KR20120109461A - 화학물질의 독성 예측 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발생 경로에 대한 화학물질의 영향을 예측하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 발생 경로에 대한 화학물질의 독성을 예측하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법 및 키트는 인간 태아 발생 동안 세포 바이오맵 (biomap) 또는 발생 경로의 변화를 예측하기 위해 사용될 수 있다.

Description

화학물질의 독성 예측 방법{METHODS FOR PREDICTING THE TOXICITY OF A CHEMICAL}

본 발명은 세포 생물학, 독성학 및 약물 스크리닝 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 발생 경로에 대한 화학물질의 독성을 예측하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 화학물질에 의한 손상 후에 인간 세포/조직 또는 태아 발생에 대한 정보를 제공하기 위해 설계된 방법을 설명한다. 이것은 생체내 세포/조직 발생을 모방하는 수단으로서 공지의 자극에 반응하는 인간 줄기 세포주의 시험관내 분화를 이용한다. 추가의 실시양태는 i) 넓은 범위의 세포/조직 마커의 사용, 및 ii) 초기 및 후기 세포/조직 마커의 사용을 포함한다. 이들은 조합되어 어느 발생 경로가 어느 시기에 붕괴되는지를 나타낼 수 있다.

전구 세포 분화 동안 세포는 화학물질, 약물, 화장품 또는 기형 유발 물질 (teratogen)에 노출되고, 발생 과정에 대한 효과는 분화 정도를 모니터링함으로써 평가될 것이다. 실제로, 수터 (Suter) (Current Opinion in Chemical Biology, 2006, 10, 362-366)는 제약 안전성 평가를 위한 표준물 (비-줄기 세포) 시험관내 시험의 예측 값 및 한계를 설명하였다. 현재 실시되는 많은 시험은 기존 방법의 특이성이 결여되기 때문에 중대한 결점이 있다. 실제로, 많은 기존 방법은 시간 소모적이고, 정보가 풍부하지 않고, 비싸고, 종종 매우 많은 실험 동물의 사용을 필요로 한다. 따라서, 다량의 데이타/정보를 생성하는 인간 발생 독성 방안의 사용은 소비자 및 환자의 안전성을 해치지 않으면서 시험 동물의 수와 비용을 감소시킬 가능성이 있는, 전통적인 방법에 대한 매력적인 대안이다.

최근 발표된 문헌은 발생 중의 태아에 대한 화학물질의 효과에 대해 집중되고 있다. 모든 정상 출산의 ~5%가 발생 및 행동적 결함을 갖는 것으로 추정되고, 이중 많은 결함은 화학물질에 의한 손상으로 인한 것이다. 또한, EU는 REACH (Registration, Evaluation and Authorization of Chemicals)로 불리는 새로운 화합물 규제 법안을 제정하였고 (2007), 이는 지금까지 실시된 가장 복합적이고 포괄적인 규제 노력이 될 것이다. 상기 법률에서 생식 및 발생 독성학에 대한 요건이 매우 중요한데, 그 이유는 이들이 실험 동물에 대한 재원 및 수요에 대한 높은 요구사항을 제시하기 때문이다. 또한, 생식 및 발생에 대한 고려사항은 현재 널리 사용되고 있는 많은 물질에 대한 제한을 제시할 수 있다. REACH가 실험 동물 연구에 대한 엄격한 요건을 부과하지만, 이 법안은 척추동물의 사용을 제지하고, 따라서 실험은 다른 방법을 고려할 필요가 있다. 많은 확립된 다른 동물 방법은 종종 문제를 야기하고, 따라서, 인간 태아 및/또는 생식 발생에 대한 화학물질에 의한 손상의 결과를 정확하게 예측할 수 있는 보다 우수하고 개선된 실험 방법에 대한 큰 필요성이 존재한다. 따라서, 인간 발생에 대한 화학물질의 잠재적인 독성 효과를 평가하기 위한 새로운 세포 기반 방법의 도입 및 확인에 대한 필요성이 존재한다.

줄기 세포

인간 발생 동안, 독성 손상에 가장 취약한 조직은 신경계, 간, 신장, 폐, 피부 등을 포함하고, 따라서 세포/조직 특이적 마커와 조합하여 전구 세포주를 사용하는 분석은 특정 화합물의 독성 여부뿐만 아니라 영향받는 세포/조직의 확인을 도울 것이다. 또한, 본원 명세서에서 설명되는 방법은 초기 & 후기 세포 분화 마커 (예를 들어, Nkx2.5 및 αMHC는 각각 초기 및 후기 심장 마커이다)를 식별하는 능력을 갖는다는 점에서 추가의 실행가능한 특징을 갖는다.

배아 줄기 (ES) 세포는 예를 들어 뉴런 세포로 분화될 수 있다. 분화시에, 배아 줄기 세포 마커의 발현 수준 및 분화된 세포 마커의 발현 수준은 정량될 수 있다. 여기서, 배아 줄기 세포 분화가 태아/세포 발생을 반영하기 위한 수단으로서 사용된다 (예를 들어, 도 1 참조).

화학물질에 의한 손상에 대해, 발현 수준이 붕괴된 마커의 확인은 어느 세포 발생 경로가 영향받는지의 확인을 용이하게 한다. 또한, 초기 및 후기 세포 마커 둘 모두의 정량에 의해 임의의 특정 세포 종류의 발생에 대한 보다 심층적인 조사를 수행할 수 있다 (예를 들어, 각각 초기 및 후기 마커 olig2 및 MOG를 사용한 희소돌기아교세포). 따라서, 모든 특이적 세포 마커의 정량은 전체 세포 발생/분화 경로의 조사를 용이하게 할 것이다. 따라서, 본원에서 설명되는 본 발명은 예를 들어 태아 발생에 대한 독성 프로필 또는 독성 바이오맵을 작성하기 위해 사용될 수 있다.

줄기 세포는 모두는 아니지만 대부분의 다세포 유기체에서 발견되는 세포이다. 이 세포는 유사 세포분열을 통한 자체 재생 및 다양한 범위의 특수 세포 종류로의 분화 능력이라는 특징을 갖는다. 다음과 같은 2개의 넓은 종류의 포유동물 줄기 세포가 존재한다: 포배의 내세포괴로부터 단리된 배아 줄기 세포, 및 성인 조직에서 발견되는 성체 줄기 세포. 발생하는 배아에서, 줄기 세포는 모든 특수 배아 조직으로 분화할 수 있다. 성인 유기체에서, 줄기 세포 및 전구 세포는 신체에 대한 복구 시스템으로서, 특수 세포의 보충을 위해 작용할 뿐만 아니라 재생 장기, 예를 들어 혈액, 피부 또는 내장 조직의 정상적인 교체를 유지한다. 줄기 세포는 이제 성장하고, 세포 배양을 통해 다양한 조직, 예를 들어 근육 또는 신경의 세포와 일치하는 특성을 갖는 특수 세포로 형질전환될 수 있다. 성체 줄기 세포는 발생상 관련되지 않은 세포 종류, 예를 들어 신경세포로, 혈액세포로 분화할 수 있다. 내인성 및 외인성 신호 둘 모두는 줄기 세포 운명을 조절하고, 상기 신호의 일부가 확인되었다 (Watt & Hogan, Science 2000, 287, 1427-1430).

제대혈 및 골수를 포함하는 다양한 공급원으로부터의 성체 줄기 세포는 통상적으로 의료 요법에 사용된다. 배아 줄기 세포 (ES 세포)는 포배로서 알려진 초기 단계 배아의 내세포괴로부터 유래된 줄기 세포이다. 인간 배아는 수정 4-5일 후에 포배기에 도달하고, 이때 이들은 50-150개의 세포로 구성된다. 배아 줄기 (ES) 세포는 분화다능성 (pluripotent)이다. 이것은 이들 세포가 3개의 일차 배엽, 즉 외배엽, 내배엽, 및 중배엽의 모든 유도체로 분화할 수 있음을 의미한다. 이들은 성체에서 220개 초과의 각각의 세포 종류를 포함한다. 분화다능성은 성인에서 발견되는, 단지 한정된 수의 세포 종류만을 형성하는 다능성 (multipotent) 전구 세포로부터 ES 세포를 구분한다. 분화를 위한 자극이 제시되지 않을 때 (즉, 시험관 내에서 성장할 때), ES 세포는 다중 세포분열을 통해 분화다능성을 유지한다. 분화다능성 성체 줄기 세포의 존재는 여전히 과학적 논쟁의 대상이지만; 연구는 분화다능성 줄기 세포가 성인 섬유모세포 배양물로부터 직접 생성될 수 있음을 입증하였다. 그의 가소성 및 잠재적으로 무제한의 자가-재생 능력 때문에, ES 세포 요법은 재생 의약 및 손상 또는 질병 후의 조직 대체를 위해 제안되었다. 그러나, 지금까지, 어떠한 승인된 의학적 치료제도 배아 줄기 세포 연구로부터 유래되지 않았다. 지금까지는 성체 줄기 세포 및 제대혈 줄기 세포가 임의의 질병을 성공적으로 치료하기 위해 사용된 유일한 줄기 세포이었다.

상기 비-배아 줄기 세포에 의해 치료되는 질병은 많은 혈액 및 면역계 관련 유전 질병, 암, 및 질환; 연소성 당뇨; 파킨슨 (Parkinson) 병; 실명 및 척수 손상을 포함한다. 줄기 세포 요법에 관한 하나의 기술적인 문제는 동종이형 (allogeneic) 줄기 세포 이식과 연관된 이식편 대 숙주 질병이다. 그러나, 조직적합성과 연관된 상기 문제는 자가 공여자 성체 줄기 세포를 사용하거나 치료적 클로닝을 통해 해결될 수 있다. 줄기 세포의 실제적인 정의는 기능적 정의, 즉 생애에 걸쳐 조직을 재생시키는 능력을 갖는 세포이다. 예를 들어, 골수 또는 조혈 줄기 세포 (HSC)에 대한 절대적 표준 시험은 하나의 세포를 이식하고 HSC가 없는 개체를 구하는 능력에 대한 것이다. 이 경우에, 줄기 세포는 효능을 보이는 새로운 혈액세포 및 면역 세포를 장기간에 걸쳐 생산할 수 있어야 한다. 또한, 이식된 개체로부터 줄기 세포를 단리하는 것이 가능하여야 하고, 줄기 세포는 그 자체가 HSC가 없는 또 다른 개체 내로 이식될 수 있고, 이것은 줄기 세포가 자가재생할 수 있음을 입증한다. 줄기 세포의 특성은 클론원성 (clonogenic) 분석과 같은 방법을 사용하여 시험관 내에서 입증될 수 있고, 여기서 단일 세포는 분화하고 자가재생하는 그 능력을 특징으로 한다. 또한, 줄기 세포는 특유한 세트의 세포 표면 마커를 기초로 하여 단리될 수 있다.

선행 기술

줄기 세포에 관한 많은 공개된 특허 및 특허 출원이 존재하고, 허용될 경우 아래에서 제시되는 특허 등의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

US5843780 및 US6200806 (위스콘신 얼럼나이 리써치 파운데이션 (Wisconsin Alumni Research Foundation))에서는 영장류 배아 줄기 세포를 단리하기 위한 방법을 기술하고 있다.

WO2007/120699 (위스콘신 얼럼나이 리써치 파운데이션)에는 발생 독성을 예측할 수 있는 저분자량 세포 대사체 (10-1500 달톤)의 생체마커 (biomarker) 프로필 및 인간 배아 줄기 세포를 사용하여 제약 작용제, 선도 및 후보 약물 화합물 및 다른 화학물질을 포함하는 화학적 화합물을 스크리닝하는 방법이 기재되어 있다.

문헌 [Stummann et al., (2009) Toxicology 257 (3) 117-126]에는 뉴런 세포로의 배아 줄기 세포를 사용하여 메틸수은의 배아 독성 위험 평가가 기재되어 있다. 이 논문은 발생 독성 화합물에 대한, 특히 메틸수은 배아 독성의 시험관내 예측을 개선하기 위한 도구로서 배아 줄기 세포 시험을 설명하고 있다. 스터만 (Stummann) 등은 3가지 종료점 (end-point), 즉, 세포독성 분석, RT-PCR 및 면역조직화학을 기초로 한 예측 모델을 설명하였다.

WO2007/063316 (플라스티셀 (Plasticell))은 (a) 제1 세포 종류의 세포를 제공하며, 여기서 제1 세포 종류는 제1 세포 종류를 2 이상의 반응 조건에 순차적으로 노출시킴으로써 전구 세포를 통해 제2 세포 종류로 분화될 수 있는 것인 단계; (b) 전구 세포가 노출된 2 이상의 반응 조건 중의 적어도 하나에 잠재적인 조정자를 포함하는 하나 이상의 상이한 반응 조건을 추가하거나 반응 조건 중의 적어도 하나를 하나 이상의 상이한 반응 조건으로 교체하는 단계; (c) 제2 세포 종류의 형성을 결정하기 위해서 제1 세포 종류의 분화를 모니터링하는 단계를 포함하는, 세포 신호전달 경로의 잠재적인 조정자를 확인하기 위한 방법을 개시하고 있다.

문헌 [Buesen et al., 2009, Toxicological Sciences, 108, (2) 389-400]은 단일 샘플로부터 단지 하나의 생체마커 (세포독성)의 측정에 대해 설명하고 있다.

WO 2004/013316 (유니버시티 오브 더럼 (University of Durham))은 포유동물 분화다능성 줄기 세포의 마커를 발현하는 개개의 세포를 인식하고 결합하는 일정량의 태그 (여기서, 태그는 회수 수단을 포함함)에 불균일한 세포 집단을 노출하는 것을 포함하는, 세포 집단으로부터 단리된 개개의 포유동물 분화다능성 줄기 세포로부터 유래된 클로날 (clonal) 분화다능성 줄기 세포의 하나 이상의 조성물을 제조하는 방법을 개시하고 있다.

WO2007/002568 (게론 코퍼레이션)에는 시험관 내에서 배양된 세포 집단에서 표적 조직 종류에 대한 약리적 효과의 신속한 결정을 위한 시스템이 기재되어 있다. 세포는 스크리닝되는 작용제에 의해 유발되는 독성학적 또는 대사적 변화를 반영하는 프로모터-리포터 구성체를 함유한다.

US7041438 (게론 코퍼레이션)에는 피더 (feeder) 세포의 부재 하에 영장류 분화다능성 줄기 세포의 배양을 위한 개선된 시스템이 개시되어 있다.

US2006/0275816 (헨더슨 & 치텀 (Henderson & Cheatham))은 생체마커를 이용하여 약리학 및 독성학의 메카니즘을 확인할 수 있는 미세어레이 및 세포 기반 스크리닝 전략을 기재하고 있다.

US2004/0254736 (미켈슨 & 뱅스 (Michelson & Bangs))에는 컴퓨터 모델링 및 생물학적 과정을 사용하여 생물학적 시스템에서 잠재적인 독성을 확인하기 위한 방법 및 장치가 개시되어 있다.

US2002/0192671 (캐슬 & 엘라쇼프 (Castle & Elashoff))에서는 적어도 2개의 유전자를 물질에 노출시키고, 대비 분석을 사용하여 각각의 유전자에 대해 물질에 대한 반응의 차이를 분석하고, 유전자 세트 내의 각각의 유전자에 대해 요약 스코어를 작성하고, 요약 스코어에 대한 로지스틱 회귀 분석 (logistic regression analysis)을 수행하고, 물질의 독성에 대한 예측 모델을 제공하기 위해 로지스틱 회귀 분석의 결과를 사용하는 것을 포함하는, 물질의 독성을 평가하기 위한 방법을 기술한다.

US7354730 (헤모게닉스, 인크 (HemoGenix, Inc))에는 조혈 줄기 및 전구 세포 증식의 고효율 (high-throughput) 분석이 개시되어 있다.

US7202081 (호프만 라 로슈 (Hoffmann La Roche))에서는 시험 시스템으로서 증식하는 포유동물 세포 샘플을 사용하는, 물질의 세포 증식 억제 활성 및 세포 독성 (세포 사멸의 유도)의 동시 결정 방법에 대해 기재되어 있다.

US6998249 (파마시아 앤 업존 (Pharmacia & Upjohn))에서는 주어진 화합물의 생체내 독성을 예측하기 위한 방법을 기술한다. 이 방법은 제시된 표적 세포에서 화학물질의 세포독성의 약 3개의 별개의 파라미터에 대한 정보를 제공하기 위해 적어도 3개의 별개의 분석을 동시에 수행하는 것을 수반하며, 여기서 상기 정보는 생체내 세포독성의 예측에 유용한 것이다. 이 방법에서는 줄기 세포를 수반하는 기술 또는 복합법 (multiplexing)에 대해서는 설명되지 않았다.

US6007993A (인스티투트 푸르 플란젠게네티크 운트 쿨투르플란젠포르슝 (Insitut fur Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung))에는 원시 생식 세포로부터 얻은 배아 생식 (EG) 세포를 사용하여 마우스 및 래트로부터의 분화된 분화다능성 배아 줄기 (ES) 세포를 기초로 한, 배아 발생에 대한 화학적으로 유도된 효과의 검출 및 배아독성/기형 유발원성 스크리닝을 위한 분화에 대한 시험관내 시험 절차가 기재되어 있다. 제안된 시험 절차는 조직-특이적 프로모터 및 리포터 유전자를 함유하는 안정한 트랜스제닉 (transgenic) ES 또는 EG 세포 클론이 선택되고, 조직-특이적 유전자의 분화-의존성 발현이 특정 시간에서 작용하는 배아독성 물질의 존재 하에 ES 세포의 상이한 발생 경로 유도체로의 분화 후에 발생하고; 이어서 배아 발생을 조절하는 조직-특이적 유전자의 화학적으로 유도된 활성화, 억제 또는 조정이 검출되는 것을 특징으로 한다.

US2008/0280300 (플라스티셀)에서는 (a) 제1 세포 종류의 세포를 제공하며, 여기서 제1 세포 종류는 제1 세포 종류를 2 이상의 반응 조건에 순차적으로 노출시킴으로써 전구 세포를 통해 제2 세포 종류로 분화될 수 있는 것인 단계; (b) 전구 세포가 노출된 2 이상의 반응 조건 중의 적어도 하나에 잠재적인 조정자를 포함하는 하나 이상의 상이한 반응 조건을 추가하거나 반응 조건 중의 적어도 하나를 하나 이상의 상이한 반응 조건으로 교체하는 단계; (c) 제2 세포 종류의 형성을 결정하기 위해서 제1 세포 종류의 분화를 모니터링하는 단계를 포함하는, 세포 신호전달 경로의 잠재적인 조정자를 확인하기 위한 방법이 개시되어 있다.

US2008/0248503에서는 림프-조혈 시스템의 독성 및 잔여 증식 및 분화 능력을 예측하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 기술한다.

US2008/0132424에는 증식에 대해 ATP 측정을 사용하는, 인간 포배-유래 줄기 세포 및 전구 세포를 기초로 한 독성 분석이 개시되어 있다.

US2007/0248947 (위스콘신 얼럼나이 리써치 파운데이션)에는 저분자량 세포 대사체의 생체마커 프로필 및 인간 배아 줄기 세포 또는 그로부터 생성되는 계통 (lineage)-특이적 세포를 사용하여 제약 작용제, 선도 및 후보 약물 화합물 및 다른 화학물질을 포함하는 화학적 화합물을 스크리닝하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 상기 화학적 화합물의 독성, 특히 발생 독성을 시험하고 기형 유발원 효과를 검출하기 위한 것이다. US2007/0248947에는 본원에서 설명되는 바와 같은 복합적 (multiplex) 방법 또는 세포 생체마커가 기재되지 않았다.

US 7541185 (사이테라, 인크. (Cythera, Inc.))에는 내배엽 세포 집단 내의 세포를 내장관으로부터 유래되는 조직 및/또는 장기를 형성할 수 있는 세포로 분화시키기 위해 유용한 하나 이상의 분화 인자를 확인하는 방법이 개시되어 있다. US 7510876 (사이테라, 인크)에는 인간 내배엽 세포의 생산을 위한 시험관내 방법이 기재되어 있다.

문헌 [Cezar (Int.J.Pharm. Med, 2006, 20, 107-114)]에서는 질병 및 독성 반응의 시험관내 모델의 생성시에 줄기 세포 기술의 중요한 기회를 검토하였다. 문헌 [O'Brien & Haskins (Methods in Molecular Biology, 2007, 356, 415-425)]에는 인간 독성을 유발하는 화합물의 잠재력을 평가하기 위한 다모수 (multiparametric), 살아있는 세포, 사멸전 (pre-lethal) 세포독성 고함량 스크리닝 분석이 기재되어 있다. 문헌 [Bremer & Hartung (Current Pharmaceutical Design, 2004, 10, 2733-2747)]에서는 국제 맹검 공동 연구에서의 생체내 결과와 비교하여 배아 줄기 세포 시험의 타당성을 검토하였다.

문헌 [Stummann et al., Toxicology 2007 242, 130-43]에는 배아 줄기 세포를 사용한 메틸수은 및 크롬의 배아 독성 위험 평가가 기재되어 있다. 이 논문은 발생 독성 화합물에 대한, 특히 메틸수은 배아 독성의 시험관내 예측을 개선하기 위한 도구로서 배아 줄기 세포 시험을 설명하고 있다. 스터만 등은 3가지 종료점, 즉, 배아 줄기 세포 심장 분화 분석 이외에 마우스 배아 줄기 세포 및 3T3 섬유모세포를 사용한 세포독성 분석을 기초로 한 예측 모델을 설명하였다. 그러나, 상기 문헌은 태아 또는 세포 발생을 반영하는 수단으로서 특정 세포 발생 경로의 초기 또는 후기 분화 생체마커에 대한 톡신 또는 기형 유발 물질의 효과를 설명하지 않았다.

문헌 [Clarke et al. (Regen. Med. 2007, 2, 947-956)]에는 다량의 정보를 제공하기 위해 다양한 조혈 조직으로부터의 1차 세포의 사용이 개시되어 있다. 문헌 [Paquette et al. (Reprod. Toxicol. 2008, 83, 104-111)]에는 제약업계에서 발생 독성 화합물에 대한 도구로서 배아 줄기 세포 시험의 적용 및 사용이 기재되어 있다.

문헌 [Li et al. (Biol. Chem. 2008, 389, 169-177)]에는 성체 줄기 세포주의 지방 생성 분화를 억제하는 독성 물질 (다이옥신)의 효과가 기재되어 있다. 문헌 [Miranda et al. (Methods Mol. Biol. 2008447,151-156)]은 태아 설치류 대뇌피질-유래 신경 줄기 세포를 실험 모델로서 사용하는 것을 설명하고 있고, 사전 에탄올 노출의 뉴런의 후속 성숙에 대한 효과를 결정하였다.

문헌 [Adler et al. (Altern Lab Anim. 2008 36, 129-40)]은 인간 세포 종류, 즉, 음경포피 (foreskin) 섬유모세포, 인간 배아 줄기 세포-유래 전구 세포, 및 인간 배아 줄기 세포를 기초로 한 세포 생활력 분석을 개시하고 있고, 이것은 상이한 정도의 발생 성숙을 나타낸다.

문헌 [Adler et al. (Toxicology in vitro, 2008 22, 200-211)]은 인간 배아 줄기 세포 및 많은 마커 유전자에 기반한 발생 독성 시험 방법을 설명한다.

문헌 [Ahuja et al. (Toxicology 2007 231, 1-10)]에는 화학적 또는 물리적 물질을 사용한 특정 세포 종류의 처리가 기재되어 있고, 그 반응의 측정은 성인 유기체에서 다양한 장기 시스템에서의 독성 시험을 위한 쉬운 방법을 제공한다.

기술적인 문제

상기 논의한 바와 같이, 시간과 비용이 많이 소요되는 동물 시험을 시행하지 않으면서 인간 발생에 대한 화학물질의 독성을 예측하기 위해 사용될 수 있고 모델 동물 시스템에 의존하기보다는 인간 발생을 보다 근접하게 반영하는 새로운 분석이 필요하다. 특히, 어느 발생 경로 및 어떤 조직이 화학물질에 의해 영향받을 것인지를 예측하는 분석의 필요성이 충족되지 않은 상태이다.

발명의 개요

본 발명의 제1 측면에서,

(i) 샘플 내의 미분화된 줄기 세포의 대조군 집단을 작용제로 처리하여 제1 발생 경로 내의 분화된 세포의 제1 대조군 집단을 생성하는 단계;

(ii) 미분화된 줄기 세포의 상기 대조군 집단 및/또는 분화된 세포의 상기 제1 대조군 집단에서 발현된 2개 이상의 생체마커의 수준을 측정하여 대조군 발현 수준을 결정하며, 여기서 적어도 하나의 상기 생체마커는 발생 경로 및/또는 분화의 초기 단계에서 발현되고 적어도 하나의 생체마커는 발생 경로 및/또는 분화의 후기 단계에서 발현되는 단계;

(iii) 상기 작용제로 처리하기 전 또는 후에 상기 샘플 내의 미분화된 줄기 세포의 시험 집단을 화학물질에 노출시켜 제1 발생 경로 내의 분화된 세포의 제1 시험 집단을 생성하는 단계;

(iv) 미분화된 줄기 세포의 상기 시험 집단 및/또는 분화된 세포의 상기 제1 시험 집단에서 상기 2개 이상의 생체마커의 수준을 측정하여 시험 발현 수준을 결정하는 단계;

(v) 상기 대조군 발현 수준을 상기 시험 발현 수준과 비교하는 단계

를 포함하며, 여기서 상기 화학물질에 대한 노출 이후의 발현 수준의 차이가 상기 발생 경로에 대한 화학물질의 독성을 나타내는 것인, 샘플에서 발생 경로에 대한 화학물질의 독성을 예측하는 방법이 제공된다.

당업자는 의심의 여지를 피하기 위해 본 발명에서 사용하기 위한 미분화된 줄기 세포가 전체형성능 (totipotent) 줄기 세포를 포함하지 않음을 이해할 것이다.

바람직한 측면에서, 방법의 단계 (i)은 미분화된 줄기 세포의 집단을 작용제로 처리하여 n번째 발생 경로 내의 분화된 세포의 n번째 집단을 생성하는 단계; 및단계 (ii) 내지 (v)를 반복하여 대조군 발현 수준과 상기 n번째 집단에서의 시험 발현 수준의 차이를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 화학물질에 대한 노출 이후의 발현 수준의 차이가 상기 n번째 발생 경로에 대한 화학물질의 독성을 나타낸다.

하나의 측면에서, 제1 및 n번째 발생 경로가 네트워크화된 (networked) 발생 경로이다.

하나의 측면에서, 방법의 단계 (i)은 미분화된 줄기 세포의 집단을 작용제로 처리하여 다수의 발생 경로 내의 분화된 세포의 다수의 집단을 생성하는 단계를 포함하고; 방법은 그후에 단계 (ii) 내지 (v)를 반복하여 대조군 발현 수준과 상기 다수의 집단에서의 시험 발현 수준의 차이를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 화학물질에 대한 노출 이후의 발현 수준의 차이가 상기 다수의 발생 경로에 대한 화학물질의 독성을 나타낸다.

적합하게는, 다수의 발생 경로는 네트워크화된 발생 경로이다.

하나의 측면에서, 줄기 세포는 분화다능성 줄기 세포이다. 분화다능성 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 유도된 분화다능성 줄기 세포, 또는 원시 생식 세포일 수 있다.

또 다른 측면에서, 줄기 세포는 성체 줄기 세포이다.

바람직하게는, 줄기 세포는 인간 줄기 세포이다.

하나의 측면에서, 적어도 하나의 생체마커는 배아 줄기 세포 생체마커이다.

또 다른 측면에서, 적어도 하나의 생체마커는 원시 생식 세포 생체마커이다.

추가의 측면에서, 적어도 하나의 생체마커는 성체 줄기 세포 생체마커이다.

적합하게는, 배아 줄기 세포 생체마커는 Nanog, SOX2, SSEA4, Oct4, TRA-1-60, TRA-1-81, 크립토 (Cripto), CD133, A2 B5, PAX6, 인테그란 베타1, CEA, Tnk1, ERAS 및 스텔라 (STELLAR)로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

적합하게는, 원시 생식 세포 생체마커는 DDX4, 프라길리스 (Fragillis), 스텔라 (Stella) 및 NANOS2로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

하나의 측면에서, 적어도 하나의 생체마커는 중배엽 생체마커이다.

바람직하게는, 중배엽 생체마커는 브라키우리 (Brachyury), Tbx6, TBR2, EOMES, PHOX2A, PHOX2B, PRRX1, PRRX2, MESDC2, Mesp1, Mesp2, MIER1, MIER3 및 SNAIL로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

또 다른 측면에서, 적어도 하나의 생체마커는 외배엽 생체마커이다. 바람직하게는, 외배엽 생체마커는 EED, TIF1 감마, KLH25, EDA, GJB6, ENC1, EDAR, SOSTDC1, NCAM 및 CD99로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

추가의 측면에서, 적어도 하나의 생체마커는 내배엽 생체마커이다. 바람직하게는, 내배엽 생체마커는 Ki67, Rb, 쿨린 (Cullin) 1, 쿨린 2, 쿨린 3, 사이클린 (Cyclin) E 및 사이클린 E2로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

하나의 측면에서, 적어도 하나의 생체마커는 심장 줄기 세포 생체마커이다. 바람직하게는, 심장 줄기 세포 생체마커는 히알루로난 신타제 1, OSR1 및 Sca1로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

또 다른 측면에서, 적어도 하나의 생체마커는 심근세포 전구체 세포 생체마커이다. 바람직하게는, 심근세포 전구체 세포는 ALPK3, 페리오스틴 (Periostin) 및 Mesp 1로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

하나의 측면에서, 초기 생체마커는 발생 경로 및/또는 분화의 초기 단계 동안 발현되는 심근세포 생체마커이다. 바람직하게는, 초기 심근세포 생체마커는 Nkx2.5, 미오카르딘, GATA4, MEF2C, HAND1, IRX4, TBX5, TBX20 및 전사 인자 25로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

또 다른 측면에서, 후기 생체마커는 발생 경로 및/또는 분화의 후기 단계 동안 발현되는 심근세포 생체마커이다. 바람직하게는, 후기 심근세포 생체마커는 심장 트라포닌 T 항체, 심장 트라포닌 I 항체, 중쇄 심장 미오신 항체, 미오신 경쇄 항체, 심장 FABP 항체 및 알파 근절 (sarcomeric) 액틴 항체로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

추가의 측면에서, 후기 생체마커는 심실 생체마커이다. 바람직하게는, 심실 생체마커는 BMP10, HAND2 및 혈청 반응 인자로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

하나의 측면에서, 초기 생체마커는 발생 경로 및/또는 분화의 초기 단계 동안 발현되는 신경 줄기 세포 생체마커이다. 바람직하게는, 초기 신경 줄기 세포 생체마커는 아그레칸 (Aggrecan) ARGxxx, CD133, EMX2, 네스틴 (Nestin) 및 NeuroD1로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

또 다른 측면에서, 후기 생체마커는 발생 경로 및/또는 분화의 후기 단계 동안 발현되는 신경 줄기 세포 생체마커이다. 바람직하게는, 후기 신경 줄기 세포 생체마커는 BRN3A, BRN3B, 무사시 (Musashi) 1, Msi1, NR2E1, 테일리스 (Tailless), 뉴클레오스테민, Oct6, Pax2, SOX2, SOX4, SOX10, SOX11, SOX22, 비멘틴 (Vimentin) 및 CDw33로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

추가의 측면에서, 적어도 하나의 생체마커는 신경 능선 (crest) 세포 생체마커이다. 바람직하게는, 신경 능선 세포 생체마커는 뉴로게닌 1, 뉴로게닌 2, 뉴로게닌 3 및 MASH1로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

하나의 측면에서, 적어도 하나의 생체마커는 성상세포 생체마커이다.

또 다른 측면에서, 적어도 하나의 생체마커는 아교세포 또는 미세아교세포 생체마커이다.

추가의 측면에서, 적어도 하나의 생체마커는 푸르키니에 세포 생체마커이다.

하나의 측면에서, 적어도 하나의 생체마커는 뉴런 또는 신경세포 생체마커이다. 바람직하게는, 신경세포 생체마커는 해마 뉴런, 종뇌 뉴런, 도파민성 뉴런, 콜린성 뉴런, 감각 뉴런, 통각 뉴런, 운동 뉴런, 피라미드 뉴런, 희소돌기아교세포, 신경내분비, 축삭, 쉬반 (Schwann) 세포, 수상돌기, 성장 원추 (cone), 세포체 및 시냅스 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

또 다른 측면에서, 적어도 하나의 생체마커는 지방세포 생체마커이다. 하나의 측면에서, 2개 이상의 생체마커의 수준은 표지된 항체와의 반응 및 결합된 표지의 측정에 의해 정량된다. 바람직하게는, 2개 이상의 생체마커의 수준은 정량적 면역-세포화학에 의해 정량된다.

또 다른 측면에서, 미분화된 줄기 세포는 적어도 2개 이상의 생체마커에 작동가능하게 연결된 상이한 리포터 유전자를 포함하고, 2개 이상의 생체마커의 수준은 상이한 유전자 생성물의 측정에 의해 정량된다. 바람직하게는, 리포터 유전자는 니트로-리덕타제, β-갈락토시다제, β-락타마제, 루시퍼라제 및 형광 단백질 리포터 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

추가의 측면에서, 2개 이상의 생체마커의 수준은 정량적 RT-PCR, 정량적 면역세포화학, 표면 플라스몬 공명 및 마이크로어레이 분석으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 정량된다.

하나의 측면에서, 방법은 단계 (iii) 후에 세포 증식을 결정하는 것을 추가로 포함한다.

바람직한 측면에서, 방법은 복합적 방법이다.

본 발명의 제2 측면에서, 상기 설명된 방법을 사용하여 인간 태아 발생 동안 세포 바이오맵 또는 발생 경로의 변화를 예측하는 방법이 제공된다.

본 발명의 제3 측면에서, 상기 설명된 방법을 수행하기 위한 키트가 제공되고, 키트는 2개 이상의 생체마커를 정량하기 위한 수단 및 방법의 수행을 위한 사용설명서를 포함한다. 바람직한 측면에서, 생체마커를 정량하기 위한 수단은 항체, 효소 기질 및 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

정의

본원에서 사용되는 바와 같이 "줄기 세포"는 다양한 범위의 특수 세포 종류로 분화하는 능력이라는 특징을 갖는 세포로서 규정된다. 다음과 같은 2개의 넓은 종류의 포유동물 줄기 세포가 존재한다: 포배의 내세포괴로부터 단리된 배아 줄기 세포, 및 성인 조직에서 발견되는 성체 줄기 세포. 발생하는 배아에서, 줄기 세포는 모든 특수 배아 조직으로 분화할 수 있다. 성인 유기체에서, 줄기 세포 및 전구 세포는 신체에 대한 복구 시스템으로서, 특수 세포의 보충을 위해 작용할 뿐만 아니라 재생 장기, 예를 들어 혈액, 피부 또는 내장 조직의 정상적인 교체를 유지한다.

본원에서 사용되는 "포배"는 포배강 형성 후, 그러나 착상 전에 초기 배아발생시에 형성된 구조체로서 규정된다. 본원에서 사용되는 "전구 세포"는 특이적인 세포 종류로 분화하는 능력을 갖는 세포로서 규정된다. 대부분의 전구세포는 단일분화성 (unipotent) 또는 다능성으로서 설명된다.

본원에서 사용되는 "발생 경로"는 세포 분화를 위한 경로 (또는 세포 분화 경로)로서 규정되고, 전구 세포가 보다 특정 목적의 세포 종류가 되는 과정이다. 분화는 유기체가 단일 접합체로부터 조직 및 세포 종류의 복잡한 시스템으로 변화하면서 다세포 유기체의 발생 동안 많은 횟수로 발생한다. 분화는 성체에서도 공통적인 과정이다: 성체 줄기 세포는 조직 복구 동안 및 정상적인 세포 교체 동안 분열하여 완전히 분화된 딸세포를 생성한다.

본원에서 사용되는 "발생 경로"의 측면에서 "네트워크화된"은 그 자체가 추가로 분화하는 능력을 가질 수 있는 2 이상의 상이한 세포 종류로 분화할 수 있는 전구 세포를 포함하는 네트워크로서 규정된다. 이 과정은 최종적으로 분화된 세포 종류가 생성될 때까지 계속된다.

본원에서 사용되는 "발생 생물학"은 유기체가 성장하고 발생하는 과정을 연구하는 학문으로 규정된다. 발생 생물학자는 세포 성장, 분화 및 형태형성 (조직, 장기 및 구조를 생성하는 과정)의 유전자 제어를 연구한다.

본원에서 사용되는 "형태형성"은 유기체가 그의 형태를 발생하도록 유도하는 생물학적 과정으로서 규정된다. 이것은 세포 성장, 세포 분화 및 세포 발생의 제어와 함께 발생 생물학의 3가지 근본적인 측면 중의 하나이다. 형태형성 과정은 유기체의 배아 발생 및 태아 발생 동안 세포의 조직적인 공간 배치를 제어한다. 형태형성 반응은 호르몬에 의해, 다른 유기체에 의해 생산되는 물질부터 독성 화학물질 또는 방사선핵종, 오염물질, 및 다른 독성 물질에 이르는 환경 화학물질에 의해, 또는 세포의 공간 패턴 형성에 의해 유도되는 기계적 스트레스에 의해 유기체에서 유도될 수 있다. 형태형성은 배아, 성숙 유기체에서, 세포 배양액에서 또는 종양 세포 덩어리 내에서 발생할 수 있다.

본원에서 사용되는 "분화다능성"은 다음과 같은 3개의 배엽 중의 임의의 배엽으로 분화하는 잠재력을 갖는 줄기 세포로서 규정된다: 내배엽 (예를 들어 위 내벽, 위장관, 폐, 간, 흉선, 부갑상선 및 갑상선으로 분화), 중배엽 (예를 들어, 근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식 세포로 분화) 또는 외배엽 (예를 들어, 표피 조직 및 신경계로 분화).

본원에서 사용되는 "유도된 분화다능성 줄기 세포"는 특정 유전자의 도처에서의 발현 (ubiquitous expression)을 유도함으로써 비-분화다능성 세포, 일반적으로 성체 체세포로부터 인공적으로 유도된 분화다능성 줄기 세포의 한 종류로서 규정된다.

본원에서 사용되는 "생체마커"는 세포 분자, 예를 들어 단백질로서 규정되지만, 생물학적 상태의 지표로서 사용되는 저분자량 대사체와 구별된다. 이것은 정상적인 생물학적 과정, 발병 과정, 또는 치료적 개입 또는 독성 물질에 대한 약리적 반응의 지표로서 객관적으로 측정되고 평가되는 특성 또는 분자이다. 세포 생물학에서, 생체마커는 특정 세포 종류에서 발현되는 분자이다 (예를 들어, 단백질 Oct-4는 배아 줄기 세포를 확인하기 위한 생체마커로서 사용된다). 생체마커는 당업자에게 공지된 다양한 기술, 예를 들어 마이크로-어레이 분석, 리포터 유전자 분석, 정량적 RT-PCR에 의해 또는 정량적 면역세포화학을 사용하여 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 "초기" 또는 "후기" 생체마커는 각각 세포 배양 또는 성장의 초기에 또는 후기 동안 발현되는 세포 생체마커로서 규정된다. 이들 생체마커는 배양 또는 성장의 상기 상이한 시기 동안 상향조절되거나 하향조절될 수 있다.

본원에서 사용되는 "복합적 분석" 또는 "복합법"은 단일 샘플로부터 다수의 분석물, 분자 또는 생체마커를 측정하는 실험 절차의 종류로서 규정된다. 따라서, 상기 기술을 사용하면, 살아있는 세포에 대한 여러 조사가 가능하여 다량의 정보를 생성할 수 있다. 복합적 분석은 단일 분석물 또는 단일 생체마커를 측정하는 절차와 구분된다.

본원에서 사용되는 "n번째"는 2에서 1000까지 양의 정수 (예를 들어 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10,... 제1,000번째)를 나타낸다.

본원에서 사용되는 "작용제"는 미분화된 줄기 세포의 분화를 유도하는 물리적 자극 (예를 들어, 광, 열, 방사선 조사) 또는 화학적 처리이다. 화학적 처리는 화학물질, 예를 들어 호르몬, 성장 인자 등의 혼합물일 수 있다. 작용제는 잠재적인 독성물질로 평가되는 "화학물질"과 일반적으로 상이하고, 작용제와 화학물질이 하나로서 동일한 경우에는 본 발명의 방법에 상이한 농도로 사용된다.

도 1은 줄기 세포의 발생 경로의 네트워크로의 분화를 보여주는 모식도이다 (생체마커는 괄호에 나타냄).
도 2는 자극 또는 작용제 (30)를 사용한 처리 후에 미분화된 줄기 세포 (10)의 분화된 세포 (40)으로의 분화에 대한 화학물질 (20)의 효과가 평가되는 본 발명의 방법의 하나의 실시양태의 모식도이다.

발명의 상세한 설명

줄기 세포 및 배아 생식 세포 마커

줄기 세포는 i) 시험관 내에서 정의하기 힘들게 분열하고, ii) 다양한 성숙 세포 종류로 분화하는 능력을 특징으로 하는 미분화된 세포이다. 이 세포는 모든 3개의 배아 생식층, 즉 외배엽, 중배엽, 및 내배엽의 세포 종류를 생성할 수 있는 분화다능성 줄기 세포로서 분류될 수 있다. 이들은 배아, 원시 생식 세포 (생식선 능선으로부터 유래됨) 및 재프로그램된 유도된 분화다능성 줄기 세포를 포함한다. 성체 줄기 세포는 다능성이고, 특정 발생 경로를 따라 분화한다.

최근 개발된 기술은 줄기 세포 분화의 다양한 단계에 대한 마커를 확인하기 위한 수단을 제공할 것으로 보인다. 줄기 세포를 비롯한 각각의 세포 종류는 세포-특이적 유전자의 발현을 일으키는 세포-특이적 전사 조절 기구에 의해 유지되는 특유의 신호전달 네트워크를 갖는다. 따라서, 인체 내의 274종의 상이한 세포 종류는 인체 내에 존재하는 ~25,000개의 유전자의 조합 발현에 의해 규정된다 (Ahn, S.M., et al., 2008 Proteomics 8, 4946-4957).

배아 줄기 세포 분화의 초기 단계는 3가지 배아 생식층, 즉 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포의 생성을 수반하고, 모든 최종적으로 분화된 세포는 이들 3가지 세포 종류로부터 유래한다. 도 1은 줄기 세포의 발생 경로의 네트워크 내로의 분화를 보여준다. 생체마커는 도면에서 괄호 내에 표시된다. 따라서, Oct4는 배아 줄기 세포에 대한 생체마커인 반면, Naggin은 신경 줄기 세포에 대한 생체마커이다. 초기 및 후기 생체마커가 또한 예시되고, 따라서, DSS3은 뉴런 발생의 초기 단계에서 발현되는 생체마커인 반면, NeuN은 뉴런 발생의 후기 단계에서 발현된다.

줄기 세포 집단에 의해 나타난 초기 분화 정도를 평가하기 위해, 다음 배엽 마커를 사용할 수 있다.

후기 분화 단계 동안 보다 많은 세포/조직 특이적 마커를 사용한다.

배아 줄기 세포 마커

[1] Nanog (항체 ab21603) - 마우스 및 인간 배아 줄기 (ES) 및 배아 생식 (EG) 세포를 포함하는 초기 배아 및 분화다능성 줄기 세포에 특이적

[2] SOX2 (항체 ab12830) - 배아 줄기 세포 마커

[3] SSEA4 (항체 ab16287) - 단계-특이적 배아 항원 4는 배아 발생 초기에 및 분화다능성 줄기 세포에서 발현된다.

[4] Oct4 (항체 ab27985) - 미분화된 배아 줄기 세포 및 배아 생식 세포에 의해 발현된 전사 인자.

[5] TRA-1-60 (항체 ab16288) - 인간 테트라암종 (tetracarcinoma) 및 배아 생식 및 줄기 세포 상에 발현되는 항원과 반응한다.

[6] TRA-1-81 (항체 ab16289) - 인간 배아 줄기, 생식 및 암종 세포의 마커

[7] 크립토 (항체 ab19917) - ES 세포에서 및 배아 발생의 초기 기 동안 모두에서 발현된다.

[8] CD133 (항체 ab19898) - 신경 및 배아 줄기 세포를 포함하는 줄기 및 전구 세포에 대한 마커

[9] A2B5 (항체 ab53521) - A2B5는 발생하는 상피 세포, 희소돌기아교세포 전구세포 및 신경내분비 세포에서 발현되는 세포 표면 강글리오시드 에피토프이다.

[10] PAX6 (항체 ab5790) - 전사 인자 (눈, 코, 중추신경계 및 췌장의 발생에서 중요함).

[11] 인테그란 베타1 (항체 ab5185) - 줄기 세포 마커

[12] CEA 암 배아 항원 (항체 ab46538) - 태아 소화관 발생 동안 발현된다.

[13] Tnk1 (항체 ab70402) - 배아 줄기 세포의 키나제

[14] ERAS (항체 ab67696) - 배아 줄기 (ES) 세포에서 발현되고, 그들의 시험관내 증식 및 종양원성을 촉진함.

[15] 스텔라 (항체 ab78559) - 생식 및 배아 줄기 세포에 풍부한 단백질

원시 생식 세포 마커

[1] DDX4 (항체 ab13840) - 난소 & 고환에서 발현되는 원시 생식 세포 마커.

[2] 프라길리스 (항체 ab15592) - 생식계열 세포 운명에 관련됨.

[3] 스텔라 (항체 ab19878) - 원시 생식 세포, 난모세포, 착상전 배아, 및 분화다능성 세포에서 특이적으로 발현되는 원시 생식 세포 마커.

[4] NANOS2 (항체 ab15731) - 무척추동물 및 척추동물 모두에서 생식 세포 발생에 관련되는 원시 생식 세포 마커.

중배엽 마커

[1] 브라키우리 (항체 ab20680) 중배엽 마커 - 중배엽 형성의 가장 조기의 지표. 중배엽 분화의 마커로서 사용됨.

[2] Tbx6 (항체 ab30946) - 원시선 (primitive streak) 및 체절형성전 (presomitic) 중배엽에서 발현됨.

[3] TBR2/Eomes (항체 ab23345) - T 박스 박스 (box) 뇌 2는 발생 동안 중간 전구 세포에 의해 발현되는 전사 인자이다.

[4] PHOX2A 및 2B (각각 항체 ab54847 및 ab12047) - 몇몇 주요 뉴런 집단의 발생에 관여되는 호메오박스 (Homeobox)-유사 전사 인자.

[5] PRRX1 및 2 (항체 ab67631 및 ab77655) - 호메오박스 단백질의 쌍을 이룬 (paired) 패밀리의 구성원.

[6] MESDC2 (항체 ab68809) - 마우스 배아 극성의 특이성에 필수적임

[7] Mesp1 및 2 (각각 항체 ab77013 및 ab23733) - 중배엽 후부 1/2은 전방 체절형성전 중배엽에서 분절화/패턴화에서 기능하는 전사 인자이다.

[8] MIER1 및 3 (각각 항체 ab26254 및 ab69877) - 중배엽 유도 초기 반응 유전자 패밀리의 구성원.

[9] SNAIL (항체 ab17732) - 중배엽 형성에 필수적인 전사 인자.

외배엽 마커

EED (항체 ab4469) - 유전자의 전사 억제 상태를 유지하는데 관여되는 폴리콤 (Polycomb)-군 패밀리. ES 세포 분화 동안 발현됨.

TIF1 감마 (항체 ab333475) - 세포 분화 및 발생에서 기능하고, 조혈 세포의 분화에서 역할을 수행함.

KLH25 (항체 ab55953) - 외배엽 신경 피질 단백질

EDA (ab54386) - 종양 괴사 인자 패밀리에 속함 (외배엽 장기의 발생 동안 세포-세포 신호전달에 관여됨).

GJB6 (항체 ab59927) - 결함은 외배엽 기원의 조직에 영향을 주는 일군의 발달 장애를 구성하는 외배엽 형성이상을 야기한다.

ENC1 (항체 ab56348) - 외배엽 신경 피질 단백질 1

EDAR (항체 ab56803) - 엑토디스팔라신 (ectodysplasin) A 수용체

SOSTDC1 (항체 ab56079) - 탈락막 세포 반응을 위한 착상/민감화를 위한 자궁내막 수용성의 개시에 관여됨.

NCAM (항체 ab6123) - 신경외배엽 유래 세포주, 조직 및 신생물, 예를 들어 망막모세포종, 수질모세포종, 성상세포종 및 신경모세포종 상에서 발현됨.

CD99 (항체 ab8855) - CD99의 발현은 원시 말초 신경외배엽 종양으로부터의 세포의 특성이다.

내배엽 마커

[1] Ki67 (항체 ab833) - Ki67 항원은 활발한 세포 주기의 모든 시기에서 세포를 증식함으로써 발현되는 원형 (prototypic) 세포 주기 관련 핵 단백질이다.

[2] Rb (항체 2G5, ab1116) - 종양 억제인자 유전자 (세포 주기의 음성 조절인자로서 기능함).

[3] 쿨린 1, 2 및 3 (각각 항체 ab1868, ab1870 및 ab1871) -중배엽 마커

[4] 사이클린 E 및 E2 (각각 항체 ab1108 및 ab1110) - 사이클린 E는 Cdk2의 조절 하위단위이고, 포유동물 세포 주기 동안 G1/S 이행을 제어한다.

심근세포 분화

i) 분화, ii) 억제제 상세내용 및 iii) 심근세포 마커를 달성하기 위한 프로토콜.

전구 세포의 심근세포로의 분화는 문헌 [McBurney, M.W. et al., (1982), Nature 299, 165-167], [Smith, S. C et al., (1987), J. Cell Physiol. 131, 74-84] 및 [Puceat, M. 2008, Methods, 45, 168-171]에 기재된 것과 같은 잘 특성화되고 공개된 프로토콜을 이용하여 가능하다. 상기 프로토콜을 이용하여 분화다능성 및 다능성 전구 세포, 예를 들어 배아 암종 및 줄기 세포로부터 심근세포를 생성하는 것이 가능하다.

심근세포 분화 - 마우스 P19 유래 심근세포

P19 세포는 DMSO의 존재 하에 성장할 때 시험관 내에서 수축성 심근세포로 분화하는 마우스 다능성 배아 암종 세포이다 [McBurney, M.W. (1993) Int. J. Dev. Biol. 37, 135-140]. 상기 분화는 문헌 [McBurney, M.W. et al., (1982), Nature 299, 165-167] 및 [Smith, S. C et al., (1987), J. Cell Physiol. 131, 74-84]에 기재된 방법을 이용하여 달성할 수 있다. P19 세포는 ATCC (cat. no. CRP-1825)로부터 상업상 이용가능하다.

문헌 [McBurney, M.W. et al., (1982)]에 기재된 "벌크 배양 (bulk culture)" 방법은 15% (v/v) 열-불활성화된 우태아 혈청, 50 ㎍/ml 스트렙토마이신, 50 단위/ml 페니실린, β-머캅토에탄올 (100 nM) 및 피루베이트 (1 mM)를 함유하는 RPMI 배지에서 물-포화 분위기, 5.0-7.5% CO₂에서 37℃에서 P19 세포를 성장시키는 것을 수반한다. 대수 성장하는 세포를 100 mm 초저 (Ultra low) 결합 세포 배양 접시 (코닝 (Corning) Cat. no. 3282)에서 분화 배지 (20% 열-불활성화된 우태아 혈청을 함유하고 1% DMSO를 보충한 성장 배지) 내로 2 x10⁴ 세포/ml로 계대 배양한다. 4일 후에, 세포 응집물을 DMSO가 결여된 신선한 분화 배지가 담긴 100 mm 팔콘 (Falcon) 조직 배양 접시 (Cat no. 353003)에 옮긴다. 박동하는 심근세포는 분화 배지 및 DMSO에 대한 노출 ~6일 후에 응집물에서 나타난다.

문헌 [Smith, S. C. et al., (1987)]에 기재된, P19 세포를 심근세포로 분화시키기 위한 "현적 (hanging drop)" 방법은 문헌 [McBurney, M.W. et al., (1982)]에 기재된 벌크 배양 방법과 유사하다. 그러나, 분화 배지 및 DMSO에 대한 노출시에, 작은 부피의 세포를 100 mm 코닝 초저 결합 세포 배양 접시의 천장에 옮긴다. 세포를 가습 분위기에서 유지하기 위해, PBS 용액 상에 뒤집는다. 제4일에, 분화 배지를 교체하고, 대략 제6일에 박동하는 심근세포가 나타난다.

심근세포 분화 - 배아 줄기 세포 유래 심근세포

마우스 배아 줄기 세포주 CGR8, R1 및 BS1의 분화를 위한 프로토콜은 이전에 문헌 [Puceat, M. 2008, Methods, 45, 168-171]에 기재된 바 있다. CGR8 및 R1은 각각 ECACC (Cat. no. 07032901) 및 ATCC (Cat. no. SCRC-1011)로부터 상업상 이용가능하다. BS1 세포주는 문헌 [Zeineddine, D. et al., 2006, Dev. Cell 11, 535-546]에 기재되고 특성화되었다.

프로토콜은 분화를 개시하기 위한 세포 응집물 (배상체 (embryoid body)로도 공지됨)의 생성 및 심장 계통으로의 분화 효율을 개선하기 위한 성장 인자의 사용을 수반한다. 프로토콜은 마우스 및 인간 배아 줄기 세포 모두의 분화에 적용가능하다. 마우스와 인간 배아 줄기 세포의 증식 사이의 주요 차이는, 마우스 세포는 백혈병 억제제 인자의 존재 하에 섬유모세포 피더 세포 없이 증식할 수 있는 반면에, 인간 세포는 전통적으로 분화다능성을 유지하기 위해 피더 세포 및 FGF2를 필요로 한다는 점이다.

대수 성장하는 마우스 배아 줄기 세포를 분화 과정 개시 24 hr 전에 증식 배지 내에 재조합 인간 BMP2 (인비트로겐 (Invitrogen)) 1 ml당 2.5 ng으로 노출시킨다. 증식 배지는 BHK21 배지 (인비트로겐), 스트렙토마이신 (50 ㎍/ml), 페니실린 (50 단위/ml), 비-필수 아미노산 (1 mM), 피루브산나트륨 (1 mM), 글루타민 (1 mM), 머캅토에탄올 (100 nM), 우태아 혈청 (7.5% v/v) 및 재조합 백혈병 억제 인자 (1 단위/ml)로 구성된다. 계대 배양 시에, 세포를 분산시키고 (배상체의 생성을 촉진하기 위해), 저속 원심분리에 의해 수거하고, 20% (v/v) 우태아 혈청을 보충한, 재조합 백혈병 억제 인자가 결여된 증식 배지로 구성된 분화 배지 내에 25,000 세포/ml로 재현탁시킨다. 모든 세포 조작은 37℃ 및 5-7.5% CO₂에서 수행한다.

세포 (500)를 100 mm 코닝 초저 결합 세포 배양 접시의 밑면 상에 20 ㎕ 분취액으로 분배한다. 증발을 억제하기 위해 PBS를 기저부 내에 분배한다. 배상체 형성은 48 hr 동안 진행시킨다. 이어서, 모든 배상체를 10 ml 분화 배지 내에 부드럽게 재현탁시키고, 추가로 72 hr 동안 인큐베이팅한다. 제5일에, 배상체를 0.1% 젤라틴으로 코팅한 팔콘 100 mm 조직 배양 접시 상에 플레이팅한다. 박동하는 마우스 심근세포는 ~7일 후에 나타나야 한다.

인간 배아 줄기 세포 유래된 심근세포의 생성은 다음을 수반한다: 대수 성장하는 I-6 인간 배아 줄기 세포 (테크니온 - 이스라엘 인스티튜트 오브 테크놀로지 (Technion - Israel Institute of Technology))를 다음 증식 배지를 사용하여 E14 마우스 배아 섬유모세포 상에 배양한다 - 머캅토에탄올 (100 nM), 글루타민 (1 mM), 비-필수 아미노산 (1 mM), 15% (v/v) KOSR 혈청 대체물 (인비트로겐) 및 10 ng/ml 재조합 인간 FGF2 (인비트로겐)를 보충한 KO-DMEM (인비트로겐). I-6 인간 배아 줄기 세포주는 NIH에서 승인된 것이다.

I-6 세포를 심근세포로 분화시키기 위해, 세포를 KOSR 혈청 대체물의 농도가 감소되고 (5% v/v) FGF2가 결여되지만 10 ng/ml BMP2, 및 FGF2 수용체 억제제 SU5402 (1 μM, 칼바이오켐 (Calbiochem) Cat. no. 572630)를 보충한 증식 배지에 48 hr 동안 노출시킨다.

인간 배상체는 마우스 세포를 분화시키기 위해 설계된 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 상기 설명된 바와 같이 생성된다. 콜라게나제 CLS2 (인비트로겐)를 사용한 I-6 세포의 효소에 의한 해리 후에, 세포를 5% KOSR 혈청 대체물 머캅토에탄올 (100 nM), 글루타민 (1 mM) 및 비-필수 아미노산 (1 mM)을 보충한 KO-DMEM 배지 내에 재현탁시키고, 세포 응집을 촉진하기 위해 코닝 초저 결합 세포 배양 접시에 옮긴다. 박동하는 인간 심근세포는 ~2주 후에 관찰된다.

최근에, 인간 배아 줄기 세포 (hES2 및 hES3)와 마우스 내배엽-유사 END2 세포의 동시 배양을 기초로 한 무혈청 현탁 배양 방법이 문헌 [Mummery C.L. et al., 2007 Curr Protoc Stem Cell Biol Chapter 1 Unit 1 F.2] 및 [Mummery C.L. (2007) Cardiomyocyte differentiation in human ES cells. In Culture of Human Stem Cells, Chapter 4, pp 93 - 106 (Eds. Freshney R.I., Stacey, G.N. and Auerbach, J.M.)]에 기재되었다. 상기 프로토콜은 END2 세포 조건화 배지의 사용을 위해 문헌 [Graichen et al. 2008 Differentiation 76 357-370]에 의해 추가로 조정되었다. 두 방법은 이전에 설명된 바와 같은 배상체의 생성을 수반하였다.

심근세포 분화의 억제제

마우스 HSP25의 발현은 P19 세포의 심근세포 분화에 중요하다. p38 경로에 의한 HSP25의 인산화는 그의 특정 기능에 중요한 것으로 알려져 있다. 특이적 억제제 SB203580 (10 μM)에 의한 p38 경로의 억제는 심근세포로의 마우스 P19 세포 분화를 억제하는 것으로 밝혀졌다 [Davidson, S.M. & Norange, M. (2000) Dev. Biol, 218, 146-160]. 상기 연구에서, 분화는 단일 심장 마커인 심장-액틴의 존재를 면역-면역조직화학에 의해, 및 심장-액틴 및 심방 나트륨이뇨 펩티드의 발현을 RT-PCR에 의해 모니터링함으로써 평가되었다.

SB 203580 [4-(4'-플루오로페닐)-2-(4'-메틸술피닐페닐)-5-(4'-피리딜) 이미다졸]은 프로메가 (Promega) (Cat. no. V1161)로부터 상업상 이용가능하다. 이것은 MAP 키나제 상동체 p38α, p38β 및 p38β2의 특이적인 세포-투과가능한 억제제이다. SB 203580은 ERK, JNK, p38γ 또는 p38δ의 활성에 유의한 효과를 갖지 않는다.

문헌 [Graichen, R. et al., (2008) Differentiation, 76, 357-370]은 1 - 10 μM의 SB 203580가 실제로 인간 배아 줄기 세포로부터 심근세포의 생성을 향상시킴을 입증하였다. 그러나, 농도가 15 μM로 증가하자 심근세포의 수가 크게 감소하고, 분화는 25 μM에서 완전히 차단되었다. 따라서, SB 203580의 기능은 종과 용량 모두에 의존적인 것으로 보인다. 또한, 상기 저자들은 또 다른 p38 MAP 키나제 억제제인 SB202190의 유사한 농도 효과를 입증하였다. 이들은 또한 다음과 같은 인간 배아 줄기 세포 심근세포 분화의 억제제를 보고하였다 - SB216763 (10-25 μM, GSK-3 억제제), PD098059 (5 - 25 μM, MAPKK 억제제), 아니소마이신 (0.01-100 μM, JNK/SAPK 및 p38 활성제), ATA (0.01-100 μM, JAK2/STAT5 활성제), FTT 0.01-100 μM, PKC 활성제) 및 OAG (0.01-100 μM, Ca^{2 +}-의존적 PKC).

심근세포 분화의 다른 억제제는 다음의 것을 포함한다. 나트륨/양성자 교환제 1 (NHE1) 억제제 EMD87580은 문헌 [Lei, L. et al., (2008) Shen Wu Gong Xue Bao, 24. (10), 1790-1795]에 의해 DMSO 유도 동안 마우스 P19 배아 암종 세포의 심근세포 분화를 억제하는 것으로 입증되었다. 문헌 [Li, X. et al., (2009) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 196, 1, 159-170]은 마우스 배아 줄기 세포주 CGR8에서 유사한 결과를 입증하였다. PI-3-키나제 억제제 LY294002 (50 μM)는 마우스 배아 줄기 세포의 심근세포로의 분화를 차단한다 [Klinz, F., et al., (1999), Exp. Cell Res., 247, (1), 79-83].

대다수의 이들 억제제는 예를 들어 SB202190 (밀리포어 (Millipore) Cat. no. 19-134), LY294002 (프로메가 V1201), SB216763 및 아니소마이신 (각각 토크리스 바이오사이언스 (Tocris Bioscience) Cat. nos. 1616 및 1290)로서 상업상 이용가능하다.

심장 발생에 대한 억제제 (및 화학물질, 약물 또는 화장품), 예를 들어 SB 203580 등의 효과는 전구 줄기 세포 분화 동안 모니터링될 수 있다. 전구 세포를 억제제에 노출시키고, 세포 발생 과정에 대한 효과는 당업자에게 공지된 기술, 예를 들어 정량적 면역-세포화학에 의해 분화된 세포 종류와 연관된 세포/조직 특이적 마커의 발현을 측정함으로써 분화의 정도를 모니터링함으로써 평가한다.

도 2는 2개 이상의 생체마커 (15, 45 및 47)의 수준을 측정함으로써, 자극 또는 작용제 (30)을 사용한 처리 후에 미분화된 줄기 세포 (10)의 분화된 세포 (40)으로의 분화에 대한 화학물질 (20)의 효과가 평가되는 본 발명의 방법의 하나의 실시양태를 도시한 것이다. 줄기 세포 (10)은 분화를 유도하는 자극 또는 작용제 (30)에 대한 노출 전 또는 후에 화학물질 (20)에 노출될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 심근세포 발생의 측면에서, 줄기 세포 (10)의 심근세포 (40)으로의 분화에 대한 약물 또는 화학물질 (20)의 잠재적인 효과는 줄기 세포 (15) 또는 심근세포 (45, 47)에 존재하는 2개 이상의 생체마커의 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다.

심장 발생을 표시하는 마커는 다음의 것을 포함한다 (앱캠 인크. (Abcam Inc.)로부터 상업상 이용가능한 항체도 기재한다):

심장 줄기 세포 마커

[1] 히알루로난 신타제 1 (항체 ab75329) - 심장 발생에 관련됨.

[2] OSR1 (항체 ab76689) - 중내배엽 및 후속적으로 내배엽 및 중간 중배엽에서 발현되는 전사 인자.

[3] Sca1 (항체 D7, ab25031) - 이것은 다능성 조혈 줄기 세포 상에 발현됨.

심근세포 전구체 세포의 마커

[1] ALPK3 (항체 ab57526) - 심근세포 분화에서 역할을 함.

[2] 페리오스틴 (항체 ab14041) - 배아 및 태아 심장에서 발현되고, 궁극적으로 원시 심장관을 4 심방으로 나누는 심내막융기에 편재함.

[3] Mesp1 (항체 ab77013) - Mesp1은 심혈관계의 많은 전구체에서 발현되고, 심장 형태형성 과정에서 역할을 하는 것으로 알려져 있다

심근세포 - 초기 마커

[1] Nkx2.5 항체 (Abacm - ab35842) - 심근 및 심장내막 모두에서 발현됨.

[2] 미오카르딘 항체 (앱캠 인크. - ab22621) - 미오카르딘은 심장 및 평활근-특이적 유전자 세트의 발현을 조절한다. 이것은 심장발생 및 평활근 세포 계열의 분화에서 중대한 역할을 한다.

[3] GATA4 항체 (앱캠 인크 - ab61170) - 심장 발생에 관여하는 전사인자이고, 심장 및 평활근 세포 종류에서 기저, 효현제 또는 스트레스 유도된 유전자 발현의 조절에서 역할을 함.

[4] MEF2C (항체 ab43796) - 심장 형태형성 및 근육발생을 제어하는 전사 활성인자이고, 혈관 발생에 또한 관여됨. 이것은 신경발생 및 피질 구조 (architecture)의 발생에도 관여될 수 있다.

[5] HAND1 (항체 ab52767) - 초기 심장 형태형성에서 필수적인 역할을 하는 전사 조절인자. 성인에서, 이것은 심장-특이적 유전자의 발현을 위해 요구된다.

[6] IRX4 (항체 ab56032) - 발생 동안 심장에서 발현됨.

[7] TBX5 (항체 ab18531) - TBX5는 심장 발생에서 일정 역할을 할 수 있다.

[8] Tbx20 (항체 ab42468) - 발생하는 심장에서 발현됨.

[9] 전사 인자 25 (항체 ab67762) - 시험관 내에서 SRF의 전사 리프레서 (repressor)로서 작용하고, 따라서 심장 발생에서 역할을 할 수 있다.

심근세포 - 후기 마커

[1] 심장 트로포닌 (troponin) T 항체 (앱캠 인크. - 1C11, ab8295) - 심근에서만 발현되고, 심장 트로포닌 T는 트로포닌 복합체의 트로포미오신 결합 하위단위이다.

[2] 심장 트로포닌 I 항체 (앱캠 인크. - 28419C7, ab19615) - 트로포닌 I은 골격근 및 심장 근육 수축의 조절에서 중요한 역할을 하는 헤테로머 (heteromeric) 복합체의 일부이다.

중쇄 심장 미오신 항체 (앱캠 인크. - 3-48, ab15) - 심장 MHC는 2개의 이소형, 즉, 알파-심장 및 베타-심장 MHC로서 존재한다. 둘 모두 인간 심장에서 발현되고, 여기서 베타-심장 MHC가 우세한 형태이다.

[4] 미오신 경쇄 항체 (& 1LC-14, ab50080) - 미오신은 2개의 중쇄 및 4개의 경쇄로 이루어진다. 심실 미오신 경쇄 I (앱캠 인크. - MLM527, ab680) 및 심장 미오신 경쇄 11LC-14, ab50080

[5] 미오신 경쇄 2 항체 (앱캠 인크. - ab48003) - 미오신 경쇄 2는 심장 미오신 베타 중쇄와 연관된다.

[6] 심장 FABP 항체 (앱캠 인크. - 67D3, ab16916) - 심장 근육 조직에서 및 유의하게 더 낮은 농도로 골격근에서 발현됨.

[7] 알파 근절 액틴 항체 (5C5, ab7799) - 알파 액틴은 액틴의 이소형 중 하나이다. 척추동물에서, 3군의 액틴 이소형, 즉 알파, 베타 및 감마가 존재한다. 알파 액틴은 근육 조직에서 발견되고, 수축 장치의 주요 성분이다. 상기 항체는 a-심장 근육 액틴과 반응한다.

심실 마커

[1] BMP10 (항체 ab34962) - 심장 심실 발생 동안 심근세포 증식 및 성숙의 조정시의 필수 성분.

[2] HAND2 (항체 ab56590) - 발생하는 심실에서 발현되고, 심장 형태형성에서 필수적인 역할을 한다.

근절 마커

[1] 근절 알파 악티닌 항체 (앱캠 인크. - EA-53, ab9465) - ACTN2는 골격근 및 심장 근육 모두에서 발현되는 근육-특이적 알파 악티닌 이소형을 코딩한다. 심근 및 골격근 내의 근관의 스트레스 섬유 내의 Z 선 및 점에 위치함.

[2] 혈청 반응 인자 (항체 ab36747) - 심장 내의 박동하는 근절의 출현에 필요한 심장에 풍부한 전사 인자.

기타 심장 마커

[1] HEY2 (항체 ab70133) - 전사 인자, 포유동물 심장 발생의 중요한 결정인자.

[2] KLF13 (항체 ab15701) - 심장 발생에 요구되는 전사 인자.

[3] 전사 인자의 MEF2 패밀리

MEF2A (항체 ab55547) - 심장 및 골격근 발생에서 핵심 역할을 함.

MEF2B (항체 ab55565) - 발생 동안 많은 근육 관련 유전자의 발현을 조절한다. 특정 신경발생 세포의 분화에 관여됨.

MEF2D (항체 ab43797) - 미분화된 근모세포 내에 존재하고, 이 사실은 이 마커가 근육 발생의 아주 초기 단계에서 역할을 할 수 있음을 시사함. 근육성 및 또한 일부 신경발생 세포의 분화에 관여됨.

[4] 포스포람반 (Phospholamban) 항체 (앱캠 인크. - 2D12, ab2865) - 심장 근육세포질 세망 (SR)의 칼슘 펌프를 조절한다.

상기 설명된 방법 및 그의 변형 방법은 전구 세포, 예를 들어 배아 줄기 및 암종 세포를 심근세포로 분화시키기 위해 통상적으로 사용된다. 상기 분화 과정은 SB 293580과 같은 화학물질에 의해 억제될 수 있다. 다양한 분화 방법의 조합, 특성 결정된 억제제 및 항체가 화학물질에 의한 손상 후에 포유동물 세포/조직 발생에 대한 효과를 평가하기 위한 복합적 정량적 면역-세포화학 방법의 기초를 형성할 것이다.

신경 분화

i) 분화, ii) 억제제 상세내용 및 iii) 신경 마커를 달성하기 위한 프로토콜

전구 세포의 신경 계통의 세포로의 분화는 아래에 기재된 것과 같은 잘 특성화되고 공개된 프로토콜을 이용하여 가능하다. 상기 프로토콜을 이용하여 분화다능성 및 다능성 전구 세포, 예를 들어 배아 암종 및 줄기 세포로부터 뉴런 세포를 생성하는 것이 가능하다.

배아 줄기 (ES) 및 암종 (EC) 세포는 신속하게 분열하고 뉴런을 포함한 다양한 세포 종류로 분화할 수 있다는 점에서 뉴런 분화 연구를 위한 많은 기준을 충족한다. ES 세포는 분화다능성이다. 그러나, 이들은 종종 피더 세포 또는 고가의 성장 인자를 필요로 하는 배양 조건의 공급을 필요로 한다. 그러나, EC 세포는 배양이 보다 용이하고, 피더 세포를 필요로 하지 않으며, 비교적 간단한 배지 내에 유지될 수 있다. EC 세포의 단점은 이들인 종양 세포이고, 유전적으로 비정상이고, 제한된 분화능을 보인다는 점이다. 그러나, 이들은 분화 연구를 위한 간단하고 강력한 시스템을 제공한다.

EC 세포주 NTERA2는 뉴런 분화 연구에 사용되었고, 레티노산에 대한 노출은 배양시에 1차 뉴런에 의해 생산된 것과 유사한 뉴런을 신뢰할 수 있게 생성한다. 레티노산 노출은 줄기 세포 마커, 예를 들어 Oct4, SSE3, TRA-1-60 및 TRA-1-81의 손실, 및 신경 마커, 예를 들어 NeuroD1, β-III 튜불린 및 신경필라멘트 (neurofilament)의 상향조절을 일으킨다. 상기 분화 과정은 매우 예측가능하고, 지속적이다. 레티노산에 대한 노출 및 유사분열 억제제의 존재 하의 세포의 재접종은 본질적으로 순수한 뉴런 집단의 생성을 촉진한다 (Leypoldt F., et al., 2001, Neurochem. 76, 806-814). 이들은 본질적으로 기능적으로 성숙하고, 시냅스 및 신경전달물질 표현형, 예를 들어 콜린성, GABA성 및 세로토닌성 수용체를 발현한다 (Hartley et al., 1999, J. Comp. Neurol., 407, 1-10).

전구 세포의 신경 분화

문헌 [Leypoldt F., et al., 2001, (Neurochem. 76, 806-814)]에 의해 수행된 NTERA2 세포의 신경 분화는 간단히 다음의 것을 포함하였다. 세포를 통상적으로 5% 우태아 혈청을 보충한 OptiMEM (인비트로겐) 배지에 37℃에서 5% CO₂ 내에서 유지하였다. 세포 응집 (1x10⁶ 세포/ml)을 10% 우태아 혈청이 존재하는 고 글루코스 DMEM (인비트로겐)이 담긴 세균학적 플레이트에서 수행하였다. 일야 경과 후에, 배지에 1 μM 트랜스-레티노산을 보충하였다. 배지 및 배양 접시를 3일마다 교체하였다. 레티노산의 존재를 21일 동안 유지한 후, 세포 응집물을 응집 배지 [유사분열 억제제 시토신-D-아라비노푸라노시드 (10 ㎍/ml) 및 우리딘 (1 ㎍/ml)을 보충한] 내의 폴리-D-라이신 및 라미닌 (둘 모두 10 ㎍/ml) 세포 배양액 처리된 접시에 옮겼다. 상기 조건을 ~7일 동안 유지하고, 배지를 2-3일마다 교환하였다. 상기 연장된 프로토콜 (~4주 지속함)은 고비율의 NTERA2 세포의 뉴런으로의 효율적인 분화를 촉진한다.

또한, 기능성 시냅스를 발현하는 뉴런 세포가 NTERA2 세포로부터 생성되었다. 문헌 [Hartley et al., 1999, (J. Comp. Neurol., 407, 1-10)]에서는 NTERA2 세포를 1차 성상세포와 동시 배양하였고, 생성되는 뉴런은 글루타메이트성 및 GABA성 시냅스를 생성한다 (또한, 그의 시험관내 생활력은 >1년으로 연장되었다). 1차 성상세포를 문헌 [Cadelli, D.S. and Schwab, M.E., 1991, (Ann. N.Y. Acad., Sci., 633, 234-240)]의 방법에 따라 18-21일 래트 배아의 대뇌반구로부터 단리하였다. NTERA2 뉴런 (1x10⁵)을 폴리-D-라이신 및 마트리겔 (Matrigel)™ (비디 바이오사이언시즈 (BD biosciences)) 코팅 커버 슬립에 접종하고, 35 mm 세포 배양액 처리 접시에서 융합성 (confluent) 성상세포와 동시 배양하였다 (접촉하지는 않음). 동시 배양은 성상세포-조건화 배지로 1:1 보충한 고글루코스 DMEM에서 유지하였다. 6주 후에, 전자 현미경사진은 시냅스의 존재를 표시하고, 시냅신 I 발현은 면역조직화학에 의해 입증하였다. 글루타메이트성, GABA성 및 NMDA 전달은 각각 선택적 길항제 CNQX (10 μM), 비쿠쿨린 (20 μM) 및 APV (100 μM)을 사용하여 전기생리학에 의해 확인하였다.

미분화된 인간 ES 세포 (NTERA2 세포와 마찬가지로)는 마커 Oct4, SSE3, TRA-1-60 및 TRA-1-81을 발현하고, 이들은 모두 분화 시에 하향-조절된다. 레티노산, 디메틸 술폭시드 (DMSO) 또는 헥사메틸렌비스아세트아미드를 사용한 뉴런 분화시에, 유도체 ES 세포는 ES 마커의 하향-조절, 및 신경 강글리오시드 당지질 GD2, GD3 및 A2B5의 증가된 발현을 보인다 (Draper J., et al., 2002, J. Anat., 200, 249-258). 상기 세포 표면 마커는 초기 분화하는 세포로부터 유망한 신경 전구체를 단리하기 위해 종종 사용된다. 신경 계통으로부터 세포의 단리를 위한 다른 유용한 마커는 N-CAM, neuroD1, NSE, 네스틴 β-튜불린 및 무사시-1을 포함한다. 희소돌기아교세포는 마커 Olig-1, -2 -3 및 -4를 사용하여 확인될 수 있다 (Jackson J.P., et al., 2007, Techniques for neural differentiation of human EC and ES cells. In, Culture of human stem cells eds. Freshney R.I., Stacey, G.D. & Auerbach J.M. J. Wiley & Sons, Inc.).

전구 세포의 신경 분화를 촉진하는 방법은 세포 응집을 포함한다. 상기 방법은 통상적으로 ES 및 EC 세포 (NTERA2, P19 및 PC12 포함)의 분화를 유도하기 위해 사용된다. 세포 응집은 세포 접촉을 증가시키고, 생체내 발생 및 시험관내 분화의 중요한 측면인 세포내 신호전달을 촉진한다. 초기 신경 분화 기술은 혈청-함유 배지에 레티노산을 이용하였지만, 이들은 이제 보다 잘 규정된 무혈청 방법으로 대체되고 있다.

신경 분화 - 무혈청 규정 배지

무혈청 규정 배지를 사용하여 세포 응집 기술에 의한 EC 및 인간 ES 세포로부터 신경구 (neurosphere)의 생성은 NTERA2 세포로부터 방사 아교세포를 생산하는 것으로 나타났다 (Marchal-Vitorion S., et al., 2003, Cell Neurosci., 24, 198-213). 이것은 다단계 과정이고, 신경구는 배지에 FGF-2를 보충하면 무한하게 유지될 수 있다. 인간 ES 세포를 사용하여 FGF-2 공급 중단시에, 신경구는 성상세포, 뉴런, 및 희소돌기아교세포로 분화한다 (Zhang, S.C. et al., 2001, Nat. Biotechnol. 19, 1129-1130).

신경구를 생성하기 위해, 문헌 [Marchal-Vitorion S., et al., 2003, Cell Neurosci., 24, 198-213]에서는 N2 (라이프 테크놀로지스 (Life Technologies)), 글루타민 (2 mM), 글루코스 (0.6% w/v), 인슐린 (20 ㎍/ml), 헤파린 (2 ㎍/ml), EGF (20 ng/ml) 및 FGF (10 ng/ml)를 보충한 무혈청-규정 배지 DMEM/F12 (인비트로겐)가 담긴 25 cm² 플라스크 (1 x 10⁵ 세포/ml)에서 성장한 NTERA2 세포를 사용하였다. 신경 분화를 유도하기 위해, 생성된 세포 응집물 또는 신경구를 해리시키고, 폴리-D-라이신-코팅된 접시 상에 5x10⁵ 세포/cm²로 접종하고, 성장 인자가 없는 혈청-규정 배지에서 추가로 10일 동안 배양하였다. 상기 NTERA2 신경구는 후속적으로 큰 비율의 미성숙 뉴런 (~ 50%)을 희소돌기아교세포 계통의 세포와 함께 생성하는 것으로 밝혀졌다.

불활성화된 마우스 배아 섬유모세포 피더층 상에서 성장한 인간 ES 세포주 H1 및 H9를 사용하여 문헌 [Zhang, S.C. et al., 2001, (Nat. Biotechnol. 19, 1129-1130)]에서는 혈청의 부재 하에, 그러나 FGF-2의 존재 하에 신경-유사 구조를 보인 신경 전구체 세포를 생성하였다. FGF-2의 제거 시에, 이들 세포는 뉴런, 성상세포 및 희소돌기아교세포로 분화되었다. ES/섬유모세포 동시 배양액의 통상적인 유지는 20% v/v 혈청 대체물 배지 (인비트로겐), β-머캅토에탄올 (0.1 mM), 헤파린 (2 ㎍/ml) 및 FGF-2 (4 ng/ml)를 보충한 DMEM/F12 배지로 구성된 ES 세포 배지에서 수행하였다. 분화를 유도하기 위해, ES 세포 콜로니를 디스파제 (Dispase)™ (0.1 mg/ml 인비트로겐)를 사용하여 제거하고, FGF-2가 없는 규정된 ES 세포 배지 내에 재현탁하였다. 세포를 매일 배지를 교체하면서 25 cm² 세포 배양 플라스크에 부유 배상체로서 배양하였다. 4일 후에, 배상체를 인슐린 (25 ㎍ /ml), 트랜스페린 (100 ㎍/ml), 프로게스테론 (20 nM), 푸트레신 (60 μM), 나트륨 셀레나이트 (30 nM), 헤파린 (2 ㎍/ml) 및 FGF-2 (20 ng/ml)를 보충한 DMEM/F12 내에 재현탁시켰다. 분화하는 배상체를 ~10일 동안 배양한 후, 부착을 방지하기 위해 폴리-(2-히드록시에틸-메타크릴레이트)로 코팅된 새로운 플라스크에 옮겼다.

희소돌기아교세포를 생성하기 위해, ES-세포 유래된 신경 전구체 세포를 FGF-2의 부재 하에 N1 (인비트로겐) 및 PDGF-1 (2 ng/ml)을 보충한 DMEM 내에서 배양하였다. ~2주 후에, 일반적인 희소돌기아교세포 형태를 갖는 olig4-양성 세포가 관찰되었다.

뉴런 분화는 FGF-2 (20 ng/ml)의 존재 하에 DMEM/F12, N2 (인비트로겐), cAMP (100 ng/ml) 및 BDNF (10 ng/ml)로 이루어지는 배지 내에서 오미틴/라미닌에 대해 세포를 배양함으로써 수행하였다. ~10일 후에, 부착 구체로부터 나오는 섬유 융기가 관찰되었다. 대다수의 세포는 뉴런 마커 MAP2ab 및 β-튜불린을 발현하였다.

신경 분화 - 동시 배양

ES 및 EC 신경 분화의 효율을 증가시키기 위한 추가의 노력에서는 다른 세포주, 예를 들어 PA6 간질 세포와의 동시 배양을 이용하였다 (Scwartz et al., 2005, Stem Cell Dev., 14, 517-534). 저자는 NTERA2 세포 (2000 세포/ml)를 PA6 세포의 융합성 단일층 상에서 동시 배양하였다. PA6 세포를 10 ㎍/ml 미토마이신-C로 불활성화시켰다. 동시 배양액을 이전에 설명된 것과 유사한 분화 배지 내에 유지하였다 (Leypoldt F., et al., 2001, Neurochem. 76, 806-814). 22일 후에, 티로신 히드롤라제는 NTERA2 뉴런의 86%에서 검출되었고, 이것은 성숙 도파민성 표현형의 존재를 나타낸다. 분화 과정을 촉진하는 인자(들)이 여전히 충분히 특성화되지 않았기 때문에, PA6 간질 세포 조건화 배지의 사용은 도파민성 표현형을 생성하는데 덜 효과적인 것으로 나타났다.

신경 분화 - 단일층

다른 신경 분화 방법은 단일층으로의 인간 ES 세포의 분화에 기초하였다 (Gerrard, L., et al., 2005, Stem Cell, 23, 1234-1241). 상기 연구에서는 ES 세포 배양액에 BMP 억제제 노긴 (noggin)의 첨가가 신경 전구 세포의 생성을 일으킴을 보여주었다. 이 방법에서는 FGF-2 (20 ng/ml)를 보충한 마우스 배아 섬유모세포 조건화 배지 내에서 마트리겔™ (비디 바이오사이언시즈) 상에서 성장하는 ES 세포를 이용하였다. 신경 분화를 위해, 융합성 ES 세포를 100 ng/ml 노긴을 보충한 N2B27 신경 분화 배지 (인비트로겐) 내에서 배양하였다. 제3 계대배양 (passage)에서, 세포를 단일 세포로 해리시키고, FGF-2를 보충한 N2B27 내에서 배양하였다. 상기 프로토콜은 신경 전구세포의 생성을 일으켰고, 이때, ~97%의 세포가 신경 마커 무사시를 발현한다. 티로신 히드롤라제 발현 뉴런, 및 신경 전구 세포는 N2B27-처리된 세포를 폴리-L-라이신/라미닌-코팅된 접시에 접종하고, 2주 동안 소닉 헤지호그 (sonic hedgehog) (300 ng/ml), FGF-8 (100 ng/ml) 및 아스코르브산 (160 μM)을 보충한 N2B27 배지 내에서 배양함으로써 생성하였다. 2주 후에, 소닉 헤지호그를 회수하고, BDNF (20 ng/ml), GDNF (20 ng/ml), 아스코르브산 (160 μM) 및 라미닌 (500 ng/ml)으로 교체하였다.

본 문헌에 설명된 많은 신경 분화 방법 중 몇몇의 상세한 설명은 문헌 [Jackson J.P., et al., 2007, Techniques for neural differentiation of human EC and ES cells. In, Culture of human stem cells eds., Freshney R.I., Stacey, G.D. & Auerbach J.M. J.Wiley & Sons, Inc.)]에 제시되어 있다. 설명된 실시예 프로토콜은 레티노산에 의한 인간 EC 세포 신경 분화의 유도, 배상체 내에서 인간 ES 세포 신경 분화, 및 인간 Es 세포로부터 신경구의 유도화 및 분화를 포함한다.

실시예 1 - 레티노산에 의한 인간 EC 세포 신경 분화의 유도.

NTERA2 세포를 37℃에서 공기 중 10% CO₂ 내에서 성장 배지 (DMEM, 4.5 g/l 글루코스 및 10% v/v 우태아 혈청) 내에 유지하였다. NTERA2 세포를 분화 배지 (10 μM 레티노산을 보충한 성장 배지) 내에 75 cm² 플라스크 당 1x10⁶ 세포로 접종하였다. NTERA2 세포는 2-3일 내에 신경 분화를 하고, 뉴런은 ~10일 후에 나타난다.

실시예 2 - 배상체 (세포 응집) 내에서 인간 ES 세포 신경 분화

대수 성장하는 ES 세포를 배상체 (EB) 배지 (DMEM 낙아웃 (knockout), 20% 낙아웃 혈청 대체물, 1% 비-필수 아미노산, 1mM β-머캅토에탄올 및 1 mM 글루타민) 내에 재현탁시키고, 세포 부착을 방지하기 위해 100 mm 코닝 초저 결합 세포 배양 또는 세균 배양 접시 내에서 37℃에서 공기 중의 5% CO₂ 내에서 배양하였다. 배지를 격일로 교체하였다. 현탁액 내에서 ~21일 후에, 분화된 EB가 존재하였다. 이들을 젤라틴-코팅된 표면 상에서 EB 배지 내에 25 cm2당 50 배상체의 밀도로 플레이팅하였다. 신경 분화는 재플레이팅의 ~24시간 후에 부착된 배상체로부터 돌출물 (outgrowth)로서 보인다.

실시예 3 - 인간 ES 세포로부터 신경구의 유도화 및 분화

융합성 ES 세포를 EB 배지 내에 재현탁시키고, 25 cm2 세포 배양 플라스크 내에 37℃에서 공기 중 5% CO₂ 내에서 4일 동안 넣었다. 배지를 매일 교환하였다. ~4일 후에, EB를 DMEM/F12, N2 보충물, FGF-2 (20 ng/ml), 인슐린 (20 ㎍/ml) 및 헤파린 술페이트 나트륨염 (2 ㎍/ml)으로 이루어진 신경구 배지 내에 넣고, 젤라틴-코팅된 25 cm2 플라스크 내로 플레이팅하였다. 배지를 격일로 교체하였다. ~10일 후에, 신경 로제트 (rosette)가 보인다. 바실러스-유래된 중성 메탈로프로테아제 디스파제™(100 ㎍/ml -인비트로겐)을 사용하여 응집되지 않은 신경 로제트를 떼어내고, 이들을 신경구 배지 내에 재현탁시키고, DMEM/F12 코팅된 플라스크 내에 1% 아가로스 상으로 분배하였다. 신경구를 신선한 신경구 배지로 5일마다 처리하고, 2-3주마다 계대 배양하였다. 분화 연구를 위해, 신경구를 신경구 배지 내에 젤라틴-코팅된 플라스크 상으로 접종하고, 몇몇 계대배양 후에 신경구-유래된 세포는 배양액 내에서 가장 우세한 세포 종류가 될 것이다. 이들 세포는 보통 초기 신경 마커, 예를 들어 무사시-1 및 네스틴에 대해 양성이다. 이어서, 신경구는 상기 개략한 것과 같은 방법, 즉, ([Marchal-Vitorion S., et al., 2003 (Cell Neurosci., 24, 198-213)] 및 [Zhang, S.C. et al., 2001 (Nat. Biotechnol. 19, 1129-1130)])의 방법을 이용하여 효율적으로 분화될 수 있다.

신경 분화의 억제제

[1] 아데노신 디알데히드

S-아데노실메티오닌 (AdoMet)는 DNA 메틸화를 비롯한 광범위한 생물학적 메틸화 반응을 위한 범용 메틸 공여기이다. 유전자는 CpG 로커스의 메틸화에 의해 전사적으로 불활성화될 수 있고, 이것은 세포 분화 과정과 때때로 연관된다. 예를 들어 신경 분화는 단계-특이적 유전자 활성을 제어하는 유전적 프로그램의 케스케이드를 요구한다. 이들 활성은 전사 수준에서뿐만 아니라 DNA 메틸화를 비롯한 후생적 변형에 의해 제어된다.

Adomet-의존적 메틸트랜스퍼라제에 의해 수행된 메틸화 반응은 2가지 생성물, 즉, 메틸화된 기질 및 부산물 Ado-호모시스테인 (AdoHcy)의 생성을 일으키고, 후자는 자체가 Adomet-의존적 메틸트랜스퍼라제의 강력한 억제제이다. AdoHcy는 효소 S-아데노실호모시스테인 히드롤라제 (SAHH)에 의해 아데노신 및 호모시스테인로 더욱 파괴된다. 따라서, SAHH의 억제는 메틸트랜스퍼라제 억제제 AdoHcy의 축적을 일으킨다. 아데노신 디알데히드 (AdOx)는 SAHH의 강력한 억제제이고, 따라서, 간접적으로 Adomet-의존적 메틸트랜스퍼라제 및 그에 의해 뉴런 분화의 강력한 억제제이다.

P19는 앞서 설명된 바와 같이 레티노산의 존재 하에 세포 응집 방법에 의해 뉴런으로 분화될 수 있는 배아 암종 세포이다. 그러나, 분화 과정의 제1일에 세포를 AdOx (1 μM)에 노출시키면 i) 관찰된 신경돌기의 수 및 ii) 뉴런 마커 β-튜불린, NeuroD1 및 mash1의 발현 수준을 감소시켰다. 따라서, AdOx는 그의 Adomet-의존적 메틸트랜스퍼라제의 간접적인 억제를 통해 P19 세포에서 뉴런 분화를 중단시킨다 (Hong, S. et al., 2008, Biochem. Biophys. Res. Commum., 377, 935-940).

[2] D-테오-1-페닐-2-데카노일아미노-3-모르폴리노-1-프로판올 (D-PDMP)

강글리오시드는 신경 발생에서 관련되었다. P19 EC 세포를 포함한 시험관내 뉴런 분화 모델을 이용하여 (Liour S.S. & Yu R.K., 2002, (Neurochemical Res. 27, 1507-1512)), 강글리오시드 생합성 억제제 D-테오-1-페닐-2-데카노일아미노-3-모르폴리노-1-프로판올 (D-PDMP)이 신경돌기 돌출을 억제하고, 궁극적으로 P19-유래된 뉴런의 사멸을 일으켰음을 입증하였다.

P19 EC 세포 (접시당 1 x 10⁶ 세포)를 2.5% 우태아 및 5% 송아지 혈청을 보충한 α-MEM (인비트로겐) 내에서 배양하였다. 이들을 4일 동안 세균 등급 접시 내에서 5 μM 레티노산의 존재 하에 분화하도록 유도하고, 그 후 레티노산이 없는 성장 배지 내에 분산시키고 폴리-라이신 코팅된 세포 배양 접시 상에 플레이팅하였다. 배지를 ~3일마다 교체하였다. 강글리오시드 억제제 D-PDMP (50 μM)를 레티노산 처리의 3일 전에 첨가하고, 분화 과정 내내 유지시켰다. 결과는 D-PDMP가 i) 세포 사멸의 어떠한 표시 없이 미분화된 P19 EC 세포의 증식을 감소시키고, ii) 신경돌기 신장을 폐지함을 보여주었다 (주의 - 신경돌기는 존재하지만 정확하게 발달하지 못하였다). 다른 강글리오시드 억제제를 사용하여, 뉴런 분화에 대한 D-PDMP의 효과가 전적으로 강글리오시드 생합성의 억제에만 관련되지 않았음을 입증할 수 있었다.

[3] 인도카르바조스타틴

인도카르바조스타틴 A, B, C 및 D는 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 종에 의해 생성되고, 모두 래트 PC12 세포의 NGF-유도된 뉴런 분화의 억제제인 것으로 입증되었다 ([Matsuura N et al. 2002, J. Antibiotics 55, 355-362] 및 [Feng, Y. et al., J. Antibiotics 57, 627-633]). 간단히 설명하면, PC12 세포를 0.35% 글루코스, 10% 우태아 혈청 및 10% 말 혈청을 보충한 DMEM 내에서 성장시켰다. PC12 세포를 96-웰 콜라겐 타입 1 코팅된 플레이트의 웰 내로 플레이팅하였다. 12시간 후에, 인도카르바조스타틴을, 12시간 후에 NGF를 첨가하였다. 뉴런 분화는 신경돌기 융기의 생성을 관찰함으로써 모니터링하였다.

[4] 인돌로카르바졸

래트 PC12 세포의 NGF-유도된 뉴런 분화의 인도카르바조스타틴-매개된 억제에 대해 상기 설명된 것과 유사한 실험에서, 인돌로카르바졸 K-252a 및 b는 또한 신경 분화의 효과적인 억제제인 것으로 입증되었다 (Matsuura N et al. 2002, J. Antibiotics 55, 355-362). 이들 화합물은 명백하게 p140 trk 티로신 키나제 NGF-수용체를 억제함으로써 신경돌기 신장의 억제를 매개한다.

[5] 2'-아미노-3'-메톡시플라본 (PD98059)

PD98059는 MAPK/ERK 키나제 1 (MAP 키나제 키나제 1 또는 MEK1)의 강력하고 세포-투과가능한 선택적 억제제이다. 이것은 MEK1의 활성화을 차단하고, 따라서, MAP 키나제의 후속적인 인산화 및 활성화를 억제한다. 문헌 [Pang, L. et al., 1995 (J. Biol. Chem. 270, 13585-13588)]에서는 PD98059가 세포 생활력을 해치지 않으면서 PC12 세포에서 NGF-유도된 신경돌기 형성을 완전히 차단함을 입증하였다. 이것은 MAP 키나제 경로가 PC-12 세포에서 NGF-유도된 뉴런 분화에 중요한 것으로 보임을 나타낸다.

[6] [7-(벤조일아미노)-4,9-디히드로-4-메틸-9-옥소-피라졸로[5,1-b]퀴나졸린-2-카르복실산] PD90780

치환된 피라졸로퀴나졸리논 PD90780은 NGF와 상호작용하여, p140 trk 티로신 키나제 NGF-수용체 및 공통적 뉴로트로핀 수용체 p75NTR에 대한 그의 결합을 방지한다. NGF의 결합 억제는 PC12 세포의 NGF-매개된 뉴런 분화를 폐지한다 (Spiegel K et al. 1995 Biochem. Biophys Res Commun. 217, 488-494).

[7] AG870

AG-879는 티르포스틴 (tyrphostin) 패밀리의 티로신 키나제 억제제의 구성원이다. 이것은 EGF 또는 PDGF 수용체 인산화를 억제하지 않으면서 p140 trk 티로신 키나제 NGF-수용체 자가인산화를 선택적으로 억제한다 (IC₅₀=10 μM). 상기 화학물질과 같이, AG-879는 또한 PC12 세포에서 NGF-유도된 신경돌기 돌출을 억제한다 [Ohmichi M et al. 1993, Biochemistry 4, 324650-4658].

신경 발생에 대한 상기 설명된 것과 같은 억제제 (및 화학물질, 약물 또는 화장품)의 효과를 전구 세포 분화 동안 모니터링할 수 있다. 전구 세포를 억제제에 노출시키고, 분화의 정도를 모니터링함으로써 세포 발생 과정에 대한 효과를 평가할 것이다. 이것은 정량적 면역-세포화학과 같은 기술에 의해 분화된 세포 종류와 연관된 세포/조직 특이적 마커의 발현을 측정함으로써 달성할 수 있다.

신경 발생을 표시하는 특이적 신경 세포 마커는 다음의 것을 포함한다 (앱캠 인크.로부터 상업상 이용가능한 항체를 또한 기재한다).

신경 줄기 세포 마커 - 초기 마커

[1] 아그레칸 ARGxx (항체 BC-3, ab3773) - 신경 전구체 세포에서 검출됨.

[2] CD133 (항체 32AT1672, ab5558) - 신경 및 배아 줄기 세포에 대한 마커.

[3] Dlx5 (항체 ab54729) - 신경 발생 동안 전사 조절인자.

[4] EMX2 (항체 ab11849) - Emx2는 Otx1/2와 함께 CNS의 발생하는 대뇌 피질에서 세포 운명을 특정하기 위해 관련되는 호메오박스 단백질이다.

[5] 네스틴 (항체 10C2, ab22035) - 초기 배아 신경상피 줄기 세포에서 발현됨. 네스틴은 줄기/전구 세포, 신경아교종 세포에 대한 마커로서 널리 사용된다.

[6] NeuroD1 항체 (ab60704) - 신경발생에서 중요한 분화 인자.

신경 줄기 세포 마커 - 후기 마커

[1] BRN3A (항체 ab30880) - 전사 인자 (뉴런 유전자의 조절에 관련됨).

[2] BRN3B(항체 ab32264) - 시각계 뉴런의 하위세트의 정체를 결정하는, 신경절 세포의 하위집단 내의 망막에서 발견됨.

[3] 무사시 1/Msi1 (항체 ab60600) - 신경 줄기 세포에서 발현됨.

[4] NR2E1/테일리스 (항체 ab66125) - 뇌에서 발현됨.

[5] 뉴클레오스테민 (항체 ab52784) - 배아 및 성인 CNS 줄기 세포에서 발견됨.

[6] Oct6 (항체 ab72681) - 배아 줄기 세포 및 발생하는 뇌에서 발현되는, 초기 배아발생 및 신경발생에 관여되는 전사 인자.

[7] Pax2 (항체 ab55490) - 중뇌, 후뇌, 척수, 눈, 귀를 비롯한 신경계의 발생에 요구되는 전사 인자.

[8] SOX2 (항체 57CT23.3.4, ab75485) - 발생하는 신경계에서 발현되는 전사 활성인자.

[9] SOX4 (항체 154C4a, ab70598) - CNS에서 발현되는 전사 인자. 발현은 발생하는 CNS에서 증가한다.

[10] SOX10 (항체 ab27655) - 신경 능선 및 말초신경계 발생을 위해 중요한, 핵세포질 왕복 (nucleocytoplasmic shuttle) 단백질로서 작용하는 전사 활성인자.

[11] SOX11 (항체 ab50194) - SOX11은 발생하는 신경계에서 중요하다.

[12] SOX22 (항체 86C2a, ab54371) - 태아 뇌 및 신장과 성인 심장에서 발현되는 전사 활성인자.

[13] 비멘틴 (항체 RV202, ab8978) - 신경 줄기 세포 마커.

[14] CDw338 (항체 BXP-21, ab3380) - 조혈/신경 줄기 세포 마커.

신경 능선 세포 - 마커

[1] 뉴로게닌 1 (항체 ab66498) - 별개의 전구세포 집단에서 발현되는 전사 인자. 이것은 뉴런 발생 및 분화를 조절한다.

[2] 뉴로게닌 2 (항체 ab57560) - 신피질 (neocortex) 발생을 조절하는 전사 인자. 세포 증식에서 신경발생으로 이행에 뉴로게닌 2를 수반한다.

[3] 뉴로게닌 3 (항체 ab54743) - 이동성 신경 능선 세포로부터 신경발생에서 중요한 역할을 하는 전사 인자.

[4] MASH1 (항체 ab76987) - 신경 세포의 초기 발생에서 발현됨. 척수, 중간- 및 배쪽-전뇌의 신경상피에서 발견됨. 나중에 뇌에서 발견됨.

성상세포 - 마커

[1] 성상세포 (항체 10E4/R5, ab3268) - 성상세포 마커

[2] CaMKII (ab63377) - CNS의 키나제 (장기 상승작용 및 신경전달물질 방출에서 기능을 함).

[3] EAAT1 (항체 ab416) - 전두 피질, 해마 및 기저핵에서 발현됨.

[4] 초기 CD15 항체 (28, ab20137) - 성상세포 및 특정 상피 세포에서 발현됨.

[5] 강글리오시드 GD3 (항체 MB3.6, ab78361) - 모든 성상세포종은 GD3 항원을 발현한다.

[6] GFAP (항체 GF5, ab10062) 성상세포 마커 - 성상세포, 성장아교세포, 말초 신경절 내의 위성 세포, 쉬반 세포 및 신경 줄기 세포에서 발현됨.

[7] S100 (항체 4C4.9, ab4066) 성상세포 마커 - 성상세포, 쉬반 세포, 뇌실막세포종 및 성장아교세포종 내에 위치함.

[8] 설비빈 (Survivin) (항체 32.1, ab9178) - 성상세포 및 일부 뉴런에서 발현됨.

[9] 다른 성상세포 마커는 다음의 것을 포함한다:

ABCA1 항체 (HJ1, ab66217) & ABCA7 항체 (7A1-144, ab48265)

ALDH1L1 항체 (ab56777)

트롬보스폰딘 항체 (A4.1, ab3131).

아교세포 및 미세아교세포 - 초기 마커

[1] CNTF (항체 4-68, ab78269) - CNS 및 PNS 내에서 아교세포에서 발현됨. CNTF는 다양한 뉴런 세포 종류의 분화를 자극한다.

[2] 트위스트 (Twist) (항체 2C1a, ab50887) - 트위스트는 신경아교종에서 발현되는 전사 인자이다. 이는 CNS 발생 및 혈관신생에서 역할을 할 수 있다.

아교세포 및 미세아교세포 - 후기 마커

[1] cCD11b (항체 ab8879) - 신경 조직에서 미세아교세포 마커로서 흔히 사용됨.

[2] Iba1/AIF1 (항체 ab54749) - 미세아교세포에 의해 발현되는 Ca2+ 결합 펩티드.

[3] MRP8 (항체 2C5/4, ab19860) - 미세아교세포에 의해 발현됨.

[4] Nfasc155 항체 (ab77951) - 아교세포 내의 무수초 축삭 내의 Nfasc155.

[5] PAX6 (항체 AD2.38, ab78545) - 눈, 코, 중추신경계 및 췌장의 발생에 관여되는 전사 인자.

[6] BLBP (항체 ab27171)

BLBP는 방사 아교세포에 대한 분자 마커로서 사용될 수 있다 (주요 신경 전구 세포 종류 및 스캐폴딩 (scaffolding) 지지 뉴런 이동)

푸르키니에 세포 - 초기 마커

[1] L1CAM (항체 2C2, ab24345) - 신경외배엽 조직에서 발현됨. 축삭 성장, 신경 이동에, 및 뉴런 분화를 매개하는데 관여됨.

푸르키니에 세포 - 후기 마커

[1] PTP 제타 (항체 ab78019) - 뇌에서 발생상 조절되고, CNS에서 발현되고, 여기서는 이것은 소뇌의 푸르키니에 세포층, 치상회 (dentate gyrus), 및 외측 뇌실의 전각의 상의하세포층 (subependymal)에 위치한다.

[2] NSMase2 (항체 ab68735) - 뉴런, 푸르키니에 세포, 피라미드 세포, 치상회 과립층의 뉴런, 및 교뇌핵 내의 뉴런에 제한됨. 시상하부 핵, 조롱박 (piriform) 피질 내의 뉴런, 및 뇌간의 핵에도 존재함.

[3] 알돌라제 (항체 1F8, ab67204) - 알돌라제 C는 뇌 및 신경에서 발현된다.

[4] 프레세레벨린 (Precerebellin) (항체 ab36909) - 뇌-특이적 세레벨린의 전구체. 활성형은 소뇌 푸르키니에 세포의 시냅스후 구조 내에 및 등쪽 와우 (cochlear) 핵의 차륜 (cartwheel) 뉴런 내에 풍부하다.

[5] 칼빈딘 (Calbindin) (항체 CL-300, ab9481) - 소뇌 푸르키니에 세포에 대한 마커

뉴런 - 초기 마커

[1] PROX1 (항체 ab57746) - CNS의 초기 발생에서 기초 역할을 함. 이것은 유사분열후 미분화된 어린 뉴런의 유전자 발현 및 발생을 조절한다.

[2] CD90 (항체 1.BB.730, ab62009) - 신경 세포, T 세포, 초기 조혈 전구세포, 섬유모세포, 뉴런, 및 쿠퍼 (Kupffer) 세포 상에서 발현됨.

[3] UCHL1/3 (항체 ab75275) - 뉴런 발생의 조절에서 역할을 함.

[4] PLAGL1 (항체 ab55659) - 초기 뇌 발생 동안 뉴런-상피에서 발현됨.

[5] HLXB9 (항체 EPR3342, ab79541) - 발생하는 척추동물 CNS에서 운동 뉴런에 의해 선택적으로 발현되는 호메오박스 유전자는 뉴런 운명을 발생학적으로 조절한다.

[6] NeuroD2 항체 (ab66607) - 뉴런 분화 및 생존을 유도한다.

[7] NEUROD4 항체 (ab67168) - 뉴런 분화를 매개한다.

[8] NEUROD6 항체 (ab77998) - 뉴런 분화 및 성숙에 관여된다.

뉴런 - 중간 마커

[1] NNPTX2 (항체 ab69858) - 흥분성 시냅스생성에서 역할을 하는 뉴런 최조기 유전자.

[2] 뉴로글리칸 C (항체 ab56941) - CNS에서 뉴런 회로 형성에 관여됨.

[3] TBR2 (항체 ab58225) - 전사 인자 (발생 동안 중간 전구 세포에 의해 발현됨). IPC는 뇌실 대역 (VZ) 또는 뇌실하 대역 (SVZ)으로 나누어지고, 엄격한 뉴런 집단을 생성한다.

뉴런 - 후기 마커

[1] SIRP (항체 OX-41, ab9295) - 골수양 세포 및 뉴런에 의해 발현됨,

[2] 어탁신 (Ataxin) 7 (항체 ab11434) - 세포질 내에 및 정상 뇌 뉴런의 핵막 상에 위치함.

[3] GIRK2 (항체 ab30738) - 뉴런 GIRK2 채널은 뉴런의 흥분성 조절에 관여되고, 휴식 전위에 기여할 수 있다.

[4] 프로필린 2 (항체 ab55611) - 프로필린 2는 뉴런 특이적이다.

[5] AP180 (항체 AP180-I, ab11329) - 뉴런 기원의 세포에 제한된 발현.

[6] PGP9.5 (항체 ab27053) 뉴런 마커 - PGP9.5의 발현은 뉴런에, 및 산재성 신경내분비계의 세포 및 그들의 종양에 고도로 특이적이다.

[7] SorCS1 (항체 ab16641) 뉴런 마커 - SorCS1 면역반응성은 뇌 전체에서 뉴런의 집단 내에 널리 분포한다.

[8] Nova1 (항체 ab77926) - Nova1은 뉴런-특이적 RNA-결합 단백질이다.

[9] NSE (항체 ab944) 뉴런 마커 - 뉴런 특이적 에놀라제는 주로 뉴런에서, 정상 및 종양 신경내분비 세포에서 발현된다.

[10] HB Hu 단백질 (항체 16A11, ab14370) - 척추동물 뉴런 단백질의 Hu 패밀리의 구성원 내에 존재하는 보존된 펩티드 에피토프에 특이적으로 결합한다.

[11] ELAVL4 (항체 16C12, ab14369) - 뉴런-특이적 RNA 처리에서 일정 역할을 할 수 있다. 이것은 뇌 조직에 위치한다.

[12] SAPAP3 (항체 ab67224) - 뉴런 세포에서 시냅스후 영역에 위치함.

[13] 초기 Ki67 항체 (PP-67, 526) - Ki67은 뉴런 마커로서 통상적으로 사용된다.

[14] MAP2 (항체 HM-2, ab11267) 뉴런 마커 - MAP2는 뇌 조직의 주요 미세관 회합 단백질이다.

[15] 수초 기초 단백질 (항체 MBP101, ab62631) - 수초막의 풍부한 단백질 성분. 초기 뇌 발생에서 역할을 할 수 있음.

[16] 키네신 (항체 ab25715), 키네신 2 (항체 K2.4, ab24626) 및 키네신 5A (항체 ab5628) - 뉴런 세포에서 소포 (vesicle) 수송에 관여됨. 5A는 뉴런-특이적이다.

[17] NeuN (항체 A60, ab77315) - 뉴런-특이적 핵 단백질은 뉴런에 대한 마커이다. NeuN은 신경계, 소뇌, 대뇌 피질, 해마, 시상 및 척수 전체에서 발견된다.

[18] Nfasc186 (항체 ab31719) - 뉴런 내에서 랑비어 (Ranvier) 결절에서 발현됨.

[19] Pin1 (항체 ab12107) - 알츠하이머 질병의 기초가 되는 타우 (tau) 병리학에 관련됨. Pin1은 정상 뉴런 기능의 유지를 위해 중추가 될 수 있다.

[20] 뉴로리긴 3 (항체 ab57375) - 뉴로리긴 3은 뉴런 세포 표면 단백질이다.

[21] PDGF 베타 수용체 (항체 Y92, ab32570) - 뉴런 상에서 발현됨.

[22] 코필린 (항체 ab54532) - 코필린은 도처에서 발현되지만, 특히 뉴런에서 발현된다.

해마 뉴런

[1] SynGAP (항체 EPR2883Y, ab77235) - 해마 뉴런 내의 시냅스에서 독점적으로 발현됨.

종뇌 뉴런

[1] 시냅토폰딘 (항체 ab50485) - 종뇌 뉴런의 가시돌기 기구 (spine apparatus)의 형성에 필수적임. 시냅스 형성성에 관여됨.

도파민성 뉴런 - 초기 마커

[1] PITX3 (항체 ab30734) - 도파민성 뉴런의 분화를 조절하는 전사 인자,

[2] Nurr1 (항체 ab12261) - 배아 배쪽 중뇌에서 발현되는 전사 인자. 도파민 뉴런의 발생 및 유지를 위해 필수적임.

[3] AMSX1 (항체 4F11, ab73883) - Wnt1과 함께 중뇌 도파민성 전구세포 도메인을 확립하는 작용을 함, 뉴런 집단을 발생시킴.

도파민성 뉴런 - 후기 마커

[1] 티로신 히드록실라제 (항체 185, ab10372) 뉴런 마커 - TH는 아드레날린성 뉴런의 생리학에서 역할을 하고, 자주 도파민성 뉴런에 대한 마커로서 사용됨.

[2] 도파민 D2 수용체 (항체 ab30743) - 뇌하수체 및 뇌에서 발현됨.

ALDH1A1 (항체 ab23375) - 등쪽 망막, 배쪽 중뇌 (도파민성 뉴런) 및 조혈 줄기 세포에서 발현됨.

[3] DOPA 데카르복실라제 (항체 ab3905) - 신경전달물질: 도파민 및 세로토닌의 합성에 관련되는 효소.

콜린성 뉴런

[1] 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (항체 ab54599) - 말초 및 중추신경계 모두에서 콜린성 뉴런에 대한 특이적 마커로서 역할을 함.

감각 뉴런

[1] 신탁신 (Syntaxin) 및 2 (각각 항체 4H256, ab18010 및 ab12369) - 감각 뉴런의 말단, 및 작은 혈관에 도달하는 신경에 위치하는 뉴런 신탁신.

통각 뉴런

[1] 페리페린 (항체 2Q135 ab17999) 통각 (통증) 뉴런 마커 - 말초 신경절 및 그들의 융기의 뉴런에서 발견됨.

운동 뉴런

[1] Islet 1 (항체 ab20670) 신경 줄기 세포 마커 - 신경관 운동 뉴런 분화 및 췌장 섬세포의 배아발생에서 역할을 하는 전사 인자.

[2] Islet 2 (항체 ab26117) 신경 줄기 세포 마커 - 운동 뉴런의 하위클래스를 규정하는 전사 인자.

추체 뉴런 - 초기 마커

[1] Emx1 (항체 ab32925) - 호메오박스 유전자 특이적으로 발현된 피라미드 뉴런. Emx1은 피라미드 뉴런 및 피라미드 세포 계열의 신뢰가능한 마커이다.

[2] TBR1 (항체 ab56994) - 대뇌 피질에서 발현됨. 초기 배아발생 동안, 이것은 고피질, 변연피질 및 neo-피질 domain을 구분한다.

추체 뉴런 - 후기 마커

[1] 히포칼신 (항체 ab24560) - CNS에 제한되고, 해마 CA1 영역의 피라미드 세포에서 가장 풍부함.

희소돌기아교세포 - 초기 마커

[1] A2B5 (항체 2Q162, ab68385) - 발생하는 희소돌기아교세포 전구세포 및 신경내분비 세포에서 발현되는 세포 표면 강글리오시드 에피토프.

[2] PDGF 알파 수용체 (항체 Y92, ab32570) - 희소돌기아교세포 전구 세포에서 발현되는 알파 하위단위.

[3] Olig1 (항체 ab21943) - Olig1은 희소돌기아교세포의 형성을 촉진한다.

[4] Olig2 (항체 ab56643) - 희소돌기아교세포, 척수 운동 뉴런을 위해, 및 후뇌에서 체세포 운동 뉴런의 발생을 위해 요구되는 전사 인자.

[5] OSP (항체 ab7474), 희소돌기아교세포 마커 - 발현은 발생 동안 고도로 조절되고, 이것은 희소돌기아교세포의 성장 및 분화에서 역할을 할 수 있다.

[6] Olig3 항체 (ab78006) - Olig3은 배아 중추신경계의 상이한 종류의 전구세포에서 일시적으로 발현된다.

희소돌기아교세포 - 중간 마커

[1] 소르틸린 (Sortilin) (항체 ab16640) - 뇌, 척수 및 근육에서 발현됨. 소르틸린은 뉴로텐신에 대한 수용체로서 작용한다. 소르틸린은 배아발생 동안 발현된다.

희소돌기아교세포 - 후기 마커

[1] 수초 희소돌기아교세포 당단백질 (항체 F3-87-8, ab24022) - MOG는 수초화 희소돌기아교세포의 표면 상에서 발견된다.

[2] CNPase (항체 11-5B, ab6319) 희소돌기아교세포 마커 - 희소돌기아교세포 및 쉬반 세포에 의해 발현됨.

[3] 수초 PLP (항체 plpc 1, ab9311), 희소돌기아교세포 마커 - CNS에서 가장 우세한 수초 단백질. 희소돌기아교세포 발생 및 축삭 생존에 관여됨.

[4] CaMKII (항체 ab63377) - 시냅스후 치밀질의 주요 성분으로서 뇌에 풍부한 도처에 존재하는 키나제.

신경내분비 세포

크로모그래닌 (Chromogranin) A (항체 23A1, ab36997) - 신경내분비 세포에서 발현됨.

축삭

[1] 신경필라멘트는 뉴런 축삭, 교감신경 신경절 세포 및 수상돌기의 주요 구조 요소를 구성한다.

200 kD 신경필라멘트 헤비 (Heavy) (항체 ab8135)

160 kD 신경필라멘트 미디엄 (Medium) (항체 3H11, ab7256)

145 kD 신경필라멘트 (항체 2E30, ab35953)

68 kDa 신경필라멘트 (항체 DA2 ab4572)

[2] 14-3-3 (항체 2Q248, ab14121) - 뉴런에 위치하고, 신경 말단으로 축삭으로 수송됨.

[3] Fez1 (항체 ab53562) - 세포 형태학 및 축삭 유도 (guidance) 기구를 조절하는 분자의 네트워크의 성분으로서 축삭 돌출에 관여됨.

[4] 다이네인 (Dynein) 중쇄 (항체 440.4, ab6305) & 중간 사슬 1 (항체 70.1, ab6304), 미세관에서 발현됨. 다이네인은 축삭 수송에 관련되었다.

[5] 기객소닌 (Gigaxonin) (항체 ab27041) - 뉴런 기능 및 생존에 필수적이고 도처에서 발현됨.

[6] Lingo1 (항체 ab23631) - 마우스 및 인간 뇌에서 발현됨.

[7] MAP1a + MAP1b (항체 HM-1, ab66021), MAP2 (항체 ab32454), MAP1B (항체 3G5 ab3095), MAP2a + MAP2b 항체 (AP20, ab3096) - 미세관은 튜불린 및 미세관-연관 단백질로 구성된다. MAP1은 뉴런-특이적이다.

[8] 네트린 (Netrin) G1 리간드 (항체 ab31983) - 선조체 및 대뇌 피질 내의 시상 축삭에서 고도로 발현됨. NGL1은 축삭 성장을 촉진하는데 관련된다.

[9] 플렉신 (Plexin) B2 (항체 ab41098) - 이 수용체는 축삭 유도에서 핵심 역할을 한다.

[10] Robo2 (항체 ab72972) - 뉴런 발생 동안 신경관의 축삭 운행을 유도하는, Slit2 및 Slit1에 대한 수용체.

[11] Tau (항체 ab8763) 뉴런 마커 - Tau는 축삭에서 주로 발견되는 뉴런 미세관 회합 단백질이다.

[12] 튜불린 (항체 YOL1/34, ab6161) 미세관 마커 - 튜불린 패밀리는 미세관 유기화에 관여된다.

쉬반 세포

[1] NGF 수용체 (항체 MLR2, ab61425) - 쉬반 세포 및 뉴런에서 발현됨. 발생 동안, NGFR은 뉴런 성장, 이동, 분화 및 세포 사멸을 조절한다.

[2] 미엘린 (Myelin) (항체 pm432B5, ab58513) - 미엘린은 CNS에서 희소돌기아교세포 및 말초신경계에서 쉬반 세포에 의해 생산된다.

[3] 글리오메딘 (Gliomedin) (항체 ab24483) - 수초화 쉬반 세포에 의해 발현됨 (발생 동안 각각의 수초 세그먼트의 가장자리에 축적함).

[4] Lgi4 (항체 KT18, ab63289) - 쉬반 세포에서 발현됨.

[5] 수초 단백질 제로 (항체 ab31851) - MPZ의 발현 쉬반 세포에 제한된다. 이것은 말초 수초 및 신경의 주요 구조 단백질이다.

[6] Lgi4 (항체 KT18. ab63289) - Lgi4는 쉬반 세포에서 발현됨 (축삭 분리 및 수초 형성을 제어함)

수상돌기 - 초기 마커

Arg 3.1 (항체 ab23382) - 뇌에 풍부한 최조기 유전자. 발현은 뉴런 활성에 의해 유도된다. 해마, 편도핵, 시상하부, 선조체 및 피질 내의 수상돌기에서 발현됨.

수상돌기 - 후기 마커

[1] RRIMS3 (항체 ab50198) - 뉴런 수상돌기 및 시냅스후 치밀질에 위치함.

[2] 드레브린 (Drebrin) (항체 M2F6, ab12350) - 드레브린은 액틴 운동학 및 뉴런 형태형성의 제어에 관여되는 주요 뉴런 F-액틴 결합 단백질이다.

[3] 뉴런 특이적 베타 III 튜불린 (항체 ab18207) - CNS 및 PNS 내에 풍부함 (여기서 태아 및 생후 발생 동안 발현됨).

[4] SAP102 (항체 7D3mAb 119, ab69738) - 시냅스-연관 단백질 102는 비대칭 타입 1 시냅스의 수상돌기 자루 및 가시에서 검출된다.

[5] 기타

여포성 수상돌기 세포 마커 (항체 ab8138)

수상돌기 세포 항체 (항체 ab8171)

성장 원추 - 초기 마커

[1] CRMP1 (항체 ab76995) - CRMP2 (항체 ab54546), CRMP5 (항체 ab77158)

콜랩신 (Collapsin) 반응 매개체 단백질은 신경 발생 동안 뉴런 분화, 축삭 및 성장 원추 유도에 관여된다.

[2] NRP2 (항체 96009, ab50205) - NRP2는 뉴로필린 (neuropilin) 패밀리의 수용체 단백질의 구성원이고, 심혈관 발생 및 축삭 유도에서 역할을 할 수 있다.

성장 원추 - 후기 마커

[1] 아그린 (Agrin) (항체 AGR 131, ab12362) - 신경근육 접합부에서 발생 동안 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (등)의 클러스터링 (clustering)을 촉진한다.

[2] BAl1 연관 단백질 2 이소형 3 (항체 ab791) - 뇌-특이적 혈관신생 억제제.

[3] BAIAP2 (항체 ab56588) - 뇌-특이적 혈관신생 억제제 (뉴런 성장-원추 유도에 관여됨).

[4] BASP1 (항체 ab79349) - 뇌에서 풍부하게 발현되는 단백질.

[5] 더블코틴 (Doublecortin) (항체 ab28941) - 이동하는 뉴런의 세포체 및 선도 융기, 및 분화하는 뉴런의 축삭에서 발견되는 미세관 결합 단백질.

[6] Eph 수용체 A1 단백질 (항체 ab55900), A2 (항체 RM-0051-8F21 ab73254), A3 (항체 6C1B6, ab76361), A4 (항체 7D3D4 ab70403), A5 (항체 ab54633), A6 (항체 ab58022), A7 (항체 ab54640), A8 (항체 ab10615), B1 (항체 5F10A4, ab66326), B2 (항체 ab54650), B3 (항체 ab54717), B4 (항체 4A12G8, 5G2F8, ab66336) 및 B6 (항체 2A6B9, ab66325) - EPH-관련 수용체는 신경 조직 발생 사건을 매개하는데 관련되었다. 발생하는 및 성인 신경 조직은 모든 Eph 수용체 및 에프린 (ephrin) 리간드를 발현한다. EPH-수용체의 역할은 축삭 유도 및 신경 능선 세포 이동을 매개하는 것이다.

[7] 에프린 A1 (항체 ab7040), A2 (항체 ab65041), A3 (항체 ab66150), A4 (항체 ab53062), B2 (항체 ab75868) 및 B3 (항체 ab53063) - 에프린은 신경계에서 발생 사건을 매개하는데 관련된 Eph 수용체의 리간드이다.

[8] GAP43 (항체 GAP-7B10, ab50608) - 뉴런 성장 원추 단백질.

[9] GPRIN1 (항체 ab74577) - GPRIN1은 신경돌기 돌출에 관여된다.

[10] LIM 키나제 1 (항체 ab51200) - 뇌 및 척수에서 활성임 (여기서 신경세포의 발생에 관여되는 것으로 생각된다).

[11] NCAM (항체 123C3, ab28377) - 대부분의 신경외배엽 유래된 세포에서 발현됨.

[12] 뉴로세르핀 (Neuroserpin) (항체 ab55587) - 발생하는 뇌 및 성인 뇌의 뉴런에 의해 주로 발현됨. 상기 세르핀은 CNS 및 PNS의 축삭 성장 원추로부터 분비된다.

세포체

[1] ALK (항체 ALKc ab650) - ALK는 전뇌 뉴런에서 발현되는 신경계에서 발견된다.

[2] 멤브랄린 (Membralin) (항체 ab21818) - 중추신경계에서 발현됨.

[3] 넥딘 (Necdin) (항체 ab55501) - 뇌 특이적 성장 억제인자.

[4] STEP (항체 23E5, ab16967) - 신경-특이적 단백질-티로신 포스파타제임.

시냅스 - 초기 마커

신테닌 (Syntenin) (항체 ab19903) - 뉴런에서 발생 프로필을 조절하고, 강한 성장 및 시냅스 형성의 기간에 가장 풍부함.

시냅스 - 후기 마커

[1] EAAT2 (항체 ab77039) - 글루타메이트의 시냅스후 작용을 종결시키기 위해 필수적임.

[2] 뉴렉신 (Neurexin) II 알파 (항체 ab34245), 뉴렉신 I 베타 (항체 ab77596) 및 NRXN3 (항체 ab18523) - 시냅스생성 동안 세포 부착 분자로서 기능을 하는 뉴런 단백질.

[3] 암피피신 (Amphiphysin) (항체 C14-23, ab16770) - 시냅스 소포의 세포질 표면과 회합됨.

[4] 바순 (Bassoon) (항체 SAP7F407, ab13249) - 시냅스전 신경 말단에 위치함.

[5] SAP102 (항체 ab12086) - 시냅스 단백질 (비대칭 타입 1 시냅스의 수상돌기 자루 및 가시에서 검출됨).

[6] CASK (항체 ab11343) - 뉴런 시냅스에 위치함.

[7] CPLX1 (항체 ab 15855) 및 CPLX2 (항체 ab77978) - 시냅스 소포 세포외배출에서 기능을 하는 세포액 단백질.

[8] CRIPT (항체 ab16422) - 뇌 전체에서 흥분성 시냅스의 시냅스후 치밀질 내에 PSD95와 함께 위치하지만, 억제 시냅스에서 검출되지 않는다.

[9] CSP (항체 ab79346) - 시냅스 소포의 세포질 표면에 위치함.

[10] CTBP2 (항체 ab67161) - 특수화 시냅스에 대한 스캐폴드로서 작용함.

[11] 다이스트로브레빈 (Dystrobrevin) 알파 (항체 ab72793) - 횡문근형질막에 위치하고, 시냅스의 형성 및 안정성에 관여될 수 있다.

[12] HOMER2 (항체 ab75037) - 글루타메이트성 시냅스에서 형성성을 유지하는데 중요한 역할을 한다.

[13] HOMER3 (항체 ab75038) - 시냅스후 치밀질 스캐폴딩 단백질.

[14] ICA1 (항체 ab55253) - 신경전달물질 분비에서 일정 역할을 할 수 있고, 췌장, 심장 및 뇌에서 풍부하게 발현됨.

[15] Munc 13 (항체 ab27077) - 시냅스 소포를 프라이밍 (priming)하는데 관여됨.

[16] Munc 18 (항체 ab3451) - 시냅스 소포 도킹 (docking) 및 융합을 조절한다. 이것은 신경전달에 필수적이고, 신탁신에 결합한다.

[17] 뉴로글리칸 C (항체 ab31946) - 중추신경계에서 발현됨.

[18] 뉴로리긴 1 (항체 ab56882), 뉴로리긴 2 (항체 ab36602) - 뉴로리긴은 시냅스 세포-부착 분자이다.

[19] PSD93 (항체 ab12097) 시냅스 마커 - 시냅스에서 N-메틸-D-아스파르테이트 수용체 (NMDAR)를 클러스터링한다.

[20] PSD95 (항체 6G6-1C9, ab2723) - 수용체, 이온 채널 및 연관된 신호전달 단백질의 클러스터링을 위한 스캐폴드를 형성하도록 시냅스후 부위에 위치함

[21] 피콜로 (Piccolo) (항체 ab20664) 시냅스 마커 - 시냅스 접합부의 시냅스전 측면에 농축된 시냅스전 세포매트릭스 단백질.

[22] RIC8 (항체 ab24383) - 시냅스 전달을 양성으로 조절함.

[23] SAP97 (항체 RPI 197.4, ab69737) - 막 회합형 시냅스 단백질은 시냅스 말단에서 이온 채널 클러스터링을 촉진한다.

[24] SAPAP3 (항체 ab67224) - 뉴런 세포 내의 시냅스후 치밀질 (PSD)에 위치함.

[25] SNAP23 (항체 ab57961) - 시냅토좀 (Synaptosomal) 회합형 단백질은 세포내 소포 트래피킹 (trafficking)에서 막 융합의 과정에서 핵심 역할을 한다.

[26] SNAP25 (항체 ab66066) - 시냅스 소포 융합 및 세포외배출에서 필수 역할을 하는 시냅스전 신경 말단 단백질.

[27] SNAP29 (항체 ab56566) - 막 트래피킹 단계에 관여되고, 신탁신에 결합한다.

[28] SNAPIN (항체 ab37496) - 시냅스 소포 도킹 및 융합을 위해 요구되는 SNARE 복합체의 성분.

[29] SV2A (항체 15E11, ab49572), SV2B (항체 ab68025) 및 SV2C (항체 ab33892) - 모든 시냅스 소포 내에 존재하는 일체형 막 당단백질.

[30] SYNPR (항체 ab75053) - 시냅스 소포막의 성분이고, 시냅스 소포 트래피킹에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각됨.

[31] 시냅신 I, II 및 III (항체 ab57468) (각각 항체 EPR3277, ab76494 및 항체 ab68849). 시냅신은 시냅스 소포의 세포질 표면과 회합하는 뉴런 인단백질이다.

[32] 시냅토브레빈 (Synaptobrevin) (항체 4E240, ab18013) - 시냅스 소포의 시냅스전막과의 도킹 및/또는 융합에 관여됨.

[33] 시냅토자닌 (Synaptojanin) (항체 ab19904) 시냅스 마커 - 신경계에서 발현됨.

[34] 시냅토피신 (Synaptophysin) (항체 4E206, ab18008) - 뇌, 척수, 망막, 부신 수질의 소포, 신경근육 접합부에서 뉴런 시냅스전 소포의 막 내에 존재함.

[35] 시냅토타그민 (Synaptotagmin) (항체 ASV30, ab13259) - 시냅스 소포의 일체형 막 단백질.

[36] 유트로핀 (Utrophin) (항체 DRP3/20C5, ab49174) - 신경근육 시냅스 및 근건 접합부에 위치하고, 시냅스후막 유지 및 수용체 클러스터링에 참여한다.

[37] VAMP2 (항체 클론 3E5, ab53407) - 뉴런 내의 시냅스 소포에서 특이적으로 발견되는 작은 일체형 막 단백질.

[38] 시냅토타그민 XII (항체 ab76261) - 신경계에서 전달물질 방출의 조절에 관여되고, 소포 트래피킹 및 세포외배출에서 Ca(2+) 센서로서 역할을 함.

다른 신경 마커

[1] MEF2A (항체 ab55547) - 시냅스생성 내내 소뇌 피질의 과립 뉴런 내에 풍부함. 또한 심장 및 골격근 발생에서 핵심 역할을 한다.

[2] MEF2B (항체 ab55565) - 발생 동안 근육 관련 유전자의 발현을 조절한다. 이들은 또한 특정 신경발생 세포의 분화에 관여된다.

[3] MEF2C (항체 ab43796) - 심장 형태형성 및 근육발생을 제어한다. 이것은 신경발생에서 및 피질 구조의 발생에서 또한 관여될 수 있다.

[4] MEF2D (항체 ab43797) - 근육성 및 또한 일부 신경발생 세포의 분화에 관여됨.

지방세포 분화

i) 분화, ii) 억제제 상세내역 및 iii) 지방세포 마커를 달성하기 위한 프로토콜

전구 세포의 지방세포로의 분화는 문헌 [Dani C et al., (1997) J. Cell Sci 110, 1279-1285]에 기재된 것과 같은 잘 특성화되고 공개된 프로토콜을 이용하여 가능하다. 상기 및 관련 프로토콜을 이용하여 분화다능성 및 다능성 전구 줄기 세포로부터 지방세포를 생성하는 것이 가능하다.

배아 줄기 세포는 분화다능성 세포이고, 백혈병 억제 인자 (LIF)의 존재 하에 미분화된 상태로 유지될 수 있다. LIF를 제거하고 적절한 분화제를 첨가하면 ES 세포의 지방세포, 심장 세포, 골격근 세포 및 뉴런을 비롯한 다양한 세포 종류로의 투입을 일으킨다. 지방세포는 근육세포, 연골세포 및 골세포에 대한 공통적인 전구체인 중배엽 줄기 세포로부터 발생한다. 일단 지방세포 계통으로 투입되면, 전-지방세포는 분화 과정의 후기 단계 동안 지방세포로 성숙한다.

따라서, 지방생성에서 2가지 별개의 상이 존재한다: i) 배상체 형성의 2-5일 사이 (이 단계는 레티노산을 필요로 하고 ES 세포 유래된 지방생성에의 투입 단계임) 및 ii) 말기 분화 단계에 상응함. 이 후기 단계는 지방생성 인자 PPARγ를 필요로 한다. 전-지방세포 세포주, 예를 들어 3T3L1 및 3T3F442A가 지방생성의 후기 단계와 연관된 메카니즘을 연구하기 위해 사용되었고, 이는 몇몇 지방세포-특이적 유전자의 확인 및 단리를 일으켰다. 따라서, 지방생성의 초기 단계는 레티노산-의존성이고, 후기 단계는 PPARγ-의존성이다.

ES 세포로부터 유래된 지방세포는 레티노산에의 초기 노출 후, 이어서 고전적인 지방 생성 유도제의 적용에 의해 생성될 수 있다. 이들 조건 하에, 성숙 지방세포의 큰 클러스터가 배상체의 70-80% 내에 존재한다. 레티노산은 시간 및 농도-의존적 방식으로 ES 세포 분화의 패턴에 영향을 미친다. 지방세포 분화 동안, 레티노산 처리는 ES 세포의 지방세포로의 초기 투입을 자극하지만, 전-지방세포 성숙의 후기 단계에서 억제제로서 작용한다. 상기 후기 억제 효과는 중요한 지방세포 전사 조절인자 유전자 PPARδ 및 C/EBP의 발현에 대한 레티노산의 리프레서 작용으로 인한 것이다 (Shao, D. and Lazar, M.A., 1997, J. Biol. Chem., 272, 21473-21478).

ES 세포를 레티노산 및 PD98059 9 (ERK 경로의 특이적 억제제)로 동시-처리하면 지방세포 형성을 방지하므로, ERK 신호전달은 지방생성을 위해 중요한 것으로 보인다. PD98059 적용은 ES 세포의 뉴런 또는 심근세포로의 분화에 대해 효과가 없다 (Bost F., et al., 2002 Biochem J., 361, 621-627).

시험관 내에서 배아 줄기 세포의 지방세포로의 분화

지방세포를 생성하기 위해 문헌 [Dani C et al., (1997) J. Cell Sci 110, 1279-1285]에서는 마우스 배아 줄기 세포주 ZIN40, E14TG2a 및 CGR8을 사용하였다. 간단히 설명하면, 상기 과정은 미분화된 세포주를 피더가 없는 조건에서 젤라틴-코팅된 플레이트 상에서 배양 배지 (0.25% 중탄산나트륨, x1 MEM 필수 아미노산, 2 mM 글루타민, 1 mM 피루베이트, 100 μM 머캅토에탄올 및 10% v/v 우태아 혈청을 함유하는 MEM/BHK21 배지) 내에서 배양하는 것을 포함하였다. 분화를 억제하기 위해 백혈병-억제 인자 (100 단위/ml)를 첨가하였다. ES 세포를 지방세포로 분화시키기 위해, 세포를 배상체 내에서 응집물로서 배양하였다. 각각의 현적은 20 ㎕ 배양 배지 내에 1,000개의 세포를 함유하였다. 이들을 2일 동안 PBS로 채운 세균학적 플레이트의 덮개 상에 유지하였다. 형성된 배상체를 레티노산 (0.1% v/v)을 보충한 배양 배지 내에 재현탁시키고, 세균학적 플레이트 덮개 상에 유지하였다. 배상체를 수일 동안 유지한 후, 젤라틴-코팅된 플레이트 상으로 침강시키고, 85 nM 인슐린, 2 nM 트리-요오도티로닌 및 10% 우태아 혈청을 보충한 배양 배지로 이루어진 분화 배지 내에 재현탁시켰다.

10-15일 후에, 지방 방울이 채워진 세포 클러스터가 나타난다. 이들은 오일 레드 O (트리글리세리드에 대한 특이적 염료)를 이용하여 염색될 수 있다. 결과는 지방 생성 마커 아딥신 (adipsin) 및 PPARγ의 발현에 의해 결정할 때 배상체의 60%가 지방세포 양성 콜로니를 형성하였음을 나타냈다.

문헌 [Dani, C, et al. (1997), J. Cell Sci., 110, 1279-1285] 방법의 변형이 대조군 및 PPARγ 결핍 마우스로부터 유래된 ES 세포 (2일령)의 분화 동안 문헌 [Rosen, E.D., et al. (1999), Molecular Cell. 4, 611-617]에서 이용되었다. 실제 변형된 프로토콜은 간단히 설명하면, 레티노산을 함유하는 배지 내에서 배양된 배아 줄기 세포로부터 배상체의 생성을 포함하였다. 이어서, 배상체를 젤라틴-코팅된 6웰 플레이트에 옮기고, 5 ㎍/ml 인슐린에 노출시켰다. 제17일에, 배상체를 덱사메타손 (400 ng/ml) 및 PDE 억제제 메틸이소부틸잔틴 (500 nM)에 2일 동안 노출시켰다. 이 후에, 배상체를 인슐린-함유 배양 배지 내에 추가로 10일 동안 재현탁시켰다. 상기 프로토콜에 의해 중성 지질의 오일 레드 O 염색에 의해 결정할 때 배상체 내의 세포의 70-90%가 지방세포 표현형을 발현하였다. 야생형 ES 세포는 분화 과정의 개시의 4일 후에 초기 마커 아딥신 및 PPARγ을 발현하였다.

마우스 배아 줄기 세포 및 인간 성체 줄기 세포의 지방세포로의 분화를 위한 포괄적인 안내가 문헌 [Wdziekonski B, Villageois P, and Dani (2007) Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 23:Unit 23.4]에 기재되어 있다. 여기에는 마우스, 인간 다능성 지방-유래된 및 인간 중간엽 줄기 세포를 분화시키기 위해 요구되는 프로토콜을 포함한다.

지방생성의 억제제

[1] ERK 신호전달의 억제

세포외-신호 조절된 키나제 (ERK)는 세포 증식 및 분화와 같은 많은 세포 기능을 조절하는 신호전달 케스케이드에 관여된다. PPARγ의 Erk-매개된 인산화는 지방생성을 명백하게 억제한다. PD98059는 MEK1 (ERK 활성화를 담당하는 효소)의 특이적 억제제이다. 분화하는 ES 세포를 레티노산 및 PD68059로 동시처리하면 ES 세포에서 지방세포 형성 및 지방 생성 마커의 발현을 모두 방지하였다 (Bost F., et al., 2002, Biochme J., 361, 621-627).

[2] HIV 프로테아제 억제제

HIV 프로테아제 억제제를 사용한 치료는 지방 대사의 변화와 연관된다. 문헌 [Lenhard, J. M., et al., (2000), Antiviral Res., 47, 121-129]에서는 C3H10T1/2 중간엽 줄기 세포를 이용하여 지방세포 분화에 대한 이들 억제제의 영향을 연구하였다. 이들 세포에서, 200 nM 인슐린 및 1 μM의 PPARγ 및 RXR 효현제 BRL49653 및 LGD1069를 각각 첨가함으로써 지방생성을 유도하였다.

이들 조건 하에, HIV 프로테아제 억제제 넬피나비어, 사퀴나비어 및 리토나비어는 지방생성의 감소, 오일 레드 O-염색, 및 지방 세포 마커 AP2 및 LPL의 발현에 의해 결정할 때 중간엽 줄기 세포의 지방세포 분화를 감소시켰다.

문헌 [Vernochet, C, et al., (2003), AIDS, 17, 2177-2180]에서 상기 연구를 연장하였고, 4가지 마우스 전-지방세포 세포주 (3T3-F442A, 3T3-L1, Ob1771 및 배아 줄기 세포)의 지방세포 분화에 대한 유사한 범위의 HIV 프로테아제 억제제의 효과를 평가하였다. 분화의 방법은 문헌 [Dani, C., et al., (1997), J. Cell Sci., 110, 1279-1285]에 기재된 것과 유사하였다.

프로테아제 억제제 넬피나비어, 로피나비어는 시험한 모든 세포에서 지방세포 분화를 억제한 반면, 인디나비어, 사퀴나비어 및 리토나비어는 3T3-L1 및 3T3-F442A 세포만의 분화를 억제하였다. 저자는 사용된 세포 모델 시스템에 따라 HIV 프로테아제 억제제가 지방세포 분화를 억제하는 것으로 결론지었다.

[3] 글리코겐 신타제 키나제 3 억제제

줄기 세포의 지방 생성 경로로의 투입에 관여된 신호전달 사건은 아직 완전히 특성화되지 않았다. 최근에, 문헌 [Mointeiro, M.C., et al., (2009), Stem Cells Dev., 18, 457-463]에서는 마우스 배아 줄기 세포 및 레티노산의 초기 처리를 이용하여 레티노산 수용체의 활성화가 ES 세포의 지방세포 분화로의 투입을 위해 필요하고 또한 충분함을 보여주었다. 저자는 또한 ES 세포에서 레티노산 수용체 베타-유도된 지방생성은 GSK3 억제제에 의해 폐지될 수 있음을 입증하였다.

지방세포 발생에 대한 상기 기재된 HIV 프로테아제 억제제와 같은 억제제 (및 화학물질, 약물 또는 화장품)의 효과는 전구 줄기 세포 분화 동안 모니터링할 수 있다. 전구 세포를 억제제에 노출하고, 세포 발생 과정에 대한 효과를 분화의 정도를 모니터링함으로써 평가할 것이다. 이것은 정량적 면역-세포화학과 같은 기술에 의해 분화된 세포 종류와 연관된 세포/조직 특이적 마커의 발현을 측정함으로써 달성할 수 있다.

지방세포 발생을 표시하는 마커는 다음의 것을 포함한다 (앱캠 인크.로부터 상업상 이용가능한 항체의 공급원을 또한 기재한다).

지방세포 - 초기 마커

C20orf3 (항체 ab69162) - 지방세포 분화에 관여됨.

FNDC3B (항체 ab69854) - 지방생성의 양성 조절인자

아디포넥틴 (Adiponectin) (항체 19F1, ab22554) - 지방 세포는 지방세포 분화 동안 아디포넥틴을 생산하고 분비한다.

NOC3L (항체 ab74151) - 지방세포 분화 촉진 인자로서 기능을 함.

AE 결합 단백질 1 (항체 ab54820) - 지방세포 인핸서 결합 단백질 1 (지방세포 인핸서 1 조절 서열에 결합하는 전사 리프레서).

PPAR 알파 (항체 ab8934), 감마 (항체 ab12409) 및 델타 (항체 ab23673) - 모두 지방세포 분화에 관여되는 것으로 생각된다.

CEBP 알파 (항체 EP708Y, ab40761) 및 베타 (항체 A16 ab18336) - 중요한 지방세포 전사 조절인자 유전자.

아딥신/팩터 D (항체 ab8841) - 지방세포 특이적.

지방세포 - 후기 마커

렙틴 (Leptin) (항체 ab3583) - 지방 세포는 렙틴을 생산하고 분비한다.

지질단백질 리파제 (항체 LPL.A4, ab21356) - 지방 세포에 의해 생산되고 분비됨.

AEBP2 (항체 2012C4a, ab74517) - AE (지방세포 인핸서) 결합 단백질 2.

FABP4 (항체 ab37458) - 지방세포에서 발견되는 주요 지방산 결합 단백질.

FABP5 (항체 ab37267) - 지방산 결합 단백질 FABP-4 FABP5는 밀접하게 관련되고, 지방세포에서 발현된다.

PDE3B (항체 ab42091) - 지방세포 조직에서 발현됨.

KIAA1881 (항체 ab78602) - 지방세포로의 트리아실글리세롤 패키징 (packaging)에 관여됨.

레시스틴 (Resistin) (항체 ab3423) - 지방세포 분비형 인자는 지방세포에 의해 특이적으로 분비되는 시토킨이다.

페릴리핀 (Perilipin) A (항체 ab61682) - 지방세포 및 스테로이드 생성 세포 내에서 지방 방울의 표면에서 독점적으로 발견됨.

페릴리핀 B (항체 ab3527) - 발현은 지방세포 및 스테로이드 생성 세포에 제한된다.

글루코스 트랜스포터 GLUT4 (항체 ab654) - 지방 조직에서 인슐린에 의한 글루코스 흡수의 자극은 GLUT4 세포내 부위의 세포 표면으로의 전위를 요구한다.

TUG (항체 4A11A6G11, ab32007) - GLUT4 분포를 조정하는 추정 테터 (tether).

글리세롤 3 포스페이트 데히드로게나제 항체 (ab34492) - 말기 분화하는 지방세포에 의해 발현됨.

검출 및 정량

세포 영상화

복합적 방식으로 세포 영상기 (예를 들어, IN 세포 분석기, 지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))를 사용하여, 상이한 특이적 항체에 묶인 상이한 형광체 (예를 들어, 시아닌 염료, 지이 헬쓰케어)를 검출할 수 있다. ES는 특정 경로를 따라 분화를 겪으므로, 상기 형광체를 이용하여 몇몇 표적 분자를 검출하고 측정한다. 따라서, 기기는 정량적 면역세포화학을 이용하여 동일한 샘플로부터 3종까지의 상이한 마커에 대한 독성 화학물질의 효과를 측정하기 위해 사용될 수 있고, 따라서, 화학물질의 독성 프로필을 작성할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법은 당업자에게 잘 알려진 기술 (예를 들어, 정량적 면역세포화학, 리포터 유전자 분석 또는 RT-PCT 및 마이크로어레이 분석)을 이용하여 초기 및 후기 배아 줄기 세포 선택적 생체마커 사이를 식별하는 추가의 특징이 있다.

전구 세포는 분화를 겪기 때문에, 이들 리포터는 분화된 세포 종류뿐만 아니라 원래의 전구 세포 내에 또한 존재하는 몇몇 세포/조직 특이적 분자를 동시에 검출하고 측정할 수 있다. 추가로, 정량적 데이타 (면역세포화학 또는 유전자 리포터 분석 등으로부터 유래한 것이든)를 생성하는 능력으로 인해 치사량-미만 용량 수준의 결정할 수 있다. 이것은 약물 발생 또는 화장품 산업에서 매우 중요할 수 있다.

본 발명을 다양한 측면 및 바람직한 실시양태에 따라 설명하였지만, 본 발명의 범위는 전적으로 그에 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되고, 본 출원인의 의도는 그의 모든 변형 및 동등물이 또한 첨부된 청구항의 범위 내에 있다는 것임을 이해해야 한다.

Claims (19)

1. (i) 샘플 내의 미분화된 줄기 세포의 대조군 집단을 작용제로 처리하여 제1 발생 경로 내의 분화된 세포의 제1 대조군 집단을 생성하는 단계;
   (ii) 미분화된 줄기 세포의 상기 대조군 집단 및/또는 분화된 세포의 상기 제1 대조군 집단에서 발현된 2개 이상의 생체마커의 수준을 측정하여 대조군 발현 수준을 결정하며, 여기서 적어도 하나의 상기 생체마커는 발생 경로 및/또는 분화의 초기 단계에서 발현되고 적어도 하나의 생체마커는 발생 경로 및/또는 분화의 후기 단계에서 발현되는 단계;
   (iii) 상기 작용제로 처리하기 전 또는 후에 상기 샘플 내의 미분화된 줄기 세포의 시험 집단을 화학물질에 노출시켜 제1 발생 경로 내의 분화된 세포의 제1 시험 집단을 생성하는 단계;
   (iv) 미분화된 줄기 세포의 상기 시험 집단 및/또는 분화된 세포의 상기 제1 시험 집단에서 상기 2개 이상의 생체마커의 수준을 측정하여 시험 발현 수준을 결정하는 단계;
   (v) 상기 대조군 발현 수준을 상기 시험 발현 수준과 비교하는 단계
   를 포함하며, 여기서 상기 화학물질에 대한 노출 이후의 발현 수준의 차이가 상기 발생 경로에 대한 화학물질의 독성을 나타내는 것인, 샘플에서 발생 경로에 대한 화학물질의 독성을 예측하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 단계 (i)이 미분화된 줄기 세포의 집단을 작용제로 처리하여 n번째 발생 경로 내의 분화된 세포의 n번째 집단을 생성하는 단계를 포함하고;
   단계 (ii) 내지 (v)를 반복하여 대조군 발현 수준과 상기 n번째 집단에서의 시험 발현 수준의 차이를 결정하는 단계를 포함하며,
   여기서 화학물질에 대한 노출 이후의 발현 수준의 차이가 상기 n번째 발생 경로에 대한 화학물질의 독성을 나타내는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 제1 및 상기 n번째 발생 경로가 네트워크화된 (networked) 발생 경로인 방법.
4. 제1항에 있어서, 단계 (i)이 미분화된 줄기 세포의 집단을 작용제로 처리하여 다수의 발생 경로 내의 분화된 세포의 다수의 집단을 생성하는 단계를 포함하고;
   단계 (ii) 내지 (v)를 반복하여 대조군 발현 수준과 상기 다수의 집단에서의 시험 발현 수준의 차이를 결정하는 단계를 포함하며,
   여기서 화학물질에 대한 노출 이후의 발현 수준의 차이가 상기 다수의 발생 경로에 대한 화학물질의 독성을 나타내는 것인 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 다수의 발생 경로가 네트워크화된 발생 경로인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 분화다능성 (pluripotent) 줄기 세포인 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 분화다능성 줄기 세포가 배아 줄기 세포인 방법.
8. 제7항에 있어서, 분화다능성 줄기 세포가 유도된 분화다능성 줄기 세포인 방법.
9. 제7항에 있어서, 분화다능성 줄기 세포가 원시 생식 세포인 방법.
10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 성체 줄기 세포인 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포가 인간 줄기 세포인 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 미분화된 줄기 세포가 적어도 2개 이상의 생체마커에 작동가능하게 연결된 상이한 리포터 유전자를 포함하며, 여기서 2개 이상의 생체마커의 수준이 상이한 유전자 생성물의 측정에 의해 정량되는 것인 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 리포터 유전자가 니트로-리덕타제, β-갈락토시다제, β-락타마제, 루시퍼라제 및 형광 단백질 리포터 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 생체마커의 수준이 정량적 RT-PCR, 정량적 면역세포화학, 표면 플라스몬 공명 및 마이크로어레이 분석으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 정량되는 것인 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii) 후에 세포 증식을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 복합적 (multiplex) 방법인 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 인간 태아 발생 동안 세포 바이오맵 또는 발생 경로의 변화를 예측하는 방법.
18. 2개 이상의 생체마커를 정량하기 위한 수단 및 방법의 수행을 위한 사용설명서를 포함하는, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 키트.
19. 제18항에 있어서, 상기 수단이 항체, 효소 기질 및 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 키트.

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