KR20110110825A - 세균의 운반 및 ｃｎｓ 침입을 감소시키기 위한 조성물 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세균의 감염(예를 들면, 폐렴구균의 감염), 코의 운반, 코의 콜로니화, 및 중추신경계 침입을 감소 또는 방지하기 위해 디자인된 조성물을 제공한다. 본 발명은 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 폐렴구균 테이코산, 폐렴구균 리포테이코산, 또는 뉴라미니다제, 포스포콜린, 폐렴구균 테이코산, 폐렴구균 리포테이코산의 항원성 영역을 포함하는 조성물을 제공한다. 선택적으로, 상기 조성물은 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 폐렴구균 테이코산, 폐렴구균 리포테이코산 또는 이들 중 어느 하나의 항원성 영역의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 제제는 무독화된다. 아울러, 본 발명에서 개시된 상기 조성물을 만들고 사용하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에 기재된 제제 또는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상에서 항체를 생성하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명에 기재된 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 코의 운반 또는 폐렴구균의 감염을 감소 또는 방지하는 방법을 제공한다.

Description

세균의 운반 및 ＣＮＳ 침입을 감소시키기 위한 조성물 및 이를 이용한 방법{COMPOSITIONS FOR REDUCING BACTERIAL CARRIAGE AND CNS INVASION AND METHODS OF USING THE SAME}

본 발명의 보균 및 ＣＮＳ 침입을 감소시키기 위한 조성물 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.

본 출원은 2003년 11월 10일자로 출원된 미국 가출원 제60/518,799호에 대한 우선권 혜택을 주장하며, 그 내용 전체는 본 명세서에 참조로 포함되어 있다.

본 발명은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 기금 DC 04976, AI 21548 및 P30 DK 54781 및 국립 알레르기 및 감염성 질환 연구소(National Institute of Allergy and Infectiuos Diseases)의 계약 NO1 AI 65299의 정부 지원하에 수행되었다.

스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)는 다소 일반적인(ubiquitous) 인간 병원균으로, 폐, 중추신경계(central nervous system, CNS), 중이(middle ear) 및 비도(nasal tract)를 포함하는 몇몇 기관을 감염시킬 수 있다. 이러한 조직이 감염되면 다양한 증상들, 예를 들면 기관지염, 폐렴, 뇌수막염 및 공동(sinus)의 감염을 일으킨다. 스트렙토코커스 뉴모니애는 인간에서의 세균성 뇌수막염의 주된 요인으로, 항생제 처리에도 불구하고 심각한 사망률 및 이환율과 연관되어 있다. Quagliarello 등, (1992) N. Eng. J. Med. 327:869-872. 스트렙토코커스 뉴모니애 뇌수막염은 지속적인 신경성 후유증을 일으킬 수 있다. 선진국과 개발도상국에서의 스트렙토코커스 뉴모니애 뇌수막염의 발병률은 각각 100,000명 당 1-2명 및 20명이다. Anon, (2002) CDSC European Bacterial Meningitis Surveillance Project. 미국에서의 폐렴구균성(pneumococcal) 뇌수막염의 사망률은 약 18%이다. Fedson 등, (1994) Arch. Intern. Med. 154:2531-2535. 폐렴구균성 뇌수막염이 가장 많이 발생하는 것은 1-4세의 아이들(모든 세균성 뇌수막염의 30%)이며, 이어서 15-19세(14%) 및 1-11개월의 영아(13%)가 뒤따른다. Anon, (2000) CDSC European Bacterial Meningitis Surveillance Project. 또한, 선진국 및 개발도상국 모두에서 연장자들도 연쇄상구균성(streptococcal) 뇌수막염에 심각하게 감염된다. Butler 등, (1999) Drugs Aging 15 (Suppl.1): 11-19; Fedson 등, (1999) Vaccine 17 Suppl.1:S11-18.

전 세계 폐렴구균의 주된 병원소는 인간에 의한의 코의 운반(nasalcarriage)에 있다. 일반적으로 보균자로부터 감염되며, 감염은 항상 코의 운반에 의해 진행된다. 비인두(nasopharynx)의 콜로니화(colonization)는 폐렴구균이 하부 기도(respiratory tract), 코의 공동 및 중이로 유포되기 위한 전제조건으로 간주된다. 따라서, 운반(carriage)을 방지하는 모든 의료적인 개입(medical intervention)은 치료된 개인에서의 질병의 위험을 제거할 수 있을 뿐만 아니라 집단면역을 일으킬 수 있으며, 심지어 치료받지 않은 공동체내의 사람에 대한 감염 위험을 크게 낮춘다. 비록, 스트렙토코커스 뉴모니애가 중요한 인간 병원균이지만, 스트렙토코커스 뉴모니애가 코의 운반 및 뇌수막염을 일으키는 메카니즘에 대해서는 상대적으로 거의 알려져 있지 않다.

뉴라미니다제(neuraminidase)가 비도에서의 유일한 독성 인자임을 제시하는 몇몇 데이터가 존재한다. 이러한 관찰 중 하나는 비인두에서 그 양친(parent) 균주보다 더 빨리 제거되는, NanA가 결핍된 스트렙토코커스 뉴모니애 균주 D39의 연구로부터 나온다. Tong 등, (2002) Infect. Immun. 68:921-924. 뉴라미니다제는 숙주 세포 표면 및 체액에 존재하는 다양한 종류의 당지질, 당단백질 및 올리고당의 말단 시알산 잔기를 절단한다. 폐렴구균성 뇌수막염 환자 뇌척수액(cerebrospinal fluid, CSF)에서 유리(free) 시알산 농도가 증가되는 것은 나쁜 예후와 연관되어 있다. O'Toole 등, (1971) J. Clin. Invest. 50:979-985. 인간에서의 스트렙토코커스 뉴모니애 독성에 대한 상기 효소의 중요성은 스트렙토코커스 뉴모니애의 모든 새로운 임상 격리집단(isolate)이 뉴라미니다제 활성을 갖고 있음을 보여주는 독립된 두 연구에서의 발견에 의해 추가로 설명된다. O'Toole 등, (1971) J. Clin. Invest. 50:979-985; Kelly 등, J. Bacteriol. 94: 272-273. 아울러, 종종 그 독성을 증가시키는 폐렴구균 격리집단의 마우스 계대(passage)가 2-5배 증가된 뉴라미니다제 활성을 보여준다는 것이 또한 보고되어 있다. Vishniakova 등, (1992) Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunologii 9-10:26-9. 테이코산(teichoic acid)으로도 알려져 있는 폐렴구균성 C-폴리사카라이드는 리포테이코산(lipoteichoic acid)으로 알려져 있는 폐렴규균성 F-항원의 폴리사카라이드 부분과 구조적으로 동일하다. Fischer 등, (1993) Eur. J. Biochem 215:851-857. 상기 분자들은 그람(Gram)-양성 세균 중에서 스트렙토코커스 뉴모니애만의 독특한 특징이다. 상기 분자들내의 면역우성 결정부(immunodominant determinant)는 포스포릴콜린(phosphorylcholine, PC) 잔기이며, PC에 대한 항체는 복강내, 정맥내 또는 코의 폐렴구균 감염에 대해 방어한다. Briles 등, (1984) Eur. J. Immunol. 14:1027-1030; Briles 등, (1981) Nature 294:88-90; Yother 등, (1982) Infect. Immun. 36:184-188; Briles 등, (1984) J. Mol. Cell. Immunol. 1:305-309. 그러나, 상기 모든 연구들은 혈청에 의해 투여되는 전신감염에 대한 방어에 관한 것으로서, 상기 항체들이 코의 콜로니화에 대해 방어하는 능력에 관한 어떠한 정보도 얻을 수 없다. 그러나, 표면의 포스포콜린 잔기는 호흡기 세균의 표면에 공통으로 존재한다. Lysenko 등, (2000) Infect. Immun. 68:1664-71.

스트렙토코커스 뉴모니애에 의해 코의 운반 및 이후의 질병이 일어나는 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 어떠한 연구도 지금까지 코의 운반이 감소되거나 또는 방지되는 것을 보여주는 메카니즘을 결정하고 있지 않다. 비인두의 콜로니화는 폐렴구균이 하부 기도, 코의 공동으로 전신 유포되고 뇌로 유포되기 위한 전제조건으로 간주되기 때문에, 종래에는 초기 폐렴구균의 콜로니화 부위에서 점막성 면역을 제공하기 위한 수단이 필요하였다. 비인두에서 초기 폐렴구균의 콜로니화를 방지하게 되면 스트렙토코커스 뉴모니애의 코의 운반 및 개인간의 유포를 방지할 것이다. 아울러, 비인두의 점막 표면에서 면역을 제공하게 되면 스트렙토코커스 뉴모니애에 의해 야기되는 이후의 질병을 방지하거나 또는 감소시킬 수 있다.

본 발명은 세균의 감염(예를 들면, 폐렴구균의 감염), 코의 운반, 코의 콜로니화 및 CNS 침입을 감소시키거나 또는 방지하기 위해 디자인된 조성물을 제공한다.

선택적으로, 상기 조성물은 점막내 투여를 위해 디자인된다. 본 발명은 무독화된(detoxified) 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 폐렴구균 테이코산, 또는 이들 중 어느 하나의 항원성 영역 및 상기 무독화된 제제를 포함하는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 폐렴구균 테이코산, 폐렴구균 리포테이코산, 또는 이들 중 어느 하나의 항원성 영역 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.

선택적으로, 상기 조성물은 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 폐렴구균 테이코산, 폐렴구균 리포테이코산 또는 이들 중 어느 하나의 항원성 영역의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 무독화된 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 폐렴구균 테이코산, 또는 이들 중 어느 하나의 항원성 영역뿐만 아니라 상기 무독화된 제제를 포함하는 조성물 및 상기 제제를 사용하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제제를 포함하는 조성물을 대상(subject)에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 폐렴구균 테이코산, 폐렴구균 리포테이코산, 또는 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 폐렴구균 테이코산, 폐렴구균 리포테이코산 중 어느 하나의 항원성 영역에 대한 항체를 생성하는 방법을 제공한다. 선택적으로, 상기 조성물은 점막 표면에 대한 투여 또는 전신 투여용으로 적합하다.

아울러, 본 발명은 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 폐렴구균 테이코산, 폐렴구균 리포테이코산, 또는 이들 중 어느 하나의 항원성 영역에 대한 항체와 더불어 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 선택적으로, 상기 조성물은 점막 표면에 대한 투여 또는 전신 투여용으로 적합하다.

아울러, 본 발명은 대상의 코 점막을 본 발명의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 대상에서 코의 운반, 코의 콜로니화, 또는 세균의 감염(예를 들면, 폐렴구균의 감염)을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다.

추가적인 이점들은 부분적으로는 이후의 상세한 설명에서 설명될 것이고, 부분적으로는 이로부터 자명할 것이며, 또는 아래에 기술된 측면을 수행함으로써 습득될 수 있다. 아래에 기술된 이점들은 청구항에서 특별히 지적된 요소 및 조합에 의해 인식되고 달성될 것이다. 전술한 일반적인 설명 및 후술하는 상세한 설명 모두 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 한정하기 위한 것은 아니다.

본 명세서에 삽입되어 그 일부를 구성하는 첨부된 도면들은 아래에 기재된 몇 가지 측면들을 설명한다.
도 1은 캡슐화되지 않은 스트렙토코커스 뉴모니애의 R36A 균주 또는 독성 EF3030 균주 중 어느 하나를 3×10⁶ CFU로 xid 마우스의 코에 전달시키는 것을 보여준다. 코에 시도한 후 1일 및 4일째에 살아있는 폐렴구균의 존재를 확인하기 위하여, 신경 조직 ON/E, OB, 뇌 및 림프 조직(NALT, CLN 및 폐)을 수집하고, 다지고, 분석하였다. 표시된 것은 평균 log₁₀CFU(콜로니 형성 단위) + 하나의 표준편차(SE)이다. Y-축의 0 값은 검출가능한 CFU가 없음을 나타낸다. 표시된 것은 군당 5마리 마우스의 평균 CFU + SE이며, 3번의 다른 실험을 나타낸다.
도 2는 코에 시도한 후 스트렙토코커스 뉴모니애 균주 EF3030 CFU의 기관 분포 동역학(kinetics)을 보여준다. 4, 11, 18, 25 및 39일째에 ON/E, OB, 뇌, 혈액, NW, NALT, CLN 및 폐 조직을 수집하였고, 스트렙토코커스 뉴모니애의 존재를 분석하였다. 3×10⁶ CFU 당량의 스트렙토코커스 뉴모니애는 비도를 콜로니화 시킨 후, 순차적으로 OB를 감염시켰다. Y-축의 0 값은 검출가능한 CFU가 없음을 나타낸다. 표시된 것은 3번의 독립적인 실험의 평균 CFU + SE 이다. 각각의 시점은 5마리 마우스를 나타내는 39일째를 제외하고는 모두 10마리 마우스를 나타낸다.
도 3은 GLS로 전배양한 후의 스트렙토코커스 뉴모니애 균주 EF3030의 분포를 보여준다. 코에 적용하기 전에, 3×10⁷ CFU 당량의 스트렙토코커스 뉴모니애를 20 ㎍의 아시알로(asialo)-GM1 (a-GM1) 또는 125 ㎍의 혼합된 GLS (MG)와 함께 배양하였다. 4일 후 ON/E, OB, 뇌 및 NW, NALT 및 폐를 수집하였고, 스트렙토코커스 뉴모니애의 수를 분석하였다. Y-축의 0 값은 검출가능한 CFU가 없음을 나타낸다. 표시된 것은 5마리 마우스의 평균 + 하나의 SE 이며, 통계적인 분석을 통해 P-값을 획득하였다. 데이터는 2번의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 4는 코에 시도한 후 OB에서 스트렙토코커스 뉴모니애 TIGR4 균주가 검출된 것을 보여준다. 5×10⁵ CFU 당량을 코로 투여하였고, 시도 후 1주일째에 혈액, NW, ON/E, OB 및 뇌 조직의 콜로니화를 분석하였다(패널 A 및 B). 상기 조직들(10 ㎍ DNA)은 또한 뉴모라이신(pneumolysin) 유전자의 존재에 대해서도 PCR로 분석하였다(패널 C). 아울러, 스트렙토코커스 뉴모니애는 대조군의 OB (D), 또는 스트렙토코커스 뉴모니애가 시도된 마우스(패널 E 및 F)에서 PspA에 특이적인 항체를 이용한 면역형광(immunofluorescence)에 의해 시각화하였다. 표시된 것은 평균 + 하나의 SE 이다. 상기 데이터는 3번의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 5는 분비된 NanA, TIGR4, 및 세포벽에 부착하기 위한 LPXTG (서열번호 14) 모티프를 갖는 R6 (제2형)에 대한 모티프를 비교한 것을 보여준다. TIGR4 유전자는 LPETG (서열번호 13) 모티프를 코딩하는 서열 이전에 정지코돈을 포함하고 있다. 상기 모티프가 없으면, NanA는 TIGR4에 의해 주위로 분비된다.
도 6A는 스트렙토코커스 뉴모니애 양친 균주 TIGR4(■) 또는 NanA 이소진(isogenic) 돌연변이 TIGR4/nanA-(○)로 비강내(i.n.) 감염된 CBA/N 마우스 코 세척액에서의 살아있는 폐렴구균의 동역학을 보여준다. 각각의 점은 각 마우스 코 세척액의 ㎖당 총 세균수를 나타낸다. TIGR4로 접종된 마우스와 비교할 때, ^*P<0.05; ^**P<0.01; ^***P<0.005.
도 6B는 스트렙토코커스 뉴모니애 양친 균주 TIGR4(■) 또는 NanA 이소진 돌연변이 TIGR4/nanA-(○)로 비강내 감염된 CBA/N 마우스에서의 코 콜로니화 동역학을 보여준다. 각각의 점은 각 마우스 조직의 그램(gram)당 총 세균수를 나타낸다. TIGR4로 접종된 마우스와 비교할 때, ^*P<0.05; ^**P<0.01; ^***P<0.005.
도 6C는 스트렙토코커스 뉴모니애 양친 균주 TIGR4(■) 또는 TIGR4/nanA-(○)로 비강내 감염된 CBA/N 마우스의 후각 구(olfactory bulb)에서의 CFU의 동역학을 보여준다. 각각의 점은 각 마우스 조직의 그램당 총 세균수를 나타낸다. TIGR4로 접종된 마우스와 비교할 때, ^*P<0.05; ^**P<0.01; ^***P<0.005.
도 7A는 스트렙토코커스 뉴모니애 양친 균주 EF3030(■) 또는 EF3030/nanA-(○)로 비강내 감염된 CBA/N 마우스에서의 코 콜로니화 동역학을 보여준다. 각각의 점은 각 마우스 코 세척액의 ㎖당 총 세균수를 나타낸다. EF3030으로 접종된 마우스와 비교할 때, ^*P<0.05; ^**P<0.01; ^***P<0.005.
도 7B는 스트렙토코커스 뉴모니애 양친 균주 EF3030(■) 또는 EF3030/nanA-(○)로 비강내 감염된 CBA/N 마우스에서의 코 콜로니화 동역학을 보여준다. 각각의 점은 각 마우스 조직의 그램당 총 세균수를 나타낸다. EF3030으로 접종된 마우스와 비교할 때, ^*P<0.05; ^**P<0.01; ^***P<0.005.
도 7C는 스트렙토코커스 뉴모니애 양친 균주 EF3030(■) 또는 NanA 이소진 돌연변이 EF3030/nanA-(○)로 비강내 감염된 CBA/N 마우스에서의 코 콜로니화 동역학을 보여준다. 각각의 점은 각 마우스 조직의 그램당 총 세균수를 나타낸다. EF3030으로 접종된 마우스와 비교할 때, ^*P<0.05; ^**P<0.01; ^***P<0.005. 야생형 및 돌연변이 데이터를 모든 시점에서 취합할 때, EF3030 및 EF3030 NanB- 간을 비교하면 P=0.001 이었다.
도 8은 스트렙토코커스 뉴모니애 양친 균주 TIGR4(■) 또는 TIGR4/nanB-(○)로 비강내 감염된 CBA/N 마우스에서의 접종후 4일째 코 콜로니화 동역학을 보여준다. 각각의 점은 각 마우스 코 세척액의 ㎖당 또는 조직의 그램당 총 세균수를 나타낸다. TIGR4 및 TIGR4/nanB- 간의 차이가 통계적으로 유의미한 경우는 없었다.
도 9는 스트렙토코커스 뉴모니애 양친 균주 TIGR4(■), TIGR4/nanA-(○) 또는 TIGR4/AB- 로 비강내 감염된 CBA/N 마우스에서의 접종후 4일째 코 콜로니화 동역학을 보여준다. 각각의 점은 각 마우스 코 세척액의 ㎖당 또는 조직의 그램당 총 세균수를 나타낸다. TIGR4/nanA- 및 이중 돌연변이 TIGR4/nanAB- 간의 차이가 통계적으로 유의미한 경우는 없었다.
도 10은 코에 시도한 후, 항-포스포콜린에 특이적인 단일클론 항체에 의해 스트렙토코커스 뉴모니애의 코 콜로니화가 억제되는 것을 보여준다. 항-PC 특이적인 mAb에 의한 스트렙토코커스 뉴모니애의 코 콜로니화 억제. 총 1×10⁶ CFU의 TIGR4 균주를 IgG3 서브클래스(subclass) 또는 IgM 이소타입(isotype)에 속하는 5 ㎍의 항-PC mAB와 함께 배양하였다. 콧구멍(nare)당 총 5 ㎕를 투여하였다. 표시된 것은, 적용한 후 각각 9 및 12시간의 500 ㎕ 코 세척액에서의 CFU 이다. 표시된 것은 군당 5마리 마우스의 평균 + SD 이다.

본 발명의 화합물, 조성물, 물품, 장치 및/또는 방법을 개시 및 기재하기 전에, 아래에 기재된 측면들은 특정한 합성 방법 또는 특정한 투여 방법에 한정되는 것은 아니며, 이들은 물론 다양할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어들은 특정한 측면을 단지 설명하기 위한 목적일 뿐, 한정하려는 의도는 아니다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태의 "하나/한(a, an 및 the)"은 문맥에서 달리 명확하게 표시하지 않는 한 복수 형태를 포함한다. 따라서, 예를 들면, "한 항원성 절편"은 항원성 절편들의 혼합물을 포함하고, "한 약학적 담체" 또는 "보조제(adjuvant)"는 둘 이상의 이러한 담체 또는 보조제의 혼합물을 포함하는 것 등과 같다.

명세서 전체에서 사용된 "대상"은 개체(individual)를 의미한다. 따라서, "대상"은 고양이, 개 등과 같은 애완동물, 가축(예를 들면, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등), 실험동물(예를 들면, 마우스, 토끼, 래트, 기니아 피그 등) 및 새를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 상기 대상은 유인원 또는 인간과 같은 포유동물이다.

"선택적" 또는 "선택적으로"는 이후 기재된 사건 또는 상황이 일어날 수도, 일어나지 않을 수도 있으며, 기재된 내용은 상기 사건 또는 상황이 일어난 경우 및 일어나지 않은 경우를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들면, "선택적으로 상기 조성물은 조합을 포함할 수 있다"라는 어구(phrase)는, 상기 조성물이 다른 분자들의 조합을 포함하거나, 또는 조합을 포함하지 않을 수 있음을 의미하는 것으로, 상기 기재는 조합 및 조합의 부재(즉, 상기 조합의 각 일원)를 모두 포함한다.

범위는 본 명세서에서 한 특정한 값의 "약"으로부터, 및/또는 다른 특정한 값의 "약"까지 표현될 수 있다. 상기 범위가 표현될 때, 다른 측면은 상기 한 특정한 값부터 및/또는 상기 다른 특정한 값을 포함한다. 이와 유사하게, 앞서 "약"을 사용하는 것에 의해 근사치로 값이 표현될 때, 상기 특정한 값은 다른 측면을 형성한다는 것이 이해될 것이다. 또한, 각 범위의 말단점들은 다른 말단점과의 관계에서 뿐만 아니라 상기 다른 말단점과는 독립적으로도 유의미하다.

본 발명은 세균의 감염(예를 들면, 폐렴구균의 감염), 코의 운반, 코의 콜로니화 및 CNS 침입을 경감시키거나 또는 방지하기 위해 디자인된 조성물 및 방법을 제공한다. 스트렙토코커스 뉴모니애는 C-폴리사카라이드-갱글리오사이드(ganglioside)의 상호작용을 통해 상피 장벽(epithelial barrier)과 교차(cross)되고, 이후 상피세포내로 엔도사이토시스(endocytosis)되는 것에 의해 부분적으로 비도에 콜로니화된다. C-폴리사카라이드는 갱글리오사이드에 존재하는 말단 또는 내부 GalNAcβ1-4Gal 서열에 결합함으로써 아시알로-GM1, 아시알로-GM2 및 푸코실(fucosyl)-아시알로-GM1에 결합한다. 비록, 인간의 폐를 제외하고는 이러한 아시알로갱글리오사이드의 세포막에서의 농도가 정상적으로는 낮지만, 스트렙토코커스 뉴모니애는 2개의 뉴라미니다제, 즉 각각 N-아세틸뉴라민산의 α2,3- 및 α-2,6- 결합을 절단하여 갈락토스를 만드는 NanA와, α2,6-결합을 절단하여 N-아세틸갈락토사민을 만드는 NanB를 갖고 있다(Berry 등, (1996) J. Bacteriol. 178:4854-4860). Scanlon 등, (1989) Enzyme 41:143-150. 갱글리오사이드 상의 시알산 잔기는 갈락토스에 α2,3 결합되어 있다. 스트렙토코커스 뉴모니애의 뉴라미니다제는 모든 모노시알로갱글리오사이드에 존재하는 말단 시알산 잔기 및 디- 및 트리시알로갱글리오사이드에서 나타나는 갈락토스와 결합된 다중 시알산 잔기를 제거한다. 따라서, 이들은 대부분의 보통 포유동물 세포 표면 갱글리오사이드에서 발견되는 GalNAcβ1-4Gal 서열을 노출시킬 수 있다. 상기 잔기들은 세포 표면의 C-폴리사카라이드 결합 위치로 추정된다. 정상적으로 세포벽과 더 연관되어 있는 NanA 및 분비되는 것으로 생각되는 NanB를 사용함으로써, 스트렙토코커스 뉴모니애는 기도에 있는 상피세포 위에 자신의 부착 위치를 생성하게 된다. 따라서, 폐렴구균의 C-폴리사카라이드는 아시알로갱글리오사이드, 특히 아시알로-GM1에 결합하고, 다소 풍부한 GM1을 아시알로-GM1으로 변환시킬 수 있는 뉴라미니다제는 ON/E 위에 C-폴리사카라이드에 대한 풍부한 결합 부위를 생성할 수 있다. 이러한 메카니즘은 코의 운반을 촉진시키고, 코의 비개골(turbinate)(ON/E), 후각 구(OB)를 덮고 있는 코 후각 신경 및 상피를 통해 스트렙토코커스 뉴모니애가 CNS에 접근하도록 한다. 이와 유사하게, 스트렙토코커스 뉴모니애가 관련되는 중이염 및 다른 감염은 중이에 연결되는 신경을 통해 CNS에 접근할 수 있다. 스트렙토코커스 뉴모니애 이외의 다른 세균도 대응하는 뉴라미니다제를 가지고 있으므로, 다른 세균에서도 이와 동일한 메카니즘이 일어난다. 따라서, 본 발명에서 개시된 조성물 및 방법은 다양한 세균에 존재하는 이러한 메카니즘을 표적으로 한다. 본 명세서에 기재된 제제, 조성물 및 방법은 상기 메카니즘을 방해함으로써 운반을 감소시키고 CNS 침입을 방지하기 위한 것이다.

선택적으로, 상기 조성물은 점막에 투여되도록 디자인된다. 예를 들면, 본 발명은 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 폐렴구균 테이코산, 폐렴구균 리포테이코산 또는 이들 중 어느 하나의 항원성 영역 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 점막 표면에 투여하기에 적합하다. 선택적으로, 상기 조성물은 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 폐렴구균 테이코산, 폐렴구균 리포테이코산 또는 이들 중 어느 하나의 항원성 영역의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

선택적으로, 상기 조성물은 에어로졸(aerosol), 코 분무제(nasal mist), 코 스프레이, 코 점적약(drops), 흡입기(nebulizer) 용액, 에어로졸 호흡기(inhalant), 좌약의 형태, 또는 점막 투여에 적합한 임의의 형태(경구 투여를 포함)이다. 선택적으로, 상기 조성물은 운반을 위해 마이크로스피어(microsphere) 또는 리포좀(liposome) 형태일 수 있다. "점막 표면의 투여"는 호흡기계, 소화기계, 또는 비뇨생식기계를 포함하는 임의의 점막 표면에 투여되는 것을 의미한다. 점막 표면의 예로는 비강(후각 신경상피 포함), 비인두, 직장, 질, 후두, 입, 유스타키오관(Eustachian tube), 기관(trachea), 기관지 및 다른 기도(airway), 및 장의 점막을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

점막 표면에 투여하기 위해, 점막 보조제가 사용될 수 있다. 상기 보조제는 본 발명의 조성물과 동시에 투여되거나, 상기 조성물의 투여 직전 또는 직후에 투여될 수 있다. 선택적으로, 상기 조성물은 보조제를 추가로 포함한다. 점막 보조제 제형(formulation)은, 예를 들면, 점막 유도 부위를 표적으로 하는 제제를 포함한다. 상기 보조제는 선택적으로 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 성장 인자, 혈관형성 인자, 세포사멸(apoptosis) 억제제 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사이토카인이 보조제로 선택되는 경우, 상기 사이토카인은 IL-1, IL-1γ, IL-1β, IL-2, IL-5, IL-6, IL-12, IL-15 및 IL-18을 포함하는 인터루킨(interleukin); 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β); 과립구 백혈구 콜로니 촉진 인자(GM-CSF); 인터페론-감마(IFN-γ); 또는 보조제 활성을 갖는 다른 사이토카인을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 보조제 활성 또는 다른 생물학적 활성을 갖는 사이토카인의 일부, 또는 사이토카인의 돌연변이체 또는 유사체(mimics)(또는 이들의 조합)도 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다.

케모카인이 보조제로 선택되는 경우, 상기 케모카인은 선택적으로 림포탁틴(Lymphotactin), RANTES, LARC, PARC, MDC, TARC, SLC 및 FKN을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 세포사멸 억제제가 보조제로 선택되는 경우, 상기 세포사멸 억제제는 선택적으로 카스파제(caspase)-8 억제제, 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 혈관형성 인자가 보조제로 선택되는 경우, 상기 혈관형성 인자는 선택적으로 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 히알우로난(hyaluronan, HA) 절편, 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 실제로, 플러스(+) 및 마이너스(-) 혈관형성 인자들이 보조제로 선택될 수 있다.

실질적으로 비독성이고 생물학적으로 활성형인 본 발명의 점막 보조제의 다른 예로는 호르몬, 효소, 성장 인자, 또는 이들의 생물학적 활성 영역을 포함한다. 이러한 호르몬, 효소, 성장 인자, 또는 이들의 생물학적 활성 영역은, 예를 들면, 인간, 소, 돼지, 양, 개, 고양이, 말, 또는 조류 유래일 수 있으며, 종양 괴사 인자(TNF), 프롤락틴(prolactin), 상피 성장 인자(EGF), 과립구 콜로니 촉진 인자(GCSF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF-1), 소마토트로핀(somatotropin)(성장 호르몬) 또는 인슐린, 또는 수용체(receptor)가 면역 시스템의 세포에서 발현되는 다른 호르몬 또는 성장 인자일 수 있다.

또한, 점막 투여용 보조제로는 세균 독소, 예를 들면, 콜레라 독소(CT), 대장균 열-민감성(heat-labile) 독소(LT), 클로스트리듐(Clostridium) 디피실(difficile) 독소 A 및 백일해 독소(PT), 또는 이들의 조합, 서브유닛(subunit), 톡소이드(toxoid), 키메라(chimera), 또는 돌연변이체를 포함한다. 예를 들면, 정제된 자연상태의 콜레라 독소 서브유닛 B (CTB)가 사용될 수 있다. 또한, 보조제 활성을 유지하고 있는 한, 상기 독소들의 임의의 절편, 동족물(homolog), 유도체, 및 융합물(fusion)도 적합하다. 바람직하게는, 감소된 독성을 갖는 돌연변이체가 사용된다. 적합한 돌연변이체는, 예를 들면, WO 95/17211(Arg-7-Lys CT 돌연변이체), WO 96/6627(Arg-192-Gly LT 돌연변이체), 및 WO 95/34323(Arg-9-Lys 및 Glu-129-Gly PT 돌연변이체)에 개시되어 있다. 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 추가적인 LT 돌연변이체는, 예를 들면, Ser-63-Lys, Ala-69-Gly, Glu-110-Asp, 및 Glu-112-Asp 돌연변이체를 포함한다. RH-3-리간드(ligand); CpG-모티프 올리고뉴클레오타이드; 예를 들면, 대장균, 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota), 살모넬라 티피무리움(typhimurium), 또는 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)의 세균 모노포스포릴 지질 A (MPLA), 사포닌(예를 들면, QS21), 또는 폴리락타이드 글리콜라이드(polylactide glycolide, PLGA) 마이크로스피어와 같은 다른 보조제도 또한 점막 투여에 사용될 수 있다. 가능한 다른 점막 보조제는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 디펜신(defensin) 및 GpG 모티프이다.

전체적으로 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물학적으로 또는 다른 점에서 비바람직하지 않은 물질을 의미하는 것으로서, 즉 상기 물질은 원하지 않는 임의의 생물학적 효과를 일으키거나 또는 상기 약학적 조성물에 포함된 임의의 다른 성분들과 함께 해로운(deleterious) 방식으로 상호작용하는 일이 없이 선택된 화합물과 함께 개체에 투여될 수 있다.

본 명세서에 기재된 임의의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 치료학적으로 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 화합물은 약학적으로 허용가능한 담체와 연관되어 있는 하나 이상의 화합물로 구성되는 약학적 조성물로 편리하게 제형화될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 개시되어 있는 화합물의 제형을 제조하기 위해 사용될 수 있는 전형적인 담체 및 약학적 조성물을 제조하는 통상적인 방법이 개시되어 있으며, 본 명세서에 참조문서로 포함되어 있는 레밍턴 약학 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences) 최신판(E.W. Martin Mack Pub. Co., Easton, PA)을 참조한다. 이들은 인간에게 투여되기 위한 조성물용의 가장 전형적인 표준 담체일 수 있다. 한 측면에서, 멸균수, 생리식염수, 및 생리학적 pH의 완충용액을 포함하는, 인간 및 비인간. 다른 화합물들은 당업자에 의해 사용되는 표준 절차에 따라 투여될 것이다.

본 명세서에 기재된 약학적 조성물은 선택된 분자 이외에 담체, 증점제(thickener), 희석제, 완충제, 보존제(preservative), 표면 활성제 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 약학적 조성물은 항생제, 항염증제, 마취제 등과 같은 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다.

폐렴구균 뉴라미니다제는 폐렴구균 세균에서 발견되는 임의의 뉴라미니다제 분자를 의미한다. 표 1은 몇몇 종 유래의 뉴라미니다제를 배열한 것을 보여준다. 또한, 뉴라미니다제 분자는, 예를 들면, SP1326을 포함한다. 상기 SP1326 아미노산 서열은 진뱅크(GenBank) 기탁번호 AAK75424를 통해 접근할 수 있다. Tettelin, H., 등, (2001) Science 293:498-506. 진뱅크 기탁번호 AAK75424에서 제공된 SP1326의 아미노산 및 핵산 서열을 포함하는 모든 정보는 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되어 있다. 명세서 전체에서 확인되는 바와 같이, 모든 아미노산 서열에 대한 아미노산 잔기는, 표 1에 나타난 바와 같이, 폐렴구균 균주 R의 아미노산 서열에 따라 번호가 매겨져 있다.

뉴라미니다제의 임의의 항원성 변이체도 또한 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다. 따라서, 상기 자연적으로 발생하는 뉴라미니다제는 본 명세서에 개시된 방법에 따라 치환, 결실, 또는 아미노산 잔기의 변경에 의해 변형될 수 있다. 선택적으로, 이러한 변형은 상기 뉴라미니다제를 무독화시키기 위해 디자인될 것이다. "무독화(detoxification)"는 항원성 또는 면역원성을 유지한 채로 효소의 활성을 감소 또는 제거하는 것을 의미한다. 이것은 위치 특이적 돌연변이를 사용하여 뉴라미니다제의 활성 부위에 있는 아미노산을 치환, 결실 또는 변경시킴으로써 수행된다. 바람직하게는, 이러한 치환, 결실, 또는 변경은 Asp 박스(즉, 460-480, 530-560, 또는 600-620 아미노산 잔기 내) 내에 있을 것이다. 내부에 기재되어 있는 뉴라미니다제 구조에 대한 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되어 있는 Crennell 등, PNAS 90:9852-9856 참조. 또한, 이러한 치환, 결실, 또는 변경은 383-387, 467-473, 541-546, 또는 610-616 아미노산 잔기 내의 Asp 박스내에서 일어날 수 있다. Asp 박스를 변경시키는 것은, 예를 들면, 아스파르트산을 글루탐산 또는 트레오닌으로 교체하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 독성을 감소시키기 위해 다른 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산의 교체가 아스파르트산 잔기 또는 Asp 박스내의 임의의 다른 잔기에서 사용될 수 있다. 뉴라미니다제의 다른 영역이 선택적으로 위치 특이적 돌연변이를 위한 표적이 된다. 예를 들면, 572 위치의 발린 또는 글루타민의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환을 포함하는 570-580 잔기에 상응하는 영역내의 변형이 개시되어 있다. 또한, 750-760 잔기에 상응하는 영역, 보다 구체적으로는 754 위치의 티로신이 변형된 뉴라미니다제가 개시되어 있다. 티로신 잔기에 대한 보존적 아미노산 치환은, 예를 들면, 세린 또는 트레오닌이다. 또한, 340-350, 600-610, 또는 360-370 아미노산 잔기에 상응하는 영역이 변형된 뉴라미니다제가 제공된다. 보다 상세하게는, 347, 605, 366, 또는 367 위치의 알기닌이 라이신 또는 글루타민, 또는 다른 보존적 또는 비보존적 아미노산으로 치환될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 다양한 변형들은 조합되어 사용될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산의 치환이 동일한 뉴라미니다제 내에 선택적으로 존재한다.

상기에서 기재된 바와 같이, 무독화된 뉴라미니다제는 종래에 널리 공지되어 있는 Lock, 등의 분석법(Microb. Pathog. 4:33-43, 1988)으로 측정할 때 무독화되지 않은 뉴라미니다제에 비해 감소된 활성을 나타내는 뉴라미니다제이다. Lock의 분석법을 사용하여, 2'-(4-메틸-움벨리페릴(umbelliferyl))-α-D-N-아세틸뉴라민산을 효소 분석시의 기질로 사용하여 용해물(lysate), 혈청, 또는 혈액 내의 NanA 활성을 측정할 수 있다(Lock 등, 1988). 10 ㎕의 기질이 10 ㎕의 혈청과 결합한 후, 37℃에서 5분간 배양된다. 상기 반응은 0.5 M의 탄산나트륨을 사용하여 중지된다. 뉴라미니다제 활성은 분당 방출된 4-메틸움벨리페론(MU)의 양에 의해 측정된다. MU는 366 nm의 여기(excitation) 파장 및 445 nm의 방출(emission) 파장을 갖고 있다. 상기 무독화된 뉴라미니다제가 무독화되지 않은 뉴라미니다제에 필적하는 항원성 또는 면역원성을 유지하여, 면역학적 조성물을 형성하기 위한 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 결합될 수 있는 것이 바람직하다. 비교를 위한 목적으로, 무독화되지 않은 뉴라미니다제는 표 1에 나타난 R6 NanA를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서, 무독화된 뉴라미니다제는 무독화되지 않은 뉴라미니다제 활성의 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 나타낸다.

무독화된 뉴라미니다제는 무독화되지 않은 뉴라미니다제와 비교할 때 그 아미노산 서열의 변경(즉, 치환, 변형, 또는 결실)을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 무독화된 뉴라미니다제는 무독화되지 않은 뉴라미니다제 내에서 발견되는 아미노산이 대략 7%, 10%, 15% 또는 20% 변경된 것을 포함한다. 바람직한 아미노산 결실은 무독화되지 않은 뉴라미니다제의 N-말단으로부터 아미노산이 대략 5, 10 또는 15개 결실되는 것을 포함한다. 다른 바람직한 실시예는 무독화되지 않은 뉴라미니다제의 C-말단 아미노산이 60, 50, 40, 30, 20, 10 또는 5개 결실되는 것을 포함한다(이러한 적용을 목적으로, 상기 C-말단은 표 1에 나타난 R6 NanA의 800 아미노산에서 시작한다). 또 다른 바람직한 실시예에서, 무독화된 뉴라미니다제는 무독화되지 않은 뉴라미니다제의 C-말단 아미노산이 17, 9, 8, 7, 4 또는 2개 결실된 것을 포함한다. 특히 대표적인 바람직한 결실이 표 1에 설명되어 있다(즉, TIGR4 NanA 아미노산 서열). 모든 상기 변경은 하나 이상의 다른 변경들과 조합될 수 있다. 바람직하게는, 상기 무독화된 뉴라미니다제 종(species)은 무독화되지 않은 뉴라미니다제 활성의 대략 60%, 70%, 80% 또는 90%를 나타낸다.

상기 뉴라미니다제가 그 항원성 및 면역원성을 유지하고 있는 한, 뉴라미니다제에서의 다른 보존적 또는 비보존적 치환이 사용될 수 있다. 상기 보존적 치환은 자연적으로 발생하는 아미노산이 유사한 특성을 갖는 다른 것에 의해 교체되는 것이다. 상기 보존적 및 비보존적 치환은 선택적으로 상기 폴리펩타이드의 효소 기능을 변경시킨다. 예를 들면, 보존적 치환은 표 2에 따라 제조될 수 있다.

원한다면, 변형 및 교체는 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 및/또는 본 발명의 핵산의 아미노산 서열에서 이루어질 수 있으며, 동일하거나 또는 다른 원하는 특성(예를 들면, 항원성 또는 면역원성)을 갖는 폴리펩타이드를 여전히 얻게 된다. 이러한 교체는 자연적 분리물(isolate)에서 일어나거나, 또는 위치 특이적 돌연변이를 사용하여 합성에 의해 도입될 수 있다. 미스매치(mismatch) 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)과 같은 이러한 과정은 종래에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 어떤 아미노산은 감지될 정도의 기능적인 활성의 감소없이 폴리펩타이드 내에서 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 따라서, 감지될 정도의 생물학적 유용성 또는 활성의 감소없이, 그리고 가능하게는 이러한 유용성 또는 활성이 증가되도록, 다양한 교체가 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 내에서 행해질 수 있다.

nanA 유전자 또는 상기 nanA 유전자의 임의 영역의 결실은 Sung 등에 의해 기재된 방법(Sung 등, (2001) Appl Environ Microbiol 67:5190-5196)을 사용하여 수행되며, 상기 문서에 기재된 방법은 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다. 단백질의 Arg 잔기와 특이적으로 반응하는 2,3-부타디온(butadione) 시약이 상기 NanA 분자의 접힘(folding)에 미치는 Arg 잔기의 중요성을 평가하기 위해 사용된다. 위치-유도된(directed) 돌연변이가 특정한 아미노산을 변형시키기 위해 사용된다.

또한, 상기 뉴라미니다제는, 예를 들면, 변성(denaturation)을 포함하는 화학적 처리에 의해 무독화될 수 있다. 화학적 처리는 또한 부정적인 부작용을 추가로 감소시키고, 또한 항원성 또는 면역원성을 향상시키기 위해 위치 특이적 돌연변이와 함께 결합될 수 있다. 상기 무독화된 뉴라미니다제로 대상을 면역화시키기 전에, 상기 무독화된 뉴라미니다제는 포르말린, 글루타르알데히드, 열, 또는 당업자에게 공지되어 있는 다른 제제와 함께 처리될 수 있다.

따라서, 본 발명은 폐렴구균 뉴라미니다제 또는 그의 항원성 또는 면역원성 영역을 제공한다. 또한, 상기 무독화된 폐렴구균 뉴라미니다제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 선택적으로, 상기 조성물은 보조제(예를 들면, 점막 보조제를 포함)를 추가로 포함한다.

아울러, 예를 들면, 항원성 또는 면역원성을 증가시키는 모이어티(moiety)를 포함하는 모이어티가 상기 뉴라미니다제에 첨가될 수 있다. 이러한 모이어티는, 예를 들면, 사이토카인, 케모카인, 성장인자, 혈관형성 인자, 세포사멸 억제제, 호르몬, 독소, 또는 보조제로 사용하기 위해 본 명세서에 개시되어 있는 다른 모이어티를 포함한다. 상기 모이어티는 변형된 분자에서 사용되기 위해 선택적으로 변형되거나 절단될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 뉴라미니다제 또는 이의 항원성 또는 면역원성 절편 및 항원성 또는 면역원성을 향상시키는 모이어티를 포함하는 폐렴구균 뉴라미니다제 키메라를 제공한다. 또한, 폐렴구균 뉴라미니다제 유도체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 선택적으로, 상기 조성물은 보조제(예를 들면, 점막 보조제를 포함)를 추가로 포함한다.

선택적으로, 본 발명의 상기 변형된 뉴라미니다제 절편 또는 이의 영역은 자연적으로 발생하는 폐렴구균 뉴라미니다제 또는 이의 절편과 적어도 약 70%의 동질성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 상기 변형된 뉴라미니다제 또는 이의 절편을 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 명세서에서 개시된 핵산 및 단백질의 임의의 공지된 변이체 및 유도체 또는 발생할 수 있는 것들을 정의하기 위한 한 방법은 특정한 공지된 서열에 대한 동질성의 관점에서 상기 변이체 및 유도체를 정의하는 것이다. 예를 들면, 표 1에 나타나 있는 R6 폐렴구균 균주의 nanA 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 폐렴구균 뉴라미니다제의 특정한 서열을 나타내고, 상기 단백질의 특정한 아미노산 서열을 나타낸다. 특히, 본 명세서에 개시된 상기 서열의 변이체는 언급된 서열과 적어도 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 동질성을 갖는다. 당업자들은 2개의 단백질 또는 핵산의 동질성을 결정하는 방법을 즉시 이해한다. 예를 들면, 상기 동질성은 동질성이 최대로 나타나도록 2가지 서열을 배열한 후 계산될 수 있다.

동질성을 계산하는 다른 방법은 공개된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 서열을 비교하기 위한 최적의 배열은 Smith 및 Waterman의 국소 동질성 알고리즘(Smith 및 Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)), Needleman 및 Wunsch의 동질성 배열 알고리즘(Needleman 및 Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)), Pearson 및 Lipman의 유사성 방법을 위한 검색(Pearson 및 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)), 상기 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(Wisconsin Genetics Software Package에 있는 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetic Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 정밀조사(inspection)에 의해 수행될 수 있다. 동일한 유형의 동질성이, 예를 들면, Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger 등, Methods Enzymol. 183:281-306, 1989에 개시되어 있는 알고리즘에 의해 핵산에 대해서도 얻어질 수 있으며, 상기 문서들은 적어도 핵산의 배열과 관련된 물질에 대해 본 명세서에 참조로 포함된다.

"폐렴구균 포스포콜린, 폐렴구균 테이코산, 폐렴구균 리포테이코산"은 폐렴구균 세균에 존재하는 포스포콜린, 테이코산, 또는 리포테이코산을 의미한다. 상기 화합물들은 변형, 무독화, 또는 상기 뉴라미니다제에 관해 개시된 것과 같이 향상(enhance)될 수 있다. 본 발명에서는 상기 변형, 무독화, 및 향상된 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다.

"그의 항원성 영역"은 상기 분자에 대한 항체의 생산을 일으킬 수 있는 분자 또는 화합물(예를 들면, 뉴라미니다제, 포스포콜린, 폐렴구균 테이코산, 폐렴구균 리포테이코산)의 임의의 에피토프(epitope)를 의미한다. 바람직하게는, 상기 항원성 영역은 상기 분자 또는 스트렙토코커스 뉴모니애에 대한 면역을 일으킨다. 바람직하게는, 상기 항체는 상기 뉴라미니다제의 활성 부위를 향하거나 또는 이를 간섭한다. 항원성 절편의 예로는 보존적 아미노산의 치환 또는 변형의 존재 또는 부재하에 nanA-R6 아미노산의 63-361 잔기에 해당하는 잔기를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 예로는 보존적 아미노산의 치환 또는 변형의 존재 또는 부재하에 뉴라미니다제의 Asp 영역(상기 NanA-R6 아미노산 서열의 460-480, 530-560, 610-620 잔기에 대응) 및 상기 NanA-R6 아미노산 서열의 340-350, 360-370, 600-610, 570-580 및 750-760 잔기에 대응하는 영역을 포함한다. 선택적으로, 뉴라미니다제의 활성 부위를 간섭하도록 유도된 항체는 서열번호 15의 347, 367 또는 605 잔기에 위치한 NanA의 알기닌 잔기, 또는 서열번호 15의 383-387, 467-473, 541-546 및 610-616 잔기에 위치한 NanA의 Asp 박스에 결합하거나 또는 결합하는 것을 방지할 수 있다. 아울러, 상기 항체는 또한 서열번호 15의 575 잔기에 위치한 발린, 또는 서열번호 15의 752 잔기에 위치한 티로신에 결합하거나 또는 결합하는 것을 방지할 수 있다. 또한, 상기 항체는 서열번호 15의 상기 나열된 잔기들의 임의의 조합에 결합하거나 또는 결합하는 것을 방지할 수 있다.

NanA 절편의 다른 예로는 1 내지 340, 330 내지 630, 620 내지 800, 700 내지 1,030 및 330 내지 800 아미노산을 포함한다. 또한, 이들 절편의 둘 이상이 융합된 절편을 제공한다. 융합된 절편은 1 내지 340 영역이 620-680 영역과 융합된 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 융합된 절편은 재조합 단백질로 발현된다. 상기 절편을 코딩하는 절편은 발현 벡터(pET Vectors; Novagen, Inc.) 내에 클로닝되고, 상기 단백질은 정제된다. 다른 한편으로, 절편은 벤더(vendor)로부터 합성 폴리펩타이드로 생성된다. 절편은 동물을 면역시켜 항체를 생성하고, 3차원 구조를 평가하도록 결정화하기 위해 사용된다. 아울러, 상기에서 기재된 것과 같이, 보존적 또는 비보존적 아미노산 변형, 또는 치환의 존재 또는 부재하에 상기 절편을 코딩하는 핵산을 제공한다. 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터 또는 발현 시스템을 제공한다.

본 발명은 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 테이코산, 리포테이코산, 또는 이들 중 어느 하나 또는 둘의 항원성 영역에 특이적으로 결합하는 단리된(isolated) 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 상기 항체들의 임의의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 항체들은 스트렙토코커스 뉴모니애에 대한 수동 면역을 개발하는데 유용하다. 상기 항체 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 선택적으로, 상기 조성물은 점막 표면에 투여하기에 적합하지만, 본 명세서에 개시된 전신 투여를 포함하는 다른 투여 경로도 개시되어 있다.

또한, 본 발명은 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 테이코산, 리포테이코산, 또는 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 테이코산, 리포테이코산의 임의의 에피토프에 특이적인 항체를 생성하는 방법을 제공한다. 선택적으로, 상기 항체는 대상의 코 점막을 본 명세서에 기재된 유효한 양의 조성물과 접촉시킴으로써 대상 내에서(즉, in vivo) 생성된다. 또한, 대상의 코 점막을 표적 분자 또는 상기 분자를 표적으로 하는 항체의 조합을 포함하는 유효한 양의 조성물과 접촉시킴으로써 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 테이코산, 리포테이코산, 또는 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 테이코산, 리포테이코산의 임의의 에피토프의 임의의 조합에 특이적인 항체를 생성하는 방법을 제공한다.

선택적으로, 자연적으로 발생하거나, 무독화되거나 또는 다르게 변형된 본 명세서에 기재된 제제는 핵산의 형태로, 예를 들면, 벡터내에서 투여될 수 있다. 상기 핵산이 발현되면 발현된 원하는 핵산과 대상이 접촉하게 되는 결과가 된다. 따라서, 예를 들면, 폐렴구균 뉴라미니다제를 코딩하는 핵산이 대상 내에서 발현될 수 있는 형태로 상기 대상에게 투여되면, 상기 대상은 상기 뉴라미니다제와 접촉하게 된다.

외인성(exogeneous) DNA를 대상의 세포내로 투여 및 섭취시키는 것(즉, 유전자 전달유도(transduction) 또는 전달감염(transfaction))을 포함하는 본 발명에 기재된 방법에서는, 상기 핵산이 맨(naked) DNA 또는 RNA의 형태이거나, 또는 상기 핵산은 새포내로 핵산을 운반시키기 위해 벡터내에 포함될 수 있으며, 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 상기 항체를 코딩하는 DNA 절편은 프로모터의 전사 조절하에 있다. 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터(Quantum Biotechnologies, Inc., Laval, Quebec, Canada)처럼 상업적으로 구입할 수 있다. 상기 핵산 또는 벡터를 세포내로 운반시키는 것은 다양한 메카니즘을 통해 수행될 수 있다. 한 예로, 운반은 리포좀, 즉 LIPOFECTIN, LIOPFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Germany) 및 TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI)과 같은 상업적으로 구입할 수 있는 리포좀 제품뿐만 아니라 종래의 표준 방법에 따라 만들어진 다른 리포좀을 통해서도 수행될 수 있다. 아울러, 개시된 핵산 또는 벡터는 유전자 총(gene gun) 또는 전기천공법(electroporation)과 같은 다른 운반 방법에 의해 생체내로 운반될 수 있으며, 상기 기술은 Genetronics, Inc.(San Diego, CA)뿐만 아니라 SONOPORATION 기계(ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ)에 의해서도 가용하다.

한 예로, 벡터의 운반은 재조합 레트로바이러스 게놈을 포장할 수 있는 레트로바이러스 벡터 시스템과 같은 바이러스 시스템을 통할 수 있다(예를 들면, Pastan 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4486, 1988; Miller 등, Mol. Cell. Biol. 6:2895, 1986 참조). 상기 재조합 레트로바이러스는 감염을 위해 사용될 수 있으며, 이로부터 예를 들면 폐렴구균 뉴라미니다제 또는 넓게 중화시키는 항체(또는 이의 활성형 단편)를 코딩하는 핵산을 감염된 세포내로 전달한다. 물론, 상기 변경된 핵산을 포유동물의 세포내로 도입하는 정확한 방법은 레트로바이러스 벡터를 사용하는 것에 한정되는 것은 아니다. 아데노바이러스 벡터(Mitani 등, Hum. Gene Ther. 5:941-948, 1994), 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터(Goodman 등, Blood 84:1492-1500, 1994), 렌티바이러스(lentivirus) 벡터(Naidini 등, Science 272:263-267, 1996), 의사형(pseudotyped) 레트로바이러스 벡터(Agrawal 등, Exper. Hematol. 24:738-747, 1996)의 사용을 포함하는 다른 기술들이 이를 위해 널리 사용된다. 리포좀 운반 및 수용체-매개성 및 다른 엔도사이토시스 메카니즘과 같은 물리적인 전달유도 기술 또한 사용될 수 있다(예를 들면, Schwartzenberger 등, Blood 87:472-478, 1996 참조). 상기에서 기재된 조성물 및 방법은 이들 또는 다른 일반적으로 사용되는 유전자 전달 방법들과 임의로 결합되어 사용될 수 있다.

한 예로, 상기 항체를 코딩하는 핵산이 아데노바이러스 벡터 내에서 대상 세포내로 운반된다면, 인간에서의 아데노바이러스 투여량은 1회 주사당 약 10⁷ 내지 10⁹ 플라크 형성 단위(pfu) 범위일 수 있으나, 주사 당 10¹² pfu 만큼 높을 수도 있다(Crystal, Hum. Gene Ther. 8:985-1001, 1997; Alvarez 및 Curiel, Hum. Gene Ther. 8:597-613, 1997). 대상은 단일 주사를 받을 수 있으며, 또는 만일 추가 주사가 필요하다면, 정해지지 않은 기간동안 6개월의 간격(또는 능숙한 당업자에 의해 결정되는 다른 적절한 시간 간격)으로 및/또는 치료 효능이 달성될 때까지 반복할 수 있다.

상기 핵산 또는 벡터의 비경구 투여가 사용된다면 일반적으로 주사에 의해 특정된다. 주사제는 액체 용액 또는 현탁액, 주사전에 액체에서 현탁 용액이 되기에 적합한 고체 형태이거나 또는 에멀젼(emulsion)과 같은 통상적인 행태로 제조될 수 있다. 비경구 투여를 위한 더욱 최근의 개선된 방법은 일정한 투여량(dosage)이얻어지도록 하는 느린 방출 또는 지속된 방출 시스템을 사용하는 것을 포함한다. 본 명세서에 참조로 포함되어 있는 미국특허 제3,610,795호 참조. 치료 화합물의 적합한 제형 및 다양한 투여 경로에 대한 추가적인 설명은 예를 들면 Remington을 참조한다(Remington, The Science and Practice of Pharmacy(19th ed.)ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995).

또한, 본 명세서에 개시된 조성물의 치료학적 유효량을 대상의 코 점막에 접촉시키는 것을 포함하는, 대상에서 폐렴구균의 코의 운반을 감소시키거나 또는 방지하는 방법이 개시되어 있다. 이러한 투여는 폐렴구균의 감염 또는 코의 운반에 대한 능동 또는 수동 면역, 또는 이에 대한 방어를 생성시키는데 유용할 수 있다.

또한, 본 명세서에서 개시된 조성물의 치료학적 유효량을 대상의 코 점막에 접촉시키는 것을 포함하는, 대상에서 폐렴구균의 감염을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 상기 방법은 폐렴구균 뇌수막염, 중이염, 폐렴, 또는 용혈성 요독증(hemolytic uremia)를 방지할 수 있다. 방지 또는 감소는 코의 운반을 감소시키거나 및/또는 CNS 침입, 전신 침입, 또는 유스타키오관 또는 하부 기도의 침입을 방지함으로써 일어날 수 있다.

본 명세서에서 제공된 화합물의 "유효한 양"이라는 용어는 원하는 결과를 제공하기에 충분하고 비독성인 화합물의 양을 의미한다. 아래에서 지적한 바와 같이, 요구되는 정확한 양은 대상의 인종, 나이 및 일반적인 상태, 치료되는 질병의 심각한 정도, 사용되는 특정한 화합물, 그 투여 경로 등에 따라 대상마다 다를 수 있다. 일반적으로, 상기 투여량은 대상의 나이, 상태, 성별 및 질병의 정도에 따라 다양할 것이며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상기 투여량은 관련된 대상의 임상 상태에 기초하여 개개 의사에 의해 조정될 수 있다. 투여량, 투여 계획 및 투여 경로는 다양할 수 있다. 바람직한 투여량은 면역당 약 1-1,000 ㎍ 또는 예를 들면 10-100 ㎍을 포함하는 그 사이의 임의의 양의 항원을 코에 적용하는 것을 포함한다.

본 명세서에 개시된 방법에 따른 화합물 또는 조성물의 특정한 투여량의 투여 효능은 의료 병력, 징후, 증상, 및 폐렴구균에 감염된 대상 또는 폐렴구균 운반자의 상태를 평가하는데 유용하다고 알려져 있는 객관적인 실험실 검사의 특정한 측면을 평가함으로써 결정될 수 있다. 이러한 징후, 증상, 및 객관적인 실험실 검사는, 이러한 환자를 치료하는 임의의 임상의(clinician) 또는 이러한 분야에서 실험을 수행하는 연구자에게 공지된 바와 같이, 치료 또는 보호된 특정한 질병 또는 상태에 따라 다양할 것이다. 예를 들면, 적절한 대조군과의 비교 및/또는 일반적인 집단 또는 특정한 개인에서의 상기 질병의 정상적인 진행에 대한 지식에 기초하여, 만일 1) 대상의 물리적인 상태가 향상된 것으로 나타나거나(예를 들면, 코의 운반이 감소되거나 또는 없어짐), 2) 상기 질병, 감염, 또는 코의 운반이 안정되고, 느려지고, 또는 유지되거나, 또는 3) 상기 질병 또는 상태를 치료하기 위한 다른 처방에 대한 필요성이 감소되거나 또는 없어진다면, 특정한 치료 처방이 효능이 있는 것으로 간주될 것이다. 예를 들면, 대상 또는 집단 내에서 코의 운반을 감소시키거나 또는 방지하거나, CNS 침입 또는 다른 2차 폐렴구균dml 감염을 피하거나 또는 감소시키는 것은 효능이 있음을 나타낸다. 이러한 효과는 단일한 대상에서 결정되거나(예를 들면, 점막 표면에서 전통적인 면봉으로 검출된 세균의 수가 감소되는 것에 의해), 또는 집단에서 결정될 수 있다(예를 들면, 역학 조사를 이용).

본 명세서에 기재된 화합물 및 약학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 요구되는지 여부, 및 치료되는 면적에 따라 몇 가지 방법으로 대상에게 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 화합물 및 약학적 조성물은 정맥내, 피하내, 근육내, 리포좀 또는 마이크로스피어에 캡슐화되어 안구 표면에 대한 안약 용액 및/또는 연고로, 코 스프레이로, 흡입 용액으로, 또는 비강 또는 기도에 대한 에어로졸로 투여될 수 있다. 아울러, 화합물 또는 약학적 조성물은 흡입, 경구 또는 삽관에 의해 대상에게 질내, 직장내, 코내, 경구내로 투여될 수 있다. 선택적으로, 상기 조성물은 정맥내, 피하내, 근육내, 또는 복강내 주사에 의해 투여된다. 상기 조성물은 액체 용액 또는 현탁액, 액체에서 용액 또는 현탁액이 되기에 적합한 고체 형태이거나 또는 에멀젼과 같은 통상적인 행태로 제조될 수 있다 선택적으로, 투여는 일정한 투여량이 유지되도록 느린 방출 또는 지속된 방출 시스템에 의해 수행된다. 문서내에 기재되어 있는 방법이 본 명세서에서 참조로 포함되어 있는, 예를 들면, 미국특허 제3,610,795호 참조.

본 명세서에서 개시된 조성물은 완충제, 희석제 및 다른 적합한 첨가제를 또한 포함할 수 있는 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸 올레이트(oleate)와 같은 유기 에스테르가 있다. 수성 담체는 물, 알콜/수성 용액, 생리식염수 및 완충 배지를 포함하는 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 운반제(vehicle)는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산화된 링거액, 또는 고정유(fixed oil)를 포함한다. 예를 들면, 항생제, 항산화제, 킬레이트제, 및 불활성 가스와 같은 보존제 및 다른 첨가제 또한 존재할 수 있다.

국소 투여를 위한 제형은 안약, 로션, 크림, 젤, 점적약, 좌약, 스프레이, 액체, 에어로졸, 흡입용액 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약학적 담체, 수성, 분말성 또는 오일성 염기, 증점제 등도 필요하거나 원할 경우 사용할 수 있다.

경구 투여를 위한 조성물은 분말 또는 과립, 현탁액 또는 수성 용액 또는 비수성 배지, 캡슐, 샤세(sachet), 또는 정제를 포함할 수 있다. 증점제, 향료, 희석제, 에멀젼화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직하게 사용된다.

본 발명은 효과적인 양의 뉴라미니다제 억제제를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 코의 운반 또는 폐렴구균의 감염을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 뉴라미니다제 억제제는 상기 대상의 내인성(endogenous) 뉴라미니다제를 유의미하게 감소시키는 일 없이 폐렴구균 뉴라미니다제의 활성을 억제한다. 따라서, 예를 들면, 상기 뉴라미니다제가 인간에게 투여된다면, 상기 억제제는 바람직하게는 인간 뉴라미니다제의 활성을 감소시키지 않거나, 또는 인간에게 음성 부작용이 나타나도록 인간 뉴라미니다제 활성을 감소시키지 않으면서 폐렴구균 뉴라미니다제를 억제할 것이다. 공지된 뉴라미니다제 억제제의 예로는 DANA, NANA, 자나미비어(zanamivir) 및 오셀타미비어(oseltamivir)를 포함한다.

본 발명은 폐렴구균 뉴라미니다제, 포스포콜린, 폐렴구균 테이코산, 폐렴구균 리포테이코산에 대한 항체 또는 이의 절편, 또는 이들 중 어느 하나의 영역에 대한 항체를 포함하는 조성물을 효과적인 양으로 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 코의 운반 또는 폐렴구균의 감염을 감소시키거나 또는 방지하는 방법을 제공한다. 선택적으로, 이러한 투여는 상기 대상의 점막 표면을 상기 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 또한, 상기 항체를 포함하는 조성물 및 용기를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 "포스포콜린 항체"라는 용어는 포스포콜린 또는 이의 항원성 절편에 선택적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 또한 폐렴구균 테이코산 또는 폐렴구균 리포테이코산 또는 이의 항원성 영역 또는 뉴라미니다제 또는 이의 절편에 선택적으로 결합할 수 있다.

"항체"라는 용어는 본 명세서에서 넓은 의미로 사용되었으며, 다클론 및 단일클론 항체 양쪽을 모두 포함한다. 이중 또는 다중 항원 또는 에피토프 특이성을 갖는 키메라 항체, 및 교잡(hybrid) 항체, 및 F(ab')₂, Fab', Fab, scFv 등과 같은 절편들도 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에서 또한 사용될 수 있다. 따라서, 특이적인 항원에 대한 결합력을 유지하는 항체의 절편들도 제공된다. 예를 들면, 뉴라미니다제, 포스포콜린, 테이코산, 또는 리포테이코산에 대한 결합 활성을 유지하는 항체의 절편은 "항체 절편"이라는 용어의 의미 내에 포함된다. 이러한 항체 및 절편은 종래에 공지된 기술에 의해 제조될 수 있으며, 실시예에 기재된 방법 또는 항체를 생산하고 항체의 특이성 및 활성을 스크리닝(screening)하는 일반적인 방법에 따라 특이성 및 활성이 스크리닝될 수 있다(Harlow 및 Lane. Antibodies, A Labratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988)).

항체 절편과 항원 결합 단백질(단일 사슬 항체)의 콘쥬게이트(conjugate)는 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있다. 이러한 콘쥬게이트는, 예를 들면, 미국특허 제4,704,692호에 기재되어 있으며, 그 내용은 참조로 포함되어 있다. 상기 항체는 시험관내(in vitro) 분석법을 사용하거나, 또는 유사한 방법에 의해 그 원하는 활성을 검사할 수 있으며, 이후 이들의 생체내 치료 및/또는 예방 활성이 공지된 임상 검사 방법에 따라 검사된다.

본 명세서에서 사용된 "단일클론 항체"라는 용어는 집단내의 개개의 항체가 항체 분자의 작은 부분에서 존재할 수도 있는 자연적으로 발생하는 가능한 돌연변이를 제외하고는 동일한, 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 얻어진 항체를 가리킨다. 개시된 단일클론 항체는 단일클론 항체를 생산하는 임의의 방법을 사용하여 만들 수 있다. 예를 들면, 개시된 단일클론 항체는 Kohler 및 Milstein에 의해 기재된 것과 같은 하이브리도마(hybridoma) 방법을 사용하여 제조할 수 있다(Kohler 및 Milstein, Nature, 256:495 (1975)). 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적합한 숙주 동물이 면역화 제제를 이용하여 전형적으로 면역화되어, 상기 면역화 제제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 유발시킨다. 다른 한편으로, 상기 림프구는 예를 들면 본 명세서에 기재된 HIV Env-CD4-co-수용체 복합체를 사용하여 시험관내에서 면역화될 수 있다.

또한, 상기 단일클론 항체는 미국특허 제4,816,567호(Cabilly 등)에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 만들어질 수도 있다. 개시된 단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 방법(예를 들면, 설치류 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함)을 사용하여 즉시 분리 및 시퀀싱(sequencing) 될 수 있다. 또한, 항체 또는 활성형 항체 절편의 라이브러리(library)는, 예를 들면, Burton 등의 미국특허 제5,804,440호 및 Barbas 등의 미국특허 제6,096,441호에 기재된 파지(phage) 디스플레이 기술을 사용하여 생성 및 스크리닝될 수 있다.

또한, 시험관내 방법이 단일가(monovalent) 항체의 제조에 적합하다. 항체를 소화시켜 그 절편, 특히 Fab 절편을 생성하는 것은 종래에 공지된 통상적인 기술을 사용함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 소화는 파파인(papain)을 사용하여 수행될 수 있다. 파파인 소화의 예는 1994년 12월 22일자로 공개된 WO 94/29348 및 미국특허 제4,342,566호에 기재되어 있다. 파파인으로 항체를 소화하면, 전형적으로 각각 하나의 항원 결합 부위를 가지며 Fab 절편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 절편 및 나머지 Fc 절편이 생성된다. 펩신으로 처리하면 2개의 항원 결합 부위를 가지고 여전히 항원과 교차결합할 수 있는 절편이 생성된다.

또한, 상기 항체 절편은, 변경되지 않은 항체 또는 항체 절편과 비교할 때 항체 또는 항체 절편의 활성이 유의미하게 변경되거나 또는 손상되지 않는 한, 다른 서열에 부착되어 있는지 여부에 상관없이 특정한 영역 또는 특정한 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 치환, 또는 다른 선택된 변이를 포함할 수 있다. 이러한 변이는 이황화(didulfide) 결합을 할 수 있는 아미노산을 제거/추가하고, 그 수명을 연장시키고, 또는 그 분비 특성을 변경시키는 등의 몇 가지 추가적인 특성을 제공할 수 있다. 모든 경우에 있어서, 상기 항체 또는 항체 절편은 동류(cognate) 항원에 대한 특이적인 결합과 같은 생활성(bioactive) 특성을 갖고 있어야만 한다. 상기 항체 또는 항체 절편의 기능성 또는 활성 영역은 단백질의 특정한 영역에 대한 돌연변이, 발현 및 발현된 폴리펩타이드의 검사에 의해 확인될 수 있다. 상기 방법은 당업자에게 즉시 자명하며, 상기 항체 또는 항체 절편을 코딩하는 핵산의 위치-특이적인 돌연변이를 포함할 수 있다(Zoller, M.J. Curr. Opin. Biotechnol. 3:348-354, 1992).

본 명세서에서 사용된 "항체" 또는 "항체들"이란 용어는 또한 인간 항체 및/또는 인간화 항체를 가리킬 수 있다. 많은 비인간 항체(예를 들면, 마우스, 래트, 또는 토끼 유래 항체)는 인간에게 자연적으로 항원성이 있으며, 따라서 인간에게 투여될 때 원하지 않는 면역 반응을 일으킬 수 있다. 따라서, 상기 방법에서 인간 또는 인간화 항체를 사용하게 되면 인간에게 투여된 항체가 원하지 않는 면역 반응을 유발시키게 되는 기회를 감소시키게 된다. 따라서, 항체를 포함하는 조성물은 선택적으로 인간화된 또는 완전한 인간 항체를 포함한다. 항체의 인간화 기술은 하나 이상의 항체 분자의 폴리펩타이드 사슬을 코딩하는 DNA 서열을 조작하기 위해 일반적으로 재조합 DNA 기술을 사용하는 것을 포함한다. 따라서, 인간화된 형태의 비인간 항체(또는 이의 절편)는 비인간(공여) 항체의 항원 결합 부위 영역이 인간(수여) 항체의 뼈대(framework)에 연결된 것을 포함하는 키메라 항체 또는 항체 사슬(또는 Fv, Fab, Fab'와 같은 그의 절편, 또는 항체의 다른 항원 결합 영역)이다.

상기 인간 항체는 임의의 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 인간 단일클론 항체를 생산하기 위한 기술의 예로는 Cool 등(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77, 1985) 및 Boerner 등(J. Immunol., 147(1):86-95, 1991)에 의해 기재된 것들을 포함한다. 인간 항체(및 그의 절편)는 또한 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 생산할 수도 있다(Hoogenboom 등, J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581, 1991).

또한, 상기 인간 항체는 형질전환 동물로부터 얻어질 수 있다. 예를 들면, 면역화에 대한 반응에서 인간 항체의 모든 레퍼토리(repertoire)를 생산할 수 있는 형질전환된 돌연변이 마우스가 개시되어 있다(예를 들면, Jakobovits 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 255 (1993); Jakobovits 등, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann 등, Year in Immunol., 7:33 (1993) 참조). 구체적으로, 상기 키메라 및 생식 라인(germ line) 돌연변이 마우스에 존재하는 항체 중쇄의 결합 부위(J(H)) 유전자를 동질(homozygous) 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전하게 억제되고, 인간 생식라인 항체 유전자 어레이(array)를 상기 생식 라인 돌연변이 마우스에 성공적으로 전달하면 항원 투여시 인간 항체가 생산되는 결과가 나타난다. 원하는 활성을 가진 항체는 본 명세서에 기재되어 있는 Env-CD4-co-수용체 복합체를 사용하여 선택된다.

인간화 항체를 생성하기 위하여, 수용(인간) 항체 분자의 하나 이상의 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR)에 위치하는 잔기는 원하는 항원 결합 특성(예를 들면, 표적 항원에 대한 특정한 수준의 특이성 및 결합성)을 갖고 있다고 알려져 있는 공여(비인간) 항체 분자의 하나 이상의 CDR에 위치하는 잔기로 교체된다. 어떤 경우에는, 인간 항체의 Fv 뼈대(FR) 잔기가 대응하는 비인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체뿐만 아니라 유입된 CDR 또는 뼈대 서열 모두에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간인 공급원(source)으로부터 내부에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 몇몇 CDR 잔기 및 때때로 몇몇 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위 유래의 잔기로 치환된 인간 항체이다. 인간화 항체는 일반적으로 항체, 전형적으로는 인간 항체의 보존 부위(Fc)의 일부를 적어도 포함한다(Jones 등, Nature, 321:522-525 (1986), Reichmann 등, Nature, 332:323-327 (1988), 및 Presta, Curr. Opin. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)).

비인간 항체를 인간화하는 방법은 종래에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 인간화 항체는 Winter 및 그 동료의 방법(Jones 등, Nature, 321:522-525 (1986), Riechmann 등, Nature, 332:323-327 (1988), Verhoeyen 등, Science, 239:1534-3536 (1988))에 따라, 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 대응하는 인간 항체의 서열에 치환시킴으로써 생성될 수 있다. 또한, 인간화 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있는 방법은 미국특허 제4,816,567호(Cabilly 등), 미국특허 제5,565,332호(Hoogenboom 등), 미국특허 제5,721,367호(Kay 등), 미국특허 제5,832,243호(Deo 등), 미국특허 제5,939,598호(Kucherlapati 등), 미국특허 제6,130,364호(Jakobovits 등), 및 미국특허 제6,180,377호(Morgan 등)에 개시되어 있다.

항체의 투여는 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 항체 운반을 위해 핵산을 사용하는 것도 또한 존재한다. 또한, 상기 항체 및 항체 절편은, 대상 자신의 세포가 상기 핵산을 받아들여 코딩된 항체 또는 항체 절편을 생산 및 분비하도록, 상기 항체 또는 항체 절편을 코딩하는 핵산 조제(예를 들면, DNA 또는 RNA)의 형태로 환자 또는 대상에게 투여될 수 있다. 상기 핵산의 운반은 종래에 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 제제 및 조성물을 포함하는 용기를 개시하고 있다. 구체적으로, 상기 용기는 코 스프레이기, 흡입기, 호흡기, 병, 또는 점막 표면에 투여하기 위한 형태의 상기 조성물을 포함하는 임의의 다른 수단일 수 있다. 선택적으로, 상기 용기는 계기된 양의 상기 조성물을 운반할 수 있다.

하기 실시예는 당업자가 본 명세서에 기재 및 청구한 화합물, 조성물, 물품, 장치, 및/또는 방법이 제조되고 평가되는 완전한 기재 및 기술을 제공하기 위한 것으로, 단지 설명을 하기 위한 의도일 뿐, 본 발명자들이 발명의 범위라고 생각하는 범위를 한정하기 위한 의도는 아니다. 수치(예를 들면, 양, 온도, 등)에 있어서의 정확성을 확인하기 위해 노력하였으나, 몇몇 오기 및 편차가 있을 수도 있다. 별도로 언급하지 않는 한, '부(parts)'는 '중량부'이고, 온도는 섭씨 또는 대기온도이고, 압력은 대기압 또는 거의 대기압이다. 예를 들면, 성분의 농도, 원하는 용매, 용매 혼합물, 온도, 압력 및 상기 기재된 방법으로부터 획득되는 산물의 순도 및 수율을 최적화하기 위해 사용될 수 있는 다른 반응 범위 및 조건과 같은 반응 조건에는 무수히 많은 변화 및 조합이 있다. 이러한 반응 조건을 최적화하기 위해서는 단지 적절하고 일상적인 실험법만이 요구될 것이다.

실시예 1

코 폐렴구균이 운반 도중 후각 조직에 침투함

*재료 및 방법

폐렴구균 균주

본 연구에서는 2가지 캡슐화된 스트렙토코커스 뉴모니애 균주, 즉 혈청형 19F인 EF3030 및 혈청형 4인 TIGR4, 및 혈청형 2인 양친 균주 D39로부터 유래된 비독성, 비캡슐화된 R36A 균주를 사용하였다. Avery 등, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158. 상기 EF3030 균주는 균혈증(bacteremia)이 없는 상태에서도 즉시 기도를 콜로니화하고(Briles 등, (1992) Infect. Immun. 60:111-116), 정맥내 접종시에는 균혈증을 유지할 수 없기 때문에 선택되었다. 상기 TIGR4 균주는 더욱 독성이 크지만, 적절하게 코에 접종되면 균혈증 없이 콜로니화된다.

마우스

CBA/CAHN/xid (xid) 마우스 균주는 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)로부터 입수하였다. 상기 마우스의 브루톤(Bruton's) 티로신 키나제에 돌연변이가 일어나면 흉선(thymus)-비의존적 제Ⅱ형 항원에 반응할 수 없게 되지만(Amsbaugh 등, (1972) J. Exp. Med. 136:931-949; Berning 등, (1980) J. Immunol. 46:506-513), 상대적으로 정상적인 T 세포-의존적 면역 반응은 허용한다. 상기 마우스는 캡슐화된 폴리사카라이드에 대해 반응하지 않으며, 폐렴구균 감염에 대해 반복적으로 감염된다. 상기 xid 마우스는 병원균-부재 조건하에서 유지하였으며, 7-12 주령의 것을 사용하였다.

조직의 수집

혈액은 후안와정맥총(retroorbital plexus)으로부터 헤파린화된 모세혈관 튜브 내로 수집하였다. 코 세척액(NW), 신장, 비장, 및 폐를 수집하기 이전에 70% 에탄올로 마우스를 소독하였다. NW가 혈액에 감염되는 것을 방지하기 위해, 기관(trachea)을 절개하고, 0.075 ㎝의 외경을 갖는 2.0 ㎝ 길이의 티곤(Tygon) 튜브(Cole-Parmer, Vernon Hills, IL)를 링거액으로 충진된 주사기에 연결시킨 채로 비인두에 삽입하였다. 상기 주사기로부터 코를 통해 유체(fluid)를 내보냈고, 3방울을 수집하였다.

비인두와 관련된 림프망(lymphoreticular) 조직(NALT), ON/E, OB 및 뇌의 나머지 부분을 기재된 바에 따라 획득하였다. van Ginkel 등, (2000) J. Immunol. 165:4778-4782; Wu 등, (1997) Scand. J. Immunol. 46:506-513. 해부 현미경을 이용하여 삼차신경절(trigeminal ganglia)을 뇌로부터 주의깊게 도려내었다. ON/E, OB, 삼차신경절, NALT 및 경부 림프절(CLN)를 0.5 ㎖의 링거액으로 각각 균질화하였고, 뇌 및 신장은 각각 1.0 ㎖의 링거액으로 균질화하였다.

다진 조직/혈액/외부 분비물에 존재하는 폐렴구균의 양

멸균된 링거액으로 조직 및 체액에 대한 8번의 순차적인 3배 희석액을 제조한 후, 4 ㎍/㎖의 젠타마이신 설페이트(gentamicin sulfate)를 포함하는 혈액 아가 플레이트에 두었다. 플레이팅 및 양초 항아리에서 배양한 후 24시간째에 CFU를 계산하였다. 그 결과는 기관, NW 또는 1 ㎖의 혈액 당 CFU로 표시하였다.

스트렙토코커스 뉴모니애 균주 EF3030 의 GLS 전배양

GLS 결합 부위를 차단하기 위하여, 3×10⁷ CFU의 스트렙토코커스 뉴모니애 균주 EF3030을 20 ㎍의 인간 뇌 유래 아시알로-GM1 또는 125 ㎍의 소 뇌 유래의 혼합된 GLS(18% GM1, 55% GD1a, 15% GD1b, 10% GT1b, 2% 기타 GLS)(Calbiochem-Novabiochem Corporation, Inc., La Jolla, CA)와 함께 얼음에서 30분간 배양하였다. GLS는 사용하기 하루 전에 PBS에 용해시킨 후 격렬하게 혼합하였다. 양친매성 GLS는 PBS에서 마이셀(micelle)을 형성하여 폐렴구균이 탄수화물 모이어티와 상호작용하도록 하였다. 배양 후, 콧구멍당 5 ㎕를 xid 마우스의 코에 적용하고 추가로 세척하지 않았다. 조직은 4일후 CFU를 분석하였다.

PCR 에 의한 스트렙토코커스 뉴모니애 유전자의 검출

PCR에 의해 스트렙토코커스 뉴모니애를 검출하기 위하여, 조직을 동결-해동에 의해 0.1% 디옥시콜산(deoxycholic acid)을 함유하는 1% SDS에 용해시키고, 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 세틸트리메틸암모늄브로마이드/NaCl 침전 방법을 이용하여 단백질을 제거하였다(Ausubel 등, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, 2nd:2.4.4, 상기 문서는 세틸트리메틸암모늄브로마이드/NaCl 침전 방법을 설명하기 위해 본 명세서에 참조로 포함되어 있음). 10 ㎍의 DNA를 PCR 증폭을 위해 사용하였다. 뉴모라이신(ply)-특이적 프라이머인 Ply1 5'-ATTTCTGTAACAGCTACCAACGA-3'(서열번호 1) 및 Ply2 5'-GAATTCCCTGTCTTTTCAAAGTC-3'(서열번호 2)를 PCR 혼합물에 첨가하여 400 bp 절편을 증폭하였다. 상기 PCR 반응은 94℃에서 5분간의 변성 단계 후 하기 증폭 단계를 포함하였다: 94℃(1분), 55℃(1분), 및 72℃(1분)를 30사이클 수행. 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색된 PCR 절편의 이미지는 Alpha Imager TM IS-3400 상에서 수집하였다(Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA).

PspA 에 특이적인 항체를 이용한 OB 의 면역형광 염색

마우스는 5×10⁵ CFU의 TIGR4 균주로 코에 접종하였다. OB는 10% 완충된 포르말린에서 고정하였다. 4 ㎛의 파라핀 절편(van Ginkel (2000) J. Immunol. 165:4778-4782)은 가습된 챔버내에서 실온에서 4시간동안 배양함으로써 PspA 패밀리 2 항체(1:100)로 염색하였다. 슬라이드를 PBS로 세척하고, 바이오틴화된 염소 F(ab')₂ 항-토끼 IgG(1:200)(Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL)로 염색하고, 스트렙트아비딘(sterptavidin)-FITC(1:100)(BD-PharMingen, San Diego, CA)로 세척 및 염색하였다. 형광 이미지는 DEI-750 CE 디지털 칼라 비디오 카메라(Optronics, Goleta, CA)가 장착된 Nikon 현미경으로 수집하였고, Scion Image 소프트웨어(Scion Corportion, Frederick, MD)로 처리하였다.

통계

데이터는 평균 ± 하나의 표준 에러로 나타내었고, 결과는 짝이없는(unpaired) Mann Whitney 투 샘플 랭크 검사(two sample rank test) 또는 스튜던트 t-검사를 이용한 통계적인 분석에 의해 비교하여 CFU에서의 유의미한 차이를 결정하였다.

결과

코의 콜로니화 및 CNS 침입시의 폐렴구균 캡슐의 역할

1차 감각 후각 신경을 통해 폐렴구균이 침입(up-take) 되는지 조사하기 위하여, EF3030 및 비캡슐화된 균주 R6A가 비도를 콜로니화하고 CNA에 들어가는 능력을 1일 및 4일째에 측정하였다(도 1). 비록 양쪽 균주 모두 1일째에 ON/E에서 높은 CFU가 관찰되었지만, R36A는 4일째에 ON/E 및 다른 조직들에서 전체적으로 없어져서, 연장된 콜로니화를 위해서는 약간의 캡슐이 요구된다는 것을 보여주는 이전의 결과와 일치하였다. Magee 및 Yother (2001) Infect. Immun. 69:3755-3761. EF3030은 1일 및 4일째에 모두 OB 및 뇌에서 분명히 존재하였고, 4일째에 NW 및 NALT에서 높은 수가 존재하였다. 이러한 발견은 코에 도입된 후 EF3030 폐렴구균이 OB 및 뇌의 축삭(axon)에 전달된다는 것과 일치하는 것이다.

코의 콜로니화 및 CNS 침입의 동역학

EF3030은 39일의 관찰기간의 모든 시점에서 ON/E, OB, NW, 및 NALT에서 유지되었다(도 2). 뇌 및 CLN에서는 매우 낮은 수의 CFU가 관찰되었고, 존재하는 CFU는 일반적으로 18일 및 25일째에 발견되었다. 흥미롭게도, 폐는 1일(도 1), 및 18, 25 및 39일째(도 2)를 제외하고는 폐렴구균이 관찰되지 않았다. 사용된 코 투여량에서는 EF3030 균주로 수행한 모든 실험에서 마우스의 혈류내에 어떠한 CFU도 검출되지 않았기 때문에, 균혈증은 신경 조직 분포에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 2). 혈액은 코에 적용한 후 1, 3, 6, 12 및 24시간 및 이후의 일주일동안 매일 균혈증에 대해 모니터하였다. 혈액에서는 어떠한 세균도 검출되지 않았다.

삼차신경절의 스트렙토코커스 뉴모니애 감염

삼차신경 신경은 비인두에 연결되며, 따라서 스트렙토코커스 뉴모니애는 코의 점막에 감염된 후 삼차신경절에 있을 것으로 예측되었다. 이를 검사하기 위하여, 접종후 4일째에 다양한 조직 및 혈액을 단리하였고, 새로운 실험에서 EF3030의 존재에 대해 분석하였다. 상기 EF3030 균주는 ON/E 및 OB 및 삼차신경절에서 검출되었다(표 3). 이러한 발견은 아시알로-GM1이 스트렙토코커스 뉴모니애에 의한 신경 표적을 위한 수용체로 작용한다는 것에 의해 추가로 지지된다. 다른 GLS도 유사한 역할을 한다.

표 3은 코에 운반된 후 다양한 조직에서의 스트렙토코커스 뉴모니애 균주 EF3030의 분포를 보여준다. 조직은 1×10⁷ CFU의 EF3030 균주를 코에 적용한 후 4일째에 단리되었다. 혈액(50 ㎕), ON/E, OB, 및 다진 뇌 조직을 희석한 후, 혈액 아가에 두었다. 삼차신경절을 모으고, 균질화한 후, 상기 배지상에 두었다. 표시된 것은 5마리 마우스의 평균 폐렴구균 CFU ± SE이고, 독립된 3번의 실험을 나타낸다. 뇌 및 혈액에서는 어떠한 폐렴구균도 검출되지 않았다.

조직	평균 CFU (Log10)	SE
뇌	0
후각 구	1.38	0.61
ON/E	4.93	0.42
혈액	0
삼차신경절	2.08	(pooled)

갱글리오사이드가 폐렴구균의 콜로니화를 억제함

코에 도입하기 전에 EF3030 균주를 아시알로-GM1 또는 PBS에 혼합된 GLS 마이셀과 함께 배양하였다. 상기 GLS 혼합물은 코에 도입한 후 4일째에 평가할 때 NW에서 가장 강력한 억제 효과를 나타내었고, CFU를 10배 감소시켰다(P=0.0365). 혼합된 GLS를 전배양한 결과, 가장 크게 CFU가 감소한 것은 ON/E에서 관찰되었다(617배 감소; P=0.0320). 놀라운 것은 폐(P=0.0320)(도 3B) 및 CNS 조직(P=0.0078)(도 3A)에서의 차이점인데, 대조군에서는 각각 평균 204 및 166 CFU가 존재한 반면, GLS로 배양하였을 때는 폐렴구균이 검출되지 않았다(검출 한계=3 CFU). 아시알로-GM1의 전배양은 혼합된 GLS보다는 효과가 적었지만, 여전히 CNS 및 폐에서 각각 25배(도 3A) 및 63배(도 3B) 감소된 콜로니화를 보였다. 폐는 흡입된 폐렴구균에 의해 감염되었으며, 폐에 상대적으로 풍부하게 존재하는 아시알로-GM1에 이들이 부착하는 것은 GLS에 의해 명백하게 억제되었다. 이것은 GLS가 상피 세포에 대한 초기 부착에서 역할을 한다는 것을 가리킨다. GLS의 처리는 폐렴구균의 생존력을 변화시키지는 않았다. 상기 실험중에 혈액에서는 폐렴구균이 검출되지 않았다. 따라서, GLS는 폐렴구균이 비도의 신경-상피에 부착하고 폐 및 CNS를 감염시키기 위한 중요한 표적을 구성한다.

코에 적용된 이후 OB 에서의 스트렙토코커스 뉴모니애의 검출

OB에서의 EF3030의 수는 일반적으로 너무 낮아서 현미경에서 세균을 시각화하기가 어렵다. 코에 적용한 후 OB에서 스트렙토코커스 뉴모니애를 시각화하기 위하여, 좀더 독성이 강한 균주인 TIGR4를 사용하였다. 도입한 지 1, 3, 6, 12 또는 24시간 후 및 이후 매일마다 대표적인 마우스로부터 채취한 혈액 샘플을 검사하였다. 어떠한 세균도 관찰되지 않았다. 시도후 일주일째에 마우스를 희생시켰으며, 조직의 CFU를 분석하였다(도 4A 및 4B). 5×10⁵ 투여량의 TIGR4 CFU만으로도 OB에서 ∼300 CFU가 나타났다(도 3). 상기 폐렴구균은 PspA에 특이적인 항체로 염색함으로써 OB에서 시각화하였다(도 4D-F). 폐렴구균은 도입된 마우서의 OB, 즉 사구체층(glomerular layer)(도 4F) 및 외총상층(external plexiform layer)(도 4E)에서 검출되었다. 폐렴구균은 대조군 마우스의 OB에서는 존재하지 않았다(도 4D).

또한, 상기 TIGR4 균주는 코에 투여된 후 6일째에 NW, ON/E 및 OB 유래의 뉴모라이신 유전자의 PCR 증폭에 의해서도 검출되었다(도 4C). 상기 기간에 채취한 혈류, 또는 감염되지 않은 마우스로부터 분리한 어떠한 샘플에서도 PCR에서 검출가능한 폐렴구균은 존재하지 않았다.

실시예 2

비인두 운반 및 CNA 표적화에 있어서의 폐렴구균 NanA 의 역할

NanA 돌연변이체는 유전적인 배경 및 NanA의 위치 모두에서 차이가 있는 3가지 스트렙토코커스 뉴모니애 균주로부터 생성되었다. EF3030(19F형) 및 D39(2형)는 모두 세포벽과 공유결합으로 부착되어 있는 NanA를 발현하는 반면, TIGR4 균주(4형)는 주위로 분비되는 잘려진 NanA를 발현한다.

콜로니화에 있어서의 NanB의 역할 또한 평가하였다.

세균 균주 및 성장 조건

본 연구에서 사용된 균주가 표 4에 나열되어 있다.

모든 폐렴구균 균주는 10% 글리세롤 내에서 -80℃에서 보관되었으며, 혈액 아가 플레이트에 전달하여 배양하고, 5% CO₂ 공기, 37℃에서 밤새 배양하였다. 폐렴구균 배양물은 0.5% 효모 추출물을 포함하는 Todd-Hewitt 배지에서 OD₆₆₀이 0.5가 될 때까지 자랐고, 10% 멸균 글리세롤이 첨가된 동일한 배양액(broth)에서 당량화한 후 -80℃에서 동결 보존하였다. 항생제 저항성 삽입체를 갖는 돌연변이체는 돌연변이의 안정성을 확인하기 위해 적합한 항생제 첨가하에 성장시켰다.

nanA 돌연변이체의 구축

*각각 양친 균주가 TIGR4, EF3030 및 D39인 NanA 돌연변이체 균주인 JW001, SAM001, 및 JCP001은 삽입 이중(insertion duplication) 돌연변이 기술(Yother 등, (1992) J. Bact. 174:610-618, 상기 문서는 그 내부에 기재된 기술에 대해 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되어 있음)을 통해 유도되었다(표 4). TIGR4 및 EF3030 균주는 이소진 nanA 균주 D39에서 분리된 공여 염색체 DNA의 형질전환(transformatin)을 위해 수용체로 사용되었다(Berry 등, (2000) Infect. Immun. 68:133-140). 각각의 경우, 상기 돌연변이체는 양친 균주와 3차례 역교배(backcross)시켰다. 상기 D39 돌연변이체 또한 D39 양친 균주와 3차례 역교배시켜 본 연구에서 사용된 양친 균주와 이소진인 것을 확인하였다. D39의 돌연변이는 성숙한 단백질의 N-말단 절편의 약 650개 아미노산을 제외한 모두를 결실시키는 삽입 이중 돌연변이에 의해 수행되었다(Berry 등, (2000) Infect. Immun. 68:133-140). TIGR4/nanB 이소진 돌연변이체는 삽입 이중 돌연변이 기술을 이용하여 구축하였다(Balachandran 등, (2002) Infect. Immun. 70:2536-2534; Yother 등, (1992) J. Bact. 174:610-618). 461 bp의 nanB 내부 영역을 프라이머를 사용하여 증폭시켰다: nanBF 및 nanBR(표 1), PCR은 Taq PCR Mastermix (Invitrogen)을 사용하여 95℃에서 1분, 45℃에서 1분, 72℃에서 1분간 30사이클을 수행하였다. 상기 절편은 pSF152로 클로닝되었다. TIGR5 균주를 상기 플라스미드 DNA로 형질전환시키는 것은 이전과 같았다(Balachandran 등, (2002) Infect. Immun. 70:2526-2534). nanA/nanB- TIGR4 이중 돌연변이체는 JW001 균주로부터 분리된 염색체 DNA를 nanB/TIGR4 돌연변이체에 형질전환시킴으로써 유도되었다.

마우스 독성 분석

6-12 주령의 암컷 CBA/CaHN-XID/J (CBA/N) 마우스는 Jackson Laboratory (Bar Harbor, MA)에서 입수하였다. 상기 마우스의 브루톤 티로신 키나제 유전자에 돌연변이가 일어나면 흉선-비의존적 제Ⅱ형 항원에 반응할 수 없게 되지만, 상대적으로 정상적인 T 세포-의존적 면역 반응은 허용된다(Amsbaugh 등, 1972, J. Exp. Med. 136:931-949; Briles 등, 1986, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 124:103-120; Potter 등, 1999, Int. Immunol. 11:1059-64; Wicker 및 Scher, 1986, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 124). 상기 마우스는 캡슐화된 폴리사카라이드에 대해 반응하지 않으며, 폐렴구균 감염에 대해 반복적으로 감염된다(Briles 등, 1986, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 124:103-120; Briels 등, 1981, J. Exp. Med. 153:694-705). 상기 x-연관된 면역결핍(xid) 마우스는 병원균-부재 조건하에서 유지하였으며, 7-12주령의 것을 사용하였다. 알려진 농도의 살아있는 세포를 포함하는 동결 감염 스톡(stock)을 젖산화된 링거요액에 희석하였다. 이후, 마우스는 공지된 바대로 10 ㎕의 부피에서 대략 5×10⁵∼1×10⁶ 세포로 코내에(intranasally, I.N.) 감염시켰다(Wu 등, 1997b, Microb. Pathog. 23:127-137).

조직의 수집

모든 마우스는 코의 세척 및 조직의 수집을 수행하기 이전에 안락사시켰다. 혈액은 후안와정맥으로부터 헤파린화된 모세혈관 튜브 내로 수집하였다. 코 세척액(NW), 코 조직(후각 상피(NT), 후각 구(OB)) 및 뇌를 수집하기 이전에 70% 에탄올로 마우스를 소독하였다. 이러한 유체 및 조직은 상기에 기재된 바대로 획득하였다. NW이 혈액에 감염되는 것을 방지하기 위해, 기관(trachea)을 절개하고, 0.075 ㎝의 외경을 갖는 2.0 ㎝ 길이의 티곤 튜브(Cole-Parmer)를 링거액으로 충진된 주사기에 연결된 채로 비인두에 삽입하였다. 상기 주사기로부터 코를 통해 유체를 내보냈고, 3방울을 수집하였다. 상기 ON/E 및 OB는 0.5 ㎖의 링거액으로 각각 균질화하였고, 뇌의 나머지 부분은 1.0 ㎖의 링거액으로 균질화하였다.

살아있는 폐렴구균의 정량화

멸균된 링거액으로 조직 및 체액에 대한 8번의 순차적인 3배 희석액을 제조한 후, 4 ㎍/㎖의 젠타마이신 설페이트를 포함하는 혈액 아가 플레이트에 두었다. 플레이팅 및 양초 항아리에서 37℃에서 배양한 후 24시간째에 콜로니 형성 단위(CFU)를 계산하였다. 뉴라미니다제 활성에 사용되는 분석법은 종래에 개시되어 있다(Lock 등, 1988, Microb. Pathog. 4:33-43, 상기 문서는 분석 방법에 대해 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되어 있음).

결과의 유의성은 야생형 폐렴구균 및 돌연변이 폐렴구균 간을 비교한 투 샘플 Mann Whitney 랭크 검사를 사용한 분석에 의해 평가하였다.

시험관내 연구

TIGR4, 및 그의 nanA 및 nanB 돌연변이체가 특정한 갱글리오사이드에 결합하는 능력을 측정한다. 사용된 갱글리오사이드는 혼합된 갱글리오사이드, 아시알로-GM1, GM1, GD1a, GD1b, GT1 (Calbiochem) 및 GM3 갱글리오사이드(Sigma)를 포함한다. 상기 GM3 갱글리오사이드는 폐렴구균의 결합에 관여하는 말단 또는 내부 GalNAcβ1-4Gal 서열이 결여되어 있으며, 음성 대조군으로 사용된다. 이들 혼합된, 모노-, 디-, 트리-시알산을 포함하는 갱글리오사이드는 즉시 ELISA 플레이트에 결합한다. TIGR4 균주를 단기간 배양한 초기 데이터는 폐렴구균이 아시알로-GM1이코팅된 플레이트에는 결합하지만, BSA, GM-3, 또는 GM1이 코팅된 플레이트에는 결합하지 않음을 가리킨다. 갱글리오사이드가 코팅된 플레이트를 사용하여 야생형 TIGR4 균주, 상기 TIGR4 균주의 안정적인 불투명 또는 투명 파지 변이체, nanA, nanB, 및 nanA/nanB 돌연변이체 균주가 상기 플레이트에 부착하는 능력을 비교한다. 상기 분석에는 갱글리오사이드가 코팅된 플레이트에 단기간 배양(1시간) 및 연장 배양(24시간)한 것을 포함한다. 부착된 폐렴구균은 0.5% 효모 추출물을 포함하는 Todd Hewitt 배지에서 짧게 배양(10-15분)함으로써 갱글리오사이드 플레이트로부터 제거하며, 반복적인 피펫팅(pipetting) 후 떼어낸 세균을 혈액 아가 플레이트에 둔다. 다른 한편으로, 0.5% 효모 추출물을 포함하는 41℃ Todd Hewitt 배지 아가를 상기 부착된 폐렴구균의 상부에 부어주고, 플레이트의 바닥을 통해 콜로니를 계수한다. 대조군으로는 폐렴구균이 없는 플레이트와, 폐렴구균은 있지만 갱글리오사이드가 없는 플레이트를 사용한다.

갱글리오사이드 결합 검사를 한 후, 뒤이어 다른 세포주들이 폐렴구균을 그 세포 표면에 부착시키고 내재화(internalize)하는 능력이 있는지 여부를 검사한다. 상기 연구는 래트 신경 크롬친화성세포종(pheochromocytoma) 세포주 PC12 (ATCC) 및 대식세포 세포주 P388D1에 초점을 맞춘다. 상기 두 세포주는 이들의 독특한 특성때문에 선택된다. 상기 P388D1 세포주는 마이크로글리아(microglia)에 존재한다고 알려져 있는 고 친화성 PAF-R을 발현한다(Valone (1988) J. Immunol. 140:2389-2394). 상기 PC12 세포주는 검출가능한 PAF-R을 발현하지 않는다. Brewer 등, (2002) J. NeuroChem 82:1502-1511. 10²-10⁵ 사이의 폐렴구균 CFU를 6웰 또는 24웰 세포 배양 플레이트에서 자라고 있는 상기 세포주들에 첨가하고 37℃에서 15분 내지 6시간동안 배양한 후, 세포를 격렬하게 세척하고 부착된 폐렴구균을 분석한다. 세포내로 내재화된 것을 결정하기 위하여, 페니실린 및 젠타마이신으로 2시간 세척한 후, 세포를 혈액 아가 위에 두거나 또는 0.5% 효모 추출물을 포함하는 Todd Hewitt 배지 아가에 41℃에서 도말한다. 사용된 상기 두 세포주는 정상적으로 CNS에서 관찰되는 RAF-R의 생체내 발현을 반영한다. 활성화된 마이크로글리아는 P388D1 세포주에서처럼 상기 수용체를 풍부하게 발현하는 반면, 상기 PAF-R 수용체는 PC12 세포주와 같은 신경세포에는 존재하지 않거나, 또는 분리된 신경 서브집단(subpopulation)에 의해 단지 매우 낮은 수준만이 발현된다. Mori 등, (1996) J. Neurosci 16:3590-3600; Bennett 등, (1988) Cell Dath Differ. 5:867-875. 폐렴구균이 양쪽 세포주에 부착하게 된다면 상기 PAF-R이 부착에 필수적인 것이 아니며, 또 다른 수용체가 존재한다는 것을 의미한다. 상기 TIGR4의 불투명 또는 투명 변이체 및 nanA-, nanB- 돌연변이체 및 nanA/nanB 이중 돌연변이체들도 야생형 TIGR4 균주에서 관찰되는 것에 대한 상대적인 부착 정도를 검사한다. 폐렴구균의 부착에 PAF-R과 갱글리오사이드가 하는 역할을 추가로 분석하기 위하여, PAF-R이 없는 COS-7 세포주(Gerard 및 Gerard (1994) J. Immunol. 152:793-800; Honda 등, (1992) J. Lipid Med. 5:105-107)를 종래에 보고된 바와 같이 pcDNA3.1/GS 플라스미드(Brewer 등, (2002) J. Neuro Chem 82:1502-1511, 상기 문서는 그 내부에 기재된 기술에 대해 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되어 있음) 및 Transfast 시약(Promega)을 사용하여 1,029 bp의 인간 PAFR 열린해독틀(open reading frame)로 전달감염시킨다. 상기 플라스미드 자체는 대조군으로 사용하고, 폐렴구균의 부착에 영향을 미치는 파라미터(parameter)는 PAF-R의 존재 또는 부재하에서 분석된다. 상기 실험은 부착에 있어서의 PAF-R의 중요성에 대한 명확한 데이터를 제공한다. PAF-R 결핍 세포주에 대한 부착은 모두 갱글리오사이드에 의해 매개되며, 갱글리오사이드를 전배양함으로써 블록(block)된다. 폐렴구균이 상피세포에 부착 및 침투하는 능력을 추가로 조사하기 위하여, 디트로이트 562 인간 인두 상피 세포주(ATCC) 및 A549 인간 폐 상피 세포주(ATCC)을 트랜스웰(transwell) 시스템을 사용하여 도입한다. Millicell®-RCF 배양(Millipore, Billerica, Mass) 플레이트 삽입체가 상기 상피 세포주를 가득(confluency) 자라게 하도록 사용된다. 가득 자란 것은 Millipore Millicell® 전기 저항 시스템을 이용하여 투명상피 저항(transepithelial resistance)을 측정함으로써 결정된다. 500 Ω/㎠ 이상의 저항은 완전히 가득찬 상피세포 단일층이 얻어졌음을 나타낸다. 상기 세포를 폐렴구균에 노출시켜 이들이 상기 상피세포층에 부착 및 침투하는 능력이 있는지를 검사한다. 부착과 내재화를 구분하기 위하여, 상기 상피 세포를 세척하고 페니실린 및 젠타마이신을 포함하는 배지에서 2시간 배양한다. 처음의 관심은 TIGR4 균주, 그의 nanA 및 nanB 돌연변이체, 및 이중 돌연변이체에 있다. TIGR4 균주의 안정적인 투명 및 불투명 변이체들은 생체내에 도입시 되돌아가지 않는 안정적인 변이체가 얻어질 때까지 순차적으로 계대함으로써 생성된다. 상기 TIGR4 변이체들은 상피 세포에 부착, 침투 및 횡단하는 능력을 비교한다. 웰들은 각 웰당 EMEM 배지에서 10³-10⁶ CFU로 부하된다. 0.5, 1, 2, 4, 8, 및 24시간 배양한 것을 상기 상피세포층 위 및 아래 모두 수확하고 CFU를 분석한다. 단일층과 연관된 폐렴구균 CFU를 결정하기 위하여, 세포를 도말하기 전에 0.5% 효모 추출물 및 41℃로 식힌 0.5% 아가가 보충된 Todd-Hewitt 배지로 세포층을 5-6회 세척한다. 상기 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 하에서 밤새 배양하고, 이후 CFU를 계수한다. 세포주를 PAF-R의 발현에 대해 분석한다. 2가지 프라이머인 PAF-1(5'-CCGATACACTCTCTTCCCGA-3', (서열번호 3), 뉴클레오타이드 151 내지 170) 및 PAF-2(5'-ACAGTTGGTGCTAAGGAGGC-3', (서열번호 4), 뉴클레오타이드 970-951)를 이용한 RT-PCR로 상기 세포주로부터 유래된 총 RNA를 분석하여, 838 bp의 PCR 산물을 얻는다(Stengel 등, (1997) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17:954-962, 상기 문서는 그 내부에 기재된 기술에 대해 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되어 있음). 만일 PAF 수용체가 존재한다면, 옥틸로니움 브로마이드(octylonium bromide)(Biomol Research Laboratories, Inc. Plymouth meeting, PA) 또는 PAF (Biomol)와 같은 PAF 수용체 억제제를 배지에 첨가하여 PAF-Rdl 상피에 대한 부착 및 침투에 기여하는 바를 결정한다. 다른 한편으로, 상기에서 언급한 COS7 세포를 이러한 목적으로 사용하여, PAF-R의 존재 또는 부재하에서 폐렴구균의 부착을 비교한다.

다른 폐렴구균 균주의 침입성 정도는 상기 Transwell 시스템의 상부(apical) 및 가측부(basolateral) 구획(compartment) 모두에서 염증성 사이토카인의 생산과 관련되어 있다. 배양 상등액(supernatant)을 상부 및 하부 구획 모두에서 다양한 시점에서 수집하고 ELISA (BD PharMingen) 분석하여 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 및 TNF-α의 농도를 결정한다. 상기 상피 단일층은 아세틱 알콜(acetic alcohol)로 고정하고, 이전에 폐렴구균 OB의 시각화를 위해 사용된 PspA-특이적 면역형광 염색을 사용하여 폐렴구균의 세포내 존재를 분석한다. 형광 이미지는 이전에 기재된 바와 같이 적절한 필터 큐브가 장착된 Leica/Leitz DMRB 현미경(Chromtechnology, Battleboro, VT)을 사용하여 시각화한다(Martin 등, (1998) J. Immunol. 160:3748-3758, 상기 문서는 그 내부에 기재된 기술에 대해 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되어 있음). 이미지를 C5810 디지털 칼라 카메라(Mamamatsu Photonic System)로 수집하고, Adobe 포토샵 및 IP LAB 스펙트럼 소프트웨어로 처리한다.

결과

NanA 및 NanB 돌연변이체의 콜로니화

코내(i.n.) 감염된 마우스의 코 세척액에서 단리된 폐렴구균 세포의 수와 NanA 돌연변이 균주로 감염된 세포의 수를 비교함으로써, 스트렙토코커스 뉴모니애가 CBA/N 마우스의 비인두를 콜로니화하는 능력에 NanA 돌연변이가 미치는 영향을 분석하였다. 3가지 다른 폐렴구균 균주가 포함되며, 따라서 조사되는 NanA 돌연변이가 캡슐의 혈청형 및 유전자 배경이 다른 균주에 미치는 효과를 확인하였다. TIGR4/NanA-(JW001), EF3030/NanA-(SAM001) 및 D39/NanA-는 각각 캡슐 4형, 19F형 및 2형이다(표 4). 캡슐 4형 임상 분리주인 TIGR4의 경우, LPETG(서열번호 13) 모티프을 코딩하는 서열 이전에 정지코돈이 존재한다. 상기 모티프가 없으므로, NanA는 TIGR4에 의해 주위로 분비되는 것으로 예상된다. 현재 가용한 다른 4가지 폐렴구균인 G54(19F형), R6(2형), Spanish 23F 및 670(6B형)(Berry 등, Gene 71:299-305; Hoskins 등, 2001 J. Bacteriol 183:5709-17; Tettelin 등, 2001 Science 293:498-506)의 NanA 서열을 조사한 결과, 이들은 세포벽에 공유결합으로 부착하기 위한 LPXTG(서열번호 14) 모티프를 갖고 있었다(도 5). 따라서, 여기에 포함된 균주들은 NanA가 분비되는 균주와 표면에 결합된 균주의 돌연변이에 대한 비교를 제공한다.

TIGR4 및 EF3030 NanA 돌연변이체 모두에서 콜로니화의 급격한 감소가 관찰되었다(도 6 및 도 7).

스트렙토코커스 뉴모니애는 다른 뉴라미니다제인 NanB를 발현한다. 유사한 정도의 동질성이 NanA과 NanB 간에 공유된다. NanB는 NanA와 43% 동질성(24% 동일함)을 공유한다. 상기 단백질들간의 공유된 잔기들은 이들이 시알리다제(sialidase)라는 것을 제시한다(Berry 등, 1996 J. Bacteriol. 178:4854-4860). NanB는 최적 pH가 4.5인 것으로 알려져 있는데, 이는 NanA의 최적 pH인 6.5 내지 7과 비교된다. 최적 pH에서, NanB는 NanA의 최적 pH에서 보다 시알리다제 활성이 약 1/100 이다. 그럴지라도, 콜로니화 및 CNS에 직접 침입하는데 NanB가 요구되는지 확인하기 위하여, TIGR4의 유전자 배경에서 NanB가 결핍된 돌연변이체인 TIGR4/NanB- 균주(JW002) 뿐만 아니라 NanA 및 NanB 발현 모두 결핍된 TIGR4/NanAB- 균주(JW003)를 구축하였다. JW002로 마우스를 감염시키면 TIGR4 균주와 거의 동일한 정도로 콜로니화 되었다(도 8). 아울러, NanA 돌연변이체와 비교할 때 이중 돌연변이체(JW003)에서는 유의한 정도의 콜로니화 감소도 일어나지 않았다(도 9)

CNS 내로 폐렴구균의 도입

스트렙토코커스 뉴모니애가 코 조직(후각 신경을 포함)으로 이동하는 자취를 조사하기 위하여, 후각 구 및 뇌의 나머지 부분에 스트렙토코커스 뉴모니애가 존재하는지를 검사하였다. NanA 돌연변이체는 유전적 배경에도 불구하고 코 조직 및 후각 구에서 야생형 균주에 비해 유의미한 정도로 수가 감소된 것이 발견되었다. 희생시키는 시점에서 모든 마우스를 채혈하였으며, 혈액에서는 어느 것도 검출가능한 폐렴구균이 나타나지 않았는데(<12 CFU/㎖ 혈액), 이것은 폐렴구균이 비강으로부터 직접 CNS 조직으로 이동한다는 것을 가리킨다. 상기 NanB 돌연변이체는 폐렴구균이 코 조직 또는 후각 구에 들어가는데 영향을 미치지 않았다(도 8).

NanA 돌연변이체는 콜로니화 되는 능력이 분명히 약화되고, 비인두 및 CNS에서 존속한다. 이것은 캡슐의 혈청형 및 NanA의 표면 부착이 모두 다른 균주에서 관찰되었다. 비록 NanA는 세균의 세포 표면과 숙주 사이의 관계에 영향을 미치는 많은 표면 구조체 중 하나이지만, 이것은 코의 운반뿐만 아니라 폐렴구균이 CNS로 표적화되는데 있어 필수적으로 관여한다. NanA를 손상시키면 콜로니화 및 CNS에 대한 표적화가 유의미하게 감소되었다. 이러한 결과는 TIGR4 및 EF330 모두에서 관찰되었다.

균주 EF3030(19F형)은 한달 이상 높은 효율로 비인두를 콜로니화시킨다. 그러나, EF3030이 존속하는 능력에도 불구하고, NanA가 돌연변이되면 코에서 발견되는 폐렴구균 세포의 수가 유의미하게 감소되었다. 약화(attenuation)는 TIGR4/NanA- 균주에서 훨씬 더 극적으로 나타났는데, 여기서는 코 세척액에서 단리된 세포의 수가 14일 후에 검출한계에 가깝게 떨어졌다.

자연 상태에서는 폐렴구균이 다른 세균 종들과 공존한다. 따라서, NanA의 다른 기능은 숙주 단백질의 기능을 변경시켜 오랜 기간의 안정된 운반에 기여하는 것을 포함할 수 있다. 또한, NanA는 폐렴구균이 N. 메닝기티디스(meningitidis) 및 H. 인플루엔자(influenzae)를 포함하는 다른 미생물과 경쟁하는 능력을 향상시키거나, 또는 숙주의 당단백질을 탄소원으로 이용하도록 할 수 있다.

비록 본 연구의 주된 결과는 NanA의 발현이 마우스에서의 최적의 운반에 필요하다는 것을 보여주는 것이지만, 상기 데이터는 또한 NanA가 없는 폐렴구균이 후각 구에서 훨씬 낮은 수가 발견된다는 것을 보여주었다. 현 시점에서는 활성형 NanA가 CNS 조직에서 스트렙토코커스 뉴모니애가 생존하는데 중요한지 여부를 아는 것이 어렵다. 상기 조직에서 회수된 NanA 돌연변이체의 수가 양친 균주보다 훨씬 적지만, 이들이 신경 조직에서 존재한다는 사실 자체는 폐렴구균이 일단 뇌로 들어간 후 NanA가 추가적인 독성 효과가 있음을 나타낸다. OB에서 뉴라미니다제-돌연변이 수가 떨어진 것은 바로 운반이 감소된 결과인 것으로 보인다. 상기 발견은, 운반이 더 침입적인 질병의 전제조건이고, NanA로 면역화시키는 것과 같이 운반을 감소시킬 수 있도록 간섭하는 것은, 폐렴, 뇌수막염, 중이염 및 패혈증에 대한 방어효과를 제공할 것이라는 원칙을 강조하게 한다.

nanA의 공지된 서열 중에서, TIGR 서열이 표면의 앵커(anchor)를 포함하고 있지 않는 유일한 것이다. 상기 균주에서, 프레임이 시프트(shift)되면 상기 분자가 LPETG(서열번호 13) 모티프 앞에서 절단되게 된다(Tettelin 등, 2001 Science 293:498-506). 대부분의 균주에서, NanA의 상당한 부분이 소르타제(sortase)에 의해 세포벽에 공유결합으로 부착되어 있는 것으로 예상되며(Mazmanian 등, 1999 Science 285:760-63), 이는 전자 현미경에서 관찰되어 왔다(Camara 등, Infect. Immun. 62:3688-95). 본 연구에서는, TIGR4 뿐만 아니라 EF3030도 NanA 의존적인 운반 및 후각 구에서의 존재를 나타내었다. 상등액 또는 세균 펠렛(pellet)에서의 NanA 활성의 위치 연구로부터, EF3030의 NanA 활성은 TIGR4와 달리 세포와 연관되어 있음이 나타났다. 따라서, NanA는 표면에 결합되어 있든지 또는 분비되든지 상관없이 콜로니화를 촉진할 수 있다.

실시예 3

스트렙토코커스 뉴모니애 발병( pathogenesis )에서의 갱글리오사이드의 역할

정제된 뉴라미니다제 NanA(Calbiochem)는 ON/E를 단리하기 15, 30 및 60분 전에 10 ㎕ PBS에 1, 10 및 50 ㎍로 코에 투여된다. 상기 조직은 4% 파라포름알데히드에서 고정되고, 파라핀 절편을 만든다. GM1은 바이오틴화된 CT-B 및 이후 스트렙트아비딘-FITC를 이용하여 염색하고, 염색 강도를 분석한다. 또한, 절편은 로다민(rodamine)과 결합된 아시알로-GM1에 특이적인 항체로 염색하여, 상기 조직에서 GM1 염색의 감소와 아시알로-GM1 염색의 증가가 부합된다는 것을 확인한다. 동일한 처리를 수행한 마우스 군에 대해 1일 및 4일째에 스트렙토코커스 뉴모니애 균주 TIGR4 및 EF3030에 의해 콜로니화되는 것을 분석하여, 뉴라미니다제 처리가 코 콜로니화를 증가시키게 된다는 것을 확인한다. 마우스는 높은 투여량의 EF3030 균주(1×10⁸ CFU)를 코에 주고, ON/E는 하기 간격으로 단리한다: 코에 시도한 후 1, 3, 6, 및 12시간, 1일 및 4일. 상기 ON/E는 상기에서 약술한 바대로 염색하고, GM1 및 아시알로-GM1 발현에 대해 분석한다. 만일 코 조직에서 감소된 GM1 및 증가된 아시알로-GM1 발현이 관찰된다면, NanA 및 NanB가 결핍된 균주들도 이들이 비도에서의 GM1 발현을 변경시키지 않을 것으로 예상되기 때문에 함께 검사한다. 시알산 잔기를 제거하면 서브말단 디사카라이드인 β-D-갈락토피라노실-(1-3)N-아세틸-D-갈락토사민이 노출되는데, 이것은 Thompson-Friedenreich 항원의 면역우성 군을 나타내며, PNA가 강한 친화력을 갖는다. 따라서, 상기 ON/E에서 PNA-결합 부위가 변화된 것은 뉴라미니다제 활성을 측정하는 다른 방법이다. 상기 조직으로부터 만든 동결된 절편은 즉시 PNA-FITC 또는 PNA-HRP (Medac, Hamburg, Germany)로 염색하고 현미경으로 관찰하여 PNA-결합 부위의 증가가 일어났는지 여부를 결정한다(Black 등, (2000) Pediatr. Infect. Dis J. 19:187-195; Klein 등, (1978) Klin. Wochenschr. 56:761-765, 상기 문서는 그 내부에 기재된 방법에 대해 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되어 있음).

상기 GM1 부위는 TIGR4 또는 EF3030 균주를 코에 투여하기 전에 특이적으로 블록된다. 이것은 1) CT-B에 대해 오브알부민(ovalbumin)과 같은 비-갱글리오사이드 대조군 단백질, 2) GM1에 대한 항체(Calbiochem)에 대해 정상 토끼 면역글로불린, 또는 3) UAB 단백질 분석 및 펩타이드 합성 핵심 설비에서 합성된 GM1-특이적 펩타이드를 사용함으로써 3가지 방법으로 접근된다. CT-B 및 아마도 GM1에 대한 항체는 동시에 염증을 일으킬 것으로 예상되기 때문에, GM1에 특이적인 펩타이드로 억제하는 것이 가장 좋은 접근법이다. 상기 실험에서, ON/E 및 OB는 폐렴구균 CFU를 적용한 후 1일 및 4일째에 분석된다. GM1을 블록시키는 다른 접근법은 GM1-결합 펩타이드를 선별하는 파지 디스플레이 펜타데카펩타이드(pentadecapeptide) 라이브러리를 사용하여 발견된 GM1-결합 펩타이드를 사용하는 것이다. 상기 GM1-결합 펩타이드인 VWRLLAPPFSNRLLP(서열번호 5)는 GM1에 대한 강한 친화도(10¹⁰ M^-1) 및 1.0 μM의 IC₅₀을 갖는다. Matsubura 등, (1999) FEBS Letters 456:253-256. 동일한 길이와 동일한 아미노산으로 구성된 임의로 선택된 서열을 갖는 펩타이드가 대조군으로 사용된다. 양쪽 펩타이드의 GM1-결합 활성은 생체내에서 사용되기 전에 ELISA에 의해 확인된다. 먼저, 3×10⁶ CFU의 EF3030 균주를 적용하기 10분전에 100 ㎍의 상기 2가지 펩타이드를 10 ㎕ 링거액 또는 PBS에서 코로 투여한다. 상기 ON/E는 적용 후 1일 및 4일째에 처리되지 않은 CBA/N 마우스에 대한 CFU의 수를 분석한다.

블록킹 실험은 PAF (Biomol Research Laboratories, Inc. Plymouth meeting, PA) 및 PAF-R 길항제인 옥틸로니움 브로마이드(octylonium bromide)(Biomol)로 수행된다. 상기 화합물은 PAF-R에 높은 친화도로 결합한다. 각각의 갱글리오사이드는 개별적으로 검사된다. 혼합된 갱글리오사이드 외에도, 아시알로-GM1, GM1, GD1a, GD1b, GT1 (Calbiochem) 및 GM3 (Sigma)가 시도 후 1일 및 4일째에 평가된 것과 같이 코 콜로니화를 억제하는 능력에 대해 검사된다. 다양한 갱글리오사이드가 상기 과정을 블록할 수 있다. 상기 GM3 갱글리오사이드는 공지된 C-폴리사카라이드 결합 모티프가 결여되어 있기 때문에 음성 대조군으로 작용한다. 갱글리오사이드 배양 후 EF3030의 콜로니화시에 제공된 데이터에 기초하면, 혼합된 갱글리오사이드는 콜로니화를 블록함에 있어서 아시알로-GM1보다 더 효과적이다. 이것은 비도, 폐 및 뇌의 폐렴구균 콜로니화 진행에 아시알로-GM1 이외의 다른 갱글리오사이드가 관여하고 있음을 나타낸다. 상기 갱글리오사이드 억제 연구는 TIGR4 균주 및 그의 뉴라미니다제 돌연변이체에 초점이 맞춰져 있다. 갱글리오사이드가 코팅된 ELISA 플레이트에 TIGR4 균주를 단기간 시험관내 배양하면 TIGR4 균주가 아시알로-GM1에 부착하는 것으로 나타났다. 장독소(enterotoxin)은 비도에서의 폐렴구균-갱글리오사이드 상호작용을 다르게 블록킹하는 또다른 수단을 제공한다. CT 및 LTh-1은 모두 세로그룹(serogroup) I 열-민감성 장독소이며(Pickett 등, (1986) J. Bacteriol 165: 348-352), 약간 다르긴 하지만 유사한 갱글리오사이드 결합 특성을 나타낸다. Fukuta 등, (1988) Infect Immun. 56:1748-1753. CT (List Biological Laboratories, Inc., Campbell, CA)는 GM1에 결합하며, GD1b에는 약간 약하게 결합한다. LTh-1은 GM1 및 GD1b에 선택적으로 결합하며, GM2 및 아시알로-GM1에는 약하게 결합한다. Fukuta 등, (1988) Infect Immun. 56:1748-1753. 만일, GM1이 스트렙토코커스 뉴모니애와 상호작용하는 주된 갱글리오사이드라면, LTh-1의 사용은 GM1 갱글리오사이드를 블록할 뿐만 아니라, 뉴라미니다제 활성에 요구되지 않는 자연적인 낮은 빈도의 결합 부위를 나타내는 아시알로-GM1도 블록할 수 있다. 세로그룹 Ⅱ 유래의 열-민감성 장독소, 특히 열-민감성 장독소 LT-Ⅱb는 다른 갱글리오사이드 결합 특성을 나타낸다. 상기 독소는 GD1a에 결합하고, GT1b에는 약간 약하게 결합하며, GM1에는 친화성을 보이지 않는다. Fukuta 등, (1988) Infect Immun. 56:1748-1753. 상기 LT-Ⅱa는 높은 친화성으로 GD1b에 결합하며, GM1, GT1b, GQ1b, GD2, GD1a, 및 GM2에는 낮은 친화성으로 결합한다. Fukuta 등, (1988) Infect Immun. 56:1748-1753. 상기 LT-Ⅱ 독소는 T.D. Connell 박사로부터 친절하게 제공되었다. 폐렴구균의 ON/E 부착이 억제되는 것을 관찰하기 위한 코 투여량 및 최적 시간 간격을 최적화하기 위하여, 스트렙토코커스 뉴모니애의 코 적용 동안에 선택된 장독소에 대해 투여량 반응 연구(1.0 또는 10 ㎍)가 먼저 수행된다. 4일째에 코 콜로니화의 억제가 관찰되면, 상기 관찰은 장독소가 이틀마다 주어지는 11일째까지 연장된다. CBA/N 마우스의 ON/E 및 OB에서의 CFU가 측정된다.

실시예 4

폐렴구균 발병에서의 C- 폴리사카라이드 특이적인 항체의 역할

테이코산으로도 알려져 있는 폐렴구균 C-폴리사카라이드는 리포테이코산으로도 알려져 있는 폐렴구균 F-항원과 구조적으로 동일하다. Fischer 등, (1993) Eur. J. Biochem 215:851-857. 이것은 그람-양성 세균 중에서 스트렙토코커스 뉴모니애의 독특한 특성이다. 상기 분자들의 면역우성 결정체는 포스포릴콜린(PC) 잔기이며, PC에 대한 항체는 복강내 또는 코의 폐렴구균 시도에 대해 방어한다. Briles 등, (1984) Eur J. Immunol. 14:1027-1030; Briles 등, (1981) Nature 294:88-90; Yother 등, (1982) Infect. Immun. 36:184-188; Briles 등, (1984) J. Mol. Cell. Immunol. 1:305-309. 따라서, 수동적인 전달 또는 능동적인 코의 면역화에 의해 얻어진 것 중 어느 하나의 PC-특이적 항체의 역할이 조사된다. 방어적인 PC-특이적인 항체의 수동적인 전달을 위해서는, IgG3(59.6C5) 및 IgM(22.1A4) 이소타입 양쪽의 T5 이디오타입(idiotypic) 단일클론 항체(mAb)가 사용된다. Briles 등, (1981) Nature 294:88-90. T15 이디오타입은 마우스에서의 폐렴구균 감염에 대해 M603 또는 M511 이디오타입보다 더 방어적인 것으로 나타났는데(Briles등, (1984) Eur. J. Immunol. 14:1027-1030), C-폴리사카라이드에 더 효과적으로 결합하기 때문인 것으로 추측된다. 수동적인 Ab 전달은 T5 항체(100 ㎍)를 코에 적용시킨 폐렴구균에 직접 적용하는 것을 포함하며, 코 콜로니화를 감소시키는데 있어서 정맥내 또는 복강내 투여와 비교한다. 콜로니화는 시간에 걸쳐 관찰되며(4, 11, 18일째), 본 실험에서 다른 군 간에 유의한 차이가 관찰되지 않으면, mAb (20 ㎍)가 이틀마다 코에 적용된다. CBA/N 마우스는 T15 이디오타입 항-PC Ab를 생산하지 않는다. 항-PC 특이적 Ab의 수동적인 전달은 비도에서 점막 IgA 또는 PC-특이적 Ab의 다른 이소타입을 유도하는 것으로 예상되지 않는다. 코 Ab를 유도하기 위하여, 2가지 다른 접근방법이 수행된다. 하나는 프로테아제가 처리된 R36A 균주를 직접 코에 적용하는 것이며, 이것은 C-폴리사카라이드에 대한 Ab 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 비록 항-PC 항체의 방어적인 면역이 연구되어 왔지만, 비도와 같은 점막 표면에서의 이들의 역할에 대한 데이터는 입수할 수 없다. 상기 CBA/N 마우스의 X-염색체-연관성 면역결핍은 T15-이디오타입의 항-PC Ab의 생성을 불가능하게 한다. 이러한 불가능의 중요성을 결정하기 위하여, CBA/N 마우스는 그 대응하는 야생형 마우스인 CBA/J 마우스(Jackson Laboratories)와 비교된다. 항-PC Ab를 유도하기 위해 R36A 균주를 면역화하는 것은 표면 단백질을 단백질 절단으로 제거하는 것을 포함한다. Krause (1970) Adv. Immunol. 12:1-56. 코 면역화를 위한 다른 접근법은 이전에 기재된 바와 같이 PC와 단백질 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH)을 커플링시키는 것이다(Krause (1970) Adv. Immunol 12:1-56; Chesebro 및 Metzger (1971) Biochemistry 11:766-771, 상기 문서는 그 내부에 기재된 방법에 대해 본 명세서에 참조로 포함되어 있음). PC-KLH로 코 면역화시키는 것은 점막 면역 반응을 최적화시키기 위해 점막 보조제인 CT와 함께 수행된다. 상기 마우스는 CT가 콜로니화에 영향을 미치는 것을 방지하기 위하여 마지막 면역화한지 2-3주 후에 시도된다. 3번의 코 면역화가 1주일 간격으로 수행된다. 혈청 Ab 역가는 당업자에 의해 일상적으로 수행되는 바와 같이 C-폴리사카라이드 및 PC-특이적 ELISA를 이용하여 관찰된다. PC-특이적 ELISA를 위하여, PC는 이전에 기재된 바와 같이 BSA와 커플된다(Chesebro 및 Metzger (1972) Biochemistry 11:766-771, 상기 문서는 그 내부에 기재된 방법에 대해 본 명세서에 참조로 포함되어 있음). 혈청뿐만 아니라, 코 세척액, 타액, 및 기관지 세척액에서도 Ab 역가를 측정한다. 상기 분석은 점막 분비물 및 혈청 양쪽에서 IgA, IgM, IgG 및 Ig-G-서브클래스의 분포를 포함한다. 가장 최적의 점막 Ab 역가를 유도할 수 있는 프로토콜(protocol)이 TIGR4 균주에 대한 점막 시도 연구를 수행하기 위해 사용되며, ∼5×10⁶ CFU로 마우스의 코에 투여되고, 이후 4일 및 11일째에 콜로니화가 관찰된다. 상기 면역 연구에서는, 이전의 연구와 마찬가지로, CBA/N 뿐만 아니라 정상적이고 완전한 면역반응성이 있는 마우스(CBA/J 종)가 사용된다. Wallick 등, (1983) J. Immunol. 130:2871-2875.

실시예 5

폐렴구균 발병에서의 뉴라미니다제 특이적인 항체의 역할

코에 시도하기 전에 마우스를 코에 면역시키기 위하여, 상업적으로 구입가능한 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 뉴라미니다제(Calbiochem)가 사용된다. 그러나, 상기 NanA 유전자는 목적하는 연구를 위해 충분한 양의 단백질을 얻기 위하여 히스티딘-태그를 포함하는 발현 벡터(Invitrogen)를 이용하여 대장균에서 클론 및 발현된다. 3.4% 포름알데히드 처리된 뉴라미니다제의 코 면역은 점막 면역 반응을 최적화하기 위하여 CT의 존재 또는 부재하에서 처리되지 않은 뉴라미니다제와 비교된다. 상기 면역은 CBA/N 및 CBA/J 마우스 모두에서 수행된다. 3번의 코 면역화가 1주 간격으로 수행되며, 이 기간 동안 혈청 및 타액 Ab의 역가가 ELISA에 의해 관찰된다. 상기 면역 마우스는 TIGR4 균주로 시도되며, ON/E, OB, 뇌, 혈액, 비장, 및 폐의 콜로니화가 4일 및 11일째에 비교된다. 숙주의 작용을 블록하기 위하여, 뉴라미니다제와 C-폴리사카리이드에 특이적인 항체 양쪽을 동시에 유도한다. 뉴라미니다제를 이용한 코의 면역화와 T5 이디오타입 mAb의 전달에 의한 수동 면역 방어를 결합시킨 처방이 사용된다.

실시예 6

스트렙토코커스 뉴모니애의 코 시도에 대해 방어하기 위한 뉴라미니다제 - PC 콘쥬게이트의 효능

각각의 항원이 단독으로 사용된 경우에 비해 11일째에 방어가 향상되는 것과 EF3030 및 TIGR4 균주에 의해 코 콜로니화가 감소되는 것을 평가하기 위하여, CT를 코 보조제로 사용하여 뉴라미니다제 및 PC-KLH로 마우스를 면역화한다. 아울러, 상기에서 나타난 바와 같이 코 세척액, 타액, 및 혈청에서의 항체 역가를 분석하여 면역 파라미터를 비도에서의 폐렴구균 방어 정도와 연관시킨다. 더욱 최적의 면역 반응을 생성시키기 위하여, 포스포콜린이 뉴라미니다제와 직접 커플된다. 상기 구축물은 CBA/N 및 CBA/J 마우스 양쪽에서 코 및 전신 면역화된 후, 보조제인 CT와 함께 또는 단독으로 운반될 때 면역원성에 대해 검사된다. 코 세척액, 타액, 및 혈장에서의 상기 Ab 역가는 ELISA에 의해 측정된다. 시도 연구가 10⁷ CFU의 EF3030 균주 또는 10⁶ CFU의 TIGR4 균주를 이용하여 수행된다. 상기 마우스는 시도 후 11일째 희생되며, 혈액, 코 세척액, ON/E, OB, 및 뇌에서 관찰되는 CFU에 대해 분석된다. PC에 커플된 뉴라미니다제로 면역화되면, 상기 2가지 독성 성분에 대한 점막 및 전신의 Ab 수치를 증가시킴으로써 방어를 향상시킨다. 상기 항원-특이적 IgG 서브클래스 분포는 다른 점막 보조제를 사용함으로써 변경된다. CT는 Th2-형 반응, LT는 혼합된 Th2/Th1-형 반응, 및 DNA 올리고뉴클레오타이드(ODN) 1826과 같은 CpG 모티프는 Th1-형 반응을 IgG 서브클래스 분포의 변경과 연관되어 생성한다. 다른 보조제는 스트렙토코커스 뉴모니애에 의한 코 콜로니화에 대해 방어하기 위하여 뉴라미니다제-C-폴리사카라이드 특이적인 면역 능력을 추가로 향상시키며, 새로운 폐렴구균 백신 접근법이 형성되도록 이끈다.

실시예 7

코 시도후 항 - 포스포콜린 특이적인 단일클론 항체에 의한 스트렙토코커스 뉴모니애의 코 콜로니화 억제

총 1×10⁶ CFU의 TIGR4 균주를 IgG3 서브클래스 또는 IgM 이소타입에 속하는 항-포스포콜린 단일클론 항체 5 ㎍과 배양하였다. 콧구멍당 총 5 ㎕가 투여되었다. 표시된 것은 적용 후 각각 9 및 12시간에 500 ㎖의 코 세척액에서의 CFU이다. 양쪽 단일클론 항체 모두에 대해 유의미한 80% 이상의 감소가 관찰되었다. 표시된 것은 군당 5마리 마우스의 평균 + SD이다. 상기 데이터는 도 10에 나타나 있다.

실시예 8

코에 스트렙토코커스 뉴모니애를 적용한 후의 신경 손상 및 염증반응

스트렙토코커스 뉴모니애 균주 EF3030의 코 적용 후 1, 3, 7, 및 14일째에 처리된 마우스로부터 ON/E, OB, 및 뇌를 단리하고, 조직학적으로 염증 반응을 분석한다. 상기 D39 또는 TIGR4 균주는 염증 반응을 생성하는 능력에 대해 이들의 nanA 돌연변이체 균주와 비교된다. 희생 시점에서, 상기 마우스는 25℃에서 PBS로 관류하고, 10 ㎖의 Zamboni 고정제(0.1 M 인산 완충액 내의 4% 파라포름알데히드, 15% 피크르산(picric acid))로 관류한다. 상기 OB 및 ON/E를 제거한 후, 새로운(fresh) 4% 파라포름알데히드(PFA)에서 4℃로 밤새 둔다. 이후, 상기 조직을 4℃에서 48시간 동안 30% 수크로스 용액으로 전달하여, 절편화하기 전에 이를 동결방지한다. 이후, 상기 조직을 OCT에서 동결하고, 절편(6 ㎛)을 미리 코팅된 현미경 슬라이드(생리식염수 내의 10% BSA)에 위치시킨다. 먼저, 상기 기간동안 OB, 삼차신경절 및 ON/E에 침투한 염증 세포를 검출하기 위하여 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 수행한다. 신경 손상을 평가하기 위하여, 신경 성장 인자 β1(NGF-β1)을 염색한다. NGF-β1은 신경 손상 후에 생성되며, 세포사멸을 방지하고 새로운 신경 세포의 성장을 촉진시킨다. 삼차신경절 및 OB 절편은 0.2 ㎍/㎖ 농도에서 바이오틴화된 토끼 항-인간 NGF-β1 Ab로 염색한다. 상기 Ab-염색된 절편은 4℃에서 밤새 배양한다. 상기 슬라이드를 PBS로 헹구고, 이후 아비딘-바이오틴 복합체(ABC)인 Vectastain (Vector Laboratories, Burlingame, CA)으로 25℃에서 30분간 반응시킨다. 상기 조직을 PBS로 3회 헹군 후, 이전에 보고된 대로 디아미노벤지덴(diaminobenzidene, DAB)으로 5-10분간 반응시킨다. 상기 슬라이드를 3회 더 헹구고, 절편을 C.S. 헤마톡실린(hematoxylin)으로 30초간 대비염색한다. H₂O에서 세척한 후, 상기 슬라이드를 100% 알콜과 자일렌으로 탈수시킨다. NGF-β1의 증가는 신경 조직의 손상 정도에 대한 지표를 제공한다. 신경이 관여된 다른 지표로는 마이크로글리아의 활성이 있다. 활성화된 마이크로글리아는 아메바형의 원형을 보이지만, 휴지기(G₀/G₁ 기)의 세포는 수지상의 가지 모양을 갖는다. 활성에 따른 이러한 변화는 휴지기 및 활성화된 마이크로글리아를 구분할 수 있게 한다. 마이크로글리아에 대해서는, 스트렙토코커스 뉴모니애 시도 후 활성 상태를 조사하기 위해 F4/80 항체 또는 항-MAC-1(MI/70)을 사용한다. 신경 손상 및 마이크로글리아 활성 이외에도, OB에서의 세포사멸 유도를 평가한다. 상기 목적을 위해, 세포사멸 경로의 개시에 있어서 중요한 역할을 하며 Asp-Glu-Val-Asp 특이적인 프로테아제인 활성형 캐스파제(Caspase) 3의 유도를 분석한다. 활성형 캐스파제 3에 특이적인 항체(Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA)는 세포사멸의 검출을 위한 면역조직화학에서 사용될 수 있다. 만일, 캐스파제 3의 활성이 면역조직화학에 의해 신경 조직에서 검출된다면, 그 활성은 기질의 단백질분해 후 유도되는 형광 신호에 기초한 캐스파제-3 분석 키트(Molecular probes, Eugene, OR)를 이용하여 정량한다.

실시예 9

역행성( retrograde ) 축삭 운반에 의해 스트렙토코커스 뉴모니애가 후각 구를 표적화하는 능력

첫번째로, 코 및 정맥내 접종 후, 처리된 마우스의 신경 조직, OB 및 뇌에서의 폐렴구균의 축적을 조사한다. 정맥내 접종 후에는, 신경 조직내의 모든 폐렴구균은 혈액을 통해 도입된 것이다. 코 시도 후 1, 4, 11 및 18일째에 조직을 수집한다. 이 경우, 1 그램의 뇌 및 OB 당 세균의 수는 주사 후 모든 시점에서 유사하여야 한다. 반대로, 코내 접종 후 비도를 통해 도입되는 세균의 경우에는, OB에서의 축적(조직 무게당 표현)이 진행되고, 일반적으로 뇌에서 관찰되는 축적 이전에 남아있다.

두번째로, 코 적용 후 폐렴구균의 생체내 이미지를 수행한다. 테크네슘-99(Tc-99m)가 표지된 TIGR4, 안정적인 불투명 및 투명 변이체, EF3030, 및 nanA 및/또는 nanB가 결실된 TIGR4 돌연변이체를 사용하여, 맨처음 Waibel 등에 의해 기재된 방법(Waibel 등, (1999) Nature Biotechnol. 17:897-901)을 사용하여 종래에 아데노바이러스에서 수행한 것과 같은 감마 카메라 이미징을 사용하여 마우스에서 이들이 존재하는지 여부를 시각화한다. 상기 방법은 사용된 동이원소의 짧은 반감기(6시간)로 인해 코 적용 후 대략 처음 24시간 동안만 이미징할 수 있으며, 비도에서 일어나는 초기 사건에 대해 분석할 수 있게 한다. 폐렴구균을 오랜 기간 이미징하기 위해서는, 루시퍼라제(luciferase) 또는 GFP를 발현하는 폐렴구균 EF3030(또는 TIGR4) 균주를 사용하여 생체내에서의 생체발광(bioluminescence)을 시각화한다. Xenogen 주식회사(Alameda, California)로부터 상업적으로 입수가능한, 루시퍼라제를 발현하는 폐렴구균 균주 EF3030를 사용한다. 상기 폐렴구균 균주로 생체내 이미징을 성공한 것은 종래에 보고되었다. 상기 마우스는 루시퍼라제의 발현을 검출하기 위하여 생체발광 이미징 시스템(IVIS system, Xenogen, Inc.)을 이용하여 이미지된다. 동일한 위치를 향하는 마우스에서 2.5 ㎎의 루시페린(luciferin)을 복강내에 주사한지 10분 후에 이미지를 수집한다. 이미징하는 동안, 상기 마우스는 엔플루란(enflurane) 마취하에 37℃에서 유지한다. 이미징은 루시퍼라제를 발현하는 폐렴구균을 코에 시도한 후 2일부터 시작하여 18일까지 각 마우스에 대해 수차례 수행한다. 이미징하는 동안의 이미지 획득 시간은 20초 내지 10분 범위이다. 데이터 획득 소프트웨어는 이미지 수집 과정에서 어떠한 픽셀(pixel)도 포화되지 않았음을 보증한다. 관심있는 부위에서 방출되는 빛(상대적인 광자(photon)/초)은 Xenogen에 의해 제공되는 소프트웨어를 이용하여 정량한다. 방출되는 빛의 세기는 생체발광 이미지의 의사색채(pseudocolor) 비례로 제공된다. 상기 생체발광 이미지들은 전형적으로 동일한 시간에 수집된 마우스의 흑백 사진위에 겹쳐진다. 상기 생체내 이미지는 폐렴구균이 비도로부터 OB로 들어가는 능력을 분석하는데 초점을 맞춘다. 상기 루시퍼라제 유전자의 성공적인 전달 후, 상기 생체발광 연구는 nanA TIGR4 돌연변이체로 확장한다.

본 명세서 전체를 통해 다양한 문헌들이 참조된다. 이러한 문서에서 개시하고 있는 내용들은 본 명세서에 기재된 화합물, 조성물 및 방법을 보다 충분히 설명하기 위해 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다.

본 명세서에 개시된 상기 화합물, 조성물 및 방법에 대해 다양한 변형 및 변경이 수행될 수 있다. 본 명세서에 기재된 상기 화합물, 조성물 및 방법의 다른 측면들은 본 명세서에 기재된 상기 화합물, 조성물 및 방법의 상술(specification) 및 실행을 고려하면 자명할 것이다. 상기 상술 및 실시예들은 단지 설명을 하기 위한 목적으로 사용된 것이다.

참조문헌

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Glu Ser Ser Thr Leu Thr Asp Thr Glu 50 55 60 Lys Ser Gln Pro Ser Ser Glu Thr Glu Leu Ser Gly Asn Lys Gln Glu 65 70 75 80 Gln Glu Arg Lys Asp Lys Gln Glu Glu Lys Ile Pro Arg Asp Tyr Tyr 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Glu Asn Val Glu Thr Val Ile Glu Lys Glu Asp Val 100 105 110 Glu Thr Asn Ala Ser Asn Gly Gln Arg Val Asp Leu Ser Ser Glu Leu 115 120 125 Asp Lys Leu Lys Lys Leu Glu Asn Ala Thr Val His Met Glu Asn Lys 130 135 140 Pro Asp Ala Lys Ala Pro Ala Phe Tyr Asn Leu Asn Ser Val Ser Ser 145 150 155 160 Ala Thr Lys Lys Asp Glu Tyr Phe Thr Met Ala Val Tyr Asn Asn Thr 165 170 175 Ala Thr Leu Glu Gly Arg Gly Ser Asp Gly Lys Gln Asn Tyr Asn Asn 180 185 190 Tyr Asn Asp Ala Pro Leu Lys Val Lys Pro Gly Gln Trp Asn Ser Val 195 200 205 Thr Phe Thr Val Glu Lys Pro Thr Ala Glu Leu Pro Lys Gly Arg Val 210 215 220 Arg Leu Tyr Val Asn Gly Val Leu Ser Arg Thr Ser Leu Arg Ser Gly 225 230 235 240 Asn Phe Ile Lys Asp Met Pro Asp Val Thr His Val Gln Ile Gly Ala 245 250 255 Thr Lys Arg Ala Asn Asn Thr Val Trp 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Asn Trp Tyr Arg Ala Ser 885 890 895 Cys Ser Asn Asn Arg Arg Val Asn Gly Ile Asn Phe Ala Cys Asn Ser 900 905 910 Tyr Tyr Lys Lys Arg Leu Tyr Leu Gln Ser Ser Ser Cys Ser Ala Gly 915 920 925 Thr Ser Asn Asn Arg Lys Gln Gly Glu Asn Pro Pro Ser Phe Thr Arg 930 935 940 Thr Asn Ser Asn Leu Pro Trp Ser Val Tyr Ala Arg Glu Lys Glu Arg 945 950 955 960 Thr Ile <210> 17 <211> 382 <212> PRT <213> S. typhimirium <400> 17 Met Thr Val Glu Lys Ser Val Val Phe Lys Ala Glu Gly Glu His Phe 1 5 10 15 Thr Asp Gln Lys Gly Asn Thr Ile Val Gly Ser Gly Ser Gly Gly Thr 20 25 30 Thr Lys Tyr Phe Arg Ile Pro Ala Met Cys Thr Thr Ser Lys Gly Thr 35 40 45 Ile Val Val Phe Ala Asp Ala Arg His Asn Thr Ala Ser Asp Gln Ser 50 55 60 Phe Ile Asp Thr Ala Ala Ala Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp 65 70 75 80 Asn Lys Lys Ile Ala Ile Tyr Asn Asp Arg Val Asn Ser Lys Leu Ser 85 90 95 Arg Val Met Asp Pro Thr Cys Ile Val Ala Asn Ile Gln Gly Arg Glu 100 105 110 Thr Ile Leu Val Met Val Gly Lys Trp Asn Asn Asn Asp Lys Thr Trp 115 120 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Claims (13)

1. 포스포콜린 항체 또는 그의 절편 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 점막 표면에 투여하기 위해 적합한 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 코 스프레이인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 흡입기 용액인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 에어로졸 호흡기인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제1항의 조성물을 포함하는 용기.
7. 제6항에 있어서, 상기 용기는 코 스프레이인 것을 특징으로 하는 용기.
8. 제 6항에 있어서, 상기 용기는 흡입기인 것을 특징으로 하는 용기.
9. 제 6항에 있어서, 상기 용기는 호흡기인 것을 특징으로 하는 용기.
10. 포스포콜린 항체 또는 그의 절편을 인간을 제외한 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상에서 폐렴구균의 비강 보균을 감소시키는 방법.
11. 제 10항에 있어서, 상기 투여는 상기 대상의 코 점막을 상기 항체 또는 그의 절편과 접촉시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 포스포콜린 항체 또는 그의 절편을 인간을 제외한 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상에서 폐렴구균의 감염을 방지하는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 상기 투여는 상기 대상의 코 점막을 상기 항체 또는 그의 절편과 접촉시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

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