KR20120054644A

KR20120054644A - 이량체화 펩티드

Info

Publication number: KR20120054644A
Application number: KR1020127008760A
Authority: KR
Inventors: 하루오 스기야마; 히데오 다카스; 후미오 사미조
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤; 인터내셔널 인스티튜트 오브 캔서 이무놀로지 인코퍼레이티드; 다이닛본 스미토모 세이야꾸 가부시끼가이샤
Priority date: 2003-01-15
Filing date: 2004-01-15
Publication date: 2012-05-30
Also published as: CN1756763A; JP4498274B2; JP2010047603A; US8242084B2; ATE444969T1; BRPI0406800A; EP1584627A1; WO2004063217A1; JP4926231B2; EP1584627B1; BRPI0406800B8; JPWO2004063217A1; HK1081975A1; CN1756763B; EP2154145B1; US20100292164A1; AU2004204031B2; KR20050098863A; DE602004023476D1; CA2513701A1

Abstract

신규의 암 항원 펩티드 및 이 암 항원 펩티드를 포함한 암 백신을 제공하고자 한다. 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하고 7 내지 30 개의 아미노산 잔기로 이루어진 암 항원 펩티드를 형성할 수 있는 2 개의 펩티드 단량체가 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 서로 결합되어 있는 펩티드 이량체.

Description

이량체화 펩티드 {DIMERIZED PEPTIDE}

본 발명은, 암 백신 요법, 좀 더 구체적으로는 세포독성 T 세포 유도 활성을 가진 종양 항원 펩티드를 생산할 수 있는 펩티드 이량체 및 이를 포함한 약학적 조성물에 관한 것이다.

세포성 면역, 특히 세포독성 T 세포 (이하, "CTL"로 칭함) 는 종양 세포 또는 바이러스-감염 세포의 생체내 거부에 중요한 기능을 한다. CTL 은, 암 세포상의 종양 항원 단백질 유래의 항원 펩티드 ("종양 항원 펩티드") 와 MHC (major histocompatibility complex, 주 조직적합성 복합체) 클래스 I 항원 (인간의 경우는 "HLA 항원"이라 함) 간의 복합체를 인식하여, 상기 세포를 공격 및 파괴한다.

종양 항원 단백질의 대표적인 예로서, 문헌 [Immumity, vo1.10:281, 1999] 의 표 중에 기재된 것들을 들 수 있다. 구체적으로는, 멜라닌 세포 (melanocyte) 조직-특이적 단백질인 gp 100 (J. Exp. Med., 179:1005, 1994), MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3515, 1994) 및 티로시나제 (J. Exp. Med., 178:489, 1993), 등의 멜라닌 소체 (melanosome) 항원, 및 흑색종 (melanoma) 이외의 항원 단백질로서 HER2/neu (J. Exp. Med., 181: 2109, 1995), CEA (J. Natl. Cancer. Inst., 87:982, 1995) 및 PSA (J. Natl. Cancer. Inst., 89:293, 1997) 등의 종양 표지자가 있다.

종양 항원 펩티드는, 종양 항원 단백질이 세포 내의 단백질분해효소에 의해 세포내 처리되어 생성될 수 있는 약 8 내지 11 개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드이다(Cur. 0pin, Immunol., 5:709, 1993; Cur. Opin, Immunol., 5:719, 1993; Cell, 82:13, 1995; Immunol. Rev., 146:167, 1995). 상기한 바와 같이, 이렇게 생성된 종양 항원 펩티드가 MHC 클래스 I 항원 (HLA 항원) 와 함께 복합체로서 세포 표면에 제시되어, CTL 에 의해 인식된다. 따라서, CTL 에 의한 종양 세포 파괴를 이용하는 암 면역요법제(암백신)를 개발하기 위해서는, 종양 항원 단백질에서 CTL 을 효율적으로 유도할 수 있는 종양 항원 펩티드를 동정하는 것이, 매우 중요하다.

발명의 개시

본 발명의 한 가지 목적은, 생체내에서 유용한 종양 항원 펩티드로부터 유래되는 신규한 종양 항원을 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 종양 항원 펩티드로 증명된 일부 펩티드가 시스테인 잔기(들)를 포함하고 있고, 이러한 펩티드로 구성된 이량체는 투여시 놀랍게도 단량체와 동등한 CTL 유도 활성 ("CTL-유도 활성") 을 나타내는 것을 발견하고, 본 발명을 확립하였다.

따라서, 본 발명은 하기를 포괄한다.

(1) 각각 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한 7 내지 30 개의 아미노산으로 이루어지고 CTL 유도 활성을 가진 종양 항원 펩티드를 생산할 수 있는 2 개의 펩티드 단량체가 이황화 결합 (disulfide bond) (들)에 의해 서로 결합되어 있는 펩티드 이량체.

(2) 상기 (1) 에 있어서, CTL-유도 활성을 가진 종양 항원 펩티드를 생산할 수 있는 펩티드 이량체.

(3) 상기 (1) 또는 (2) 에 있어서, 2 개의 펩티드 단량체가 1 개 또는 2 개의 이황화 결합에 의해 결합된 펩티드 이량체.

(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드 단량체가 종양 억제 유전자의 발현 산물인 WT1 에서 유래하는 것인 펩티드 이량체.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드 단량체가 하기와 같은 펩티드 이량체:

Cys Xaa Thr Trp Asn Gln Met Asn Xaa (서열번호: 72)

(이때, 위치 2 의 Xaa 는, Tyr, Phe, Met 및 Trp 에서 선택되는 1 개의 아미노산 잔기이고; 위치 9 의 Xaa 는, Phe, Leu, Ile, Trp 및 Met 에서 선택되는 1 개의 아미노산 잔기이다).

(6) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드 단량체가 하기 펩티드들로부터 선택되는 펩티드 이량체:

Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열번호: 11)

Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe (서열번호: 18)

Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr (서열번호: 19)

Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu (서열번호: 20)

Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu (서열번호: 21)

Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열번호: 22)

Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu (서열번호: 23)

Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열번호: 44).

(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 따른 펩티드 이량체와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한 약학적 조성물.

(8) 암백신으로서 사용되는 상기 (7) 에 따른 약학적 조성물.

(9) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 따른 펩티드 이량체의, 암백신의 제조에서의 용도.

(10) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 따른 펩티드 이량체의 치료상 유효량을, 이를 필요로 하는 WT1-양성 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

본 발명의 펩티드 이량체에 있어서, 2 개의 펩티드 단량체는 이 단량체들 사이에 존재하는 1 쌍 이상의 시스테인 잔기의 SH 기들 간의 이황화 결합(들)을 통해 이량체화한다.

본 발명의 펩티드 이량체는 CTL-유도 활성을 가지며, 이렇게 유도된 CTL 은, 세포독성 작용 또는 림포카인 (lymphokine) 생성을 통해 항종양 작용을 발휘할 수 있다. 따라서, 본 발명의 이량체는, 암(종양)의 치료 또는 예방을 위한 암백신으로 사용할 수 있다.

본 발명의 펩티드 이량체를 구성하는 펩티드 단량체는, 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한 7 내지 30 개의 아미노산 잔기로 이루어져 있고, CTL-유도 활성을 가진 종양 항원 펩티드를 생산한다. "종양 항원 펩티드를 생산한다"는 구절은, 상기 펩티드 단량체가 HLA 항원과 결합하여 세포독성 T 세포(CTL)에 의해 인식될 수 있는 종양 항원 펩티드를 생산할 수 있는 특성을 가진 것을 의미한다. 본 발명에서는, CTL 유도 활성을 갖고 있는 한 제한없이 임의의 펩티드 단량체가 사용될 수 있고; 그러나, 인간 윌름스 종양의 종양 억제 유전자 WT1 에서 유래하고 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한 펩티드 단량체가 바람직하다. 상기 종양 억제 유전자 WT1 는 다양한 종류의 종양에서 발현된다(Cell., 60:509, 1990; NCBI 데이터 베이스 등록번호 제 XP_034418, 서열번호: 1). 상기 WT1 유전자는, 윌름스 종양, 무홍채증 (aniridia), 비뇨생식 이상 (urogenital anomaly), 정신 지체 등의 합병증을 수반하는 WAGR 증후군의 분석에 기초하여 윌름스 종양의 원인 유전자 중 하나로서 염색체 11p13 으로부터 분리되었다(Nature, 343:774, 1990). 상기 WT1 의 게놈 DNA 는 약 50 kb 이고, 10 개의 엑손으로 이루어져 있으며, 이의 cDNA 는 약 3 kb 이다. 상기 cDNA 에서 추정된 아미노산 서열은, 서열번호: 1 에 나타난 바와 같다(Cell., 60:509, 1990). 상기 WT1 유전자가 인간 백혈병에서 고도로 발현되며, 상기 백혈병 세포를 WT1 안티센스 올리고머로 처리하면 이의 세포증식이 억제된다는 사실 (JP-A-104627/1997) 로부터, 상기 WT1 유전자는 백혈병 세포의 성장을 촉진하는 것으로 시사되었다. 그 후, 상기 WT1 유전자는, 위암, 결장암, 폐암, 유방암, 배아암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암 및 난소암 등의 고형암에 있어서도 고도 발현되고 있는 사실 (JP-A-104627/1997 및 WO00/06602) 로부터, 백혈병 및 고형암에 있어서의 새로운 종양 항원 단백질로 판명되었다(J. Immunol., 164: 1873-80, 2000 및 J. Clin. Immunol., 20, 195-202, 2000). 암 면역요법(암백신)은 가능한 한 많은 암환자에 대하여 적용가능한 것이 바람직하기 때문에, 많은 종류의 암에서 고도로 발현되고 있는 WT1 로부터의 종양 항원 펩티드의 동정, 및 결과적으로 생성되는 종양 항원 펩티드를 이용한 암백신의 개발은 중요하다. 이것에 관하여, WO 00/06602 및 WO 00/18795 에, WT 1 단백질의 부분적 절편으로 이루어진 수 개의 천연형의 종양 항원 펩티드가 기재되어 있지만, 이들의 생체내에서의 효과에 관해서는 알려진 것이 없다.

본 발명에 사용가능한 기타 펩티드 단량체로서는, 문헌 [Immunity, vo1.10:281, 1999] 의 표 중에 기재된 종양 항원 단백질에서 유래하고 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한 종양 항원 펩티드가 있다.

CTL-유도 활성은, HLA 4량체법(Int. J. Cancer: 100, 565-570 (2002)) 또는 한계 희석법 (Nat. Med.:4, 321-327 (1998)) 에 의해 CTL 의 수를 측정함으로써 확인할 수 있다. 다르게는, 예를 들어 HLA-A24-제한성 CTL-유도 활성의 경우, WO 02/47474 및 문헌 [Int. J. Cancer: 100, 565-570 (2002)] 에 기술된 방법에 따라 HLA-A24 모델마우스를 사용하여 활성을 조사할 수 있다.

상기 펩티드 단량체는 7 내지 30 개, 바람직하게는 8 내지 12 개, 좀 더 바람직하게는 9 내지 11 개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 상기 펩티드 단량체는, HLA 와의 결합에 대한 모티브와 펩티드의 길이를 고려하여, 바람직하게는 1 또는 2 개의 시스테인 잔기를 포함한다.

상기 펩티드 단량체는, 펩티드 화학 분야에서 통상 사용되는 방법에 준하여 합성할 수 있다. 이러한 방법으로서는, 하기를 포함하는 문헌들에서 발견할 수 있다: Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vo1 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen, Inc., 1975; Peptide-Gosei no Kiso to Jikken, Maruzen, Inc., 1985; 및 Iyakuhin no Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa-syoten, 1991).

생성된 펩티드 단량체는, 펩티드 화학 분야에서 통상 사용되는 방법에 준하여 분자 사이의 이황화 결합을 형성하도록 할 수 있다. 이황화 결합의 형성 방법은, 하기를 포함한 문헌들에서 발견할 수 있다: Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vo1 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen, Inc., 1975; Peptide-Gosei no Kiso to Jikken, Maruzen, Inc., 1985; 및 Iyakuhin no Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa-syoten, 1991).

구체적으로는, 1 개의 시스테인 잔기를 포함한 펩티드 단량체는, 예를 들어, 시스테인 측쇄 상의 보호기를 포함하는 모든 보호기를 제거한 후, 생성된 단량체 용액을 알칼리 조건 하에서 공기-산화반응시킴으로써, 또는, 알칼리성 또는 산성 조건하에서 산화제를 첨가하여 이황화 결합(들)을 형성함으로써 합성할 수 있다. 산화제의 예로서, 요오드, 디메틸술폭시드 (DMSO), 페리시안화 칼륨 등을 들 수 있다.

2 개 이상의 시스테인 잔기를 포함한 단량체 펩티드도, 상기한 방법에 따라 합성할 수 있다. 이 경우는, 상이한 결합 양식의 이황화 결합으로부터 생성되는 이성질체가 수득될 수 있다. 시스테인 측쇄에 대한 보호기들의 특정한 조합을 선택함으로써, 원하는 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합이 형성된 이량체를 제조할 수 있다. 상기 보호기 조합의 예로서는, MeBzl (메틸벤질) 기와 Acm (아세트아미드메틸) 기, Trt (트리틸) 기와 Acm 기, Npys (3-니트로-2-피리딜티오) 기와 Acm 기, S-Bu-t (S-tert-부틸) 기와 Acm 기 등을 들 수 있다. 예를 들어, MeBzl 기와 Acm 기의 조합의 경우, 우선 MeBzl 기와 시스테인측쇄 상의 보호기 외의 보호기를 제거한 뒤, 결과적인 단량체 용액을 공기-산화반응시켜 탈보호된 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합(들)을 형성하고, 그 후 요오드로 탈보호 및 산화하여 Acm 기로 보호되어 있던 시스테인 잔기들 사이에 이황화 결합(들)을 형성하는 것을 포함하는 방법으로 상기 제조를 수행할 수 있다.

상기 생성된 펩티드 이량체는, 펩티드 화학 분야에서 통상 사용되는 방법에 준하여 정제할 수 있다. 이러한 정제 방법은, 하기를 포함하는 문헌들에서 발견할 수 있다: Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vo1 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen, Inc., 1975; Peptide-Gosei no Kiso to Jikken, Maruzen, Inc., 1985; 및 Iyakuhin no Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa-syoten, 1991). HPLC 를 사용하는 방법이 바람직하다.

이렇게 생성된 본 발명의 펩티드 이량체는, 시스테인 잔기들 사이의 이황화 결합(들)에 기인하여, 용액 중에서의 산화제 등에 대한 안정성이 뛰어나고, 주어진 품질과 CTL-유도 활성을 유지한다.

본 발명에 사용가능한 바람직한 펩티드 단량체는 예로서 WT1 를 취하여 이하에 나타낸다. 본원에서 사용되는 바, 각 아미노산 잔기를 축약하기 위하여 하기의 1- 또는 3-문자-약어를 사용한다: Ala(A): 알라닌 잔기, Arg(R): 아르기닌 잔기, Asn(N): 아스파라긴 잔기, Asp(D): 아스파르트산 잔기, Cys(C): 시스테인 잔기, Gln(Q): 글루타민 잔기, Glu(E): 글루탐산 잔기, Gly(G): 글리신 잔기, His(H): 히스티딘 잔기, Ile(I): 이소류신 잔기, Leu(L): 류신 잔기, Lys(K): 리신 잔기, Met(M): 메티오닌 잔기, Phe(F): 페닐알라닌 잔기, Pro(P): 프롤린 잔기, Ser(S): 세린 잔기, Thr(T): 트레오닌 잔기, Trp(W): 트립토판 잔기, Tyr(Y): 티로신 잔기, Val(V): 발린 잔기.

하기 표 중, "위치" 라는 용어는 인간 WT1 에 있어서의 펩티드의 위치를 지칭한다.

HLA 분자에는 많은 아형이 존재하고, 각 아형에 결합하는 종양 항원 펩티드의 아미노산 서열은 일정한 규칙 (결합 모티브) 을 따르는 것으로 알려져 있다. HLA-A24 의 결합 모티브가, 8 내지 11 개의 아미노산 잔기들로 이루어진 펩티드 중에서, 위치 2 의 아미노산이 티로신(Tyr), 페닐알라닌(Phe), 메티오닌(Met) 또는 트립토판(Trp)이고, C 말단의 아미노산이 페닐알라닌(Phe), 류신(Leu), 이소류신(Ile), 트립토판(Trp) 또는 메티오닌 (Met) 인 것이 알려져 있다(J. Immunol., 152, p3913, 1994, Immunogenetics, 41, p178, 1995, J. Immunol., 155, p4307, 1994). 따라서, 상기 표 4 에 있는 펩티드 단량체에 더하여, 하기 식의 펩티드 단량체 또한 HLA-24-제한성 펩티드 단량체로서 바람직하게 사용될 수 있다.

Cys Xaa Thr Trp Asn Gln Met Asn Xaa (서열번호: 72)

(이 때, 위치 2 의 Xaa 는, Tyr, Phe, Met 및 Trp 로부터 선택되는 1 개의 아미노산 잔기이고, 위치 9 의 Xaa 는, Phe, Leu, Ile, Trp 및 Met 로부터 선택되는 아미노산 잔기이다).

또한, HLA-A0201 의 결합 모티브로서, 8 내지 11 개 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드에서, 위치 2 의 아미노산이 류신(Leu) 또는 메티오닌(Met)이고, C 말단의 아미노산이 발린(Val) 또는 류신(Leu) 인 것이 알려져 있다. HLA-A0205 의 결합 모티브로서, 8 내지 11 개 아미노산으로 이루어진 펩티드에서, 위치 2 의 아미노산이 발린(Val), 류신(Leu), 이소류신(Ile) 또는 메티오닌(Met)이고, C 말단의 아미노산이 류신(Leu) 인 것이 알려져 있다(Immunogenetics, 41, p178, 1995; J. Immunol., 155: p.4749, 1995). 따라서, 상기 표 2 또는 3 에 나타난 펩티드 단량체의 위치 2 의 아미노산 또는 C 말단의 아미노산을 상기 아미노산 모티브 중 어느 하나로 치환한 펩티드도 HLA-A0201 또는 HLA-A0205-제한성 펩티드 단량체로서 바람직하게 사용될 수 있다.

상기 표 4 에 나타나는 펩티드 단량체가 본 발명에 있어서는 특히 바람직하게 사용된다. 표 4 중, 서열번호:44 의 펩티드는, 서열번호:11 (위치 235 내지 243) 의 위치 236 의 메티오닌을 티로신으로 변경한 비천연의 변이 펩티드이다. 따라서, 본 발명의 펩티드 단량체에는, 천연형 펩티드의 서열 중에서 시스테인 잔기 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경한 서열을 가지며 CTL 유도 활성을 나타내는 것들이 포함된다.

또 다른 구현예로서, 본 발명은 본 발명의 펩티드 이량체와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물 중의 활성 성분으로서 본 발명의 펩티드 이량체의 양은, 치료의 목적, 환자의 연령, 체중등에 따라 다양할 수 있지만, 통상 O.OOO1 ㎎ 내지 1OOO㎎, 바람직하게는 O.OO1 ㎎ 내지 1OOO ㎎, 보다 바람직하게는 0.1 ㎎ 내지 20 ㎎ 이다.

본 발명의 약학적 조성물은, 활성 성분으로서, 본 발명의 펩티드 이량체 외에도 펩티드 단량체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물 중의 "펩티드 이량체" 의 함량은, CTL 유도 활성을 발휘하는 한 제한이 없으나; 전체 펩티드 중50% 이상, 바람직하게는 70 내지 100 %, 좀 더 바람직하게는 80 내지 100 % 일 수 있다. 펩티드 이량체의 함량은, 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 에 의해 확인할 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체는, 세포성 면역을 증강할 수 있는 것들이다. 이러한 담체로서는, 아주반트 (adjuvant) 를 들 수 있다. 아주반트로서는, 문헌 [Clin. Microbiol. Rev., 7:277-289, 1994] 에 기재된 것들이 있고, 구체적으로는, 미생물에서 유래한 성분, 사이토카인, 식물에서 유래한 성분, 수산화알루미늄등의 광물 겔 (mineral gel), 리소레시틴, Pluronic

폴리올 등의 계면활성제, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀션 (에멀션 제제) 등을 들 수 있다. 또한, 리포솜 제제, 직경 수 ㎛ 의 비드에 결합시킨 입자상의 제제, 지질에 결합시킨 제제 등의 제조에 필요한 성분도 담체에 포함된다.

투여는, 예를 들어, 피내, 피하, 근육내 또는 정맥내로 수행할 수 있다. 바람직한 경로는 CTL 을 효율적으로 유도하는 피내 또는 피하 투여이다. 투여 회수 및 투여 간격은, 치료 또는 예방되어야할 질환, 개별적 차이에 따라 적절히 조절할 수 있으나; 바람직하게는 수 일 내지 수 개월에 1회의 간격으로 1 회 이상 투여한다.

예를 들어, WT1 유래의 펩티드 단량체로 이루어진 펩티드 이량체를 포함한 본 발명의 약학적 조성물을 WT1-양성 환자에게 투여하는 경우, 항원-제시 세포의 HLA 항원에 상기 펩티드가 제시되어 복합체가 형성된다. 그 후, 상기 제시된 HLA 항원복합체에 특이적인 CTL 이 증식하여 암 세포를 파괴하고, 이로써, 암이 치료 또는 예방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은, 백혈병, 골수이형성 증후군 (myelodysplastic syndrome), 다발성 골수종 및 악성 림프종 등의 혈액성 암 및 위암, 결장암, 폐암, 유방암, 배아암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암 등의 고형암을 포함하는, WT1 유전자의 발현 수준의 상승과 관련된 암을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.

추가적인 구현예로서, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물을 WT1-양성 환자에게 투여함으로써 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

도 1 은, 형질전환 (transgenic) 마우스에서 펩티드 이량체 (서열번호: 44) 가 CTL 을 유도하는 것을 보여주는 그래프이다.

하기 실시예에 의해 본 발명을 더욱 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예들에 의해 어떤 면으로든 한정되지 않는다.

제조예 1

1. 보호된 펩티드 수지의 합성 (H- Cys ( Trt )- Tyr ( Trt )-( Thr ( tBu )- Trp ( Boc )-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지)

Fmoc-Leu-Alko-수지 (이때, Alko 는 p-알콕시벤질 알콜이다) (12 g) (0.81 mmol/g, Watanabe Chemical Industries, Ltd.) 를 반응 용기 (500 ㎖, ACT90 형 고형상 합성기, Advanced ChemTech) 에 채워 넣고 DMF 등으로 1 회 세척하였다(공정 1). 그 후, 상기 수지를 25% Pip (피페리딘) 으로 처리 (3 분 × 1 회, 및 15 분 × 1 회) 하여 Fmoc 기를 절단하고(공정 2), 다시 DMF 등으로 세척하여 (공정 1), Pip 를 제거하였다. 이 반응 용기에, NMP (N-메틸피롤리디논) (150 ㎖) 중의 Fmoc-Asn(Trt)-OH (29.36 g) 및 HOBT (1-히드록시벤조트리아졸) (7.5 g) 의 용액을 가하였다. DIPCI (N,N'-디이소프로필카르보디이미드) (7.6 ㎖) 를 가한 후, 30 분간 실온에서 교반하였다(공정 3). 30분 후, 상기 수지를 NMP 로 세척하고(공정 4), Fmoc-Asn(Trt)-OH (29.36 g) 과 HOBT (7.5 g) 를 사용하여 다시 한번 커플링 반응을 하여(공정 5), Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko 수지를 합성하였다. 그 후, 공정 2 의 탈보호반응을 수행하여 생성된 수지를 H-Asn(Trt)-Leu-Alko 수지로 변환시켰다. 세척 (공정 1) 후, Fmoc-Met-OH (18.27 g), Fmoc-Gln(Trt)-OH (30.04 g), Fmoc-Asn(Trt)-OH (29.36 g), Fmoc-Trp(Boc)-OH (25.91 g), Fmoc-Thr(tBu)-OH (19.56 g), Fmoc-Tyr(tBu)-OH (22.60 g) 및 Fmoc-Cys(Trt)-OH (28.82 g) 를 순차적으로 가하여, 커플링 반응 (공정 3) 을 수행하였는데, 이때 상기 커플링은 Fmoc-Thr(tBu)-OH 로 3 회 반복하였다. 생성된 수지를 DMF 로 세척한 후, 25% AC₂O (무수아세트산) 로 처리 (15 분 × 2 회) 하여 미반응의 아미노기를 캡핑(capping)하였다. N-말단의 Fmoc-Cys(Trt)-OH 를 축합한 후, 탈보호 반응 (공정 2) 및 세척 (공정 6) 을 수행하여, H-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지를 수득하였다. 상기 합성 방법은 표 33에 요약되어 있다.

합성 방법
공정	시약	처리 회수	시간(분)
1) 세척	DMF	100 ㎖×6	0.3
	MeOH	100 ㎖×1	0.3
	DMF	100 ㎖×3	0.3
2) 탈보호	25% 피페리딘/DMF	100 ㎖	3.0
2) 탈보호	25% 피페리딘/DMF	100 ㎖	15.0
3) 커플링	아미노-보호된 아미노산 (각 5 당량), HOBT (5 당량), DIPCI (5 당량)/NMP	150 ㎖	30 ×1
4) 세척	NMP	100 ㎖×2	0.3
5) 커플링	아미노-보호된 아미노산 (각 5 당량), HOBT (5 당량), DIPCI (5 당량)/NMP	150 ㎖	30 ×1
6) 세척	DMF	100 ㎖×5	0.3
	MeOH	100 ㎖×1	0.3
	DMF	100 ㎖×2	0.3

2. 보호된 펩티드 수지의 탈보호

상기 방법에 따라 수득된 상기 보호된 펩티드 수지 (H-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-수지) (14.06 g) 에 시약 K (5 % 페놀/5 % 티오아니솔/5 % H₂O/2.5 % 에탄디올/TFA 용액, 100 ㎖) 와 트리이소프로필실란 (TIPS, 15 ㎖) 를 가하고, 실온에서 2.5 시간 교반하였다. 그 후, 디에틸에테르 (약 500 ㎖) 를 가한 후, 상기 혼합물을 글라스 필터로 여과하여, 시약 K와 디에틸에테르를 여과액으로서 제거하였다. 상기 필터 상의 잔류물을 디에틸에테르 (약 100 ㎖ × 3) 로 세척한 후, TFA (약 100 ㎖ × 3) 를 가하여 상기 목적 산물을 함유하는 여과액 (300 ㎖) 을 수득하였다. 이 여과액을 농축하여 TFA 를 제거하고, 아세토니트릴 (약 50 ㎖) 및 20% 아세트산 수용액 (약 250 ㎖) 를 첨가한 후, 동결건조하여, 파우더로서의 조 펩티드 (H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH, 서열번호:44) (6.12 g) 를 수득하였다.

3. 조 펩티드의 정제

결과적인 조 펩티드 (749 ㎎) 을 TFA (10 ㎖) 에 용해시키고, 이를, 용액 1 (= H₂O/0.1% TFA) 와 평형을 이루고 있는 HPLC (Shimadzu; LC8AD 형) 의 ODS C₁₈ 컬럼 (5 cm φ × 50 cm L, YMC, Co., Ltd.) 에 HPLC 의 펌프를 이용하여 채워넣었다. 상기 컬럼을 그 상태로 약 30 분간 유지하고, 그 후, 용액 2 (= CH₃CN/0.1 % TFA) 의 농도를 30 분에 걸쳐 0 % 에서 15 % 로 증가시켰다. 그 후, 용액 2 의 농도를 330 분에 걸쳐 28 % 까지 상승시키는 한편, 목적 펩티드를 함유한 용출액을 220 nm 에서의 UV 흡광도로 모니터링하여 상기 목적물을 함유한 분획을 수집하였다. 상기 분획을 수합하고, 용액 1 (= H₂O/0.1% TFA) 와 용액 2 (= CH₃CN/0.1% TFA) 의 혼합물 중의 17 % 용액 2 (= CH₃CN/0.1% TFA) 와 평형된, HPLC (Hitachi, L-4000 형) 에 부착된 ODS C₁₈ 컬럼 (4.6 ㎜ φ × 25 cm L, YMC, Co., Ltd.) 내로 주입한 후, 30 분에 걸쳐 220 nm 에서의 UV 흡광도로 상기 용출액을 모니터링하면서 용액 2 의 농도를 47 % 까지 30분간으로 상승시켜, 유지시간 (retention time) 14.79 분의 정제된 목적 펩티드 단량체 (227.5 mg) 을 수득하였다.

아미노산 분석

가수분해: 1% 페놀/6N 염산 수용액

110 ℃, 10 시간

분석 방법: 닌히드린법

Asx:1.71(2) Thr:0.75(1) Glx:1.07(1) Met:0.91(1) *Leu:(1) Tyr:0.82(1)

*) Leu = 기준 아미노산

괄호( )안의 값: 이론치

질량분석: LC/MS M⁺¹ = 1173.0 (이론치 = 1172.36)

펩티드 서열분석: N-말단으로부터의 두번째 잔기 (Tyr) 에서부터, C-말단의 Leu 까지 순차적으로 서열을 확인하였다.

실시예 1

하기 식의 이량체의 합성:

제조예 1 에서 제조된 펩티드 단량체 (227.5 mg), N-메틸글루카민 (NMG) (227.5 mg) 및 물 (23 ㎖) 의 혼합물을 실온에서 약 2 일간 교반함으로써, 공기 산화를 수행하였다. 그 후, 상기 반응 용액에 물 (5 ㎖) 중의 아세트산 나트륨 (2 g) 수용액을 가하고, 혼합물을 실온에서 약 20 분간 교반하였다. 물 (200 ㎖) 및 아세토니트릴 (약 200 ㎖) 을 가한 후, Kiriyama Roht (여과지 No. 5C) 로 여과하고, 필터 상의 잔류물을 물 (약 50 ㎖ × 3 회) 로 세척하였다. 상기 필터 상의 잔류물을 수집하고, 물 (약 200 ㎖) 을 가하여 동결건조하여, 목적 펩티드 이량체의 조 생성물 (158 mg) 을 수득하였다.

조 펩티드 이량체의 정제

조 펩티드 이량체 (158 mg) 를 DMSO (9 ㎖) 에 용해시키고, 용액 1 (= H₂O/1% AcOH) 와 평형 상태인 HPLC (Shimadzu; LC8AD 형) 의 ODS C₁₈ 컬럼 (5 cm φ × 50 cm L, YMC, Co., Ltd.) 에 HPLC 펌프를 이용하여 채워넣었다. 상기 컬럼을 그 상태로 약 30 분간 유지한 후, 용액 2 (= CH₃CN/1% AcOH) 의 농도를 360 분에 걸쳐 0 % 에서 40 % 까지 상승시켰다. 그 후, 220 nm 에서의 UV 흡광도로 목적 펩티드 이량체를 함유한 용출액을 모니터링하면서, 자동분획수집기에 의해 상기 목적 생성물을 함유한 분획을 수집하였다. 분획을 수합하고, 용액 1 (= H₂O/0.1% TFA) 와 용액 2 (= CH₃CN/0.1% TFA) 의 혼합물 중의 17 % 용액 2 (= CH₃CN/0.1% TFA) 와 평형된, HPLC (Hitachi, L-4000 형) 에 부착된 ODS C₁₈ 컬럼 (4.6 ㎜ φ × 25 cm L, YMC, Co., Ltd.) 내로 주입하였다. 그 후, 30 분에 걸쳐 220 nm 에서의 UV 흡광도로 상기 용출액을 모니터링하면서 용액 2 의 농도를 0 % 에서 47 % 까지 30분간으로 상승시켜, 유지시간이 20.51 분인 정제된 목적 펩티드 이량체 (46.6 mg) 을 수득하였다.

FAB.MS 2365.0 (이론치: 2342.70) Na⁺ F = 0.25 %

시험예 1

펩티드 이량체에 의한 CTL 유도

실시예 1 에서 제조된 펩티드 이량체의 CTL-유도 활성을 HLA-A24 형질전환 마우스 (Int. J. Cancer: 100, 565, 2002) 를 사용하여 평가하였다. 상기 펩티드 이량체를 디메틸술폭시드 (DMS0) 에 용해시켜 40 mg/㎖ 의 펩티드 용액을 수득하였다. 그 후, 이 펩티드 용액 (35 ㎕) 을 10 mM 인산완충액 (pH 7.5) (581 ㎕) 에 첨가하여 펩티드 현탁액을 수득하였다. 상기 생성된 펩티드 현탁액 (550 ㎕) 및 Montanide ISA51 (Seppic 사) (700 ㎕) 을, 연결된 유리 시린지를 사용하여 혼합하여, 투여 용액으로서의 에멀션을 제조하였다.

상기 투여 용액 (200 ㎕) 을 HLA-A24 형질전환 마우스에 꼬리 기부에 피하 주입하였다. 3 마리의 마우스를 사용하였다. 주입 7 일 후, 비장을 제거하고, 비장 세포를 제조하였다. 비장 세포의 일부를 상기 펩티드 이량체 (1OO ㎍/㎖) 로 1 시간동안 펄스하였다. 펩티드로 펄스되지 않은 비장 세포를 24-웰 플레이트에 웰당 7 × 10⁶ 세포로 시딩(seeding)하고, 여기에 상기 언급한 펩티드로 펄스된 비장 세포 (웰당 1 × 1O⁶ 세포) 를 첨가하고, 상기 플레이트를 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션은, 10% FCS, 10 mM HEPES, 20 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 1 mM MEM 비필수 아미노산, 1 % MEM 비타민 및 55μM 2-메르캅토에탄올이 보충된 RPMI1640 배지에서, 5일간 수행되었다.

⁵¹Cr 방출 검정 (J. Immunol.: 159, 4753, 1997) 으로, 상기 배양된 비장 세포에 대하여, 상기 투여에 사용된 펩티드에 대하여 특이적인 세포독성 활성이 있는지 조사하였다. 표적 세포로서는, HLA-A24 와 H2K^b 의 키메라 MHC 클래스 I 분자 (Int. J. Cancer: 100, 565, 2002) 를 안정적으로 발현하도록 EL-4 세포 (ATCC No. TIB-39) 를 형질전환하여 수득된 EL4-A2402/K^b 를 사용하였다. 상기 표적 세포를 ⁵¹Cr (3.7 MBq/10⁶ 세포) 로 표지하고, 상기 펩티드로 100 ㎍/㎖ 가 되도록 1 시간동안 펄스하였다. 대조군에 있어서, 상기 펩티드로 펄스되지 않은 표적 세포를 2 시간동안 ⁵¹Cr 로 표지하였다. 이들 표지된 표적 세포와 먼저 제조된 비장 세포를 1:120 의 비율로 혼합하고, 4 시간동안 배양하고, 상해를 받은 표적 세포의 비율을 기준으로 CTL 활성을 평가하였다. 결과를 도 1 에 나타내었다. 상기 펩티드가 주입된 마우스로부터 제조된 비장 세포는, 펩티드로 펄스된 표적 세포를 강하게 상해하였다. 그러나, 이들은 상기 펩티드로 펄스되지 않은 표적 세포에 대하여는 약한 세포독성을 보였다. 이 결과는 상기 펩티드에 대하여 특이적인 CTL 이 유도된 것을 분명히 나타내었다.

본 발명에 따르면, 생체내 CTL-유도 활성을 가진 펩티드 이량체 및 이를 활성 성분으로서 포함한 약학적 조성물이 제공된다. 본 발명은, 많은 종양 환자들의 질병 상태의 개선에 유용할 수 있다.

<110> Haruo Sugiyama Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha SUMITOMO PHARMACEUTICALS COMPANY, LIMITED <120> Dimerized peptides <130> 664263 <140> PCT/JP2004/000254 <141> 2004-01-15 <150> JP 2003-007122 <151> 2003-01-15 <160> 72 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 1 5 10 15 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 20 25 30 Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45 Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe 85 90 95 Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe 115 120 125 Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile 130 135 140 Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr 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Gly Thr Ala Gly Ala Cys 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 71 Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide Xaa at position 2 means Tyr, Phe, Met or Trp, and Xaa at position 9 means Phe, Leu, Ile, Trp or Met. <400> 72 Cys Xaa Thr Trp Asn Gln Met Asn Xaa 1 5

Claims

HLA-A24 제한성 CTL 의 유도 활성을 갖고 하기의 서열에 의해 나타나는 펩티드 이량체를 유효성분으로 포함하는, 암백신으로 사용되는 약학 조성물:

여기에서, Xaa 가 Tyr 및 Met 로부터 선택되는 아미노산 잔기임.
제 1 항에 있어서, Xaa 가 Tyr 인 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, Xaa 가 Met 인 약학 조성물.