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KR20110099333A - 황화시약, 및 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 그 용도 - Google Patents

황화시약, 및 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 그 용도 Download PDF

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KR20110099333A
KR20110099333A KR1020117017343A KR20117017343A KR20110099333A KR 20110099333 A KR20110099333 A KR 20110099333A KR 1020117017343 A KR1020117017343 A KR 1020117017343A KR 20117017343 A KR20117017343 A KR 20117017343A KR 20110099333 A KR20110099333 A KR 20110099333A
Authority
KR
South Korea
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group
oligonucleotide
mmol
mixture
solution
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020117017343A
Other languages
English (en)
Inventor
위슬로 아담 마주르
이강 허
빅터 소로킨
Original Assignee
기린두스 아메리카 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 기린두스 아메리카 인코포레이티드 filed Critical 기린두스 아메리카 인코포레이티드
Publication of KR20110099333A publication Critical patent/KR20110099333A/ko
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Abstract

본 발명은 P-S-R 결합을 포함한 하나 이상의 뉴클레오타이드간 결합(internucleotide linkage)과, 둘 이상의 뉴클레오사이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드이며, R은 하기 화학식(I)에 해당된다:
Figure pct00033
(I)
(식 중, A는 동일위치에 치환되는 알킬렌기, 바람직하게는 CH2이고; X 및 Y는 S 및 0 중에서 독립적으로 선택되고; R0은 임의 치환된 탄소-결합된 유기 잔기, 예를 들어 구체적으로는 임의 치환된 알킬 또는 아릴, SRx, ORx 및 NRxRy (Rx 및/또는 Ry는 H 및 유기 잔기 중에서 선택되며 적어도 Rx는 H 이외의 치환기임)로 이루어진 군에서 선택됨). 본 발명의 다른 목적은 올리고뉴클레오타이드 제조에 유용한 황화제 및 그 제조이다.

Description

황화시약, 및 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 그 용도{SULFURIZING REAGENTS AND THEIR USE FOR OLIGONUCLEOTIDES SYNTHESIS}
본 출원은 2008년 12월 23일자로 출원된 미국 특허출원 제61/140391호의 이점을 주장하며, 그 전체 내용이 본원에 참조로 통합된다.
본 발명은 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드(phosphorothioate oligonucleotides), 신규 황화시약을 이용한 그 제조, 상기 황화시약 및 그 제조에 관한 것이다.
올리고뉴클레오타이드는 (몇 가지만 예를 들어, 암, 바이러스성 감염 및 염증성 질환을 비롯한) 각종 질환의 치료용으로 큰 잠재력을 지닌 생약제의 한 종류에 속한다. 올리고뉴클레오타이드를 치료제로서 발전시키는 한 가지 중요한 방법은 올리고머 주쇄를 변형하여, 무엇보다도, 대사내성 및 화학적 안정성을 제공하고 작용부위로의 생체 내 전달을 향상시키는 것이다. 변형된 주쇄 화합물의 예로: PNAs(peptide nucleic acids)(Nielsen, Methods Mol. Biol., 208:3-26, 2002를 참조함), LNAs(locked nucleic acids) (Petersen & Wengel, Trends Biotechnol., 21(2):74-81, 2003을 참조함), 포스포로티오에이트 (Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 10(2):117-21, 2000을 참조함), 메틸포스포네이트(Thiviyanathan et al., Biochemistry, 41(3):827-38, 2002를 참조함), 포스포아미데이트 (Gryaznov, Biochem. Biophys. Acta, 1489(1):131-40, 1999; Pruzan et al., Nucleic Acids Res., 30(2):559-68, 2002를 참조함), 티오포스포아미데이트 (Gryaznov et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 20(4-7):401-10, 2001; Herbert et al., Oncogene, 21(4):638-42, 2002를 참조함)가 포함된다. 포스포로티오에이트의 형성이 가장 유용한 변형에 속하는데 그 이유는 P=O를 P=S 부분(moiety)으로 치환함으로써 올리고뉴클레오타이드가 핵산분해에 내성을 나타내면서 한편으로는 대부분의 경우에 천연 올리고머의 생물학적 특성을 유지하기 때문이다.
포스포로티오에이트는 산화황화반응에 의해 형성될 수 있다(Oligonucleotide synthesis, methods and applications, P. Herdewijn Methods in Molecular Biology, volume 288, Chapter 4, 51-63을 참조함). 이러한 반응에 사용되는 아인산에스테르의 성질 및 예상되는 생성물의 성질에 따라, 기본적으로 두 가지 방법에 의해 포스포로티오에이트를 제조한다. 그 중 한 가지는, 예를 들어, 황 원소, 디벤조일 테트라설파이드, 3-H-1,2-벤조디티올-3-온 1,1-디옥사이드(Beaucage 시약으로도 알려져 있음 (Iyer et al., J. Org. Chem. 55, 4693-4699 (1990) 참조), 테트라에틸티우람 디설파이드(TETD), 디메틸티우람 디설파이드(DTD), 페닐아세틸 디설파이드(PADS) 및 비스(O,O-디이소프로폭시 포스피노티오일)디설파이드(Stec 시약으로 알려져 있음)를 통해 비치환 황원자를 인에 도입하는 것이다. 이들 반응은 포스포아미다이트 방법에 의해 고체 지지체 상에서 올리고뉴클레오타이드를 자동 합성하는데 주로 사용되며, 올리고머의 연장반응 도중에 형성되는 아인산 트리에스테르의 산화황화 단계를 포함한다.
올리고머 포스포로티오에이트를 제조하기 위한 두 번째 방법은 H-포스포네이트 방법을 이용하는 것으로, 지방족 또는 방향족 치환기를 가진 황원자를 인에 전달시키는 황 전달 시약을 H-포스포네이트 디에스테르와 반응시키는 것이다. 황에 있는 보조 치환기는 합성 조작시 보호기의 역할을 하며, 올리고뉴클레오타이드 제조의 최종 단계에서 일반적으로 절단된다. 이러한 방법은 용액상의 올리고뉴클레오타이드 합성에 특히 적합하다.
비치환 황원자를 아인산 에스테르에 도입하는데 이용가능한 시약의 선택의 폭이 넓은 것과는 대조적으로, 보호된 황으로 H-포스포네이트 에스테르를 황화시키는 기(group)의 범위는 한정되어 있다(예컨대, Dreef, et al. Synlett, 481-483, 1990, 미국 특허 제6,506,894호를 참조함). 실제로, 각 단계에서 크로마토그래피 정제가 수행되는 올리고뉴클레오타이드 용액 합성 동안의 이러한 반응에서는 시아노에틸설파이드기만 광범위하게 사용되어 왔다. 올리고뉴클레오타이드 용액 합성에서 중요한 문제점은, 특히 크로마토그래피법을 피하고 단순 정제를 용이하게 하는 형태의 고순도 생성물을 제공하면서 각 합성 단계에서 우수한 특이성을 갖는 높은 기질 전환율을 얻어야 한다는 필요성과 관련이 있다. 경제적인 용액상 합성을 가능하게 하는 방법들이 부족하다는 것을 감안하여, 상업적 규모의 올리고뉴클레오타이드 합성에 용액상 기법이 현재 이용되는 것으로 보이지 않는다.
이에 본 발명은 신규의 황화시약, 그 제조 방법 및 특히 용액상 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드의 경제적이면서 편리한 합성 및 정제에 있어서 상기 황화시약의 용도를 제공하고자 한다.
본 발명은 구체적으로 첨부된 청구범위에 기술된 발명에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 명세서, 특히 실시예에 대체로 기술된 방법 및 시약에 관한 것이다.
본 발명은 특히 H-포스포네이트 방법을 통해 바람직하게 수행되는 올리고뉴클레오타이드의 합성에서, 기존의 P-S 결합(linkage) 형성 방법보다 많은 장점을 가진다. 예를 들면, 신규 시약을 이용하여 올리고뉴클레오타이드에 전달된 잔기 R은 올리고뉴클레오타이드의 결정화 또는 침전을 용이하게 하여, 크로마토그래피법을 최소한으로 또는 전혀 이용하지 않으면서 생성물의 단순 정제가 가능하게 할 수 있다. 이러한 방법으로 제조되며 2개 내지 적어도 16개의 뉴클레오타이드 단위를 갖는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 필요한 올리고뉴클레오타이드를 최종적으로 탈보호시킨 후까지는 크로마토그래피로 정제할 필요가 없다는 것을 발견하였다. 중간생성물 올리고머는, 5'- 및 3'- 위치에서의 임의의 탈보호, 그리고 원한다면 이들 조(crude) 탈보호된 물질을 더 많은 올리고뉴클레오타이드와 커플링하기에 충분히 순수하게 얻어질 수 있다. 다른 장점으로, 본 발명의 방법은, 단순하면서도 크로마토그래피법을 사용하지 않는 정제법의 효율을 최대화시키는 것과 관련하여, 형성된 올리고뉴클레오타이드의 특성을 변형시키는데 사용될 수 있는 다양한 황화시약에 대한 접근성을 제공한다. 본 발명에 따른 방법의 또 다른 장점은, 예를 들어 황-보호 아실옥시메틸렌기 RC(O)-OCH2를 상온 상압조건(mild conditions) 하에서, 예를 들어, 일차 또는 이차 또는 장애(hindered) 아민(예컨대, n-프로필아민 또는 터트-부틸아민)을 이용하여 쉽게 단순절단할 수 있다는 것이다. 아민을 이용한 임의적 처리시, 황-메틸렌 결합을 포함하여, 자발적 절단이 일어남에 따라 P=S 결합이 선명하게 형성된다. 절단 생성물은 용매나 수성 세척액을 이용하여 생성물로부터 쉽게 제거가능하다. 예컨대 염기성 비친핵성 조건 하에서 이를 테면 아실옥시메틸렌기의 안정성 특징 덕분에, 합성 경로를 따라 선택적인 탈보호가 가능하므로, 예를 들면 핵염기 보호기의 절단을 방지함으로써, 합성 방법에 더 많은 유연성이 허용된다.
특별히 용액상 올리고뉴클레오타이드의 합성을 위한 경제적인 방법을 개발하는데 있어서 중요한 요소는 올리고뉴클레오타이드 사슬 연장의 각 단계에서 전환 생성물의 순도이다. 비록 본 발명에 따른 방법이 생성물의 고수율과 고순도를 보장하더라고, 각 연장주기는 일반적으로 세 단계를 포함하며, 적은 양의 불순물이라도 제거하지 않으면 도중에 축적될 것이므로 제거하는 것이 유리하다. 많은 단계들이 있기 때문에, 크로마토그래피법을 각 단계에서 이용한다는 것은 실제 대규모 올리고뉴클레오타이드 합성에서 경제적으로 실현 가능하지 않을 수 있다. 이에 따라, 본 출원인은 또한 사슬의 연장 과정에서 형성되는 올리고뉴클레오타이드의 정제용으로 크로마토그래피법을 사용하지 않는 방법론을 개시한다.
본 발명의 구체적인 제1 목적은 P-S-R 결합을 포함한 하나 이상의 뉴클레오타이드간 결합(internucleotide linkage)과, 둘 이상의 뉴클레오사이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것으로, 이때 R은 하기 화학식(I)에 해당된다:
Figure pct00001
(식 중, A는 동일위치에 치환되는 알킬렌기, 바람직하게는 CH2이고; X 및 Y는 S 및 0 중에서 독립적으로 선택되고; R0은 임의 치환된 탄소-결합된 유기 잔기, 예를 들어 구체적으로는 임의 치환된 알킬 또는 아릴, SRx, ORx 및 NRxRy (Rx 및 Ry는 H 및 유기 잔기 중에서 선택되며 적어도 Rx는 H 이외의 치환기임)로 이루어진 군에서 선택됨).
가용성 특징에 대해 유리한 특성을 가짐으로써 예를 들어 침전 기법과 추출 기법의 조합에 의해 효과적으로 달성될 수 있는 효율적 정제를 감안한 P-황화 올리고뉴클레오타이드 합성에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드가 중요한 합성 중간생성물이라는 것이 밝혀졌다. 또한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 인간 또는 동물의 몸 안에 있는 R기를 절단시킴으로써, 생체 내에 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드를 방출할 수 있는 전구약물로서 효과적으로 여겨진다.
본 발명의 구성 내에서 "올리고뉴클레오타이드"란 용어는 핵염기에 연결된 당(sugar) 단위들을 포함한 뉴클레오사이드 단량체 단위들의 올리고머를 구체적으로 지칭하며, 상기 뉴클레오사이드 단량체 단위는 뉴클레오타이드간 결합(internucleotide bond)에 의해 연결되어 있다. "뉴클레오타이드간 결합"은 구체적으로 2개의 뉴클레오사이드 부분 사이의 화학적 결합(chemical linkage)을 가리키는 것으로, 예컨대, 자연에서 발견되는 핵산에 통상 존재하는 포스포디에스테르 결합 또는 합성 핵산 및 핵산 유사물에 통상 존재하는 다른 결합들을 가리킨다. 이러한 뉴클레오타이드간 결합에는 예를 들어 포스포(phospho)기 또는 포스파이트(phosphite)기가 포함될 수 있으며, 포스포기 또는 포스파이트기의 하나 이상의 산소 원자가 치환기로 변형되거나 (예컨대, 황 원자, 또는 모노- 또는 디-알킬 아미노기의 질소 원자와 같은) 다른 원자로 대체되는 결합이 포함될 수 있다. 일반적인 뉴클레오타이드간 결합은 인산의 디에스테르 또는 그 유도체로, 예를 들면, 포스페이트, 티오포스페이트(thiophosphates), 디티오포스페이트, 포스포아미데이트, 티오 포스포아미데이트가 있다.
"뉴클레오사이드"란 용어는 당에 연결된 핵염기로 구성된 화합물을 구체적으로 지칭한다. 이러한 당으로는, 오각형 고리(furanose ring)(예컨대, 리보스), 2'-디옥시리보스 및 비(non)-오각형 고리(예컨대, 사이클로헥센일, 안하이드로헥시톨, 모르폴리노)가 포함되되, 이에 한정되지는 않는다. 뉴클레오사이드에 포함된 당과 관련하여 이하 표시되는 변형, 치환 및 위치들이 오각형 고리를 참조하여 설명되되, 동일한 변형 및 위치가 다른 당 고리의 유사한 위치에도 적용된다. 당은 추가적으로 변형될 수 있다. 당 변형의 비제한적 예로는 예를 들어 수소; 하이드록시; 메톡시, 에톡시, 알릴옥시, 이소프로폭시, 부톡시, 이소부톡시, 메톡시에틸, 알콕시, 페녹시와 같은 알콕시; 아지도(azido); 아미노; 알킬아미노; 플루오로; 클로로; 및 브로모를 포함하는 오각형 당 고리의 예컨대 2'- 또는 3'-위치(구체적으로는 2'-위치)에서의 변형; 2'-4'- 및 3'-4'-연결된 오각형 당 고리 변형을 특히 언급할 수 있으며, 여기서 오각형 당 고리에서의 변형은 예를 들면 고리 4'-O를 S, CH2, NR, CHF 또는 CF2로 치환하는 것을 포함한다.
"핵염기"란 용어는 특히 상보적인 핵염기 또는 핵염기 유사물과 쌍을 이룰 수 있는 질소-함유 헤테로사이클릭 부분을 구체적으로 지칭하는 것으로 이해하면 된다. 전형적인 핵염기는, 자연발생적 핵염기로서, 퓨린 염기인 아데닌(A) 및 구아닌(G)과, 피리미딘 염기인 티민(T), 사이토신(C) 및 우라실(U)을 포함하며; 다른 합성 및 천연 핵염기를 포함하는 변형된 핵염기로서, 예를 들어 5-메틸사이토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 사이토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌과 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌과 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로피닐 우라실 및 사이토신, 그리고 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-우라실(pseudouracil), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히는 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-디아자구아닌 및 7-디아자아데닌, 3-디아자구아닌 및 3-디아자아데닌, 및 불소화 염기를 포함한다. 추가의 변형된 핵염기로는, 트리사이클릭 피리미딘, 예를 들어 페녹사진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예를 들어 치환된 페녹사진 시티딘(예컨대, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조옥사진-2(3H)-온), 카바졸 시티딘(2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)을 포함한다. 잠재적으로 적합한 다른 염기로는, 만능(universal) 염기, 소수성 염기, 프로미스큐어스(promiscuous) 염기 및 크기-확대형 염기가 포함된다.
"올리고뉴클레오타이드"는 보통 약 2개 내지 약 50개의 인접한 아단위를 갖는 뉴클레오사이드 아단위 중합체를 가리킨다. 뉴클레오사이드 아단위들은 다양한 아단위간 결합에 의해 연결될 수 있다. 또한, "올리고뉴클레오타이드"는, 당업자에 공지되어 있는 변형체들, 이를 테면 당 주쇄에 대한 변형체(예컨대, 포스포아미데이트, 포스포로디티오에이트), 당류에 대한 변형체(예컨대, 2'-F, 2'-OMe 같은 2' 치환), 염기에 대한 변형체, 그리고 3' 및 5' 말단에 대한 변형체를 포함한다. 통상, 본 발명에서 올리고뉴클레오타이드는 2 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오사이드, 2'-디옥시리보뉴클레오사이드, 2'-치환된 리보뉴클레오사이드, 2'-4'-고정된-리보뉴클레오사이드, 3'-아미노-리보뉴클레오사이드, 3'-아미노-2'-디옥시리보뉴클레오사이드 중에서 선택되는 뉴클레오사이드를 포함한다.
본 발명의 일부 올리고뉴클레오타이드에서, R은 메틸렌아실옥시기, 메틸렌카보네이트기 및 메틸렌카바메이트기 중에서 선택된다.
R이 메틸렌아실옥시기인 경우에는 바람직하게 화학식 -CH2-O-C(O)-R0 (식 중, R0은 C1-C20의 포화, 불포화, 헤테로사이클릭 또는 방향족, 탄화수소 잔기임)에 해당된다. R0이 포화 탄화수소 잔기인 경우에는 바람직하게 선형, 분지형 또는 고리형 알킬 잔기 중에서 선택된다. R0은 예를 들어 저급알킬 또는 사이클로알킬(C1-C7) 잔기 중에서 선택될 수 있다. 구체적으로 포화 탄화수소 잔기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 터트-부틸 사이클로펜틸 및 사이클로헥실 중에서 중에서 선택된다. 메틸기, 에틸기 또는 n-프로필기가 바람직하다. 에틸기가 더 특히 바람직하다. R0이 방향족 잔기인 경우에는 6 내지 14개의 탄소 원자를 가진 방향족 시스템 중에서 적합하게 선택된다. 구체적으로 방향족 잔기는 예를 들어 아릴 또는 헤테로아릴, 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클 또는 헤테로치환기(예컨대, 할로겐, 아민, 에테르, 카복실레이트, 니트로, 티올, 설폰산 및 설폰)로 치환가능한 페닐기 및 나프틸기 중에서 선택된다. 페닐기가 바람직하다. R0이 헤테로사이클릭 잔기인 경우에는 환형 탄소 원자를 통해 카보닐기에 결합된 하나 이상의 환형 N, O 또는 S 원자를 함유하는 헤테로사이클 중에서 종종 선택된다. 이러한 헤테로사이클릭 잔기의 구체적인 예에는 피리딘 및 퓨란이 포함된다.
특정 양상에 의하면, 올리고뉴클레오타이드는 P-S-R 결합(R은 본원에 기술된 바와 같은 메틸렌아실옥시기임)을 포함하는 2개 이상의 뉴클레오타이드간 결합 및 3개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다.
R이 메틸렌카바메이트기인 경우에는 바람직하게 화학식 -CH2-O-C(O)-NRxRy (식 중, Rx 및 Ry는 독립적으로 알킬 또는 (헤테로)아릴 중에서 선택됨)에 해당된다. 바람직하게 Rx 및/또는 Ry는 알킬기이다. 이 경우에 Rx 및/또는 Ry는 예를 들어 저급알킬 또는 사이클로알킬 (C1-C7) 잔기 중에서 선택될 수 있다. 구체적으로 알킬기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 터트 부틸, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실 중에서 선택된다. 메틸기, 에틸기 또는 n-프로필기가 바람직하다. 특히 바람직한 양상에 의하면 메틸렌 카바메이트기 내의 Rx 및 Ry는 둘 다, 구체적으로는 이전에 기술한 바와 같은, 알킬기이다. N,N-디메틸 또는 N,N-디에틸기가 더 특히 바람직하다. 본 구현예의 다른 양상에 의하면, Rx 및 Ry는 함께 O, N 및 S 중에서 선택되는 추가 환형 헤테로원자를 임의로 함유한 3 내지 8원 고리를 형성한다. 구체적인 예로는 N-피페리딜 또는 N-피롤리딜기가 포함된다.
R이 메틸렌카보네이트기인 경우에는 바람직하게 화학식 -CH2-O-C(O)ORx(식 중, Rx는 임의 치환된 알킬, 사이클로알킬 및 (헤테로)아릴기 중에서 선택됨)에 해당된다. 바람직하게, Rx는 알킬기이다. 이 경우 Rx는 예를 들어 저급알킬 또는 사이클로알킬 (C1-C7) 잔기 중에서 선택될 수 있다. 구체적으로 알킬기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 터트 부틸, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실 중에서 선택된다. 메틸기, 에틸기 또는 n-프로필기가 바람직하다. 에틸기가 더 특히 바람직하다. Rx가 아릴기인 경우에는 6 내지 14개의 탄소 원자를 가진 방향족 시스템 중에서 적합하게 선택된다. 구체적으로 방향족 잔기는 페닐기 및 나프틸기 중에서 선택된다. 페닐기가 바람직하다. Rx가 헤테로사이클릭 잔기인 경우에는 환형 탄소 원자를 통해 옥시카보닐기에 결합된 하나 이상의 환형 N, O 또는 S 원자를 함유하는 헤테로사이클 중에서 종종 선택된다. 이러한 헤테로사이클릭 잔기의 구체적인 예에는 피리딘 및 퓨란이 포함된다.
R이 메틸렌아실옥시기, 메틸렌카보네이트기 및 메틸렌카바메이트기 중에서 선택되는 경우에 대해 앞서 제공된 치환기 Rx, Ry 및 R0의 정의 및 선호사항은 화학식(I)에 있는 X 및/또는 Y가 황(sulfur)인 해당 티오유사체(thioanalogue)에 똑같이 적용된다는 것은 물론이다. 또한 언급한 치환기는 예를 들어 할로겐 또는 알콕시 치환기에 의해 임의치환되거나 또는 예를 들어 연쇄(catenary) 헤테로원자, 특히는 산소를 알킬 사슬에 삽입하여 변형될 수 있음은 물론이다.
본 발명의 구체적인 제2 목적은 화학식 R"-S-R (식 중, R은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드에 관해 이전에 정의된 바와 같고, R"는 이탈기임)의 황화제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 황화제가, 구체적으로는 올리고뉴클레오타이드 내에 S-보호된 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 형성하는데 특히 효율적인 황 전달을 가능하게 한다는 것이 발견되었다. 본 발명에 따른 황화제는 보호된 황을 도입시키며, 상기 보호된 황으로부터 보호기를 선택적 및 효율적으로 절단시킬 수 있다.
본 발명에 따른 황화제에서, 이탈기 R"는 일반적으로 친전자성 기이다. 종종, R"는 황에 결합된 친전자성 질소 원자를 함유한 기이다. 친전자성 질소 원자는 하나 이상의 전자를 끄는(electron-withdrawing)기로 적합하게 치환된다.
본 발명의 황화제에 대한 특정의 일 구현예에서, 황화제는 화학식(II)에 해당된다:
Figure pct00002
(식 중, RA 및 RB는 서로 동일하거나 상이하며 RA 및 RB 중 적어도 하나는 치환된 설포닐기 또는 아실기 중에서 선택되며, 상기 RA 및 RB는 임의로 함께 고리형 치환기를 형성함).
RA 및 RB 중 적어도 하나, 바람직하게는 이들 중 하나가 치환된 설포닐인 경우에는 일반적으로 알킬설포닐기 및 아릴설포닐기 중에서 선택된다. 바람직하게, RA 및 RB 중 적어도 하나가 알킬설포닐기인 경우, 그의 알킬 치환기는 바람직하게 저급알킬 또는 사이클로알킬(C1-C7) 잔기 중에서 선택된다. 구체적으로 알킬기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 터트-부틸, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실기 중에서 선택된다. 메틸기, 에틸기 또는 n-프로필기가 바람직하다. 메틸기가 더 특히 바람직하다. RA 및 RB 중 적어도 하나가 아릴설포닐기인 경우, 그의 아릴 치환기는 예를 들어 임의치환된 페닐기이다. RA 및 RB 중 적어도 하나, 바람직하게는 양측 모두가 아실기인 경우에는 일반적으로 알킬아실기 및 아릴아실기 중에서 선택된다. 바람직하게, RA 및 RB 중 적어도 하나가 알킬아실기인 경우, 그의 알킬 치환기는 바람직하게 저급알킬 또는 사이클로알킬(C1-C7) 잔기 중에서 선택된다. 구체적으로 알킬기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 터트-부틸, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실기 중에서 선택된다. 메틸기, 에틸기 또는 n-프로필기가 바람직하다. 메틸기, 에틸기 또는 n-프로필기가 바람직하다. 메틸기가 더 특히 바람직하다. 특히 바람직한 구현예에서, RA 및 RB는 함께 고리형 치환기, 바람직하게는 4 내지 7원 고리형 치환기를 형성하는 아실기이다.
특정의 일 구현예에서, 황화제는 화학식(III)에 해당된다:
Figure pct00003
(식 중, R1, R3 및 R4는 독립적으로 C1-C20의, 임의의 불포화 또는 방향족의 탄화수소 잔기이며, 바람직하게는 선형 또는 분지형 알킬기 또는 사이클로알킬기임).
본 발명에 따른 황화제의 또 다른 특정 구현예에서, R"는 디카복실아미드이다. 본 발명의 구체적인 일 양상에서, 황화제는 화학식(IV)에 해당된다:
Figure pct00004
(식 중, Z는 -CH2-CH2-, -CH=CH-, -CH2-O-CH2-,
Figure pct00005
로 이루어진 군 중에서 선택되는 기이며, 바람직하게 Z는
Figure pct00006
기임).
본 발명의 구체적인 제3 목적은 본 발명에 따른 황화제의 합성 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 설퍼릴 할라이드, 바람직하게는 염화 설포릴을 화학식 R-S-C(O)-R2(식 중, R은 앞서 기술한 바와 같고, R2는 유기 잔기로서 바람직하게는 C1-C20 임의의 불포화 또는 방향족 탄화수소 잔기 중에서 선택됨)의 티오아세탈과 반응시켜 화학식 R-S-W (식 중, W는 할로겐이며, 바람직하게는 C1임)의 중간생성물을 생성하는 단계, 및 (b) 상기 중간생성물을 N-설포닐 화합물 또는 N-아실 화합물과 반응시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 더 구체적인 구현예에 의하면, 화학식 R1-C(O)-O-CH2-S-C(O)-R2 (식 중, R1 및 R2는 독립적으로 C1-C20 임의의 불포화 또는 방향족 탄화수소 잔기임)의 티오아세탈은 염화 설퍼릴과 반응하여 화학식 R1-C(O)-O-CH2-S-Cl(식 중, R1은 독립적으로 C1-C20, 임의의 불포화 또는 방향족 탄화수소 잔기임)의 중간생성물을 생성한다. 본 발명의 다른 구체적인 구현예에 의하면, 단계 (b)에서 중간생성물은 화학식 R3-S(O)2-NH-R4 (식 중, R3 및 R4는 독립적으로 유기 잔기이며, 바람직하게는 C1-C20 임의의 불포화 또는 방향족 탄화수소 잔기임)의 N-설포닐 화합물과 반응한다.
황화제 합성을 위한 본 발명에 따른 방법에서, 단계 (a)의 반응은 일반적으로 비양성자성 극성 유기 용매 중에, 예를 들면 할로겐화 탄화수소 용매(특히, 염화메틸렌 같은 염소화 탄화수소 용매) 중에 수행된다.
황화제 합성을 위한 본 발명에 따른 방법에서, 단계 (a)의 반응은 일반적으로 -80℃ 내지 30℃의 온도에서 수행된다.
황화제 합성을 위한 본 발명에 따른 방법에서, 단계 (b)의 반응은 일반적으로 비양성자성 극성 유기 용매 중에, 예를 들면 할로겐화 탄화수소 용매(특히, 염화메틸렌 같은 염소화 탄화수소 용매) 중에 수행된다.
황화제 합성을 위한 본 발명에 따른 방법에서, 단계 (b)의 반응은 일반적으로 -20℃ 내지 50℃, 바람직하게는 0℃ 내지 30℃의 온도에서 수행된다.
본 발명의 구체적인 제4 목적은 본 발명에 따른 황화제를 이용하여 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 본 발명에 따른 방법은 적어도 (a) 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드 중에서 선택된 두 반응물질 사이에 인광성 뉴클레오타이드간 결합을 형성하는 커플링 단계 및 (b) 본 발명에 다른 황화제를 사용하여 상기 인광성 뉴클레오타이드간 결합을 황화시키는 단계를 포함한다. 단계 (a) 및 (b)는 황화 올리고뉴클레오타이드의 3' 또는 5'를 탈보호시킨 이후에 반복될 수 있다.
바람직하게 상기 제조 방법의 단계 (a)는 H-포스포네이트 모노에스테르염을 보호된 뉴클레오사이드와 커플링시키거나 또는 자유 하이드록시기를 갖는 올리고뉴클레오타이드와 커플링시켜 H-포스포네이트 디에스테르 결합을 형성하는 조작을 포함한다. 이러한 커플링 조작은 바람직하게 용액 상에서 수행된다.
단계 (a)는 바람직하게 극성 비양성자성 유기 용매 중에, 예를 들면 할로겐화 용매 또는 질소-함유 용매, 더 구체적으로 N-헤테로사이클릭 용매 또는 염소화 탄화수소, 훨씬 더 구체적으로는 아세토니트릴 및 피리딘(바람직하게는 피리딘) 중에 수행된다. H-포스포네이트 디에스테르를 형성하는 반응은 바람직하게 카복실산 할라이드, 특히는 염화피발로일(pivaloyl chloride)에 의해 활성화된다.
단계 (a)는 일반적으로 -40℃ 내지 30℃, 바람직하게는 0℃ 내지 20℃의 온도에서 수행된다.
본 발명에 따른 방법의 단계 (a) 및 그 특정 구현예들에서, 액체 반응매질은 일반적으로 반응매질 총 중량에 대해 20 중량% 이상의 H-포스포네이트 올리고뉴클레오타이드를 함유한다. 바람직하게 이 함량은 20% 중량 이상이다. 액체 반응매질은 일반적으로 반응매질 총 중량에 대해 50 중량% 이하의 H-포스포네이트 올리고뉴클레오타이드를 함유한다.
단계 (a)의 커플링 생성물, 구체적으로 H-포스포네이트는 단계 (b)에서 단리된 후 황화된다. 바람직하게는 단계 (b)에서 단리 조작 없이 사용될 수도 있다. 형성된 디에스테르의 황화반응은, 적절한 용매에 적합하게 용해된 상태의 황화제를 현장에서 첨가시켜 수행될 수 있거나 또는 반응 혼합물로부터 형성된 디에스테르를 미리 정제시킨 후에 수행될 수 있다.
단계 (b)는 바람직하게 극성 비양성자성 유기 용매 중에, 예를 들면 할로겐화 탄화수소 용매, 구체적으로는 염화메틸렌 같은 염소화 탄화수소 용매를 비롯한 용매 중에 수행된다. 특정 양상에서, 단계 (b)는 할로겐화 탄화수소 용매 및 질소-함유 용매, 더 구체적으로 N-헤테로사이클릭 용매, 바람직하게는 피리딘을 함유한 혼합물 용매에서 수행된다. 구체적으로 단계 (a)의 커플링 생성물이 단리 조작 없이 황화되는 경우에는 피리딘/염화메틸렌 혼합물이 더 특히 바람직하다.
단계 (b)는 일반적으로 -40℃ 내지 30℃, 바람직하게는 0℃ 내지 20℃의 온도에서 수행된다.
단계 (b)에서, 황화반응 대상 뉴클레오타이드간 결합의 양에 대한 황화제의 몰비는 일반적으로 1 이상, 종종 1.5 내지 4.0, 바람직하게는 2.0 내지 3.0이다.
단계 (b)에서, 중간생성물인 H-포스포네이트 디에스테르는 바람직하게 활성제, 특히는 염기에 의해 활성화된다. 적합한 염기로는 알킬아민, 구체적으로 3차 알킬아민이 포함되며, 디이소프로필에틸아민이 바람직하다.
제5 양상에서, 본 발명은, 앞서 본원에 기술한 바와 같이 하나 이상의 P-S-R 결합을 가진 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 정제 방법에 관한 것이다. 본 양상의 일 구현예에 의하면, 상기 방법은 적어도 제2 올리고뉴클레오타이드를 침전시키는 단계를 포함한다. 더 구체적인 구현예에 의하면, 본 방법은 제2 올리고뉴클레오타이드를, 특히는 침전 단계로부터 회수된 고체 물질로부터, 용매를 이용하여 추출하는 단계를 더 포함한다. 추출용으로 적합한 용매로는 극성 유기 용매가 포함된다.
이러한 정제는 본 발명의 방법에 따라 수득되는 보호된 올리고뉴클레오타이드의 침전 및 추출 기법을 조합시킴으로써 효과적으로 달성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 주어진 올리고뉴클레오타이드의 서열 및 길이를 고려하여 침전을 위한 정확한 조건을 결정할 수 있다. 침전법은 일반적으로 (a) 올리고뉴클레오타이드를 극성 유기 용매에 용해시키는 단계, 및 (b) 용액이 탁하게 될 때까지 비극성 유기 용매를 첨가하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 침전을 통해 단리 및 정제될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
단계 (a)에서 올리고뉴클레오타이드를 용해시키는데 사용되는 용매는 바람직하게 염화메틸렌 및 클로로포름 같은 할로겐화 탄화수소; 아세토니트닐 및 피리딘 같은 질소-함유 용매; 및 아세톤 같은 카보닐-함유 용매 중에서 선택된다.
일반적으로, 단계 (a)에서, 약 0.5(n+1)mL 내지 약 2.0(n+1)mL의 범위 내, 바람직하게는 약 1.0(n+1)mL (n은 포스포로티오에이트 트리에스테르 결합의 밀리몰 수임)의 용매 부피가 사용된다.
제2 올리고뉴클레오타이드의 용액이 탁해질 때까지, 용액을 바람직하게는 탄화수소, 예를 들어, 헥산 같은 알칸 용매, 특히 MTBE 같은 에테르 용매 및 이들의 혼합물 (예컨대, 바람직하게는 헥산/MTBE 혼합물) 중에서 선택된 비극성 유기 용매로 처리한다. 다른 특정 구현예에서는, 이렇게 얻은 탁한 용액을 후속으로 침전보조제로 처리한다.
이러한 경우, 침전보조제는 일반적으로 비활성 다공성 고체 중에서 선택되며, 바람직하게는 셀라이트, 석탄, 목재셀룰로오스, 및 실리카 또는 알루미나 같은 크로마토그래피 고정상 중에서 선택된다.
이러한 경우, 침전보조제는 일반적으로 약 0.25(n+1)g 내지 약 1.5(n+1)g의 범위 내, 바람직하게는 약 0.75(n+1)g (n은 포스포로티오에이트 트리에스테르 결합의 밀리몰 수임)의 양으로 사용된다.
바람직하게, 침전보조제를 첨가하고 난 후 혼합물을 앞서 기술된 바와 같은 비극성 유기 용매의 제2분획으로 처리한다. 상기 분획의 부피는 일반적으로 약 1(n+1)mL 내지 약 4(n+1)mL의 범위에 속하며, 바람직하게는 약 2.0(n+1)mL (n은 포스포로티오에이트 트리에스테르 결합의 밀리몰 수임)이다.
침전 이후, 특히는 침전보조제를 사용한 경우, 결과로 얻은 혼합물은 일반적으로 고액분리(solid/liquid separation) 조작(바람직하게는 여과 조작)을 거치게 된다. 일반적으로 올리고뉴클레오타이드는 고액분리 조작으로부터 회수되는 고체로부터 회수되며, 특히는 극성 유기 용매를 이용한 추출법에 의해 침전보조제로부터 회수되며, 이때 극성 유기 용매는 바람직하게 카보닐형 용매(예컨대, 아세톤), 질소-함유 용매(예컨대, 아세토니트릴) 및 할로겐화 탄화수소(예컨대, 염화메틸렌 및 클로로포름) 중에서 선택된다.
상기 침전 처리로부터 얻은 올리고뉴클레오타이드는 유기 용매 및 물 사이를 분리(partitioning)시킴으로써 더 정제될 수 있다. 이 단계는 보통 수용액층에 용해되는 극성 불순물을 생성물로부터 분리시킨다. 본 구현예에서, 올리로뉴클레오타이드가 적합하게는 유기 용매 중에, 구체적으로는 질소-함유 용매 같은 극성 유기 용매, 특히 아세토니트릴, DMF 같은 포름아미드, 피리딘 같은 N-헤테로사이클, 아세톤 같은 카보닐형 용매, 또는 THF 또는 DMSO 중에 용해된다.
사용되는 유기 용매의 부피는 일반적으로 약 2.0(n+1)mL 내지 약 8.0(n+1)mL의 범위에 속하며, 바람직하게는 약 4.0(n+1)mL (n은 포스포로티오에이트 트리에스테르 결합의 밀리몰 수임)이다. 수성 매질, 구체적으로는 물을 이용하여 용액을 처리한다. 사용되는 수성매질의 부피는 일반적으로 유기 용매의 약 0.5 당량 부피 내지 약 1.5 당량 부피로, 보통은 유기 용매의 약 0.7 당량 부피이다. 수성매질을 이용한 처리가 끝나면, 올리고뉴클레오타이드-함유 층은 일반적으로 분리되며, 적절하다면, 추가 처리하여 정제된 올리고뉴클레오타이드를 얻을 수 있다.
본 발명의 구체적인 제6 목적은 하나 이상의 포스포티오에이트기를 갖는 제2 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 본 발명에 따른 제1 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계, 및 (b) 상기 제1 올리고뉴클레오타이드로부터 하나 이상의 R기를 절단시켜 하나 이상의 티오포스페이트 결합을 갖는 상기 제2 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일부 특정 구현예에서, R기는 용액상 제1 올리고뉴클레오타이드를 염기와 반응시켜 절단되며, 이때 염기는 바람직하게 알킬, 사이클로알킬 및 방향족 아민 중에서; 더 바람직하게는 일차 아민, 예를 들어 알킬기가 C1 내지 C8 선형 또는 분지형 알킬 중에서 바람직하게 선택되는 동일하거나 상이한 치환기들을 포함하는 알킬 일차 아민, 또는 이차 알킬아민 중에서; 가장 바람직하게는 n-프로필 및 터트-부틸 아민 중에서 선택되고, 바람직하게 염기는 장애 일차 아민이다.
특정의 일 구현예에 의하면, 본 발명의 제6 양상에 따른 절단 단계는 입체 장애 염기, 및 일반적으로 N-헤테로방향족 염기로 이루어진 활성제의 존재 하에 수행된다. 바람직하게 활성제는 1,2,4-트리아졸 또는 기타 트리아졸 및 테트라졸 유도체이고, 더 바람직하게 이러한 활성제는 입체 장애 염기, 구체적으로 터트-부틸 아민과 함께 사용된다.
S-메틸렌-에스테르, -카보네이트 또는 -카바메이트 기의 탈보호는 예를 들면 보호된 뉴클레오타이드를 예컨대 t-부틸아민 같은 입체 장애 염기를 이용하여 처리함으로써 달성할 수 있다. 이들 벌크형 아민이 특히 선택성이 높은데 그 이유는 이들이 핵염기, 특히 카보닐 산소 위치에서 보호된 핵염기와 반응하지 않기 때문이다. 이들 아민은 실제로 핵염기 부분과의 가능한 부가 반응(side-reaction)을 제한하거나 또는 실질적으로 방지시킨다. 표준 조건 하에서 입체 장애 아민과, 예를 들면, S-메틸렌프로파노에이트와의 반응도를 향상시키기 위해, 활성제를 적절하게 첨가시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 적합한 활성제의 예로는 N-헤테로사이클릭 염기, 예컨대, 디아졸, 트리아졸, 및 이들의 유도체가 포함된다. 본 구현예는 특히 신속하고 효율적인 청정(clean) 탈보호 반응을 가능하게 한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 탈보호 방법은 치환된 아닐린을 염기로 이용하며, 여기서 아닐린의 아릴기는 선형 또는 분지형 알킬 또는 아릴 치환기를 제2 및/또는 6 위치에 함유(예컨대, 2,6-디메틸아닐린 및 2,6-디에틸아닐린)한다.
제6 양상에 따른 탈보호 방법은 바람직하게 비양성자성 극성 유기 용매 중에, 예를 들면 질소-함유 용매 중에, 더 구체적으로는 N-헤테로사이클릭 용매 (바람직하게는 피리딘) 중에 수행된다.
제6 양상에 따른 탈보호 방법은 일반적으로 -10℃ 내지 50℃, 바람직하게는 0℃ 내지 30℃의 온도에서 수행된다.
본 발명의 제6 양상 및 그의 특정 구현예들에서, 액체 반응매질은 일반적으로 반응매질 총 중량에 대해 20 중량% 이상의 제1 올리고뉴클레오타이드를 함유한다. 바람직하게 이 함량은 50 중량% 이상이다.
본 발명의 제6 양상에서, 사용되는 염기의 양은 일반적으로 5n mmol 내지 15n mmol의 범위에 속하며, 바람직하게는 약 10n mmol (n은 포스포로티오에이트 트리에스테르 결합의 밀리몰 수임)이다.
본 발명의 제6 양상에서 활성제를 사용하는 경우에, 사용되는 활성제의 양은 일반적으로 0.5n mmol 내지 3n mmol의 범위에 속하며, 바람직하게는 1.5n mmol (n은 포스포로티오에이트 트리에스테르 결합의 밀리몰 수임)이다.
하기의 실시예들은 본 발명을 예시하고자 함이며, 본 발명의 범주를 제한하고자 함이 아니다.
이들 실시예 및 본 명세서에 걸쳐 사용된 약자들의 정의는 다음과 같다:
CH2Cl2는 디클로로메탄, KI는 요오드화칼륨, Na2S2O3은 나트륨 티오설페이트, DME는 디메톡시에탄, DIPEA는 디이소프로필에틸아민, NaCl은 염화나트륨, MTBE는 메틸 터트-부틸 에테르, EtOAc는 에틸아세테이트, HCl은 염산, Na2SO4는 황산나트륨, N2는 이질소(dinitrogen), Br2는 브롬, SO2Cl2는 염화티오닐, NaHCO3은 중탄산나트륨, CDCl3은 중수소치환된 클로로포름, THF는 테트라하이드로퓨란, DMSO는 디메틸설폭사이드, DMF는 N,N-디메틸포름아미드이다.
Ap, Gp, Tp는 전술된 바와 같이 A, G 및 T 핵염기에 각각 연결된 전술된 바와 같은 2-디옥시리보오스 핵염기이며, 이때 A, G 및 T는 다음과 같이 보호된다:
Ap는 A가 N-(퓨린-6-일)벤즈아미드인 2-디옥시리보오스 핵염기이고, Gp는 G가 N-(6-(2,5-디클로로펜옥시)-퓨린-2-일)이소부티르아미드인 2-디옥시리보오스 핵염기이고, Tp는 T가 5-메틸-4-펜옥시피리미딘-2-온인 핵염기이다.
Ap(S), Gp(S) 및 Tp(S)는 전술된 바와 같이 각각 Ap, Gp 및 Tp에 대응되는 4'O-P-티오메틸 프로피오네이트이다. Ap(H), Gp(H) 및 Tp(H)는 전술된 바와 같이 각각 Ap, Gp 및 Tp에 대응되는 4'O-P-H 프로피오네이트이다.
DMTr은 당업자에 공지되어 있는 비스 파라-메톡시 트리틸 보호기이며, 해당 올리고뉴클레오타이드에 결합되는 경우에 전술된 바와 같이 올리고뉴클레오타이드의 5-O'에 결합된다. Lev는 당업자에 공지되어 있는 펜탄 1,4-디온 보호기이며, 해당 올리고뉴클레오타이드에 결합되는 경우에 전술된 바와 같이 올리고뉴클레오타이드의 3-O'에 결합된다.
본 발명의 명세서에서 사용된 약어들이 쓰이는 관행을 하기의 반응식들을 통해 더 설명하기로 한다.
Figure pct00007
Figure pct00008
실시예 1: 비스 - 클로로메틸 디설파이드의 합성
Figure pct00009
1.0 L의 환저 플라스크에 무수 CH2Cl2(200 mL)와 디메틸 디설파이드(27.1mL, 300 mmol)을 투입하였다. 혼합물을 교반시키고 질소 분위기 하에 -78℃까지 냉각시키고, 교반된 혼합물에 걸쳐 염소(Cl2) 기체의 거품을 서서히 발생시켰다. 혼합물이 황색을 띤 녹색 슬러리로 변하였을 때 염소 기체의 첨가를 멈추었다. 저온조(cold bath)를 제거하고 혼합물은 실온까지 자연스럽게 승온되도록 하였다. HCl 진화(evolution) 현상이 용액에서 사라지자 적색 용액이 형성되었다. 혼합물을 먼저 15분 동안 질소로 기포처리하고 이어서 회전증발시켜 휘발성 CH2Cl2를 제거하였다. 잔류물에는 새로운 CH2Cl2(300 mL)를 첨가하였다. 이렇게 얻은 용액을 얼음-물 조 내에서 교반하고, 물(200 mL)에 용해된 KI(139.4g, 840 mmol) 수용액을 서서히 15분에 걸쳐 첨가하였다. 저온조를 제거하고 혼합물을 2 시간 동안 상온에서 교반하였다. 유기층을 분리하고 얼음-물 조 내에서 교반하였으며; I2의 색깔이 사라질 때까지 포화 Na2S2O3 수용액을 서서히 첨가하였다. 유기층을 분리한 후에 물(100 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조한 후에 농축시켜 생성물(42.2g)을 적색 오일 형태로 수득하였다. 수율: 87.3%. 이렇게 얻은 조생성물을 추가 정제없이 다음 단계를 위해 사용하였다.
실시예 2: 비스(프로피오닐옥시메틸)디설파이드의 합성
Figure pct00010
1.0 L의 환저 플라스크에 요오드화나트륨(1.50g, 10.0 mmol), 비스-클로로메틸 디설파이드(16.2g, 100 mmol) 및 무수 DME(150 mL)를 투입하였다. 20분 동안 실온에서 교반시킨 후에, 혼합물을 얼음-물 조에서 냉각시키고, 이어서 DIPEA(42.0 mL, 240 mmol)를 첨가한 후, 프로피온산(16.4 mL, 220 mmol)을 첨가하였다. 저온조를 제거하고 혼합물을 18 시간 동안 실온에서 교반하였다. 회전 증발법에 의해 용매 덩어리(bulk)를 제거하였다. 잔류물에 에틸아세테이트(400 mL)를 첨가하고, 혼합물을 물(150 mL x 2)로 세척하고, 이어서 염수(brine)(80 mL)로 세척하였다. 유기층을 농축시키고 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제시켜 원하는 생성물(9.62g)을 주황색 오일 형태로 수득하였다. 수율: 40.4%.
실시예 3: N- 메틸 메탄설폰아미드의 합성
Figure pct00011
얼음-물 조에서 냉각되고 교반된 수성 메틸아민(물 중에 40%, 152 mL, 1.75 mol)에 염화메탄설포닐(38.7 mL, 500 mmol)을 15분에 걸쳐 적가하였다. 첨가시 내부온도를 20 내지 24℃에 유지하였다. 첨가가 끝나면, 저온조를 제거하고 혼합물은 밤새 실온에서 교반하였다. NaCl(40g)을 첨가하고 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하였다. CH2Cl2(150 mL, 100 mL x 2)를 이용하여 혼합물을 추출하였다. Na2SO4 상에서 건조시킨 후, 용매를 증발시켜 원하는 생성물(48.7g)을 무색의 오일 형태로 수득하였다. 수율: 89.2%.
실시예 4: N- 메틸 -N- 프로피오닐옥시메틸설파닐 메탄설폰아미드의 합성
Figure pct00012
건조된 100 mL 환저 플라스크에 N-메틸 메탄설폰아미드(1.09g, 10.0 mmol), 피리딘(1.66g, 21.0 mmol), 비스(프로피오닐옥시메틸)디설파이드(1.2g, 5.0 mmol) 및 무수 CH2Cl2(8 mL)를 투입하였다. 혼합물을 질소 하에 실온에서 교반하고, 4 mL의 CH2Cl2에 용해된 Br2(0.882g, 5.52 mmol) 용액을 30분에 걸쳐 적가하였다. 그 결과로 얻은 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. MTBE(15 mL)를 첨가하고 얻은 혼합물을 여과시켰다. 고형물을 CH2Cl2(5 mL) 및 MTBE(5 mL)의 혼합물로 세척하였다. 여과액을 농축시키고 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제시켜 원하는 생성물(1.62g)을 무색 오일 형태로 수득하였다. 수율: 71.3%.
실시예 5: 클로로메틸 프로피오네이트의 합성
Figure pct00013
건조된 500 mL 환저 플라스크에 파라포름알데하이드(90.1g, 3000.0 mmol), 무수 염화아연(8.18g, 60.0 mmol)을 투입하였다. 용기를 얼음-물 조에 놓고, 염화프로피오닐(260.6 mL, 3000.0 mmol)을 1시간에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 첨가가 끝나면, 혼합물을 질소 하에 18시간 동안 50℃에서 교반하였다. 혼합물을 증류시켜 원하는 생성물(212.2g)을 무색의 오일 형태로 수득하였다. 수율: 58%.
실시예 6: 프로피온산 아세틸설파닐메틸 에스테르의 합성
Figure pct00014
기계식 교반기, 적가 깔때기 및 질소 주입구가 구비된 건조한 2000 mL 3구 환저 플라스크에, 클로로메틸 프로피오네이트(168.0g, 1370.9 mmol), 무수 CH2Cl2(1000 mL), 및 디이소프로필에틸아민(194.9g, 1508.0 mmol)을 투입하였다. 이 용액을 교반하고 얼음-물 조에서 냉각시킨 후, 여기에 티오아세트산(98.0 mL, 1370.9 mmol)을 서서히 30분에 걸쳐 첨가하였다. 첨가가 끝나면, 혼합물을 교반하고 실온까지 서서히 승온시키고, 밤새 실온에서 교반하였다. 대부분의 CH2Cl2를 회전증발시켰다. 이렇게 얻은 혼합물에, 에틸아세테이트(500 mL) 및 MTBE(500 mL)의 혼합물을 첨가하였다. 혼합물을 여과시키고, 고형물을 에틸아세테이트(100 mL) 및 MTBE(100 mL)의 혼합물로 세척하였다. 여과액을 농축시키고, 잔류물을 증류시켜 원하는 생성물(169.8g)을 황색 오일 형태로 수득하였다. 수율: 76.4%.
실시예 7: N- 메틸 -N- 프로피오닐옥시메틸설파닐 메탄설폰아미드의 합성
Figure pct00015
건조한 1000 mL 환저 플라스크에 프로피온산 아세틸설파닐메틸 에스테르(70.0g, 431.5 mmol), 무수 CH2Cl2(600 mL)을 투입하였다. 용액을 질소 하에 얼음-물 조에서 교반하고, 염화 설퍼릴(34.6 mL, 431.5 mmol)을 첨가하였다. 첨가가 끝나면, 저온조를 제거하고 혼합물은 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 회전증발시켜 모든 휘발성 물질을 제거하였다. 잔류물을 80 mL의 무수 CH2Cl2에 용해시켜 용액 A를 수득하였다.
다른 건조한 1000 mL 환저 플라스크에 N-메틸 메탄설폰아미드(49.5g, 453.1 mmol), 분자체(4Å, 활성화됨, 5.0g) 및 무수 CH2Cl2(200 mL)를 첨가하였다. 용액을 질소 하에 얼음-물 조에서 교반하고, 무수 피리딘(41.9 mL, 517.8 mmol)을 첨가하였다. 첨가가 끝나면, 상기 용액 A를 15분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 그 결과로 얻은 혼합물을 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 헥산(200 mL)을 서서히 첨가한 후 얻은 혼합물을 10분 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 여과시키고, 고형물을 에틸아세테이트: 헥산 = 1:1(80 mL) 혼합물로 세척하였다. 여과액을 농축시키고, 잔류물을 컬럼 상에서 800g의 실리카와, (헥산(2 리터), 에틸아세테이트/헥산(1:9, 3 리터), 에틸아세테이트/헥산(2:8, 4 리터) 및 에틸아세테이트/헥산(3:7, 2 리터) 순서의) 용리액을 이용하여 정제시켰다. 주요 불순물은 20% 에틸아세테이트에서 용출되었고 생성물은 30% 에틸아세테이트에서 용출되었다. 수율: 74.4%.
실시예 8: N- 메탄설폰아미드 숙신이미드의 합성
Figure pct00016
자성 교반기, 열전대, 질소 라인 및 냉각용 얼음조가 구비된 250 mL 3구 환저 플라스크에, 80 mL의 무수 디클로로메탄에 용해된 아세틸설파닐메틸 9.803g(60.43 mmol) 용액을 투입하였다. 플라스크의 내용물을 약 0℃까지 냉각시키고, 이 용액에 총 11.33g(83.94 mmol, 1.38 당량)의 이염화 설퍼릴(sulfuryl dichloride)을 0 내지 5℃의 온도가 유지되는 속도로 서서히 첨가시켰다. 저온조를 제거하고, 반응 혼합물을 추가로 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 그 결과로 얻은 황색 용액을 회전증발기 상에서 농축시켜 8.88g의 조 아세틸메틸설페닐 클로라이드를 악취를 풍기는 점성 황색 오일 형태로 수득하였다. 이 물질은 숙신이미드의 설페닐화 반응을 위한 다음 단계에서 바로 사용되었다.
자성 교반기, 열전대, 질소 라인 및 냉각용 얼음조가 구비된 250 mL 3구 환저 플라스크에, 80 mL의 무수 디클로로메탄에 용해된, 6.12g(61.76 mmol, 1.02 당량)의 숙신이미드 및 8.17g(80.73 mmol, 1.33 당량)의 트리에틸아민의 혼합물을 투입하였다. 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 20 mL의 무수 디클로로메탄에 용해된 조 아세틸메틸설페닐 클로라이드(8.88g) 용액을 숙신이미드 및 트리에틸아민의 미리 냉각된 현탁액에 0 내지 5℃의 온도가 유지되는 속도로 서서히 첨가시켰다. 첨가가 완료되면, 저온조를 제거하고 그 결과로 얻은 갈색 현탁액을 추가 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각수(300 mL) 및 포화 NaHCO3(100 mL)으로 급냉시키고, 디클로로메탄(3x80 mL)으로 추출하였다. 유기층을 합한 후, Na2SO4 상에서 건조시키고 나서 회전증발기 상에서 농축시켜 13g의 어두운 색의 점성 오일을 수득하였다. 이 물질을 용리액으로 EtOAc-헥산 혼합물을 사용하는 실리카 겔 컬럼(120g) 상에서 0 내지 30%의 에탈아세테이트를 이용하여 정제시켜 4.12g의 설펜아미드 N-메탄설폰아미드 숙신이미드를 백색 고형물 형태로 수득하였다. 30% EtOAc-헥산 내 Rf=0.16. 수율: 32%.
실시예 9: 에틸 아세틸설파닐메틸 카보네이트의 합성
Figure pct00017
건조한 100 mL 환저 플라스크에 클로로메틸 클로로포메이트(12.9g, 100.0 mmol), 무수 아세토니트릴(300 mL)을 투입하였다. 용액을 얼음-물 조에서 교반하고, 여기에 무수 에탄올(4.6g, 100.0 mL) 및 무수 피리딘(23.7g, 300 ml)의 혼합물을 20분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 첨가가 끝나면, 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 요오드화나트륨(1.50g, 10.0 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 얼음-물 조에서 교반하고, 티오아세트산(7.6g, 100 mmol)을 5분에 걸쳐 첨가하였다. 첨가가 끝나면, 저온조를 제거하고 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 헥산(600 mL)을 반응 혼합물에 첨가하고 여과시켰다. 여과액을 농축 및 증류시켜 원하는 생성물을 수득하였다.
실시예 10: N- 메틸 -N- 에톡시카보닐옥시메틸설파닐 메탄설폰아미드의 합성
Figure pct00018
건조한 500 mL 환저 플라스크에 에틸 아세틸설파닐메틸 카보네이트(8.9g, 50.0 mmol), 무수 CH2Cl2(200 mL)을 투입하였다. 용액을 질소 하에 얼음-물 조에서 교반하고, 염화 설퍼릴(4.0 mL, 50.0 mmol)을 첨가하였다. 첨가가 끝나면, 저온조를 제거하고 혼합물은 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 회전증발시켜 모든 휘발성 물질을 제거하였다. 잔류물을 50 mL의 무수 CH2Cl2에 용해시켜 용액 A를 수득하였다.
다른 건조한 500 mL 환저 플라스크에 N-메틸 메탄설폰아미드(6.0g, 55.0 mmol), 분자체(4Å, 활성화됨, 3.0g) 및 무수 CH2Cl2(150 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 질소 하에 얼음-물 조에서 교반하고, 무수 피리딘(5.3 mL, 65.0 mmol)을 첨가하였다. 첨가가 끝나면, 상기 용액 A를 10분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 그 결과로 얻은 혼합물을 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 헥산(200 mL)을 서서히 첨가한 후 얻은 혼합물을 10분 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 여과시키고, 고형물을 에틸아세테이트: 헥산 = 1:1(60 mL) 혼합물로 세척하였다. 여과액을 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 컬럼에 의해 정제시켜 원하는 생성물을 수득하였다.
실시예 11: 아세틸설파닐메틸 디메틸카바메이트의 합성
Figure pct00019
건조한 100 mL 환저 플라스크에, 클로로메틸 클로로포메이트(12.9g, 100.0 mmol), 염산 디메틸아민(8.15g, 100 mmol) 및 무수 아세트로니트릴(300 mL)을 투입하였다. 혼합물을 얼음-물 조에서 교반하고, 여기에 N,N-디이소프로필에틸 아민(43.5 mL, 250 mmol)을 30분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 첨가가 끝나면, 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 요오드화나트륨(1.50g, 10.0 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 얼음-물 조에서 교반하고, 티오아세트산(7.6g, 100 mmol)을 5분에 걸쳐 첨가하였다. 첨가가 끝나면, 저온조를 제거하고 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 헥산(300 mL)을 반응 혼합물에 첨가하고 여과시켰다. 여과액을 농축 및 증류시켜 원하는 생성물을 수득하였다.
실시예 12: N- 메틸 -N- 디메틸카바모일옥시메틸설파닐 메탄설폰아미드의 합성
Figure pct00020
건조한 500 mL 환저 플라스크에 에틸 아세틸설파닐메틸 디메틸카바네이트(8.9g, 50.0 mmol), 무수 CH2Cl2(200 mL)을 투입하였다. 용액을 질소 하에 얼음-물 조에서 교반하고, 염화 설퍼릴(4.0 mL, 50.0 mmol)을 첨가하였다. 첨가가 끝나면, 저온조를 제거하고 혼합물은 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 회전증발시켜 모든 휘발성 물질을 제거하였다. 잔류물을 50 mL의 무수 CH2Cl2에 용해시켜 용액 A를 수득하였다.
다른 건조한 500 mL 환저 플라스크에 N-메틸 메탄설폰아미드(6.0g, 55.0 mmol), 분자체(4Å, 활성화됨, 3.0g) 및 무수 CH2Cl2(150 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 질소 하에 얼음-물 조에서 교반하고, 무수 피리딘(5.3 mL, 65.0 mmol)을 첨가하였다. 첨가가 끝나면, 상기 용액 A를 10분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 그 결과로 얻은 혼합물을 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 헥산(100 mL)을 서서히 첨가한 후 얻은 혼합물을 10분 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 여과시키고, 고형물을 에틸아세테이트: 헥산 = 1:1(60 mL) 혼합물로 세척하였다. 여과액을 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 컬럼에 의해 정제시켜 원하는 생성물을 수득하였다.
실시예 13: 중간생성물 H- 포스포네이트의 단리 단계를 포함하는, 완전보호된 디뉴클레오타이드 포스포로티오에이트의 합성
Figure pct00021
실시예 13-1. 1.86g(2.62 mmol, 1.15 당량)의 H-포스포네이트 1 및 0.78g(2.28 mmol)의 3'-보호된 디옥시-티미딘 2의 혼합물을 무수 피리딘(3x25 mL)을 사용하여 동시증발시켰다. 오일성 잔류물을 10 mL의 무수 피리딘에 용해시키고 아르곤 분위기 하에 약 0℃까지 냉각시켰다. 여기에 총 0.56g(4.66 mmol, 2 당량)의 염화피발로일을 주사기를 통해 적가하고, 그 결과로 얻은 혼합물이 상온까지 승온되도록 하였다. 반응물을 추가 15분 동안 교반한 후 50g의 얼음과 100 mL의 희석된 포화 NaHCO3(80 mL의 물과 20 mL의 중탄산나트륨)으로 급냉시켰다. 유기 물질을 디클로로메탄(2x80 mL)으로 추출하고, 추출액을 냉각수(70 mL), 포화 중탄산나트륨(30 mL) 및 염수(10 mL)의 혼합물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조하고 회전증발기 상에서 농축시켜 6.74g의 조 생성물 3을 투명한 오일 형태로 수득하였다. 31P (162 MHz, CDCl3, δ): 8.58 (s) 및 7.06 (s).
20 mL의 무수 피리딘에 용해된 조(crude) H-포스포네이트 3(6.74g)의 용액을 아르곤 분위기 하에서 약 0℃까지 냉각시켰다. 총 1.21g(5.43 mmol, 2.3 당량)의 시제 4를 반응물에 적가하고, 5분 후에는 0.502g(3.88 mmol, 1.7 당량)의 디이소프로필에틸 아민을 또한 플라스크에 투입하였다. 반응물이 상온까지 승온되도록 하고, 추가로 1시간 교반한 후 저온의 희석된 중탄산나트륨(100 mL) 용액을 사용하여 급냉시켰다. 유기 생성물을 디클로로메탄(2x80 mL)으로 추출하고, 물(100 mL)로 세척한 후, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 유기층을 회전증발기 상에서 농축시켜 5.02g의 조 생성물 5(HPLC에 의해 측정하였을 때 약 90% 순도)를 황색 오일 형태로 수득하였다. 31P (162 MHz, CDCl3, δ): 26.77 (s) 및 26.67 (s).
실시예 13-2. 방법 A와 유사하게, H-포스포네이트 1 (1.49g, 2.1 mmol, 1.08 당량) 및 3'-보호된 디옥시티미딘 2(0.66g, 1.94 mmol)를 20 mL의 무수 피리딘 중에 염화피발로일 0.49g(4.06 mmol, 2 당량)의 존재 하에서 반응시킴으로써 중간생성물 H-포스포네이트 3을 얻었다. 반응 혼합물을 냉각수/NaHCO3 수용액/염수의 혼합물로 급냉시킨 후, 디클로로메탄(3x30 mL)을 이용한 추출법에 의해 중간생성물 3을 단리시켰다. 유기 추출액을 물(50 mL), NaHCO3 수용액(20 mL) 및 염수(10 mL)로 세척하였다. Na2SO4로 (약 1분 동안) 건조시킨 후에, 유기층을 원래 부피의 약 1/4까지 농축시키고, 0℃까지 냉각시킨 후, S-전달 시제 4(0.96g, 4.3 mmol, 2.2 당량)를 중간생성물 3에 첨가한 다음에 디이소프로필에틸아민(0.45g, 3.48 mmol, 1.8 당량)을 첨가하였다. 추가 1시간 동안 실온에서 교반하고 난 후, 반응물을 방법 A에 기술된 바와 같이 급냉시켰다. 유기층을 회전증발기 상에서 농축시켜 3.55g의 조생성물 5를 HPLC에 의해 측정된 순도가 91%인 투명한 황색 오일 형태로 수득하였다.
실시예 14: DMTr - Ap (s)T- Lev 의 제조
트리에틸암모늄 6-N-(벤조일)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-디옥시아데노신-3'H-포스포네이트(4.94g, 6.0 mmol) 및 3'-O-레불리닐티미딘(1.70g, 5.0 mmol)의 혼합물을 피리딘으로 증발시켜 무수 상태로 만들고, 무수 피리딘(12.5 mL)을 이용하여 희석한 후, 질소 하에 0℃에서 교반하였다. 후속으로는, 염화피발로일(1.24 mL, 10.0 mmol)을 2분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 5분 동안 교반하고, 염화메틸렌(100 mL) 및 1.25N 아세테이트 나트륨-아세트산 완충액(2 x 100 mL) 사이로 격리되었다. 완충액은 190 mL의 1.25N 아세테이트 나트륨 수용액을 10 mL의 1.25N 아세트산 수용액과 혼합시켜 마련하였다. 유기층을 (Na2SO4 상에서) 건조시키고 농축하였다. 잔류물을 50 mL의 톨루엔으로 동시증발시키고, 무수 염화메틸렌(25 mL)에 용해시킨 후, 무수 염화메틸렌(1.0 mL)에 용해된 N-프로피오닐옥시메틸티오-N-메틸 메탄설폰아미드(2.05g, 9.0 mmol)의 용액을 이용하여 질소 하에 0℃에서 처리한 다음에 N,N-디이소프로필에틸아민(0.87 mL, 5.0 mmol)을 첨가하였다. 30분 동안 상온에서 교반한 후에, 용액 A(MTBE:헥산 = 1:2, 37.5 mL)을 10분에 걸쳐 첨가한 후, 이어서 셀라이트(7.5g)를 첨가하였다. 혼합물을 교반하고, 여기에 A의 추가분(37.5 mL)을 30분에 걸쳐 첨가하였다. 추가 30분 동안 계속 교반하고, 혼합물을 여과하였다. 고형물을, 용액 A 및 CH2Cl2가 5:1의 비율로 이루어진 용매 혼합물(60 mL)로 세척하였다. 그런 후에는 고형물을 염화메틸렌(4 x 40 mL)으로 추출하였다. 염화메틸렌 추출액을 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴(20 mL)에 용해시키고 얼음-물 조에서 교반한 후, 냉각수(14 mL)를 20분에 걸쳐 첨가하였다. 하부층이 염화메틸렌(100 mL) 및 염수 용액(1:1)(60 mL) 사이로 격리되었다. 유기층을 (Na2SO4 상에서) 건조시키고 농축하여 생성물(5.7g)을 백색 고형물 형태로 수득하였다. 수율: 97%. 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 26.7, 26.3.
실시예 15: DMTr - Gp (H)의 제조
피리딘(500 mL)으로 증발시켜 무수 상태로 만든 인산(78.7g, 960.0 mmol)에, 2'-디옥시-6-O-(2,5-디클로로페닐)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-N-이소부티릴구아노신(62.8g, 80.0 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 피리딘으로 증발시켜 다시 무수 상태로 만들었다. 잔류물을 무수 피리딘(480 mL), 그리고 10℃에서 30분에 걸쳐 첨가시킨 염화피발로일(64.0 mL, 520.0 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하고, 농축시켰다. 잔류물을 800 mL의 염화메틸렌에 용해시킨 후에, 냉각수(800 mL) 및 탄산수소 트리에틸암모늄(2.0 N, 400 mL x 2)을 이용하여 순차적으로 세척하였다. 유기층을 (무수 Na2SO4) 상에서 건조시키고, 농축하였다. 잔류물을 80 mL의 염화메틸렌에 용해시키고, 용액 A(MTBE:헥산 = 1:2, 360 mL)를 교반 하에 20분에 걸쳐 첨가한 후, 셀라이트(80g)를 첨가하였다. 다음으로는, 용액 A 추가분(360 mL)을 30분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 혼합물을 여과시키고, 고형물을 MTBE(300 mL)로 세척하였다. 그런 후에는 고형물을 염화메틸렌(200 mL x 4)으로 추출하였다. 염화메틸렌 여과액을 농축시켜 생성물(70.4g)을 백색 포말(foam) 형태로 수득하였다. 수율: 93%. 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 2.71.
실시예 16: DMTr - Gp (s)T- OH 의 제조
트리에틸암모늄 2'-디옥시-6-O-(2,5-디클로로페닐)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-N-이소부티릴구아노신-3'H-포스포네이트(54.9g, 58.0 mmol) 및 3'-O-레불리닐-4-O-페닐티미딘(20.1g, 48.3 mmol)의 혼합물을 피리딘으로 증발시켜 무수 상태로 만들고, 무수 피리딘(121 mL)을 이용하여 희석하였다. 이렇게 얻은 용액을 질소 하에 0℃에서 염화피발로일(11.8 mL, 96.6 mmol)로 5분에 걸쳐 처리하였다. 5분 동안 추가로 교반한 후에, 무수 염화메틸렌(20 mL)에 용해된 N-프로피오닐옥시메틸티오-N-메틸 메탄설폰아미드(22.0g, 96.6 mmol)의 용액에 이어 N,N-디이소프로필에틸아민(8.4 mL, 48.3 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 상온에서 교반시키고, 600 mL의 염화메틸렌을 이용하여 희석하였다. 유기층을 냉각수(600 mL) 및 포화 중탄산나트륨(500 mL x 2)으로 순차적으로 세척하고, (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고, 농축하였다. 잔류물을 97 mL의 염화메틸렌에 용해시키고, 용액 A(MTBE:헥산 = 1:2, 194 mL)를 교반 하에 20분에 걸쳐 첨가한 후, 셀라이트(73g)를 첨가하고, 이어서 용액 A의 추가분(194 mL)을 30분에 걸쳐 첨가하였다. 30분 동안 추가로 교반한 후에, 혼합물을 여과시켰다. 고형물을 MTBE:헥산 = 4:1(200 mL)으로 세척하고, 염화메틸렌(150 mL x 4)으로 추출하였다. 염화메틸렌 여과액을 농축시켜 생성물(68.1g)을 황색 포말 형태로 수득하였다. 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 26.9, 26.2. 본 생성물은 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용되었다. 상기 생성물(64g)을 117 mL의 염화메틸렌에 용해시키고 0℃에서 교반시킨 용액에, 피리딘: 아세트산: 하이드라진 모노하이드레이트 = 37.5 mL: 25.0 mL: 2.5 mL(51.6 mmol)의 냉각 혼합물을 첨가하였다. 1시간 동안 0℃에서 교반한 후에, 반응 혼합물을 염화메틸렌(200 mL)으로 희석시키고 냉각수(500 mL)로 세척하였다. 수용액층을 염화메틸렌(100 mL)으로 다시 추출하였다. 염화메틸렌 추출액을 모아서 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고, 농축하였다. 잔류물을 235 mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 얼음-물 조에서 교반하고, 30분에 걸쳐 서서히 첨가시킨 냉각수(188 mL)로 처리하였다. 하부 유기층을 분리하고, 200 mL의 염화메틸렌을 이용하여 희석한 후 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시켰다. 농축시킨 후, 잔류물을 94 mL의 염화메틸렌에 용해시키고, 이를 20분에 걸쳐 첨가시킨 용액 A(MTBE:헥산 = 1:2, 94 mL), 셀라이트(70g) 및 다시 30분에 걸쳐 첨가시킨 용액 A(94 mL)으로 순차적으로 교반 하에 처리하였다. 혼합물을 여과시키고, 고형물을 MTBE:헥산 = 4:1(300 mL)으로 세척한 후 염화메틸렌(150 mL x 4)으로 추출하였다. 염화메틸렌 여과액을 농축시켜 생성물(52g)을 황색 포말 형태로 수득하였다. 수율: 87%. 이 생성물은 다음 단계에서 바로 사용되었다. 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 28.1, 25.3.
실시예 17: HO - Gp (s)A- Lev 의 제조
트리에틸암모늄 2'-디옥시-6-O-(2,5-디클로로페닐)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-N-이소부티릴구아노신-3'H-포스포네이트(45.4g, 48.0 mmol) 및 2'-디옥시-3'-O-레불리닐-6-N-벤조일아데노신(18.1g, 40.0 mmol)의 혼합물을 피리딘으로 증발시켜 무수 상태로 만들었다. 잔류물을 무수 피리딘(100 mL)으로 희석하고, 이렇게 얻은 용액을 질소 하에 0℃에서 염화피발로일(9.9 mL, 80.0 mmol)로 10분에 걸쳐 처리하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 5분 동안 추가로 교반한 후에 무수 염화메틸렌(10 mL)에 용해된 N-프로피오닐옥시메틸티오-N-메틸 메탄설폰아미드(18.2g, 80.0 mmol)의 용액에 이어 N,N-디이소프로필에틸아민(7.0 mL, 40.0 mmol)으로 처리하였다. 30분 동안 상온에서 교반시키고, 반응 혼합물을 600 mL의 염화메틸렌으로 희석한 후, 냉각수(600 mL) 및 포화 중탄산나트륨(300 mL x 2)을 이용하여 순차적으로 세척하였다. 유기층을 (무수 Na2SO4) 상에서 건조시키고, 농축하였다. 잔류물을 80 mL의 염화메틸렌에 용해시키고, 20분에 걸친 용액 A(MTBE:헥산 = 1:2, 160 mL), 셀라이트(60g), 및 30분에 걸친 용액 A의 추가분(160 mL)을 이용하여 순차적으로 처리하였다. 30분 동안 추가로 교반한 후에, 혼합물을 여과시켰다. 고형물을 MTBE:헥산 = 4:1(200 mL)으로 세척하고, 염화메틸렌(150 mL x 4)으로 추출하였다. 염화메틸렌 여과액을 농축시켰다. 잔류물을 160 mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 얼음-물 조에서 교반한 후, 냉각수(112 mL)로 30분에 걸쳐 처리하였다. 하부 유기층이 분리되어 염화메틸렌(320 mL) 및 물(320 mL) 사이로 격리되었다. 유기층을 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고 농축하여 생성물(64.1g)을 황색 포말 형태로 수득하였다. 본 생성물은 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용되었다. 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 26.2, 26.0.
상기 생성물(64.0g)을 120 mL의 염화메틸렌에 용해시키고 0℃에서 교반시킨 용액에, 피롤(13.9 mL, 200.0 mmol)을 첨가시키고나서 디클로로아세트산(16.5 mL, 200.0 mmol)을 20분에 걸쳐 첨가하였다. 1시간 동안 0℃에서 교반한 후에, 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨(200 mL)으로 급냉시켰다. 수용액층을 염화메틸렌(60 mL x 2)으로 추출하고, 염화메틸렌 추출액을 모아서 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고, 농축하였다. 잔류물을 80 mL의 염화메틸렌에 용해시키고, 이를 15분에 걸쳐 첨가시킨 용액 A(MTBE:헥산 = 1:1, 100 mL), 셀라이트(60g) 및 다시 30분에 걸쳐 첨가시킨 용액 A 추가분(100 mL)으로 순차적으로 처리하였다. 혼합물을 여과시키고, 고형물을 MTBE(150 mL x 2)로 세척한 후 염화메틸렌(200 mL x 4)으로 추출하였다. 염화메틸렌 여과액을 농축시키고나서, 160 mL의 아세토니트릴에 용해시키고 얼음-물 조에서 교반하고, 냉각수(144 mL)로 20분에 걸쳐 처리하였다. 하부 유기층이 분리되어 염화메틸렌(320 mL) 및 염수 용액(1:1)(320 mL) 사이로 격리되었다. 유기층을 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고 농축하여 생성물(40.5g)을 회백색(off-white)의 고형물 형태로 수득하였다. 수율: 92%. 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 26.4, 26.2.
실시예 18: DMTr - Gp (s) Tp (H)의 제조
인산(29.8g, 364.0 mmol)을 피리딘(182 mL)으로 증발시켜 무수 상태로 만들었다. 잔류물에, DMTr-Gp (s)T-OH(33.0g, 26.0 mmol)을 첨가하고 얻은 혼합물을 피리딘으로 증발시켜 다시 무수 상태로 만들었다. 혼합물을 무수 피리딘(130 mL)으로 희석하고, 10℃에서 30분에 걸쳐 첨가시킨 염화피발로일(24.0 mL, 195.0 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 농축시키고, 잔류물을 400 mL의 염화메틸렌에 용해하였다. 이렇게 얻은 용액을 냉각수(400 mL) 및 탄산수소 트리에틸암모늄(2.0 N, 200 mL x 3)으로 순차적으로 세척하였다. 유기층을 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고, 농축하였다. 150 mL의 톨루엔을 이용하여 동시증발시킨 후, 잔류물을 52 mL의 염화메틸렌에 용해시키고, 20분에 걸친 용액 A(MTBE:헥산 = 1:1, 78 mL), 셀라이트(39g), 및 30분에 걸친 용액 A의 추가분(78 mL)을 이용하여 순차적으로 처리하였다. 혼합물을 여과시키고, 고형물을 용액 A 및 CH2Cl2가 5:1의 비율로 이루어진 용매 혼합물(180 mL)로 세척하였다. 고형물을 염화메틸렌(150 mL x 4)으로 추출하고 여과액을 농축시켜 생성물(33.1g)을 회백색의 포말 형태로 수득하였다. 수율: 89%. 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 26.9, 25.4, 3.0, 2.9.
실시예 19: DMTr - Gp (s) Tp (s) Gp (s)A- OH 의 제조
DMTr-Gp (s) Tp(H)(28.6g, 20.0 mmol) 및 HO-Gp (s)A-Lev(16.9g, 15.4 mmol)의 트리에틸암모늄염 혼합물을 피리딘으로 증발시켜 무수 상태로 만들었다. 잔류물을 무수 피리딘(62.0 mL)으로 희석하고, 질소 하에 0℃에서 염화피발로일(4.8 mL, 38.5 mmol)로 5분에 걸쳐 처리하였다. 0℃에서 10분 동안 추가로 교반한 후에, 무수 염화메틸렌(10 mL)에 용해된 N-프로피오닐옥시메틸티오-N-메틸 메탄설폰아미드(7.0g, 30.8 mmol)의 용액에 이어 N,N-디이소프로필에틸아민(2.7 mL, 15.4 mmol)으로 처리하였다. 1시간 동안 상온에서 교반시키고, 반응 혼합물을 450 mL의 염화메틸렌으로 희석한 후, 냉각수(450 mL) 및 포화 중탄산나트륨(300 mL x 2)으로 순차적으로 세척하였다. 유기층을 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고, 농축하였다. 100 mL의 톨루엔을 이용하여 동시증발시킨 후, 잔류물을 62 mL의 염화메틸렌에 용해시키고, 20분에 걸친 용액 A(MTBE:헥산 = 1:1, 124 mL), 셀라이트(46.2g), 및 30분에 걸친 용액 A의 추가분(124 mL)을 이용하여 순차적으로 처리하였다. 30분 동안 추가로 교반한 후에, 혼합물을 여과시키고, 고형물을 용액 A: CH2Cl2 = 6:1 (140 mL)로 세척하였다. 그런 후에는 고형물을 염화메틸렌(150 mL x 4)으로 세척하였다. 염화메틸렌 여과액을 농축시켰다. 잔류물을 123 mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 얼음조에서 교반하면서, 냉각수(86 mL)로 20분에 걸쳐 처리하였다. 하부 유기층이 분리되어 염화메틸렌(300 mL) 및 염수 용액(1:1)(200 mL) 사이로 격리되었다. 유기층을 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고 농축하여 생성물 DMTr-Gp (s) Tp (s) Gp (s)A-Lev(43.4g)을 황색 포말 형태로 수득하였다. 본 생성물은 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용되었다. 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 27.9-25.8(m).
DMTr-Gp (s) Tp (s) Gp (s)A-Lev(38.0g)을 38.0mL의 염화메틸렌에 용해시키고 0℃에서 교반시킨 용액에, 피리딘: 아세트산: 하이드라진 모노하이드레이트 = 14.3 mL: 9.5 mL: 0.95 mL(19.5 mmol)의 냉각 혼합물을 첨가하였다. 40분 동안 0℃에서 교반한 후에, 반응 혼합물을 염화메틸렌(450 mL)으로 희석시키고 냉각수(300 mL x 2) 및 염수(150 mL)로 세척하였다. 염화메틸렌층을 (Na2SO4 상에서) 건조시키고, 농축하였다. 100 mL의 톨루엔을 이용하여 동시증발시킨 후, 잔류물을 60 mL의 염화메틸렌에 용해시키고, 교반 하에 20분에 걸쳐 용액 A(MTBE:헥산 = 1:1, 90 mL)를 첨가한 후 이어서 셀라이트(45g)를 첨가하였다. 혼합물을 교반하고 용액 A 추가분(90 mL)을 30분에 걸쳐 첨가하였다. 혼합물을 여과시키고, 고형물을 용액 A 및 CH2Cl2가 5:1의 비율로 이루어진 용매 혼합물(150 mL)로 세척하였다. 고형물을 염화메틸렌(150 mL x 4)으로 추출하고, 추출액을 농축시키고 잔류물은 에틸아세테이트 내 아세토니트릴 0-80%의 구배를 이용하여 짧은 실리카 컬럼을 통해 정제되었다. 생성물 분획들을 농축시켜 생성물(26.9g)을 황색 포말 형태로 수득하였다. 수율: 82%, 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 27.6-26.0(m).
실시예 20: HO - Gp (s) Tp (s) Gp (s)A - Lev 의 제조
DMTr-Gp (s) Tp (s) Gp (s)A-Lev(7.2g, 2.84 mmol)을 14mL의 염화메틸렌에 용해시키고 0℃에서 교반시킨 용액에, 피롤(2.0 mL, 28.4 mmol)에 이어서, 디클로로아세트산(2.34 mL, 28.4 mmol)을 3분에 걸쳐 첨가하였다. 30분 동안 0℃에서 교반한 후에, 반응 혼합물을 14 mL의 염화메틸렌으로 희석하고나서, 여기에 포화 중탄산나트륨(50 mL)을 서서히 첨가하였다. 수용액층을 염화메틸렌(40 mL)으로 추출하고, 염화메틸렌 추출액을 모아서 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고, 농축하였다. 잔류물을 30 mL의 염화메틸렌에 용해시키고, 용액 A(MTBE:헥산 = 2:1, 45.0 mL), 셀라이트(9.0g) 및 다시 30분에 걸쳐 첨가시킨 용액 A 추가분(45.0 mL)을 이용하여 순차적으로 처리하였다. 혼합물을 여과시키고, 고형물을 MTBE(40 mL x 2)로 세척한 후 염화메틸렌(50 mL x 4)으로 추출하였다. 염화메틸렌 추출액을 농축시키고, 잔류물을 28.4 mL의 아세토니트릴에 용해시킨 후 얼음조 내에서 교반하면서 냉각수(28.4 mL)로 20분에 걸쳐 처리하였다. 유기층을 염화메틸렌(80 mL)으로 희석하고 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고 농축하여 생성물(5.7g)을 회백색의 고형물 형태로 수득하였다. 수율: 95%. 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 27.4-26.2(m).
실시예 21: DMTr - Gp (s) Tp (s) Gp (s) Ap (H)의 제조
인산(4.7g, 57.3 mmol)을 피리딘(29 mL)으로 증발시키고, DMTr-Gp(s)Tp(s)Gp(s)A-OH(8.7g, 3.58 mmol)와 혼합하였다. 혼합물에 피리딘을 첨가시켜 증발시킴으로써 혼합물을 무수 상태로 만들고, 무수 피리딘(29.0 mL)을 이용하여 희석하였다. 혼합물을 교반하고 여기에 염화피발로일(3.75 mL, 30.4 mmol)을 10℃에서 5분에 걸쳐 첨가하였다. 이렇게 얻은 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔류물을 200 mL의 염화메틸렌에 용해시키고, 냉각수(100 mL) 및 탄산수소 트리에틸암모늄(2.0N, 100 mL x 3)을 이용하여 순차적으로 세척하였다. 유기층을 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고 농축하여 생성물(9.15g)을 회백색의 포말 형태로 수득하였다. 수율: 98%. 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 27.5-25.8(m), 2.9, 2.8.
실시예 22: HO - Gp (s) Tp (s) Gp (s) Ap (s) Gp (s) Tp (s) Gp (s)A- Lev 의 제조
DMTr-Gp (s) Tp (s) Gp (s) Ap(H)(10.1g, 3.9 mmol) 및 HO-Gp (s) Tp (s) Gp (s)A-Lev(6.7g, 3.0 mmol)의 트리에틸암모늄염 혼합물을 피리딘으로 증발시켜 무수 상태로 만들고 무수 피리딘(15.0 mL)을 이용하여 희석시켰다. 이렇게 얻은 혼합물을 0℃에서 교반하면서 염화피발로일(1.1 mL, 9.0 mmol)을 2분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 상온에서 교반하고, 다시 0℃에서 냉각시킨 후, 무수 염화메틸렌(2.0 mL)에 용해된 N-프로피오닐옥시메틸티오-N-메틸 메탄설폰아미드(1.70g, 7.5 mmol)의 용액에 이어 N,N-디이소프로필에틸아민(0.78 mL, 4.5 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 상온에서 교반하고, 300 mL의 염화메틸렌을 이용하여 희석시켰다. 유기층을 냉각수(300 mL) 및 포화 중탄산나트륨(200 mL)으로 순차적으로 세척하고나서, (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고 농축하였다. 잔류물을 염화메틸렌(24 mL)에 용해시키고, 10분에 걸친 용액 A(MTBE:헥산 = 1:1, 48 mL), 셀라이트(18g), 및 30분에 걸친 용액 A의 추가분(48 mL)을 이용하여 순차적으로 처리하였다. 30분 동안 교반한 후에, 혼합물을 여과시키고, 고형물을 MTBE:헥산 = 2:1(60 mL)으로 세척하고, 염화메틸렌(50 mL x 4)으로 추출하였다. 염화메틸렌 추출액을 농축시키고; 잔류물을 아세토니트릴(48 mL)에 용해시키고, 얼음-물 조에서 교반하면서, 냉각수(34 mL)로 20분에 걸쳐 처리하였다. 하부층이 분리되어 염화메틸렌(150 mL) 및 염수 용액(1:1)(160 mL) 사이로 격리되었다. 유기층을 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고 농축하여 생성물(11.7g)을 회색 고형물 형태로 수득하였다. 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 27.7-25.8(m). 본 생성물은 추가의 정제 없이 다음 단계에서 바로 사용되었다.
상기 생성물(11.2g)을 18 mL의 염화메틸렌에 용해시키고 0℃에서 교반시킨 용액에, 피롤(2.85 mL, 41.1 mmol)을 첨가시키고나서 디클로로아세트산(3.2 mL, 38.4 mmol)을 5분에 걸쳐 첨가하였다. 40분 동안 0℃에서 교반한 후에, 포화 중탄산나트륨(40 mL)을 서서히 첨가하여 반응 혼합물을 급냉시켰다. 혼합물을 20 mL의 염화메틸렌으로 희석시키고, 수용액층을 염화메틸렌(40 mL)으로 분리 및 추출하고, 염화메틸렌 추출액을 모아서 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고, 농축하였다. 잔류물을 28 mL의 염화메틸렌에 용해시키고, 이를 10분에 걸쳐 첨가시킨 용액 A(MTBE:헥산 = 1:1, 28 mL), 셀라이트(16.8g) 및 다시 20분에 걸쳐 첨가시킨 용액 A 추가분(28 mL)으로 순차적으로 처리하였다. 혼합물을 여과시키고; 고형물을 용액 A(40 mL) 및 MTBE(40 mL)로 세척한 후 염화메틸렌(4 x 50 mL)으로 추출하였다. 염화메틸렌 추출액을 농축하고, 짧은 실리카 겔 컬럼을 통해 정제시켰다. 염화메틸렌을 이용하여 컬럼을 용리하였다. 농축 이후, 생성물(8.7g)을 회색 고형물 형태로 수득하였다. 수율: 66%. 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 27.8-26.3(m).
실시예 23: HO - Gp (s) Tp (s) Gp (s) Ap (s) Gp (s) Tp (s) Gp (s) Ap (s) Gp (s) Tp (s) Gp (s)A-Lev의 제조 ( SEQ . ID NO : 1)
DMTr-Gp (s) Tp (s) Gp (s) Ap(H)(6.85g, 2.64 mmol) 및 HO-Gp(s)Tp(s)Gp(s)Ap(s)Gp(s)Tp(s)Gp(s)A-Lev(8.2 g, 1.81 mmol)의 트리에틸암모늄염 혼합물을 피리딘으로 증발시켜 무수 상태로 만들었다. 잔류물에 무수 피리딘(14 mL)을 첨가하고, 그 결과로 얻은 용액을 질소 하에 0℃에서 교반하고, 3분에 걸쳐 첨가되는 염화피발로일(0.8 mL, 6.48 mmol)로 처리하였다. 저온조를 제거하고 혼합물을 30분 동안 상온에서 교반하였다. 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 무수 염화메틸렌(2.0 mL)에 용해된 N-프로피오닐옥시메틸티오-N-메틸 메탄설폰아미드(1.23g, 5.40 mmol)의 용액에 이어 N,N-디이소프로필에틸아민(0.56 mL, 3.24 mmol)을 첨가하였다. 1시간 동안 상온에서 교반한 후에, 반응 혼합물을 250 mL의 염화메틸렌으로 희석시키고, 저온의 반포화(semi-saturated) 중탄산나트륨(250 mL)으로 세척하였다. 유기층을 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고 농축하였다. 잔류물을 50 mL의 톨루엔으로 동시증발시키고, 43 mL의 염화메틸렌에 용해시킨 후, 20분에 걸친 용액 A(MTBE:헥산 = 1:1, 43 mL), 셀라이트(19.4g), 및 30분에 걸친 용액 A의 추가분(43 mL)을 이용하여 순차적으로 처리하였다. 30분 동안 교반한 후에, 혼합물을 여과시키고, 고형물을 용액 A 및 CH2Cl2가 4:1의 비율로 이루어진 용매 혼합물(100 mL x 2)로 세척하였다. 고형물을 염화메틸렌(100 mL x 4)으로 추출하고, 추출액을 농축시켰다. 잔류물을 65 mL의 아세토니트릴에 용해시키고 냉각수(46 mL)로 20분에 걸쳐 처리하였다. 하부 유기층이 분리되어 염화메틸렌(200 mL) 및 염수 용액(1:1)(200 mL) 사이로 격리되었다. 유기층을 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고 농축하여 생성물(12.8g)을 황색 포말 형태로 수득하였다. 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 30.0-24.8(m).
상기 생성물(12.8g)을 20 mL의 염화메틸렌에 용해시키고 0℃에서 교반시킨 용액에, 피롤(2.64 mL, 38.0 mmol)을 첨가시키고나서 디클로로아세트산(3.0 mL, 36.0 mmol)을 첨가하였다. 30분 동안 0℃에서 교반한 후에, 반응 혼합물을 200 mL의 염화메틸렌으로 희석시키고, 이어서 포화 중탄산나트륨(100 mL)을 서서히 첨가하였다. 유기층을 분리하고, (Na2SO4 상에서) 건조시키고, 농축하였다. 잔류물을 40 mL의 염화메틸렌에 용해시키고, 이를 10분에 걸쳐 첨가시킨 용액 A(MTBE:헥산 = 1:1, 40 mL), 셀라이트(20g) 및 20분에 걸쳐 첨가시킨 용액 A 추가분(80 mL)으로 순차적으로 처리하였다. 혼합물을 여과시키고, 고형물을 용액 A 및 CH2Cl2가 5:1의 비율로 이루어진 용매 혼합물(120 mL)로 세척하였다. 고형물을 염화메틸렌(100 mL x 4)으로 추출하고, 추출액을 농축시켰다. 잔류물을 70 mL의 아세토니트릴에 용해시키고 냉각수(49 mL)로 30분에 걸쳐 처리하였다. 하부 유기층이 분리되어 염화메틸렌(150 mL) 및 염수 용액(1:1)(150 mL) 사이로 격리되었다. 유기층을 (Na2SO4 상에서) 건조시키고 농축하여 생성물(9.2g)을 회백색 고형물 형태로 수득하였다. 이 생성물은 다음 단계에서 바로 사용되었다. 수율: 75%. 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 27.7-26.4(m).
실시예 24: HO- Gp (s) Tp (s) Gp (s) Ap (s) Gp (s) Tp (s) Gp (s) Ap (s) Gp (s) Tp (s) Gp (s) Ap (s) Gp (s) Tp (s) Gp (s)A-Lev의 제조 ( SEQ . ID NO : 2)
DMTr-Gp (s) Tp (s) Gp (s) Ap(H)(3.64g, 1.4 mmol) 및 HO-Gp(s)Tp(s)Gp(s)Ap(s)Gp(s)Tp(s)Gp(s)Ap(s)Gp(s)Tp(s)Gp(s)A-Lev(6.1g, 0.89 mmol)의 트리에틸암모늄염 혼합물을 피리딘으로 증발시켜 무수 상태로 만들었다. 잔류물을 무수 피리딘(10 mL)으로 희석시키고, 질소 하에 0℃에서 3분에 걸쳐 서서히 첨가시킨 염화피발로일(0.37 mL, 3.0 mmol)로 처리하였다. 저온조를 제거하고 혼합물을 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 무수 염화메틸렌(1.0 mL)에 용해된 N-프로피오닐옥시메틸티오-N-메틸 메탄설폰아미드(568.3 mg, 2.5 mmol)의 용액에 이어 N,N-디이소프로필에틸아민(0.26 mL, 1.5 mmol)을 첨가하였다. 1시간 동안 상온에서 교반한 후에, 반응 혼합물을 120 mL의 염화메틸렌으로 희석시키고, 냉각수(120 mL) 및 반포화 중탄산나트륨(120 mL)으로 순차적으로 세척하였다. 유기층을 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고 농축하였다. 잔류물을 32 mL의 염화메틸렌에 용해시킨 후, 20분에 걸쳐 첨가시킨 용액 A(MTBE:헥산 = 1:1, 32 mL), 셀라이트(16.0g), 및 30분에 걸쳐 첨가시킨 용액 A의 추가분(64 mL)을 이용하여 순차적으로 처리하였다. 30분 동안 교반한 후에, 혼합물을 여과시키고, 고형물을 용액 A 및 CH2Cl2가 5:1의 비율로 이루어진 용매 혼합물(60 mL)로 세척하였다. 고형물을 염화메틸렌(80 mL x 4)으로 추출하고, 추출액을 농축시켰다. 잔류물을 40 mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 교반하면서 냉각수(28 mL)로 20분에 걸쳐 처리하였다. 하부 유기층이 분리되어 염화메틸렌(150 mL) 및 염수 용액(1:1)(150 mL) 사이로 격리되었다. 유기층을 (Na2SO4 상에서) 건조시키고 농축하여 생성물(6.92g)을 황색 고형물 형태로 수득하였다. 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 27.6-26.3(m). 본 생성물은 추가의 정제 없이 다음 단계에서 바로 사용되었다.
상기 생성물(6.92g)을 10 mL의 염화메틸렌에 용해시키고 0℃에서 교반시킨 용액에, 피롤(1.74 mL, 25.0 mmol)을 첨가시키고나서 디클로로아세트산(2.0 mL, 24.0 mmol)을 2분에 걸쳐 첨가하였다. 30분 동안 0℃에서 추가로 교반한 후에, 반응 혼합물을 100 mL의 염화메틸렌으로 희석시키고, 이어서 포화 중탄산나트륨(50 mL)을 서서히 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 수용액층을 50 mL의 염화메틸렌으로 추출하였다. CH2Cl2 추출액을 모아서 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고, 농축하였다. 잔류물을 32 mL의 염화메틸렌에 용해시키고, 이를 10분에 걸쳐 첨가시킨 용액 A(MTBE:헥산 = 1:1, 32 mL), 셀라이트(16g) 및 30분에 걸쳐 첨가시킨 용액 A 추가분(64 mL)으로 순차적으로 처리하였다. 혼합물을 여과시키고, 고형물을 용액 A 및 CH2Cl2가 5:1의 비율로 이루어진 용매 혼합물(90 mL)로 세척하였다. 고형물을 염화메틸렌(80 mL x 4)으로 추출하고, 추출액을 농축시켰다. 잔류물을 40 mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 혼합물을 얼음조에서 교반하면서, 10분에 걸쳐 첨가시킨 냉각수(28 mL)로 처리하였다. 하부 유기층이 분리되어 염화메틸렌(100 mL) 및 염수 용액(1:1)(100 mL) 사이로 격리되었다. 유기층을 (무수 Na2SO4 상에서) 건조시키고 농축하여 생성물(5.8g)을 황색 고형물 형태로 수득하였다. 수율: 71%. 31P NMR (CDCl3, 121.5 MHz): δ= 27.7-26.3(m).
실시예 25: 5'- OH 완전보호된 올리고뉴클레오타이드 포스포로티오에이트 HO - Gp(s)Tp(s)Gp(s)A -Lev의 완전 탈보호
완전보호된 테트라머 HO-Gp (s) Tp (s) Gp (s)A-Lev(1.38g, 0.62 mmol)을 첨가 피리딘으로 증발시켜 무수 상태로 만들었다. 잔류물에, 1,2,4-트리아졸(192.7 mg, 2.79 mmol), 4Å 분자체(1.5g) 및 무수 피리딘(6.0 mL)을 첨가하였다. 이렇게 얻은 혼합물을 교반하고 질소 하에 0℃까지 냉각시키고, 여기에 터트-부틸아민(1.95 mL, 18.6 mmol)을 첨가하였다. 그 결과로 얻은 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 여과시키고, 분자체를 피리딘(5 mL x 2)으로 세척하였다. 여과액을 합친 후, 건조 상태까지 농축시켰다. 이러한 잔류물에, syn-2-피리딘알독심(909 mg, 7.44 mmol)에 이어서 무수 아세토니트릴(10 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 교반하고 0℃까지 냉각시키고 나서, 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔(1.67 mL, 11.2 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 15시간 동안 교반한 후에, MTBE(50 mL)를 10분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 추가로 20분 동안 교반한 후에, 상부의 투명 용액을 경사분리시키고, 잔류물을 에틸아세테이트(20 mL)로 세정하였다. 잔류물을 증발시킴으로써 남아있는 용매를 제거하고, 28% 암모늄 수용액(10.0 mL) 및 2-머캅토에탄올(0.5 mL)의 혼합물에 용해시켰다. 그 결과로 얻은 혼합물을 55℃에서 15시간 동안 가열하였다. 냉각시킨 후에, 혼합물을 이소프로판올: THF = 1:3(80 mL)의 교반 혼합물에 10분에 걸쳐 적가하였다. 추가로 20분 교반한 후에, 상부의 투명 용액을 경사분리시키고, 잔류물을 THF(20 mL)로 세정하였다. 잔류물을 역상 C18 크로마토그래피를 통해 정제시켰다. 이렇게 얻은 생성물을 Amberlite® IR-120(플러스) 이온교환 수지(나트륨 형태)의 컬럼(8 cm x 3 cm 직경)에 투입하였다. 물을 이용하여 컬럼을 용출시키고, 원하는 분획들을 모아서 동결건조시켜, 백색 고형물로서의 생성물 684 mg을 완전 탈보호된 올리고뉴클레오타이드 포스포로티오에이트의 나트륨 형태로 수득하였다. 수율: 83%. 31P NMR (D2O, 121.5 MHz): δ= 55.4-54.6(m).
실시예 26: 하기 반응식에 도시된 바와 같은, 완전보호된 디뉴클레오타이드 포스포로티오에이트의 합성
Figure pct00022
트리에틸암모늄 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-티미딘-3'-H-포스포네이트(425,9 mg, 0.6 mmol), 3'-O-레불리닐 티미딘(170.2 mg, 0.5 mmol) 및 건조 피리딘(10.0 mL)의 용액을 건조 상태까지 회전증발시켰다. 잔류물을 10 mL의 피리딘에 재용해하고, 다시 건조 상태까지 회전증발시켰다. 잔류물에, 분자체(300 mg, 활성화됨, 3Å) 및 무수 피리딘(5.0 mL)을 첨가하였다. 이렇게 얻은 혼합물을 질소 하에 실온에서 교반하고, 여기에 염화 피발로일(0.22 mL, 1.75 mmol)을 첨가하였다. 5분 동안 실온에서 교반한 후에, CH2Cl2(1.0 mL)에 용해된 N-메틸-N-프로피오닐옥시메틸설파닐 메탄설폰아미드(284.1 mg, 1.25 mmol)의 용액에 이어, DIPEA(0.17 mg, 2.0 mmol)를 첨가하였다. 그 결과로 얻은 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하였다. 에틸아세테이트(30 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 여과시키고, 여과액을 물(15 mL), 반포화 중탄산나트륨 수용액(15 mL x 2) 및 염수(15 mL)로 세척하였다. 유기층을 건조 및 증발시켜 1.21g의 연한 황색 오일을 수득하였다. 이러한 조 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피(EtOAc/아세톤)를 통해 정제시켜 생성물(389 mg)을 무색 포말 형태로 수득하였다. 수율: 74.4%.
<110> Girindus America Inc <120> Sulfurizing reagents and their use for oligonucleotides synthesis <130> GIR 2008/02 <140> US 61/140,391 <141> 2008-12-23 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <220> <221> modified_base <222> (1) <223> N-(6-(2,5-dichlorophenoxy)-purin-2-yl)isobutyramide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> 4'O-P-thiomethyl propionate <220> <221> modified_base <222> (2) <223> 5-methyl-4-phenoxypyrimidin-2-one <220> <221> modified_base <222> (3) <223> N-(6-(2,5-dichlorophenoxy)-purin-2-yl)isobutyramide <220> <221> modified_base <222> (4) <223> N-(purin-6-yl)benzamide <220> <221> modified_base <222> (5) <223> N-(6-(2,5-dichlorophenoxy)-purin-2-yl)isobutyramide <220> <221> modified_base <222> (6) <223> 5-methyl-4-phenoxypyrimidin-2-one <220> <221> modified_base <222> (7) <223> N-(6-(2,5-dichlorophenoxy)-purin-2-yl)isobutyramide <220> <221> modified_base <222> (8) <223> N-(purin-6-yl)benzamide <220> <221> modified_base <222> (9) <223> N-(6-(2,5-dichlorophenoxy)-purin-2-yl)isobutyramide <220> <221> modified_base <222> (10) <223> 5-methyl-4-phenoxypyrimidin-2-one <220> <221> modified_base <222> (11) <223> N-(6-(2,5-dichlorophenoxy)-purin-2-yl)isobutyramide <220> <221> modified_base <222> (12) <223> 3O'-pentan1,4-dione <220> <221> modified_base <222> (12) <223> N-(purin-6-yl)benzamide <400> 1 gtgagtgagt ga 12 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesis exemple <220> <221> modified_base <222> (1) <223> N-(6-(2,5-dichlorophenoxy)-purin-2-yl)isobutyramide <220> <221> misc_structure <222> (1)..(15) <223> 4'O-P-thiomethyl propionate <220> <221> modified_base <222> (2) <223> 5-methyl-4-phenoxypyrimidin-2-one <220> <221> modified_base <222> (3) <223> N-(6-(2,5-dichlorophenoxy)-purin-2-yl)isobutyramide <220> <221> modified_base <222> (4) <223> N-(purin-6-yl)benzamide <220> <221> modified_base <222> (5) <223> N-(6-(2,5-dichlorophenoxy)-purin-2-yl)isobutyramide <220> <221> modified_base <222> (6) <223> 5-methyl-4-phenoxypyrimidin-2-one <220> <221> modified_base <222> (7) <223> N-(6-(2,5-dichlorophenoxy)-purin-2-yl)isobutyramide <220> <221> modified_base <222> (8) <223> N-(purin-6-yl)benzamide <220> <221> modified_base <222> (9) <223> N-(6-(2,5-dichlorophenoxy)-purin-2-yl)isobutyramide <220> <221> modified_base <222> (10) <223> 5-methyl-4-phenoxypyrimidin-2-one <220> <221> modified_base <222> (11) <223> N-(6-(2,5-dichlorophenoxy)-purin-2-yl)isobutyramide <220> <221> modified_base <222> (12) <223> N-(purin-6-yl)benzamide <220> <221> modified_base <222> (13) <223> N-(6-(2,5-dichlorophenoxy)-purin-2-yl)isobutyramide <220> <221> modified_base <222> (14) <223> 5-methyl-4-phenoxypyrimidin-2-one <220> <221> modified_base <222> (15) <223> N-(6-(2,5-dichlorophenoxy)-purin-2-yl)isobutyramide <220> <221> modified_base <222> (16) <223> N-(purin-6-yl)benzamide <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> 3O'-pentan1,4-dione <400> 2 gtgagtgagt gagtga 16

Claims (49)

  1. P-S-R 결합을 포함한 하나 이상의 뉴클레오타이드간 결합(internucleotide linkage)과, 둘 이상의 뉴클레오사이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드이며, R은 하기 화학식(I)에 해당된다:
    Figure pct00023

    (식 중, A는 동일위치에 치환되는 알킬렌기, 바람직하게는 CH2이고; X 및 Y는 S 및 0 중에서 독립적으로 선택되고; R0은 임의 치환된 탄소-결합된 유기 잔기, 예를 들어 구체적으로는 임의 치환된 알킬 또는 아릴, SRx, ORx 및 NRxRy (Rx 및/또는 Ry는 H 및 유기 잔기 중에서 선택되며 적어도 Rx는 H 이외의 치환기)로 이루어진 군에서 선택됨).
  2. 제1항에 있어서, R이 메틸렌아실옥시기, 메틸렌카보네이트기 및 메틸렌카바메이트기 중에서 선택되는 것인 올리고뉴클레오타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R은 화학식 -CH2-O-C(O)-R0 (식 중, R0은 C1-C20의 포화, 불포화, 헤테로사이클릭 또는 방향족, 탄화수소 잔기임)에 해당되는 것인 올리고뉴클레오타이드.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, R은 화학식 -CH2-O-C(O)-NRxRy (식 중, Rx 및 Ry는 독립적으로 알킬 또는 (헤테로)아릴 중에서 선택되고, 바람직하게 Rx 및 Ry는 알킬이거나, 또는 Rx 및 Ry는 함께 O, N 및 S 중에서 선택되는 추가 환형 헤테로원자를 임의로 함유한 3 내지 8원 고리를 형성함)의 메틸렌카바메이트기에 해당되는 것인 올리고뉴클레오타이드.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, R은 화학식 -CH2-O-C(O)ORx(식 중, Rx는 임의 치환된 알킬, 사이클로알킬 및 (헤테로)아릴기 중에서 선택됨)의 메틸렌카보네이트기에 해당되는 것인 올리고뉴클레오타이드.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Rx는 저급알킬 또는 사이클로알킬 (C1-C7) 잔기, 치환된 페닐기 및 나프틸기를 포함하는 페닐 중에서 선택되는 것인 올리고뉴클레오타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 2 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 리보뉴클레오사이드, 2'-디옥시리보뉴클레오사이드, 2'-치환된 리보뉴클레오사이드, 2'-4'-고정된-리보뉴클레오사이드, 3'-아미노-리보뉴클레오사이드, 3'-아미노-2'-디옥시리보뉴클레오사이드 중에서 선택되는 뉴클레오사이드를 함유하는 올리고뉴클레오타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 전구약물로서의 올리고뉴클레오타이드.
  10. 하나 이상의 티오포스페이트 결합을 갖는 제2 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법이며, (a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 제1 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계, 및 (b) 상기 제1 올리고뉴클레오타이드로부터 하나 이상의 R기를 절단시켜 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 갖는 상기 제2 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, R기는, 바람직하게 알킬, 사이클로알킬 및 방향족 아민 중에서; 더 바람직하게는 일차 아민 또는 이차 알킬아민 중에서; 가장 바람직하게는 n-프로필 및 터트-부틸 아민 중에서 선택되는 염기와 용액상 제1 올리고뉴클레오타이드를 반응시켜 절단되는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 염기는 장애 일차 아민인 것인 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 단계는 입체 장애 염기, 및 일반적으로 N-헤테로방향족 염기로 이루어진 활성제의 존재 하에 수행되는 것인 방법.
  14. 제24항에 있어서, 제1 염기는, 알킬기가 C1 내지 C20의 선형 또는 분지형 알킬 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 치환기들을 포함하는 알킬 일차 아민인 것인 방법. 제24항에 있어서, 제1 염기는, 아릴기가 제2 및/또는 6 위치에서 선형 또는 분지형의 알킬 또는 아릴기를 포함하는 아릴 일차 아민인 것인 방법.
  15. 제24항 또는 제25항에 있어서, 활성제가 1,2,4-트리아졸 또는 기타 트리아졸 및 테트라졸 유도체인 것인 방법.
  16. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오타이드를 탈보호시키는 방법이며, 입체 장애 염기가 터트-부틸 아민인 것인 방법.
  17. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 티오포스포에이트 결합을 갖는 상기 제2 올리고뉴클레오타이드의 정제 단계를 더 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 제2 올리고뉴클레오타이드를 적어도 침전시키는 단계를 포함하는 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 제2 올리고뉴클레오타이드를 용매로 추출시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 염화메틸렌, 클로로포름, 아세토니트릴, 아세톤 및 피리딘 중에서 바람직하게 선택되는 극성 유기 용매에 제2 올리고뉴클레오타이드를 용해시키는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 약 0.5(n+1)mL 내지 약 2.0(n+1)mL의 범위 내, 바람직하게는 약 1.0(n+1)mL (n은 포스포로티오에이트 트리에스테르 결합의 밀리몰 수임)의 용매 부피가 사용되는 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 제2 올리고뉴클레오타이드의 용액이 탁해질 때까지, 상기 용액을 탄화수소, 에테르 용매 및 이들의 혼합물 중에서 바람직하게 선택된 비극성 유기 용매로 처리하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 약 1(n+1)mL 내지 약 4(n+1)mL의 범위 내, 바람직하게는 약 2.0(n+1)mL (n은 포스포로티오에이트 트리에스테르 결합의 밀리몰 수임)의 용매 부피가 사용되는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 탁한 용액을 침전보조제로 처리하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 침전보조제는, 셀라이트, 석탄, 목재셀룰로오스, 및 실리카 또는 알루미나 같은 크로마토그래피 고정상 중에서 바람직하게 선택된 비활성 다공성 고체 중에서 선택되는 것인 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 침전보조제는 약 0.25(n+1)g 내지 약 1.5(n+1)g의 범위 내, 바람직하게는 약 0.75(n+1)g (n은 포스포로티오에이트 트리에스테르 결합의 밀리몰 수임)의 양으로 사용되는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 침전보조제를 첨가하고 난 후 혼합물을 비극성 유기 용매의 제2분획으로 처리하며, 상기 분획의 부피는 일반적으로 약 1(n+1)mL 내지 약 4(n+1)mL의 범위에 속하고, 바람직하게는 약 2.0(n+1)mL (n은 포스포로티오에이트 트리에스테르 결합의 밀리몰 수임)인 것인 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 침전 단계에서 얻는 고체 물질을 여과시키고 세척하는 방법.
  29. 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 용매를 이용하여 올리고뉴클레오타이드-함유 침전물로부터 추출되는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 용매는 아세토니트릴, 아세톤, THF, DMF, DMSO 및 피리딘 중에서 바람직하게 선택되는 극성 유기 용매와, 바람직하게는 물인 수성 매질의 혼합물을 포함하며; 극성 유기 용매/수성 매질의 부피비는 바람직하게 약 0.5 내지 1.5이며, 더 바람직하게는 약 0.7인 것인 방법.
  31. 제10항에 있어서, 메틸렌아실옥시기, 메틸렌카바메이트기 또는 메틸렌카보네이트기 중에서 바람직하게 선택되는 R기는, 인간의 몸 또는 동물의 몸에서 절단되는 것인 방법.
  32. 화학식 R"-S-R의 황화제이며, R은 하기 화학식(I)에 해당된다:
    Figure pct00024

    (식 중, A는 동일위치에 치환되는 알킬렌기, 바람직하게는 CH2이고; X 및 Y는 S 및 0 중에서 독립적으로 선택되고; R0은 임의 치환된 알킬 또는 아릴, SRx, ORx 및 NRxRy (Rx 및 Ry는 H 및 유기 잔기 중에서 선택되며 적어도 Rx는 H 이외의 치환기임)로 이루어진 군에서 선택됨)로 이루어진 군에서 선택됨).
  33. 제32항에 있어서, R은 메틸렌아실옥시기, 메틸렌카바메이트기 또는 메틸렌카보네이트기 중에서 선택되고, R"는 이탈기인 것인 황화제.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, R은 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 황화제.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식(II)에 해당되는 황화제:
    Figure pct00025

    (식 중, RA 및 RB는 서로 동일하거나 상이하며 RA 및 RB 중 적어도 하나는 치환된 설포닐기 또는 아실기 중에서 선택되며, 상기 RA 및 RB는 임의로 함께 고리형 치환기를 형성함).
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, R"가 설폰아미드기이며, 바람직하게는 N-치환-N-알킬설포닐인 것인 황화제.
  37. 제36항에 있어서, 하기 화학식(III)에 해당되는 황화제:
    Figure pct00026

    (식 중, R1, R3 및 R4는 독립적으로 C1-C20의 임의의 불포화 또는 방향족의 탄화수소 잔기이며, 바람직하게는 선형 또는 분지형 알킬기 또는 사이클로알킬기임).
  38. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, R"가 디카복실아미드인 것인 황화제.
  39. 제38항에 있어서, 하기 화학식(IV)에 해당되는 황화제:
    Figure pct00027

    (식 중, Z는 -CH2-CH2-, -CH=CH-, -CH2-O-CH2-,
    Figure pct00028
    로 이루어진 군 중에서 선택되는 기이며, 바람직하게 Z는
    Figure pct00029
    기임).
  40. 올리고뉴클레오타이드의 합성 방법이며, 상기 올리고뉴클레오드의 전구체의 하나 이상의 인광성 뉴클레오타이드간 결합(phosphorus internucleotide linkage)을 황화시키기 위해 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 황화제를 사용하는 것을 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 인광성 뉴클레오타이드간 결합이 H-포스포네이트 디에스테르 결합인 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, H-포스포네이트 모노에스테르염을 보호된 뉴클레오사이드와 커플링시키거나 또는 자유 하이드록시기를 갖는 올리고뉴클레오타이드와 커플링시켜 H-포스포네이트 디에스테르 결합을 형성하는 단계를 더 포함하는 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 커플링 조작을 용액상에서 수행하는 방법.
  44. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 황화제의 합성 방법이며, (a) 설퍼릴 할라이드, 바람직하게는 염화 설포릴을 화학식 R-S-C(O)-R2(식 중, R은 제1항 내지 제6항에 기재된 바와 같고, R2는 유기 잔기로서 바람직하게는 C1-C20 임의의 불포화 또는 방향족 탄화수소 잔기 중에서 선택됨)의 티오아세탈과 반응시켜 화학식 R-S-W (식 중, W는 할로겐이며, 바람직하게는 C1임)의 중간생성물을 생성하는 단계, 및 (b) 상기 중간생성물을 N-설포닐 화합물 또는 N-아실 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 화학식 R1-C(O)-O-CH2-S-C(O)-R2 (식 중, R1 및 R2는 독립적으로 C1-C20 임의의 불포화 또는 방향족 탄화수소 잔기임)의 티오아세탈을 염화 설퍼릴과 반응시켜 화학식 R1-C(O)-O-CH2-S-Cl(식 중, R1은 독립적으로 C1-C20, 임의의 불포화 또는 방향족 탄화수소 잔기임)의 중간생성물을 생성하는 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 단계 (b)에서 중간생성물을 화학식 R3-S(O)2-NH-R4 (식 중, R3 및 R4는 독립적으로 유기 잔기이며, 바람직하게는 C1-C20의 임의의 불포화 또는 방향족 탄화수소 잔기임)의 N-설포닐 화합물과 반응시키는 방법.
  47. 제44항 또는 제45항에 있어서, 단계 (b)에서 중간생성물을 하기 화학식의 N-아실 화합물과 반응시키는 방법.
    Figure pct00030

    (식 중, Z는 -CH2-CH-, -CH=CH-, -CH2-O-CH2-,
    Figure pct00031
    로 이루어진 군 중에서 선택되는 기이며, 바람직하게 Z는
    Figure pct00032
    기임).
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 저급알킬 또는 사이클로알킬 (C1-C7) 잔기, 치환된 페닐기 및 나프틸기를 포함하는 페닐 중에서 선택되며, 더 바람직하게는 에틸기인 것인 방법.
  49. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, R2 , R3 및 R4는 저급알킬 또는 사이클로알킬 (C1-C7) 잔기, 치환된 페닐기 및 나프틸기를 포함하는 페닐 중에서 중에서 선택되며, 더 바람직하게는 메틸기인 것인 방법.
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