KR20110138001A

KR20110138001A - 유색콩 추출물을 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR20110138001A
Application number: KR1020100058068A
Authority: KR
Inventors: 김진관; 김채욱; 정연수; 윤준원; 임경민; 주영협; 박영호; 신현정
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2010-06-18
Filing date: 2010-06-18
Publication date: 2011-12-26
Also published as: US20130089631A1; CN102970998A; JP2016065087A; JP6284920B2; WO2011159134A3; CN102970998B; WO2011159134A2; JP2013530181A

Abstract

본 발명은 유색콩 등으로부터 추출한 유색콩 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항혈전 효능 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 항혈전 조성물은 아데노신을 포함하고 있으며, 혈전 형성의 원인이 되는 심장혈관질환, 뇌혈관질환, 동맥경화증, 고혈압, 당뇨 등의 순환기계 질환의 치료에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

유색콩 추출물을 함유하는 조성물{Composition Comprising Colored-Bean Extracts}

본 발명은 유색콩 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항혈전 조성물에 관한 것이다.

현대사회는 식생활 양식의 변화와 내외부적인 환경 스트레스로 인해 중장년층에서 소위 성인병이라 일컬어지는 순환기계 질환이 큰 문제가 되고 있다. 2008년도 통계청 자료에 따르면, 동맥경화증, 뇌출혈, 뇌졸중, 뇌경색 등의 뇌혈관 질환과 심장 질환은 암발생 사망률을 제외하면 사망원인 1, 2위를 차지하고 있는 것으로 보고되었다. 이들 질환의 주요 원인은 혈전(thrombus) 으로서, 혈전증이란 과잉의 혈소판 응집반응에 의해 일어나는 병리현상이다. 혈관이 손상되었을 때 혈소판은 콜라겐(collagen), 트롬빈(thrombin), ADP(adenosine diphosphate) 등과 같은 각종 작용물질(agonists)의 자극에 응답해서 활성화되어 점착반응 (adhesion), 방출반응(secretion) 및 응집반응 (aggregation)을 일으킨다. 이 과정은 지혈(hemostasis) 뿐만 아니라 혈전증 (thrombosis) 등을 포함하는 순환계 질환에 중요한 역할을 담당한다.

한 예로 관상동맥질환을 들 수 있으며, 이는 전세계적으로 가장 흔한 사망원인으로 알려져 있다. 특히 급성관동맥 증후군(acute coronary syndrome) 은 직접적인 사망을 일으키는 관상동맥질환이다. 급성관동맥증후군은 불안정협심증 (Unstable angina), ST분절 비상승 심근경색(Non-ST-segment elevation myocardial infarction; NSTE; Non Q-wave MI), ST 분절 상승 심근경색(ST-elevation myocardial infarction; STE MI; Q-wave MI) 등으로 분류될 수 있으며, 전자의 2가지는 치료, 예후가 유사하기에 묶어서 NSTE ACS(Non-ST-elevation Acute Coronary Syndrome)로 칭하기도 한다. 만성안정성협심증(Chronic Stable Angina)에서는 죽상경화에 의해 관상동맥 유효직경이 감소되어 허혈을 유발하나 급성관상동맥증후군은 그 기전이 다르다. 급성관상동맥증후군은 죽상경화반의 파열 혹은 미란으로 유발된 관상동맥내 급성혈전(Intracoronary Acute Thrombosis)에 의해 혈류가 급속히 감소 혹은 차단되어 일어난다.

보다 구체적으로 설명하면, 급성관상동맥증후군에서 혈관 내 혈전형성과정은 외상으로 혈관손상이 온 후 지혈(hemostasis)이 일어나는 과정과 같다. 즉 취약성 동맥경화반(Vulnerable atherosclerotic plaque)에 파열 혹은 미란이 발생하면 내피세포 밑의 결체조직이 혈액에 노출된다. 혈액 속의 혈소판은 이에 부착되고(Platelet adhesion), 기계적 생화학적 자극으로 혈소판이 활성화되어 TxA2(thromboxane A2), ADP(adenosine diphosphate), 에피네프린(epinephrine) 등이 분비된다(Platelet activation). 이들 물질은 혈소판 표면의 당단백질 수용체(GP IIb/IIIa receptor)를 활성화시키고, 활성화된 GP IIb/IIIa 수용체는 피브리노겐(fibrinogen)을 매개로 혈소판들이 서로 엉켜 붙게 한다(Platelet aggregation). 혈소판은 수많은 경로를 통해 활성화되지만 최종적으로 GP IIb/IIIa 수용기를 통해 피브리노겐을 매개로 응집되므로, 이 과정이 혈소판 응집의 최종 공통경로(final common pathway)가 된다. 일차적으로 생성된 혈전은 혈소판이 풍부한 소위 “백색 혈전(white thrombus)”이며 지혈과정의 1차 지혈(primary hemostasis)에 해당된다.

이 때 생긴 PRT(platelet rich thrombus)는 죽상경화반 손상부위의 혈관벽에 생성되며 관상동맥을 완전히 폐색시키지 않는 것이 보통이다(Mural thrombus). 이는 임상적으로 NTSE ACS에 해당된다. PRT(Platelet rich thrombus) 상에 2차적으로 혈액 응고과정(coagulation)이 활성화되며 연쇄반응에 의해 트롬빈(factor IIa)이 생성된다. 트롬빈은 피브리노겐(fibrinogen)을 피브린(fibrin)으로 활성화시키고, 피브린은 그물 모양으로 얽히게 되면서(fibrin meshwork) 적혈구 등 혈액세포들이 포함된 혈전을 형성한다. 형성된 혈전은 소위 “적색 혈전(red thrombus)”으로서 지혈과정의 2차 지혈(secondary hemostasis) 에 해당된다. 국소적인 혈전/혈전용해 균형(Thrombosis/thrombolysis balance)이 혈전생성 방향으로 지속되면 혈관이 완전 폐색되어(Occlusive Thrombus) 임상적으로 STE MI로 발현된다.

항혈전 약제는 1 차 지혈에 관여하는 혈소판을 억제하는 항혈소판제제(Antiplatelet agent)와 2 차 지혈의 혈액응고(Coagulation)를 억제하는 항응고제(Anticoagulant)로 분류할 수 있다. 항혈소판제제로는 TxA2의 생성을 억제하는 아스프린(aspirin), ADP 수용체 차단제(ADP receptor blocker)인 클로피도그렐(clopidogrel)과 티클로피딘(ticlopidine), GP IIb/IIIa 수용체 차단제(GP IIb/IIIa receptor blocker)인 압식시맙(abciximab) 등이 있다. 또한 데오필린(theopylline), 몰시도민(molsidomine), 베라파밀(verapamil), 니페디핀(nifedipine), 니트로글리세린(nitroglycerine) 등은 cAMP와 cGMP의 생성을 촉진하여 Ca² ⁺의 동원을 억제하는 것으로 알려져 있다. 항응고제로서는 항트롬빈 III(antithrombin III)를 활성화시켜 트롬빈을 분해하는 헤파린(heparin), DTI(direct thrombin inhibitor)인 히루딘(hirudin), 비타민K 길항제인 와파린(warfarin) 등이 있다.

그러나, 위에서 언급된 약물들은 의약품이긴 하지만 인체에 지혈과다억제, 불임, 소화기 장애 등의 여러 부작용을 야기하는 문제점이 있다. 따라서, 항혈전 약물의 부작용을 획기적으로 줄이면서도 안전한 약물로 개발하는 것이 필요하다.

본 발명의 일실시예의 목적은 항혈전 효능이 인정되는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은 항혈전 효능이 인정되는 약학 조성물 또는 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.

물, C₁-C₅ 알코올 또는 그 혼합물을 이용하여 추출한 유색콩 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물이 개시된다.

본 발명의 일실시예에 따른 조성물은, 우수한 항혈전 효능이 인정되고, 부작용이 없는 천연물질을 사용하였으며, 약학 및 건강식품 분야 등에서 다양하게 활용 가능하다.

도 1은 울타리콩의 20% 에탄올 추출물을 HP-20 레진으로 분획한 50% 에탄올 분획물의 농도에 따른 혈소판 응집 억제 효능을 나타낸 그래프이다.

종래의 콩에 관한 연구는, 콩에서 약리활성을 나타내는 유효성분을 분리, 정제하는 방향으로 진행되었으며, 콩 자체의 의약적 용도에 대한 연구는 부족하였다. 또한 그 추출방법에 있어서도, 천연물에서 통상적으로 이용하는 추출법인, 고농도의 유기 용매를 이용한 추출방법을 사용하였다.

콩 추출물에는 밝혀진 성분 외에 아직도 여러 가지 미지의 성분들이 있으며, 이들 중 일부 성분은 인체에 유용한 약리효과를 나타내기도 한다. 본 발명의 발명자들은 천연물 및 생약 추출에서 일반적으로 사용되는 추출법에 대한 인식을 탈피하여, 저농도의 저급 알코올을 추출 용매로 사용하여 콩으로부터 추출물을 획득하였고, 이 추출물이 고농도 유기 용매를 추출 용매로 사용하는 경우보다 더 강력한 항혈전 효능이 있음을 밝혀냈다. 또한, 상기 콩 추출물에 대하여 레진을 이용하여 분획화를 진행함으로써, 더욱 강력한 항혈전 효능을 얻을 수 있음을 밝혀냈다.

본 발명의 일실시예에 따른 조성물은, 물, 유기용매 또는 물과 유기용매의 혼합물을 이용하여 추출한 콩 추출물의 분획물을 함유하는 것을 특징으로 한다. 일실시예에서, 본 발명에 따른 조성물은, 물, C₁-C₅ 알코올 또는 그 혼합물을 이용하여 추출한 유색콩 추출물의 분획물을 함유하는 항혈전 조성물일 수 있다.

일실시예에서, 상기 유기용매는, 특별히 제한되는 것은 아니며, C₁-C₅의 저급 알코올일 수 있다. 상기 C₁-C₅의 저급 알코올은, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, n-프로필알코올, n-부탄올 및 이소부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합용매일 수 있으며, 구체적으로는 에탄올이다. 또 다른 일실시예에서, 상기 C₁-C₅ 알코올의 농도는 1 내지 70% (v/v), 또는 1 내지 40% (v/v)이며, 구체적으로는 5 내지 25% (v/v), 보다 구체적으로는 7 내지 20% (v/v)이다. 예를 들어, 상기 용매는 5 내지 25% (v/v) 농도의 에탄올이며, 보다 구체적으로는 10% 또는 20% (v/v) 농도의 에탄올이다.

본 발명에 따른 조성물은, 물 또는 저농도의 저급 알코올을 이용하여 콩을 추출하게 된다. 본 발명의 발명자들은, 다양한 연구 및 반복적인 실험을 통해, 물을 포함한 여러 종류의 유기용매들 중에서 저급 알코올, 예를 들어 에탄올, 특히 저농도 에탄올을 이용하여 추출한 유색콩 추출물이 혈액 순환을 개선시키고, 비만 및 당뇨에 효과적이며, 고지혈증에 우수한 효과를 갖는다는 점을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

일실시예에서, 상기 유색콩 추출물의 분획물은, 물 또는 저급 알코올 추출물에 대한 레진 분리 분획물이며, 구체적으로는 HP-20 레진 분획물일 수 있다. 상기 레진은, 예를 들어, 폴리스티렌(polystylene)과 벤젠(benzene)의 중합체를 포함하는 합성 흡착제 컬럼이며, 구체적으로는 HP-20 레진(resin)이다. 본 발명의 발명자들은, 예를 들어, 저농도 에탄올을 이용하여 추출한 유색콩 추출물에 대한 다양한 분획을 추출하는 실험을 진행하였다. 실험 결과, 저농도 HP-20 레진 분획에 의해 그 항혈전 효능이 우수한 것으로 확인되었으며, 특히 물 분획에 비해 HP-20 레진 50% 에탄올 분획물의 효능이 매우 우수한 것으로 나타났다.

일실시예에서, 상기 유색콩 추출물의 분획물은, 유색콩의 물 또는 저급 알코올 추출물에 대한 레진 분리 분획물이며, 구체적으로는 저농도 에탄올을 사용하여 추출한 추출물을 HP-20 레진을 이용하여 분획화한 분획물일 수 있다.

본 발명에 따른 “유색콩(colored soybean)”이란, 낟알 껍질의 색이 짙은 빛깔을 띠는 콩을 총칭하는 의미이며, 검은색 뿐만 아니라 적색, 황색 또는 청색 등의 빛깔이 나는 경우도 포괄한다. 상기 유색콩은, 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 서리태, 서목태, 청태(푸르대콩), 황태, 울타리콩, 강낭콩, 얼룩강낭콩, 적두, 거두, 콩나물콩, 대두, 흑태, 녹두, 및 선비콩 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다. 일실시예에서, 본 발명에 따른 유색콩은 울타리콩일 수 있다. 유색콩의 명칭은 지역이나 분류, 방언의 영향 등으로 다양하게 호칭될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 “유색콩 추출물”이란, 유색콩에 대한 다양한 추출과정을 통해 추출된 물질을 총칭하며, 예를 들어, 물 또는 유기용매 등을 이용하여 추출된 물질을 포함하며, 또한 추출된 물질에 대한 다양한 분획물(예, HP-20 resin 분리 분획) 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 유색콩 추출물의 분획물을 함유하는 조성물은, 혈소판 응집을 억제하여 혈전생성을 저해하는 효능이 있으며, 혈관의 수축을 억제하여 혈관 이완을 유도하는 효능이 있다. 따라서, 이러한 효능을 통해, 혈액 순환 개선에 효과적이며, 비만, 당뇨 및 고지혈증 등의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일실시예에서, 상기 약학 조성물은 혈관 질환의 예방, 경감 또는 치료용 조성물일 수 있다. 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 약학 조성물은, 혈전생성 방지, 혈관수축 억제 및/또는 콜레스테롤 억제 효능이 인정된다. 구체적으로는, 상기 약학 조성물은, 항혈전 효능에 기인하는 혈액 순환 개선용일 수 있으며, 비만, 당뇨 및 고지혈증 등을 포함하는 혈관 질환의 경감 또는 치료에 효과적인 약학 조성물일 수 있다. 상기 혈관 질환은, 예들 들어, 비만, 당뇨, 뇌졸증, 뇌출혈, 동맥경화, 협심증, 심근경색, 고혈압, 빈혈, 편두통 또는 고지혈증 등을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물을 의약품에 적용할 경우에는, 상기 조성물을 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구 투여제 혹은 비경구 투여제로 제제화 할 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 제재로서는 정제 (錠劑), 환제 (丸劑), 과립제 (顆粒劑), 연·경 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제 (乳濁濟), 시럽제, 펠렛제 등을 들 수 있다. 또한, 상기 비경구 투여를 위한 제재로는 주사제, 점적제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제 (坐劑) 등을 들 수 있다. 본 발명의 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다.

또한, 상기 활성성분의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 일반적인 투여량은 0.001mg/kg/일 내지 2000mg/kg/일, 보다 구체적으로는 0.5mg/kg/일 내지 1500mg/kg/일이다.

또한, 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 건강식품 등을 제공한다. 상기 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 건강식품 등은 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 포함한다. 일실시예에서, 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 건강식품 등은 혈액 순환 개선용이며, 보다 구체적으로는 비만, 당뇨 및 고지혈증을 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 완화에 효과적인 건강식품 조성물 등일 수 있다. 상기 혈관 질환은, 예를 들어, 비만, 당뇨, 뇌졸증, 뇌출혈, 동맥경화, 협심증, 심근경색, 고혈압, 빈혈, 편두통 또는 고지혈증 등을 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 포함하는 다양한 형태의 식품 첨가제 또는 기능성 식품을 제공한다. 상기 조성물을 포함하는 발효유, 치즈, 요구르트, 주스, 생균제제 및 건강보조식품 등으로 가공될 수 있으며, 그 외 다양한 식품 첨가제의 형태로 사용될 수 있다.

일실시예에서 상기 조성물은 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외에도, 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조 성분을 더 포함할 수도 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라서 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분들의 첨가량은, 조성물 전체 중량을 기준으로, 0.01-5 중량%, 보다 구체적으로는 0.01-3 중량% 범위일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 제형은 용액, 유화물, 점성형 혼합물, 타블렛, 분말 등의 다양한 형태일 수 있으며, 이는 단순 음용, 주사 투여, 스프레이 방식 또는 스퀴즈 방식 등의 다양한 방법으로 투여될 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상술하지만, 하기 실시예 등은 본 발명의 효과를 예시적으로 확인하기 위한 것이며, 본 발명의 범주가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 울타리콩 10%에탄올 추출물의 HP-20 레진(resin)을 이용한 분리

건조된 울타리콩 1 kg을 10%의 에탄올 용액 5 L에 침지하여 60℃의 온도에서 3 시간 동안 환류 추출한 다음, 상온에서 일정 시간 동안 방치하였다. 추출액은 여과하여 감압 농축하고 동결 건조하여 10% 에탄올 추출물 시료를 제조하였다.

소수성 수지인 DIAION HP-20 (SUPELCO) 을 이용하여 하기와 같이 10% 에탄올 울타리콩 추출물에 대한 레진 분리 분획을 얻었다.

HP-20 레진을 이용한 분리를 위해, 컬럼에 30 cm 길이가 되도록 HP-20 레진을 충진 한 후, 1 L 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 50% 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 증류수를 이용하여 500 ml씩 2 회 각각 세척한 후에 이용하였다. 6 g의 10% 에탄올 울타리콩 추출물을 물에 녹인 후 HP-20 레진 충진 칼럼에 가한 후, 750 ml 증류수, 750 ml 50% 에탄올, 500 ml 에탄올을 순차적으로 넣어주면서 흘러나온 용매를 250 ml 삼각 플라스크로 받은 후 각각을 감압 농축하여 동결 건조하여 분획 시료를 제조하였다.

[실시예 2] 울타리콩 20%에탄올 추출물의 HP-20 레진(resin)을 이용한 분리

건조된 울타리콩 1 kg을 20%의 에탄올 용액 5 L에 침지하여 60℃의 온도에서 3 시간 동안 환류 추출한 다음, 상온에서 일정 시간 동안 방치하였다. 추출액은 여과하여 감압 농축하고 동결 건조하여 20% 에탄올 추출물 시료를 제조하였다.

소수성 수지인 DIAION HP-20 (SUPELCO) 을 이용하여 하기와 같이 20% 에탄올 울타리콩 추출물에 대한 레진 분리 분획을 얻었다.

HP-20 레진을 이용한 분리를 위해, 컬럼에 30 cm 길이가 되도록 HP-20 레진을 충진 한 후, 1 L 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 50% 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 증류수를 이용하여 500 ml씩 2 회 각각 세척한 후에 이용하였다. 6 g의 20% 에탄올 울타리콩 추출물을 물에 녹인 후 HP-20 레진 충진 칼럼에 가한 후, 750 ml 증류수, 750 ml 50% 에탄올, 500 ml 에탄올을 순차적으로 넣어주면서 흘러나온 용매를 250 ml 삼각 플라스크로 받은 후 각각을 감압 농축하여 동결 건조하여 분획 시료를 제조하였다.

[실시예 3] 울타리콩 30%에탄올 추출물의 HP-20 레진(resin)을 이용한 분리

건조된 울타리콩 1 kg을 30%의 에탄올 용액 5 L에 침지하여 60℃의 온도에서 3 시간 동안 환류 추출한 다음, 상온에서 일정 시간 동안 방치하였다. 추출액은 여과하여 감압 농축하고 동결 건조하여 30% 에탄올 추출물 시료를 제조하였다.

소수성 수지인 DIAION HP-20 (SUPELCO) 을 이용하여 하기와 같이 30% 에탄올 울타리콩 추출물에 대한 레진 분리 분획을 얻었다.

HP-20 레진을 이용한 분리를 위해, 컬럼에 30 cm 길이가 되도록 HP-20 레진을 충진 한 후, 1 L 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 50% 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 증류수를 이용하여 500 ml씩 2 회 각각 세척한 후에 이용하였다. 6 g의 30% 에탄올 울타리콩 추출물을 물에 녹인 후 HP-20 레진 충진 칼럼에 가한 후, 750 ml 증류수, 750 ml 50% 에탄올, 500 ml 에탄올을 순차적으로 넣어주면서 흘러나온 용매를 250 ml 삼각 플라스크로 받은 후 각각을 감압 농축하여 동결 건조하여 분획 시료를 제조하였다.

[실시예 4] 울타리콩 40%에탄올 추출물의 HP-20 레진(resin)을 이용한 분리

건조된 울타리콩 1 kg을 40%의 에탄올 용액 5 L에 침지하여 60℃의 온도에서 3 시간 동안 환류 추출한 다음, 상온에서 일정 시간 동안 방치하였다. 추출액은 여과하여 감압 농축하고 동결 건조하여 40% 에탄올 추출물 시료를 제조하였다.

소수성 수지인 DIAION HP-20 (SUPELCO) 을 이용하여 하기와 같이 40% 에탄올 울타리콩 추출물에 대한 레진 분리 분획을 얻었다.

HP-20 레진을 이용한 분리를 위해, 컬럼에 30 cm 길이가 되도록 HP-20 레진을 충진 한 후, 1 L 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 50% 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 증류수를 이용하여 500 ml씩 2 회 각각 세척한 후에 이용하였다. 6 g의 40% 에탄올 울타리콩 추출물을 물에 녹인 후 HP-20 레진 충진 칼럼에 가한 후, 750 ml 증류수, 750 ml 50% 에탄올, 500 ml 에탄올을 순차적으로 넣어주면서 흘러나온 용매를 250 ml 삼각 플라스크로 받은 후 각각을 감압 농축하여 동결 건조하여 분획 시료를 제조하였다.

[실시예 5] 울타리콩 70%에탄올 추출물의 HP-20 레진(resin)을 이용한 분리

건조된 울타리콩 1 kg을 70%의 에탄올 용액 5 L에 침지하여 60℃의 온도에서 3 시간 동안 환류 추출한 다음, 상온에서 일정 시간 동안 방치하였다. 추출액은 여과하여 감압 농축하고 동결 건조하여 70% 에탄올 추출물 시료를 제조하였다.

소수성 수지인 DIAION HP-20 (SUPELCO) 을 이용하여 하기와 같이 70% 에탄올 울타리콩 추출물에 대한 레진 분리 분획을 얻었다.

HP-20 레진을 이용한 분리를 위해, 컬럼에 30 cm 길이가 되도록 HP-20 레진을 충진 한 후, 1 L 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 50% 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 증류수를 이용하여 500 ml씩 2 회 각각 세척한 후에 이용하였다. 6 g의 70% 에탄올 울타리콩 추출물을 물에 녹인 후 HP-20 레진 충진 칼럼에 가한 후, 750 ml 증류수, 750 ml 50% 에탄올, 500 ml 에탄올을 순차적으로 넣어주면서 흘러나온 용매를 250 ml 삼각 플라스크로 받은 후 각각을 감압 농축하여 동결 건조하여 분획 시료를 제조하였다.

[실시예 6] 울타리콩 물 추출물의 HP-20 레진(resin)을 이용한 분리

건조된 울타리콩 1 kg을 증류수 5 L에 침지하여 60℃의 온도에서 3 시간 동안 환류 추출한 다음, 상온에서 일정 시간 동안 방치하였다. 추출액을 여과하여 감압 농축한 후, 동결 건조하여 물 추출물 시료를 제조하였다.

HP-20 레진을 이용한 분리를 위해, 컬럼에 30 cm 길이가 되도록 HP-20 레진을 충진 한 후, 1 L 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 50% 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 증류수를 이용하여 500 ml씩 2 회 각각 세척한 후에 이용하였다. 물을 이용하여 추출한 울타리콩 추출물 6 g을 물에 녹인 후 HP-20 레진 충진 칼럼에 가한 후, 750 ml 증류수, 750 ml 50% 에탄올, 500 ml 에탄올을 순차적으로 넣어주면서 흘러나온 용매를 250 ml 삼각 플라스크로 받은 후 각각을 감압 농축하여 동결 건조하여 분획 시료를 제조하였다.

[실시예 7] 서리태 추출물의 HP-20 레진(resin) 을 이용한 분리

건조된 서리태 1 kg을 20%의 에탄올 용액 5 L에 침지하여 60℃의 온도에서 3 시간 동안 환류 추출한 다음, 상온에서 일정 시간 동안 방치하였다. 추출액은 여과하여 감압 농축하고 동결 건조하여 20% 에탄올 추출물 시료를 제조하였다.

소수성 수지인 DIAION HP-20 (SUPELCO) 을 이용하여 하기와 같이 20% 에탄올 서리태 추출물에 대한 레진 분리 분획을 얻었다.

HP-20 레진을 이용한 분리를 위해, 컬럼에 30 cm 길이가 되도록 HP-20 레진을 충진 한 후, 1 L 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 50% 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 증류수를 이용하여 500 ml씩 2 회 각각 세척한 후에 이용하였다. 6 g의 20% 에탄올 서리태 추출물을 물에 녹인 후 HP-20 레진 충진 칼럼에 가한 후, 750 ml 증류수, 750 ml 50% 에탄올, 500 ml 에탄올을 순차적으로 넣어주면서 흘러나온 용매를 250 ml 삼각 플라스크로 받은 후 각각을 감압 농축하여 동결 건조하여 분획 시료를 제조하였다.

[실시예 8] 대두 추출물의 HP-20 레진(resin)을 이용한 분리

건조된 대두 1 kg을 20%의 에탄올 용액 5 L에 침지하여 60℃의 온도에서 3 시간 동안 환류 추출한 다음, 상온에서 일정 시간 동안 방치하였다. 추출액은 여과하여 감압 농축하고 동결 건조하여 20% 에탄올 추출물 시료를 제조하였다.

소수성 수지인 DIAION HP-20 (SUPELCO) 을 이용하여 하기와 같이 20% 에탄올 대두 추출물에 대한 레진 분리 분획을 얻었다.

HP-20 레진을 이용한 분리를 위해, 컬럼에 30 cm 길이가 되도록 HP-20 레진을 충진 한 후, 1 L 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 50% 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 증류수를 이용하여 500 ml씩 2 회 각각 세척한 후에 이용하였다. 6 g의 20% 에탄올 대두 추출물을 물에 녹인 후 HP-20 레진 충진 칼럼에 가한 후, 750 ml 증류수, 750 ml 50% 에탄올, 500 ml 에탄올을 순차적으로 넣어주면서 흘러나온 용매를 250 ml 삼각 플라스크로 받은 후 각각을 감압 농축하여 동결 건조하여 분획 시료를 제조하였다.

[실시예 9] 서목태 추출물의 HP-20 레진(resin)을 이용한 분리

건조된 서목태 1 kg을 20%의 에탄올 용액 5 L에 침지하여 60℃의 온도에서 3 시간 동안 환류 추출한 다음, 상온에서 일정 시간 동안 방치하였다. 추출액은 여과하여 감압 농축하고 동결 건조하여 20% 에탄올 추출물 시료를 제조하였다.

소수성 수지인 DIAION HP-20 (SUPELCO) 을 이용하여 하기와 같이 20% 에탄올 서목태 추출물에 대한 레진 분리 분획을 얻었다.

HP-20 레진을 이용한 분리를 위해, 컬럼에 30 cm 길이가 되도록 HP-20 레진을 충진 한 후, 1 L 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 50% 에탄올을 이용하여 500 ml씩 2 회, 1 L 증류수를 이용하여 500 ml씩 2 회 각각 세척한 후에 이용하였다. 6 g의 20% 에탄올 서목태 추출물을 물에 녹인 후 HP-20 레진 충진 칼럼에 가한 후, 750 ml 증류수, 750 ml 50% 에탄올, 500 ml 에탄올을 순차적으로 넣어주면서 흘러나온 용매를 250 ml 삼각 플라스크로 받은 후 각각을 감압 농축하여 동결 건조하여 분획 시료를 제조하였다.

[실험예 1] 콜라겐에 의해 유도된 사람 혈소판 응집 억제 관찰

에탄올 함량에 따른 추출물의 활성 차이를 비교하기 위하여 물 또는 에탄올 함량을 달리하여 추출한 울타리콩을 이용하여 하기의 실험을 실시하였다.

사람의 혈소판 농축 혈장을 (Platelet Rich Plasma, PRP)를 분리하기 위하여, 3.2% 구연산 나트륨(sodium citrate)을 항응고제로 사용하였으며, 2 주일 이상 약물을 복용하지 않은 건강한 남성의 정맥으로부터 혈액을 채취하였다. 채혈된 혈액 150 g을 15 분간 원심 분리한 후, 상층액(PRP)을 얻고 잔사를 다시 원심분리하여 혈소판 결핍 혈장(platelet poor plasma, PPP)를 분리하였다. 분리된 PRP의 혈소판 수는 세포 카운터를 사용하여 세고, PRP를 PPP로 희석하여 1 ml 당 3x10⁸ 개의 혈소판이 포함되도록 희석한 뒤에 실험에 사용하였다.

혈소판의 응집 활성은 혈소판 응집계(lumi-aggregometer, Chrono-Log Co., USA)를 이용하여 흡광도 변화로써 측정하였다. 2 분간 37℃가 되도록 열혼합기(thermomixer)에서 선 배양한 PRP에 울타리콩 추출물을 200 ㎍/ml 농도가 되도록 가하고 7 분간 배양하였다. 배양된 PRP 500 ㎕를 실리콘이 코팅된 혈소판 응집계용 큐벳에 넣고 3 분간 배양하였다. 그런 다음, 혈소판 응집 유발 시료인 콜라겐을 최대 응집을 일으키는 최소 농도인 1-3 ㎍/ml를 가하고, 이 후 6 분간 반응을 관찰하였다. 관찰 결과, 콜라겐만 처리한 대조군의 혈소판 응집 억제율을 0%로 했을 때의 비교값을 표 1(혈소판 응집 억제율(%))에 나타내었다.

시료	억제율 (%)
물 추출물	69.0
10% 에탄올 추출물	57.3
20% 에탄올 추출물	76.3
30% 에탄올 추출물	38.7
40% 에탄올 추출물	34.7
50% 에탄올 추출물	39.7
70% 에탄올 추출물	10.7

표 1을 참조하면, 물과 10%, 20% 에탄올 추출물이 다른 추출물에 비해 혈소판 응집 억제 효능이 우수한 것으로 나타났다. 위의 각 에탄올 추출물들을 HP-20 레진을 이용하여 분획화를 진행하였을 때 그 활성의 변화를 알아보기 위해 실시예 1 내지 5에 기재된 것과 같이 HP-20 레진으로 분획화를 진행하였다.

[실험예 2] 에탄올 함량별 추출물의 HP-20 레진을 이용한 분획에 대한 혈소판응집 억제 활성

실시예 1 내지 5에 개시된 방법으로, HP-20 레진으로 분획하여 얻은 울타리콩의 물 분획물과 50% 에탄올 분획물을 처리하여 실험예 1과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다. 실험 결과는 하기 표 2(혈소판 응집 억제율(%))에 나타내었다.

	HP-20 레진 분획 전	HP-20 레진 분획 후
	HP-20 레진 분획 전	물 분획	50% 에탄올 분획
	200 ㎍/ml	200 ㎍/ml	100 ㎍/ml	200 ㎍/ml
10% 에탄올 추출물	57.3	8	81	-
20% 에탄올 추출물	76.3	39.7	68	100
30% 에탄올 추출물	38.7	-	29	62
40% 에탄올 추출물	34.7	20	29	69
70% 에탄올 추출물	10.7	<5	-	67

표 1과 표 2를 참조하면, 효과가 비교적 약하였던 30%, 40%, 70% 에탄올 추출물도 HP-20 레진으로 분획화를 진행한 50% 에탄올 분획물의 경우에는 그 활성이 증가된 것으로 나타났다. 또한, 도 1에는 울타리콩의 20% 에탄올 추출물을 HP-20 레진으로 분획한 50% 에탄올 분획물의 농도에 따른 혈소판 응집 억제 효능을 나타내었으며, 농도 의존적으로 혈소판 응집 억제 효능이 우수한 것으로 나타났다.

이를 통해서 HP-20 레진을 이용한 분획화 방법이 혈소판 응집 억제 효능을 50% 에탄올 분획으로 집중화시키는 것으로 확인된다.

[실험예 3] 각 콩의 HP-20 레진 분획별 혈소판응집 억제 활성

다양한 콩에 대해서도 혈소판 응집 억제 효능을 평가하기 위해 효능이 가장 우수한 것으로 나타난 20% 에탄올 추출물에 대하여, 실시예 7 내지 9에 개시된 방법으로 HP-20 레진을 이용한 분획화를 진행하였다.

실험예 1과 동일한 조건에서 각 콩의 HP-20 레진 분획에 의한 물 분획과 50% 에탄올 분획에 대해 200 ㎍/ml을 처리하여 실험을 진행하였다. 실험 결과는 하기 표 3(혈소판 응집 억제율(%))에 나타내었다.

	HP-20 레진 분획 전	HP-20 레진 분획 후
	HP-20 레진 분획 전	물 분획	50% 에탄올 분획
	200 ㎍/ml	200 ㎍/ml	100 ㎍/ml	200 ㎍/ml
대두	19.3	4.3	66.0	91.3
서목태	25.0	1.0	82.0	90.7
서리태	65.3	3.7	69.3	95.7
울타리콩	76.3	39.7	93.0	100.0

표 3을 참조하면, 울타리콩 뿐만 아니라 모든 콩에서, 20% 에탄올 추출물과 비교하여, HP-20 레진을 이용한 50% 에탄올 분획에서 혈소판 응집 억제 효능이 현저히 증가된 것으로 나타났다. 이는 실험예 2에서와 마찬가지로 HP-20 레진을 이용한 용매 분획이 활성을 증가시키는 주요 방법임을 알 수 있고, 비교적 활성이 좋았던 울타리콩과 서리태 뿐만 아니라 활성이 상대적으로 낮은 것으로 나타났던 대두에서도 혈소판 응집 억제 활성을 증가시키는 방법임이 확실하다.

[실험예 4] 혈소판응집 자극원별 활성 억제 특이성 관찰

활성이 가장 우수했던 각 콩의 20% 에탄올 추출물의 HP-20 레진 50% 에탄올 분획에서, 혈소판 응집 자극원에 따라 특이적 활성 억제 효능을 보이는지 살펴보기 위한 실험을 실시하였다.

혈관이 손상되면 그 부위의 내피세포층이 파괴되면서 혈액내로 노출되는 콜라겐 (collagen), 혈소판에서 분비하는 ADP(adenosine diphosphate), 트롬빈(thrombin)은 혈소판 응집을 자극하는 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 따라서 HP-20 레진 50% 에탄올 분획이 ADP, 트롬빈 (thrombin) 에 의한 활성 억제 특이성을 가지는지 평가를 실시하였다. 평가는 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 실시하였으며, 단지 실험예 1의 콜라겐 대신 ADP, 트롬빈 자극을 가하였다. 그 결과는 표 4에(혈소판 응집 억제율(%)) 나타내었다.

	ADP	트롬빈
대두	75.0	45.0
서목태	83.5	58.0
서리태	74.5	49.7
울타리콩	99.0	57.0

표 4에서 알 수 있는 것처럼, HP-20 레진 50% 에탄올 분획은 콜라겐으로 유도된 혈소판 응집뿐만 아니라 ADP, 트롬빈 등의 다른 자극제로 유도된 혈소판 응집에 대해서도 억제 효과가 나타났다.

[실험예 5] 각 콩의 HP-20 레진 50% 에탄올 분획에 대한 혈소판응집 후 활성화 물질 분비 억제 효능 관찰

각 콩의 HP-20 레진 50% 에탄올 분획이 혈소판 응집시 생성되는 트롬복산 생성을 억제시키는 효과를 살펴보기 위해서, 실험예 1에서 사용한 PRP에 시료를 400 ㎍/ml이 되도록 가하고 37℃에서 10 분간 배양한 후, 콜라겐 5 ㎍/ml을 가하고 6 분간 반응시켰다. EDTA 2 mM, 인도메타신(Indomethacin) 50 μM을 가하여 반응을 종결시키고 2000xg에서 20 분간 원심분리하여 상층액만을 취하여 생성된 트롬복산을 효소면역법을 사용하여 정량하였다. 그 결과는 표 5(트롬복산 생성 억제율 (%))에 나타내었다.

	억제율 (%)
대두	57.6
서목태	54.1
서리태	47.9
울타리콩	74.4

표 5에서 볼 수 있는 것처럼, HP-20 레진 50% 에탄올 분획은 혈소판 응집후 생성되는 트롬복산 생성을 억제하는 것으로 관찰되었다.

[실험예 6] SD 래트(rat)로부터 분리한 혈소판 응집 억제 효능 관찰

상기에서 효능을 관찰했던 울타리콩의 HP-20 레진 50%에탄올 분획에 대하여 래트 (rat) 로부터 분리한 혈소판의 응집 억제 효과가 있는지 살펴보기 위하여 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 자극원인 콜라겐과 ADP의 농도를 각각 15 ㎍/ml, 10 uM 농도로 실험을 수행하였다. 시료의 처리 농도는 200 ㎍/ml 이었으며 그 결과는 표 6(혈소판 응집 억제율 (%))에 나타내었다.

	콜라겐	ADP
울타리콩	83	69

표 6에서 알 수 있는 것처럼, 울타리콩의 HP-20 레진 50% 에탄올 분획은 사람 뿐만 아니라 래트에서도 혈소판 응집억제 효과가 높은 것으로 나타났다.

Claims

물, C₁-C₅ 알코올 또는 그 혼합물을 이용하여 추출한 유색콩 추출물의 레진 분획물을 함유하는 항혈전 조성물.
제 1 항에 있어서,
C₁-C₅ 알코올의 농도는 1% 내지 40% (v/v)인 항혈전 조성물.
제 1 항에 있어서,
C₁-C₅ 알코올은, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, n-프로필알코올, n-부탄올 및 이소부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상을 이용한 항혈전 조성물.
제 1 항에 있어서,
유색콩은 서리태, 서목태, 청태, 황태, 울타리콩, 강낭콩, 얼룩강낭콩, 적두, 거두, 콩나물콩, 대두 및 흑태로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 둘 이상인 항혈전 조성물.
제 1 항에 있어서,
레진 분획물은 유색콩 추출물을 폴리스티렌(polystylene)과 벤젠(benzene)의 중합체를 포함하는 합성 흡착제 컬럼을 사용하여 분획화한 분획물인 항혈전 조성물.
제 1 항에 있어서,
C₁-C₅ 알코올은, 5 내지 25%(v/v) 농도의 에탄올인 항혈전 조성물.
제 1 항에 있어서,
유색콩 추출물의 레진 분획물은,
에탄올을 이용하여 추출한 유색콩 추출물에 대한, 폴리스티렌(polystylene)과 벤젠(benzene)의 중합체를 포함하는 합성 흡착제 컬럼 분획물인 항혈전 조성물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관 질환의 경감 또는 치료용 약학 조성물.
제 8 항에 있어서,
상기 혈관 질환은, 비만, 당뇨, 뇌졸증, 뇌출혈, 동맥경화, 협심증, 심근경색, 고혈압, 빈혈, 편두통 또는 고지혈증인 혈관 질환의 경감 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관 질환의 예방 또는 완화용 건강식품 조성물.
제 10 항에 있어서,
상기 혈관 질환은, 비만, 당뇨, 뇌졸증, 뇌출혈, 동맥경화, 협심증, 심근경색, 고혈압, 빈혈, 편두통 또는 고지혈증인 혈관 질환의 예방 또는 완화용 건강식품 조성물.