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KR20120101054A - 암에 대한 바이오마커로서 플렉틴-1을 검출하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

암에 대한 바이오마커로서 플렉틴-1을 검출하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20120101054A
KR20120101054A KR1020127014652A KR20127014652A KR20120101054A KR 20120101054 A KR20120101054 A KR 20120101054A KR 1020127014652 A KR1020127014652 A KR 1020127014652A KR 20127014652 A KR20127014652 A KR 20127014652A KR 20120101054 A KR20120101054 A KR 20120101054A
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KR
South Korea
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cancer
peptide
plectin
peptide ligand
ligand complex
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Withdrawn
Application number
KR1020127014652A
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English (en)
Inventor
킴벌리 에이. 켈리
Original Assignee
유니버시티 오브 버지니아 페이턴트 파운데이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 오브 버지니아 페이턴트 파운데이션 filed Critical 유니버시티 오브 버지니아 페이턴트 파운데이션
Publication of KR20120101054A publication Critical patent/KR20120101054A/ko
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Abstract

본 발명은 바이오마커 플렉틴-1을 검출 및 국부화하기 위한 진단 및 영상화 기술에 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은, 영상화제 및/또는 치료제가 접합될 수 있는, 플렉틴-1을 표적화하기 위한 다량체성 펩티드 리간드 복합체, 예컨대 화학식 (βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4 KKKKDOTAβA-NH2를 갖는 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 제공한다.

Description

암에 대한 바이오마커로서 플렉틴-1을 검출하기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING PLECTIN-1 AS A BIOMARKER FOR CANCER}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)에 따라 2009년 11월 5일에 출원한 미국 가특허 출원 제61/258242호에 대해 우선권을 주장한다.
정부 지원 연구 또는 개발에 관한 진술서
본 발명은 미국국립보건원에 의해 수여된 허가 번호 NIH-P50-CA86355 및 PO1-CA117969-01 하에 미국 정부 지원을 받았다. 미국 정부는 본 발명에 대해 소정의 권리를 갖는다.
췌장암 (PDAC)은 미국 및 기타 선진국에서 암-관련 사망의 4번째 주요 원인이다 [1]. 강력한 노력에도 불구하고, 여전히 치명적인 질환으로 남아 있으며, 그의 5년 생존률은 5％ 미만이고, 평균 중앙 생존기간은 1년 미만이다 [1]. 이러한 어두운 예후는 대부분 흔히 그의 불치의 진행 단계 (종종 전이 후 단계)에서의 늦은 초기 진단 때문이다.
PDAC는 다른 악성종양에서 발견되는 선종암종연쇄와 유사하게 췌장 상피내 종양 (PanIN)으로 명명되는 전구 병변을 통해 침윤성 암으로 진행되는 것으로 여겨진다. 병변은 선종 (PanIN I)으로부터 이형성증을 갖는 선종 (PanIN II), 상피내 암종 (PanIN III) 및 마지막으로 침윤성 암으로 진행된다 [2, 3, 4]. 이러한 널리 특성화된 전구 병변을 통한 발암현상에도 불구하고, PDAC에 대한 효과적인 초기 검출 및 스크리닝은 여전히 이용불가능하다. 이는 대부분 초기 암에 대한 진단 도구 및 바이오마커의 부재 때문이다. 이상적으로, PDAC에 대한 바이오마커는 이에 따라 침윤성 암 뿐만 아니라 그의 전구 병변, PanIN II 및 보다 중요하게는 침윤전 악성 PanIN III 병변을 검출해야 한다. 일반적으로, CA 19.9가 유일하게 임상적으로 사용되는 PDAC에 대한 혈청 바이오마커이다. 그러나, 이는 특히 소형암의 검출, 및 악성 및 양성 췌장 질환의 구분에 있어서 특이성 및 민감성이 결여되어 있다 [5]. 따라서, CA 19.9는 PDAC의 스크리닝 또는 초기 검출에 적합하지 않다. 침윤성 내시경 절차 (EUS 및 ERCP)는 몇몇 초기 병변을 검출할 수 있지만, 췌장 손상 가능성, 높은 부정 오류 및 조작자 의존성이 높다는 문제가 있다 [6, 7]. 상기 절차는 또한 종종 악성 병변과 양성 또는 전암 병변을 구분하지 못한다 [8, 9]. 또한, 횡단 복부 영상화도 특히 고-위험 환자에서의 초기 단계 PDAC의 검출에 있어 신뢰할 수 없는 것으로 입증되었다 [10, 11]. 이는 수술 전 PDAC 환자의 최대 30％에서 전이를 검출하지 못하고 [12, 13], 만성 췌장염 (CP)과 PDAC를 안전하게 구분하지 못한다 [14, 15]. PDAC와 만성 췌장염의 신뢰할 만한 구분은 중요하지만, 이는 종종 어렵다. 두 질환은 많은 임상적 징후 및 증상을 공유하지만, 각각 매우 상이한 치료 전략이 이용된다. PDAC에 대해서만 이용가능한 치료적 처치는 기본적인 외과적 절제술인 반면에, 만성 췌장염의 치료는 증상의 개선에 중점을 두며, 이는 대부분 종종 수술 없이 이루어질 수 있다 [14, 15].
최근 이용되는 진단 도구의 단점을 극복하는 신규 바이오마커 및 비-침윤성 영상화 전략이 PDAC와 만성 췌장염 간에 신뢰할 만한 구분을 가능하게 할 것이다. 이는 또한 보다 초기의 진단을 허용하여, 결과적으로 전이 발생 전 PDAC의 치료를 가능하게 것이다. 따라서, 이는 매우 필요하며, 궁극적으로 생존기간을 개선하는 데 도움을 줄 수 있다 [16]. 최근, 플렉틴-1 (Plec1)이 시험관내 및 유전자 조작된 마우스 모델에서의 발견에 기초하여 PDAC에 대한 잠재적인 신규 영상화 바이오마커인 것으로 제시되었다 [17]. 펩티드 리간드는 Plec1을 검출하는 데 사용되는 것으로 확인되었다 [17]. 그러나, 인간 PDAC 및 그의 전구 병변에 대한 바이오마커로서 Plec1의 적합성은 여전히 평가받아야 할 것으로 남아있다. Plec1은 악성 췌장 "관내 유두상 점액 신생물" (IPMN)에 대한 바이오마커로 확인되었으며, 비-소세포 폐암에 대한 (Harris, 2009, J. Clin. Oncology, 27, No. 15S (May 20 Supplement): e22118) 및 인간 직장결장 선종 및 선암종에 대한 바이오마커로서 (Lee, 2004, J. Med., 35:(1-6):141-149), IPMN에서 발생하는 암종의 초기 검출에 대한 마커인 것으로 가정되었다 (Bausch et al., 2009, J. Gastrointest. Surg., 13:1948). Plec1에 대한 하나의 펩티드 리간드는 펩티드 KTLLPTP (서열 1)이다 [Kelly et al. (2008) Targeted nanoparticles for imagimg incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLoS Med 5:4:e85; International Pat. Pub. No. WO 2009/129220, Kelly et al., published October 22, 2009].
암을 진단하고, 모니터링하며 국부화하는 데 도움이 될 보다 양호한 암 바이오마커, 바이오마커를 인지하는 신규의 보다 양호한 시약에 대한 당업계의 오랜 절실한 필요성이 존재한다. 본 발명은 이러한 필요성을 만족시킨다.
<발명의 개요>
본 발명은 플렉틴-1을 표적화하는 본원에 기재된 신규한 분지형 다량체성 펩티드 영상화 복합체에 기초하며, 이는 또한 이러한 복합체를 사용하여 얻어진 놀라운 결과에 기초한다.
플렉틴-1 (진뱅크 접근 번호(GenBank accession number) AAR95677)은 초기 칩윤전 원발성 및 전이성 인간 PDAC에서 특이적으로 상향조절된다. 전임상 모델에서, 플렉틴-1은 비-침윤성 영상화에 사용될 수 있는 PDAC에 대한 제1 바이오마커 중 하나이다. 이러한 데이터는 함께, Plec1이 PDAC에 대해 민감하고 특이적인 바이오마커이며, 그의 검출 및 상연(staging)을 개선하는 데 사용될 수 있음을 제시한다.
본 발명은 플렉틴-1 또는 그의 상동체 또는 단편과 결합하는 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 제공하며, 상기 복합체는 플렉틴-1 또는 그의 상동체 또는 단편과 독립적으로 결합하는 2개 이상의 펩티드를 포함한다. 한 측면에서, 플렉틴-1 또는 그의 상동체 또는 단편과 결합하는 펩티드 각각은 독립적으로 및 임의로 하나 이상의 비표준 아미노산 치환 또는 보존적 아미노산 치환 또는 부가를 포함한다. 한 측면에서, 다량체의 펩티드 각각은 독립적으로 하나 이상의 추가의 아미노산의 부가에 의해 임의로 변형된다. 한 측면에서, 다량체의 펩티드 각각은 독립적으로 및 임의로 폴리에틸렌 글리콜과 커플링된다. 한 측면에서, 다량체의 펩티드 또는 폴리에틸렌 글리콜과 임의로 커플링된 펩티드 각각은 킬레이트제와 추가로 커플링된다. 임의로, 킬레이트제는 하나 이상의 연결기에 의해 펩티드 또는 폴리에틸렌 글리콜과 임의로 커플링된 펩티드와 커플링된다. 임의로, 하나 이상의 영상화제가 상기 킬레이트제와 커플링되고, 임의로 하나 이상의 치료제가 상기 킬레이트제와 커플링된다.
한 측면에서, 다량체는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체 및 팔량체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 다량체성 펩티드 리간드 복합체는 동종다량체 또는 이종다량체이다. 한 측면에서, 동종다량체는 사량체이다.
한 실시양태에서, 다량체성 펩티드 리간드 복합체는 DTPA, DO3A, DOTA, EDTA, TETA, EHPG, HBED, NOTA, DOTMA, TETMA, PDTA, TTHA, LICAM, HYNIC 및 MECAM로 이루어진 군으로부터 선택되는 킬레이터를 포함한다.
한 측면에서, 폴리에틸렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 5000이다.
한 실시양태에서, 다량체성 펩티드 리간드 복합체는 방사성핵종, 방사성 조영제, 상자성 이온, 금속, 생물학적 태그, 형광성 표지, 화학발광성 표지, 초음파 조영제 및 광활성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 영상화제를 포함한다. 한 측면에서, 영상화제는 방사성핵종이다. 한 측면에서 방사성핵종은 110In, 111In, 177Lu, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 94 mTc, 94Tc, 99 mTc, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154-158Gd, 32P, 11C, 13N, 15O, 186Re, 188Re, 51Mn, 52 mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82 mRb, 83Sr, 및 기타 감마-, 베타- 또는 양전자-방사체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 측면에서, 방사성핵종은 111In이다.
한 측면에서, 다량체성 펩티드 리간드 복합체는 독립적으로 서열 1-4 및 9-22로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 펩티드를 포함한다. 한 측면에서, 상기 서열은 서열 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 서열 1 (KTLLPTP)은 염기 펩티드 리간드이고, 다른 서열은 그의 변형물이다 (예를 들어, 실시예 및 도 9 참조):
서열 2- βAKTLLPTP
서열 3- βAKTLLPTPGGS
서열 4- KTLLPTPGGS
서열 9- ATLLPTP
서열 10- KALLPTP
서열 11- KTALPTP
서열 12- KTLAPTP
서열 13- KTLLATP
서열 14- KTLLPAP
서열 15- KTLLPTA
서열 16- βAATLLPTPGGS
서열 17- βAKALLPTPGGS
서열 18- βAKTALPTPGGS
서열 19- βAKTLAPTPGGS
서열 20- βAKTLLATPGGS
서열 21- βAKTLLPAPGGS
서열 22- βAKTLLPTAGGS (서열 22)
베타 알라닌 잔기는 본원에 제공된 서열 목록에서 Xaa로 제공됨을 유의하기 바란다. 서열은 이들 펩티트의 플렉틴-1 또는 이들의 상동체 또는 단편에의 결합에 실질적으로 영향을 미치지 않는 아미노산 치환체 및 부가물을 비롯하여 변형될 수 있다. 알라닌 치환체를 상기에 나타내었지만, 다른 아미노산을 사용하는 치환체가 본 발명에 포함된다. 추가로, 본원에 개시된 데이터는 서열 내 트레오닌, 및 또한 프롤린의 중요성을 제시한다.
본 발명의 펩티드는 다량체로서 유용하다. 추가로, 다량체는 아미노산, 예컨대 베타 알라닌 (βA) 및 폴리에틸렌 글리콜의 첨가에 의해 변형하여 혈류 및 조직에서의 반감기, 안정성을 증가시키고, 분해 등을 감소시킬 수 있다. 당업자는 복합체 내의 서열의 배향이 일부 경우 변경될 수 있고 다량체가 이종다량체 또는 동종다량체일 수 있음을 인지할 것이다.
한 실시양태에서, 다량체성 복합체는 사량체이고 도 8의 화학 구조로 묘사되는 화학식 (βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4 KKKKDOTAβA-NH2를 갖는다. 도 8은 DOTA에 커플링된 영상화제를 추가로 나타낸다. 한 양태에서, 사량체성 복합체의 Ki는 약 8.3 x 10-7 M이다. 한 실시양태에서, 영상화제는 111In이다. 한 측면에서, 영상화제는 컴퓨터에 커플링된 SPECT/CT 스캐너 및 프로그램을 사용하는 분석 영상화 데이터로 검출한다.
본 발명은 대상체 내에 플렉틴-1 또는 이들의 상동체 또는 단편을 검출하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 대상체에 영상화제를 포함하는 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 투여하는 것, 및 플렉틴-1을 포함하는 세포의 위치를 검출하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 상기 방법은 각 펩티드 리간드가 서열 1 내지 4 및 9 내지 22로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 서열을 갖는 다량체 펩티드 리간드 영상화 복합체의 사용을 포함한다.
한 측면에서, 상기 방법은 방사성핵종, 방사성 조영제, 상자성 이온, 금속, 생물학적 태그, 형광성 표지, 화학발광성 표지, 초음파 조영제 및 광활성제로 이루어진 군으로부터 선택된 영상화제의 사용을 허용한다. 당업자는 사용되는 검출 방법이 사용되는 특정 영상화제에 따라 좌우될 것임을 이해할 것이다.
상기 방법의 한 측면에서, 플렉틴-1 또는 이들의 상동체 또는 단편은 세포 표면 플렉틴-1 또는 이들의 상동체 또는 단편이다.
본 발명은 암 세포가 플렉틴-1 또는 이들의 상동체 또는 단편을 발현하거나 나타내는 것인, 암을 검출하거나, 암을 진단하거나, 암의 진행을 모니터링하거나, 암의 치료를 모니터링하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 시험 대상체에 영상화제를 포함하는 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 포함하는 제약 조성물을 투여한 후, 영상화제를 검출하고 시험 대상체 내의 영상체의 수준 및 위치를 측정하는 것을 포함한다. 시험 대상체 내의 수준 및 위치는, 질병에 걸리지 않은 대상체로부터의 그렇지 않다면 동일한 위치로부터의 영상화제의 수준 및 위치와 또는 시험 대상체의 질병에 걸리지 않은 영역과 비교한다. 질병에 걸리지 않은 대상체로부터 또는 시험 대상체의 질병에 걸리지 않은 영역으로부터의 상기 샘플 내의 영상화제의 수준 또는 위치와 비교한 시험 대상체 내의 영상화제의 보다 높은 수준 또는 상이한 위치는, 시험 대상체가 플렉틴-1 또는 이들의 상동체 또는 단편을 발현하거나 나타내는 암을 갖는다는 것을 나타낸다. 검출된 영상화제의 수준 또는 위치는 바이오마커 플렉틴-1의 위치 및 양의 지표이다.
한 실시양태에서, 암은 두경부암, 간암, 췌장암, 식도암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁내막암, 자궁경부암, 전립선암, 부신암, 림프종, 침샘암, 뼈암, 뇌암, 소뇌암, 결장암, 직장암, 대장암, 구비강인두암, NPC, 신장암, 방광암, 피부암, 흑색종, 기저세포암, 경구개암종, 혀의 편평세포암종, 수막종, 다형선종, 별아교세포종, 연골육종, 피질선종, 간세포암종, 췌장암, 편평세포암종, 및 선암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 암은 췌장암이다. 한 측면에서, 췌장암은 췌관 선암종, 췌장 상피내 신생물, 선종, 형성이상 선종, 및 상피내암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 암은 전이성 암이다.
본 발명은 또한 검출되는 영상화제의 수준 (플렉틴-1의 양의 척도)을 기준으로, 암이 양성인지 악성인지를 결정하는 것을 돕도록 영상화되는 플렉틴-1의 수준을 비교하는데 유용하다.
본 발명은 또한 암의 발암기를 결정하고 초기 암에서 말기 암까지 그의 진행을 모니터링하는데 유용하다. 상기 방법은 사용되는 요법의 유형 및 양을 결정하는데 유용하다.
본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 다량체성 펩티드 리간드 복합체의 펩티드는 각각 서열 1 내지 4 및 9 내지 22로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 서열을 갖는다.
본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 다량체성 펩티드 리간드 복합체는 화학식 (βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4 KKKKDOTAβA-NH2를 갖고 영상화제는 111In이다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 영상화제는 방사성핵종, 방사성 조영제, 상자성 이온, 금속, 생물학적 태그, 형광성 표지, 화학발광성 표지, 초음파 조영제 및 광활성제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 플렉틴-1 또는 이들의 상동체 또는 단편은 세포 표면 플렉틴-1 또는 이들의 상동체 또는 단편이다.
본 발명은 암 세포가 플렉틴-1 또는 이들의 상동체 또는 단편을 발현하는, 대상체 내의 암을 진단하기 위한 조성물 및 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻고, 샘플을 영상화제를 포함하는 청구항 1의 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 시험 대상체로부터의 샘플 내의 플렉틴-1의 수준 또는 위치를, 질병에 걸리지 않은 대상체로부터 얻은 그렇지 않다면 동일한 샘플로부터의 플렉틴-1의 수준 또는 위치와 또는 공지된 양의 플렉틴-1을 포함하는 표준 샘플과 비교하는 것을 추가로 허용하며, 여기서 상기 시험 대상체로부터의 상기 샘플 내의 플렉틴-1의 보다 높은 수준은 상기 시험 대상체가 암을 갖는다는 것을 나타낸다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 다량체성 펩티드 리간드 복합체는 화학식 (βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4 KKKKDOTAβA-NH2를 갖는다. 한 측면에서, 영상화제는 방사성핵종, 방사성 조영제, 상자성 이온, 금속, 생물학적 태그, 형광성 표지, 화학발광성 표지, 초음파 조영제 및 광활성제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체 및 플렉틴-1과 결합하는 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 제약상 허용되는 담체 및 청구항 1의 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 포함하는 제약 조성물, 어플리케이터, 및 이들의 사용을 위한 교육용 자료, 및 임의로는 영상화제 및 치료제를 포함하는 키트를 추가로 포함한다.
생체내 영상화를 위한 플렉틴-1 표적화된 펩티드 (PTP)의 활용성을 평가하기 위해, 본 발명은, 한 실시예에서 펩티드를 영상화제용 킬레이트제로서 DOTA를 갖는 사량체성 구조로서 GMP 등급 설비에서 합성하였음을 개시한다. 한 측면에서, 영상화제는 111In이다. 한 측면에서, 본원에 사용되는 플렉틴-1을 위한 펩티드 리간드는 펩티드 KTLLPTP (서열 1)이다 (문헌 [Kelly et al., 2008, PLoS Medicine, 5:4:0657-0668]; 2009년 10월 22일자로 공개된 켈리(Kelly) 등의 국제 특허 공보 WO 2009/129220호). 한 측면에서, 펩티드 리간드는 본원에 기재된 바와 같이 다량체성 펩티드 리간드 영상화 복합체를 제조하기 이전에 변형할 수 있다. 한 측면에서, 변형된 펩티드 리간드는. 한 측면에서, 본 발명의 신규한 사량체성 펩티드 영상화 복합체는 화학식 (βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4 KKKKDOTAβA-NH2 (본원에서 또한 [(βAla-Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro-Gly-Gly-Ser-PEG5K)2-Lys]2-Lys-Lys(DOTA)-βAla-NH2로도 지칭함)을 갖고, 즉, 플렉틴-1을 위한 리간드인 4종의 펩티드를 포함하는 복합체이다.
한 측면에서, 상기 복합체는 플렉틴-1 발현 세포 위치의 시각화에 도움이 되는 영상화제를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 영상화제는 111IN이다.
임의로, 치료제는 영상화 복합체를 포함하는 제약 조성물에 부착될 수 있거나 또는 그 내부에 포함될 수 있다.
당업자는 베이스 펩티드 리간드, 즉, 서열 1이 복합체에서 반대 방향으로 배향될 수 있음을 인지할 것이다.
한 측면에서, 플렉틴-1에 대한 다른 펩티드 리간드로는 서열 1 내지 4 및 9 내지 22, 및 그의 기능적 상동체, 유도체 및 단편이 포함되나 이들로 제한되지는 않는다.
한 측면에서, 본 발명의 사량체성 복합체는 약 8.3 x 10-7 M의 Ki (억제 해리 상수)를 갖는다. 한 측면에서, 이는 대상체에게 투여되는 경우, 약 4.29 분의 혈액 반감기를 가진다.
본 발명은 추가로 추가의 활성 사량체성 복합체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 3 개의 추가 아미노산 (Gly, Gly, 및 Ser)을 가진 변형된 서열 1, 즉, KTLLPTPGGS (서열 4)를 포함하는 복합체를 포함한다. 상기 사량체성 복합체는 도 7의 구조를 갖는 화학식 [Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro-Gly-Gly-Ser]4-Lys4-βAla-DOTA ([KTLLPTPGGS]4-K4-βA-DOTA라고도 지칭됨)를 가진다.
리신 (K)은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00001
리신
본원에서 사용되는 임상적으로 적절한 SPECT 트레이서는 작은 PDAC 및 전이의 검출을 가능케 한다.
한 측면에서, 영상화제 또는 검출가능한 모이어티로는 방사성핵종, 방사성 조영제, 상자성 이온, 금속, 생물학적 태그, 형광 표지, 화학발광 표지, 초음파 조영제 및 광활성제가 포함되나 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 사량체성 펩티드 영상화 복합체는 놀랍게도, 종래 공지된 작용제보다 감수성이다. 또한, 본 발명의 사량체성 펩티드 영상화 복합체는 놀랍게도, 공지된 작용제보다 빠르게 작용한다.
본원은 추가로 수많은 유형의 암에서의 플렉틴-1의 발현을 개시한다 (도 2). 따라서, 본 발명은 췌장암 이외의 다른 암의 검출, 진단 및 국부화를 위한, 본 발명의 다량체성 펩티드 영상화 복합체의 용도를 포함한다. 본 발명은 추가로 플렉틴-1의 수준을 정량하는 것을 제공하며, 이에 따라 본 발명은 정상, 양성 및 악성 조직의 구별 능력을 포함한다. 한 측면에서, 다량체 펩티드 영상화 복합체는 사량체성 펩티드를 포함한다.
본 발명은 추가로 1종 이상의 본 발명의 다량체성 펩티드 리간드 복합체, 교육용 자료, 및 임의로 1종 이상의 영상화제 및 임의로 1종 이상의 치료제를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 다양한 측면 및 실시양태는 하기에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
도 1: 플렉틴-1 면역조직화학 및 웨스턴 블롯. A) 평가된 정상 췌장, 만성 췌장염, PanIN, PDAC, 이종이식된 PDAC 및 PDAC 전이 부위 (간, 림프절 및 복막)의 대표적 영상. 개관 (상부 패널) 및 블랙 박스의 상세한 견해 (하부 패널). 만성 췌장염은 플렉틴-1에 대해 미약하게 염색된 반면, 정상 췌장은 플렉틴-1을 발현하지 않는다. PanIN은 미약 내지 중간의 막 염색 패턴을 나타낸다. PDAC 및 PDAC 이종이식 조직은 플렉틴-1에 대해 세포질 및 막이 중간 정도 내지 강하게 염색된다. 통상의 PDAC 전이 부위는 유의한 플렉틴-1 발현을 보이지 않는 반면, 종양 세포는 Plec1에 대해 짙게 염색된다. B) 시편들에서 염색 강도의 분포도. 모든 PDAC 사례들은 중간 정도 또는 강한 염색 패턴을 나타낸 반면, 정상 췌장 및 만성 췌장염 대부분은 플렉틴-1을 발현하지 않는다. 반대로, PanIN II 병변의 과반수는 Plec1을 미약하게 또는 중간 정도로 발현하는 반면, PanIN III 병변의 대부분은 Plec1 양성이다. C) Plec1의 세포성 국부화는 또한 발암 동안에 변화한다. 이는 모든 PanIN I 및 대부분의 PanIN II 병변의 경우 막에서만 확인되었으나, 일부 PanIN III 병변의 경우 세포질에서도 나타났으며, PDAC에서는 항상 식별된다. D) 50 mg의 췌장 조직 (스냅 동결 수술 시편)으로부터의 Plec1에 대한 정량적 웨스턴 블롯. Plec1은 정상 췌장 및 CP에서 검출되지 않은 반면, 각각의 PDAC에서 존재한다.
도 2: 정상 및 악성 인간 조직에서의 플렉틴-1 발현: 플렉틴-1 발현에 대해 평가된 조직 미세배열법의 면역조직화학: 정상 조직은 방광 및 남성 생식기관을 제외하고, 단지 미약 내지 중간의 플렉틴-1 발현을 나타낸다. 정상과 악성 질환을 구별하는 플렉틴-1 발현의 명백한 차이는 췌장, 식도, 위 및 폐에서만 관찰되었다. 통상의 PDAC 전이 부위 (림프절, 간)는 Plec1을 발현하지 않는다.
도 3: 동소성(orthotopic) PDAC에서 Plec1의 생체내 영상화. (A). tPTP의 시험관내 확인. L3.6 세포를 96 웰 플레이트 상에 플레이팅하고, 111In-tPTP와 함께 그리고 tPTP 또는 스크램블된(scrambled) 사량체의 log 농도를 증가시키면서 인큐베이션시켰다. (B). 동소 이식된 L3.6 세포로부터의 종양을 가진 무흉선 누드 마우스에 111In-tPTP를 주입하고, 주입 4 시간 후 SPECT/CT를 통해 영상화하였다. PDAC에 tPTP가 축적됨에 따라 췌장 및 복막 전이에서의 종양이 생체내 영상화될 수 있음을 주목한다. T - 종양, L - 간, rK - 우 신장, lK - 좌 신장, M - 복막 전이. (C). SPECT/CT 영상화 (도 3) 후, 동물 (n=5)을 희생시키고, 기관을 수거하고, 감마 계수치를 평가하였다. (D). 조직학. 동소 이식된 종양을 가진 동물을 희생시키고, 췌장 및 복막 전이의 가시 영역을 제거하고, OCT에 끼워넣고, 절단하고, H&E로 염색하였다. A. 췌장에서의 종양의 10× 영상. 삽화, 2 가지 종양을 보여주는 췌장의 2× 확대도. B. 복막 전이의 10× 영상. 삽화, 전이 및 주위 복막의 2× 영상.
도 4. tPTP 는 PDAC 를 표적화하고 , 비-침윤성 생체내 영상을 가능케 함. 동소 이식된 L3.6 세포로부터의 종양을 가진 무흉선 누드 마우스에 111IN-tPTP를 주입하고, 주입 4 시간 후 SPECT/CT를 통해 영상화하였다. SPECT/CT 영상은 PDAC에 tPTP가 축적되어 췌장 및 복막 전이에서의 종양이 생체내 영상화되었음을 나타낸다. T - 종양; L - 간; rK - 우 신장; lK - 좌 신장; M - 복막 전이. 상부 패널 - 촬영상의 정중면; 하부 패널 - 촬영상의 관상면. 왼쪽 2 개의 영상 - CT; 왼쪽에서 두번째 - SPECT; 왼쪽에서 세번째 - SPECT/CT; 오른쪽 2 개의 영상 - MIP. (도 3을 또한 참조).
도 5. 플렉틴 -1 표적화 펩티드의 개략도. 다원자가를 증가시킨 서열 1의 4개의 복제본을 포함하고, 작용제의 순환 시간을 증가시키고 면역원성을 감소시키고 펩티드가 의도되는 표적에 도달하기 전에 생체내에서 절단되지 않도록 하기 위해 부가될 수 있는 4 개의 5000 Da PEG 쇄를 도시한, 다량체성 펩티드 리간드 복합체의 고도로 개략화된 형태. 다른 가능한 변형은 나타나지 않았다.
도 6. tPTP 의 생체내 특성화. 6A. 동소적으로 배치된 L3.6 세포로부터의 종양을 가진 무흉선 누드 마우스에 주입된 111IN-tPTP의 혈액 반감기. 혈액을 주입 후 0 분, 15 분, 30 분, 45 분, 60 분 및 120 분에서 취하였다. tPTP의 혈액 반감기는 4.29 분이다. 6B. SPECT/CT 영상화 (도 4 참조) 후, 동물 (n=5)을 희생시키고, 기관을 수거하고, 감마 계수치를 평가하였다. 췌장은 3% 주입 용량/g을 나타낸 반면, 복막강에서 발견된 전이는 1.5% 주입 용량/g을 나타내었다. 111IN-tPTP의 초기 배설 경로는 뇨를 통해서이다.
도 7. [ Lys - Thr - Leu - Leu - Pro - Thr - Pro - Gly - Gly - Ser ] 4 - Lys 4 -β Ala - DOTA . 화학식 [Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro-Gly-Gly-Ser]4-Lys4-βAla-DOTA ([KTLLPTPGGS]4-K4-βA-DOTA라고도 지칭됨)를 가진 사량체성 복합체의 화학적 구조.
도 8. tPTP -4(β AKTLLPTPGGS ( PEG5000 ))KKKKDOTAβA- NH 2 의 화학적 구조. 111In 분자를 포함하는 다량체성 펩티드 복합체의 화학적 구조가 제시된다.
도 9. KTLLPTP (서열 1)의 아미노산 치환: 알라닌 돌연변이. 이 연구에서 사용된 펩티드는 Panc 27 펩티드라고도 지칭되는 파지 유래된 서열 KTLLPTP (서열 1; 대조군) 및 돌연변이 서열로 이루어진다. 7 개 위치 각각은 개별적으로 알라닌으로 돌연변이되었다. 알라닌 돌연변이 ATLLPTP, KALLPTP, KTALPTP, KTLAPTP, KTLLATP, KTLLPAP 및 KTLLPTA (각각 서열 9 내지 15)로 기재되었고, 친화성에 대해 시험하였다.
약어 및 두문자어
βA - 베타 알라닌
CP - 만성 췌장염
DOTA - 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산
ncPTP - 음성 대조군 PTP
NIR - 근적외선
NIRF - 근적외선 형광색소
Panc 27 펩티드 - KTLLPTP (서열 1)
PanIN - 췌장 상피내 종양
PanIN I - 선종
PanIN II - 이형성을 갖는 선종
PanIN III - 제자리 암종
PDAC - 췌관 선암
Plec1 - 플렉틴-1
PTP - 플렉틴-1 표적화 펩티드
SPECT - 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영
tPTP - 사량체성 합성 펩티드로도 지칭되는 사량체성 플렉틴-1 표적화 펩티드 (이것은 플렉틴-1을 표적화함)
정의
본 발명의 설명 및 청구에 있어서, 하기 용어가 아래 설명된 정의에 따라 사용될 것이다.
본원에서 단수형은 하나 또는 하나 초과 (즉, 하나 이상)인 상기 문법적 대상을 지칭하기 위해 사용된다. 예로서, "구성요소"는 하나의 구성요소 또는 하나 초과의 구성요소를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "약"은 대략, ~의 범위인, 대개, 또는 ~ 정도를 의미한다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 그것은 설명된 수치 값의 위 아래로 경계를 확장시킴으로써 상기 범위를 변형시킨다. 일반적으로, 본원에서 용어 "약"은 수치 값을 언급된 값의 위 아래로 10％ 격차까지 변형시키기 위해 사용된다. 한 측면에서, 용어 "약"은 그것이 함께 사용된 숫자의 수치 값의 플러스 또는 마이너스 20％를 의미한다. 그러므로, 약 50％는 45％-55％의 범위 내를 의미한다. 본원에서 말단 값이 언급된 수치 범위에는 그 범위 내에 포괄되는 모든 숫자 및 분수가 포함된다 (예를 들면 1 내지 5에는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4 및 5가 포함됨). 또한, 모든 숫자 및 그의 분수는 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "선암"은 샘 (빈 공간을 둘러싼 세포들의 집합)을 형성하는 세포들로 이루어진 양성 (비-악성) 종양을 지칭하는 "선종"에 반대되는 것으로서의 악성 종양을 지칭한다.
본 발명의 문맥에서 사용되는 바와 같은 용어 "추가의 치유적으로 활성인 화합물" 또는 "추가의 치료제"는 치료할 특정 손상, 질환 또는 장애에 대한 추가의 치유적 용도를 위한 화합물의 사용 또는 투여를 지칭한다. 이러한 화합물에는, 예를 들어, 비-관련 질환 또는 장애, 또는 치료할 손상, 질환 또는 장애에 대한 1차적 치료에 반응하지 않은 수 있는 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용되는 것이 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "아쥬반트"는 특이적 항원과 조합하여 사용되는 경우 강화된 면역 반응을 발휘하는 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어, 화합물"의 투여" 및/또는 화합물"을 투여함"은 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물의 전구약물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "에어로졸"은 공기 중 현탁물을 지칭한다. 구체적으로, 에어로졸은 본 발명의 제형 및 그의 공기 중 현탁물의 입자화 또는 원자화를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "효능제"는 포유동물, 예컨대 인간에게 투여되는 경우, 상기 포유동물에서 관심 있는 표적 화합물 또는 분자의 수준 또는 존재에 기인하는 생물학적 활성을 강화시키거나 확장시키는 물질의 조성물이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "펩티드 구조에서의 변경"은 서열에서의 변화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 변화, 및 번역 후 변형을 지칭한다.
"길항제"는 포유동물, 예컨대 인간에게 투여되는 경우, 상기 포유동물에서 관심 있는 화합물 또는 분자의 수준 또는 존재에 기인하는 생물학적 활성을 억제하는 물질의 조성물이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "질환 또는 장애 증상을 완화함"은 증상의 중증도 또는 환자가 이러한 증상을 겪는 빈도를 감소시킴, 또는 둘 다를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 아미노산은 하기 표에 나타낸 바와 같이, 그의 전체 명칭, 그에 대응하는 3자리 문자 코드, 또는 그에 대응하는 1자리 문자 코드로 표현된다:
전체 명칭 3자리 문자 코드 1자리 문자 코드
아스파르트산 Asp D
글루탐산 Glu E
리신 Lys K
아르기닌 Arg R
히스티딘 His H
티로신 Tyr Y
시스테인 Cys C
아스파라긴 Asn N
글루타민 Gln Q
세린 Ser S
트레오닌 Thr T
글리신 Gly G
알라닌 Ala A
발린 Val V
류신 Leu L
이소류신 Ile I
메티오닌 Met M
프롤린 Pro P
페닐알라닌 Phe F
트립토판 Trp W
용어 "아미노산"은 "아미노산 잔기"와 상호교환적으로 사용되며, 유리 아미노산 및 펩티드의 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 상기 용어가 유리 아미노산을 지칭하는지, 또는 펩티드의 아미노산 잔기를 지칭하는지는, 그것이 사용되는 문맥으로부터 명백할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 표현 "아미노산"은 천연 및 합성 아미노산 둘 다와 D 및 L 아미노산 둘 다를 포함하는 의미이다. "표준 아미노산"은 천연 발생 펩티드에서 일반적으로 발견되는 20개의 표준 L-아미노산 중 임의의 것을 의미한다. "비표준 아미노산 잔기"는 그것이 합성으로 제조된 것인지 천연 공급원으로부터 유도된 것인지에 관계없이, 표준 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "합성 아미노산"에는 또한 염, 아미노산 유도체 (예컨대 아미드) 및 치환체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 화학적으로 변형된 아미노산이 포함된다. 본 발명의 펩티드 내에 함유된 아미노산은, 특히 카르복시- 또는 아미노-말단에서, 그의 활성에는 부정적인 영향을 주지 않으면서 펩티드의 순환 반감기를 변화시킬 수 있는 다른 화학기로의 치환, 아세틸화, 아미드화 또는 메틸화에 의해 변형될 수 있다. 추가로, 본 발명의 펩티드에는 디술피드 연결이 존재하거나 부재할 수 있다.
아미노산은 하기 일반 구조를 가진다:
Figure pct00002
아미노산은 측쇄 R을 기초로 하여 7개의 군으로 분류될 수 있다: (1) 지방족 측쇄, (2) 히드록실 (OH) 기를 함유하는 측쇄, (3) 황 원자를 함유하는 측쇄, (4) 산성 또는 아미드 기를 함유하는 측쇄, (5) 염기성 기를 함유하는 측쇄, (6) 방향족 고리를 함유하는 측쇄, 및 (7) 측쇄가 아미노 기에 융합된 이미노산인 프롤린.
본 발명의 펩티드 화합물을 기재하기 위해 사용되는 명명법은 통상적인 관행에 따르며, 여기서 아미노 기는 각 아미노산 잔기의 좌측에 존재하고 카르복시 기는 우측에 존재한다. 본 발명의 선택된 특정 실시양태를 나타내는 화학식에서, 아미노- 및 카르복시-말단 기는, 비록 구체적으로 나타내지는 않더라도, 달리 명시하지 않는다면 생리학적 pH 값에서 취할 수 있는 형태가 되는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "염기성" 또는 "양전하" 아미노산은 R 기가 pH 7.0에서 알짜 양전하를 갖는 아미노산을 의미하며, 표준 아미노산 리신, 아르기닌 및 히스티딘이 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 화학 화합물의 "유사체"는 예를 들어 구조가 서로 비슷하지만 반드시 이성질체인 것은 아닌 화합물이다 (예를 들어, 5-플루오로우라실은 티민의 유사체임).
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 항원 상의 특이적 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 의미한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유도되는 원형 면역글로불린일 수 있으며, 원형 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 통상적으로, 항체는 면역글로불린 분자의 사량체이다. 본 발명에서의 항체는 예를 들어 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 Fv, Fab 및 F(ab)2, 및 또한 단일 쇄 항체 및 인간화 항체를 비롯한 여러 형태로 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 "항체 중쇄"는 모든 항체 분자에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 쇄 중 보다 큰 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "항체 경쇄"는 모든 항체 분자에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 쇄 중 보다 작은 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "합성 항체"는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 박테리오파지에 의해 발현된 항체와 같이 재조합 DNA 기법을 사용하여 생성되는 항체를 의미한다. 또한, 상기 용어는, 항체를 코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되며 DNA 분자가 항체 단백질 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하는 것인 항체를 의미하도록 해석되어야 하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 당업계에서 이용가능하며 잘 알려진 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기법을 사용하여 얻어진다.
본원에서 사용되는 용어 "항원"은 면역 반응을 자극하는 분자로서 정의된다. 이 면역 반응은 항체 생산 또는 특이적 면역-적격 세포의 활성화 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 항원은 유기체, 단백질/항원의 서브유닛, 사멸 또는 불활성화된 전체 세포 또는 용해물로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결정기"는 특정 항체 (즉, 에피토프)와 접촉하도록 하는 항원의 부분을 의미한다. 단백질 또는 단백질의 단편 또는 화학적 모이어티를 사용하여 숙주 동물을 면역화시키는 경우에, 여러 항원 영역은 단백질 상의 소정의 영역 또는 3차원 구조에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도할 수 있으며; 이 영역 또는 구조가 항원 결정기로 지칭된다. 항원 결정기는 항체에의 결합에 대하여 원형 항원 (즉, 면역 반응의 유발을 위해 사용되는 "면역원")과 경쟁할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항미생물제"는 임의의 자연-발생, 합성 또는 반-합성 화합물 또는 조성물 또는 그의 혼합물을 의미하며, 이는 본 발명의 방법에서 실시되는 것과 같이 인간 또는 동물용으로 안전하며, 미생물을 사멸시키거나 또는 그의 성장을 실질적으로 억제하는데 효과적이다. 본원에서 사용되는 "항미생물제"에는 항박테리아제, 항진균제 및 항바이러스제가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드" 또는 안티센스 핵산은 적어도 그의 부분이 정상적인 세포 또는 질환이 발생하는 세포에 존재하는 핵산에 상보적인 핵산 중합체를 의미한다. "안티센스"는 특히 단백질을 코딩하는 이중 가닥 DNA 분자의 비-코딩 가닥의 핵산 서열 또는 비-코딩 가닥에 실질적으로 상동성인 서열을 의미한다. 본원에서 정의된 것과 같이, 안티센스 서열은 단백질을 코딩하는 이중 가닥 DNA 분자의 서열에 상보적이다. 안티센스 서열이 DNA 분자의 코딩 가닥의 코딩 부분에 전적으로 상보적인 것이 필요한 것은 아니다. 안티센스 서열은 단백질을 코딩하는 DNA 분자의 코딩 가닥에 특정된 조절 서열에 상보적일 수 있으며, 이 조절 서열은 코딩 서열의 발현을 제어한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드에는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드, 및 다른 올리고뉴클레오티드 변형체가 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"앱타머"는 시험관내에서 또 다른 화합물 (예를 들어, 본원에서의 확인된 단백질)에 우선적으로 결합하도록 선택된 화합물이다. 무작위 서열이 수많은 뉴클레오티드 또는 아미노산 (자연 발생 또는 합성 제조됨)으로부터 쉽게 생성될 수 있기 때문에, 앱타머는 종종 핵산 또는 펩티드이지만, 물론 이들로 제한되지는 않는다.
본원에서 "결합하다" 또는 "결합하는" 또는 "결합" 또는 "결합된"과 상호교환적으로 사용되는, 본원에서 사용되는 용어 "부착하다" 또는 "부착" 또는 "부착된" 또는 부착하는"은 안정한 복합체의 형성을 유발하는 분자 사이의 임의의 물리적 관계, 예컨대 리간드, 예컨대 펩티드 또는 소형 분자와 "결합 파트너" 또는 "수용체 분자" 사이의 물리적 관계를 나타낸다. 상기 관계는 선택적 비공유 결합, 이온 인력, 수소 결합, 공유 결합, 반 데르 발스 힘 또는 소수성 인력을 비제한적으로 비롯한 물리화학적 상호작용에 의해 매개될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "결합활성"은 리간드와 수용체 분자와의 전체 결합 강도를 의미하여, 상호작용의 강도는 파트너 간의 다수의 독립적인 결합 상호작용을 포함하도록 하며, 이는 다수의 낮은 친화도 상호작용 또는 소수의 높은 친화도 상호작용으로부터 유래될 수 있다.
용어 "결합"은 효소와 기질, 리간드와 수용체, 항체와 항원, 단백질의 DNA 결합 도메인과 DNA, DNA 또는 RNA 가닥과 상보적 가닥과 같은 (이들로 제한되지는 않음) 분자가 서로 부착하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "결합 파트너"는 또 다른 분자에 결합할 수 있는 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "생적합성"은 숙주에서 실질적으로 유해한 반응을 유도하지 않는 물질을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 폴리펩티드의 "생물학적 활성 단편" 또는 "생활성 단편"은 그의 천연 리간드에 특이적 결합하거나 또는 단백질의 기능을 수행할 수 있는 전장 단백질의 천연 또는 합성 부분을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "생물학적 샘플"은 여기에 제한되는 것은 아니나 피부, 모발, 조직, 혈액, 혈장, 세포, 땀 및 소변을 포함하는, 대상체로부터 수득된 샘플을 가리킨다.
본원에서 사용된 용어 "생검 조직"은 샘플이 암 조직을 함유하고 있는지를 결정하기 위해서 대상체로부터 제거된 조직의 샘플을 가리킨다. 일부 실시양태에서, 대상체가 암에 걸린 것이 의심되기 때문에 생검 조직이 수득된다. 이후, 암의 존재 또는 부재에 대해 생검 조직을 검사한다.
본원에서 사용된 용어 "암"은 그의 고유의 특성 (정상적인 통제의 상실)으로 인해 무제한 성장, 분화의 결핍, 국소 조직 침습 및 전이로 귀결되는 세포의 증식으로서 정의된다. 예로는 흑색종, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장암, 신장암 및 폐암이 포함되나 여기에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "담체 분자"는 관심 분자로 화학적으로 접합되는 임의의 분자를 가리킨다.
본원에서 사용된 용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양"은 상호 교환하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 용어들은 모두 임의의 그리고 모든 후속 세대인 그들의 자손을 포함한다. 모든 자손은 의도된 또는 우연한 돌연변이로 인해 동일하지 않을 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본원에서 사용된 용어 "대상체 중 암의 특징화"는 여기에 제한되지는 않지만 양성의 전암 조직 또는 암 조직의 존재, 암의 단계 및 대상체의 예후를 포함하는, 대상체 중 암 샘플의 하나 이상의 특징을 식별하는 것을 가리킨다. 암은 여기에 제한되지는 않지만 본원에 개시된 암 마커를 포함하는, 1종 이상의 암 마커 유전자의 발현의 식별에 의해 특징화될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "화학적으로 접합된" 또는 "화학적으로 접합하는"은 항원을 담체 분자에 연결하는 것을 가리킨다. 이러한 연결은 항원 및 담체 분자 모두의 아미노산 서열, 또는 이들의 부분을 함유하는 하이브리드 단백질이 생산될 수 있는, 재조합 기술을 사용하여 유전적 수준 상에서 발생할 수 있다. 상기 하이브리드 단백질은 항원 및 담체 분자 모두, 또는 이들의 부분을 코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열에 의해 생산된다. 또한, 이러한 연결은 기타 화학 반응, 예컨대 여기에 제한되지는 않지만 글루타르알데히드 반응을 사용하여 항원과 담체 단백질 사이에 생성되는 공유 결합을 포함한다. 또한, 항원을 담체 분자에 가교하는 제3 분자를 사용하여 공유 결합이 생성될 수 있다. 상기 가교제는 항원 및 담체 분자 상에서, 예컨대 여기에 제한되지는 않지만 1차 아민, 술프히드릴, 카르보닐, 탄수화물 또는 카르복실산 기와 반응할 수 있다. 또한, 화학적 접합은 항원과 담체 분자 사이의 비-공유 연결을 포함한다.
유전자의 "코딩 영역"은 유전자의 코딩 가닥의 뉴클레오티드 잔기 및 유전자의 전사에 의해 생산되는 mRNA 분자의 코딩 영역과 각각 동종이거나 또는 상보적인 유전자의 비-코딩 가닥의 뉴클레오티드로 구성된다.
용어 "경쟁적 서열"은 그의 동족 결합 부위에 대해 또다른 펩티드와 경쟁하는 펩티드 또는 그의 변형, 단편, 유도체 또는 상동체를 가리킨다.
본원에서 사용된 "상보적"은 2개의 핵산, 예를 들어 2개의 DNA 분자 사이의 넓은 개념의 서브유닛 서열 상보성을 가리킨다. 두 분자 모두에서 뉴클레오티드 위치가 보통 서로 염기 쌍형성을 할 수 있는 뉴클레오티드에 의해 점유되면, 이 위치에서 핵산은 서로 상보적인 것으로 간주된다. 따라서, 각 분자에서 상응하는 위치의 상당한 수 (50% 이상)가 보통 서로 염기 쌍형성을 하는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우 (예를 들어, A:T 및 G:C 뉴클레오티드 쌍), 2개의 핵산은 서로 상보적이다. 따라서, 잔기가 티민 또는 우라실인 경우 제1 영역에 역평행인 제2 핵산 영역의 잔기와 특정 수소 결합을 형성 ("염기 쌍형성")할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 유사하게, 잔기가 구아닌인 경우 제1 핵산 가닥의 시토신 잔기가 제1 가닥에 역평행인 제2 핵산 가닥의 잔기와 염기 쌍형성을 할 수 있다는 것이 공지되어 있다. 두 영역이 역평행 방식으로 배열되는 경우, 제1 영역의 하나 이상의 뉴클레오티드 잔기가 제2 영역의 잔기와 염기 쌍형성을 할 수 있으면, 핵산의 제1 영역은 동일하거나 또는 상이한 핵산의 제2 영역에 상보적이다. 바람직하게는, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고, 제2 영역은 제2 부분을 포함함으로써, 제1 및 제2 부분이 역평행 방식으로 배열되는 경우, 제1 부분의 뉴클레오티드 잔기의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 75% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상이 제2 부분의 뉴클레오티드 잔기와 염기 쌍형성을 할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 제1 부분의 모든 뉴클레오티드 잔기는 제2 부분의 뉴클레오티드 잔기와 염기 쌍형성을 할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "화합물"은 보통 약물로 고려되는 임의의 유형의 물질 또는 작용제, 또는 약물로서 사용하기 위한 후보물질뿐만 아니라 이들의 배합물 및 혼합물을 가리킨다.
본원에서 사용된 용어 "보존적 아미노산 치환"은 하기 5개의 군 중 하나 내에서의 아미노산 교환으로서 본원에서 정의된다:
I. 비극성 또는 약간 극성인 지방족 소형 잔기:
Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;
II. 음으로 하전된 극성 잔기 및 그의 아미드:
Asp, Asn, Glu, Gln;
III. 양으로 하전된 극성 잔기:
His, Arg, Lys;
IV. 비극성 지방족 대형 잔기:
Met Leu, Ile, Val, Cys
V. 방향족 대형 잔기:
Phe, Tyr, Trp
"대조" 세포는 시험 세포와 동일한 세포 유형을 갖는 세포이다. 예를 들어, 시험 세포를 검사하는 것과 정확하게 또는 거의 동일한 시간에 대조 세포를 검사할 수 있다. 또한, 예를 들어 시험 세포를 검사하는 시간과 차이를 두고 대조 세포를 검사할 수 있고, 대조 세포의 검사 결과를 기록하여 기록된 결과를 시험 세포의 검사에 의해 수득된 결과와 비교할 수 있다.
"시험" 세포는 검사 대상 세포이다.
본원에서 사용되는 "시토카인"은 세포사이 신호전달 분자를 지칭하며, 가장 널리 공지된 것은 포유동물 체세포의 조절에 포함되는 것이다. 이들의 효과 중 성장을 촉진하고 성장을 억제하는 많은 시토카인 족은 예를 들어 인터류킨, 인터페론, 및 형질전환 성장 인자를 포함함을 특징으로 한다. 많은 다른 시토카인이 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 시토카인의 공급원, 특징, 표적 및 이펙터 활성이 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 화합물의 "유도체"는 하나 이상의 단계에서 유사 구조의 또다른 화합물로부터 제조될 수 있는 화학적 화합물을 지칭하며, H의 대체물로서 알킬, 아실, 또는 아미노기가 있다.
용어 "검출" 및 이의 문법적인 변형의 사용은 정량하지 않고 종을 측정하는 것을 지칭하는 반면, 용어 "결정" 또는 "측정"과 이들의 문법적인 변형을 사용하는 것은 정량하여 종을 측정하는 것을 지칭하는 것으로 의미된다. 본원에서, 용어 "검출" 및 "확인"은 호환하여 사용된다.
본원에서 사용되는 "검출가능한 마커" 또는 "리포터 분자"는 마커 없이 유사 화합물의 존재하에 마커를 포함하는 화합물을 특이적으로 검출할 수 있게 하는 원자 또는 분자이다. 검출가능한 마커 또는 리포터 분자에는, 예를 들어 방사성 동위원소, 항원 결정기, 효소, 혼성화에 이용가능한 핵산, 발색단, 형광단, 화학발광성 분자, 전기화학적으로 검출가능한 분자, 및 변경된 형광-편광 또는 변경된 광-산란을 제공하는 분자가 포함된다.
"질환"은 동물이 항상성을 유지하지 못하고, 질환이 개선되지 않고 동물의 건강의 악화가 지속되는 경우의 동물의 건강 상태이다.
반면, 동물의 "장애"는 동물이 항상성을 유지할 수 있으나, 동물의 건강 상태가 장애가 부재하는 경우보다 덜 유리한 건강 상태이다. 치료하지 않고 방치할 경우, 장애가 반드시 동물의 건강 상태의 추가 격감을 유발하는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "도메인"은 일반적인 물리화학적 특징 (예컨대, 소수성, 극성, 구형 및 나선형 도메인이 있으나, 이에 제한되지 않음) 또는 특성, 예컨대 리간드 결합, 신호 형질도입, 세포 침투 등을 공유하는 분자 또는 구조의 일부를 지칭한다. 결합 도메인의 특이적 예에는 DNA 결합 도메인 및 ATP 결합 도메인이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 췌장에 관한 "도관 세포"는 췌장 내 및 췌장으로부터 배출되는 도관의 도관 라이닝을 형성하거나 이를 형성하는 능력을 갖거나 또는 이로부터 유래된 임의의 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 질환 또는 장애의 증상을 완화시키는 것과 같은 선택된 효과를 생성하기에 충분한 양을 의미한다. 조합 형태의 화합물, 예컨대 다중 화합물을 투여하는 것과 관련해서, 또다른 화합물(들)과 조합하여 투여하는 경우 각각의 화합물의 양은 화합물을 단독으로 투여하는 경우와 상이할 수 있다. 따라서, 유효량의 화합물의 조합은 각각의 화합물의 실제량을 변화시킬 수 있음에도 불구하고 전체적으로 조합을 총칭하여 지칭한다. 용어 "보다 유효한"은 비교하고자 하는 제2 치료에 비해 제1 치료가 선택된 효과를 보다 큰 정도로 완화시킨다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "이펙터 도메인"은 생화학적 경로를 조절할 수 있는 세포질에서의 이펙터 분자, 화학물질, 또는 구조와 직접 상호작용할 수 있는 도메인을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "엘릭시르"는 투명하고 달게한 (sweetened) 알콜-함유, 통상적으로 향을 내는 물질을 함유하는 히드로알콜성 액체 및 때때로 활성 의약제를 일반적으로 지칭한다.
"코딩"은 뉴클레오티드 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 규정된 서열 또는 아미노산의 규정된 서열 및 이들로부터 생성된 생물학적 특성을 갖는 생물학적 공정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로 작용하는 폴리뉴클레오티드에서의 뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA의 특이적 서열의 고유 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 전이가 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우 유전자는 단백질을 코딩한다. 코딩 가닥, 이의 뉴클레오티드 서열 모두는 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에서 제공되고, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥은 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
"인핸서"는 전사의 출발 부위에 대해 인핸서의 거리 또는 방향에 관계없이, 전사의 효율을 증가시킬 수 있는 DNA 조절 요소이다.
본원에서 사용되는 "에티토프"는 항체를 유발하거나 이와 반응할 수 있는 항원 분자상의 작은 화학적 군으로서 정의된다. 항원은 하나 이상의 에티토프를 가질 수 있다. 대부분의 항원은 많은 에티토프를 가질 수 있는데, 즉 이들은 다가이다. 일반적으로, 에티토프는 크기에 있어서 대략 5개의 아미노산 또는 당이다. 당업자는 일반적으로 분자의 특이적 선형 서열보다는 전반적인 3-차원 구조가 항원의 특이성의 주요 척도임을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 특정 단백질 또는 펩티드의 "본질적으로 순수한" 제조는 제조에서 단백질 또는 펩티드의 약 95 중량% 이상, 바람직하게는 약 99 중량% 이상이 특정 단백질 또는 펩티드라는 것이다.
"단편" 또는 "세그먼트"는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열의 일부, 또는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열의 일부이다. 본원에서 용어 "단편" 및 "세그먼트"는 호환하여 사용된다.
본원에서 사용되는 단백질 또는 펩티드에 적용되는 용어 "단편"은 길이에 있어서 통상적으로 약 3-15개 이상의 아미노산, 약 15-25개 이상의 아미노산, 길이에 있어서 약 25-50개 이상의 아미노산, 길이에 있어서 약 50-75개 이상의 아미노산, 길이에 있어서 약 75-100개 이상의 아미노산, 및 길이에 있어서 100개 초과의 아미노산일 수 있다.
본원에서 사용되는 핵산에 적용되는 용어 "단편"은 통상적으로 길이에 있어서 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 전형적으로 약 50개 이상의 뉴클레오티드, 보다 전형적으로, 약 50 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 100개 이상 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 200개 이상의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 약 300개 이상 내지 약 350개의 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 약 350개 이상의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 약 500개 이상 내지 약 600개, 더욱 더 바람직하게는 약 600개 이상의 뉴클레오티드 내지 약 620개의 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 약 620개 이상 내지 약 650개일 수 있으며, 가장 바람직하게는 핵산 단편은 길이에 있어서 약 650개 초과의 뉴클레오티드일 것이다.
본원에서 사용되는 "기능적" 생물학적 분자는 이것이 특성화되는 특성을 나타내는 형태의 생물학적 분자이다. 기능적 효소는, 예를 들어 효소가 특성화되는 특징적인 촉매 활성을 나타내는 것이다.
본원에서 사용되는 "상동성"은 두 중합체 분자, 예를 들어 두 핵산 분자, 예를 들어 두 DNA 분자 또는 두 RNA 분자 또는 두 폴리펩티드 분자 사이의 소단위 서열 유사성을 지칭한다. 두 분자 모두의 소단위 위치가 동일한 단량체 소단위에 의해 점유되는 경우, 예를 들어 각각의 두 DNA 분자에서의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 이들은 그 위치에서 상동성이다. 두 서열 사이의 상동성은 매칭 또는 상동성 위치의 수의 직접적 기능이며, 예를 들어 두 화합물 서열에서 위치의 절반 (길이에 있어서 중합체 10개의 소단위에서 5개의 위치)이 상동성이면 두 서열은 50% 상동성이고, 위치의 90%, 예를 들어 9/10이 매칭되거나 또는 상동성이면 두 서열은 90% 상동성을 공유한다. 예를 들어, DNA 서열 3'ATTGCC5' 및 3'TATGGC는 50% 상동성을 공유한다.
본원에서 사용되는 "상동성"은 "동일성"과 유사한 의미로 사용된다.
두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 (%)의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 두 서열을 비교하는데 유용한 수학적 알고리즘은 칼린 및 알트쉴 (Karlin and Altschul) (문헌 [1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877])에서와 같이 변형된 칼린 및 알트쉴 (문헌 [1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268])의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 알트쉴 등 (문헌 [1990, J. Mol. Biol. 215:403-410])의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램으로 도입되고, 예를 들어 미국 생물 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information (NCBI)) 웹사이트에서 BLAST 도구를 사용하는 유니버셜 리소스 로케이터 (universal resource locator)를 갖는 NCBI 월드 와이드 웹 사이트 (world wide web site)에서 접속할 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 조사는 하기 변수를 사용하는 NBLAST 프로그램 (NCBI 웹 사이트에서 "blastn"으로 명시됨)으로 수행하여 본원에 기재된 핵산과 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다: 갭 벌칙 (penalty) = 5; 갭 연장 벌칙 = 2; 미스매치 (mismatch) 벌칙 = 3; 매치 보상 (reward) = 1; 기대 값 10.0; 및 단어 크기 = 11. BLAST 단백질 조사는 하기 변수를 사용하는 XBLAST 프로그램 (NCBI 웹 사이트에서 "blastn"으로 명시됨) 또는 NCBI "blastp" 프로그램으로 수행하여 본원에 기재된 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다: 기대 값 10.0, BLOSUM62 득점 매트릭스. 비교를 위해 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 알트쉴 등 (문헌 [1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402])에 기재된 바와 같이 갭이 있는 BLAST를 사용할 수 있다. 별법으로, PSI-Blast 또는 PHI-Blast를 사용하여 분자 사이의 거리 관계 (Id.) 및 일반적인 패턴을 공유하는 분자 사이의 관계를 검출하는 반복 조사를 수행할 수 있다. BLAST, 갭이 있는 BLAST, PSI-Blast, 및 PHI-Blast 프로그램을 사용하는 경우, 해당 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 (default) 변수를 사용할 수 있다.
두 서열 사이의 동일성 (%)은 갭을 허용하든지 또는 허용하지 않으며 상기 기재된 것과 유사한 기술을 사용하여 결정할 수 있다. 동일성 (%)의 계산에서, 전형적으로 정확한 매치를 센다.
본원에서 사용되는 용어 "혼성화"는 상보적 핵산의 쌍형성에 관해 사용된다. 혼성화 및 혼성화의 강도 (즉, 핵산 사이의 회합 강도)는 핵산 사이의 상보성 정도로서 이러한 인자에 영향을 받고, 조건의 엄중함 (stringency)에는 형성된 하이브리드의 길이, 및 핵산 내의 G:C 비가 포함된다.
본원에서 사용되는 "흡입기"는 예를 들어, 용액, 분말 등의 약물을 코 및 폐로 투여하는 장치 모두를 지칭한다. 예를 들어, 용어 "흡입기"는 추진체로 유도되는 흡입기를 포함하는 것으로 의도되며, 예컨대 급성 천식증에 항히스타민제를 투여하는데 사용되고, 플라스틱 분무 병은 예컨대 충혈 완화제를 투여하는데 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "억제"는 화합물, 제제의 능력, 또는 용어 "억제"가 사용되는 문맥을 기준으로 기재되는 기능, 수준, 활성, 속도 등을 감소시키거나 지연시키는 방법을 지칭한다. 바람직하게는, 억제는 10% 이상이다. 용어 "억제"는 "감소" 및 "차단"과 호환하여 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "복합체의 억제"는 복합체의 형성을 억제하는 것 또는 둘 이상의 단백질의 상호작용뿐만 아니라 복합체의 기능 또는 활성을 억제하는 것을 지칭한다. 상기 용어는 형성된 복합체에 지장을 주는 것을 또한 포함한다. 그러나, 용어는 동시에 억제되어야 하는 이러한 기능의 면면을 암시하지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "단백질 억제"는 단백질의 합성, 수준, 활성 또는 기능을 억제하는 임의의 방법 또는 기술 뿐만 아니라 관심 단백질의 합성, 수준, 활성 또는 기능의 유도 또는 자극을 억제하는 방법을 의미한다. 상기 용어는 또한 관심 단백질의 합성, 수준, 활성 또는 기능을 조절할 수 있는 임의의 대사 또는 조절 경로를 의미한다. 상기 용어는 다른 분자 및 복합체 형성과의 결합을 포함한다. 그러므로, 용어 "단백질 억제제"는 이를 적용함으로써 단백질 기능 또는 단백질 경로 기능의 억제가 유발되는 임의의 제제 또는 화합물을 의미한다. 그러나, 상기 용어는 상기 기능 중 각각 그리고 모두가 동시에 억제되어야 함을 시사하지는 않는다.
본원에 사용된 "주사 또는 적용"은 국소, 경구, 협측, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심실내, 경피, 피하, 복강내, 비내, 장관, 국소, 설하, 질내, 안구, 폐 또는 직장 수단을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 경로 또는 수단에 의해 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "지도 자료"는 본원에 인용된 다양한 질환 또는 장애의 완화를 수행하기 위한 키트에서 본 발명의 펩티드의 유용성을 전달하기 위하여 사용할 수 있는 공개물, 기록물, 도해 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 임의로, 또는 다르게는, 상기 지도 자료는 포유동물의 세포 또는 조직에서 질환 또는 장애를 완화하는 하나 이상의 방법을 기재할 수 있다. 본 발명의 키트의 지도 자료는 예를 들어, 확인된 화합물을 함유하는 용기에 부착되거나 확인된 화합물을 함유하는 용기와 함께 수송될 수 있다. 다르게는, 상기 지도 자료는 지도 자료 및 화합물이 수용자에 의해 협조적으로 사용되려는 의도로 용기와 별개로 수송될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "침윤성" 또는 "전이"는 임의의 세포 이동, 특히 침윤성 암 세포 또는 종양 세포를 의미한다. 상기 용어는 정상적으로 침윤성인 세포, 예컨대 상처-치유 섬유모세포에 적용되고, 또한 비정상적으로 이동하는 세포에도 적용된다. 상기 용어를 임의의 기계론적 근거로 제한하려는 것은 아니지만, 상기 세포는 정상적으로 기능하기 위하여 충분히 "제 자리에" 있게 하는 신체의 수단을 패배시킴으로써 이동한다고 여겨진다. 상기 세포가 조직 또는 종양 내에서 비정상적으로 이동하는 경우, 또는 조직을 탈출하거나, 또는 다른 조직을 침윤하는 경우 상기 세포는 "침윤성"이다.
"단리된 핵산"은 자연 발생 상태에서 옆에 위치한 서열로부터 분리된 핵산 절편 또는 단편, 예컨대 단편에 정상적으로 인접한 서열 (예컨대 단편이 자연적으로 발생되는 게놈 내 단편에 인접한 서열)로부터 제거된 DNA 단편을 의미한다. 상기 용어는 또한 핵산과 자연적으로 동반되는 다른 성분, 예컨대 세포 내에서 자연적으로 핵산과 동반되는 RNA 또는 DNA 또는 단백질로부터 실질적으로 정제된 핵산에도 적용된다. 그러므로 상기 용어는 예를 들어, 벡터로, 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스로, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA로 도입된, 또는 다른 서열과 독립적으로 별개의 분자로서 (예컨대 cDNA, 또는 PCR 또는 제한 효소 소화에 의해 생산된 게놈 또는 cDNA 단편으로서) 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 이는 또한 추가의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA도 포함한다.
"리간드"는 표적화 수용체 또는 표적화 분자에 특이적으로 결합된 화합물이다.
"수용체" 또는 표적화 분자는 리간드에 특이적으로 결합된 화합물이다.
리간드 또는 수용체는, 상기 리간드 또는 수용체가 이종 화합물의 샘플에서 화합물의 존재를 결정하는 결합 반응에서 기능하는 경우, 화합물에 "특이적으로 결합한다". 따라서, 지정된 검정법 (예컨대 면역검정법) 조건 하에서, 상기 리간드 또는 수용체는 특정 화합물에 우선적으로 결합하고, 샘플 내 존재하는 다른 화합물과는 상당한 양으로 결합하지 않는다. 예를 들어, 혼성화 조건 하에서, 폴리뉴클레오티드는 상보적 서열을 포함하는 화합물 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하며; 면역검정법 조건하에서, 항체는 항체가 제기되는 에피토프를 갖는 항원에 특이적으로 결합한다.
본원에 사용된 용어 "연결"은 2개의 기 사이의 결합을 의미한다. 상기 결합은 공유 결합, 또는 이온 결합, 수소 결합 및 소수성/친수성 상호작용을 포함하나 이에 제한되지 않는 비공유 결합일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "링커"는 공유적으로 또는 비공유적으로, 예컨대 이온 또는 수소 결합 또는 반 데르 발스 상호작용을 통해 2개의 다른 분자를 결합시키는 분자, 예컨대 5' 말단에서 하나의 상보적 서열에 3' 말단에서 다른 상보적 서열에 혼성화함으로써 2개의 비상보적 서열을 연결시키는 핵산 분자를 의미한다.
유전자의 "발현불량(malexpression)"은 발현의 수준 (비-발현을 포함함), 발현된 유전자의 부분, 또는 세포 사이클과 관련된 유전자 발현의 시기가 질환 또는 장애가 없는 환자의 세포 중 동일한 유전자의 발현과 상이한, 질환 또는 장애가 있는 환자의 세포 내 유전자의 발현을 의미한다. 발현불량은 질환 또는 장애를 유발하거나 이에 기여할 수 있거나, 질환 또는 장애의 증상일 수 있거나, 또는 둘 다일 수 있다고 이해된다.
본원에 사용된 용어 "악성"은 퇴화, 침투, 예컨대 근접 영역 또는 혈관으로의 침투, 및 전이의 성질을 가짐을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "매스 태그"는 화학적 동일성에도 불구하고 분자량 기준으로 또다른 변형과 구별될 수 있는 분자의 화학적 변형, 또는 보다 전형적으로는 펩티드와 같은 분자의 2개의 이러한 변형을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "샘플 내 펩티드의 확인 방법"은 단백질을 비롯한 크고 작은 펩티드를 확인하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "발현 수준 측정" 또는 "발현 수준 결정"은 검정의 결과를 관심 유전자 또는 단백질의 발현 수준과 상관시키기 위하여 사용할 수 있는 임의의 측정법 또는 검정법을 의미한다. 이러한 검정법은 mRNA 수준, 단백질 수준 등의 측정을 포함하며, 예컨대 노던 및 웨스턴 블롯 분석, 결합 검정, 면역블롯 등과 같은 검정법으로 수행할 수 있다. 발현의 수준은 발현율을 포함할 수 있고, 존재하는 mRNA 또는 단백질의 실제 양에 대하여 측정될 수 있다.
용어 "핵산"은 전형적으로는 큰 폴리뉴클레오티드를 의미한다. "핵산"은 데옥시리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오시드으로 구성되든, 포스포디에스테르 연결 또는 변형된 연결, 예컨대 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸에스테르, 아세트아미데이트, 카르바메이트, 티오에테르, 가교된 포스포라미데이트, 가교된 메틸렌 포스포네이트, 가교된 포스포라미데이트, 가교된 포스포라미데이트, 가교된 메틸렌 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 가교된 포스포로티오에이트 또는 설폰 연결 및 상기 연결의 조합으로 구성되든, 임의의 핵산을 의미한다. 또한, 용어 핵산은 구체적으로는 5개의 생물학적 발생 염기 (아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실) 이외의 염기로 구성된 핵산도 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "핵산"은 RNA 뿐만 아니라 단일 및 이중 가닥 DNA 및 cDNA를 포함한다. 더욱이, 용어 "핵산", "DNA", "RNA" 및 유사한 용어는 또한 핵산 유사체, 즉 포스포디에스테르 주쇄 이외의 것을 갖는 유사체를 포함한다. 예를 들어, 당업계에 공지되고 주쇄에 포스포디에스테르 결합 대신에 펩티드 결합을 갖는 소위 "펩티드 핵산"은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 고려된다. "핵산"은 임의의 핵산, 데옥시리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오시드를 포함하는 핵산, 및 포스포디에스테르 연결 또는 변형된 연결, 예컨대 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸에스테르, 아세트아미데이트, 카르바메이트, 티오에테르, 가교 포스포르아미데이트, 가교 메틸렌 포스포네이트, 가교 포스포르아미데이트, 가교 포스포르아미데이트, 가교 메틸렌 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 가교 포스포로티오에이트 또는 술폰 연결, 및 이러한 연결들의 조합을 포함하는 핵산을 의미한다. 용어 핵산은 또한 특히 5종의 생물학상 발생 염기 (아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실) 이외의 염기를 포함하는 핵산을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 서열을 기술하는데 통상적인 명명법이 본원에서 사용된다: 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 말단은 5'-말단이고; 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향은 5'-방향이라고 지칭된다. 신생 RNA 전사체로의 뉴클레오티드의 5'에서 3'으로의 첨가의 방향은 전사 방향이라고 지칭된다. mRNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥은 "코딩 가닥"이라고 지칭되고; DNA 상의 기준점에 대해 5'에 위치된 DNA 가닥 상의 서열은 "상류 서열"이라고 지칭되고; DNA 상의 기준점에 대해 3'인 DNA 가닥 상의 서열은 "하류 서열"이라고 지칭된다.
본원에서 사용된 용어 "핵산 구조체"는 유전체 또는 합성 방법에 의해 얻은 원하는 특정 유전자 또는 유전자 단편을 코딩하는 DNA 및 RNA 서열을 포함한다.
달리 명시하지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로 퇴화 버전이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 RNA는 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 전형적으로 짧은 폴리뉴클레오티드, 일반적으로 약 50개 이하의 뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열 (즉, A, T, G, C)에 의해 표시되는 경우 이는 또한 RNA 서열 (즉, A, U, G, C) (여기서, "U"가 "T"를 대체함)을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용된 용어 "다른점에서 동일한 샘플"은 제1 샘플과 유사한 샘플, 즉 동일한 대상체로부터 동일한 조직 또는 체액으로부터 동일한 방법으로 얻은 샘플을 지칭하거나, 또는 상이한 대상체로부터 얻은 유사한 샘플을 지칭한다. 용어 "비감염(unaffected) 대상체로부터의 다른점에서 동일한 샘플"은 시험될 질환 또는 장애를 갖는 것으로 공지되지 않은 대상체로부터 얻은 샘플을 지칭한다. 샘플은 물론 표준 샘플일 수 있다. 유사하게, 용어 "다른점에서 동일한"이 또한 대상체 또는 비감염 대상체 내의 영역 또는 조직에 대해 사용될 수 있다.
2개의 폴리뉴클레오티드가 "작동가능하게 연결된"으로 기재된 것은, 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산 모이어티가 2개의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 서로 특징화시키는 생리학적 효과를 발휘할 수 있는 방식으로 핵산 모이어티 내에 배열된 2개의 폴리뉴클레오티드를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 유전자의 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 프로모터는 코딩 영역의 전사를 촉진할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "췌장"은 기관과 관련하여, 연결 조직에 의해 함께 유지되는 다수의 세포 유형의 집합을 지칭하며, 여기서 다수의 세포는 선포 세포, 도관 세포 및 섬 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. "선포"는 십이지장 내 음식물을 소화시키는데 필요한 많은 효소, 예컨대 리파제를 생성한다. 선포에 의해 생성된 효소는 도관이라고 불리는 작은 채널에 의해 십이지장으로 운반된다. 전형적으로, 도관 세포는 혈관 세포 및 신경 세포에 근접하여 연결 조직에 의해 제 자리에서 유지된다. 랑게르한스섬은 전형적으로 췌장의 외분비선 선포 유닛 사이에 묻혀있다. 섬 내분비선 세포의 예는 인슐린과 반대 작용을 하는 글루카곤을 분비하는 알파 세포인 반면, 베타 세포는 인슐린을 분비하며, 이는 탄수화물 대사의 제어를 돕는다.
본원에서 사용된 "췌장암"은 췌장을 포함하는 조직에서 유래하는 암, 예컨대 췌장 도관 선암종 세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 "췌장 도관 선암종 세포"는 췌장의 도관 내층을 형성하거나 이로부터 유래할 수 있는 능력을 갖는 암성 세포를 지칭한다. 췌장 도관 선암종 세포는 샘을 형성하는 췌장 내에서 발견되거나, 또는 전이된 세포로서 임의의 기관 내에서 발견되거나, 또는 림프계의 혈류 내에서 발견될 수 있다.
본원에서 사용된 제약 조성물의 "비경구 투여"는 대상체의 조직의 물리적 파괴 및 조직에서 파괴를 통한 제약 조성물의 투여를 특징으로 하는 임의의 투여 경로를 포함한다. 따라서, 비경구 투여는 조성물의 주사에 의한 제약 조성물의 투여, 수술적 절개를 통한 조성물의 적용, 조직-침투 비수술적 창상을 통한 조성물의 적용 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특히, 비경구 투여는 피하, 복강내, 근육내, 흉골내 주사, 및 신장 투석식 주입 기술을 포함하나 이에 제한되지 않는 것으로 고려된다.
용어 "펩티드"는 전형적으로 짧은 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "펩티드 리간드" (또는 펩티드와 관련하여 단어 "리간드")는 분자, 예컨대 단백질, 탄수화물 등에 특이적으로 결합하는 펩티드 또는 단백질의 단편을 지칭한다. 펩티드 리간드의 수용체 또는 결합 파트너는 본질적으로 임의의 유형의 분자, 예컨대 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 또는 임의의 유기 유도 화합물일 수 있다. 리간드의 특정 예는 본 발명의 펩티드 리간드이다.
용어 "다량체성 펩티드 리간드 복합체"는 플렉틴-1에 결합하는 2종 이상의 펩티드 리간드를 포함하는, 플렉틴-1 또는 그의 단편 또는 상동체에 결합하여 이를 검출하기 위한 복합체를 지칭한다. 임의로 펩티드 리간드가 보존적 아미노산 치환으로 변형되거나, 또는 추가 표준 또는 비-표준이 분포 또는 분해전 시간을 향상시키기 위해 첨가되고, 임의로 추가 아미노산이 링커로서 첨가되고, 임의로 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌이 펩티드에 첨가되고, 이들 각각은 그 후 임의로 링커, 예컨대 가요성 아미노산 사슬을 통해 킬레이팅제에 부착되어 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 형성한다. 킬레이팅제는 영상화제의 부착에 유용하다. 용어 "다량체성 펩티드 리간드 복합체"는 영상화제 함유 또는 비함유 복합체를 지칭할 수 있고, 이와 같이 용어 "다량체성 펩티드 리간드 영상화 복합체" 및 상기 용어는 문맥에서 사용되고 해석되는 것으로 의도된다. 상기 용어는 영상화제를 갖는 어구 또는 영상화제를 갖지 않는 어구, 또는 유사한 어구를 부가함으로써 적합하게 될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드 질량 표지"는 화학적으로 동일하지만 구별되는 질량에 의해 상이한 2개의 질량 태그 시약으로 펩티드를 표지하는 전략을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "적용 당"은 대상체로의 약물 또는 화합물의 투여를 지칭한다.
용어 "제약 조성물"은 하나 이상의 활성 성분을 포함하는 조성물을 의미할 것이며, 이에 따라 조성물은 포유동물 (예를 들어, 제한 없이, 인간)에서 특정화된, 효과적인 결과를 위해 조사에 잘 받아들여진다. 당업자는 활성 성분이 당업자의 요구사항을 기반으로 하여 원하는 효과적인 결과를 갖는지 아닌지를 결정하는 적절한 기술을 이해하고 인정할 것이다 .
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제약상 허용되는 담체"는 적절한 화합물 또는 유도체가 조합될 수 있는 화학 조성물 및 조합 후, 대상체에게 적절한 화합물을 투여하는데 사용될 수 있는 화학 조성물을 의미한다 .
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생리학상 허용되는" 에스테르 또는 염은 조성물이 투여되는 대상체에게 유해하지 않은 제약 조성물의 임의의 다른 성분과 상용가능한 활성 성분의 에스테르 또는 염 형태를 의미한다.
"제약상 허용되는"은 인간 또는 수의학적 적용 중 하나를 위해 생리학적으로 견딜만한 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "제약 조성물"은 인간 및 수의학적 사용을 위한 제제를 포함한다.
"다수"는 2개 이상을 의미한다.
"폴리뉴클레오티드"는 핵산의 단일 가닥 또는 평행 및 반-평행 가닥을 의미한다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산 중 하나일 수 있다.
"폴리펩티드"는 펩티드 결합, 관련된 자연적으로 발생하는 구조적 변이체, 및 그의 합성 비-자연적으로 발생하는 동족체를 통해 연결된 아미노산 잔기, 관련된 자연적으로 발생하는 구조적 변이체, 및 그의 합성 비-자연적으로 발생하는 동족체로 구성된 중합체를 지칭한다.
"합성 펩티드 또는 폴리펩티드"는 비-자연적으로 발생하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 합성 펩티드 또는 폴리펩티드는 예를 들어, 자동화 폴리펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 다양한 고체상 펩티드 합성 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "수술 후 종양 조직"은 대상체 (예를 들어, 수술 중)로부터 제거된 암성 조직 (예를 들어, 생검 조직)을 지칭한다.
"예비민감화"는 제제로의 검사 전의 하나 이상의 선천 면역계 자극자의 예비-투여를 의미한다. 이는 때때로 내성의 유도라고 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예방"은 어떠한 일이 일어나는 것을 방지하거나, 또는 가능한 일 또는 있을법한 일이 일어나지 않도록 사전 조치를 취하는 것을 의미한다. 의학의 문맥에 있어서, "예방"은 일반적으로 질환 또는 상태의 발병의 가능성을 감소시키기 위해 취하는 행위를 지칭한다.
"방지적" 또는 "예방적" 치료는 질환 또는 장애의 징후가 나타나지 않거나 또는 초기의 징후만이 나타나는 대상체에게 투여되는 치료이다. 예방적 또는 방지적 치료는 질환 또는 장애의 발병과 관련된 병리상태의 발생 위험을 감소시킬 목적으로 투여된다.
"프라이머"는 지정된 폴리뉴클레오티드 주형과 특이적으로 하이브리드화하며 상보적 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 개시 지점을 제공할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 합성은, 폴리뉴클레오티드 프라이머가 합성이 유도되는 조건 하에, 즉 뉴클레오티드, 상보적 폴리뉴클레오티드 주형 및 중합을 위한 작용제, 예컨대 DNA 폴리머라제의 존재 하에 위치하는 경우에 일어난다. 전형적으로, 프라이머는 단일 가닥이지만, 이중 가닥일 수 있다. 전형적으로, 프라이머는 데옥시리보핵산이지만, 광범위한 합성 및 자연 발생 프라이머가 여러 용도에 대하여 유용하다. 프라이머는 하이브리드화되어 합성의 개시를 위한 부위로서 기능하도록 지정되는 주형에 상보적이지만, 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없다. 이러한 경우에서, 프라이머와 주형과의 특이적 하이브리드화는 하이브리드화 조건의 엄격성(stringency)에 따른다. 프라이머는 예를 들어 발색성 모이어티, 방사성 모이어티 또는 형광성 모이어티로 표지될 수 있으며, 검출가능한 모이어티로서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 생성물의 발현에 요구되는 핵산 서열을 의미한다. 몇몇 경우에서, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있으며, 다른 경우에서, 이 서열은 또한 인핸서 서열 및 유전자 생성물의 발현에 요구되는 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들어 조직 특이적 방식으로 유전자 생성물을 발현하는 것일 수 있다.
"구성적" 프로모터는 세포에서 불변 방식으로 작동가능하게 연결되는, 유전자의 발현을 실행하는 프로모터이다. 예로써, 세포의 하우스 키핑 유전자의 발현을 실행하는 프로모터는 구성 프로모터로 고려될 것이다.
"유도가능한" 프로모터는, 유전자 산물을 코딩하거나 또는 명시하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결되는 경우 프로모터에 상응하는 유도인자가 세포에 존재하는 경우에서만 살아있는 세포에서 실질적으로 유전자 산물을 생성시키는 뉴클레오티드 서열이다.
"조직-특이적" 프로모터는, 유전자 산물을 코딩하거나 또는 명시하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결되는 경우 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에서만 살아있는 세포에서 실질적으로 유전자 산물을 생성시키는 뉴클레오티드 서열이다.
"예방적" 치료는 질환과 관련된 병리 진행 위험을 감소시키기 위한 목적으로 질환의 징후가 나타나지 않거나 또는 질환의 초기 징후만이 나타나는 대상체에게 투여되는 치료이다.
본원에 사용된 말단 아미노기에 대한 "보호기"는 펩티드의 말단 아미노기를 지칭하며, 말단 아미노기는 펩티드 합성에 통상적으로 이용되는 임의의 다양한 아미노-말단 보호기로 커플링되어 있다. 이러한 보호기는, 예를 들어 아실 보호기, 예컨대 포르밀, 아세틸, 벤조일, 트리플루오로아세틸, 숙시닐 및 메톡시숙시닐; 방향족 우레탄 보호기, 예컨대 벤질옥시카르보닐; 및 지방족 우레탄 보호기, 예를 들어 tert-부톡시카르보닐 또는 아다만틸옥시카르보닐을 포함한다. 적합한 보호기에 대해서는 문헌 [Gross and Mienhofer, eds., The peptides, vol. 3, pp. 3-88 (Academic Press, New York, 1981)]을 참조한다.
본원에 사용된 말단 카르복시기에 대한 "보호기"는 펩티드의 말단 카르복실기를 지칭하며, 말단 카르복실기는 임의의 다양한 카르복실기-말단 보호기로 커플링되어 있다. 이러한 보호기는, 예를 들어 tert-부틸, 벤질 또는 다른 에스테르 또는 에테르 결합을 통해 말단 카르복실기에 연결된 기타 허용가능한 기를 포함한다.
용어 "단백질"은 통상적으로 거대 폴리펩티드기를 지칭한다. 본원에서는 통상의 표기법이 폴리펩티드 서열을 묘사하는데 사용된다: 폴리펩티드 서열의 좌측 말단은 아미노-말단부이고; 폴리펩티드 서열의 우측 말단은 카르복실-말단부이다.
본원에 사용된 용어 "단백질 조절 경로"는 단백질을 조절하는 상류 조절 경로뿐만 아니라, 단백질 조절을 조절하는 하부 이벤트 둘 다를 지칭한다. 이러한 조절은 전사, 번역, 수준, 활성, 번역 후 변형 및 관심 단백질의 기능뿐만 아니라 단백질을 조절하는 하류 이벤트를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
용어 "단백질 경로" 및 "단백질 조절 경로"는 서로 교환해서 사용할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "예후를 제공한다"는 대상체의 이후 건강에 대한 암(예를 들면, 본 발명의 진단 방법에 의해 결정되는 바와 같음)의 존재의 영향에 대한 정보를 제공하는 것을 지칭한다(예를 들면, 예상 질병률 또는 사망률, 암이 걸릴 가능성 및 전이의 위험).
본원에 사용된 용어 "정제된" 및 유사 용어는 분자의 풍부 또는 천연 환경에서 분자 또는 화합물과 정상적으로 결합한 다른 성분에 대한 화합물에 관한 것이다. 용어 "정제된"은 공정 동안 얻어진 특정 분자의 완전한 정제를 의미하는 것은 아니다. 본원에 사용된 "고도로 정제된" 화합물은 90％ 순도를 초과하는 화합물을 지칭한다. 특히, 정제된 정자 세포 DNA는 정제된 정자 세포 DNA의 PCR 증폭 및 증폭된 DNA의 후속 분석에 비-정자 세포 DNA를 현저하게 검출가능한 수준으로 생산하지 않는 것을 지칭한다. "현저한 검출 가능 수준"은 얻어진 데이터에서 식별할 수 있을 정도의 오염량이고, 법의학적 증거의 분석 중에 언급/설명될 필요가 있다.
"재조합 폴리뉴클레오티드"는 자연적으로 함께 연결되지 않는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 증폭되거나 어셈블된 재조합 폴리뉴클레오티드는 적합한 벡터에 포함될 수 있으며, 벡터는 적합한 숙주 세포를 형질전환하는데 사용될 수 있다.
재조합 폴리뉴클레오티드는 비-코딩 기능(예를 들면, 프로모터, 복제의 기원, 리보솜-결합 위치 등)으로도 작용할 수 있다.
재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포는 "재조합 숙주 세포"로 지칭된다. 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자인, 재조합 숙주 세포에서 발현되는 유전자는 "재조합 폴리펩티드"를 생산한다.
"재조합 폴리펩티드"는 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현시 생산되는 것이다.
"재조합 세포"는 트랜스진을 포함하는 세포이다. 이러한 세포는 진핵 또는 원핵 세포일 수 있다. 또한, 트랜스제닉 세포는 트랜스진을 포함하는 배아 줄기 세포, 세포가 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 배아 줄기 세포로부터 유래된 키메라 포유동물로부터 얻어진 세포, 트랜스제닉 포유동물로부터 얻어진 세포, 또는 이들의 태아 또는 태반 조직 및 트랜스진을 포함하는 원핵 세포를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
용어 "조절하다"는 관심의 기능 또는 활성을 자극하거나 억제하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "리포터 유전자"는 유전자를 의미하고, 공지된 방법을 이용하여 발현을 검출할 수 있다. 예로서, lacZ 유전자의 발현은 배지에 색원체 기질 o-니트로페닐-β-갈락토시드를 첨가함으로써 공지된 방법을 사용하여 검출할 수 있기 때문에, 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) lacZ 유전자가 사용될 수 있다(문헌 [Gerhardt et al., eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, DC, p. 574]).
본원에 사용된 "샘플"은 바람직하게는 정상 조직 샘플, 질환 조직 샘플, 조직, 혈액, 타액, 배설물, 정액, 눈물 및 오줌을 비롯한(이들로 한정되는 것은 아님) 대상체로부터의 생물학적 샘플을 지칭한다. 또한, 샘플은 세포, 조직 또는 관심 유체를 함유하는 대상체로부터 얻어진 재료의 임의의 다른 원료일 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "2차 항체"는 다른 항체(1차 항체)의 불변 영역에 결합하는 항체를 지칭한다.
"신호 서열"이란 용어는 폴리펩티드를 세포 내로 가져가는 경로를 지시하는 펩티드, 즉 세포로부터 폴리펩티드의 최종적 분비를 포함한 (이에 제한되지 않음) 세포에서의 폴리펩티드의 세포성 처리를 지시하는 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 신호 서열은 소포체에 폴리펩티드의 합성을 표적화하는 폴리펩티드의 아미노 말단부에서 독점적이지는 않지만 통상적으로 발견되는 아미노산 서열이다. 일부 경우에, 신호 펩티드는 단백질 가수분해적으로 폴리펩티드로부터 제거되어, 성숙 단백질로부터 결여된다.
"소형 간섭 RNA(siRNA)"는 그 중에서도 센스 및 안티센스 가닥 둘 다로 이루어지는 단리된 dsRNA 분자를 의미한다. 한 측면에서, 이는 길이가 10 뉴클레오티드를 초과한다. 또한, siRNA는 표적화 유전자로부터의 센스 및 상보적 안티센스 서열 둘 다를 갖는 단일 전사체, 예를 들면 헤어핀을 지칭한다. 또한, siRNA는 dsRNA (단백질 가수 분해적으로 분열된 거대 dsRNA의 생성물, 특히 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합으로 생성된 RNA)뿐만 아니라, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 제거, 치환 및/또는 변경에 의해 자연적으로 발생하는 것과는 상이한 RNA 변환 RNA의 임의의 형태를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "고형 지지체"는 다양한 화합물과 결합(바람직하게는 공유 결합)을 형성할 수 있는 용매에 불용인 기질에 관한 것이다. 지지체는 자연적인 생물체, 예컨대 세포 또는 박테리오파지 입자, 또는 합성, 예컨대 아크릴아미드 유도체, 아가로스, 셀룰로오스, 나일론, 실리카, 또는 자화 입자일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합하는"은 이종의 화합물의 샘플 중의 존재를 결정하는 결합 반응 또는 검정 조건에서의 화합물 또는 리간드 기능을 의미하거나, 또는 샘플 중의 다른 분자의 존재 하에서, 하나의 분자, 예컨대 결합 모이어티, 예를 들면 올리고뉴클레오티드 또는 항체, 다른 분자, 예를 들면 핵산 또는 단백질에의 특이적 결합, 예컨대 표적화 분자를 의미한다.
또한, 펩티드(리간드) 및 수용체(분자)의 상호작용에 사용될 때 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다"는 특정 구조(예를 들면, 리간드의 아미노 서열 또는 단백질 내의 리간드 결합 도메인)의 존재에 따른 상호작용을 지칭하며; 펩티드는 일반적으로 인식시키는 구조 및 분자에 대해 결합 파트너에서의 특이적 단백질 구조를 포함한다. 예를 들어, 리간드가 결합 포켓 "A"에 대하여 특이적인 경우, 결합 포켓 A를 포함하는 단백질의 존재 하에서, 표지된 펩티드 리간드 "A"(예컨대 단리된 파지 표식 펩티드 또는 단리된 합성 펩티드)를 함유하는 반응에서, 비표지된 "A"는 결합 파트너에 결합된 표지된 펩티드 리간드의 양을 감소시킬 것이다. 즉, 경쟁적인 결합 검정이 될 것이다.
본원에 사용된 용어 "표준"은 비교를 위해 사용된 것을 지칭한다. 예를 들어, 이는 시험 화합물을 투여할 때의 결과와 비교하기 위해 사용되는 공지된 표준 제제 또는 투여된 화합물이거나, 파라미터 또는 기능일 수 있고, 이는 제제 또는 화합물의 효과를 측정할 때 대조값을 측정하여 얻을 수 있다. 또한, 표준은, 예컨대 샘플에 공지된 양으로 첨가된 제제 또는 화합물을 지칭할 수 있으며, 관심 마크를 측정하기 전에 샘플을 정제 또는 추출 공정에 적용할 때 정제 또는 회수율로서 이를 측정하는데 유용한 것이다. 내부 표준은 내생의 마커와는 구분되는, 예컨대 방사성 동위 원소로 표지된 정제된 관심 마커일 수 있다.
분석, 진단, 또는 치료의 "대상체"는 동물이다. 이러한 동물에는 포유동물, 바람직하게는 인간이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "암에 걸린 것으로 진단된 대상체"는 암성 세포를 갖는 지 검사하여 암성 세포를 갖는 것으로 밝혀진 대상체를 지칭한다. 암은 임의의 적합한 방법을 사용하여 진단될 수 있고, 이에는 생체검사, X-선, 혈액 검사 및 본 발명의 진단 방법이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는, 췌장 세포와 관련된 용어 "비-암성"은 이의 발병 단계 및 활성에 관하여 조절가능한 세포 성장 및 기능적 생리를 보여주는(demonstrating) 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "~를 필요로 하는 대상체"는 본 발명의 방법으로부터 이익을 얻을 환자, 동물, 포유동물 또는 인간이다.
본원에서 사용되는 용어 "암을 갖는 것으로 의심되는 대상체"는 암을 나타내는 하나 이상의 증상 (예를 들면 분명한 럼프(lump) 또는 매스)을 나타내거나, 또는 (예를 들면 정기 검진(routine physical) 중) 암이 스크리닝된 대상체를 지칭한다. 암을 갖는 것으로 의심되는 대상체는 또한 하나 이상의 위험 인자를 가질 수 있다. 암을 갖는 것으로 의심되는 대상체는 일반적으로 암 검사를 하지 않는다. 그러나, "암을 갖는 것으로 의심되는 대상체"는 최초 진단을 받았지만 암의 단계가 알려지지 않은 개체를 포함한다. 이 용어에는 암에 한번 걸렸던 사람도 포함된다 (예를 들면 관해기(remission)의 개체).
본원에서 사용되는 용어 "암의 위험이 있는 대상체"는 특정 암을 발병시키는 하나 이상의 위험 인자를 갖는 대상체를 지칭한다. 위험 인자에는 성별, 나이, 유전적 소인, 환경적 노출, 및 이전의 암 병력(incidents of cancer), 선재(preexisting) 비-암 질환, 및 생활방식이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "실질적으로 상동성인 아미노산 서열"에는 대조 항체 쇄의 아미노산 서열에 대하여 약 95% 이상의 상동성, 바람직하게는 약 96% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 상동성, 더 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 약 99% 이상 또는 그 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이 포함된다. 아미노산 서열 유사성 또는 동일성은 블라스트(BLAST; basic local alignment search tool) 2.0.14 알고리즘을 사용하는 BLASTP 및 TBLASTN 프로그램을 사용함으로써 계산될 수 있다. 이들 프로그램에 사용되는 디폴트 세팅(default setting)은 본 발명의 목적상 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 확인하기에 적합하다.
"실질적으로 상동성인 핵산 서열"은 대조 핵산 서열에 상응하는 핵산 서열을 의미하고, 여기서 상기 상응하는 서열은 실질적으로 동일한 구조 및 기능을 가지는 펩티드를 상기 대조 핵산 서열에 의해 인코딩된 펩티드로서 인코딩하며; 예를 들면, 아미노산에서 펩티드 기능에 영향을 유의하게 미치지 않는 변화만 일어난다. 바람직하게는, 실질적으로 동일한 핵산 서열은 상기 대조 핵산 서열에 의해 인코딩된 펩티드를 인코딩한다. 상기 실질적으로 유사한 핵산 서열과 상기 대조 핵산 서열 사이의 동일성의 백분율은 적어도 약 50%, 65%, 75%, 85%, 95%, 99% 또는 그 이상이다. 핵산 서열의 실질적인 동일성은 2개 서열의 서열 동일성을 비교함으로써, 예를 들면 물리적/화학적 방법 (즉 혼성화)에 의해 또는 컴퓨터 알고리즘을 통한 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다. 뉴클레오티드 서열이 대조 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 유사한가를 결정하기에 적합한 핵산 혼성화 조건은 다음과 같다: 7% 나트륨 도데실 술페이트 SDS, 0.5 M NaPO4, 1 mM EDTA 50℃에서 2X 표준 살린 시트레이트 (SSC)로 세척, 0.1% SDS 50℃에서; 바람직하게는 7% (SDS), 0.5 M NaPO4, 1 mM EDTA 50℃에서 1X SSC로 세척, 0.1% SDS 50℃에서; 바람직하게는 7% SDS, 0.5 M NaPO4, 1 mM EDTA 50℃에서 0.5X SSC로 세척, 0.1% SDS 50℃에서; 및 보다 바람직하게는 7% SDS, 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 50℃에서 0.1X SSC로 세척, 0.1% SDS 65℃에서. 2개의 핵산 서열 사이의 실질적인 유사성을 결정하기에 적합한 컴퓨터 알고리즘에는 GCS 프로그램 패키지 (문헌 [Devereux et al., 1984 Nucl. Acids Res. 12:387]), 및 BLASTN 또는 FASTA 프로그램 (문헌 [Altschul et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990 87:14:5509-13]; 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990 215:3:403-10]; 문헌 [Altschul et al., 1997 Nuclei Acids Res. 25:3389-3402])이 포함된다. 상기 프로그램에 의해 제공되는 디폴트 세팅은 본 발명의 목적상 핵산 서열의 실질적인 유사성을 결정하기에 적합하다.
용어 "실질적으로 순수한"은 화합물, 예를 들면 자연적으로 동반되는 성분으로부터 분리된 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 전형적으로, 화합물은 샘플 중 전체 물질 (부피에 의한, 습윤 중량 또는 건조 중량에 의한, 또는 몰 백분율 또는 몰 분율에 의한)의 10% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상이 관심 화합물인 경우에 실질적으로 순수하다. 순도는 임의의 적절한 방법에 의해, 예를 들면, 폴리펩티드의 경우에 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다. 화합물, 예를 들면 단백질은 또한 자연적으로 관련된 성분이 본질적으로 없는 경우 또는 자연 상태에서 동반되는 자연의 오염물질로부터 분리된 경우에 실질적으로 정제된다.
본원에서 사용되는 용어 "증상"은 환자 및 질환의 나타남(indicative)에 의해 경험된 임의의 병적 현상 또는 구조, 기능, 또는 감각이 정상에서 벗어남(departure)을 지칭한다. 대조적으로, "신호(sign)"는 질환의 객관적인 증거이다. 예를 들면, 코피는 신호이다. 이는 환자, 의사, 간호사 및 다른 관찰자에게 명백한 것이다.
"치유적" 치료는 상기 신호를 약화시키거나 제거하기 위해 병리학적 신호가 나타난 대상체에 투여되는 치료이다.
화합물의 "치료 유효량"은 화합물이 투여된 대상체에 유익한 효과를 제공하기에 충분한 화합물의 양이다.
본원에서 사용되는 용어 "트랜스진"은 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터/조절 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 외인성 핵산 서열을 의미하고, 이 외인성 핵산은 트랜스제닉 포유동물에 의해 인코딩된다.
본원에서 사용되는 용어 "트랜스제닉 포유동물"은 포유동물을 의미하고, 이의 생식 세포는 외인성 핵산을 포함한다.
본원에서 사용되는 "트랜스제닉 세포"는 도입된 핵산 서열에 의해 인코딩된 유전자의 발현을 가능하게 하는 방식으로 세포에 도입되는 핵산 서열을 포함하는 임의의 세포이다.
본원에서 사용되는 용어 "처치(treat)"는 환자 또는 대상체가 증상을 경험하는 빈도를 줄이는 것, 또는 이 증상을 경험하는 빈도를 줄이기 위해 제제 또는 화합물을 투여하는 것을 의미한다.
"예방적" 치료는 질환과 관련된 병을 발병시킬 위험을 감소시키기 위해 질환의 신호가 나타나지 않거나 단지 질환의 조기 신호만 나타나는 대상체에 투여되는 치료이다.
본원에서 사용되는 용어 "종양"은 제어되지 않고 폭발적인 과잉 세포 분열로 인한 조직의 비정상적인 매스를 지칭한다. 또한, 상기는 신생물(neoplasm)이라고 한다. 종양은 양성 (암성이 아님) 또는 악성일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "종양 세포"는, 본원에서 사용되는 바와 같이 임의의 제어되지 않은 성장 패턴 또는 변형된 생리를 나타내는 세포의 임의의 매스를 지칭한다. 종양 세포는 유기체 내의 임의의 조직 (예를 들면, 췌장 관상 종양 세포)으로부터 유도될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "암"은 세포의 제어되지 않고 비정상적인 성장을 특징으로 하는 100종을 초과하는 질환에 대한 일반적인 용어이다. 암 세포는 국부적으로 전파될 수 있거나, 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 혈관내침투(intravasation) 및 전파될 수 있으며, 전이를 형성할 수 있다. 전파되는 암 세포는 "악성"이라 한다. 포유류의 생리학적 상태와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예는 편평세포암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포암종, 복막의 암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 헤파토마(hepatoma), 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁관 암종, 침샘암종, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암종 및 다양한 유형의 두부 및 경부 암을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "백신"은 대상체 내로 접종되는 경우 대상체의 면역 반응을 자극하는 효과를 갖는 조성물을 의미하며, 대상체를 상태, 질환 또는 그의 증상에 대해 전부 또는 일부 보호하는 기능을 한다. 한 양태에서, 상태는 수태이다. 용어 "백신"은 예방적 및 또한 치유적 백신을 포함한다. 조합 백신은 2종 이상의 백신, 또는 2종 이상의 화합물 또는 작용제를 조합한 것이다.
"벡터"는 단리된 핵산을 포함하며 단리된 핵산을 세포의 내부에 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양쪽성 화합물과 결합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 비롯한 다수의 벡터가 당업계에 공지되어 있으나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 용어 "벡터"는 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 또한, 상기 용어는 예를 들어 폴리리신 화합물 및 리포솜 등과 같은, 세포에 대한 핵산의 운반 또는 전달을 촉진하는 비-플라스미드 및 비-바이러스성 화합물을 포함하려는 것이다. 바이러스성 벡터의 예는 아데노바이러스성 벡터, 아데노-결합 바이러스 벡터, 레트로바이러스성 벡터 및 재조합 바이러스성 벡터 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 비-바이러스성 벡터의 예는 리포솜 및 DNA의 폴리아민 유도체 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
"발현 벡터"는 발현하고자 하는 뉴클레오티드 서열에 유효하게 연결된 발현 대조군 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용(cis-acting) 요소를 포함하며; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 생체외(in vitro) 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입한 코스미드, 플라스미드 (예를 들면, 순수하거나 리포솜에 함유됨) 및 바이러스와 같은 당업계에 공지된 모든 것을 포함한다.
본 발명의 서열
서열 1- KTLLPTP (서열 1) (또한, Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro로 칭함)
서열 2- βAKTLLPTP (서열 2)
서열 3- βAKTLLPTPGGS (서열 3)
서열 4- KTLLPTPGGS (서열 4)
서열 5- KHVMSKQ (서열 5)
서열 6 - KHVMSKQGGS (서열 6)
서열 7- βAKHVMSKQ (서열 7)
서열 8- βAKHVMSKQGGS (서열 8)
서열 9- ATLLPTP (서열 9)
서열 10- KALLPTP (서열 10)
서열 11- KTALPTP (서열 11)
서열 12- KTLAPTP (서열 12)
서열 13- KTLLATP (서열 13)
서열 14- KTLLPAP (서열 14)
서열 15- KTLLPTA (서열 15)
서열 16- βAATLLPTPGGS (서열 16)
서열 17- βAKALLPTPGGS (서열 17)
서열 18- βAKTALPTPGGS (서열 18)
서열 19- βAKTLAPTPGGS (서열 19)
서열 20- βAKTLLATPGGS (서열 20)
서열 21- βAKTLLPAPGGS (서열 21)
서열 22- βAKTLLPTAGGS (서열 22)
서열 23- KKKK (서열 23)
βA는 베타 알라닌이며, 서열 목록에서는 Xaa로서 식별된다.
실시양태-
본 발명은 플렉틴-1을 발현하는 암 또는 임의의 세포를 진단, 검출, 모니터링 및 영상화하는데 유용한 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 제공한다. 펩티드는 영상화, 진단 및 암 국부화 등에 유용한 복합체로 사용된다. 페길화를 비롯한 다량체성 펩티드의 제조 방법 및 상응하는 단량체성 펩티드에 대한 그들의 활성의 비교 방법은, 본원에 기재되어 있거나 당업계에서 찾아 볼 수 있다(문헌 [Li, 2007, J. Nuc. Med., 48:7:1162-1171, "64Cu-labeled tetrameric and octameric RGD peptides for small-animal PET of tumor αvβ3 integrin expression"; reviewed in Choe and Lee, 2007, Current Pharmaceutical Design, 13:17-31; Chen et al., 2004, Mol. Imaging Biol. 6:350-9, "MicroPET imaging of breast cancer alphav-integrin expression with 64Cu-labeled dimeric RGD peptides"; Janssen, 2002, Cancer Biother. Radiopharm., 17:641-6, "Comparison of monomeric and dimeric radiolabeled RGD-peptide for tumor targeting; Poethko, 2004, J. Nucl. Med. 45:892-902; Chen, 2004, Bioconjugate Chem., 15:41-9; Chen, 2004, Nucl. Med. Biol., 31:11-19, "Pharmacokinetics and tumor retention of 125I-labeled RGD peptide are improved by PEGylation"; Li et al., 2009, Mol. Cancer Ther., 8:5:1239-1249; U.S. Pat. No. 7,666,979 (issued from U.S. Pat. App. No. 10/661,032); U.S. Pat. App. No. 12/012,011 (continuation of U.S. Pat. App. No. 10/792,582); Nahrendorf, 2010, JACC: Cardiovascular Imaging, 2:10:1213-1222; Krajewski et al., 2005, "Effect of Dimerization and Tetramerization on the Potency of HIV-Integrase Inhibitory Peptides," in Understanding Biology Using Peptides, American Peptide Society, S. Blondelle, Editor, 411-412]).
본 발명의 유용한 베이스 펩티드는 본원 또는 문헌 [Kelly et al. (2008, Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLoS Med 5:4:e85); 및 International Pat. Pub. No. WO 2009/129220 (Kelly et al., published October 22, 2009)]에 기재되어 있으며, 서열 1- KTLLPTP (서열 1)를 포함한다. 플렉틴-1에 결합하기 위한 서열 2-4 및 9-15를 비롯한, 다른 유용한 펩티드는 본원에 기재되어 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 서열 인코딩 펩티드를 포함하는 단리된 핵산을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 유용한 펩티드는 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 제조하는데 사용되며, 합성 공정 동안 추가의 아미노산을 부가하거나 아미노산을 치환함으로써 변형된다. 예를 들어, 플렉틴-1에 결합하는 공지된 리간드 KTLLPTP (서열 1)은 본원에서 다량체성 복합체를 형성하는데 사용되었으며, 염기 서열은 변형되어 서열 βAKTLLPTPGGS (서열 3)가 유도되며, 여기에 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 예컨대 PEG5000, 이어서 다수의 펩티드를 DOTA와 같은 킬레이터에 연결하는데 사용되는 연결용/간극용(linking/spacing) 리신이 부가된다. 킬레이터는 111In와 같은 영상화제가 부가될 수 있는 모이어티로서 유용하다. 이들 서열을 기재로 하는 생성된 본 발명의 다량체성 펩티드 리간드는 상기 경우에는 사량체이며, 화학식 (βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2을 갖는다.
플렉틴-1의 4개의 펩티드 리간드 (서열 1)을 포함하는 화학식 (βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2를 갖는 구조(또한, 본원에서 [(βAla-Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro-Gly-Gly-Ser-PEG5K)2-Lys]2-Lys-Lys(DOTA)-βAla-NH2로 지칭함)에 대한 켐드로우(ChemDraw)에 의해 유도된 화학명은, 아미노-3-옥소프로필카르바모일)-9-(히드록시메틸)-1,4,7,10,19,26,33,41-옥타옥소-14,17-디옥사-2,5,8,11,20,27,34,40-옥타아자도테트라콘탄-42-일)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산, 인듐 염이다.
상기 표시된 사량체성 화학식의 화학적 구조는 아래와 같다(또한, 도 8 참조).
Figure pct00003
본 발명은 또한, 예를 들어 서열 1 또는 βAKTLLPTPGGS (서열 3)를 변형시킴으로써, 다른 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 제조하는 것을 개시한다. 예를 들어, 이들 서열은 서열 9-22 중 임의의 것으로 대체될 수 있다. 따라서, 상기 기재된 본 발명의 사량체 (βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2는, 서열 3의 전부 또는 일부를 유사한 특성을 허용하는 다른 서열로 대체하거나 변형시킴으로써 변형된다. 본원에 기재된 바와 같이, 알라닌 돌연변이/치환은 서열 1의 각각의 잔기에 대해 이루어지며, 따라서 본 발명의 다른 사량체는 각각의 상기 치환을 포함한다. 이들 7가지의 변화는, 각각 서열 3을 서열 16-22로 대체하는 것에 기초하여 본 발명의 추가의 7개의 사량체, 즉
(βAATLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2,
(βAKALLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2,
(βAKTALPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2,
(βAKTLAPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2,
(βAKTLLATPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2,
(βAKTLLPAPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2, 및
(βAKTLLPTAGGS (PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2
를 포함한다.
상기 아미노산 치환만이 본 발명에 포함되는 것은 아니다. 다른 아미노산을 사용한 유사한 치환이 또한 본 발명에 포함된다. 추가로, 본원에 개시된 데이터는 트레오닌의 존재가 특히 중요하며 프롤린이 또한 중요할 수 있음을 시사한다. 이는 알라닌으로의 그의 치환이 친화도의 적어도 약간의 감소를 유발하였다는 사실을 입증한다. 그러므로, 본 발명은 또한, 예를 들어 추가의 트레오닌 잔기 또는 다양한 위치에서의 트레오닌 잔기를 포함시키기 위한 서열의 부가 및 치환을 제공한다.
따라서, 본 발명은 펩티드 리간드의 다량체, 및 적어도 하나의 영상화제, 예컨대 금속, 방사성핵종 등 (이들은 전형적으로 영상화제 복합체 형성을 위하여 킬레이터에 접합됨)을 포함하는 복합체의 제조를 포함한다.
특정 실시양태에서, 영상화제는 킬레이터에 의해 복합체에 부착된다. 한 측면에서, 킬레이터는 DOTA이다.
다수의 3가 금속 방사성핵종은 방사성동위원소 영상화에 적합한 물리적 특성 (예를 들어, 인듐-111 (111In), 갈륨-67/68 (67/68Ga) 및 이트륨-86 (86Y)) 또는 표적화된 방사성핵종 요법에 적합한 물리적 특성 (예를 들어, 90Y 및 루테늄-177 (177Lu))을 갖는다. 이들 금속 방사성핵종은 질환의 진단, 모니터링 또는 치료를 위해 표적화 생체분자 (예컨대, 펩티드 또는 항체)와 조합될 수 있다. 필요한 안정성을 갖는 방사성표지된 생체분자를 수득하기 위해, 우선 펩티드 또는 단백질을 적합한 킬레이터에 접합시켜 금속 복합체를 형성해야 한다. 펩티드 표지용 3가 금속 (예컨대, In, Y, Ga 및 Lu)에 대한 킬레이터의 요건은 단백질의 표지에 대한 것과 일반적으로 동일하다. 복합체는 생물학적 시스템에서 안정해야 하며, 그의 킬레이트화 능력이 펩티드와의 반응에 의해 약화되어서는 안된다. 대체로, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 및/또는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA; CAS 60239-18-1)가 사용된다 (문헌 [Choe and Lee, 2007, Current Pharmaceutical Design, 13:17-31]; [Li et al., 2007, J. Nuclear Medicine, "64Cu-Labeled Tetrameric and Octameric RGD Peptides for Small-Animal PET of Tumor avb3 Integrin Expression", 48:1162-1171]; [Nahrendorf et al., 2009, JACC Cardiovasc. Imaging, 2:10:1213-1222]; [Li et al., 2009, Mol. Cancer Ther., 8:5:1239-1249]; [Yim et al., 2010, J. Med. Chem., 53:3944-3953]; [Dijkgraaf et al., 2010, Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging] (2010년 9월 21일 온라인 출판); 미국 특허 출원 번호 10/792,582; 미국 특허 공보 번호 US 2010/0261875 (Dransfield et al.); 미국 특허 번호 7,666,979 참조). 언급된 금속 중, DOTA 복합체가 DTPA 복합체보다 열역학적으로 및 동역학적으로 보다 안정하다 (문헌 [Sosabowski et al., Nature Protocols 1, - 972 - 976 (2006)] 및 [Leon-Rodriguez et al., Bioconjugate chemistry, 01/03/2008; 19(2):391-402] 참조).
킬레이팅제
일부 실시양태에서, 킬레이팅제는 직접적으로 또는 간접적으로 펩티드에 부착될 수 있고, 치료제 또는 진단제, 예컨대 방사성핵종을 킬레이트화하는 데 사용될 수 있다. 예시적 킬레이터는 DTPA (예컨대, Mx-DTPA), DOTA, TETA, NETA 또는 NOTA를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 단백질에 금속 또는 다른 리간드를 부착시키기 위한 접합 방법 및 킬레이팅제의 용도는 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 일련 번호 12/112,289 참조).
본 발명에 포함되는 유용한 킬레이터는 DTPA, DO3A, DOTA, EDTA, TETA, EHPG, HBED, NOTA, DOTMA, TETMA, PDTA, TTHA, LICAM, HYNIC 및 MECAM을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. HYNIC가 본 발명의 또 다른 영상화제인 Tc99를 킬레이트화하는 데 특히 유용하다.
변형
본 발명은 또한 복합체의 일부로서의 분자, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG") 분자의 용도를 제공한다. 한 측면에서, PEG는 약 20,000 m.w.이거나, 또는 약 20,000 m.w. 미만이다. 또 다른 측면에서, PEG는 약 18,000 m.w. 미만이다. 또 다른 측면에서, PEG는 약 16,000 m.w. 미만이다. 추가 측면에서, PEG는 약 14,000 m.w. 미만이다. 추가 측면에서, PEG는 약 12,000 m.w. 미만이다. 추가 측면에서, PEG는 약 10,000 m.w. 미만이다. 추가 측면에서, PEG는 약 8,000 m.w. 미만이다. 추가 측면에서, PEG는 약 7,000 m.w. 미만이다. 추가 측면에서, PEG는 약 6,000 m.w. 미만이다. 추가 측면에서, PEG는 약 5,000 m.w. 미만이다. 추가 측면에서, PEG는 약 4,000 m.w. 미만이다. 추가 측면에서, PEG 약 3,000 m.w. 미만이다. 추가 측면에서, PEG는 약 2,000 m.w. 미만이다. 추가 측면에서, PEG는 약 1,000 m.w. 미만이다. 추가 측면에서, PEG는 약 500 m.w. 미만이다.
한 측면에서, PEG는 PEG5000 이다.
펩티드 변형 및 제조
펩티드 제조는 실시예에서 설명된다. 물론, 본 발명의 단백질 또는 펩티드가 활성에 영향을 미치지 않으면서 변형되는 아미노산 잔기를 포함할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 말단은 "원치않는 분해"로부터 N- 및 C-말단을 보호하고/거나 안정화시키기에 적합한 차단기, 즉 화학적 치환기를 포함하도록 유도체화될 수 있으며, 상기 용어 "원치않는 분해"는 화합물의 기능에 영향을 미칠 가능성이 있는 그의 말단에서의 화합물의 효소적, 화학적 또는 생화학적 분해 중 임의의 유형의 분해, 즉 말단 종결부에서의 화합물의 순차적 분해를 포함하는 것으로 의도된다.
차단기는 펩티드의 생체내 활성에 부정적인 영향을 미치지 않는, 펩티드 화학 분야에서 통상적으로 사용되는 보호기를 포함한다. 예를 들어, 적합한 N-말단 차단기가 N-말단의 알킬화 또는 아실화에 의해 도입될 수 있다. 적합한 N-말단 차단기의 예로는 C1-C5 분지 또는 비분지 알킬 기, 아실 기, 예컨대 포르밀 및 아세틸 기, 뿐만 아니라 그의 치환된 형태, 예컨대 아세트아미도메틸 (Acm) 기가 포함된다. 아미노산의 데스아미노 유사체가 또한 유용한 N-말단 차단기이고, 펩티드의 N-말단에 커플링되거나, 또는 N-말단 잔기 대신에 사용될 수 있다. C-말단의 카르복실 기가 혼입되거나 혼입되지 않은 적합한 C-말단 차단기는 에스테르, 케톤 또는 아미드를 포함한다. 에스테르 또는 케톤-형성 알킬 기, 특히 저급 알킬 기, 예컨대 메틸, 에틸 및 프로필, 및 아미드-형성 아미노 기, 예컨대 1급 아민 (-NH2), 및 모노- 및 디-알킬아미노 기, 예컨대 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 메틸에틸아미노 등이 C-말단 차단기의 예이다. 데스카르복실화된 아미노산 유사체, 예컨대 아그마틴이 또한 유용한 C-말단 차단기이고, 펩티드의 C-말단 잔기에 커플링되거나, 또는 그 대신에 사용될 수 있다. 또한, 펩티드 활성에 대한 영향 없이 데스아미노 및 그의 데스카르복실화된 형태를 수득하기 위해 말단의 유리 아미노 및 카르복실 기가 펩티드로부터 완전히 제거될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 산 부가염이 또한 기능적 등가물로서 고려된다. 따라서, 펩티드의 수용성 염을 제공하기 위해 무기산, 예컨대 염산, 브로민화수소산, 황산, 질산, 인산 등, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등으로 처리된 본 발명에 따른 펩티드가 본 발명에서 사용하기에 적합하다.
변형 (통상적으로 1차 서열을 변경시키지는 않음)에는 폴리펩티드의 생체내 또는 시험관내 화학적 유도체화, 예를 들어 아세틸화, 또는 카르복실화가 포함된다. 글리코실화의 변형, 예를 들어 폴리펩티드의 합성 및 프로세싱 중에 또는 추가 프로세싱 단계에서 폴리펩티드의 글리코실화 패턴을 변형시킴으로써; 예를 들어, 폴리펩티드를 글리코실화에 영향을 미치는 효소, 예를 들어 포유동물 글리코실화 또는 탈글리코실화 효소에 노출시킴으로써 만들어진 변형이 또한 포함된다. 포스포릴화된 아미노산 잔기, 예를 들어 포스포티로신, 포스포세린 또는 포스포트레오닌을 갖는 서열이 또한 포함된다.
단백질분해성 분해에 대한 내성을 개선시키거나 용해도 특성을 최적화하거나 이를 치료제로서 보다 적합하게 하기 위해 통상적인 분자 생물학적 기술을 이용하여 변형시킨 폴리펩티드가 또한 포함된다. 이러한 폴리펩티드의 유사체에는 천연 L-아미노산, 예를 들어 D-아미노산, 또는 비-천연 또는 비-표준 합성 아미노산 이외의 잔기를 함유하는 것이 포함된다. 본 발명의 펩티드는 본원에 나열된 구체적인 예시적 방법 중 임의의 방법의 생성물로 제한되지 않는다.
본 발명은 구조
Figure pct00004
를 갖는 베타-알라닌 (또한, β-알라닌, β-Ala, bA 및 βA로 지칭됨)의 용도를 포함한다.
부호 "βA"를 사용하는 서열이 본원에 제공되지만, 본원과 함께 제출된 서열 목록에서 "βA"는 "Xaa"로서 제공되고, 서열 목록 본문의 참조사항은 Xaa가 베타 알라닌임을 나타낸다.
본 발명에서, 예컨대 분석을 위한 표준 또는 변형에 유용한 펩티드는 문헌 [Stewart et al. in Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois]; 및 [Bodanszky and Bodanszky in The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York]에 기재된 바와 같은 잘 확립된 표준 기술, 예컨대 고체-상 펩티드 합성 (SPPS)에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 처음에는, 적합하게 보호된 아미노산 잔기가 그의 카르복실 기를 통해 유도체화된 불용성 중합체 지지체, 예컨대 가교된 폴리스티렌 또는 폴리아미드 수지에 부착된다. "적합하게 보호된"은 아미노산의 α-아미노 기 및 임의의 측쇄 관능기 둘 모두에 보호기가 존재하는 것을 지칭한다. 측쇄 보호기는 일반적으로 합성 전반에 걸쳐 사용되는 용매, 시약 및 반응 조건에 대해 안정하고, 최종 펩티드 생성물에 영향을 미치지 않는 조건 하에 제거가능하다. 올리고펩티드의 단계적 합성은 초기 아미노산으로부터 N-보호기를 제거하고, 원하는 펩티드의 서열내의 다음 아미노산의 카르복실 말단을 커플링시킴으로써 수행된다. 이러한 아미노산은 또한 적합하게 보호된다. 도입 아미노산의 카르복실은 활성화되어, 반응성 기로의 형성, 예컨대 카르보디이미드, 대칭 산 무수물, 또는 "활성 에스테르" 기, 예컨대 히드록시벤조트리아졸 또는 펜타플루오로페닐 에스테르로의 형성에 의해 지지체-결합된 아미노산의 N-말단과 반응할 수 있다.
고체상 펩티드 합성 방법의 예에는 α-아미노 보호기로서 tert-부틸옥스카르보닐을 사용하는 BOC 방법, 및 아미노산 잔기의 α-아미노를 보호하기 위해 9-플루오레닐메틸옥스카르보닐을 사용하는 FMOC 방법이 포함되며, 상기 방법은 둘 모두 당업자에게 널리 공지되어 있다.
N- 및/또는 C-차단기의 혼입은 또한 고체 상 펩티드 합성 방법에 통상적인 프로토콜을 이용하여 달성될 수 있다. C-말단 차단기의 혼입을 위해, 예를 들어 원하는 펩티드의 합성은 전형적으로, 수지로부터의 절단이 원하는 C-말단 차단기를 갖는 펩티드에 이르게 하도록 화학적으로 변형된 지지체 수지를 고체상으로 사용함으로써 수행된다. C-말단이 1급 아미노 차단기를 보유하는 펩티드를 제공하기 위해, 예를 들어 합성은, 펩티드 합성이 완료되면, 플루오린화수소산에 의한 처리가 원하는 C-말단 아미드화된 펩티드를 방출하도록, p-메틸벤즈히드릴아민 (MBHA) 수지를 사용하여 수행된다. 유사하게, C-말단에서 N-메틸아민 차단기의 혼입은 HF 처리시 N-메틸아미드화된 C-말단을 보유하는 펩티드를 방출하는 N-메틸아미노에틸-유도체화된 DVB, 수지를 사용하여 달성된다. 에스테르화에 의한 C-말단의 차단은 또한 통상의 절차를 이용하여 달성될 수 있다. 이는 수지로부터 측쇄 펩티드를 방출시켜, 원하는 알콜과의 후속적 반응을 허용하여, 에스테르 관능기를 형성하는 수지/차단기 조합의 사용을 수반한다. FMOC 보호기는 메톡시알콕시벤질 알콜 또는 등가의 링커로 유도체화된 DVB 수지와 조합하여 이러한 목적을 위해 사용될 수 있으며, 여기서 지지체로부터의 절단은 디클로로메탄 중 TFA에 의해 수행된다. 그 후, 적합하게 활성화된 카르복실 관능기의 에스테르화 (예를 들어, DCC에 의함)는 원하는 알콜의 첨가, 이어서 에스테르화된 펩티드 생성물의 탈보호 및 단리에 의해 진행될 수 있다.
N-말단 차단기의 혼입은 합성된 펩티드가 예를 들어 적합한 무수물 및 니트릴로의 처리에 의해 여전히 수지에 부착되어 있는 동안 달성될 수 있다. N-말단에 아세틸-차단기를 혼입시키기 위해, 예를 들어 수지-커플링된 펩티드를 아세토니트릴 중 20％ 아세트산 무수물로 처리할 수 있다. 그 후, N-차단된 펩티드 생성물이 수지로부터 절단되고, 탈보호되고, 후속적으로 단리될 수 있다.
화학적 또는 생물학적 합성 기술로부터 얻어진 펩티드가 원하는 펩티드임을 확실하게 하기 위해, 펩티드 조성물의 분석이 수행되어야 한다. 이러한 아미노산 조성물 분석은 펩티드의 분자량을 결정하기 위한 고해상도 질량 분광측정법을 이용하여 수행될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 펩티드의 아미노산 함량은 수성 산 중 펩티드의 가수분해, 및 HPLC 또는 아미노산 분석기를 이용한 혼합물 성분의 분리, 확인 및 정량화에 의해 확인될 수 있다. 펩티드의 서열을 확실히 결정하기 위해, 순차적으로 펩티드를 분해하고 순서에 따라 아미노산을 확인하는 단백질 서열분석기가 또한 이용될 수 있다.
펩티드는 사용 전에 오염물질을 제거하기 위해 정제될 수 있다. 이와 관련하여, 적절한 규제 기관에 의해 설정된 표준을 충족시키도록 펩티드가 정제될 것임을 인지할 것이다. 요구되는 수준의 순도에 도달하기 위해, 예를 들어 알킬화된 실리카 칼럼, 예컨대 C4-, C8- 또는 C18- 실리카를 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 비롯한 수많은 통상의 정제 절차 중 임의의 하나가 사용될 수 있다. 정제를 달성하기 위해, 증가하는 유기 함량의 구배 이동상, 예를 들어 수성 완충제 중 아세토니트릴 (통상적으로 소량의 트리플루오로아세트산을 함유함)이 일반적으로 사용된다. 펩티드를 그의 전하에 기초하여 분리하기 위해 이온-교환 크로마토그래피가 또한 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 수득한 실질적으로 순수한 단백질은 단백질 정제를 위한 하기 공지된 절차에 의해 정제될 수 있으며, 여기서 면역학적, 효소적 또는 다른 검정이 절차 중 각각의 단계에서 정제를 모니터링하기 위해 사용된다. 단백질 정제 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Deutscher et al. (ed., 1990, Guide to Protein Purification, Harcourt Brace Jovanovich, San Diego)]에 기재되어 있다.
논의된 바와 같이, 본 발명의 펩티드 리간드의 변형 또는 최적화가 본 출원의 범주 내에 있다. 변형되거나 최적화된 펩티드는 펩티드 결합 리간드의 정의 내에 포함된다. 구체적으로, 확인된 펩티드 서열은 그의 효능, 약동학적 거동, 안정성 및/또는 다른 생물학적, 물리적 및 화학적 특성을 최적화하기 위해 변형될 수 있다.
아미노산 치환
특정 실시양태에서, 개시된 방법 및 조성물은 1개 이상의 치환된 아미노산 잔기를 갖는 펩티드의 제조를 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 펩티드 서열의 구조적, 물리적 및/또는 치료적 특징은 1개 이상의 아미노산 잔기를 대체함으로써 최적화될 수 있다.
다른 변형이 또한 활성에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 혼입될 수 있고, 이들은 D-이성질체 형태의 아미노산에 의한 천연 L-이성질체 형태의 아미노산 중 1개 이상의 치환을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 펩티드는 1개 이상의 D-아미노산 잔기를 포함할 수 있거나, 또는 모두 D-형태인 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드의 역반전 형태, 예를 들어 모든 아미노산이 D-아미노산 형태로 치환된 반전 펩티드가 또한 고려된다.
당업자는 일반적으로, 펩티드에서의 아미노산 치환이 비교적 유사한 특성의 또 다른 아미노산에 의한 아미노산의 대체 (즉, 보존적 아미노산 치환)를 전형적으로 포함한다는 것을 알 것이다. 다양한 아미노산의 특성, 및 단백질 구조 및 기능에 대한 아미노산 치환의 효과는 당업계에서 광범위한 연구 및 이해의 대상이 되어 왔다.
예를 들어, 폴리펩티드가 상기 기재된 유사하거나 개선된 특성 프로파일을 갖게 할 것이라는 예상과 함께, 모 폴리펩티드 서열에 하기 동배체 및/또는 보존적 아미노산 변화를 생성할 수 있다:
알킬 -치환된 소수성 아미노산의 치환: 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 노르류신, S-2-아미노부티르산, S-시클로헥실알라닌, 또는 분지형, 시클릭 및 직쇄 알킬, 알케닐 또는 알키닐 치환기를 비롯한 C1-10 탄소로부터의 지방족 측쇄에 의해 치환된 다른 단순한 알파-아미노산을 포함한다.
방향족-치환된 소수성 아미노산의 치환: 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 비페닐알라닌, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 2-벤조티에닐알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, 히스티딘, 앞서 나열된 방향족 아미노산의 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아자, 할로겐화 (플루오로, 클로로, 브로모 또는 아이오도) 또는 알콕시-치환된 형태를 포함하며, 그의 예시적 예는 다음과 같다: 2-, 3- 또는 4-아미노페닐알라닌, 2-, 3- 또는 4-클로로페닐알라닌, 2-, 3- 또는 4-메틸페닐알라닌, 2-, 3- 또는 4-메톡시페닐알라닌, 5-아미노-, 5-클로로-, 5-메틸- 또는 5-메톡시트립토판, 2'-, 3'- 또는 4'-아미노-, 2'-, 3'- 또는 4'-클로로-, 2-, 3- 또는 4-비페닐알라닌, 2'-, 3'- 또는 4'-메틸-2, 3 또는 4-비페닐알라닌, 및 2- 또는 3-피리딜알라닌.
염기성 관능기를 함유하는 아미노산의 치환: 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴, 2,3-디아미노프로피온산, 호모아르기닌, 앞선 아미노산의 알킬, 알케닐 또는 아릴-치환 (C1-C10 분지형, 선형 또는 시클릭으로부터)된 유도체를, 치환기가 헤테로원자 (예컨대, 알파 질소, 또는 말단 질소 또는 질소들) 상에 있든지 또는 알파 탄소 상에, 예를 들어 pro-R 위치에 있든지 관계없이 포함한다. 예시적 예의 역할을 하는 화합물은 다음을 포함한다: N-엡실론-이소프로필-리신, 3-(4-테트라히드로피리딜)-글리신, 3-(4-테트라히드로피리딜)-알라닌, N,N-감마,감마'-디에틸-호모아르기닌. 알킬 기가 알파 탄소의 pro-R 위치를 점유하는 화합물, 예컨대 알파 메틸 아르기닌, 알파 메틸 2,3-디아미노프로피온산, 알파 메틸 히스티딘, 알파 메틸 오르니틴도 또한 포함된다. 또한, 알킬, 방향족, 헤테로방향족 (여기서, 헤테로방향족 기는 1개 이상의 질소, 산소 또는 황 원자를 단독으로 또는 조합으로 가짐) 카르복실산 또는 수많은 널리 공지된 활성화 유도체 (예컨대, 산 클로라이드, 활성 에스테르, 활성 아졸리드 및 연관된 유도체)로부터 형성된 아미드, 및 리신, 오르니틴 또는 2,3-디아미노프로피온산도 포함된다.
산성 아미노산의 치환: 아스파르트산, 글루탐산, 호모글루탐산, 티로신, 2,4-디아미노프로피온산, 오르니틴 또는 리신의 알킬, 아릴, 아릴알킬 및 헤테로아릴 술폰아미드, 및 테트라졸-치환된 알킬 아미노산을 포함한다.
측쇄 아미드 잔기의 치환: 아스파라긴, 글루타민, 및 아스파라긴 또는 글루타민의 알킬 또는 방향족 치환된 유도체를 포함한다.
히드록실 함유 아미노산의 치환: 세린, 트레오닌, 호모세린, 2,3-디아미노프로피온산, 및 세린 또는 트레오닌의 알킬 또는 방향족 치환된 유도체를 포함한다. 상기 나열된 각각의 카테고리 내의 아미노산이 동일한 군의 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있다는 것이 또한 이해된다.
예를 들어, 아미노산의 소수성 지수가 고려될 수 있다 (문헌 [Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157:105-132]). 아미노산의 상대적 소수성 특징은 생성된 단백질의 2차 구조에 기여하며, 이는 결국 단백질의 다른 분자와의 상호작용을 규정한다. 각각의 아미노산에 그의 소수성 및 전하 특징에 기초하여 소수성 지수를 할당하였고 (문헌 [Kyte & Doolittle, 1982]), 이들은 다음과 같다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5). 보존적 치환을 생성하는 데 있어서, 소수성 지수가 +/-2 이내인 아미노산의 사용이 바람직하고, +/-1 이내인 아미노산의 사용이 보다 바람직하며, +/- 0.5 이내인 아미노산의 사용이 보다 더 바람직하다.
아미노산 치환은 또한 아미노산 잔기의 친수성을 고려할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,554,101호). 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0); 글루타메이트 (+3.0); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5+/-0.1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 유사한 친수성의 다른 아미노산에 의한 아미노산의 대체가 바람직하다.
다른 고려사항은 아미노산 측쇄의 크기를 포함한다. 예를 들어, 소형 측쇄를 갖는 아미노산, 예컨대 글리신 및 세린을 대형 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어 트립토판 또는 티로신으로 대체하는 것은 일반적으로 바람직하지 않을 것이다. 단백질 2차 구조에 대한 다양한 아미노산 잔기의 효과도 또한 고려사항이다. 실증적 연구를 통해, 알파-나선, 베타-시트 또는 역회전 2차 구조를 취하는 단백질 도메인의 성향에 대한 다양한 아미노산 잔기의 효과가 결정되어 있으며, 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Chou & Fasman, 1974, Biochemistry, 13:222-245; 1978], [Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276; 1979], [Biophys. J., 26:367-384] 참조).
이러한 고려사항 및 광범위한 실증적 연구에 기초하여, 보존적 아미노산 치환의 표가 구성되어 있으며, 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어: 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신. 대안적으로: Ala (A) leu, ile, val; Arg (R) gln, asn, lys; Asn (N) his, asp, lys, arg, gln; Asp (D) asn, glu; Cys (C) ala, ser; Gln (Q) glu, asn; Glu (E) gln, asp; Gly (G) ala; His (H) asn, gln, lys, arg; Ile (I) val, met, ala, phe, leu; Leu (L) val, met, ala, phe, ile; Lys (K) gln, asn, arg; Met (M) phe, ile, leu; Phe (F) leu, val, ile, ala, tyr; Pro (P) ala; Ser (S), thr; Thr (T) ser; Trp (W) phe, tyr; Tyr (Y) trp, phe, thr, ser; Val (V) ile, leu, met, phe, ala.
아미노산 치환에 대한 다른 고려사항은 잔기가 단백질의 내부에 위치하는지, 또는 용매에 노출되어 있는지의 여부를 포함한다. 내부 잔기의 경우에, 보존적 치환은 다음을 포함할 것이다: Asp 및 Asn; Ser 및 Thr; Ser 및 Ala; Thr 및 Ala; Ala 및 Gly; Ile 및 Val; Val 및 Leu; Leu 및 Ile; Leu 및 Met; Phe 및 Tyr; Tyr 및 Trp (예를 들어, PROWL 록펠러 대학 웹사이트 참조). 용매에 노출된 잔기의 경우에, 보존적 치환은 다음을 포함할 것이다: Asp 및 Asn; Asp 및 Glu; Glu 및 Gln; Glu 및 Ala; Gly 및 Asn; Ala 및 Pro; Ala 및 Gly; Ala 및 Ser; Ala 및 Lys; Ser 및 Thr; Lys 및 Arg; Val 및 Leu; Leu 및 Ile; Ile 및 Val; Phe 및 Tyr (동일). 아미노산 치환의 선택을 돕기 위해, PAM250 스코어링 매트릭스, Dayhoff 매트릭스, Grantham 매트릭스, McLachlan 매트릭스, Doolittle 매트릭스, Henikoff 매트릭스, Miyata 매트릭스, Fitch 매트릭스, Jones 매트릭스, Rao 매트릭스, Levin 매트릭스 및 Risler 매트릭스와 같은 다양한 매트릭스가 구성되어 있다 (동일).
아미노산 치환을 결정하는 데 있어서, 분자간 또는 분자내 결합의 존재, 예컨대 양으로 하전된 잔기 (예를 들어, His, Arg, Lys)와 음으로 하전된 잔기 (예를 들어, Asp, Glu) 사이의 이온 결합 (염 가교), 또는 가까운 시스테인 잔기 사이의 디술피드 결합의 형성을 또한 고려할 수 있다.
예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발의 기술에 의해, 또는 아미노산 치환을 코딩하고 발현 벡터 구축물 내로 스플라이싱하는 올리고뉴클레오티드의 합성 및 어셈블리에 의해, 코딩된 펩티드 서열에서 임의의 아미노산으로 임의의 다른 아미노산을 치환하는 방법은 널리 공지되어 있으며, 당업자에게는 일상적인 실험의 문제이다.
링커
추가로, 본 발명에 포함되는 변형은 결합 모이어티 또는 결합 폴리펩티드의 표적 서열과 검출가능한 표지 또는 치료제 사이의 링커 또는 스페이서의 도입을 포함한다. 예를 들어, 이러한 링커/스페이서의 사용은 결합 펩티드의 적절한 특성을 개선 (예를 들어, 혈청 안정성의 증가 등)시킬 수 있다. 이들 링커는 당업계에 통상적인 치환 또는 비치환된 알킬 쇄, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 아미노산 스페이서, 당, 또는 지방족 또는 방향족 스페이서를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 적합한 링커는 동종이관능성 및 이종이관능성 가교 분자를 포함한다. 동종이관능성 분자는 동일한 2개 이상의 반응성 관능기를 갖는다. 동종이관능성 분자 상의 반응성 관능기는, 예를 들어 알데히드 기 및 활성 에스테르 기를 포함한다. 알데히드 기를 갖는 동종이관능성 분자는, 예를 들어 글루타르알데히드 및 수베르알데히드를 포함한다.
2개 이상의 활성 에스테르 단위를 갖는 동종이관능성 링커 분자는 디카르복실산과 N-히드록시숙신이미드의 에스테르를 포함한다. 이러한 N-숙신이미딜 에스테르의 일부 예는 디숙신이미딜 수베레이트 및 디티오-비스-(숙신이미딜 프로피오네이트), 및 이들의 가용성 비스-술폰산 및 비스-술포네이트 염, 예컨대 이들의 나트륨 및 칼륨 염을 포함한다.
이종이관능성 링커 분자는 2개 이상의 상이한 반응성 기를 갖는다. 반응성 디술피드 결합을 함유하는 이종이관능성 시약의 일부 예는 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜-디티오)프로피오네이트 (문헌 [Carlsson et al., 1978. Biochem. J., 173:723-737]), 나트륨 S-4-숙신이미딜옥시카르보닐-알파-메틸벤질티오술페이트 및 4-숙신이미딜옥시카르보닐-알파-메틸-(2-피리딜디티오)톨루엔을 포함한다. N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트가 바람직하다. 티올 기와 반응하는 이중 결합을 갖는 반응성 기를 포함하는 이종이관능성 시약의 일부 예는 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산)-1-카르복실레이트 및 숙신이미딜 m-말레이미도벤조에이트를 포함한다. 다른 이종이관능성 분자는 숙신이미딜 3-(말레이미도)프로피오네이트, 술포숙신이미딜 4-(p-말레이미도-페닐)부티레이트, 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸-시클로헥산)-1-카르복실레이트, 말레이미도벤조일-5N-히드록시-숙신이미드 에스테르를 포함한다.
또한, 상기 기술된 분자 및/또는 모이어티의 혼합인 링커는 펩티드의 성질에 특별한 장점을 부여하도록 또한 이용될 수 있다.　 링커를 갖는 지질 분자는 초음속 거품, 리포솜 또는 구조체에 기초되는 다른 응집체를 형성하기 위해 부착될 수 있다.　 그러한 구조체는 진단 리포터, 치료용 작용제(예를 들어, 치료용 화학적 "탄두"), 또는 그들의 조합의 표적화 및 운반을 위한 작용제로서 이용될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 펩티드 리간드의 이량체, 다량체 또는 중합체를 이용하는 구조체가 또한 고려된다. 사실, 저강도 펩티드 또는 작은 분자의 결합이 이량체 및 다량체의 형성에 의해 실질적으로 증가될 수 있다는 충분한 문헌적 증거가 있다. 따라서 이량체성 및 다량체성 구조체(동종성 및 이종성 모두)가 본 발명의 범위 내이다. 이량체성 구조체에서 폴리펩티드 서열이 적합하게 배치(또는 펜던트 옥시아미노와 같은 선택적으로 유도될 수 있는 기 또는 다른 친핵성기를 지탱하는 또다른 기능)된 리신 모이어티의 N- 또는 C-말단 또는 N-엡실론 질소에서 부착될 수 있거나, 적절한 부착 화학물질을 이용하는 하나 이상의 링커(예컨대, 여기서 논의되는 것들)를 통해 함께 결합될 수 있다. 이 커플링 화학물질은 아미드, 요소, 티오우레아, 옥심 또는 아미노아세틸아미드 (클로로- 또는 브로모아세트아미드 유도체로부터, 그러나 이에 제한되지는 않는다)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Plec1 결합 폴리펩티드의 이량체성 또는 다량체성 구조체를 준비하는 방법은 적어도 아래에서 논의되는 것들을 포함한다.
링커는 킬레이팅제에 부착을 위해 또한 사용될 수 있다.
치료제
다른 실시양태에서, 세포독성 작용제, 항혈관형성제, 항세포사멸제, 항생제, 호르몬, 호르몬 길항제, 케모카인, 약물, 전구약물, 톡신, 효소 또는 다른 작용제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 치료제는 여기서 기술된 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 사용하는 경우, 부가적인 치료법으로서 사용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 약물은 예를 들어, 항유사분열, 안티키나아제, 알킬레이팅, 대사길항물질, 항생제, 알칼로이드, 혈관신생방해제, 항세포사멸제 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 제약 성질을 가질 수 있다.
암의 진단, 모니터링, 및 치료
또다른 측면에서, 본 발명은 대상체의 암을 진단하는 방법 및 조성물을 제공한다. 그 방법은 환자로부터 샘플, 예를 들어 생체 검사 샘플 및 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 포함하는 진단 조성물을 제공하는 것을 포함하는데, 여기서 펩티드 리간드(들) 서열은 한 측면에서 검출가능한 모이어트와 임의로 접합된 서열 s1-4 및 9-22 중 하나로부터 선택되어, 샘플에 펩티드를 첨가하고, 예컨대 샘플에서 검출가능한 부분을 검출함으로써 진단 조성물을 검출한다. 일부 실시양태에서, 영상화는 레이저 주사현미경, 면역조직화학, 형광성 현미경, 방사선사진술 영상화 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
또다른 측면에서, 본 발명은 생체 내에서 암을 진단하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 그 방법은 췌장 세포 암에 대한 위험이 있거나 그것이 예상되는 대상체를 확인하는 것; 대상체에 영상화 분자가 접합된 본 발명의 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 포함하는 진단 조성물을 투여하는 것, 및 생체 내 영상화를 이용하여 대상체 내의 영상화 분자를 영상화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 췌장 세포 암은 췌장선암종이다. 일부 실시양태에서, 영상화 분자는 자기형광성 입자이다. 일부 실시양태에서, 자기형광성 입자는 근적외선(NIR) 형광색소(NIRF)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 피내의, 피하의, 복강 내의, 정맥 내의, 동맥 내의, 구강 내의, 및 위의 경로로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, 생체 내 영상화는 자기공명영상화(MRI), 생체 레이저 주사현미경, 내시경술, SPECT/CT 및 방사선 사진술의 영상화를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한 암이 발현하는 동안을 포함하여 암의 진행을 모니터링을 하기 위해 제공된다. 본 출원은 췌장 발암 동안의 플렉틴-1 발현 및 세포 국부화가 변화되는 것을 개시한다. 본 발명은 이러한 변화를 모니터링하는 방법 및 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 암의 진행 또는 치료를 모니터링하는 방법 및 조성물을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 췌장암 세포를 수술적으로 제거하는 방법을 제공한다. 그 방법은 a) i) 췌장 비-암세포로부터 췌장암 세포를 구별하기 위해 본 발명의 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 포함하는 조성물; ii) 췌장암을 갖는 있는 것이 공지된 대상체; iii) 생체 내 영상화 장치를 제공하는 것; 및 b) 대상체에 조성물을 투여하는 것; c) 영상화 장치로 생체 내 췌장암 세포를 영상화하는 것; 및 d) 그 위치에서 검출 후 대상체로부터 췌장암 세포를 제거하는 것을 포함한다.
본 발명은 a) i) 치료가 필요한 대상체; ii) 리간드가 본 발명의 바이오마커에 결합되어 있는 본 발명의 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것; 및 b) 대상체에 치료 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 치료제를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 일 이상의 융합단백질, 톡신 및 약물 또는 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 플렉틴-1 또는 그의 단편 또는 상동체가 발현되거나 세포 표면 플렉틴-1이 존재하는 형태로 제한되지 않는다. 사실, 폐암, 담낭암, 두 및/또는 경부암, 유방암, 식도암, 구강암, 설암, 치육암, 피부암(예를 들어, 흑색종, 기저 세포암, 카포시 육종 등), 근육암, 심장암, 간암, 기관지암, 연골암, 골암, 위암(stomach cancer), 전립선암, 고환암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁암, 췌장암, 대장암, 직장암, 위암(gastric cancer), 신장암, 방광암, 림프종암, 비장암, 흉선암, 갑상선암, 뇌종양, 신경암, 중피종, 담낭암, 안암(예컨대, 각막암, 포도막암, 맥락막암, 각막 백반암, 유리액암 등), 관절암(예컨대, 활막암), 교아종, 백혈구 암(예컨대, 림프종, 백혈병 등), 가족성 대장암(HNPC), 염증성 대장암 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 다양한 형태의 암이 본 발명의 검출 방법으로 사용되는 것이 고려된다.
본 발명은 a) i) 치료의 필요가 있는 암환자, ii) 플렉틴-1 또는 그의 단편에 결합된 리간드를 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것; 및 b) 환자에게 치료 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 췌장암 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 치료제를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 융합 단백질, 톡신 및 약물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가적인 측면에서, 본 발명은 췌장암을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 그 방법은 예컨대 췌장암을 갖는 것을 기초로 하여, 치료가 필요한 대상체를 확인하는 것, 및 서열 1-4 및 9-22를 갖는 펩티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 세포독성 작용제, 즉 톡신 또는 약물에 결합된 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 췌장암 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 펩티드 리간드에 선택적인 친화도를 갖는 암 세포-결합 파트너(수용체)를 확인하는 방법을 제공한다. 그 방법은 결합 분자의 다양한 집단을 고체 지지체에 선택적으로 고정화하는 것, 일 이상의 펩티드 리간드로 고체 지지체에 고정화된 다양한 집단을 접촉시키는 것 및 박테리오파지에 의해 발현된 것을 포함하는 일 이상의 펩티드 리간드에 선택적으로 결합된 일 이상의 결합 분자를 결정하는 것을 포함한다. 또한, 종양 항원 (결합 분자)에 대한 선택적인 친화도를 갖는 펩티드 리간드를 확인하는 방법이 제공된다. 그 방법은 고체 지지체에 종양 항원을 선택적으로 고정화하는 것, 일 이상의 펩티드 리간드와 고체 지지체 상에 고정된 종양 항원을 접촉하는 것(예를 들어, 동시에 접촉하는 것) 및 일 이상의 종양 항원에 선택적으로 결합되는 일 이상의 펩티드 리간드를 확인하는 것을 포함한다. 또한 종양 바이오마커에 선택적인 단리된 결합 펩티드("펩티드 리간드"), 특히 플렉틴-1에 대한 펩티드 리간드를 제공한다. 또한, 여기서 기술된 것은 관심있는 일 이상의 펩티드 리간드에 대해 선택적인 친화도를 갖는 결합 분자의 식별을 위한 빠르고 효과적인 방법이다. 그 방법은 관심있는 다수의 펩티드 리간드에 대해 다수의 결합 분자를 동시에 주사가 가능하다는 것에서 유리하다. 또한, 본 발명에서 사용되는 리간드 또는 결합 분자 중의 하나의 확인 또는 기능에 관하여 매우 적은 정보만이 요구된다. 예를 들어, 결합 분자의 다양한 집단은 소기의 결합 특이성을 보이는 다양한 분자를 빠르게 확인하기 위하여 펩티드 리간드의 다양한 집단에 대하여 동시에 주사될 수 있다. 여기에 기술된 그 방법은 따라서, 예컨대 인간 질환의 진단 및 치료를 위해 바이오 마커 및 펩티드 리간드와 같은 특이적인 시약의 발견을 위해 유리하게 적용될 수 있다.
본 발명에서 유용한 핵산은 비제한적인 예로써, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 예컨대 안티센스 DNA 및/또는 RNA; 리보자임; 유전자 치료용 DNA; 바이러스성 DNA 및/또는 RNA를 포함하는 바이러스성 단편; DNA 및/또는 RNA 키메라; mRNA; 플라스미드; 코스미드; 게놈의 DNA; cDNA; 유전자 단편; 단일-가닥 DNA, 이중-가닥 DNA, 초헬릭스 DNA 및/또는 삼중-나선 DNA를 포함하는 다양한 구조적 형태의 DNA; Z-DNA; 등을 포함한다. 핵산은 통상적으로 많은 양의 핵산을 제조하기 위해 사용된 임의의 전통적 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, DNA 및 RNA는 이 분야에서 잘 알려진 방법에 의한 합성기 및 상업적으로 이용가능한 시약을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gait, 1985, OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH (IRL Press, Oxford, England)] 참조). RNA는 체외에서 플라스미드 예컨대 SP65 (미국 위스콘신주의 메디슨에 소재한 프로메가 코포레이션(Promega Corporation)제품)를 사용한 전사를 통해 고 수율로 생산될 수 있다.
영상화 및 진단제
진단제는 예를 들어, 방사성핵종, 방사성 조영제, 상자성 이온, 금속, 형광성 표지, 화학발광성 표지, 초음파 조영제 및 광활성제로 구성된 군으로부터 선택된다. 이런 진단제는 잘 공지되어있고 임의의 이런 공지된 진단제가 사용될 수 있다. 진단제의 비제한적인 예시는 방사성핵종 예컨대 110In, 111In, 177Lu, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 94 mTc, 94Tc, 99 mTc, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154-158Gd, 32P, 11C, 13N, 15O, 186Re, 188Re, 51Mn, 52mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, 또는 다른 감마-, 베타-, 또는 양전자-방출자를 포함할 수 있다. 사용되는 상자성 이온은 크로뮴 (III), 망간 (II), 철 (III), 철 (II), 코발트 (II), 니켈 (II), 구리 (II), 네오디뮴 (III), 사마륨 (III), 이테르븀 (III), 가돌리늄 (III), 바나듐 (II), 테르븀 (III), 디스프로슘 (III), 홀뮴 (III) 또는 에르븀 (III)을 포함할 수 있다. 금속 조영제는 란타늄 (III), 금 (III), 납 (II) 또는 비스무트 (III)를 포함할 수 있다. 초음파 조영제는 리포솜, 예컨대 가스가 찬 리포솜을 포함할 수 있다. 방사성 비투과성 진단제는 화합물, 바륨 화합물, 갈륨 화합물 및 탈륨 화합물로부터 선택될 수 있다. 형광성 표지의 넓은 다양성은 비제한적으로 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 및 플루오레스크아민을 포함하여, 이 분야에서 공지되어 있다. 사용되는 화학발광성 표지는 루니놀, 이소루미놀, 방향성 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 또는 옥살레이트 에스테르를 포함할 수 있다.
이 제제를 검출 및 측정하는 기술은 이 분야에 제공되거나 본 명세서에서 설명된다.
항체 및 이들의 제조
본 발명의 단백질, 폴리펩티드, 또는 이들의 펩티드 단편에 관한 항체는 이 분야에서 잘 공지된 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 그 전문이 참고문헌으로 인용된 미국 특허 출원 제07/481,491호는 펩티드에 항체를 일으키는 방법을 개시한다. 항체의 생산을 위해, 비제한적으로 토끼, 마우스, 및 래트를 포함하여 다양한 숙주 동물에 폴리펩티드 또는 이들의 펩티드 단편을 주입하여 면역력을 갖게 할 수 있다. 면역 반응을 증가시키기 위해, 다양한 아쥬반트가 비제한적으로 프로인트(Freund's) (완전 및 불완전), 미네랄 젤 예컨대 알루미늄 히드록사이드, 표면 활성 물질 예컨대 라이소레시틴(lysolecithin), 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 아쥬반트 예컨대 BCG (바실 칼메테-구에린(bacille Calmette-Guerin)) 및 코리네박테리움 파르붐(corynebacterium parvum)을 포함하여 숙주 종류에 따라 사용될 수 있다.
단클론성 항체의 제조를 위해, 배양에서 계속적인 세포주로 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 기술이 활용될 수 있다. 예를 들어, 원래 콜러(Kohler) 및 밀스테인(Milstein)에 의해 발전한 하이브리도마 기술 (문헌 [1975, Nature 256:495-497]), 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (문헌 [Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72]), 및 EBV-하이브리도마 기술 (문헌 [Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96])이 인간 단클론성 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 단클론성 항체는 무균 동물에서 생산된다.
본 발명에 따라서, 인간 항체가 사용될 수 있고 인간 하이브리도마 (문헌 [Cote et al ., 1983, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 80:2026-2030])가 활용되거나 체외에서 EBV 바이러스와 함께 인간 B 세포를 형질전환하여 얻어질 수 있다 (문헌 [Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96]). 게다가, "키메라 항체"의 생산을 위해 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 SLLP 폴리펩티드의 에피토프에 특이적인 마우스 항체 분자로부터의 유전자 스플라이싱에 의해 개발된 기술 (문헌 [Morrison et al ., 1984, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 81:6851-6855; Neuberger et al ., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al ., 1985, Nature 314:452-454])이 사용될 수 있고; 이런 항체는 본 발명의 범위 안에 있다. 특이적인 단클론성 항체가 개발될 때, 전통적인 기술에 의한 이들의 돌연변이 및 변이체의 제조가 또한 가능하다.
한 실시양태에서, 단일-쇄 항체의 생산에 대해 설명한 기술 (본 명세서에서 그 전문이 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제4,946,788호)은 단백질-특이적 단일-쇄 항체를 생산하기 위해 구성된다. 또 다른 실시양태에서, Fab 발현 라이브러리의 구축에 대하여 설명한 기술 (문헌 [Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281])이 본 발명의 특이적 항원, 단백질, 유도체, 또는 유사체에 대해 바람직한 특이성을 보유하는 단클론성 Fab 단편의 빠르고 쉬운 식별을 허용하는데 활용된다.
항체 분자의 유전자형을 함유하는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 이런 단편은 비제한적으로 다음을 포함한다: 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생산될 수 있는 F(ab')2 단편; F(ab')2 단편의 이황화물 다리를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab' 단편; 파파인 및 환원제와 항체 분자를 처리하여 생산할 수 있는 Fab 단편; 및 Fv 단편.
다클론성 항체의 생성은 항원 및 항원과 특이적으로 결합한 분리 항체를 원하는 동물에 접종하여 수행된다.
단백질 또는 펩티드의 전체 길이 또는 펩티드 단편과 관계된 다클론성 항체는 예컨대 할로우(Harlow) 등 (문헌 [1988, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY]) 및 투스진스키(Tuszynski) 등 (문헌 [1988, Blood, 72:109-115])이 설명한, 임의의 잘 공지된 단클론성 항체 제조 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 원하는 펩티드의 양이 또한 화학 합성 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 그 대신에, 원하는 펩티드를 코딩한 DNA가 많은 양의 펩티드의 생성에 적합한 세포에서 적절한 프로모터 서열로부터 복제되고 발현될 수 있다. 펩티드와 관계된 단클론성 항체는 본 명세서의 참고문헌에 따른 표준 방법을 사용한 펩티드로 면역력을 갖게 된 마우스로부터 발생된다.
본 명세서에서 설명하는 방법을 사용하여 얻어진 단클론성 항체를 코딩한 핵산은 이 분야에서 이용할 수 있는, 예를 들어 라이트(Wright) 등 (문헌 [1992, Critical Rev. in Immunol. 12(3,4):125-168]) 및 본 명세서에 포함된 참고문헌에서 설명한 기술을 사용하여 복제될 수 있고 서열 순서를 밝힐 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 항체는 라이트 등, (앞에) 및 본 명세서에 포함된 참고문헌에, 및 구(Gu) 등 (문헌 [1997, Thrombosis and Hematocyst 77(4):755-759])이 설명하는 기술을 사용하여 "인간화"될 수 있다.
파지 항체 라이브러리를 생성하기 위해서, cDNA 라이브러리가 세포로부터 단리되어 mRNA, 예를 들어, 원하는 단백질, 예를 들어, 원하는 항체를 발현하여 파지 표면 상에 발현되는 하이브리도마로부터 처음 얻어질 수 있다. mRNA의 cDNA 복제는 역전사 효소를 사용하여 생산된다. 이뮤노글로불린 단편을 명시하는 cDNA는 PCR에 의해 얻어지고 얻어진 DNA는 적합한 박테리오파지 벡터로 복제되어 이뮤노글로불린 유전자를 명시하는 DNA를 포함하는 박테리오파지 DNA 라이브러리를 생성한다. 이종 DNA를 포함하는 박테리오파지 라이브러리를 만들기 위한 방법은 이 분야에 잘 공지되어 있고 예를 들어 삼브룩(Sambrook) 등 (문헌 [1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY])이 설명한다.
원하는 항체를 코딩하는 박테리오파지는 단백질이 상응하는 결합 단백질, 예를 들어, 항체와 관계된 항원과 결합에 이용가능한 이런 방법으로 이들의 표면상에 나타나도록 제작될 수 있다. 따라서, 특이적 항체가 발현하는 박테리오파지는 대응 항원을 발현하는 세포의 존재하에서 배양될 때, 박테리오파지는 세포와 결합할 것이다. 항체와 발현하지 않는 박테리오파지는 세포와 결합하지 않을 것이다. 이런 계획 기술은 이 분야에서 잘 공지되어있다.
예컨대 상기에서 설명한 방법이 M13 박테리오파지 표시를 사용하여 인간 항체의 생산을 위해 개발되었다 (문헌 [Burton et al., 1994, Adv. Immunol. 57:191-280]). 본질적으로, cDNA 라이브러리는 항체-생산 세포의 집단으로부터 얻어진 mRNA로부터 생성된다. mRNA는 재배열된 이뮤노글로불린 유전자를 코딩하고 따라서, cDNA가 이것을 코딩한다. 증폭된 cDNA는 그들의 표면상에 인간 Fab 단편을 발현하는 파지의 라이브러리를 생성하는 M13 발현 백터로 복제한다. 관심있는 항체를 나타내는 파지가 결합하는 항원에 의해 선택되고 용해가능한 Fab 이뮤노글로불린을 생산하기 위해 박테리아에서 번식된다. 따라서, 전통적인 단클론성 항체 합성과 대조적으로, 이 방법은 인간 이뮤노글로불린을 발현하는 세포보다 더 나은 인간 이뮤노글로불린을 코딩한 DNA를 남긴다.
단지 제시된 절차는 항체 분자의 Fab 부분을 코딩하는 파지의 세대를 서술한다. 하지만, 본 발명은 단지 Fab 항체를 코딩하는 파지의 세대에 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 단일 사슬 항체(scFv/파지 항체 라이브러리) 또한 본 발명에 포함된다. Fab 분자는 완전한 Ig 경쇄를 포함하고, 즉 이들은 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역 도메인(CH1)만을 포함한다. 단일 사슬 항체 분자는 Ig Fv 단편을 포함하는 단일 사슬의 단백질을 포함한다. Ig Fv 단편은 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역만을 포함하고, 그 안에 포함되는 불변 영역은 가지지 않는다. scFv DNA를 포함하는 파지 라이브러리는 문헌[막스(Marks) 등, 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597]에 서술된 절차에 따라서 발생될 수 있다. 원하는 항체의 분리를 위해 그렇게 발생된 파지의 패닝(Panning)은 Fab DNA를 포함하는 파지 라이브러리에 대해 서술된 것과 유사한 방식으로 수행된다.
본 발병은 또한 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 거의 모든 가능한 특이성을 포함하도록 합성되어질 수 있는 합성 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 것으로 해석되어야 한다(문헌[Barbas, 1995, Nature Medicine 1:837-839; de Kruif et al. 1995, J. Mol. Biol.248:97-105] 참조)
항체의 생산에서, 원하는 항체에 대한 스크리닝은 당해 분야에 공지된 기술, 예를 들어 ELISA(효소면역측정법)으로 달성될 수 있다. 본 발명에 따라 발생된 항체는 다클론성, 단일클론성, 융합(즉, "인간화"), 및 단일 사슬 (재조합) 항체, Fab 절편, 및 Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 절편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
앱타머(Aptamer)
본 발명은 또한 유용한 앱타머와 관련된다. 한 실시양태에서, 앱타머는 생체 외에서 우선적으로 또 다른 화합물(이러한 경우 동정된 단백질)에 결합시키기 위해 선택되는 화합물이다. 한 측면에서, 무작위 서열이 다수의 뉴클레오티드 또는 아미노산(자연적으로 발생한 또는 합성적으로 만들어진 것 모두)으로부터 쉽게 발생될 수 있기 때문에, 앱타머는 핵산 또는 펩티드이나, 물론 이들에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 측면에서, 핵산 앱타머는 단백질 표적을 결합시키는 짧은 가닥의 DNA이다. 한 측면에서, 앱타머는 올리고뉴클레오티드 앱타머이다. 올리고뉴클레오티드 앱타머는 관심의 특정 단백질 서열에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 앱타머 동정의 일반적인 방법은 부분적으로 디제너레이트(degenerate) 올리고뉴클레오티드로 시작하는 것이고 그리고는 동시에 목적한 단백질에 결합하는 능력에 대해 수천개의 올리고뉴클레티드를 스크리닝한다. 묶여져 있는 올리고뉴클리오티드는 단백질로부터 용출될 수 있고 특이적 인지 서열을 동정하기 위해 서열이 밝혀질 수 있다. 세포 내로 다량의 화학적으로 안정화된 앱타머의 전달은 관심의 폴리펩티드에 특이적 결합을 가져올 수 있고, 그로써 그것의 기능을 막는다[예를 들어, 세포 외 앱타머의 선택을 서술하는 하기의 출판물 클럭(Klug) 등, Mol. Biol. Reports 20:97-107 (1994); 왈리스(Wallis) 등, Chem. Biol. 2:543-552 (1995); 엘링턴(Ellington), Curr. Biol. 4:427-429 (1994); 라토(Lato) 등, Chem. Biol. 2:291-303 (1995); 콘라드 등, Mol. Div. 1:69-78 (1995); 및 업호프(Uphoff) 등, Curr. Opin. Struct. Biol. 6:281-287 (1996)을 참조].
앱타머는 높은 친화성 및 특이성을 가지고 유전자의 단백질 생산물에 결합하는 능력으로 인해 표적 유전자 기능을 인위적으로 방해하는 다른 올리고뉴클리오티드에 기초한 접근보다 장점을 제공한다. 그러나, RNA 앱타머는 뉴클레아제-저항성 앱타머조차도 세포 내 구획에 유효하게 들어가지 않기 때문에, 세포 내 단백질을 표적화하는 데에는 그것의 능력에 제한될 수 있다. 게다가, 벡터에 기초한 접근을 통해서 포유동물 세포 내로 RNA 앱타머를 발현시키고자 한 시도는 발현되는 RNA 앱타머에서의 그것의 기능적 구조를 바꿀 수 있는 추가적인 플랭킹(flanking) 서열의 존재에 의해 방해되었다.
단백질 분자를 표적화 하는데 단일-가닥의 핵산(DNA 및 RNA 앱타머)을 사용하는 생각은 이들이 높은 친화성 및 특이성을 가지고 표적화 단백질에 결합하는 것을 가능하게 하는 특유의 3D 구조로 접히는 짧은 서열(20 량체 내지는 80 량체)의 능력을 기초로 한 것이다. RNA 앱타머는 이스트 및 다세포 유기체와 같은 진핵 세포 내에서 성공적으로 발현되었고 세포 내 환경에서 이들의 표적화 단배질에 대하여 억제성 효과를 가지는 것을 보였다.
결합 분석법(biding assay)에서, 상호작용은 결합이고 형성된 복합체는 반응 혼합물에서 분리 또는 검출될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본원에 서술된 복합체의 펩티들 중의 하나 또는 시험 화합물 또는 약물 후보는 고체상 위에 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 위에 공유 또는 비공유 부착에 의해 고정된다. 비-공유 부탁은 고체 표면을 펩티드 용액으로 코팅하고 건조시켜 달성된다. 대안적으로, 고정되어야 하는 펩티드에 특이적인 고정된 항체 예를 들어, 단일클론성 항체가 펩티드를 고체 표면에 고정시키기 위해 사용될 수 있다. 이 분석법은 겸출가능한 표지로 레이블(label)될 수 있는 비-고정된 요소를 고정된 요소 예를 들어, 고정된 요소를 포함하는 코팅된 표면에 첨가하여 수행된다. 반응이 끝나면, 비-반응된 요소는 예를 들어, 세척에 의해 제거되고, 고체 표면에 고정된 복합체가 검출된다. 본래 비-고정 요소가 검출가능한 표지를 지닐 때, 표면에 고정된 표지의 검출은 복합체 형성이 일어났음을 지적한다. 본래 비-고정된 요소가 표지를 지니지 않는 경우, 복합체 형성은 예를 들어, 고정된 복합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 포함하는 제약상 및 치유적 조성물을 포함한다. 더욱 바람직하게, 이러한 화합물은 당해 분야의 통사의 기술자에게 공지된 표준 제약상 허용되는 담체, 충전제, 용해제 및 안정화제를 사용하여 제약 조성물로서 제형화 될 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 하나 이상의 다량체성 펩티리 리간드 또는 복합체를 포함하는 제약상 제조를 제공한다. 제약 조성물 내에 상기 폴리펩티드의 농도는 크게 예를 들어, 일반적으로 1 중량% 이상으로, 약 0.1 중량% 미만부터 20 중량% 이상 만큼 많은 정도까지 다양할 수 있다.
조성물은 활성 성분 외에 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 제약상 담체는 환자에게 펩티드 o를 전달하는데 적합한 임의의 양립성, 무독성 물질일 수 있다. 폴리펩티드 경우, 멸균 증류수, 알콜, 지방, 왁스 및 불활성 고체가 담체로써 사용될 수 있다. 제약상 허용되는 보조제, 완충제, 분산제 등은 또한 제약상 조성물 내에 포함될 수 있다.
폴리펩티드를 포함하는 제약상 조성물의 제조 방법은 미국 특허 제 5,789,543호 및 제 6,207,718호에 서술된다. 바람직한 제형은 투여 및 치료 용도의 의도되는 방식에 의존한다.
한 실시태양에서, 다량체성 펩티드를 포함하는 본 조성물은 주사로 투여된다. 폴리펩티드의 투여를 위한 비경구 경로는 공지된 방법에 따라 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 피하내, 또는 병변내 경로를 통한 주사 또는 주입이다. 단백질 또는 폴리펩티드는 주입 또는 일시 주사에 의해 연속적으로 투여될 수 있다. 정맥내 주입용인 전형적인 조성물은 임의적으로 20 %의 알부민 용액 및 10 ug 내지 50 mg, 바람직하게 50 ug 내지 10 mg의 폴리펩티드로 보충된 10 내지 50 ml의 멸균 0.9 % NaCl 또는 5 % 글루코오즈를 포함하도록 구성될 수 있다.
근육내 주사용 전형적인 제약상 조성물은 예를 들어, 1-10 ml의 멸균된 완충수(buffered water) 및 10 ug 내지 50 mg, 바람직하게 50 ug 내지 10 mg의 본 발명의 폴리펩티드를 포함하도록 구성될 것이다. 비경구적으로 투여가능한 조성물의 제조 방법은 당해 분야에 공지되었고 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, Pa., 1980)](모든 목적으로 전문으로써 본원에 참고문헌으로 인용됨)을 포함하는 다양한 자료에 더 상세하게 서술된다.
제약상 조성물 및 투여
본 발명은 또한 본 발명의 화합물을 대상에 투여하는 방법과 관련된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명 설명의 방법을 사용하여 동정된 화합물을 투여하여 암 진단의, Plec-1 검출의, Plec-1 발현 세포 국부화의, 또는 대상 치료의 방법을 제공한다. 본 화합물을 포함하는 제약상 조성물은 필요한 경우 국소, 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 척추 강내, 뇌실내, 경피내, 피하내, 복강내, 비강내, 장관내, 설하, 직장내 방법을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 이들의 임의의 수의 경로로 대상에 투여된다.
한 실시양태에 따르면, 이러한 치료가 필요한 대상의 치료 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 하나 이상의 화합물을 포함하는 제약상 조성물을 이들이 필요한 대상에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 동정된 화합물은 공지된 화합물 또는 다른 약물과도 함께 투여될 수 있다.
본 발명을 실시하기에 유용한 제약상 조성물은 1 ng/kg/일 내지 100 mg/kg/일의 용량을 전달하기 위해 투여될 수 있다.
본 발명은 활성성분으로써 본원에 개시된 질병의 치료에 유용한 화합물을 포함하는 제약상 조성물의 제조 및 용도를 포함한다. 이러한 제약상 조성물은 대상에 투여하기에 적합한 형태로 활성 성분 단독으로 구성될 수 있거나 제약상 조성물은 활성 성분 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 하나 이상의 추가적인 성분 또는 이들의 일부 조합을 포함할 수 있다. 활성 성분은 제약상 조성물 내에 당해 분야에 공지된 것처럼, 생리학적으로 허용되는 양이온 또는 음이온과의 조합물과 같은, 생리학적으로 허용되는 에스테르 또는 염의 형태로 존재할 수 있다.
본원에 사용되는 것처럼, 용어 "생리학적으로 허용되는" 에스테르 또는 염은 조성물이 투여되는 대상체에 유해하지 않는 제약상 조성물의 임의의 다른 성분과 양립가능한 활성 성분의 에스테르 또는 염 형태를 의미한다.
본원에 기재된 제약 조성물의 제제는 약리학 당업계에 공지되어 있거나 또는 이후 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 담체 또는 1종 이상의 다른 부성분과 함께 합치는 단계 및 이에 이서, 필요하거나 바람직한 경우, 생성물을 바람직한 단일- 또는 다중-용량 단위로 성형하거나 또는 패키징하는 단계를 포함한다.
당업자는 이러한 제약 조성물이 일반적으로 모든 종류의 동물에게 투여되기에 적합하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 제약 조성물의 투여가 고려되는 대상체에는 인간 및 다른 영장류, 통상적으로 관련된 포유동물, 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 고양이 및 개를 비롯한 포유동물, 통상적으로 관련된 조류, 예컨대 닭, 오리, 거위 및 칠면조를 비롯한 조류가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명은 또한 뉴슨스(nuisance) 동물, 예컨대 설치류를 피임시키기 위한 용도로도 고려된다.
본 발명의 제약 조성물은 하나의 단일 단위 용량으로서 또는 다수의 단일 단위 용량으로서 제조되거나, 패키징되거나 또는 산적으로(in bulk) 판매될 수 있다. 본원에 사용된 "단위 용량"은 소정량의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물의 분리된 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량 또는 그러한 투여량의 용이한 분율, 예컨대 예를 들어, 그러한 투여량의 1/2 또는 1/3에 동등하다.
본 발명의 제약 조성물 내 활성 성분, 제약상 허용되는 담체 및 임의의 추가적 성분의 상대적인 양은 치료될 대상체의 신원, 크기 및 상태에 따라 그리고 또한 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 조성물은 0.1% 내지 100% (w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
활성 성분 외에, 본 발명의 제약 조성물은 1종 이상의 추가적 제약 활성 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 특히 고려되는 추가적 작용제에는 항구토제 및 스캐빈저, 예컨대 시아니드 및 시아네이트 스캐빈저가 포함된다.
본 발명의 제약 조성물의 제어-방출형 또는 지속-방출형 제제는 종래 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
본원에 사용된 "추가적 성분"에는 부형제; 표면 활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 향미제; 착색제; 보존제; 생리학적으로 분해가능한 조성물, 예컨대 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁화제; 분산제 또는 습윤제; 에멀젼화제, 완화제(demulcent); 완충제; 염; 증점제; 충전재; 에멀젼화제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 안정화제; 및 제약상 허용되는 중합성 또는 소수성 물질 중 하나 이상이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 제약 조성물에 포함될 수 있는 다른 "추가적 성분"은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 본원에 참고로 포함된 문헌 [Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA]에 기재되어 있다.
전형적으로, 동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있는 본 발명의 화합물의 투여량은 동물 체중 1 킬로그램 당 1 ㎍ 내지 약 100 g 양의 범위이다. 한편, 투여되는 정밀한 투여량은, 이들로 제한되지는 않지만, 동물의 유형 및 치료할 질환 상태의 유형, 동물의 연령 및 투여 경로를 비롯한 많은 인자에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 화합물의 투여량은 동물 체중 1 킬로그램 당 약 1 mg 내지 약 10 g으로 달라질 것이다. 보다 바람직하게는, 투여량은 동물 체중 1 킬로그램 당 약 10 mg 내지 약 1 g으로 달라질 것이다.
상기 화합물은 1일에 여러 횟수만큼 빈번하게 동물에게 투여될 수 있거나, 또는 이는 덜 빈번하게, 예컨대 1일에 1회, 1주에 1회, 2주마다 1회, 1달에 1회, 또는 더욱 덜 빈번하게, 예컨대 수개월에 1회 또는 심지어 1년에 1회 또는 그보다 적게 투여될 수 있다. 투여 빈도는 당업자에게 기꺼이 명백할 것이며, 이는 많은 인자, 예컨대 이들로 제한되지는 않지만, 진단될 암의 유형, 치료할 병태 또는 질환의 유형 및 중증도, 동물의 유형 및 연령 등에 따라 달라질 것이다.
적합한 제제에는 액체 용액 또는 현탁액으로서의 주사제가 포함되지만, 주사 전 용액 내, 현탁액 내, 액체에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 상기 제제는 또한 에멀젼화될 수 있거나, 또는 폴리펩티드는 리포좀 내에 캡슐화될 수 있다. 활성 성분은 종종, 제약상 허용되며 활성 성분과 상용성인 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제는, 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 그의 조합이다. 또한, 바람직하게는, 백신 제제는 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 에멀젼화제, pH 완충제 및/또는 아쥬반트도 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 조성물 및 상기 조성물을 대상체의 세포 또는 조직에 외막(adventitially) 투여하는 것을 기재하는 지침 자료를 포함하는 키트를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 키트는 상기 화합물을 대상체에 투여하기 전에 본 발명의 조성물을 용해시키거나 또는 현탁시키기에 적합한 (바람직하게는 멸균) 용매를 포함한다.
본원에 사용된 "지침 자료"는 간행물, 기록물, 다이어그램, 또는 키트 내 본 발명의 펩티드의 유용성을 본원에 인용된 다양한 질환 또는 장애의 완화에 대한 영향과 연결시키는 데 사용될 수 있는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 임의로 또는 다르게는, 지침 자료는 진단용 또는 확인용으로 상기 조성물을 사용하거나 또는 포유동물의 세포 또는 조직에서 질환 또는 장애를 완화시키는 하나 이상의 방법을 기재할 수 있다. 본 발명의 키트의 지침 자료는, 예를 들어 본 발명의 다량체성 펩티드를 함유하는 컨테이너에 부착되거나 또는 상기 펩티드를 함유하는 컨테이너와 함께 출하(shipping)될 수 있다. 다르게는, 상기 지침 자료는, 상기 지침 자료 및 상기 화합물이 수령자에 의해 협동적으로 사용되게 하기 위한 의도로, 컨테이너로부터 별개로 출하될 수 있다.
당업계에 공지되어 있는 다른 기술이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
본 발명은 이제 하기 실시예 및 실시양태에 대한 언급과 함께 기재된다. 추가의 기재 없이, 당업자가 선행 기재 및 하기의 예시적 실시예를 사용하여, 본 발명을 제조 및 이용하고 청구된 방법을 실시할 수 있음을 믿는다. 따라서, 하기의 실시예는 예시의 목적으로만 제공되며, 특히 본 발명의 바람직한 실시양태를 지적하고, 어떠한 방식으로도 본 개시내용의 남은 부분을 제한하는 것으로서 간주되어서는 안된다. 따라서, 본 실시예는 본원에 제공된 교시에 따라 명백해지는 임의의 그리고 모든 변형을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
실시예
하기 기재된 실험은 플렉틴-1 (PLEC-1)이 암, 특히 전이 전의, 침윤성 및 전이성 PDAC의 바이오마커인지를 결정하고, 플렉틴-1을 검출하기 위한 더 우수한 리간드 복합체을 개발하기 위해 고안되었다. 또한, 이 실험은 악성 췌장병으로부터 양성, 가장 중요하게는 만성 췌장염을 구별하는지의 여부, 및 그것의 과발현이 PDAC의 비침윤성 영상화에 이용될 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 시도되었다. 게다가, 본원에서는 Plec1이 또한 췌장암에 걸리지 않은 다른 인간의 암에서도 바이오마커인지에 대해 평가하였다.
방법:
조직 샘플
모든 조직 및 생물학적 샘플을 임상시험심사위원회(Institutional Review Board)의 승인 및 요구에 따라 수집하였다.
파라핀 포매 조직 샘플을 병원 보관소로부터 수득하였다. 평가시에 모든 시편의 진단을 확립하였다. 총 4개의 정상 췌장, 15개의 만성 췌장염, 14개의 PanIN I, 26개의 PanIN II, 15개의 PanIN III 및 31개의 PDAC, 8개의 간 전이, 1 림프절 전이 및 1개의 복막 전이를 수득하였다. 췌장외 인간 암에서의 Plec1 발현의 평가를 위해, 시판되는 종양 조직 마이크로어레이 (MTU951, US 바이오맥스(US Biomax), 메릴랜드주 록빌)를 이용하였다.
마우스
모든 동물 절차는 승인되었다. 무흉선 암컷 마우스 (nu/nu)를 내부 번식 시설로부터 수득하였다. 마우스를 무균 환경에서 유지시키고, 임의로 음식 및 물에 접근하도록 하였다.
웨스턴 블롯 분석
스냅 냉동 외과 시편으로서 수득된 50 mg의 췌장 조직을 프로테아제 억제인자 칵테일 (0.001 mg/ml의 아프로티닌(Aprotinin), 베스타틴(Bestatin), 펩스타틴(Pepstatin), 로이펩틴(Leupeptin) 및 0.005 mg/ml의 PMSF 20 mM, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 세인트루이스)과 함께 RIPA-완충액 (50 mM 트리즈마(Trizma) 염기, pH 7.4, 1% 트리톤(Triton) X-100, 0,25% 데옥시콜린산나트륨, 100 mM EDTA, 150 mM NaCl)에서 균질화시켰다.
용해물을 원심분리법에 의해 분리하고, 매우 정확한 분석법 (2-D 퀀트 키트(Quant Kit), 아머샴 바이오사이언씨즈(Amersham Biosciences), 뉴저지주)을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. SDS-PAGE를 통해 래인(lane) 당 20 ㎍의 단백질을 분리하였고, 니트로셀룰로스 막 상으로 이동시켰다. 인간 Plec1 (아브캄 (Abcam), 메사추세츠 주 캠브릿지)에 대한 토기 모노클로날 항체를 사용하여 항원 검출을 수행하였다. 2차 항체는 HRP-커플링된 염소 항-토끼 폴리클로날 항체 (시그마 알드리치, 미국 세인트 루이스)이었다. 밴드가 ECL에 의해 가시화되었다 (대조군: 토끼 뇌 용해물, 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 캘리포니아주 라홀라).
면역염색법
파라핀 포매 조직 부분에서 파란핀을 제거하고, TBS로 수화시키고, H2O2로 차단하였다. 리트리에비트(Retrievit) (바이오제넥스(BioGenex), 캘리포니아주 산라몬) 중 끓는 조직에 의해 항원 검색을 달성하였다. 아비딘/비오틴 (벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories), 캘리포니아주 벌링게임) 및 TBS 중 5%의 염소 혈청으로의 차단 후, 슬라이드를 1:250의 Plec1 항체 (아브캄)로 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 절편을 TBST에서 3회 세척한 후, 바이오티닐화 항-토끼 염소 2차 항체 (벡터 래보러토리즈, 캘리포니아주 벌링게임)로 인큐베이션하고, 이어서 DAB (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼즈배드)를 사용하여 전개시키고, 헤마톡시린으로 대비염색시켰다. Y-FL 현미경 (니콘(Nikon), 일본)을 이용하여 슬라이드를 평가하였다. 이미지를 DP-25 카메라 및 구입한 소프트웨어 (올림푸스(Olympus), 일본)로 획득하였다.
조직학적 평가
신경에 주목하여 Plec1에 대한 보통 염색 강도를 갖도록 하였고, 이것은 모든 슬라이드에 존재하였다. 따라서, 각 슬라이드 내의 신경에서의 Plec1의 발현을 염색 강도에 대한 염색 대조군 및 기준으로서 이용하였다. 염색 강도를 2 명의 독립적인 관찰자에 의해 기록하였고, 일치하지 않는 결과의 경우에는 제3자의 관찰자에 의해 평가하였다. 비정상적인 상피 세포의 염색을 신경에서 나타나는 보통의 염색에 대해 음성, 약함, 보통 또는 강함으로 분류하였다.
시험관내 경쟁 분석
사량체성 플렉틴-1 표적화 펩티드 (tPTP) 복합체, (βAKTLLPTP-GGS(PEG5000))4 KKKKDOTAβA-NH2, (또한, 본원에서 [(βAla-Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro-Gly-Gly-Ser-PEG5K)2-Lys]2-Lys-Lys(DOTA)-βAla-NH2로서 지칭됨)를 GMP 등급 장비 (CS 바이오 컴퍼니(CS Bio Company), 캘리포니아주 먼로 파크)에서 플렉틴-1 표적화 펩티드 KTLLPTP (서열 1) (문헌 [Kelly et al., 2008, PLoS Medicine, 5:4:e85:0657-0668])를 기준으로 하여 합성하였다.
tPTP 분지형 PEG 펩티드 복합체의 제조에 대한 요약:
펩티드 서열 ( 실시예 )-
[(βAla-Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro-Gly-Gly-
Ser-PEG5K)2-Lys]2-Lys-Lys(DOTA)-βAla-NH2
분자량: 25648
PEG5K: Fmoc-PEG5000-NHS 에스테르로부터의 것임 (젠켐 테크(JenKem Tech))
물질-
1) 수지:
Fmoc-링크-아미드 수지 (Sub: 0.34 mmol/g);
2) AA를 보호하기 위한 특별한 슬라이드-쇄를 하기와 같이 사용하였음:
Lys-15: Lys(Mmt), Lys-14, 13: Fmoc-Lys(Fmoc);
3) 커플링제: Rx/AA/DIC/HOBt (1/3/3/3);
4) 절단 시약: TFA/TIS/H2O;
5) 정제: ACN/H2O/TFA
합성-
1) 링크 아미드 수지에 β-Ala를 부착하고, Rx 상의 β-Ala의 Fmoc 제거 후, Fmoc-Lys(Mmt)를 부착하였다.
2) Fmoc 기와 함께, Mmt를 제거하고, Tri-tBu-DOTA와 Lys-15 측쇄를 커플링시켰다. 커플링: Rx/DOTA/DIC/HOBt (1/2/2/2), 단일 커플링.
3) Fmoc 제거 후, Fmoc-Lys(Fmoc)를 Rx 상의 연장된 펩티드에 부착시켰다.
Lys-14 상의 Fmoc의 제거를 실행하였다 (2개의 유리 NH2- 기를 남김, 주 쇄 상의 하나, 및 주 쇄 상의 다른 하나).
4) 2 배 양의 커플링제를 사용하여, Rx 상의 2 개의 NH2- 기에 Fmoc-Lys(Fmoc)를 부착하였다. Fmoc 제거 후, Rx 상의 2개의 NH2- 기가 다음 커플링에 이용가능하였다.
5) 이어서, Fmoc-PEG5000-NHS를 촉진제로서의 DIPEA를 사용하여 4 개의 NH2- 기에 부착하였다 (Rx/PEG 1/8). 음성 카이저(Kaiser) 시험 이후, PEG의 Fmoc를 제거하고, β-Ala-1까지 4개의 분지형 N-말단으로 차례대로 AA 커플링을 연속하였다.
6) 최종 Fmoc의 제거 후, Rx를 절단되도록 하였다.
절단 -
시약: 95% TFA, 2.5% H2O, 2.5% TIS. 실온에서 240분간 교반하였다.
진공을 이용하여 반응물로부터 용매를 제거하고 물/ACN의 첨가후 혼합물을 동결 건조하였다.
정제-
조 펩티드 (시럽으로서)를 물로 희석한 후 HPLC 컬럼 (4.1x25 cmxcm)에 충전하고 20 내지 60% 완충액 B의 구배로 60분 동안 정제하였다. 유속, TFA 완충계 중 25 mL/분. 0.1 mmol 합성은 200 mg의 최종 생성물을 수득하였다. (최적화되지 않음)
DOTA (1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산)은 하기 구조를 갖는다.
Figure pct00005
대조군으로서, 비-결합 사량체 (ncPTP-4(βAKHVMSKQGGS (PEG5000))KKKDOTAβA-NH2)도 합성하였다. 대조 펩티드의 서열은 KHVMSKQ (서열 5) 및 2개의 글리신과 세린이 가해진 서열 5를 포함하여, KHVMSKQGGS (서열 6)을 생기게 한다. 서열 5 또는 서열 6에 가해진 베타 알라닌 (βA)은 βAKHVMSKQ (서열 7) 및 βAKHVMSKQGGS (서열 8)을 각각 생기게 한다.
tPTP를 GMP 시설에서 사량체로서 화학적으로 합성하여 다원자가성을 증진시키고, 4개의 5000 Da PEG 쇄 (4개의 펩티드 중 각 펩티드 하나)를 가하여 제제의 순환 시간을 높여, 면역원성을 감소시키고, 의도된 표적화에 도달하기 전에 생체내에서 절단됨으로부터 펩티드를 보호하였다.
영상화제의 첨가
인듐 표지를 위해, 펩티드 (100 μg, nmoles)를 20 μL PBS에 용해시키고, 이어서 100 μL 암모늄 아세테이트 완충액 (0.1M, pH 4.5)으로 희석하였다. 염화인듐 (물 중 5mCi)(카디날 헬쓰(Cardinal Health), 버지니아주)를 펩티드와 혼합하고, 15분 동안 40 ℃로 혼합하여 평형 유지시켰다. 반응 혼합물을 DPBS로 예비-평형된 PD10 탈염 컬럼을 이용하여 크기 배제로 정제하였다. 시험관내 펩티드 확인 실험을 위해, 10-3 내지 10-9 범위의 농도의 tPTP 또는 ncPTP 및 5 μCi tPTP-In111에 의해 세포를 1시간 동안 실온에서 3회 인큐베이션하였다. 1시간 후, 세포를 세정하고 5분 동안 100 μL 1M NaOH로 용해 분리하였다. 이후 혼합물을 튜브로 옮기고 감마 계수기로 카운트를 분석하였다.
영상화
L3.6pl 췌장암 종양 세포가 정소적으로 주사된 마우스 (n=4)를 111In 표지된 tPTP의 1 mCi로 주사한 후, UVa에서 설계 및 개발된 마이크로SPECT/CT 스캐너로 주사한 지 4시간 후에 영상화하였다. 마취액 (산소 중 1% 내지 2% 이소플루란)을 영상화 내내 전달하였다. CT 포착은 약 5분에 걸쳐 200도 스패닝한 200개의 고르게 간격을 둔 영상을 사용하였다. 핀홀 SPECT 스캐닝 60개의 고르게 간격을 둔 영상에 대해 마우스를 축방향으로 재배치하고, 2개의 감마 카메라를 동시에 사용하여 180도를 넘는 사진을 얻었다. 포착 시간은 약 30분이었다. 2개의 카메라를 1 mm 직경 텅스텐 핀홀로 고정하였다. 재건된 CT 3D 화소 크기는 512×512×640 화상 매트릭스에 대하여 0.082×0.082×0.082 mm이었다. 재건된 SPECT 3D 화소 크기는 60×60×60 화상 매트릭스에 대하여 0.65×0.65×0.65 mm이었다. 모든 SPECT 화상을 감마선 감쇠가 아닌 방사능 부식에 대하여 보정하였다.
생분산도 및 혈액 반감기
SPECT/CT를 통해 마우스를 영상화한 후, 동물을 희생시키고, 그의 장기를 거둬들이고 예비-칭량된 에펜도르프 (Eppendorf) 튜브에 두었다. 이후 각각의 튜브를 재칭량하여 장기의 무게 및 방사량을 측정하였다.
프로브의 플라즈마 수명을 측정하기 위해서, tPTP-Peg-111In로 주사된 마우스를 주사후 0, 15, 30, 45, 60 및 120분에 채혈하고, 방사성을 우물형 계수기로 측정하였다.
조직학
췌장 및 복막 전이로부터의 PDAC 표본을 4% PFA로 고정시키고 OCT에서 동결시켰다. 이후 조직 샘플을 슬라이스하고 H&E을 통해 착색시켰다.
Panc 27 펩티드 ( KTLLPTP (서열 1))의 알라닌 돌연변이
서열 1의 각각의 아미노산 잔기의 알라닌 치환 효과를 측정하였다. 이 연구에 사용된 펩티드는 각각 서열 KTLLPTP (서열 1)로부터 유도된 파지, 및 각각의 잔기가 알라닌에 대해 연속적으로 돌연변이가된 알라닌 돌연변이 ATLLPTP, KALLPTP, KTALPTP, KTLAPTP, KTLLATP, KTLLPAP 및 KTLLPTA, 서열 9 내지 15로 이루어진다. 각 펩티드의 2 mg를 200 μL PBS에 용해시키고, 1 mg FITC과 혼합하고, 밤새 반응시켰다. 아세토니트릴/물 혼합물을 이용하여 C18 역상 수지의 플래시 크로마토그래피에 의해 펩티드를 정제하고, 분광기로 정량화하였다.
L3.6 세포를 24 웰 플레이트 상에 플레이팅하고, 약 90 내지 95 % 융합한 때 사용하였다. 펩티드를 30μM로 희석한 후, 가장 낮은 농도를 약 14 nM (8 농도)으로 하여, 3으로 희석하여 농도 시리즈를 제조하였다. 이들은 L3.6 세포 (200 μL/웰, 3회) 상에 두고, 2시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션시켰다. 이들을 PBS + 1% 트윈-20으로 3회 세척하고, 200 μL의 용해 분리 완충액(50 mL PBS, 0.5 mL 트리톤 X-100, 15 mg ANSA (아미노 나프탈레노 술포닉산)으로 용해 분리하고, 20 uL의 항-FITC 항체를 HRP로 표지하였다. 남아있는 펩티드의 양을 측정하기 위해, 표준 곡선의 펩티드 희석으로, FITC-BSA로 표지된 면역학적 검정 플레이트에서 용해물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 중 0.1% BSA 및 0.1% 트윈-20의 용액으로 플레이트를 4 내지 5회 세척하고, 테트라메틸벤지딘으로 전개하였다.
이러한 연구로부터 얻은 흡광도 대 농도 곡선을 그래패드 프리즘(Graphpad prism)을 사용하여 S자형 용량-반응(가변 기울기) 곡선으로서 분석하여 펩티드의 겉보기 친화도를 산출하였다. 전체적인 절차를 1회 이상 반복하여 각 돌연변이의 친화도를 확인하고, 예상했던 S자형 용량-반응 곡선에 맞지 않았던 실험들에 대해서는 재실행하였다.
결과
Plec1은 PDAC 에서 발현되며, 만성 췌장염 및 정상 췌장에서는 발현되지 않음
Plec1 발현은 양성 췌장 질환으로부터 악성을 명백하게 구별한다(도 1). Plec1에 대하여 100%의 PDAC (31/31)가 염색되었으며; 77% (24/31)는 강하게 염색되었고, 23% (7/31)는 적당히 염색되었다. PDAC와는 대조적으로, Plec1은 정상 췌장 (4/4)과 만성 췌장염의 대다수 (10/15) 모두에서 확인되지 않았다. 나머지 만성 췌장염 (5/15)은 관상피에서 Plec1에 대하여 약하게 염색되었다(도 1b). 췌장 조직 용해물의 웨스턴 블럿팅은 IHC 결과를 확인해주었다. Plec1은 정상 췌장 (2/2) 및 만성 췌장염 (3/3)에서 검출되지 않았는데 비하여, 각 PDAC (3/3; 도 1d)에서는 존재하였다.
췌장 발암 동안의 Plec1 발현 및 세포 국부화의 변화
Plec1 발현 강도는 췌장 발암동안 증가한다(도 1). 저등급 상피내병변이 PanIN I에서 III으로 진행됨에 따라, Plec1에 대한 그들의 염색 강도가 증가하고, 저등급 상피내병변의 증가 비율은 Plec1 양성이 된다. 초기 단계 PDAC 전구체 저등급 상피내병변, PanIN I은 주로 Plec1-음성 (11/14)이다. 대조적으로, 절반 초과의 PanIN II 저등급 상피내병변은 Plec1을 약하게 발현하거나 (13/26) 또는 적당하게 발현한 반면 (1/26), 87%의 PanIN III 저등급 상피내병변은 Plec1-양성이었다 (13/15; 도 1a, b). 특히, Plec1의 세포 국부화 또한 발암 동안에 변화한다. Plec1이 초기 PanIN 저등급 상피내병변에서 확인되는 경우 이의 국부화는 세포막으로 제한되는 반면, 악성 저등급 상피내병변에서의 Plec1 발현은 세포질 및 막의 국부화를 갖는다. Plec1은, 27% (4/15)의 예비-침윤성 악성 PanIN III 및 100% (31/31)의 침윤성 PDAC 저등급 상피내병변에서 세포질 및 막으로 국부화된다(도 1c).
PDAC 전이에서 Plec1 발현이 유지됨
PDAC는 보통 Plec1이 발현되지 않는 복막, 림프절 및 간으로 빠르게 전이되는 경향이 있다. 분석된 모든 전이소는, 이러한 조직에서 전이성 침전을 분명하게 확인해주고 강조해주는 그들의 Plec1 발현 (8/8 간, 1/1 림프절 및 1/1 복막 전이)을 유지하였다(도 1a).
Plec1은 비췌장 인간 암에서 과발현됨
인간 종양 조직 마이크로어레이의 IHC는 Plec1의 유용성이 췌장암으로만 제한되는 것이 아닐 수 있다는 것을 나타내었다. 식도, 위 및 폐 표본에서 Plec1은 또한 상이한 발현 양상을 가졌으며, 이는 잠재적으로 악성 조직으로부터 양성을 구별하는데에 사용될 수 있다(도 2).
Plec1 표적 프로브는 PDAC 의 비침윤성 영상화에 대하여 사용될 수 있음
Plec1이 인간 PDAC의 생체내 검출을 가능하게 하는 영상화 바이오마커로서 기능할 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여, 파지 디스플레이 스크린으로부터 유도된 Plec1-표적화 펩티드를 채용하여, 단일광자 단층촬영(SPECT)용 임상 관련 영상화제로서 기능하는 사량체성 합성 펩티드(tPTP) 복합체를 합성하였다(도 8 참조). tPTP의 특이성의 시험관내 확인을 표지된 tPTP 및 비표지된 tPTP 또는 음성 제어 PTP(ncPTP)로 경쟁 분석에 의해 수행하였다. Ki(억제 분해 상수)는 tPTP에 대하여 8.3 x 10-7 M이고, ncPTP에 대하여 2.86 x 10-6 M이었다(도 3a). 췌장암 세포를 정위(orthotopic) 주입한 동물에 tPTP를 투여하였고 4시간 후에 SPECT/CT를 통해 영상화하였다. 영상화는, 췌장에서의 종양뿐만 아니라 동물의 복막에 존재하는 전이도 분명히 보여주었다(도 3b 및 도 4). 영상화 후에 수행한 생체내 분포(biodistribution) 연구는, 췌장 종양이 조직의 3% 주입량/그램(id/g)을 가지는 반면, 비장, 간 및 심장은 1% id/g 미만을 갖는다는 것을 증명하였다(도 3c). 프로브는 또한 신장에 축적되었고; 이 펩티드 제거의 주된 경로는 신장(도 3c) 및 뇨를 통해서였다. 구획된 췌장 및 복막의 H&E 염색은 췌장 중 종양의 존재와 복막 중 전이를 증명하였다(도 3d). 이러한 자료는 tPTP가 플렉틴-1에 대하여 고도의 특이적 영상화 도구로서 기능하는 것을 나타낸다.
tPTP 의 PDAC 표적화 및 생체내 비침윤성 영상화 가능화
정위 주입한 L3.6 세포로부터의 종양을 가지고 있는 가슴샘 없는(athymic nude) 마우스에 111IN-tPTP를 주입하였고, 주입 4시간 후에 SPECT/CT로 영상화하였다. SPECT/CT 영상화는 tPTP가 PDAC에 축적되었다는 것을 증명하며, 이는 췌장 및 복막 전이 중 종양의 생체내 영상화를 가능하게 한다. 도 4를 참조하라.
도 5는 사량체성 플렉틴-1 표적화 펩티드의 도식도이다. 도 7은 다른 사량체성 플렉틴-1 사량체성 펩티드이다.
tPTP 의 생체내 특성화
도 6은 정위적으로 위치시킨 L3.6 세포로부터의 종양을 가지고 있는 가슴샘 없는 마우스에 주입된 111IN-tPTP의 혈중 반감기 결과를 증명한다(도 6a 참조). 혈액은 주입 후 0, 15, 30, 45, 60 및 120분에서 취하였다. tPTP의 혈중 반감기는 4.29분이었다. SPECT/CT 영상화(도 4 참조) 후, 동물 (n=5)을 희생시키고, 장기를 채취하고, 감마 카운트를 평가하였다. 췌장은 3% 주입량/그램을 나타낸 반면 복막강 중에 발견되는 전이는 1.5% 주입량/그램을 나타내었고, 최대치는 신장에서 나타났다(도 6b 참조). 111IN-tPTP의 배출 제 1경로는 뇨를 통해서였다.
단량체성 펩티드에 비례하는 사량체성 펩티드의 평균 수명 및 결합
사량체성 플렉틴-1 표적화된 펩티드 4(βAKTLLPTP-GGS(PEG5000))-KKKKDOTAβA-NH2(도 8의 화학구조 참조)가 전술한 단량체성 펩티보다 증가된 감도를 갖는다는 것이 발견되었다(즉, 단량체성 펩티드 160 nmol 친화도에 비해 tPTP 친화도 600 pmol). 또한, β-알라닌 및 PEG의 첨가로 인해, 사량체성 펩티드가 단량체성 펩티드보다 더 양호한 평균 수명 및 생체내 분포를 갖는데, 이는 PET가 독성을 감소시키고 β-알라닌이 분해를 감소시키기 때문이다. 더욱이, 공지의 단량체성 펩티드에 대한 가시화 전에는 더 많은 시간(즉, 48 시간)이 걸리는데 비해 표지된 사량체성 펩티드 복합체는 신속하게 가시화될 수 있다(즉, 1-4시간).
KTLLPTP 의 아미노산 치환(서열 1): 알라닌 돌연변이
본 연구에서 사용된 펩티드는, 판크(Panc) 27 펩티드로도 불리는 유도된 서열 KTLLPTP(서열 1)로 이루어져 있다. 7개의 위치 각각은 개별적으로 알라닌으로 돌연변이되었다. 알라닌 돌연변이 ATLLPTP, KALLPTP, KTALPTP, KTLAPTP, KTLLATP, KTLLPAP 및 KTLLPTA, 서열 9-15 각각이 제조되었으며 친화도를 시험하였다. 결과를 도 9에 나타내었다. 자료는 트레오닌의 중요성을 시사하는데, 이는 트레오닌을 알라닌으로 치환하는 것이 친화도를 감소시키지만, 본 발명의 서열 중 임의의 다른 위치에 하나 이상의 트레오닌을 추가하는 것이 치환에 유용할 수 있다는 가능성을 배제하지 않기 때문이다. 동일한 사항이 프롤린에도 적용되지만 자료에 제시된 바와 같지는 않고, 범위가 더 좁다. 그러나, 치환 분석에 대한 주된 기준은 얻어진 치환이 친화도에 상당한 영향을 미치는 지의 여부이다.
결론
현재, 조기의 또는 심지어 침윤전 PDAC의 검출을 보조하는데 이용될 수 있는 바이오마커가 없다. 이용가능한 어떠한 바이오마커도 양성 췌장 질환, 가장 특히 만성 췌장염으로부터 PDAC를 확실하게 구별하지 않는다. 본원에서, 본 발명자들은, 만성 췌장염에서의 정상적인 선관 상피 및 선관 상피 세포가 단백질을 발현하지 않는 한편, 조기의 침윤전, 1차 및 전이성 인간 PDAC에서 특이적으로 발현되는 제1의 신규한 바이오마커로서 Plec1을 확인하였다. 게다가, 본 발명자들은, Plec1의 발현이 전이를 비롯하여 식도, 위 및 폐에서의 암을 검출하는데 활용될 수 있다는 것을 확인하였다. 이러한 연구 결과 이외에, 본 발명자들은 생체내 전임상 모델에서, Plec1 표적화 영상화제가 PDAC의 비침윤성 영상화에 대해 사용될 수 있다는 것을 입증할 수 있었다. 이는 Plec1 표적화 영상화를 통상적인 임상적 진단과 PDAC에 대한 스크리닝 측정에 혼합하는 것을 잠재적으로 가능하게 한다.
Plec1 그자체는 플래킨족(Plakin family)의 전형적인 사이토링커 단백질이다. 플래킨은 중간 필라멘트를 데스모좀(desmosome)과 헤미데스모좀(hemidesmosome)에 연결하고, 세포를 기계적으로 안정시키고, 세포골격 동력을 조절하고, 신호 분자를 위해 스캐폴딩 플랫폼으로서 작용한다. 게다가, 플래킨은 피부와 골격근의 완전성에 대해 필수적인 것이다 [18]. 결국, Plec1 유전자 돌연변이는 피부 질환, 예컨대 수포성 표피박리증(epidermolysis bullosa)에서 처음으로 밝혀졌다 [19, 20]. 최근에, Plec1은 유방암 감수성 유전자 2 (BRCA2)와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다 [21]. BRCA2 돌연변이는 췌장암의 증가된 위험성과 연관된다 [22, 23]. BRCA2 그 자체는 DNA 손상 복구에서 중요한 역할을 하고, 세포핵에서 주로 발견되지만, 또한 중심체에서도 확인되었다. Plec1/BRCA2의 상호작용은 중심체 국소화의 조절에서 중요한 역할을 한다. 따라서, Plec1의 오발현은 중심체의 제거를 초래하고, 유전자 불안전성 및 암 발생을 초래할 수 있다 [21].
PDAC는 PanIN I 및 II 병변에서 PanIN III (상피내 암종)로, 결국 침윤성 암종으로의 진행을 통해 발생하는 것으로 여겨진다 [2, 3, 4]. 이러한 연구에서 수득한 데이터를 기초하여, Plec1 과발현은 PanIN I에서 PanIN II로의 전이 동안에 획득된다. 적은 분율의 PanIN I (21%)만이 Plec1을 발현하는 반면, 절반의 PanIN II (54%)와 대부분의 PanIN III (87%)이 Plec1 양성이었다. 따라서, Plec1의 과발현은 PanIN II으로의 조직학적 진행 훨씬 이전의 PanIN I의 단계에서 시작하고, 병변 진행으로서 PDAC으로 추가로 증가시키는 것으로 보인다. 흥미롭게는, 병변 진행으로서 Plec1은 세포막에서 보유하지 않고, 오히려 암 세포에서 편재하여 발현한다. Plec1은 조기의 PanIN I 및 II 병변에서 세포막 상에서만 위치하지만, 27%의 PanIN III과 31개의 모든 PDAC는 막 및 세포질 Plec1 발현을 나타낸다. 따라서, Plec1 발현은 암으로 진행하도록 예정된 조기의 PanIN 병변을 잠재적으로 확인한다. 이것은, PDAC가 그의 임상적 진행 중에 조기에 전이하기 때문에, 특히 중요하다. 따라서, Plec1는 조기의 발암 현상에서 존재하고, 그의 발현이 침윤성 암에서 보유되는 PDAC에 대한 제1의 바이오마커이다. 이는 잠재적으로 침윤전 PDAC 병변이 전이하기 전에 이의 조기 검출을 위한 바이오마커를 사용하는 것을 처음으로 가능하게 한다. Plec1 기반 PDAC의 스크리닝과 진단은 현재 이용가능한 진단 도구의 결점의 많은 부분을 극복하기 위한 잠재력을 가지고 있다. 민감성과 특이성을 결여한 CA 19-9와는 다르게 [5], 상기는 PDAC에 대해 민감하고 특이적인 바이오마커이다. Plec1 기반 횡단면적 복부 영상화는, 특히 고 위험 환자에서 조기 단계 PDAC를 확실하게 검출하는 것을 주요하게 가능케 한다. 추가적으로, Plec1 과발현은 작고, 현재 확인되지 않은 전이성의 양상을 강조하기 위해 잠재적으로 활용될 수 있으며, 따라서 수술 전 단계를 향상시킨다. 게다가, Plec1 기반 횡단면적 복부 영상화는 만성 췌장염과 PDAC를 안전하게 구별해야 한다.
이들 데이터는 함께 취하여, 1차 및 전이성 인간 PDAC 뿐만 아니라 조기의 침윤전 암에 대해서도 Plec1이 민감하고 특이적인 바이오마커인 것을 제시한다. Plec1 표적화 영상화는 진단 과정에 쉽게 혼합될 수 있고, 특히 전이 개시 전의 그의 조기 단계에서, PDAC의 검출에 대한 진단 정확도를 향상시키는 데에 실질적으로 기여한다는 것을 보증한다.
본원에서 인용된 각각 및 모든 특허, 특허 출원 및 공보의 개시 내용은 본원에 그 전문이 참조로 포함된다.
특정 부분을 배정하는 것을 돕고 이를 참조하기 위하여 본원에 제목을 포함시켰다. 이러한 제목은 본원에서 설명된 개념의 범위를 제한하고자 하는 의도는 아니며, 이러한 개념은 본 명세서 전체에 걸쳐 다른 부분에서 이용 가능성을 지닐 수 있다.
본 발명은 특정한 실시양태를 참조로 개시하는 한편, 이는 본 발명의 다른 실시양태 및 다양성이 본 발명의 정신 또는 범위로부터 벗어남 없이 다른 당업자에게 유도될 수 있음을 명백히 한다.
참고문헌
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Claims (34)

  1. 플렉틴-1 또는 그의 상동체 또는 단편에 독립적으로 결합하는 2개 이상의 펩티드를 포함하며,
    여기서, 플렉틴-1 또는 그의 상동체 또는 단편에 결합하는 상기 펩티드의 각각은 독립적으로 하나 이상의 비-표준 아미노산 치환 또는 보존적 아미노산 치환을 임의로 포함하고,
    상기 펩티드의 각각은 독립적으로 하나 이상의 추가의 아미노산의 첨가에 의해 임의로 변형되며, 상기 펩티드의 각각은 임의로 폴리에틸렌 글리콜에 커플링되고,
    상기 펩티드의 각각 또는 임의로 폴리에틸렌 글리콜에 커플링된 상기 펩티드는 독립적으로 킬레이트화제에 추가로 커플링되며, 임의로 상기 킬레이트화제는 하나 이상의 링커에 의해 상기 펩티드 또는 폴리에틸렌 글리콜에 임의로 커플링된 펩티드에 커플링되고,
    임의로 하나 이상의 영상화제는 상기 킬레이트화제에 커플링되고,
    임의로 하나 이상의 치료제는 상기 킬레이트화제에 커플링되는 것인,
    플렉틴-1 또는 그의 상동체 또는 단편에 결합하기 위한 다량체성 펩티드 리간드 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다량체가 동종다량체 또는 이종다량체인 다량체성 펩티드 리간드 복합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 다량체가 사량체인 다량체성 펩티드 리간드 복합체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 다량체성 펩티드 리간드 복합체의 펩티드가 독립적으로 서열 1-4 및 9-22로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 것인 다량체성 펩티드 리간드 복합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 서열이 서열 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 다량체성 펩티드 리간드 복합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 사량체성 복합체가 약 8.3 x 10-7 M의 Ki를 갖는 것인 다량체성 펩티드 리간드 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 복합체가 화학식 (βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4 KKKKDOTAβA-NH2를 갖는 것인 사량체성 펩티드 리간드 복합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 킬레이터가 DTPA, DO3A, DOTA, EDTA, TETA, EHPG, HBED, NOTA, DOTMA, TETMA, PDTA, TTHA, LICAM, HYNIC, 및 MECAM으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 다량체성 펩티드 리간드 복합체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 영상화제가 방사성핵종, 방사성 조영제, 상자성 이온, 금속, 생물학적 태그, 형광 표지, 화학발광 표지, 초음파 조영제 및 광활성제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 다량체성 펩티드 리간드 복합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 영상화제가 방사성핵종인 다량체성 펩티드 리간드 복합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 방사성핵종이 110In, 111In, 177Lu, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 94 mTc, 94Tc, 99 mTc, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154-158Gd, 32P, 11C, 13N, 15O, 186Re, 188Re, 51Mn, 52mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, 및 다른 감마-, 베타-, 또는 양전자-방출자로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 다량체성 펩티드 리간드 복합체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 방사성핵종이 111In인 다량체성 펩티드 리간드 복합체.
  13. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 폴리에틸렌 글리콜 5000인 다량체성 펩티드 리간드 복합체.
  14. 대상체에게 영상화제를 포함하는 제1항의 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 투여하는 것, 및 플렉틴-1을 포함하는 세포의 위치를 검출하는 것을 포함하는, 대상체에서의 플렉틴-1 또는 그의 상동체 또는 단편의 검출 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 다량체성 펩티드 리간드 복합체가 화학식 (βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4 KKKKDOTAβA-NH2를 가지며, 영상화제가 111In인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 영상화제가, 컴퓨터에 커플링되어 있고 프로그램을 사용하여 영상화 데이터를 분석하는 SPECT/CT 스캐너로 검출되는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 다량체성 펩티드 리간드를 포함하는 펩티드가 각각 서열 1-4 및 9-22로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 서열을 갖는 것인 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 영상화제가 방사성핵종, 방사성 조영제, 상자성 이온, 금속, 생물학적 태그, 형광 표지, 화학발광 표지, 초음파 조영제 및 광활성제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 플렉틴-1 또는 그의 상동체 또는 단편이 세포 표면 플렉틴-1 또는 그의 상동체 또는 단편인 방법.
  20. 시험 대상체에게 영상화제를 포함하는 제1항의 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 포함하는 제약 조성물을 투여하고, 상기 영상화제를 검출하고, 상기 시험 대상체에서 상기 영상화제의 수준 및 위치를 결정하고, 상기 수준 및 위치를, 영향받지 않은 대상체로부터의 그렇지 않은 동일한 위치로부터의 상기 영상화제의 수준 및 위치와 비교하거나 또는 상기 시험 대상체의 영향받지 않은 영역과 비교함으로써 암을 검출하고, 암을 진단하고, 암의 진행을 모니터링하거나, 또는 암의 치료를 모니터링하는 것을 포함하며, 여기서 영향받지 않은 대상체 또는 상기 시험 대상체의 영향받지 않은 영역으로부터의 상기 샘플에서의 상기 영상화제의 수준 또는 위치에 비해 상기 시험 대상체에서의 상기 영상화제의 더 높은 수준 또는 상이한 위치는 상기 시험 대상체가 플렉틴-1 또는 그의 상동체 또는 단편을 발현하는 암을 가짐을 나타내는 것인, 암을 검출하거나, 암을 진단하거나, 암의 진행을 모니터링하거나, 또는 암의 치료를 모니터링하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 암이 두경부암, 간암, 췌장암, 식도암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁내막암, 자궁경부암, 전립선암, 부신암, 림프종, 침샘암, 골암, 뇌암, 소뇌암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 구비강인두 (oronasopharyngeal)암, NPC, 신장암, 방광암, 피부암, 흑색종, 기저 세포 암종, 경구개 암종, 혀의 편평 세포 암종, 수막종, 다형 선종, 별아교세포종, 연골육종, 피질 선종, 간세포 암종, 췌장암, 편평 세포 암종, 및 선암종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 암이 췌장암인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 췌장암이 췌관 선암종, 췌장 상피내종양, 선종, 이형성을 갖는 선종, 및 제자리(in situ) 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 암이 전이성 암인 방법.
  25. 제20항에 있어서, 상기 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 포함하는 펩티드가 각각 서열 1-4 및 9-22로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 서열을 갖는 것인 방법.
  26. 제20항에 있어서, 상기 다량체성 펩티드 리간드 복합체가 화학식 (βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4 KKKKDOTAβA-NH2를 가지며, 영상화제가 111In인 방법.
  27. 제20항에 있어서, 상기 영상화제가 방사성핵종, 방사성 조영제, 상자성 이온, 금속, 생물학적 태그, 형광 표지, 화학발광 표지, 초음파 조영제 및 광활성제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  28. 제20항에 있어서, 상기 플렉틴-1 또는 그의 상동체 또는 단편이 세포 표면 플렉틴-1 또는 그의 상동체 또는 단편인 방법.
  29. 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하고, 상기 샘플을 영상화제를 포함하는 제1항의 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 포함하는 조성물과 접촉시키고, 상기 시험 대상체로부터의 상기 샘플에서의 상기 플렉틴-1의 수준 또는 위치를, 영향받지 않은 대상체로부터 수득된 그렇지 않은 동일한 샘플로부터의 플렉틴-1의 수준 또는 위치와 비교하거나 또는 알려진 양의 플렉틴-1을 포함하는 표준 샘플과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 상기 시험 대상체로부터의 상기 샘플에서의 플렉틴-1의 더 높은 수준은 상기 시험 대상체가 암을 가짐을 나타내는 것인, 대상체에서 플렉틴-1 또는 그의 상동체 또는 단편을 발현하는 세포를 갖는 암을 진단하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 다량체성 펩티드 리간드 복합체가 화학식 (βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4 KKKKDOTAβA-NH2를 갖는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 영상화제가 방사성핵종, 방사성 조영제, 상자성 이온, 금속, 생물학적 태그, 형광 표지, 화학발광 표지, 초음파 조영제 및 광활성제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  32. 제약상 허용되는 담체 및 제1항의 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 포함하는 제약 조성물.
  33. 제약상 허용되는 담체 및 제1항의 다량체성 펩티드 리간드 복합체를 포함하는 제약 조성물, 어플리케이터(applicator), 및 그의 사용을 위한 지시 자료, 및 임의로 영상화제 및 치료제를 포함하는 키트.
  34. 제1항에 있어서, 하기 구조를 가지며, 영상화제를 포함하는 다량체성 펩티드 리간드 복합체.
    Figure pct00012

KR1020127014652A 2009-11-05 2010-11-05 암에 대한 바이오마커로서 플렉틴-1을 검출하기 위한 조성물 및 방법 Withdrawn KR20120101054A (ko)

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