KR20110101135A

KR20110101135A - 예정 세포 사멸을 유도하는 방법

Info

Publication number: KR20110101135A
Application number: KR1020117011752A
Authority: KR
Inventors: 알란 제임스 허즈번드; 데이비드 브라운; 길 모어; 이완 엠 타이틀러
Original assignee: 노보겐 리서치 피티와이 리미티드
Priority date: 2008-10-22
Filing date: 2009-10-19
Publication date: 2011-09-15
Also published as: WO2010045674A1; US20100130598A1; EP2362773A1; CN102596196A; IL212418A0; EP2362773A4

Abstract

본 발명은 세포에서 카스파제-비의존성 세포사멸을 유도 또는 촉진하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 여기에 기술된 와 같이 화학식(I) 화합물의 유효량을 세포에 노출시킴을 포함한다. 본 발명은 또한 화학식(I) 화합물의 유효량을 필요로 하는 개체에 투여함으로써 질병 및 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 화합물은 개체의 적어도 하나의 세포에서 카스파제-비의존성 세포사멸을 유도 또는 촉진한다.

Description

예정 세포 사멸을 유도하는 방법{Methods for Inducing Programmed Cell Death}

본 발명은 카스파제-비의존성 세포 사멸을 유도 또는 촉진하는 방법 및 mTOR 활성을 저해하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 비정상적인/원치 않는 성장 및/또는 증식과 연관하는 질병 및 증상의 치료에 관한 것이다.

예정 세포 사멸(programmed cell death)은 진화학적으로 보존된 경로로서, 이들 경로의 활성화는 에너지-의존 세포 자살 기작을 유도한다. 두 가지 형태의 예정 세포 사멸, 즉, 아폽토시스 또는 카스파제-의존성 세포 사멸, 및 카스파제-비의존성 세포 사멸이 일반적으로 문헌에 기술되어 있다. 카스파제-의존성 세포 사멸은 두 가지 타입의 예정 세포 사멸 중 보다 더 잘 특성화된 경로로써 프로그램된 세포 사멸 및 아폽토시스 두 용어가 통상적으로 상호 호환적으로 사용되고 있다. 카스파제-의존성 아폽토시스는 프로티아제인 카스파제 그룹의 연속적인 활성화와 관련하며 또한 Fas 및 TNFR와 같은 죽음 수용체의 라이게이션(외부 경로) 또는 미토콘드리아 탈분극화(내부 경로)에 의해 활성화될 수 있다. 프로-세포 사멸(Bak, Bax, 등) 및 항-세포 사멸 멤버(Bcb, BcIx)를 갖는 단백질의 Bcb 패밀리는 미토콘드리아 완전성 및 외부 미토콘드리아 막의 프로-세포 사멸 및 항-세포 사멸 멤버의 비율에 의존하는 내부경로에 관여할지의 여부 결정을 조절한다.

카스파제-비의존성 세포 사멸은 카스파제 활성화 없이 세포가 죽을 때 발생하는 사건을 포함한다. 오토파지(autophagy)가 가장 잘 특성화된 카스파제-비의존성 예로서 세포 사멸 경로로서 타입 Il 예정 세포 사멸로 종종 불리운다. 이것은 이중막의 세초내 소낭인 오토파고좀의 조절된 형성에 관여하고 이들 소낭은 리소좀과 융합하여 오토파고좀내의 분자를 분해 유도한다. 오토파지는 Akt-mTOR 경로를 통해 조절되고 Beclin-1 및 Class III PI3 키나제와 같은 중요 단백질을 포함한다. 세포 생존을 촉진하려고 활성화된 경로이나, 불러일으킨 고유의 기작에 의하여 세포 사멸을 또한 유도할 수 있다. 카스파제-비의존성 세포 사멸을 포함하는 카스파제-비의존성 세포 사멸의 다른 경로는 Hail등, 2006에서 검토 되어있다.

다수의 연구는 대다수의 화학요법 약제가 세포 사멸 경로를 활성화하여 세포사멸을 유도하고 또한 XIAP와 같은 항-세포 사멸 블록커의 높은 세포내 레벨로 인한 세포 사멸 저항성이 화학-저항성의 주요 원인이라는 것을 나타내었다. 사실, XIAP와 같은 세포 사멸 블록커의 분자 또는 약물 표적화는 화학-저항성의 반전을 야기한다(참조. 예를 들어 Alvero등, 2006; Kluger등, 2007). 비정상적인 세포 성장 및/또는 증식은 광범위하게 다양한 질병 증상과 또한 연관되어 있고 세포사멸 유도인자의 치료학적 응용에 관심이 증가되고 있다.

여기에 기술된 바와 같이, 본 발명자는 인간 세포에서 카스파제-비의존성 비오토파지적인 예정 세포사멸을 유도하는 이소플라보노이드 화합물 클래스를 확인하고 새로운 범위의 치료학적 길을 열었다.

첫 번째 양상에 따르면, 유효량의 하기 화학식(I) 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체를 세포에 노출시키는 것을 포함하는 세포중의 카스파제-비의존성 세포 사멸을 유도 또는 촉진하는데 방법이 제공된다,

상기 식에서,

R₁은 수소, 하이드록시, 알킬, 알콕시, 할로 또는 OC(O)R₇이며,

R₂ 및 R₃는 독립적으로 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 사이클로알킬, 할로 또는 OC(O)R₇이며,

R₄, R₅ 및 R₆는독립적으로 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 사이클로알킬, 아실, 아미노, C₁ _-4-알킬아미노 또는 디(C_1-4-알킬)아미노, OC(O)R₇ 또는 OR₈이며,

R₇은 수소, 알킬,사이클로알킬, 아릴, 아릴알킬, 또는 아미노이며, 또한

R₈은아릴 또는 아릴알킬이고,

R₉ 및 R₁₀은 독립적으로 수소, 하이드록시, 알킬, 알콕시 또는 할로이며, 또한

부호 "

"는 단일 결합 또는 이중 결합을 나타낸다.

하나의 구현 예에서, 본 화합물은 하기 구조식를 갖는 3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)-8-메틸크로만-7-올이다.

대안적 구현 예에서, 본 화합물은 하기 구조식를 갖는 3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)크로만-7-올이다.

화합물에 세포의 노출은 in vitro , ex vivo 또는 in vivo 에서 일어날 수 있다.

특정 구현예에서 세포는 암세포가 아니다. 일 예로서, 세포는 심근 세포 및 면역 세포일 수 있다. 면역 세포는 증식하는 T 세포일 수 있다.

두 번째 양면에 따라서, 세포에서 mTOR 활성을 저해하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 여기에 기술되어 있는 바와 같은 화학식 (I) 화합물의 유효량을 세포에 투여함을 포함한다.

전형적으로 mTOR 활성의 저해는 mTOR의 탈인산화를 포함한다.

세 번째 양상에 따르면, 질병 또는 증상의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 여기에 기술된 바와 같은 유효량의 화학식 (I) 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체를, 경우에 따라 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 보조제 및/또는 부형제와 함께, 필요로 하는 대상에게 투여함을 포함하며 여기서 상기 화합물은 개체의 적어도 하나의 세포에서 카스파제-비의존성 세포 사멸을 유도 또는 촉진한다.

네 번째 양상에 따르면, 질병 또는 증상의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 여기에 기술된 바와 같은 유효량의 화학식 (I) 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체를, 경우에 따라 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 보조제, 및/또는 부형제와 함께, 필요로 하는 개체에게 투여함을 포함하며 여기서 상기 화합물은 개체의 적어도 하나의 세포에서 mTOR 활성을 저해한다.

세 번째 또는 네 번째 양상에 따른 특정한 구현 예에서 상기 세포는 암세포가 아니다. 한 예로서 상기 세포는 심근 세포 또는 면역세포이다.

전형적으로 상기의 세 번째 또는 네 번째 양상에 따르면, 질병 또는 증상은 비정상적 또는 원치않은 세포 성장 또는 증식과 관련된다. 한 구현 예에서, 상기 질병 또는 증상은 협착증 또는 재협착증, 이식 거부 또는 류마티스 관절염으로부터 선택될 수 있다. 세포 증식이 T세포 증식일 경우, 질병 또는 증상은 T 세포 백혈병, 자가면역 질환 및 이식편대숙주병과 같은 이식 거부로부터 선택될 수 있다. 자가 면역 질환은 간경변, 건선, 루푸스, 류마티스 관절염, 에디슨 질병, 전염성 단핵세포증, 세자리 증후군 및 엡스타인 바 바이러스 감염을 포함하나 여기에 제한되지는 않다.

협착증 또는 재협착증의 치료를 위해 상기 화합물 또는 상기 화합물을 포함하는 조성물은 관상동맥에 삽입된 스텐트(stent)에 코팅되거나 또는 별도로 병합될 수 있다. 스탠트는 상기 화합물 또는 조성물을 일정 시간에 걸쳐 스탠트로부터 용출시켜 원하는 결과를 달성하도록 할 수 있다.

하나의 구현 예에서, 상기 화합물은 하기의 구조식을 갖는 3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)-8-메틸크로만-7-올이다:

대안적인 구현 예에서, 상기 화합물은 하기의 구조식을 갖는 3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)크로만-7-올이다:

다섯 번째 양상을 따르면, 비정상적이거나 또는 원치않은 세포 성장 및/또는 증식과 연관된 질병 또는 증상의 치료 또는 예방을 위한 약제가 제공되며, 상기 약제는 여기에 기술된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체를 포함한다.

여섯 번째 양상을 따르면, 세포에서 카스파제-비의존성 세포 사멸을 유도 또는 촉진하기 위한 약제의 제조를 위해 여기에 기술된 바와 같은 화학식(I) 화합물의 용도가 제공된다.

일곱 번째 양상을 따르면, 세포에서 mTOR 활성을 저해하기 위한 약제의 제조를 위해 여기에 기술된 바와 같은 화학식(I) 화합물의 용도가 제공된다.

여덟 번째 양상을 따르면, 질병 또는 증상을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조를 위해 여기에 기술된 바와 같은 화학식 (I) 화합물의 용도가 제공되며, 여기서 상기 화합물은 개체의 적어도 하나의 세포에서 카스파제-비의존성 세포 사멸을 유도 또는 촉진한다.

아홉 번째 양상을 따르면, 질병 또는 증상을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조를 위해 여기에 기술된 바와 같은 화학식 (I) 화합물의 용도가 제공되며, 여기서 상기 화합물은 개체의 적어도 하나의 세포에서 mTOR 활성을 저해한다.

열 번째 양상을 따르면, 개체의 세포 또는 조직에 적어도 하나의 활성제를 전달하기 위한 이식가능한 의료기기가 제공되며 여기서 상기 적어도 하나의 활성제는 여기에 기술된 바와 같은 화학식(I) 화합물을 포함한다.

전형적으로 세포 또는 조직에 화합물을 투여하기 위해 화합물은 기기에 코팅되거나 또는 병합된다. 경우에 따라, 상기 기기는 하나 또는 그 이상의 부가적인 활성제를 또한 포함한다.

하나의 구현 예에서, 이식가능한 의료기기는 약물-용출 스텐트(drug-eluting sten)이다.

전형적으로 상기 양상 및 구현 예에 따르면, 개체는 인간이다. 다른 구현 예에서, 개체는 제한적이지는 않지만 영장류, 양, 소, 개, 고양이, 돼지, 말, 주로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 명세서 및 청구 범위 전반을 통해서 문맥이 별도로 주어지지 않는다면 단어 "포함하다(comprise)" 및 변형어 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"는 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 내포하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.

관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 목적어의 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하도록 여기서 사용된다. 예를 들어, "an element"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.

여기서 사용되는 "치료하는", "치료", "예방하는", 및 "예방"은 증상 또는 증후군을 치료하고, 증상 또는 질병의 정착을 예방하거나 또는 증상 또는 질병 또는 다른 바람직하지 않은 증후군의 발전을 예방, 지연 또는 역전하는 임의의 모든 용도를 지칭한다. 따라서, "치료하는" 및 "예방하는" 등의 용어는 그들의 가장 광범위한 문맥에서 고려된다. 예를 들어, 치료는 환자가 완쾌까지 치료됨을 의미하는 것은 반드시 아니다.

여기서 사용되는 용어 "유효량" 및 "유효투약량"은 그의 의미 안에서 비독성이면서 원하는 효과를 제공하는 약제 또는 화합물의 충분한 양 또는 투약량을 포함한다. 필요로 되는 정확한 양 또는 투약량은 치료되는 종, 나이 및 개체의 일반적인 증상, 치료되는 증상의 중증도, 투여되는 특수한 약제, 투여 방법 등과 같은 요소에 따라 개체에서 개체마다 다를 것이다. 따라서 정확한 "유효량" 또는 "유효투약량"을 명시하는 것은 불가능하다. 그러나, 어떠한 경우에 대해는, 적절한 "유효량" 또는 "유효투약량"은 일반적인 실험만을 사용하여 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.

"약제학적으로 허용가능한 염"이란 용어는 전하(charge)를 가지며 또한 예를 들어, 염에서 카운터-양이온 또는 카운터-음이온으로서 약제학적 제제와 함께 투여될 수 있는 유기 또는 무기 부분을 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 양이온은 당업자들에게 알려져 있으며, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 아연 및 4차 아민을 포함하나 여기에 제한되지는 않는다. 약제학적으로 허용가능한 음이온은 당업자들에게 알려져 있으며, 또한 염소, 아세테이트, 시트레이트, 바이카르보네이트 및 카르보네이트를 포함하나 여기에 제한되지는 않는다.

"약제학적으로 허용가능한 유도체"란 용어는 개체에게 투여시 직접 또는 간접적으로 모체 화합물 또는 중간대사물을 제공할 수 있거나 또는 활성을 나타내는 활성 화합물의 유도체를 지칭한다. 프로드러그는 본 발명의 범위 내에 포함된다.

여기에서 예시된 화합물 1 및 10은 다양한 암 세포주에 대해 항-증식 활성을 갖는 화합물의 페닐-치환된 이소플라반 패밀리의 구성원이다. 본 출원는 카스파제-비의존성 비-오토파지 세포 사멸 경로의 이 패밀리 화합물에 의한 인간세포에서의 활성화를 기술한다. 적어도 화합물 1의 경우에서, 이것은 mTOR의 탈인산화에 관여한다. 여기에 예시된 바와 같이, 파클리탁셀(paclitaxel)-저항 세포주는 p-mTOR의 저해, Beclin-1 미토콘드리아 위치이동, 뉴클리아제 EndoG의 핵내로 위치이동, DNA 조각화에 의해 특징 지워지는 화합물 1의 존재하에서 카스파제-비의존성 세포사멸을 하는것으로 입증된다. 세포 사멸은 오토파지가 아니고 세포사멸 유도 인자 존재하에서 진행되어 본 명세서에서는 "카스파제-비의존성 세포사멸"이라 여기서 명명된다. 유사하게, 화합물 10은 다양한 세포주에서 세포 사멸을 유도하면서 세포 주기 억제를 유발하는 것으로 입증된다. 화합물 10-유도 세포사멸이 팬-액팅(pan-acting) 카스파제 저해제의 존재하에서 진행한다는 것은 세포사멸의 카스파제-매개 및 카스파제 비-의존성 경로가 유도된다는 것을 암시한다.

본 명세서에는 하기 화학식(I) 화합물의 유효량을 세포에 노츨시킴을 포함하는 세포에서 세포사멸을 유도 또는 촉진하는 방법이 기술된다

본 발명은 또한 감소된 또는 비정상적인 세포사멸과 연관된 질병 및 질환의 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명의 한가지 양상은 개체의 질병 또는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 구조식을 갖는 3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)크로만-7-올 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체의 유효량을 개체에 투여함을 포함하며,

여기서, 상기 화합물은 개체의 적어도 하나의 세포에서 세포사멸을 유도 또는 증진한다. 경우에 따라, 상기 화합물은 약제학적 조성물의 형태로 투여되며, 이 조성물은 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 보조제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다.

본 발명이 하나 이상의 화학식 I 화합물을 투여 및/또는 적어도 하나의 화학식 I 화합물을 적어도 하나의 부가적인 치료학적 화합물 또는 약제와 함께 투여함을 포함한다는 것으로 당업자들에 의해 또한 쉽게 인식될 것이다.

본 발명에서 유용한 화합물은 일반 화학식 (I) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체이다:

상기 식에서

R₁은 수소, 하이드록시, 알킬, 알콕시, 할로 또는 OC(O)R₇이고_.

R₂ 및 R₃는 독립적으로 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 사이클로알킬, 할로 또는 OC(O)R₇이고,

R₄, R₅ 및 R₆는 독립적으로 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 사이클로알킬, 아실, 아미노, C₁ _-4-알킬아미노 또는 디(C_1-4-알킬)아미노, 0C(0)R₇ 또는 OR₈이고,

R₇은 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아릴알킬 또는 아미노이고,

R₈는 아릴 또는 아릴알킬이고,

R₉ 및 R₁₀는 독립적으로 수소, 하이드록시, 알킬, 알콕시, 또는 할로이고, 또한

부호 "

"는 단일 결합 또는 이중 결합이다.

전형적으로 화학식 (I) 화합물에서 R₂ 및 R₃의 치환 패턴은 하기에 나타낸 바와 같다:

또는

화학식 (I)의 화합물에서, R₄, R₅ 및 R₆의치환 패턴은 하기에 나타낸 바와 같을 수 있다:

또는

화학식 (I) 화합물에서 부호 "

"는 단일 결합을 나타낼 수 있다.

하나의 구현 예에서, 화학식 (I) 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체에서:

R₁은 하이드록시, C₁ _-4-알콕시 또는 OC(O)R₇이고,

R₂ 및 R₃는 독립적으로 수소, 하이드록시, C₁ _-4-알콕시, 할로 또는 0C(0)R₇이고,

R₄, R₅ 및 R6는 독립적으로 수소, 하이드록시, 알콕시, 알킬, 사이클로알킬, 아실, 0C(0)R₇ 이고

R₇은 C₁ _-4-알킬, 페닐 또는 벤질이고,

R₉은 수소, 하이드록시, 알킬 또는 할로이다.

R₁은 하이드록시, 메톡시, 에톡시 또는 아세틸옥시이고,

R₂ 및 R₃는 독립적으로 수소, 하이드록시, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 브로모, 클로로, 플루오로 또는 아세틸옥시이고,

R₄는 수소, 하이드록시, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시 또는 아세틸옥시 이고,

R₅ 및 R₆는 독립적으로 수소, 하이드록시,메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 아세틸 또는 아세틸옥시이고,

R₉은 수소, 하이드록시, 메틸, 메톡시, 브로모, 클로로, 플루오로 또는 아세틸옥시이고,

R₁₀은 수소이다,

화학식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체는 하기의 치환기를 가질 수 있다:

R₁은 하이드록시,메톡시 또는 아세틸옥시이고,

R₂ 및 R₃는 독립적으로 수소, 하이드록시, 메톡시, 브로모 또는 아세틸옥시이고,

R₄ 및 R₆는 독립적으로 수소, 하이드록시, 메톡시 또는 아세틸옥시이고,

R₅ 및 R₁₀은 수소이고,

R₉은 수소, 메틸 또는 브로모이다.

하나의 구현 예에서, R₉은 메틸이다.

본 발명의 구현 예에 따르면 화학식(I) 화합물은 하기 화합물을 포함한다:

3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)-8-메틸크로만-7-올(화합물 1);

3-(4-메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)-7-메톡시-8-메틸크로만(화합물 2);

3-(3,4-디메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)-8-메틸크로만-7-올(화합물 3);

3-(4-메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)-8-메틸크로만-7-올(화합물 4);

3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)-7-메톡시-8-메틸크로만(화합물 5);

3-(3-메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)-8-메틸크로만-7-올(화합물 6);

3-(3,4-디하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)-7-메톡시-8-메틸크로만(화합물 7);

3-(3-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)-8-메틸크로만-7-올(화합물 8);

3-(3,4-디하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)-8-메틸크로만-7-올(화합물 9);

또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염.

다른 구현 예에서, R₉은 수소이다.

부가적인 구현 예에 따르면 화학식 (I)의 화합물은 하기 화합물을 포함한다:

3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)크로만-7-올(화합물 10);

3-(4-하리드록시페닐)-4-페닐크로만-7-올(화합물 11);

3-(4-하이드록시페닐)-4-(3-메톡시페닐)크로만-7-올(화합물 12);

3-(3,4-디메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)크로만-7-올(화합물 13);

3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메틸페닐)크로만-7-올(화합물 14);

3-(4-메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)-7-메톡시크로만(화합물 15);

3-(4-하이드록시페닐)-4-(2,6-디메톡시-4-하이드록시페닐)크로만-7-올(화합물 16);

3-(4-하이드록시페닐)-4-(2-하이드록시페닐)크로만-7-올(화합물 17);

3-(4-하이드록시페닐)-4-(3-아실-2-하이드록시-4-메톡시페닐)크로만-7-올(화합물 18);

3-(3-하이드록시페닐)-4-(3-메톡시페닐)크로만-7-올(화합물 19);

3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-하이드록시페닐)크로만-7-올 (화합물 20);

3-(4-브로모페닐)-4-(4-메톡시페닐)크로만-7-올(화합물 21);

3-(4-하이드록시페닐)-4-(3-메톡시페닐)크로만-7-올(화합물 22);

3-(4-하이드록시페닐)-4-(3-아미노페닐)크로만-7-올(화합물 23);

3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-펜녹시페닐)크로만-7-올(화합물 24);

또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염.

본 발명에 따른 화학식 (I) 화합물은 2개의 키랄 중심(chiral centre)을 포함한다. 본 발명은 모든 광학이성질체 및 부분입체이성질체 뿐만 아니라 임의의 비율로 그의 혼합물을 포함한다. 본 발명은 또한 분리된 광학이성질체 또는 광학이성질체의 쌍으로 확장한다. 광학이성질체 및 부분입체이성질체를 분리하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

화학식 (I) 화합물에서 헤테로사이클릭 환의 아릴 치환기는 서로에 대해 시스(cis) 또는 트랜스(trans)일 수 있다는 것은 당업자들에게 분명할 것이다.

본 발명의 특정 구현 예가 관계하는 화합물은 하기와 같다:

화합물 1 (그의 cis-이성질체 포함)

또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염; 및

화합물 10

또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염.

"알킬"이라는 용어는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 2차부틸, 3차부틸, 펜틸 등과 같은 1 내지 6개의 탄소 원자의 직쇄(straight chain) 및 분지쇄(branched chain) 포화 알킬 그룹을 포함한다. 알킬 그룹은 보다 바람직하게 1 내지 4개의 탄소 원자, 특히 메틸, 에틸, 프로필, 또는 이소프로필를 포함한다.

사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실등의 C₁ _-6 사이클로알킬을 포함한다.

알킬 그룹 또는 사이클로알킬 그룹은 하나 또는 그 이상의 불소, 염소, 브롬, 요오드, 카르복실, C₁-C₄-알콕시카르보닐, C₁-C₄-알킬아미노-카르보닐, 디-(C₁-C₄-알킬)-아미노-카르보닐, 하이드록실, C₁-C₄-알콕시, 포르밀옥시, C₁-C₄-알킬-카르보닐옥시, C₁-C₄-알킬티오, C₃-C₆-사이클로알킬 또는 페닐에 의해서 임의로 치환될 수 있다. 상기 알킬 그룹은 임의의 치환기를 포함할 수 없다.

"아릴"이라는 용어는 페닐, 벤질, 비페닐 및 나프틸을 포함하고 또한 하나 또는 그 이상의 C₁-C₄-알킬, 하이드록시, C₁-C₄-알콕시, 카르보닐, C₁-C₄-알콕시카르보닐, C₁-C₄-알킬카르보닐옥시, 니트로 또는 할로에 의해 임의로 치환된다.

"할로"라는 용어는 불소, 염소, 브롬 및 요오드, 바람직하게는 불소 및 염소, 더욱 바람직하게는 불소를 포함한다. 예를 들어, "할로알킬"에 대한 언급은 모노할로겐화(monohalogenated), 디할로겐화(dihalogenated) 및 퍼할로겐화(perhalogenated) 알킬 그룹까지 포함한다. 바람직한 할로알킬 그룹은 트리플루오로메틸 및 펜타플루오로에틸이다.

본 발명의 화합물은 산 부가 염, 음이온성 염 및 쯔비터이온성(zwitterionic) 염과 같은 모든 염을 포함하고 특히, 당업자에게 잘 알려진 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 염은 아세트산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤조산, 벤젠설폰산, 구연산, 신남산, 에탄설폰산, 푸마르산, 글루탐산, 글루타르산, 글루콘산, 염산, 브롬화 수소산, 젖산, 말레산, 말산, 메탄설폰산, 나프토익산, 하이드록시나프토익산, 나프탈렌설폰산, 나프탈렌디설폰산, 나프탈렌아크릴산, 올레산, 옥살산, 옥살로아세트산, 인산, 피루브산, p-톨루엔설폰산, 주석산, 트리플루오로아세트산, 트리페닐아세트산, 트리카르발릴산, 살리실산, 황산, 설팜산, 설판닐산 및 숙신산으로부터 형성된 염을 포함한다.

약제학적으로 허용가능한 유도체는 용매 화합물, 약제학적으로 활성이 있는 에스테르, 프로드러그 등을 포함한다. 이것은 또한 in vivo에서 절단되어 본 발명의 화합물 또는 그들의 활성 부위를 제공할 수 있는 생리학적으로 절단 가능한 이탈 그룹을 가진 유도체를 포함한다. 이탈 그룹은 아실, 인산염, 황산염, 설폰산염을 포함할 수 있으며 바람직하게는 모노-, 디-, 퍼-아실 옥시- 치환된 화합물이고, 여기서 하나 또는 그 이상의 펜단트 하이드록시 그룹(pendant hydroxy group)은 아실 그룹 바람직하게는 아세틸 그룹에 의해 보호된다. 전형적으로 본 발명의 아실옥시 치환된 화합물은 해당 하이드록시 치환 화합물로 쉽게 절단할 수 있다.

본 발명이 관계하는 화학식 I의 화합물은 정상세포를 가지고 바람직한 독성 프로파일 및 양호한 생체 이용율을 갖는 것으로 믿어진다. 이들 화합물은 국제 특허 출원 PCT/AU2005/001435(WO 2006/032085호로 공개) 및 PCT/AU2005/001436 (WO 2006/032086호로 공개)에 기술되어 있고 이의 기술내용은 여기에 참고로 포함된다.

mTOR(라파마이신의 포유동물 타겟)은 세포 성장 및 증식의 조절, 세포 생존, 세포 운동성 및 단백질 합성에 관여하는 세린/트레오닌 단백질 키나제이다(참조 Hay 및 Sonenberg, 2004). mTOR의 중요한 기능은 S6k 및 4EBP1 조정을 통한 번역(translation)의 조절이다. 상기 경로가 활성화되면 번역 증대, 세포 물질 증강, 세포 주기의 진행이 이루어진다. mTOR은 또한 증식, 항세포사멸 및 혈관형성을 통합할 수 있는 종양 진행의 필수적인 부분이다. 재협착증, 이식 거부 및 류마티스 관절염을 포함하는 다양한 질병 또는 증상을 치료하기 위해 사이로리무스 및 더욱 최근에는 사이로리무스 유사체인 템사이로리무스 및 에버로리무스로 예시되는 mTOR 저해제의 치료학적 적용에 관심이 증가하고 있다.

본 발명의 구현 예는 비정상적인 또는 원치 않는 세포 성장 및/또는 증식과 연관된 질병 및 증상 및 mTOR 활성 저해가 유익한 질병 및 증상의 치료 또는 예방에 특별한 적용을 발견한다. 비정상적인 또는 원치 않는 세포 성장 및/또는 증식과 연관된 질병 및 증상으로 여기서 사용되는 "연관된"이라는 용어는 질병 또는 증상이 비정상적인 세포 증식에 의해 일어날 수 있으며, 질병 또는 증상이 비정상적인 세포 증식을 일으킬 수 있으며 또는 연관될 수 있음을 의미한다. 비정상적인 세포 증식은 임의의 세포 타입에서 일어날 수 있으며 예를 들어, 심근세포 또는 면역세포를 포함한다(전형적으로 증식하는 또는 비정상적으로 증식하는 T 세포). 바람직하게는 세포는 암세포가 아니다.

따라서, 본 발명의 구현 예가 적용가능성을 빌견하는 적합한 질병 및 증상은 협착증, 재협착증, 이식 거부 및 류마티스 관절염 및 비정상적인 면역 세포 증식 또는 활성화와 연관된 질병 및 증상을 포함하나 여기에 제한적인 것은 아니다. 예를 들어, 이소플라보노이드 화합물은 임상학적으로 중대한 재협착증을 야기하는 비정상적인 증식 반응을 감소 또는 제거하기 위한 수단으로서 심장 또는 혈관 성형술과 같은 혈관 중재술 전 및 후에 곧바로 투여될 수 있다.

이식 거부는 임의의 조직 또는 기관일 수 있다. 당업자들은 광범위한 질병 및 증상이 비정상적 또는 원치 않는 세포 성장 및/또는 증식과 연관되어 있음을 인식할 것이고 또한 본 발명은 임의의 그러한 질병 또는 증상의 치료에 적용가능함을발견한다.

본 발명의 구현 예는 세포 사멸을 유도하여 면역세포 증식을 저해하는데 적용되고 따라서 비정상적인 면역 세포 특히, T 세포의 증식 또는 자극에 연관된 질병 및 증상을 치료 및 예방하는데 적용된다. 전형적으로, 본 발명의 설명에서 비정상적인 T 세포 증식은 비정상으로 빠른 증식을 의미한다. 제한적이지 않는 예로서, 질병 및 증상은 T 세포 백혈병, 자가 면역 질환, 및 이식편대숙주병과 같은 이식 거부를 포함한다. 자가 면역 질환은 간경변, 건선, 루푸스, 류마티스 관절염, 에디슨 질병, 전염성 단핵세포증, 세자리 증후군 및 엡스타인 바 바이러스 감염을 포함하나 여기에 제한적이지는 않다. 당업자들은 광범위한 질병 및 증상이 비정상적인 T 세포 분열과 연관되어 있음을 인식할 것이며 또한 본 발명은 임의의 그러한 질병 또는 증상의 치료에 적용가능함을 발견한다.

여기에 기술된 화합물은 비정상 또는 원치 않는 세포 성장 및/또는 증식과 연관된 질병 및 증상 및 mTOR 활성 저해가 유익한 질병 및 증상을 치료하기 위해 단독으로 투여되거나 또는 다른 활성제와 연합으로 투여될 수 있다. 일 예로서, 재협착증의 치료를 위해, 본 발명의 화합물은 사이로리무스, 템사이로리무스 또는 에버로리무스와 같은 다른 mTOR 저해제와 함께 투여될 수 있다. 그러한 조합 치료법이 투여되는 경우에 활성제는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.

비정상적 또는 원치 않는 세포 성장 및/또는 증식과 연관된 질병 또는 증상으로부터 고생하는 개체를 위한 현재 치료 계획을 강화하는 방법이 여기에 제공되며, 상기 방법은 여기에 기술된 바와 같은 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드러그의 유효량을 필요로 하는 개체에게 투여함을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 여기에 기술된 화합물은 증식하는 T 세포 활성 및/또는 증식의 감소가 유익하고 광범위한 질병 및 증상을 위한 현재 치료학적 치료와 연합으로 사용될 수 있다. 즉, 여기에 기술된 화합물의 면역 조절 유효량의 투여는 환자에 의해 고통받는 질병 또는 증상을 위한 현존하는 치료에 반응하는 환자의 능력을 향상시킨다.

"면역 조절 유효량"이란 어구는 필요시 면역 체계 또는 면역 반응을 조절하는데 충분한 화합물의 양 또는 투약량을 의미한다. 이러한 면역 조절 유효량은 화합물의 하위(sub)치료학적 투약량일 수 있으며 여기서 치료학적 투약량은 특정 질병 또는 증상에 대해 비면역 조절적이고 치료학적인 효과를 갖는 충분한 투약량이다. 즉, 비면역 조절 치료 효과를 달성하기 위해 투여하는데 필요한 양 또는 투약량보다도 화합물의 더 적은 양 또는 투약량은 면역 조절 효과를 달성하기 위해 투여될 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 이소플라보노이드 화합물 및 그러한 이소플라보노이드를 포함하는 조성물은 임의의 적합한 경로로서 전신, 국부 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 임의의 주어진 환경에서 사용되는 특수한 투여 경로는 치료되는 증상의 성질, 증상의 중증도 및 정도, 전송되는 특정 화합물의 필요한 투여량 및 화합물의 잠재적 부작용을 포함하는 다수의 인자에 의존한다. 예를 들어, 치료되는 체내의 부위에 직접적으로 원하는 화합물의 적합한 농도가 전달되는 경우, 투여는 전신이라기보다는 국부적일 수 있다. 국부적 투여는 원하는 화합물의 높은 국소 농도를 필요한 부위에 전달할 수 있는 능력을 제공하며 따라서 체내의 다른 기관에 상기 화합물을 노출시키지 않아 부작용을 감소시키면서 원하는 치료학적 또는 예방적인 효과를 달성하는데 적합하다.

일 예로서, 본 발명의 구현 예에 따른 투여는 강내, 방광, 근육내, 동맥내, 정맥내, 안내, 피하, 국부 또는 경구를 포함하는 임의의 표준 경로를 통해 이룰 수 있다.

본 발명의 특정 구현 예에 따르면, 이소플라보노이드 화합물 및 그러한 이소플라보노이드를 포함하는 조성물은 투여를 위해 이식가능한 의료기기에 포함될 수 있다. 특히 스텐트 및 카테터는 환자의 혈관 예를 들어, 관상동맥, 담도, 식도, 결장, 또는 기관지, 수뇨관 및 요도와 같은 체 내강에 이식되도록 적용될 수 있다. 스텐트는 특히 동맥경화 협착증 및 동맥류의 치료에 유용하다.

스텐트는 전형적으로 혈관이나 내강 내에 수축된 상태로 이식되고 혈관을 통해 액체가 흐르도록 하기 위한 혈관의 개방을 유지하기 위해 혈관에서 확장될 수 있다. 스텐트는 필요로 하는 힘을 제공하기 위해 금속 구조체와 같은 지지 구조를 가지고 있고 생물학적으로 호환가능하고 및/또는 혈액적으로 호환가능한 표면을 제공하기 위해 외부표면 코팅이 종종 제공된다. 코팅은 통상적으로 중합체 물질이며 또한 주위의 혈관 또는 그의 하류에 작용하기 위해서 특정 혈관내 부위에 방출되는 약제학적으로 활성이 있는 제제로 장전되어 있다.

약물-용출 스텐트는 관상 동맥 질병을 치료하는데, 특히 동맥경화에 의한 협착된 동맥에서 혈류를 다시 열어 복구하는 관점에서 전망이 밝다. 경피적 중재술 동안 약물-용출 스텐트를 사용한 후의 재협착 속도는 베어 금속 스텐팅(bare metal stenting) 및 풍선 혈관성형술과 비교하여 현저히 낮다.

당해 분야의 통상의 기술자들에게 인식되는 바와 같이, 본 발명에 따라 사용된 약물-용출 스텐트는 실질적으로 임의의 타입일 수 있다. 약물-용출 스텐트는 스테인레스 스틸, 백금, 티탄, 탄탈륨, 니켈-티타늄, 코발트-크롬 및 그의 합금과 같은 적어도 의료등급 금속 물질의 일부로서 형성될 수 있다. 스텐트는 또한 생흡수되는 물질로 제조될 수 있다. 전형적으로 이들 스텐트는 금속과 같은 스캐폴딩을 갖는 재흡수될 수 있는 구조이고 일반적으로 표준 풍선 전개를 사용하며, 및 약물로 장전될 수 있다. 생흡수되는 스텐트를 만드는 물질의 예는 폴리락트산(PLA), 생분해성, 열가소성의, 지방족 폴리에스테르, 또는 폴리락트-코-글리콜릭산(PLGA), 생분해성 생체 적합성 공중합체 또는 마그네슘이다.

활성제는 약물-방출 플랫폼을 제공하는 임의의 도구에 의해 이식가능한 의료기기에 부착될 수 있다. 결합은 공유결합, 이온결합, 또는 수소 결합 및 반 데르 왈스 힘을 포함한 다른 분자 간 작용을 통해 이루어질 수 있다. 코팅 방법은 침전, 코아세르베이션 및 결정화를 포함하지만 여기에 제한적이지는 않다. 더욱 전형적으로, 활성제는 적합한 생체적합성 중합체와 복합된다. 이어서 중합체-약물 복합체는 예비 성형전 의료 기기 내로 통합된 서방성 의료기기를 형성하는데 사용되거나 또는 당업자에게 잘 알려진 바와 같은 의료기기를 코팅하는데 사용하는데 사용된다. 코팅물은 용액 중합체/용매 매트릭스로서 적용될 수 있다. 액체 코팅물은 패드 인쇄, 인크젯 인쇄, 로울링, 스프레이, 마이크로-스프레이, 담그기, 닦음, 정전기 침강, 기상 증착, 에피택셜 성장, 그의 조합에 의해 적용될 수 있고 또한 활성제로 조절되는 약물 방출을 달성하기 위한 다른 방법은 본 발명의 일부인 것으로 고려된다.

이식가능한 의료기기를 코팅하는데 사용되는 적합한 중합체의 예는 폴리(에틸렌-코-비닐 알코올) (EVAL), 폴리(N-비닐피롤리돈) (PVP), 에틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트 , 카르복시메틸 셀룰로오스, 셀룰로오직스, 키틴, 키토산, 폴리(비닐 알코올), 헤파린, 덱스트란, 덱스트린, 덱스트란 설페이트, 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 콘드로이탄 설페이트, 글리코스아미노글리칸스, 폴리[(2-하이드록시에틸)메틸메타크릴레이트], 폴리우레탄, 폴리(에테르 우레탄), 폴리(에스테르 우레탄), 폴리(카르보네이트 우레탄), 열가소성 폴리에스테르, 용매 용해성 나일론, 폴리(아크릴아미드), 폴리(아크릴릭 산), 아크릴 산과 아크릴레이트의 공중합체, 폴리(메타크릴 산), 메타크릴 산과 메타크릴레이트의 공중합체 및 그의 혼합물을 포함한다.

당업자들은 의료 기기 코팅물의 형성에서 다른 중합체가 다른 용매에 보다 더 적합하다는 것을 인식할 것이다. 적합한 용매의 예는 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄, DMAC, DMSO 1, DMF 1, THF, 포름아미드, N-메틸-2-피롤리돈 (NMP), 설포란, 벤질 알코올, 사이클로헥사놀, 페놀, 포름산, m-크레졸, p-크레졸, 트리플루오로아세트 산, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 프로판올 및 그의 혼합물을 포함한다. 활성제는 또한 중합체/용매 혼합물에 적절히 용해 또는 분산되어야 하고 또한 코팅 프로세스 중에 그의 활성을 보유하여야 한다. 상기 중합체는 당업계에 알려진 침지, 스프레이, 닦음 및, 브러쉬와 같은 통상적인 금속-중합체 접합 기술을 사용하여 스텐트에 접합 될 수 있다. 이들 공정은 웹 클리어링 조작(web clearing operation)을 수반할 수 있으며, 이는 증발, 가열 및 코팅물 감압 처리를 비롯한 에어 블로우잉(air blowing), 또는 스피닝(spinning) 및 건조 조작을 포함하여 용매를 제거하고 약물 함유 중합체를 고정할 수 있다. 중합체 코팅물은 두께가 약 1 마이크론 내지 약 10 마이크론 또는 그 이상의 범위를 가질 수 있으며, 프라이머 코팅물 및 보호 막 코팅물을 포함하는 하나의 코팅물은 바람직할 수 있다.

활성제의 장전은 전형적으로 약물-중합체 막을 제조하기 위해 사용되는 제형의 전체 질량의 약 0.1 내지 약 10 질량 %이다. 약물은 환자에 대해 또는 약물 전달을 증가시키는데 사용하기 위해 치료학적 또는 예방학적 효과를 나타낼 수 있는 부가적인 물질을 보존제, 안정제 등으로서 포함할 수 있다.

스텐트에 공동 적용하기에 적합한 치료학적 약물은 파클리탁셀, 라파마이아신, 항트롬빈을 포함하는 항증식제, 사이로리무스, 항지질제, 항염증제, 항종양제, 항혈소판제제, 혈관생성 인자, 항혈관생성 인자, 비타민, 항분열제, 메탈로프로테인나제 저해제, NO 공여체, 에스트라디올, 항경화제, 및 혈관활성물질, 내피세포 성장인자, 에스트로겐, 베타 차단제, AZ 차단제, 호르몬, 스타틴, 인슐린 성장인자, 항산화제, 막 안정화제제, 칼슘 길항제, 레테노이드, 비발리루딘, 페녹소디올, 에토포시드, 티클로피딘, 디피리다몰 및 트라피딜 또는 여기에 언급된 치료학적 제제와의 조합으로 하는 것을 포함하는 면역 억제제를 포함하나 여기에 제한적이지는 않다.

치료학적 제제는 또한 몇가지 예를 제외하고 열거하자면 또한 펩티드, 지질단백질, 폴리펩티드, 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 지질, 단백질-약물, 단백질 결합 약물, 효소, 올리고뉴클레오티드 및 그들의 유도체, 리보자임, 다른 유전 물질, 세포, 안티센스, 올리고뉴클레오티드, 단일클론항체, 혈소판, 프라이온, 바이러스, 박테리아, 및 내피 세포, 줄기세포, ACE 저해제, 단핵구/대식세포 또는 혈관 평활근 세포와 같은 진핵 세포를 포함한다. 치료학적 제제는 또한 숙주로 투여되었을 때 원하는 약물로 대사되는 프로-드러그일 수 있다. 그 외에 치료학적 제제는 그들이 치료학적 막에 혼입되기 전에 마이크로캡슐, 마이크로스피어, 마이크로버블, 리포좀, 니오좀, 유제, 분산제등으로서 예비-제형화될 수 있다. 치료학적 제제는 또한 방사성 동위원소 또는 빛 또는 초음파 에너지등의 다른 형태의 에너지에 의해 또는 전신으로 투여될 수 있는 다른 순환하는 분자에 의해 활성화되는 제제일 수 있다. 치료학적 제제는 혈관형성, 재협착증, 세포 증식, 혈전증, 혈소판 응집, 응고 및 혈관확장을 조절하는 것을 포함하는 복수의 기능을 수행할 수 있다. 항염증제는 아릴 아세트산 유도체, 예를 들어, 디클로페낙, 아릴 프로피온산 유도체, 예를 들어, 나프록센 및 살리실산 유조체, 예를 들어, 아스피린 및 디프루니살과 같은 비스테로이드 항염증제(NSAID)를 포함한다. 항염증제는 또한 덱사메타손, 프레드니솔론 및 트리암시놀론과 같은 글루코코티코이드(스테로이드)를 포함한다. 항염증제는 항증식제에 대한 조직의 반응을 완화시키기 위해 항증식제와 조합하여 사용될 수 있다.

여기에 기술된 약물-용출 스텐트 및 카테터는 신경학적, 경동맥, 심장, 신장, 대동맥, 장골, 대퇴부, 또는 다른 말초의 맥관 구조를 포함하는 맥관 구조의 임의의 부분으로 사용될 수 있다. 스텐트는 활성제를 이식 부위 또는 부위의 하류로 전달할 수 있다.

약물-용출 스텐트는 독립적으로 생성된 복수 개의 막을 가질 수 있고 따라서 개개의 화학적 조성물 및 약동학적 성질이 각 막에 부여될 수 있다. 각각의 막은 막으로부터 막까지에서 같거나 또는 다른 비율로 하나 또는 그 이상의 약제를 포함할 수 있다. 막 간의 약제 농도 변화는 원하는 전달 프로파일을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 약 24시간 동안 약물의 감소되는 방출이 이루어질 수 있다. 다른 실시 예에서, 초반 폭발(burst) 이 후에 약 일 주일간의 일정 방출이 이루어질 수 있다. 다른 실시 예는 몇 칠 내지 몇 달과 같은 지속적인 기간에 걸쳐 약제를 전달할 수 있다. 몇 시간 내지 몇 달에 걸친 기간에 실질적으로 일정한 배출 속도가 이루어질 수 있다. 막은 고체이고 다공성이며, 다른 약물 또는 부형제 등으로 충진할 수 있다.

본 발명의 사용함에 있어서, 이소플라보노이드 화합물은 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 적합한 조성물은 당업자들에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있고 또한 약제학적으로 허용가능한 희석제, 보조제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 희석제, 보조제 및 부형제는 조성물의 다른 성분과 상용성이 있다는 관점에서 "허용가능"해야하고 약물 수령자에게 해로워서는 안 된다. 희석제, 보조제 또는 부형제는 고체 또는 액체 또는 둘 다 일 수 있고, 단위 투약량, 예를 들어, 활성 화합물의 0.5 내지 59 중량 % 또는 활성 물질의 100중량 % 이하를 포함할 수 있는 정제로서 화합물과 제형화될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 활성 화합물은 본 발명의 제형에 혼입될 수 있으며 상기 제형은 구성분들을 혼합하고 선택적으로 하나 또는 그 이상의 보조 성분들을 포함하는 것으로 필수적으로 이루어진 잘 알려진 약학 기술의 어느 것으로 제조될 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 희석제의 예는 탈염수 또는 증류수; 식염수; 식물성 기반 오일, 예를 들어 땅콩 오일, 홍화유, 올리브 오일, 목화씨 오일, 옥수수 오일, 예를 들어, 참깨 오일, 땅콩오일(peanut oil), 홍화유, 올리브 오일, 목화씨 오일, 옥수수 오일, 참깨 오일, 땅콩오일(arachis oil) 또는 코코넛 오일; 폴리실록산을 포함하는 실리콘 오일, 예를 들어, 메틸 폴리실록산, 페닐 폴리실록산 및 메틸페닐 폴리솔폭산; 휘발성 실리콘; 광물성 오일, 예를 들어 액체 파라핀, 연성 파라핀 또는 스쿠알렌; 셀룰로오스 유도체, 예를 들어 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로오스; 저급 알카놀, 예를 들어 에탄올 또는 이소-프로판올; 저급 아랄카놀; 저급 폴리알킬렌 글리콜 또는 저급 알킬렌 글리콜, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜 또는 글리세린; 지방산 에스테르, 예를 들어 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 미리스테이트 또는 에틸 올리에이트; 폴리비닐피리돈; 한천; 카라기닌; 검 트래거캔스 또는 검 아카시아 및 석유젤리이다. 전형적으로 담체 또는 담체들은 조성물의 1 내지 99.9 중량 %를 형성한다.

경구 투여에 적합한 제형은 캡슐, 향낭(sachets), 로렌지(lozenge), 또는 정제(tablet)과 같은 분리된 단위로 나타낼 수 있으며 각 단위는 활성 화합물의 소정 양의 활성화합물을 함유하며; 분말 또는 과립으로서; 수성 또는 비수성 액체중의 용액 또는 현탁액으로; 오일-인-워터 또는 워터-인-오일 유제로서 포함한다. 그러한 제형은 활성 화합물 및 적합한 담체(상기에 언급된 바와 같이 하나 또는 그 이상의 보조 성분을 포함)를 연합하는 단계를 포함하는 임의의 적절한 약학 방법으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 제형은 활성 혼합물을 액체 또는 미세하게 나뉘어진 고체 담체 또는 이들 둘과 균일하고 친밀하게 혼합하여 제조된다. 이어서 필요하다면 수득된 혼합물을 성형하여 단위 투약량을 형성하도록 한다. 예를 들어, 정제는 활성 화합물을 함유하는 분말 또는 과립을 경우에 따라 하나 또는 그 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 주형하여 제조될 수 있다. 압축된 정제는 분말 또는 과립과 같은 자유롭게 유동하는 화합물을 선택적으로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 및/또는 계면활성제/분산제와 혼합하여 적합한 기계에서 압축하여 제조할 수 있다. 주형된 정제는 적합한 기계에서 불활성화된 액체 결합제에 적셔진 분말 화합물을 주형(moulding)함으로써 제조할 수 있다.

경구 투여를 위한 고체 형태는 인간 및 수의 약제학적 실시에서 허용가능한 결합제, 감미제, 붕괴제, 희석제, 향미료, 코팅제제, 보존제, 윤활제 및/또는 시간 지연제를 포함할 수 있다. 적합한 결합제는 검 아카시아, 젤라틴, 옥수수 전분, 검 트래거캔스, 소듐 알지네이트, 카르복시메틸셀룰로오스 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 적합한 감미제는 수크로오스, 락토오스, 글루코오스, 아스파탐 또는 사카린을 포함한다. 적합한 붕괴제는 옥수수 전분, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 구아검, 잔탄 검, 벤토나이트, 알긴산 또는 한천를 포함한다. 적합한 희석제는 락토오스, 소르비톨, 만니톨, 덱스트로오스, 카올린, 셀룰로오스, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 실리케이트, 또는 디칼슘 포스페이트를 포함한다. 적합한 향미료는 페퍼민트 오일, 노루발풀 오일, 체리, 오렌지 또는 나무 딸기 향미료를 포함한다. 적합한 코팅 제제는 아크릴산 및/또는 메타크릴산 및/또는 그들의 에스테르의 중합체 또는 공중합체, 왁스, 지방 알코올, 제인, 셸락 또는 글루텐을 포함한다. 적합한 보존제는 소듐 벤조에이트, 비타민 E, 알파-토코페롤, 아스코르브산, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 또는 소듐 비설파이트를 포함한다. 적합한 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 소듐 올리에니트, 염화 나트륨 또는 활석을 포함한다. 적합한 시간 지연제는 모노스테아린산 글리세린 또는 글리세린 디스테아레이트를 포함한다.

경구 투여의 액체 형태는 상기 제제뿐만 아니라 액체 담체를 포함할 수 있다. 적합한 액체담체는 물, 오일류, 예를 들어 올리브 오일, 땅콩오일, 참깨 오일, 해바라기 오일, 잇꽃 오일, 땅콩(arachis)오일, 코코넛 오일, 액체 파라핀, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 글리세롤, 지방 알코올, 트리글리세리드 또는 그의 혼합물을 포함한다.

설하 투여에 적합한 제형은 향미료 베이스 일반적으로 수크로오스 및 아카시아 또는 트라가칸스 중의 활성 화합물을 포함하는 로렌지; 및 불활성 베이스, 예를 들어 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로오스 및 아카시아를 포함한는 향정(pastilles)를 포함한다.

장관외 투여에 적합한 본 발명의 조성물은 전형적으로 편리하게는 활성 화합물의 멸균 수성 제제를 포함하고 여기서 제제는 계획된 투여자의 혈액과 등장성이다. 이들 제제는 또한 피하, 근육 내, 또는 피내주사에 의해 투여를 할 수 있지만 통상적으로 정맥 내로 투여된다. 그러한 제제는 화합물을 물 또는 글리신 완충제와 혼합하고 수득된 용액을 멸균화하고 피와 등장되게 만들어서 편리하게 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 주사가능한 제형은 일반적으로 활성 화합물의 0.1% 내지 60% w/v를 포함하고 또한 0.1 ml/분/kg의 속도로 또는 필요에 따라 투여된다.

예를 들어, 주입용 제형은 식염수를 담체 및 용해제, 예를 들어 사이클로덱스트린 또는 그의 유도체를 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 사이클로덱스트린은 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 디메틸-β-사이클로덱스트린, 2-하이드록시에틸-β-사이클로덱스트린, 2-하이드록시프로필-사이클로덱스트린, 3-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 및 트리-메틸-β-사이클로덱스트린을 포함한다. 보다 바람직하게는 사이클로덱스트린은 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린이다. 사이클로덱스트린의 적합한 유도체는 미국특허 제 5,134,127호에 기술된 바와 같은 사이클로덱스트린의 Captisola® 설포부틸 에테르 유도체 및 그의 유사체를 포함한다.

직장 투여에 적합한 제형은 전형적으로 단위 투약량 좌약으로 나타낸다. 이들은 활성 화합물을 하나 또는 그 이상의 통상적인 고체 담체, 예를 들어, 코코아 버터와 혼합한 다음 수득된 혼합물을 성형하여 제조될 수 있다.

피부에 국소 투여를 위해 적합한 제형 및 조성물은 연고, 크림, 페이스트, 젤, 스프레이, 에어로졸, 또는 오일의 형태를 취할 수 있다. 사용할 수 있는 담체는 바셀린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 알코올, 및 그의 둘 또는 그 이상의 조합을 포함한다. 활성 화합물은 일반적으로 0.1% 내지 0.5% w/w의 농도로 존재하고 예를 들어, 0.5% 내지 2% w/w로 존재한다. 그러한 조성물의 예는 화장품 피부 크림을 포함한다.

흡입을 위해 적합한 제형은 용액, 현탁액, 또는 유제의 형태로 스프레이 조성물로서 전달될 수 있다. 흡입 스프레이 조성물은 약제학적으로 허용가능한 추진제, 예를 들어 이산화탄소 또는 아산화질소 또는 수소 함유 플루오로카본 예를 들어, 압축은 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로-n-프로판 또는 그의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다.

경피성 투여를 위해 적합한 제형은 장기간동안 투여자의 표피와 밀접하게 접촉되도록 적용된 분리형 패치로서 나타낼 수 있다. 그러한 패치는 활성 화합물을 상기 활성 화합물에 대해서 예를 들어, 0.1 M 내지 0.2 M 농도의 임의의 완충된 수용액으로서 적절하게 포함한다. 경피성 투여를 위해 적합한 제형은 이온토포레시스(예를 들어, Pharmaceutical Research 3 (6), 318 (1986)참조)에 의해 전달될 수 있으며 또한 전형적으로 활성 화합물의 임의의 완충된 수용액의 형태를 취할 수있다. 예를 들어, 적합한 제형은 시트레이트 또는 비스/트리스 완충제 (pH 6) 또는 에탄올/물을 포함할 수 있으며 또한 0.1 M 내지 0.2 M의 활성 성분을 포함할 수 있다.

활성 화합물은 식품에 첨가된, 혼합된, 코팅된, 조합된, 또는 달리 첨가된 식품 형태로서 제공될 수 있다. 식품이라는 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되며 또한 유제품을 포함하는 음료수와 같은 액체 제형도 포함하고, 헬스바, 디저트등과 같은 다른 음식도 포함된다. 본 발명의 화합물을 포함하는 식품 제형은 표준 실시에 따라 쉽게 제조될 수 있다.

본 발명에 따르면, 화합물 및 조성물은 치료학적으로 또는 예방학적으로 투여될 수 있다. 치료학적 적용에서, 화합물 및 조성물은 이미 질병 또는 질환을 앓는 또는 증후군을 경험한 환자에게, 질병 또는 질환 증후군 및/또는 임의의 연관된 합병증을 치유 또는 적어도 부분적으로 억제하기에 충분한 양으로 투여된다. 화합물 또는 조성물은 환자를 효과적으로 치료하기에 충분한 활성 화합물의 양을 제공한다.

임의의 특정 개체에 대한 투여된 화합물의 효과적인 투약량 수준은 치료될 증상의 타입, 증상의 단계, 사용된 화합물의 활성, 사용된 조성물, 나이, 몸무게, 일반적인 건강, 성별 및 환자의 음식, 투여시간, 투여의 경로, 화합물 제거의 속도, 치료 기간, 치료에 조합적으로 또는 동시에 사용된 약물, 의학에서 잘 알려진 다른 관계된 인자를 포함하는 다양한 인자에 의존한다.

당업자는 일반적인 실험을 통해 적용가능한 증상을 치료하기 위해 필요한 효과적이고 비독성적인 투여량을 결정할 수 있다. 이들은 종종 그때그때 경우에 따라 결정될 수 있을 것이다. 일 예로서, 유효량은 24 시간당 몸무게 kg당 약 0.0001 mg 내지 약 1OOOmg; 전형적으로는 24 시간당 몸무게 kg당 약 0.001 mg 내지 약 75Omg; 24 시간당 몸무게 kg당 약 0.01 mg 내지 약 50Omg; 24 시간당 몸무게 kg당 약 0.1 mg 내지 약 50Omg; 24 시간당 몸무게 kg당 약 0.1 mg 내지 약 25Omg; 또는 24 시간당 몸무게 kg당 약 1.0 mg 내지 약 25Omg 범위에 있는 것으로 예측될 수 있다. 보다 전형적으로는, 유효 투약량 범위는 24 시간당 몸무게 kg당 약 10 mg 내지 약 20Omg 범위에 있는 것으로 예측된다.

또한, 개체 투여량의 최적 양과 복용 간격은 치료되는 증상의 성질 및 정도, 투여의 형태, 경로 및 부위, 및 치료되는 개체에 의해 주로 결정될 것임이 당업자들에게는 자명할 것이다. 적합한 조건은 통상적인 기술에 의해 결정될 수 있다.

또한 정의된 일수 동안 일당 주어진 조성물의 투여량 수와 같은 최적화된 치료 코스는 기존의 치료 결정 테스트의 코스를 사용하여 당업자들에 의해 확인될 수 있다는 것이 당업자들에게는 자명할 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, 이소플라보노이드 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 유도체 프로드러그 또는 염은 원하는 작용을 손상하지 않는 다른 활성제와 함께 또는 항생제, 항진균제, 항염증제, 지질 감소제, 혈소판 응집 저해제, 항트롬보제, 칼슘 채널 차단제, 코르티코스테로이드, 항바이러스 화합물과 같은 원하는 작용을 보충하는 약제와 함께 공동 투여될 수 있다. 사용되는 특정 제제(들)는 다수의 인자에 의존적이며 또한 통상적으로 치료될 질병 또는 질환에 맞추어져 있다. 약제의 공동 투여는 동시적 또는 순차적으로 이루어질 수 있다. 동시 투여는 단일 조성물로 또는 동시 또는 유사한 시점에서 투여되는 분리된 조성물로 제형화된 화합물에 의해 수행할 수 있다. 순차적인 투여는 필요에 따라 임의의 순서일 수 있다.

본 명세서에서 임의의 선행 간행물(또는 그것으로부터 유래된 정보) 또는 알려진 임의의 물질에 대한 참조는 선행 간행물(또는 그것으로부터 유래된 정보) 또는 알려진 물질이 이 명세서가 관계하는 노력의 분야에서 상식적인 알반 지식의 일부를을 형성한다고 제안하는 인정 또는 허락 또는 임의의 형태로서 취급해서는 안 된다.

본 발명은 하기의 구체적 실시예를 참조하여 기술되며, 이들 예는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 비제한적인 실시예에 의거하여 기술될 것이다.
도 1. (A) EOC 세포를 24시간 동안 화합물 1의 증가되는 농도로 처리하였고 세포 생존능을 여기에 기술된 바와 같이 결정하였다. 도시된 결과는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. (B) 비처리된 대조군 세포 및 24시간 동안 화합물 1(10 g/ml)로 처리된 세포를 Hoechst 및 PI로 염색하였고 유세포 분석기에 의해 분석하였다. (C) 카스파제 활성을 24시간 동안 화합물 1의 증가되는 농도로 처리된 세포 또는 2μM 파클리탁셀로 처리된 세포로부터 얻어진 세포 용해물에서 측정하였다.
도 2. EOC 세포를 표시된 시간 동안 10 g/ml 화합물 1에 의해 처리한 후 전체 세포 용해물을 (A) XIAP에 대해 (B)인산화된-Akt (p-Akt)에 대해 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. β-actin 및 Akt 블랏은 고른 로딩을 증명하였다. (C) 세포를 Z-VAD-FMK (20 μM) 또는 3-MA (10 μM)의 존재 또는 부재하에서 화합물 1의 증가하는 농도에서 처리하였다. 이들 데이터는 분석된 모든 EOC 세포주로부터 얻은 결과의 대표이다.
도 3. EOC 세포를 표시된 시간 동안 10 g/ml 화합물 1에 의해 처리한 후 전체 세포 용해물을 (A) phospho-mTOR 및 pS6k에 대해 (B)LC3-II에 대해 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. (C) 여기에 기술된 바와 같은, 8 인산화-단백질의 레벨, β-액틴, mTOR, 및 S6k의 블랏이 균일한 로딩(loading)을 증명하였다.
도 4. 2시간 동안 10 g/ml 화합물 1로 (A)비처리된 또는 (B)처리된 EOC 세포의 공초점 현미경 사진. B에 세포내 액포(vacoules)의 존재 및 A(빨간 화살표)에는 존재하지 않음을 주의하라. JC-1로 염색된 세포의 공초점 현미경 사진; 2시간 동안 10 μg/ml 화합물 1로 (C)비처리 또는 (D)처리한 세포 사진. 처리되지 않은 세포에서 적색 염색을 강조하는 둥근 화살표 포인트; 몇몇 미토콘드리아 탈분극을 지닌 세포에 대한 다이아몬드-끝 화살표 포인트; 대다수의 미토콘드리아가 탈분극한다는 것을 제시하는 밝은 녹색 형광을 지닌 세포에 대한 화살표 머리 포인트.
도 5. EOC 세포를 10 μg/ml 화합물 1으로 (A)1시간 처리 및 (B)4시간 처리한 후 JC-1로 염색하여 유세포 분석기로 분석하였다. 결과는 대표적인 세포주로부터 얻었다. 유사한 결과가 다른 세포주에서도 얻었다.
도 6. (A) 10 μg/ml 화합물 1으로 처리한 EOC 세포로부터 제조된 미토콘드리아 분획과 세포 용해물의 웨스턴 블랏 분석. 전체 세포 용해물을 전체 길이 Bid에 대해 분석하였고 미토콘드리아 분획은 Beclin-1 및 Bax에 대해서 분석하였다. β-actin 및 VDAC는 로딩 대조군이다. (B) 화합물 1 (10 μg/ml, 1h)로 처리한 EOC 세포의 미토콘드리아 분획으로부터 항-Bcl-2 및 항-Bak으로 탐침된 유래된 항-Beclin 면역침전물.
도 7. EOC 세포를 표시된 시간 동안 화합물 1 (10 μg/ml)로 처리하였고 여기에 기술된 바와 같이 핵 추출물을 제조하였다. AIF 및 EndoG의 레벨을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 토포이소머라제 I(Topo-I)는 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 8. EOC 종양을 NCR 누드 마우스에서 확립하였다. 여기에 기술된 바와 같이 치료를 실시하였다. 종양크기는 캘리퍼스 측정으로 결정하였다. (A) EOC 종양 증식 동역학 및 (B) 비히클 대조군, 파클리탁셀, 카르보플라틴, 또는 화합물 1이 투여된 마우스로부터의 최종 종양 질량; (C) 비히클 또는 화합물 1 (50 또는 100 444 mg/kg)으로 투여된 대표 마우스로부터의 절단된 종양; (D) 대표 마우스로부터의 종양을 용해하여 포스포-S6 키나아제 (p-S6K) 및 전체 S6 키나아제 (S6K)에 대해 웨스턴 블랏으로 분석하였다. (E) 마우스 종양의 파라핀-포매 섹션을 IHC로 Endo의 위치를 분석하였다. 비히클에 대해 * p = 0.02.
도 9. FACS 분석으로 측정된 췌장샘암종에서 카스파제 저해제 I (z-VAD-fmk)의 화합물 10-유도 세포사멸 및 괴사에 대한 효과. A. HPAC, B. MIAPaCa- 2. 세포는 10 μM 화합물 10 첨가 전에 10 μM z-VAD-fmk와 선-항온처리하였다. 42-46시간 후에, 세포를 수확하여 FACS 분석으로 세포사멸을 검사하였다. 양성 카스파제-의존성 대조군으로서, HPAC 세포는 Fas-활성 항체 (CH-11, Upstate)로 퍼리하였으며 MIAPaCa-2 세포는 50 ng/mL TRAIL (Alexis)에 노출시켰다. 각 스펙트럼에서 10,000개의 게이트화된 이벤트를 기록하였고 분석하였다. 모든 실험은 3번 실시하였으며 에러 바(error bar)가 하나의 표준 편차를 나타냈다.
도 10. FACS 분석으로 측정된 췌장암 세포에서의 인시투(In Situ) 카스파제 활성도. (A) 화합물 10을 처리한(10 μM, 24 hr) 및 처리하지 않은 MIAPaCa-2 세포에서 카스파제-2, -3 및 -9 활성도의 히스토그램; (B) 화합물 10을 처리한(10 μM, 24 hr) 및 처리하지 않은 HPAC 세포에서 카스파제-2, -3 및 -9 활성도의 히스토그램. (C) 화합물 10을 처리한(10 μM, 24 hr) 및 처리하지 않은 PANC-1 세포에서 카스파제-2, -3 및 -9 활성도의 히스토그램. 모든 실험은 3번 실시하였으며 에러 바가 하나의 표준 편차를 나타냈다.
도 11. 세포사멸에 핵심적인 중요 조절 단백질 및 p21 및 p53 의 웨스턴 블랏 분석. (A) MIAPaCa-2 세포에서 카스파제 2, 카스파제 9, XIAP, Bcl-2, Bid 및 MIAPaCa-2 및 HPAC 세포에서 Akt의 웨스턴 블랏 분석. (B) MIAPaCa-2 및 HPAC 세포에서 p21 및 p53 발현의 웨스턴 블랏 분석. 두 개의 데이터에서 세포를 0, 4, 8, 16, 24 및 48 시간 동안 10 μM 화합물 10에 처리하였다. 세포는 용해되어 제조물이 원심분리되어 용해물이 수거되었다. 각 시간 포인트로부터 각 세포 용해물(25 μg) 샘플을 SDS-PAGE로 분리하였고 PVDF 멤브레인에 옮겨 타겟 항원에 특이적인 항체로 탐침하였다. 단백질 로딩은 GAPDH에 대해 표준화하였고 보여진 GAPDH 데이터는 반복된 연구의 대표값이다(RDI). (C) 48 시간 동안 화합물 10 (5 and 10μg/ml)로 처리된 PANC-1 세로로부터 방출된 사이토크롬 c의 웨스턴 블랏 분석. 웨스턴 블랏 분석 전에 평행된 실험를 세포내 및 미토콘드리아 분획이 분리된 곳에서 수행하였다. 세포 내 및 미토콘드리아 제조물의 완전성을 보여주기 위해 Cox-4를 포함하였고 단백질 로딩은 β-actin에 대해서 표준화하였다.
도 12. HPAC 및 MIAPaCa-2 세포에서 화합물 10의 미토콘드리아 막 전위에 대한 효과. MIAPaCa-2 세포를 48 시간 동안 0 μM (A), 또는 100 μM (B) 화합물 10에 노출하였다. 온전하고 분극화된 미토콘드리아로부터의 응집된 JC-1 적색 형광은 Y 축에 나타냈고, 탈분극화된 미토콘드리아를 지닌 세포사멸된 세포로부터의 단량체의 JC-1 녹색 형광은 X축에 나타났다. 왼쪽 상단의 4분면은 분극화된 세포로 정의하였다. 오른쪽 상단 및 오른쪽 하단 4 분면의 합은 탈분극화된 세포로 정의하였다. 각 스펙트럼에서, 10,000 개의 게이트화된 이벤트를 기록하고 분석하였다. 화합물 10의 증가하는 농도에 걸쳐 미토콘드리아 막 전위를 HPAC (C) 또는 MIAPaCa-2 (D)에서 측정하였다. 모든 실험은 3번 실시되었다.
도 13. MIAPaCa-2, HPAC 및 PANC-1 세포에서 화합물 10의 세포 주기 진행에 대한 효과. (A) 화합물 10을 처리하지 않은 및 처리한 (10μM, 4hr 및 24 hr) MIAPaCa-2 세포, HPAC 세포 및 PANC-1 세포의 대표적 FACS 히스토그램. 게이트: M1 = sub-G0/Gi, M2 = Go/Gi, M3 = S, M4 = G2/M and M5 = 배수성 세포. 각 스펙트럼에서 10,000 개의 게이트화된 이벤트를 기록하고 분석하였다. 모든 실험은 3번 실시되었다; (B) 세포 주기 분포의 조합된 플롯. 0, 4, 24 및 48 시간 동안 세포를 10 μM 화합물 10에 노출하였다. 세포를 에탄올에 고정하고 요오드화 프로피디움으로 염색하고 FACS로 분석하였다. 모든 실험은 3번 실시되었다. 에러 바가 하나의 표준 편차를 나타냈다.

실시예

일반적인 방법

화합물 1 연구:

세포주 및 배양 조건. 확립된 인간 EOC 세포주, A2780 및 A2780/CP70 (Dr. TC Hamilton이 기증)(Behrens 등, 1997)을 10% 태아 소 혈청(Gemini Bio-Products, 우드랜드, 캘리포니아)이 첨가된 RPMI에서 증식하였다. 프라이머리 EOC 세포주를 악성종양 난소 복수로부터 분리하거나 또는 난소 종양으로부터 외식하여 이전에 기술된 바와 같이 배양하였다(Alvero 등, 2006). 사이토케라틴 7 항원에 대한 면역염색에 의해 결정된 바와 같이 EOC 세포의 순도는 100%였다. 모든 세포주는 5% CO₂ _,37℃에서 성장하였다.

세포 생존능 검사. 세포 생존능은 이전에 보고된 바와 같이 결정하였다(Alvero 등., 2006). 간략하게, 세포(5 x 10³)를 96-웰 마이크로타이터 플레이트(BD Biosciences/Pharmingen, 샌디에고, 캘리포니아)의 웰당 100 μml 부피로 3중 웰에 도말하였다. 세포는 70% 컨플루언스(confluence)로 성장하였으며 이어서 감소된 혈청 페놀이 고갈된 Opti-MEM 배지(Invitrogen-GIBCO, 칼스배드, 캘리포니아)에서 처리 전 4 시간 동안 항온처리하였다. 화합물 1(Novogen, Inc., NSW, 오스트랄리아)을 10 mg/ml 스톡으로부터 배지에 첨가하여 결론 섹션에서 기술된 바와 같이 다양한 최종농도를 제조하였다. 24시간 처리를 따라, 세포 생존능을 제조사의 지시에 따라 CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega Corporation, 메디슨, 위스콘신)을 사용하여 평가하였다. 샘플의 광학 밀도를 490nm에서 자동 마이크로플레이트 리더기(Model 550, Bio-Rad, 허큘레스, 캘리포니아)를 사용하여 측정하였다. 처리된 세포로부터의 값은 비처리된 대조군으로부터 생성된 값으로 비교하였고 퍼센트 생존능으로 보고하였다. 각 실험은 3번 실시하였다.

카스파제 저해제인 Z-VAD-FMK (Sigma Aldrich, 세인트 루이스, 미조리)를 사용항 실험에 대해서, 저해제는 최종 농도 20 μM을 생성하기 위해 처리 30분 전에 배양액에 첨가하였다. 오토파지 저해제인 3-methyladenine (Sigma Aldrich)를 시용한 실험에 대해서, 저해제는 최종 농도 10 mM을 생성하기 위해 처리 1시간 전에 첨가하였다.

훽스트 및 요오드화 프로피디움 염색을 갖는 유세포 분석. 처리 후, 세포를 트립신화하고 PBS로 2번 세척하고 1 x10⁶ cells/ml로 재현탁하였다. 이어서 세포를 5 μg/ml 훽스트 33342 (Invitrogen-Molecular Probes, 칼스배드, 캘리포니아) 및 1 μg/ml 요오드화 프로피디움 (Sigma Aldrich)으로 염색하였고 암실에서 15분간 항온처리하였다. 그 후, BD LSR Il System을 사용하여 데이터를 수거하였고 FIoJo FACS 분석 소프트웨어(Tree Star, Inc., 애쉬랜드, 오레곤)를 사용하여 분석하였다.

단백질 제조 및 세포 분획화 . 약물 처리 후, 단백질을 추출하여 이전에 기술된 바와 같이 측정하였다(Alvero 등, 2006). 세포 내 및 미토콘드리아 분획의 분리를 위해, 세포 펠렛을 제조사의 지시에 따라 ApoAlert™ Cell Fractionation Kit (BD Biosciences, 산 호세, 캘리포니아)를 시용하여 가공하였다. 세포 내 및 핵 분획의 분리를 위해, 펠렛을 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction (Pierce Biotechnology, Inc., 록포드, 일리노이즈)를 사용하여 가공하였다.

카스파제 -3/7, -8, 및 -9 활성 검사. 전체 부피 50 μl중 단백질 10μg 을 평형된 카스파제-Glo¹⁰ 3/7, 8, or 9 시약(Promega) 50 μl와 혼합하였다. 1시간 동안 실온에서 항온처리 후, TD 20/20 Luminometer (Turner Designs, 선니베일, 캘리포니아)를 시용하여 발광을 측정하였다. 블랭크 값을 차감하여 활성의 증가 배수를 대조군 비처리군에 관계하여 결정하였다.

SDS - PAGE 및 웨스턴 블랏 . 세포 용해물(20 μg 단백질)을 샘플 완충제(2.5% SDS, 10% 글리세롤, 5% β-머캅토-에탄올, 0.15 M Tris (pH=6.8) and 0.01% 브로모페놀 블루)에서 변성시켜 이전에 기술된 바(Kamsteeg 등, 2003)와 같이 12% SDS-PAGE에서 분석하였다. 하기의 항체 및 농도를 사용하였다: 마우스 항-XIAP (BD, 1:1,000), 토끼 항-MAP LC3 (1:200), 토기 항-액틴 (Sigma, 1 :10,000), 토끼 항-인산화된 Akt (Cell Signaling, 1 :1,000), 토끼 항-Akt (Cell Signaling, 1: 1000), 토끼 항-인산화된 mTOR (Cell Signaling, 1:1000), 토끼 항-mTOR (Cell Signaling, 1 :1000), 토끼 항-사이토크롬 c (Clontech Laboratories, Inc, 마운트뷰, 캘리포니아, 1:100), 토끼 항-Omi (R&D Systems, 미니아폴리스, 미네소타, 1:5000), 토끼 항-Bid (Cell Signaling, 1:1000), 마우스 항-Bax (BD Pharmingen, 1:250), 토끼 항-VDAC (Sigma Aldrich, 1:2000), 마우스 항-Bcl2 (BD Pharmingen, 1:500), 토끼 항-AIF (Sigma Aldrich, 1:1000), 토끼 항-EndoG (Sigma Aldrich, 1:1000), 마우스 항-토포이소머라제 I (BD Pharmingen, 1:10,000). 향상된 화학발광을 사용하여 단백질을 시각화하였다(Pierce, 록포드, 일리노이즈).

xMAP 기술을 이용한 인산화-단백질의 분석. 처리 후, 세포를 용해한 후 제조사의 지시에 따라 용해물 및 Beadlyte8-plex Multi- Pathway Signaling kit (Millipore, 빌러리카, 메사추세츠)을 사용하여 8 단백질의 인산화 상태를 측정하였다. 데이터는 BioPlex System (BioRad, 허큘레스, 캘리포니아)를 사용하여 수거되었다.

JC - 1를 사용한 미토콘드리아 탈분극의 검사. 처리 후, 세포를 트립신화 한 후 제조사의 지시에 따라 Mitocapture™ 미토콘드리아 세포사멸 감지 키트(BioVision Research Products, 마운튼 뷰, 캘리포니아)를 사용하여 JC-1으로 염색하였다. 데이터는 BD LSR Il System을 사용하여 수거되었고 BD FACSDiva Software™를 시용하여 분석하였다.

면역 침전법. Beclin-1을 1시간 동안 10 μg/ml 화합물 1로 처리한 세포의 미토콘드리아 분획으로부터 제조사의 지시에 따라 Catch and Release^® v2.0 Reversible Immunoprecipitation System (Millipore, 빌러리카, 메사추세츠) 및 항-토끼 Beclin-1 (Abeam, Cambridge, MA)을 사용하여 면역 침전하였다.

마우스 이종 이식 연구. in vivo 연구가 예일 대학 실험동물운영위원회에서 승인받았다. 50% RPMI 및 50% BD Matrigel Matrix (BD Biosciences, 베드포드, 메사추체츠)의 전체 부피 200 μl에 세포(1χ10⁶ cells)를 재현탁하였고 NCR 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. 복막 내 치료법(intra-peritoneal therapy)이 주사 후 8일째에 다음 같이 시작하였다: 20% HPBCD중의 파클리탁셀 10 mg/kg q×3d, 카르보플라틴 40 mg/kg q×7d, 및 화합물 1, 매일 100 mg/kg을 받았다. 대조군 그룹은 PBS중의 20% HPBCD를 받았다. 마우스를 처리하고 3주 동안 관찰하였다. 종양 크기는 캘리퍼스 측정에 의해 결정하였고 이전에 기술된 바(Kamsteeg 등, 2003)와 같이 항-종양 활성은 최대 종양 저해에 대하여 분석하였다(treated/control, T/C).

면역조직화학법 . 면역조직화학법은 이전에 기술된 바(Kelly et al, 2006)와 같이 토끼 항-EndoG (Lifespan Biosciences, 시애틀, 워싱톤)을 1 : 100 으로 희석하여 수행하였다.

화합물 10 연구:

세포. 인간 췌장 세포주 HPAC, MIAPaCa-2 및 PANC-1은 ATCC(마나사스, 버지니아)로부터 입수하였다. 세포를 Gln 및 높은 글루코스(Mediatech, 마나사스, 버지니아), 10% 태아 소 혈청(FBS, HyClone, 로건, 유타) 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 유지하였다.

항체. p53 및 p21에 특이적인 본 연구에 사용된 항체는 (Calbiochem, EMD, 샌디에고, 캘리포니아), 카스파제 9, XIAP, COX IV, Bcl2 및 Akt (Cell Signaling Technology, 덴버, 메사추세츠), 카스파제 2, 사이토크롬 c 및 Bid (BD Pharmingen, 샌디에고, 캘리포니아)로부터 입수하였다. GAPDH (RDI, 콘코드, 메사추세츠) 또는 β-actin (Sigma, 세인트 루이스, 미조리)는 하우스키핑(housekeeping) 유전자로 사용되어 겔 및 블랏 상의 단백질 로딩을 표준화하였다.

세포 생존능 . 세포 생존능은 이전에 기술된 바(Alvero 등, 2006)와 같이 MTS 검사법(CellTiter 96 Aqueous One, Promega, 메디슨, 위스콘신)을 사용하여 96 웰 플레이트에서 측정하였다.

FACS 분석. 세포 사멸을 프로브(Ahn 등, 2003)로서 Annexin-V-FITC 및 요오드화 프로피디움 (Pl) (Biovision, 마운튼 뷰, 캘리포니아)를 사용하여 FACS로 측정하였다. 미토콘드리아 막 전위는 JC-1 (Biovision)를 프로브(Ahn et al., 2003)로 사용하여 FACS 분석으로 측정하였다. 세포 주기는 Pl로 염색되고 에탄올로 고정되고 RNaseA가 처리된 세포 상에서 분석하였다. 각 스펙트럼에서, FACSCalibur(BD Biosciences. 산 호세, 캘리포니아)로 10,000개의 게이트화된 이벤트를 기록하고 분석하였다. 모든 실험은 세번 실시되었고 에러 바는 하나의 표준 편차를 나타낸다. 카스파제 저해제 I(zVAD-fmk)은 Calbiochem로부터 입수하였다.

웨스턴 블랏 분석. 세포를 100 mm 조직 배양 플레이트에 시딩(seeding)하여 ~90% 컨플루언스까지 하룻밤 성장시켰다. 이어서 표시된 시간 포인트 동안 세포를 약물 조합으로 처리하였다. 최종 처리 단계 후, 상기 세포는 30분 동안 얼음 상에서 1% 논이뎃 P-40, 0.1% SDS, 0.5% 디옥시콜레이트, 150 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH7.5, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF and 프로티아제 저해제를 포함하는 용해 완충제 500 μl로 용해하였다. 세포 용해물을 멸균된 세포 스크레이퍼로 수확한 후 세포 부스러기를 제거하고자 15분 동안 15,000 x g 에서 원심분리하였다. 단백질을 BCA 방법(Pierce)으로 검사하였고 50 μg 분획을 12%,T, 2.6%C SDS-PAGE 겔상에서 분리하였다. 단백질을 전기영동적으로 습윤 이동(wet transfer) 방법에 의해 PVDF 멤브레인(Immobilon P, Millipore, 빌러리카, 메사추세츠)에 옮겼다. 이들 멤브레인은 특이적 항체 및 단백질 로딩을 표준화하는 하우스키핑 유전자로서 사용되는 항-GAPDH로 탐침하였다. 블랏은 HRP-결합 2차 항체 (Southern Biotech, 버밍햄, 알라바마) 및 화학발광 기질(ECL Amersham, 뉴욕)을 사용하여 X-ray 필름에서 현상하였다.

카스파제 활성. 10 μM 화합물 10로 48 시간 처리 후, HPAC, MIAPaCa-2 및 PANC-1 세포를 트립신화하여 수확하고 10% FBS를 가진 DMEM에 재현탁하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂에서1시간 동안 카스파제 기질과 항온처리하면서 Annexin-V-Cy5 및 시톡스 블루로 탐침하였다. 카스파제 +ve 세포는 히스토그램에서 보여지는 바와 같이 게이트화 되어있고 이들 세포는 Annexin-V-Cy5/시톡스 블루 스펙트럼에서 파란색 세포로 나타났다. 인시투 카스파제 활성은 형광 기질을 사용하여 검사하였다. 카스파제 2에 대해서, FITC-VDVAD-fmk (Biovision K182-100), 카스파제 3에 대해서, FITC-DEVD-fmk (K183-100) 및 카스파제 9에 대해서, FITC-LEHD-fmk (K199-100)를 사용하였다. 이들 기질은 그들의 각 활성화된 카스파제에 비가역적으로 결합하고 카스파제 활성화는 유세포 분석기를 통해 정량화하였다. 37℃, 5% CO₂에서 1시간 동안 항온처리 후, 세포를 5% FBS를 포함하는 DPBS로 세척하였고 Annexin-V- Cy5 (Biovision K103-3) 및 괴사세포에 결합하는 시톡스 블루(Invitrogen)를 함유하는 Annexin-V 결합 완충제에 재현탁하였다. 카스파제 활성화, 세포사멸 및 괴사는 BD LSRII 유세포 분석기에서 보라색, 파란색 및 적색 레이저를 사용하여 동시에 측정하였다.

실시예 1 - 화합물 1-유도 세포 사멸은 카스파제 - 비의존성 DNA 조각화와 관계한다

화합물 1은 몇몇 EOC 세포주를 포함하는 암세포의 범주에서 세포 생존능을 감소시키는 것으로 나타났다(데이터 도시되지 않음). 따라서 본 발명자의 첫번째 목적은 화합물 1의 복수 또는 종양 조직으로부터 분리된 EOC 세포의 프라이머리 배양체에 대한 효과를 결정하는 것이고, 이들 배양체는 파클리탁셀-저항인 배양을 포함한다(R182, R456) (Kelly et al, 2006). 이들 배양체는 항-세포사멸 단백질인 XIAP 및 FLIP(16)를 높은 레벨로 발현한다. 파클리탁셀-민감 뿐만 아니라 파클리탁셀-저항인 배양체는 5 및 10 μg/ml사이의 Gl₅₀을 갖는 화합물 1으로 처리된 후 생존 세포의 퍼센티지에서 현저한 감소를 보여주었다(도 1A).

세포 생존능에서 감소가 세포사멸에 기인하는지를 결정하기 위해서, 세포를 훽스트 및 요오드화 프로피디움(PI)으로 염색하여 유세포 분석기로 분석하였다. 뿐만 아니라, 카스파제-3/7, - 8, 및 -9의 활성을 측정하였고 두 개의 항-세포사멸 분자인 XIAP 및 인산화된 Akt(p-Akt)의 상태를 결정하였다. 화합물 1은 24시간 후 훽스트 및 Pl 둘다에 대해 양성적으로 염색된 세포의 95%로 조각화된 DNA 빈도에서 현저한 증가를 유발하였다(도 1B). 그러나 알려진 세포사멸 유도자인 파클리탁셀로 처리한 후 관찰되는 카스파제 활성의 증가와 대조적으로, 화합물 1로 처리 후 카스파제-3/7, -8, 및 -9 활성에는 어떠한 변화도 관찰되지 않았다(도 1C). 뿐만 아니라, XIAP(항-세포사멸 단백질) 상태에서도 어떠한 변화도 관찰되지 않았다(도 2A). 그러나, 흥미롭게도 이미 15분 화합물 1 후처리에서 p-Akt의 강력한 하향조절(down-regulation)이 관찰되었다(도 2B).

카스파제 활성화의 부재하에서 DNA 조각화는 카스파제-비의존성 경로의 관여를 제안한다. 화합물 1-유도 세포 사멸이 카스파제-비의존성이라는 것을 결론적으로 보여주기 위해, 판(pan)-카스파제 저해제인 Z-VAD-FMK의 존재 또는 부재하에서 세포를 화합물 1의 증가하는 농도로 처리하였다. 카스파제의 저해는 화합물 1-유도 세포 사멸에 어떠한 영향도 갖지 않았다(도 2C). 종합하건데, 이러한 결과는 화합물 1-유도 세포 사멸은 카스파제-비의존성을 통해 진행되지만, DNA 조각화에서는 아마도 p-Akt 의존성 경로가 정점을 이룬다.

실시예 2 - 오토파지는 화합물 1에 의해 유도된 세포 사멸을 위해 필요로 되지 않는다

형태학적으로, 화합물 1로 처리된 EOC 세포는 커다란 세포 내 아크리딘 오렌지로 양성적으로 염색되는 액포(도 4B)를 갖으며(데이터 도시되지 않음) 따라서 화합물 1이 오토파지 세포 사멸을 유도함을 제시한다. 오토파지의 프로세스가 관여하는지를 결정하기 위해, 오토파지 경로의 주요 조절자인 인산화된 mTOR (p-mTOR) 및 그것의 타겟 중 하나인 리보좀멀 p70 S6 키나제(p-S6k)의 레벨이 결정하였다. 뿐만 아니라 오토파지 마커인 LC3-II의 레벨도 결정하였다. 웨스턴 블랏 분석은 15분 화합물 1 후처리 후 p-mTOR 및 p-S6k가 하향 조절되고(도 3A) 그 후 LC3-II의 레벨에서 현저한 증가(도 3B)가 일어나서 오토파지 경로의 활성화를 증명하였다.

오토파지 프로세스가 화합물 1-유도 세포 사멸의 주요 기작인지 여부를 결정하기 위해, 세포를 잘 특성화되고 오토파고좀 형성의 가장 초기 단계를 저해(Seglen 및 Bohley, 1992)하는 오토파지 저해제인 3-메틸아데닌(3-MA)의 존재 또는 부재하에서 화합물 1(10 μg/ml)과 처리하였다. 3 MA (10μM)를 이용한 세포 생존능 연구는 상기 화합물이 화합물 1-유도 세포 사멸을 저해할 수 없다는 것을 나타냈다(도 2C). 이들 데이터는 몇 가지 오토파지 특성이 관찰되었지만, 그것이 화합물 1에 의해 유도되는 세포 사멸의 주요 기작이 아님을 제시한다.

화합물 1이 특정 생존 경로에 영향을 주는지 여부를 결정하기 위해, 화합물 1 10 μg/ml의 존재 또는 부재하에서 항온처리된 세포내의 인산화-단백질을 평가하였다. 도 3C에서 보여지는 바와 같이, 시험된 8 개의 인산화-단백질들 중 화합물 1은 오직 p-S6k 만을 하향 조절하여, 웨스턴 블랏 결과를 확인하였고, pkB, pSTAT3, 및 p38에 대해서는 최소 또는 어떠한 효과도 나타내지 않았다. ERK, pJNK, pSTAT5a/b, 및 pCREB의 상향 조절도 또한 관찰되었는데 아마도 보상적인 반응을 나타낸다. 이들 결과는 화합물 1의 mTOR 경로에 대한 특이적 효과를 제시한다.

실시예 3 - 미토콘드리아 탈분극 , 미토콘드리아 이동 및 핵 이동

대조군 및 처리된 세포를 JC-1로 염색하였고 이들 양이온성 형광 염료는 온전한 미토콘드리아에서는 적색으로 염색하고 미토콘드리아가 탈분극되는 동안 녹색으로 색상이 바뀐다. 비히클 대조군과 비교시, 화합물 1 처리 세포의 면역 형광 사진은 외관상 주로 녹색이었다(도 4). 화합물 1 처리 세포에서 JC-1 스펙트럼이 적색에서 녹색으로 바뀌는 이러한 이동은 화합물 1이 미토콘드리아 탈분극을 유도할 수 있음을 확인하였다. 이러한 이동은 유세포 분석기를 통해 확인하였고, 이 분석기는 화합물 1 처리 후 탈분극된 미토콘드리아를 갖는 세포의 30%(1시간) 및 50%(4시간)를 나타내었다(도 5).

미토콘드리아 막의 안정성은 부분적으로 보존된 BH 도메인에 의해 특성화되는 단백질의 Bcb 패밀리에 의해 조절된다. Bid 및 Bax는 세포 내 단백질로 탈분극을 초기화하기 위해 미토콘드리아로 이동한다. 대조적으로, Bcb는 미토콘드리아 상주 단백질로서 막을 안정화한다. 화합물 1로 처리는 처리 2시간 후 Bax의 미토콘드리아내로의 이동을 유도하지만 Bid의 활성화는 유도하지 않는다(Fig. 6A). 화합물 1-유도 미토콘드리아 탈분극의 시작 후 미토콘드리아 막 탈분극의 첫 번째 매개자들 중의 하나인 Bax 이동이 일어난다면, 다른 대안의 기작이 미토콘드리아 불안정화의 초기화를 책임져야 한다. Beclin-1은 오토파지에서 그것의 역할에 관해 아주 잘 기술된 분자이다. 뿐만 아니라, Beclin-1은 최근 BH 도메인을 갖는다고 보고되어서 단백질의 Bcb 패밀리의 정당한 맴버로 만들었다. RT-PCR에 의한 Beclin-1 mRNA의 분석 및 전체 세포 용해물로부터의 Beclin-1 단백질 레벨은 화합물 1 처리후 Beclin-1 메시지 또는 단백질 발현에서 어떠한 변화도 나타내지 않았다(데이터도시되지 않음). 그러나, 미토콘드리아 분획의 분석은 Beclin-1이 화합물 1 처리 1시간 후에 미토콘드리아 내로 이동함을 나타냈고(도 6A), 이것은 미토콘드리아 탈분극의 시작과 연관한다.

클래스 III Pl-3 키나제와 연관하는 오토파지 초기화에서 역할을 별개로 하고, Beclin-1의 BH3 도메인은 Bcl₂ 및 Bcl_xl와 상호작용할 수 있음을 증명하였다. 이것 대신에, 본 발명자들은 Beclin-1의 미토콘드리아 내로의 이동이 Bcl₂와의 상호작용을 일으키고 따라서 Bcl₂가 미토콘드리아를 안정화하는 능력이 방해됨을 가정하였다. 이러한 상호작용을 보여주기 위해, Beclin-1을 화합물 1으로 비처리된 세포 또는 1시간 동안 처리된 세포의 미토콘드리아 분획으로부터 면역침전시켰다. 면역 복합체에서 Bcl₂ 및 Bak의 존재를 웨스턴 블랏팅에 의해 결정하였다. Beclin-1과 복합체를 이룬 Bcl2의 더 높은 레벨이 비처리된 대조군과 비교하여 화합물 1 처리 후에 관찰되었다. 따라서 화합물 1-유도 Beclin-1의 미토콘드리아 내로의 이동은 Beclin1-Bcl₂ 상호작용을 유도하였다. Bak은 복합체에서 발견되지 않아서 이것은 Beclin-1 및 Bcl2간의 특이적 상호작용이다. 이러한 발견은 Beclin-1이 미토콘드리아 내로 이동하여 Bcl₂와 결합한 후 이를 비활성화하여 미토콘드리아 탈분극을 초기화하는 능력을 가지고 있음을 암시한다. 잠재적으로 이들 기작은 Bid-Bak 또는 Bid-Bax 상호작용과 유사한 방식이다.

미토콘드리아 뉴클리아제는 일단 미토콘드리아로부터 방출되면 핵 안으로 이동하여 DNA 조각화를 유도하는 단백질 패밀리이다. 화합물 1이 미토콘드리아 탈분극을 유도할 수 있다는 관찰은 미토콘드리아 뉴클리아제가 DNA 조각화를 책임질 수 있다는 갓을 제시한다. 따라서, 웨스턴 블랏 분석을 사용하여 화합물 1이 처리된 세포의 핵 분획에서 미토콘드리아 뉴클리아제, 세포사멸-유도 인자(AIF) 및 엔도뉴클리아제 G(EndoG)의 레벨을 정량화할 수 있다. AIF가 아닌 핵 내의 EndoG 레벨의 증가를 화합물 1 처리 후에 관찰하였고 이것은 EndoG가 미토콘드리아에서 방출되어 DNA 조각화를 촉매하는 핵 안으로 이동했음을 제시하는 것이다.

실시예 4 - 화합물 1의 화학-저항성 EOC 이종 이식 모델에 대한 항-종양 활성도

본 발명자는 화합물 1의 생체 내 항-종양 활성도를 평가하였다. 누드 마우스 EOC 이종 이식 모델을 악성종양 난소암 복수로부터 분리된 EOC 세포를 사용하여 확립하였다. 화합물 1의 항-종양 활성도를 상기에 기술된 바와 같은 카르보플라틴 및 파클리탁셀의 활성과 비교하였다. 화합물 1은 종양 증식 동역학(도 8A), 및 최종 종양 크기 및 부피에서 카르보플라틴 및 파클리탁셀과 비교(도 8A 및 8B)하여 투여량에 의존하는 방식(도 8B 및 8C)으로 현저한 감소를 유도하였다. T/C 값은 화합물 1, 카르보플라틴, 및 파클리탁셀에 대해 각각 30%, 58%, 및 58%였다. 화합물 1-처리 그룹에서는 어떠한 독성적인 부작용이 관찰되지 않았으나 카르보플라틴 그룹의 마우스는 심각한 체중 감소와 악액질(cachexia)을 나타내었다.

마지막으로, 화합물 1의 생체 내 항-종양 활성도가 시험관 내에서 관찰된 기작과 평행하는 지를 증명하기 위해, 종양을 용해하여 p-S6k 레벨을 웨스턴 블랏 분석으로 결정하였고 마우스 종양의 파라핀포매 섹션을 EndoG에 대해 면역염색하였다. 도 8D에 도시된 바와 같이, 화합물 1로 처리된 동물로부터의 종양은 비히클 대조군과 비교하여 p-S6k에 대해 현저한 감소를 나타낸다(도 8D). 뿐만 아니라, 화합물 1으로 처리된 동물로부터의 종양 내에서 EndoG의 핵 위치가 관찰되었으나 대조군 동물로부터의 종양은 오직 세포 내 염색만을 가지고 있었다(Fig. 8E).

실시예 5- 화합물 10에 의해 유도된 카스파제 - 비의존성 세포 사멸

화합물 10이 췌장암 세포에서 세포 사멸을 유도할 수 있는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 48시간 노출에 대해 점차적으로 확대되는 투여량 연구를 실시하였고 Annexin-V-FITC/PI로 염색된 세포에 대한 FACS 분석을 사용하였다. 분석된 모든 세포 타입(HPAC, MIAPaCa-2 및 PANC-1)에서, 화합물 10은 투여량-의존 방식으로 세포사멸을 유도하였다(도 9). 어떠한 괴사도 관찰되지 않았다.

HPAC 세포는 TRAIL에 저항적이고 FasL-의존성 세포 사멸에 민감한 반면, MIAPaCa-2 세포는 TRAIL-의존성 세포사멸에 민감하고 FasL-의존성 세포 사멸에 저항적이다. 이들 두 가지 경로는 카스파제-의존성 세포 사멸 경로이다. 결과로서, Fas-활성 항체 CH 11 (업스테이트) 및 TRAIL은 이들 세포 타입에서 각각 양성 대조군으로 사용된다. HPAC 세포에서, 세포를 10 μM 카스파제 저해제 I (zVAD-fmk)을 1시간 동안 전-처리하면 Fas-의존성 괴사의 저해를 야기하나 상기의 같은 전-처리는 화합물 10-의존성 괴사를 저해하지만 화합물 10-유도 세포사멸을 저해하지 않는다(도 9A). MIAPaCa-2 세포에서, 세포를 zVAD-fmk로 전-처리하면 TRAIL-의존성 세포 사멸을 저해하나 상기의 같은 전-처리는 화합물 10-의존성 괴사를 저해하고 아마도 괴사로 진행됨이 차단되는 세포의 결과로써 분명히 화합물 10-유도 세포사멸을 강화시켰다(도 9B). 이러한 결과는 화합물 10에 의해 유도된 세포 사멸 효과의 큰 부분은 췌장암 세포에서 카스파제-비의존성 경로를 사용하나 화합물 10-유도 괴사 경로는 카스파제-의존적이다.

카스파제 활성화, 세포사멸 및 괴사는 비처리된 및 화합물 10으로 처리된 췌장암 세포에서 유세포 분석기를 사용하여 동시에 측정할 수 있다. 48시간 후, 화합물 10은 MIAPaCa-2 및 PANC-1 세포에서 카스파제 2, 3 및 9를 활성화하였다(도 10). 카스파제 양성 세포는 또한 Annexin-V-Cy5 양성이어서 화합물 10-유도 카스파제 활성화은 세포사멸을 겪고 있는 세포에서 일어난다. 화합물 10-처리된, 카스파제 양성 세포의 약 60%는 Annexin-V 양성이고 시톡스 블루 음성이어서 그들이 초기 세포 사멸 단계에 있음을 암시한다. 카스파제 양성 세포의 약 30%는 Annexin-V-Cy5 및 시톡스 블루에 결합 되어있어 이들 세포가 후기의 세포 사멸 단계에 들어감을 암기한다. 화합물 10-유도, 카스파제 양성 세포의 5% 미만은 시톡스 블루 양성이고 Annexin-V 음성이어서 카스파제가 화합물 10-의존성 괴사에 아무런 역할을 않는다. 처리된 HPAC 세포에서 유도된 카스파제-3를 제외하고, 이용된 조건을 사용하여 이들 세포주에서 카스파제 2 또는 카스파제 9 어느 것도 유도되지 않았다(도 10). 보다 더 높은 농도(30 μM)에서, 화합물 10은 HPAC 세포에서 카스파제 9을 활성화하나 카스파제 2는 활성화하지 않는다(데이터 도시되지 않음). 이들 데이터는 세포사멸의 카스파제-비의존성 기작은 화합물 10이 처리된 HPAC 세포에서 활성화됨을 제시한다.

웨스턴 블랏 분석은 MIAPaCa-2 세포에서 전체길이 카스파제 2(48Kd)는 10 μM 화합물 10에 노출함으로써 절단될 수 있음을 나타내었다(도 11A). 대조적으로, 카스파제 2는 HPAC 세포에서 화합물 10에 의해 적은 정도로 절단되었다(도 11A). 시간에 걸친 실험을 통해, 화합물 10은 절단된 카스파제 9(17kd)의 초기 드롭(drop)을 유도하고 그 후 두 개의 세포 타입에서 16시간 후에 증가된다(도 11B). 화합물 10의 처리는 MIAPaCa-2 및 HPAC 세포에서 카스파제 3의 현저한 절단을 야기시키지 않는다. 같은 블랏을 더 길게 노출시키면 HPAC에서는 카스파제 3의 보다 작은 절단을 나타내나 MIAPaCa-2 세포에서는 절단되지 않는다(데이터 도시되지 않음). 종합하건데, 이들 실험은 화합물 10이 카스파제 활성화 및 합성에 영향을 끼침을 제시한다.

실시예 6- 화합물 10의 시험관 내 미토콘드리아 전위 및 세포주기 진행에 대한 효과

테스트된 모든 세포주에서(실시예 5 참조), 화합물 10은 이들 세포에서 처리 48시간을 따라가며 투여량 의존성 방식으로 미토콘드리아를 탈분극화했으며, 세포사멸의 고유 경로가 활성화되었음을 나타내었다(도 12).

모든 세 개의 세포주에서, 화합물 10은 G₀/G₁의 손실 및 sub-G₀/G₁ phase의 증가와 함께 G₂/M 에서 세포주기를 다양한 정도로 억제하였다(도 13). 화합물 10 유도 G₂/M 억제의 타이밍은 각 세포주마다 달랐다. PANC-1은 화합물 10 처리 4-24 시간 후에 G₂/M에서 정지하였고 적어도 48시간 동안 정지상태로 남아 있었다. MIAPaCa-2 세포는 화합물 10 처리 24-48 시간 후 G₂/M 정지에 들어갔다. 정지를 동반함은 G₀/G₁ 세포 수에서 해당하는 감소이다. 화합물 10에 반응하여 HPAC 세포에서 관찰된 G₂/M 정지는 덜 뚜렷하고 G₀/G₁에서의 정지와 동반한다. 그러나, 유도된 정지는 일시적인 것으로 나타난다(도 13).

OEC 세포에 대한 이전 연구는 카스파제 3 저해제인 XIAP가 페녹소디올에 의해 현저히 감소하며 이 이소플라바노이드는 BIRC 패밀리 맴버의 자동-분해를 촉진함을 나타내었다(Alvero et al., 2006). HPAC 및 MIAPaCa-2 세포에서, 화합물 10은 XIAP 레벨을 감소시켰으나(도 11A), XIAP 분해는 MIAPaCa-2 세포에서 더욱 두드러졌다. XIAP의 감소는 카스파제 3 활성화에 대한 차단제를 제거하는 것과 같다(Deveraux et al. 1997). 중요하게, 전체 Akt 또한 초기 시간 포인트(4 시간)에서 감소하였고 이는 XIAP 분해와 동반한 전체 Akt 제거는 화합물 10 작용 기작에서 가장 초기 이벤트 중의 2 개임을 제시하는 것이다. Akt 발현의 감소는 XIAP 발현에 또한 영향을 미친다(Alvero et al., 2006 and Alvero et al., 2008).

실시예 7 - 화합물 10의 Bcl ₂ 패밀리 멤버 화학량론에 대한 효과

실시예 6에서 주지된 바와 같이, 화합물 10은 미토콘드리아 탈분극을 유도한다. 따라서 본 발명자들은 그들의 작용이 프로-세포사멸(Bid, Bak, Bax) 및 항-세포사멸(Bcl₂, BCl_XL) BCl₂ 패밀리 멤버의 화학량론을 변형시키는가에 관여하는지를 조사하였다. BCl₂의 레벨은MIAPaCa-2 및 HPAC 세포에서 화합물 10 처리에 의해 더 낮추어진다(도 11A). 화합물 10 처리는 MIAPaCa-2 세포(도 11A)에서 시간에 걸쳐 Bid 절단을 유도하나 HPAC(도 11A)에서는 화합물 10에 의한 Bid 절단이 일시적으로 증가함을 나타낸다.

세포 주기는 사이클린-의존성 키나제에 의해 조절되고 이 키나제는 일반적으로 p53-의존성 경로에서 p21에 의해 조절된다. 대다수의 췌장암은 돌연변이 p53을 갖고 이들은 p53-의존성 전사를 정지시킨다. HPAC 세포는 야생형 p53을 갖는데 있어서 일반적이지 않고, MIAPaCa-2 및 PANC-1은 p53에서 R248W 및 R273H의 돌연변이를 갖는다. 이들 돌연변이는 p53의 루프 3에 위치하며 p53이 DNA에 결합하는 능력에 영향을 준다. p53의 기저 레벨은 HPAC 세포보다 MIAPaCa-2 세포에서 94배 더 높다(데이터 도시되지 않음). MIAPaCa-2 세포에서의 p53 발현은 화합물 10에 의해 영향을 받지 않지만(도 1B) HPAC 세포에서는 48시간에 의해 증가된다(도 11B). p21은 MIAPaCa-2 세포에서는 사라질 만큼 낮고 화합물 10에 의해 증가되나(도 11B), p21은 HPAC 세포에서 풍부하고 화합물 10에 의해 영향을 받지 않는다(도 11B).

실시예 8- 화합물 10 단독 및 젬시타빈과 조합으로의 항-종양 활성도

이종 이식연구에서, 5주령 된 수컷 Balb/c 누드 마우스를 표준사료에 의해 제공되는 백그라운드 이소플라본 레벨을 제거하고자 이소플라본이 없는 사료로 유지하였다. 접종 날에, MIAPaCa2 또는 HPAC 세포의 현탁액을 얼음에서 차가워진 DMEM (-FBS)에서 제조한 다음 동일 부피의 마트리젤(BD)을 첨가하였다. 마우스에 3 ×10⁶ MIAPaCa2 또는 HPAC 세포를 등면을 따라 좌우 양쪽(겨드랑이 및 사타구니 중간)으로 피하주사하였고 주사된 세포가 중간-말기 로그 상에서 성장하고 있었다는 것을 보장한다. 종양의 성장을 10-15 일에 걸쳐 모니터하였다. 화합물 10을 비히클로서 1% 카르복시 메틸 셀룰로오스(CMC) 중의 영양(gavage)에 의해 경구적으로 제공했다. 젬시타빈은 PBS에서 복강주사로 투여하였다. 조합 그룹에서, 각각의 투여 계획, 투약량, 언급된 전달 경로를 사용하여 동물을 첫째로 화합물 10을 투여하고 이어서 젬시타빈을 투여하였다.

췌장암의 HPAC 모델에서, 화합물 10과 젬시타빈을 각각 50 및 4 mg/kg 투여된 동물은 각각의 단일 제제 대조군과 비교(데이터 도시되지 않음)하여 현저히 감소된 종양 증식 속도 및 최종적인 종양 부하를 나타내었다(% T/C = 38). 더욱이, 단일 제제 대조군의 반(25 mg/kg 화합물 10 및 2 mg/kg 젬시타빈)인 투약량으로 화합물 10 및 젬시타빈이 투여된 동물은 단일 요법 대조군과 비교하여 현저히 감소된 종양 증식 동역학 및 감소된 최종 종양 부하를 나타내었다(%T/C = 47.8). 화합물 10 및 젬시타빈 투여 조합의 유효성은 각각의 단일요법 대조군과 비교(데이터 도시되지 않음)하여 조합으로 투여된 동물의 종양이 복용량 반응 방식으로 현저히 감소된 속도로 증식함으로써 추가로 증명되었다. 이들 데이터를 종합하건데 HPAC 췌장 암 종양 모델을 사용하여 화합물 10과 젬시타빈은 조합으로 투여될 때 상승적으로 작용하여 전체 종양 부하를 감소시킨다.

췌장암의 MIAPaCa-2 모델에서, 비히클 대조군과 비교하여, 경구로 투여된 화합물 10(100 mg/kg, qd×12)은 젬시타빈(20 mg/kg, q3d×4)과 유사한 레벨로 종양 증식의 속도를 지연시켰다. 화합물 10과 젬시타빈을 각각 100 및 20 mg/kg 투여된 동물은 각각의 비히클 및 단일 제제 대조군과 비교하여 현저히 감소된 종양 성장 및 최종적인 종양 부하를 나타내었다(%T/C = 51). 조합에 대해 관찰된 평균 최종 종양 부하는 각 단일 제제 대조군의 종양 부하의 현저한 밑이었다(100 mg/kg 화합물 10, T/C = 94%; 20 mg/kg gemcitabine에 대해서는, T/C = 79%). 이들 데이터는 MIAPaCa-2 췌장암 이종 이식을 사용하여 조합으로 투여시 화합물 10 및 젬시타빈은 상승적으로 작용하여 전체 종양 부하를 감소시킨다는 것을 제시한다.

젬시타빈 및 화합물 10의 조합으로 높고 낮은 양을 투여받는 동물에서, 신장 및 간기능의 모든 마커는 백혈구 및 적혈구 카운트와 같은 대조군 동물의 마커와 비교할 만하다(데이터 도시되지 않음). 중요 기관의 조직병리학적 분석은 약물 독성에 근거할 수 있는 비정상을 나타내지 않았다(데이터 도시되지 않음). 이들 데이터는 화합물 10이 측정된 매개변수에 대해 젬시타빈의 독성을 악화시키지 않는다는 것과 화합물 10이 사용된 투약 량에서 젬시타빈과 조합으로 안전하게 사용될 수 있음을 증명하였다.

[참고문헌]

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Seglen PO and Bohley P. Experientia 1992, 48: 158-172.

Claims

하기 구조식을 갖는 3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)크로만-7-올 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체의 유효량을 세포에 노출시킴을 포함하는 세포에서 카스파제-비의존성 세포 사멸을 유도 또는 촉진하는 방법:
제 1항에 있어서, 상기 화합물에 세포의 노출이 ex vivo 또는 in vitro에서 일어나는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 화합물에 세포의 노출이 in vivo에서 일어나는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나에 있어서, 세포가 암세포가 아닌 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나에 있어서, 세포가 심근세포 또는 면역세포로부터 선택되는 방법.
하기 구조식을 갖는 3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)크로만-7-올 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체의 유효량을 세포에 노출시킴을 포함하는 세포에서 mTOR 활성을 저해하는 방법:
제 6항에 있어서, 상기 화합물에 세포의 노출이 ex vivo 또는 in vitro에서 일어나는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 화합물에 세포의 노출이 in vivo에서 일어나는 방법.
제 6항 내지 제 8항 중 어느 하나에 있어서, mTOR 활성의 저해가 mTOR의 탈인산화를 포함하는 방법.
하기 구조식을 갖는 3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)크로만-7-올 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체의 유효량을, 경우에 따라 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 보조제, 및/또는 부형제와 함께, 필요로 하는 대상에게 투여함을 포함하며, 여기서, 상기 화합물은 상기 대상의 적어도 하나의 세포에서 카스파제-비의존성 세포 사멸을 유도 또는 촉진하는 것인 질병 또는 증상을 치료 또는 예방하는 방법
하기 구조식를 갖는 3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)크로만-7-올 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체의 유효량을 경우에 따라 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 보조제, 및/또는 부형제와 함께, 필요로 하는 대상에게 투여함을 포함하며, 여기서 상기 화합물은 대상의 적어도 하나의 세포에서 mTOR 활성을 저해하는 것인 질병 또는 증상을 치료 또는 예방하는 방법.
제 10항 또는 제 11항에 있어서, 상기 세포가 암세포가 아닌 방법.
제 10항 내지 제 12항 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 분열하는 T 세포인 방법.
제 10항 내지 제 13항 중 어느 하나에 있어서, 상기 질병과 증상은 비정상적이거나 또는 불필요한 세포 성장 또는 증식과 연관되는 방법.
제 10항 내지 제 14항 중 어느 하나에 있어서, 상기 질병 또는 증상이 협착증, 재협착증, 이식거부, 류마티스 관절염, T 세포 백혈병, 자가면역질환 및 이식 또는 이식편 거부(transplant or graft rejection)로부터 선택된 방법.
제 15항에 있어서, 협착 또는 재협착 치료를 위해 상기 화합물 또는 상기 화합물을 포함하는 조성물이 관상동맥으로의 도입을 위한 스텐트에 코팅되거나 또는 스텐트내에 혼입되는 방법.
제 16항에 있어서, 화합물 또는 조성물을 스텐트로부터 일정 시간 동안 용출시켜 원하는 결과를 얻는 방법.
제 17항에 있어서, 자가면역질환이 간경변, 건선, 루푸스, 류마티스 관절염, 에디슨 질병, 전염성 단핵증, 세자리증후군, 및 엡스타인 바 바이러스 감염으로부터 선택된 방법.
하기 구조식을 갖는 3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)크로만-7-올 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체를 포함하는, 비정상적이거나 또는 불필요한 세포 성장 및/또는 증식과 연관되는 질병 또는 증상의 치료 또는 예방용 약제
대상의 세포 또는 조직에 적어도 하나의 활성제를 전달하는 이식 가능한 의료 기기로서 상기 적어도 하나의 활성제가 3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)크로만-7-올 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체를 포함하는 의료기기.
제 20항에 있어서, 상기 화합물은 세포 또는 조직에 투여하기 위한 기기에 코팅되거나 또는 기기내에 혼입되는 의료 기기.
제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상기 기기가 약물 용출 스텐트인 의료 기기.
세포에서 카스파제-비의존성 세포 사멸을 유도 또는 촉진 및/또는 mTOR 활성을 저해하기 위한 하기 구조식을 갖는 3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)크로만-7-올 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체의 용도.
질병 또는 증상을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조를 위한 하기 구조식을 갖는 3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)크로만-7-올 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체의 용도로서 상기 화합물이 대상의 적어도 하나의 세포에서 카스파제-비의존성 세포 사멸을 유도 또는 촉진 및/또는 mTOR 활성을 저해하는 것인 용도.
하기 구조식을 갖는 3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)크로만-7-올 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체를, 경우에 따라 담체 및/또는 부형제와 함께 포함하는, 세포에서 카스파제-비의존성 세포 사멸을 유도 또는 촉진 및/또는 mTOR 활성을 저해하기 위해 사용되는 조성물.
하기 구조식을 갖는 3-(4-하이드록시페닐)-4-(4-메톡시페닐)크로만-7-올 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 유도체를 경우에 따라 담체 및/또는 부형제와 함께 포함하는, 대상에서 질병 또는 증상을 치료 또는 예방하는데 사용되는 조성물로서, 상기 화합물이 대상의 적어도 하나의 세포에서 카스파제-비의존성 세포 사멸을 유도 또는 촉진 및/또는 mTOR 활성을 저해하는 것인 조성물 .