KR20120055549A - 알코올 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물 발효, 특히 CO를 함유하는 기질을 미생물 발효시킴으로써 알코올 및 산과 같은 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 미생물 발효에 의한 생성물의 생산 효율을 개선시키기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 목적하는 대사산물의 제조가 최적화되도록 기질 공급을 조절하는 방법을 제공한다.

Description

알코올 제조방법{ALCOHOL PRODUCTION PROCESS}

본 발명은 일반적으로, 기질에서 미생물 발효를 통해 미생물 성장 효율 및 생성물의 생성 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 일산화탄소를 함유하는 가스상 기질의 미생물 발효를 통해 알코올류, 특히 에탄올을 생성하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 전체적인 미생물 발효 효율이 개선되도록 기질 공급을 최적화시키는 방법에 관한 것이다.

에탄올은 전세계에서 급속하게 주요한 수소가 풍부한 액체 수송 연료가 되고 있다. 2005년에 에탄올의 세계 소비량은 122억 갤런인 것으로 평가되었다. 또한, 연료 에탄올 산업에 대한 세계 시장은 유럽, 일본, 미국 및 몇몇 개발도상국에서 에탄올에 대한 관심의 증가로 인해 미래에 급속하게 계속 성장할 것으로 예측되어 왔다.

예를 들어, 미국의 경우, 에탄올은 가솔린에 함유된 에탄올의 10% 혼합물인 ElO을 제조하기 위해 사용되고 있다. ElO 블렌드에서, 에탄올 성분은 산화제(oxygenating agent)로 작용하여, 연소 효율을 개선하고 대기 오염물의 생성을 감소시킨다. 브라질에서, 에탄올은 가솔린에 배합된 산화제 및 순수 연료로서 수송 연료 요구량의 약 30%를 차지하고 있다, 또한, 유럽에서, 그린 하우스 가스(GHG) 방출에 따른 환경 문제는 유럽 연합(EU) 국가들이 바이오매스 유래의 에탄올과 같은 재활용가능한 수송 연료의 소비에 대한 목표를 설정하게 하는 자극제가 되어왔다.

연료 에탄올의 대부분은 사탕수수로부터 추출한 수크로스 또는 곡물로부터 추출한 전분과 같은 곡물 유래 탄수화물을 주요 탄소원으로 이용하는 전통적인 효모 기반 발효 공정을 통해 제조되고 있다. 그러나, 이러한 탄수화물 공급 원료의 가격은 인간용 식품 또는 동물 사료로서의 그 가치에 의해 영향을 받고, 에탄올 제조용 전분 또는 수크로스 함유 곡물의 재배가 모든 지역에서 경제적으로 실행가능한 것은 아니다. 따라서, 가격이 낮고 더욱 풍부한 탄소 자원을 연료 에탄올로 전환하는 기술을 개발하는 것이 중요하다.

CO는 석탄 또는 오일과 같은 유기 물질 및 오일 유래 제품의 불완전 연소의 주요한 에너지가 풍부한 부산물이다. 다른 산업 공정에 의하여도 일산화탄소가 생산된다. 호주의 철강 산업은 매년 500,000 톤 이상의 CO를 생성하여 대기중으로 방출하는 것으로 보고되고 있다.

촉매적 공정을 이용하여 CO 및/또는 CO 및 수소(H₂)로 주로 구성되는 가스를 연료 및 농약으로 전환할 수 있다. 또한, 미생물을 이용하여 상기 가스를 연료 및 농약으로 전환할 수 있다. 이러한 생물학적 공정들은 화학 반응보다 느리긴 하지만, 촉매적 공정과 비교하여 높은 특이성, 높은 수율, 낮은 에너지 비용 및 중독에 대한 큰 저항성을 비롯한 몇 가지 장점이 있다.

CO를 단독 탄소원으로 이용하여 성장하려는 미생물의 능력이 1903년에 최초로 발견되었다. 나중에 이는 독립영양 성장의 아세틸 조효소 A (아세틸 CoA) 생화학 경로(Woods-Ljungdahl 경로 및 일산화탄소 탈수소효소/아세틸 A 합성효소 (CODH/ACS) 경로라고도 함)을 이용하는 유기체의 특성인 것으로 확인되었다. 일산화탄소 영양, 광합성, 메탄생성 및 아세트산생성 유기체를 비롯한 다수의 혐기성 유기체들이 CO를 여러 가지 최종 생성물, 즉, CO₂, H₂, 메탄, n-부탄올, 아세테이트 및 에탄올로 대사하는 것으로 확인되어 왔다. CO를 단독 탄소원으로 이용하면서, 모든 이러한 유기체들은 상기 최종 생성물들 중 적어도 두 가지를 생성한다.

클로스트리듐(Clostridium) 속에서 유래한 것들과 같은 혐기성 세균은 아세틸 CoA 생화학 경로를 통해 CO, CO₂ 및 H₂로부터 에탄올을 생성하는 것으로 확인되어 왔다. 예를 들어, 가스로부터 에탄올을 생성하는 클로스트리듐 륭달리(Clostridium ljungdahlii )의 여러 가지 균주가 WO 00/68407호, EP 117309호, 미국 특허 제 5,173,429호, 5,593,886호 및 6,368,819호, WO 98/00558호 및 WO 02/08438호에 기재되어 있다. 또한, 세균인 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum sp )도 가스로부터 에탄올을 생성하는 것으로 알려져 있다(Abrini 외, Archives of Microbiology 161, pp 345-351 (1994)).

그러나, 가스의 미생물 발효를 통한 에탄올 제조는 아세테이트 및/또는 아세트산의 동시 제조와 일반적으로 관련이 있다. 이용가능한 탄소중 일부는 에탄올보다는 아세테이트/아세트산으로 전환되기 때문에, 이러한 발효 공정을 이용한 에탄올의 제조의 효율은 원하는 수준보다 낮을 수 있다. 또한, 상기 아세테이트/아세트산 부산물이 일부의 다른 목적에 사용될 수 없다면, 폐기물 처리 문제를 야기할 수 있다. 아세테이트/아세트산은 미생물을 통해 메탄으로 전환되기 때문에, GHG 방출에 기여할 가능성이 있다.

그 개시내용이 본 원에 참조로 포함되는 WO2007/117157호, WO2008/115080호 및 WO2009/022925호는 일산화탄소 함유 가스의 혐기성 발효를 통해 알코올류, 특히 에탄올을 생산하는 공정을 기재하고 있다. WO2007/117157호는 일산화탄소를 함유하는 가스를 혐기 발효시킴으로써 알코올 특히 에탄올을 제조하는 방법을 설명하고 있다. 발효 공정의 부산물로서 생성되는 아세테이트는 수소 가스 및 이산화탄소 가스로 전환되는데 이들 중 어느 한가지 또는 두가지 모두는 혐기성 발효 공정에 사용될 수 있다. WO2008/115080호는 다단계 발효 공정(들)로 알코올을 제조하는 방법을 설명한다. 제1 바이오리액터 중에서 가스(들)의 혐기 발효의 결과로서 생산되는 부산물들을 이용하여 제 바이오리액터에서 생산물을 만들 수 있다. 뿐만 아니라, 이 제2 발효 단계의 부산물은 제1 바이오리액터 내로 재순환되어 생성물을 만드는데 이용될 수 있다. WO2009/022925호는 발효를 통한 산 및 알코올과 같은 생성물로 CO 함유 기질의 전환에 미치는 pH 및 ORP의 효과를 개시하고 있다.

CO 함유 가스를 이용하여 성장할 수 있는 미생물은 당에서 성장하는 미생물의 성장 속도에 비해 훨씬 느린 속도로 성장하는 것으로 알려져 있다. 상업적인 관점에서, 발효 공정에서는 미생물 개체군이 충분히 높은 세포 밀도까지 성장하여 경제적으로 실행가능한 수준의 생성물이 합성되도록 하는데 필요한 시간은 상기 공정의 수익성에 영향을 미치는 중요한 인자이다. 배양 성장 속도 및/또는 생산성을 향상시켜서 원하는 세포 밀도 및/또는 원하는 생성물 수준에 도달하는데 필요한 시간을 감소시키는 기술을 이용하여 총괄 공정의 상업적인 실시가능성을 개선할 수 있다.

가스상 공급원료로부터 알코올을 제조하기 위해 이용되는 발효 공정에서, 미생물 성장 및/또는 알코올 생성을 위한 적절한 조건을 확보하는 것은 최적 미생물 생산 및/또는 알코올 생산성을 유지하는데 중요할 수 있다. 예를 들어, 미생물 배양체에 기질을 최적 수준이나 그에 가까운 범위로 공급하면 그 내용이 본문에 병합된 PCT/NZ2010/000009에 설명된 바와 같이 최적의 미생물 성장 및/또는 목적하는 대사산물 생산을 결과시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 기질을 너무 조금 제공하면, 미생물 성장이 둔화되고 발효 산물(들)은 주로 아세테이트와 같은 산(들)이 되는 반면, 기질을 너무 많이 공급하면, 미생물 성장이 불량하게 되거나 심지어 세포 사멸에 이를 수 있다.

CO의 낮은 용해도 및 용해도를 측정하는 정확한 칭량 수단이 없기 때문에, 특정 조건 하의 주어진 시점에서 미생물 배양체에 얼마나 만은 CO가 이용가능한지를 측정하기란 어려운 일이다. 따라서, 어떤 특정 시점에서 미생물 배양체에 제공되는데 최적인 CO 수준을 측정하는 것은 어려울 수 있다.

본 발명의 목적은 전술한 단점들 중 적어도 일부를 극복하는 방법을 제공하거나 적어도 공중에게 유용한 선택을 제공함에 있다.

발명의 개요

본 발명의 첫번째 광의의 측면에서, 바이오리액터에 대한 CO 함유 기질의 공급을 최적화하는 방법이 제공되며, 이 방법은 1종 이상의 일산화탄소 영양미생물(carboxydotraphic microorganisms)에 의해 기질을 발효시켜 1종 이상의 알코올(들) 및/또는 산(들)을 포함하는 생성물을 생산하는 것으로서, 제1 시점과 제2 시점에서 바이오리액터 중의 산의 수준을 측정하는 단계를 포함하되, 여기서 제1 시점과 제2 시점 사이의 산 수준의 변화는 기질 공급의 변화를 초래한다.

특정 구체예에서, 제1 시점과 제2 시점 사이의 산 수준이 증가하면 기질 공급이 증가된다.

특정 구체예에서, 제1 시점과 제2 시점 사이의 산 수준이 감소하면 기질 공급이 감소된다.

본 발명의 두번째 광의의 측면에 따라, 산(들) 및/또는 알코올(들)을 비롯한 생성물을 생산하기 위하여 1종 이상의 일산화탄소 영양미생물에 의해 바이오리액터에서 CO 함유 기질의 발효 효율을 증가시키는 방법이 제공되며, 여기서 상기 기질은 바이오리액터 중에서 산 수준이 소정의 역치 농도들 사이에서 유지되도록 제공된다.

특정 구체예에서, 기질 공급은 산 농도의 변화에 응답하여 자동 제어된다.

특정 구체예에서, 산 수준은 발효 브로쓰 1 L 당 소정의 역치 농도인 1-10 g (즉 1-10 g/L) 사이로 유지된다. 특정 구체예에서, 산 수준은 발효 브로쓰 1 L 당 소정의 역치 농도 2-8 g 사이로 유지된다. 특정 구체예에서, 산 수준은 배양물의 pH를 측정함으로써 구한다.

특정 구체예에서, 발효는 연속식으로 행한다.

본 발명의 세번째 광의의 측면에서, 최적의 기질 공급 수준 및/또는 농도를 구하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 CO 함유 기질의 발효에 의해 소망되는 알코올:산 생성물의 비율이 얻어지도록 하는 수준 또는 실질적으로 그에 지향된 수준으로 바이오리액터 중의 1종 이상의 일산화탄소 영양미생물의 배양체에 기질을 공급하는 것을 포함하여 이루어진다.

전술한 여러 측면들의 특정 구체예에서, 산은 아세테이트이다. 특정 구체예에서, 알코올은 에탄올이다.

본 발명의 네번째 광의의 측면에서, 기질을 미생물 발효시켜 생성물을 생산하는 전체적인 효율을 향상시키는 방법이 제공되는데, 이 방법은 기질을 실질적으로 최적 수준에 지향되도록, 최적 수준 또는 최적 범위 내로 미생물 배양체에 제공하는 단계를 포함하여 이루어진다.

특정 구체예에서, 기질은 CO를 포함하는 것이다.

특정 구체예에서, 생성물은 산(들) 및/또는 알코올(들)이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 알코올(특히 에탄올)은 산(특히 아세테이트)의 부수적인 생산 없이 생산된다.

특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 발효 배지의 pH가 실질적으로 일정하게 또는 소정 범위 내로 유지되도록 기질을 제공하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 기질은 발효 도중 산(들)의 농도에 실질적으로 아무런 변화가 일어나지 않도록 제공된다.

특정 구체예에서, 기질은 pH가 소망하는 범위 내로 유지되도록 제공된다. 특정 구체예에서, 소망되는 범위는 최적 작동 pH의 ±0.5 유닛이다. 일반적으로, 기질은 pH가 5-6 범위; 또는 5.1-5.9 범위; 또는 5.2-5.8 범위; 또는 5.3-5.7 범위; 또는 5.4-5.6 범위; 또는 실제로 5.5에서 유지되도록 제공된다.

다섯번째 광의의 측면에서, 생성물을 생산하기 위한 기질의 미생물 발효의 전체적인 효율을 증가시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 pH를 모니터링하여 pH 변화에 기초하여 기질 공급을 조절하는 것을 포함하여 이루어진다. 특정 구체예에서, 기질은 CO를 포함한다.

특정 구체예에서, 기질 공급은 pH가 일정한 값으로 또는 소정 범위 내에서 유지되도록 조절되거나 또는 소정의 변화율로 변화하도록 조절된다.

특정 구체예에서, 상기 방법은 pH의 감소에 응답하여 기질 공급을 증가시키는 것을 포함한다. 이에 더하여 또는 별법으로, 상기 방법은 pH 증가에 응답하여 기질 공급을 감소시키는 것을 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에서, 이 방법은 공지의 분석법에 의해 발효 브로쓰에서 대사산물 농도를 모니터링하는 것을 포함한다.

본 발명의 여섯번째 광의의 구체예에서, 생성물을 생산하기 위한 기질의 미생물 발효의 전체적인 효율을 증가시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 실질적으로 최적 수준에 가까운 수준, 최적 수준 또는 최적 범위로 기질을 미생물 배양체에 제공하는 것을 포함하여 이루어진다. 특정 구체예에서, 기질은 CO를 포함한다.

특정 구체예에서, 생성물은 산(들) 및/또는 알코올(들)이다. 특정 구체예에서, 생성물은 산:알코올의 소망되는 생성물 비율이 적어도 1:1; 또는 적어도 1:2; 또는 적어도 1:3; 또는 적어도 1:4; 또는 적어도 1:5; 또는 적어도 1:10; 또는 적어도 1:20이 되도록 생산된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 알코올(특히 에탄올)은 산(특히 아세테이트)의 부수적인 생산 없이 생산된다.

특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 수소가 미생물 배양체에 의해 생산되도록 기질을 제공하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 수소가 미생물 배양체에 의해 소비되는 기질의 적어도 0.5mol%; 또는 적어도 1.0mol%; 또는 적어도 1.5mol%; 또는 적어도 2.0mol%의 수준으로 생산되도록 기질이 제공된다. 이에 더하여 또는 별법으로, 기질은 미생물 배양체에 의한 CO 비흡수율 (specific CO uptake)이 1분당 바이오매스 1 그램 당 소비된 CO의 양이 0.6-1.5 mmol (mmol/g/min) 사이로 유지되도록 하는 양으로 제공된다. 특정 구체예에서, 기질이 CO를 포함하는 경우, 기질 이용성이 최적량을 상회하여 (또는 최적 범위를 상회하여) 증가함에 따라, 과량의 CO가 하이드로게나제 효소(들)을 억제하고, 이에 따라 실제로 H2 생성이 방지된다. 하이드로게나제 효소(들)이 억제되면 미생물은 과도한 환원력을 내지 못하기 때문에, 성장 억제 및/또는 미생물 사멸과 같은 배양상의 문제가 발생하게 된다.

일곱번째 광의의 측면에서, 본 발명은 생성물을 생산하기 위한 기질의 미생물 발효의 전반적인 효율을 향상시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 미생물 배양체에 의해 생산된 수소를 모니터링하여 수소 생산에 기초해서 기질 공급을 조절하는 것을 포함한다.

특정 구체예에서, 기질은 CO를 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에서, 기질 제공은 미생물 배양체에 의한 수소 생산량이 배양체에 의해 소비된 기질의 적어도 0.5 mol%, 적어도 1.0 mol%; 또는 적어도 1.5 mol%; 또는 적어도 2.0 mol%가 되도록 조절된다.

특정 구체예에서, 기질 공급은 수소 생산량이 미생물 배양체에 의해 소비된 기질의 적어도 0.5mol%; 또는 적어도 1.0mol%; 또는 적어도 1.5mol%; 또는 적어도 2.0mol%의 수준으로 유지되도록 증가된다. 이에 더하여 또는 별법으로, 기질 공급은 수소 생산량이 미생물 배양체에 의해 소비된 기질의 적어도 0.5mol%; 또는 적어도 1.0mol%; 또는 적어도 1.5mol%; 또는 적어도 2.0mol% 수준으로 유지되도록, 감소되거나 유지되거나 또는 실제로 항상적일 수 있다.

여덟번째의 광의의 측면에서, 본 발명에 따라 생성물을 생산하기 위한 기질의 미생물 발효의 전반적인 효율 개선 방법이 제공되는데, 이 방법은 CO 함유 기질을 미생물 배양체의 비흡수율(specific uptake)이 분당 바이오매스 1 그램 당 CO 소비량이 0.6-1.5 mmol (mmol/g/min)이 되도록 CO 함유 기질을 미생물 배양체에 제공하는 것이다. 특정 구체예에서, CO를 함유하는 이 기질은 비흡수율이 실제로 0.8 - 1.2 mmol/g/min이 되도록 제공된다.

본 발명의 특정 구체예에서, CO 함유 기질은 가스상이다. 특정 구체예에서, 이 가스상 기질은 산업 공정의 부산물로서 얻어지는 가스를 포함한다. 특정 구체예에서, 산업 공정은 철금속 산물 제조, 비철금속 산물 제조, 퍼트롤륨 정제 공정, 바이오매스의 기화 공정, 석탄의 기화 공정, 전력 생산, 카본 블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산 및 코크 제조로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 예컨대 6%와 같이 CO 농도가 낮은 기질 역시도 적합하며 특히 H₂와 CO₂ 역시도 존재하는 경우 적합할 수 있다.

여러가지 측면의 특정 구체예에서, CO 함유 기질은 일반적으로 CO를 큰 비율로, 예컨대 적어도 약 20 부피% 내지 약 100 부피%의 CO, 40 부피% 내지 95 부피%의 CO, 40 부피% 내지 60 부피%의 CO 및 45 부피% 내지 55 부피%의 CO를 함유한다. 특정 구체예에서, 기질은 부피 기준으로 CO를 약 25%, 또는 약 30%, 또는 약 35%, 또는 약 40%, 또는 약 45%, 또는 약 50% CO, 또는 약 55%, 또는 약 60% 함유한다.

여러가지 측면의 특정 구체예에서, 발효 공정에 의해 생산되는 알코올은 에탄올이다. 발효 반응은 아세테이트를 생산할 수도 있다.

여러가지 측면의 특정 구체예에서, 발효 반응은 1종 이상의 아세트산 생산균 (acetogenic bacteria) 균주에 의해 수행된다. 좋기로는 아세트산 생산균은 클로스트리듐(Clostridium), 무렐라(Moorella) 및 카복시도데르무스(Carboxydothermus), 예를 들어, 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 륭달리(Clostridium ljungdahlii), 및 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica)로부터 선택된다. 한가지 구체예에서, 아세트산 생산균은 클로스트리듐 오토에타노게눔이다.

본 발명은 아홉번째 광의의 측면에서, 생성물을 생산하기 위한 기질의 미생물 발효 장치가 제공되며, 이 장치는 소망되는 발효를 수행하기 위한 바이오리액터, 소망되는 발효 공정 동안 발효 브로쓰의 pH를 측정하기 위한 측정 수단 및 기질 공급을 조절하기 위한 조절 수단을 포함하여 이루어진다.

특정 구체예에서, 이 장치는 CO를 함유하는 기질을 제공하도록 만들어진다.

특정 구체예에서, 조절 수단은 만일 pH가 소정의 값이나 범위로부터 일탈할 경우 기질 공급에 대한 한가지 이상의 조정 수단을 제공한다.

특정 구체예에서, 장치는 프로세싱 수단을 포함한다. 특정 구체예에서, 프로세싱 수단은 기질 공급이 pH의 변화에 응답하여 자동적으로 조절되도록, 조절 수단에 연결된다. 특정 구체예에서, 기질 공급은 pH가 감소하면 증가된 기질의 양이 공급되고 및/또는 pH가 증가하면 더 적은 양의 기질이 공급되도록 조절된다.

열번째 광의의 측면에서 본 발명은 생성물을 생산하기 위한 기질의 미생물 발효 장치를 제공하는데, 이 장치는 소망하는 발효를 수행하기 위한 바이오리액터, 소망하는 발효 공정 동안 생산되는 수소의 양을 측정하기 위한 측정 수단 및 기질 공급을 조절하기 위한 조절 수단을 포함하여 이루어진다.

특정 구체예에서, 장치는 CO 함유 기질을 제공하도록 설정된다. 특정 구체예에서, 측정 수단은 발효 과정 동안 소비된 기질의 양도 측정한다. 필요에 따라, 측정 수단은 H2_생산량/CO_소비량 비율을 구할 수 있도록 프로세싱 수단에 연결될 수 있다.

특정 구체예에서, 조절 수단은 H2_생산량/CO_소비량 비율이 소정의 값이나 범위를 벗어날 경우 기질 공급에 대한 한가지 이상의 조정 수단을 제공하도록 설정된다.

특정 구체예에서, 프로세싱 수단은 기질 공급이 H2 생산량 및/또는 H2_생산량/CO_소비량 비율의 변화에 응답하여 자동 조절될 수 있도록, 조절 수단에 연결된다.

본 발명의 열한번째 광의의 측면에서:

i. CO 함유 기질의 발효를 수행하도록 설정된 바이오리액터

ii. 측정 수단; 및

iii. 조절 수단;

을 포함하여 이루어지는 미생물 발효를 위한 장치가 제공되며, 여기서 조절 수단은 측정 수단에 의한 측정에 응답하여 CO를 포함하는 기질의 공급을 조절하도록 설정되는 것이다.

특정 구체예에서, 측정 수단은 발효 과정 중 생산된 1종 이상의 산(들)의 양을 측정하도록 설정된다.

특정 구체예에서, 측정 수단은 발효시 pH를 측정하도록 설정된다.

특정 구체예에서, 측정 수단은 발효시 H2의 생산량을 측정하도록 설정된다.

이상 본 발명의 광의로 정의하였으나, 본 발명은 상기 설명으로 한정되는 것이 아니며 다음의 실시예와 도면을 참고로 한 구체예들 역시도 포괄하는 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 측면에 따라, 기질의 미생물 발효의 총괄적인 효율을 개선시키기 위한 방법이 제공되며, 이 방법은 기질을 실질적으로 최적 수준으로, 최적 수준에 근접하게 또는 최적 수준 범위로 제공하는 것을 포함하여 이루어진다. 본 발명의 특정 구체예에서, 기질은 CO를 포함하며 아세트산 생산균과 같은 1종 이상의 일산화탄소 영양세균에 제공된다. 적절한 혐기 조건 하에서, 클로스트리듐 오노에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리, 클로스트리듐 락스달레이 및 클로스트리듐 카르복시디보란스와 같은 아세트산 생산균은 CO 함유 기질을 산 및 알코올을 포함하는 생성물로 전환시킨다.

CO 함유 기질과 같은 기질을 미생물 배양체에 최적 수준 또는 최적 수준에 가깝게 또는 최적 수준 범위로 공급하면 본 발명에 그 개시내용 전체가 참조 병합된 PCT/NZ2010/000009에 설명된 바와 같이 최적의 미생물 성장 및/또는 소망되는 대사산물 생산이 달성가능한 것으로 인식되어 왔다. 예를 들어, 기질을 1종 이상의 일산화탄소 영양미생물을 함유하는 미생물 배양체에 최적 수준에 가까운 수준 또는 최적 수준으로 공급하면 미생물 성장이 양호해질 뿐만 아니라 1종 이상의 알코올과 같은 바람직한 생성물이 생산되는 것으로 알려져 있다.

미생물 성장 및 목적하는 생성물의 생산을 최적으로 유지하기 위해, 기질은 실제로 발효 과정 내내 연속적으로 미생물 배양체에 최적 농도로 또는 최적 농도에 근접한 농도로 제공되어야만 한다. 최적 공급을 일탈하면 성장이 둔화되고 덜 바람직한 생성물이 생산되거나 심한 경우 미생물 성장이 저해되거나 미생물이 사멸될 수도 있다.

특정 이론에 구애되는 것은 아니나, 기질, 특히 CO 함유 기질의 적어도 일부는 미생물 배양체에 의해 산화되어 대사산물의 생산 및/또는 세포 성장시 사용될 수 있는 에너지(환원 당량: reducing equivalents)를 생산하는데 사용될 수 있을 것으로 여겨진다. 기질 공급을 증가시키면 대사산물의 생산 및/또는 성장에 이용가능한 환원 당량이 증가된다. 일반적으로, 기질이 제한된 배양에 있어서는, 미생물 배양체가 성장 및 산(들)과 같은 생성물을 생산하도록 하기 위해 환원 당량이 이용된다. 그러나, 기질 공급이 증가됨에 따라, 미생물은 부가적인 환원 당량을 생산하는데 부가적인 기질을 사용할 수 있고 이는 다시 산(들)과 같은 생성물(들)을 알코올(들)과 같은 바람직한 생성물로 환원시키는데 이용될 수 있다. 기질 공급이 최적 수준으로 근접할수록, 알코올(들)의 양이 산(들)의 양에 비해 증가하는데 이는 미생물이 환원 당량을 더 증가된 양으로 사용하기 때문이다. 일반적으로, 이러한 구체예에서 미생물 배양체는 성장하여 에탄올과 같은 알코올(들)을 생산하게 된다.

1종 이상의 미생물에게 기질이 제공되는 기질 공급량 또는 수준은 실제로 기질로부터 수성 발효 브로쓰로의 질량 전달속도(mass trasfer rate)와 연관되어 있다. 가스에서 액체로의 질량 전달은 다음의 3가지 주요 변수들의 함수이다:

1. 농도추진력(concentration driving force): 특정한 가스상 성분의 분압은 그 성분이 용액내로 추진될 수 있는 속도에 실질적으로 비례한다.

2. 인터페이스 표면적(interfacial surface area): 가스상과 액체상 사이의 인터페이스 표면적이 클수록 질량 전달 기회도 높아진다. 특히, 인터페이스 표면적은 일반적으로 가스 홀드업 및 기포 크기의 함수이다.

3. 전달계수(trasfer coefficient): 장치의 전달계수는 여러가지 인자에 의해 영향을 받는다. 그러나, 실무상, 대개 가장 큰 영향은 액체상과 가스상 사이의 상대 속도이다. 상대속도(및 따라서 질량전달)는 일반적으로 교반 또는 기타 혼합을 통해 난류(turbulence)를 증가시키으로써 증가된다.

당업자라면 기질의 용액 내로의 질량 전달 증가 방법을 익히 이해할 것이다. 그러나, 예를 들어, 기질 공급 또는 수단은 1가지 이상의 수단 예컨대: 기질이 바이오리액터에 공급되는 속도를 증가시키거나, 기질의 분압을 증가시키거나 또는 교반 탱크 바이오리액터의 교반 속도를 증가시키기 위한 수단, 또는 특정 바이오리액터의 특징적인 질량전달을 증가시키는 등에 의하여 증가될 수 있다. 가스상 기질의 발효시 미생물에 대한 질량 전달을 촉진하기 위한 많은 기구와 장치가 알려져 있다.

최적 수준을 향해 생성물로의 전환을 위하여 미생물 배양체가 이용할 수 있는 기질의 양을 증가시키면 산(들)에 비해 알코올(들)의 생산량이 증가된다는 것이 알려져 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 생성물들은 배양체에 의해 적어도 1:1; 또는 적어도 1:2; 또는 적어도 1:3; 또는 적어도 1:4; 또는 적어도 1:5; 또는 적어도 1:10; 또는 적어도 1:20의 바람직한 산:알코올의 생성물 비율이 되도록 생산된다. 특정 구체예에서, 정상 상태에서, CO 함유 기질의 정상 상태 연속 발효에 의해 아세테이트 및/또는 알코올을 비롯한 생성물들이 생산된다. 특정 구체예에서, 정상 상태에서 기질이 최적 수준으로 또는 최적 수준을 향해 공급되면, 아세테이트는 발효 브로쓰 중에서 10g/L 미만, 또는 9g/L 미만, 또는 8g/L 미만, 또는 7g/L 미만, 또는 6g/l 미만, 또는 5g/L 미만의 농도로 유지된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 알코올(특히 에탄올)은 산(특히 아세테이트)의 부수적인 생산 없이 생산된다. 그러나, 기질이 과도한 이용성(과잉 공급에 의한)은 성장 억제 및/또는 미생물 사멸과 같은 배양상의 문제를 초래할 수 있다.

특정 측면에서, 본 발명은 배양체의 생존능과 성장능력 및 에탄올과 같은 바람직한 대사산물의 생산량을 증대시키기 위해 최적 수준으로, 최적 수준을 향해 또는 최적 수준 범위로 기질이 제공되도록, 기질, 특히 CO 함유 기질의 미생물 발효를 최적화하기 위한 방법을 제공한다. 최적 수준(또는 범위)는 미생물 집단의 크기로 인해 시간이 지나면 변할 수 있다. 예를 들어 특정 구체예에서, 배양체가 아세테이트와 같은 산(들)을 2 g/g 바이오매스/일 미만, 또는 1.5g/g/일 미만 또는1.2g/g/일 미만, 또는 1g/g/일 미만의 특이 속도로 생산하면, 기질이 최적 수준으로 또는 최적 수준을 향해 제공된다.

따라서, 본 발명의 방법은 미생물 배양체의 크기와 관계없이 기질 공급을 최적화하기 위한 수단을 제공한다. 예를 들어, 뱃치 또는 유가식(fed-batch) 발효의 경우, 미생물 배양체는 성장기 동안 대수적으로 성장하게 된다. 따라서, 기질은 실질적으로 최적의 기질량이 연속적으로 제공되도록 증가된 양으로 공급되어야만 한다. 이에 더해서 또는 별법으로 연속식 배양의 경우, 기질은 지속가능한 미생물 성장과 소망되는 대사산물 생산을 유지하기 위해 장기간에 걸쳐 최적 수준으로 또는 최적 수준을 향해 또는 최적 수준 범위로 제공되어야만 한다. 신선한 배지 공급 속도, 온도, pH, ORP, 배양체 생존능과 같은 작업 조건의 작은 변화가 바이오매스 수준의 변화를 유발하고 따라서 기질 요구사항을 변화시킬 수 있는 것으로 인식되었다. 본 발명의 방법에 따라, 기질은 바이오매스의 변화와 관계 없이 최적 수준으로 또는 최적 수준을 향해 공급될 수 있다.

특정 구체예에 따라, 최적화 방법은 발효 배지의 pH를 모니터링하고 pH의 측정치 또는 경시적인 pH 변화에 기초하여 기질의 공급을 조절하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 기질은 배지의 pH가 소정의 변화 속도로 또는 소정의 변화 속도를 향해 또는 소정의 변화 속도 범위 내에서 변화하도록 발효 배지 중의 미생물 배양체에 제공된다. 특정 구체예에서, 변화 속도는 0에 근접하며, 몇몇 구체예에서는 배지의 pH가 실제로 일정하게 유지되거나 소정 범위 내로 유지된다. 본 발명의 특정 측면에서, 제한된 기질 공급 기간 동안, 아세톤 생산균은 아세트산을 비롯한 생성물을 생산한다. 따라서, 기질 제한된 아세톤생산 배양체를 함유하는 발효 배지의 pH는 염기 첨가에 의해 조절되지 않는 한 저하될 것이다. 본 발명에 그 개시 내용이 참조로 병합된 WO2009/113878에 설명된 바와 같이, CO 함유 기질이 과잉공급되면, 아세테이트가 알코올로 변환되고 pH는 산 첨가에 의해 조절되지 않는 한 증가하게 된다. 따라서, 최적의 성장 및/또는 알코올 생산 조건 하에서, 미생물 배양체에 의해 산성 대사산물이 생산되거나 소비될 수 있다. 특정 구체예에서, 최적의 알코올 생산성은 아세테이트와 같은 산(들)의 공동생산과 연관이 있다. 따라서, 아세테이트와 같은 산성 대사산물이 생산되면 시간이 경과함에 따라 발효 브로쓰의 pH를 저하시키는 결과를 초래할 것이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 생성물은 배양체에 의해 산:알코올의 생성물 비율이 바람직하게 적어도 1:1; 또는 적어도 1:2; 또는 적어도 1:3; 또는 적어도 1:4; 또는 적어도 1:5 ; 또는 적어도 1:10; 또는 적어도 1:20이 되도록 생산되며 pH는 미생물 배양체에 의한 산 생산 결과로 변화될 것이다.

발효 브로쓰의 pH는 1종 이상의 산이나 염기 또는 이들의 조합의 소비 또는 생산고 같은 여러가지 영향으로 인해 변화될 수 있다. 예를 들어, 미생물이 성장하는 동안 미생물 배양체에 의한 질소 고정으로 인해 pH가 저하될 수 있다. 특정 구체예에서, 클로스트리듐 오토에타노게눔과 같은 일산화탄소 영양 미생물은 질소를 NH3의 형태로 흡수할 수 있는데 이는 경시적으로 발효 브로쓰의 pH 저하를 초래한다. 포스페이트 및/또는 락테이트와 같은 다른 대사산물 역시도 미생물 배양체에 의해 생산 및/또는 소비될 수 있으므로, 발효 브로쓰의 pH에 영향을 미치게 된다. 아세테이트는 일반적으로 아세톤 생산균에 의한 발효시 중요한 생산물이고, 일반적으로 pH에 가장 큰 영향을 끼치는 것으로 인식되어 있다.

따라서, 특정 구체예에서, 본 발명은 기질을 최적 농도로 또는 최적 농도가 되도록 또는 최적 농도 범위에서 제공하는 방법을 제공하며, 이 방법은 pH 변화를 소정의 변화 속도로 또는 소정의 변화 속도가 되도록 유지시키는 것을 포함하여 이루어진다. 특정 구체예에 따라, 어떤 주어진 미생물 배양쳬에 대한 소망되는 pH 변화 속도는 대수적으로 구할 수 있다. 예를 들어, 최적의 성장 및/또는 소망되는 대사산물 생산을 위해 최적량의 기질을 미생물 배양체에 공급하여 pH 변화를 모니터링할 수 있다. 발효가 진행되는 동안 산성 및/또는 염기성 성분들이 미새물 배양체에 의해 생산 및/또는 소비되어, 경시적으로 pH가 변화된다. 이러한 (소정의) 또는 측정된 pH 변화 속도는 이번에는 후속적인 발효 공정에서 미생물 배양체에 대한 기질 공급을 제어하는데 이용될 수 있다.

특정 구체예에서, 기질이 최적 공급된 미생물 배양체는 성장하여 알코올 (예컨대 에탄올) 및 산 (예컨대 아세테이트)을 비롯한 대사산물을 생산한다. 대사산물의 정상상태 생산기간 동안, 산(들)의 생산량은 실제로 일정하게 유지되어 pH 변화 속도가 실제로 일정하게 된다. 만일 pH가 소정의 변화 속도보다 빨리 저하되면, 배양체에 의해 더 많은 산(들)이 생산되는 것으로 판단하여 기질 공급을 최적 수준이 되도록 증가시킬 수 있다. 만일 pH가 소정의 변화 속도보다 느리게 저하되면, 산(들)이 배양체에 의해 보다 느린 속도로 생산되는 것으로 유추할 수 있으며 따라서 기질 공급을 최적 속도가 되도록 감소시킬 수 있다. 만일 pH가 증가하면 배양체에 의해 산(들)이 소비되는 것으로 유추할 수 있으므로 기질 공급을 최적 속도가 되도록 감소시킬 수 있다.

또 다른 구체예에서, 실제로 일정한 pH를 유지하기 위해 산 또는 염기를 첨가함으로써 pH 변화를 저지할 수 있다. 이러한 구체예에서는, 발효시 첨가되는 산/염기 비율을 이용하여 최적 기질 공급량을 구할 수 있다.

특정 구체예에서, 놀랍게도 미생물 성장과 알코올 생산은 pH를 소정 수준으로 또는 소정 범위로 유지시킴으로써, 기질, 특히 CO 함유 기질을 소망되는 수준으로 공급함으로써 최적화시킬 수 있는 것으로 인식되었다. 아세테이트와 같은 산성 대사산물의 실질 생산이나 소비가 일어나지 않도록 함으로써, pH를 소정 수준으로 또는 소정 범위로 유지할 수 있다. 이러한 구체예에서, pH의 변화속도는 0에 가깝다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라, 기질 공급을 증가시켜야 한다. 반대로, 만일 발효시, pH가 증가하기 시작하면, 아세테이트와 같은 산(들)이 에탄올과 같은 알코올(들)로 순전환(net conversion)되는 것으로 유추할 수 있으며 배양체에 기질이 과다공급되는 것으로 유추할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라, 기질 공급을 감소시켜야 한다.

이러한 조절 방법은 배양체의 기질 요구사항이 경시적으로 변화하기 때문에, 성장중인 미생물 배양체에 있어서 특히 중요하다. 예를 들어, 만일 배양체가 뱃치 공정으로 성장한 경우, 어떤 한 시점에서의 기질의 최적 수준은 나중 시점에서는 기질의 제한량(limiting amount)가 될 수 있다. 대수 성장기에서는, 요구되는 기질의 최적량 역시도 실제로 대수적으로 증가할 것으로 여겨진다. 연속식 공정에서는 정상상태에서조차, 다이나믹 배양 상태는 미생물 배양체의 작은 변화에 응답하여 최적 수준이나 최적 수준이 되도록 또는 최적 수준 범위로 기질 공급을 연속적으로 공급할 수 있음을 의미한다.

기질의 최적 공급은 또한 발효 공정상의 요구조건에 따라 달라지기도 한다. 예를 들어, 뱃치식 발효(또는 연속 배양의 뱃치상 스타트업)에서는 아세테이트가 순생산 또는 소비되지 않도록 하여 pH의 변화가 일어나지 않도록 기질을 공급하는 것이 소망될 수 있다. 연속식 공정에서는, 안정한 배양 상태가 유지될 수 있도록 아세테이트를 소량으로 연속적으로 생산하는 것이 소망될 수 있다.

이에 더하여 또는 별법으로, 아세테이트 및 예컨대 락테이트와 같은 기타 산 또는 NH3과 같은 염기와 같은 대사산물의 축적 및/또는 소비를 공지 기술에 의해 모니터링하여 대사산물 수준에 응답하여 기질 공급을 제어할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 선택적 프로브(들) 예컨대 전류측정 프로브를 이용하는 GC, HPLC, GCIR, GCMS, LCMS, NIR 또는 당업자에게 익숙한 기타 분석법과 같은 다양한 분석 기술을 이용하여 발효조 내의 아세테이트 및/또는 락테이트 농도를 주기적으로 그리고 실제로 연속적으로 모니터링할 수 있다. 대사산물의 농도를 바이오리액터 중의 발효 배지 중에서 및/또는 바이오리액터에 존재하는 배지에서 (예컨대 연속식 발효로부터의 생성물 스트림) 모니터링하여 배지 중에서 측정된 대사산물에 기초하여 기질 수준을 최적화하 수 있다. 예를 들어, 만일 아세테이트가 소정의 역치를 초과하여 배지 중에 축적되기 시작하면, 본 발명의 방법에 따라 기질 공급을 증가시킬 수 있다. 마찬가지로, 만일 아세테이트 농도가 소정의 또는 예정된 역치 미만으로 저하하면, 기질 공급을 감소시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 정상상태에서, 기질이 최적 수준으로 또는 최적 수준이 되도록 제공되면, 아세테이트는 소정 농도 범위 즉 약 1-10g/L, 또는 약 2-8g/L, 또는 약 3-7g/L, 또는 약 4-6g/L으로 유지된다.

특정 구체예에서, 정상 상태에서, 기질이 최적 농도로 또는 최적 농도가 되도록 제공되면, 아세테이트는 발효 브로쓰에서 약 10g/L, 또는 약 9g/L, 또는 약 8g/L, 또는 약 7g/L, 또는 약 6g/l, 또는 약 5g/L으로 유지된다. 특정 구체예에서, 배양체가 아세테이트와 같은 산(들)을 2g/g 바이오매스/일 미만, 또는 1.5g/g/일 미만 또는 1.2g/g/일 미만, 또는 1g/g/일 미만의 특이 속도로 생산하면, 기질을 최적 수준으로 또는 초적 수준이 되도록 제공한다.

따라서, 본 발명의 방법에 따라, 배지의 pH를 표시자로서 이용하여 배양체에 실질적으로 최적량의 기질을 공급하거나 또는 적어도 최적 범위로 기질을 공급할 수 있다. 또한, 배지를 소망되는 pH에서 또는 소정의 pH 범위로 유지함으로써, 기질 공급, 특히 CO 함유 기질 공급을 최적화시킬 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에 따라, 미생물 발효를 개선하는 방법은 미생물 배양체에 의한 수소(H2) 생산을 모니터링하여 H2 생산에 기초하여 기질 공급량을 조절하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, CO를 함유하되 H2는 최소량으로 함유하거나 함유하지 않는 기질이 최적 수준으로 또는 최적 수준이 되도록 또는 최적 수준 범위로 제공되면 H2가 1종 이상의 일산화탄소 영양미생물에 의해 생산된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 제한된 기질 공급 기간 동안, 클로스트리듐 오토에타노게눔과 같은 일산화탄소 영양 세균은 기질의 일부를 산(들) 및 소량의 알코올(들)과 가튼 생성물로 변환시키고 추가 부분은 세포 물질(성장)의 혐기적 생산에 지향된다. 이러한 제한된 기질 공급 기간 동안, H2는 실제로 생산되지 않는다. 놀랍게도, 기질 공급이 최적 수준이 되도록 증가되는 경우, 클로스트리듐 오토에타노게눔과 같은 일산화탄소 영양세균이 기질의 일부를 산(들) 및 알코올(들)과 같은 생성물로 전환시키고, 또 다른 일부는 세포 재료로 전환시키겨 또 다른 일부는 H2로 전환시키는 것으로 밝혀졌다. 특정 구체예에서, 기질, 특히 CO 함유 기질이 최적 수준 또는 최적 수준이 되도록 또는 최적 수준 범위로 제공되면, 에탄올과 같은 목적하는 대사산물에 더해 H2가 생산된다. 또한, CO 함유 기질을 과잉공급하면 하이드로게나제 효소(들)이 억제됨으로 해서 배양체에 의해 생산되는 H2의 양이 감소되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따라, 배양체에 의해 생산되는 H2를 모니터링함으로써, 기질을 최적 농도로 또는 최적 농도 근방으로 또는 최적 농도 범위로 제공할 수 있다.

기질이 CO를 포함하는 특정 구체예에서, 기질 이용성이 최적량 (또는 최적 수준 이상으로) 증가함에 따라, 과량의 CO가 하이드로게나제 효소(들)을 억제하게 되고 실제로 H2 생산이 방지된다. 하이드로게나제 효소(들)이 억제됨에 따라, 미생물들은 과량의 환원력을 발산하지 못하게 됨으로 해서, 성장 억제 및/또는 미생물 사멸과 같은 배양상의 문제점이 초래된다.

따라서, 본 발명의 방법에 따라, 미생물 배양체에 의해 생산되는 수소는 배양체에 실제로 기질이 최적량으로 공급되는지 또는 적어도 최적 범위로 공급되는지를 나타내는 표시자로서 이용될 수 있다. 뿐만 아니라, 미생물 배양체에 의한 수소 생산을 이용하여 미생물 배양체에 공급되는 기질을 조절할 수 있다. 예컨대, 수소 생산이 관찰될 때까지, 기질 제한된 배양체에 대한 기질 공급량을 증가시킬 수 있다. 수소 생산이 개시되면, 경시적으로 수소 생산이 유지되도록 기질 공ㄱ브을 조절할 수 있다. 미생물 배양체가 성장함에 따라, 기질 공급을 증가시켜 수소 생산을 유지할 수 있다.

이러한 조절 방법은 성장하는 미생물 배양체에서 특히 중요한데, 이는 배양체의 기질 요구사항이 경시적으로 변화하기 때문이다. 예를 들어, 어떤 한 시점에서의 기질의 최적 수준은 만일 배양체가 성장한다면, 나중 시점에서는 기질의 제한량이 될 수 있다. 대수 성장기 동안에는, 필요한 기질의 최적량 역시도 실제로 대수적으로 증가할 것으로 여겨진다.

하이드로게나제 효소는 가역적이기 대문에, 미생물 배양체는 수소를 함유한느 기질 스트림의 수소 성분을 에너지원으로서 이용할 수 있는 것으로 인식되었다. 따라서, 특정 구체예에서, 최적화 방법은 CO를 함유하되, 수소는 최소량 함유하거나 실제로 함유하지 않는 기질을 이용한다.

정의

달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 하기의 용어들은 하기와 같이 정의된다:

발효 공정에 대하여 사용되는 용어 "효율을 증가시키는", "증가된 효율" 등은 하기의 것들 중 하나 이상을 증가시키는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 발효를 촉매하는 미생물의 성장 속도, 소비되는 기질(예, 일산화탄소)의 체적 당 생성되는 원하는 생성물(예, 알코올)의 체적, 원하는 생성물의 생성 속도 또는 생성 수준, 및 발효의 다른 부산물과 비교한 원하는 생성물의 상대적 비율. 마찬가지로, "최적화(optimisation)" 또는 이와 유사한 용어는 주어진 일련의 발효 조건들에서 최대 효율이 되도록 효율을 증가시키는 것을 포함한다.

용어 "일산화탄소를 포함하는 기질" 등은 일산화탄소가 예를 들어 성장 및/또는 발효를 위한 한 종 이상의 균주에 이용가능하게 되는 어떠한 기질을 포함하는 것으로 이해된다.

용어 "일산화탄소를 함유하는 가스상 기질"은 일산화탄소를 포함하는 어떠한 가스를 포함한다. 일반적으로, 상기 가스상 기질은 충분한 비율, 바람직하게는 적어도 약 5 부피% 내지 약 100 부피%의 CO를 함유하게 된다.

발효 생성물의 문맥에서, 본 원에서 사용되는 용어 "산"은 카르복시산 및 관련 카르복시산염 음이온, 예를 들어, 본 원에서 기재한 바와 같이 발효액에 존재하는 유리 아세트산과 아세테이트의 혼합물을 포함한다. 상기 발효액에서 카르복시산염에 때한 분자 산의 비율은 그 시스템의 pH에 의존한다. 용어 "아세테이트"는 아세테이트 단독 및 분자 또는 유리 아세트산과 아세테이트의 혼합물, 예를 들어, 본원에서 기재한 바와 같이 발효액에 존재하는 아세테이트와 유리 아세트산의 혼합물 모두를 포함한다. 상기 발효액에서 아세테이트에 대한 분자 아세트산의 비율은 그 시스템의 pH에 의존한다.

용어 "바이오리액터"는 하나 이상의 용기 및/또는 탑 또는 배관 장치로 구성되는 발효 장치로서, 연속 교반 텡크 반응기(CSTR), 고정 셀 반응기(ICR), 살수층 반응기(TBR), 이동층 바이오필름 반응기(MBBR), 버블 칼럼, 가스 리프트 발효조, 중공 섬유 막 반응기(HFMBR)와 같은 막 반응기, 정적 혼합기, 또는 기-액 접촉에 적당한 다른 용기 또는 장치를 포함한다.

본 발명에서 "질량 전달(mass transfer)"라는 용어는 원자나 분자 특히 기질의 원자나 분자의 가스상으로부터 수용액으로의 전달과 관련한 것이다.

달리 나타내지 않는 경우, 본 원에서 사용되는 용어 "발효하는", "발효 공정" 또는 "발효 반응" 등은 공정의 성장 단계 및 생성물 생합성 단계를 모두 포함하는 의미이다. 본 원에서 더욱 설명하는 바와 같이, 일부 구체예에서 상기 바이오리액터는 제 1 성장반응기 및 제 2 발효 반응기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 발효 반응에 금속 또는 조성물을 첨가하는 것은 이러한 반응기중 어느 하나 또는 둘 모두에 첨가하는 것을 포함하는 것으로 이해하여야 한다.

하기의 설명은 본 발명의 특정 구체예, 즉, 일차 기질로서 CO를 이용한 에탄올/아세테이트의 제조에 초점을 둔 것이지만, 본 발명은 다른 알코올 및/또는 산의 제조에 적용할 수 있고 당업자가 알고 있는 바와 같이 다른 기질을 이용할 수 있다는 것을 알아야 한다. 예를 들어, 이산화탄소 및 수소를 함유하는 가스상 기질을 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명은 부틸산염, 프로피온산염, 카프로산염, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 제조하기 위한 발효에 적용될 수도 있다. 또한, 상기 방법은 수소를 제조하는데 이용될 수도 있다. 예를 들어, 이러한 생성물들은 무렐라(Moorella), 클로스트리디아(Clostridia), 루미노코커스(Ruminococcus), 아세토박테리움(Acetobacterium), 유박테리움(Eubacterium), 부티로박테리움(Butyribacterium), 옥소박터(Oxobacter), 메타노사시나(Methanosarcina), 및 디설포토마큐럼(Desulfotomaculum) 유래의 미생물을 이용한 발효를 통해서 제조될 수도 있다.

본 발명의 특정 구체예는 하나 이상의 공업적 공정을 통해 제조되는 가스 흐름을 사용하는데 적합하다. 이러한 공정으로는 제강 공정, 특히 높은 CO 함량 또는 예정 수준(즉, 5%) 이상의 CO 함량을 갖는 가스 흐름을 제조하는 공정이 있다. 이러한 구체예에 따라, 아세트산생성 세균을 이용하여 하나 이상의 바이오리액터에서 산 및/또는 알코올, 특히 에탄올 또는 부탄올을 제조하는 것이 바람직하다. 당업자는 본 발명이 내연 기관을 갖는 엔진의 가스 흐름을 비롯한 여러 가지 산업 및 폐가스 흐름에 적용될 수 있다는 것을 알게 된다. 또한, 당업자는 본 발명이 동일 또는 상이한 미생물들을 이용하는 것들을 비롯한 다른 발효 반응에도 적용될 수 있다는 것을 알게 된다. 따라서, 본 발명의 범위는 설명한 특정 구체예 및/또는 적용으로 제한되지 않고 더욱 넓은 의미로 이해되어야 하는데, 예를 들어, 가스 흐름의 소스는 제한되지 않고, 그의 적어도 한 성분이 발효 반응을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 자동차 배기 가스 및 고체적 CO-함유 공업적 배연 가스와 같은 가스상 기질로부터 에탄올 및 다른 알코올의 제조 및/또는 총괄 탄소 포착을 개선하기 위한 특별한 이용가능성이 있다.

발효

가스상 기질로부터 에탄올 및 다른 알코올을 제조하는 방법이 알려져 있다. 예시적인 공정으로는 그 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 WO2007/117157호, WO2008/115080호, US 6,340,581호, US 6,136,577호, US 5,593,886호, US 5,807,722호 및 US 5,821,111호에 기재된 것들이 있다.

다수의 일산화탄소 영양 혐기성 세균들이 n-부탄올 및 에탄올을 비롯한 알코올 및 아세트산으로의 CO의 발효를 수행할 수 있는 것으로 알려져 있고 본 발명에서 사용하기에 적당하다. 본 발명에서 사용하기에 적당한 이러한 세균의 예로는 WO 00/68407호, EP 117309호, US 특허 제 5,173,429호, 5,593,886호 및 6,368,819호, WO 98/00558호 및 WO 02/08438호에 기재된 것들을 비롯한 클로스트리듐 륭달리, 클로스트리듐 카복시디보란스(Liou 외, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33: pp 2085-2091), 클로스트리듐 라그스달리(WO/2008/028055) 및 클로스트리듐 오토에타노게눔(Abrini 외, Archives of Microbiology 161: pp 345-351)의 균주와 같은 클로스트리듐 속의 세균이 있다. 다른 적당한 세균으로는 무렐라 속 HUC22-1(Sakai 외, Biotechnology Letters 29: pp 1607-1612)를 비롯한 무렐라 속 및 카복시도세무스 속(Svetlichny, V.A., Sokolova, T.G. et al (1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260)의 세균이 있다. 다른 예로는 무렐라 서모아세티카, 무렐라 서모오토트로피카, 루미노코커스 프로덕터스, 아세토박테리움 우디, 유박테리움 리모섬, 부티리박테리움 메틸로트로피컴, 옥시박터 페니기(Oxobacter pfennigii), 메티노사시나 바케리(Methanosarcina barkeri), 메타노사시나 아세티보란스, 디설포토마컬럼 쿠즈네소모가 있다(Simpa 외, Critical Reviews in Biotechnology, 2006 Vol. 26. Pp41-65). 또한, 당업자가 이해하고 있는 바와 같이 다른 일산화탄소 영양세균 및/또는아세트산생성 혐기성 세균이 본 발명에 적용될 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 또한, 본 발명은 두 종 이상의 세균의 혼합 배양액에도 적용될 수 있는 것으로 이해된다.

본 발명에 사용하기에 적당한 한가지 예시적인 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔이다. 일 구체예에서, 상기 클로스트리듐 오토에타노게눔은 기탁번호 19630하에서 독일 생물자원 센터(DSMZ)에 기탁된 균주의 특성을 갖는 클로스트리듐 오토에타노게눔이다. 또 다른 구체예에서, 상기 클로스트리듐 오토에타노게눔은 DSMZ 기탁번호 DSMZ 10061의 특징을 갖는 클로스트리듐 오토에타노게눔이다. 본 발명의 방법에 사용되는 세균을 배양하는 것은 혐기성 세균을 이용하여 기질을 배양 및 발효하는 분야에서 알려진 임의의 수의 공정들을 이용하여 수행될 수 있다. 예시적인 기법들이 하기의 실시예에서 기재되어 있다. 예를 들어, 발효에 가스상 기질을 이용하는 하기의 논문들에 일반적으로 기재된 공정을 이용할 수 있다: (i) K. T. Klasson 외, (1991). Bioreactors for synthesis gas fermentations resources. Conservation and Recycling, 5; 145-165; (ii) K. T. Klasson 외, (1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations. Fuel. 70. 605-614; (iii) K. T. Klasson 외, (1992). Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; (iv) J. L. Vega 외, (1989). Study of Gaseous Substrate Fermentation: Carbon Monoxide Conversion to Acetate. 2. Continuous Culture. Biotech. Bioeng. 34. 6. 785-793; (v) J. L Vega 외, (1989). Study of gaseous substrate, fermentations: Carbon monoxide conversion to acetate. 1. Batch culture. Biotechnology and Bioengineering. 34. 6. 774-784; (vi) J. L Vega 외, (1990). Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations. Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160. 상기 논문들은 모두 본 원에 참조로 포함된다.

발효는 연속 교반 탱크 반응기(CSTR), 고정 셀 반응기, 가스 리프트 반응기, 버블 칼럼 반응기(BCR), 막 반응기, 예를 들어 중공 섬유 막 반응기 (HFMBR) 또는 살수층 반응기(TBR)와 같은 어떤 적당한 바이오리액터를 이용하여 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 일부 구체예에서, 상기 생물 반응기는 미생물이 배양되는 제 1 성장 반응기, 및 상기 성장 반응기로부터의 발효액이 공급되고 발효 생성물(예, 에탄올 및 아세테이트)의 대부분이 생성되는 제 2 발효 반응기를 포함할 수 있다.

본 발명의 여러 가지 구체예에 따라, 발효 반응을 위한 탄소원은 CO를 함유하는 가스상 기질이다. 상기 기질은 공업적 공정의 부산물로 얻어지거나 자동차 배기 가스와 같은 또 다른 소스로부터 얻어지는 CO-함유 폐가스일 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 공업적 공정은 제강 공장과 같은 제1철 금속 생성물의 제조, 비제1철 생성물의 제조, 석유 정제 공정, 석탄의 기화, 전력 생산, 카본 블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산 및 코크스 제조로 구성되는 군에서 선택된다. 이러한 구체예에서, 상기 CO-함유 가스는 대기로 방출되기 전에 임의의 편리한 방법을 이용하여 공업적 공정으로부터 포착할 수 있다. 상기 CO-함유 기질의 조성에 따라, 상기 기질을 발효 공정에 도입하기 전에 이를 처리하여 분진 입자와 같은 임의의 원치 않는 불순물들을 제거하는 것이 바람직할 수도 있다. 예를 들어, 상기 가스상 기질은 공지된 방법을 이용하여 여과 또는 세정할 수 있다.

별법으로, 상기 CO-함유 기질은 바이오매스의 기화로부터 얻어질 수 있다. 상기 기화 공정은 공기 또는 산소를 제한적으로 공급하면서 바이오매스를 부분적으로 연소하는 것을 포함한다. 일반적으로, 얻어지는 가스는 주로 CO 및 H2를 포함하고, 최소 체적의 CO2, 메탄, 에틸렌 및 에탄을 포함한다. 예를 들어, 사탕수수로부터 설탕 또는 옥수수 또는 곡물로부터 전분과 같은 식량의 추출 및 가공 동안에 얻어지는 바이오매스 부산물 또는 임업에서 발생되는 비식품 바이오매스를 기화하여 본 발명에서 사용하기에 적당한 CO-함유 가스를 생성할 수 있다.

일반적으로, 상기 CO-함유 기질은 주요 비율의 CO, 예를 들어 적어도 약 20 부피% 내지 약 100 부피%, 40 내지 95 부피%, 40 내지 70 부피%, 및 40 내지 65 부피% CO를 함유한다. 특정 구체예에서, 상기 기질은 25 부피%, 30 부피%, 35 부피%, 45 부피%, 또는 50 부피% CO를 포함한다.

상기 기질이 수소를 함유할 필요는 없지만, H2의 존재는 본 발명에 따른 생성물 형성에 해롭지 않아야 한다. 특정 구체예에서, 상기 기질 흐름은 저농도의 H2, 예를 들어, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만의 H2를 포함하거나 수소가 실질적으로 없다. 또한, 상기 기질은 일정량의 CO2, 예를 들어 약 1 부피% 내지 약 80 부피% CO2, 또는 1 부피% 내지 약 30 부피% CO2를 함유할 수도 있다.

특정 구체예에서, pH를 이용하여 기질 공급을 조절할 경우, 기질은 H2를실질량으로 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 수소가 존재하면 총괄적인 알코올 생산 효율이 개선된다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 기질은 H2:CO를 약 2:1 또는 1:1 또는 1:2의 비율로 함유할 수 있다.

일반적으로, 일산화탄소를 가스 상태로 발효 반응에 첨가하게 된다. 그러나, 본 발명의 방법은 이러한 상태의 기질의 첨가로 제한되지 않는다. 예를 들어, 일산화탄소는 액체 상태로 첨가될 수 있다.

예를 들어, 액체를 일산화탄소 함유 가스로 포화시키고 그 액체를 바이오리액터에 첨가할 수 있다. 이는 표준 방법을 이용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 이러한 목적을 위해 마이크로버블 분산 발생기(Hensirisak 외, Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3 / October, 2002)를 사용할 수 있었다.

일반적으로, 가스/액체 인터페이스를 통한 유효한 질량 전달이 일어나도록, 가스상 기질을 1종 이상의 미생물을 함유하는 수성 발효 브로쓰에 공급한다. CO함유 기질의 수성 발효 브로쓰 내로의 질량전달 효율을 증가시키기 위한 많은 방법이 알려져 있으며, 이러한 방법 모두가 개별적으로 명시되는 것과 같은 취지로 본 발명에 모두 병합된다. 특정 구체예에서, CO 함유 기질의 질량전달 속도는 본 발명의 방법에 따라 기질이 최적 속도로 또는 최적 속도가 되도록 제공되는 방식으로 조절된다.

세균의 성장 및 CO에서 알코올로의 발효를 일으키기 위하여, CO 함유 기질 가스 외에도 적당한 액체 영양 배지를 바이오리액터에 공급할 필요가 있다는 것을 알 수 있다. 영양 배지는 사용되는 미생물의 성장을 가능하게 하기에 충분한 비타민 및 미네랄을 함유한다. 단독 탄소원으로 CO를 이용한 에탄올의 발효에 적당한 혐기성 배양액이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 적당한 배양액이 전술한 미국특허 제 5,173,429호 및 593,886호 및 WO 02/08438호, WO2007/115157호, WO2008/115080호 및 WO2009/022925 호에 기재되어 있다.

발효는 원하는 발효가 일어나는 적절한 조건하에서 수행되는 것이 바람직하다(예를 들어, CO에서 에탄올로의 발효). 고려되어야 하는 반응 조건은 압력, 온도, 가스 유속, 액체 유속, 배지의 pH, 배지의 산화환원 전위, 교반 속도(연속 교반형 탱크 반응기를 이용하는 경우), 접종 수준, 액체상의 CO를 확실히 제한하지 않도록 하는 최대 가스 기질 농도, 및 생성물 억제를 회피하기 위한 최대 생성물 농도가 있다. 적당한 조건은 WO02/08438호, WO07/117157호, WO08/115080호 및 WO2009/022925 호에 기재되어 있다.

최적 반응 조건은 사용되는 특정 미생물에 부분적으로 의존하게 된다. 그러나, 특정 구체예에서, 발효는 주변 압력보다 높은 압력에서 실시된다. 증가된 압력에서 조작하면, 에탄올의 제조를 위한 탄소원으로 미생물에 의해 흡수될 수 있는 기체상에서 액체상으로의 CO 전달 속도가 유의적으로 증가할 수 있다. 이는 바이오리액터가 상압이 아닌 승압에서 유지되는 경우 체류 시간(입력 가스 유량으로 나눈 바이오리액터내 액체 체적으로 정의됨)이 감소될 수 있다는 것을 의미한다.

수성 배지 내로의 CO의 질량전달 속도는 CO 함유 가스상 기질의 분압과 비례하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 불활성 성분과 같은 원치 않는 성분의 제거 또는 부화(enrichment)에 의해 가스 흐름 중의 CO의 비율을 증가시킴으로써 질량전달속도를 증가시킬 수 있다. 이에 더해서, CO의 분압은 가스상 기질 흐름의 압력을 증가시킬 수 있다.

또한, 승압에서 가스에서 에탄올로의 발효를 수행하는 이점이 설명되어 왔다. 예를 들어, WO 02/08438호는 150 g/l/day 및 369 g/l/day의 에탄올 생산성을 가정하여 각각 30 psig 및 75 psig의 압력하에서 수행되는 가스에서 에탄올로의 발효를 기재하고 있다. 그러나, 대기압에서 유사한 배지 및 입력 가스 조성을 이용하여 수행되는 발효는 하루에 리터당 10 내지 20 배 적은 에탄올을 생성하는 것으로 확인되었다.

또한, CO-함유 가스 기질의 도입 속도는 액상에서 CO의 농도가 확실히 제한되지 않을 정도인 것이 바람직하다. 이는 CO가 제한된 조건의 결과 에탄올이 배양액에 의해 소모될 수 있기 때문이다.

생성물의 회수

발효 반응의 생성물은 알려진 방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예시적인 방법으로는 WO07/117157호, WO08/115080호, US 6,340,581호, US 6,136,577호, US 5,593,886호, US 5,807,722호 및 US 5,821,111호에 기재된 것들이 있다. 그러나, 간략히 예를 들면, 분별 증류 또는 증발 및 추출 발효와 같은 방법을 통해 발효액으로부터 에탄올만을 회수할 수 있다.

발효액으로부터 에탄올을 증류하면 에탄올과 물의 공비 혼합물(즉, 95% 에탄올 및 5% 물)이 얻어진다. 무수 에탄올은 당업계에서 알려져 있는 분자체 에탄올 탈수 기술을 이용하여 차후에 얻어질 수 있다.

추출 발효 과정은 발효 유기체에 대한 저독성 위험을 방지하는 수혼화성 용매를 이용하여 묽은 발효액으로부터 에탄올을 회수하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이러한 형태의 추출 공정에서 사용될 수 있는 용매는 올레일 알코올이다. 올레일 알코올은 발효조에 연속적으로 도입되기 때문에, 이러한 용매는 발효조의 상부에 층을 형성하고, 상기 층은 원심분리기를 통해 연속적으로 추출 및 공급된다. 다음에, 물 및 세포가 상기 올레일 알코올로부터 용이하게 분리되고 발효조로 귀환되는 반면에 올레일 함유 용매가 플래시 증발 장치로 공급된다. 상기 에탄올의 대부분은 증발 및 응축되는 반면에 상기 올레일 알코올은 비휘발성이고 회수되어 발효에 재사용된다.

또한, 발효 반응에서 부산물로 생성되는 아세테이트는 당업계에 알려진 방법을 이용하여 발효액으로부터 회수할 수도 있다. 예를 들어, 활성탄 필터를 포함하는 흡착 장치를 이용할 수도 있다. 이러한 경우, 적당한 분리 장치를 이용하여 발효액으로부터 미생물 세포를 우선 제거하는 것이 바람직하다. 생성물 회수를 위해 세포가 없는 발효액을 발생하는 다수의 여과 기반 방법들이 알려져 있다. 다음에, 얻어지는 세포가 없는 에탄올 함유 및 아세테이트 함유 투과물은 활성탄을 함유하는 칼럼을 통과하여 아세테이트가 흡착된다. 염 형태(아세테이트)이 아닌 산 형태(아세트산)의 아세테이트는 활성탄에 더욱 용이하게 흡착된다. 따라서, 발효액의 pH는 활성탄 칼럼에 통과하기 전에 3 미만으로 감소시켜서 아세테이트의 대부분을 아세트산 형태로 전환하는 것이 바람직하다. 활성탄에 흡착된 아세트산은 당업계에 알려진 방법을 이용하여 용리시켜 회수할 수 있다. 예를 들어, 에탄올을 이용하여 결합 아세테이트를 용리시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 발효 공정 그 자체에 의해 생성되는 에탄올을 이용하여 아세테이트를 용리시킬 수 있다. 에탄올의 비점은 78.8 ℃ 이고 아세트산의 비점은 107 ℃ 이므로, 에탄올 및 아세테이트는 증류와 같은 휘발성 기반 방법을 이용하여 서로 쉽게 분리될 수 있다.

또한, 발효액으로부터 아세테이트를 회수하기 위한 다른 방법들이 당업계에 알려져 있고 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,368,819호 및 6,753,170호는 발효액으로부터 아세트산의 추출을 위해 사용될 수 있는 용매 및 공용매계를 기재하고 있다. 에탄올의 추출 발효에 대하여 기재된 올레일 기반 용매계의 예로서, 미국특허 제 6,368,819호 및 6,753,170호에 기재된 계는 아세트산 생성물을 추출하기 위하여 발효 미생물의 존재 또는 부재하에서 발효액과 혼합될 수 있는 수비혼화성 용매/공용매 계이다. 다음에, 상기 아세트산 생성물을 함유하는 용매/공용매는 증류를 통해 발효액으로부터 분리된다. 다음에, 제2 증류 단계를 이용하여 용매/공용매 계로부터 아세트산을 정제할 수 있다.

발효 반응의 생성물(예컨대 에탄올과 아세테이트)는 발효 바이오리액터로부터 브로쓰 부분을 연속적으로 제거하여, 브로쓰로부터 미생물 세포를 제거하고 (간편하게 여과에 의한다), 이와 동시에 또는 순차적으로 qmfhTM로부터 1종 이상의 생성물을 회수함으로써, 발호 브로쓰로부터 회수할 수 있다. 에탄올의 경우 증류에 의해 간편하게 회수할 수 있으며 아세테이트는 전술한 방법을 이용하여 활성 챠콜 상에 흡착시키는 방식으로 회수할 수 있다. 분리된 미생물 세포는 발효 바이오리액터로 되돌릴 수 있다.에탄올과 아세테이트를 제거하고 남은 무세포 삼출물 역시도 발효 바이오리액터로 되돌리는 것이 바람직하다. 이것을 바이오리액터에 되돌리기에 앞서서, 영양 배지를 보충하기 위해 이 무세포 삼출물에 부가적인 영양 성분 (예컨대 비타민 B)를 첨가할 수 있다. 또한, 활성 챠콜에 대한 아세트산의 흡착을 증대시키기 위해 브로쓰의 pH가 전술한 바와 같이 조정되는 경우, 이를 바이오리액터에 되돌리기 전에, 발효 바이오리액터 중의 브로쓰의 pH와 유사한 pH가 되도록 재조정하여야만 한다.

기질 공급 조절

본 발명의 몇가지 측면에 따라, 기질의 미생물 발효의 총괄적 수율을 개선시키는 방법이 제공되는데, 이 방법은 기질을 실제로 최적 수준으로, 최적 수준을 향햐도록 또는 최적 수준 범위로 제공하는 것을 포함하여 이루어진다. 본 발명의 특정 구체예에서, 기질은 CO를 함유하며 아세톤생산균과 같은 1종 이상의 일산화탄소 영양균에게 제공된다. 적절한 혐기성 조건 하에서, 클로스트리듐 오노에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리, 클로스트리듐 락스달레이 및 클로스트리듐 카르복시디보란스와 같은 아세트산 생산균은 CO 함유 기질을 산 및 알코올을 포함하는 생성물로 전환시킨다. 특정 구체예에서, 본 발명은 배양체의 생존능 및 에탄올과 같은 바람직한 대사산물의 생산을 촉진시키기 위하여 기질이 최적 수준으로, 최적 수준을 향하여 또는 최적 수준 범위가 되도록 제공함으로써 기질, 특히 CO 함유 기질의 미생물 발효를 최적화하는 방법을 제공한다.

미생물 배양체가 생성물로 전환시키기 위하여 이용할 수 있는 기질의 양을 최적 수준으로 또는 최적 수준 범위가 되도록 증가시키면 미생물 성장 속도, 대사산물의 성장 속도 및/또는 산(들)에 비해 알코올(들)의 생산량이 상대적으로 증가되는 것으로 나타났다. 본 발명의 특정 구체예에서, 생성물은 배양에 의해 산:알코올의 바람직한 생산 비율이 적어도 1:1; 또는 적어도 1:2; 또는 적어도 1:3; 또는 적어도 1:4; 또는 적어도 1:5; 또는 적어도 1:10; 또는 적어도 1:20의 비율로 생산된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 알코올(특히 에탄올)은 산(특히 아세트산)의 부수적 생산 없이 생산된다.

특정 구체예에서, 미생물 배양체는 기질 흡수를 조절할 수 없다. 따라서, 기질 공급이 과다하면 성장 억제 및/또는 미생물 사멸과 같은 배양상의 문제점이 일어날 수 있다.

CO 함유 기질은 일반적으로 가스상 형태로 제공되며 미생물 배양체의 CO 이용능은 발효 시스템의 질량전달 특성에 의존한다. 예를 들어, 발효 브로쓰 중에 현탁된 미생물 배양체가 CO를 이용할 수 있는 이용능은 온도, 브로쓰 조성, 가스 공급속도, 가스 조성, CO 증기압, 혼합 등과 같은 당업자에게 알려진 몇가지 인자에 의존한다. 따라서, 미생물 발효시 이용가능한 CO를 증가시키기 위해서는 기질 공급속도의 증가 및/또는 기계적으로 교반된 바이오리액터의 교반속도 증가와 같은, 장치의 질량전달 특성의 개선을 필요로 한다.

배양체의 생존능, 미생물 성장 및/또는 알코올과 같은 소망되는 생성물의 생산을 유지하기 위해, 배양체는 기질을 최적 수준으로, 최적 수준이 되도록 또는 최적 수준 범위로 이용할 수 있어야만 한다. CO 공급이 부적절한 (준최적:sub-optimal) 미생물 배양체는 잘 성장하지 않고, 생존능도 낮으며 및/또는 산(들) 특히 아세테이트와 같이 덜 바람직한 생성물을 주로 생산하게 된다. 뿐만 아니라, 성장속도와 대사산물의 생산 속도 역시도 적정량 또는 최적량의 기질이 공급된 미생물 배양체에 비해 실제로 낮을 수 있다. 특정 구체예에서, 미생물 배양체는 기질 흡수를 조절할 수 없다. 따라서, 기질 공급이 과다하면 성장 억제 및/또는 미생물 사멸과 같은 배양상의 문제점이 일어날 수 있다.

미생물 배양체가 생성물로 전환시키기 위하여 이용할 수 있는 기질의 양을 최적 수준으로 또는 최적 수준 범위가 되도록 증가시키면 산(들)에 비해 알코올(들)의 생산량이 상대적으로 증가되는 것으로 나타났다. 본 발명의 특정 구체예에서, 알코올(특히 에탄올)은 산(특히 아세테이트)의 부수적 생산 없이 생산된다.

본 발명은 기질이 최적 수준으로, 최적 수준이 되도록 또는 최적 수준 범위로 실질적으로 연속적으로 공급되도록, 기질, 특히 CO 함유 기질을 공급하는 것을 조절하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 발효 배지의 pH를 일정 수준으로 또는 일정 범위로 또는 소정의 변화 속도로 유지시킴으로써, 기질을 최적 수준으로, 또는 최적 수준 범위로 제공한다.

미생물 배양체가 생성물로 전환시키기 위하여 이용할 수 있는 기질의 양을 최적 수준으로 또는 최적 수준 범위가 되도록 증가시키면 산(들)에 비해 알코올(들)의 생산량이 상대적으로 증가되는 것으로 나타났다.

또 다른 구체예에서, 미생물 배양체는 최적의 작업 동안 pH가 변화하도록 1종 이상의 산 및/또는 염기 성분을 생산하거나 소비할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라, 기질은 pH 변화가 실제로 소정의 변화 속도로 변화하거나 또는 소정의 변화 속도가 되도록 변화하도록 공급될 수 있다. 이러한 구체예에서, 유지가능한 미생물 성장 및 소망되는 대사산물의 생산은 경시적으로 pH의 순변화(net change)가 일어나도록, 1종 이상의 산 및/또는 염기의 생산 및/또는 소비와 연관될 것이다. 특정 구체예에서, 클로스트리듐 오토에타노게눔과 같은 일산화탄소 영양미생물은 알코올(예컨대 에탄올)과 산(예컨대 아세테이트)을 동시에 생산한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 생성물은 배양체에 의해 산:알코올의 바람직한 생산 비율이 적어도 1:1; 또는 적어도 1:2; 또는 적어도 1:3; 또는 적어도 1:4; 또는 적어도 1:5; 또는 적어도 1:10; 또는 적어도 1:20의 비율이 되도록 생산된다. 뿐만 아니라, NH3과 같은 염기성 성분의 소비와 연관된 pH 변화도 있을 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서, 정상 상태의 연속 발효가 일어나는 동안, 일정한 pH를 유지하는데 적합한 pH를 갖는 신선한 배지를 지속적으로 첨가하거나 염기를 첨가하는 것을 통해 pH를 조절하지 않는 한, pH의 순감소(net decrease)가 일어날 것이다.

발효장치의 pH는 일반적으로 아세테이트 및/또는 락테이트와 같은 산 화합물의 생산에 의해 영향을 받으며 이보다 덜하기는 하지만 NH3, 포스페이트등과 같은 염기성 또는 산성 화합물의 소비에 의해서도 영향을 받는다. pH 변화 속도는 산성/염기성 화합물의 이러한 생산 속도 및/또는 소비 속도에 의존한다. 특정 구체예에서, 아세톤생산 미생물은 대사산물로서 아세테이트를 생산하며 이는 경시적인 pH 변화에 있어서 최대의 변화에 책임이 있는 것이다.

주어진 발효 장치에서, pH 변화 속도는 기질이 최적 속도로 공급될 경우 실험적으로 구할 수 있다. 예컨대, 1종 이상의 일산화탄소 영양미생물의 배양체에 기질이 최적 수준 또는 최적 수준을 향해 제공되면, 에탄올과 아세테이트가 특정 속도로 생산될 수 있다. 발효 브로쓰의 pH는 아세테이트 존재량에 따라 달라지며 이보다 덜하기는 하나 NH3과 같은 다른 존재하는 산이나 염기 성분의 양에도 영향을 받는다. pH의 변화 속도는 발효 브로쓰의 완충능력과 개시시점의 pH에 의해 의존하는 것으로 인식되었다. 예를 들어,잘 완충된 발효 브로쓰 중의 아세테이트 축적은 pH 변화를 작게 및/또는 느리게 유발할 것이다. 반대로, 실질적으로 완충된 발효 브로쓰 중의 아세테이트 축적은 pH 변화를 크게 및/또는 빠르게 유발할 것이다. 따라서, 최적 기질 공급시 pH의 변화 속도는 주어진 발효 장치에 예정된다.

또한 pH 변화가 작으면 발효에 해로운 영향을 미칠 수 있는 것으로 인식되었다. 따라서, 산 생산을 통한 pH 변화는 NH4OH와 같은 염기의 첨가에 의해 저지될 수 있다. 따라서, 연속적으로 작동하는 발효 장치의 pH는 최적의 pH 작동 파라미터 내로 유지될 수 있다. 예를 들어, 클로스트리듐 오토에타노게눔의 최적 작동 pH는 실험적으로 약 5-5.5인 것으로 측정되어 왓다. 특정 구체예에서, 소망되는 범위는 최적 작동 pH의 ±0.5 유닛이다. 여러가지 일산화탄소 영양세균의 최적 작업 PH는 Henstra et al . Current Opinion in Biotechnology , 2007, 18:200-206에 설명되어 있다.

따라서, 기질 공급의 제어는 여러가지 대체적인 메카니즘을 이용하여 유지될 수 있다. 예를 들어, 이것은 pH 변화 속도를 측정하거나, pH 변화를 저지하는데 필요한 산/염기의 양을 측정하거나 또는 배양체에 의해 생산되는 아세테이트의 양을 측정함으로써 가능하다.

따라서, 정상상태 조건 하에서, 산은 실질적으로 일정한 속도로 생산되어, 발효 브로쓰 내에서 실제로 일정한 농도가 된다. 특정 구체예에서, 1종 이상의 일산화탄소 영양미생물에 의하여 기질을 1종 이상의 알코올(들) 및/또는 산(들)을 포함하는 생성물을 생산하도록 발효시킴에 있어서, 바이오리액터에 대한 CO 함유 기질의 공급을 최적화하는 방법이 제공되며, 이 방법은 제1 시점과 제2 시점에서의 바이오리액터 중의 산 수준을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 제1 시점과 제2 시점 사이의 산 수준이 변화하면 변화가 기질 공급을 변화시키는 것이다. 따라서, 산(아세테이트)의 수준이 경시적으로 증가하면, 산 생산을 둔화시켜 경시적으로 산을 소망하는 수준 또는 범위로 되돌리도록, 기질 공급을 증가시킬 수 있다. 반대로, 산 수준이 감소하면, 기질 공급을 감소시켜, 산 생산을 촉진할 수 있다. 특정 구체예에서, 아세테이트는 발효 브로쓰 1 L당 약 10g/L, 또는 약 9g/L, 또는 약 8g/L, 또는 약 7g/L, 약 6g/L, 또는 약 5g/L의 실제로 일정한 농도로 유지된다. 특정 구체예에서, 아세테이트는 소정 농도 범위, 예컨대 발효 브로쓰 1 L 당 약 1-10g/L, 또는 약 2-8g/L, 또는 약 3-7g/L, 또는 약 4-6g/L의 농도 범위로 유지된다.

또한, 특정 구체예에서, 아세테이트와 같은 1종 이상의 산(들)의 생산 속도는 발효 브로쓰 중의 미생물 농도에 의존하는 것으로 인식되었다. 특정 구체예에서, 아세테이트의 특이적 생산성은 2g/g 바이오매스/일 미만, 또는 1.5g/g/일 미만, 또는 1.2g/g/일 미만, 또는 1g/g/일 미만으로 유지되다.

본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, 알코올(특히 에탄올)은 산(특히 아세테이트)의 부수적인 생산 없이 생산된다. 따라서, 기질, 특히 CO 함유 기질이 최적 수준으로 또는 최적 수준 범위로 제공되면, 배지 중의 산 농도(들)의 순변화는 일어나지 않고 배지의 pH는 실제로 일정하게 남아있다. 이러한 구체예에서는, pH의 변화속도는 약 0이다.

본 발명의 그 개시내용 전체가 병합된 Gaddy의 미국특허 7,285,402호에 설명된 바와 같이, 생성물 비율은 부분적으로 배지 조성과도 관련이 있을 수 있는 것으로 인식되었다. 따라서 소망되는 생성물 비율은 발효 장치마다 다를 수 있다. 따라서 최적 수준의 기질 공급과 연계된 pH 변화 속도 역시도 변할 것이다.

만일 발효의 어떤 단계에서든 배양이 기질 제한적이 되면, 배양체는 아세테이트와 같은 산(들)을 생산하여 발효 브로쓰의 pH가 저하된다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라, 순 아세테이트 축적이 중단되어 pH가 안정화되도록 기질 공급을 증가시킬 수 있다.

이에 더하여 또는 별법으로, 만일 기질이 과잉공급되면, 아세테이트가 에탄올로 변환됨에 따라 산(들)의 순 소비가 일어나서 pH가 증가된다. 따라서, 산의 순소비가 중단되어 pH가 안정화되도록 기질 공급을 감소시켜야 한다. 장기간동안 기질이 과다공급되면 성장 억제 및/또는 미생물 사멸과 같은 배양상의 문제점이 일어날 수 있는 것으로 인식되었다.

특정 구체예에서, 기질은 pH가 소망되는 범위로 유지되도록 제공된다. 당업자라면 특정 발효를 수행하기 위한 적절한 pH 또는 pH 범위를 구할 수 있을 것이다. 특정 구체예에서, 예컨대 생성물을 생산하는데 클로스트리듐 오토에타노게눔이 이용되는 경우, 기질은 pH가 5-6 사이; 또는 5.1-5.9 사이; 또는 5.2-5.8 사이; 또는 5.3-5.7 사이; 또는 5.4-5.6 사이; 또는 실제로 5.5에서 유지되도록 제공된다.

pH는 공지 방법으로 측정할 수 있다. 그러나, 예컨대, 발효시의 pH를 측정하는데는 일반적으로 전극 프로브가 이용되며 이러한 프로브의 예는 당업자에게 잘 알려져 있다.

비제한적인 예로서, 다음 조건 하에서 미생물을 배양하는 것을 고려할 수 있다:

1. 제한된 기질(limited substrate):

배양체는 성장하는데 충분하고 생성물(주로 산(들))을 생산하는데 충분한 기질을 갖지만 소망되는 생성물(예컨대 알코올(들))은 충분한 양으로 생산하지 않는다. pH는 소장의 변화 속도보다 빠르게 저하된다. 따라서, 기질 공급을 최적 수준을 향해 증가시킨다.

2. 최적 기질 공급(optimal substrate supply)

배양체는 성장하는데 충분하고 생성물 특히 알코올(들)과 같은 소망되는 생성물을 고속으로(최적의 생산속도에서 또는 적어도 최적의 생산속도를 향해) 생산하는데 충분한 기질을 갖는다. pH는 소정의 변화 속도로 변화한다. 따라서, 기질 공급을 최적 수준으로 유지한다.

3. 기질의 과잉공급(oversupply of substrate)

아세테이트와 같은 산(들)이 에탄올과 같은 알코올로 변환된다. 성장 억제 및 미생물 사멸이 일어날 수 있다. pH는 소정의 변화 속도보다 느리게 저하되거나 또는 증가한다. 따라서, 최적 수준이 되도록 기질 공급을 감소시킨다.

따라서, (전술한) 시나리오 1의 미생물 배양의 경우에는 pH가 안정화하거나 소정 수준으로 복귀되도록 기질의 양을 증가시켜 공급하여야 한다. 이러한 배양은 시나리오 2에서와 같이 최적량의 기질이 공급되도록 고려한다. 뱃치 조건 하에서는, 배양체가 다시 제한적이 될 때까지 계속 성장할 것으로 고려되며, 성장하는 배양체에 경시적으로 기질 양을 증가시켜서, pH가 소정의 범위로 또는 일정하게 유지되도록 하여야 한다. 만일, 하시라도 기질이 과잉공급되면 (시나리오 3), pH가 증가하여 효과적인 성장 및 대사산물 생산이 재개되기에 최적 상태로 되돌아가도록 기질 공급을 감소시켜야 한다.

락테이트와 같은 다른 산성 대사산물은 특히 기질이 과잉광급되는 동안 미생물 배양체에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서, 이 방법은 pH를 모니터링하는 것에 더해서 발효 배지 중의 대사산물의 농도를 모니터링하는 것을 포함한다. 당업자라면 바효 배지 중의 대사산물 농도를 모니터링하는 적절한 방법을 잘 알 것이다. 그러나, 예시적으로, GC, GCIR, GCMS, LCMS, HPLC, NIR과 같은 분석법을 이용할 수 있다.

본 발명의 특정 측면에 따라, 기질의 미생물 발효의 총괄 효율을 개선시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 기질 공급을 실제로 최적 수준으로, 최적 수준이 되도록 또는 최적 범위내로 제공하는 것을 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 기질은 CO를 포함하며 아세톤생산균과 같은 1종 이상의 일산화탄소 영양균에게 제공된다. 적절한 혐기성 조건 하에서, 클로스트리듐 오노에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리, 클로스트리듐 락스달레이 및 클로스트리듐 카르복시디보란스와 같은 아세트산 생산균은 CO 함유 기질을 산 및 알코올을 포함하는 생성물로 전환시킨다. 특정 구체예에서, 본 발명은 배양체의 생존능 및 에탄올과 같은 바람직한 대사산물의 생산을 촉진시키기 위하여 기질이 최적 수준으로, 최적 수준을 향하여 또는 최적 수준 범위가 되도록 제공함으로써 기질, 특히 CO 함유 기질의 미생물 발효를 최적화하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, CO 함유 가스는 H2를 거의 또는 전혀 함유하지 않으며, 예컨대, H2를 5% 미만, 또는 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 2% 미만, 또는 1% 미만 또는 0% 함유한다.

CO 함유 기질은 일반적으로 가스상 형태로 제공되며 미생물 배양체의 CO 이용능은 발효 시스템의 질량전달 특성에 의존한다. 예를 들어, 발효 브로쓰 중에 현탁된 미생물 배양체가 CO를 이용할 수 있는 이용능은 온도, 브로쓰 조성, 가스 공급속도, 가스 조성, CO 증기압, 혼합 등과 같은 당업자에게 알려진 몇가지 인자에 의존한다. 따라서, 미생물 발효시 이용가능한 CO를 증가시키기 위해서는 기질 공급속도의 증가 및/또는 기계적으로 교반된 바이오리액터의 교반속도 증가와 같은, 장치의 질량전달 특성의 개선을 필요로 한다.

배양체의 생존능, 미생물 성장 및/또는 알코올과 같은 소망되는 생성물의 생산을 유지하기 위해, 배양체는 기질을 최적 수준으로, 최적 수준이 되도록 또는 최적 수준 범위로 이용할 수 있어야만 한다. CO 공급이 부적절한 (준최적:sub-optimal) 미생물 배양체는 잘 성장하지 않고, 생존능도 낮으며 및/또는 산(들) 특히 아세테이트와 같이 덜 바람직한 생성물을 주로 생산하게 된다. 뿐만 아니라, 성장속도와 대사산물의 생산 속도 역시도 적정량 또는 최적량의 기질이 공급된 미생물 배양체에 비해 실제로 낮을 수 있다.

본 발명은 기질이 실제로 최적 수준으로, 최적 수준을 향하여 또는 최적 수준 범위로 제공되도록 기질을 실질적으로 연속적으로 제공하도록, 기질, 특히 CO 함유 기질을 공급하는 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 미생물 발효를 개선시키는 방법은 미생물 배양에 의한 수소 생산을 모니터링하여 수소 생산에 기초해서 기질 공급을 조절하는 것을 포함한다.

특정 구체예에서, 기질이 최적량으로 (또는 기질이 최적 수준 범위로) 공급된 미생물 배양체는 성장하여, 알코올과 같은 소망되는 생성물을 최적 속도로 생산할 것이다. 소망되는 대사산물 생산 비율에 더해서, 미생물 배양체는 수소도 생산할 것이다. 일반적으로, 수소는 소량, 예컨대 미생물 배양체에 의해 소비되는 기질의 약 0.5-5 mol%의 양으로 생산된다. 특정 구체예에서, 수소의 생산량이 배양체에 의해 소비되는 기질의 약 1-3%로 유지될 때 미생물 배양체에 기질의 최적량이 제공된다.

비제한적인 예로서, 다음 조건 하에서 미생물을 배양하는 것을 고려할 수 있다:

1. 제한된 기질:

배양체는 성장하는데 충분하고 생성물(주로 산(들))을 생산하는데 충분한 기질을 갖지만 소망되는 생성물(예컨대 알코올(들))은 충분한 양으로 생산하지 않는다. 수소는 무시할만한 양으로 생산되거나 전혀 생산되지 않는다.

2. 최적 기질 공급:

배양체는 성장하는데 충분하고 생성물 특히 알코올(들)과 같은 소망되는 생성물을 고속으로(최적의 생산속도에서 또는 적어도 최적의 생산속도를 향해) 생산하는데 충분한 기질을 갖는다. 수소가 생산된다.

3. 기질의 과잉공급

성장 억제 및 미생물 사멸이 일어날 수 있다. 수소가 생산되지 않는다.

본 발명에 따라, 미생물 배양체에 의해 생산되는 수소는 배양체에 실제로 최적량의 기질이 공급되고 있는지 또는 적어도 최적 수준 범위로 공급되고 있는지를 알려주는 표시자로서 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 미생물 배양체에 의한 수소 생산은 미생물 배양체에 대한 기질 공급을 조절하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 수소 생산이 관찰될 때까지 기질 제한 배양체에 대한 기질 공급을 증가시킬 수 있다. 수소 생산 개시 후, 기질 공급을 조절하여 경시적으로 수소 생산을 유지할 수 있다.

따라서, (전술한) 시나리오 1의 미생물 배양의 경우에는 수소가 배양체에 의해 생산될 때가지 기질의 양을 증가시켜 공급하여야 한다. 이러한 배양은 시나리오 2에서와 같이 최적량의 기질이 공급되도록 고려한다. 뱃치 조건 하에서는, 배양체가 다시 제한적이 될 때까지 계속 성장할 것으로 고려되며, 성장하는 배양체에 경시적으로 기질 양을 증가시켜서, H2 생산이 유지되도록 하여야 한다. 만일, 하시라도 기질이 과잉공급되면 (시나리오 3), H2 생산이 중단되어 효과적인 성장 및 대사산물 생산이 재개되기에 최적 상태로 되돌아가도록 기질 공급을 감소시켜야 한다.

특정 구체예에서, 시나리오 1과 3에서 소량의 수소가 생산될 수 있는 것으로 인식되었다. 그러나, 본 발명의 방법에 따라, 배양체에 의해 생산되는 수소의 양은 배양체가 이용할 수 있는 기질의 양이 최적 수준 (또는 최적 수준 범위로) 증가하거나 감소함에 따라, 증가한다.

특정 구체예에서, 미생물 배양체가 클로스트리듐 오토에타노게눔을 포함하는 경우, 기질 제한 동안 CO의 비흡수율(specific CO uptake)는 일반적으로 1분에 바이오매스 1 그램 당 0.3-0.6 mmol의 CO가 소비되는 것이다 (mmol/g/분). 이러한 기질 제한 조건 하에서는, 클로스트리듐 오토에타노게눔을 함유하는 미생물 배양체는 H2를 전혀 또는 최소량으로 생산한다 (소비된 기질의 0.5 mol% 미만으로). 기질 이용능이 증가함에 따라 배양체에 의해 생산되는 H2는 배양체에 의해 소비된 CO의 적어도 0.5mol%; 또는 적어도 1.0mol%; 또는 적어도 1.5mol%; 또는 적어도 2.0mol%로 증가한다. 일반적으로, 배양체의 비흡수율은 약 0.6 mmol/g/분을 상회하도록 증가된다. 본 발명에 설명된 조건하에서, 클로스트리듐 오토에타노게눔을 함유하는 미생물 배양체는 비흡수율이 적어도 0.6 mmol/g/분으로, 그러나 1.2 mmol/g/분 미만으로 유지될 때 최적의 기질 공급을 갖는다. 비흡수율이 1.2 mmol/g/분을 초과하도록 증가하면, 기질이 과다공급되어 H2 생산이 감소하므로 기질 공급은 감소되어야 한다. 만일 기질 공급이 감소되지 않으면, 성장 억제 및 세포 사멸이 일어난다.

도 1은 본 발명의 구체예에 따른 장치 100의 대표적인 개략도이다. 기질 흐름 1은 적절한 도관 3을 통해 바이오리액터 2 내부로 유입된다. 기지리 흐름 1은 CO를 포함하며 특정 구체예에서는 기질 흐름이 강철의 탈탄(decarburisation)과 같은 산업공정으로부터의 폐가스 흐름이다. 기질 흐름 1은 일정하게 공급된다는 측면에서 일정한 흐름일 수 있지만, 이 흐름의 양은 경시적으로 변할 수 있다.

바이오리액터 2는 원하는 발효 반응을 수행하여 생성물을 생성하도록 구성된다. 특정 구체예에 따라, 바이오리액터 2는 CO를, 1 종 이상의 산 및/또는 알코올을 포함하는 생성물로 전환하도록 구성된다. 바이오리액터 2는 하나 이상의 탱크를 포함할 수 있는데, 각각의 탱크는 하나 이상의 공통 단계를 포함할 수 있는 상이한 발효 반응들을 비롯한, 특정의 발효 공정 및/또는 상이한 반응들에서 동일한 반응 및/또는 상이한 단계들을 수행하도록 구성된다.

산 및/또는 알코올과 같은, 바이오리액터 2에서 생성된 생성물은 당업계에 알려진 임의의 회수 공정을 통해 회수될 수 있다.

발효 배지의 pH는 pH 측정 수단 4에 의해 모니터링될 수 있다. 따라서, 오퍼레이터는 조정 수단 5를 이용하여 바이오리액터 2 및/또는 기질 흐름 1 중의 미생물 배양체 임의로 조절할 수 있음으로 해서, pH 변화에 응답하여 기질이 최적 수준으로, 최적 수준이 되도록 또는 최적 수준 범위로 공급되도록, 미생물 배양체를 유지 또는 통과시킬 수 있다. 배양체에 제공되는 CO 수준을 조정하는 것은 다음 중 한가지 이상의 방법에 의한다, 즉: 발효 브로쓰의 CO 농도를 변화시키거나; 기질 흐름의 조성을 변화시키거나; 기질 흐름의 압력을 변화시키거나; 발효 브로쓰의 교반 속도를 변화시키는 것이 그것이다. 이에 더하여 또는 별법으로, 장치 100은 기질이 최적 수준으로 또는 최적 범위 내로 미생물 배양체에 공급되도록, 발효 브로쓰의 pH를 조정하도록 설정된 임의의 프로세싱 수단 6과 조절 조정 수단 5를 포함한다. 뿐만 아니라, 조정 수단 5는 필요하다면 연속적으로 조정하거나 또는 불연속적인 시점에서 조정하도록 설정될 수도 있다.

또 다른 구체예에서, 4는 바이오리액터 2 중의 아세테이트와 같은 산의 농도를 측정하도록 설정된 측정 수단이다. 산의 농도가 소정의 역치보다 큰 것으로 측정되면, 조정 수단 5는 바이오리액터 2에 대한 기질 공급량을 증가시킬 수 있다. 바이오리액터 2 중의 산의 농도를 측정하기 위해 여하한 측정 수단을 이용해도 무방하다. 그러나, 예를 들자면, HPLC, GCMS, LCMS 및/또는 NIR이 이용될 수 있다.

도 2는 본 발명의 구체예에 따른 장치 100의 대표적인 개략도이다. 기질 흐름 1은 적절한 도고나 3을 통해 바이오리액터 2 내부로 유입된다. 기지리 흐름 1은 CO를 포함하며 특정 구체예에서는 기질 흐름이 강철의 탈탄(decarburisation)과 같은 산업공정으로부터의 폐가스 흐름이다. 기질 흐름 1은 일정하게 공급된다는 측면에서 일정한 흐름일 수 있지만, 이 흐름의 양은 경시적으로 변할 수 있다. 특정 구체예에서, 기질 흐름은 H2를 거의 또는 전혀 함유하지 않으며, 예컨대 H2를 5% 미만, 또는 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 2% 미만, 또는 1% 미만 또는 0% 함유한다.

바이오리액터 2는 원하는 발효 반응을 수행하여 생성물을 생성하도록 구성된다. 특정 구체예에 따라, 바이오리액터 2는 CO를, 1 종 이상의 산 및/또는 알코올을 포함하는 생성물로 전환하도록 구성된다. 바이오리액터 2는 하나 이상의 탱크를 포함할 수 있는데, 각각의 탱크는 하나 이상의 공통 단계를 포함할 수 있는 상이한 발효 반응들을 비롯한, 특정의 발효 공정 및/또는 상이한 반응들에서 동일한 반응 및/또는 상이한 단계들을 수행하도록 구성된다.

산 및/또는 알코올과 같은, 바이오리액터 2에서 생성된 생성물은 당업계에 알려진 임의의 회수 공정을 통해 회수될 수 있다.

발효 반응에서 소비되지 않은 기질 흐름 성분들과 발효 반응의 모든 부산물, 예컨대 CO2 및 H2는 배출구 7을 통해 바이오리액터 2를 빠져나간다. 본 발명의 특정 구체예에서, 측정 수단 8은 배출구 4를 통해 바이오리액터 2를 빠져나가는 배출 흐름 중의 H2 및 임의로 CO 및 CO2 농도를 측정하도록 설정된다. 특정 구체예에서는, 미생물 배양체에 의해 생산되는 수소의 양이 측정된다. 따라서, 오퍼레이터는 조정 수단 9를 이용하여 바이오리액터 2 및/또는 기질 흐름 1 중의 미생물 배양체 임의로 조절할 수 있음으로 해서, 기질이 최적 수준으로, 최적 수준이 되도록 또는 최적 수준 범위로 공급되도록, 미생물 배양체를 유지 또는 통과시킬 수 있다. 배양체를 유지 또는 통과시키기 위해 조정하는 것은 다음 중 한가지 이상의 방법에 의한다, 즉: 발효 브로쓰의 CO 농도를 변화시키거나; 기질 흐름의 조성을 변화시키거나; 기질 흐름의 압력을 변화시키거나; 발효 브로쓰의 교반 속도를 변화시키는 것이 그것이다. 이에 더하여 또는 별법으로, 장치 101은 기질이 최적 수준으로 또는 최적 범위 내로 미생물 배양체에 공급되도록, 배출 흐름의 수소 농도를 측정하기 위한 임의의 프로세싱 수단 6과 조정 수단 9를 포함한다.

특정 구체예에서, 연속적으로 또는 불연속적인 시점에서 바이오리액터 2로부터 방출되는 수소를 모니터링할 수 있다. 뿐만 아니라, 필요하다면 조정 수단 9는 연속적으로 또는 불연속적적인 시점에서 조정되도록 설정될 수도 있다.

배양체에 의해 생산되는 수소를 측정하기 위한 모든 수단을 이용할 수 있으나, 특정 구체예에서는; 바이오리액터 2 및 임의로 기질 흐름 1로부터 빠져나오는 흐름의 H2 농도를 측정하기 위해 한가지 이상의 가스 크로마토그래프를 이용한다. 한가지 구체에에서, 바이오리액터 2로부터 방출되는 흐름 중의 H2 농도를 측정하는 수단은 Varian CP-4900 마이크로 GC이다.

도 1은 본 발명의 한가지 구체예에 따른 개략도이다.
도 2는 본 발명의 한가지 구체예에 따른 개략도이다.
도 3은 실시예 1에 설명된 바와 같은 미생물 성장 및 대사산물의 생산량을 도시한 도면이다.
도 4는 실시예 1에 설명된 바와 같이 CO 소비량과 H2 생산량을 나타낸 도면이다.
도 5는 실시예 2에 설명된 바와 같이 미생물 성장과 대사산물 생산량을 나타낸 도면이다.
도 6은 실시예 2에 설명된 바와 같이 CO 소비량과 H2 생산량을 나타낸 도면이다.
도 7은 실시예 3에 설명된 바와 같이 미생물 성장과 대사산물 생산량을 나타낸 도면이다.
도 8은 실시예 3에 설명된 바와 같이 CO 소비량과 H2 생산량을 나타낸 도면이다.
도 9는 실시예 4에 설명된 바와 같이 미생물 성장과 대사산물 생산량을 나타낸 도면이다.
도 10은 실시예 4에 설명된 바와 같이 발효시의 pH 변화를 나타낸 도면이다.
도 11은 실시예 5A에 설명된 바와 같이 가스 소비량/생산량을 나타낸 도면이다.
도 12는 실시예 5A에 설명된 바와 같이 미생물 성장 및 대사산물 생산량을 나타낸 도면이다.
도 13은 실시예 5B에 설명된 바와 같이 가스 소비량/생산량을 나타낸 도면이다.
도 14는 실시예 5B에 설명된 바와 같이 미생물 성장 및 대사산물 생산량을 나타낸 도면이다.
도 15는 실시예 6에 설명된 바와 같이 가스 소비량/생산량을 나타낸 도면이다.
도 16은 실시예 6에 설명된 바와 같이 미생물 성장 및 대사산물 생산량을 나타낸 도면이다.

실시예

재료 및 방법:

N2 ₂ S _x 의 제조

A 500ml 플라스크에 Na₂S (93.7g, 0.39mol) 및 200ml H₂O를 채웠다. 이 용액을 염이 용해될 때까지 교반하고 황 (25g, 0.1mol)을 일정한 N₂ 흐름 하에 첨가하였다. 실온에서 2시간 교반한 후, 이제 적갈색의 투명 용액이 된 "Na₂S_x" 용액 ([Na]에 대하여 4M 그리고 황에 대하여는 약 5M)을 N₂ 정화된 혈청 보틀에 넣고 알루미늄 호일로 감쌌다.

Cr ( II ) 용액의 제조

1 리터 용량의 삼구목 플라스크에 가스가 샐 수 없는 입구 및 출구를 장착하여 비활성 가스하에서의 작업 및 나중에 원하는 생성물의 적당한 저장 용기로의 운반을 가능하게 하였다. 상기 플라스크에 CrCl₃.6H₂0(4Og, 0.15 mol), 아연 분말 [20 매시](18.3g, 0.28 mol), 수은(13.55g, ImL, 0.0676 mol) 및 500 mL의 증류수를 채웠다. N₂를 이용하여 1 시간 동안 플러싱한 후, 그 혼합물을 약 80 ℃까지 가열하여 반응을 개시하였다. 일정한 N₂ 흐름하에서 2 시간 동안 교반한 후, 그 혼합물을 실온으로 냉각하고 반응 혼합물이 진한 청색 용액이 될 때까지 48 시간 동안 연속적으로 교반하였다. 그 용액을 N₂로 퍼지한 혈청병에 옮기고 사용시까지 냉장고에서 보관하였다.

세균:

사용된 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) 은 19630의 기탁번호로 독일 생물 자원 센터(DSMZ)에 기탁된 것이다.

시료채취 및 분석 과정

각각의 발효 과정동안 일정 간격을 두고 CSTR 반응기로부터 배지 시료를 취하였다. 각각의 경우마다, 가스가 반응기로 유입되거나 유출되지 않도록 주의하면서 배지를 샘플링하였다.

HPLC

HPLC 시스템 Agilent 1100 Series. 이동상: 0.0025N 황산. 유량 및 압력: 0.800 mL/min. 칼럼: Alltech 1OA; Catalog # 9648, 150 x 6.5 mm, 입자크기 5 ㎛. 칼럼의 온도: 60 ℃. 검출기: Refractive Index. 검출기의 온도: 45 ℃.

시료 제조 방법:

400 ㎕의 시료 및 50 ㎕의 0.15M ZnSO₄ 및 50 ㎕의0.15M Ba(OH)₂를 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 로딩한다. 상기 튜브를 12,000rpm 및 4 ℃에서 10 분간 원심분리한다. 200 ㎕의 상층액을 HPLC 바이알에 옮기고, 5 ㎕를 HPLC 기기에 ㅈ주중주입한다.

헤드스페이스 ( Headspace ) 분석:

측정은 두 개의 채널이 설치된 Varian CP-4900 micro GC 상에서 수행하였다. 채널 1은 70℃, 20OkPa 아르곤 및 4.2 초의 백플러시 시간(backflush time)으로 작동하는 10m Mol-sieve 칼럼인 반면, 칼럼 2는 백플러시없이 90℃, 15OkPa 헬륨에서 작동하는 10m PPQ 칼럼이었다. 두 채널에 대한 주입 온도는 70℃였다. 런타임은 120초로 설정하였지만, 모든 중요 피크는 일반적으로 100초 전에 용리하였다.

세포 밀도:

발효 브로쓰의 규정 분취액 중의 세균 세포수를 계수함으로써 세포 밀도를 측정하였다. 별법으로, 시료의 흡수도를 600 nm(분광광도계)에서 측정하고 공개된 공정에 따라 계산하여 건조 질량을 구하였다.

실시예 1 뱃치식 발효

약 1400ml의 용액 A를 1.5L의 발효조에 넣고 질소를 살포하였다. 레사주린 (1.5ml의 2g/L 용액) 및 H₃PO₄ (85% 용액, 2mL)을 첨가하고 진한 NH₄OH(aq)를 이용하여 pH를 5.3으로 조정하였다. 용액의 ORP가 약 -150 mV로 저하될 때까지 염화크롬(II)를 첨가하였다. 소듐 폴리설파이드(4.2ml의 4.3M 용액)를 첨가하고 이 용액에 N2를 살포한 다음, 용액 D (1.5mL), 용액 B (15mL) 및 Na₂WO₃ (1.5ml의 0.01M 용액)를 첨가하였다. 용액 F (15mL)를 첨가하고 pH를 5.5로 조정한 다음 40mL/분으로 CO 함유 가스(50% CO; 50% N2)로 갈아주기 전에 N2를 뿌렸다. 이어서 반응기에 150 ml의 클로스트리듐 오토에타노게눔 배양체를 접종하였다. 바이오리액터를 37℃에서 유지하고 300 rpm으로 교반하였다. 성장상이 진행되는 동안 800 rpm까지 단계별로 교반속도를 증진시켰다.

대사산물 및 미생물 생장 정도를 도 3에 도시하였다. 성장상 (약 0.5일에 개시됨)이 진행되는 동안, 교반 속도 및/또는 가스 유속을 증가시킴으로써 기질 공급을 증가시켰다. 도 3에서, 0.5일과 1.2일 사이에 대수 성장기가 일어났음을 알 수 있다. 배양체에 의하여 수소를 약 1-2.5 mol% 사이의 수준으로 생산하도록 미생물 성장에 따른 기질 공급을 증가시켰다. 제1.2일 후에는 CO 공급은 증가되었으나 H2 생산량은 실질적으로 감소하였는데, 이는 기질이 약간 과잉공급되었음을 가리키는 것이다. H2 생산량 및 CO 소비량을 도 4에 도시하였다. 1.2일 이후에도 배양체는 계속 성장하고 대사산물도 생산된 반면, 성장 속도는 실제로 둔화되어 더 이상 대수 성장기는 아니다. H2가 생산되도록 기질 공급을 조절함으로써, 산의 부수적인 생성 없이 에탄올을 생산한다.

표 1은 수소가 배양체에 의해 생산되도록 기질 공급을 유지함으로써, CO 비흡수율을 0.6mmol/g/분 이상 약 1.2mmol/g/분 이하의 높은 수준으로 유지할 수 있음을 보여준다.

실시예 2

배지를 pH 5.5에서 다음과 같이 제조하였다. 시스테인-HCl을 제외하고 용액 E의 모든 성분들을 400 ml 증류수에 혼합하였다. 이 용액을 비등 열처리한 다음 95% CO, 5% CO2 가스를 지속적으로 흘려보내면서 실온 하에 냉각시킴으로써 혐기성으로 만들었다. 일단 냉각된 후, 시스테인-HCl을 첨가하고, 용액의 부피를 1000 ml로 만들기 전에 용액의 pH를 5.5로 조정하였다; 실험 내내 혐기성을 유지시켰다.

상기와 같이 제조한 400ml 용액 E 배지를 1L 들이 바이오리액터에 N2를 끊임없이 흘려주면서 충전시켰다. 400 ml의 클로스트리듐 오토에타노게눔 배양체를 접종하기에 앞서서, 주변압력에서 CO 함유 가스(50% CO; 50%N2)로 갈아주었다. 바이오리액터를 배양 초기에 37℃로 유지하고 400 rpm으로 교반하였다. 성장상 동안, 교반 속도를 400 rpm으로 증가시켰다. pH를 5.3으로 저하시키기 전에 5.5로 유지하였다. 초기 성장상에 이어서, 1일에 약 1 반응기 부피의 희석비율로 신선한 배지를 첨가함으로서 배양을 연속식 작업으로 변경하였다. 신선한 배지는 전술한 바와 같이 제조하였으나, 단 부가적으로 니켈(약 0.5mL/L의 0.1M 용액)을 함유하였다.

초기 성장 단계에 이어서, H2가 연속적으로 생산되도록 기질을 공급함으로써 바이오매스를 일정 수준으로 유지하였다 (도 5 및 도 6 참조). 이 시기 동안, 비흡수율이 약 0.8-0.9mmol/g/분으로 증가되도록 기질 공급을 증가시켰다 (표 2 참조). 에탄올 생산성은 약 9-10g/L/일로 증가된 반면, 아세테이트 생산성은 6-8g/L/일로 유지되었다.

실시예 3

1L 들이 바이오리액터에 N2를 끊임없이 흘려주면서 전술한 바와 같이 제조된 200ml 용액 E 배지를 충전하였다. 400 ml의 클로스트리듐 오토에타노게눔 배양체를 접종하기에 앞서서, 가스를 주변압력에서 CO 함유 가스(50% CO; 20% CO2; 3% H2; 27% N2)로 갈아주었다. 바이오리액터를 배양 초기에 37℃로 유지하고 200 rpm으로 교반하였다. 성장상 동안, 교반 속도를 400 rpm으로 증가시켰다. pH를 5.5로 조정하고 5 M NaOH를 자동 첨가함으로써 유지하였다. 초기 성장상에 이어서, 1일에 대략 1 반응기 부피의 희석비율로 신선한 배지를 첨가함으로서 배양을 연속식 작업으로 변경하였다.

미생물 성장, 대사산물 생산 및 가스 소비량/생산량 데이터를 도 7 및 8에 도시하였다. 교반속도 및 가스 유속을 경시적으로 증가시킴으로써 기질 공급을 증가시켰다. 제 1.9일에, 8시간 동안 2시간마다 교반속도를 100 rpm 증가시켰다. 이 기간 동안, CO 소비량이 증가하고 H2 생산량은 약간 증가하였는데, 이는 CO가 최적 수준으로 공급되거나 최적 수준에 근접함을 가리키는 것이다. 이 기간 동안, CO 비흡수율은 0.6mmol/g/분 이상 0.9mmol/g/분 이하로 증가하였다.

제2.9일에, 가스 흐름을 단계적으로 증가시켰다 (매 2시간 마다 10mL/분씩 증가시킴). 가스 공급 증가 후, CO 소비량이 증가되었으나 H2 생산량은 저감되었다. 도 6은 이 기간 동안의 성장이 둔화되어 바이오매스가 급감함을 보여준다.

실시예 4

약 1400ml의 용액 A를 1.5L 들이 발효조에 넣고 질소를 살포하였다. 레사주린 (1.5ml의 2g/L 용액) 및 H₃PO₄ (85% 용액, 2mL)를 첨가하고 진한 NH₄OH(aq)를 이용해서 pH를 5.3으로 조정하였다. 용액의 ORP가 약 -150 mV로 저하될 때까지 염화크롬(II)를 첨가하였다. 소듐 폴리설파이드(4.2ml의 4.3M 용액)를 첨가하고 이 용액에 N2를 살포한 다음, 용액 B (15mL), 용액 G (1.5mL) 및 Na₂WO₃ (1.5ml의 0.01M 용액)를 첨가하였다. 용액 F (15mL)를 첨가하고 pH를 5.5로 조정한 다음 40mL/분으로 CO 함유 가스(50% CO; 50% N2)로 갈아주기 전에 N2를 뿌렸다. 이어서 반응기에 150 ml의 클로스트리듐 오토에타노게눔 배양체를 접종하였다. 바이오리액터를 37℃에서 유지하고 300 rpm으로 교반하였다. 성장상이 진행되는 동안 800 rpm까지 단계별로 교반속도를 증진시켰다.

대사산물 및 미생물 생장 정도를 도 9에 도시하였다. 성장상 (약 0.5일에 개시됨)이 진행되는 동안, 교반 속도 및/또는 가스 유속을 증가시킴으로써 기질 공급을 증가시켰다. 도 9에서, 0.5일과 1.2일 사이에 대수 성장기가 일어났음을 알 수 있다. 도 10에 도시된 바와 같이 배지의 pH를 약 pH 5 owl 5.6으로 유지시키도록 미생물 성장에 따라 기질 공급을 증가시켰다. 제 0.5일부터는 교반 속도 및/또는 가스 유량 증가에 의해 기질 이용성이 서서히 증가되었다. 제0.5일부터 1.0일까지, 기질은 미생물 성장 및 알코올 생합성에 더해서 아세테이트가 에탄올로 순전환되도록, 기질을 공급하였다. 이 기간 동안, pH는 서서히 약 5.6까지 증가되었다. 제1.0일부터 1.2일까지, 기질 이용성은 실제로 일정하게 유지되었다. 이 기간 동안, 미생물 성장은 실제로 지속적으로 대수적으로 성장하였다. 아세테이트의 순생산이 일어났고 pH는 약 4.9로 저하도었다. 제1.2일 이후에 CO 공급이 증가되었으나; pH는 4.9로부터 약 5.6까지 급속히 증가되었는데, 이는 기질의 과다공급과 연관된 아세테이트의 순소비를 가리키는 것이다. 배양체가 계속 성장하고 대사산물이 1.2일 후에 생산되는 반면, 성장률은 실제로 둔화되어 더 이상 대수 성장기가 아니다.

표 1은 소망되는 범위로 pH가유지되도록 기질 공급을 유지시킴으로써, CO 비흡수율을 적어도 0.6mmol/g/분 이상 약 1.2mmol/g/분 이하의 높은 수준으로 유지할 수 있음을 보여준다.

실시예 5A: CSTR 에 있어서의 연속식 발효

배지를 하기와 같이 제조하였다. 100 ml의 용액 A를 1.7L의 물에 첨가하였다. 85% H₃PO₄ (30mM)를 첨가하고 사용 전에 배지 용액을 121℃에서 30 분간 고압처리하거나 여과하여 멸균하였다. 배지 용액을 3 리터의 CSTR 용기에 무균 및 혐기적으로 옮기고, N₂를 이용하여 연속적으로 살포하였다.

수산화암모늄을 첨가하여 pH를 증가시켰다. 20 ml의 미량 금속 용액 H, 이어서 2mL의 빙초산 및 20 mL의 용액 B를 첨가하였다. 용액이 투명하게 될 때까지 크롬 II를 첨가하였다. 접종에 앞서서, 가스를 2%H2, 33% N2, 45%CO 및 22% CO2로 갈아주었다. 왕성하게 생장중인 클로스트리듐 오토에타노게눔 배양체를 약 12% (v/v)의 수준으로 CSTR에 접종하였다. 이 실험기간 동안, Na2S (0.2M) 용액을 약 0.4ml/시간의 속도로 첨가하였다.

이 미생물 배양액을 약 1일간 뱃치식으로 성장시켰다. 1일째에, 발효를 연속적인 조작으로 스위칭했는데, 하루에 약 1.5 내지 1.8의 반응기 부피의 희석 비율이 되도록 하였다. 본 발명에 따른 미생물 배양액의 요건에 따라 기질 공급을 증가시켰다 (후술함).

발효의 결과를 도 11-12에 나타낸다. 발효 공정 동안 기질 공급 속도와 교반 속도를 pH 변화에 응답하여 자동적으로 증감시켰다. 초기에, 뱃치 성장상에서, 기질 공급을 증가시킴으로써 pH를 자동적으로 약 5.5로 유지시켰다. 연속식 작업으로 발효 공정을 변경시킨 후, 실제로 일정한 pH 변화 속도가 달성되도록 기질을 공급하였다. 변화속도가 증가하면, pH 변화 속도가 소정의 값으로 회귀되도록 기질 공급을 자동적으로 증가시켰다. 반대로, 변화율이 감소하면 (또는 pH가 증가하기 시작하면), 기질 공급이 감소되었다. pH 변화율은 하루에 3 pH 유닛만큼이었다. 지속적인 연속 작업에 의하여 약 3g/L의 적절한 바이오매스, 약 5g/L의 실제로 안정한 아세테이트 농도 및 적어도 10g/L의 실제로 안정한 에탄올 농도가 달성되었다. 이것은 아세테이트 약 2g/g 바이오매스/일 및 약 4g/g 바이오매스/일 에탄올의 비생산성에 상응하는 것이다.

실시예 5B: CSTR 에 있어서의 연속식 발효

실시예 5A로부터 얻은 모든 액상 발효 브로쓰를 GE 헬스케어사의 친수성 Xampler 세포 리사이클 막 (기공크기: 0.1 NMWC, 섬유 내경: 1mm, 막면적: 0.011 m2)이 구비된 3L 들이 CSTR에 넣었다. 발효기를 일정 용량으로 유지되고 2%H2, 33% N2, 45%CO 및 22% CO2를 함유하는 기질 흐름이 연속적으로 공급되도록 하였다. 세포 리사이클 루프는 미생물 바이오매스의 약 70%가 각각의 통과시마다 발효조 내에 유지되도록 작동시켰다.

pH가 실제로 약 5.3으로 유지되도록 기질 가스를 자동 공급하였다. 발효 공정 동안, 만일 pH가 증가하기 시작하면, 기질 공급을 감소시켰다. 반대로, pH가 저하되기 시작하면, 기질 공급을 증가시켰다. 발효 결과를 도 13-14에 도시하였다. 세포 체류 및/또는 미생물 성장의 결과 미생물 밀도가 증가함에 따라 기질 공급은 자동적으로 증가되어 실제로 pH가 일정하게 유지된다. 유입되는 발효 브로쓰의 pH 보다 약간 낮은 pH로 일정하게 유지하면 아세테이트가 에탄올로 순전환된다. 발효기간 동안, 아세테이트는 생산되지 않았으며, 발효조 중의 순 수준(net level)은 5g/L으로 저하된 반면, 에탄올은 적어도 40g/L까지 축적되었다. 이러한 방식으로 발효조를 가동하면 일정한 H2 생산이 결과되었다. 제6일과 제7일 사이에, 배양체에 의해 생산되는 H2의 양은 약 1 mol%였다.

실시예 6: CSTR 에 있어서 연속식 발효

2리터 CSTR을 하기의 조건하에 두었다. 배지를 하기와 같이 제조하였다. 85% H₃PO₄ (30mM)를 용액 A의 1.5L 용액에 첨가하였다. 그 배지의 pH를 NH₄OH의 첨가를 통해 5.3으로 조절하였다. 그 배지 용액을 사용에 앞서 121 ℃에서 30 분간 고압처리하거나 여과하여 멸균하였다. 산화환원 지시약으로 레사주린(Resazurin)을 첨가하였다. 그 배지 용액을 1.5 리터의 CSTR 용기에 무균 및 혐기적으로 옮기고, N₂를 연속 살포하였다. 발효조 내로 옮겨진 후, 그 옮겨진 배지의 환원 상태 및 pH는 프로브를 통해 직접 측정할 수 있었다. 배지를 37℃까지 가열하고 300rpm에서 교반한 다음 미량의 금속 용액 J(1.5mL)와 니트릴로아세테틱산 (0.15M 용액, 0.3 ml)를 첨가하고, 이어서 Na2WO4 (1.5mL의 0.01M 용액), 및 이어서 용액 K(15mL)를 첨가하였다. 접종에 앞서, 가스를 50% N2와 50% CO2로 갈아주었다. 왕성하게 자라는 클로스트리듐 오토에타노게눔 배양체를 약 12% (v/v)의 수준으로 CSTR에 접종하였다. 실험 동안, Na2S (0.2M) 용액을 약 0.3ml/시간의 속도로 첨가하였다.

미생물 배양액을 약 1 일간 뱃치식으로 성장시켰다. 1일째에, 새로운 배지를 공급하여 발효를 연속적인 조작으로 스위칭하였다. 미생물 배양체의 요구사항에 따라 기질 공급을증가시켰다. 발효 결과를 도 15-16에 도시하였다. 초기 안정화 기간에 이어서, 바이오매스가 약 3 g/L로 안정화되는 한편 아세테이트는 약 5 g/L의 농도로 유지되고 에탄올은 15-20 g/L의 농도로 유지되도록 발효시켰다. 약 1.5의 희석률에서, 아세테이트의 특이적 생산성은 약 1.2g/g 바이오매스/일인 반면 에탄올 생산성은 약 4-6g/g 바이오매스/일이었다.

발효 기간 내내 H2 역시도 1 mol%를 초과하는 수준으로 생산되었다.

본 발명은 특정의 바람직한 구체예를 참조로 설명함으로써, 독자가 과도하게 실험하지 않고 본 발명을 실시할 수 있도록 하고자 하였다. 당업자는 구체적으로 기재된 것들 외에도 본 발명이 다른 여러 가지로 변화 및 변경될 수 있다는 것을 알 수 있다. 본 발명은 이러한 모든 변화 및 변경을 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 또한, 명칭, 표제 등은 본 서류의 독자 이해를 강화하기 위해 제공되는 것으로서, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 판단하여서는 아나된다. 전술 또는 후술하는 내용에서 열거된 모든 출원, 특허 및 간행물의 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.

본 명세서에서 어떤 종래 기술에 대한 언급은 그 종래 기술이 전세계의 어느 국가에서 노력의 분야에서 공통되는 일반 상식의 일부를 구성한다는 판단이나 암시가 아니고 이러한 판단이나 암시로 간주하지도 않아야 한다.

본 명세서 및 후술하는 특허청구범위에서, 달리 나타내지 않는 경우, 단어 "포함한다", "포함하는" 등은 배타적인 의미에 반대되는 포괄적인 의미, 즉, "포함하나 이에 제한되지 않는다"의 의미로 해석하여야 한다.

Claims (27)

1종 이상의 일산화탄소 영양미생물(carboxydotrophic microorganism)을 배양함으로써 1종 이상의 알코올(들) 및/또는 산(들)을 포함하는 생성물이 생성되도록 기질을 발효시키는 방법에서 바이오리액터에 대한 CO 함유 기질의 공급을 최적화시키는 방법으로서, 제1 시점과 제2 시점에서의 바이오리액터 중의 산 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 제1 시점과 제2 시점 사이의 산 수준에 변화에 생기면 기질 공급을 변화시키는 것인, 바이오리액터에 대한 CO 함유 기질의 공급을 최적화시키는 방법.

제1항에 있어서, 제1 시점과 제2 시점 사이에 산 수준이 증가되면 기질 공급을 증가시키는 것인 방법.

제1항에 있어서, 제1 시점과 제2 시점 사이에 산 수준이 감소되면 기질 공급을 감소시키는 것인 방법.

산(들) 및/또는 알코올(들)을 포함하는 생성물의 생산을 위하여, 1종 이상의 일산화탄소 영양미생물의 배양체에 의해 바이오리액터에서의 CO 함유 기질의 발효 효율을 증가시키는 방법으로서, 산 수준이 바이오리액터중에서 소정의 역치 농도들 사이로 유지되도록 기질을 공급하는 것인, 바이오리액터에서의 CO 함유 기질의 발효 효율을 증가시키는 방법

제4항에 있어서, 기질 공급은 산 수준의 변화에 따라 자동적으로 조절되는 것인 방법.

제4항 또는 제5항에 있어서, 산 수준은 1-10 g/L 발효 브로쓰의 소정의 역치 농도들 사이로 유지되는 것인 방법.

제4항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 산 수준은 2-8 g/L 발효 브로쓰의 소정의 역치 농도들 사이로 유지되는 것인 방법.

제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 산 수준은 배양체의 pH를 측정함으로써 구하는 것인 방법.

제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 발효는 연속식인 것인 방법.

최적의 기질 공급 수준 및/또는 범위를 구하는 방법으로서, CO 함유 기질의 발효에 의해 알코올:산 생성물이 소망 비율로 생산되도록 바이오리액터 중 1종 이상의 일산화탄소 영양미생물의 배양체에 기질을 공급하는 것을 포함하는 것인, 최적의 기질 공급 수준 및/또는 범위를 구하는 방법.

제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생성물은 알코올(들) 대 산(들)이 적어도 2:1의 비율로 생산되는 것인 방법.

제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생성물은 알코올(들) 대 산(들)이 적어도 3:1의 비율로 생산되는 것인 방법.

산(들) 및/또는 알코올(들)을 포함하는 생성물을 생산하기 위해, 1종 이상의 일산화탄소 영양미생물을 포함하는 미생물 배양체에 의해 CO 함유 기질의 미생물 발효 효율을 개선시키는 방법으로서, 미생물 배양체에 의해 H2가 생산되도록 기질을 제공하는 것을 포함하는 것인, CO 함유 기질의 미생물 발효 효율을 개선시키는 방법

제13항에 있어서, 미생물 배양체에 의해 발효된 기질의 적어도 1.0 mol%의 수준으로 H2가 생산되도록 기질을 제공하는 것인 방법.

제13항 또는 제14항에 있어서, 발효는 연속식인 것인 방법.

제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 산은 아세테이트인 것인 방법.

제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 알코올은 에탄올인 방법.

제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 기질은 가스상인 것인 방법.

제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 기질은 철금속 산물 제조, 비철금속 산물 제조, 퍼트롤륨 정제 공정, 바이오매스의 기화 공정, 석탄의 기화 공정, 전력 생산, 카본 블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산 및 코크 제조로 이루어지는 군으로부터 선택된 사넙 공정의 부산물로서 얻어지는 가스를 포함하는 것인 방법.

제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, CO 함유 기질은 CO를 부피 기준으로 적어도 약 15% 내지 약 95% 함유하는 것인 방법.

제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, CO 함유 기질은 CO를 부피 기준으로 적어도 약 40% 내지 약 70% 함유하는 것인 방법.

제1항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미생물은 클로스트리듐(Clostridium), 무렐라(Moorella), 파이로코커스(Pyrococcus), 유박테리움(Eubacterium), 데술포박테리움(Desulfobacterium), 카르복시도써무스(Carboxydothermus), 아세토게눔(Acetogenium), 아세토박테리움(Acetobacterium), 아세토안에어로븀(Acetoanaerobium), 부티로박테리움(Butyribaceterium) 및 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

제22항에 있어서, 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 륭달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리듐 락스달레이(Clostridium lagsdalei) 또는 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica)인 것인 방법.

i. CO 함유 기질의 발효를 수행하도록 설정된 바이오리액터
ii. 측정 수단; 및
iii. 조절 수단;
을 포함하고, 여기서 상기 조절 수단은 측정 수단에 의한 측정에 응답하여 CO를 포함하는 기질의 공급을 조절하도록 설정되는 것인, 생성물을 생산하기 위해 미생물을 발효시키기 위한 장치.

제24항에 있어서, 측정 수단은 발효시 생산된 1종 이상의 산(들)의 양을 측정하도록 설정된 것인 장치.

제24항에 있어서, 측정 수단은 발효시 pH를 측정하도록 설정된 것인 장치.

제24항에 있어서, 측정 수단은 발효시 생산된 H2의 양을 측정하도록 설정된 것인 장치.

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