KR20120031496A - 장 투과성의 ｅｇｆｒ 및 ｐａｒ２ 조절 - Google Patents

Abstract

본 발명은 경상피 전기 저항을 증가시켜 감소된 세포 투과성을 초래하는 단계를 포함하여, 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 일본쇄 조눌린에 대해 지시된 항체를 투여함으로써 상피 성장 인자 수용체를 억제하고 PAR₂를 억제하는 단계를 포함하여, 복강 질환(celiac disease)의 치료가 요구되는 개인에서 복강 질환을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

장 투과성의 ＥＧＦＲ 및 ＰＡＲ２ 조절{EGFR AND PAR2 REGULATION OF INTESTINAL PERMEABILITY}

연방 자금 설명

본 발명은 국립 보건원에 의해 지급된 승인 번호 DK048373 하의 정부 지원하에 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.

관련 출원의 교차 참조

본 국제 특허원은 현재 포기된, 2009년 6월 10일자로 출원된 미국 가특허원 일련번호 제61/185,662호의 35 U.S.C. §119(e)하의 우선권의 이익을 청구하며, 이의 전문은 본원에 참조로 도입되어 있다.

발명의 분야

본 발명은 세포 생물학 및 장 투과성의 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 장 투과성의 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 및 프로테이나제 활성화된 수용체(PAR)2 조절에 관한 것이다.

관련 분야의 기술

각종 미생물에 대한 노출을 감소시키는 증가된 위생은 지난 30-40년 동안 개발도상국에서 기록된 알레르기, 염증 및 자가면역병의 '유행'에 대한 원인으로 시사되어 왔다(1). 유전적 기질 및 환경적 매개인자에 대한 노출과는 달리, 세번째 주요 요소, 즉, 증가된 장 투과성(IP)이 이들 질병의 발병기전에서 제안되어 왔다(2-4).

창자세포 및 관강내 가지돌기 세포(luminal dendritic cell)에 의한 항원 샘플링과 함께, 장 투과성은 장 관강과 점막하층 사이에 분자 트래피킹(trafficking)을 조절하여 비-자가 항원에 대한 내성 또는 면역원성을 초래한다(5). 그러나, 세포사이(paracellular) 공간의 치수(10 내지 15Å)는, 15Å을 초과하는 분자 반경(~3.5 kDa)을 가진 용질(단백질 포함)이 일반적으로 이러한 흡수 경로로부터 배제됨을 제안한다. 세포내 밀착 연접(TJ)은 이러한 세포사이 항원 트래피킹을 강력하게 조절한다.

밀착 연접(tight junction)은 생리학적 및 병리학적 상황 둘다에서 장 내피의 몇가지 주요 기능에 작동적인 역동적인 구조이다(3). 그러나, 세포내 밀착 연접의 조성 및 기능에 있어서의 지식에 주요한 진전에도 불구하고, 이들을 조절하는 메카니즘은 여전히 완전하게 이해되어 있지 않다.

밀착 연접 투과성을 증가시키는 독소인, 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae) 조눌라 폐쇄소대 독소(zonula occludens toxin: Zot)의 발견은 세포내 밀착 연접을 조절함으로서 장내 투과성을 가역적으로 조절하는 것으로 알려진 유일한 생리학적 매개인자로서 이의 진핵세포 대응물인, 조눌린의 확인을 가져왔다(6,7). 사람 조눌린은 비-사람 원시 장내 상피에서 장내 투과성을 증가시키는 ~47 kDa 단백질이고(7), 장내 선천적 면역성에 관여하며(8), 복강 질환(celiac disease, CD)(9, 10) 및 제1형 당뇨병(T1D)(11)을 포함하는 밀착 연접 기능장애가 중심이 되는 자가면역 질환에서 과발현된다.

합토글로빈(Hp)은 간 및 동맥 벽, 자궁내막 및 복막에서 주로 합성되는, 급성-상 반응 단백질이다. 합토글로빈의 주요 기능은 간의 세망내피 시스템에서 주로 유리된 헤모글로빈의(Hb)의 말기 프로세싱 및 처리에 요구되는 헤모글로빈 결합 단백질로서이다. 당해 시스템은 Hb 잔기내에 존재하는 철이 보존되도록 한다.

합토글로빈은 이황화물 연결에 의해 연결된 2개의 알파 및 2개의 베타 쇄를 포함하는 사합체 구조를 갖는다. 베타 쇄(245개 아미노산)는, 질량이 약 40 kDa(이중 대략 30%는 탄수화물이다)이고 모든 표현형에 의해 공유된다. 알파 쇄는 2개의 형태: 알파 1(83개 아미노산, 9 kDa) 및 알파 2(142개 아미노산, 17.3 kDa)로 존재하므로 합토글로빈은 Hp1-1, Hp2-1 및 Hp2-2로 언급되는 3개의 표현형으로서 나타난다. Hp1-1은 2개의 알파 1 쇄를 함유하며, Hp2-2는 2개의 알파 2 쇄를 함유하고, Hp2-1은 1개의 알파 1 및 1개의 알파 2 쇄를 함유한다. Hp 1-1은 Hb와 복합체화되는 경우 100 kDa, 또는 165 kDa의 분자 질량을 가진다. Hp 1-1은 단일 이소형(isoform)으로써 존재하고 또한, Hp 이합체로 언급된다. Hp2-1는, 평균 분자량이 220 kDa이며 선형 중합체를 형성한다. Hp2-2는, 평균 분자량이 400 kDa이고 사이클릭 중합체를 형성한다. 각각의 상이한 중합체 형태는 상이한 이소형이다.

합토글로빈은 용혈에 의해 유발된 신장 질환의 잠재적 치료제이다. 이는 유리된 해모글로빈을 제거하는 수단으로서 치료학적으로 잠재적으로 유용하며; 이렇게 형성된 복합체는 소염제, 항산화제 또는 혈관형성제로서 잠재적 추가의 이익을 갖는다. 그러나, 합토글로빈은 이의 생물학적 활성을 보유하면서 대량으로 분리하기 어려운 것으로 고려된다.

당해 분야에서 전-합토글로빈 2의 기능적 특성화 뿐만 아니라 장내 투과성을 조절하는 방법에 대한 인지된 요구가 존재한다. 본 발명은 당해 분야의 이러한 오래된 요구를 충족시킨다.

건강 및 질병에서 장내 투과 조절인자로서의 조눌린의 역활은 기능적인 것으로 기술되어 왔으며, 이의 생화학적 특성화는 규정하기 힘든 것으로 남아있다. 본 발명은, 사람 혈청의 단백질체학적 분석을 통해, 조눌린이 사람 전-합토글로빈의 2개의 유전적 변이체중 하나(HP1과 함께)인, HP2에 대한 불활성 전구체로 지금까지 단지 간주되어 온 분자인 전-합토글로빈(HP)2와 동일함을 입증한다. 본 발명은, 이의 온전한 일본쇄(intact single chain) 전구체 형태에서 PAR₂ 활성화를 통해 EGFR을 전사촉진시킴으로써 장내 투과성을 조절하는 한편, 이의 분해된 2개-쇄 형태는 Hb 스캐빈저로서 작용하는 것으로 여겨지는 다기능성 단백질인 전-합토글로빈 2로서 조눌린(zonulin)의 기능적 특성화를 입증한다.

따라서, 본 발명의 하나의 양태에서, 경상피 전기 저항(transepithelial electrical resistance)을 증가시켜 감소된 세포 투과성을 초래하는 단계를 포함하여, 자가면역 질환을 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 양태에서, 상피 성장 인자 수용체를 억제하는 단계; 및 PAR₂를 억제하는 단계를 포함하여, 자가면역 질환의 치료가 요구되는 개인에서 자가면역 질환을 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명의 여전히 다른 양태에서, 일본쇄 조눌린에 대해 지시된 항체를 투여함으로써 상피 성장 인자 수용체를 억제하고 PAR₂를 억제하는 단계를 포함하여, 복강 질환의 치료가 요구되는 개인에서 복강 질환을 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 및 추가의 측면, 특징 및 장점은 기재 목적을 위해 제공된 본 발명의 본 바람직한 양태의 다음 설명으로부터 명백해질 것이다.

다음 약어가 본원에서 사용될 수 있다. Ab: 항체; EGFR: 상피 성장 인자 수용체; HP: 합토글로빈; IP: 장 투과성; PAR: 프로테이나제 활성화된 수용체; TJ: 밀착 연접; WB: 웨스턴 블롯; CD: 복강 질환.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "a" 또는 "an"은, 특허청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용된 경우, "하나"를 언급할 수 있지만, 이는 또한 "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나 이상"의 의미와 일치한다. 본 발명의 일부 양태는 하나 이상의 성분, 방법 단계들 및/또는 본 발명의 방법들로 이루어질 수 있거나 필수적으로 이루어질 수 있다. 본원에 기술된 특정의 장치, 화합물, 조성물 또는 방법이 본원에 기술된 다른 어떠한 장치, 화합물, 조성물 또는 방법에 대하여 시행될 수 있다고 고려된다.

본원에 사용된 특허청구의 범위의 용어 "또는"은 기재내용이 대안만을 나타내고 또한 "및/또는"을 나타내는 정의를 지지한다고 해도, 대안들만을 언급하는 것으로 명확하게 나타내지 않는 한 또는 상기 대안이 상호간에 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 나타낸다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "접촉하는"은 본원에 기술된 하나 이상의 화합물을 하나 이상의 다른 치료제와 함께 또는 이러한 치료제 없이 하나 이상의 세포와 접촉시키기에 적합한 임의의 방법을 나타낸다. 생체내 적용을 위해, 어떠한 공지된 투여 방법도 본원에 기술된 바와 같이 적합하다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "유효량", "약제학적 유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 상호교환 가능하며 시험관내 세포에 대한 효과 또는 개선을 초래하는 양을 말한다. 당해 분야의 숙련가들은, 유효량이 환자 또는 대상체의 상태를 개선시킬 수 있지만 완전히 치유하지는 않을 수 있음을 이해한다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "대상체"는 치료의 특정 표적을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 경상피 전기 저항을 증가시켜 감소된 세포 투과성을 초래하는 단계를 포함하여, 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은, 감소된 세포 투과성이 요구되는 어떠한 자가면역 질환에도 적용가능하다. 대표적인 세포는 소장 세포 또는 위십이지장 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 국면에서, 이러한 세포는 조눌린 mRNA의 감소된 발현을 갖는다. 관련된 국면에서, 당해 방법은 상피 성장 인자 수용체를 억제하는 단계를 추가로 포함한다. 당해 분야에서 통상의 기술을 가진 자는 당해 방법에 사용하기 위한 상피 성장 인자 수용체를 억제하기 위한 공지된 기술을 용이하게 인지할 수 있을 것이다. 바람직한 양태는, 상피 성장 인자 수용체가 일본쇄 조눌린에 대해 지시된 항체를 투여함으로써 억제하는 것이다. 다른 관련된 국면에서, 당해 방법은 또한 PAR₂를 억제하는 단계를 추가로 포함한다. 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 PAR₂를 억제하기 위한 공지된 기술을 용이하게 인식할 수 있을 것이다.

본 발명의 당해 방법의 바람직한 양태에서, PAR₂는 일본쇄 조눌린에 대해 지시된 항체를 사용하거나 siRNA를 사용함에 의해 억제된다. 다른 관련된 국면에서, 당해 방법은 CXCR3 수용체 결합을 통한 글리아딘에 의해 조눌린 방출을 피하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료할 수 있는 대표적인 자가면역 질환은 T1D, 전신 홍반 루푸스, 복강 질환, 강직성 척추염, 다발경화증, 류마티스 관절염, 크론병 및 정신분열병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 또한 상피 성장 인자 수용체를 억제하는 단계; 및 PAR₂를 억제하는 단계를 포함하여, 자가면역 질환의 이러한 치료가 요구되는 개인에서 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법을 사용하여, 경상피 전기 저항은 증가되어 감소된 세포 투과성을 초래한다. 세포 투과성은 소장 세포 또는 위십이지장 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 특정 세포에서 감소될 수 있다. 전형적으로, 이러한 세포는 조눌린 mRNA의 감소된 발현을 나타낼 것이다. 상피 성장 인자 수용체 및 PAR₂는 위에서 기술된 바와 같이 억제될 수 있다. 추가의 국면에서, 당해 방법은 항-글리아딘 항체를 포함하는, 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 어떠한 기술을 사용하여 글리아딘을 억제하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 이러한 방법을 사용하여 치료할 수 있는 대표적인 질환은 T1D, 전신 홍반 루푸스, 복강 질환, 강직성 척추염, 다발경화증, 류마티스 관절염, 크론병(Crohn's disease) 및 정신분열병과 같은 자가면역 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 또한 일본쇄 조눌린에 대해 지시된 항체를 투여함으로써 상피 성장 인자 수용체를 억제하고 PAR₂를 억제하는 단계를 포함하여, 복강 질환의 치료가 요구되는 개인에서 복강 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 방법을 사용하여, 경상피 전기 저항은 증가되어 감소된 세포 투과성을 초래할 수 있다. 대표적인 세포는 소장 세포 또는 위십이지장 세포이지만 당해 방법은 많은 세포 유형에서 유용할 수 있다. 당해 방법의 관련 측면에서, PAR₂는 또한 siRNA를 사용하여 억제한다. 또한, 당해 방법은 글리아딘을 억제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 언급된 본 발명의 특징, 장점 및 목적뿐만 아니라, 명백해질 다른 것들도 획득하여 좀더 상세히 이해하기 위해서, 상기 간략하게 요약한 본 발명의 보다 특별한 기술 및 특정 양태를 첨부된 도면에서 나타낸다. 이들 도면은 본 명세서의 일부를 형성한다. 그러나, 첨부된 도면은 본 발명의 바람직한 양태를 설명하며 따라서 이들의 영역으로 한정하는 것으로 고려되지 않음에 주목하여야 한다.
도 1은 알부민 및 면역글로불린이 고갈된 CD 환자 혈청에서 항-Zot 폴리클로날 Ab와 교차-반응하는 조눌린을 사용한 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 나타낸다. 3개의 주요 패턴이 검출되었다: 18 kDa 면역반응성 밴드 및 미약한(fainter) ~45 kDa 밴드를 나타내는 혈청(레인 1), 단지 9 kDa 밴드를 나타내는 혈청(레인 2), 및 18 kDa 및 9 kDa 밴드 둘다를 나타내는 혈청(레인 3).
도 2a 내지 2b는 처리하지 않은 및 PGNase로 탈글리코실화시킨 후 둘다의 정제된 사람 동종접합체 HP1-1 및 HP2-2 쿠마시 및 웨스턴 면역블롯팅(WB)을 나타낸다. 도 2a: 처리하지 않은 HP의 쿠마시 염색은 MW ~52 kDa로 이주(migrating)하는 공유된 글리코실화된 b 쇄를 나타내었지만, HP1-1의 a(a1) 및 HP2-2의 a(a2)는 각각 8 및 18 kDa의 예측된 MW로 이주하였다. PGNase를 사용한 탈글리코실화는 ~36 kDa의 MW로 b 쇄의 변환(shift)(완전한 탈글리코실화) 또는 보다 높은 MW로 b 쇄의 변환(불완전힌 탈글리코실화)를 유발하였다. 예측한 바와 같이, 글리코실화되지 않은 a1 및 a2 쇄에서 변환은 관측되지 않았다. 도 2b: 처리되지 않은 및 PGNase를 사용한 탈글리코실화 후 둘다의 정제된 사람 동종접합체(HP1-1 및 HP2-2)의 WB를 단일 겔 상에서 3회 수행한 후, 트렌스퍼(transfer)하고, 폴리클로날 항-Zot(좌측 패널), 모노클로날 항-HP(중앙 패널), 또는 폴리클로날 항-HP Ab(우측 패널)을 사용하는 WB 분석에 별도로 적용시켰다. 시험한 3개의 Ab는 이의 반응성 패턴이 HP1-1 및 HP2-2 단백질 제제(레인 3 및 4) 둘다의 탈글리코실화 후 변하지 않았던 a1 및 a2 쇄(모든 패널, 레인 1 및 2) 둘다를 인식하였다. 역으로, 탈글리코실화는 항-HP 모노클로날(중앙 패널, 레인 3 및 4) 또는 항-HP 폴리클로날 Ab(우측 패널, 레인 3 및 4)에 의해 검출된 HP1-1 및 HP2-2 둘다에서 β 쇄의 예측된 겔 이동성 변환을 유발하였다. 항-Zot Ab와 교차-반응하는 조눌린은 HP2-2에서 여분의 ~45 kDa 밴드를 인식하지만 탈글리코실화 후 변환하지 않았던 HP1-1(화살표)는 인식하지 않았다. MS/MS 분석 및 N-말단 서열분석은 전-HP2로서 이러한 ~47 kDa 밴드를 확인하였다.
도 3은, 조눌린이 투여량- 및 시간-의존적 방식으로 C57BL/6 WT 마우스에서 장내 투과성을 증가시켰음을 나타낸다. 조눌린은 C57BL/6 WT 장내 분절의 관강 측면에 5, 10, 25 및 50 ㎍/웰(well)로 적용하였다. 트립신-절단된 전-HP2를 50 ㎍/웰에서 적용하였다. 노출-후 60분째에 출발하여, 조눌린은 ≥10 ㎍/웰(0.03 내지 0.036 범위의 P 값)의 농도에서 적용된 경우 TEER에서 현저한 강하를 유도하였다. 데이타는 4개의 별개의 실험으로부터의 평균값 ± SEM이다.
도 4a 내지 4d는 생체내 마우스 위장 투과성에 있어서 조눌린의 효과를 나타낸다. 조눌린(닫힌 바아)(170 mg/마우스)은 BSA-처리된 대조군(개방된 바아)와 비교하여 마우스 소장(도 4a) 및 위십이지장(도 4b) 투과성 둘다를 증가시킨다. 락만(lacman) 비(작은 IP) 및 슈크로즈 분획 배출(위십이지장 투과성)에 있어서의 차이는 챌린지(challenge) 당일 측정과 챌린지 3일 전 측정 사이의 투과성에 있어서의 변화 퍼센트로 나타낸다. 성숙한 2개-쇄 HP2(점선 바아)(170 mg/마우스)는 소장 또는 위십이지장 투과성에서 변화를 유발하지 않았다. 소장(도 4c) 및 위십이지장(도 4d) 투과성 둘다는 48시간내에 전-챌린지 값으로 회복되었으므로, 조눌린의 효과는 완전히 가역성이었다. 락만 또는 슈크로즈 분획 배출에 있어서의 차이는 챌린지 2 일(d) 후 및 챌린지 당일에 값 사이의 투과성 변화의 퍼센트로 나타낸다. ^*BSA 대조군 및 2개-쇄 HP2 둘 다와 비교한 락만 P<0.0024; ^*BSA 대조군 및 2개-쇄 HP2 둘 다와 비교한 슈크로즈 P<0.0049(각각의 처리 그룹에 대해 n = 10).
도 5a 내지 5d는 EGFR 포스포릴화에 있어서 조눌린의 효과를 나타낸다. 도 5a: 증가하는 농도에서 조눌린을 혈청-고갈된 Caco-2 세포에서 항온처리하였다. 세포를 분해하고, 항-EGFR Ab를 사용하여 면역침강시키고, WB에 대해 항-포스포 EGFR(PY 플러스) Ab를 사용하여 진행하였다. 동등한 로딩(loading)을 보장하기 위해, 블롯을 스트립(strip)하고 EGFR에 대해 재-프로브화하였다. 조눌린은 3ml/ml에서 정점지속(plateau)에 이르는 EGFR 포스포릴화에 있어서 투여량-의존적 증가를 유발하였다. 도 5b: 10 ml/웰에서 조눌린을 혈청-고갈된 Caco-2 세포상에서 단독으로(레인 2) 또는 5μM의 EGFR-선택적인 PTK 억제제 AG1478의 존재하에서(레인 3) 항온처리하였다. 배지에 노출된 세포(레인 1) 또는 AG1478 단독(레인 4)을 추가의 대조군으로 사용하였다. 조눌린은 PTK 억제제 AG1478에 의해 완전히 폐지된 EGFR 포스포릴화에 있어서의 증가를 유발하였다(n = 3회의 실험). 도 5c: 조눌린 10 mg/ml을 단독으로 또는 5 μM의 AG1478의 존재하에서, C57BL/6 WT 장내 분절의 관강 측면에10 ㎍/웰의 농도로 적용하고 TEER을 기준선(개방된 바아) 및 90분 항온처리 후(닫힌 바아)에서 측정하였다. 조눌린은 AG1478의 존재에 의해 예방된 TEER에 있어 현저한 강하를 유발하였다(n = 각각의 그룹에 대해 4마리의 마우스). 도 5d: 조눌린-유도된 EGFR 포스포릴화는 일본쇄 조눌린(레인 2)과 비교하여 2개-쇄 성숙한 HP2(10 ml/ml)(레인 3)를 사용하여 처리 후 현저히 감소하였다. 레인 1은 배지(media)만으로 처리한 세포에서 EGFR 포스포릴화를 나타낸다.
도 6a 내지 6b는 EGFR 포스포릴화 및 IP에 대한 조눌린의 효과를 설명한다. 도 6A: 조눌린-유도된 EGFR 포스포릴화는, PAR₂가 사일런스(silence)인 경우 감소되었다. PAR₂ 발현은 2개의 상이한 PAR₂ siRNA를 사용하는 Caco-2에서 사일런싱되었다. 이후에, 세포를 조눌린(10 mg/ml) 또는 배지 대조군으로 처리하고, 분해하며, 항-EGFR Ab를 사용하여 면역침강시키고, WB에 대해 항-포스포-EGFR PY-플러스 Ab로 진행시켰다. 조눌린-매개된 EGFR 포스포릴화는 PAR₂ 사일런싱(silencing)에 의해 방지되었다. 동등한 단백질 로딩 및 트렌스퍼는 EGFR에 대한 블롯을 스트립하여 재프로빙(reprobing)함으로써 확인하였다. 도 6B: 조눌린은 PAR₂ ^-/- 마우스에서 장 투과성을 증가시키지 않았다. C57BL/6 WT 및 PAR₂ ^-/- 마우스 둘다로부터 소장의 분절을 마이크로스냅웰 시스템(microsnapwell system) 위에 두고, 30분 동안 배지 단독 또는 10mg의 정제된 재조합체 조눌린을 함유하는 배지에 노출시키고, 경내피 전기 저항(TEER)을 0시(개방된 바아) 및 90분 항온처리 후(닫힌 바아)에 모니터링하였다. 야생형 마우스에서 관측된 TEER에서 조눌린-유도된 강하는 PAR₂ ^-/- 마우스(n = 5)에서 제거되었다.

다음 실시예(들)은 본 발명의 각종 양태를 설명하기 위한 목적으로 제공되며 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한함을 의미하지 않는다.

증가된 장 투과성(IP)은 알레르기, 염증 및 자가면역 질환의 발병기전에서 일반적이고 근본적인 메카니즘으로서 나타난다. 장 투과성을 가역적으로 조절하는 것으로 알려진 유일한 생리학적 매개인자인, 조눌린의 특성화는 찾기힘든 것으로 남아있다. 사람 혈청의 단백질체학적 분석을 통해, 본 발명은 합토글로빈-2에 대한 전구체(전-HP2)로서 사람 조눌린을 확인하였다. 성숙한 HP는 유리된 헤모글로빈을 스캐빈징(scavenging)하여 이의 산화 활성을 억제하는 것으로 공지되어 있는 반면, 이의 절단되지 않은 전구체 형태에 대한 기능은 지금까지 추정되지 않았다. 본 발명은, 일본쇄 조눌린이 EGF 수용체(EGFR)의 경활성화를 프로테이나제 활성화된 수용체 (PAR)₂ 활성화를 통해 유도하는 EGF-유사 모티프(motif)를 포함한다는 것을 입증한다. 이들 2개의 수용체의 활성화는 증가된 장 투과성과 커플링되어 있었다. PAR₂의 siRNA-유도된 사일런싱 또는 PAR₂ ^-/- 마우스의 사용은 장벽 완전성의 손실을 방지하였다. 조눌린의 이의 a2 및 b 소단위로의 단백질분해적 절단은 EGFR을 활성화시키고 장 투과성을 증가시키는 이의 능력 둘다를 중화시켰다. 정량적 유전자 발현은, 조눌린이 복강 질환의 대상체의 장 점막내에서 과발현됨을 나타내었다. 이는 이의 전구체 형태가 이의 성숙한 형태의 기능과는 구별된다는 점에 있어서 분자의 첫번째 예이다. 따라서, 이들 결과는, 조눌린을 치료학적 중재를 위해 표적화시킬 수 있는 사람 면역-매개된 질환의 발병기전에 관여된 주요 시그날로소옴(signalosome)에 관여하는 신규 리간드로서 특성화한다.

실시예 1

사람 혈청 시료

건강한 지원자 및 CD 지원자 둘다로부터의 사람 혈청을 복강 조사 혈청 은행 센터(Center for Celiac Research serum bank)로부터 입수하였다. 모든 시료에서 시판되는 키트(Enchant^TM Life Science kit; 제조원: Pall Corporation, 미국 미시간주 앤 아르보 소재) 및 IgG ImmunoPure 고정된 단백질 G 플러스(제조원: PIERCE, 미국 일리노이주 록포드 소재)를 사용하여 알부민 및 IgG 각각을 고갈시켰다. 알부민- 및 IgG-고갈된 혈청을 SDS-PAGE, 2-D 전기영동 및 WB 분석으로 분석하였다.

실시예 2

사람 합토글로빈

사람 혈장으로부터 추출한 HP1-1 및 HP2-2는 제조업자(Sigma, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)에서 구입하였다. HP SDS-PAGE, 일차원 및 이차원 겔 전기 영동 WB 둘 다, 및 질량-분광법 분석을 수행하였다. HP 탈글리코실화를 제조업자(Sigma, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)의 지시에 따라 N-글리코시다제 F(PNGase F)를 첨가하여 수행하였다.

실시예 3

SDS/PAGE 및 WB 분석

알부민- 및 IgG-고갈된 혈청(50mg/웰), 사람 HP1-1(1mg/웰), 및 사람 HP2-2(1mg/웰)을 SDS/PAGE로 변성 및 비변성 조건하에 18% 또는 12% SDS/PAGE 트리스-글리신 겔(Invitrogen) 위에서 각각 분해하였다. 변성 조건은 30mL의 래믈리 완충액(Laemmli buffer)을 시료에 첨가한 후 SDS/PAGE 전에 5-분동안 비등시키는 단계를 필요로 하였다. 단백질을 SimplyBlue SafeStain 용액(제조원: Invitrogen)으로 염색하거나 PVDF 막(제조원: Millipore) 상으로 이동시키고 ImmunoPure IgG(단백질 A) 정제 키트(제조원: PIERCE)를 사용하여 정제된 사람 조눌린과 교차 반응하는 것으로 이미 밝혀진, 5mg/mL 친화성 정제된 토끼 폴리클로날 항-Zot IgG Ab(1), 또는 제 1 Ab로서 2mg/mL 마우스 모노클로날 항-사람 HP(제조원: Sigma) 또는 1mg/mL 토끼 폴리클로날 항-사람 HP(제조원: Sigma)를 사용하여 프로브하였다. HRP-표지된 폴리클로날 항-토끼 IgG(1:5,000; 제조원: Amersham) 또는 항-마우스 IgG(1:10,000; 제조원: Sigma)를 제2 Ab로 사용하였다. 밴드를 ECL Plus 시약(제조원: Amersham)으로 검출하였다.

실시예 4

2-DE 분석 및 2-DE WB

2-DE를 ZOOM IPGRunner 시스템(제조원: Invitrogen)을 사용하여 수행하였다. 요약하면, 알부민 및 IgG 고갈된 혈청을 우레아, 세제, 환원제, 양쪽성 전해질 용액, 및 염료(ReadyPrep 재수화/시료 완충액; 제조원: Bio-Rad)를 1:2의 비율로 함유하는 시판되는 시료 재수화 완충액에 가하여 ZOOM STRIP pH 5.3 내지 6.3(제조원: Invitrogen)을 1시간 동안 실온(RT)에서 재수화시켰다. 이후에, 스트립을 ZOOM IPGRunner Cassette(제조원: Invitrogen)에 로딩하여 등전점 포커싱(IEF)을 수행하였다. 시료를 분획화시키기 위해, 20분 동안 200 V, 15분 동안 450 V, 15분 동안 750 V, 및 105분 동안 2,000 V의 IEF 단계 전압 프로토콜을 사용하였다. IEF 후, 2-DE SDS/PAGE 전에, 스트립을 15분 동안 NuPAGE 시료 환원제를 함유하는 NuPAGE LDS 시료 완충액(제조원: Invitrogen) 속에서 평형화하고 15분 동안 새로이 가해진 요도아세트아미드(125 mM; 제조원: BioRad)를 함유하는 NuPAGE LDS 시료 완충액 속에서 알킬화하였다. 2-DE SDS/PAGE를 NuNovex 4 내지 20% 트리스-글리신ZOOM겔(1.0 mm)을 사용하여 고정된 pH 구배 웰(제조원: Invitrogen) 속에서 수행하였다. 단백질 밴드를 SimplyBlue SafeStain 용액(제조원: Invitrogen)으로 가시화하였다. 단백질 밴드를 PVDF 막(제조원: Millipore) 위로 이동시키고 친화성-정제된[Immuno-Pure IgG (단백질 A) 정제 키트; PIERCE] 토끼 폴리클로날 조눌린 교차 반응 항-Zot IgG(5mg/mL)를 제 1 Ab로서 사용하고 항-토끼 IgG(ECL 토끼 IgG, HRP-연결됨; 제조원: Amersham Biosciences)를 제2 Ab로 사용하여 프로브하였다. 필름을, PVDF 막을 ECL 검출 시약(제조원: Amersham Biosciences)에 노출시킨 후 현상하였다.

실시예 5

MS 분석

단백질 밴드 확인을 위해 겔내 트립신 분해(in-gel tryptic digest)를 SDS/PAGE 또는 2-DE로부터 잘라낸 SimplyBlue로 예비염색한 겔 밴드위에서 수행하고 MS/MS로 분석하여 스탠포드 단백질(Stanford Protein) 및 핵산 생물공학 시설(Nucleic Acid Biotechnology Facility)(제조원: Beckman Center, 캘리포니아주 스탠포드 소재)의 단백질 서열/질량 맵핑 서열을 사용하여 단백질을 확인하였다.

실시예 6

곤충 세포에서 조눌린/전-HP2의 발현

HP2를 암호화하는 사람 완전한 길이의 cDNA 클론은 OriGene(TC116954; 수탁 번호 NM_005143; 제조원: OriGene Technologies, Inc.)에서 구입하였다. C-말단에 6xHis 태그가 있는 야생형 사람 조눌린 cDNA를 함유하는 재조합체 바큘로바이러스를 pDEST8 및 Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템(제조원: Invitrogen)을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 작제하였다. 이후에, 조눌린을 pENTR/D-TOPO 벡터로부터 pDEST8로 게이트웨이 기술(Gateway technology)(제조원: Invitrogen)을 사용하는 재조합을 통해 이동시켰다. 박시미드(bacmid) DNA를 지닌 MAX 효능 DH10Bac 세포를 pDEST8-조눌린으로 형질전환시켰다. 재조합체 박시미드를 DH10Bac 세포로부터 분리하고 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (Sf9) 세포내로 셀펙틴 시약(제조원: Invitrogen)을 사용하여 형질감염시켜 재조합체 바큘로바이러스를 생성시켰다. Sf9 세포를 조눌린 단백질의 발현을 위해 사용하였다. 조눌린의 단백질 발현을 위해, Sf9 세포(3 x 10⁷)를 현탁 플라스크내 SFM-900 III 배지(제조원: Invitrogen) 속에서 27℃에서 성장시켰다. 세포를 재조합체 바큘로바이러스로 3의 다중 감염도에서 감염시켰다. 감염 후 72시간 째에, Sf9 세포를 10분 동안 2,000 x g에서 원심분리로 수집하였다. 조눌린의 정제를 위해, 인산염 완충액(pH 7.5) 및 NaCl을 조건화된 배지에 가하여 최종 농도가 각각 20mM 및 0.5M이 되도록 하였다(2). 당해 용액을 Ni2⁺가 충전된 킬레이팅세파로즈(His-결합 수지; 제조원: Novagen) 컬럼에 적용시킨 후 200 mM 이미다졸로 용출시키고 PBS로 투석시켰다. 정제된 사람 조눌린을 분취화하고 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.

실시예 7

마이크로스냅웰 시스템에 의한 생체외 IP 연구

생체외 장 투과성에 대한 조눌린/전-HP2의 효과를 (3)에 기술된 바와 같이 마이크로스냅웰 시스템내에서 모니터링하였다. 요약하면, C57BL/6 WT 마우스로부터의 소장의 분절을 마이크로스냅웰 시스템 위에 두고, 이들의 관강 측면을 30분 동안 배지 단독 또는 증가하는 농도의 정제된 재조합체 조눌린을 함유하는 배지에 노출시켰다. TEER을 0시 및 2시간의 기간 동안 30분 간격에서 평면 전극(Evom-G WPI 분석기에 부착된 Endohm SNAP 전극; 제조원: World Precision Instruments)을 사용하여 측정하고 표준화한 후 Ω/cm²로 나타내었다. 모든 TEER 마이크로스냅웰 실험을 마우스 소장에서 77.9 ± 3.5 Ω/cm² (n = 23)의 기본 TEER 값으로 수행하였다. 선택된 실험에서, TEER에 대한 조눌린의 효과를 기준선 조건 및 EGFR 트립신 키나제 억제제 AG1478로 예비처리한 후 모니터링하였다. 다른 실험 세트에서, 조눌린을 C57BL/6 WT 및 PAR2-/- 마우스 둘다에서 시험하였다.

실시예 8

생체내 IP

129/SvEv WT 마우스를 30마리의 마우스의 3개 그룹으로 무작위로 나누었다. 이들 동물을 3시간 동안 절식시키고, 동물에 당 프로브를 위관 영양(gavaging)시키고, 이들을 각 주마다 2회씩 대사 우리(cage)에 둠으로써 실험 기술에 3주 동안 적응시켰다. 단백질 챌린지 당일에, 동물에게 60-mL 용액 중의 170mg의 정제된 일본쇄 조눌린 또는 유사한 양의 정제된 2-쇄 절단된 HP2를, (4)에 기술된 당 위관 영양과 함께 제공하였다. 마우스를 대사 우리에 두고 음료수를 추가로 22시간 동안 자유로이 공급하고; 이 동안에, 이들의 뇨를 수집한 후, 마우스를 다시 통상의 우리에 두었다. 약물 챌린지 당일로부터 2일 후, 마우스를 다시 대사 우리에 두어 치료로부터 이들의 회복을 측정하였다.

실시예 9

RNA 방해를 통한 PAR2의 녹다운(knockdown)

Caco-2 세포의 PAR2 발현을 2개의 상이한 PAR2 siRNA[HSS103471 및 HSS103473 (각각 50 nM); 제조원: Invitrogen]로 사일런싱시켰다. 세포를 제조업자의 지시에 따라 PAR2 siRNA를 사용하여 DharmaFECT1 형질감염 시약(제조원: Dharmacon)을 사용하여 10-cm 플레이트 속에 5% FCS의 존재하에서 24시간 동안 형질감염시켰다. PAR2 녹다운 효능을 WB 및 실시간 PCR 분석 둘다로 확인하였다.

실시예 10

장 생검으로부터 총 RNA 추출

총 RNA를 트리졸(TRizol) RNA 정제 프로토콜을 사용하여 추출하였다. 요약하면, 각각의 장 조직 표본을 1 mL의 트리졸 시약(제조원: Invitrogen) 속에서 폴리트론 파워 균질화기(Polytron power homogenizer) PT 3100(제조원: KINEMATICA AG)를 사용하여 균질화하였다. RNA를 0.2 mL의 클로로포름을 가하여 추출하였다. 튜브를 손으로 15초 동안 격렬하게 진탕시킨 후, 시료를 RT에서 5분 동안 항온처리하고 15,000 x g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리(Marathon 21000R 원심분리; Fisher Scientific)하였다. RNA가 풍부한 수성 상을 다른 튜브로 이동시킨 후에, RNA를 초기 균질화를 위해 사용된 트리졸 시약 1mL당 0.5mL의 이소프로필알콜을 가하여 침전시켰다. 시료를 실온에서 10분 동안 항온처리하고 15,000 x g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, RNA펠렛은 초기 균질화를 위해 사용된 1mL의 트리졸 시약당 적어도 1mL의 75% 에탄올을 가하여, 75% 빙-냉 에탄올로 1회 세척하였다. 펠렛을 2분 이하 동안 공기-건조시키고, 20mL의 RNase-유리된 물 속에 용해하고 -80℃에서 저장하였다. RNA 농도를 260 nm에서 분광광도계(DU530, UV/vis; 제조원: Beckman Coulter)로 판독하였다. 260:280 비를 각각의 시료에 대해 측정하였다.

실시예 11

cDNA 합성

2㎍의 총 RNA를 고-용량(High-Capacity) cDNA Archive 키트로 제조업자의 지시(제조원: Applied Biosystems)에 따라 역전사시켰다.

실시예 12

사람 장 생검에서 HP의 PCR 증폭

cDNA의 분취량을 특수하게 설계하여 상이한 엑손(exon)을 다 포함하는 다음의 프라이머 쌍을 사용하여 HP2에 대해 특이적인 단편의 PCR을 위해 이용하였다: 전방 프라이머(엑손 5) 5'-ATGGCTATGTGGAGCACTCG-3'(서열 번호: 1) 및 역 프라이머(엑손 7) 5'-TACAGGGCTCTTCGGTGTCT-3'(서열 번호: 2). PCR을 0.1mg의 cDNA, 2.5 단위의 TaqDNA 폴리머라제(제조원: Promega), 0.2 mM dNTP 혼합물, 0.5 mM의 각각의 프라이머, 5 mM MgCl₂, 및 1:10 용적의 10ml PCR 표준 완충액(제조원: Promega)으로 수행하였다. PCR을 열 순환기(제조원: Thermo Electro Corporation) 속에서 수행하였다. 94℃에서 초기 1분의 변성 후, 94℃에서 30초를 포함하는 30개 주기(탈변성), 58℃에서 30초(어닐링), 및 72℃에서 30초(연장)을 완료한 후, 72℃에서 10분간 최종 연장시켰다. 이후에, PCR 생성물을 2% 아가로즈 겔 상에서 분리하고, 에티디움 브로마이드로 염색하고, 겔을 절개하여, 겔 밴드 정제 키트(제조원: Amersham Biosciences)를 사용하여 정제하고 3730xl DNA 분석기(제조원: Applied Biosystems)로 서열분석하였다.

실시예 13

TaqMan 과정을 사용한 실시간 PCR

실시간 PCR을 HP2-2 또는 HP2-1 만의 표현형 대상체로부터의 cDNA 위에서 수행하고 HP2-특이적인 유전자 프라이머 및 프로브(제품 확인번호:: Hs00978377_m1) 및 하우스키핑 유전자 18S(제품 확인번호: Hs99999901_S1(제조원: Applied Biosystems)로 수행하였다. 반응을 태크만 유니버설 PCR 마스터 믹스(TaqMan Universal PCR Master Mix)(시판원: Applied Biosystems, 제조원: Roche)로 수행하고 7500 신속한 실시간 PCR 시스템(제조원: Applied Biosystems)에서 수행하였다. 모든 반응을 2회 수행하였다. 상대적인 유전자 발현을 하우스키핑 유전자로서 18S를 사용한 비교 Ct 방법을 사용하여 계산하였다. 18S mRNA에 대해 표준화 한 후 비-CD 대조군에서 조눌린 mRNA 발현에 대해 상대적인 GFD 식이에서 활성 CD 환자 및 CD 환자에서 조눌린 mRNA 발현의 배율 변화를 기록하였다.

실시예 14

바큘로바이러스 발현 시스템 및 프로테아제에 의한 이의 절단에서 사람 조눌린 -전 HP2 클로닝 및 발현

바큘로바이러스 시스템 및 이의 정제를 사용한 재조합체 조눌린/전HP2 단백질 생산을 상기 기술한다. 정제된 일본쇄 조눌린을 나타낸 세린 프로테아제를 사용하여 단백질 절단에 적용시키고, SDS-PAGE로 분해한 후, SimplyBlue^TM SafeStain 용액(제조원: Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)으로 염색하였다. 2개 쇄 HP2의 생성을 위해, 일본쇄 조눌린을 트립신-아가로즈 비드(Sigma T-1763)에 20분 동안 25℃에서 노출시켰다. 비드를 원심분리로 제거하고, 트립신 제거의 효능을 기질 Glu-Gly-Arg-pNA(제조원: Bachem Bioscience)에 대한 트립신 펩티다제 활성의 검정으로 확인하였다.

실시예 15

생체외 및 생체내 IP 연구

생체외 및 생체내 장 투과성에 대한 조눌린의 효과를 기술한 바와 같이(8, 14) 수행하고 상기 기록하였다. 조눌린이 EGFR을 활성화시킬 수 있는지를 측정하기 위해, 증가하는 농도의 조눌린 또는 2-쇄 성숙한 HP2를 혈청 고갈된 고 EGFR-발현 Caco-2 세포에 대한 노출 시간을 증가시키기 위해 가하였다. 세포를 분해하고 WB에 대해 항-포스포 EGFR(Y1068) Ab(제조원: Cell Signaling Technol. Inc.)를 보고한 바와 같이(40) 진행시켰다. 실험을 5μM의 EGFR-선택성 PTK 억제제 AG1478(제조원: Calbiochem, 미국 뉴저지주 깁스타운 소재)의 존재하에 반복하였다.

실시예 16

복강 질환(CD) 및 비-CD 환자로부터의 장 조직으로부터 조눌린 유전자 서열분석 및 정량화

소장 점막의 시료를 진단적 상부 위장(GI) 내시경검사중인 대상체로부터 회장의 제2/제3 부위로부터 수득하였다. 포함된 대상체는 10명은 건강한 대조군, 7명은 진단시 활성 CD인 환자, 3명은 적어도 6개월 동안 글루텐이 없는 식이를 사용하여 치료중인 CD 환자였다. 모든 환자는 수술 동안 임상 처방을 가졌고 당해 연구 목적을 위해 추가의 생검을 수행하기 위해 동의서를 통지하였다. 연구 프로토콜은 매릴랜드 대학의 윤리위원회(Ethics Committee of the University of Maryland)에 의해 승인되었다. 소장 생검을 즉시 RNAlater RNA 안정화 시약(제조원: Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아가 소재)에서 수집하고 -20℃에서 가공할 때가지 저장하였다. 총 RNA 추출, cDNA 합성 및 실시간 PCR은 위에서 기술한 바와 같다.

모든 값은 평균 ± SE(표준 편차)로 나타낸다. 차이의 분석은 2개-테일된 스튜던츠 t 시험(two-tailed Student's t test)으로 수행하여 쌍을 이루거나 쌍을 이루지 않은 변수에 대해 2개 그룹들 사이의 차이를 시험하였다. 경우에 따라 다변량분석(Multi-variate analysis)을 수행하였다. P ≤/ 0.05의 값은 유의적인 것으로 간주하였다.

실시예 17

CD 사람 혈청으로부터 조눌린의 특성화

조눌린은 사람 혈청 속에서 조눌린 교차-반응 항-Zot Ab(Ab)-계 ELISA(7-10)에 의해 검출되고 정상 대조군과 비교하여 CD 환자에서 증가되므로(10), 웨스턴 분석을 초기에 사용하여 CD 대상체로부터 알부민- 및 IgG-고갈된 혈청에서 단백질의 조눌린 면역반응성을 검출하였다. 이들 혈청은 명백한 분자량이 18 및 9 kDa인 2개의 주요 단백질 밴드를 나타내었다(도 1). 반응성의 3개의 명백한 패턴을 CD 혈청에서 확인하였다: 18 kDa 단백질 밴드(도 1, 레인 1), 9 kDa 단백질 밴드(도 1, 레인 2), 및 9 및 18 kDa 단백질 밴드 둘다(도 1, 레인 3). 그중에서도 특히, ~45 kDa 밴드가 단일의 18 kDa 밴드(도 1, 레인 1)을 나타낸 혈청에서만 검출되었으나, 9 kDa 밴드 또는 밴드 둘다(도 1, 레인 2 및 3)를 가진 혈청에서는 검출되지 않았다. 18kDa 밴드를 발현한 CD 환자로부터의 혈청의 2차원 겔 전기영동(2-DE)은 MS/MS 질량 분광법 분석에 적용된 2개의 조눌린 면역반응성 스폿(spot)을 나타내었다. 18 kDa 스폿은 HP2의 a2 쇄(수탁 번호 GI:223976)로 확인되었고 9 kDa 스폿은 HP1의 a1 쇄(수탁 번호 GI:3337390)로 확인되었다. CD 환자로부터의 14개 혈청의 무작위적 스크리닝은, 7%가 HP1 동형접합, 57%가 HP1/HP2 이형접합, 및 36%가 HP2 동형접합을 나타내었다.

실시예 18

사람 HP 제제로부터 조눌린의 특성화

사람 CD 혈청에서 항-Zot IgG Ab와 폴리클로날 조눌린-교차 반응에 의해 인식된 면역반응성 밴드의 동일성을 확인하기 위해, HP1(HP1-1) 또는 HP2(HP2-2)에 대한 대상체 동종접합체로부터의 사람 HP의 시판되는 정제된 제제를 SDS-PAGE에 의해 단일 겔 상에서 동시에 분해하고 쿠마시 염색으로 분석하였다(도 2a). 예측한 바와 같이, HP1-1의 a1-쇄는 ~9 kDa의 MW(도 2a, 레인 1)를 나타낸 반면, HP2-2의 a2-쇄는 ~18 kDa(도 2a, 레인 2)이었다. 이의 글리코실화로 인하여, b 쇄는 HP1-1 및 HP2-2 제제 둘다에서 ~52 kDa의 MW를 나타내었다(도 2a, 레인 1 및 2). N-글리코시다제 F(PGNase F)와 3시간의 탈글리코실화 반응 후, 짐작컨대 탈글리코실화의 변화하는 정도로 인해 HP1-1 및 HP2-2 둘다의 b 쇄를 52 kDa 이하의 다중 밴드로 수행하였다(도 2a, 레인 3 및 4). 예측한 바와 같이, 글리코시다제 처리 후, HP1-1의 a1 쇄(도 2a, 레인 1 및 3과 비교) 또는 HP2-2의 a2쇄(도 2a, 레인 2 및 4와 비교)에 대한 겔 이동성에 있어서 변화는 명백하지 않았다.

도 2b는 탈글리코실화 전 및 후 둘다에서 시판되는 정제된 동형접합체 HP1-1 및 HP2-2 단백질의 면역블롯을 나타낸다. 단백질을 단일 겔에서 동시에 수행하고 폴리클로날 조눌린-교차 반응 항-Zot Ab(도 2b, 좌측 패널), 모노클로날 항-글리코실화된 b 쇄 HP(도 2b, 중앙 패널), 또는 폴리클로날 항-HP Ab(도 2b, 우측 패널)을 사용하여 면역블롯팅하였다. 항-Zot Ab는 HP1-1 a1 쇄 및 HP2-2 a2 쇄 둘다에서 강력하게 반응하였고 HP2-2내에 존재하는 ~45 kDa에서 추가의 밴드를 나타내었지만, HP1-1 제제는 그렇지 않았다(도 2b, 좌측 패널, 각각의 레인 2 및 1). 예측한 바와 같이, ~52 kDa HP b 글리코실화된 소단위에 대해 생성된 모노클로날 항-HP 항체는 HP1-1 또는 HP2-2 중 하나인 b 쇄 (도 2b, 중심 패널, 각각 레인 1 및 2) 만을 인식한 반면, 폴리클로날 항-HP Ab는 HP1-1 및 HP2-2 둘다의 a1, a2 및 b 쇄의 에피토프를 인식하였다(도 2b, 우측 패널, 각각 레인 1 및 레인 2). 도 2b는 또한 동일한 3개의 Ab를 사용한 탈글리코실화 후 면역블롯팅된 HP1-1 및 HP2-2 제제를 나타낸다. 3개의 Ab의 반응성의 패턴을 비-글리코실화된 9 kDa a1 및 18 kDa a2 소단위에 대해 시험하였으며 탈글리코실화 후 변화하지 않았다(도 2b, 모든 3개 패널, 각각 레인 3 및 4). 그러나, 탈글리코실화는 HP1-1 및 HP2-2 둘다에서 β 쇄의 예측된 겔 이동성 변환을 유발하였다. 모노클로날 항-HP Ab(도 2b, 중심 패널, 레인 3 및 4)는 2개의 불완전한 탈글리코실화된 β 쇄 밴드만을 인식한 반면, 폴리클로날 항-HP Ab는 또한 완전하게 탈글리코실화된 ~36 kDa β 쇄(도 2b, 우측 패널, 레인 3 및 4)를 인식하였다. HP2-2 제제에서만 존재하며 항-Zot Ab에 의해 인식된 45 kDa 밴드는 탈글리코실화시 겔 이동성에 있어서 어떠한 변화도 나타내지 않았으나, 이는 미약한 강도를 보였다(도 2b, 좌측 패널, 레인 4). 당해 45 kDa 단백질 밴드의 MS/MS 분석 및 NH₂-말단 서열분석을 사람 HP2 전구체(전-HP2, 수탁 번호 P00738)로서 상이한 시간에 확인한 당해 단백질에서 분석한 2개의 명백한 시료 상에서 수행하였다. 조합된 MS/MS 분석은 총 49.8%의 비-중첩(non-overlapping) 단백질 및 전체 단백질 서열에 걸친 13개의 독특한 펩타이드를 커버하였다. 따라서, a1 및 a2 쇄 외에, 항-Zot Ab는 절단되지 않은 일본쇄 전-HP2를 인식하나, b 쇄는 인식하지 않는다.

이들 결과는, ELISA에 의해 혈청 조눌린을 측정하기 위해 사용된 항-Zot Ab가 고도로 풍부한 HP1 및 HP2 단백질뿐 아니라 전-HP2도 추정상 검출하여야 함을 제안한다. 그러나, ELISA에 의해 검출된 혈청 조눌린의 양은 ng/ml 범위(11)인 반면, 혈청 중 전체 HP 혼주물(pool)은 mg/ml 범위(12)이다. 이러한 명백한 차이를 지적하기 위해, 사람 혈청 및 정제된 HP 둘다의 WB 분석을 항-Zot Ab를 사용하는 비-변성화 조건하에 반복하였다. WB는 HP2-2 표현형 혈청 및 시판되는 정제된 HP2-2에서 일련의 밴드를 나타낸 반면, HP1-1 표현형 혈청 또는 시판되는 정제된 HP1-1에서는 밴드가 검출되지 않았다. 역으로, 절단되지 않은 전-HP2를 인식하지 않았던 항-HP 폴리클로날 Ab는 시판되는 정제된 HP1-1 및 HP2-2 제제 둘다에서 밴드를 검출하였다. 결합된, 이들 데이타는, 비-변성 조건하에서, 항-Zot Ab가 일본쇄 전-HP2 만을 검출하지만, 2개-쇄의 성숙한 HP는 검출하지 않음을 제안하며, 또한, 일본쇄 전-HP2, 그러나 이의 절단된 2개-쇄 성숙한 형태는 조눌린 분자에 상응한다는 개념을 뒷받침한다.

실시예 19

재조합체 조눌린의 기능적 분석

포유동물 HP2 mRNA 전사체의 주요 해독 생성물은 동시-해독적으로 이합체화되는 폴리펩타이드이고, 여전히 세린 프로테아제, Cr1LP에 의해 세포질세망내에서 단백질분해적으로 절단된다(13). 역으로, 조눌린은 사람 혈청 속에서 절단되지 않는 전-HP2로 검출가능하다(상기 참조). 절단된 성숙한 2개 쇄 HP2가 아니고 일본쇄 전-HP2로서 조눌린의 실체를 확인하기 위하여, 재조합체 전-HP2를, pre - HP2 cDNA를 곤충 세포 벡터내로 삽입시켜 발현시키고 이를 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 발현시켰다. 도 2b와 유사하게 항-Zot 폴리클로날 Ab에 의해 인식되고 C-말단에 부착된 6xHis 태그로 인해 ~53kDa의 명백한 MW로 이주하는 고도로 정제된 재조합체 전-HP2를 수득하였다. 이후에, 일본쇄 전-HP2를 일련의 세린 프로테아제를 사용하여 단백질분해 절단에 적용하였다. 매트립타제, 유로키나제, 트롬빈 및 혈청 칼리크레인은 전-HP2를 절단하지 않은 반면, 플라스민은 단백질의 완전한 분해를 유발하였다. 대조적으로, 장 세린 프로테아제 트립신을 사용한 치료는 조눌린의 a2 및 b 소단위와 혼화성인 분자량으로 이주하는 2개의 주요 밴드의 출현을 초래하였다. 이들 2개의 밴드의 NH₂-말단 서열분석은, 2개 단백질이 예측된 Arg¹⁶¹ 절단 부위에서 전-H2 a2 및 b쇄와 동일함을 나타내었다. 트립신 분해 후 수득한, 온전한 일본쇄 전-HP2 및 절단된 2개-쇄 성숙한 HP2 둘다를 하기 연구에서 이들의 생물학적 활성에 대해 시험하였다.

실시예 20

마이크로-스냅웰 시스템에서 탑재된 마우스 소장에서 TEER에 대한 재조합체 조눌린의 생체외 효과

재조합체 전-HP2(조눌린으로서 정의된 지금으로부터)를 마이크로스냅웰에 탑재된 WT C57BL/6 쥐 소장 단편에 적용시켰다. 재조합체 일본쇄 조눌린을 ≥40 ㎍/ml의 농도에서 적용시키는 경우 경상피 전기 저항(TEER)이 감소된, 즉, 투과성이 증가된 마우스 장 단편의 점막(관강) 측면에 가하였다(도 3). 대조적으로, 트립신-절단된 2개 쇄 HP2를 시험한 경우 일관된 TEER 변화는 검출되지 않았다(도 3).

실시예 21

마우스 위장 투과성에 대한 재조합체 조눌린의 생체내 효과

조눌린이 생체내에서 장 투과성을 변경시킬 수 있는지를 확립하기 위하여, 마우스를 일본쇄 재조합체 전-HP2 단백질(170 mg/마우스)로 위관영양시키고, 위십이지장 및 소장 투과성을 특이적인 당 프로브(슈크로즈 및 락툴로즈/만니톨 각각)를 사용하여 기술한 바와 같이(14) 시험하였다. 조눌린/전HP2는 소장(도 4a) 및 위십이지장(도 4b) 투과성 둘다를 소 혈청 알부민(BSA)-처리된 대조군과 비교하여 증가하였다. 위십이지장 및 소장 투과성 각각은 조눌린/전HP2(도 4c 및 4d)에 노출시킨 지 48시간 내에 기준선으로 회귀하였다.

2개-쇄 성숙한 HP2가 IP에 영향을 미치는지를 측정하기 위하여, 위에서 기술한 생체내 실험을, 2개-쇄 단백질분해적으로 절단된 단백질을 투여함으로써 반복하였다. 일본쇄 조눌린과는 대조적으로, 2개-쇄 HP2(170 mg/마우스)는 BSA-처리된 대조군과 비교하여 위십이지장 또는 소장 투과성을 변경시키는데 실패하였다(도 4a 및 4b). 결합된, 이들 데이타는, 단백질분해적 절단에 의해 생성된 이의 2개-쇄 성숙한 HP2 형태를 제외한, 일본쇄 조눌린이 조눌린에 대해 보고된 가역적 투과 활성을 보유함을 나타낸다.

실시예 22

사람 장 점막내 조눌린 mRNA 발현 및 정량화

조눌린 양성 대상체로부터 사람 장 생검의 특이적인 프라이머 및 cDNA를 사용하여, 686 bp 단편을 증폭시켰으며, 이의 144 bp는 HP1 및 HP2 유전자 둘다의 a 쇄에 속하며 542bp는 HP1 및 HP2 유전자 둘다의 b-쇄에 속한다. 당해 단편의 서열분석은 HP로서 이의 동일성을 확인하였으나, HP1은 증폭된 영역내 일반적인 서열로 인하여 HP2와 구별될 수 없었다. 이를 극복하고 사람 장내에서 조눌린 유전자의 발현을 특이적으로 정량화하기 위하여, 건강한 개인(n=10), CD 환자(급성 상 질병(n=7), 및 글루텐이 없는 식이(GFD)이후 차도된 CD 질환 환자(n=3)의 장 점막으로부터 수득한 cDNA를 실시간 PCR에 의해 a2 쇄에 대해 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 분석하였다. 건강한 개인과 비교하여, 조눌린 mRNA 발현은 활성 질병이 있는 CD 대상체의 장 점막에서 증가하였다(3배 증가, P < 0.05). 글루텐이 없는 식이를 고수하는 3명의 복강 질환 대상체의 장 점막은 대조군과 비교하여 단지 1.5배의 조눌린 발현 증가를 나타내었다.

실시예 23

EGFR의 타이로신 포스포릴화를 증가시키는 재조합체 조눌린

밀 및 몇가지 다른 곡물 속에 존재하는 당단백질인 글리아딘 및 전형적인 CD(15)의 소장의 자가면역 손상에 관여하는 환경적 트리거(trigger)는 액틴 세포골격에서 EGF의 효과를 완전히 재생하며(16), 이러한 효과는 조눌린과 매우 유사하다(7, 10, 16). 또한, 구조적 분석은, 전-HP-2 b 쇄가 EGF-유사 활성에 필수적인 3개의 분자내 이황화물 결합을 형성하는 6개의 공간적으로 보존된 시스테인 잔기를 함유하는 EGF 모티프를 포함함을 나타내었다.

조눌린이 EGFR을 활성화시킬 수 있는지를 측정하기 위해, 증가하는 농도의 바큘로바이러스-기원한, 재조합체 조눌린을 Caco-2 장 상피 세포에 가하였다. 세포를 분해하고, 항-EGFR Ab로 면역침강시키고, 포스포타이로신 면역블롯팅(PY-Plus)에 대해 가공하였다. ≥3 mg/ml의 농도에서, 조눌린은 EGFR의 타이로신 포스포릴화를 증가시켰다(도 5a). TEER에서 조눌린-유도된 변경에 있어 EGFR의 역할을 추가로 확립하기 위하여, 위에서 기술한 시험관내 및 생체외 시험을 EGFR-선택적인 PTK 억제제, AG1478의 존재하에 수행하였다. Caco-2 세포를 2시간 동안 EGFR 선택적인 단백질 타이로신 키나제 억제제, AG1478(5 mM)와 함께 예비-항온처리하는 것은 Y1068 상에서 조눌린/전HP2-유도된 EGFR 포스포릴화를 방지하였다(도 5b). 유사하게, AG1478을 사용한 전처리는 조눌린의 반응시 TEER 감소를 폐지하였다(도 5c). 최종적으로, 조눌린의 트립신 분해는 EGFR을 활성화시키는 이의 능력을 현저히 감소시켰다(도 5d). 결합된 이들 데이타는, 일본쇄 조눌린이 EGFR을 활성화시키고 TEER에 있어서 EGFR-기원한 감소를 유도한 반면, 절단된 2개-쇄 HP2는 EGFR을 활성화시키고 IP를 증가시키는 것 둘다를 실패하였음을 제안한다.

실시예 24

재조합체 조눌린-유도된 EGFR 활성화 및 TEER 변화는 PAR ₂ -의존적이다.

Zot 활성 펩타이드 FCIGRL(AT1002)는 PAR₂-활성화 펩타이드(AP), SLIGRL와 구조적 유사성을 가지며, TEER에서 PAR₂-의존적인 변화를 유발하며(17), 이러한 발견은 WT에서는 입증되었으나, PAR2^-/- 마우스에서는 입증되지 않았다. 또한, PAR₂를 포함하는 몇개의 G 단백질 커플링된 수용체(GPCR)는 EGFR을 경활성화시켰다(18). Zot 및 조눌린은 유사한 작용 메카니즘을 공유하며(6) 조눌린 단백질 서열은 이의 b 쇄(FCAGMS)내 Zot-유사 및 PAR₂ AP-유사 모티프를 함유하므로, 조눌린-유도된 EGFR 활성화가 PAR₂-의존성인지 여부를 측정하였다.

Caco-2 세포에서 PAR₂의 siRNA-유도된 사일런싱은 EGFR의 PAR₂-의존성 전사촉진과 양립성인, 재조합체 조눌린(10 mg/ml)(도 6a)에 대한 반응으로 EGFR Y1068 포스포릴화를 약화시켰다.

조눌린에 대한 반응으로 EGFR 활성화에 있어 PAR₂에 대한 역할을 추가로 확립하기 위해, 소장 장벽 기능을 C57BL/6 WT 또는 PAR₂ ^-/- 마우스로부터 분리된 단편을 사용한 마이크로스냅웰 시스템에서 연구하였다. 예상한 바와 같이, 재조합체 조눌린은 C57BL/6 WT 마우스로부터의 장 단편에서 TEER을 감소시켰지만, PAR₂ ^-/- 마우스로부터 소장 단편에 있어 TEER, 장벽 기능 조절이 있는 EGFR의 이렇게 연결된 조눌린-유도된 PAR₂-의존성 전사활성화를 감소시키는데 실패하였다(도 6b).

본 발명은 HP2의 전구체로서 조눌린을 확인하였다. 성숙한 사람 HP는 이황화물 결합에 의해 공유 연합된 a 및 b 펩타이드 쇄로 구성된 이종이합체 혈장 당단백질이며, 여기서, b 쇄만이 글리코실화되어 있다(19). b 쇄(36 kDa)와는 달리, a 쇄는 2개 형태, 즉, α1(~9 kDa) 및 α2(~18 kDa)로 존재한다. 2개 쇄 중 하나 또는 둘다의 존재는 3개의 표현형, HP1-1, HP2-1, 및 HP2-2를 초래한다. 이들 HP 변이체는 만노즈-결합 렉틴-관련된 세린 프로테아제(MASP)로부터 발달되며(12, 20), 상보체 대조군 단백질을 함유하는 a 쇄 및 b 쇄는 키모트립신-유사 세린 프로테아제 도메인을 촉매적으로 사멸시킨다(21-24). MASP 계열의 다른 구성원은 세포 성장, 증식, 분화, 이주 및, 세포내 연결의 파괴에 관여하는 일련의 플라스미노겐-관련 성장 인자(EGF, HGF 등)를 포함한다. 이러한 다중도메인 구조에도 불구하고, 지금까지 HP에 지정된 유일한 기능은 Hb에 결합하여 안정한 HP-Hb 복합체를 형성함으로써 Hb-유도된 산화성 조직 손상을 방지하는 것이다(25). 이들의 전구체 형태에 대해 지금까지 어떠한 기능도 기술되지 않았다.

HP는 트랜스-골지 복합체내에서 절단되는 대신, 이들의 전구체 단백질이 세포질 세망내에서 상보체 C1r-유사 프로테아제(Cr1LP)에 의해 단백질분해적으로 프로세싱된다는 점에서 예외적인 분비성 단백질이다(13). 흥미롭게도, 세포질 세망 분획은 세포 분획이었으며, 여기서, 최대 조눌린 농도가 검출되었다(9).

조눌린의 주요 생물학적 효과는 세포내 TJ 기능을 조절하는 것이므로(7, 9-11), 재조합체 전-HP2를 장 투과성 검정에서 시험하였다. 전-HP2는 생체외 및 생체내 둘다에서 쥐 소장 점막을 가로질러 TEER을 투여량- 및 시간-의존적으로 감소시켰다. 조눌린이 이의 2개의 a2 및 b 소단위로 절단된 후 이의 투과 활성을 상실한다는 관찰은, 조눌린/전-HP-2 및 성숙한 2개-쇄 HP2가 분명한 생물학적 기능을 발휘한다는 개념을 추가로 뒷받침한다. HP 단백질 기능을 좌우하는데 있어서 단백질 구조의 중요성은 또한, 조눌린-교차 반응성 항-Zot Ab가 변성 조건하에서 HP1 a1 쇄를 인식하지만(도 1a 및 2b), 변성되지 않은 HP1를 인식하는데 실패한 발견에 의해 추가로 뒷받침된다. 결합된, 이들 데이타는 전-HP2로서의 조눌린의 동일성을 입증한다.

조눌린의 NH₂-말단 아미노산 서열은 HP에 대해서도 또한 주목된 유사성인(26), 사람 g 글로불린의 경쇄와 놀랄만한 유사성을 갖는다(7). HP-Hb 복합체의 청소(clearance)는 단핵세포/거대세포 스캐빈저 수용체(scavenger receptor), CD163에 의해 매개될 수 있다(25). 클러스탈 W 덴도그람 분석(Clustal W dendogram analysis)은, 다음의 감마 글로불린-유사 컨센수스 모티프와 함께 CD163 결합 부위의 바로 상부의 조눌린 b 쇄내 a 영역을 나타내었다: QLVE---V---P. 앞서 보고된 조눌린 서열과 당해 전-HP2 컨센수스 모티프사이의 불일치는 종간 차이로 인할 수 있다.

조눌린은 성장 인자-유사 반복물을 함유한다. 조눌린과 유사하게, 성장 인자는 세포내 밀착 연접 온전함(integrity)에 영향을 미친다(27, 28). 본 발명은, 이의 절단된 성숙한 형태가 아닌, 일본쇄 조눌린이 PAR₂를 통해 EGFR을 전사활성화시키며, TEER에 대한 이의 효과는 EGFR 또는 siRNA-유도된 PAR₂ 사일런싱의 약리학적 억제에 의해 방지됨을 나타낸다. 이는, 성숙한 2개-쇄 HP2에서가 아닌 일본쇄 조눌린에 있어서 성장 인자 모티프가 PAR₂를 통한 간접적인 전사활성화에 의해 밀착 연접 분해를 유도하는데 요구되는 분자 구조를 가짐을 제안한다.

CD의 환경적 트리거(trigger)인 글리아딘은 액틴 세포골격에 대한 EGF의 효과를 재생산하는 것으로 보고되어 있다(16). 이들 효과는 조눌린에 대해 보고된 효과와 매우 유사하다(7). 글리아딘은 CXCR3 케모킨 수용체에 결합하며(29) 이러한 상호작용은 장 세포(9) 및 전체 장 조직(10) 둘다로부터의 조눌린-전-HP2 방출에 커플링된다. 따라서, 글리아딘-관련된 EGF 효과는 조눌린 방출을 통해 매개되는 것으로 여겨진다. 장 세균 콜로니화는 또한 조눌린 방출에 대한 자극이다(8). 글리아딘 및 미생물 둘다는 조눌린의 편향된 관강 분비를 유발한다(8). 따라서, 연구들이 초기 조눌린 작용, 즉, 장 관강 측면에서 이의 활성에 초점이 맞추어졌다. 이러한 시도는 반직관적인 것으로 여겨질 수 있으며, EGFR 및 PAR₂ 둘다가 기저측으로 발현된다는 관측을 제공한다(3, 30). 그러나, 이들이 또한 꼭대기쪽(apically)으로 발현된다는 증거가 존재한다(31). 조눌린이 장 점막의 관강 측면에 적용되는 경우, 생체외 및 생체내 둘다에서 투과 효과를 발휘하였다는 사실은, 단백질이 또한 기저측으로 작용한다는 가능성에 이의를 제기하지 않는다. 환경적 트리거(즉, 세균, 글루텐)이 장 관강내에 존재하는 경우, 조눌린은 적어도 글리아딘의 경우에 CXCR3에 의해 매개되는 공정인, 장세포로부터 방출된다(29). 조눌린 방출 및 장 투과성에 있어서 후속적인 증가에 이어, 이러한 트리거는, 조눌린-발현 면역 세포가 기저측 측면에 대해 조눌린을 제공할 수 있는 점막하부에 도달할 수 있다. 유사한 양쪽(bilateral) 작용이 관강 및 장막 측면으로부터 둘다 작용하는 장 투과성을 조절하는 다른 세린 프로테아제인, 점막 비만 세포 프로테아제 II에 대하여 보고되었다(32).

상피 투과성을 조절하는데 있어서, EGFR 및 PAR₂ 둘다의 역할은 앞서 보고되어 왔다(33, 34). 그러나, 본 발명은, 2개의 수용체가 협동적으로 작용하여 소장 투과성을 조절한다는 첫번째 증거를 제공한다.

조눌린이 CD의 급성 상 동안 상향조절된다는 것은 보고되어 왔다(9, 10). HP-특이적인 프라이머를 사용하여, 본 발명은 최초로 사람 장내에서 조눌린 mRNA의 발현을 보고한다. 또한, 실시간 PCR 실험은, 조눌린 발현이 정상 대조군과 비교하여 CD 환자에서 증가되었음을 나타내었다. 조눌린의 증가된 발현은 글루텐이 없는 식이를 하는 CD 환자가 활성 CD 환자 및 정상 대조군에 대해 중간인 조눌린 발현에 대한 평균 값을 나타내었으므로 질병 활성과 상호관련되었다. 흥미롭게도, 팝(Papp) 및 공동-연구자들은 최근에, HP 유전자에 있어서 다형성이 CD 발달 및 이의 임상적 만연에 대한 신규 유전적 위험 인자임을 보고하였다(35).

전-HP의 사람 혈장 수준은 100 내지 300 mg/100ml이고, HP2-2는 100-260 mg/100 ml의 범위이다(36). HP의 거의 8%는 이들의 프로-형태(pro-form)를 분비하며(37), 이는, 생리학적 상황하에서 80-208 mg/ml의 전-HP2이 사람 혈장 속에 존재함을 제안한다. 따라서, 본원에 사용된 조눌린의 농도는 생리학적 범위내이며 조눌린이 병리학적 공정동안 상향조절되는 경우 활성화된 시그날링 경로의 가장 유력한 지표이다. CD 이외에, 조눌린의 상승된 수준은 T1D(11), 전신 홍반 루푸스(38), 및 강직성 척추염(39)을 포함하는 다른 자가면역질환에서 보고되었으며, 또한, 자가면역 질환의 발병기전에 있어서 조눌린 경로의 중요성이 또한 기술되어 있다. 조눌린이 몇가지 면역-매개된 질환의 급성 상 동안 과발현되며 이의 차단이 자가면역 반응의 발병을 방지한다는 관측과 함께, 이들 발견은, 조눌린이 이들 상태의 발병기전에 기여하며 면역-매개된 질환의 병리생물학 및 치료 선택에 있어 새로운 패러다임을 열었음을 제안한다.

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Claims (24)

1. 경상피 전기 저항을 증가시켜 감소된 세포 투과성을 초래하는 단계를 포함하여, 자가면역 질환을 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 세포가 소장 또는 위십이지장 세포인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 세포는 조눌린 mRNA의 감소된 발현을 갖는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상피 성장 인자 수용체를 억제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 상피 성장 인자 수용체가 일본쇄 조눌린에 대해 지시된 항체를 투여함에 의해 억제되는 방법.
6. 제1항에 있어서, PAR₂를 억제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 일본쇄 조눌린에 대해 지시된 항체를 투여하는 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 PAR₂가 siRNA를 사용하여 억제되는 방법.
9. 제1항에 있어서, CXCR3 수용체 결합을 통해 글리아딘에 의한 조눌린 방출을 피하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 T1D, 전신 홍반 루푸스, 복강 질환 (celiac disease), 강직성 척추염, 다발경화증, 류마티스 관절염, 크론병(Crohn's disease) 및 정신분열병으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
11. 상피 성장 인자 수용체를 억제하는 단계; 및
    PAR₂를 억제하는 단계를 포함하여, 자가면역 질환의 치료가 요구되는 개인에서 자가면역 질환을 치료하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 경상피 전기 저항은 증가되어 감소된 세포 투과성을 초래하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 세포가 소장 또는 위십이지장 세포인 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 세포가 조눌린 mRNA의 감소된 발현을 갖는 방법.
15. 제11항에 있어서, 상기 상피 성장 인자 수용체가 일본쇄 조눌린에 대해 지시된 항체를 투여함에 의해 억제되는 방법.
16. 제11항에 있어서, 상기 PAR₂가 siRNA를 사용하여 억제되는 방법.
17. 제11항에 있어서, 글리아딘을 억제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 T1D, 전신 홍반 루푸스, 복강 질환, 강직성 척추염, 다발경화증, 류마티스 관절염, 크론병(Crohn's disease) 및 정신분열병으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
19. 일본쇄 조눌린에 대해 지시된 항체를 투여함으로써 상피 성장 인자 수용체를 억제하고, PAR₂를 억제하는 단계를 포함하여, 복강 질환의 치료가 요구되는 개인에서 복강 질환을 치료하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 경상피 전기 저항은 증가되어 감소된 세포 투과성을 초래하는 방법.
21. 제19항에 있어서, 상기 세포가 소장 또는 위십이지장 세포인 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 세포가 조눌린 mRNA의 감소된 발현을 갖는 방법.
23. 제19항에 있어서, 상기 PAR₂가 siRNA를 사용하여 추가로 억제되는 방법.
24. 제19항에 있어서, 글리아딘을 억제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

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