 다른 선택으로 인공 괄약근의 사용(Lima S. V. C. et al ., J. Urology , 156:622-624 (1996), Levesque P. E. et al ., J. Urology , 156:625-628 (1996)), 방광 목 지지 보철의 사용(Kondo A. et al., J. Urology , 157:824-827 (1996)), 교차-연결된 콜라겐 주사의 사용(Berman C. J. et al., J. Urology , 157:122-124 (1997), Perez L. M. et al ., J. Urology , 156:633-636 (1996); Leonard M. P. et al ., J. Urology , 156:637-640 (1996)), 그리고 폴리테트라플로로오에틸렌 주사의 사용(Perez L. M. et al ., J. Urology , 156:633-636 (1996))을 포함한다.

ISD와 관련된 요실금 치료의 최근 공개된 방법은 환자의 요도주위에 내시경으로 콜라겐을 주사하는 것이다. 이 방법은 방광 누출 또는 긴장성(Stress) 실금의 가능성을 감소시키기 위한 노력으로 방광 근육을 확대한다.

실금을 우회하는 기존 해결책들은 잘 알려진 단점들을 가진다. 방광 목 주변 내시경에 의한 콜라겐의 직접 주사는 심각한 병적 상태없이 괄약근 결함에 상당한 높은 성공률을 가지지만, 콜라겐의 이용으로 평균 2년후 발생되는 기능부전을 초래하여 비용 효과면에서 고려해볼 필요가 있다(Khullar V. et al ., British J. Obstetrics & Gynecology , 104:96-99 (1996)). 게다가, 주로 이동 현상으로 인하여(Perez L. M. et al.) 환자의 자제(continency) 악화는 자제의 복원을 위하여 반복적 주사를 요구할 수 있다(Herschorn S. et al ., J. Urology , 156:1305-1309 (1996)).

긴장성 요실금 치료를 위하여 근치적 전립샘 적출술 후 콜라겐의 사용 결과는 또한 전반적으로 실망스러웠다(Klutke C. G. et al ., J. Urology , 156:1703-1706 (1996)). 더욱이, 한 연구에서 소의 진피 콜라겐 주사는 IgG 및 IgA 부류의 특정 항체를 만들었다는 증거를 제시한다(McCell and , M. and Delustro , F. , J. Urology 155, 2068-2073 (1996)). 따라서, 시간을 경과함에 따라 콜라겐에 대한 환자의 가능한 민감화가 예측될 수 있다.

제한적인 성공률에도 불구하고, 경요도 콜라겐 주사 요법은 다른 적합한 대안의 부재로 인하여 내인성 괄약근 실조에 대해 용인되는 치료법으로 남아있다.

현재, 과민성 방광 장애 또는 절박성 실금을 앓고 있는 개인은 피-침습성 약학 의료제품으로 의사에게 우선 치료받는다. 그러나, 이러한 비-침습성 약학 제품이 실패할 경우, 의사는 침습성이 큰 해결책을 제안한다.

따라서, 기존의 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조, 예를 들면, 방광을 확대하기 위한 적어도의 침습성 방법이 필요하다.

방광, 방광의 일부분, 또는 방광 구성요소와 같은 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 재구성, 복구, 확대 또는 대체에 사용하기 위한 이식가능한 세포 살포된 매트릭스를 성공적으로 제공하는데 조직 공학 원리를 적용하였다. Atala의 미국 특허 제6,576,019호 (전문이 여기에 참고자료로 통합됨)에서 설명된 것과 같이, 세포는 방광, 요도, 수뇨관, 그리고 기타 비뇨생식기 조직을 포함한 환자 본인의 조직으로부터 유도할 수 있다. 그러나, 새로운 그리고 건강하게 만들어진 조직을 개발하기 위한 기본 단위로 주요 장기 부위로부터 세포 배양 시스템의 발달 및 유지에 의존성과 관련된 문제점들이 있다. 예를 들면, 불량성(defective) 방광의 치료는 세포 원천에 대해 특히 난관이 있는데, 그 이유는 불량성 방광으로부터 방광 세포를 배양하게 되면 배양된 세포 또한 불량성일 것이라는 이치 때문이다. 이러한 세포들은 이식가능한 새로운-방광 골격 또는 매트릭스에 정주(populating)시키기 위한 현명한 선택은 아니다. 그것 자체로, 이식가능한 새로운-장기/조직 구조 골격 또는 매트릭스에 살포(seeding)하는데 적합한 세포의 대안 원천이 필요하다.

Jayo et al . Regen . Med . (2008) 3(5), 671-682 (이하 "Jayo I"으로 통칭함)에서 설명된 것과 같이, 장기 또는 조직을 복구하기 위한 시도는 빈번하게 콜라겐 침착으로 불완전한 조직 대체를 특징으로 하며, 그리고 일부 경우는 반흔 조직 형성을 특징으로 한다. Jayo et al .는 또한 조직 공학(engineering)의 좀더 바람직한 결과는 조직 구조 또는 장기의 본래 구조 및 기능의 재생이라는 것을 관찰하였다. Jayo et al., J. Urol . (2008) 180;392-397 또한 참고 (이하 "Jayo II"로 통칭함). 특정 분자들은 생체내에서 재생성 과정과 관련있는 것으로 보고 있다. 예를 들면, 케모킨 MCP-1은 단핵 세포를 모집하는 능력에 대해 가장 잘 알려져 있다. 그러나, 이것은 또한 맥관 평활근 세포 증식을 위한 강력한 미토겐(mitogen)인 것으로도 보인다. MCP-1는 관(vessel) 손상 부위로 순환하는 단핵세포들을 모집시키고, 그 다음 사이토킨과 성장 인자들을 위한 저장소로 기능을 할 수 있는 대식세포들로 일반적으로 변형시킬 수 있다. 대식세포들은 또한 콜레스테롤을 받아들이고, 지질을 산화시킨다. 대식세포들과 근육 전구(precursor) 세포들은 모두 MCP-1 신호발생을 위한 표적으로 보고 있다. CCR-2 수용체는 MCP-1 (CCL2)의 리간드이며, 그리고 CCR-2 결함 마우스는 지방세포분화(adipogenesis)/섬유형성(fibrosis)이 강화된 재생 결함을 나타낸다. 정상적인 마우스와 비교하여 골 근육 재생으로 CCR-2 결함 마우스의 단편들은 다음과 같이 설명된다: 더 많은 간질성(interstitial) 공간, 더 많은 수의 염증성 세포, 둥글고 크게 부어오른 근섬유들, 간질 공간에 더 많은 섬유아세포 축적, 지방 침착 주변에 콜라겐 분포와 함께 지방 침윤, 그리고 섬유형성(fibrosis)과 수반되는 칼슘 침착 (Warren et al . (2005), FASEB J.19:413-415; Selzman et al . (2002), Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283(4); H1455 - H1461 ; Shannon et al . (2007), Am . J. Cell Physiol . 292: C953 - C967 ; Shireman et al . (2006), J. Surg . Res . 134(1):145-57. Epub 2006 Feb 20; Amann et al . (1998), Brit. J. Urol . 82:118-121; Schecter et al . (2004), J. Leukocyte Biol .75:1079-1085; Deonarine et al.,(2007), Transl Med . 5:11; Lumeng et al . (2007), J Clin . Invest . 117(1): 175-184).

본 발명은 복막 조직 원천으로부터 유래된 세포 집단, 이러한 세포를 단리시키는 방법들, 이러한 세포들이 살포된 새로운-장기/조직 구조 골격 (구조물들) 그리고 이를 만드는 방법, 뿐만 아니라 이러한 새로운-장기/조직 구조 구조물들을 이용하여 치료를 요하는 환자를 치료하는 방법들에 관한 것이다.

발명의 요약

일 측면에서, 본 발명은 치료를 요하는 환자에서 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 재생, 재구성, 확대 또는 대체를 위한 이식가능한 구조물들을 제공한다. 일 구체예에서, 이식가능한 구조물은 다음을 포함한다: a) 제 1 표면을 가진 매트릭스, 이때 매트릭스는 치료를 요하는 피험자에서 고유의 내강형 장기 또는 조직 구조의 적어도 일부분에 정합되는(conform) 형태가 되며; 및 b) 매트릭스의 제 1 표면, 이식가능한 구조물을 형성하는 매트릭스와 세포 집단 위 또는 내부에 침착된 복막 유래된 세포 집단. 또 다른 구체예에서, 세포 집단은 평활근 세포 (SMC) 집단이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 이러한 치료를 요하는 피험자에서 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 재구성, 확대, 또는 대체를 위한 방법들을 제공한다. 일 구체예에서, 이 방법은 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 형성을 위하여 피험자의 치료 부위로 구조물을 이식하는 단계를 포함한다. 또 다른 일 측면에서, 본 발명은 이러한 치료를 요하는 피험자에서 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 재구성, 확대, 또는 대체를 위한 이식가능한 구조물을 제조하는 방법들을 제공한다. 일 구체예에서, 이 방법은 제 1 표면을 가진 매트릭스를 제공하는 단계를 포함하는데, 이때 매트릭스는 치료를 요하는 피험자에서 고유의 내강형 장기 또는 조직 구조의 적어도 일부분에 정합되는 형태가 된다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 이식가능한 구조물을 만들기 위하여 매트릭스의 제 1 표면위 또는 내부에 복막 유래된 세포 집단을 침착시키는 단계를 포함한다. 하나의 다른 구체예에서, 이 방법은 이식가능한 구조물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 비뇨기 새로운-도관으로 이용할 수 있는 이식가능한 구조물들을 제공한다. 일 구체예에서, 이 구조물은 다음을 포함한다: a) 치료를 요하는 피험자에서 고유 관(vessel)로부터 유체의 통과를 허용하도록 적합한 제 1 표면을 보유한 관형(tubular) 매트릭스; 및 b) 매트릭스의 제 1 표면, 이식가능한 구조물을 형성하는 매트릭스와 세포 집단 위 또는 내부에 침착된 복막 유래된 세포 집단. 또 다른 구체예에서, 세포 집단은 평활근 세포 (SMC) 집단이다. 관형 매트릭스는 제 1 단부를 보유할 수 있다. 일 구체예에서, 제 1 단부는 피험자의 복부 벽에 접촉하도록 형성되거나 또는 모양을 갖출 수 있다. 제 1 단부는 피험자의 복부 벽에서 개구부(opening)에 문합(anastomosis)되도록 형성되거나 또는 모양을 갖출 수 있다. 또 다른 구체예에서, 제 1 단부는 피험자의 피부에 노출되도록 형성될 수 있다. 하나의 다른 구체예에서, 관형 매트릭스의 제 1 단부는 이식시 피험자의 외부에 기공을 형성한다. 제 1 단부는 피험자의 복부 벽을 통하여 연장된 기공 단부를 포함한다. 일 구체예에서, 기공 단부는 피험자의 피부에 연결된다. 이식시에, 구조물은 기공 단부에서 상피화된(epithelialized) 점막을 형성한다. 상피화된 점막은 기공 단부에서 점막피부 영역을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상피화된 점막은 점막피부 영역에 인접한 전정(vestibular) 영역을 보유할 수 있다. 상피화된 점막은 전정 영역에서 우선 나타나고, 그리고 기공 단부쪽으로 점막피부 영역을 통하여 점진적으로 증가되는 상피를 특징으로 할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상피는 상피 세포 마커의 발현을 특징으로 한다. 상피화된 점막은 자연적으로 발생하는 점막피부 영역에 상당한다.

또 다른 구체예에서, 관형 매트릭스는 고유의 관(vessel)에의 연결을 위한 제 1 측면 개구부를 추가로 포함한다. 고유의 관(vessel)은 제 1 수뇨관일 수 있다. 일 구체예에서, 관형 매트릭스는 제 2 수뇨관에 연결형 제 1 단부를 추가로 포함한다. 관형 매트릭스는 제 2 수뇨관에 연결형 제 1 측면 개구부를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 구조물은 제 1 및/또는 제 2 측면 개구부로부터 관형 매트릭스의 내부로 유체의 통과를 허용하도록 모양을 갖추고 있다. 하나의 다른 구체예에서, 이 구조물은 관형 매트릭스의 내부로부터 관형 매트릭스의 제 1 단부를 통하여 외부로 유체의 통과를 한층 더 허용하도록 모양을 갖추고 있다. 이식시에, 이 구조물은 제 1 및/또는 제 2 수뇨관으로부터 관형 매트릭스의 내부로 소변의 통과를 허용한다. 게다가, 이 구조물은 이식시에, 매트릭스의 내부로부터 피험자 밖으로 소변의 통과를 허용한다. 또 다른 일 측면에서, 본 발명은 이러한 치료를 요하는 불량성 방광에 이식가능한 구조물을 제공하는 방법들을 제시한다. 일 구체예에서, 이 방법은 여기에서 설명된 구조물을 이식하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 이러한 치료를 요하는 피험자에서 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 재구성, 확대, 또는 대체를 위한 이식가능한 구조물을 제조하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 이 방법은 제 1 표면을 가진 매트릭스를 제공하는 단계를 포함하며, 이때 매트릭스는 치료를 요하는 피험자에서 고유의 내강형 장기 또는 조직 구조의 적어도 일부분에 정합되는 형태가 된다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 상기 이식가능한 구조물을 만들기 위하여 상기 매트릭스의 제 1 표면 위 또는 안에 복막 유래된 세포 집단을 침착하는 단계를 추가로 포함한다.

또 다른 측면에서, 여기에서 설명된 이식가능한 구조물들은 평활근 세포 집단을 포함하나, 추가 세포 집단은 없다. 일 구체예에서, 이 구조물들은 요상피 세포가 없다.

도 1a-d는 방광 확대 골격의 예들을 나타낸다.
도 2a-d는 방광 대체 골격의 예들을 나타낸다.
도 3a는 비뇨기 전환 또는 도관 골격의 예를 나타낸다. 도 3b-c는 상이한 유형의 단면 지역들과, 뿐만 아니라 수뇨관(들)에 연결되는 형상을 가진 개구부의 잠재적 위치가 상이한 유형의 비뇨기 전환 구조물의 예를 나타낸다. 도 3c는 비뇨기 전환 구조물의 변이를 설명한다 (A: 개방 클레임 난형(ovoid); B: 개방 클레임 난형 소켓; C: 닫힌 난형 소켓과 세 개의 튜브).
도 4는 비뇨기 전환 또는 도관 구조물의 상이한 적용을 보여준다.
도 5a-b는 근육 등가물(equivalent) 골격의 예들을 나타낸다.
도 6은 패취 또는 스트립 형태의 다양한 근육 등가물 골격의 영상을 표현한다.
도 7은 상이한 근육 등가물 골격과 대표적인 이식 방법을 설명한다. 도 7a는 골격의 편평한 쉬트의 형성을 나타낸다. 도 7b는 복강경에 적합한 골격을 나타내는데, 이것은 이식할 때 말아서 복강경 관을 통하여 공급하고, 복강에서 펼쳐질 수 있다. 도 7c는 복강경 관을 통하여 삽입이 용이하도록 말린(rolled) 형태의 복강경에 적합한 골격의 형성을 설명하며, 이후 복강에서는 펼쳐진다. 도 7d는 복강경 관을 통하여 삽입이 용이하도록 접힌(folded) 형태 또는 어코디언 스타일의 복강경에 적합한 골격의 형성을 설명하며, 이후 복강에서는 펼쳐진다. 도 7e는 근육 등가물 골격의 이식을 위한 가능한 외과적 방법을 설명한다. 도 7f는 비어있는 그리고 가득찬 방광에 이식 부위를 나타낸다. 도 7g는 표면의 절단시 만들어지는 타원면을 보여주는 외과적 슬릿(slit)을 가진 비뇨기 방광 모델을 나타낸다.
도 8은 복강경 포트를 통하여 삽입이 용이하도록 사전에 접힌 어코디언 스타일의 골격을 나타낸다.
도 9a는 스트립으로 사전-절단된 골격을 나타내는데, 그 다음 함께 봉합하여, 스태킹(staking)과 복강경 포트로의 삽입이 허용되며, 복강에서 자리에 고정된다. 도 9b는 길이가 18.7 cm이며, 폭이 2.0 cm인 하나의 골격을 나타내며, 폭에는 2개 폴드(fold)가 있다. 도 9c는 길이가 13.3 cm이며, 폭이 2.8 cm인 하나의 골격을 나타내며, 폭에는 3개 폴드(fold)가 있다. 도 9d는 길이가 9.7 cm이며, 폭이 4.0 cm인 하나의 골격을 나타내며, 폭에는 4개 폴드(fold)가 있다. 도 9e는 2개 조각으로 구성된 하나의 골격을 나타내는데, 각각 2개 폴드를 가지며, 길이는 9.7 cm이고, 폭은 2.0 cm이다.
도 10은 이식된 도관 구조물의 상대적 배치에 대한 예를 보여준다.
도 11a는 비뇨기 새로운-도관 골격의 예시적인 상대적 배치를 설명한다. 도 11b는 비뇨기 이식된 새로운-도관 골격의 두 가지 대안적인 배치(A 및 B)를 설명한다.
도 12는 영구적인 비뇨기 전환 구조물의 이식된 구성요소들의 예를 보여준다.
도 13은 비뇨기 전환 구조물들의 기타 적용을 나타낸다.
도 14는 복막 조직으로부터 세포 단리를 위한 대표적인 프로토콜의 단계들을 나타낸다.
도 15는 갯과 동물 및 돼지로부터 유래된 세포들의 세포 형태를 보여준다.
도 16a-b는 갯과 동물로부터 유래된 방광 세포들에서 평활근 α-액틴 및 칼포닌의 발현을 보여준다. 도 16c-d는 갯과 동물로부터 유래된 망(omentum) 세포들에서 평활근 α-액틴 및 칼포닌의 발현을 보여준다.
도 17a-c는 갯과 동물 망으로부터 유래된 세포 SMC, 상피 및 내피의 항원성 마커들의 FACS에 의한 표현형을 보여준다.
도 18a-c는 갯과 동물 망으로부터 유래된 세포 SMC, 상피 및 내피의 항원성 마커들의 FACS에 의한 표현형을 보여준다.
도 19는 망- 및 방광으로부터 유래된 갯과 동물 SMC로부터 평활근 세포에 연합된 마커들의 면역형광 분석을 나타낸다.
도 20a-b는 상피, 내피의 그리고 SMC 항원성 마커들을 보여주는 갯과 동물 망으로부터 유래된 세포들의 면역형광 분석을 나타낸다.
도 21은 망- 및 방광으로부터 유래된 돼지 SMC에서 평활근 세포 연합된 마커들의 면역형광 분석을 나타낸다.
도 22는 갯과 동물로부터 유래된 세포들에 의한 SMC 유전자 발현을 PCR에 의해 나타낸 것이다.
도 23은 갯과 동물로부터 유래된 세포들에 의한 SMC 유전자 발현을 PCR에 의해 나타낸 것이다.
도 24는 돼지로부터 유래된 세포들에 의한 SMC 유전자 발현을 PCR에 의해 나타낸 것이다.
도 25는 갯과 동물로부터 유래된 망 세포들의 수축성 표현형을 보여준다.
도 26는 골격 내부 갯과 동물 망으로부터 유래된 세포들 SMC의 면역형광 분석을 보여준다.
도 27은 골격 내부 망으로부터 유래된 SMC로부터 MCP1 단백질 분비를 설명한다.
도 28은 골격에서 망으로부터 유래된 세포들에 의한 ECM 생산의 면역형광 분석을 보여준다.
도 29는 골격 내부 망으로부터 유래된 SMC 대사를 나타낸다.
도 30은 이식후 비뇨기 새로운-도관의 특징들을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 복막 조직 원천으로부터 수득한 세포들이 살포된 골격을 이용하여, 치료를 요하는 피험자에서 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조물의 재생, 재건, 확대 또는 대체에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 복막 조직 원천으로부터 수득한 세포들을 포함하는 비뇨기 새로운-도관으로 사용할 이식가능한 구조물들을 제공한다.
본 발명은 복막 조직 원천으로부터 유래된 세포 집단, 이러한 세포들을 단리시키는 방법들, 이러한 세포들 (구조물들)이 살포된 새로운-장기/조직 구조 골격 또는 매트릭스 및 이를 만드는 방법들, 그리고 이러한 새로운-장기/조직 구조 구조물들을 이용하여 치료를 요하는 환자를 치료하는 방법들에 관한 것이다. 본 발명의 이 구조물들은 여기에서 설명된 것과 같이 장기 또는 조직 구조의 재건, 수리, 확대 또는 대체, 또는 재생에 이용될 수 있다.
1. 정의
다른 정의 되지 않는 한, 여기에서 사용된 기술적 그리고 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당업계 숙련자들이 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. Principles of Tissue Engineering, 3 ^rd Ed. (Edited by R Lanza, R Langer, & J Vacanti), 2007은 본 출원에서 이용된 많은 용어들에 대해 총괄적인 지침을 당업계 숙련자에게 제공한다.
당업계 숙련자는 여기에서 설명된 것과 유사한 또는 등가의 많은 방법들 및 재료들을 인지할 수 있을 것이며, 본 발명을 실행함에 있어서 이용될 수 있다. 게다가, 본 발명은 여기에서 설명된 방법들 및 재료들에 어떠한 방식으로던 제한되지 않는다. 본 발명의 목적을 위하여 다음의 용어들은 하기에서 정의된다.
여기에서 사용된 용어 "평활근 세포" 또는 "SMC"은 여기에서 설명된 것과 같은 재건, 수리, 확대 또는 대체 구조물들 및 방법들의 대상이 되는 고유의 장기 또는 조직들과는 상이한 원천으로부터 유래된 수축성 세포를 지칭한다. 본 발명에 의해 제공되는 골격 또는 매트릭스상에 살포되고 배양된 평활근 세포들은 속이 빈 장기 (예를 들면 방광, 복강, 위장관, 등)의 벽에서 볼 수 있고 수축과 이완 능력을 특징으로 하는 민무늬(non-striated) 근육을 형성할 수 있다. 당업계 숙련자들은 평활근 세포들의 기타 속성들을 인지할 것이다.
여기에서 사용된 것과 같이 용어 "세포 집단"은 적합한 포유동물 조직 원천으로부터 바로 분리하고, 시험관에서 후속적으로 배양함으로써 수득된 다수의 세포들을 지칭한다. 당업계 숙련자들은 본 발명에서 사용하기 위한 세포 집단을 분리하고 배양하는 다양한 방법들 그리고 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 집단내 다수의 다양한 세포들과 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 집단내 다양한 수의 세포들을 인지할 것이다. 이 세포 집단은 복막조직으로부터 유래된 평활근 세포 집단 (SMC)일 수 있다. 이 복막 조직은 망 조직일 수 있다. SMC 집단은 평활근 세포들과 연합된 마커들의 발현을 특징으로 할 수 있다. SMC 집단은 또한 정제된 세포 집단일 수 있다. SMC 집단은 자가조직 또는 비-자가조직 원천으로부터 유도될 수 있다.
용어 "자가조직"은 동일한 개체의 신체로부터 유래된 또는 이전된 것을 말한다. 자가조직 평활근 세포 집단은 여기에서 설명된 이식가능한 구조물의 수취인이 될 피험자로부터 유래된다.
용어 "비-자가조직"은 여기에서 설명된 이식가능한 구조물의 수취인이 아닌 제공자로부터 유도되거나 이전된 것을 지칭한다. 이러한 비-자가조직 원천은 이질유전적(allogeneic), 동계의(syngeneic)(autogeneic 또는 isogeneic), 및 이의 임의의 조합이 되는 원천을 포함한다.
용어 "마커" 또는 "바이오마커"는 DNA, RNA, 단백질, 탄수화물, 또는 당지질-기반 분자 마커를 일반적으로 지칭하며, 배양된 세포 집단내 이의 발현 또는 존재는 표준 방법들(또는 여기에서 설명된 방법들)에 의해 탐지할 수 있으며, 배양된 세포 집단에서 특정 유형의 세포가 되는 하나 이상의 세포들과 일치한다. 일반적으로, 용어 세포 "마커"또는 "바이오마커"는 고유의 세포에 의해 전형적으로 발현되는 여기에서 설명된 세포 집단내에서 발현되는 분자를 지칭한다. 이 마커는 이 세포에 의해 발현되는 폴리펩티드일 수 있거나 또는 유전자, 제한효소 엔도뉴클라아제 인식 부위 또는 고유의 세포에 의해 발현되는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산(예를 들면, mRNA)과 같이 염색체 상에서 확인가능한 물리적 위치가 될 수 있다. 이 마커는 "유전자 발현 마커"로 불리는 유전자의 발현된 영역일 수 있거나, 또는 알려진 코딩 기능이 없는 DNA의 일부분이 될 수 있다.
용어 "평활근 세포 마커"는 DNA, RNA, 단백질, 탄수화물, 또는 당지질-기반 분자 마커를 일반적으로 지칭하는데, 배양된 세포 집단내에서 이의 발현 또는 존재는 표준 방법들(또는 여기에서 설명된 방법들)에 의해 탐지될 수 있으며, 그리고 평활근 세포인 배양된 세포 집단내 하나 이상의 세포들과 일치한다. 일반적으로, 용어 평활근 세포 (SMC) "마커" 또는 "바이오마커"는 고유의 평활근 세포에 의해 전형적으로 발현되는 분자를 말한다. 이 마커는 세포에 의해 발현된 폴리펩티드일 수 있거나 또는 유전자, 제한효소 엔도뉴클라아제 인식 부위 또는 SMC에 의해 발현되는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산과 같이 염색체 상에서 확인가능한 물리적 위치가 될 수 있다. 이 마커는 "유전자 발현 마커"로 불리는 유전자의 발현된 영역일 수 있거나, 또는 알려진 코딩 기능이 없는 DNA의 일부분이 될 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 이러한 마커들은 다음중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 미오카르딘(myocardin), 알파-평활근 액틴, 칼포닌, 미오신 중쇄, BAALC, 데스민(desmin), 근섬유아세포 항원, SM22, 그리고 이들의 임의의 조합.
용어들 "차등적으로 발현된 유전자", "차등적 유전자 발현"그리고 상호 호환될 수 있는 이들의 동의어들은 제 2 세포 또는 세포 집단에서 이들 유전자의 발현과 비교하여, 제 1 세포 또는 세포 집단에서 더 높은 또는 더 낮은 수준으로 유전자 발현이 활성화되는 유전자를 지칭한다. 이 용어들은 또한 이들 유전자의 발현이 배양물에서 제 1 또는 제 2 세포의 계대 동안 시간이 경과함에 따라 상이한 단계에서 더 높은 또는 더 낮은 수준으로 활성화되는 유전자도 포함한다. 차등적으로 발현된 유전자는 핵산 수준 또는 단백질 수준에서 활성화되거나 또는 억제될 수 있으며, 또는 선택적 접합(alternative splicing)을 거치게 되어 상이한 폴리펩티드 산물이 야기될 수 있다는 것으로 또한 이해된다. 이러한 차이는 예를 들면, mRNA 수준들, 폴리펩티드의 표면 발현, 분비 또는 기타 분할에서의 변화로 증명될 수 있다. 차등 유전자 발현은 두 개 이상의 유전자 또는 이들의 산물 간의 발현을 비교하거나, 또는 두 개 이상의 유전자 또는 이들의 산물 간의 발현 비율을 비교하거나, 또는 동일한 유전자의 두 가지 차등적으로 진행된 산물의 비교를 포함하는데, 제 1 세포와 제 2 세포간에 상이하다. 차등적 발현은 예를 들면, 제 1 세포와 제 2 세포에서 유전자 또는 이의 발현 산물의 일시적 또는 세포적 발현 패턴의 정량적, 그리고 정성적 차이를 모두 포함한다. 본 발명의 목적을 위하여, "차등적 유전자 발현"은 제 1 세포와 제 2 세포에서 주어진 유전자의 발현 간에, 또는 배양물에서 이들 세포의 계대 동안 시간이 경과함에 따른 상이한 단계들에서 적어도 약 1배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5 배, 적어도 약 4배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14배, 적어도 약 14.5배, 또는 적어도 약 15배 차이가 있을 때 존재하는 것으로 간주한다.
용어들 "억제하다(inhibit)", "하향-조절하다(down-regulate)", "하향-발현하다(under-express)"그리고 "감소하다(reduce)"는 상호 호환적으로 이용되며, 그리고 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위를 인코드하는 RNA 분자 또는 등가의 RNA 분자들의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위의 활성은 하나 이상의 대조군들, 예를 들면, 하나 이상의 양성 및/또는 음성 대조군들과 비교하여 감소된다는 것을 말한다.
용어 "상향-조절하다(up-regulate)"또는 "과다-발현하다(over-express)"는 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위를 인코드하는 RNA 분자 또는 등가물의 RNA 분자들의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위의 활성은 하나 이상의 대조군들, 예를 들면, 하나 이상의 양성 및/또는 음성 대조군들과 비교하여 상승된다는 의미로 이용된다.
용어 "수축성 기능"은 액틴 및 미오신 필라멘트의 슬라이딩 상호작용에 관련된 평활근 수축성 기능을 말하는데, 이는 미오신의 칼슘-활성화된 포스포릴화에 의해 개시되며 따라서 세포내 칼슘 수준들에 의존하여 수축한다.
용어 "복막 조직"은 외복막(parietal peritoneum), 장측복막(visceral peritoneum), 그리고 망을 포함하나 이에 한정되지 않는 복막으로부터 기인된 조직을 일반적으로 의미한다. 이 복막 조직은 위, 간, 및/또는 장을 포함하나 이에 한정되지 않는 내부 장기와 밀접하게 접촉될 수 있다. 망 조직은 대망(greater omentum)과 소망(lesser omentum)을 포함하나 이에 한정되지 않는 상이한 원천으로부터 수득될 수 있다. 망 조직은 절개와 생검을 통하여 수득될 수 있다.
용어 "구조물"은 하나 이상의 합성 또는 자연 발생 생체적합한 재료들로 만들어진 골격 또는 매트릭스의 표면 위 또는 내부에 침착된 적어도 하나의 세포 집단을 지칭한다. 이 세포 집단은 생체내(in vivo) 또는 시험관에서(in vitro) 골격 또는 매트릭스와 복합될 수 있다.
용어 "시료" 또는 "환자의 시료" 또는 "생물학적 시료"는 개체, 체액, 신체 조직, 세포 계, 조직 배양물, 또는 기타 원천으로부터 수득된 임의의 생물학적 시료를 일반적으로 의미한다. 이 용어는 체액, 예를 들면, 말초 혈액 또는 정맥 혈액과 같은 혈액, 소변 및 생물학적 기원의 기타 액체 시료, 예를 들면, 지방흡입물(lipoaspirates), 그리고 생검 표본 (예를 들면, 복막 조직 생검)과 같은 고형 조직 생검물, 또는 조직 배양물 또는 이들로부터 유래된 세포들, 그리고 이들의 결과물(progeny)을 포함한다. 이 용어는 원천으로부터 이들을 획득한 후, 시약으로 처리, 특정 구성요소들, 예를 들면, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드에 대해 농축(enrichment)과 같은 처리에 의해 임의의 방식으로 조작된 시료를 또한 포함한다. 이 정의는 임상 시료를 또한 포함하고, 그리고 배양물, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체, 그리고 조직 시료내 세포들을 또한 포함할 수 있다. 시료의 원천은 예를 들면, 신선한, 냉동된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 시료 또는 생검 또는 흡입물로부터 얻은 고형조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분들; 신체 유체 예를 들면, 뇌 척추 유체, 양막 유체, 복막 유체, 또는 간질성(interstitial) 유체; 피험자의 발달 과정의 임의의 시간대의 세포들일 수 있다. 이 생물학적 시료는 자연계에 존재하지 않는 또는 조직에 자연적으로 존재하지 않는, 예를 들면, 방부제, 항응고제, 완충제, 정착액, 영양제, 항생제, 또는 이와 유사한 것과 같은 화합물들을 포함할 수 있다. 이 시료는 진단 또는 모니터링 분석에도 이용될 수 있다. 포유류로부터 시료를 수득하는 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 용어 "시료"가 단독으로 이용될 경우, "시료"는 "생물학적 시료"또는 "환자 시료"이며, 예를 들면, 이 용어들은 호환된다. 시료는 또한 테스트 시료일 수 있다.
용어 "테스트 시료"는 여기에서 설명된 구조물을 이식한 후 피험자의 시료를 지칭한다. 이 테스트 시료는 포유 동물 피험자의 혈액, 혈청, 소변, 정액, 골수, 점막, 조직, 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 원천으로부터 기인될 수 있다.
용어 "대조군" 또는"대조군 시료"는 음성 대조군을 말하며, 이때 음성 결과는 테스트 시료에서 양성 결과와 관련시키는데 도움을 주는 것으로 기대된다. 대안으로, 대조군은 양성 대조군을 말하며, 이때 양성 결과는 테스트 시료에서 음성 결과와 관련시키는데 도움을 주는 것으로 기대된다. 본 발명에 적합한 대조군들은 사이토킨의 정상 수준을 가진 것으로 알려진 시료, 여기에서 설명된 구조물이 이식되지 않은 것으로 알려진 포유동물로부터 수득한 시료, 그리고 정상인 것으로 알려진 포유동물로부터 수득한 시료를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 대조군은 또한 여기에서 설명된 구조물을 이식하기 전, 피험자로부터 수득한 시료일 수도 있다. 게다가, 이 대조군은 테스트 시료에 포함된 세포들과 동일한 기원을 보유한 정상 세포들을 포함하는 시료일 수 있다. 당업계의 숙련자는 본 발명에 이용하기에 적합한 다른 대조군들을 인지할 수 있을 것이다.
용어 "환자"는 이러한 치료가 바람직한 임의의 단일 동물, 좀더 바람직하게는 포유류 (인간이 아닌 동물들, 예를 들면, 개, 고양이, 말, 토기, 동물원 동물, 소, 돼지, 양 그리고 인간이 아닌 영장류를 포함)를 의미한다. 가장 바람직하게는, 여기에서 환자는 인간이다.
용어 "피험자(subject)"는 결함이 있는, 손상된 또는 기능을 못하는 비뇨계를 포함하는, 결함이 있는 장기 기능 또는 부전의 하나 이상의 신호, 징후, 또는 기타 지표들을 경험하였거나 또는 현재 겪고 있는, 치료에 적격인 환자를 포함한 임의의 단일 인간 피험자를 의미한다. 이러한 피험자들은 새로이 진단을 받은 또는 이미 진단을 받았고 현재 재발을 경험하거나, 또는 원인이 뭐든 간에 결함이 있는 장기 기능 또는 부전의 위험에 처한 피험자들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 피험자는 결함이 있는 장기 기능 또는 부전과 관련된 이상에 대해 이미 치료를 받았을 수도 있으며, 또는 치료를 받지 않았을 수도 있다. 피험자들은 방광절제를 요하는 방광암을 보유한 피험자들, 신장 기능에 영향을 주는 신경성 방광을 가진 피험자들, 방광에 방사능 손상을 입은 피험자들, 그리고 난치성 실금이 있는 피험자들을 포함하나 이에 한정되지 않는 비뇨기 전환을 위한 후보자일 수 있다. 이 피험자는 비뇨기 전환이 필요하다고 새로 진단을 받을 수 있거나, 또는 비뇨기 전환이 필요한 것으로 이미 진단을 받았고, 현재 합병증을 경험하거나, 또는 원인에 관계없이 결함이 있는 손상된 또는 기능을 못하는 비뇨계 위험에 처해있을 수 있다. 이 피험자는 결함이 있는, 손상된 또는 기능을 하지 못하는 비뇨계와 관련한 이상에 대해 이미 치료를 받았을 수 있으며, 또는 치료를 받지 못했을 수도 있다.
용어 "비뇨기 전환" 또는 "도관(conduit)"은 시간이 경과함에 따라 이식된 비뇨기 전환 구조물, 문합된(anastomosed) 수뇨관, 그리고 임의선택적으로 인접한 공간(atrium)과 피험자의 상호작용으로 인하여 생성된 장기 또는 조직 구조를 말한다. 이 공간(atrium)은 복막을 통하여 소변 통과를 허용하는 앞쪽에 연결된 방이고, 그리고 이 구조물의 꼬리 단부를(복강내 위치한) 피부에 연결시키는 복막 랩의 가장 앞쪽 관-모양 부분으로 만들어질 수 있다.
용어 "꼬리단부(caudal)"와 "두개(cranial)"는 비뇨기 생산 및 흐름(flow)과 관련된 기술적인 용어들이다. 용어 "꼬리단부"는 이식 시에 기공에 가장 근접한 비뇨기 전환 구조물의 단부를 말하며, 용어 "두개(cranial)"는 이식시에 신장과 수뇨관에 가장 근접한 비뇨기 전환 구조물의 단부를 말한다.
용어 "생물찌꺼기(detritis)"는 비뇨기 전환 구조물을 이식한 후에 일어나는 치유 및 재생 과정 동안 형성되는 잔해를 말한다. 생물찌꺼기는 박리된 조직 세포들, 염증성 삼출물 그리고 골격 생분해로 구성될 수 있다. 도관이 이러한 잔해들에 의해 막힌다면(부적절한 유출), 그 다음 괴어 있는 잔해들은 도관의 내강(lumen)내에서 생물찌꺼기 또는 반고형 둥근 덩어리를 형성한다.
용어 "좌멸괴사조직제거술(debridement)"는 감염을 막고, 폐색을 방지하고, 그리고 치유 과정을 촉진시키기 위하여 도관으로부터 외부 물질, 상처난 조직, 무기력해진 조직, 오염된 조직 또는 사멸된 조직을 외과적 또는 비-외과적 제거하는 것을 말한다. 좌멸괴사조직제거술은 생물찌꺼기의 제거와 연관될 수 있다.
용어 "기공"은 비뇨기 전환 구조물의 배수 유출 단부로부터 신체의 외부로 소변을 통과시키는데 이용되는 외과적으로 만든 개구부(opening)를 말한다. 소변은 신체 외부 저장소에 일반적으로 수거된다.
용어 "기공 포트" 또는 "기공 버튼"은 기공 개구부의 온전한 상태를 유지하는데 이용되는 장치와 같은 수단을 말한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "확장하는(expanding)" 또는 "확대하는(enlarging)"은 기존의 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 크기를 키우는 것을 말한다. 예를 들면, 본 발명의 일 측면에서, 기존의 박층형으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조는 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 또는 29% 확대될 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 기존의 박층형으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조는 기존의 박층형으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 기존 용적 용량을 증가시키기 위하여 확대될 수 있다.
여기에서 사용된 용어 "용적 용량(volumetric capacity)"은 한정된 지역안에 담을 수 있는 액체의 양을 말한다.
"재생 예후(prognosis)" 또는 "재생성 예후"는 여기에서 설명된 구조물의 이식 결과 또는 있을 수 있는 과정의 예상 또는 예견을 일반적으로 지칭한다. 여기에서 사용된 것과 같이, 재생 예후는 다음중 임의의 하나 이상의 예상 또는 예견을 포함한다: 방광 대체 또는 확대후 기능성 방광의 발달 또는 개선, 도관 이식 후 기능성 비뇨기 전환 발달, 개선된 방광 용량의 발달, 그리고 개선된 방광 순응의 발달. 여기에서 사용된 것과 같이, "재생 예후"는 새로운 장기 또는 조직 구조의 이식 결과 또는 있을 수 있는 과정의 예상 또는 예견을 제공하는 것을 말한다. 일부 구체예들에서, "재생 예후"는 다음중 임의의 하나 이상(다음중 하나 이상에 대한 예후)을 예상 또는 예견을 제공하는 것을 포함한다: 방광 대체 또는 확대후 기능성 방광의 발달 또는 개선, 도관 이식 후 기능성 비뇨기 전환 발달, 방광 용량 또는 개선된 방광 용량의 발달, 그리고 방광 순응 또는 개선된 방광 순응의 발달.
"재생된(Regenerated) 조직"은 여기에서 설명된 구조물의 이식후 발달한 새로운 장기 또는 조직 구조의 조직을 말한다. 장기 또는 조직 구조는 방광 또는 방광의 일부분일 수 있다. 재생된 조직은 아래에 있는 평활근과 연속성 요로상피 (continous urothelium)를 포함할 수 있다.
2. 세포 집단
본 발명은 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 재건, 수리, 확대 또는 대체에 사용하기 위한 평활근 세포 집단을 제공하는데, 이때 이 세포 집단은 수축성 기능을 보유하고, 하나 이상의 평활근 세포 마커들에 대해 양성인 적어도 하나의 세포를 포함한다.
여기에서 논의된 바와 같이, 조직 공학 원리는 박층형으로 구조화된 내강형 장기 및 조직 구조, 예를 들면, 요상피 및 평활근 층들로 일반적으로 구성된 방광 또는 방광 구성요소의 재건, 수리, 확대 또는 대체에 사용하기 위한 이식가능한 세포가 살포된 매트릭스를 제공하는데 성공적으로 적용되었다. (Becker et al . Eur . Urol . 51, 1217-1228 (2007); Frimberger et al . Regen . Med . 1, 425-435 (2006); Roth et al . Curr . Urol . Rep . 10, 119-125 (2009); Wood et al . Curr . Opin . Urol . 18, 564-569). 평활근 세포들은 방광, 요도, 수뇨관 및 기타 비뇨생식기 조직을 포함한 환자 본인의 조직으로부터 유도될 수 있다. 그러나, 암이 있는 방광 조직을 치료하는 동안 새로운 그리고 건강하게 만들어진 조직을 개발하기 위한 기본 단위로 근원 장기 부위로부터 세포배양 시스템을 개발 및 유지에 따른 위험들이 있다. 분명한 것은, 이러한 암 세포들은 이식가능한 새로운-방광 골격 또는 매트릭스상에 정주(populating)용으로는 부적합하다.
본 발명은 재건, 수리, 확대 또는 대체의 대상이 되는 장기 또는 조직 구조와는 상이한 원천으로부터 유래된 세포 집단을 제공한다. 일 구체예에서, 이 원천은 자가조직 원천이다. 또 다른 구체예에서, 이 원천은 비-자가조직 원천이다.
또 다른 측면에서, 이 세포 집단은 평활근 세포 집단의 전형적인 또는 일관되는 마커들을 발현시킨다.
또 다른 일 측면에서, 본 발명은 재건, 수리, 확대 또는 대체의 대상이 되는 내강형 장기 또는 조직 구조와 상이한 원천으로부터 단리된 평활근 세포 집단을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 내강형 장기 또는 조직 구조는 방광 또는 방광의 일부분이다.
일 측면에서, 이 원천은 복막 조직이다. 일 구체예에서, 이 복막 조직로부터 유래된 평활근 세포 집단은 환자 시료 또는 기증자(donor) 시료로부터 유래된다. 이 환자 또는 기증자 시료는 생검과정 동안 제거된 복막 조직일 수 있다. 이 복막 조직은 망 조직일 수 있다.
또 한 가지 다른 구체예에서, 본 발명의 단리된 세포 집단은 배양시에 구릉과 골(hill-and-valley) 형태, 하나 이상의 평활근 세포 마커들의 발현, 수축성 기능, 필라멘트 형성, 그리고 사이토킨 합성을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 평활근 세포 특징들을 발달시킬 수 있다.
일 측면에서, 이 배양된 세포 집단은 구릉과 골 형태를 특징으로 한다. 구릉과 골 형태를 보유한 세포들은 스핀들 모양의, 편평한 그리고 계대시에 섬유아세포와 유사하고, 나란히 가늘고 길게 배열되며, 성장시 "소용돌이(whirled)"외양, 그리고 이들의 임의의 조합의 다양한 특징을 가지나 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에서, 적절한 배지에서 배양시에 이 세포 집단은 배양된 평활근 세포들의 전형인 "구릉과 골 형태"를 발달시킨다.
또 다른 측면에서, 이 배양된 세포 집단은 하나 이상의 평활근 세포 마커들의 존재로 특징화된다. 일 구체예에서, 적절한 배지에서 배양시에 이 세포 집단은 다음중 하나 이상을 포함하는 탐지가능한 평활근 세포 마커들을 발달시키나 이에 한정되지 않는다: 데스민, 알파-평활근 액틴, 미오신 중쇄, 칼포닌, 미오카르딘, 비멘틴(vimentin), 근섬유아세포, BAALC, SM22, 그리고 이들의 임의의 조합.
일 측면에서, 배양된 세포 집단은 하나 이상의 상피 또는 내피의 마커들의 부재를 특징으로 한다. 일 구체예에서, 적절한 배지에서 배양시에 이 세포 집단은 다음중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는 탐지가능한 상피 또는 내피의 마커를 발달시키지 않는다: 가시금작와(Ulex Europaeus) 아글루티닌 1 (UEA-1), EpCam, CDH5, KDR, FLT1, PECAM, TEK, vWF, 사이토케라틴 AE1/AE3, 그리고 이들의 임의의 조합.
또 다른 일 측면에서, 이 배양된 세포 집단은 수축성 기능을 보유한 하나 이상의 세포들의 존재를 특징으로 한다. 일 구체예에서, 적절한 배지에서 배양시에 이 세포 집단은 수축성 기능을 발달시킨다. 또 다른 구체예에서, 이 수축성 기능은 칼슘 의존적이다. 하나의 다른 구체예에서, 칼슘-의존적 수축성 기능은 칼슘 킬레이트에 의한 수축의 억제로 설명된다. 또 다른 구체예에서, 이 칼슘 킬레이트는 EDTA이다. 당업계 숙련자들은 당업계에 공지되어 있는 다른 킬레이트들도 적합할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
또 다른 측면에서, 이 배양된 세포 집단은 필라멘트 형성을 특징으로 한다. 일 구체예에서, 적절한 배지에서 배양시에 이 세포 집단은 필라멘트를 형성한다.
일 측면에서, 이 세포 집단은 하나 이상의 사이토킨을 발현시키는 적어도 하나의 세포를 포함한다. 일 구체예에서, 이 사이토킨은 MCP-1이다.
일 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 재생성 세포를 담고있는 재생성 세포 집단을 제공하는데, 여기에서 설명된 골격 또는 매트릭스에 침착되고, 이를 요하는 피험자에게 이식되면, 여기에서 고려하는 재건, 수리, 확대, 또는 대체 대상인 장기 또는 조직 구조에 재생 효과를 제공한다. 재생성 세포 집단은 도움이 필요한 환자에게 이식 시에 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 재생을 자극 또는 개시하는 능력을 보유한다. 일반적으로, 장기 또는 조직 구조의 재생은 세포적 구성요소들, 조직 체계화 및 구성, 기능, 그리고 조절성 발달의 부활을 특징으로 한다. 게다가, 재생성 세포 집단은 세포 살포된 내강형 장기 또는 조직 구조 구조물의 이식 부위에서 일어나는 경향이 있는 불완전함 또는 장애를 최소화시킨다. 이식 부위에서 혼란은 콜라겐 침착 및/또는 반흔 조직 형성의 증가로 자체적으로 나타나며, 재생성 세포 집단의 이용을 통하여 이들 각각을 최소화시킬 수 있다. 게다가, 특정 세포성 과정들은 재생성 과정의 지표다. 여기에서 설명된 세포 집단과 골격을 이용한 재생된 방광 또는 방광의 일부분의 경우, 재생되는 장기 또는 조직 구조는 내강형 표면으로 뻗어있는 다수의 미세관 주변에서 방사되는 섬유맥관조직과 평활근 유조직, 그리고 점막 표면으로 정렬된 잘 발달된 혈관을 가진 기질(stromal) 요소들로 구성된다(상기 Jayo II 참고). 재생성 방광 또는 방광의 일부분은 스핀들로이드(spindloid)/간엽성(mesenchymal) 세포들 그리고 αSMA 양성 근육 전구(precursor) 세포들의 존재로 또한 특징화된다. 일 구체예에서, αSMA 양성 스핀들로이드 세포들은 신기질(neostromal) 조직과 다수의 새로운-관(vessel)(소동맥) 주변에서 관찰된다.
일 구체예에서, 본 발명은 세포 집단을 제공하는데, 이 세포집단은 여기에서 설명된 골격 또는 매트릭스상에 침착되고, 이를 요하는 피험자에게 이식할 때 여기에서 고려되는 재건, 수리, 확대, 또는 대체의 대상이 되는 장기 또는 조직 구조에게 재생 효과를 제공한다. 다른 구체예들에서, 회복 효과는 반흔 조직 형성 및/또는 콜라겐 침착을 특징으로 한다. 당업계 숙련자는 당업계에 공지되어 있는 기타 복구 특징들을 인지할 것이다.
또 다른 측면에서, 이 재생성 세포 집단은 회복된 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 크기를 적응력있게 조절함을 특징으로 하는 재생성 효과를 제공한다. 일 구체예에서, 이 재생성 세포 집단의 재생성 효과는 재생성 세포 집단이 살포된 골격 또는 매트릭스를 제공받는 피험자에 특이적인 적응력있는 조절의 확립이다. 일 구체예에서, 적응성 조절은 피험자의 신체 크기에 비례한 크기로 성장하고 발달하도록 여기에서 설명된 구조물을 이용하여 피험자의 방광을 대체 또는 확대한다.
일 구체예에서, 재생성 자극을 할 수 있는 이 세포 집단은 MCP-1 생산하는 세포 집단이며, 케모킨 산물 MCP-1을 발현시키는 적어도 하나의 세포를 담고 있다. MCP-1 재생성 자극은 이식 부위로 특정 세포 유형들을 모집하는 것을 특징으로 한다. 일 구체예에서, MCP-1은 새로운-방광내에서 증식할 수 있도록 이식 부위로 근육 조상 세포들을 모집한다. 또 다른 구체예에서, MCP-1은 이식 부위로 단핵세포들을 모집하고, 그 다음 재생성 공정을 촉진하도록 다양한 사이토킨 및/또는 케모킨을 생산한다. 하나의 다른 구체예에서, MCP-1은 망 세포들이 근육 세포들로 발달되도록 유도한다.
일 측면에서, 본 발명은 조직 재생을 위한 대리 마커로써 MCP-1과 같은 특정 사이토킨의 이용을 제시한다. 이러한 마커는 기능이 재건되었는지에 근거하여 재생을 평가와 연계하여 이용될 수 있다. 재생 과정의 시간이 경과함에 따른 대리 마커의 모니터링은 재생의 예상 지표로 작용을 또한 할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이 세포 집단은 정제된 세포 집단이다. 여기에서 설명된 정제된 세포 집단은 하나 이상의 형태에 근거한 표현형, 마커들의 발현, 및 기능을 특징으로 한다. 이 표현형은 구릉과 골 형태, 하나 이상의 평활근 세포 마커들의 발현, 사이토킨의 발현, 배양물에서 유한한 증식 수명, 수축성 기능, 그리고 필라멘트 형성을 유도하는 능력중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이 표현형은 여기에서 설명된 또는 당업계 숙련자들에게 공지된 기타 특징들을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이 정제된 집단은 여기에서 설명된 것과 같이 평활근 세포 집단에 실질적으로 동질이다. 실질적으로 동질인 정제된 집단은 형태, 마커들의 발현, 그리고 기능중 하나 이상에 의해 판단하였을 때, 일반적으로 적어도 약 90% 동질이다. 다른 구체예들에서, 이 정제된 집단은 적어도 약 95% 동질성, 적어도 약 98% 동질성, 또는 적어도 약 99.5% 동질성이다.
모든 구체예들에서, SMC 집단은 자가조직 원천 또는 비-자가조직 원천으로부터 유래된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 안과 장애에 여기에서 설명된 SMC 집단의 적용을 고려한다. 안과 장애는 피험자 눈 근육의 부적절한 기능으로 인하여 불량성 눈을 가진 장애다. 평활근은 눈에서 섬모 근육으로 존재하며, 그리고 다양한 거리에서 물체를 보기위하여 눈의 조정을 조절하고, 그리고 Schlemm의 도관을 통하여 수성 액체의 흐름을 조절한다. 평활근은 또한 눈의 홍채에도 존재한다. 노안 및 원시와 같은 안과 장애를 가진 개체들은 이러한 SMC 집단으로부터 효과를 볼 수 있다. 일 구체예에서, SMC 세포 집단은 도움이 필요한 피험자 또는 기증자의 복막 조직으로부터 단리될 수 있다. 이 세포 집단은 피험자의 눈 안 한 부위에 이식하기에 적합한 골격에 살포될 수 있다. 본 발명의 세포 집단의 장점은 이 피험자가 불량성 눈을 가지는 경우 또는 눈 조직의 제한된 이용성으로 인하여 피험자의 눈 원천으로부터 적합한 SMC을 이용할 수 없을 수도 있다는 점에 있다. SMC 집단은 새로운 눈 조직을 제공하기 위하여 생검, 배양된, 적합한 골격상에 살포된, 그리고 피험자에게 이식된 것으로부터 단리할 수 있다. 이 복막 조직은 망 조직일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 평활근 세포 집단은 접목(engraftment)에 의해 골격의 사용 없이 안과 장애를 가진 피험자에게 투여될 수 있다. 당업계 숙련자들은 적합한 접목 방법들을 인지할 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 복막 조직으로부터 유래된 단리된 평활근 세포 집단에 관한 것이다. 일 구체예에서, 복막 유래된 세포 집단은 수축성 기능을 보유하고, 평활근 세포 마커에 대해 양성인 하나 이상의 세포들을 담고 있다.
모든 구체예들에서, 이 세포 집단은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 평활근 세포 마커들을 특징으로 할 수 있다: 미오카르딘, 알파-평활근 액틴, 칼포닌, 미오신 중쇄, BAALC, 데스민, 근섬유아세포 항원, 비멘틴(vimentin), 그리고 SM22. 일부 구체예들에서, 이 세포 집단은 미오카르딘 (MYOCD)을 발현시킬 수 있다. 모든 구체예들에서, 용어 "MYOCD"는 MYOCD 폴리펩티드와 MYOCD 폴리펩티드를 인코드하는 핵산을 포함한다. 모든 구체예들에서, 세포 집단의 수축성 기능은 칼슘-의존적일 수 있다.
3. 세포 집단을 단리하는 방법들
자가조직 세포 집단은 치료를 요하는 피험자들로부터 직접적으로 유래된다. 비-자가조직 세포 집단은 기증자들로부터 유래된다. 이 원천 조직은 일반적으로 치료를 요하는 장기 또는 조직 구조와 동일하지 않다. 세포들의 집단은 예를 들면, 복막 조직과 같은 환자 고유 조직 또는 기증자 조직으로부터 유도될 수 있다. 일 구체예에서, 이 원천 조직은 망 조직이다. 이들 세포는 생검에서 단리될 수 있다. 게다가, 이들 세포는 사용하기 전 냉동되거나 확장될 수 있다.
세포 살포된 골격 구조물을 만들기 위하여, 평활근 세포들을 포함하는 시료(들)을 적절한 세포 현탁액으로 분리시킨다. 세포들의 단리 및 배양 방법들은 미국 특허 제5,567,612호에서 논의되었으며, 이 특허는 여기 참고자료에 통합되어 있다. 세포들을 단일 세포 단계로 해리(Dissociation)시키는 것은 초기 1차 배양물에서 필수적인 것은 아닌데, 그 이유는 단일 세포 현탁액이 시험관 배양 기간 후에 획득될 수 있기 때문이다. 조직 해리는 세포외 매트릭스와 세포들을 서로 잡아주는 세포내 접합을 기계적 그리고 화학적 파괴에 의해 실행될 수 있다. 세포들은 골격 상의 살포에 이용될 수 있는 세포의 수를 증가시키기 위하여 필요한 경우 시험관내에서 배양될 수 있다.
세포들은 유전적 물질과 함께 살포하기 전에 형질감염(transfected)될 수 있다. 평활근 세포들은 폴리머 살포전 특정 유전자로 형질감염될 수 있다. 이 세포-폴리머 구조물은 숙주 또는 조직이 공작된 새로운 장기의 장기 생존에 요구되는 유전적 정보를 나를 수 있다.
세포 배양물은 세포 분획화 단계 존부하에 준비될 수 있다. 세포 분획화는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 실시할 수 있다. 세포 분획화는 세포 크기, DNA 함량, 세포 표면 항원, 그리고 생존력에 근거하여 실행될 수 있다. 예를 들면, 평활근 세포들은 복막 조직으로부터 농축될 수 있고, 한편 내피의 세포들은 평활근 세포 수거를 위하여 축소될 수 있다. 세포 분획화가 이용될 수 있지만, 본 발명의 실시에서 필수적인 것은 아니다. 복막 조직은 망 조직일 수 있다.
여기에서 설명된 방법들에서 또 다른 선택적인 절차는 저온보존(cryopreservation)이다. 저온 보존은 예를 들면, 다중 침습성 외과 과정의 필요성을 감소시키는데 유용할 것이다. 피험자의 생검 또는 피험자의 시료로부터 취한 세포들을 증식시킬 수 있고, 그리고 증식된 세포들의 일부분을 이용하고, 또 다른 부분은 저온 보존될 수 있다. 세포들을 증식시키고 보존하는 능력은 요구되는 외과 과정의 수를 최소화시킬 수 있다. 저온 보존의 유용성의 또 다른 예는 조직 은행에 있다. 세포들은 예를 들면, 기증자 조직 은행에 보관될 수 있다. 새로운 장기 또는 조직 구조에 세포들이 필요하기 때문에, 저온 보존된 세포들의 공급이 필요시 이용될 수 있다. 환자의 기존 장기 또는 조직 구조를 위험에 빠뜨릴 수 있는 장애를 가지고 있거나 또는 치료를 받는 환자들은 하나 이상의 생검을 저온보존적으로 보존시킬 수 있다. 나중에, 환자의 자기 장기 또는 조직 구조가 기능을 못한다면, 저온 보존된 세포들을 해동시키고, 치료에 이용할 수 있다. 예를 들면, 치료후 새로운 장기 또는 조직 구조에 암이 다시 나타난다면, 저온보존에 의해 보존된 세포들을 추가 생검 없이, 장기 또는 조직 구조의 재건에 이용할 수 있다.
평활근 세포들은 다음의 일반적인 프로토콜에 근거하여 복막 조직으로부터 단리시킬 수 있다. 적합한 무게(예를 들면, grams) 및/또는 면적 (예를 들면, ㎠)의 생검 표본을 얻을 수 있다. 다음은 망 조직으로부터 평활근 세포들의 단리에 적합한 대표적인 프로토콜의 예다. 생검에 의해 적합한 무게의 망 조직 (예를 들면, 7-25g)을 얻을 수 있고, PBS로 세척하고(예를 들면, 3 회), 외과용 메스와 가위로 잘게 썰고, 50mL 원뿔 관으로 옮기고 콜라게나제(예를 들면, 0.1 내지 0.3%) (Worthington) 그리고 1% BSA의 DMEM-HG 용액에서 37℃에서 60분간 항온처리한다. 이 튜브는 절단을 촉진시키기 위하여 지속적으로 흔들거나 또는 주기적으로 흔들 수 있다. 절단된 시료는 600g에서 10분간 원심분리에 의해 펠렛화시킬 수 있고, DMEM-HG + 10% FBS에서 재현탁시킬 수 있다. 이 펠렛은 그 다음 계대 0에 접종하는데 이용할 수 있다. 도 14는 복막 조직으로부터 세포 단리를 위한 대표적인 프로토콜을 나타낸다.
당업계 숙련자들은 평활근 세포들의 단리를 위한 추가 방법들을 인지할 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 복막 조직으로부터 평활근 세포 집단을 단리시키는 방법들을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 복막 조직으로부터 단리된 평활근 세포 집단를 단리하는 방법들을 제공한다. 이 복막 조직은 망 조직일 수 있다. 일 구체예에서, 이 방법은 a) 망 조직을 얻고, b) 이 망 조직을 절단하고, c) 절단된 망 조직을 원심분리시켜 SMC-함유 분획물을 펠렛화시키고, d) 펠렛화된 분획물을 배양하고, 그리고 e) 분획물로부터 평활근 세포 집단을 단리하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 배양 단계는 이 펠렛을 세척하고, 세포 배양물 배지에 펠렛을 재현탁시키고, 그리고 재-현탁된 펠렛을 도말하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 배양 단계는 세포 배양물 지지대, 예를 들면, 플레이트 또는 용기에 흡착성인 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 이 배양된 세포 집단을 확장하는 것을 추가로 포함한다. 다른 구체예들에서, 이 방법은 평활근 세포 특징화를 위하여 평활근 세포 집단의 분석을 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 이 망 조직은 자가조직 또는 비-자가조직 원천으로부터 유래된다.
또 다른 일 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 평활근 세포 마커들에 대해 양성인 적어도 하나의 세포를 담고 있는 평활근 세포 집단을 단리하고 배양하는 방법들을 제공한다. 일 구체예에서, 이 방법은 박층형으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 재건, 수리, 확대 또는 대체를 요하는 환자로부터 시료를 얻는 단계를 포함하며, 여기에서 이 시료는 재건, 수리, 확대 또는 대체를 요하는 내강형 장기 또는 조직 구조로부터 수득하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 평활근 세포들은 환자 시료로부터 유래된다. 하나의 다른 구체예에서, 이 내강형 장기 또는 조직 구조는 방광 또는 방광의 일부분이다. 일 구체예에서, 이 시료는 자가조직 또는 비-자가조직 시료다. 또 다른 구체예에서, 이 시료는 복막 조직 시료다. 이 복막 조직 시료는 망 조직 시료일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 수득 단계에 이어 분리 단계가 이어진다.
망 조직 시료의 경우, 정제 단계는 콜라게나제로 이 시료를 절단하고, 이 절단된 시료를 원심분리하고, 이 원심분리된 시료를 혼합하여 SMC-함유하는 분획물을 제공하고, 이 혼합된 시료를 원심분리하여 후속 배양을 위해 재현탁될 수 있는 분획물을 수득하는 단계들을 포함한다.
일 구체예에서, 배양 방법은 당업계 숙련자들에게 공지된 표준 조건에 의해 최소 필수 배지(예를 들면, DMEM 또는 α-MEM)와 태아 소의 혈청 (예를 들면, 10% FBS)을 포함하는 세포 배양 배지의 이용을 포함한다.
4. 골격( Scaffolds )
Atala의 미국 특허 제6,576,019호 (전문이 여기에서 참고자료에 통합됨)에서 설명된 것과 같이, 골격 또는 폴리머성 매트릭스는 다양한 상이한 재료들로 구성될 수 있다. 일반적으로, 생체적합한 재료 및 특히 생분해가능한 재료는 여기에서 설명된 골격을 만들기 위한 바람직한 재료다. 이 골격은 적어도 2개의 별도 표면을 가진 이식가능한, 생체적합한, 합성 또는 천연 폴리머성 매트릭스다. 이 골격은 치료를 요하는 내강형 장기 또는 조직 구조의 적어도 일부에 정합하는 형태다. 생체적합한 재료들은 생분해가능하다. "생체적합한"이란 생물학적 기능에 독성 또는 해로운 효과를 가지지 않는 재료들을 지칭한다. "생분해가능한"이란 환자의 체내로 흡수되거나 체내에서 분해될 수 있는 재료를 지칭한다. 생분해가능한 재료들의 예는 예를 들면, 흡수가능한 봉합사를 포함한다. 이 골격을 형성하는 대표적인 재료들은 천연 또는 합성 폴리머들, 예를 들면, 콜라겐, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리오르소에스테르 그리고 폴리안하이드리드 및 이들의 코폴리머와 같은 폴리(알파 하이드록시 에스테르)를 포함하며, 이들은 가수분해에 의해 조절된 속도로 분해되고, 그리고 재흡수된다. 이들 재료는 분해능, 조절능, 크기 및 형상의 최대 조절을 제공한다. 바람직한 생분해가능한 폴리머 재료는 흡수가능한 합성 봉합사 재료로 개발된 폴리글리콜산과 폴리글액틴을 포함한다. 폴리글리콜산과 폴리글액틴 섬유들은 제조업자가 공급하는 것을 이용할 수 있다. 기타 골격 재료들은 셀룰로오즈 에테르, 셀룰로오즈, 셀룰로오즈 에스테르, 플로오르화된 폴리에틸렌, 폴리-4-메틸펜텐, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 폴리아미드이미드, 폴리아크릴레이트, 폴리벤조옥사졸, 폴리카르보네이트, 폴리시아노아릴에테르, 폴리에스테르, 폴리에스테르카르보네이트, 폴리에테르, 폴리에테르에테르케톤, 폴리에테르이미드, 폴리에테르케톤, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 폴리플로오르올레핀, 폴리이미드, 폴리올레핀, 폴리옥사디아졸, 폴리페닐렌 산화물, 폴리페닐렌 설파이드, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리설파이드, 폴리술폰, 폴리테트라플로오르에틸렌, 폴리티오에테르, 폴리트리아졸, 폴리우레탄, 폴리비닐, 폴리비닐리덴 플로라이드, 재생된 셀룰로오즈, 실리콘, 우레아-포름알데히드, 또는 이들 재료의 코폴리머 또는 물리적 혼합물들을 포함한다. 이 재료는 적합한 항균제와 함께 주입될 수 있고, 그리고 가시성을 개선시키고 외과 시술에서 도움이 되도록 발색 첨가제로 채색될 수 있다.
생분해가능한 기타 골격 재료들은 Ethicon Co. (Ethicon Co., Somerville, N.J.)에서 제조한 합성 봉합사 재료, 예를 들면 MONOCRYL™ (글리코리드와 입실론-카프로락톤의 코폴리머), VICRYL™ 또는 폴리글액틴 910 (폴리글액틴 370 및 칼슘 스테아레이트로 피복된 락티드와 글리코리드의 코폴리머), 그리고 PANACRYL™ (카프로락톤과 글리코리드의 폴리머로 피복된 락티드와 글리코리드의 코폴리머)(Craig P. H., Williams J. A., Davis K. W., et al .: A Biological Comparison of Polyglactin 910 and Polyglycolic Acid Synthetic Absorbable Sutures . Surg . 141; 1010, (1975)) 그리고 폴리글리콜산을 포함한다. 이들 재료는 제조업자가 공급하는 것을 이용할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 매트릭스 또는 골격은 천연 탈세포화된(decellularized) 장기의 일부분들을 이용하여 만들 수 있다. 장기의 생물구조 또는 일부는 장기로부터 전체 세포 및 조직 함량을 제거하여 탈세포화시킬 수 있다. 탈세포화(decellularization) 과정은 일련의 추출을 포함한다. 이 추출 과정의 한 가지 주요 특징은 이 생물구조의 복합한 하부 구조를 혼란시킬 수 있거나 또는 파괴할 수 있는 가혹한 추출은 피해야 한다. 제 1 단계는 세포성 잔해를 제거하고, 세포 막을 가용화(solubilization)시키는 것을 포함한다. 그 다음 핵 세포질 구성요소들과 핵 구성요소들의 가용화가 이어진다.
바람직하게는, 생물구조, 예를 들면, 장기의 일부분은 장기의 이 부분을 에워싸는 세포 막과 세포성 잔해를 부드러운 기계적 파괴 방법을 이용하여 제거함으로써 탈세포화된다. 부드러운 기계적 파괴 방법들은 충분히 세포성 막을 파괴해야만 한다. 그러나, 탈세포화 과정은 생물구조의 복합한 하부-구조의 파괴 또는 혼란을 피해야 한다. 부드러운 기계적 파괴 방법들은 장기 일부의 표면을 긁어 내고, 적합한 용적의 유체, 예를 들면, 증류수에서 장기 일부를 교반시키고, 또는 휘젓는 것을 포함한다. 한 가지 바람직한 구체예에서, 이 부드러운 기계적 파괴 방법은 세포 막이 파열되고, 세포성 잔해가 장기로부터 제거될 때까지 적합한 용적의 증류수에서 장기 일부를 휘젓는 것을 포함한다.
세포 막이 제거된 후, 생물구조의 핵 및 세포질 구성요소들이 제거된다. 하부-구조의 파괴없이, 세포성 그리고 핵 구성요소들을 가용화시킴으로써 실행될 수 있다. 핵 구성요소들을 가용화시키기 위하여, 비-이온성 세척제 또는 계면활성제가 이용될 수 있다. 비이온성 세척제 또는 계면활성제의 예는 Rohm and Haas of Philadelphia, Pa.에서 이용할 수 있는 많은 판매인으로부터 상업적으로 이용가능한 Triton X-100, Triton N-101, Triton X-114, Triton X-405, Triton X-705, 및 Triton DF-16을 포함한 Triton 시리즈; Tween 시리즈, 예를 들면, 모노라우레이트 (Tween 20), 모노팔미테이트(Tween 40), 모노올레이트(Tween 80), 그리고 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르 (Brij. 35), 폴리옥시에틸렌 에테르 W-1 (폴리옥스), 그리고 이와 유사한 것들, 콜산 나트륨염, 데옥시콜레이트, CHAPS, 사포닌, n-데실-D-글루코푸라노사이드, n-헵틸-D-글루코피라노사이드, n-옥틸-D-글루코피라노사이드 그리고 Nonidet P-40을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
당업계 숙련자는 상기 분류에 속하는 화합물들 및 판매상의 설명은 상업적으로 얻을 수 있으며, 그리고 " Chemical Classification , Emulsifiers and Detergents ", McCutcheon's , Emulsifiers and Detergent, 1986, North American and International Editions , McCutcheon Division , MC Publishing Co., Glen Rock , N.J., U.S.A. and Judith Neugebauer , A Guide to the Properties and Uses of Detergent in Biology and Biochemistry , Calbiochem . R., Hoechst Celanese Corp ., 1987에서 찾아볼 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에서, 비-이온성 계면활성제는 Triton 시리즈, 바람직하게는, Triton X-100이다.
비-이온성 세척제의 농도는 탈세포화되는 생물구조의 유형에 따라 변경될 수 있다. 예를 들면, 연약한 조직, 예를 들면, 혈관의 경우, 이 세척제의 농도는 감소되어야 한다. 비-이온성 세척제의 바람직한 농도 범위는 약 0.001 내지 약 2.0% (w/v)이다. 더욱 바람직하게는, 약 0.05 내지 약 1.0% (w/v)이다. 더더욱 바람직하게는, 약, 0.1% (w/v) 내지 약 0.8% (w/v)이다. 이들의 바람직한 농도 범위는 약 0.001 내지 약 0.2% (w/v)이며, 특히 바람직한 범위는 약 0.05 내지 약 0.1% (w/v)이다.
조밀한 세포질 필라멘트 네트워크, 세포간 복합체와 정점의 미세세포 구조들을 포함하는 세포골격 구성요소는 수산화암모늄과 같은 알칼리 용액을 이용하여 가용화시킬 수 있다. 암모늄 염 또는 이들의 유도체로 구성된 기타 알칼리 용액도 또한 세포골격 구성요소들을 가용화시키는데 이용될 수 있다. 기타 적합한 암모늄 용액의 예는 암모늄 설페이트, 암모늄 아세테이트 그리고 암모늄 하이드록시드를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 암모늄 하이드록시드가 이용된다.
알칼리 용액, 예를 들면, 암모늄 하이드록시드의 농도는 탈세포화되는 생물구조의 유형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 연약한 조직, 예를 들면, 혈관의 경우, 세척제의 농도는 감소되어야만 한다. 바람직한 농도 범위는 약 0.001 내지 약 2.0% (w/v)일 수 있다. 더 바람직하게는, 약 0.005 내지 약 0.1% (w/v)이다. 더더욱 바람직하게는, 약 0.01% (w/v) 내지 약 0.08% (w/v)이다.
탈세포화된, 동결건조된 구조는 사용할 필요가 있을 때까지 적합한 온도에서 보관될 수 있다. 사용하기 전, 탈세포화된 구조는 적합한 등장성 완충액 또는 세포 배양 배지에서 균등화될 수 있다. 적합한 완충액은 인산염 완충된 염수(PBS), 염수, MOPS, HEPES, Hank의 Balanced Salt Solution, 그리고 이와 유사한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적합한 세포 배양 배지는 RPMI 1640, Fisher 배지, Iscove 배지, McCoy 배지, Dulbecco 배지, 그리고 이와 유사한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이용될 수 있는 다른 생체적합한 재료들은 스테인레스 강, 티타늄, 실리콘, 금 그리고 실래스틱(silastic)을 포함한다.
폴리머성 매트릭스 또는 골격은 보강될 수 있다. 예를 들면, 보강 재료들은 합성 매트릭스 또는 골격의 형성 동안 첨가되거나 또는 이식전 천연 또는 합성 매트릭스에 부착될 수 있다. 보강용 대표 재료들은 천연 또는 합성 폴리머, 예를 들면, 콜라겐, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리오르소에스테르 및 폴리안하이드리드 그리고 이들의 코폴리머와 같은 폴리(알파 하이드록시 에스테르)를 포함하는데, 이들은 가수분해에 의해 조절된 속도로 분해되고, 재흡수된다. 이들 재료는 분해능, 조절능, 크기 및 형상의 최대 조절을 제공한다.
생분해가능한 폴리머들은 Instron 테스트기를 이용하여 인장강도와 같은 기계적 성질들, 겔 침투 크로마토그래피(GPC)에 의한 폴리머 분자량, 시차주사열량계(DSC)에 의한 유리 전이 온도, 그리고 적외선(IR) 분광계에 의한 결합 구조에 대해 특징화되며; Ames 분석과 관련된 초기 스크리닝 테스트에 의한 독성학, 그리고 시험관내 기형발생성(teratogenicity) 분석 및 면역원성에 대한 동물에서의 이식 연구, 염증, 방출 및 분해 연구에 대해 특징화된다. 시험관내 세포 흡착 및 생존력은 전자주사현미경, 조직학 및 방사능동위원소를 이용한 정량적 평가를 이용하여 평가될 수 있다. 생분해가능한 재료는 또한 환자에게 이식될 때 재료가 분해되는데 필요한 시간에 대해 또한 특징화될 수 있다. 예를 들면, 두께 및 메쉬 크기와 같은 구성을 변화시킴으로써, 생분해가능한 재료는 약 2 년 또는 약 2 개월이내, 바람직하게는 약 18 개월과 약 4 개월 사이, 가장 바람직하게는 약 15 개월과 약 8 개월 사이 그리고 가장 바람직하게는 약 12 개월과 약 10 개월 사이에 실질적으로 생분해될 수 있다. 필요하다면, 생분해가능한 재료는 약 3 년, 또는 약 4 년 또는 약 5년 또는 그 이상동안 실질적으로 분해되지 않도록 만들어질 수 있다.
폴리머성 매트릭스 또는 골격은 상기에서 설명된 것과 같이 조절된 포어(pore) 구조를 가지도록 제작될 수 있다. 포어의 크기는 세포 분포를 결정하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 폴리머성 매트릭스 또는 골격 상의 포어는 세포들이 한 표면에서 반대 표면으로 이용할 수 있도록 클 수도 있다. 대안으로, 포어는 폴리머성 매트릭스 또는 골격의 두 측면 사이의 유체 소통은 되지만, 그러나 세포들이 이를 통과할 수 없도록 작을 수 있다. 이런 목적을 이루기 위하여 적합한 포어 크기는 직경이 약 0.04 마이크론 내지 약 10 마이크론이며, 바람직하게는 약 0.4 마이크론 내지 약 4 마이크론 사이가 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격의 표면은 세포 집단이 포어에 부착하여 이동할 수 있도록 충분히 큰 포어를 포함할 수 있다. 세포들이 폴리머성 매트릭스 또는 골격의 한 측면으로부터 반대 측면으로 이동하는 것을 막기 위하여 폴리머성 매트릭스 또는 골격의 내부에서 포어 크기가 감소될 수 있다. 감소된 포어 크기를 가진 폴리머성 매트릭스 또는 골격의 일 구체예 는 두 개의 큰 포어 재료 사이에 작은 포어 재료가 끼어있는 판상형 구조다. 폴리카르보네이트 막이 특히 적합한데, 그 이유는 예를 들면, 약 0.01 마이크론, 약 0.05 마이크론, 약 0.1 마이크론, 약 0.2 마이크론, 약 0.45 마이크론, 약 0.6 마이크론, 약 1.0 마이크론, 약 2.0 마이크론 및 약 4.0 마이크론과 같은 매우 조절된 포어 크기로 제작할 수 있기 때문이다. 미크론 이하의 수준에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 세균, 바이러스 및 기타 미생물에 대해 불투성일 수 있다.
이중에서 다음의 특징들 및 기준은 각 별도의 매트릭스 또는 이의 일부분을 기획하는데 고려된다: (i) 모양, (ii) 강도, (iii) 경직성 및 강성, 그리고 (iv) 봉합성 (매트릭스, 또는 이의 일부분이 인접 조직에 용이하게 봉합되거나 그렇지않으면 부착되는 정도). 여기에서 사용된 것과 같이, 주어진 매트릭스 또는 골격의 경직성(stiffness)은 탄성율로 정의되는데, 골격을 변형시키기 위하여 작용 단위 면적당 압력과 이로 인한 변형의 양 사이의 비율을 나타내는 계수다(예를 들면, Handbook of Biomaterials evaluation , Scientific , Technical , and Clinical Testing of Implant materials , 2 nd edition, edited by Andreas F. von Recum , (1999); Ratner , et al ., Biomaterials Science : An Introduction to materials in Medicine , Academic Press (1996) 참고). 골격의 강성(rigidity)은 주어진 골격에 의해 나타나는 유연성 수준(또는 이의 부족)을 지칭한다.
이들 각 기준은 매트릭스, 또는 이의 일부분이 최적으로 배치되도록 변형될 수 있고, 그리고 의도했던 의학적 징후 및 생리학적 기능을 해결하도록 변형될 수 있도록 가변성(이들중 재료 및 제조 과정의 선택을 통하여)이다. 예를 들면, 방광 대체, 재건 및/또는 확대용 매트릭스 또는 골격을 포함하는 재료는 소변의 변동량에 순응하도록 충분히 유순해야 하면서도, 한편으로 찢어짐 없이 봉합을 지지할 수 있도록 충분히 강해야 한다.
최적으로, 매트릭스 또는 골격은 이것이 생분해된 후, 생성된 재구성된 방광은 천연 방광과 유사한 방식으로 비어있을 때 접힐 수 있고, 그리고 비뇨기 카테터는 누수점을 남기지 않고 새로운 장기 또는 조직 구조으로부터 제거하는 동안 수뇨관이 가로막히지 않도록 모양을 갖추어야 한다. 생물공학적으로 제작된 방광 구조물은 한 조각으로 만들어질 수 있거나, 각 부분이 개별적으로 만들어지고, 부분들의 조합에 의해 특정 부분들이 만들어질 수 있다. 각 특정 매트릭스 또는 골격 부분은 특이적 기능을 가지도록 만들어질 수 있다. 그렇지 않다면, 특정 부분은 제작 용이함을 위해 만들어질 수 있다. 특정 부분들은 특이적 재료들로 만들어질 수 있고, 특정 성질들을 제공하도록 기획될 수 있다. 특정 부분 성질은 0.5 내지 1.5 MPa.sup.2의 고유 조직(예를 들면, 수뇨관)과 유사한 인장 강도와 30 내지 100%의 최대신장율을 포함하거나 또는 인장 강도는 0.5 내지 28 MPa.sup.2의 범위이거나, 최대 신장율은 10-200%의 범위일 수 있고, 그리고 압축 강도는 <12일 수 있다.
둥글거나, 물결모양의, 편평한, 별 모양의, 단독의 섬유로 또는 다른 섬유들과 함께 형성된 메쉬 유사 구조가 바람직하다. 분기(branching) 섬유의 이용은 용량 증가에 비례하여 표면적 증가 문제를 해결하는데 이용되었던 동일한 원리에 근거한다. 모든 다중세포 유기체는 이러한 반복 분기 구조를 이용한다. 분기 시스템은 장기간에, 뿐만 아니라 개별 장기의 기능 단위들간에 소통 네트워크를 나타낸다. 세포들을 가진 이러한 형상을 살포 및 이식하면 다수의 세포들의 이식이 가능하며, 이들 각각은 숙주의 환경에 노출되어, 신생혈관형성이 이루어지는 동안 영양분과 폐기물의 자유 교환을 위하여 제공된다. 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 원하는 최종 형태, 구조 및 기능에 따라 유연성있게 또는 견고하게 만들어질 수 있다.
한 가지 바람직한 구체예에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 15 .mu.m 평균 섬유 직경을 가진 폴리글리콜산으로 만들어지며, 그리고 4-0 폴리글액틴 910 봉합사를 이용하여 방광 모양을 하고 있는 주형으로 형성된다. 생성된 구조는 적합한 기계적 성질을 얻고, 이 모양을 굳히기 위하여, 액화된 코폴리머, 예를 들면, 폴-DL-락티드-코-글리코리드 50:50을 메틸렌 클로라이드 ml당 80mg으로 피복시킨다.
추가 구체예에서, 본 발명의 골격은 생체적합한 그리고 생분해가능한 형상을 고정시키는(shape-setting) 재료로 피복한다. 일 구체예에서, 이러한 형상을 고정시키는 재료는 폴리-락티드-코-글리코리드 코폴리머를 함유한다. 또 다른 구체예에서, 형상 고정 재료는 액화된 상태다.
또 다른 일 측면에서, 본 발명의 골격은 이식전(폴리머성 매트릭스 또는 골격에 세포들을 살포하기 전 또는 후), 첨가제 또는 약물로 처리하여 이식후 새로운 조직의 재생을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 예를 들면, 성장 인자들, 사이토킨, 세포외 매트릭스 또는 골격 구성요소들, 그리고 기타 생물활성 재료들을 폴리머성 매트릭스 또는 골격에 첨가하여 이식편 치유와 새로운 조직의 재생을 촉진시킬 수 있다. 이러한 첨가제는 주입된 장기 또는 조직내에서 적절한 새로운 조직의 형성을 확실히 하기 위하여, 재구성되는, 대체되는, 또는 확대되는 조직 또는 장기에 따라 일반적으로 선택될 것이다(골 치유를 촉진시키는데 이용되는 이러한 첨가제의 예는 예를 들면, Kirker - Head , C. A. Vet . Surg . 24 (5): 408-19 (1995)을 참고한다). 예를 들면, 폴리머성 매트릭스 (선택적으로 내피의 세포들이 살포된)를 맥관조직을 확대시키는데 이용할 때, 맥관내피 성장 인자 (VEGF) (예를 들면, 미국 특허 제5,654,273호 참고)를 이용하여 새로운 맥관조직의 재생을 촉진시킬 수 있다. 성장 인자들 및 기타 첨가제(예를 들면, 상피 성장 인자 (EGF), 헤파린-결합 상피 유사 성장 인자 (HBGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 사이토킨, 유전자들, 단백질들, 그리고 이와 유사한 것들)는 폴리머성 매트릭스에 추가된 세포들이 이용될 경우, 매트릭스에 살포된 세포들에 의해 생산될 수도 있는 이러한 성장 인자들(만약 있다면)의 임의의 양을 초과하는 양으로 추가할 수 있다. 이러한 첨가제는 수리되거나, 대체되거나, 또는 확대되는 조직 또는 장기에 적절한 유형의 새로운 조직의 재생을 촉진하는데(예를 들면, 이식물로 숙주 세포들의 침윤시키거나 또는 침윤을 가속화시킴으로써) 충분한 양으로 제공되는 것이 바람직하다. 기타 유용한 첨가제는 항생제와 같은 항균물질을 포함한다.
한 가지 바람직한 지지대 매트릭스 또는 골격은 교차 필라멘트로 구성되어, 세포 지지대가 이식된 후 짧은 간격을 통하여 영양제의 확산에 의해 세포가 생존할 수 있도록 한다. 세포 지지대 매트릭스 또는 골격은 이식 후 세포 물질의 확장과 동시에 맥관화되기 시작한다.
이식하기 전, 시험관에서 3차원적 구조 구조물들의 구축은 생체에서 이식한 후 세포들의 궁극적인 최종 분화를 용이하게 하고, 그리고 매트릭스에 대한 염증 반응의 위험을 최소화시키고, 따라서 이식편의 긴장(contracture) 및 수축(shrinkage)을 피한다.
폴리머성 매트릭스 또는 골격은 사용하기 전 임의의 공지된 방법들을 이용하여 살균할 수 있다. 이용되는 방법은 폴리머성 매트릭스내에 이용되는 재료에 따라 달라진다. 살균 방법들의 예로는 증기, 건열, 방사능, 에틸렌 옥시드와 같은 가스, 가스 및 가열을 포함한다.
골격을 구성하는 합성 재료들은 예를 들면, 용제 주형(solvent casting), 압착 몰딩, 필라멘트 드로잉(filament drawing), 메슁(meshing), 침출(leaching), 위빙(weaving) 및 코팅(coating)과 같은 방법들을 이용하여 형상화될 수 있다. 용제 주형에서, 메틸렌 클로라이드와 같은 적절한 용제내 하나이상의 폴리머 용액은 분기 패턴 릴리프 구조로 주조된다. 용제 증발 후, 얇은 필름을 얻는다. 압착 몰딩에서, 평방 인치당 최대 30,000 파운드의 압력에서 폴리머를 적절한 패턴으로 압착한다. 필라멘트 드로잉은 용융된 폴리머로부터 드로잉과 관련되며, 그리고 메슁은 섬유를 펠트(felt) 유사 재료로 압착함으로써 메쉬를 만드는 것과 관련된다. 침출에서, 두 가지 재료를 포함하는 용액을 구조물의 최종 형태에 근접한 모양으로 스프레드한다. 그 다음, 용제를 이용하여 구성요소들중 하나를 용해시켜 사라지게 하면, 포어가 형성된다(Mikos, 미국 특허 제5,514,378호 참고, 여기 참고자료에 통합됨). 핵형성(nucleation)에서, 골격의 모양의 얇은 필름들은 방사능활성 분열 산물들에 노출되고, 방사능 손상된 재료들의 궤도가 만들어진다. 그 다음, 폴리카르보네이트 쉬트들은 산 또는 염기로 식각되고, 방사능-손상된 재료의 궤도들은 포어로 전향된다. 끝으로, 레이저를 이용하여 많은 재료들을 통하여 각 구멍을 만들고 열처리하여 균질한 포어 크기를 가진 구조를 만든다. 코팅은 예를 들면 액화된 코폴리머 (폴리-DL-락티드 코-글리코리드 50:50 80 mg/ml 메틸렌 클로라이드)와 같은 재료로 폴리머성 구조를 피복하거나 스며들게 하여 구조의 물리적 성질을 변경시키는 것을 말한다. 코팅은 원하는 물리적 성질을 얻을 때까지 한 층 또는 다중 층에서 실행될 수 있다. 이러한 형태를 만드는 기술들을 조합적으로 이용될 수 있는데, 예를 들면, 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 위빙되고, 압착 몰딩되고, 함께 접착될 수 있다. 더욱이, 상이한 공정에 의해 형태를 가진 상이한 폴리머성 재료들을 함께 결합시켜 복합 형태를 만들 수 있다. 복합 형태는 박층구조일 수도 있다. 예를 들면, 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 하나 이상의 폴리머성 매트릭스에 부착시켜 다중층의 폴리머성 매트릭스 또는 골격 구조를 만들 수 있다. 이러한 부착은 액체 폴리머로 접착에 의해 실행되거나 또는 봉합에 의해 실행될 수 있다. 게다가, 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 고형 블록으로 형성되고, 그리고 레이저 또는 기타 표준 가공 기술을 이용하여 원하는 최종 모양으로 만든다. 레이저 성형은 레이저를 이용하여 재료들을 제거하는 공정을 말한다.
바람직한 구체예에서, 골격은 부직(nonwoven) 폴리글리콜산(PGA) 펠트와 폴리(라틱-코-글리콜산) 폴리머(PLGA)로부터 형성된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 골격은 비뇨기 전환 골격이다.
Bertram et al. 미국의 공개된 출원 20070276507 (여기에 이의 전문이 참고자료에 통합됨)에서 설명된 것과 같이, 본 발명의 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 전체적인 시스템, 기하학 또는 공간적 제약과 같은 많은 것들을 만족시키기 위하여 많은 바람직한 형상으로 성형될 수 있다. 매트릭스는 박층형으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 크기 및 모양에 정합하도록 성형된 3차원 매트릭스일 수도 있다. 예를 들면, 방광 재건을 위하여 폴리머성 매트릭스를 사용하는 경우, 방광 전체 또는 방광의 일부의 크기 및 모양에 정합하도록 성형된 3차원 매트릭스를 이용할 수 있다. 물론, 이 폴리머성 매트릭스는 상이한 체구를 가진 환자의 방광에 정합하도록 상이한 크기 및 모양으로 성형될 수 있다. 선택적으로, 이 폴리머성 매트릭스는 이의 생분해 후, 생성된 재구성된 방광이 자연 방광과 유사한 방식으로 비어있을 때 접힐 수 있도록 성형되어야만 한다. 이 폴리머성 매트릭스는 환자의 특정 요구에 부응하도록 다른 방식으로 또한 성형될 수 있다. 예를 들면, 이미 손상된 또는 불구인 환자는 상이한 복강을 가질 수 있고, 그리고 끼워 맞추는데 적합한 방광 대체 골격, 방광 확대 골격, 방광 도관 골격, 그리고 배뇨근 근육 등가물 골격을 요구할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 여기에서 설명된 평활근 세포 집단과 사용하기에 적합한 추가 골격을 고려한다. 예를 들면, 폐로 이식하기에 적합한 골격을 제공할 수 있다.
A. 확대 또는 대체 골격
또 다른 일 측면에서, 이 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 방광의 일부에 정합하도록 성형된다. 일 구체예에서, 성형된 매트릭스는 수취인의 기존 방광의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%를 대체하도록 정합된다. 또 다른 일 측면에서, 이 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 방광 모두 또는 100%에 정합하도록 성형된다.
일 구체예에서, 이 폴리머성 매트릭스는 적어도 2개의 별도 표면을 보유한 이식가능한, 생체적합한, 합성 또는 천연 폴리머성 제 1 매트릭스 또는 골격과 그리고 적어도 2개의 별도 표면을 보유한 이식가능한, 생체적합한, 합성 또는 천연 폴리머성 제 2 매트릭스 또는 골격을 포함하며, 이들은 서로 맞물리기에 적합하여 그리고 맞물렸을 때 치료를 요하는 내강형 장기 또는 조직 구조의 적어도 일부분에 정합하도록 성형된다. 제 1과 제 2 폴리머성 매트릭스는 하나의 일체형 단위로부터 두 개 이상의 별개 부분으로 분할되도록 형성될 수 있고, 또는 결합하는데 적합한 두 개 이상의 별개 부분들로부터 형성될 수 있다. 일부 구체예들에서, 제 1과 제 2 폴리머성 매트릭스는 일단 맞물린 후, 내강형 장기 또는 조직 구조의 재건, 수리, 확대, 또는 대체에 이용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 제 1과 제 2 폴리머성 매트릭스는 대칭이며, 한편 다른 구체예들에서, 제 1과 제 2 폴리머성 매트릭스는 비대칭이다. 일 구체예에서, 제 1 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 닫힌, 돔형의 단부와 열린 적도선상의 경계를 보유한 반구 또는 준반구형(quasi-hemispherical) 모양을 보유하며, 그리고 제 2 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 제 1 폴리머성 매트릭스의 적도선상의 경계와 짝을 이루기에 적합한 칼라(collar)이다. 또 다른 구체예에서, 제 1과 제 2 폴리머성 매트릭스는 각각 닫힌, 돔형의 단부와 열린 적도선상의 경계를 보유한 반구 또는 준반구형(quasi-hemispherical) 모양이다. 여전히 또 다른 구체예에서, 제 1과 제 2 폴리머성 매트릭스는 각각 원형 또는 반-원형 기부와 각 기부로부터 방사형으로 뻗어나온 적어도 2개의 화판(petals)을 포함한다. 이 구체예에서, 제 1과 제 2 폴리머성 매트릭스의 기부와 화판 성형 부분들은 맞물려 중공의 구형 또는 준-구형 매트릭스 또는 골격이 만들어지고, 플렌지가 있는 세로의 타원형 개구부는 맞물린 폴리머성 매트릭스의 한 측면에 만들어지고, 그리고 세로로된 개구부의 반대 측면에는 원형 개구부가 만들어진다. 또 다른 구체예에서, 제 1과 제 2 폴리머성 매트릭스는 맞물리기에 적합한 상부, 전단부 그리고 측면부를 포함하는 3개 부분으로 만들어진다. 이 구체예에서, 3개 별도 부분들은 적어도 3개, 바람직하게는 4개 수직 이음매(seam)를 이용하여 맞물리고, 이에 의해 크라운 모양의 새로운-방광 구조물이 형성된다. 크라운 모양의 구조물들은 바람직하게는 내강형 장기 재건, 수리, 확대, 또는 대체용 장비로 단독으로 이용된다. 일 구체예에서, 이 구조물은 방광 확대 골격이다. 방광 확대 골격의 한 가지 예가 도 1a-d에 묘사되어 있다.
또 다른 구체예에서, 이 구조물은 방광 대체 골격이다. 방광 대체 골격의 한 가지 예가 도 2a-d에 묘사되어 있다.
추가로, 제 1 폴리머성 매트릭스, 제 2 폴리머성 매트릭스, 또는 이 둘 모두는 고유의 관(vessel) 또는 튜브에 이 구조물을 연결할 필요가 있을 때, 관형 관(vessel) 또는 삽입부를 수용하기에 적합한 적어도 하나의 소켓(receptacle) 또는 포트를 포함할 수 있다. 관(vessel) 또는 삽입부는 자체가 예를 들면, 실린더형 또는 관형 폴리머 매트릭스이며, 이들 각각은 실린더형 폴리머의 제 1 단부에 위치한 적어도 하나의 플렌지를 보유한다. 관(vessel) 또는 삽입부는 상기에서 설명된 바람직하게는 제 1 또는 제 2 폴리머성 매트릭스와 동일한 생체적합한 재료로 구성된다. 일부 구체예들에서, 관(vessel) 또는 삽입부는 또한 실린더형 또는 관형 관(vessel) 또는 삽입부 폴리머 매트릭스 둘레에 합치되는데 적합한 워셔(washer)를 포함한다. 예를 들면, 이 워셔는 하이드로겔이다. 실린더형 또는 관형 관(vessel) 또는 삽입부는 선택적으로 워셔를 포함할 수 있다. 이 워셔는 하이드로겔일 수 있다. 추가로, 실린더형 또는 관형 삽입부은 자체-안정화될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 고유의 관(vessel) 또는 튜브에 골격 또는 매트릭스(세포들이 살포된 후)의 연결이 필수적인 장소에서 관형 관(vessel) 또는 삽입부를 수용하는데 적합한 소켓 또는 포트는 하기에서 논의되는 다른 매트릭스에도 또한 적용된다.
일 측면에서, 이 골격은 적어도 2개 매트릭스를 포함하는 장기 또는 조직 구조 대체 골격이다. 일 구체예에서, 이 골격은 제 1 표면을 보유한 제 1 매트릭스와 제 1 표면을 보유한 제 2 매트릭스를 포함한다. 제 1 매트릭스 와 제 2 매트릭스는 서로 맞물리도록 형성되거나 맞물리는데 적합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 제 1 매트릭스와 제 2 매트릭스는 맞물렸을 때 내강형 장기의 적어도 일부에 정합하도록 성형될 수 있다. 제 1과 제 2 매트릭스는 생체적합한 재료를 포함할 수 있다. 생체적합한 재료는 생분해가능한 재료를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 제 1 매트릭스는 닫힌 단부와 열린 적도선상의 경계를 가진 반구형 모양을 보유할 수 있고, 그리고 제 2 매트릭스는 제 1 매트릭스의 적도선상의 경계와 맞물리기에 적합한 또는 형상을 한 칼라를 보유할 수 있다. 닫힌 단부는 돔형일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 제 1 매트릭스와 제 2 매트릭스는 닫힌 단부와 열린 적도선상의 경계를 보유한 반구형 모양을 각각 가질 수 있다. 닫힌 단부는 돔형일 수 있다. 여전히 또 다른 구체예에서, 제 1 매트릭스는 제 1 매트릭스의 적어도 하나의 경계를 따라 플렌지 영역을 추가로 포함할 수 있다. 제 2 매트릭스는 제 2 매트릭스의 적어도 하나의 경계를 따라 플렌지 영역을 추가로 포함할 수 있고, 그리고 이때 제 2 매트릭스의 플렌지 영역은 제 1 매트릭스의 플렌지 영역에 맞물리는데 적합한다.
일 구체예에서, 이 골격은 제 1의 생체적합한 매트릭스와 제 2의 생체적합한 매트릭스를 포함하는데, 여기에서 제 1과 제 2 매트릭스는 각각 기부를 포함하며, 맞물리도록 구성되거나 또는 맞물리는데 적합할 수 있다. 일 구체예에서, 제 1 및 제 2 매트릭스는 맞물렸을 때 내강형 장기의 적어도 일부에 정합되도록 성형될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 제 1 및 제 2 매트릭스는 각 기부로부터 방사형으로 뻗어나온 적어도 2개의 화판을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 다른 구체예에서, 제 1 및 제 2 매트릭스 각각은 하나의 기부와 적어도 4개의 화판을 포함하는 주형(template)으로부터 최초에 유도될 수 있다. 한 가지 형상에서, 마주하는 한 쌍의 화판은 다른 화판보다 길이가 더 짧을 수 있다. 또 다른 구체예에서, 제 1 및 제 2 매트릭스는 맞물리는데 적합한 2개의 별도 유닛일 수 있다.
일 구체예에서, 제 1 및 제 2 매트릭스의 기부는 맞물리는데 적합하다. 일부 구체예들에서, 제 1 및 제 2 매트릭스는 제 1 및 제 2 매트릭스의 화판 모양 부분을 통하여 맞물린다.
다른 구체예들에서, 제 1 및 제 2 매트릭스는 제 1 및 제 2 매트릭스 사이에 제 1 교접점에서 세로 개구부와 세로 개구부의 반대편인 제 1 및 제 2 매트릭스의 제 2 교접점에서 원형 모양의 개구부의 중공 구형 또는 준-구형 모양을 형성하도록 구성되거나 또는 적합할 수 있다. 골격은 제 1 또는 제 2 매트릭스의 기부로 통합되는 적어도 한 개의 플랩(flap)을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세로 개구부는 입술모양(lip) 부분을 보유하며, 적어도 하나의 입술모양 부분은 세로 개구부의 입술 부분에 배치된다.
또 다른 측면에서, 매트릭스 또는 매트릭스들은 고유의 관(vessel)에 연결가능할 수 있다. 일 구체예에서, 제 1 매트릭스, 제 2 매트릭스, 또는 이둘 모두 고유의 관(vessel)을 수용하도록 구성되거나 또는 수용하는데 적합하다. 또 다른 구체예에서, 제 1 매트릭스, 제 2 매트릭스, 또는 이둘 모두는 적어도 하나의 소켓(receptacle)을 추가로 포함한다. 적어도 하나의 소켓은 관형 삽입부를 수용하도록 구성되거나 또는 적합할 수 있다. 관형 삽입부는 소켓내에 배치될 수 있다. 일부 구체예들에서, 관형 삽입부는 단부(end)를 보유한다. 이 삽입부는 이 단부에 위치한 적어도 한 개의 플랜지(flange)를 보유할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 관형 삽입부는 고유의 관(vessel)에 연결되도록 구성되거나 또는 적합할 수 있다. 추가 구체예에서, 골격은 관형 삽입부 둘레에 배치된 표면과 워셔를 보유한다. 이 워셔는 이 구조물의 플랜지와 표면 사이에 수밀(watertight) 밀봉을 이루도록 구성되거나 수밀 밀봉을 이루는데 적합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 워셔는 하이드로겔을 포함한다.
도 1과 2는 적어도 두 개의 매트릭스를 포함하는 대표적인 골격 형상을 묘사한다.
일 측면에서, 이 골격은 하나 이상의 매트릭스를 포함하는 장기 또는 조직 구조 확대 골격이다. 일 구체예에서, 이 골격은 기부와 다수의 새김눈(notches)을 보유한 제 1 매트릭스를 포함하며, 이때 제 1 매트릭스는 결집되었을 때 내강형 장기의 적어도 일부에 정합하는 반구형을 만드는데 적합하다. 또 다른 구체예에서, 이 골격은 제 2와 제 3 매트릭스를 포함하는데, 이때 제 1, 제 2 및 제 3 매트릭스는 맞물릴 수 있도록 형성되거나 또는 맞물리는데 적합할 수 있으며, 그리고 맞물렸을 때 내강형 장기의 적어도 일부분에 정합하도록 형성되거나 정합하는데 적합할 수 있다. 제 1, 제 2 및 제 3 폴리머성 매트릭스는 3가지 세분된 부분을 포함하는 주형으로부터 유도될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 제 1, 제 2 및 제 3 매트릭스는 3가지 별도 주형으로부터 유도되며, 그리고 맞물리도록 구성되거나 또는 맞물리는데 적합할 수 있다. 하나의 다른 구체예에서, 제 1, 제 2, 및/또는 제 3 매트릭스는 생체적합한 재료를 포함한다. 이 생체적합한 재료는 생분해가능한 재료를 포함할 수 있다.
또 다른 일 측면에서, 이 골격은 상이한 모양 또는 형상(configuration)을 가진 부분들로 구성된다. 일 구체예에서, 이 골격은 차례로 상부 피스(piece), 전면 피스 및 측면 피스에 해당하는 제 1, 제 2 및 제 3 폴리머성 매트릭스를 포함하고, 함께 맞물리면 제 1 크라운 모양을 만든다. 또 다른 구체예에서, 전면 피스와 측면 피스는 각각 제 1 모서리(edge)와 제 2 모서리를 포함할 수 있다. 전면 피스의 제 1 모서리는 측면 피스의 제 1 모서리에 이어질 수 있다. 전면 피스의 제 2 모서리는 측면 피스의 제 2 모서리에 이어질 수 있다. 하나의 다른 구체예에서, 제 1 모서리들은 이음매에 의해 이어지거나 및/또는 제 2 모서리들은 이음매에 의해 이어질 수 있다. 다른 구체예들에서, 전면 피스는 제 1 모서리와 제 2 모서리를 보유한 새김눈을 포함할 수 있다. 제 1과 제 2 모서리는 예를 들면 이음매로 이어질 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상부 피스는 제 1 모서리를 보유할 수 있고, 측면 피스는 제 3 모서리를 보유하고, 그리고 전면 피스는 제 3 모서리를 보유한다. 상부 피스의 제 1 모서리는 측면 피스의 제 3 모서리에 이어질 수 있고 및/또는 상부 피스의 제 1 모서리는 전면 피스의 제 3 모서리에 이어질 수 있다. 제 1과 제 3 모서리들은 이음매에 의해 이어질 수 있다. 또 다른 구체예에서, 각 새김눈은 제 1 모서리와 제 2 모서리를 보유할 수 있다. 이들 모서리는 예를 들면 이음매에 의해 이어질 수 있다. 다른 구체예들에서, 측면 피스는 적어도 하나의 플랩을 포함할 수 있다.
모든 구체예들에서, 골격내 각 개별 매트릭스 또는 모든 매트릭스는 생분해가능한 재료를 포함할 수 있다. 이 재료는 폴리글리콜산, 폴리락트산 그리고 글리콜산과 락트산의 코폴리머로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 구체예들에서, 매트릭스 또는 매트릭스들은 폴리글리콜산 그리고 글리콜산과 락트산의 코폴리머를 포함한다.
일 구체예에서, 내강형 장기는 관형 또는 중공 장기다. 이 장기는 비뇨생식기 장기일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 비뇨생식기 장기는 방광, 수뇨관 및 요도로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나의 다른 구체예에서, 비뇨생식기 장기는 방광 또는 방광 일부분이다. 일부 구체예들에서, 이용된 이 골격은 천연 방광 조직의 순응을 나타내는 생체내 재생된 방광 조직을 만들기 되해 구성되거나 재생된 방광 조직을 만드는데 적합하다.
일 구체예에서, 침착된 세포들이 있는 맞물린 매트릭스는 이식가능한 구조물을 형성한다. 또 다른 구체예에서, 적어도 제 1 세포 집단은 여기에서 설명된 근육 세포 집단을 포함한다. 이 근육 집단은 평활근 세포 집단일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이 골격은 제 1 매트릭스의 제 1 표면, 제 2 매트릭스의 제 1 표면, 또는 이 둘 모두에 침착된 적어도 제 1 세포 집단을 보유할 수 있다. 하나의 다른 구체예에서, 이 골격은 제 1 매트릭스의 제 2 표면, 제 2 매트릭스의 제 2 표면, 또는 이 둘 모두에 침착된 적어도 제 2 세포 집단을 더 보유할 수 있다. 세포들의 제 2 집단은 요상피 세포들을 포함한다.
여기에서 설명된 확대 및 대체 골격과 이를 만드는 방법 및 이를 이용하는 방법들은 Bertram et al의 미국 공개 특허 출원 번호 20070276507 (전문이 참고자료에 통합됨)에서 더 설명된다.
B. 비뇨기 도관 골격
본 발명은 세포들을 살포할 수 있고, 피험자에서 위장 조직의 대체용으로 비뇨기 전환 구조물에 이용될 수 있는 새로운-비뇨기 전환 또는 도관 골격을 제공한다. 예를 들면, 여기에서 설명된 새로운-비뇨기 전환은 회장(ileal) 루프 전환을 겪어야 하는 환자의 치료를 위하여 완전한 방광 절제후 이용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 치료를 요하는 피험자의 비뇨기 전환 용도에 적합한 여기에서 설명된 방법들에 의해 만들어진 도관 골격 또는 매트릭스를 고려한다. 도관 골격의 한 단부는 하나 이상의 수뇨관에 연결될 수 있고, 다른 단부는 피험자의 체외에 있는 소변 저장소에 연결될 수 있다. 일 구체예에서, 이 도관은 기공을 통하여 피험자의 신체를 벗어날 수 있다. 또 다른 구체예에서, 폴리머성 매트릭스는 관형 형태로 제공되는 이식가능한, 생체적합한, 합성 폴리머성 제 1 매트릭스 또는 골격을 포함한다. 일부 구체예들에서, 관형 골격은 피험자의 수뇨관에 연결되도록 형성된 제 1 단부를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제 1 골격은 피험자에서 기공 또는 괄약근을 형성하도록 구성된 제 1 단부를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제 1 골격은 적어도 하나의 수뇨관에 연결되도록 형성된 적어도 하나의 측면 개구부를 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 제 1 골격은 제 1 수뇨관에 부착된 제 1 측면 개구부와 제 2 수뇨관에 부착된 제 2 측면 개구부를 포함한다.
일 측면에서, 이 골격은 피험자에서 하나 또는 두개 수뇨관 모두의 부착에 대해 유연하도록 고안된다. 일 구체예에서, 이 골격은 관형 구조의 측면에 수뇨관 부착을 위하여 하나 이상의 개구부를 보유할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이 골격은 수뇨관의 부착을 위하여 관 모양 구조의 한 단부에 개구부를 보유할 수 있다. 부착되는 수뇨관 단부와 골격 단부 사이의 거리가 수뇨관 단부와 골격 측면 사이의 거리보다 짧다면, 수뇨관이 이 구조의 측면보다 구조의 한 단부에 부착하는 것이 수뇨관에 긴장을 덜 줄 수 있다.
일 측면에서, 관형 도관 골격은 하나 또는 두 수뇨관 모두로부터 소변이 관형 골격을 경유하여 최종적으로 골격 수취인 밖으로 유출되도록 작용하는 튜브의 한 단부를 포함한다. 일 구체예에서, 이 골격의 유출 단부는 수취인의 복강 벽에서 끝나도록 형성된다. 도 11b (패널 A)는 이 골격의 예시적인 형상을 설명한다.
또 다른 구체예에서, 이 골격의 유출 단부는 복벽 예를 들면, 경복(transabdominal)을 통하여 뻗어있고, 그리고 피부 기공의 피하 층, 예를 들면, 경피에 바로 연결되도록 형성된다. 도 11b (패널 B)는 이 골격의 예시적인 형상을 설명한다.
당업계 숙련자들은 상이한 형상들은 수취인의 복강의 특정 크기에 따라 달라질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
하나의 다른 구체예에서, 관형 구조는 매끈한 모서리를 포함하는 제 1 단부와 균일하지 않은 또는 매끈하지 않은 모서리를 포함하는 제 2 단부를 포함한다. 균일하지 않은 모서리는 원형 기부와 기부로부터 방사형으로 뻗어있는 다수의 화판을 포함할 수 있다. 다수의 화판은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 일 수 있다. 매끈하지 않은 모서리는 예를 들면, 도 3에 나타낸 것과 같이, 일련의 화판들을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 관형 구조는 필요로 하는 환자의 비뇨기 전환 시스템 또는 도관으로 사용하기에 적합한 형태를 보유한다. 또 다른 구체예에서, 이 시스템은 예를 들면, 요관루조성술의 경우와 같이 하나 이상의 수뇨관으로부터 복벽 구역으로 소변을 우회시킨다. 다른 구체예들에서, 이 시스템은 예를 들면, 방광조루술의 경우 방광으로부터 복벽 구역으로 소변을 우회시킨다. 하나의 다른 구체예에서, 이 시스템은 방광을 요도에 연결시킨다. 여전히 또 다른 구체예에서, 제 1 시스템은 하나 이상의 수뇨관으로부터 복벽 구역으로 소변을 우회시킬 수 있고, 그리고 제 2 시스템은 방광으로부터 복벽 구역으로 소변을 우회시킬 수 있다. 모든 구체예들에서, 이 시스템은 예를 들면, 기공 형성에서 하나 이상의 수뇨관으로부터 소변을 복벽 구역으로 우회시킬 수 있다.
또 다른 구체예에서, 관형 매트릭스 또는 골격은 비뇨기 전환 또는 도관 골격이다.
일 구체예에서, 비뇨기 전환 시스템의 관형 구조는 직사각, 원형, 또는 삼각 절단면 영역이다. 도 3a는 여기에서 고려되는 일부 상이한 절단면 형상을 설명한다.
또 다른 구체예에서, 관형 구조는 이식후 명백하게 통로가 나있을 수 있도록 충분한 강성을 보유한다. 하나의 다른 구체예에서, 관형 구조의 강성은 이의 내강에 카테터를 이용하여도 또는 이용하지 않아도 유지된다. 카테터가 이용되면, 관형 구조의 내강 공간에 배치되어 추가 개존(patency)을 제공할 수 있다.
하나의 다른 구체예에서, 도관 골격은 제 1 골격의 제 1 단부를 수뇨관에 연결하도록 형성된 둥근 또는 난형의 커넥터(connector) 형태의 제 2 골격을 추가로 포함할 수 있다. 여전히 또 다른 구체예에서, 도관 골격은 피험자에서 기공을 만들기 위하여 관형 제 1 골격의 제 1 단부가 있는 기공 또는 괄약근을 만들도록 형성된 워셔-링 형태의 제 3 골격을 추가로 포함할 수 있다. 도 3B는 다양한 비뇨기 전환 구조물을 설명한다 (A: 개방 클레임 난형(ovoid); B: 개방 클레임 난형 소켓; C: 닫힌 난형 소켓과 세 개의 튜브).
일부 구체예들에서, 관형 구조는 배설을 억제할 수 있는(continent) 기공 또는 괄약근을 만들기 위한 문합(anastomosis)을 이루기 위하여 조직, 장기 또는 신체 일부에 연결용 워셔 구조를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이 워셔는 약 1 mm 미만, 약 1.5 mm 미만, 약 2 mm 미만, 약 2.5 mm 미만, 약 3 mm 미만, 약 3.5 mm 미만, 약 4 mm 미만, 약 4.5 mm 미만, 또는 약 5 mm 미만의 두께로 제공된다.
일 구체예에서, 비뇨기 전환 또는 도관 골격은 도 3에 나타낸 형상으로 성형된다.
하나의 다른 구체예에서, 관형 구조는 매끈한 모서리를 포함하는 제 1 단부와 균일하지 않은 또는 매끈하지 않은 모서리를 포함하는 제 2 단부를 포함한다. 균일하지 않은 모서리는 피험자에 외부에 있는 기공 형성과 같이, 피험자의 외부 영역에 부착용으로 형성된 하나 이상의 잠금쇠(fasteners)를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 관형 구조의 제 1과 제 2 단부는 도 3에 설명된 형태가 될 수 있다. 잠금쇠의 수는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 관형 골격은 도 27에 나타낸 형태다.
도 4a는 인간 비뇨기 시스템의 정상적인 해부의 일부를 나타낸다.
일 구체예에서, 관형 구조는 이를 필요로 하는 환자의 비뇨기 전환 또는 도관으로 사용하기에 적합한 형태를 보유한다. 또 다른 구체예에서, 도관은 예를 들면, 요관루조성술 (도 4d)의 경우와 같이, 하나 이상의 수뇨관으로부터 소변을 복벽 구역으로 우회시킨다. 다른 구체예들에서, 이 도관은 예를 들면, 방광조루술 (도 4b)의 경우에 방광으로부터 소변을 복벽 구역으로 우회시킨다. 하나의 다른 구체예에서, 이 도관은 방광을 요도에 연결시킨다 (도 4d). 여전히 또 다른 구체예에서, 제 1 도관은 하나 이상의 수뇨관으로부터 복벽 구역으로 소변을 우회시킬 수 있으며, 그리고 제 2 도관은 방광으로부터 복벽 구역으로 소변을 우회시킬 수 있다. 모든 구체예들에서, 이 도관은 하나 이상의 수뇨관으로부터 복벽 구역으로 소변을 우회시킬 수 있다 (도 4b). 모든 구체예들에서, 이 도관은 기공을 형성하도록 설계될 수 있다.
일 구체예에서, 비뇨기 전환 또는 도관 골격의 관형 구조는 직사각, 원형, 또는 삼각 절단면이다. 또 다른 구체예에서, 관형 구조는 이식후 명백하게 통로가 나있을 수 있도록 충분한 강성을 보유한다. 하나의 다른 구체예에서, 관형 구조의 강성은 이의 내강에 카테터를 이용하여도 또는 이용하지 않아도 유지된다. 일부 구체예들에서, 비뇨기 전환 골격은 이식할 때, 관형 구조의 내강 공간에 배치되도록 설계된 카테터를 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 이 카테터는 Foley-형 벌룬(balloon) 카테터다. 카테터가 이용되면, 관형 구조의 내강 공간에 배치되어 추가 개존(patency)을 제공할 수 있다. 당업계 숙련자들은 당업계에 공지되어 있는 다른 카테터들도 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
또 다른 구체예에서, 이 골격의 관 모양 벽의 두께는 약 2 mm 미만, 약 2.5 mm 미만, 약 3.5 mm 미만, 약 4 mm 미만, 약 4.5 mm 미만, 약 5 mm 미만, 약 5.5 mm, 또는 약 6 mm 미만일 것이다.
일부 구체예들에서, 이 골격은 다양한 외측 및 내측 직경을 가질 수 있다. 일 구체예에서, 이 골격의 단부는 나팔모양으로 벌어지거나, 나팔모양이 아니거나, 봉인되거나 또는 둥근 형태일 수 있다.
다른 구체예들에서, 이 골격은 소변에 대해 투과성이다. 일 구체예에서, 이 골격의 포어 크기는 약 0 마이크론 내지 약 500 마이크론이다. 또 다른 구체예에서, 이 포어 크기는 약 100 마이크론 내지 약 200 마이크론이다. 또 다른 구체예에서, 이 포어 크기는 약 150 마이크론 내지 약 200 마이크론이다. 다른 구체예들에서, 이 포어 크기는 약 100 마이크론, 약 110 마이크론, 약 120 마이크론, 약 130 마이크론, 약 140 마이크론, 약 150 마이크론, 약 160 마이크론, 약 170 마이크론, 약 180 마이크론, 약 190 마이크론, 또는 약 200 마이크론이다. 일부 구체예들에서, 이 포어 크기는 약 100 마이크론, 약 200 마이크론, 약 300 마이크론, 약 400 마이크론, 약 500 마이크론, 또는 약 600 마이크론이다. 다른 구체예들에서, 이 골격은 단일 포어 크기 분포, 다중 포어 크기 분포, 또는 그라디언트 분포의 포어로 된 포어 구성 양식을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 이 골격 재료는 봉합가능하며, 그리고 누출에 저항성을 가진 조직과 연결부를 형성할 수 있다.
다른 구체예들에서, 관형 골격 재료는 이식 용도, 지지대 세포 부착 그리고 숙주 조직의 내부-성장(in-growth) 동안에 걸쳐 개존성(patency)을 유지하고, 유연성을 보유하도록 선택된다. 또 다른 구체예에서, 이 재료는 정상적인 생체내 유체 순환 동안 노출되는 압력을 초과하는 파열 강도(burst strength)를 보유할 것이다. 다른 구체예들에서, 이 재료는 숙주 조직 내부 성장과 비등한 분해 기간을 가질 것이다.
여기에서 설명된 도관 골격과 이를 제조하고 이용하는 방법들은 Ludlow et al.의 미국 공개 특허 출원 번호 20100131075 (전문이 참고자료에 통합됨)에서 더 설명되어 있다.
C. 근육 등가물들
일 측면에서, 본 발명의 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 근육 등가물 골격이다. 일 구체예에서, 이 근육 등가물 골격은 배뇨근 근육 등가물 골격이다. 또 다른 구체예에서, 이 골격은 복강경 이식에 적합하다.
일 측면에서, 이 폴리머성 매트릭스는 상기 치료에서 장기 또는 조직 구조의 적어도 일부분에 정합하도록 성형되고, 그리고 복강경으로 이식되기에 충분한 크기를 가진 폴리머성 매트릭스 또는 골격을 포함한다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 폴리머성 매트릭스 또는 골격의 길이는 약 3 cm 내지 약 20 cm이다. 일 구체예에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격의 최대 길이는 약 20 cm이다. 또 다른 구체예에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격의 최대 길이는 약 15 cm이다. 또 다른 구체예에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격의 최대 길이는 약 10 cm 이다. 또 다른 구체예에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격의 최대 길이는 약 8 cm이다. 또 다른 구체예에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격의 최대 길이는 약 4 cm 이다. 여전히 또 다른 구체예에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격의 최대 길이는 약 3 cm 이다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 폴리머성 매트릭스 또는 골격의 폭은 약 1 cm 내지 약 8 cm이다. 일부 구체예들에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격의 최대 폭은 약 4 cm 이다. 다른 구체예들에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격의 최대 폭은 약 3 cm 이다. 추가 다른 구체예들에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격의 최대 폭은 약 5 cm 이다.
일 구체예에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 3차원(3-D) 모양을 가진다. 또 다른 구체예에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 편평한 모양을 가진다. 일 구체예에서, 편평하게 성형된 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 더 나은 유연성을 허용하도록 사전-처리된 영역들을 포함한다. 특정 구체예들에서, 이 사전-처리된 영역들은 주름이 잡히는 영역들에서 피복된다. 일 구체예에서, 이 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 말리거나, 접히거나(folded) 또는 복강경 튜브 및/또는 포트를 통하여 이식하기에 적합한 모양이 되도록 충분한 유연성이 있다. 이러일 구체예 들에서, 이 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 말린 것이 풀리거나, 접힌 것이 펼쳐지거나 또는 복강경 튜브 및/또는 포트를 통하여 삽입후 모양으로 복귀될 수 있도록 충분한 유연성이 있다. 일 구체예에서, 이 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 복강경 튜브 및/또는 포트를 통하여 이식 전, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 스트립으로 절단된다. 특정 구체예들에서, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 스트립은 복강경 튜브 및/또는 포트를 통하여 이식하기 전 맞물린다. 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 스트립은 접착제, 스테이플, 봉합사, 또는 당업계에 공지되어있는 다른 기술을 이용하여 맞물릴 수 있다. 이러일 구체예 들에서, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 스트립은 복강경 튜브 및/또는 포트를 통과하기 위하여 접히거나 및/또는 겹겹이 쌓이게 된다. 이러일 구체예 들에서, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 스트립은 복강경 튜브 및/또는 포트를 통하여 삽입된 후 펼쳐지거나 및/또는 내려놓이게 된다. 일부 구체예들에서, 이미 위치한 맞물림 수단들은 복강경 튜브 및/또는 포트를 통하여 삽입된 후 적절하게 죄이게 된다.
일 구체예에서, 폴리머성 매트릭스는 패취(patch) 또는 스트립 형태로 제공되는 이식가능한, 생체적합한, 합성 또는 천연 폴리머성 제 1 매트릭스 또는 골격을 포함한다. 일 구체예에서, 이 패취는 치료를 요하는 환자의 방광내 배뇨근 근육 등가물로 이용되는 적합한 형태를 보유한다. 하나의 다른 구체예에서, 이 패취는 치료를 요하는 환자의 기존 방광의 체적 용량을 증가시키는데 적합한 형태를 보유한다. 특정 구체예들에서, 이 패취는 약 50 mL 내지 약 500 mL 사이로 방광 크기를 증가시킨다. 일부 구체예들에서, 이 패취는 방광 크기를 50 mL 증분으로 증가시킬 것이다. 일부 구체예들에서, 이 패취는 방광 크기를 약 450 mL 증가시킨다. 일 구체예에서, 30 ㎠의 표면적 증가는 200 mL의 방광 체적을 250 mL로 증가시킨다. 또 다른 구체예에서, 25 ㎠의 증가는 350 mL의 방광 체적을 400 mL로 증가시킨다. 일 구체예에서, 이 골격은 약 30 ㎠의 2차원 표면적을 보유한다. 또 다른 구체예에서, 이 골격은 약 25 ㎠의 2차원 표면적을 보유한다. 일 구체예에서, 이 패취는 스트립, 원판, 사각, 타원체 또는 임의의 기타 적절한 형상이다. 다른 구체예들에서, 이 패취는 예를 들면, 아코디언과 같이 이미 접혀진 형태로 제공된다.
도 5a-b는 근육 등가물 골격 또는 폴리머성 매트릭스의 예들을 보여준다. 일 구체예에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 도 5a에 나타낸 모양과 같은 이중 쐐기 모양이다. 또 다른 구체예에서, 폴리머성 매트릭스는 도 6-9에 나타낸 것과 같은 형상들중 하나로 성형된다. 도 9d에서, 이식물은 접으면 12 mm 튜브를 통하여 통과할 수 있다.
모든 구체예들에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 방광과 매트릭스 또는 골격 모두에서 긴장을 최소화시키도록 성형된다.
또 다른 구체예에서, 폴리머성 매트릭스는 패취 또는 스트립의 형태로 제공되는 이식가능한, 생체적합한, 합성 또는 천연 폴리머성 제 1 매트릭스 또는 골격을 포함한다. 일 구체예에서, 이 패취는 치료를 요하는 환자의 방광에서 배뇨근 근육 등가물로 사용되기에 적합한 형태를 보유한다. 하나의 다른 구체예에서, 이 패취는 치료를 요하는 환자의 기존 방광의 체적 용량을 증가시키는데 적합한 형태를 보유한다. 일부 구체예들에서, 이 패취는 방광 크기를 50 mL 증분으로 증가시킬 것이다. 일 구체예에서, 이 패취는 스트립, 원판, 사각, 타원체 또는 임의의 기타 적절한 형상이다. 다른 구체예들에서, 이 패취는 예를 들면, 아코디언과 같이 이미 접혀진 형태로 제공된다.
일 구체예에서, 폴리머성 매트릭스는 도 1-9에 나타낸 형상들중 하나로 성형된다.
또 다른 구체예에서, 폴리머성 매트릭스는 도 10-13에 나타낸 형상들중 하나에 따라 이를 요하는 환자에게로 이식된다.
모든 구체예들에서, 이러한 매트릭스 또는 골격에 이용된 생체적합한 재료는 예를 들면, 생분해가능하다. 모든 구체예들에서, 생체적합한 재료는 폴리글리콜산일 수 있다. 모든 구체예들에서, 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 생체적합한 그리고 생분해가능한 성형된 세팅 재료로 피복된다. 일 구체예에서, 성형 세팅 재료는 액체 코폴리머를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 액체 코-폴리머는 액화된 락티드/글리코리드 코폴리머를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 액체 코-폴리머는 폴리-DL-락티드-코-글리코리드를 포함할 수 있다.
여기에서 설명된 근육 등가물 골격과 이를 제조하고 이용하는 방법들은 Ludlow et al .의 미국 공개 특허 출원 번호 20100131075 (이의 전문은 참고자료에 통합된다)에서 더 설명된다.
5. 구조물들( Constructs )
일 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 세포 집단이 살포된 하나 이상의 폴리머성 골격 또는 매트릭스를 제공한다. 세포 집단이 살포된 이러한 골격을 여기에서 "구조물들(constructs)"이라고 부를 수 있다. 일 구체예에서, 세포 살포된 폴리머성 매트릭스 또는 매트릭스는 방광 대체 구조물, 방광 확대 구조물, 방광 도관 구조물, 및 배뇨근 근육 등가물 구조물로 구성된 군으로부터 선택된 새로운 방광 구조물을 형성한다.
여기에서 설명된 하나 이상의 세포 집단의 살포 또는 침착은 당업계에 공지되어 있는 다양한 기술들에 의해 이루어질 수 있다는 것을 당업계 숙련자들은 인지할 것이다. 예를 들면, 생물반응기 항온처리 및 배양(Bertram et al .의 미국 공개된 출원 20070276507; McAllister et al .의 미국 특허 제7,112,218호; Auger et al .의 미국 특허 제5,618,718호; Niklason et al .의 미국 특허 제6,537,567호); 압력 유래된 살포(Torigoe et al . (2007) Cell Transplant ., 16(7):729-39; Wang et al . (2006) Biomaterials. May ; 27(13):2738-46); 및 정전기적 살포 (Bowlin et al.의 미국 특허 제5,723,324호)를 이용할 수 있다. 게다가, 세포들의 에어로졸과 함께 일렉트로스펀 섬유들(electrospun fibers)을 동시에 피복시키는 최근 기술이 살포 또는 침착에 적합할 수 있다(Stankus et al . (2007) Biomaterials, 28:2738-2746).
일 구체예에서, 세포들의 침착은 골격에 세포 부착 강화 단백질을 접촉시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 강화 단백질은 다음중 하나 이상을 포함한다: 피브로넥틴, 콜라겐, 및 MATRIGEL™. 하나의 다른 구체예에서, 이 골격에는 세포 부착 강화 단백질이 없다. 또 다른 구체예에서, 세포들의 침착은 골격에 세포 집단을 접촉시킨 후 배양하는 단계를 포함한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 배양은 생물반응기에서 두드림(pulsatile) 및/또는 안정한 흐름에 의한 조건을 포함할 수 있다.
여기에서 설명된 복막 조직으로부터 단리된 평활근 세포 집단들은 그 다음 여기에서 설명된 골격 상에 살포될 수 있다. 이 복막 조직은 망 조직일 수 있다.
다음은 골격에 망으로부터 유래된 평활근 세포들을 살포하기 위한 대표적인 프로토콜의 예시다. 망으로부터 유래된 평활근 세포들은 골격에 살포하기 위해 요구되는 세포의 양을 만들기 위하여 수주간(예를 들면, 최대 7주) 확장될 수 있다. 골격에 살포하기에 적합한 세포들의 밀도는 하기에서 설명한다. 망으로부터 유래된 평활근 세포들은 구조물을 만들기 위하여 골격 살포용 세포들을 수거하기 전 다수의 계대를 위해 확장될 수 있다. 세포 살포용 골격을 준비하기 위하여, 적합한 재료 (예를 들면, PGA 펠트)를 크기로 절단하고, 적절한 모양으로 봉합하고, 그리고 재료 (예를 들면, PLGA)로 피복한다. 그 다음 이 골격은 적합한 방법(예를 들면, 에틸렌 옥시드)을 이용하여 살균한다. 세포 살포 하루 전날, 살균된 골격은 연속적으로 60% 에탄올/40% D-PBS, 100% D-PBS, D-MEM/10% FBS 또는 α-MEM/10% FBS로 침윤시켜 미리-적시고, 실온에서 하룻밤 동안 D-MEM/10% FBS 또는 α-MEM/10% FBS에서 항온처리할 수 있다. 그 다음 이 골격은 망으로부터 유래된 평활근 세포들로 살포되며 그리고 살포된 구조물은 피험자에 이식될 때까지 5% CO₂, 가습된 37℃ 배양기에서 성숙된다(예를 들면, 7일까지). 당업계 숙련자들은 세포 살포용 골격을 준비하고 그리고 골격에 세포를 살포하기 위한 추가 방법들을 인지할 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 복막 유래된 평활근 세포들을 보유하는 구조물을 제조하는 방법들을 제공한다. 일 구체예에서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: a) 인간 복막 조직 시료를 수득하는 단계; b) 이 시료로부터 평활근 세포 집단을 단리시키는 단계; c) 이 세포 집단을 배양하는 단계; 및 d) 이 세포 집단에 성형된 폴리머성 매트릭스 세포 구조물을 접촉시키는 단계. 인간 복막 조직 시료는 자가조직 또는 비-자가조직 원천으로부터 구할 수 있다. 인간 복막 조직 시료는 망 조직일 수 있다. 하나의 다른 구체예에서, 이 방법은 평활근 세포 마커의 발현을 탐지하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 발현은 mRNA 발현이다. 추가 구체예에서, 이 발현은 폴리펩티드 발현이다. 일 구체예에서, 이 폴리펩티드 발현은 세포내 면역형광에 의해 탐지된다.
일 구체예에서, 이 골격은 여기에서 설명된 세포 집단을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 골격은 기본적으로 여기에서 설명된 세포 집단으로 구성한다. 하나의 다른 구체예에서, 이 골격은 여기에서 설명된 세포 집단으로 구성한다.
만약 있다면, 제 1 폴리머성 매트릭스 또는 제 2 폴리머성 매트릭스, 또는 이 둘 모두는 세포와 함께 매트릭스 또는 골격의 구조물을 만들기 위하여, 제 1 폴리머성 매트릭스의 제 1 표면에, 제 2 폴리머성 매트릭스의 제 1 표면에, 또는 이 둘 모두에 침착된 적어도 하나의 세포 집단을 포함하며, 이때 적어도 하나의 세포 집단은 실질적으로 근육 세포 집단을 포함한다. 이 근육 세포 집단은 예를 들면, 평활근 세포 집단이다. 바람직한 구체예에서, 제 1 표면 및 제 2 표면은 각각 제 1과 제 2 폴리머성 매트릭스의 외측 표면이다.
또 다른 구체예에서, 매트릭스 및 세포들을 포함하는 이 구조물에는 임의의 기타 세포 집단들이 없다. 바람직한 구체예에서, 이 구조물에는 요상피 세포들이 없다.
이들 구조물은 비뇨생식기 장기, 예를 들면, 비뇨기 방광, 수뇨관 및 요도를 포함하는 비뇨생식기 장기와 같은 내강형 장기 또는 조직 구조들을 이를 필요로 하는 피험자에게 제공하는데 이용된다. 이 피험자는 이러한 장기 또는 조직들의 재건, 수리, 확대 또는 대체를 필요로 할 수 있다. 일 구체예에서, 내강형 장기 또는 조직 구조는 방광 또는 이의 일부분이며, 그리고 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 매트릭스의 표면 상에 침착된 평활근 세포들을 보유한다. 이 구조물들은 비뇨기 전환 또는 도관, 또는 배뇨근 근육 등가물을 제공하는데 또한 이용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 여기에서 설명된 세포 집단이 살포된 비뇨기 전환 또는 도관 골격 또는 매트릭스를 제공한다. 세포 집단이 살포된 이러한 골격은 여기에서"구조물들"이라고 지칭할 수 있다. 일 구체예에서, 비뇨기 전환 또는 방광 도관 구조물은 여기에서 설명된 하나 이상의 골격과 여기에서 설명된 하나 이상의 골격 표면 상에 침착된 세포 집단으로 구성된다.
일 측면에서, 본 발명은 비뇨기 전환 구조물들과 이를 만들고 이용하는 방법들을 제공한다. 일 구체예에서, 비뇨기 전환은 피험자의 불량성 방광을 위한 것이며, 그리고 (a) 복벽 구역에 연결되도록 형성된 제 1 단부를 보유한 관형 골격, 제 2 닫힌 단부, 그리고 제 1 수뇨관에 연결되도록 형성된 적어도 하나의 제 1 측면 개구부를 포함하는 이식가능한 생체적합한 제 1 구조물; 및 (b) 이 골격의 표면상에 침착된 복막 유래된 세포 집단을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 비뇨기 전환은 피험자의 불량성 방광을 위한 것이며, 그리고 (a) 피험자의 복벽의 개구부에 연결되도록 형성된 제 1 단부, 제 2 닫힌 단부, 그리고 제 1 수뇨관으로부터 소변이 관형 골격로 통과할 수 있도록 수뇨관에 연결되는데 적합한 적어도 하나의 제 1 측면 개구부를 포함하는 소변의 임시 보관 및 통과에 적합한 이식가능한, 생체적합한 관형 골격; 및 (b) 이 골격의 표면상에 침착된 복막 유래된 세포 집단을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 치료를 요하는 피험자의 불량성 방광을 위한 비뇨기 전환 구조물을 준비하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: a) 복벽 구역과 접촉하도록 형성된 제 1 단부를 보유한 관모양의 골격, 제 2 닫힌 단부, 그리고 제 1 수뇨관에 연결되도록 형성된 적어도 하나의 제 1 측면 개구부를 포함하는 이식가능한 생체적합한 제 1 골격을 제공하는 단계; 및 b) 비뇨기 전환 구조물을 만들기 위하여 골격의 제 1 지역에 복막 유래된 세포 집단을 침착시키는 단계. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 a) 피험자의 복벽에 있는 개구부에 연결되도록 형성된 제 1 단부, 제 2 닫힌 단부, 그리고 제 1 수뇨관으로부터 소변이 관형 골격의 내부로 통과를 허용하도록 제 1 수뇨관에 연결되는데 적합한 적어도 하나의 제 1 측면 개구부를 포함하는 소변의 임시 저장 및 통과에 적합한 이식가능한, 생체적합한 관형 골격을 제공하는 단계; 및 b) 비뇨기 전환 구조물을 만들기 위하여 골격의 표면에 복막 유래된 세포 집단을 침착시키는 단계를 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 기존의 내강형 장기 또는 조직 구조 예를 들면, 비뇨기 방광을 포함하는 비뇨생식기 장기를 강화시키는데 이용되는 근육 등가물 구조물들을 이를 요하는 피험자에게 제공한다. 이 피험자는 이러한 장기 또는 조직의 확장 또는 치료를 필요로 할 수 있다. 일 구체예에서, 내강형 장기 또는 조직 구조는 방광 또는 이의 일부분이며, 그리고 폴리머성 매트릭스 또는 골격은 매트릭스 표면에 침착된 평활근 세포들을 보유한다. 일 구체예에서, 이 구조물들을 이용하여 배뇨근 근육 등가물을 제공한다.
당업계 숙련자들은 매트릭스 또는 골격 상에 세포집단을 침작시키는 몇 가지 적합한 방법들이 있다는 것을 인지할 것이다.
일 측면에서, 이 구조물들은 새로운 장기 또는 조직 구조가 필요한 피험자에게 이식하는데 적합하다. 일 구체예에서, 이 구조물은 사이토킨 MCP-1을 생산하는 세포 집단을 포함한다. 또 다른 구체예에서, MCP-1는 이식 부위로 피험자의 또는 수취인의 고유 간엽성 줄기 세포들이 이식 부위로의 이동을 유도한다. 일 구체예에서, 이동하는 수취인의 고유 간엽성 줄기 세포들은 새로운 장기 또는 조직 구조의 재생을 지원한다.
또 다른 일 측면에서, 본 발명은 특정 세포 밀도에서 세포들이 살포된 골격을 제공한다. 일 구체예에서, 골격은 약 20×10⁶ 내지 약 30×10⁶ 세포 밀도에서 평활근 세포 집단이 살포된다. 또 다른 구체예에서, 세포 밀도는 약 1×10⁶ 내지 약 40×10⁶, 약 1×10⁶ 내지 약 30×10⁶, 약 1×10⁶ 내지 약 20×10⁶, 약 1×10⁶ 내지 약 10×10⁶, 또는 약 1×10⁶ 내지 약 5×10⁶이다.
추가 구체예에서, 세포 밀도는 약 20×10⁶ 내지 약 98×10⁶ 세포들이다. 추가 구체예들에서, 세포 밀도는 약 21×10⁶ 내지 약 97×10⁶, 약 22×10⁶ 내지 약 95×10⁶, 약 23×10⁶ 내지 약 93×10⁶, 약 24×10⁶ 내지 약 91×10⁶, 약 25×10⁶ 내지 약 89×10⁶, 약 26×10⁶ 내지 약 87×10⁶, 약 28×10⁶ 내지 약 85×10⁶, 약 29×10⁶ 내지 약 83×10⁶, 약 30×10⁶ 내지 약 80×10⁶, 약 35×10⁶ 내지 약 75×10⁶, 약 40×10⁶ 내지 약 70×10⁶, 약 45×10⁶ 내지 약 65×10⁶, 또는 약 50×10⁶ 내지 약 60×10⁶이다. 바람직한 구체예에서, 세포 밀도는 약 24×10⁶ 내지 약 91×10⁶ 세포들이다.
또 다른 구체예에서, 세포 밀도는 약 2.5×10⁶ 내지 약 40×10⁶, 약 5×10⁶ 내지 약 40×10⁶, 약 7.5×10⁶ 내지 약 35×10⁶, 약 10×10⁶ 내지 약 30×10⁶, 약 15×10⁶ 내지 약 25×10⁶, 그리고 약 17.5×10⁶내지 약 22.5×10⁶이다. 또 다른 구체예에서, 세포 밀도는 약 1×10⁶, 약 2×10⁶, 약 3×10⁶, 약 4×10⁶, 약 5×10⁶, 약 6×10⁶, 약 7×10⁶, 약 8×10⁶, 약 9×10⁶, 약 10×10⁶, 약 11×106, 약 12×10⁶, 약 13×10⁶, 약 14×10⁶, 약 15×10⁶, 약 16×10⁶, 약 17×10⁶, 약 18×10⁶, 약 19×10⁶, 약 20×10⁶, 약 21×10⁶, 약 22×10⁶, 약 23×10⁶, 약 24×10⁶, 약 25×10⁶, 약 26×10⁶, 약 27×10⁶, 약 28×10⁶, 약 29×10⁶, 약 30×10⁶, 약 31×10⁶, 약 32×10⁶, 약 33×10⁶, 약 34×10⁶, 약 35×10⁶, 약 36×10⁶, 약 37×10⁶, 약 38×10⁶, 약 39×10⁶, 약 40×10⁶, 약 41×10⁶, 약 42×10⁶, 약 43×10⁶, 약 44×10⁶, 약 45×10⁶, 약 46×10⁶, 약 47×10⁶, 약 48×10⁶, 약 49×10⁶, 약 50×10⁶, 약 51×10⁶, 약 52×10⁶, 약 53×10⁶, 약 54×10⁶, 약 55×10⁶, 약 56×10⁶, 약 57×10⁶, 약 58×10⁶, 약 59×10⁶, 약 60×10⁶, 약 61×10⁶, 약 62×10⁶, 약 63×10⁶, 약 64×10⁶, 약 65×10⁶, 약 66×10⁶, 약 67×10⁶, 약 68×10⁶, 약 69×10⁶, 약 70×10⁶, 약 71×10⁶, 약 72×10⁶, 약 73×10⁶, 약 74×10⁶, 약 75×10⁶, 약 76×10⁶, 약 77×10⁶, 약 78×10⁶, 약 79×10⁶, 약 80×10⁶, 약 81×10⁶, 약 82×10⁶, 약 83×10⁶, 약 84×10⁶, 약 85×10⁶, 약 86×10⁶, 약 87×10⁶, 약 88×10⁶, 약 89×10⁶, 약 90×10⁶, 약 91×10⁶, 약 92×10⁶, 약 93×10⁶, 약 94×10⁶, 약 95×10⁶, 약 96×10⁶, 약 97×10⁶, 약 98×10⁶, 또는 약 99×10⁶이다.
추가 측면에서, 본 발명은 골격 ㎠ 당 특정 세포 밀도에서 세포들이 살포된 골격을 제공한다. 일 구체예에서, 이 밀도는 약 3,000개 세포/㎠ 내지 약 15,000개 세포/㎠, 약 3,500개 세포/㎠ 내지 약 14,500개 세포/㎠, 약 4,000개 세포/㎠ 내지 약 14,000개 세포/㎠, 약 4,500개 세포/㎠ 내지 약 13,500개 세포/㎠, 약 5,000개 세포/㎠ 내지 약 13,000개 세포/㎠, 약 4,500개 세포/㎠ 내지 약 13,500개 세포/㎠, 약 5,000개 세포/㎠ 내지 약 13,000개 세포/㎠, 약 5,500개 세포/㎠ 내지 약 12,500개 세포/㎠, 약 6,000개 세포/㎠ 내지 약 12,000개 세포/㎠, 약 6,500개 세포/㎠ 내지 약 11,500개 세포/㎠, 약 7,000개 세포/㎠ 내지 약 11,000개 세포/㎠, 약 7,500개 세포/㎠ 내지 약 10,500개 세포/㎠, 약 8,000개 세포/㎠ 내지 약 10,000개 세포/㎠, 약 7,500개 세포/㎠ 내지 약 9,500개 세포/㎠, 또는 약 8,000개 세포/㎠ 내지 약 9,000개 세포/㎠다. 바람직한 구체예에서, 이 밀도는 약 3,000개 세포/㎠ 내지 약 7,000개 세포/㎠, 또는 약 9,000개 세포/㎠ 내지 약 15,000개 세포/㎠다.
일 측면에서, 본 발명의 이 구조물들은 이식 후 피험자에 특별한 성질을 제공하는데 적합하다. 일 구체예에서, 이 구조물들은 이식후 피험자에게 재생을 제공하는데 적합하다. 또 다른 구체예에서, 이 구조물들은 피험자의 이식 부위에서 재생을 촉진시키는데 적합하다. 예를 들면, 이식 후, 재생된 조직은 이식 부위에서 구조물 자체로부터 형성될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이 구조물은 이식후 피험자에게 기능적 속성을 부여할 수 있다. 예를 들면, 비뇨기 전환 구조물은 제 1 수뇨관 (예를 들면, 제 1 측면 개구부)으로부터 피험자의 소변이 관형 골격의 내부로 통화하는데 적합할 수 있거나, 및/또는 소변의 일시적 보관 (예를 들면, 관형 골격) 및 피험자 밖으로 배출시키는데 적합할 수 있다. 일 구체예에서, 비뇨기 전환 구조물은 이식시에 상피화된 점막을 제공하는데 적합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 구조물은 피험자에서 새로운 장기 또는 조직 구조의 항상성 조절 발달을 제공하는데 적합할 수 있다.
6. 이용 방법들
일 측면에서, 본 발명은 이러한 치료를 요하는 피험자에게 박층형으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조을 제공하기 위한 방법들을 고려한다. 일 구체예에서, 이 피험자는 장기 또는 조직의 재생, 재건, 수리, 확대, 또는 대체를 필요로 할 수 있다. 일 구체예에서, 이 방법은 장기 또는 조직 구조가 필요한 장기 또는 조직 구조의 적어도 일부에 정합하는 모양의 생체적합한 합성 또는 천연 폴리머성 매트릭스를 제공하는 단계를 포함한다. 제공 단계에 이어 재건, 수리, 확대 또는 대체의 대상이 되는 장기 또는 조직 구조로부터 유도되지 않은 적어도 하나의 세포 집단의 침착이 이어질 수 있다. 침착 단계는 폴리머성 매트릭스 상에 세포 집단을 배양하는 것을 포함할 수 있다. 구조물을 제공하기 위하여 매트릭스 상에 세포 집단을 침착시킨 후, 박층형으로 구조화된 원하는 내강형 장기 또는 조직 구조의 형성을 위하여 환자의 치료 부위로 이식될 수 있다. 일 구체예에서, 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조는 방광 또는 방광의 일부다.
또 다른 일 측면에서, 본 발명은 치료를 요하는 피험자에게 박층형으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조를 제공하는 방법들을 제공한다. 일 구체예에서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: a) 상기 치료를 요하는 장기 또는 조직 구조의 적어도 일부분에 정합하도록 성형된 생체적합한 합성 또는 천연 폴리머성 매트릭스를 제공하는 단계; b) 새로운 장기 또는 조직 구조에 대응하는 고유의 장기 또는 조직으로부터 유도되지 않은 세포 집단을 폴리머성 매트릭스의 제 1 영역에 침착시키는 단계; 및 c) 박층형으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 형성을 위하여 상기 피험자에게 성형된 폴리머성 매트릭스 세포 구조물을 이식하는 단계. 또 다른 일 측면에서, 본 발명은 새로운-방광 또는 이의 일부분을 이를 필요로하는 피험자에게 제공하는 방법들을 제시한다. 일 구체예에서, 이 방법은 a) 방광 또는 이의 일부분에 정합하도록 성형된 생체적합한 합성 또는 천연 폴리머성 매트릭스를 제공하고; b) 피험자의 방광으로부터 유도되지 않은 세포 집단을 폴리머성 매트릭스의 제 1 영역에 침착시키고; 및 c) 새로운-방광 또는 이의 일부분의 형성을 위하여 성형된 폴리머성 매트릭스 세포 구조물을 피험자에게 이식시키는 단계들을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 여기에서 설명된 방법의 단계 b)의 세포 집단은 평활근 세포 마커에 대해 양성인 수축성 기능을 보유한 하나 이상의 복막 유래된 평활근 세포들을 담고 있다. 하나의 다른 구체예에서, 이 세포 집단의 수축성 기능은 칼슘-의존적이다. SMC는 망으로부터 유도될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법들은 혈관생성을 허용하기 위하여 이식된 도관 구조물을 피험자의 망, 장간막, 근육 막, 및/또는 복막으로 감싸는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 일 측면에서, 본 발명은 불량성 방광 치료를 요하는 피험자의 불량성 방광을 위한 비뇨기 전환 또는 도관을 제공하는 방법들을 제공한다. 일 구체예에서, 피험자에게 비뇨기 전환을 제공하는 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 생체적합한 도관 골격을 제공하는 단계; (b) 상기 골격의 제 1 영역에 제 1 세포 집단을 침착시키는 단계, 상기 제 1 세포 집단은 실질적으로 근육 세포 집단이며; 및 (c) 단계 (b)의 골격을 상기 피험자에게 이식하여 피험자 외부로 소변을 방출시키는 도관을 형성시키는 단계. 또 다른 구체예에서, 생체적합한 재료는 생분해가능하다. 다른 구체예들에서, 이 생체적합한 재료는 폴리글리콜산이다. 추가 또 다른 구체예에서, 제 1 세포 집단은 실질적으로 평활근 세포 집단이다.
일 구체예에서, 이 방법은 여기에서 설명된 비뇨기 전환 또는 도관 골격을 제공하는 단계를 포함한다. 기타 추가 구체예들에서, 비뇨기 전환 또는 도관 골격은 여기에서 설명된 것과 같이 다중 부분, 예를 들면, 제 1, 제 2, 그리고 제 3 골격로 제공된다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 비뇨기 전환 또는 도관 구조물을 만들기 위하여 불량성 방광으로부터 유도되지 않은 세포 집단을 침착시키는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 다른 구체예에서, 침착 단계는 이 골격 상에 세포 집단을 배양하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 방법들은 이 비뇨기 전환 구조물을 치료를 요하는 환자에게 이식하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이식은 불량성 방광 부위에 실시한다.
일 구체예에서, 이 구조물의 개방 단부 (예를 들면, 복벽에 연결되도록 형성된 제 1 단부)는 기공 또는 괄약근을 만들기 위하여 복부 또는 결합부위(suprapubic) 벽을 통하여 피부에 문합된다(인공항문성형술). 또 다른 구체예에서, 카테터는 소변을 배출시키기 위하여 기공 개구부를 통하여 구조물의 내강으로 삽입된다.
도 10은 이식된 도관 구조물의 형상을 설명한다.
하나의 다른 구체예에서, 본 발명은 치료를 요하는 피험자의 불량성 방광의 비뇨기 전환을 제공하는 방법을 제시하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: a) 복벽 구역에 연결되도록 형성된 제 1 단부를 보유한 관형 골격, 제 2 닫힌 단부, 그리고 제 1 수뇨관에 연결되도록 형성된 적어도 하나의 제 1 측면 개구부를 포함하는 이식가능한 생체적합한 제 1 골격을 제공하는 단계; 및 b) 비뇨기 전환 구조물을 형성하기 위하여 골격의 제 1 영역상에 복막 유래된 세포 집단을 침착시키는 단계; 및 c) 비뇨기 전환의 형성을 위하여 이 구조물을 피험자에게 이식하는 단계. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: a) 피험자의 복벽에 있는 개구부에 연결되도록 형성된 제 1 단부, 제 2 닫힌 단부, 그리고 소변이 제 1 수뇨관으로부터 관형 골격로 통과하도록 하기 위하여 제 1 수뇨관에 연결되는데 적합한 적어도 하나의 제 1 측면 개구부를 포함하는 소변의 임시 보관 및 통과에 적합한 이식가능한, 생체적합한 관형 골격을 제공하는 단계; b) 비뇨기 전환 구조물을 만들기 위하여 골격의 표면에 복막 유래된 세포 집단을 침착시키는 단계; 및 c) 비뇨기 전환 형성을 위하여 이 구조물을 피험자에게 이식시키는 단계. 하나의 다른 구체예에서, 이 방법은 피험자에게 다음의 구성을 포함하는 비뇨기 전환 구조물을 이식시키는 단계를 포함한다: (a) 복벽 구역에 접촉하도록 형성된 제 1 단부, 제 2 닫힌 단부, 그리고 제 1 수뇨관에 연결되도록 형성된 적어도 하나의 제 1 측면 개구부를 보유한 관형 골격; 및 (b) 비뇨기 전환의 형성을 위하여 골격의 표면에 침착된 복막 유래된 세포 집단.
모든 구체예들에서, 비뇨기 전환 골격은 제 2 수뇨관에 연결되도록 형성된 제 2 측면 개구부를 추가로 포함할 수 있다. 모든 구체예들에서, 제 1 단부는 복벽과 동일한 면에 위치하도록 설계될수 있다. 모든 구체예들에서, 제 1 단부는 피험자의 피부에 봉합되도록 설계될 수 있다. 모든 구체예들에서, 제 1 단부는 기공을 형성하도록 설계될 수 있다. 모든 구체예들에서, 이 기공은 기공 버턴을 추가로 포함할 수 있다. 모든 구체예들에서, 이 골격은 기공을 형성하도록 설계된 워셔 링을 추가로 포함한다. 모든 구체예들에서, 생체적합한 골격은 생분해가능하다. 모든 구체예들에서, 이 골격은 폴리글리콜산, 폴리락트산, 그리고 폴리글리콜산과 폴리락트산의 코폴리머로 구성된 군으로부터 선택된 재료를 포함할 수 있다. 모든 구체예들에서, 세포 집단은 평활근 세포 집단이다. 모든 구체예들에서, 이 전환은 불량성 방광을 대체하는 것일 수 있다. 모든 구체예들에서, 이 전환은 일시적인 것일 수 있다. 모든 구체예들에서, 이 전환은 영구적인 것일 수 있다. 모든 구체예들에서, 관형 골격은 직사각 단면 형상 또는 삼각 단면 형상, 또는 원형 단면 형상을 보유할 수 있다. 모든 구체예들에서, 이 전환은 요상피 세포들이 없을 수 있다. 모든 구체예들에서, 본 발명의 방법들은 비뇨기 유사 조직 재생을 특징으로 하는 새로운 비뇨기-도관을 제공할 수 있다. 모든 구체예들에서, 재생된 조직은 다음 중 하나 이상의 존재로 특징화될 수 있다: 전환상피(urothelium), 기저막(lamina propria), 그리고 평활근 번들. 모든 구체예들에서, 재생된 조직은 다음중 하나 이상에서 관찰될 수 있다: 수뇨관-도관 접합부(UCJ), 도관의 두개부분(cranial portion), 그리고 도관의 중간-방 부분. 모든 구체예들에서, 재생된 조직은 다음중 하나 이상의 존재로 특징으로 할 수 있다: 점막, 점막하조직, 그리고 섬유관기질과 함께 평활근. 모든 구체예들에서, 재생된 조직은 기부 평활근과 함께 연속 전환상피(urothelium)다. 모든 구체예들에서, 비뇨기 도관은 이식시에 상피화된 점막을 형성한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 이 방법들은 비뇨기 전환 구조물의 이식 후 폐색의 존재에 대해 도관을 모니터하는 단계를 추가로 포함한다. 이 폐색은 생물찌꺼기의 축적에 의한 것일 수 있다. 이 방법은 폐색이 탐지된다면 도관의 내강으로부터 생물찌꺼기를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 일시적으로 비뇨기 전환을 요하는 피험자에게 이를 제공한다. 일 구체예에서, 일시적 비뇨기 전환 또는 도관 구조물은 기공 개구부를 만들기 위하여 피험자에게 이식되고, 카테터 또는 기타 장비는 기공을 통하여 도관 구조물의 내강으로 일시적으로 삽입된다. 일시적 도관은 피험자로부터 소변이 배출되는 장점을 제공하며, 한편으로 불량성 방광에 영구적인 해결방법이 시도되고 있다. 예를 들면, 도관 구조물의 이식은 세포 집단이 살포된 새로운-방광 구조물의 이식 전, 이식 후, 또는 동시에 실행될 수 있다(예를 들면 Bertram et al . supra 참고). 도 11은 일시적 비뇨기 전환 구조물의 이식된 구성요소들의 예를 나타낸다.
일 구체예에서, 본 발명의 이 방법들은 맥관화를 위하여 이식된 비뇨기 전환 또는 도관 구조물을 피험자의 망, 장간막, 근육 근막, 및/또는 복막으로 두르는 단계를 추가로 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 비뇨기 전환을 요하는 피험자에게 영구적인으로 이를 제공한다. 도 12는 영구적인 비뇨기 전환 구조물의 이식된 구성요소들의 예를 보여준다.
일 구체예에서, 여기에서 설명된 이 구조물들은 전립선 요도 대체 및 비뇨기 전환에 이용될 수 있다. 이러한 과정은 전립선 요도를 제거하기 위하여 근치적 전립샘 적출술이 필요한 피험자에게 필수적이다. 다른 구체예들에서, 이 구조물들은 벨브와 유사한 비틀림(kink)을 가진 자제형(continent) 튜브를 만들기 위하여 경피 전환 튜브에 이용될 수 있다. 추가 구체예에서, 이 구조물들은 방광 목 슬링(sling) 그리고 방광 목 수술에 이용되는 포장 재료들 그리고 자제성 채널 또는 카테터를 꽂을 수 있는 개구부를 가진 비뇨기 배출구로 이용될 수 있다. 도 13은 이러일 구체예 들의 예시들을 나타낸다.
소변은 국소 및/또는 올라오는 감염에 대항하여 개구부를 방어하는 성질이 결합된, 그리고 여성에서는 질 연결통로에서 그리고 남성에서 주상와(fossa navicularis)에서 비어있는 독특한 구조의 요도관을 통하여 신체 밖으로 배출된다. 특히, 이 영역의 점막피부는 보호성 내생 락토박테리아 세균총에 대한 기질을 제공하는 글리코겐이 풍부한 세포들로 구성된 비-케라틴화된 계층화된 비늘모양의 상피다. 또한, 이 상피는 피부에 가까이 있기 때문에, 산-포스파타제 활성 및 세균성 화합물들을 분비하는 대식세포들의 존재를 나타내는 라이소자임 유사 면역반응성과 연관된다(Holstein AF et al . (1991) Cell Tissue Res 264: 23).
일 측면에서, 여기에서 설명된 비뇨기 전환 또는 비뇨기 새로운-도관 (NUC) 구조물들은 고유의 요도에서 관찰되는 구조적 특징들을 보유한 비뇨기 점막과 피부 피부 사이에 고유의 것과 유사한 전이의 형성을 유도할 수 있다. 전이 영역은 상피화된 점막으로 불릴 수도 있다. 일 구체예에서, 이 구조물은 이식 시에 상피화된 점막을 형성하는데 적합하다. 일 구체예에서, 상피화된 점막은 전정 영역 및 점막피부 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 전정 영역은 점막피부 영역에 인접한다. 또 다른 구체예에서, 이 점막피부 영역은 피험자의 복벽 및 피부에 연결된 구조물의 기질 단부에 위치한다. 일반적으로, 천연적으로 생성되는 점막피부 영역들은 점막과 피부 가죽(cutaneous skin)의 존재로 특징화되며, 전형적으로 외부 가죽이 끝나고 신체의 내부를 덮고 있는 점막이 시작되는 신체의 구멍들에 가까이 존재한다. 본 발명의 구조물들과 방법들에 의해 제공되는 상피화된 점막은 피험자에게 이식 후 비뇨기 전환 구조물의 제 1 단부에서 발달한다. 추가 구체예에서, 상피화된 점막은 전정 영역에서 우선 나타나고, 점진적으로 점막피부 영역을 통하여 이 구조물의 기질 말단 쪽으로 확장 또는 증가되는 상피의 존재로 특징화된다. 또 다른 구체예에서, 이 상피는 상피 세포 마커의 발현으로 특징화된다. 추가 구체예에서, 상피 세포 마커는 사이토케라틴이다. 이 사이토케라틴은 사이토케라틴 1 내지 19를 포함하나 이에 한정되지 않는 당업계에 공지되어 있는 하나 이상의 사이토케라틴일 수 있다. 하나의 다른 구체예에서, 이 사이토케라틴은 AE-1/AE3 항체로 탐지가능하다.
상피화된 점막을 형성하기 위하여 여기에서 설명된 구조물들의 능력은 복부 기공을 통하여 비뇨기 전환을 얻은 주요 난관에 해결책을 제공한다. 경피 장치들의 수명은 출구-부위 감염에 의해 종종 방해를 받는다는 것은 인정된 사실이다(Knabe C et al . (1999) Biomaterials 20: 503). 카테터, 캐뉼라, 보철 부착, 그리고 포도당 센서들과 같은 경피 장비들은 이들의 의도된 의학적 목적과 관계없이 피부를 관통하고, 피부의 보호 장벽을 파괴하고, 그리고 세균 침입을 위한 상처한 누관을 만든다(Isenhath SN et al . (2007) J Biomed Mater Res A 83: 915). 부적절한 상피 치료, 생체적합성 부족, 또는 물리적인 스트레스로 인하여 산물-피부 경계면의 파괴는 추가적인 실패 위험의 원인이 될 수 있다(von Recum AF and Park JB . (1981) Crit Rev Bioeng 5:37).
또 다른 측면에서, 수취인의 조직과 상호작용을 통하여 비뇨기 전환 구조물들은 관형 피지선(organoid)을 재생시킨다. 일 구체예에서, 수취인 조직과 이 구조물의 상호작용은 경복-경피 배치에 의한 것이다. 하나의 다른 구체예에서, 관형 피지선은 수뇨관으로부터 수취인 외부로 소변의 이동을 허용한다. 소변은 수취인 밖으로 배출되고, 한편으로 방광, 요도, 그리고 기공(예를 들면, 관 또는 개구부)에서 볼 수 있는 고유의 것과 유사한 기능적 성질들은 유지된다. 점막-피부 접합부는 전방 요도의 개구부; 남성 및 여성의 각각 질 연결통로 그리고 주상와에서 발견되는 접합과 닮았다. 이러한 천연 접합부는 올라오는 감염으로부터 보호를 제공할 수 있는 습식-건식 표면들에 중대한 점막 지역들에 의해 피복된다. 이들 점막 지역의 비늘모양의 상피는 1) 글리코겐-풍부하고, 2) 분비성 (효소들과 살균제를 방출할 수 있는), 그리고 3) 식작용성이며; 및 손상된 표면으로 신속하게 이동할 수 있다.
확대될 장기 또는 조직에 골격의 접합은 실시예들에서 설명된 방법들 또는 당업계에 공지되어 있는 방법들에 따라 실행할 수 있다. 매트릭스 또는 골격은 접합 재료를 표적 장기에 봉합함으로써 피험자의 장기 또는 조직에 접합시킬 수 있다.
설명된 기술들을 이용하여 이러한 치료를 요하는 환자의 기존 박층형으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조를 확장할 수 있다. 예를 들면, 기존의 박층형으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조는 상기 치료를 요하는 장기 또는 조직 구조의 적어도 일부분에 정합하도록 성형되고, 복강경으로 이식되기에 충분한 크기를 가진 폴리머성 매트릭스 또는 골격을 제공하고; 상기 폴리머성 매트릭스의 제 1 지역에 상기 장기 또는 조직 구조로부터 유도되지 않은 세포 집단을 침착시키고; 및 상기 환자의 상기 치료 부위에 성형된 폴리머성 매트릭스 구조물을 복강경으로 이식하여, 기존의 박층형으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조가 확장되도록 함으로써, 확대될 수 있다.
도 7e는 여기에서 설명된 근육 등가물 골격의 이식을 위한 가능한 외과술 방법들을 설명한다. 도 7f는 비어있는 그리고 가득찬 방광에서 이식 부위를 설명한다. 도 7g는 표면의 절단시에 만들어지는 타원체를 보여주는 외과적 상처가 있는 비뇨기 방광을 나타낸다. 플라스틱 튜브는 본 발명의 접힌 또는 말린 폴리머성 매트릭스 또는 골격을 통과시키기 위하여 이용가능한 제한된 공간의 모델로 이용될 수 있다.
설명된 기술들을 이용하여 이러한 치료를 요하는 환자에서 방광 용적 용량을 또한 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 방광 용적 용량은 상기 치료가 필요한 장기 또는 조직 구조의 적어도 일부분에 정합되도록 성형되고, 그리고 복강경으로 이식하기에 충분한 크기의 생체적합한 합성 또는 천연 폴리머성 매트릭스를 제공하고; 상기 폴리머성 매트릭스의 제 1 영역상에 상기 장기 또는 조직 구조로부터 유도되지 않은 세포 집단을 침착시키고; 및 방광 체적 용량이 증가되도록 상기 환자의 치료 부위로 성형된 폴리머성 매트릭스 구조물을 복강경으로 이식함으로써, 방광 체적 용량은 증가될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 매트릭스 또는 골격은 방광 체적 용량을 약 50 mL 증가시키는데 적합하다. 다른 구체예들에서, 본 발명의 매트릭스 또는 골격은 방광 체적 용량을 약 100 mL 증가시키는데 적합하다. 다른 구체예들에서, 본 발명의 매트릭스 또는 골격은 방광 체적 용량을 약 60, 약 70, 약 80, 또는 약 90 mL 증가시키는데 적합하다.
여기에서 설명된 기술들은 이러한 치료를 요하는 환자에서 방광 절개 부위를 확장시키는데 더 이용될 수 있다. 예를 들면, 방광 절개 부위는 상기 치료가 필요한 장기 또는 조직 구조의 적어도 일부분에 정합되도록 성형되고, 그리고 복강경으로 이식하기에 충분한 크기의 생체적합한 합성 또는 천연 폴리머성 매트릭스를 제공하고; b) 상기 폴리머성 매트릭스의 제 1 영역상에 상기 장기 또는 조직 구조로부터 유도되지 않은 세포 집단을 침착시키고; c) 그리고 방광 절개 부위가 확장되도록 상기 환자의 치료 부위로 성형된 폴리머성 매트릭스 구조물을 복강경으로 이식함으로써, 방광 절개 부위는 확장될 수 있다.
본 발명의 또 다른 비-제한적인 용도는 이러한 치료를 요하는 환자의 요실금 치료 방법들을 포함한다. 예를 들면, 요실금은 상기 치료가 필요한 장기 또는 조직 구조의 적어도 일부분에 정합되도록 성형되고, 그리고 복강경으로 이식하기에 충분한 크기의 생체적합한 합성 또는 천연 폴리머성 매트릭스를 제공하고; 상기 폴리머성 매트릭스의 제 1 영역상에 상기 장기 또는 조직 구조로부터 유도되지 않은 세포 집단을 침착시키고; 및 방광 체적 용량이 증가되도록 상기 환자의 치료 부위로 성형된 폴리머성 매트릭스 구조물을 복강경으로 이식함으로써, 치료될 수 있다.
일 구체예에서, 여기에서 설명된 골격, 세포 집단, 그리고 방법들은 여기에서 설명된 장애의 치료에 유용한 약물을 제조하는데 더 이용될 수 있다. 장애는 피험자에서 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 재생, 재건, 수리, 확대 또는 대체를 요하는 임의의 상태를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 장기 또는 조직 구조는 방광 또는 방광의 일부다.
또 다른 구체예에서, 이식된 구조물에 침착되는 세포들은 MCP-1를 생산하고 이식부위에서 이를 방출하여, 고유의 간엽성 줄기 세포들 (MSCs)이 이식 부위로의 이동을 자극한다. 하나의 다른 구체예에서, 고유의 MSCs는 이식 부위에서 이식된 구조물의 재생을 실행하고 및/또는 강화시킨다.
일 구체예에서, 침착된 세포 집단은 여기에서 설명된 복막 조직으로부터 유래된 평활근 세포 (SMC) 집단이다. 복막 조직은 망일 수 있다. 또 다른 구체예에서, SMC 집단은 평활근 세포 마커, 예를 들면, 미오카르딘, 알파-평활근 액틴, 칼포닌, 미오신 중쇄, BAALC, 데스민, 근섬유아세포 항원, SM22, 비멘틴(vimentin) 그리고 이들의 임의의 조합에 대해 양성인 수축성 기능을 가진 적어도 하나의 세포를 포함한다. 다른 구체예들에서, SMC 집단은 미오카르딘 (MYOCD) 발현을 나타내는 적어도 하나의 세포를 포함한다. MYOCD 발현은 MYCOD 폴리펩티드 또는 MYOCD 폴리펩티드를 인코드하는 핵산의 발현일 수 있다. 또 다른 구체예에서, SMC의 수축성 기능은 칼슘-의존적이다. 일 구체예에서, 재건, 수리, 확대 또는 대체 대상이 되는 박층형으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조는 방광 또는 방광의 일부분이다. 또 다른 구체예에서, 폴리머성 매트릭스에는 요상피 세포들이 없다.
모든 구체예들에서, 본 발명의 방법들은 여기에서 설명된 세포 집단이 살포된 방광 대체 골격, 방광 확대 골격, 방광 도관 골격, 또는 배뇨근 근육 등가물 골격에 기초한 이식용 구조물을 이용한다.
또 다른 구체예에서, 여기에서 설명된 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 재생, 재건, 수리, 확대 또는 대체를 위한 방법들은 다음의 단계들을 포함한다: a) 상기 치료를 요하는 내강형 장기 또는 조직 구조의 적어도 일부분에 정합하는 모양의 생체적합한 합성 또는 천연 폴리머성 매트릭스를 제공하는 단계; b) 여기에서 설명된 세포 밀도에서 상기 폴리머성 매트릭스에 제 1 세포 집단을 침착시키는 단계, 이때 상기 제 1 세포 집단은 실질적으로 근육 세포 집단이며; 및 c) 박층형으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 형성을 위하여 상기 환자의 치료 부위로 성형된 폴리머성 매트릭스 세포 구조물을 이식하는 단계. 하나의 다른 구체예에서, 생체내에서 형성된 박층형으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조는 천연 방광 조직의 순응을 나타낸다.
또 다른 일 측면에서, 본 발명은 신체역학적 자극 또는 순환에 근거하여 방광 재생을 필요로 하는 피험자로 이식한 후 새로운 방광을 재생시키는 방법들을 제공한다. 일 측면에서, 이 방법은 방광 또는 방광의 일부의 확대 또는 대체를 위하여 이식된 새로운-방광 구조물의 재생을 촉진시키는데 사용하기에 적합하다. 일 구체예에서, 새로운-방광 구조물은 새로운-방광 매트릭스 또는 골격상에 살포된 세포로부터 형성된다. 또 다른 구체예에서, 새로운-방광 골격은 방광 대체 골격, 방광 확대 골격, 방광 도관 골격, 또는 배뇨근 근육 등가물 골격이다.
일 측면에서, 본 발명의 방법은 적어도 하나의 세포 집단을 새로운 방광 골격에 살포하여 형성된 이식된 새로운 방광 구조물에 적용한다. 일 구체예에서, 세포 살포된 폴리머성 매트릭스 (또는 매트릭스들)는 방광 대체 골격, 방광 확대 골격, 방광 도관 골격, 또는 배뇨근 근육 등가물 골격이다. 일 구체예에서, 적어도 하나의 세포 집단은 실질적으로 근육 세포 집단을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 근육 세포 집단은 평활근 세포 집단일 수 있다. 살포를 위한 상이한 밀도의 세포들은 여기에서 설명된 것과 같이 적합할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 방법들은 새로운-방광을 이식한 후 상이한 시간대에 그리고 상이한 기간동안 실행된다. 일 구체예에서, 순환(cycling)은 기간에 걸쳐 매일, 매주 또는 2주에 한번씩 실행한다. 또 다른 구체예에서, 일일 순환 섭생의 기간은 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주, 약 8 주, 약 9 주, 약 10 주, 약 11 주, 약 12 주, 약 13 주, 약 14 주, 또는 14 주 이상이다.
일 구체예에서, 피험자용 일일 순환 프로토콜은 약 1시간 동안 새로운-방광을 채우는 단계, 약 1시간 동안 채워진 새로운 방광을 배출하는 단계, 그리고 새로운-방광이 일반적으로 하룻밤 동안 자유롭게 배출하도록 허용하는 단계들을 포함할 수 있다. 이 프로토콜은 피험자에서 당일 순환 섭생로 실행할 수 있다. 일간 순서는 제 1 일 이후 다수의 연속 일자에 실행할 수 있다. 일 구체예에서, 순환 프로토콜은 매일 매일 실행할 수 있는데, 충전 단계 시간은 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4시간 또는 약 4시간 이상으로 증가된다. 또 다른 구체예에서, 충전 및 배수 단계는 새로운-방광이 자유로이 배수하기 전 매일 1회 이상 반복할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이식 후 피험자에게 카테터를 꽂고, 그리고 순환 시간은 피험자의 카테터를 죄고 그리고 풀어서 조정한다.
당업계 숙련자들은 추가 순환 섭생이 여기에서 고려됨을 인지할 것이다.
순환 프로토콜의 예는 다음과 같다. 여기에서 설명된 것과 같이, 새로운-방광 매트릭스 또는 골격에 세포들을 살포하여 형성된 새로운-방광 구조물의 이식 후, 순환은 이식 후 대략 1달에 시작하여 매 2 주 (14 ± 2 일 간격) 단위로, 대략 90일까지 지속할 수 있다. 순환은 특정 유형의 평가 후 그러나 형광 투시 영상과 같은 다른 유형의 평가전, 예를 들면, 이식된 새로운-방광의 순응 측정으로 완료될 수 있다. 순환은 순응 측정이 완료된 후 멸균 염수(배양기에서 데워진)를 10-25 mL/min의 속도로 방광을 재-팽창시켜 실행할 수 있다. 순환은 적어도 5-10 회 반복할 것이다. 0-10 mmHg의 시작 압력이 얻어지며, 출발 시간과 함께 기록한다. 시간, 운반되는 등장성 용액의 체적, 그리고 확인되는 압력은 카테터 주변 누출이 관찰되는 시간(a.k.a. 누출점), 또는 운반된 체적이 막 실행된 순응 측정과 동일할 때, 어느 것이던 먼저 나타날 때 각 순환에 대해 기록할 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 피험자에서 이식된 새로운 방광의 재생을 촉진시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 이식된 새로운-방광을 유체로 채우는 단계; (b) (a) 단계의 채워진 새로운-방광을 비우는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 단계 (a)와 (b)를 반복하는 단계 (c)를 포함한다. 하나의 다른 구체예에서, 이 방법은 이식 후 첫 2주내에 시작한다. 일 구체예에서, 단계(a) 와 (b)는 일일 1회, 매주 1회 또는 2주에 1회 실행한다. 일부 다른 구체예들에서, 채움 단계 (a)는 약 1시간 동안 실행되며, 그리고 비움 단계 (b)는 약 1시간 동안 실행된다. 여전히 또 다른 구체예에서, 단계 a)와 b)는 이식 후 적어도 약 6주가 될 때까지 실행한다. 하나의 다른 구체예에서, 단계 a)와 b)는 이식 후 약 10주 이상 동안 실행하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 단계 a)와 b)는 이식 후 약 10주 이상 동안 실행한다. 다른 구체예들에서, 채움은 새로운-방광을 확장시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 재생은 순환을 겪지 않았던 피험자의 새로운 방광과 비교하였을 때 새로운 방광의 용량의 증가를 포함한다. 하나의 다른 구체예에서, 재생은 순환을 겪지 않았던 피험자의 새로운 방광과 비교하였을 때 새로운 방광의 순응 증가를 포함한다. 다른 구체예들에서, 재생은 순환을 겪지 않았던 피험자의 새로운 방광과 비교하였을 때 새로운-방광의 세포외 매트릭스 증가를 포함한다. 일 구체예에서, 세포외 매트릭스 발달의 증가는 엘라스틴 섬유의 발달을 포함한다.
또 다른 일 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 이식된 새로운-방광은 수취인의 생리적요구에 반응하도록 새로운-방광의 항상성 조절 발달을 제공하는 방법들에 관한 것이다. 일 구체예에서, 이식된 새로운-방광은 수취인에 비례하여 크기가 커진다. 또 다른 구체예에서, 피험자에서 새로운 방광의 항상성 조절 발달을 제공하는 방법들은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 생체적합한 폴리머성 골격을 제공하는 단계; (b) 상기 골격의 제 1 영역내에 제 1 세포 집단을 침착시키는 단계, 이때 상기 제 1 세포 집단은 실질적으로 근육 세포 집단이며; 및 (c) 항상성 조절 발달을 확립하기 위하여 단계 (b)의 골격을 상기 피험자로 이식하는 단계. 하나의 다른 구체예에서, 항상성 조절 발달은 장기 크기 및 구조의 복원을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항상성 조절 발달은 체중에 비례하는 새로운-방광 수용량을 포함한다. 일 구체예에서, 비례한 새로운-방광 용량은 이식 후 약 4개월에 이루어진다. 또 다른 구체예에서, 피험자에서 새로운 방광의 항상성 조절 발달을 제공하는 방법은 항상성 조절 발달의 상태 또는 이식된 새로운-방광의 진전을 모니터하는 단계를 포함한다. 모니터링은 이식된 새로운-방광의 위치 및 모양을 보여주고, 및/또는 요역동적 순응 및 용량의 측정을 보여주는 방광조영(cystogram) 과정을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 새로운 장기 또는 조직 구조의 이식 후 환자의 예후 평가를 위한 방법들을 제공한다. 일 구체예에서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 상기 피험자로부터 수득한 테스트 시료내 MCP-1 발현 수준을 탐지하는 단계; (b) 대조군 시료 (또는 대조군 기준치)와 비교하여 테스트 시료내 MCP-1 발현 수준을 결정하고; 및 (c) MCP-1 발현 수준들의 측정에 근거하여 환자의 재생성 예후를 예측하고, 이때 대조군 시료 (또는 대조군 기준치)와 비교하여 테스트 시료내 MCP-1 발현 수준이 더 높은 것은 피험자에서 재생의 조짐이 된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 새로운 장기 또는 조직 구조를 이식한 후, 환자의 예후 평가를 위한 방법들을 제공하는데, 이 방법들은 다음의 단계를 포함한다: (a) 환자의 생물학적 시료를 수득하는 단계; 및 (b) 생물학적 시료에서 MCP-1 발현을 탐지하는 단계, 이때 MCP-1 발현은 환자에서 재생의 조짐이 된다. 일부 구체예들에서, 대조군 시료 (또는 대조군 기준치)와 비교하여 환자의 생물학적 시료에서 MCP-1의 발현 증가는 환자에서 재생의 조짐이 된다. 일부 구체예들에서, 대조군 시료 (또는 대조군 기준치)와 비교하여 환자의 생물학적 시료에서 MCP-1의 발현 감소는 환자에서 재생의 조짐이 아니다. 이 환자 시료는 혈액 또는 소변과 같은 체액을 포함하는 테스트 시료일 수 있다.
일부 구체예들에서, 측정 단계는 (i) 테스트 시료와 대조군에서 MCP-1 발현의 차등 수준을 측정하고; 및/또는 (ii) 테스트 시료와 대조군에서 MCP-1 발현의 차등 수준을 측정함으로써 수득한 데이터를 분석하기 위한 목적에 적합한 프로세서에 의해 실행되는 소프트웨어 프로그램의 사용을 포함한다. 적합한 소프트웨어와 프로세서는 당업계에 공지되어 있으며, 시판되는 것을 이용한다. 이 프로그램은 프로세서에 연결된 CD-ROM, 플로피 디스크, 하드 드라이브, DVD, 또는 메모리와 같은 유형의 매체에 저장된 소프트웨어에서 구체화될 수 있지만, 당업계 숙련자는 전체 프로그램 또는 이의 일부분은 프로세서이외의 장치에 의해 대안적으로 실행되며, 및/또는 잘 공지된 방식으로 펌웨어에서 및/또는 전용 하드웨어에서 구체화될 수 있다.
측정 단계에 이어서, 측정 결과, 발견, 진단, 예견 및/또는 치료 권고는 일반적으로 기록되며, 전문가, 의사 및/또는 환자에게 전달된다. 예를 들면, 특정 구체예들에서, 컴퓨터는 환자 및/또는 주치의와 같은 관련자들에게 이러한 정보를 알리는데 이용될 것이다. 일부 구체예들에서, 분석을 실행할 것이거나 또는 분석 결과는 이 결과 또는 진단이 통지되는 지역 또는 관할구역과는 상이한 지역 또는 관할구역에서 분석될 것이다.
바람직한 구체예에서, MCP-1 발현의 차등 수준을 보유하는 테스트 피험자에서 측정된 MCP-1 발현 수준에 근거한 예후, 예견 및/또는 치료 권고는 분석이 완료되고, 예후 및/또는 예견이 있은 후 가능한 빨리 해당 피험자에게 통지한다. 결과 및/또는 관련 정보는 피험자의 치료 의사에 의해 피험자에게 통지될 수 있다. 대안으로, 그 결과들은 편지, 전자형태의 통신 수단 예를 들면, 이메일 또는 전화를 포함하는 임의의 통신 수단에 의해 테스트 피험자에게 바로 알려질 수 있다. 이메일 통신과 같은 경우, 컴퓨터의 이용에 의해 통신이 실행될 수 있다. 특정 구체예들에서, 예후 테스트의 결과들 및/또는 이로부터 유추된 결론 및/또는 테스트에 근거한 치료 권고를 포함하는 통신이 만들어지고 그리고 전기통신분야의 업자들에게 친숙한 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어의 조합을 이용하여 피험자에게 자동으로 전달될 것이다. 건강관리를 지향한 통신 시스템의 한 가지 예가 미국 특허 제6,283,761호에서 설명되고 있지만; 본 발명은 이러한 특정 통신 시스템을 이용하는 방법들에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법들의 특정 구체예들에서, 시료들의 분석, 재생의 예후 및/또는 예견, 그리고 분석 결과 또는 예측의 통신을 포함하는 모든 단계들 또는 일부 단계들은 다양한 관할 구역 (예를 들면, 외국)에서 실시될 수 있다.
또 다른 측면에서, 여기에서 설명된 예후 방법들은 이식의 성공, 그리고 재생을 위한 재건/치료 프로토콜에 관련하여 관련자에게 정보를 제공한다. 일 구체예에서, 이 방법들은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 상기 피험자로부터 수득한 테스트 시료에서 MCP-1 발현 수준을 탐지하는 단계; (b) 대조군 시료 (또는 대조군 기준치)의 MCP-1 발현 수준에 대해 테스트 시료내 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) MCP-1 발현 수준들의 측정에 근거하여 환자의 재생성 예후를 예측하는 단계, 이때 테스트 시료내 MCP-1의 발현 수준이 대조군 시료 (또는 대조군 기준치)의 것과 비교하여 더 높다는 것은 새로운 장기 또는 조직 구조의 재생 상태를 나타낸다.
일반적으로, 여기에서 사용된 것과 같이, 재생 예후는 다음중 임의의 하나 이상의 예상 또는 예견을 포함한다: 여기에서 설명된 구조물의 이식을 통하여 방광 대체 또는 확대후 기능성 방광의 발달 또는 개선, 여기에서 설명된 구조물의 이식후 기능성 비뇨기 전환의 발달, 여기에서 설명된 구조물의 이식후 방광 용량의 발달 또는 개선된 방광 용량, 또는 여기에서 설명된 구조물의 이식후 방광 순응의 발달 또는 개선된 방광 순응.
모든 구체예들에서, 여기에서 설명된 것과 같은 이러한 치료를 요하는 피험자에게 박층형으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조를 제공하는 방법들은 상기에서 설명된 것과 같이 이식후 재생의 예후 평가 단계를 포함할 수 있다.
모든 구체예들에서, 본 발명은 필요로 하는 피험자에게 새로운 장기 또는 조직 구조를 제공하는 방법들에 관련되며, 이 방법은 특정 이식후 모니터링 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 초음파 영상, 신우상(pyelogram) 뿐만 아니라 이식 후 상이한 시간대에 소변 및 혈액 분석을 통하여 이식된 구조물들의 효과 및 성능을 모니터한다.
7. 키트
본 발명은 본 발명의 폴리머성 매트릭스과 골격 그리고 관련 재료들, 및/또는 세포 배양물 배지 그리고 사용 설명서가 포함된 키트를 추가로 포함한다. 사용 설명서는 예를 들면, 세포들의 배양을 위한 설명서 또는 세포들 및/또는 세포 산물들의 투여를 위한 설명서를 포함할 수 있다. 사용 설명서는 본 발명의 복강경 이식을 위한 폴리머성 매트릭스와 골격을 미리-처리하고, 폴딩하거나 또는 준비하기 위한 설명서를 또한 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 여기에서 설명된 골격과 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 키트의 골격은 다음중 하나이다: 방광 확대 골격, 방광 대체 골격, 비뇨기 도관 골격, 또는 근육 등가물 골격.
8. 보고서
상업적 목적으로 실행되었을 때, 본 발명의 방법들은 일반적으로 재생성 예후의 보고 또는 요약을 제출한다. 본 발명의 방법들은 여기에서 설명된 구조물을 제공하기 위하여 임의의 외과적 과정 전과 후 재생의 가능한 과정 또는 결과의 예견을 포함하는 보고서를 제출할 것이다. 보고서는 예후에 관련된 어느 지표에 대한 정보를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법들과 보고서는 데이터베이스에 보고서를 저장하는 것을 추가로 포함한다. 대안으로, 이 방법은 피험자의 데이터베이스에 기록을 더 만들고, 이 기록은 데이터와 함께 상주시킬 것이다. 일 구체예에서 보고서는 종이 보고서이며, 또 다른 구체예에서 보고서는 청각 보고서이며, 또 다른 구체예에서 보고서는 전자 보고서이다. 이 보고서는 의사 및/또는 환자에게 제공되는 것이 고려된다. 이 보고서의 수령은 데이터와 보고서를 가지고 있는 서버에 네트워크를 연결시키고, 서버 컴퓨터로부터 데이터와 보고서를 요청하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 방법들은 전부 또는 부분적으로 또한 자동화될 수 있다.
다음의 실시예들은 설명을 위한 목적으로 제공된 것이며, 어떠한 방식으로던 본 발명의 범위를 한정시키기 위한 의도는 없다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허, 특허 출원들 및 문헌 자료는 이들의 전문이 참고자료로 통합된다.
실시예
실시예 1 - SMC 의 원천으로서 망
갯과 동물과 돼지 망으로부터 평활근 세포들을 성공적으로 단리하였다. 우선 첫째로, 갯과 동물 또는 돼지 망 조직으로부터 조직의 표면 오염물질을 제거하기 위하여 이 조직을 완충 염용액에 세척함으로써 망으로부터 유래된 평활근 세포들을 단리하였다. 도 14의 설계도에 의해 설명되는 것과 같이, 그 다음 망은 일련의 효소 절단 처리와 원심분리 단계를 거쳐 추가 배양 및 특징화를 위한 망으로부터 단리된 세포들을 얻는다. 간략하게 설명하자면, 세척된 망 조직은 1시간 동안 37℃에서 0.1% 콜라게나제 I (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ) 및 1% BSA (Sigma, St. Louis, MO)의 DMEM-HG 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 절단하였다. 조직 절단을 지원하기 위하여, 이 용액은 플렛포옴 쉐이커상에 놓인 50ml 원뿔 튜브에서 속도 50, 경사 15로 37℃에서 1시간 동안 교반되었다. 절단 후, 용액은 5분간 300×g에서 원심분리하고, 망으로부터 유래된 세포들을 담고 있는 생성된 펠렛화된 세포는 인산염 완충액 염수 (PBS), PBS1%에 재현탁과 지방 플러그 및 기타 비-필수 조직 찌꺼지를 제거하기 위하여 5분간 300×g에서 펠렛에 원심분리가 관련된 일련의 단계들에 의해 세척된다. 세척 후, 이 세포들은 DMEM + 10% FBS를 함유하는 배양 배지에 재현탁하고, 그리고 T-플라스크 상에 도말하였다. ex vivo 확장을 목적으로 사이토킨 및 성장 인자들이 보충된 시판되는 이용가능한 배지에서 배양을 실시하였다. 후속 세포 계대를 통하여 적절한 세포 수에 도달되었을 때, 세포 형태를 관찰하였고, 한 방울을 고정시키고, 발현된 평활근 세포 단백질의 면역탐지를 위하여 처리하였다. 비교 분석을 위하여, Atala et al ., (J. Urol . 150: 608, 1993); Cilento et al ., (J. Urol . 152: 655, 1994); 및 Atala의 미국 특허 제6,576,019호 (이의 전문이 참고자료에 통합됨)에서 설명하고 있는 프로토콜을 이용하여 조직 외식편 배양을 통하여 방광 평활근 층으로부터 세포들을 또한 단리하였다. 당업계 숙련자들은 기타 적합한 세포 단리 방법들을 인지할 것이다.
실시예 2 - SMC 특징화
형태 . 도 15는 갯과 동물- 및 돼지로부터 유래된 방광 세포들과 비교하여 갯과 동물- 및 돼지로부터 유래된 망 세포들의 세포 형태를 보여준다. 갯과 동물 및 돼지 방광 평활근 그리고 망으로부터 유래된 세포들의 세포 형태는 DMEM + 10% FBS에서 성장하였을 때 동일한 형태는 아니지만 유사한 것으로 보인다. 세포들은 소용돌이(whirling)와 구릉과 골(hill-and-valley) 형성의 증거와 함께 스핀들 모양의 그리고 가늘고 긴 형태다. 따라서, 망으로부터 유래된 세포는 이들의 형태가 평활근 세포와 유사한 것으로 보인다.
세포 표면 마커들의 형광 활성화된 세포 분류( FACS ) 분석 . 도 16a-d는 FACS 분석에 의해 세포 표현형의 특징을 설명하는데, 갯과 동물로부터 유래된 망 세포들은 평활근 세포 마커들 α-액틴 및 칼포닌에 양성임을 나타낸다. 간략하게 설명하자면, 데이터 포인트당 0.5×10⁶ - 1×10⁶ 개 세포를 2% 파라포름알데히드에 고정시키고, 비-특이적 결합을 방지하기 위하여 Fc 수용체들을 차단시켰다. 그 다음 세포들은 제조업자의 권장에 따라 평활근 세포 α-액틴 (SMA) 및 칼포닌에 대한 항체와 함께 항온처리하였다. 이소타입 대조군 항체 (IgG1 또는 IgG2a)를 음성 대조군으로 이용하였다. 최종 세척(PBS, 0.1% Triton X-100)에 이어서, 항원 탐지는 BD FACS Aria 1 또는 적절한 형광 채널을 이용하는 Guava EasyCyte Mini Express Assay System을 이용하여 실시하였다. 각 시료로부터 최소 5,000-10,000 결과들을 얻었다. 방광 평활근 세포들 (도 16 a 및 b)과 유사하게, 망으로부터 단리된 세포들의 98% 이상 (도 16 c 및 d)은 평활근 세포 마커들 α-액틴 및 칼포닌을 발현한다. 따라서, 특징적인 세포 표면 마커들에 대해 망으로부터 유래된 세포들은 방광으로부터 단리된 평활근 세포들과 동일한 표현형을 보유한다.
도 17 및 18은 평활근 세포 마커들, 뿐만 아니라 상피 및 내피의 항원성 마커들을 모두 검사함으로써 두 가지 상이한 동물로부터 갯과 동물 망 유래된 세포들의 FACS 항원성 발현을 더 나타낸다. 1 ㎍/ml의 1 차 및 2 차 항체로 망으로부터 유래된 세포에 착색을 실행하였다. 아래 표 2.1에 요약된 바와 같이, 갯과 동물 망 유래된 세포들은 평활근 세포 마커들에 대해 양성이며, 그리고 상피 및 내피의 세포 마커들에 대해 음성이다.
[표 2.1]

면역형광 분석 . 도 19-21은 다양한 평활근 세포 마커들의 면역형광 분석에 의한 망 및 방광으로부터 유래된 평활근 세포의 평혈근 세포 유사 표현형과, 그리고 내피 및 상피 세포 마커들과의 비교를 더 설명한다. 간략하게 설명하자면, 세포들을 2% 파라포름알데히드 (Sigma)에 고정시켰고, 그리고 10% 말 혈청 (Gibco)/0.2% Triton X-100 (Sigma)/ D-PBS (Gibco)으로 차단시켰다. 1차 항체들을 추가하였고, 플레이트는 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 2% 말 혈청/0.2% Triton X-100/D-PBS로 세포들을 3회 세척하고, 그 다음 2 차 항체: 염소 항-마우스 IgG1 및 염소 항-마우스 IgG2a의 1:500 희석액으로 실온에서 1-3 시간 동안 항온처리하였다. 핵은 Hoechst 33342으로 대비착색하였다. 마우스 IgG1 (Invitrogen) 및 마우스 IgG2a (Invitrogen) 이소타입 대조군들은 음성 대조군들으로 사용하였다 (나타내지 않음). Simple PCI 소프트웨어로 운용되는 Leica DMI4000B epi-형광현미경으로 영상을 캡쳐하였다.
도 19는 갯과 동물 망 및 방광으로부터 유래된 세포들에서 칼포닌, 평활근 (SM) α-액틴, 그리고 트란스게린 (SM22) 발현의 면역 착색을 나타낸다. 망 유래된 세포들은 방광 평활근 세포들에 의해 발현된 것과 필적하는 수준으로 이들 3가지 평활근 특이적 단백질을 발현시킨다는 것을 그린 형광 발광으로 확인한다.
도 20a 및 20b은 갯과 동물 망으로부터 유래된 세포들의 면역형광 분석을 나타내는데 이들 세포들은 평활근 세포 마커들 (평활근 액틴, 비멘틴(vimentin), 미오카르딘, 그리고 baalc (뇌와 급성백혈병 세포질 단백질))에 대해 양성이며, 그리고 상피 및 내피의 세포 마커들 (UEA-1 및 EpCam)에 대해 음성임을 보여준다. 각 패널의 좌측은 영상 필드의 세포 함량을 증명하는 대조군 영상이다. 각 패널의 그린 형광을 나타내는 우측 영상으로 망으로부터 유래된 세포들이 평활근-특이적 단백질을 발현시킨다는 것을 확인한다.
도 21은 면역착색 분석을 나타내는데, 돼지 망으로부터 유래된 세포들은 면역형광에 의해 평활근 세포 마커들에 대해 또한 양성이며, 그리고 방광으로부터 유래된 세포들과 유사하다는 것을 보여준다. 이러한 추가 면역형광 데이터는 돼지 망 및 돼지 방광으로부터 유래된 SMC에서 평활근 액틴, baalc, 미오카르딘, 그리고 미오신 중쇄의 발현을 보여준다.
항원성 마커 발현에 의한 세포 표현형 분석은 하기 표 2.2에 요약하며 갯과 동물과 돼지 망으로부터 유래된 세포들과 인간 방광 평활근 세포들을 비교한다. 이와함께, 이들 데이터들은 갯과 동물 망으로부터 유래된 세포들 (3마리 상이한 개로부터 추출하고, 계대 2와 3에서 3가지 상이한 배지 유형에서 배양된)과 돼지 망으로부터 유래된 세포들 (PODS, 최종 계대 5에서 2가지 상이한 배지 유형에서 배양된)은 6가지 상이한 평활근 마커들에 대해 양성이며, 그리고 상피 및 근섬유아세포 세포 마커들에 대해 음성이다. 이들 동일한 마커들은 대조군으로 유래된 인간 방광 평활근 세포들 (Hu1022 SMC, 계대 5)에서 발현된다. 더욱이, 망은 SMC의 대체 원천이 될 수 있다는 견해를 뒷받침한다. 따라서, 이들 면역조직화학적 데이터는 평활근 세포들이 망 조직으로부터 단리된다는 발견을 추가로 뒷받침한다.
[표 2.2]

폴리머라제 연쇄 반응 ( PCR )-기반의 유전자 발현 분석. 내피의 그리고 평활근 세포 유전자 발현 분석은 PCR에 의해 평가하였다. 제조업자의 지시에 따라 시료 RNA는 RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen)로 단리하였다. SuperScript VILO cDNA 합성 키트(Invitrogen)를 이용하여 제조업자의 사용법에 따라 2㎍ RNA로부터 cDNA를 만들었다. cDNA 합성 후, 각 시료는 증류수로 1:10으로 희석시켰다. 표 2.2에서 언급된 TaqMan primers와 프로브(Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 그리고 10㎕ 마스터 믹스(2X), 1㎕ 프라이머/프로브, 그리고 9㎕ cDNA (1:10로 희석된)을 포함하는 반응 혼합물을 이용하여 정량적인 역-전사 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)을 실시한다. 디폴트 순환 매개변수들을 이용하여 ABI 7300 실시간 열 순환기에서 반응을 실행하였다. 비교 Ct에 의한 상대 수량(RQ) 방법을 이용하여 PCR 데이터를 분석하였다. 상대 수량(Relative Quantity)은 내생 기준에 대해 표준화된 그리고 구경 측정기에 대해 표적의 양을 말하며, 다음의 식에 의해 제공된다: 2^-ΔΔ ^CT 는 ΔΔCT = ΔCT_Test- ΔCT_{구경 측정기}이다. 내생 기준(내부 대조군)은 18S rRNA이다. 인간 대동맥 내피의 세포들 (인간 AEC)을 이들 유전자의 발현에 대해 양성 대조군으로 이용되었다. 표 2.3은 PCR 실험에서 발현을 위해 테스트된 유전자들을 열거한다.
[표 2.3]

도 22는 갯과 동물 망으로부터 유래된 세포들, 갯과 동물 방광으로부터 유래된 평활근 세포들, 그리고 대조군으로 인간 방광 세포들 사이에 평활근 세포 마커들 액틴 (계대 1에서 세포들), SM22, 미오신 중쇄 및 칼포닌의 유전자 발현 수준들을 설명한다. 인간 방광 대조군과 비교하였을 때, 망 및 방광으로부터 유래된 평활근 세포들에서 평활근 세포 유전자들의 발현은 상승되었다.
도 23은 갯과 동물 망으로부터 유래된 세포들, 갯과 동물 방광으로부터 유래된 평활근 세포들, 그리고 대조군으로 인간 방광 세포들 사이에서 내피의 세포 마커들 CDH5, FLT1, KDR, PECAM, TEK, 및 vWF의 유전자 발현 수준들을 나타낸다. FLT1를 제외하고 그리고 KDR은 훨씬 낮은 수준이며, 나머지 내피의 유전자들은 방광 평활근 세포들 또는 망 유래된 세포들에 의해 발현되지 않았다. 존재하는 망 평활근 세포들과 방광 평활근 세포들은 내피의 세포 마커들의 동일한 제한된 발현을 보여준다.
도 24는 돼지로부터 유래된 세포들의 평활근 세포 마커들 (MYOCD, SMA, SM22, SM-MHC, CNN, B-액틴)의 유전자 발현 수준들을 보여준다. 겔 전기영동에 의해 정량적으로 분석된 qRT-PCR 결과에서 돼지 망으로부터 유래된 평활근 세포 유전자 발현은 돼지 방광으로부터 유래된 평활근 세포들의 것과 유사하다.
겔 수축 기능 분석 . 당 분야에 흔히 이용되는 평활근 세포들의 기능 분석은 콜라겐 겔에 묻었을 때 수축하는 능력이다. 갯과 동물 방광 또는 갯과 동물 망으로부터 얻은 평활근 세포들을 2 내지 3mg/mL 쥐 꼬리 콜라겐 I (BD Biosciences, San Jose, CA., USA)을 함유하는 용액에 500,000개 세포/mL 농도로 현탁시켰다. 1.8mg/mL NaHCO₃ (Sigma, St Louis, MO, USA) 및 2.3mg/mL L-글루타민(Invitrogen)이 보충된 농축 MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA., USA)은 희석액으로 이용하였으며, 콜라겐 폴리머화를 위하여 3.7mg/mL HEPES (Invitrogen)으로 pH를 조정하였다. 음성 대조군 하이드로겔에 5uM EDTA (Invitrogen)을 보충하여 Ca² ⁺-의존적 세포 수축을 억제하였다. 각 복제를 위하여, 250 ㎕의 세포 현탁액은 48개-웰 플레이트의 단일 웰에 분배하였다. 일단 폴리머화된 후, 완전한 수축을 방지할 수 있는 마찰 또는 흡착을 감소시키기 위하여 웰 플레이트로부터 콜라겐 겔을 서서히 벗겨내었다. 무-혈청 DMEM (250uL)를 웰 플레이트내 각 웰의 상부에 추가하고, 37℃에서, 가습화된, 5% CO₂ 함유 대기에서 항온처리하였다. Molecular Imager ChemiDoc XRS System (BIO-RAD, Hercules, CA, USA)을 이용하여 0 hr, 24 hr, 및 48 hr 시간대에서 모든 겔을 영상화하였다. ImageJ 소프트웨어 버젼 1.40g으로 상을 측정하였고, 픽셀 유닛으로 나타내었다. 웰 플레이트 콜라겐 겔 직경은 정확성을 개선시키기 위하여 표면적으로부터 계산하였다. 겔 직경의 감소는 겔이 수축되었음을 나타낸다.
도 25에서는 망 및 방광 유래된 평활근 세포들이 평활근 세포들의 특징적인 기능인 수축하는 능력을 보유한다는 것을 보여주고 있다.
실시예 3 - 비뇨기의 새로운-도관 골격에 살포된 망으로부터 유래된 평활근 세포들
여기에서 설명된 것과 같이 비뇨기의 새로운-도관은 튜브(도관) 형 모양의 생분해가능한 골격과 이 골격에 살포된 평활근 세포로 구성된다. 본 연구를 위하여, 망 조직으로부터 유래된 평활근 세포는 비뇨기 새로운-도관에 대하여 동일한 과정으로 준비된 골격 재료에 살포되었다. 다음을 포함하는 평활근 세포 특징들에 대해 이 골격 내부 세포들을 평가하였다: 항원성 발현에 의한 세포 표현형; 단백질 발현; 세포외 매트릭스 (ECM) 생산; 및 대사 활성 프로파일.
면역조직화학 착색 . 도 26은 골격 재료에 살포된 후 방광 및 망 유래된 평활근 세포들의 면역조직화학 착색을 보여준다. 세포 살포된 골격은 상기에서 설명된 것과 같이, 평활근 α-액틴에 대한 항체로 고정되고 착색된다. 이 골격 내부의 망 유래된 평활근 세포 표현형의 면역 착색은 평활근 α-액틴의 발현을 보여주었다. 따라서, 망으로부터 유래된 세포들은 이 골격 내부에 평활근 세포 표현형을 보유하고, 그리고 골격 상에 살포되었을 때 방광으로부터 유래된 평활근 세포들과 동일하게 거동하는 것으로 보인다.
MCP1 단백질 분비 . MCP-1은 방광 평활근 세포들의 정상적인 산물이며 그리고 효능, 정체성 및 기능에 대한 마커로 이용할 수 있다. 갯과 동물 MCP-1에 특이적인 R&D 시스템의 ELISA 기반 분석 시스템을 이용하였다. 시료들을 이중으로 분석하였고, 표준 곡선과 비교하여 구조물 배지내 MCP-1의 예상 수준을 제공하였다. 도 27에서 설명된 것과 같이, 이 골격에 살포된 망으로부터 유래된 평활근 세포들은 MCP1 단백질을 생산한다.
ECM 생산 . ECM 단백질을 생산하는 망으로부터 유래된 세포들의 능력을 평가하기 위하여, 골격 재료에 살포후 방광- 및 망으로부터 유래된 평활근 세포들의 면역조직화학적 착색을 실행하였다. 세포 살포된 골격은 상기에서 설명된 것과 같이, 피브로넥틴에 대한 항체로 고정시키고, 착색시켰다. 도 28에서 설명된 것과 같이, 망으로부터 유래된 평활근 세포들은 세포외 매트릭스 재료 피브로넥틴을 합성하고, 이는 세포 흡착, 이동, 성장 및 분화용 이식물이다. 더욱이, 망 평활근 세포들은 다시 골격에 살포될 때 방광 평활근 세포들과 유사한 거동을 한다.
대사 프로파일링 . 갯과 동물 방광으로부터 유래된 평활근 세포들과 망으로부터 유래된 세포들에 대한 대사 프로파일은 이 골격에 살포시에 더 분석하였다. 6일간의 시간에 걸쳐 배지 시료들을 취하였다. 자동화된 시스템 (Biolyzer)을 이용하여 시료들을 분석하였다. 간략하게 설명하자면, 배지를 시료 쳄버에 추가하고, 기계로 주사하여 다양한 대사물질들의 수준들을 측정하였다. 도 29에 나타낸 것과 같이, 갯과 동물 방광 평활근 세포들과 망 유래된 세포들에 대한 대사 프로파일은 Gln, Glu, Gluc, Lac 및 NH⁴⁺의 수준에 대해 유사하다. 따라서 망으로부터 유래된 세포들은 골격에 살포되는 동안 대사적으로 활성이 있다는 것을 설명한다.
이들 연구는 평활근 세포들이 망 조직으로부터 효과적으로 단리될 수 있음을 보여준다. 망으로부터 유래된 세포들은 방광으로부터 단리된 평활근 세포들과 동일한 특징들을 보유한다. 망으로부터 유래된 세포들은 분리 및 확장에서 평활근 세포 형태를 분명하게 나타내었다. 항원성 마커들에 의한 표현형 분석은 방광 평활근 세포들에서 발견된 것과 동일하였다. 망 및 방광으로부터 유래된 세포들에 대한 유전자 발현도 유사하였다. 내피의 세포 마커들의 발현은 방광 평활근 세포들에서 탐지된 것과 동일하였다. 또한, 지방 마커들은 세포 배양물 (데이터는 나타내지 않음)에서 탐지되지 않았는데, 방광 평활근 세포들과 동일하다. 끝으로, 망으로부터 유래된 세포들은 방광으로부터 유래된 세포들과 유사하게 수축성 표현형을 또한 나타내었다. 따라서, 이러한 관찰들에 근거하여, 우리는 평활근 세포들을 갯과 동물 및 돼지 망으로부터 성공적으로 단리하였다는 것을 알았다.
다음의 특징들에 의해 나타난 것과 같이, 망으로부터 유래된 평활근 세포들은 비뇨기 새로운-도관 골격에 살포되었을 때, 방광 조직으로부터 단리된 평활근 세포들과 동일하게 거동한다는 것을 우리는 또한 설명한다: 항원성 마커 발현 (평활근 α-액틴); 단백질 발현 (MCP-1); ECM 생산 (피브로넥틴); 대사 (포도당 흡수, 젖산염 생산 등).
도 30은 이식 후, 또 다른 유형의 대체 원천의 평활근 세포들 (지방으로부터 유래된 평활근 세포들)이 살포된 비뇨기 새로운-도관의 특징들을 나타낸다. 면역 반응 없이 3개월 시점에서 고유의 것과 유사한 재생을 관찰할 수 있을 것이다(A). 게다가, 수뇨관과 피부 접합점의 점막 라이닝은 소변의 수밀성 흐름을 허용한다(B). 비정상적인 세포 성장 또는 조직 발달, 소변 흡수, 점액 분비, 또는 면역 거부에 대한 증거는 없었다.
이러한 발견들은 비뇨기 새로운-도관의 생산을 위한 평활근 세포들의 대체 원천으로 망이 이용될 수 있음을 암시한다.

Claims

a) 치료를 요하는 피험자의 고유의 내강형 장기 또는 조직 구조의 적어도 일부분에 정합하도록 성형되는 제 1 표면을 보유한 매트릭스; 및
b) 상기 매트릭스의 제 1 표면 상에 또는 그 내에 침착된 복막 유래된 세포 집단을 포함하며,
상기 매트릭스와 상기 세포 집단은 이식가능한 구조물을 형성하는 이식가능한 구조물.
a) 치료를 요하는 피험자의 고유의 관(vessel)으로부터 유체의 관통을 허용하도록 성형되는, 제 1 표면을 보유한 관형 매트릭스; 및
b) 상기 매트릭스의 제 1 표면에 침착된 복막 유래된 세포 집단을 포함하며,
상기 매트릭스와 상기 세포 집단은 이식가능한 구조물을 형성하는 이식가능한 구조물.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 세포 집단은 평활근 세포 (SMC) 집단인, 이식가능한 구조물.
청구항 2에 있어서, 상기 관형 매트릭스는 제 1 단부를 포함하는, 이식가능한 구조물.
청구항 4에 있어서, 상기 제 1 단부는 피험자의 복벽에 접촉하도록 구성된, 이식가능한 구조물.
청구항 5에 있어서, 상기 제 1 단부는 피험자의 복벽에 있는 개구부에 문합되도록 구성된, 이식가능한 구조물.
청구항 5 또는 6에 있어서, 상기 제 1 단부는 피험자의 피부로 외면화되도록 구성된, 이식가능한 구조물.
청구항 4 내지 6중 어느 한 항에 있어서, 상기 관형 매트릭스는 상기 고유의 관에의 연결을 위한 제 1 측면 개구부를 추가로 포함하는, 이식가능한 구조물.
청구항 8에 있어서, 상기 고유의 관은 제 1 수뇨관인, 이식가능한 구조물.
청구항 9에 있어서, 상기 관형 매트릭스는 제 2 수뇨관에의 연결을 위한 제 2 단부를 추가로 포함하는, 이식가능한 구조물.
청구항 9에 있어서, 상기 관형 매트릭스는 제 2 수뇨관에의 연결을 위한 제 2 측면 개구부를 추가로 포함하는, 이식가능한 구조물.
청구항 9에 있어서, 이식 시에 제 1 수뇨관으로부터 관형 매트릭스 내부로 소변의 관통을 허용하는, 이식가능한 구조물.
청구항 10 또는 11에 있어서, 이식 시에 제 2 수뇨관으로부터 관형 매트릭스 내부로 소변의 관통을 허용하는, 이식가능한 구조물.
청구항 12에 있어서, 이식 시에 피험자 밖으로 소변의 배출을 허용하는, 이식가능한 구조물.
청구항 13에 있어서, 이식 시에 피험자 밖으로 소변의 배출을 허용하는, 이식가능한 구조물.
청구항 7에 있어서, 상기 관형 매트릭스의 제 1 단부는 이식 시에 피험자의 외부에 기공을 형성하는, 이식가능한 구조물.
청구항 16에 있어서, 상기 제 1 단부는 피험자의 복벽을 통하여 뻗어나온 기공 단부를 포함하는, 이식가능한 구조물.
청구항 17에 있어서, 상기 기공 단부는 피험자의 피부에 연결된, 이식가능한 구조물.
청구항 17 또는 18에 있어서, 이식 시에 기공 단부에서 상피화된 점막이 형성되는, 이식가능한 구조물.
청구항 19에 있어서, 상기 상피화된 점막은 기공 단부에서 점막피부 영역을 포함하는, 이식가능한 구조물.
청구항 20에 있어서, 상기 상피화된 점막은 점막피부 영역에 인접한 전정 영역(vestibular region)을 포함하는, 이식가능한 구조물.
청구항 21에 있어서, 상기 상피화된 점막은 우선 전정 영역에 나타나고, 점막 피부 영역을 통하여 기공 단부를 향하여 점진적으로 증가되는 상피를 특징으로 하는, 이식가능한 구조물.
청구항 22에 있어서, 상기 상피는 상피 세포 마커의 발현을 특징으로 하는, 이식가능한 구조물.
청구항 19에 있어서, 상기 상피화된 점막은 자연 발생 점막피부 영역과 동등한, 이식가능한 구조물.
청구항 1 내지 24중 어느 한 항에 있어서, 상기 요상피 세포들 또는 다른 세포 집단이 없는, 이식가능한 구조물.
박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 재구성, 확대, 또는 대체를 요하는 피험자에서 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 재구성, 확대, 또는 대체 방법으로서,
상기 방법은 상기 박층형으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 형성을 위하여 상기 피험자의 상기 치료 부위로 청구항 1에 따른 구조물을 이식하는 것을 포함하는 방법.
박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 재구성, 확대, 또는 대체를 요하는 피험자에게서 박층으로 구조화된 내강형 장기 또는 조직 구조의 재구성, 확대, 또는 대체를 위한 이식가능한 구조물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은,
a) 제 1 표면을 보유한 매트릭스를 제공하는 단계로서, 상기 매트릭스는 상기 피험자의 고유의 내강형 장기 또는 조직 구조의 적어도 일부분에 정합하도록 성형되는 단계; 및
b) 상기 이식가능한 구조물을 만들기 위하여 상기 매트릭스의 제 1 표면에 복막 유래된 세포 집단을 침착하는 단계
를 포함하는 방법.
청구항 27에 있어서, 상기 형성된 이식가능한 구조물은 청구항 1의 구조물인 방법.
불량성 방광 치료를 요하는 피험자의 이러한 방광을 위한 이식가능한 구조물을 제공하는 방법으로서, 청구항 2에 따른 구조물을 이 피험자에게 이식하는 것을 포함하는 방법.
불량성 방광 치료를 요하는 피험자의 이러한 방광을 위한 이식가능한 구조물을 제공하는 방법으로서,
상기 방법은,
a) 제 1 표면을 보유한 관형 매트릭스를 제공하는 단계로서, 상기 매트릭스는 상기 피험자에서 고유 관으로부터 유체의 관통을 허용하도록 성형되는 단계; 및
b) 상기 이식가능한 구조물을 형성하기 위하여 상기 매트릭스의 제 1 표면에 복막 유래된 세포 집단을 침착하는 단계
를 포함하는 방법.
청구항 30에 있어서, 상기 형성된 이식가능한 구조물은 청구항 2에 따른 구조물인, 방법.