KR20110128582A

KR20110128582A - 쉬와넬라 변이균주, 제조방법 및 그 용도

Info

Publication number: KR20110128582A
Application number: KR1020100048104A
Authority: KR
Inventors: 장인섭; 최동건; 최인걸
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2010-05-24
Filing date: 2010-05-24
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2030-05-24
Also published as: KR101235170B1

Abstract

본 발명의 쉬와넬라 변이균주는 종래의 쉬와넬라 균주와는 달리 값싼 6탄당을 효과적으로 대사(분해)하고, 상기 대사과정에서 발생한 전자를 금속산화물에 공여할 수 있으므로 이를 미생물 연료전지에 사용하는 경우 미생물 연료전지의 효율 및 경제성을 현저하게 개선시킬 수 있다.

Description

쉬와넬라 변이균주, 제조방법 및 그 용도{Shewanella Variants. Manufacturing method and use thereof}

본 발명은 신규한 쉬와넬라 변이균주, 제조방법 및 그 용도에 관한 것으로서. 보다 상세하게는 혐기적 조건에서 6탄당을 대사할 수 있는 신규한 쉬와넬라 변이균주, 제조방법 및 이를 이용한 미생물 연료전지를 제공하는 것이다.

유전자 염기서열의 분석을 바탕으로 탄소를 에너지원으로 이용하는 쉬와넬라(Shewanella) 균주의 모든 대사경로가 밝혀졌다. 쉬와넬라 균주는 에너지원으로써 3탄당 이하의 탄수화물을 이용하여 생합성에 필요한 여러 가지 대사산물들을 합성할 수 있으나, 4~6탄당의 탄수화물은 대사하지 못하는 것으로 알려졌다. 이는 6탄당 탄소화물을 대사할 수 있는 경로를 갖고 있음에도 대사에 관련된 몇몇 효소의 결핍 때문에 대사경로가 퇴화한 것으로 보고 있다. 또한, 4~6탄당 탄수화물을 세포 내부로 수용하는데 관여하는 포스포 트랜스포레이즈 시스템이 대장균의 일종인 이콜라이 균주에서 41개의 관련된 유전자가 발견된데 비해 쉬와넬라 균주는 단 한 개의 시스템만을 갖고 있다. 세포 외부에 존재하는 6탄당의 탄수화물은 PTS (Phosphotransferase system)를 통해 세포 내로 흡수되고 대사에 사용될 수 있는 형태인 인산화 당으로 바꿔준다. 하지만 쉬와넬라 균주에는 위와 같은 시스템이 단 한 개만 존재하여 6탄당의 탄수화물을 대사하는데 어려움이 있다.

한편, 미생물 연료전지(Microbial fuel cell; MFC)는 생물 또는 그의 일부를 사용하여 생물의 에너지 대사에서 발생하는 환원력을 전기에너지로 전환하는 장치이다. 구체적으로 쉬와넬라 균주는 혐기 호흡 과정 중 외부에 존재하는 산화된 형태의 금속물질을 환원시키는 능력을 갖고 있어 미생물연료전지 시스템에서 전기를 생산해내는데 이용된다. 그런데, 상술한 바와 같이 종래의 쉬와넬라 균주는 값이 비싼 저탄당(3탄당 이하)의 탄수화물을 대사할 수 있을 뿐, 가격이 저렴하고 에너지 발생효율이 높은 포도당, 과당과 같은 6탄당의 탄수화물을 대사할 수 없어 에너지 효율이 극히 떨어지는 문제가 있었다.

본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 혐기적 조건에서 6탄당을 대사할 수 있는 쉬와넬라 변이균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 혐기적 조건에서 6탄당을 대사할 수 있는 쉬와넬라 변이균주의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 세번째 해결하려는 과제는 본 발명의 쉬와넬라 변이균주의 대사과정을 통해 외부 금속이온을 환원시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 네번째 해결하려는 과제는 본 발명의 쉬와넬라 변이균주를 포함하여 에너지 발생효율을 향상시킬 수 있는 미생물 연료전지를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 첫번째 과제를 달성하기 위하여, 6탄당을 대사할 수 없는 쉬와넬라 균주의 내부에, 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자 및 상기 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자를 도입하여 혐기적 조건에서 6탄당을 대사하는 특성을 가지는 쉬와넬라 변이균주를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 쉬와넬라 균주는 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis MR-1 ATCC 700550)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 6탄당은 포도당, 과당 , 갈락토오스, 만니톨, 슈크로스, N-아세틸글루코사민 및 셀루비오스 중 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자는 glf(ZMO0366), sugar transporter(ZMO0293), glucose-galactose transporter(SO_2213.1), glucose/galactose transporter(SO_3503) 중 어느 하나 이상이고, 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자는 glk(ZMO0369), pgi(JW3985), pfkA(JW3887), fbaA(JW2892) 및 gapC(JW1413) 중 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 전방 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 후방 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 서열번호 3으로 표시되는 전방 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 후방 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 제공한다.

상기 두번째 과제를 달성하기 위하여, 1) 6탄당을 대사할 수 없는 쉬와넬라 균주를 준비하는 단계, 2) 상기 쉬와넬라 균주에 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자 및 상기 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자를 형질전환시켜 혐기적 조건에서 6탄당을 대사하는 특성을 가지는 쉬와넬라 변이균주를 생산하는 단계를 포함하는 쉬와넬라 변이균주의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 2) 단계는, a) 플라스미드에 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자 및 상기 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자를 도입하여 재조합 플라스미드를 제작하는 단계, b) 상기 재조합 플라스미드로 숙주세포를 형질전환시키는 단계, 및 c) 상기 형질전환된 숙주세포를 쉬와넬라 균주과 접합시켜 상기 재조합 플라스미드를 공여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 쉬와넬라 균주는 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis MR-1 ATCC 700550)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 6탄당은 포도당, 과당, 갈락토오스, 만니톨, 슈크로스, N-아세틸글루코사민 및 셀루비오스 중 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 숙주세포는 대장균일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 a) 단계는, 상기 제5항의 프라이머 세트를 이용하여 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자인 glf를 증폭하고, 제6항의 프라이머 세트를 이용하여 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자인 glk를 증폭하는 단계를 포함한다.

상기 세번째 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 쉬와넬라 변이균주에 6탄당을 제공하여, 상기 6탄당의 대사과정에서 발생하는 전자를 외부 금속이온에 전달하여 상기 외부 금속이온을 환원시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 6탄당은 포도당, 과당, 갈락토오스, 만니톨, 슈크로스, N-아세틸글루코사민 및 셀루비오스 중 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 금속이온은 (Mn(VI), Fe(III), Cr(VI), U(VI)일 수 있다.

상기 네번째 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 쉬와넬라 변이균주를 포함하는 미생물 연료전지를 제공한다.

본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 쉬와넬라 변이균주가 대사할 수 있는 6탄당을 더 포함할 수 있다.

이하, 본 명세서에서 사용된 용어에 대해 간략히 설명한다.

'작동적으로 결합된(operatively linked to)'은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독 과정을 조절하게 된다.

세포와 관련하여 사용되는 용어 '재조합(recombinant)'은 세포가 이형의 핵산을 복제하거나 이형의 핵산에 의해 코드화되는 펩타이드 또는 단백질을 발현하는 것을 가리킨다. 또한 재조합 세포는 세포의 본래 형태에서 발견되는 유전자를 발현시킬 수 있으나, 변형된 유전자가 인공적인 방법에 의해 세포로 재도입 되어지기도 한다.

본원에 사용된 "벡터"라는 용어는 외래 유전자를 숙주 세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주 세포 내로 유입할 수 있는 방안을 갖추어야 하고, 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비하여 한다. 여기서, 외래 유전자로는 예를 들면 glf, glk 가 해당된다.

본원에 사용된 "플라스미드"라는 용어는 일반적으로 외래 유전자가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 벡터에 작동적으로 연결되어 형성된 환상의 DNA 분자를 말한다. 그러나, 플라스미드는 목적하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 작제하기 위해 유전자 재조합에 의해 특정한 제한 효소에 의해 분해되고 새로운 유전자를 도입하는 벡터로 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서는 플라스미드와 벡터는 상호교환적으로 사용되며, 유전공학 분야에 통상의 지식으로 가진 자라면 그들의 명칭을 구분하지 않더라도 그 의미를 충분히 이해할 것이다.

본원에 사용된 용어 "접합(conjugation)"이란 플라스미드를 갖고 있는 공여자(donor)가 플라스미드를 갖고 있지 않는 수용자(recipient)를 만나면 두 세포 사이에 세포질 통로가 형성되게 된다. 이때 형성된 통로를 통해 외래 플라스미드가 이동하게 된다.

본원에 사용된 용어 "6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자"는 이는 6탄당의 촉진 확산 단백질을 코딩하는 유전자를 의미하는 것으로서, 6탄당의 분해과정에서 외부의 6탄당을 쉬와넬라 균주의 내부로 도입(흡수)하는 기능을 수행하는 효소를 코딩하는 외래유전자로서 예를 들어 glf (glucose facilitated diffusion protein)일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자"는 6탄당을 직접적으로 분해하는데 필수적인 효소이나 쉬와넬라 균주에는 결여된 효소를 코딩하는 외래 유전자를 의미하는 것으로 예를 들어 6탄당이 포도당인 경우 외래 유전자 glk (glucokinase)는 해당과정 중 첫 번째로 작용하는 효소로써 포도당을 인산화 시켜주는 필수 효소(key enzmye)이다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 쉬와넬라 균주에 도입될 수 있는 재조합 플라스미드의 개열지도이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 재조합 플라스미드의 전기영동사진이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이 쉬와넬라 균주는 혐기 호흡 과정 중 외부에 존재하는 산화된 형태의 금속물질을 환원시키는 능력을 갖고 있어 미생물연료전지 시스템에서 전기를 생산해내는데 이용된다. 그런데, 상술한 바와 같이 종래의 쉬와넬라 균주는 값이 비싼 저탄당(3탄당 이하)의 탄수화물을 대사할 수 있을 뿐, 가격이 저렴하고 에너지 발생효율이 높은 포도당, 과당과 같은 6탄당의 탄수화물을 대사할 수 없어 에너지 효율이 극히 떨어지는 문제가 있었다.

이에 본 발명의 한 특징에 따르면, 6탄당을 대사할 수 없는 통상의 쉬와넬라 균주의 내부에, 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자 및 상기 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자가 도입된 쉬와넬라 변이균주를 제작하였고, 상기 쉬와넬라 변이균주가 혐기적 조건에서 6탄당을 대사할 수 있는 것을 확인하였다.

이 경우 바람직하게는 본 발명에 사용될 수 있는 쉬와넬라 균주는 6탄당을 대사(분해)할 수 없는 것이면 종류의 제한없이 적용될 수 있으며, 본 발명에서는 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis MR-1 ATCC 700550)를 예시하였지만 이에 제한되는 것은 아니며 유전자 염기서열분석이 완료된 다른 종류의 쉬와넬라 균주에도 적용되는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

한편, 상기 6탄당은 종류의 제한은 없으나, 필요에 따라, 포도당, 과당, 갈락토오스, 만니톨, 슈크로스, N-아세틸글루코사민 및 셀루비오스 등일 수 있으며, 보다 바람직하게는 포도당일 수 있다.

본 발명의 한 특징에 있어서, 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자 및 상기 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자는 6탄당을 대사(분해)할 수 없는 특징을 가지는 쉬와넬라 균주에 형질전환되어 상기 쉬와넬라 균주가 6탄당을 대사할 수 있도록 하기 위한 것이다. 따라서, 대사(분해)하려는 6탄당의 종류에 따라 형질전환되는 외래 유전자의 종류를 달리할 수 있다. 구체적으로 포도당을 대사하려는 경우 포도당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자는 glf(ZMO0366, 서열번호 1), sugar transporter(ZMO0293)일 수 있으며, 포도당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래유전자는 glk(ZMO0369, 서열번호 2), pgi(JW3985), pfkA(JW3887), fbaA(JW2892), gapC(JW1413)일 수 있다.

만일, 분해하려는 6탄당이 갈락토스인 경우 갈락토스의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자는 glucose-galactose transporter(SO_2213.1), glucose/galactose transporter(SO_3503)일 수 있으며, 갈락토스의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래유전자는 gluP(SO_2214), UDP-galactose 4-epimerase, putative(SO_3173) 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 혐기적 조건은 통상적으로 사요오디는 조건인 산소를 제거하기 위하여 수소 또는 질소를 이용하여 조성할 수 있으며, 이는 배지 내 산소가 H₂O나 N₂O로 전환되면서 제거된다. 산소는 호기적 환경에서 최종전자수용체로 작용하게 되고, 산소가 없는 혐기적 환경에서는 금속이온이나 산화된 형태의 물질들이 최종전자수용체로서의 역할을 수행하게 된다.

본 발명의 다른 특징에 따르면, 쉬와넬라 변이균주의 제조방법은 1) 6탄당을 대사할 수 없는 쉬와넬라 균주를 준비하는 단계, 2) 상기 쉬와넬라 균주에 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자 및 상기 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자를 형질전환시켜 혐기적 조건에서 6탄당을 대사하는 특성을 가지는 쉬와넬라 변이균주를 생산하는 단계를 포함한다. 이하 중복되는 내용은 제외하고 설명하기로 한다.

먼저, 1) 단계로서 6탄당을 대사할 수 없는 쉬와넬라 균주를 준비하며 이에 대한 구체적인 내용은 상술한 바와 같다.

다음 2) 단계로서 상기 쉬와넬라 균주에 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자 및 상기 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자를 형질전환시켜 혐기적 조건에서 6탄당을 대사하는 특성을 가지는 쉬와넬라 변이균주를 생산한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 2) 단계는, a) 플라스미드에 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자 및 상기 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자를 도입하여 재조합 플라스미드 벡터를 제작하는 단계, b) 상기 재조합 플라스미드 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계, 및 c) 상기 형질전환된 숙주세포를 쉬와넬라 균주과 접합시켜 상기 재조합 플라스미드를 공여하는 단계를 포함한다.

먼저, a) 단계로서 플라스미드에 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자 및 상기 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자를 도입하여 재조합 플라스미드 벡터를 제작한다.

본 발명에 이용되는 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol.,158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4?λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으며, 쉬와넬라가 갖고 있는 플라스미드 숙주 특이성을 고려하여 보다 바람직하게는 broad host range 플라스미드인 pBBR1MCS-2(NCBI accession NO. U23751)를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명에서는 서열번호 1, 2로 표시되는 신규한 프라이머 쌍을 이용하여

6탄당 중 포도당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자인 서열번호 5로 표시되는 glf 유전자를 증폭하였고, 서열번호 3, 4로 표시되는 신규한 프라이머 쌍을 이용하여 6탄당 중 포도당의 대사(분해)에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자인 서열번호 6으로 표시되는 glk 유전자를 증폭하였다. 그 뒤 상업적으로 널리 알려진 pBBR1MCS-2(서열번호 7)에 상기 2개의 외래유전자들을 작동가능하도록 삽입하여 재조합 플라스미드 벡터(도 1, 서열번호 8)를 제조하였으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자가 목적하는 6탄당의 대사를 위하여 적절한 유전자를 선택하고 이를 통상의 플라스미드 벡터에 삽입하여 재조합 플라스미드 벡터를 제작하는 것은 자명한 일이다.

다음, b) 상기 재조합 플라스미드 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다.

본 발명의 방법에서 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli DH5α, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 외래유전자를 포함하는 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 외래유전자를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell

Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 형질전환된 숙주세포의 배양은 당업계에서 통상적으로 이용되는 배지를 이용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 형질전환체가 원핵세포(예컨대, E. coli)인 경우, LB(Luria-Bertani) 배지를 이용하여 형질전환체를 배양할 수 있다. 형질전환체가 동물세포인 경우에는, 예컨대, Eagles's MEM(Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959))을 이용하여 형질전환체를 배양할 수 있다.

형질전환체의 다양한 배양방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있고, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

그 뒤 c) 상기 형질전환된 숙주세포를 쉬와넬라 균주과 접합시켜 상기 재조합 플라스미드를 공여할 수 있다. 구체적으로 쉬와넬라 균주에 재조합 플라스미드를 도입하는 방법은 상술한 여러가지 방법을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 형질전환된 숙주세포를 쉬와넬라 균주과 접합시켜 상기 재조합 플라스미드를 공여하는 것이 전기충격법 등의 방법으로 쉬와넬라 균주를 형질전환시키는 방법에 비하여 수율이 현저하게 개선되었다(실시예 2 및 비교예 1 참조)

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 본 발명의 쉬와넬라 변이균주에 6탄당을 제공하여, 상기 6탄당의 대사과정에서 발생하는 전자를 외부 금속이온에 전달하여 상기 외부 금속이온을 환원시킬 수 있다(표 4 참조). 이 경우 상기 금속이온은 Mn(VI), Fe(III), Cr(VI), U(VI)일 수 있으며, 상기 금속이온은 금속산화물의 형태로 산화되어 있다가, 쉬와넬라 변이균주의 대사과정에서 발생한 전자를 공여받아 환원될 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면. 본 발명의 쉬와넬라 변이균주를 포함하는 미생물 연료전지를 제공한다. 구체적으로 미생물 연료전지(Microbial fuel cell; MFC)는 생물 또는 그의 일부를 사용하여 생물의 에너지 대사에서 발생하는 환원력을 전기에너지로 전환하는 장치로서, 본 발명의 쉬와넬라 변이균주를 포함하는 미생물 연료전지는 통상의 미생물 연료전지의 구조에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 한국특허출원 제2008-79847호에 개시된 미생물 연료전지에 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 한국특허출원 제2008-79847호는 본 특허의 참조로서 삽입된다.

바람직하게는 쉬와넬라 변이균주를 포함하는 미생물 연료전지의 경제성을 극대화하기 위하여 6탄당을 첨가할 수 있으며, 보다 바람직하게는 포도당을 첨가할 수 있다.

통상적으로 미생물 연료전지는 전기화학적 활성 미생물 (electrochemically active bacteria 또는 EAB)을 이용하며 이 미생물들은 먹이로부터 전자를 얻어서 전극으로 직접 전달하는 능력을 갖고 있다. 이때 전극에 모인 전자를 전기에너지로 사용할 수 있다. 전기화학적 활성 미생물로부터 전기를 생산하는 방법은 다음과 같다. 미생물은 생존과 번식을 위해 필요한 에너지를 얻기 위해 먹이를 섭취 후 분해하는 과정에서 전자를 얻는다. 이때 얻은 전자를 전자 전달자 (예를 들어 NADH)에게 맡겨두는 방식으로 에너지를 저장할 수 있다. 이 전자 전달자는 높은 에너지 레벨을 가지는데, 세포벽의 더 낮은 에너지 레벨을 가지는 곳으로 전자를 전달해 주면서 에너지를 만드며 본 발명의 쉬와넬라 변이균주는 6탄당을 대사하여 전자를 공여할 수 있으므로 미생물 연료전지에 사용되는 전기화학적 활성 미생물에 해당하게 된다.

결국, 본 발명의 쉬와넬라 변이균주는 종래의 쉬와넬라 균주와는 달리 값싼 6탄당을 효과적으로 대사(분해)하고, 상기 대사과정에서 발생한 전자를 금속산화물에 공여할 수 있으므로 이를 미생물 연료전지에 사용하는 경우 미생물 연료전지의 효율 및 경제성을 현저하게 개선시킬 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

<실시예 1> 재조합 플라스미드의 제작

자이모모나스 모빌러스(ATCC 10988) 염색체 DNA를 주형으로 glf, glk 유전자의 프로모터가 존재하는 upstream 영역을 약 100 bp 정도 포함시켜 프라이머를 제작하였다. glf 유전자(ZMO0366, 서열번호 5)를 증폭할 수 있는 전방 프라이머(서열번호 1)와 후방 프라이머 (서열번호 2)를 제작하였고, glk 유전자(ZMO0369, 서열번호 6)를 증폭하기 위하여 전방 프라이머(서열번호 3) 및 후방 프라이머(서열번호 4)를 제작하였다. 또한 발현 플라스미드에 삽입할 때 사용되는 제한효소 인식부위를 각각의 유전자의 5' 말단과 3' 말단에 XhoI, HindIII (glf)와 HindIII, XbaI (glk)를 포함시켜 제작하였다(vy1 : 유전자 클로닝에 사용된 프라이머 염기서열).

2 ng의 주형, 10 pmol의 각각의 전방 및 후방 프라이머(서열번호 1 ~ 4), 5㎕의 10× pfu 중합효소 버퍼 및 5㎕의 2.5mM의 dNTP의 반응 혼합물을 각각 넣고 최종 부피가 50 ul가 되도록 증류수를 첨가한 후, 0.5 ul의 pfu 중합효소를 첨가하였다. 각각의 유전자를 증폭시키기 위해 95℃ 에서 5분 동안 예비 변성시킨 후, 95℃ 에서 45초, 56℃ 에서 45초, 72℃ 에서 2분 동안 PCR을 30회 수행한 후, 72℃ 에서 7분 동안 최종 연장반응(extension)을 실시하였다. 각각 증폭된 2개의 유전자를 하나로 이어주기 위해 증폭된 PCR 산물을 주형으로 glf의 전방 프라이머와 glk의 후방 프라이머를 사용하여 위와 동일한 조건에서 두 번째 PCR을 수행하였다.

최종적으로 증폭된 유전자는 발현 플라스미드 pBBR1MCS-2(NCBI accession NO. U23751, 서열번호 7)의 XhoI, XbaI 제한효소 결합부위에 삽입하기 위해 양쪽말단을 XhoI, XbaI 제한효소로 처리하였다. 제한효소 처리된 플라스미드와 유전자는 4 ℃에서 12시간 동안 연결(ligation)반응 시킨 후 이콜라이 균주에 형질전환 시켰다 (실시 예 2).

도 1의 개열지도와 같이 증폭된 각각의 유전자를 broad host range 플라스미드인 pBBR1MCS-2(NCBI accession NO. U23751, 서열번호 7)에 삽입하였다. 2개의 유전자는 플라스미드의 프로모터를 이용하여 표적 단백질의 발현이 유도되었다. 각각의 유전자는 XhoI, HindIII, XbaIbaI한효소를 이용하여 절단하였고, 플라스미드도 동일한 제한효소를 이용하여 절단한 후 라이게이즈를 이용하여 결합시켜 재조합 플라스미드를 제작하였다(도 1, 서열번호 8)

<실시예 2> 재조합 플라스미드의 형질전환

연결(ligation) 반응으로 결합된 실시예 1의 재조합 플라스미드를 CaCl₂ 방법으로 대장균에 형질전환 시키기 위하여, E. coli S17-1 (ATCC 47055)을 LB 액체배지(효모 추출물 0.5 %, 트립톤 1 %, NaCl 0.5 %, pH 7.0)에서 30℃ 에서 하룻밤 동안 배양한 후, 이를 다시 LB 액체배지에 1/100 비율로 접종하여 O.D.600이 0.4가 될 때까지 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균체를 수확한 후 1/3 비율의 CCMB (Calcium Manganese based) 용액을 가하여 현탁시키고, 0℃ 얼음에 20분간 방치시켜 감응시킨 후 4℃ 에서 6,000 rpm으로 10분 동안 원심분리 하였다. 분리된 세포에 다시 1/12의 CCMB (Calcium Manganese based)를 첨가하여 재현탁 시킨 후 감응세포(competent cell)를 수확하였다. 얻어진 현탁액 100㎕ 에 실시예 1에서 얻은 재조합 플라스미드를 각각 가하여 0℃ 에서 30분 동안 방치한 후 42℃ 에서 90초 동안 열충격(heat shock)을 가하여 형질전환시켰다. 이 형질전환체에 1ml 의 신선한 LB 액체배지를 넣고 30℃ 에서 3시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 그리고 나서, 항생제인 스트렙토마이신 (50 ug/ml)과 카나마이신 (50 ug/ml)이 들어있는 LB 고체배지에 도말하여 클로닝된 형질전환체를 선별하였다. 클로닝된 형질전환체의 확인을 위해 스트렙토마이신 (50 ug/ml)과 카나마이신 (50 ug/ml)이 들어있는 액체배지에 15시간 배양하여 플라스미드를 분리한 후 각각의 유전자를 제한효소로 절단하여 0.9% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동을 실행하였다 (도 2, 레인 1: pBBR1MCS-2::glf , glk 약 7.8 kb (제한효소를 처리하기 전 플라스미드 사이즈), 레인 2: pBBR1MCS-2::glf , glk를 XhoI, XbaI 제한효소로 절단한 것, 2개의 밴드는 pBBR1MCS-2 플라스미드 (약 5.1 kb)와 삽입된 2개의 유전자 (약 2.7 kb), 레인 3: pBBR1MCS-2::glf , glk를 XhoI, HindIII로 절단한 것. 2개의 밴드는 각각 pBBR1MCS-2::glk (약 6.2 kb)와 glf (1.6 kb), 레인 4: pBBR1MCS-2::glf , glk를 HindIII, XbaI으로 절단한 것. 2개의 밴드는 각각 pBBR1MCS-2::glf (약 6.7 kb)와 glk (1.1 kb))

재조합 플라스미드가 형질전환된 대장균을 스트렙토마이신 (50 ug/ml)과 카나마이신 (50 ug/ml)이 들어간 LB 고체배지에 접종하여 30℃ 배양기에서 15시간 배양하고 쉬와넬라 균주(Shewanella oneidensis MR-1 ATCC 700550)를 리팜피신 (50 ug/ml)이 들어있는 LB 고체배지에 접종하여 30℃ 배양기에서 15시간 배양하였다. 대장균은 공여자(donor)로서 재조합 플라스미드를 전해주는 숙주가 되고 쉬와넬라 균주는 재조합 플라스미드를 건네받는 수용자(recipient)가 된다. 각각의 균주를 15시간 배양한 후 항생제가 들어있지 않은 LB 고체 배지에 루프(loop)를 이용해 한 루프(loop)의 양만큼 따서 섞은 후 고르게 도말하였다. 도말한 배지는 30℃ 배양기에서 약 4시간 동안 배양하면서 물리적 접합(physical conjugation)을 유도하였다. 접합이 유도된 배지를 다시 리팜피신 (50 ug/ml)과 카나마이신(50 ug/ml)이 들어있는 LB 고체배지에 얇게 도말하였다. 30 ℃ 배양기에서 약 15시간을 배양하면 배지에 재조합 플라스미드를 포함하고 있는 쉬와넬라 균주가 나타났다. 생성된 콜로니는 스트렙토마이신 (50 ug/ml)과 카나마이신 (50 ug/ml)이 들어있는 LB 고체배지와 리팜피신 (50 ug/ml)과 카나마이신 (50 ug/ml)이 들어있는 LB 고체배지에서 선별작업(screening)을 통해 쉬와넬라 균주를 선별하였다. 리팜피신 내성이 있으며 카나마이신 내성이 있는 균주는 재조합 플라스미드가 올바르게 전환된 쉬와넬라 균주이다.

<비교예 1> 전기충격방법을 통한 재조합 플라스미드의 형질전환

형질전환 방법 중 전기충격 방법은 실험방법이 간단하며, 적은 양의 DNA로도 많은 형질전환체를 얻을 수 있는 단점이 있다. 형질전환 실험 방법도 간단하며, 전기충격 형질전환 용 감응세포(competent cell)도 만들기가 쉬워 자주 사용되는 방법이다. 하지만 전기충격 방법에는 여러 가지 변수(DNA 농도, 전압, 전극사이의 거리, 배양시간 등)들이 존재하여 예측된 결과에 도달하기가 쉽지 않다.

구체적으로 쉬와넬라 균주(Shewanella oneidensis MR-1 ATCC 700550)를 LB 액체배지에 접종하여 30 ℃ 배양기에서 15시간 배양하였다. 배양된 쉬와넬라 균주를 다시 신선한 LB 액체배지에 1/100의 비율로 재접종하였다. 재접종한 쉬와넬라 균주는 분광광도계를 이용하여 세균수를 측정하였다. OD600nm에서 1의 수치는 0.8

× 10⁹ 개의 세균수와 일치한다. OD 600nm에서 0.4 수치까지 배양된 세포는 지수생장기 상태에 있는 세포로써 실험하기에 가장 좋은 세균의 상태를 나타낸다. 따라서 쉬와넬라 균주를 0.4 까지 배양한 후 4℃, 6000 rpm, 10분간 원심분리하여 상등액을 버리고 세균의 세포만을 회수하였다. 이는 CaCl₂를 이용한 열처리(heat shock) 형질전환법과는 다르게 동량의 증류수만을 이용하여 현탁시킨다. 이는 전기충격 형질전환 중에 발생할 수 있는 아크(arc)를 배양액에 남아있는 성분을 충분히 제거해줌으로써 방지할 수 있다. 현탁시킨 배양액을 다시 한 번 4℃ , 6000 rpm, 10분간 원심분리하고 상등액을 제거한 후 100 ul의 증류수로 재현탁시킨다. 농축된 쉬와넬라 균주를 50 ul를 취하여 실시예 1의 재조합 플라스미드 1 ul (50 ng/ul)과 섞어준 후 1분동안 방치한 후 큐벳(cuvette)에 담고 전기충격장치 (BioRad)에 넣는다. 큐벳의 양 전극 사이에 1.8 kV의 전압(voltage)을 걸어주고 전기충격이 완료되면 신선한 LB 액체배지를 신속하게 첨가한 후 큐벳으로부터 다시 회수한다. 회수된 쉬와넬라 균주를 30 ℃ 배양기에서 4시간동안 안정화 시켰다. 안정화된 쉬와넬라 균주를 13000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상등액 100 ul로 재현탁시켰다. 스트렙토마이신 (50 ug/ml)과 카나미이신 (50 ug/ml)이 들어있는 LB 고체배지에 재현탁액을 골고루 도말한 후 30 ℃ 배양기에서 12시간 배양 후 콜로니(colony) 생성 유무를 관찰하였으나 별다른 콜로니가 관찰되지 않았다.

<실시예 3> 글루코키나아제 효소활성 실험

실시예 2를 통해 제조된 재조합 플라스미드가 형질전환된 쉬와넬라 균주를 스트렙토마이신 (50 ug/ml)과 카나마이신 (50 ug/ml)이 들어있는 LB 액체배지에 접종한 후 30℃ 배양기에서 15시간 배양 후 다시 신선한 LB 액체배지에 1/100의 비율로 재접종하였다. 재접종한 배양액을 분광광도계를 이용하여 OD600nm에서 1까지 배양시키고 4 6000 rpm, 10분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 세균의 세포만 회수한다.

동량의 1X PBS (phosphate buffered saline) 용액을 첨가하여 현탁시킨 후 동일한 조건으로 다시 한 번 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 1 ml의 1X PBS 용액을 첨가하여 40배 농축된 쉬와넬라 균주를 재현탁시켰다. 초음파 분쇄기(sonication)를 40% 진폭(amplitude)과 9초간의 펄스(pulse)를 주어 쉬와넬라 균주의 세포벽을 파괴시켰다. 초음파 분쇄기 사용 시 고온의 열이 발생하여 세포에 영향을 주는 것을 방지하기 위해 세포를 아이스에 보관해둔 상태로 실험한다. 초음파 처리가 끝난 쉬와넬라 균주를 13000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액만을 회수하였다. 회수된 상등액은 세균이 갖고 있는 총단백질로써 단백질 효소의 일종인 글루코카이네이즈 활성 실험의 시료로 사용된다. 글루코카이네이즈 활성 실험은 시그마(Sigma)의 실험방법(EC 2.7.1.2)를 기초로 하였다. 요약하면, 세포내부로 유입된 포도당은 글루코카이네이즈 효소에 의해 인산화가 되고, 인산화된 형태의 포도당은 다시 글루코즈 6-포스페이트디하이드로게네이즈 효소에 의해 6-포스페이트 글루코네이트로 전환된다. 글루코카이네이즈 활성 실험에 사용되는 시료를 제외한 포도당, ATP, β-NADP, 글루코즈 6-포스페이트디하이드로게네이즈가 첨가된 혼합물을 준비하여 30℃ 분광광도계의 OD340nm의 수치를 측정한다.

결국, 형질전환을 통해 얻어진 유전자변형 쉬와넬라 균주의 glucokinase 효소활성 실험을 위해 37 ℃ 배양기에서 18시간 배양하여 얻은 배양액을 40배로 농축한 후 초음파 기기를 이용하여 세포벽을 파괴하고 원심분리 과정을 통해 총 단백질을 얻었다. 쉬와넬라 균주의 glucokinase 효소를 포함하고 있는 총 단백질은 양성 대조군의 효소활성과 비교 측정하여 그 결과를 표 2(쉬와넬라 야생형 균주와 유전자 변형 균주의 글루코키나아제 효소활성)에 나타내었다.

상기 표 2를 통해 알 수 있듯이 외래 유전자가 도입된 본 발명의 쉬와넬라 변이균주만이 글루코키나제 효소활성을 가지는 것을 알 수 있다.

<실시예 4> 쉬와넬라 변이균주의 포도당 분해능

재조합 플라스미드를 갖고 있는 쉬와넬라 균주를 PBBM(Phosphate Buffered Basal Medium)에 포도당과 최종전자수용체로 사용되는 제 2 산화철을 첨가하여 30 배양기에서 24시간 동안 혐기적 조건 배양하였다. 분광광도계 OD600nm에서 1 만큼의 세포수가 될 때까지 배양한 후 4℃, 1300 rpm, 3시간동안 원심분리하였다. 상등액을 모두 제거하고 남은 쉬와넬라 균주 세포를 동일한 배지 10 ml을 첨가하고 재현탁시켰다. 재현탁 시킨 세포를 혐기조건으로 된 시험관에 옮긴 후 4℃, 2000 rpm, 10분간 원심분리한다. 상등액을 제거하고 남은 세균의 세포는 동일한 배지 2 ml을 첨가하여 재현탁시킨다. 현탁하여 농축시킨 쉬와넬라 균주 세포를 포도당이 들어있는 배지에 접종하고 30℃ 배양기에서 7일 동안 배양한 후 배양액의 일부를 채취하여 13000 rpm, 10분간 원심분리하여 회수된 상등액을 시료로 포도당의 농도를 분석하는데 사용하였다.

포도당의 분석은 HPLC(High Performance Liquid Chromatography, 영린기기)를 이용하여 초기 포도당의 농도와 7일 후 포도당의 농도변화를 측정하여 수치로 나타내었다 (야생형 쉬와넬라 균주 및 유전자 변형 균주의 포도당 소비 (총 20mM 중, 표 3).

표 3은 배양액에 포함된 20 mM의 포도당의 소비를 나타낸 것으로 포도당 소비 0의 수치는 소비 반응이 일어나지 않은 것을 의미하며, 재조합 플라스미드를 갖고 있는 쉬와넬라 균주의 수치는 포도당의 소비를 농도로 나타낸 것이다. 이 중 포도당의 대사활동으로 얻어진 전자는 최종전자수용체에 전달되게 되는데, 실험 결과 최종전자수용체에 따라 포도당의 소비된 농도가 다르게 나타났다. 또한 쉬와넬라의 야생형 균주와 플라스미드만 들어있는 쉬와넬라 균주를 비교해 봤을 때 포도당을 에너지원으로 이용하고 최종전자수용체를 사용하는 균주는 재조합 플라스미드로 갖고 있는 쉬와넬라 균주임을 알 수 있다.

한편, 시료 내 존재하는 환원된 철의 농도를 측정하기 위한 실험으로 ferrozine 측정방법(Stookey, 1970)을 사용하였다. Ferrozine은 환원된 철(ferrous)과 결합하여 비색 반응을 나타내며, 이는 OD562nm의 흡광도에서 측정되어 측정된 값의 수치를 환원된 철의 표준곡선에 대입하여 농도를 적량할 수 있다. 간략하게 말하면, ferrozine 시약을 50 mM HEPES pH 7.0 버퍼용액에 녹여 만들고 표준 환원철(ferrous ethylenediamnonium sulfate tetrahydrate)의 농도를 각각 1 mM, 2 mM, 4 mM, 5 mM로 0.5 N HCl 용액에 녹여 준비한다. 200 ul의 ferrozine 용액에 20 ul의 시료를 첨가하여 분광광도계 OD562nm에서의 값을 측정하여 이를 표 4에 나타내었다.

표 4를 통해 재조합 플라스미드를 갖고 있는 쉬와넬라 균주는 포도당을 에너지원으로 대사하며 만들어지는 환원력을 전자를 생성하는데 사용하고 전자는 다시 최종전자수용체인 제 2 산화철을 환원시키는데 사용된다. 쉬와넬라 야생형 균주와 플라스미드만 갖고 있는 쉬와넬라 균주에선 반응이 나타나지 않는데 반해 재조합 플라스미드가 들어있는 쉬와넬라 균주에선 84 uM 농도의 철이 환원된 것을 알 수 있다.

쉬와넬라 변이균주는 6탄당을 에너지원으로 이용하여 발효과정을 통해 생합성에 필요한 여러 대사산물들을 합성해내고, 만들어진 에너지는 환원된 형태의 에너지로 보존된다. 또한 환원력은 전자를 만들어내는데 사용되며 최종 전자수용체인 금속산화물(산화 제2 철)에 전자를 전달해줌으로써 전체적인 에너지 대사 흐름을 완성하게 된다. 이는 야생형 쉬와넬라 균주가 갖고 있지 않은 포도당 에너지 대사능을 이용한 것으로서 6탄당의 탄수화물을 이용하며 생성되는 전자의 양보다 더 많은 양의 전자를 형성해낼 수 있다.

본 발명의 쉬와넬라 변이균주는 미생물 연료전지, 바이오 센서 등의 분야에서 널리 활용될 수 있다.

<110> Gwangju institute of science and technology <120> Shewanella variants, manufacturing method and use thereof <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 ccgctcgagc caaggattcg gtttgtga 28 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer <400> 2 cccaagctta gaggccgaat ccttttag 28 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 ccaagcttct ggtatagggg tatccc 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer <400> 4 gctctagaaa aatcgggagg cagcct 26 <210> 5 <211> 1422 <212> DNA <213> Zymomonas mobilis <400> 5 atgagttctg aaagtagtca gggtctagtc acgcgactag ccctaatcgc tgctataggc 60 ggcttgcttt tcggttacga ttcagcggtt atcgctgcaa tcggtacacc ggttgatatc 120 cattttattg cccctcgtca cctgtctgct acggctgcgg cttccctttc tgggatggtc 180 gttgttgctg ttttggtcgg ttgtgttacc ggttctttgc tgtctggctg gattggtatt 240 cgcttcggtc gtcgcggcgg 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tgctggcgct gggcctgttt ctggcgctgg acttcccgct gttccgtcag 7740 cagcttttcg cccacggcct tgatgatcgc ggcggccttg gcctgcatat cccgattcaa 7800 cggccccagg gcgtccagaa cgggcttcag gcgctcccga aggt 7844

Claims

6탄당을 대사할 수 없는 쉬와넬라 균주의 내부에, 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자 및 상기 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자를 도입하여 혐기적 조건에서 6탄당을 대사하는 특성을 가지는 쉬와넬라 변이균주.
제1항에 있어서,
상기 쉬와넬라 균주는 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis MR-1 ATCC 700550)인 것을 특징으로 하는 쉬와넬라 변이균주.
제1항에 있어서,
상기 6탄당은 포도당, 과당, 갈락토오스, 만니톨, 슈크로스, N-아세틸글루코사민 및 셀루비오스 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 쉬와넬라 변이균주.
제1항에 있어서,
상기 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자는 glf(ZMO0366), sugar transporter(ZMO0293), glucose-galactose transporter(SO_2213.1), glucose/galactose transporter(SO_3503) 중 어느 하나 이상이고, 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자는 glk(ZMO0369), pgi(JW3985), pfkA(JW3887), fbaA(JW2892) 및 gapC(JW1413) 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 쉬와넬라 변이균주.
서열번호 1로 표시되는 전방 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 후방 프라이머를 포함하는 프라이머 세트.
서열번호 3으로 표시되는 전방 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 후방 프라이머를 포함하는 프라이머 세트.
1) 6탄당을 대사할 수 없는 쉬와넬라 균주를 준비하는 단계;
2) 상기 쉬와넬라 균주에 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자 및 상기 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자를 형질전환시켜 혐기적 조건에서 6탄당을 대사하는 특성을 가지는 쉬와넬라 변이균주를 생산하는 단계를 포함하는 쉬와넬라 변이균주의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 2) 단계는
a) 플라스미드에 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자 및 상기 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자를 도입하여 재조합 플라스미드를 제작하는 단계;
b) 상기 재조합 플라스미드로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및
c) 상기 형질전환된 숙주세포를 쉬와넬라 균주과 접합시켜 상기 재조합 플라스미드를 공여하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 쉬와넬라 변이균주의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 쉬와넬라 균주는 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis MR-1 ATCC 700550)인 것을 특징으로 하는 쉬와넬라 변이균주의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 6탄당은 포도당, 과당, 갈락토오스, 만니톨, 슈크로스, N-아세틸글루코사민 및 셀루비오스 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 쉬와넬라 변이균주의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자는 glf(ZMO0366), sugar transporter(ZMO0293), glucose-galactose transporter(SO_2213.1), glucose/galactose transporter(SO_3503) 중 어느 하나 이상이고, 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자는 glk(ZMO0369), pgi(JW3985), pfkA(JW3887), fbaA(JW2892) 및 gapC(JW1413) 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 쉬와넬라 변이균주의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 쉬와넬라 변이균주의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 a) 단계는;
상기 제5항의 프라이머 세트를 이용하여 6탄당의 흡수에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자인 glf를 증폭하고, 제6항의 프라이머 세트를 이용하여 6탄당의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 외래 유전자인 glk를 증폭하는 단계를 포함하는 쉬와넬라 변이균주의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 쉬와넬라 변이균주에 6탄당을 제공하여, 상기 6탄당의 대사과정에서 발생하는 전자를 외부 금속이온에 전달하여 상기 외부 금속이온을 환원시키는 방법.
제14항에 있어서, 상기 6탄당은 포도당, 과당, 갈락토오스, 만니톨, 슈크로스, N-아세틸글루코사민 및 셀루비오스 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 금속이온은 Mn(VI), Fe(III), Cr(VI) 및 U(VI) 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 쉬와넬라 변이균주를 포함하는 미생물 연료전지.
제17항에 있어서, 상기 쉬와넬라 변이균주가 대사할 수 있는 6탄당을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 연료전지.