KR20120120253A

KR20120120253A - Ｃｄ３４－ 음성 줄기세포를 위한 증식 배지

Info

Publication number: KR20120120253A
Application number: KR1020127019427A
Authority: KR
Inventors: 엘레나 아세바; 크리스틴 군터
Original assignee: 아프세스 게엠베하 & 씨오. 카게
Priority date: 2009-12-23
Filing date: 2010-12-23
Publication date: 2012-11-01
Also published as: ES2657840T3; BR112012015578A2; AU2010335551A1; US20140087459A1; AU2010335551B2; EP2516627B1; US20110183414A1; IL220519A0; CA2784820A1; US8557578B2; WO2011076414A1; CN102686725B; CN102686725A; EP2516627A1

Abstract

본 발명은 (a) 상기 세포 성장 배지 중 전체 부피의 2% 부터 15%까지를 구성하는, 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate); (b) 상기 세포 성장 배지 중 전체 부피의 1% 부터 10%까지를 구성하는, 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 신선동결혈장(human fresh frozen plasma, FFP) 여과액; (c) 상기 세포 성장 배지 중 0 U/ml 부터 10 U/ml까지의 농도의 헤파린; (d) 0.5 mM 부터 10 mM 까지의 농도의 L-글루타민; 및 (e) 상기 세포 성장 배지의 전체 부피 중 75% 부터 97%까지를 구성하고 (d) 부분의 L-글루타민을 함유할 수 있는, 포유류 세포 성장에 적합한 무혈청, 저글루코스 배지를 포함하고, 인간 CD34^-줄기 세포의 증식을 제한하고, 상기 결과 증식된 CD34^-줄기 세포는 분화 능력을 유지하는 것인 세포 성장 배지를 제공한다. 또한, 본 발명은 살균된 인간 혈소판 용해물 및 인간 신선동결혈장 여과액, 키트, CD34^- 줄기세포를 함유하는 조성물 및 관련 생산물 및 세포 증식 방법을 제공한다.

Description

ＣＤ３４－ 음성 줄기세포를 위한 증식 배지{EXPANSION MEDIUM FOR CD ３４－ NEGATIVE STEM CELLS}

본 발명은 2009년 12월 23일에 출원된 미국 가출원 제 61/289,796호에 대한 우선권을 주장하며, 전체 개시 사항은 본 명세서에 참조로써 통합된다.

본 발명에서, 다양한 공개(publications)가 인용된다. 이러한 공개의 내용(disclosure)은 본 발명에 존재하는 어느 것의 시점에서 보다 충분히 서술하기 위하여 본 발명에 이로써 통합된다.

골수(bone marrow) 및 제대혈(cord blood)로부터 유래하는 인간 비-조혈 줄기세포(Human non-hematopoetic stem cells)는 환자에서 재생 및 면역조절(immunemodulatory) 지표에 대한 중간엽세포(mesenchymal cells)로 점점 더 이용된다. 80 개 이상 임상 시도가 중간엽세포와 함께 전세계적으로 수행되었다.

거의 모든 연구자들은 표준 혈청(standard serum) 보충물(supplement)로 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함하는 배지를 사용한다. FBS는 소 유래이고, TSE(즉, 전염성 해면양뇌증 (Transmissible Spongiform Encephalopathy))를 전염시킬수 있고, 받는 사람에서 면역반응을 자극할 수 있다. BSE가 없는 소만이 인간에서 사용에 대한 인가(authorities)에 의해 허가되고(New Zealand), 연구자들은 세포 성장 촉진에 대한 대체적인 접근을 개발하기 위한 일환에 참여된다. 세포 기반 치료는 앞으로 점점 더 사용될 것이기 때문에, 수반하는 FBS의 단축이 있을 것이다.

일부 회사들은 무혈청 배지(serum-free media)를 개발하고 있다. 하지만, 이러한 배지는 이상적인 세포 성장률, 및 형태(morphology)보다 더 낮은 것을 보이며, 이러한 배지에서 상기 골수 유래 CD34-음성 줄기세포의 특성은 FBS를 포함하는 배지에서의 그것들 만큼 광범위하게 특성화되지 않는다.

인간 혈소판(thrombocytes)(즉, 혈소판(platelets))은 신선동결혈장(Fresh Frozen Plasma, FFP)로서, 성장을 증가하는 성분(components)으로 다른 연구자에 의해 사용된다. 혈소판 및 이의 재생 의학(regenerative medicine)에서 가능성있는 영향은 Stellos 및 Gawaz, 및Langer 및 Gawaz에 의해 개별적으로 재검토된다.

당업계에서 하기 특이적 견해(teaching)는 혈소판 또는 FFP를 이용한 줄기 세포 증식에 대하여 언급된다. Schallmoser, et al은 혈소판 용해물을 이용한 중간엽세포 증식을 발표한다. Capelli, et al은 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cells)를 증식하고 생산하기 위하여 여과되지 않은 인간 혈소판 용해물의 이용을 발표한다. 혈청 및 트롬빈(thrombin)으로 활성화된 자가혈치료술(platelet-rich plasma)의 이용을 발표한다. Muller, et al은 인간 골수 유래 다분화능(multipotent) 중간엽 기질 세포 분리 및 증식을 위하여, FFP 및 혈소판 둘 다를 이용하는 동물 혈청이 없는 배양 조건을 발표한다. Blande, et al은 살균 여과된 자가 유래 인간 혈소판 용해물이 보충된 동물 혈청이 없는 배지에서 지방 조직 중간엽 줄기 세포 증식을 발표한다. 비슷하게, Salvade' et al은 중간엽 기질 세포 배양에서 살균 여과된 혈소판 용해물의 이용을 발표한다.

중간엽 줄기 세포 배양에서 혈소판 용해물 및 FFP의 알려진 용도에도 불구하고, 나중에 필요할 때 분화하는 그들의 능력을 보존하는 동안, 안정된 면에서 이러한 세포를 배양하는 보다 빠르고, 비용-효율적이고 안전한 방법을 위한 충족되지 않은 요구는 여전히 존재한다.

Blande, et al., "Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate", Transfusion, Vol. 49, Dec. 2009; 2680-2685. Capelli, et al. (2007) "Human platelet lysate allows expansion and clinical grade production of mesenchymal stromal cells from small samples of bone marrow aspirates or marrow filter washouts." Bone Marrow Transplant. 40(8):785-91. Horn et al. (2010). "Impact of individual platelet lysates on isolation and growth of human mesenchymal stromal cells" Cytotherapy, 12: 888-898. Kocaoemer, et al., "Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue", Stem Cells, Nov. 11, 2008; 1271-1278. Langer and Gawaz, "Platelets in regenerative medicine", Basic Res Cardiol 103:299-307 (2008). Muller, et al. (2006). "Animal serum-free culture conditions for isolation and expansion of multipotent mesenchymal stromal cells from human BM." Cytotherapy 8(5): 437-44. Salvade, et al., "Characterization of Platelet Lysate Cultured Mesenchymal Stromal Cells and Their Potential Use in Tissue-Engineered Osteogenic Devices for the Treatment of Bone Defects." Tissue Eng Part C Methods. 15, 2009:185-196. Schallmoser, et al. (2008) "Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum." Tissue Eng Part C Methods. 14(3):185-96. Stellos and Gawaz, "Platelet interaction with progenitor cells: Potential implications for regenerative medicine", Thromb Haemost 2007; 98:922-929.

발명의 개요

본 발명은 하기를 포함하는, 인간 CD34^-줄기 세포의 증식을 제한하고 결과 증식된 CD34^- 줄기 세포는 분화하는 능력을 유지하는, 세포 성장 배지를 제공한다:

(a) 상기 세포 성장 배지의 전체 부피 중 2% 부터 15%까지를 구성하는, 0.22 μm 직경보다 더 큰 고체(solid matter)가 없는 인간 혈소판 용해물;

(b) 상기 세포 성장 배지의 전체 부피 중 1% 부터 10%까지를 구성하는, 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 신선동결혈장(fresh frozen plasma, FFP) 여과액(filtrate);

(c) 세포 성장 배지의 0 U/ml 부터 10 U/ml까지의 농도의 헤파린(heparin);

(d) 0.5 mM 부터 10 mM까지 농도의 L-글루타민(L-glutamine); 및

(e) 세포 성장 배지의 전체 부피 중 75% 부터 97% 까지를 구성하고, (d) 부분의 L-글루타민을 포함할 수 있는, 포유류 세포 성장에 적합한 무혈청, 저글루코스 배지(low glucose medium).

또한, 본 발명은 (i) 상기 세포 성장 배지 첨가물의 부피로 3% 내지 25%, (ii) 0 U/ml 부터 10 U/ml까지의 농도에서 헤파린, 및 (iii) 0.5 mM 부터 10 mM까지의 농도에서 L-글루타민을 포함하는 세포 성장 배지를 형성하기 위하여, 상기 세포 성장 배지 첨가물은 헤파린 및 포유류 세포 성장에 적합한 L-글루타민을 포함하고, 무혈청, 저글루코스 배지로 조합되는 경우, 상기 결과 세포 성장 배지는 상기 인간 CD34^-줄기 세포의 증식을 제한하고, 상기 결과 증식된 CD34^-줄기세포는 분화 능력을 유지하는, 하기로 구성된 세포 성장 배지 보충물을 제공한다:

(a) 상기 세포 성장 배지 보충물의 전체 부피의 17% 내지 94%를 구성하는0.22 μm 직경보다 더 큰 고체가 없는 인간 혈소판 용해물; 및

(b) 상기 세포 성장 배지 첨가물의 전체 부피의 6% 부터 83%까지를 구성하는, 0.22 μm 직경보다 더 큰 고체가 없는 인간 FFP 여과액.

또한, 본 발명은 하기 단계에 따라 제조된, 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 혈소판 용해물을 제공한다:

(i) 혈소판 농축물을 동결함으로써 상기 혈소판을 그 안에 용해하는 단계;

(ii) 상기 결과 용해된 혈소판을 해동하는(thawing) 단계;

(iii) 그 안에 펠렛(pellet) 고체에 적합한 속도 및 기간 동안 상기 해동된 용해 혈소판을 원심분리 하는 단계;

(iv) 그 안에 펠렛 고체에 적합한 속도 및 기간 동안 단계 (iii)의 상기 상청액(supernatant)을 재-원심분리하는 단계; 및

(v) 첫 번째 여과는 적어도 5 μm의 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하고, 마지막 여과는 0.22 μm보다 더 크지 않은 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하는 감소하는 구멍 크기의 필터를 이용한 단계 (iv)의 상기 상청액을 적어도 2회 여과하는 단계.

또한, 본 발명은 여전히 하기 단계에 따라 제조된, 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 신선동결혈장(human fresh frozen plasma, FFP) 여과액(filtrate)을 제공한다:

(i) FFP 해동 단계;

(ii) 상기 이의 액체 및 고체 부분을 분리하는 것에 적합한 속도 및 기간 동안 상기 해동된 FFP를 원심분리하는 단계;및

(iii) 상기 결과 액체 부분을, 첫 번째 여과는 적어도 5 μm의 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하고, 마지막 여과는 0.22 μm 보다 더 크지 않은 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하는, 감소하는 구멍 크기의 필터를 이용하여 적어도 2회 여과하는 단계.

또한, 제공된 것은 하기 각 부분(compartments)을 포함하고, (i) 상기 용해물은 (a) 및 (b)의 조합된 부피 중 17% 부터 94%까지를 구성하고, (ii) 상기 FFP 여과액은 (a) 및 (b)의 조합된 부피 중 6% 부터 83%까지를 구성하며, (iii) (i) 상기 키트의 내용물은 배지 부피의 3% 내지 25%를 구성하고, (ii) 헤파린은 0 U/ml 부터 10 U/ml까지의 농도인 세포 성장 배지를 형성하기 위하여, 상기 용해물 및 여과액은 헤파린 및 포유류 세포 성장에 적합한 L-글루타민을 포함하고, 무혈청, 저글루코스 배지로 조합될 경우, 상기 결과 세포 성장 배지는 인간 CD34^-줄기 세포의 증식을 제한하고, 상기 결과 증식된 CD34^-줄기 세포는 분화 능력을 유지하는 인간 CD34^-줄기 세포 증식에 사용을 위한 키트(kit)이다:

(a) 0.22 μm 직경보다 더 큰 고체가 없는 인간 혈소판 용해물, 및

(b) 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 신선동결혈장(human fresh frozen plasma, FFP) 여과액.

또한, 본 발명은 (a) 인간 CD34^-줄기 세포 및 (b) 상기 개체 세포 성장 배지의 실시예 중 어느 것을 포함하는 물질의 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 혈소판 용해물을 제조하는 방법을 제공한다:

(i) 혈소판 농축물을 동결함으로써 상기 혈소판을 용해하는 단계;

(ii) 상기 결과 용해된 혈소판을 해동하는 단계;

(iii) 그 안에 펠렛 고체에 적합한 속도 및 기간 동안 상기 해동된 용해 혈소판을 원심분리 하는 단계;

(iv) 그 안에 펠렛 고체에 적합한 속도 및 기간 동안 단계 (iii)의 상기 상청액을 재-원심분리하는 단계; 및

(v) 단계 (iv)의 상기 상청액을, 첫 번째 여과는 적어도 5 μm의 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하고, 마지막 여과는 0.22 μm보다 더 크지 않은 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하는, 감소하는 구멍 크기의 필터를 이용한 적어도 2회 여과하는 단계.

또한, 본 발명은 여전히 하기 단계를 포함하는 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 신선동결혈장(human fresh frozen plasma, FFP) 여과액을 제조하는 방법을 제공한다:

(i) FFP 해동 단계;

(iii) 상기 결과 액체 부분을, 첫 번째 여과는 적어도 5 μm의 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하고, 마지막 여과는 0.22 μm보다 더 크지 않은 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하는, 감소하는 구멍 크기의 필터를 이용하여 적어도 2회 여과하는 단계.

또한 본 발명은 하기를 조합하는 단계를 포함하는, 인간 CD34^-줄기세포의 증식을 제한하고, 결과 증식된 CD34^-줄기세포는 분화 능력을 유지하는, 세포 성장 배지를 제조하는 방법을 제공한다:

(a) 상기 세포 성장 배지의 전체 부피 중 2% 부터 15 % 까지를 구성하는 0.22 μm보다 더 큰 고체가 없는 인간 혈소판 용해물;

(b) 상기 세포 성장 배지의 전체 부피 중 1% 부터 10%까지를 구성하는, 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 신선동결혈장(human fresh frozen plasma, FFP) 여과액;

(c) 상기 세포 성장 배지 중 0 U/ml 부터 10 U/ml까지의 농도 산출량에 충분한 양의 헤파린;

(d) 0.5 mM 부터 10 mM까지 농도 산출량에 충분한 양의 L-글루타민;및

(e) 세포 성장 배지의 전체 부피 중 75% 부터 97%까지를 구성하고, (d) 부분의 L-글루타민을 포함할 수 있는, 포유류 동물 세포 성장에 적합한 무혈청, 저글루코스 배지.

본 발명은 상기 개체 세포 성장 배지에서 적합한 온도에서 상기 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 인간 CD34^-줄기세포의 집단을 증식하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (i) 분화 능력을 가지고, (ii) 인간 CD34^-줄기세포 집단의 증식으로서, 상기 개체 세포 성장 배지에서 적합한 온도로 줄기세포 집단을 배양하는 것을 포함하는 증식의 결과로 야기된 인간 CD34^-줄기세포를 제공한다.

최종적으로, 본 발명은 (i) 분화 능력을 가지고, (ii) 인간 CD34^-줄기세포 집단의 증식으로서, 상기 개체 세포 성장 배지에서 적합한 온도로 줄기세포 집단을 배양하는 것을 포함하는 증식의 결과로 야기된 인간 CD34^-줄기세포 집단을 제공한다.

도 1
다른 조성물의 배지에서 MSC의 배가 시간(Doubling time).
도 2
다른 배지에서 MSC의 증식 속도.
도 3
Bio-1에서 MSC-성장 역학.
도 4
MSC-특이적 표면 단백질의 발현.
도 5
유동 세포 분석법(flow cytometry)으로 MSC 집단 분석. 왼쪽 패널: IMDM + 20% FBS에서 배양된 MSC, 오른쪽 패널: Bio-1에서 배양된 MSC.
도6
Bio-1에서 MSC 성장의 유도된 분화.
도 7
MSC의 배가 시간(일). 붉은색(막대 4-6): 적어도 40 μm 필터 또는 더 작은 구멍 크기의 필터를 통하여 여과된 FFP 와 배양된 MSC의 배가 시간. 파랑색(막대 1-3): 여과되지 않았거나, 100 μm 만을 통해 여과된 FFP로 배양된 MSC의 배가 시간.
도 8
12일 후에 달성된 배가(doubling)의 양. 붉은색(막대 4-6): 적어도 40 μm 필터 또는 더 작은 구멍 크기의 필터를 통하여 여과된 FFP 와 배양된 MSC로 달성된 배가. 파랑색(막대 1-3): 여과되지 않았거나, 100 μm 만을 통해 여과된 FFP로 배양된 MSC로 달성된 배가.
도 9
현미경 분석을 배양 4일 후에 수행하였다. 40 μm, 40 μm 또는 0.22 μm 필터를 통한 FFP의 여과는 MSC의 성장 속도를 유의적으로 증가시켰다. 100 μm을 통한 필터 단독만이 상기 성과를 조금 개선시켰다.
도 10
MSC의 배가 시간(일). 40 μm 필터를 통과한 FFP가 있는 배지에서 배양된 MSC의 배가 시간(붉은색; 막대 4-7)은 필터되지 않은 FFP와 배양된 MSC의 그것보다(파랑색; 막대 1-3)의 약 절반이다.
도 11
배양 9일 후의 현미경 분석. 늦은 계대(passages)의 MSC가 이 분석을 위해 사용되었고, 이는 긴 배가 시간 및 노화 MSC에 대한 대표적인 납작한 형태 인것을 설명한다(사진 1-4). 하지만, 여과된 FFP가 있는 배지에서 배양은 세포 성장 속도를 증가시키는 것 뿐만 아니라 세포의 형태를 개선시켰다(사진 5-8).
도 12
다른 TK 및 FFP 제조와 MSC 성장의 조절. TK 및 FFP는 다른 여과 단계로 종속된다. 현미경 사진은 배양 7일 후에 상기 세포 성장을 나타낸다. 40 μm 및 0.20 μm 필터 둘 다를 통해 여과된 TK 및 FFP가 있는 상기 배지는 가장 효과적인 MSC 성장을 제공하였고(시료 2), 또한, 상기 결과 배지를 0.20 μm를 통해 다시 여과하였을 때(시료 5) 효과적인 MSC 성장을 제공하였다. 모든 경우에서, 세포 성장은 충분히 개선되었다.
도 13
다른 여과 단계로 제조된 Bio-1에서 성장된 MSC에서 CD41⁺의 분석. 기증자 AP00029, AP00042 및 AP00045 유래 MSC를 상기 분석에 사용하였다. (A) 1- 대조군(control); 2 - TK 0.8 μm / 0.2 μm + FFP; 3 - TK + FFP 0.8 μm / 0.2 μm; 4 - Tk 0.8 μm / 0.2 μm + FFP 0.8 μm / 0.2 μm. (B) 1- 대조군; 2 - TK 8 μm + FFP; 3 - TK + FFP 8 μm; 4 - TK 8 μm + FFP 8 μm. (C) 1- 대조군; 2 - TK 8 μm / 0.8 μm / 0.2 μm + FFP; 3 - TK + FFP 8 μm / 0.8 μm / 0.2 μm; 4 - TK 8 μm / 0.2 μm + FFP 8 μm / 0.8 μm / 0.2 μm. (D) 1 - 대조군; 2 - TK 0.8 μm / 0.2 μm + FFP 0.8 μm / 0.2 μm + Bio-1 0.8 μm / 0.2 μm; 3 - TK 8 μm / 0.8 μm / 0.2 μm + FFP 8 μm / 0.8 μm / 0.2 μm + Bio-1 0.8 μm / 0.2 μm.
도 14
(1) 표준 FFP 및 (2) 한랭형침강물(cryoprecipitate-free)이 없는 FFP가 있는 Bio-1에서 자란 MSC의 분석.

본 발명은 인간 CD34^-줄기 세포의 예상외의 빠른 증식을 제한하는 신규한 성장 배지를 제공한다. 하지만, 상기 증식된 줄기 세포는 유도하지 않는 한 분화하지 않는다. 따라서, 상기 본 발명의 성장 배지 및 이의 관련된 방법은 빠르게, 안전하게 및 저렴하게 질환 치료에서 사용을 위한 유의적인 CD34^-줄기 세포의 수를 제조하는 능력에서 유의적인 개선으로 여겨진다.

특히, 본 발명은 하기를 포함하는, 인간 CD34^-줄기 세포의 증식을 제한하고 결과 증식된 CD34^-줄기 세포는 분화하는 능력을 유지하는, 세포 성장 배지를 제공한다:

(a) 상기 세포 성장 배지의 전체 부피의 2% 부터 15%까지를 구성하는, 0.22 μm 직경보다 더 큰 고체(solid matter)가 없는 인간 혈소판(즉, 혈소판(thrombocyte)) 용해물;

(b) 상기 세포 성장 배지의 전체 부피 당 1% 부터 10%까지를 구성하는, 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 신선동결혈장(fresh frozen plasma, FFP) 여과액(filtrate);

(c) 상기 세포 성장 배지의 0 U/ml 부터 10 U/ml까지의 농도의 헤파린(heparin);

(d) 0.5 mM 부터 10 mM까지 농도의 L-글루타민(L-glutamine); 및

(e) 세포 성장 배지의 전체 부피의 75% 부터 97% 까지를 구성하고, (d) 부분의 L-글루타민을 포함할 수 있는, 포유류 세포 성장에 적합한 무혈청, 저글루코스 배지(low glucose medium).

하기의 것은 이 세포 성장 배지의 바람직한 실시예이다: (i) 상기 용해물은 상기 세포 성장 배지의 전체 부피 중 3% 부터 8%까지, 및 바람직하게 6%를 구성하고; (ii) 상기 FFP 여과액은 2% 부터 7% 까지, 4% 부터 6%까지, 및 바람직하게 5%를 구성하고; (iii) 헤파린(heparin)은 상기 세포 성장 배지의 0.8 U/ml 부터 1.2 U/ml까지, 및 바람직하게 1 U/ml에서의 농도이고; (iv) L-글루타민(L-glutamine)은 0.5 mM 부터 10 mM까지, 및 2 mM에서의 농도이고; 및 (v) 상기 무혈청, 저글루코스(low glucose)(1 mg/ml) 배지는 L-glutamine을 포함하는, 저글루코스 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)이고, 상기 세포 성장 배지의 전체 부피 중 85% 부터 93% 까지, 87% 부터 91%까지, 및 바람직하게 89%를 구성한다.

또한, 바람직한 실시예에서, 상기 증식된 CD34^-줄기 세포는 CD34^-/CD45^-/CD73⁺/CD105⁺/CD90⁺표현형(phenotype)을 가진다. 이러한 표현형에 의해, 이것은 CD34 및 CD45 마커가 이러한 마커들에 대한 시험에서 증식된 세포의 0% ± 10% (및 바람직하게 ± 0.5%)에서 나타나는 것을 의미하였다(예를 들면, 유세포 분석(flow cytometric analysis)을 이용하여). 비슷하게, 마커 CD73, CD105 및 CD90는 이러한 마커들에 대한 시험에서 증식된 세포의 100% ± 10% (및 바람직하게 ± 0.5%)에서 나타난다.

본 명세서에서 사용된, "CD34^- 줄기세포"는 이의 표면에 CD34가 부족한 줄기세포를 의미할 것이다. CD34^-줄기 세포는 예를 들면, 뼈(bone), 탯줄(umbilical cord) 및 지방조직(adipose tissue)과 같은 조직으로부터 유래될 수 있다. CD34^-줄기 세포 및 이를 분리하는 방법은, 예를 들면 Lange C. et al., Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine. J. Cell Physiol. 2007, Apr. 25 [Epub ahead of print]에 기재된다.

본 발명의 한 실시예에서, 상기 용어 신선동결혈장(fresh frozen plasma, FFP)은 동결되고 보존된 인간 혈액의 액체 부분을 나타낸다. 특히, 상기 용어 FFP는 실시예에서, 원심분리되고, 분리되고, 수집 6 시간 내에 -18 ℃에서 고체로 동결된 인간 혈액의 유체(fluid) 부분을 나타낸다. 상기 포유류의 세포 성장에 적합한 무혈청, 저글루코스 배지는, 예를 들면 다양한 아미노산(amino acids), 비타민(vitamins), 염(salts) 및 다른 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 또한 상기 무혈청, 저글루코스 배지는 글루코스의 낮고(DMEM), 이는 또한 L-글루타민을 포함할 수 있다. 아래 제공된 표 1 및 2, 예를 들면, 거의 두 개의 동일한 생장 배지 제형(formulation)이다.

Dulbecco's Modified Eagle Medium ( DMEM ) Low Glucose

DMEM은 하기를 g/ml로 함유한다:

무기염류( Inorganic salts ):

0.0002 mg CaCl

0.0001 mg Fe(NO₃) x 9 H₂O

0.0004 mg KCl

0.0000977 mg MgSO₄

0.0064 mg NaCl

0.000125 mg NaH₂PO₄ x 2 H₂O

0.0037mg NaHCO₃

아미노산( Amino acids ):

0.000084 mg L-아르기닌(L-Arginine) x HCl

0.000048 mg L-시스테인(L-Cystine)

0.000584 mg L-글루타민(L-Glutamine)

0.000030 mg 글리신(Glycine)

0.000042 mg L-히스티딘(L-Histidine) x HCl x H₂O

0.000105 mg L-이소루신(L-Isoleucine)

0.000105 mg L-루신(L-Leucine)

0.000146 mg L-리신(L-Lysine) x HCl

0.00003 mg L-메티오닌(L-Methionine)

0.000066 mg L-페닐알라닌(L-Phenylalanine)

0.000042 mg L-세린(L-Serine)

0.000095 mg L-트레오닌(L-Threonine)

0.000016 mg L-트립토판(L-Tryptophan)

0.000072 mg L-티로신(L-Tyrosine)

0.000094 mg L-발린(L-Valine)

비타민( Vitamins ):

0.000004 mg D-칼슘-판토텐산염(D-Calcium-Pantothenate)

0.000004 mg 염화 콜린(Choline chloride)

0.000004 mg 엽산(Folate)

0.0000072 mg 미오이노시톨(Myo-Inositol)

0.000004 mg 니코틴아미드(Nicotinamide)

0.000004 mg 피리독살(Pyridoxal) x HCl

0.0000004 mg 리보플라빈(Riboflavin)

0.000004 mg 티아민(Thiamine) x HCl

다른 성분( Other components):

0.001 mg D-글루코스(D-Glucose)

0.000015 mg 페놀 레드(Phenol red)

0.00011 mg 나트륨 피루빈산염(Sodium pyruvate)

0.9862567 mg H₂O

물( Water ):

0.9862567 mg

인간 혈소판(platelets)(즉, 혈소판(thrombocytes))은 전체 혈액 또는 성분채집(apheresis)으로부터 수득될 수 있다. 혈소판은 단독 기증자 또는 부합하는 모인(pooled) 기증자로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 단독-기증자 성분채집이 이용된다. 비슷하게, FFP는 전체 혈액 또는 성분채집으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게, 성분채집은 FFP를 제조하는 것에 이용된다. 혈소판 농도 및 FFP 농도는 “Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components”, Council of Europe, Recommendation; 및 “Transfusionsgesetz and Richtlinien zur Hamotherapie“ (Germany)에 기재된 것과 같은 일반적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

바람직한 실시예에서, 상기 사용된 혈소판 단위는 하기 특징을 가진다: 부피는 200-300 ml이다; 혈소판 내용물은 2-4 x 10¹¹/단위(unit) 이다; 적혈구(erythrocyte) 내용물은 < 3 x 10⁹/단위이다; 백혈구(leukocyte) 내용물은 혈소판의 < 1 x 10⁶ /단위이다; 및 상기 기증자는 HLA-항체에 대하여 음성이다(면역 합병증(immune complications)의 회피에 중요함). 이러한 것들은 제조자의 면허에 따른 특성이다. 또한, 다른 혈소판 단위가 사용될 수 있다.

상기 개체 세포 성장 배지의 바람직한 실시예에서, 상기 (a) 부분의 혈소판 용해물은 하기 단계에 따라 제조된다:

(ii) 상기 결과 용해된 혈소판을 해동하는(thawing) 단계;

(v) 단계 (iv)의 상기 상청액을, 첫 번째 여과는 적어도 5 μm의 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하고, 마지막 여과는 0.22 μm보다 더 크지 않은 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하는, 감소하는 구멍 크기의 필터를 이용하여 적어도 2회 여과하는 단계.

본 발명의 한 실시예에서, 여과 단계 (v)는 생략된다.

한 실시예에서, 단계 (i) 의 상기 인간 혈소판 농도는 원심분리 함으로써 그들을 펠렛팅(pelleting)하고; 상기 액체상으로부터 펠렛화된(pelleted) 혈소판을 분리하고; FFP에서 상기 결과 혈소판을 재구성함에 의해 제조된다.

하기는 상기 혈소판 용해물 제조 과정의 확실한 부가적인 바람직한 실시예이다: 인간 혈소판 농축물의 동결은 -20 및 -80 ℃ 사이, 및 바람직하게 -80 ℃에서 수행된다; 상기 용해된 혈소판의 해동은 18 및 37 ℃ 사이, 및 바람직하게 37 ℃에서 수행된다; 상기 해동된 혈소판의 원심분리는 9,000 x g 및 55,000 x g 사이, 및 바람직하게 10,000 x g에서, 10 및 20 분에서, 및 바람직하게 20 분 동안 수행된다; 단계 (iii)으로부터 상기 상청액을 재-원심분리하는 것은 3,000 x g 및 5,000 x g사이, 및 바람직하게 4,000 x g에서, 10 분 동안 수행된다; 및 단계 (iv)로부터 상기 상청액을 여과하는 것은 감소하는 구멍 크기, 즉 40 μm ± 5 μm, 5 μm ± 1 μm, 및 0.22 μm의 필터를 이용하여 3 회 수행된다.

상기 재구성된 혈소판은 그 후에 상기 언급된 단계 (i), 동결 단계로 종속될 수 있다. 이러한 절차는 혈장에서 혈액형항원(blood group antigens) 및 동종 응집소(isoagglutinin) 사이의 좋은 혈액형 호환성(compatibility)을 달성할 수 있다. 단계 (ic)의 상기 혈소판 재구성에 사용된 상기 FFP는 아래 기재된 방법 중 어느 것에 따라 제조될 수 있다.

또한, 상기 개체 세포 성장 배지의 바람직한 실시예에서, (b) 부분의 상기 FFP 여과액은 하기 단계에 따라 제조된다:

(i) FFP 해동 단계;

본 발명의 한 실시예에서, 여과 단계 (iii)은 생략된다.

본 발명의 다른 실시예에서, (b) 부분의 상기 FFP 여과액은 (i) 인간 FFP를 해동; (ii) 상기 해동된 인간 FFP를 동결; (iii) 상기 결과 인간 FFP를 해동; 및 (iv) 상기 결과 해동된 FFP를 이의 상기 액체 및 고체 부분을 분리하는 것에 적합한 속도 및 기간 동안 원심분리함에 의해 제조된다. 또한, 한 실시예에서, 단계 (iv) 결과 상기 액체 부분의 여과는 생략된다.

하기는 상기 FFP 여과액을 제조하는 이러한 방법의 확실한 바람직한 실시예이다: 상기 FFP 해동은 18 및 37 ℃ 사이, 및 바람직하게 37 ℃에서 수행된다; 상기 해동된 FFP를 원심분리하는 것은 9,000 x g 및 55,000 x g 사이, 및 바람직하게 10,000 x g 에서, 10 및 20 분 사이, 및 바람직하게 20 분 동안 수행된다; 및 단계 (ii) 로부터 상기 액체 부분의 여과는 감소하는 구멍 크기, 즉 40 μm ± 5 μm, 5 μm ± 1 μm, 및 0.22 μm를 이용하여 3회 수행된다.

이상적으로 , 상기 개체 세포 성장 배지는 동물 혈청이 없다. 이러한 것은 인간 개체에 비인간(non-human) 항원을 도입할 때 일어날 수 있는 합병증을 감소시킨다.

바람직하게, 상기 개체 세포 성장 배지에서, 상기 혈소판 용해물 및 FFP 여과액은 혈액형 항원 ABO 및 Rh에 대하여 부합된다. 즉, 상기 혈소판 용해물 및 FFP 여과액은 바람직하게, 이러한 동일한 혈액형 항원을 가지는 개체로부터 유래된다(예를 들면, 상기 용해물 및 여과액 둘 다는 O+/Rh+ 개체로부터 유래된다). 이러한 주제는 하기에 더 자세히 논의된다.

또한, 본 발명은 하기를 포함하는, (i) 상기 세포 성장 배지 첨가물의 부피로 3% 내지 25%, (ii) 0 U/ml 부터 10 U/ml까지의 농도에서 헤파린, 및 (iii) 0.5 mM 부터 10 mM까지의 농도에서 L-글루타민을 포함하는 세포 성장 배지를 형성하기 위하여, 상기 세포 성장 배지 첨가물은 헤파린 및 포유류 세포 성장에 적합한 L-글루타민을 포함하고, 무혈청, 저글루코스 배지로 조합되는 경우, 상기 결과 세포 성장 배지는 상기 인간 CD34^-줄기 세포의 증식을 제한하고, 상기 결과 증식된 CD34^-줄기세포는 분화 능력을 유지하는, 세포 성장 배지 보충물을 제공한다:

(a) 상기 세포 성장 배지 보충물의 전체 부피의 17% 내지 94%를 구성하는 0.22 μm 직경보다 더 큰 고체가 없는 인간 혈소판 용해물; 및

(b) 상기 세포 성장 배지 첨가물의 전체 부피의 6% 부터 83%까지를 구성하는, 0.22 μm 직경보다 더 큰 고체가 없는 인간 FFP 여과액;

이러한 세포 성장 배지 보충물은 사실은 DMEM같은 표준 성장 배지에 첨가 하기 위한 “농축물(concentrate)”로서 사용된다. 따라서, 상기 보충물은 바람직하게 상기의 혈소판 용해물 및 FFP 여과액의 바람직한 농도를 생산한다(예를 들면, 상기 혈소판 용해물 및 FFP 여과액은 각각 상기 보충물의 54.5% 및 45.5% 를 구성한다).

한 실시예에서, 상기 개체 세포 성장 배지 보충물은 또한 헤파린을 포함하고, 이는 상기 세포 성장 배지 보충물의 부피의 3% 내지 25%(및 바람직하게 11%)를 함유하고, 0 U/ml 부터 10 U/ml까지(및 바람직하게 1 U/ml)의 헤파린을 가지는 세포 성장 배지를 구성하기 위하여, 상기 세포 성장 배지 보충물이 포유류 세포 성장에 적합한 L-글루타민을 함유하고, 무혈청, 저글루코스 배지로 조합될 때, 상기 결과 세포 성장 배지는 인간 CD34^-줄기세포의 증식을 제한하고, 상기 결과 증식된 CD34^- 줄기세포는 분화 능력을 유지한다.

바람직하게, 상기 개체 세포 성장 배지 보충물에서, 상기 (a) 부분의 혈소판 용해물은 하기 단계에 따라 제조된다:

(ii) 상기 결과 용해된 혈소판을 해동하는(thawing) 단계;

(iii) 그 안에 펠렛(pellet) 고체에 적합한 속도 및 기간 동안 상기 해동되고 용해된 혈소판을 원심분리 하는 단계;

본 발명의 한 실시예에서, 여과 단계 (v)는 생략된다.

또한, 상기 개체 세포 성장 배지 보충물에서, 상기 (b) 부분의 FFP 여과액은 하기 단계에 따라 제조된다:

(i) FFP 해동 단계;

본 발명의 한 실시예에서, 여과 단계 (iii)는 생략된다.

상기 개체 성장 배지의 모든 실시예를 망라하여, 또한, 상기 세포 성장 배지 보충물은 이상적으로 동물 혈청이 없다.

또한, 바람직한 상기 개체 세포 성장 배지 보충물은 상기 혈소판 용해물 및 FFP 여과액은 혈액형 항원 ABO 및 Rh에 대하여 부합하는 경우이다. 이러한 것은 다시 개체 성장 배지에 관하여 상기에 논의된다.

(ii) 상기 결과 용해된 혈소판을 해동하는(thawing) 단계;

본 발명의 한 실시예에서, 여과 단계 (v)는 생략된다.

또한, 본 발명은 여전히 하기 단계에 따라 제조되는, 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 신선동결혈장(human fresh frozen plasma, FFP) 여과액을 제공한다:

(i) FFP 해동 단계;

본 발명의 한 실시예에서, 여과 단계 (iii)는 생략된다.

또한, 제공된 것은 하기 각 부분(compartments)을 포함하고, (i) 상기 용해물은 (a) 및 (b)의 조합된 부피 중 17% 부터 94%(및 바람직하게 54.5%)까지를 구성하고, (ii) 상기 FFP 여과액은 (a) 및 (b)의 조합된 부피 중 6% 부터 83%(및 바람직하게 45.5%)까지를 구성하며, (iii) (i) 상기 키트의 내용물은 배지 부피의 3% 내지 25%(및 바람직하게 11%)를 구성하고, (ii) 헤파린은 0 U/ml 부터 10 U/ml(및 바람직하게 1 U/ml)까지의 농도인 세포 성장 배지를 형성하기 위하여, 상기 용해물 및 여과액은 헤파린 및 포유류 세포 성장에 적합한 L-글루타민을 포함하고, 무혈청, 저글루코스 배지로 조합될 경우, 상기 결과 세포 성장 배지는 인간 CD34 ^-줄기 세포의 증식을 제한하고, 상기 결과 증식된 CD34^-줄기 세포는 분화 능력을 유지하는, 인간 CD34^-줄기 세포 증식에 사용을 위한 키트(kit)이다:

(b) 0.22 μm 직경보다 더 큰 고체가 없는 FFP 여과액.

상기 개체 키트의 한 실시예에서, 상기 키트는, (i) 상기 용해물은 (a) 내지 (c)의 조합된 부피 중 17% 부터 94%(및 바람직하게 54.5%)까지를 구성하고, (ii) 상기 FFP 여과액은 (a) 내지 (c)의 조합된 부피 중 6% 부터 83%(및 바람직하게 45.5%)까지를 구성하며, (iii) (i) 상기 키트의 내용물은 배지 부피의 3% 내지 25%(및 바람직하게 11%)를 구성하고, (ii) 헤파린은 0 U/ml 부터 10 U/ml(및 바람직하게 1 U/ml)까지의 농도인 세포 성장 배지를 형성하기 위하여, 상기 용해물 및 여과액은 헤파린 및 포유류 세포 성장에 적합한 L-글루타민을 포함하고, 무혈청, 저글루코스 배지로 조합될 경우, 상기 결과 세포 성장 배지는 인간 CD34^-줄기 세포의 증식을 제한하고, 상기 결과 증식된 CD34^-줄기 세포는 분화 능력을 유지하는, 하기 각 성분을 포함한다:

(a) 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 혈소판 용해물, 및

(b) 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 FFP 여과액,

(c) 헤파린.

또한, 본 발명은 (a) 인간 CD34^-줄기 세포 및 (b) 상기 개체 세포 성장 배지의 실시예 중 어느 것을 포함하는 물질 중 조성물을 제공한다.

결국 이러한 배지의 조성물 및 줄기세포는 개체에 투여되는 것이고, 본 발명에 구상된 것과 같이, 상기 조성물은 상기 환자의 혈액형의 면역호환되는(immunocompatible) 것이 바람직하다. 이것과 관련하여, 일부 바람직한 실시예는 물질 중 즉각적인 조성물의 임상적 용도와 관련하여 존재한다. 첫째로, 상기 혈소판 용해물은 O형(O형 혈액의 사람(universal donor))이고, 상기 FFP 여과액은 AB 형(O형 혈액의 사람)이며, 상기 조성물은 어떠한 혈액형(즉, O, A, B 또는 AB)을 가지는 환자에 투여된다. 두 번째 바람직한 실시예에서, 상기 혈소판 용해물, 상기 FFP 여과액 및 상기 환자는 모두 동일한 혈액형을 가진다. 세 번째 바람직한 실시예에서, 상기 FFP 여과액은 AB형이고, 상기 혈소판 용해물 유형 및 환자 유형은 동일하고, 어떤 혈액형일 수 있다(예를 들면, FFP 여과액은 AB형이고, 상기 혈소판 용해물 유형 및 환자 유형은 둘 다 O형일 수 있다). 최종적으로, 만약 상기 환자가 O형이면, 상기 사용된 FFP는 어떤 혈액형일 수 있다. Rh 요인에 관하여, 필요하지 않지만, 상기 환자 유형은 상기 FFP 여과액 및 혈소판 용해물의 그것과 부합하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 0.22 μm 직경보다 더 큰 고체가 없는 인간 혈소판 용해물을 제조하는 방법을 제공한다:

(ii) 상기 결과 용해된 혈소판을 해동하는(thawing) 단계;

(iv) 그 안에 펠렛 고체에 적합한 속도 및 기간 동안 단계 (iii) 의 상기 상청액(supernatant)을 재-원심분리하는 단계; 및

본 발명의 한 실시예에서, 여과 단계(v)는 생략된다.

또한, 본 발명은 여전히 하기 단계를 포함하는 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 FFP 여과액을 제조하는 방법을 제공한다:

(i) FFP 해동 단계;

또는, 상기 세포 성장 배지의 상기 (b) 부분의 FFP 여과액은 하기 단계에 따라 제조된다: (i) 인간 FFP 해동; (ii) 해동된 인간 FFP 동결 ; (iii) 단계 (ii) 로부터 상기 인간 FFP를 해동 ; 및 (iv) 상기 이의 액체 및 고체 부분을 분리에 적합한 속도에서 및 기간 동안 단계 (iii)로부터 상기 해동된 FFP를 원심분리.

상기 FFP 제조 방법 동안, 단계 (iii)로부터 상기 해동된 FFP는 동결되고, 상기 원심분리 단계 (iv) 전에 다시 적어도 한번 해동될 수 있다. 특히, 상기 FFP는 -35 ℃ 미만 또는 동등한 온도에서 동결될 수 있고, 또한 5 ℃ ± 3 ℃ 온도에서 하룻밤 해동될 수 있으며, 배양된 MSC의 집합체를 정상적으로 유도할 수 있는 요인의 집합체(agglomeration)가 발생한다.

또한, 본 발명의 이러한 방법에서, 상기 언급된 뭉쳐진(agglomerated) 인자들을 침강시키기 위하여, 상기 원심분리 단계는 4000×g 에서 적어도 10분 동안 수행될 수 있다.

상기 기재된 상기 액체 부분의 여과 단계로서 해동하고 동결하는 단계를 이용할 경우, 결과적으로 야기되는 상기 여과 단계 (iv)는 생략될 수 있다. 한랭형침강물(cryoprecipitate) 제거 단계를 통해 전처리된 상기 FFP를 이용하여 제조된 상기 배지에서 상기 배양된 MSC의 배가시간(doubling time)는 상기 FFP 성분의 여과 단계를 통해 제조된 배지에서의 상기 배가 시간과 비교된다.

또한, 본 발명은 하기의 조합된 단계를 포함하는, 인간 CD34^-줄기 세포의 증식을 제한하고, 상기 결과 증식된 CD34^-줄기세포는 분화 능력을 유지하는, 세포 성장 배지를 제조하는 방법을 제공한다:

(a) 상기 세포 성장 배지의 전체 부피 중 2% 부터 15% 까지(및 바람직하게 6%)를 구성하는, 0.22 μm 직경보다 더 큰 고체가 없는 인간 혈소판 용해물;

(b) 상기 세포 성장 배지의 전체 부피 중 1% 부터 10% 까지(및 바람직하게 5%)를 구성하는, 0.22 μm 직경보다 더 큰 고체가 없는 FFP 여과액;

(c) 상기 세포 성장 배지 중 0 U/ml 부터 10 U/ml까지 (및 바람직하게 1 U/ml)의 농도를 산출하는데 적합한 양의 헤파린;

(d) 0.5 mM 부터 10 mM 까지 농도를 산출하는데 적합한 양의 L-글루타민; 및

(e) 상기 세포 성장 배지 중 전체 부피의 75% 부터 97%까지(및 바람직하게 89%)를 구성하는, 포유류 세포 성장에 적합한 무혈청, 저글루코스 배지.

본 발명은 상기 세포 성장 배지에서 적합한 온도에서 상기 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 인간 CD34^-줄기세포 집단(population)을 증식하기 위한 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 적합한 온도는 36 및 38 ℃ 사이, 및 바람직하게 37 ℃이다.

최종적으로, 본 발명은 (i) 분화 능력을 가지고, (ii) 인간 CD34^-줄기세포 집단의 증식으로서, 상기 개체 세포 성장 배지에서 적합한 온도로 줄기세포 집단을 배양하는 것을 포함하는 증식의 결과로 야기된 인간 CD34^-줄기세포의 집단을 제공한다.

본 발명은 하기의 실험 세부사항에 대한 참조로서 더 잘 이해될 수 있으나, 당업계의 당업자는 상기 기재된 특이적 실험은 오직 본 발명의 예시이고, 그 후에 보다 충분히 하기의 청구항에 기재된 것임을 쉽게 인식할 수 있다.

실험 세부 사항

A. 줄기세포-관련 재료의 제조 및 용도

신선동결혈장( Fresh frozen plasma , FFP )(약효 생산물( medicinal product ))

FFP은 투입 또는 또한 분류 과정을 위해 사용된 인간 혈장 성분이며, 전체 혈액 또는 성분채집(apheresis)에 의해 수집된 혈장으로 제조된다. FFP는 안정한 응고(coagulation) 인자, 알부민(albumin) 및 면역글로블린(immunoglobulins)의 정상 혈장 수준을 함유한다. 불안정한 응고인자는 요인 VIIIc를 포함한다.

FFP의 순도는 성분채집을 통한 수집으로 달성된다. HLA 및 HPA 항체에 대하여 시험은 알로-면역(allo-immunisation)의 가능성 있는 위험을 감소시키기 위해 각 기증자에서 수행될 수 있다. ABO로 호환되는 혈장이 이용된다(O-형 혈액형 사람(universal donor) 또는 ABO에 부합하는 것으로 AB Rh+).

FFP는 매우 낮은 농도로 배양 동안 MSC 증식을 위해 사용된다. 또한, 병원균 이동의 위험을 감소시키기 위해, FFP에 대한 상기 기증자는 이상적으로 병원균에 대해 시험되고, B 형 간염(Hepatitis B)에 대하여 면역화된다. 상기 환자의 알로-면역 및 병원균의 이동에 대한 위험은 기재된 측정으로 감소된다.

혈소판 용해물 ( Thrombocyte lysate )(혈소판( platelets ) 유래: 약효 생산물)

상기 혈소판 용해물은, 이상적으로 단독 기증자 유래 성분채집에 의해 수득된 혈소판으로부터 유래된다. 상기 적용된 혈소판 단위(unit)은 적혈구(erythrocytes)의 오염이 없고, 매우 적은 수의 백혈구(leukocytes)(< 10⁵/unit)를 함유한다. 상기 혈소판 용해물은 유의적으로 MSC의 성장 및 순도를 지원하는 무세포 용해물로 이루어진다. 상기 용해물 1ml은 6.5 x 10⁸- 2.0 x 10⁹ 혈소판에 해당한다.

상기 알로-면역화의 가능성있는 위험은 백혈구가 없는 단독-기증자 성분채집 산물의 이용에 의해 감소된다. 상기 혈소판-단위는 적혈구를 포함하지 않지만(또는 매우 낮은 양만을 함유), 오직 O Rh+ 혈소판 또는 부합하는 단위가 사용된다.

병원균 이동의 가능성있는 위험은 단독 기증자 혈소판을 사용하고, CMV에 대한 시험으로 감소된다. 또한, Parvo B19, EBV 또는 톡소플라스마증(toxoplasmosis)와 같은 병원균에 대한 시험을 필요한 경우 수행할 수 있다.

B. Bio -1 조성물(즉, 혈소판 용해물 및 FFP 여과액을 함유하는 배지)의 개발 및 시험

하기 조건하에서 MSC의 배양은 비교되었다: (a) 표준으로 IMDM + 20% FBS ; (b) 3% 혈소판 용해물(=TK) 및 5% FFP로 보충된 DMEM 저글루코스; 및 (c) 6% 혈소판 용해물(=TK) 및 5% FFP로 보충된 DMEM 저글루코스.

MSC 증식 속도

4 명의 기증자 유래 MSC의 증식속도를 하기 세 가지 선택 조건하에서 조사하였다. 동일한 초기 밀도에서 MSC를 배양하고, 계대하였고(passaged), 상기 증식 속도를 각 계대 단계(passaging step) 동안 확인하였다.

배가 시간(Doubling time)은 Td = t*log(2)/log(q2/q1)로 계산하였고, Td는 배가 시간, q1-초기 세포 양, q2-최종 세포 양, t-배양 기간(일)이다.

도 1은 세 가지 조사된 조건하에서 MSC의 하나의 배가(doubling)에 대하여 요구된 시간을 나타낸다. FBS를 함유하는 배지에서 배양된 MSC는 DMEM + 6% TK 및 5% FFP(1.78 ± 0.23 일)에서 자란 MSC 보다 더 높은 배가 시간(2.86 ± 0.43 일) 을 나타낸다. 더 적은 혈소판 용해물(DMEM + 3% TK 및 5% FFP)과 배양된 MSC의 생장 속도는 상기 두 개 사이에 있다(2.4 ± 0.32 일). 이러한 차이는 IMDM + 20% FBS 및 DMEM + 6% TK 및 5% FFP 사이에서 통계학적으로 유의적이고, 비교된 모든 세 개의 배지에서 재현가능한 경향은 평가된다.

FBS를 함유하는 배지에서 정상화된 TK를 함유하는 배지에서 MSC의 증식 속도는 도 2에서 대표된다.

상기 배지 조성물 DMEM + 6% TK 및 5% FFP (Bio-1로 나타낸)은 또한 상세한 분석을 위해 선택되었다.

Bio-1에서 MSC의 증식을 연장된 배양 기간 이상 연구하였다. 골수(Bone marrow) 세포는 Bio-1(10 명 기증자) 또는 IMDM+20% FBS (6 명 기증자)에서 배양하였고, 순수한 MSC 배양을 수득하였다(하기 보여진 분석에 의해 확인된). 세포는 75%-85%의 컨플루언시(confluency)를 달성하기 위해 배양하였고, 계대 동안 계산하였으며, 동일한 초기 밀도에서 재-도말(re-plated)하였다. 세포 배가를 t / Td로 계산하였고, t는 계대(일) 사이의 배양 기간이고, Td는 배가 시간이다.

상기 성장 속도에서 큰 차이 때문에, 두 개의 배지에서 자란 MSC는 동일한 시간에 계대될 수 없었다. 그러므로 MSC 성장의 역학(도 3)은 계대 사이 시간의 기간에 도달하는 세포 배가의 양을 대표하는 단일 데이터 위치(single data points) 이상 추세선(trend line)으로서 대표된다. 상기 접종(seeding)을 낮은 세포 밀도에서 수행한 이후, MSC가 노화에 진입하였기 때문에, 추가적인 계대(passaging) 단계 없이 배양 45일 후에 분석하였다(데이터 보여지지 않음).

다른 배지에서 MSC -특이적 표면 마커의 특성

상기 조건하에서 자란 MSC의 표면 마커 발현의 유세포 분석(Flow cytometric analysis)을 수행하였다. 마커의 표준 조합, MSC 표현형으로 나타내고, ISTH-표준(criteria)으로 허용된(Dominici, Le Blanc et al. 2006)이 사용된다. MSC는 조혈마커 CD34 및 CD45의 발현이 부족하고, 반면에, CD73, CD90 및 CD105는 높이 발현하는 것으로 알려져 있다. 상기 데이터는 5 명의 기증자 비교로부터 수득되었고, 표 3에 요약된다.

표면 마커(Surface markers)	IMDM + 20%FBS	Bio-1
CD34	0.62 ± 0.82	0.20 ± 0.27
CD45	0.38 ± 0.56	0.08 ± 0.03
CD73	99.06 ± 1.59	99.87 ± 0.24
CD90	94.17 ± 2.72	99.92 ± 0.05
CD105	99.28 ± 1.07	99.83 ± 0.18

TK 및 FFP 함유 배지에서의 배양은 수득된 배양의 표현형적 특성을 개선하였다. 이러한 추세는 모든 분석된 마커의 발현에서 관측되었다(도 4 참조).

세포 생존능 ( viability ) 및 형태

Bio-1에서 배양된 MSC의 생존능은 FACS 분석에서 7-AAD 염색으로 결정하였다. 11 명의 기증자 유래 MSC의 분석으로부터 계산된 상기 평균 생존능은 97.61 ±1.26%이었다.

또한, Bio-1에서 자란 MSC는 크기 및 입도(granularity)의 면에서 균질한 세포 집단을 나타내고, FBS 함유 배지에서 배양된 MSC와 비교하였을 때(도 5 참조) 더 작은 크기를 나타내며, 이는 MSC의 보다 생리학적 주기로서 여겨진다. 이러한 관측은 현미경 분석으로 확인된다(데이터 보여지지 않음).

Bio -1에서 자란 MSC 의 기능적 분석

MSC의 클론을 형성하는 능력(Clonogenicity)을 CFU-F(fibroblast colony forming unit) 분석에서 증명하였다(데이터 보여지지 않음). MSC의 지방, 골 및 연골 계열로의 분화가 유도될 수 있었다(도 6 참조).

C. Bio -1 조성물의 추가 개발

하기 시험에서, 두 개의 Bio-1 성분에 대한 제조 방법, 혈소판 용해물(platelet lysate, TK) 및 신선동결혈장(fresh frozen plasma, FFP)가 추가적으로 개선되었다. 상기 개선의 목적은 0.22 μm 크기 보다 더 큰 모든 입자를 배지로부터 제거하고, TK 및 FFP를 가지는 배지에서 정상적으로 보일 수 있는 침전물(precipitates)이 없는 깨끗한 용액을 수득하는 것이었다.

시작성분은 하기로 제조되었다:

TK는 동결(-20˚C 또는 -80˚C) 및 혈소판 농축물의 해동, 10,000 x g 에서 20’ 동안 및 4,000 x g 에서 10’ 동안 18˚C 에서 원심분리하여 수득하였다. 상기 결과 상청액을 사용하였다.

FFP는 < -35˚C에서 보관한 후에 해동하였다.

하기의 모든 실험에서, 상기 성분들을 L-글루타민 및 헤파린으로 보충된 DMEM 저글루코스에 6% TK 및 5% FFP 농도에서 첨가하였다.

첫 번째 시험에서, 상기 배지를 제조하였고, 0.22 μm 필터를 통해 직접적으로 통과하였다. 3 명의 기증자의 MSC를 상기 여과된 배지에서 표준 방법으로 배양하였다. 상기 세포 성장이 저지되었고, 배양 2 주 후에, 상기 배지를 여과되지 않은 하나로 교환하였고, 상기 세포 성장을 개시하였다(데이터 보여지지 않음).

추가 시험에서, 시작 성분은 원심분리 및 여과 단계에 별도로 종속되었고, 그 뒤에 배지에 첨가되었다. 배지 투명도의 가시 분석을 수행하였고(데이터 보여지지 않음), MSC 성장 속도를 모니터하였다.

FFP 제조의 개선

TK 제조 방법은 바뀌지 않은 것으로 유지하였다. FFP 제조는 하기와 같이 달랐다:

1. FFP 4000 x g

2. FFP 4000 x g+100 μm

3. FFP 100 μm

4. FFP 40 μm

5. FFP 40 μm+0.22 μm

6. FFP 40 μm+0.45 μm

배지를 제조하였고, MSC를 12일 동안 배양하였다. 배지 시료 4, 5 및 6에서 자란 세포는 4일 후에 85% 컨플루언시(confluency)를 달성하였고, 재-계대(re-passaged)하였다. 트립신처리(trypsination) 후에 MSC를 계산하였고, 성장속도를 추정하였다(도 7-9).

TK 제조의 개선

기존 방식으로 제조된 TK 및 0.45 μm 필터를 통하여 부가적으로 통과된 TK간의 MSC 비교를 수행하였다. FFP의 제조는 하기에 나타낸 것과 같이 다르다. 이러한 배지에서 배양된 MSC의 배가 시간을 평가하였고, 현미경 분석을 수행하였다(도 10-12).

더 작은 구멍 또는 다른 필터의 조합(8 μm, 0.8 μm 및 0.2 μm)를 통한 TK 여과의 효과를 시험하였다. 상기 시험된 조합 중 어느 것도 상기 세포 성장 속도를 유의적으로 바꾸지 않았다(데이터 보여지지 않음). 하지만, 상기 결과 배지는, 특히 0.8 μm 및 0.2 μm 필터를 사용하였을 때, 거시적으로 입자가 없었고, 보다 투명하였다. 침전된 혈소판의 부재 때문에, 더 적은 집합체(aggregation)를 표준 배지와 비교하여 여과된 배지에서 자란 세포의 트립신 처리 후에 관찰하였다.

또한, 상기 여과의 효과는 CD41⁺세포의 유동세포 분석법(flow cytometry)으로 모니터될 수 있다. 여과되지 않은 TK에서, 상기 유지된 혈소판 막(membranes)은 CD41⁺신호를 야기한 MSC를 고정시키는 능력을 가진다. 상기 신호는 작은 구멍을 이용한 여과 단계로 대부분이 제거된다.

도 13에 이것의 실시예가 제시된다. 다른 여과 단계를 TK 또는 FFP 각각 또는 둘 다로 수행하였다(도 13, A-C). 그 뒤에, 상기 결과 배지를 여과하였다(도 13, D). 모든 연구된 배지 차이는 충분히 세포 성장을 지지하는 것을 알려주었다(데이터 보여 지지 않음). 모든 시험에서, 상기 대조군(control)은 부가적인 여과 단계가 없이 제조된 상기 표준 Bio-1이었다.

0.8 μm 및 0.2 μm 구멍을 통한 TK 여과, 단독 또는 FFP 여과 단계와 조합은 결과적으로 상기 CD41⁺신호의 유의적인 감소를 야기하였다(도 13A 및 C). 또한, 상기 0.8 μm 및 0.2 μm를 통한 TK 그 후의 여과가 0.2 μm 구멍 단독을 통한 여과 보다 더 많은 표명된 CD41⁺ 감소를 야기하기 때문에(도 13C, 2 및 4를 비교), 이러한 영향의 수준은 여과의 효과에 의한 것으로 보여진다. 이것은 도 13 D 에 제시된 결과에 의해 뒷받침된다. 8 μm를 통한 여과는 CD41⁺신호의 유의적인 감소를 유도하지 않았고, 전적으로 더 큰 크기인 입자를 제거하는 것을 제공하였고, 따라서, 더 작은 구멍을 통한 그 후의 여과를 가능하게 한다. 예상대로, 상기 FFP의 여과는 CD41⁺ 신호에 대하여 어떤 다른 차이를 나타내지 않았다.

추가적인 최적화: 변형된 FFP 제조

하기 단계의 목적은 FFP로부터 응고 인자(coagulating factors)를 제거하고, 배지의 최종 응고 및 세포의 집합 및 혈소판 용해물 잔여물의 침강을 예방하는 것이다. 이러한 목적을 위해, FFP는 < -35 °C에서 동결되고, 5 ± 3 °C에서 하룻밤 해동된다. 이러한 단계를 뒤이어 상기 FFP의 원심분리를 4000 x g 에서 10 분 동안 1회 이상 반복하였다. 상기 상청액(한랭형침강물(cryoprecipitate)이 없는 FFP)를 Bio-1 제조에 사용하였다. 표준 Bio-1 및 한랭형침강물이 없는 FFP에서 자란 MSC 비교를 도 14에 제시하였다. 연구된 배지 차이 둘 다와 상기 한랭형침강물이 없는 FFP에서 자란 약간 개선된 세포에서 달성된 상기 배가 시간을 비교하였다. 이러한 배지는 사실상 추가적인 FFP 여과가 필요 없도록 오염 입자가 없었다.

Bio -1 배지 보충물의 하기 제조와 FFP 에서 상기 혈소판 펠렛(pellet)의 재구성

상기에 기재된 혈장안의 혈액형 항원 및 동종응집소(isoagglutinin)에 대하여 혈액형 호환성(compatibility)의 최대치를 달성하고, 상기 배지 조성물 사이의 어떤 임의의 비호환성(incompatibilities)을 제거하기 위하여, TK 제조에서 부가적인 단계를 일부 경우에 필요로 할 수 있다. 이것은 상기 혈소판 농축물이 동종 응집소를 함우하는 자가유래 혈장에서 수집될 경우 역할을 수행할 수 있다. 상기 FFP의 동종응집소 및 혈소판 농축물의 혈장에 대한 호환성은 고려되야 한다.

이것을 위해, 상기 혈소판은 자가유래 세척된 혈소판에 대하여 2000 x g 에서 10’동안 또는 5000 x g 에서 6’ 동안 원심분리하여 수집될 수 있다. 상기 펠렛을 수집하고, FFP(표준, 여과 또는 한랭형침강물이 없는)에서 재구성하였으며, -20 °C에서 동결하였다. 하기 제조 단계는 TK에 대해 상기에 기재된 것과 같이 수행될 수 있다.

상기 보충물은 기본 배지(DMEM 또는 α-MEM과 같은)에 첨가될 수 있다. 상기 보충물 및 상기 기본 배지에 첨가된 양의 최종 부피는 원하는 최종 조성물에 따라 조절될 수 있다. 예를 들면, 만약, 최적 세포 성장에 대하여 5% 혈소판 농축물 및 5% FFP로 선택한다면, 혈소판 200 ml은 작은 부피에서 원심분리된 후에 수집되고, FFP 200 ml에 재부유될 수 있다.

하기 사실은 본 발명에 나타낸 상기 FFP 및 TK 양에 대하여 언급된다. Bio-1 1 l안의 1% FFP는 응고성의 활성있는 인간 혈장의 8.0-10.0 ml에 해당한다. 상기 혈소판 용해물에 관하여, 상기 생산물의 혈소판 최종 농도 및 Bio-1에서 백분율은 사용된 혈소판 제조 방법에 따른다. (1) 성분채집 유래 TK (Apceth): TK-용해물 1ml은 혈소판의 6.5 x 10⁸- 4.5 x 10⁹에 해당한다. 따라서, 1% TK를 가지는 Bio-1의 1 l은 혈소판 6.5 x 10⁸- 4.5 x 10¹⁰에 대하여 동일한 용해물 양을 함유한다. Bio-1에 대하여 사용된 혈소판 용해물의 백분율은 상기 초기 재료에서 혈소판 양 및 상기 본 적용(application)에 기재된 vol% 값에 기초하여 계산되어야 한다. (2) 전체 혈액 유래 혈소판 용해물: 50-60 ml 현탁액에 45 - 90 x 10⁹혈소판이 있다.

Claims

하기를 포함하는, 인간 CD34^-줄기 세포의 증식을 제한하고 그 결과 증식된 CD34^-줄기 세포가 분화 능력을 유지하는, 세포 성장 배지:
(a) 상기 세포 성장 배지의 전체 부피 중 2% 내지 15%를 구성하는, 0.22 μm 직경보다 더 큰 고체(solid matter)가 없는 인간 혈소판 용해물;
(b) 상기 세포 성장 배지의 전체 부피 중 1% 내지 10%를 구성하는, 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 신선동결혈장(fresh frozen plasma, FFP) 여과액(filtrate);
(c) 세포 성장 배지의 0 U/ml 내지 10 U/ml의 농도의 헤파린(heparin);
(d) 0.5 mM 내지 10 mM의 농도의 L-글루타민(L-glutamine); 및
(e) 세포 성장 배지의 전체 부피 중 75% 내지 97%를 구성하고, (d) 부분의 L-글루타민을 포함할 수 있는, 포유류 세포 성장에 적합한 무혈청, 저글루코스 배지(low glucose medium).
제 1항에 있어서, (a) 부분의 상기 혈소판 용해물은 하기 단계에 따라 제조되는 세포 성장 배지:
(i) 인간 혈소판 농축물을 동결함으로써 상기 혈소판을 그 안에 용해하는 단계;
(ii) 상기 결과 용해된 혈소판을 해동하는(thawing) 단계;
(iii) 그 안에 펠렛(pellet) 고체에 적합한 속도 및 기간 동안 상기 해동된 용해 혈소판을 원심분리하는 단계;
(iv) 그 안에 펠렛 고체에 적합한 속도 및 기간 동안 단계 (iii) 유래 상기 상청액(supernatant)을 재-원심분리하는 단계; 및
(v) 단계 (iv)의 상기 상청액을, 첫 번째 여과는 적어도 5 μm의 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하고, 마지막 여과는 0.22 μm보다 더 크지 않은 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하는, 감소하는 구멍 크기의 필터를 이용하여 적어도 2회 여과하는 단계.
제 2항에 있어서, 단계 (i)의 상기 인간 혈소판 농축물은 혈소판을 원심분리함으로써 그들을 펠렛팅(pelleting)하고; 상기 액체상으로부터 상기 펠렛화된 혈소판을 분리하며; FFP 안에 상기 결과 혈소판을 재구성함에 의해 제조되는 세포 성장 배지.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, (b) 부분의 상기 FFP 여과액은 인간 FFP를 해동하고; 상기 이의 액체 및 고체 부분을 분리하는 것에 적합한 속도에서 및 기간 동안 상기 결과 해동된 FFP를 원심분리하고; 상기 결과 액체 부분을, 첫 번째 여과는 적어도 5 μm의 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행되고, 마지막 여과는 0.22 μm 보다 더 크지 않은 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행되는, 감소하는 구멍 크기의 필터를 이용하여 적어도 2회 여과에 의해 제조되는 세포 성장 배지.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, (b) 부분의 상기 FFP 여과액은 (i) 인간 FFP를 해동하고; (ii) 상기 해동된 인간 FFP를 동결하고; (iii) 상기 이의 액체 및 고체 부분을 분리하기에 적합한 속도에서 및 기간 동안 상기 결과 해동된 FFP를 원심분리함에 의해 제조되는 세포 성장 배지.
제 5항에 있어서, 단계 (iii)으로부터 상기 해동된 FFP는 동결되고, 원심분리 단계 (iv) 전에 다시 적어도 한번 해동되는 것인 세포 성장 배지.
제 5 항 또는 제 6항에 있어서, 단계 (iv)의 결과로 야기된 상기 액체 부분의 여과는 생략되는 세포 성장 배지.
제 1 항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 성장 배지는 동물 혈청이 없는 세포 성장 배지.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈소판 용해물 및 FFP 여과액은 혈액형 항원 ABO 및 Rh에 대하여 부합하는 것인 세포 성장 배지.
하기로 구성된, 세포 성장 배지 보충물로서:
(a) 상기 세포 성장 배지 보충물의 전체 부피의 17% 내지 94%를 구성하는0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 혈소판 용해물; 및
(b) 상기 세포 성장 배지 첨가물의 전체 부피의 6% 부터 83%까지를 구성하는, 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 FFP 여과액;
여기서, (i) 상기 세포 성장 배지 보충물의 부피로 3% 내지 25%, (ii) 0 U/ml 부터 10 U/ml까지의 농도에서 헤파린, 및 (iii) 0.5 mM 부터 10 mM까지의 농도에서 L-글루타민을 포함하는 세포 성장 배지를 형성하기 위하여, 상기 세포 성장 배지 첨가물이 헤파린 및 포유류 세포 성장에 적합한 L-글루타민을 포함하고, 무혈청, 저글루코스 배지로 조합되는 경우, 상기 결과 세포 성장 배지는 상기 인간 CD34^-줄기 세포의 증식을 제한하고, 상기 결과 증식된 CD34^-줄기세포는 분화 능력을 유지하는 것인 세포 성장 배지 보충물.
제 10항에 있어서, 상기 세포 성장 배지 보충물의 부피의 3% 내지 25%를 함유하고, 헤파린 0 U/ml 부터 10 U/ml까지를 가지는 세포 성장 배지를 형성하기 위하여, 상기 세포 성장 배지 보충물이 포유류 세포 성장에 적합한 L-글루타민을 포함하고, 무혈청, 저글루코스 배지로 조합될 경우, 상기 결과 세포 성장 배지는 인간 CD34^-줄기세포의 증식을 제한하고, 상기 결과 증식된 CD34^-줄기세포는 분화 능력을 유지하는 것인 세포 성장 배지 보충물.
제 10항 및 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 부분의 상기 혈소판 용해물은 하기 단계에 따라 제조되는 것인 세포 성장 배지 보충물:
(i) 혈소판 농축물을 동결함으로써 상기 혈소판을 그 안에 용해하는 단계;
(ii) 상기 결과 용해된 혈소판을 해동하는(thawing) 단계;
(iii) 그 안에 펠렛(pellet) 고체에 적합한 속도 및 기간 동안 상기 해동된 용해 혈소판을 원심분리 하는 단계;
(iv) 그 안에 펠렛 고체에 적합한 속도 및 기간 동안 단계 (iii)의 상기 상청액(supernatant)을 재-원심분리하는 단계; 및
(v) 단계 (iv)의 상기 상청액을, 첫 번째 여과는 적어도 5 μm의 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하고, 마지막 여과는 0.22 μm보다 더 크지 않은 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하는, 감소하는 구멍 크기의 필터를 이용하여 적어도 2회 여과하는 단계.
제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (b) 부분의 FFP 여과액은 하기 단계에 따라 제조되는 것인 세포 성장 배지 보충물:
(i) 인간 FFP를 해동하는 단계;
(ii) 상기 이의 액체 및 고체 부분을 분리하기에 적합한 속도에서 및 기간 동안 상기 결과 해동된 FFP를 원심분리하는 단계;및
(iii) 상기 결과 액체 부분을, 첫 번째 여과는 적어도 5 μm의 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하고, 마지막 여과는 0.22 μm보다 더 크지 않은 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하는, 감소하는 구멍 크기의 필터를 이용하여 적어도 2회 여과하는 단계.
제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 성장 배지 보충물은 동물 혈청이 없는 것인 세포 성장 배지 보충물.
제 10항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈소판 용해물 및 FFP 여과액은 혈액형 항원 ABO 및 Rh에 대하여 부합하는 것인 세포 성장 배지 보충물.
하기 단계에 따라 제조된, 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 혈소판 용해물:
(i) 인간 혈소판 농출물을 농축함으로써 그 안에 상기 혈소판을 용해하는 단계;
(ii) 상기 결과 용해된 혈소판을 해동하는 단계;
(iii) 그 안에 펠렛(pellet) 고체에 적합한 시간에서 및 기간 동안 해동된 용해 혈소판을 원심분리하는 단계;
(iv) 단계 (iii)로부터 상기 상청액을 그 안에 펠렛 고체에 적합한 속도에서 및 기간 동안 재-원심분리하는 단계; 및
(v) 단계 (iv)로부터 상기 상청액을, 첫 번째 여과는 적어도 5 μm의 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하고, 마지막 여과는 0.22 μm보다 더 크지 않은 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하는, 감소하는 구멍 크기의 필터를 이용하여 적어도 2회 여과하는 단계.
하기 단계에 따라 제조된, 0.22 μm 직경보다 더 큰 고체가 없는 인간 신선동결혈장(fresh frozen plasma, FFP) 여과액:
(i) 인간 FFP를 해동하는 단계;
(ii) 상기 이의 액체 및 고체 부분을 분리하기에 적합한 속도에서 및 기간 동안 상기 결과 해동된 FFP를 원심분리하는 단계;및
(v) 상기 상청액을, 첫 번째 여과는 적어도 5 μm의 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하고, 마지막 여과는 0.22 μm보다 더 크지 않은 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하는, 감소하는 구멍 크기의 필터를 이용하여 적어도 2회 여과하는 단계.
분리된 구획에 하기를 포함하는, 인간 CD34^-줄기 세포 증식에 사용을 위한 키트(kit)로서:
(a) 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 혈소판 용해물, 및
(b) 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 신선동결혈장(human fresh frozen plasma, FFP) 여과액,
여기서, (i) 상기 용해물은 (a) 및 (b)의 조합된 부피 중 17% 부터 94%까지를 구성하고, (ii) 상기 FFP 여과액은 (a) 및 (b)의 조합된 부피 중 6% 부터 83%까지를 구성하며, (iii) (i) 상기 키트의 내용물은 배지 부피의 3% 내지 25%를 구성하고, (ii) 헤파린은 0 U/ml 부터 10 U/ml까지의 농도인 세포 성장 배지를 형성하기 위하여, 상기 용해물 및 여과액은 헤파린 및 포유류 세포 성장에 적합한 L-글루타민을 포함하고, 무혈청, 저글루코스 배지로 조합될 경우, 상기 결과 세포 성장 배지는 인간 CD34^-줄기 세포의 증식을 제한하고, 상기 결과 증식된 CD34^-줄기 세포는 분화 능력을 유지하는 것인 인간 CD34^-줄기 세포 증식에 사용을 위한 키트.
분리된 구획에 하기를 포함하는, 제 18항의 키트로서:
(a) 0.22 μm 직경보다 더 큰 고체가 없는 인간 혈소판 용해물,
(b) 0.22 μm 직경보다 더 큰 고체가 없는 인간 신선동결혈장(human fresh frozen plasma, FFP) 여과액, 및
(c) 헤파린,
여기서, (i) 상기 용해물은 (a) 내지 (c)의 상기 조합된 부피 중 17% 부터 94%까지를 구성하고, (ii) 상기 FFP 여과액은 a) 내지 (c)의 상기 조합된 부피 중 6% 부터 83%까지를 구성하고, 및 (iii) (i) 상기 키트의 내용물이 부피로 배지 중 3% 내지 25%를 구성하고, (ii) 헤파린은 0 U/ml 부터 10 U/ml까지의 농도인 세포 성장 배지를 형성하기 위하여, 상기 용해물, 여과액 및 헤파린이, 포유류 세포 성장에 적합한L-글루타민을 포함하고, 무혈청, 저글루코스 배지에 조합될 경우, 상기 결과 세포 성장 배지는 인간 CD34^-줄기 세포의 증식을 제한하고, 상기 결과 증식된 CD34^-줄기 세포는 분화 능력을 유지하는 것인 제 18항의 키트.
(a) 인간 CD34^-줄기 세포 및 (b) 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 상기 세포 성장 배지를 포함하는 물질의 조성물.
하기 단계를 포함하는 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 혈소판 용해물 제조를 위한 방법:
(i) 혈소판 농축물을 동결함으로써 상기 혈소판을 그 안에 용해하는 단계;
(ii) 상기 결과 용해된 혈소판을 해동하는(thawing) 단계;
(iii) 그 안에 펠렛(pellet) 고체에 적합한 속도 및 기간 동안 상기 해동된 용해 혈소판을 원심분리하는 단계;
(iv) 그 안에 펠렛 고체에 적합한 속도 및 기간 동안 단계 (iii)의 상기 상청액(supernatant)을 재-원심분리하는 단계; 및
(v) 단계 (iv)의 상기 상청액을, 첫 번째 여과는 적어도 5 μm의 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하고, 마지막 여과는 0.22 μm보다 더 크지 않은 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하는, 감소하는 구멍 크기의 필터를 이용하여 적어도 2회 여과하는 단계.
하기 단계를 포함하는, 0.22 μm 직경 보다 큰 고체가 없는 인간 신선동결혈장(human fresh frozen plasma, FFP) 여과액을 제조하는 방법:
(i) 인간 FFP를 해동하는 단계;
(ii) 상기 이의 액체 및 고체 부분을 분리하기에 적합한 속도에서 및 기간 동안 상기 결과 해동된 FFP를 원심분리하는 단계;및
(iii) 상기 결과 액체 부분을, 첫 번째 여과는 적어도 5 μm의 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하고, 마지막 여과는 0.22 μm보다 더 크지 않은 구멍을 가지는 필터를 이용하여 수행하는, 감소하는 구멍 크기의 필터를 이용하여 적어도 2회 여과하는 단계.
하기를 조합하는 단계를 포함하는, 인간 CD34^-줄기 세포의 증식을 제한하고, 상기 결과 증식된 CD34^-줄기 세포는 분화 능력을 유지하는 것인 세포 성장 배지를 제조하기 위한 방법:
(a) 상기 세포 성장 배지 중 전체 부피의 2% 부터 15%까지를 구성하는, 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 혈소판 용해물;
(b) 상기 세포 성장 배지 중 전체 부피의 1% 부터 10%까지를 구성하는, 0.22 μm 직경 보다 더 큰 고체가 없는 인간 신선동결혈장 여과액;
(c) 상기 세포 성장 배지 중 0 U/ml 부터 10 U/ml까지의 농도를 산출하기에 충분한 양의 헤파린;
(d) 0.5 mM 부터 10 mM 까지의 농도를 산출하기에 충분한 양의 L-글루타민; 및
(e) 상기 세포 성장 배지의 전체 부피 중 75% 부터 97%까지를 구성하고 (d) 부분의 L-글루타민을 함유할 수 있는, 포유류 세포 성장에 적합한 무혈청, 저글루코스 배지.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 배지에서 적합한 온도로 상기 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 인간 CD34^-줄기세포의 집단(population)을 증식하는 방법.
(i) 분화 능력을 가지고, (ii) 인간 CD34^-줄기세포의 집단의 증식으로서, 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 배지에서 적합한 온도로 줄기세포 집단을 배양하는 것을 포함하는 증식의 결과로 야기된 인간 CD34^-줄기세포.
(i) 분화 능력을 가지고, (ii) 인간 CD34^- 줄기세포의 집단의 증식으로서, 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 배지에서 적합한 온도로 줄기세포 집단을 배양하는 것을 포함하는 증식의 결과로 야기된 인간 CD34^- 줄기세포 집단.