KR20110084254A - 척추 및 관절 통증을 탐지하고 치료하는 생체표식 및 방법 - Google Patents
척추 및 관절 통증을 탐지하고 치료하는 생체표식 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
척추 또는 관절 통증 및 염증과 관련된 복합체 및 이를 탐지하는 방법이 제공된다. 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 증가된 수준을 탐지함으로써, 통증 및 염증 치료를 위한 척추 또는 관절에서 치료 부위를 확인하는 방법이 제공된다. 척추 또는 관절 통증 및 염증 치료 방법 또한 제공된다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 미국 가출원 61/106,059 (2008년 10월 16일자 제출됨), 61/118,401(2008년 11월 26일자 제출됨) 그리고 61/122,045 (2008년 12월 12일자 제출됨)(세 건 모두 Gaetano J. Scuderi , Lewis S. Hanna , and Robert Bowser의 출원임)에 대한 우선권을 주장하며, 이들은 전문이 참고문헌에 통합된다.
발명의 분야
본 발명은 척추-관련 통증 또는 관절-관련 통증과 관련된 병인을 진단하고, 뿐만 아니라 척추-관련 통증 또는 관절-관련 통증을 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
척추와 관절 통증은 치료가 어렵다. 특히, 척추와 관절 통증의 원인은 확인하기 쉽지 않다. 관절에 가해지는 힘이 증가되면 관절이 손상된다. 비정상적인 관절 해부학적 모형은 흔히 노화의 표시지만, 관절 손상은 또한 외상으로 인하여 발생될 수 있다. 예를 들면, 운동 선수들에게서 연골 병소들을 흔히 볼 수 있다. 외상으로 인한 관절 손상은 급성 염증과 주로 관련되며, 노화(가령, 골관절염)로 인한 비정상적 관절의 해부학적 모형은 만성 질환이다. 내과의사들은 외상으로 인한 급성 손상과 노화와 관련된 관절 퇴행을 구별할 수 있는 시스템 또는 방법을 현재 보유하지 못하고 있다. 해당 환자에서 적절한 치료 과정을 결정하는 것이 어려운데 그 이유는 환자가 앓고 있는 특정 증상이 급성 또는 만성인지가 불확실하기 때문이다.
연구용 무릎 관절경검사의 상당한 비율은 반월 손상의 어려움을 강조한다. 이 문제는 현재 이 병리를 진단하는 주요 수단이 되는 MRI의 낮은 특이성으로 인하여 더욱 악화된다. MRI가 무증후성 환자의 65%에서 반월 손상을 확인할 수 있기 때문에, MRI는 문제가 있는 진단 도구이며, 비정상적인 반월의 해부학적 모형과 무릎 통증 사이에 상관관계가 없는 것을 강조하였다. 비정상적인 반월판의 해부학적 모형과 무릎 통증 사이에 명백한 상관 관계가 없는 것은 골관절염이 발생된 대부분의 노인 환자 군에서 특히 문제가 된다. 관절경검사 용도에 의문을 제기하는 앞도적인 증거에도 불구하고(Moseley , et al , N. Engl , J. Med . , 347(2): 81-8 (2002)), 무릎 관절경검사는 미국내에서만 매년 660,000회 실행되는 것으로 추정한다(AAOS website).
척추-관련 통증은 일반적으로 추간판, 소골면(facetogenic) 또는 신경경변증 통증으로 분류된다. 신경경변증 통증의 현시는 일반적으로 추간판 헤르니아(herniation), 협착, 척추탈위증(spondylolisthesis), 좌골신경통, Piriformis 증후군, Obturator 증후군, 낭성 병소 (가령, 신경절 및 활액), 종양, 및 기타 병리와 같은 질환에 관련된 신경 뿌리에 다양한 물리적/기계적 비정상, 가령, 압박 또는 기계적인 자극 때문이다.
척추 신경 뿌리에 속질핵(nucleus pulposus)을 제공하면 축색 손상이 일어나고, 신경 뿌리의 미세-해부학적 모형에 기능적 변화가 초래되어, 통증-관련 거동이 초래된다고 설명되었다. 따라서, 경막 밖의 공간으로 속질핵을 방출하는 기계적인 결함은 신경 뿌리의 손상 원인이 되어, 소근(radicular) 통증이 일어난다는 가설이 확립되었다. 이와 같은 "화학적 신경뿌리질병(radiculopathy)"은 추간판 헤르니아와 같은 기계적 고장을 가지는 환자군의 일부에서만 존재하는 신경경변증 통증으로 설명할 수 있고, 나머지 환자들은 통증이 없는 상태이다.
척추-관련 통증의 병리생리학을 밝히기 위한 수 많은 연구가 있었고, 몇 가지 분자 경로들이 연루되어있다. 그러나, 손상 또는 퇴행에서 통증 상태로 발전되는 명백한 원인 경로를 확인하지 못하였다. 분자 표식은 임상적 증후에 관련이 될 수 있으며, 진단 및 치료 도구의 개발에 잠재적 표적으로 작용할 수 있다. 척추간 헤르니아에 경막 밖의 공간이 영향을 줄 수 있다는 증거를 몇몇 연구에서 제시하기는 하였지만, 질환자와 질환이 없는 자들간에 차이를 탐지하는 시도에서 경막 밖의 공간내에서 생분자의 농도를 측정한 연구는 없었다.
따라서, 본 발명의 목적은 척추 또는 관절의 통증을 표시하는 생체표식을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 통증 치료용으로 척추 또는 관절내 부위를 확인하기 위한 생체표식 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 척추-관련 통증 또는 관절-관련 통증의 원인이 되는 병인의 존재를 진단함에 있어서 진단 또는 진단을 지원하는데 이용될 수 있는 생체표식을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 척추-관련 통증 또는 관절-관련 통증의 원인이 되는 병인의 존재를 진단함에 있어서 진단 또는 진단을 지원 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 척추-관련 통증 또는 관절-관련 통증을 경험한 대상체에게 맞는 치료법을 결정하기 위한 생체표식 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 척추- 또는 관절- 관련 통증 치료 효과를 모니터 및 평가하는 생체표식 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 척추 또는 관절 통증을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 통증을 억제 또는 감소시키는 치료를 위하여 척추 또는 관절내 치료 부위를 선택하는 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
발명의 요약
척추 및/또는 관절 통증과 관련된 생체표식이 확인되었다. 생체표식은 피브로넥틴 및 어그레칸(aggrecan) 폴리펩티드, 또는 이의 단편들을 함유하는 복합체 또는 집합체를 포함한다. 일부 구체예들에서, 피브로넥틴-어그레칸 복합체는 어그레칸의 G1, G2, 또는 G3 도메인, 이의 피브로넥틴 결합 단편들, 또는 이의 복합체들을 함유한다.
척추 또는 관절 시료내에 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존부를 탐지함으로써, 통증 치료를 위한 척추 또는 관절내 치료 부위를 확인하는 방법이 제공된다. 일부 구체예들에서, 치료 부위로 확인된 부위는 척추 또는 관절 통증의 원천 부위다. 척추 시료는 경막외 세척, 추간판 공간 세척 및 파셋을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 적적한 방법에 의해 수득될 수 있다. 관절 시료는 경피 또는 개방 흡인, 생검 또는 세척을 포함하나 이에 한정되지 않는 통상적인 방법에 의해 수득될 수 있다. 피브로넥틴과 어그레칸을 함유하는 복합체는 크로마토그래프 방법, 선택적 결합 분석, 질량 분석법, 분광 광도법, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 적절한 방법에 의해 탐지될 수 있다. 한 구체예에서, 피브로넥틴과 어그레칸을 함유하는 복합체는 척추 시료, 경막 밖의 공간, 또는 뇌척추 유체로부터 분리될 수 있다.
피브로넥틴-어그레칸 복합체를 탐지하는데 이용되는 선택적 결합 분석은 피브로넥틴, 어그레칸, 또는 이들 단편들 또는 이의 복합체에 대한 선택적 결합 파트너를 이용한다. 유용한 선택적 결합 파트너는 피브로넥틴 및 어그레칸의 생체내 결합 파트너로 알려진 항체 및 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 선택적 결합 분석은 웨스턴 블랏팅, 면역침전, ELISA 및 방사면역분석을 포함한다. 특별히 선호되는 결합 분석은 피브로넥틴-어그레칸 복합체에 존재하지 않는 피브로넥틴-어그레칸을 유의적으로 탐지하지 않고, 피브로넥틴-어그레칸을 함유하는 복합체를 선택적으로 탐지하는 분석을 포함한다.
공개된 탐지 분석에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체 탐지용 양성 기준도 제공된다. 양성 기준 또는 표준 기준은 전형적 피브로넥틴-어그레칸 복합체이며, 여기서 피브로넥틴 및 어그레칸은 인간 서열에 상동성인 서열을 가진 동일한 또는 상이한 종의 것이다.
피브로넥틴-어그레칸 복합체를 탐지하는 공개된 방법들은 척추 또는 관절의 해부학적 구조 및 생리학적 기능에 관련된 통증 증후군을 진단 또는 진단을 지원하는데 유용하다. 척추내 특정 부위의 시료안에 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 탐지하는 것을 이용하여 신경뿌리질병, 파셋 관절 통증, 추간판 통증, 또는 관절 통증을 진단 또는 진단을 지원할 수 있다. 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재는 대상체에게 치료를 지정하고, 대상체의 예후를 판단하고, 또는 대상체에서 척추 또는 관절 통증 치료의 효과를 모니터하는데 이용될 수도 있다. 척추 또는 관절 통증을 치료하는 방법들도 제공된다. 방법은 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 증가된 양을 탐지함으로써 대상체에서 확인된 통증 부위의 치료를 포함한다. 적절한 치료 방법은 외과적 척추 감압 방법, 그리고 스테로이드 및 비-스테로이드 소염제를 이용한 치료들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 척추 또는 관절 통증을 치료하는 기타 방법들은 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 길항제 투여를 포함한다. 적절한 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제들은 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제 또는 감소시키고, 피브로넥틴 및 어그레칸 및/또는 이들 단편으로부터 피브로넥틴-어그레칸 복합체 형성을 억제 또는 감소시키고 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 해리시키고, 피브로넥틴 및/또는 어그레칸의 발현을 감소시키거나, 또는 연골로부터 어그레칸의 분해 및 붕괴를 감소시킨다. 예시적인 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제는 항체 및 기타 폴리펩티드, 펩티드모방체, 작은 유기 분자들, 및 억제성 RNAs, 가령, 리보자임, 삼합체-형성 올리고뉴클레오티드, 안티센스 DNA, siRNA 및 miRNA을 포함하나 이에 한정되지 않는다..
도 1은 증후를 나타내는 인간 시료의 크기 압출 크로마토그래피(SEC)의 결과를 보여주는 그래프다. 그래프는 용리 시간(분)에 대한 함수로써 SEC 컬럼으로부터 용리된 215nm에서 단백질의 광학 밀도를 나타낸다. 화살표는 분석에 의해 탐지된 피브로넥틴/어그레칸 G3 단편 피크를 나타낸다. 기타 고분자 피크는 피브로넥틴과 다른 또는 어그레칸의 더 큰 단편들의 복합체를 포함한다.
도 2는 무증후성 인간 시료의 크기 압출 크로마토그래피(SEC)의 결과를 보여주는 그래프다. 그래프는 용리 시간(분)에 대한 함수로써 SEC 컬럼으로부터 용리된 215nm에서 단백질의 광학 밀도를 나타낸다. 화살표는 피크의 위치와 부재를 나타내는데, 여기서 분석에 의해 탐지된 피브로넥틴/어그레칸 G3 단편이 위치해있어야만 한다. 피브로넥틴과 다른 또는 어그레칸의 더 큰 단편들의 복합체를 포함하는 기타 고분자 피크는 없다.
도 3은 피브로넥틴에 대한 네가티브 ELISA와 정제된 Bovine 어그레칸 G3 단편과 시험관에서 사전 혼합된 피브로넥틴에 대한 포지티브 ELISA의 결과를 보여주는 막대 그래프다. 데이터는 관련 단위의 광학 밀도로 나타낸다.
도 4는 표시된 추간판 수준에서 얻은 척추 시료를 ELISA로 분석한 Pfirrmann 및 수술중 VAS 값을 나타낸 막대 그래프다.
도 5는 포획용 항-어그레칸-G3 항체와 탐지용 항-피브로넥틴 항체를 이용하여 1차원 ELISA를 보여주는 그래프다. 데이터는 450 nm에서 예상 흡수도에 대한 450nm에서의 실제 흡수도로 나타낸다.
도 6은 한 명의 인간 대상체에 대해 증후를 나타낸는 통증성 무릎와 무증후성 기준 무릎으로부터 피브로넥틴-어그레칸(G3)의 이질성 ELISA 분석에서 얻은 광학 밀도(OD)를 비교한 막대 그래프다.
도 2는 무증후성 인간 시료의 크기 압출 크로마토그래피(SEC)의 결과를 보여주는 그래프다. 그래프는 용리 시간(분)에 대한 함수로써 SEC 컬럼으로부터 용리된 215nm에서 단백질의 광학 밀도를 나타낸다. 화살표는 피크의 위치와 부재를 나타내는데, 여기서 분석에 의해 탐지된 피브로넥틴/어그레칸 G3 단편이 위치해있어야만 한다. 피브로넥틴과 다른 또는 어그레칸의 더 큰 단편들의 복합체를 포함하는 기타 고분자 피크는 없다.
도 3은 피브로넥틴에 대한 네가티브 ELISA와 정제된 Bovine 어그레칸 G3 단편과 시험관에서 사전 혼합된 피브로넥틴에 대한 포지티브 ELISA의 결과를 보여주는 막대 그래프다. 데이터는 관련 단위의 광학 밀도로 나타낸다.
도 4는 표시된 추간판 수준에서 얻은 척추 시료를 ELISA로 분석한 Pfirrmann 및 수술중 VAS 값을 나타낸 막대 그래프다.
도 5는 포획용 항-어그레칸-G3 항체와 탐지용 항-피브로넥틴 항체를 이용하여 1차원 ELISA를 보여주는 그래프다. 데이터는 450 nm에서 예상 흡수도에 대한 450nm에서의 실제 흡수도로 나타낸다.
도 6은 한 명의 인간 대상체에 대해 증후를 나타낸는 통증성 무릎와 무증후성 기준 무릎으로부터 피브로넥틴-어그레칸(G3)의 이질성 ELISA 분석에서 얻은 광학 밀도(OD)를 비교한 막대 그래프다.
I. 정의
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "소근 통증", "신경뿌리질병", "신경경변증 통증" 및 "좌골신경통"은 척추 뿌리 수준으로부터 기인되거나 또는 하나 이상의 자극을 받은 허리 신경 뿌리의 경로를 따라 “신경”으로부터 발생되어 사지의 발산되는 통증을 말한다. 좌골신경통의 경우, 좌골 신경을 만드는 L4, L5 및/또는 S1 척추 신경 뿌리로부터 기인될 수 있다. 발산 통증(Radiating pain)은 경부 추간판 헤르니아, 경부 신경 뿌리 염증 또는 경부 추간판 퇴행의 경우 L3, L2 또는 L1 부위에서 고 요추 추간판 헤르니아로부터 또는 임의의 경부 신경 뿌리로부터 있을 수 있다. 이 통증은 파셋 관절 또는 기타 척추 구조로 인한 통증과는 상이하여, "언급된(referred)" 통증으로 분류된다. 발산 통증은 L3, L2 또는 L1 부위의 고요추 추간판 헤르니아 또는 경부 척추 부분으로부터 발생될 수도 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, "추간판 통증"은 추간판으로부터 발생된 척추-관련 통증을 말한다. 추간판은 속질핵으로부터 수화 상실과 연관된 감소된 기능으로 고통을 받는다. 기능 감소는 고리 섬유증(fibrosus)에서 손상과 일치한다. 이와 같은 약화는 팽창(bulging), 탈수화된(prolapsed), 밀려나온(extruded), 또는 격리된(sequestered) 추간판과 같은 해부학적 병소로 이어질 수 있다. 이와 같은 약화는 또한 추간판 내용물의 누출로 인한 생화학적 병소로 이어질 수 있고, 이는 등 통증 또는 상기 언급된 화학적 신경뿌리질병으로 나타날 수 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, "파셋 관절 통증" 또는 "소골면 통증(facetogenic pain)"은 파셋 관절로부터 발생된 통증을 말한다. "파셋 관절" 또는 "추간(zygapophysial) 관절"은 연골, 캡슐, 반월, 및 활액 막에서 제공되는 쌍을 이룬 전형적인 활액 관절이다.
여기에서 사용된 것과 같이 용어 "척추-통증" 또는 "척추 관련 통증"은 추간판, 파셋 및 신경뿌리질병 통증을 포함한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "급성 통증"은 최대 6개월, 예를 들면, 5개월, 4개월, 3개월, 2개월, 4주, 3주, 2주, 1주, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 또는 1일 미만으로 지속되는 통증을 말한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "만성 통증"은 6개월 이상 지속되는 통증을 말한다.
여기에서 사용된 것과 같이, "생물학적 시료"는 환자의 세포 또는 세포군 또는 조직 또는 유체의 양을 말한다. 이와 같은 시료는 일반적으로 인간에서 얻지만, 인간이 아닌 영장류, 설치로, 가령 마우스 및 쥐, 소, 갯과 동물, 말과 고양잇과 동물로부터 분리된 조직도 포함한다.
생물학적 시료는 조직학적 목적으로 취한 냉동 단편, 및 세척 시료와 같은 조직의 단편들을 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "척추 시료" 또는 "척추에서 취한 시료"는 "척추판 시료", "경막외 시료" 및 "파셋 관절시료"를 포함하나 이에 한정되지 않는 척추로부터 얻은 조직 또는 유체의 시료를 말한다. 흔히, 이와 같은 시료를 "생물학적 시료"라고 한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "관절" 또는 "사지 골격의 관절"은 임의의 가동관절(diarthoidal) 관절이라고 한다. 가동관절은 또한 활액 관절이라고도 한다. 용어 "관절"은 뼈, 관절의 연골, 관절캡슐, 활액 조직 라이닝, 및 캡슐내부 윤활성 활액 유체를 포함하는 임의의 관절을 말한다. 용어 "연골"은 관절의 연골 성분을 말한다. 용어 "반월판" 또는 "반월"은 일반적으로 무릎의 성분을 말한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "정상 관절" 또는 "기준 관절"은 대상체에게 무시되는 통증이 있는 관절을 말한다. 정상 관절에 있을 수 있는 통증의 수준은 일반적으로 환자가 의료기관을 찾을 정도로 환자의 삶의 기능 또는 질에 영향을 주지 않는다. 여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "관절시료" 또는 "관절의 시료"는 활액 유체 시료 및 생체외 또는 생체내 관절 또는 조직 세척을 포함하나 이에 한정되지 않는 관절로부터 얻은 조직 또는 유체의 시료를 말한다. 흔히, 이와 같은 시료는 "생물학적 시료"라고 할 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, 생물학적 시료에서 "생체표식의 수준" 또는 "피브로넥틴-어그레칸 복합체의 수준" 또는 "피브로넥틴-어그레칸 G3 복합체의 수준"은 생물학적 시료에 존재하는 생체 표식의 양을 말한다. "생체표식의 수준" 또는 "피브로넥틴-어그레칸 복합체의 수준" 또는 "피브로넥틴-어그레칸 G3 복합체의 수준"은 정량화할 필요는 없지만, 기준 시료의 수준 또는 기준 시료의 예상된 수준과 비교하지 않고, 인간이 객관적으로 시각적으로 탐지하는 것과 같이 간단하게 탐지될 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 호환적으로 아미노산 잔기의 폴리머를 말한다. 용어는 아미노산 폴리머에 적용되는데, 여기서 하나 이상의 아미노산 잔기는 자연적으로 발생되는 아미노산의 인공적인 화학적 모방체이며, 뿐만 아니라 자연적으로 발생되는 아미노산 폴리머, 변형된 잔기 및 비자연적으로 발생되는 아미노산 폴리머에도 적용된다.
용어 "물질" 또는 "치료 물질"은 약리학적 활성을 가진 또는 가질 수 있는 화합물을 설명하는데 이용된다. 물질은 공지의 약물, 약리학적 활성이 확인되었지만, 치료학적 평가가 진행중인 화합물, 그리고 약리학적 활성을 위해 스크리닝되는 집합 및 라이브러리 멤버인 화합물을 포함한다. 이 용어는 항체를 포함하는 펩티드, 단백질 및 소분자 및 자연 산물과 같은 유기 또는 무기 화학물질을 포함한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "면역분석"은 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 분석이다. 면역분석은 항원을 탐지하는, 정량화하는 및/또는 표적으로 하는 특정 항체의 특이적 결합 성질을 이용하는 것을 특징으로 한다.
결합 물질, 가령, 항체 및 단백질, 가령, 생체 표식 사이에 “특이적인 결합”은 생물학적 시료와 같은 혼합물에 존재하는 특정 물질에 선호적으로 결합하는 포획 또는 탐지 물질의 능력을 말한다. 특이적 결합은 또한 약 10-6 M 미만, 바람직하게는 10-8 M 미만의 그리고 가장 바람직하게는 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)를 의미한다.
항체에 “특이적(또는 선택적으로)으로 결합하는” 또는 단백질 또는 펩티드를 언급할 때 “~와 특이적 (또는 선택적) 면역반응성”은 단백질 및 기타 생물학의 이질성 집단에서 단백질의 결정적 존재가 되는 결합 반응을 말한다. 따라서, 명시된 면역분석 조건하에서, 특화된 항체는 배경보다 최소한 2배 이상의 수준으로 특정 단백질에 결합하고, 시료에 존재하는 다른 단백질에는 유의적인 양으로 결합하지 않는다.
여기에서 사용된 것과 같이, "라벨" 또는 "탐지가능한 모이어티"는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 방사선 사진, 면역화학 또는 기타 물리적 수단에 의해 탐지가능한 조성물이다. 예를 들면, 유용한 라벨은 32P, 형광 염료, 전자-조질 시약, 효소(가령, ELISA에 흔히 이용되는 것과 같은), 바이오틴, 디옥시게닌, 또는 합텐 그리고 펩티드에 방사능 라벨을 결합시켜 또는 펩티드와 특이적 반응성을 가진 항체를 탐지하는데 이용되는 라벨을 결합시켜 탐지가능하도록 만들어진 단백질 또는 기타 엔터티를 포함한다. 라벨은 임의의 위치에서 핵산, 단백질 및 항체에 결합될 수 있다. 라벨에 항체를 콘쥬게이트시키는 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있는데, 가령, Hermanson , Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press , Inc ., San Diego에서 설명된 방법을 이용할 수 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "억제제" 또는 "길항제"는 표적이 되는 생체표식의 활성을 직간접적으로, 부분적으로 또는 완전하게 차단, 감소, 억제, 활성화의 지연, 비활성화, 비감작화 또는 활성 또는 발현을 감소시키는 화합물 또는 조성물을 말한다. 길항제는 예를 들면, 항체 및 가용성 수용체와 같은 폴리펩티드 뿐만 아니라 siRNA 또는 안티센스 RNA와 같은 핵산, 뿐만 아니라 작은 화학 분자를 포함한 자연적으로 생성되는 그리고 합성된 생체표식 길항제다.
II
. 척추 또는 관절의 생체표식
척추 또는 관절에서 통증을 나타내는 생체 표식은 실험적으로 결정되었다. 몇 가지 구체예에서, 생체표식은 피브로넥틴과 어그레칸의 복합체를 포함하는데, 선호적으로 척추 시료 또는 관절시료로부터 분리된 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 포함한다. 하기 실시예들은 피브로넥틴 및 어그레칸의 복합체를 포함하는 생체표식이 척추 또는 관절 통증을 경험한 대상체의 척추 또는 관절에서 분리한 생물학적 시료안에 존재한다는 것을 설명한다.
생체표식은 임의의 비율로 피브로넥틴 및 어그레칸 폴리펩티드를 함유한다. 복합체는 전장의 피브로넥틴 및 어그레칸 폴리펩티드를 함유할 수 있거나 또는 피브로넥틴 및/또는 어그레칸 폴리펩티드의 단편들을 함유할 수도 있다. 용어 "단편"은 전장 단백질보다 짧은 폴리펩티드가 되는 임의의 하류 폴리펩티드를 말한다. 예시적인 피브로넥틴 또는 어그레칸 단편들은 피브로넥틴 또는 어그레칸의 20개, 30개, 40개, 50개 이상의 아미노산을 함유하는데, 차례로 항-피브로넥틴 또는 항-어그레칸 항체로 탐지될 수 있다. 다른 예시적인 어그레칸의 단편들은 하나 이상의 어그레칸의 G1, IGD, G2, KS, CS1, CS2 또는 G3 도메인, 또는 이의 단편들 또는 이의 복합체들을 함유하는 어그레칸 폴리펩티드의 일부분을 포함한다. 한 구체예에서, 생체표식은 어그레칸의 G3 도메인 또는 이의 단편과 피브로넥틴 또는 이의 단편의 복합체를 포함한다. 다른 구체예에서, 생체표식은 어그레칸의 G1 또는 G2 도메인 또는 이의 단편과 피브로넥틴 또는 이의 단편의 복합체를 포함한다.
예시적인 인간 피브로넥틴 1 서열은 NCBI gene ID 2335 (FNl; Ensembl:ENSG000001 15414; HPRD:00626; MIM: 135600)에서 발견될 수 있다. "피브로넥틴"은 여기에서 사용된 것과 같이, 질병 또는 질환과 관련된 대략 20개의 공지된 접합 변이체(splice variants) 및 상이한 세포 유형에 의한 상이한 접합으로 발생되는 피브로넥틴 변이체를 포함한 임의의 자연적으로 발생되는 피브로넥틴 변이체를 포함한다.
어그레칸은 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 패밀리의 멤버이며, 이 패밀리는 베르시칸, 브레비칸 및 뉴로칸도 포함한다. 예시적인 어그레칸 1 서열은 NCBI gene ID 176 (ACAN; Ensembl: ENSGOOOOOl 57766; HPRD:01123; MIM: 155760)에서 볼 수 있을 것이다. 예시적인 베르시칸 서열은 NCBI gene ID (VCAN; Ensembl: ENSG00000038427; UniProtKB: Pl 3611)에서 볼 수 있을 것이다. 예시적인 브레비칸 서열은 NCBI gene ID (BCAN; Ensembl: ENSGOOOOOl 32692; UniProtKB: Q96GW7)에서 볼 수 있을 것이다. 예시적인 뉴로칸 서열은 NCBI gene ID (NCAN; Ensembl: ENSGOOOOOl 30287; UniProtKB: 014594)에서 볼 수 있을 것이다. 이 유전자 패밀리은 매우 상동성이 크고, 그리고 50% 이상의 아미노산 동일성을 가진 넓은 단백질 도메인을 포함하는 유사한 단백질 기능을 나타낸다. "어그레칸"은 여기에서 사용된 것과 같이 어그레칸, 베르시칸, 브레비칸 및 뉴로칸의 자연-발생적 변이체 및 접합 변이체 그리고 상이한 세포 유형에 의한 접합으로 인한 어그레칸, 베르시칸, 브레비칸 및 뉴로칸의 임의의 변이체를 포함할 수 있다.
피브로넥틴 또는 어그레칸 폴리펩티드, 또는 이의 단편들은 피브로넥틴 또는 어그레칸의 변이체 또는 해독후 변형된 변이체가 될 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, "변이체" 폴리펩티드는 대응하는 야생형 폴리펩티드의 아미노산과 비교하였을 때, 최소한 한 개의 아미노산 변경을 포함한다. 아미노산 서열의 변경은 예를 들면, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결손 또는 삽입이 될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 임의의 조합의 아미노산 치환, 결손 또는 삽입을 가질 수 있다. 한 구체예에서, 피브로넥틴 또는 어그레칸 변이체 폴리펩티드는 정수의 아미노산 변경을 가질 수 있어, 이들은 야생형 피브로넥틴 또는 어그레칸 폴리펩티드의 아미노산 서열과 60%, 70%, 80%, 85%, 9O%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일성을 공유한다. 선호되는 구체예에서, 피브로넥틴 및 어그레칸 변이체 폴리펩티드는 야생형 피브로넥틴 또는 어그레칸 폴리펩티드의 아미노산 서열과 최소한 60%, 70%, 80%, 85%, 9O%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 가진다.
서열 동일성 비율은 컴퓨터 프로그램 또는 직접적인 서열 비교를 통하여 계산될 수 있다. 두 서열 간에 상동성을 결정하는 선호되는 컴퓨터 프로그램은 GCG program package, FASTA, BLASTP, 및 TBLASTN을 포함하나 이에 한정되지 않는다. (D. W. Mount , 2001, Bioinformatics : Sequence and Genome Analysis , Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor , N. Y.). BLASTP 및 TBLASTN 프로그램은 NCBI 및 다른 출처로부터 이용할 수 있다. 공지된 Smith Waterman 알고리즘 또한 상동성을 결정하는데 이용될 수 있다.
아미노산 서열 비교를 위한 예시적인 매개변수들은 다음을 포함한다: 1) Needleman 및 Wunsch의 알고리즘 (J MoL Biol ., 48:443-453 (1970)); 2) Hentikoff and Hentikoff의 BLOSSUM62 비교 매트릭스 (Proc . Natl Acad . ScL U.S.A., 89:10915-10919 (1992)) 3) 갭 패널티 = 12; 및 4) 갭 길이 패널티 = 4. 이들 매개변수에 유용한 프로그램은 "gap" 프로그램(Genetics Computer Group , Madison , Wis .)으로 이용할 수 있다. 전술한 매개변수들은 폴리펩티드 비교용 디폴트 매개변수다(단부 갭에 대한 패널티 없음). 대안으로, 폴리펩티드 서열 동일성은 다음의 식을 이용하여 계산될 수 있다: 동일성 % = (동일한 잔기의 수)/(아미노산 잔기에서 배열 길이)×100. 이 계산을 위하여, 배열 길이는 내부 갭을 포함하지만, 말단 갭은 포함하지 않는다.
III
. 척추 또는 관절 통증 치료용 치료 부위를 확인하는 방법.
피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 이의 수준을 탐지함으로써, 척추 통증 또는 관절 통증 치료용 치료 부위를 결정하는 방법을 설명한다.
A. 척추 통증
척추내 한 부위에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 증가된 수준 탐지를 이용하여 척추 통증 치료가 필요한 부위를 확인할 수 있다. 일부 구체예들에서, 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 증가된 수준에 근거하여 척추 동물 치료 부위로 결정되는 부위는 또한 통증 원천 부위다. 일부 구체예들에서, 제안된 방법은 통증 원천으로 의심되는 척추 부위로부터 하나 이상의 생물학적 시료를 수득하고, 그리고 각 생물학적 시료에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 탐지하고, 이들의 수준을 비교하는 것을 포함한다. 이 방법은 언급된 통증(referred pain) 부위 이외에 실질적으로 통증 부위를 확인하는데 유용할 것이다. 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 증가된 수준에 대해 테스트되는 적절한 대상체는 척추에 통증이 있는 임의의 대상체를 포함한다. 대상체는 예를 들면, 추간판, 파셋 또는 소근 통증으로 의심되는 통증을 경험할 수 있다.
개시된 방법은 척추 통증을 치료하기 위하여 척추내 위치를 결정하는데 유용하다. 이와 같은 위치들은 통증의 원천이 되는 척추내 부위가 될 수도 있다. 대상체에게 통증을 주는 부위를 확인하면 대상체에 병리 또는 손상을 진단 또는 진단을 지원하는데 유용할 것이다. 대상체에게 통증을 주는 부위를 확인하면 질병이 있는 대상체의 적절한 치료 판단을 지원하는데 유용할 것이다.
B. 관절 통증
관절내 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 증가된 수준 탐지를 이용하여 관절 통증 치료가 필요한 부위를 확인할 수 있다. 일부 구체예들에서, 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 증가된 수준에 근거하여 관절 통증 치료 부위로 결정되는 부위는 또한 통증 원천 부위다. 일부 구체예들에서, 제안된 방법은 통증 원천으로 의심되는 관절로부터 하나 이상의 생물학적 시료를 수득하고, 그리고 생물학적 시료에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 수준을 탐지하는 것을 포함한다. 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 증가된 수준에 대해 테스트되는 적절한 대상체는 사지골격의 관절에 통증이 있는 임의의 대상체를 포함한다. 대상체들은 골관절염, 연골증으로 의심되는 통증, 또는 반월, 힘줄 또는 인대 병리와 관련된 통증을 경험할 수 있다.
개시된 방법은 관절 통증 치료용 치료 부위를 결정하는데 유용하다. 이와 같은 위치들은 통증의 원천이 되는 관절이 될 수도 있다. 대상체에게 통증을 주는 관절을 확인하면 대상체에 병리 또는 손상을 진단 또는 진단을 지원하는데 유용할 것이다. 대상체에게 통증을 주는 관절을 확인하면 질병이 있는 대상체의 적절한 치료 결정을 지원하는데 유용할 것이다.
C.
대상체
피브로넥틴-어그레칸 복합체 탐지를 위해 선택될 수 있는 대상체들은 척추 또는 관절에 통증이 있는 임의의 대상체를 포함한다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다. 대상체는 추간판, 파셋 또는 신경경변증 통증을 포함하나 이에 한정되지 않는 척추와 연관된 임의의 통증을 경험할 수 있다.
적절한 대상체는 뼈, 관절의 연골, 또는 활액 조직 라이닝을 포함하나 이에 한정되지 않는 관절의 임의의 해부학적 구조와 관련된 통증을 경험하는 것으로 의심된다. 관절은 큰 가동관절(diarthrodial)(활액) 관절 (가령 무릎, 엉덩이, 어깨), 작은 가동관절(활액) 관절(가령 팔꿈치, 손목, 복사뼈, 척추관절돌기 또는 척추의 파셋 관절), 및 연골성 관절 (가령 천장관절, 흉쇄관절, 악관절("TMJ"))을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 대상체는 급성 관절-관련 통증, 또는 만성 관절- 관련 통증을 경험할 수 있다.
한 구체예에서, 대상체는 30주 또는 25주 미만동안 관절-관련 또는 척추 관련 통증을 경험하였다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 20주, 15주, 10주, 8주, 또는 6 주 미만동안 관절-관련 또는 척추 관련 통증을 경험하였다.
대상체는 성별 상관없으며 또는 임의의 연령대일 수 있다. 대상체는 급성 또는 만성 통증을 앓을 수 있다.
D.
피브로넥틴
-
어그레칸
복합체의 탐지
1. 척추로부터 생물학적 시료를 수득하는 방법
피브로넥틴-어그레칸 복합체를 탐지하기 위하여 척추로부터 시료를 빼내는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법들이 이용될 수 있다. 이와 같은 방법들에는 경막 밖의 공간, 추간판 공간 및 파셋 관절공간으로부터 시료를 수득하는 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적절한 방법은 하기에서 더 상세하게 설명된다.
방법 1 ; 경막 밖의 공간 세척 (
꼬리쪽
)
1) 형광투시로 확인된 도입 부위에 피부 및 피하 조직이 침윤되어 있다;
2) 삽관 바늘은 천골열공을 통하여 삽입되고, 다시 형광투시로 확인한다;
3) 바늘을 통하여 카테테르가 경막 밖의 공간으로 들어가고, 형광투시를 이용하여 카테테르를 병리 수준으로 통과시키고;
4) 만족할 만한 위치에 카테테르가 도달되면, 유도 와이어를 제거하고;
5) 약 3 cc 표준염(NS)를 포함하는 주사기를 카테테르의 말단에 부착시키고;
6) NS의 1/2 cc 증가량을 경막 밖의 공간으로 주사하면서, 주사량과 동량이 흡인되고, 주사후 재-흡입 전까지 3-5초 시격을 두고;
7) 흡인물을 프로테아제 억제제 칵테일 용액을 담고 있는 마이크로원심기에 넣고, 얼음 또는 드라이아이스에 두거나 또는 액화 질소에 담구거나 또는 기타 급속 냉동 방식하에 두고;
8) 시료는 분석때까지 -20℃ 이하의 영구 보관실로 이동시킨다.
방법 2:
경막외
(
꼬리쪽
해면(
sponge
))
1) 형광투시로 확인된 도입 부위에 피부 및 피하 조직이 침윤되어 있다;
2) 삽관 바늘은 천골열공을 통하여 삽입되고, 다시 형광투시로 확인한다;
3) 바늘을 통하여 카테테르를 경막 밖의 공간으로 들어가고, 형광투시를 이용하여 카테테르를 병리 수준의 가장 우세한 쪽으로 통과시키고;
4) 유도 와이어를 제거하고, 그리고 흡수재와 함께 분석 와이어를 인입시키고;
5) 1 cc 표준염(NS)를 포함하는 주사기를 삽관 포터에 부착시키고;
6) 흡수재가 젖도록 NS를 주사하고;
7) 카테테르를 병리의 가장 아래 측면으로 빼내고, 흡주재는 병소위에 두고;
8) 분석물질 와이어를 제거하고;
9) 흡수재로부터 세척시킨 물질을 프로테아제 억제제 칵테일 용액이 담겨있는 마이크로원심기로 넣고, 그리고 얼음 또는 드라이아이스 또는 액화 질소에 바로 위치시키거나 또는 기타 급속 냉동 방식하에 두고;
10) 마이크로원심기 튜브는 분석때까지 -20℃ 이하의 영구 보관실로 이동시킨다. 대안으로, 9) 단계에서, 시료는 집중화된 실험실 분석 또는 관리 분석 포인트를 이용하여 바로 분석될 수 있다.
방법 3:
경추간공
(
Transforaminal
)(
경막외
변경)
1) 형광투시로 확인된 도입 부위에 피부 및 피하 조직이 침윤되어 있다;
2) 작은 구경 바늘을 질병이 침범된 소공(foramen)을 통하여 삽입시키고, 다시 형광투시로 확인한다;
3) 약 1.5 cc 표준염(NS)를 포함하는 주사기를 바늘에 부착시키고;
4) NS의 약 1/2 cc 증가량을 경막 밖의 공간으로 주사하면서, 주사량과 동량을 흡인하고; 주사후 재-흡입 전까지 3-5초 시격을 두고;
5) 흡인물을 프로테아제 억제제 칵테일 용액을 담고 있는 마이크로원심기에 넣고, 얼음 또는 드라이아이스에 두거나 또는 액화 질소에 담구거나 또는 기타 급속 냉동 방식하에 두고;
6) 마이크로원심기 튜브는 분석때까지 -20℃ 이하의 영구 보관실로 이동시킨다.
방법 4:
경추간공
(
Ab
/흡착제
스폰지
)
1) 형광투시로 확인된 도입 부위에 피부 및 피하 조직이 침윤되어 있다;
2) 작은 구경 바늘을 질병이 침범된 소공(foramen)을 통하여 삽입시키고, 다시 형광투시로 확인한다;
3) 흡수재가 있는 분석물질 와이어를 바늘을 통하여 인입시키고;
4) 약 1 cc 표준염(NS)를 포함하는 주사기를 바늘에 부착시키고;
5) 흡수재 물질이 젖도록 NS를 주사하고;
6) 분석물질 와이어를 빼내고;
7) 흡입제로부터 물질을 프로테아제 억제제 칵테일 용액을 담고 있는 마이크로원심기로 세척해 넣고, 얼음 또는 드라이아이스에 두거나 또는 액화 질소에 담구거나 또는 기타 급속 냉동 방식하에 두고;
8) 마이크로원심기 튜브는 분석때까지 -20℃ 이하의 영구 보관실로 이동시킨다. 대안으로, 7) 단계에서, 시료는 집중화된 실험실 분석 또는 관리 분석 포인트를 이용하여 바로 분석될 수 있다.
방법 5: 경후궁(Translaminar)
1) 형광투시로 확인된 도입 부위에 피부 및 피하 조직이 침윤되어 있다;
2) 바늘을 추궁판간 도달 방법을 이용하여 경막 밖의 공간으로 삽입한다. 황인대(ligamentum flavum)를 통한 “팝(pop)”은 경막 밖의 공간내 적당한 위치를 확인할 수 있다, 대안으로, 형광투시로 확인한다;
3) 약 3-5cc 표준염(NS)를 포함하는 주사기를 바늘에 부착시키고;
4) NS의 약 1 cc 증가량을 경막 밖의 공간으로 주사하면서, 주사량과 동량을 흡인하고; 주사후 재-흡입 전까지 3-5초 시격을 두고;
5) 흡인물을 프로테아제 억제제 칵테일 용액을 담고 있는 마이크로원심기에 넣고, 얼음 또는 드라이아이스에 두거나 또는 액화 질소에 담구거나 또는 기타 급속 냉동 방식하에 두고;
6) 시료는 분석때까지 -20℃ 이하의 영구 보관실로 이동시킨다.
방법 6: 추간판 공간 (세척)
1) 형광투시로 확인된 도입 부위에 피부 및 피하 조직이 침윤되어 있다;
2) 단일 또는 이중 바늘 기술을 이용하여, 형광투시 유도하에 추간판 공간안으로 삽입시키고;
3) 약 1.5cc 표준염(NS)을 포함하는 주사기를 바늘에 부착시키고, 추간판 공간으로 주사하고;
4) 약 3초 후, 추간판은 세척 유체 용으로 재흡인되고;
5) 충분한 유체(대략 3/8 cc)를 얻을 때까지 이 과정을 반복할 수도 있으며;
6) 흡인물은 세척되어 프로테아제 억제제 칵테일 용액을 담고 있는 마이크로원심기로 들어가고, 얼음 또는 드라이아이스에 두거나 또는 액화 질소에 담구고;
7) 마이크로원심기 튜브는 분석때까지 -20℃ 이하의 영구 보관실로 이동시킨다.
방법 7: 추간판 공간 (흡수성
스폰지
)
1) 형광투시로 확인된 도입 부위에 피부 및 피하 조직이 침윤되어 있다;
2) 단일 또는 이중 바늘 기술을 이용하여, 형광투시 유도하에 추간판 공간안으로 삽입시키고;
3) 삽관 유도 와이어가 제거되고, 흡수제가 있는 분석물질 와이어가 인입되고;
4) 약 1cc 표준염(NS)을 포함하는 주사기를 삽관 포터에 부착시키고;
5) 마이크로원심기 튜브를 적시도록 NS가 주사되고;
6) 분석물질 와이어가 제거되고;
7) 흡수제로부터 물질은 세척되어 프로테아제 억제제 칵테일 용액을 담고 있는 마이크로원심기로 들어가고, 얼음 또는 드라이아이스에 두거나 또는 액화 질소에 담구고;
8) 마이크로원심기 튜브는 분석때까지 -20℃ 이하의 영구 보관실로 이동시킨다. 대안으로, 7) 단계에서, 시료는 집중화된 실험실 분석 또는 관리 분석 포인트를 이용하여 바로 분석될 수 있다.
방법 8:
파셋
관절공간 (세척)
1) 형광투시로 확인된 도입 부위에 피부 및 피하 조직이 침윤되어 있다;
2) 단일 또는 이중 바늘 기술을 이용하여, 형광투시 유도하에 파셋 관절로 삽입시키고;
3) 약 1.5cc 표준염(NS)을 포함하는 주사기를 바늘에 부착시키고, 그리고 파셋 관절공간으로 주사하고;
4) 약 3초 후, 추간판은 세척 유체 용으로 재흡인되고;
5) 충분한 유체(대략 3/8 cc)를 얻을 때까지 이 과정을 반복할 수도 있으며;
6) 흡인물은 세척되어 프로테아제 억제제 칵테일 용액을 담고 있는 마이크로원심기로 들어가고, 얼음 또는 드라이아이스에 두거나 또는 액화 질소에 담구고;
7) 마이크로원심기 튜브는 분석때까지 -20℃ 이하의 영구 보관실로 이동시킨다.
방법 9:
파셋
관절공간 (
ab
/흡착성
스폰지
)
1) 형광투시로 확인된 도입 부위에 피부 및 피하 조직이 침윤되어 있다;
2) 단일 또는 이중 바늘 기술을 이용하여, 형광투시 유도하에 파셋 관절로 삽입시키고;
3) 삽관 유도 와이어가 제거되고, 흡수제가 있는 분석물질 와이어가 인입되고;
4) 약 1cc 표준염(NS)을 포함하는 주사기를 삽관 포터에 부착시키고;
5) 마이크로원심기 튜브를 적시도록 NS가 주사되고;
6) 분석물질 와이어가 제거되고;
7) 흡수제로부터 물질은 세척되어 프로테아제 억제제 칵테일 용액을 담고 있는 마이크로원심기로 들어가고, 얼음 또는 드라이아이스에 두거나 또는 액화 질소에 담구고;
8) 마이크로원심기 튜브는 분석때까지 -20℃ 이하의 영구 보관실로 이동시킨다. 대안으로, 7) 단계에서, 시료는 집중화된 실험실 분석 또는 관리 분석 포인트를 이용하여 바로 분석될 수 있다.
선호되는 흡수성 물질은 스폰지, 포말, 거즈, 펠트, 또는 헝겊을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 흡수성 물질은 생체접합성이며, 천연 또는 합성물질로 만들 수 있다. 천연 물질은 면을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 합성 물질은 나일론과 같은 폴리머를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
2. 관절로부터 시료를 수득하는 방법.
피브로넥틴-어그레칸 복합체를 탐지하기 위하여, 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 관절 시료를 수득할 수 있다. 적절한 방법은 경피 또는 개방 흡인, 생검, 또는 세척을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
3.
피브로넥틴
-
어그레칸
복합체를 탐지하는 방법
생물학적 시료에서 폴리펩티드의 존재를 탐지하는 임의의 공지된 방법을 이용하여 척추 또는 관절 시료에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재를 정량적 또는 정성적으로 탐지할 수 있다. 적절한 방법은 크로마토그래프 방법, 선택적 결합 분석, 질량 분석법, 분광 광도법, 또는 이의 복합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
예시적인 결합 분석은 면역분석, 가령, 효소 연결된 면역흡수 분석을 포함한다. 면역분석은 척추 시료에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재를 정량적 또는 정성적으로 탐지할 수 있다. 이용가능한 기술의 전반적인 개요는 바로 이용가능한 매뉴얼에서 찾아 볼 수 있는데, 가령, Harlow & Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press , Using Antibodies : A Laboratory Manual (1999).
a. 선택적 결합 파트너
일부 구체예들에서, 개시된 방법 및 키트는 피브로넥틴 또는 어그레칸의 선택적 결합 파트너를 이용하여 척추 또는 관절의 시료안에 피브로넥틴 또는 어그레칸의 존재 또는 수준을 확인한다. 선택적 결합 파트너는 피브로넥틴 또는 어그레칸, 또는 이의 단편들 또는 이의 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 기타 생분자가 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 단클론 또는 다클론 항체가 이용된다.
항체는 시판되는 항체를 포함하여 당업계에 공지된 임의의 항체가 될 수 있다. 이용되는 항체의 유형, 원천 및 기타 측면은 항체가 이용되는 분석에 맞게 항체를 만드는데 고려사항이 된다는 것은 당업자가 잘 알고 있는 사실이다. 일부 경우에, 웨스턴 블랏 상에서 항원 표적(예를 들면, 피브로넥틴 또는 어그레칸의 에피토프 또는 다중 에피토프)을 인지할 수 있는 항체가 모든 ELISA 또는 ELISpot 분석에 적용될 수 있는 것은 아니다. 일부 구체예들에서, 이용되는 항체, 항체 단편, 또는 단일 쇄 항체는 당업계에 공지된 단클론 또는 다클론 항체를 만드는 기술을 이용하여 만들 수 있다(가령, Coligan , Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane , supra ; Goding , Monoclonal Antibodies : Principles 및 Practice (2d ed . 1986); and Kohler & Milstein , Nature 256:495-497 (1975). 이와 같은 기술은 파아지 또는 유사한 벡터내에 재조합 항체 라이브러리로부터 항체의 선택에 의한 항체 준비, 뿐만 아니라 토끼 또는 마우스를 면역주사하여 다클론 항체 및 단클론 항체를 준비하는 것을 포함한다(가령 Huse et al . Science 246:1275-1281 (1989); Ward et al, Nature 341 :544-546 (1989)). 피브로넥틴 또는 어그레칸의 다수의 이뮤노겐을 이용하여 피브로넥틴 및 어그레칸 및 이의 단편들과 특이적인 반응성을 가진 항체를 만들 수 있다. 예를 들면, 재조합 피브로넥틴 또는 어그레칸 또는 이의 항원 단편들은 당업계에 공지된 방법에 의해 분리될 수 있다. 재조합 단백질은 진핵세포 또는 원핵세포에서 발현될 수 있다. 재조합 단백질은 단클론 또는 다클론 항체 생산을 위해 일반적으로 이용되는 이뮤노겐이다. 대안으로, 피브로넥틴 및 어그레칸의 공지의 서열로부터 유도되고, 운반체 단백질에 콘쥬게이트된 합성 펩티드를 이뮤노겐으로 이용할 수 있다. 자연적으로 생성되는 단백질은 순수한 형태 또는 정제안된 형태로 이용될 수 있다. 그 다음 생성물은 항체를 생산할 수 있는 동물에게 투여된다. 단백질 측정을 위한 후속 면역 분석에 사용되는 단클론 또는 다클론 항체가 생성될 수 있다.
기타 구체예에서, 피브로넥틴과 어그레칸을 함유하는 복합체에 특이적으로 결합하는 항체는 특이적 결합 파트너로 이용된다. 특정 구체예에서, 피브로넥틴 또는 어그레칸 단독에는 존재하지 않고, 피브로넥틴-어그레칸 복합체에 존재하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 이용된다.
다른 구체예들에서, 비-항체 폴리펩티드가 피브로넥틴 또는 어그레칸, 또는 이의 단편들 또는 복합체의 탐지를 위한 특이적 결합제로 이용된다. 피브로넥틴에 특이적으로 결합하는 다수의 단백질이 당업계에 공지되어 있다. 피브로넥틴의 선택적 결합 파트너로 이용될 수 있는 예시적인 단백질은 세포-표면 인테그린, 콜라겐, 피브린, 렉틴 및 헤파린 설페이트를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 어그레칸의 선택적 결합 파트너로 이용될 수 있는 폴리펩티드는 테나신-R, 테나신-C, 피불린-1, 피불린-2 및 피부릴린-1을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
b. 분석
선택적 결합 파트너가 이용가능하다면, 면역분석을 포함하는 다양한 선택적 결합 분석에 의해 특이적인 생체표식이 탐지될 수 있다. 면역학적 그리고 면역분석 과정에 대해서 Basic and Clinical Immunology ( Stites & Terr eds ., 7 th ed . 1991)을 참고한다. 더욱이, 개시된 선택적 결합 분석은 임의의 몇 가지 형태로 실행될 수 있다. 몇 가지 면역분석 형태는 Enzyme Immunoassay (Maggio, ed., 1980)에서 검토한다.
특정 구체예는 피브로넥틴 또는 어그레칸, 또는 이의 단편들 또는 복합체의 결합 파트너를 이용하여, 척추 또는 관절시료에서 피브로넥틴-어그레칸의 존재를 탐지하고 및/또는 그 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 일반적으로 다음을 포함한다: a) 척추 또는 관절시료를 피브로넥틴 또는 어그레칸, 또는 이의 단편들 또는 복합체의 특이적 결합 파트너에 접촉시키고; 그리고 b) 시료의 특이적 결합 파트너와 분자 사이에 결합을 탐지한다. 적절한 기준과 비교하였을 때, 결합 파트너가 시료안의 분자에 특이적 결합된 것이 탐지되면, 시료안에 생체표식이 존재한다는 것을 나타낸다. 특이적 단백질 상호작용을 탐지하는 다양한 방법들이 당업계에 공지되어 있고, 이들 방법을 이용할 수 있다. 방법은 경쟁 분석 및 비경쟁 분석을 포함한다. 적절한 방법은 웨스턴 블랏, 면역침전, ELISA 및 방사능면역분석을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이들 분석 및 기타 적절한 분석을 실행하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 생체표식을 탐지하는데 이용되는 특이적 결합 파트너는 직간접적으로 탐지가능하도록 라벨될 수 있다. 척추 또는 관절시료는 세포, 세포 입자들 또는 가용성 단백질을 고정시킬 수 있는 막 (가령, 니트로셀룰로오즈) 또는 폴리스티렌 또는 자성 비드와 같은 고형 지지대 또는 운반체에 고정되거나 접촉될 수 있다. 지지물을 적절한 완충액으로 세척시킨 후, 탐지가능하도록 라벨된 선택적 결합 파트너와 접촉시킨다.
선호되는 방법은 피브로넥틴-어그레칸 복합체에 존재하지 않는 피브로넥틴 및/또는 어그레칸과 비교하였을 때, 피브로넥틴과 어그레칸을 함유하는 복합체 폴리펩티드 또는 이의 단편들을 선택적으로 탐지하는 방법들을 포함한다. 피브로넥틴- 어그레칸 복합체의 이와 같은 선택적 탐지를 위한 적절한 결합 분석은 피브로넥틴-어그레칸 복합체에 결합하고, 복합체에 존재하지 않는 피브로넥틴 및/또는 어그레칸은 탐지하지 않는 선택적 결합 파트너를 사용하는 분석을 포함한다. 이와 같은 분석에 이용되는 적절한 선택적 결합 파트너는 피브로넥틴-어그레칸 복합체에는 존재하지만, 피브로넥틴-어그레칸 복합체에 있지 않는 피브로넥틴 또는 어그레칸에는 존재하지 않는 에피토프를 인지하는 항체를 포함한다. 비-복합된 피브로넥틴 또는 어그레칸과 비교하였을 때, 피브로넥틴-어그레칸 복합체에 특이적인 에피토프는 이들 각 폴리펩티드의 아미노산 서열로부터 부분적으로 형성될 수 있다. 이와 같은 방식으로, 각 폴리펩티드는 에피토프에 기여한다. 비-복합된 피브로넥틴 또는 어그레칸과 비교하였을 때, 피브로넥틴-어그레칸 복합체에 특이적인 에피토프는 복합체내 이들 폴리펩티드의 형태학적 차이로 인하여 보통은 “차단된”형태의 에피토프가 항체 또는 다른 폴리펩티드에 의한 결합에 용이한 형태가 되도록 존재할 수 있다. 다른 적절한 분석은 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 탐지하기 위하여 각 피브로넥틴 및 어그레칸의 특이적 결합 파트너를 복합하여 이용하는 것을 포함한다. 공동-면역침전 및 이질성 ELISA 분석이 이와 같은 유형의 분석의 예가 된다. 이들 분석에서, 제 1 폴리펩티드에 대한 제 1 특이적 결합 파트너는 복합체를 “포획”하는데 이용되며, 그리고 제 2 폴리펩티드에 대한 제 2 선택적 결합 파트너는 복합체를 탐지하는데 이용된다. 이질성 ELISA 및 공동-면역침전과, 이어서 웨스턴 블랏팅에 의한 폴리펩티드 복합체 탐지 방법은 당업계에 공지된 것이다. 하기 실시예들은 인간 시료에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 탐지하기 위하여 항-피브로넥틴 및 항-어그레칸 항체를 이용한 이질성 ELISA 시스템을 이용하는 것을 설명한다.
모든 특이적 결합 분석에서, 특이적 결합 파트너가 기질에 부착되어 있을 때 발생되는 비-특이적 결합의 양을 최소화시키는 것이 바람직하다. 비-특이적 결합을 감소시키는 수단은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로 이와 같은 기술은 기질을 단백질성 조성물로 피복시키는 것을 포함한다. 특히, 소 혈청 알부민 (BSA), 탈지 분유, 및 젤라틴과 같은 단백질 조성물이 광범위하게 이용된다. 추가로, 또는 단백질 조성물을 대신하여, 다양한 계면활성제 및/또는 염이 면역분석에 포함되어 비-특이적 상호작용을 최소화시킬 수 있다. 분석 과정에서, 항온처리 및/또는 세척 단계가 각 시약 복합 후에 필요할 수도 있다. 항온처리 및 세척 횟수는 생체표식에 대한 특이적 결합 파트너의 친화력, 용액의 용적 및 농도를 포함하는 몇 가지 인자들에 따라 달라질 수 있다.
한 구체예는 탐지 분석을 조정하기 위하여 탐지 분석에 이용될 수 있는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 포지티브 기준을 제공한다. 특정 구체예에서, 피브로넥틴 및 어그레칸은 상이한 출처, 가령, 상이한 종으로부터 유래된다. 피브로넥틴은 인간 피브로넥틴이고, 어그레칸은 소, 돼지 또는 말의 어그레칸이 될 수 있다. 대안으로, 피브로넥틴은 소, 돼지, 또는 말의 것이며, 어그레칸은 인간의 것일 수 있다. 피브로넥틴 및 어그레칸이 인간 서열에 서열 상동성을 가진 동일한 또는 상이한 종으로부터 유래되었다면, 임의의 조합이 이용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 피브로넥틴 및 어그레칸은 재조합, 자연적 또는 이의 조합이 될 수 있다.
c. 탐지가능한 라벨
면역분석을 포함하는 특이적 결합 분석은 특이적 결합 파트너와 탐지되는 분석물질에 의해 형성된 복합체에 특이적으로 결합하여, 탐지를 허용하는 라벨링 물질을 흔히 이용한다. 라벨링 물질은 분석물질을 탐지하기 위하여 이용되는 특이적 결합 파트너의 일부가 될 수 있다. 대안으로, 라벨링 물질은 2차 항체와 같은 제 3 모이어티가 되며, 이 항체는 특이적 결합 파트너와 탐지되는 분석물질에 의해 형성된 복합체에 특이적으로 결합한다. 단백질 A 또는 단백질 G와 같은 면역글로블린 불변부위에 특이적으로 결합할 수 있는 다른 단백질도 라벨링 물질로 이용될 수 있다. 이들 단백질은 다양한 종의 면역글로블린 불변 부위에 대해 강력한 친화력을 나타낸다(가령 Kronval et al ., J. Immunol . 111: 1401-1406 (1973); Akerstrom et aL , J. Immunol . 135:2589-2542 (1985)). 라벨링 물질은 스트렙타아비딘과 같은 또 다른 분자가 특이적으로 결합할 수 있는 바이오틴과 같은 탐지가능한 모이어티로 변형될 수 있다. 다양한 탐지가능한 모이어티는 당업계에 잘 공지되어 있다. 탐지가능한 라벨은 탐지가능한 물리적 또는 화학적 성질을 가지는 임의의 물질이 될 수 있다. 많은 유용한 탐지가능한 라벨이 당분야에 공지되어 있으며, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 방사선사진, 전기, 광학 또는 화학적 수단에 의해 탐지가능한 임의의 라벨을 포함한다. 라벨 선택은 요구되는 감도, 화합물에 콘쥬게이트의 용이성, 안정성 요구, 이용가능한 장비 및 처리 규정에 따라 달라질 수 있다. 유용한 라벨은 자성 비드 (가령, DYNABEADS®), 형광 염료 (가령, 플루오레세인 이소티오시아네이트, Texas red, 로다민 및 이와 유사한 것들), 방사능라벨 (가령, 3H, 125I, 35S, 14C, 또는 32P), 효소 (가령, 양고추냉이 과산화효소, 알칼리 포스포타제 그리고 ELISA에 흔히 이용되는 것들), 그리고 발색성 라벨 가령, 콜로이드성 금 또는 발색 유리 또는 플라스틱 비드(가령, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스, 등)를 포함한다.
비-방사능활성 라벨은 간접적인 수단에 의해 흔히 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자(가령, 바이오틴)가 분자에 공유적으로 결합된다. 그 다음 리간드는 또 다른 분자(가령, 스트렙타아비딘)에 결합하고, 이는 탐지가능한 효소, 형광 화합물, 또는 화학적발광 화합물과 같은 신호계에 간접적으로 탐지가능하게 또는 공유적으로 결합된다. 리간드와 이의 표적은 생체표식을 인지하는 항체, 또는 생체표식에 대한 항체를 인지하는 2차 항체와의 적절한 조합으로 이용될 수 있다.
분자는 효소 또는 형광단과 콘쥬게이트에 의해 신호 생성 화합물에 직접적으로 콘쥬게이트될 수 있다. 라벨로 이용될 수 있는 효소는 주로 가수분해효소, 특히 포스파타제, 에스테라제 그리고 글리코시다제, 또는 옥시도타제, 특히 퍼옥시다제를 포함한다. 예시적인 형광 화합물은 플루오레세인 및 이의 유도체들, 그리고 로다민 및 이의 유도체들, 단실 및 움벨리페론을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 화학적발광 화합물은 루시페린 및 2,3-디하이드로필할라즈메디온을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 라벨을 탐지하는 수단은 당업계에 공지되어 있다.
E. 진단 및 예후
통증의 원천이 되는 척추 또는 관절내 부위를 확인하기 위하여 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 탐지하는 방법을 이용하여 척추 또는 관절의 해부학적 구조 및 생리학적 기능과 관련된 통증 증후군이 있는 대상체의 진단 또는 진단을 지원할 수 있다.
1. 척추-통증의 진단 및 예후
예를 들면, 경막 밖의 공간, 추간판, 또는 파셋 관절에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 확인으로 신경뿌리질병, 파셋 관절 통증 또는 추간판 통증을 진단 또는 진단을 지원할 수 있다.
특정 환자에서 통증의 원천으로 척추내 특정 위치를 나타내는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 양은 환자의 나이, 성별, 병력 등, 생물학적 시료를 뽑아낸 부위, 그리고 생체표식을 탐지하는데 이용된 분석 포멧을 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 인자들에 따라 달라진다. 일부 구체예들에서, 생물학적 시료내에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 수준을 정량화하거나 또는 기준 시료와 직접 비교할 필요가 없으며, 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 “진단학적 존재”로 탐지되고, 여기서 대해 진단학적 존재( "diagnostic presence")는 시료를 얻은 위치에서 통증의 원인이 되는 병리 또는 손상이 존재함을 또는 존재 가능성을 알리는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 양을 말한다. 일부 구체예들에서, “진단학적 존재”는 양성 또는 음성 결과를 제공하는 간단한 분석에서 탐지가능하며, 여기서, 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 “진단학적 존재”의 양성 “탐지”는 시료를 얻은 위치에서 통증의 원인이 되는 병리 또는 손상이 존재함을 나타낸다.
피브로넥틴-어그레칸 복합체의 수준은 탐지되는 “진단학적 존재”에 대해 정량화할 필요는 없다. 오히려, 정상 또는 기준보다 훨씬 높은 수준으로 피브로넥틴-어그레칸 복합체가 존재하는 지를 판단할 수 있는 방법이 이용된다. 더구나, ‘진단학적 존재’는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 임의의 절대적 양을 말하는 것이 아니며, 생물학적 시료, 분석 조건, 환자의 의학적 상태에 따라 정상 또는 기준 환자의 수준과 비교하여 질병이 있는 환자에서의 수준 차이를 구별할 수 있을 정도의 양을 말한다.
개시된 방법은 특정 기준 시료에 피브로넥틴-어그레칸 복합체가 정상적으로 존재하는지 또는 존재하는 것으로 예상되는지에 관계없이 이용될 수 있다. 예를 들면, 특정 분석을 이용하여 특정의 정상적인 척추 시료(가령, 추간판 공간 또는 경막 밖의 공간 lavasate)에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 탐지할 수 없어서 생물학적 기준 시료에 피브로넥틴-어그레칸 복합체가 없다고 결론지을 수도 있다. 생물학적 시료에서, "진단학적 존재"는 동일한 분석을 이용하여 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 임의의 탐지가능한 양을 말한다. 그러나, 다른 경우에는 정상 또는 기준 시료에 존재하는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 탐지가능한 수준을 말하며, 그리고"진단학적 존재"는 정상 수준이상의 수준을 나타내며, 바람직하게는 정상 수준보다 통계학적으로 유의적인 증가를 나타낸다. 일부 구체예들에서, 생물학적 시료안에 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 “진단학적 존재”는 기준 시료보다 최소한 약 1.5배, 2배, 5배, 10배, 10O배, 200배, 500배, 1000배 또는 그 이상이 될 것이다. 기준 시료는 척추 통증을 경험하지 않은 개인 또는 집단에서 취한 시료가 될 수 있다. 대안으로, 기준 시료는 통증의 원천으로 의심되지 않는 척추 부위로부터 수득될 수 있다. 예를 들면, 추간판 통증을 겪는 대상체에서, 동일 환자의 영향을 받지 않는 또는 무증후성 추간판 공간으로부터 기준 시료를 수득할 수 있다.
척추내 특정 높이에 존재하는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 이의 수준은 추간판, 파셋 또는 신경경변증 통증과 같은 특정 유형의 척추 통증을 진단 또는 진단을 지원하는데 이용한다. 추가적으로, 또는 대안으로, 척추 시료안에 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 존재 수준은 척추 병리 또는 손상으로 인한 통증을 근육 통증과 같은 또 다른 원천으로부터 기인된 통증과 구별하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 척추를 따라 특정 위치에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 존재 수준은 해당 특정 위치에 병리 또는 손상을 나타낸다. 예를 들면, 피브로넥틴-어그레칸 복합체가 L5 추간판 lavasate에서 탐지되며, 이 환자는 L5에서 손상 또는 병리를 가진다. 그 다음 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재는 MRI와 같은 다른 방법에 의해 손상이 탐지가능한 지 여부에 관계없이, 특정 위치의 손상을 진단하고 치료물을 투여하는데 이용될 수 있다. 환자는 손상 또는 병리 부위, 가령, 피브로넥틴-어그레칸 복합체가 존재하는 부위로 치료제를 투여하여 치료될 것이다.
생물학적 시료안에 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 존재 수준을 이용하여 환자를 특정 치료에 대한 후보로 지정할 수 있다. 환자로부터 구한 척추 시료를 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존부에 대해 분석한다. 피브로넥틴-어그레칸 복합체가 척추 시료에서 탐지된다면, 이 환자는 해당 치료를 받도록 선택될 수 있다. 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 존재 수준에 의해 결정된, 질환의 중증도에 맞게 항염증제 또는 외과술과 같은 치료 유형을 맞출 수 있다.
특정 부위에 존재하는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 수준은 또한 치료될 대상체의 예후를 판단하는데 유용할 것이다. 예를 들면, 척추 시료에 존재하는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 양은 척추에 급성 손상 정도를 나타내고, 그리고 손상 또는 병리의 성공적인 복구 또는 치료를 얻을 수 있는 정도를 판단하는데 도움이 될 것이다.
2. 관절 통증의 진단 및 예후
관절-관련 통증을 치료하기 위한 부위가 되는 관절을 확인하기 위하여 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 탐지하는 방법은 사지골격의 활액 관절의 해부학적 구조 및 생리학적 기능과 관련된 통증 증후군이 있는 대상체를 진단 또는 진단을 지원하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 관절내 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 확인하여 골관절염, 반월 병리, 회전건판 파열, 힘줄 또는 인대 병리, 연골증, 또는 근막성 통증을 진단 또는 진단을 지원한다.
특정 대상체의 관절-관련 통증 치료를 요하는 부위의 해당 관절을 표시하는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 양은 환자의 나이, 성별, 병력 등, 생물학적 시료를 뽑아낸 부위, 그리고 생체표식을 탐지하는데 이용된 분석 포멧을 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 인자들에 따라 달라진다. 일부 구체예들에서, 생물학적 시료내에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 수준을 정량화하거나 또는 기준 시료와 직접 비교할 필요가 없으며, 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 “진단학적 존재”로 탐지되고, 여기서 대해 진단학적 존재는 시료를 얻은 위치에서 통증의 원인이 되는 병리 또는 손상이 존재함을 또는 존재 가능성을 알리는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 양을 말한다. 일부 구체예들에서, “진단학적 존재”는 양성 또는 음성 결과를 제공하는 간단한 분석에서 탐지가능하며, 여기서, 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 “진단학적 존재”의 양성 “탐지”는 시료를 얻은 위치에서 통증의 원인이 되는 병리 또는 손상이 존재함을 나타낸다.
피브로넥틴-어그레칸 복합체의 수준은 탐지되는 “진단학적 존재”에 대해 정량화할 필요는 없다. 오히려, 정상 또는 기준보다 훨씬 높은 수준으로 피브로넥틴-어그레칸 복합체가 존재하는 지를 판단할 수 있는 방법이 이용된다. 더구나, ‘진단학적 존재’는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 임의의 절대적 양을 말하는 것이 아니며, 생물학적 시료, 분석 조건, 환자의 의학적 상태에 따라 정상 또는 기준 환자의 수준과 비교하여 질병이 있는 환자에서의 수준 차이를 구별할 수 있을 정도의 양을 말한다.
개시된 방법은 특정 기준 시료에 피브로넥틴-어그레칸 복합체가 정상적으로 존재하는지 또는 존재하는 것으로 예상되는지에 관계없이 이용될 수 있다. 예를 들면, 특정 분석을 이용하여 특정의 정상적인 척추 시료(가령, 활액 유체 시료)에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 탐지할 수 없어서 생물학적 기준 시료에 피브로넥틴-어그레칸 복합체가 없다고 결론지을 수도 있다. 생물학적 시료에서, "진단학적 존재"는 동일한 분석을 이용하여 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 임의의 탐지가능한 양을 말한다. 그러나, 다른 경우에는 정상 또는 기준 시료에 존재하는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 탐지가능한 수준을 말하며, 그리고 "진단학적 존재"는 정상 수준 이상의 수준을 나타내며, 바람직하게는 정상 수준보다 통계학적으로 유의적인 증가를 나타낸다. 일부 구체예들에서, 생물학적 시료안에 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 “진단학적 존재”는 기준 시료보다 최소한 약 1.5배, 2배, 5배, 10배, 10O배, 200배, 500배, 1000배 또는 그 이상이 될 것이다. 기준 시료는 관절-관련 통증을 경험하지 않은 개인 또는 집단에서 취한 시료가 될 수 있다. 대안으로, 기준 시료는 테스트되는 대상체의 영향이 없는 부위 또는 무중후성 관절로부터 수득될 수 있다. 특히, 기준 시료를 수득하는데 적합한 관절은 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 진단학적 존재에 대해 테스트되는 관절의 반대 쪽 질병에 영향을 받지 않은 또는 무증후성 관절이다. 예를 들면, 왼쪽 무릎 통증을 겪고 있는 대상체에서, 오른쪽 무릎이 영향을 받지 않는 또는 무증후성이라면, 동일한 대상체의 오른쪽 무릎으로부터 기준 시료를 얻을 수 있다.
특정 관절에 피브로넥틴-어그레칸 복합체가 존재하거나 존재하는 양을 이용하여 골관절염, 반월 병리, 회전건판 파열, 힘줄 또는 인대 병리, 연골증, 또는 근막성 통증을 포함하나 이에 한정되지 않는 관절-관련 통증의 유형을 진단 또는 진단을 지원할 수 있다. 일부 구체예들에서, 관절내에 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 존재량은 해당 특정 관절의 병리 또는 손상을 나타낸다. 추가적으로 또는 대안으로, 관절 시료안에 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 존재량을 이용하여 척추와 같은 또 다른 해부학적 또는 생리학적 원천으로부터 기인된 통증으로부터 관절-관련된 통증을 구별할 수 있다. 예를 들면, 기준 시료와 비교하여 관절 시료내에 존재하는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 존재량의 증가는 신경뿌리질병 통증으로부터 관절-관련 통증을 구별하는데 이용될 수 있다.
피브로넥틴-어그레칸 복합체의 탐지만으로 또는 다른 진단 방법과 병용하여 관절-관련 통증을 진단할 수 있다. 예시적인 진단 방법은 병력 및 신체 검사, x-선 촬영, MRI 및 관절내 주사를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 그러나, 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재를 이용하여 다른 수단, 가령 MRI에 의해 손상이 탐지되는지에 상관없이 손상을 진단하고, 특정 부위로 치료물질을 투여할 수 있다. 일반적으로 환자는 손상 또는 병리 부위, 가령, 피브로넥틴-어그레칸 복합체가 존재하는 부위로 치료제를 투여하여 치료될 것이다.
생물학적 시료안에 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 존재량을 이용하여 환자를 특정 치료에 대한 후보로 지정할 수 있다. 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재 또는 존재량에 의해 결정된, 질환의 중증도에 맞게 항염증제 또는 외과술과 같은 치료 유형을 맞출 수 있다.
특정 부위에 존재하는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 수준은 또한 치료될 대상체의 예후를 판단하는데 유용할 것이다. 예를 들면, 척추 시료에 존재하는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 양은 척추에 급성 손상 정도를 나타내고, 그리고 손상 또는 병리의 성공적인 복구 또는 치료를 얻을 수 있는 정도를 판단하는데 도움이 될 것이다.
D. 치료 효과의
모니터링
개시된 방법을 이용하여 치료 효과 또는 치료 과정을 평가할 수 있다. 예를 들면, 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 “진단학적 존재”에 대해 양성으로 테스트된 신경뿌리질병 환자에서, 항염증 치료의 효과는 시간에 따른 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재량을 모니터함으로써 평가될 수 있다. 치료후 환자에서 취한 생물학적 시료내에 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재량이 동일 환자에서 치료 전 또는 치료 초기에서 취한 시료에서의 양과 비교하여 감소되었다면, 효과적인 치료임을 나타낸다. 관절시료에 있는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 “진단학적 존재”에 대해 양성인 관절-관련 통증 환자에서, 항염증 치료의 효과는 시간에 따른 치료된 관절에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재량을 모니터함으로써 평가될 수 있다. 예를 들면, 치료후 환자에서 취한 생물학적 시료내에 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재량이 동일 환자에서 치료 전 또는 치료 초기에서 취한 시료에서의 양과 비교하여 감소되었다면, 효과적인 치료임을 나타낸다.
IV
. 통증을 치료하는 방법
통증이 기인된 부위를 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 존재로 확인했다면, 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 통증을 치료하거나 또는 통증을 일으키는 병리를 치료할 수 있다. 예를 들면, 신경뿌리질병 또는 추간판 통증 또는 파셋 통증으로 진단받았다면, 척추 통증을 치료하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 환자를 치료하는데 적용할 수 있다. 적절한 방법은 추궁판절개술(laminotomy), 척추궁절개술, 관절원판 절제술, 마이크로관절원판 절제술, 경피 관절원판 절제술, 내시경 관절원판 절제술, 레이져 관절원판 절제술, 추간공 확대술, 융합, 증식치료, 다른 외과적 감압, 기계사용 또는 사용없이 융합과 감압을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
척추내 통증은 스테로이드성 또는 비-스테로이드성 소염제의 투여를 포함하는표준 비-외과적 방법에 의해 치료될 수 있다. 비-스테로이드성 소염제 (NSAID)는 당업계에 공지되어 있다. 이부프로펜, 아스피린 또는 파라세라몰과 같은 NSAID를 포함하는 비-스테로이드제가 이용될 수 있다. 콜티졸 수용체에 결합하여 염증을 감소시키는 글루코코르티코이드와 같은 스테로이드가 치료에 이용될 수도 있다.
관절-관련 통증 치료를 위하여 당업계에 공지된 임의의 방법을 환자 치료에 적용할 수 있다. 적절한 방법은 관절경적 변연 절제술 또는 스테로이드성 또는 비-스테로이드성 소염제의 투여를 포함하나 이에 한정되지 않는 외과적 또는 비-외과적 방법을 포함한다.
A. 생체표식 길항제
일부 구체예들에서, 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 하나 이상의 길항제가 척추 또는 관절 통증 치료에 이용될 수 있다. 적절한 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 생물학적 활성을 직간접적으로 억제 또는 감소시킬 수 있다. 다른 적절한 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제는 피브로넥틴 및 어그레칸 단량체로부터 피브로넥틴-어그레칸 복합체 형성을 억제 또는 감소시키고, 또는 기존의 피브로넥틴과 어그레칸을 함유하는 복합체를 해리시킨다. 또 다른 적절한 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제는 피브로넥틴 또는 어그레칸의 발현을 억제 또는 감소시킨다.
1. 항체
한 구체예에서, 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 길항제는 항체다. 피브로넥틴 또는 어그레칸에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편들을 이용하여 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 형성을 억제 또는 감소시키고, 기존의 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 해리시키고 및/또는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 활성을 억제 또는 감소시킨다. 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되고, 당업자의 능력 범위에 속하며 하기에서 설명된다. 여기에섯 설명되고 있는 항체는 피브로넥틴 또는 어그레칸 폴리펩티드, 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하고, 피브로넥틴이 어그레칸에 결합하는 것을 감소 또는 억제시킬 수 있으며, 또는 피브로넥틴-어그레칸 복합체가 통증을 일으키는 시그날을 중재하는 생물학적 표적에 결합되는 것을 감소 또는 억제시킬 수 있다. 다른 적절한 항체는 이들 개별적 폴리펩티드보다는 피브로넥틴-어그레칸 복합체에 특이적으로 결합한다. 이들 항체는 복합체내에서의 기능을 벗어난 피브로넥틴 및 어그레칸 기능을 간섭하지 않기 때문에 특히 유용하다.
개시된 항체는 “차단”, “기능-차단”, 또는 “길항” 항체로 정의된다. 항체를 만드는데 이용되는 이뮤노겐은 피브로넥틴 또는 어그레칸의 임의의 면역원 부분이 될 수 있다. 한 구체예에서, 항-어그레칸 항체를 만드는데 이용되는 이뮤노겐은 어그레칸의 G3 도메인이다. 이뮤노겐는 당업계에 공지된 다양한 방법을 생산되는데, 가령, 통상적인 재조합 방법을 이용한 클론된 유전자의 발현, 합성된 펩티드 복합체, 피브로넥틴 또는 어그레칸을 높은 수준으로 발현시키는 세포 집단 기원 세포로부터 분리등이 있다. 또 다른 구체예에서, 이뮤노겐은 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 포함한다. 복합체는 대상체의 생물학적 시료로부터 분리하거나 또는 시험관에서 피브로넥틴 및 어그레칸 모노머로부터 복합체를 만들 수 있다.
항체는 다클론 또는 단클론 항체가 될 수 있다. 항체는 이종(xenogeneic), 동종이계(allogeneic), 동계(syngeneic), 또는 이의 변형된 형태, 가령, 인간화 또는 키메라 항체가 될 수 있다. 항체는 항-이디오타입 항체가 될 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, 항체는 또한 Fab 및 F(ab)2 단편을 포함하는 항체 단편들, 그리고 정상적인 다중체 구조 대신 단일 쇄 항체 또는 scFv으로 생산된 항체를 포함한다. 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4과 같은 IgG; 또는 IgM, IgA, IgE 또는 IgD 이소타입이 될 수 있다. 항체 중쇄의 불변 도메인은 원하는 효과 기능에 따라 선택될 수 있다. 경쇄 불변 도메인은 카파 또는 람다 불변 도메인이 될 수 있다.
당업계에서 피브로넥틴 또는 어그레칸에 결합하는 것으로 공지된 기타 항체 또는 시판되는 항체를 이용할 수 있다. 예를 들면, 피브로넥틴에 결합하는 인간화된 항체는 U.S. 특허 6,329,511 및 7,183,390에서 설명되고 있다.
2. 기타 폴리펩티드
또 다른 구체예에서, 생체표식 길항제는 피브로넥틴 또는 어그레칸, 또는 이의 복합체에 결합하는 항체 이외의 폴리펩티드다. 피브로넥틴- 또는 어그레칸-결합 폴리펩티드를 이용하여 피브로넥틴과 어그레칸을 함유하는 복합체의 형성을 감소 또는 억제시키고 및/또는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 생물학적 활성을 억제 또는 감소시킬 수 있다. 폴리펩티드를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 피브로넥틴 또는 어그레칸 수용체들의 가용성 단편들이다. 예시적인 피브로넥틴 수용체들은 피브로넥틴 수용체들 1 및 2를 포함한다. 다른 적절한 가용성 폴리펩티드는 피브로넥틴 또는 어그레칸에 결합하는 것으로 알려진 바이러스 단백질을 포함한다. 예를 들면, 다양한 종의 피브로넥틴에 결합하는 키메라 바이러스수용체(viroreceptor)가 이용될 수 있다.
3.
소분자
및 기타 길항제
길항 활성에 대해 추가 생활성 물질이 스크리닝될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 한 구체예에서, 후보 생활성 물질은 피브로넥틴과 어그레칸을 함유하는 복합체의 형성을 억제 또는 감소시키거나 또는 기존의 복합체를 해리시키는 능력에 대해 스크리닝된다. 또 다른 구체예에서, 후보 생활성 물질은 피브로넥틴 및 어그레칸의 복합체가 생물학적 표적에 결합하는 것을 감소시키거나 또는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 생물학적 활성을 억제 또는 감소시키는 이들의 능력에 대해 스크리닝된다.
용어 "후보 생활성 물질"은 여기에서 사용된 것과 같이 가령, 단백질, 작은 유기 분자, 작은 무기 분자, 유기-금속 분자, 탄수화물 (폴리사카라이드 포함), 폴리뉴클레오티드, 지질 등의 임의의 분자를 설명한다. 일반적으로 복수의 분석 혼합물은 다양한 농도에 대한 차등적인 반응을 얻기 위하여 다양한 물질 농도로 나란하게 진행된다. 일반적으로, 이들 농도중 하나가 음성 기준, 즉, 농도 0 또는 탐지 수준 이하의 농도로 삼는다. 추가적으로, 양성 기준, 즉, 피브로넥틴 또는 어그레칸에 결합하는 것으로 알려진 시약을 이용할 수 있다. 후보 물질은 유기, 무기, 유기-금속, 합성, 반-합성 및 자연 발생적 작은 분자를 포함한다. 후부 물질은 다수의 화학적 부류를 포함하는데, 전형적으로는 유기 분자, 바람직하게는 분자량이 100 달론이상 그리고 약 2,500 미만, 더 바람직하게는 100 달톤 내지 2000 달톤, 더욱 바람직하게는 150 달톤 내지 1250 달톤, 더 바람직하게는 100 달톤 내지 1000 달톤, 더욱 바람직하게는 약 200 달톤 내지 약 500달톤을 가진 작은 유기 화합물이다. 후보 물질은 단백질과 구조적 상호작용에 필요한 기능기, 특히 수소 결합을 포함하고, 그리고 일반적으로 최소한 아민, 카르보닐, 하이드록실 또는 카르복실을 포함하며, 바람직하게는 최소한 두 개의 화학 기능기를 포함한다. 후보 화합물은 실린더형 탄소 도는 이형 고리 구조를 포함하거나 또는 상기 언급된 하나 이상의 기능기로 치환된 방향족 또는 다환방향족 구조를 포함한다. 후보 물질은 펩티드, 사카라이드, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피롤리딘, 이들의 유도체, 구조적 유사체 또는 이의 복합체들을 포함하는 생분자에서 찾을 수 있다. 특별히 선호되는 물질은 펩티드, 가령, 펩티드모방체다. 펩티드모방체는 가령, WO 98156401에서 설명된 것과 같이 만들 수 있다.
후부 물질은 합성 또는 천연 화합물 라이브러리를 포함하는 다양한 원천으로부터 수득된다. 예를 들면, 무작위화된 올리고뉴클레오티드의 발현을 포함하는 다양한 유기 화합물 및 생분자의 무작위 및 직접적인 합성에 많은 방법이 이용될 수 있다. 대안으로, 세균, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물 라이브러리가 이용가능하거나 바로 만들 수 있다. 추가적으로, 자연 또는 합성에 의해 생산된 라이브러리 및 화합물은 통상적인 화학, 물질, 그리고 생화학적 수단을 통하여 변형될 수 있다. 공지의 약리학적 물질은 아실화, 알키화, 에스테르화, 아미드화과 같은 직접적인 또는 무작위 화학 변경을 당하여 구조적 유사체가 만들어진다. 선호되는 구체예에서, 후보 생활성 물질은 유기 화학적 모이어티 또는 작은 분자 화학 조성물, 당업계에서 이용가능한 다양한 물질이다.
4.
피브로넥틴
또는
어그레칸의
발현을 감소 또는 억제하는 길항제
또 다른 구체예에서, 길항제는 피브로넥틴 또는 어그레칸의 발현을 감소 또는 억제시킨다. 피브로넥틴 또는 어그레칸의 발현을 감소 또는 억제시키는 길항제는 리보자임, 삼합체-형성 올리고뉴클레오티드 (TFOs), 안티센스 DNA, siRNA, 그리고 피브로넥틴 또는 어그레칸을 인코딩하는 핵산에 특이적인 마이크로 RNA을 포함하나 이에 한정되지 않는 억제성 핵산을 포함한다.
유용한 억제성 핵산은 기준과 비교하였을 때, 피브로넥틴 또는 어그레칸을 인코드하는 RNA 발현을 by 최소한 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95 % 감소시키는 것을 포함한다. 피브로넥틴 또는 어그레칸의 발현은 당업계에 공지된 방법, 가령, 노던 블랏팅 및 정량적 폴리메라제 쇄 반응(PCR)을 포함하는 방법에 의해 측정될 수 있다.
억제성 핵산 및 이를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. siRNA 디자인 소프트웨어는 예를 들면, http://i.cs.hku.hk/~sirna/software/sirna.php에서 구할 수 있다. 핵산의 합성은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual ( Sambrook and Russel eds . 3 rd ed .) Cold Spring Harbor , New York (2001)을 참고한다.
용어 "siRNA"은 독성이 없는 짧은 이중 가닥의 RNA가 되는 작은 간섭 RNA 이다. 일반적으로, 독성을 보이지 않는 한, siRNA 길이에 특별한 제한은 없다. "siRNAs"는 예를 들면, 15 내지 49 bp, 바람직하게는 15 내지 35 bp, 그리고 더욱 바람직하게는 21 내지 30 bp 길이가 된다. 대안으로, 발현되는 siRNA의 최종 전사 산물의 이중 가닥 RNA 부분은 예를 들면, 15 내지 49 bp, 바람직하게는 15 내지 35 bp, 그리고 더욱 바람직하게는 21 내지 30 bp 길이가 된다. 두 개 RNA가 쌍을 이루는 siRNA의 이중 가닥 RNA 부분은 완전하게 쌍을 이룬 것에 제한되지 않으며, 그리고 미스매취(대응하는 뉴클레오티드가 상보적이지 않거나) 또는 중배(한 가닥에 대응하는 상보적인 뉴클레오티드가 부족함)로 인하여 짝을 이루지 못한 부분을 포함할 수 있다. siRNA 형성을 간섭하지 않을 수준으로 짝을 이루지 못한 부분이 포함될 수 있다. 여기에서 사용된 중배("bulge")는 바람직하게는 1 내지 2개 짝을 이루지 못한 뉴클레오티드를 포함하며, 두 개 RNA 가닥이 짝을 이루는 siRNA의 이중 가닥 RNA 부분은 바람직하게는 1 내지 7개의 중배, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개 중배를 포함한다. 또한, 여기에서 사용된 미스매취("mismatch")는 두 개 RNA 가 짝을 이루는 siRNA의 이중 가닥 RNA 부분은 바람직하게는 1 내지 7개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개가 포함된다. 바람직한 미스매취에서, 뉴클레오티드중 하나는 구아닌이며, 다른 하나는 우라실이다. 이와 같은 미스매취는 센스 RNA를 코딩하는 DNA에서 C가 T로, G가 A로 또는 이의 혼용된 돌연변이 때문이나 이에 제한되지 않는다. 더욱이, 두 개 RNA 가 짝을 이루는 siRNA의 이중 가닥 RNA 부분은 중배와 미스매취를 최대 1 내지 7개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개 포함한다.
siRNA의 말단 구조는 siRNA가 RNAi 효과로 인하여 표적 유전자 발현을 침묵, 감소 또는 억제시킨다면 둔단 또는 코헤시브(오버행)가 될 수도 있다. 코헤시브(오버행) 말단 구조는 3' 오버행에 한정되지 않으며, RNAi 효과를 유도할 수 있다면, 5' 오버행 구조가 포함될 수도 있다. 더욱이, 오버행 뉴클레오티드의 수는 이미 보고된 2 또는 3개에 국한되지 않으며, 오버행이 RNAi 효과를 유도할 수 있다면 임의의 수가 될 수 있다. 예를 들면, 오버행은 1 내지 8개 뉴클레오티드, 바람직하게는 2 내지 4개 뉴클레오티드로 구성된다. 여기에서 코헤시브 말단 구조를 가지는 siRNA의 총 길이는 쌍을 이룬 이중 가닥의 부분과 양단에 오버행 단일 가닥을 포함하는 쌍의 길이의 합으로 나타낸다. 예를 들면, 양단에 4개 뉴클레오티드 오버행이 있는 19 bp의 이중 가닥 RNA 부분의 경우에, 총 길이는 23bp로 나타낸다. 더욱이, 오버행 서열은 표적 유전자에 특이성이 낮기 때문에 표적 유전자의 서열에 반드시 상보적(안티센스) 또는 동일(센스)하지 않는다. 더욱이, siRNA가 표적 유전자에 대해 유전자 침묵 효과를 유지할 수 있는 한, siRNA는 한 쪽 단부의 오버행 부분에 저분자량 RNA(tRNA, rRNA, 바이러스 RNA 또는 인위적 RNA 분자가 될 수 있음)를 포함할 수도 있다.
또한 siRNA의 말단 구조는 상기에서 설명된 것과 같이 반드시 컷 오프 구조일 필요는 없으며, 줄기-루프 구조를 가질 수 있으며, 이 경우 이중 가닥 RNA의 한 쪽 양단은 링커 RNA에 의해 연결된다. 이중-가닥 RNA 부분(줄기-루프 부분)의 길이는 예를 들면, 15 내지 49 bp, 바람직하게는 15 내지 35 bp, 그리고 더욱 바람직하게는 21 내지 30 bp 길이가 된다. 대안으로, siRNA의 발현되는 최종 전사 산물이 되는 이중 가닥 RNA 부분의 길이는 예를 들면, 15 내지 49 bp, 바람직하게는 15 내지 35 bp, 그리고 더욱 바람직하게는 21 내지 30 bp 길이가 된다. 더욱이, 이 길이가 줄기 부분의 결합을 방해하지 않는 한 링커의 길이에 제약은 없다. 예를 들면, 줄기 부분의 안정적 쌍 형성과 이 부분을 코딩하는 DNA 사이에 재조합 억제를 위하여 링커 부분이 클로버-잎 tRNA 구조를 가질 수 있다. 링커가 줄기 부분의 쌍 형성을 방해하는 길이를 가지더라도, 인트론을 포함하는 링커 부분을 만드는 것도 가능하며, 이때 전구체 RNA가 성숙 RNA로 프로세싱 하는 동안 인트론은 잘려나가게 되어 줄기 부분의 쌍 형성이 가능하다. 줄기-루프 siRNA의 경우, 루프 구조가 없는 RNA의 한 쪽 단부(머리 또는 꼬리)는 저분자량 RNA를 가질 수 있다. 상기에서 설명한 것과 같이, 이와 같은 저분자량 RNA는 tRNA, rRNA, 바이러스 RNA 또는 인위적 RNA 분자가 될 수 있다.
miRNA는 Dicer 유사 효소에 의해 짧은 줄기-루프 전구물질의 절단에 의해 만들어지는데; 반면 siRNA는 긴 이중 가닥 RNA 분자의 절단에 의해 만들어진다. miRNA는 단일 가닥이지만, siRNA는 이중 가닥이다. siRNA를 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 피브로넥틴 또는 어그레칸의 서열이 공지되어 있기 때문에, 당업자는 공개된 정보를 이용하여 피브로넥틴 또는 어그레칸 발현을 하향 조절하는 siRNA를 바로 생산할 수 있을 것이다.
5.
피브로넥틴
및/또는
어그레칸
분해를 담당하는
어그레카나제
및 매트릭스 메탈로프로테아제(
MMP's
)의 억제제
한 구체예에서, 공지의 어그레카나제 또는 MMP의 킬레이트와 같은 공지의 억제제를 어그레칸 단편들의 방출을 억제 또는 지연시키는 효과량으로 대상체에 투여하여 피브로넥틴 어그레칸 복합체의 형성을 감소 또는 제거하여 환자를 통증으로부터 해방시킬 수 있다.
B. 제약학적 조성물
피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제를 포함하는 제약학적 조성물이 제공된다. 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물은 장관외(근육내, 복막내, 정맥(IV) 또는 피하 주사), 또는 경점막(비강, 질, 직장 또는 설하) 투여 경로에 이용될 수 있다. 조성물은 생부식가능한 삽입체를 이용하여 투여되고, 그리고 척추간 추간판, 경막 밖의 공간 및 파셋 관절과 같은 척추 구조로 직접적으로 전달되거나 또는 가동관절에 직접적으로 전달될 수 있다. 조성물은 각 투여 경로에 적합한 약형으로 조제될 수 있다. 펩티드 또는 폴리펩티드가 아닌 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제를 포함하는 조성물은 추가적으로 장내 투여를 위해 조제될 수 있다.
여기에서 설명된 길항제는 치료 유효량으로 대상체에게 투여된다. 여기에서 사용된 것과 같이 용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 치료를 요하는 대상체의 척추 통증을 치료, 억제, 경감시키는데 충분한 투여량을 의미한다. 정확한 투여량은 대상체-의존적 변수(가령, 나이 등), 치료될 손상 또는 병리 및 효과를 가져올 치료와 같은 다양한 인자들에 따라 달라질 것이다.
여기에서 설명된 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제의 경우, 추가 연구가 실시되어, 다양한 환자들의 다양한 상태를 치료하는데 적절한 투여량 수준에 대한 정보를 얻을 수 있을 것이며, 당업자는 치료 수용자의 치료 내용, 나이, 그리고 전반적인 건강상태를 고려하여 적절한 투여량을 확인할 수 있을 것이다. 선택된 투여량은 투여 경로, 원하는 치료 지속 기간에 따라 달라진다. 일반적으로 포유동물에 일일 체중 kg당 0.001 내지 10 mg이 투여된다. 일반적으로, 정맥 주사 또는 주입의 경우, 투여량은 더 낮다.
한 구체예에서, 펩티드 및 폴리펩티드를 함유하는 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제는 장관외, 추간판내, 수막내, 경막외 또는 관절 주사에 의해 수성 용액으로 투여된다. 선호되는 구체예에서, 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제는 대상체의 통증 원천이 되는 척추 부위에 직접 주사된다. 예를 들면, 피브로넥틴-어그레칸 복합체이 경막 밖의 공간에서 탐지된다면, 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제는 경막 밖의 공간으로 직접 주사하여 투여될 수 있다. 대안으로, 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제는 추간판 공간, 파셋 관절, 또는 가동관절에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체이 탐지되었다면, 이들 공간으로 직접 주사하여 투여될 수 있다.
제제는 현탁액 또는 유제 형태가 될 수 있다. 일반적으로, 펩티드 또는 폴리펩티드의 유효량과, 선택적으로 약제학적으로 수용가능한 희석액, 보존제, 용해제, 유제, 어쥬번트 및/또는 캐리어를 포함하는 제약학적 조성물이 제공된다. 이와 같은 조성물은 희석 멸균 수, 다양한 완충 성분 및 pH 및 이온 강도(가령, Tris-HCl, 아세트산염, 인산염)의 완충된 염; 그리고 선택적으로 계면활성제 및 가용화제(가령, TWEEN®20, TWEEN®80, Polysorbate 80), 항산화제(가령, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨염), 그리고 보존제(가령, 티메르졸, 벤질 알코올) 그리고 벌크 물질 (가령, 락토즈, 만니톨)과 같은 보조제를 포함할 수 있다. 비-수성 용매 또는 비이클의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일 및 옥수수 오일과 같은 식물성 오일, 젤라틴, 그리고 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르다. 제제는 동결전조되고, 사용 직전 재용해/재현탁될 수 있다. 제제는 세균을 유지시키는 필터를 통한 여과나, 조성물에 멸균제를 통합시키거나, 조성물을 조사하거나 또는 조성물을 가열시킴으로써 멸균될 수 있다.
펩티드 및 폴리펩티드를 포함하는, 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제는 방출 제어형 제제로 투여될 수 있다. 방출 제어형 폴리머 장치는 폴리머 도구(막대, 실린더, 필름, 디스크)의 이식 또는 주사(미소입자)후 전신적으로 장기간 방출되도록 만들어진다. 매트릭스는 미소구와 같은 미소입자의 형태가 될 수 있으며, 펩티드는 고형 폴리머 매트릭스 또는 마이크로캡슐에 분산되며, 코어는 폴리머 껍질과는 상이한 물질이며, 펩티드는 코어에 분산 또는 현탁되며, 코어는 액체 또는 고체가 될 수 있다. 특별한 다른 언급이 없는 한, 미소구, 미소입자 및 마이크로캡슐은 호환된다. 대안으로, 폴리머는 나노미터 내지 4cm 범위의 얇은 슬랩 또는 필름으로 제조될 수 있고, 분말은 연마 또는 다른 표준 기술에 의해 만들어지며, 하이드로겔과 같은 겔이 될 수도 있다.
피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제를 전달하기 위하여 생분해되지 않는 또는 생분해가능한 매트릭스가 이용될 수 있지만, 생분해가능한 매트릭스가 선호된다. 이들은 자연 또는 합성 폴리머일 수 있지만, 분해 및 방출 프로파일의 특징에서 합성 폴리머가 우위에 있기 때문에 합성 폴리머가 선호된다. 폴리머는 방출되기를 원하는 기간에 근거하여 선택된다. 일부 경우, 선형 방출이 가장 유용하지만, 다른 경우에서는 순간 방출 또는 “대량 방출”이 더 효과적인 결과를 제공할 수도 있다. 폴리머는 하이드로겔(일반적으로 물 중량의 약 90%까지 흡수) 형태이며, 선택적으로 다가 이온 또는 폴리머에 가교연결되어 있다. 매트릭스는 용매 증발, 분무 건조, 용매 추출 및 당업계에 공지된 기타 방법에 의해 만들어질 수 있다.
생분해가능한 미소구는 약물 전달용 미소구를 만들기 위하여 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있는데, 예를 들면, Mathiowitz and Langer , J Controlled Release, 5:13-22 (1987); Mathiowitz , et al ., Reactive Polymers , 6:275-283 (1987); and Mathiowitz , et al ., J Λ ppl . Polymer ScL , 35:755-774 (1988) 참고.
도구는 이식 또는 주사 부위를 치료하기 위하여 국소 방출되도록 제조되며-전신 또는 전신 전달 치료용 투여량보다 더 적은 양으로 전달된다. 이 도구는 피하에 이식 또는 주사되거나, 근육, 지방으로 이식 또는 주사되거나 또는 삼킬 수 있다.
V.
키트
면역 분석과 같은 특이적 결합 분석을 이용한 탐지 방법은 특히 환자 관리 차원에서 실시하는데 적합하다. 이와 같은 방법은 환자의 즉각적인 진단 및/또는 예후 평가가 가능하다.
상기에서 설명된 진단, 연구 및 치료에 사용되는 키트가 제공된다. 진단 및 연구에서, 이와 같은 키트는 다음중 일부 또는 전부를 포함한다; 분석 시약, 완충액, 그리고 설명된 생체표식에 대한 선택적 결합 파트너, 그리고 이들 모두는 운반에 적합한 용기에 담을 수 있다. 선택적 결합 파트너는 피브로넥틴- 어그레칸 복합체에 선택적으로 결합하는 항체 또는 복합물로 이용시, 이들 개별 성분에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 키트는 연속 고형 표면에 있는 선택적 결합 파트너를 포함한다. 예시적인 키트는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 탐지 결합 파트너와 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 탐지하기 위한 양성 기준을 담고 있는 용기를 포함한다. 양성 기준은 피브로넥틴-어그레칸 복합체 또는 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 만드는 성분이 될 수 있다. 피브로넥틴 및 어그레칸 서열은 인간 서열 또는 임의의 다른 종의 것일 수 있고, 이때 어그레칸 및 피브로넥틴은 인간 서열에 상동성이다. 피브로넥틴 및 어그레칸 둘다 동일한 종 또는 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 피브로넥틴 및/또는 어그레칸 단편은 자연 출처로부터 정제되거나 또는 고형 상 방법에 의해 합성되거나, 또는 재조합 방법에 의해 만들 수 있다. 키트는 연속 고형 표면과 같은 기질에 결합된 포획 결합 파트너를 또한 포함할 수 있다. 포획 결합 파트너는 일반적으로 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 어그레칸에 결합하고, 탐지 결합 파트너는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 피브로넥틴에 결합하지만, 포획 결합 파트너가 피브로넥틴에 결합하고, 탐지 결합 파트너가 어그레칸에 결합할 수 있다는 것도 인지할 것이다.
일부 구체예들에서, 생물학적 시료를 추출하는데 이용되는 도구가 키트에 포함될 수 있다. 일부 구체예들에서, 추출 도구, 가령, 주사기, 바늘 그리고 카테테르는 잠재적으로 질병이 있는 추간판 또는 경막 밖의 공간 또는 관절로부터 생물학적 시료를 직접 추출하여 생체표식에 대한 선택적 결합 파트너가 담겨있는 쳄버로 넣을 수 있다. 일부 경우, 키트는 생체표식의 존재 및/또는 그 수준을 즉시 평가할 수 있다. 이와 같은 유형의 키트는 관리 시점에서 사용하는데 특히 적합하다. 관리 진단 시스템의 예는 U.S. Pat. No. 6,267,722에서 설명되고 있다. 본 발명의 키트를 사용하는데 적합한 디자인을 가진 다른 도구들은 U.S. Pat Nos. 7,198,522 및 6,818,455에서 설명하고 있다.
일부 구체예들에서, 키트는 척추 또는 관절로부터 생물학적 시료의 추출에 사용될 수 있는 용액을 포함할 수 있다. 키트에 포함될 수 있는 이 용액은 예를 들면, 생리적 용액, 가령 염이 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 키트는 시료 추출에 이용된 동일한 도구 또는 상이한 도구를 통하여 투여되는 하나 이상의 치료제를 포함할 수 있다.
추가로, 키트는 키트에서 제공되는 물질들의 사용 지침(가령, 프로토콜)을 포함하는 지시 용구를 포함할 수 있다. 지시 용구는 일반적으로 서면 또는 인쇄된 용구가 될 수 있지만, 지시사항을 저장하고 사용자에게 전달될 수 있는 임의의 매체에 제공될 수 있다. 적절한 매체는 전자 저장 매체(가령, 자성 디스크, 테이프, 카트릿지, 칩) 그리고 광학 매체(가령, CD ROM)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 매체는 지시사항을 제공하는 인터넷 사이트에 접속하는 것을 포함한다.
실시예
실시예
1. 인간 시료의
피브로넥틴
-
어그레칸
복합체를 정제하기 위한 크로마토그래피 실시
추간판 세척 시료 또는 활액 유체로부터 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 정제하기 위하여, 크기 압출 크로마토그래피(SEC)에 이어서, 음이온-교환 크로마토그래피를 실시하였다. SEC 및 음이온-교환 크로마토그래피는 Bio-Rad BioLogic DuoFlow®컴퓨터 제어된 HPLC 시스템과 이에 장착된 BioLogic QuadTec®UV/VIS 탐지기 및 전도성 모니터를 이용하였다. SEC는 일련의 두 개의 Bio-Rad®SEC-400-5 컬럼을 이용하여, 5OmM Tris/HCl, 10OmM NaCl, pH 8.0으로 등용매 용리에 의해 실시되었다. 전체 단백질 함량에 대해(A280nm 및 A215nm) 그리고 피브로넥틴-어그레칸 단편의 복합체로 구성된 발견된 생체표식의 존재에 대해 생성된 분취물을 분석하였다. 도 1은 증후를 나타내는 시료의 SEC-HPLC 용리 프로파일(A215nm)을 나타내고, 도 2는 동일한 조건에서 무증후성 시료의 SEC-HPLC 용리 프로파일을 나타낸다. 후속적인 실험에서, 분취물 14 및 15가 개발된 분석에 의해 탐지된 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 탐지가능한 수준을 함유하고 있는 유일한 분취물임이 밝혀졌다. 이 컬럼에 대한 분자량 표준에 근거하여, 분취물 14 및 15로부터 용리되는 단백질은 250 Kda 내지 700 Kda 범위의 분자량을 가질 것이라고 예상된다. 피브로넥틴 어그레칸 복합체는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가 정제될 수 있다. 복합체는 5OmM Tris/HCl, 15OmM NaCl, pH 8.0로 평형을 이룬 컬럼에 결합되었으며, Tris/HCl 완충액안에 15OmM NaCl 내지 23OmM NaCl의 범위의 선형 염 구배 컬럼으로부터 용리되었다.
피브로넥틴 어그레칸 복합체는 또한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 복합체는 5OmM 아세트산 나트륨염, 10OmM NaCl, pH 6.0로 평형을 이룬 컬럼에 결합되었으며, 아세트산염 완충액안에 10OmM NaCl 내지 30OmM NaCl의 범위의 선형 염 구배 컬럼으로부터 용리되었다.
실시예
2. 항-
피브로넥틴
, 그리고 항-
어그레칸
(
G3
도메인) 특이적 항체를 이용한
실버
착색 및
웨스턴
블랏
분석
실시예 1은 SEC-HPLC에 의한 인간 시료의 분취를 설명한다. SEC 분석에서 분취물 14 및 15는 SDS-PAGE 분리후 실버 착색 또는 웨스턴 블랏팅을 거쳐, 분취물의 단백질 크기를 결정하고, 이들의 실체를 규명하였다. 웨스턴 블랏팅은 항-피브로넥틴 단클론 (DiaPharma Group , Inc. DPGR028A 피브로넥틴 ELISA 키트의 탐지 항체), 및 항-어그레칸 단클론 (G3 도메인) (Santa Cruz Biotechnology, 어그레칸 C20, sc-16493) 특이적 항체를 이용한 표준 방법에 따라 실시되었다.
실버 착색 분석에 따르면, 이들 두 분취물내에 250Kd 이상의 단백질이 존재하였다. 항-피브로넥틴 단클론 및 항-어그레칸 단클론 (G3 도메인)항체를 이용한 웨스턴 블랏팅에서, 400 - 600 Kd의 분자량 범위에서 면역 반응성 밴드가 나타났고, 이것은 단백질이 폴리아크릴아미드 겔을 통하여 함께 이동하였다는 것을 나타낸다. 데이터는 항-피브로넥틴과 항-어그레칸 (G3) 항체 모두에 면역반응성이 있는 단백질 복합체가 존재한다는 것을 나타낸다.
실시예
3.
폴리아크릴아미드겔을
통하여
피브로넥틴과
함께 이동하는
어그레칸
도메인의 분석
실시예 1에서 설명된 것과 같이 단일 인간 시료의 크기 압출 크로마토그래피가 실시되었고, SEC로부터 분취물 8 내지 20이 용리되어, 이들을 SDS-PAGE에 의해 분리하였고, 그 다음 다클론 항-어그레칸 G1 (Santa Cruz Biotechnology, 어그레칸 D20, sc-16492), G2 (Santa Cruz Biotechnology, 어그레칸 El 2, sc-67513) 또는 G3 (Santa Cruz Biotechnology, 어그레칸 C20, sc-16493) 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 하기 위하여 막으로 옮겼다.
항-어그레칸 G3 도메인 항체를 이용한 웨스턴 블랏에서 분취물 8-20에서 상이한 분자 크기의 면역활성 밴드가 나타났는데, 이는 G3 도메인을 함유하는 어그레칸의 다양한 단백질분해성 단편들에 상응한다. 항-어그레칸 G1 도메인 항체를 이용한 웨스턴 블랏에서 분취물 8-20에서 항-어그레칸 G3 도메인 항체를 이용하였을 때 관찰된 것과는 상이한 밴드 패턴을 나타내는, 면역반응성 밴드가 나타났다. 항-어그레칸 G2 도메인 항체를 이용한 웨스턴 블랏에서는 분취물 8-20에서 항-어그레칸 G1 또는 G3 도메인 항체을 이용하였을 때 관찰된 것과 상이한 밴드 패턴을 나타내는 면역반응성 밴드가 나타났다. 항-어그레칸 G1, G2 및 G3 항체를 이용하여 수득된 밴드 패턴 분석에서, 어그레칸의 G1, G2 및 G3 도메인은 피브로넥틴 또는 이의 단편들과 상이한 복합체로 존재한다는 것을 암시한다.
실시예
4.
피브로넥틴
-
어그레칸
단백질 복합체의 이질성
ELISA
분석
이전 실시예들은 인간 시료안에 피브로넥틴-어그레칸(G3) 복합체가 존재한다고 제안한다. 이와 같은 복합체의 존재에 대해 추가 테스트하기 위하여, 이질성 ELISA 샌드위치 분석을 개발하였고, 이용하였다.
재료 및 방법:
단일 인간 시료의 크기 압출 크로마토그래피는 실시예 1에서 설명된 것과 같이 실시되었고, 추가 분석에는 분취물 14 및 15가 이용되었다.
항-피브로넥틴 단클론 항체 (DiaPharma Group, Inc. DPGR028A 피브로넥틴 ELISA 키트의 탐지 항체)를 포획 항체로 기능을 하도록 폴리스티렌 판에 고정시켰다. 인간 시료의 SEC의 분취물 14 및 15를 피브로넥틴 포획 항체가 포함된 판에 한 방울 떨어뜨렸다. 항온처리후, 시료를 제거하고, 판을 세척하고, 판은 탐지항체로서 항-어그레칸 G3 도메인 다클론 항체 (Santa Cruz Biotechnology, 어그레칸 C20, sc-16493)와 항온처리하였다. 판을 세척하고, HRP로 라벨된 2차 항체를 이용하여 피브로넥틴과 어그레칸의 G3 복합체의 존재를 탐지하고, 이어서 광학 탐지하였다. 항-어그레칸 G3 도메인 항체를 포획 항체로 이용하고, 항-피브로넥틴 항체를 탐지 항체로 이용한 추가 실험을 또한 실시하였다.
분취물 14는 최대 광학 밀도를 가지며, 분취물 15도 역시 양성이지만, 광학 밀도가 더 낮았다. 이와 같은 결과들은 어떤 항체가 포획 항체로 이용되고, 어떤 항체가 탐지 항체로 이용되었느냐에는 관계없이, 상호작용하는 단백질 복합체와 일치하는 분자량의 SEC 분취물안에 피브로넥틴 및 어그레칸 (G3 도메인)과 상호작용하는 이질성 복합체가 존재한다는 것을 말해준다.
실시예
5. 열과 환원제를 이용한
피브로넥틴
및
어그레칸(G3)의
복합체의 해리
피브로넥틴 및 어그레칸의 G3 도메인을 함유하는 복합체의 존재에 대한 추가 테스트로써, 웨스턴 블랏 상의 이동 밴드에 열과 환원제의 영향을 테스트하였다.
재료 및 방법:
단일 인간 시료의 크기 압출 크로마토그래피는 실시예 1에서 설명된 것과 같이 실시되었고, 추가 분석에는 분취물 14 및 15가 이용되었다. 분취물 14 및 15의 단백질을 4-20% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 분리하였다. 시료를 처리하지 않거나, 3분간 끓는 수조내에서 가열하여 처리하거나, 또는 환원제 DTT 존재하에 3분간 끓는 수조내에서 가열하여 처리한다. 상기 실시예에서 설명된 것과 같이, 항-어그레칸 G3 도메인 단클론 또는 항-피브로넥틴 단클론 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅하기 위하여 단백질을 막으로 이동시켰다.
결과:
시료를 열 또는 환원제로 처리하지 않을 때, 웨스턴 블랏에서는 항-피브로넥틴 단클론 항체 및 항-어그레칸 (G3) 단클론 항체와 면역반응성이 있는 밴드가 한 개 나타났다.
시료를 3분간 끓는 수조내에서 가열하여 처리하였을 대, 후속 웨스턴 블랏에서 단일 항- 피브로넥틴 및 항-어그레칸 (G3) 면역양성 밴드는 더 낮은 분자량의 여러 밴드로 쪼개졌다. 이것은 피브로넥틴-어그레칸 (G3 도메인) 복합체의 이량체 형이 피브로넥틴 단량체 및 어그레칸 (G3 도메인) 복합체로 부분적 해리되었다는 것과 일치한다.
시료를 DTT 존재하에 3분간 끓는 수조내에서 가열하여 처리하였을 대, 후속 웨스턴 블랏에서 단일 항- 피브로넥틴 및 항-어그레칸 (G3) 면역양성 밴드는 더 낮은 분자량의 여러 밴드로 쪼개졌다. 이것은 피브로넥틴-어그레칸 (G3 도메인) 복합체가 별도의 피브로넥틴 및 어그레칸 (G3 도메인) 소단위로 해리된 것과 일치된다. 또한, 피브로넥틴은 이황화결합에 의해 연결된 몇 개의 펩티드로 절단되었다.
이 실시예는 피브로넥틴 및 어그레칸 (G3 도메인)에 양성인 밴드의 겔 이동 특징이 열과 환원에 의해 영향을 받을 수 있으며, 단백질-단백질 해리와 일치된다는 것을 설명한다.
실시예
6. 인간
척추간
추간판에서 통증에 대한 생체 표식으로서
피브로넥틴
-
어그레칸
(
G3
) 복합체의 검사
임상적 그리고 방사선 사진 특징에 의해 요추부 속질핵 탈출증(HNP)로 진단을 받은 45세 여성을 추간판조영술로 더 조사하였다. 추간판 퇴행은 Phirrmann 스케일을 이용한 방사능사진 평가에 의해 판단되었다. 환자에서 통증에 대한 시각척도(VAS) 또한 실시하였으며, 이 환자의 VAS 값은 5였다. VAS는 1 내지 10 등급으로, 1은 통증이 없으며, 10은 가장 강한 통증을 나타낸다. 추간판조영술 전에, 인간 척추간 추간판 공간으로부터 추간판 공간 세척 방법(방법 6)을 이용하여 시료를 얻었다. 추간판조영술 과정 동안, 각 요추부 추간판 수준에서 수술중 VAS 값을 얻었다. 표 1에 나타낸 것과 같이, 생체표식 복합체 ELISA은 퇴행에 대해 가장 강력한 방사능 측정된 강력한 수술중 통증 측정을 나타낸 요추부 추간판 수준에서 양성이었다.
이 실시예는 인간 대상체의 추간판내 공간에 피브로넥틴-어그레칸 단백질 복합체가 존재한다는 것은 임상적 통증과 관련되며, 추간판조영술 및 MRI와 일치된다는 것을 설명한다. 이들 데이터는 도 4에서 그래프로 나타내었다.
실시예
7:
ELISA
키트에
대한 양성 기준
ELISA 키트에 대한 양성 기준을 확립하려는 시도에서, 소의 어그레칸이 조사되었다. 인간 어그레칸에 대한 소의 어그레칸의 높은 서열 상동성으로 인하여, 확립된 방법에 따라 연골로부터 소의 어그레칸을 정제하였다. 정제된 어그레칸을 시험관에서 어그레칸의 분해를 담당하는 매트릭스 메탈로프로테아제, MMP-9로 처리하였다. G3 및 이의 단편들은 Sepharose®수지상에 고정된 항-어그레칸 G3 도메인과 친화력 크로마토그래피를 통하여 정제되었다. 용리된 어그레칸 G3 도메인은 인간 피브로넥틴과 복합되어, 복합체를 형성하였다. 개발된 ELISA는 시험관에서 인간 피브로넥틴과 소의 어그레칸 G3 사이에 어셈블리된 복합체를 탐지하였다(도 3). 높은 상동성을 가진 소와 인간의 피브로넥틴에 동일한 원리를 적용할 수 있을 것이다.
피브로넥틴 또는 어그레칸-G3 도메인 단독은 ELISA 분석에서 양성 신호를 만들지 않았다; 따라서, 이들은 음성 기준으로 이용될 수 있다. 도 5는 포획용으로 항-어그레칸-G3 항체를 이용하고, 탐지용으로 항-피브로넥틴 항체를 이용한 일차원 ELISA의 선형성을 나타낸다. 통증이 있는 환자의 양성 시료를 이 실험에 이용하였다. 복합체 ELISA에 의해 450nm에서 첫 O.D.를 측정하였다. 이 시료의 연속 희석물을 선형성 연구에 이용하였다. 예상된 O.D.는 초기 측정된 값과 희석 인자로부터 계산된다. 이상적인 조건하에, 이와 같은 선형 플롯은 기울기가 1, y 절편은 0, R2=1이어야 한다. 수득된 값은 기울기가 ~ 1.09이며, y 절편=-0.09이며, R2=O.99이었다. 포획용 항체가 항- 피브로넥틴이며, 그리고 탐지용 항체가 항-어그레칸이 될 수 있음을 인지할 것이다.
실시예
8. 관절경
변연
절제술을 받는 통증 무릎에서 취한
활액
유체 시료를 무증후성 기준 무릎과 비교
활액 관절의 존재하는 통증에 대한 생체표식으로 피브로넥틴-어그레칸(G3) 복합체의 유용성을 비교하기 위하여, 관절경검사를 받는 환자의 통증이 있는 무릎의 활액 유체를 무증후성 지원자의 무릎의 활액 유체와 비교하였다
재료 및 방법:
시설의 검토 위원회 승인을 얻은 후, 환자군-대조군 안의 연구를 위하여 환자들을 모집하였다. 모든 대상체들에게 참여에 대한 고지에 입각한 동의서가 제공되었다. 무릎 관절경을 받는 통증이 있는 무릎을 가진 대상체들은 개인 병원의 한명의 외과의로부터 모집하였다. 포함된 기준은 연령대가 30-69세, 활동 관련 무릎 통증, 보존적 치료(주사 및 요법)에 실패, 잠김(locking), 걸림. (catching) 또는 꺾임(giving way) 등의 기계적 증상 및 반월 찢김에 대한 MRI 양성이 포함된다. 배제 기준은 고에너지 손상 또는 골절, 염증성 관절염, 인대 손상 또는 수술 일로부터 3개월이내 경구/관절내 스테로이드 주사가 포함된다.
무릎 통증 없이 나이가 일치되는 무증후성 지원자로부터 또 다른 대상체가 모집되었다. 포함 기준은 연령대가 30-69세, 무릎 통증이 없거나 또는 간헐적 무릎 통증 병력을 포함한다. 배제 기준은 염증성 관절염, 수술 일로부터 3개월이내 경구/관절내 스테로이드 주사, 유출의 존재, 무릎 외과술 병력, 무릎 정렬의 신체 검사 또는 정상 범위밖의 안정성이 포함된다.
각 대상체에서, 관절내 시료는 다음과 같이 수거되었다. 흡입 부위는 클로로헥시딘 글루코네이트의 3중 준비로 사전 준비해두었고, 흡인은 멸균된 10cc 주사기와 21 가우지 ×1.5 인치 바늘을 이용하여 전방 또는 직접적인 측면 방법으로 실행되었다. 무릎을 10 cc의 0.9% 표준 염으로 세척하였고, 흡인물을 주사기로 빼내었다. 흡인물을 프로테아제 억제제 칵테일이 담겨있는 에펜도르프 튜브에 넣고, 운반될 때까지 얼음에 두었다.
피브로넥틴-어그레칸 (G3) 복합체의 존재에 대한 이질성 ELISA 분석 (실시예 4에서 실시된 것과 같은)은 1:5 비율로 희석한 후 각 시료에서 실시되었다.
결과:
프로토콜에 따라 12명의 증후를 나타내는 무릎과, 10명의 무증후성 무릎을 분석하였다. 증후를 나타내는 군의 평균(± 표준 편차) 광학 밀도(OD)는 1.82 (± 0.50)이며, 무증후성 기준군은 -0.12 (± 0.07)이었다. 이 차이는 t-test (p < 0.001)에 의해 통계학적으로 유의성이 있다. 도 6은 증후를 나타내는 환자와 무증후성 기준에 대한 결과를 설명한다.
본 실시예는 피브로넥틴-어그레칸 (G3)의 복합체가 무릎 관절의 활액 유체로부터 분석될 수 있으며, 그리고 병력, 신체 검사 및 MRI 스캐닝에 의해 진단된 관절내 교란이 있음을 예측하는 생체 표식으로 삼을 수 있다는 것을 설명한다.
실시예
9. 단일 인간
대상체에서
통증이 있는 무릎의
활액
유체 시료와
반대측
무증후성
무릎의 유체와의 비교
활액 관절에 존재하는 통증에 대한 생체표식으로 피브로넥틴-어그레칸(G3) 복합체의 유용성을 비교하기 위하여, 단일 인간 대상체에서 통증이 있는 무릎의 활액 유체 시료와 반대측 무증후성 무릎의 유체와 비교하였다
재료 및 방법:
시설의 검토 위원회 승인을 얻은 후, 일치된 환자군-대조군 안의 연구를 위하여 한 명의 환자를 모집하였다. 대상체는 47세의 남성이며, 한 쪽 무릎에 활동 관련 통증이 있다. 보존적 치료(주사 및 요법)에 실패하였고, MRI에서 반월 찢김에 대해 양성이었다. 무릎 골절 또는 염증성 관절염, 인대 손상이 없으며 또는 통증이 있는 무릎에 3개월이내 경구/관절내 스테로이드 주사를 하지 않았다. 반대측 무증후성 무릎은 유의적인 통증이 없었고, 또는 간헐적 통증 또는 외과술 병력이 없다. 검사에서 무증후성 무릎은 정상이었고, 이전 외과술 병력도 없었다.
실시예 6에서 설명된 것과 같이 두 가지 관절내 시료를 수거하였다; 하나는 통증이 있는 무릎에서, 다른 하나는 무증후성 무릎에서 수거하였다. 흡인물을 주사기로 빼내었다. 흡인물을 프로테아제 억제제 칵테일이 담겨있는 에펜도르프 튜브에 넣고, 운반될 때까지 얼음에 두었다. 피브로넥틴-어그레칸 (G3) 복합체의 존재에 대한 이질성 ELISA 분석 (실시예 4에서 실시된 것과 같은)은 1:10 비율로 희석한 후 각 시료에서 실시되었다.
결과:
통증이 있는 무릎의 광학 밀도는 450nm 파장에서 22.68이었다. 통증이 없는 무릎의 광학 밀도는 450nm에서 빈 값을 뺀 후 소수 두자리 까지 0.00이었다. 도 6은 막대 그래프 형태로 결과를 설명한다.
본 실시예는 피브로넥틴-어그레칸 (G3)의 복합체가 무릎 관절의 활액 유체로부터 분석될 수 있으며, 그리고 한명의 대상체의 반대 무릎을 검사하여 다변성에 대해 실험적으로 조절하였을 때에도 병력, 신체 검사 및 MRI 스캐닝에 의해 진단된 관절내 교란이 있음을 예측하는 생체 표식으로 삼을 수 있다는 것을 설명한다.
실시예
10. 전체 복사뼈 인공관절 치환술을 받는
대상체의
통증이 있는 복사뼈의
활액
유체와,
무증후성
기준 복사뼈의 유체와의 비교
활액 관절에 존재하는 통증에 대한 생체표식으로 피브로넥틴-어그레칸(G3) 복합체의 유용성을 비교하기 위하여, 전체 복사뼈 인공관절 치환술을 받는 환자의 통증이 있는 복사뼈의 활액 유체와, 무증후성 지원자의 기준 복사뼈의 유체와 비교하였다
재료 및 방법:
시설의 검토 위원회 승인을 얻은 후, 환자군-대조군 안의 연구를 위하여 환자들을 모집하였다. 모든 대상체들에게 참여에 대한 고지에 입각한 동의서가 제공되었다. 전체 복사뼈 인공관절 치환술을 받는 복사뼈 통증이 있는 대상체들은 개인 병원의 발 및 복사뼈 외과의로부터 모집하였다. 포함된 기준은 연령대가 40-70세, 활동 관련 복사뼈 통증, 보존적 치료(주사 및 요법)에 실패, 퇴행성 관절 질환 및 골관절염에 대한 단술촬영이 포함된다. 배제 기준은 급성 골절, 염증성 관절염(가령, 류마티스 관절염), 또는 수술 일로부터 3개월이내 경구/관절내 스테로이드 주사가 포함된다.
복사뼈 통증 없이 나이가 일치되는 무증후성 지원자로부터 또 다른 대상체가 모집되었다. 포함 기준은 연령대가 30-69세, 복사뼈 통증이 없거나 또는 간헐적 복사뼈 통증 병력을 포함한다. 배제 기준은 염증성 관절염, 수술 일로부터 3개월이내 경구/관절내 스테로이드 주사, 복사뼈의 신체 검사 또는 정상 범위밖의 안정성이 포함된다.
각 대상체에서, 관절내 시료는 다음과 같이 수거되었다. 흡입 부위는 클로로헥시딘 글루코네이트의 3중 준비로 사전 준비해두었고, 흡인은 멸균된 10cc 주사기와 21 가우지 ×1.5 인치 바늘을 이용하여 전방 또는 직접적인 측면 방법으로 실행되었다. 무릎을 2cc의 0.9% 표준 염으로 세척하였고, 흡인물을 주사기로 빼내었다. 흡인물을 프로테아제 억제제 칵테일이 담겨있는 에펜도르프 튜브에 넣고, 운반될 때까지 얼음에 두었다.
피브로넥틴-어그레칸 (G3) 복합체의 존재에 대한 이질성 ELISA 분석 (실시예 4에서 실시된 것과 같은)은 1:5 비율로 희석한 후 각 시료에서 실시되었다.
결과:
프로토콜에 따라 4명의 증후를 나타내는 복사뼈와, 10명의 무증후성 복사뼈를 분석하였다. 증후를 나타내는 군의 평균(± 표준 편차) 광학 밀도(OD)는 8.4 (± 5.1)이며, 무증후성 기준군은 0.0이었다.
본 실시예는 피브로넥틴-어그레칸 (G3)의 복합체가 복사뼈 관절의 활액 유체로부터 분석될 수 있으며, 그리고 병력, 신체 검사 및 MRI 스캐닝에 의해 진단된 관절내 교란 및 퇴행성 관절 질환이 있음을 예측하는 생체 표식으로 삼을 수 있다는 것을 설명한다.
다른 언급이 없는 한, 모든 기술적 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 당업자가 인지하는 것과 동일한 의미를 가진다. 여기에서 언급된 공개물 및 언급된 재료들은 참고문헌에 통합된다.
Claims (55)
- 척추 시료 또는 관절시료로부터 분리되는, 피브로넥틴 및 어그레칸을 함유하는 분리된 복합체.
- 청구항 1에 있어서, 복합체는 어그레칸의 G1, IGD, G2, KS, CS1, CS2 또는 G3 도메인 또는 이의 단편들, 피브로넥틴 및 이의 단편들, 또는 이의 복합체들을 함유하는, 복합체.
- 청구항 1에 있어서, 복합체는 어그레칸-피브로넥틴 결합 단편을 함유하는 복합체.
- 청구항 1에 있어서, 피브로넥틴 및 어그레칸은 재조합, 천연 또는 합성 또는 이의 복합인 복합체.
- 대상체에서 척추 통증 또는 염증 치료를 위한 치료 부위를 확인하는 방법으로서,
a) 대상체의 척추에 하나 이상의 잠재적인 치료 부위로부터 하나 이상의 생물학적 시료를 수거하고, 그리고
b) 척추 통증 치료를 위한 치료 부위로부터 하나 이상의 생물학적 시료안에 척추 통증과 관련된 하나 이상의 생체표식을 가진 치료 부위를 선택하는 것을 포함하는 방법. - 청구항 5에 있어서, 하나 이상의 생체표식은 피브로넥틴 및 어그레칸, 또는 이의 단편들, 또는 이의 복합체, 또는 이의 조합들 사이에 복합체들로 구성된 방법.
- 청구항 5에 있어서, 하나 이상의 생체표식은 피브로넥틴 또는 이의 단편과 어그레칸 또는 이의 단편의 복합체인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 생체표식은 어그레칸의 G3 도메인 또는 이의 단편을 함유하는 방법.
- 청구항 5에 있어서, 하나 이상의 생물학적 시료는 세척, 흡인, 주사-흡인, 생검, 비세-바늘 흡인 생검, 코어 생검, 내시경 또는 개방 생검으로 구성된 군으로부터 선택된 기술을 이용하여 수득되며;
시료는 경막외, 추간판내, 추간판외, 또는 파셋-관절관절내 공간으로 구성된 군으로부터 선택된 척추내 공간으로부터 수득되며; 그리고
시료는 경추간공, 꼬리, 추간판간, 경피, 내시경, 개방 및 전방, 후방 및 측방에서 선택된 척추에 접근 방법에 의해 수득되며; 그리고
흡인물, 조직, 또는 유체 시료는 주사된 염, 다른 주사된 수성 용액, 주사된 비-수성 용액, 용액, 활액 유체, 속질핵(nucleus pulposis), 환형 섬유화(annulus fibrosis), 경막외 지방, 뼈, 관절캡슐, 인대, 또는 힘줄로부터 선택되며; 그리고
시료화된 유체 또는 조직은 추가 흡수제, 흡착제, 또는 모세관 물질 또는 스폰지, 심지, 가제, 봉합사, 친수성 카테테르, 소수성 카테테르, 또는 동공-루멘 카테테르로부터 선택된 도구의 도움으로 수거되는 방법. - 청구항 5에 있어서, 하나 이상의 생체표식은 크로마토그래피 기술, 결합 분석, 면역학적 기술 또는 질량 분석을 이용하여 탐지되는 방법.
- 청구항 5에 있어서, 치료 부위는 통증 또는 염증의 원천이 되는 부위인 방법.
- 대상체에서 관절-관련 통증 또는 염증 치료를 위한 부위 관절을 확인하는 방법으로서,
a) 대상체에서 관절-관련 통증 또는 염증 잠재적 치료 부위가 되는 하나 이상의 관절로부터 하나 이상의 생물학적 시료를 수득하고, 및
b) 관절 통증 또는 염증 치료를 위한 치료 부위로부터 하나 이상의 생물학적 시료안에 관절 통증 또는 염증과 관련된 하나 이상의 생체표식을 가진 치료 부위를 선택하는 것을 포함하는 방법. - 청구항 12에 있어서, 하나 이상의 생체표식은 피브로넥틴 및 어그레칸, 또는 이의 단편들, 또는 이의 복합체, 또는 이의 조합들 사이에 복합체들로 구성된 방법.
- 청구항 13에 있어서, 하나 이상의 생체표식은 피브로넥틴 또는 이의 단편과 어그레칸 또는 이의 단편의 복합체인 방법.
- 청구항 14에 있어서, 생체표식은 피브로넥틴 또는 이의 단편과 어그레칸의 G3 도메인 또는 이의 단편의 복합체를 함유하는 방법.
- 청구항 12에 있어서, 하나 이상의 생물학적 시료는 세척, 흡인, 주사-흡인, 생검, 비세-바늘 흡인 생검, 코어 생검, 내시경 또는 개방 생검으로 구성된 군으로부터 선택된 기술을 이용하여 수득되며; 그리고
시료는 활액 (가령 가동관절), 연골성, 및 유합성연골(synarthrodial)로부터 선택된 관절 부류로부터 수득되고; 그리고
관절은 어깨, 팔꿈치, 손목관절, 장골, 지골, 견봉쇄골, 흉쇄관절, 견갑골, 늑골, 천장관절, 엉덩이, 무릎, 복사뼈, 중족 관절 군으로부터 선택되며;
흡인물, 조직, 또는 유체 시료는 주사된 염, 다른 주사된 수성 용액, 주사된 비-수성 용액, 용액, 활액 유체, 속질 핵(nucleus pulposis), 환형 섬유화(annulus fibrosis), 경막외 지방, 뼈, 관절캡슐, 인대, 또는 힘줄로부터 선택되며; 그리고
시료화된 유체 또는 조직은 추가 흡수제, 흡착제, 또는 모세관 물질 또는 스폰지, 심지, 가제, 봉합사, 친수성 카테테르, 소수성 카테테르, 또는 동공-루멘 카테테르로부터 선택된 도구의 도움으로 수거되는 방법. - 청구항 12에 있어서, 하나 이상의 생체표식은 크로마토그래피 기술, 결합 분석, 면역학적 기술 또는 질량 분석을 이용하여 탐지되는 방법.
- 청구항 12에 있어서, 치료 부위는 통증 또는 염증의 원천이 되는 부위인 방법.
- 시료안의 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 탐지하는 키트로서,
탐지 결합 파트너; 그리고
피브로넥틴-어그레칸 복합체 탐지를 위한 양성 기준을 포함하고 있으며, 이때 양성 기준은 청구항 1항의 복합체를 포함하는 키트. - 청구항 19에 있어서, 기질에 결합된 포획 결합 파트너를 더 포함하는 키트.
- 청구항 20에 있어서, 포획 결합 파트너는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 어그레칸에 결합하고, 탐지 결합 파트너는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 피브로넥틴에 결합하는 키트.
- 청구항 19에 있어서, 포획 결합 파트너는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 피브로넥틴에 결합하고, 탐지 결합 파트너는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 어그레칸에 결합하는 키트.
- 청구항 19에 있어서, 포획 결합 파트너 및 탐지 결합 파트너는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 상이한 에피토프에 결합하는 키트.
- 청구항 19에 있어서, 포획 결합 파트너 및 탐지 결합 파트너는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 동일한 에피토프에 결합하는 키트.
- 청구항 19에 있어서, 동일한 또는 상이한 종으로부터 기인된 피브로넥틴 및 어그레칸 또는 이의 단편들의 복합체를 포함하는 양성 기준 또는 표준을 포함하는 키트.
- 청구항 25에 있어서, 제1 종은 인간인 키트.
- 청구항 25에 있어서, 제 2 종은 소, 돼지 및 말 또는 인간의 것에 상동성인 피브로넥틴 또는 어그레칸 서열을 가진 임의의 포유동물로부터 선택되는 키트.
- 청구항 25에 있어서, 제 1 종은 인간이며, 제 2 종은 소가 되는 키트.
- 청구항 19에 있어서, 복합체는 어그레칸의 G1 , IGD, G2, KS, CS1, CS2 또는 G3 도메인, 이의 피브로넥틴-결합 단편들, 또는 이의 복합체들를 포함하는 키트.
- 청구항 19에 있어서, 복합체는 피브로넥틴의 어그레칸-결합 단편을 포함하는 키트.
- 청구항 19에 있어서, 피브로넥틴 및 어그레칸은 재조합, 천연 또는 합성 또는 이의 조합인 키트.
- 청구항 19에 있어서, 대상체로부터 생물학적 시료를 수득하는데 이용되는 도구를 더 포함하는 키트.
- 청구항 19에 있어서, 병리 또는 손상을 나타내는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 기준 수준을 더 포함하는 키트.
- 청구항 19에 있어서, 탐지 결합 파트너는 피브로넥틴-어그레칸 복합체에피토프 결합하는 키트.
- 청구항 31에 있어서, 탐지 결합 파트너는 피브로넥틴 단독 또는 어그레칸 단독에는 탐지가능할 수준으로 결합하지 않는 키트.
- 청구항 19에 있어서, 포획 결합 파트너 및 탐지 결합 파트너는 피브로넥틴- 어그레칸 복합체에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 피브로넥틴-어그레칸 복합체 수용체 또는 이의 단편 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 키트.
- 척추-통증 또는 염증을 억제 또는 감소시키는 방법으로
a) 청구항 5에 따라 척추에서 치료 부위를 확인하고; 그리고
b) 척추-통증 또는 염증을 억제 또는 감소시키기 위하여 치료부위로 치료물질을 투여하는 것을 포함하는 방법. - 청구항 37에 있어서, 치료는 추궁판절개술, 척추궁절개술, 관절원판 절제술, 현미경허리수술, 경피 관절원판 절제술, 내시경 관절원판 절제술, 레이져 관절원판 절제술, 추간공 확대술, 융합, 증식치료, 다른 외과적 감압, 기구사용 또는 사용없이 융합과 함께 감압, 움직임 자제 도구(motion sparing devices), 인공추관판 대체술, 소관절 교체술(facet arthroplasties), 인터스피너스(interspinous) 장치, 동적 안정화 장치(dynamic stabilization devices), 척추경 나사(pedicle screws), 로드(rods), 후크(hooks), 인터바디(interbody) 장치, 속질핵(nucleus pulposus) 교체 또는 증강 장치, 환형 섬유증 복구 또는 복구 장치, 스테로이드성 또는 비-스테로이드성 소염제로부터 선택된 방법.
- 척추 통증 또는 염증을 억제 또는 감소시키는 방법으로서,
피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여, 대상체의 척추안의 피브로넥틴- 어그레칸 복합체를 길항시키는 것을 포함하는 방법. - 청구항 39에 있어서, 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제는 대상체의 척추에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 형성을 억제 또는 감소시키고, 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 해리시키고, 또는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 생물학적 활성을 억제 또는 감소시키는 방법.
- 청구항 39에 있어서, 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제는 폴리펩티드인 방법.
- 청구항 39에 있어서, 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제는 피브로넥틴, 어그레칸, 또는 이의 단편들에 의해 형성된 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 방법.
- 청구항 42에 있어서, 항체는 피브로넥틴-어그레칸 복합체에 선택적으로 결합하고, 피브로넥틴 단독 또는 어그레칸 단독에는 탐지가능할 수준으로 결합하지 않는 방법.
- 대상체에서 척추 통증 또는 염증을 억제 또는 감소시키기 위하여 치료될 척추 추간판을 확인하는 방법으로서,
개체의 두 개 이상의 척추 추간판에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 수준을 결정하고;
척추 통증 또는 염증이 없는 대상체의 척추 추간판의 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 수준과 비교하여 피브로넥틴-어그레칸 복합체 수준이 증가, 감소 또는 상이한 척추 추간판을 선택하는 것을 포함하는 방법. - 청구항 44에 있어서, 피브로넥틴의 수준은 청구항 5의 방법에 따라 결정되는 방법.
- 척추 통증 또는 염증 치료를 요하는 대상체를 선택하는 방법으로서,
대상체에서 수득한 척추 시료를 피브로넥틴-어그레칸 복합체에 대해 분석하고; 그리고
피브로넥틴- 어그레칸 복합체가 척추 시료에서 탐지되면, 척추 통증 치료 대상으로 선택되는 것을 포함하는 방법. - 청구항 45에 있어서,
척추 시료는 세척, 흡인, 주사-흡인, 생검, 비세-바늘 흡인 생검, 코어 생검, 내시경 또는 개방 생검으로 구성된 군으로부터 선택된 기술을 이용하여 수득되며;
시료는 경막외, 추간판내, 추간판외, 또는 파셋-관절 관절내 공간으로 구성된 군으로부터 선택된 척추내 공간으로부터 수득되며; 그리고
시료는 경추간공, 꼬리, 추간판간, 경피, 내시경, 개방 및 전방, 후방 및 측방에서 선택된 척추에 접근 방법에 의해 수득되며; 그리고
흡인물, 조직, 또는 유체 시료는 주사된 염, 다른 주사된 수성 용액, 주사된 비-수성 용액, 용액, 활액 유체, 속질 핵(nucleus pulposis), 환형 섬유화(annulus fibrosis), 경막외 지방, 뼈, 관절캡슐, 인대, 또는 힘줄로부터 선택되며; 그리고
시료화된 유체 또는 조직은 추가 흡수제, 흡착제, 또는 모세관 물질 또는 스폰지, 심지, 가제, 봉합사, 친수성 카테테르, 소수성 카테테르, 또는 동공-루멘 카테테르로부터 선택된 도구의 도움으로 수거되는 방법. - 척추 통증 또는 관절 통증 또는 염증을 감소시키는 유효량의 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제를 포함하는 제약학적 조성물.
- 관절-관련 통증 또는 염증을 억제 또는 감소시키는 방법으로,
a) 청구항 12에 따른 관절-관련 통증 또는 염증을 치료하기 위한 치료 부위 관절을 확인하고; 그리고
b) 관절-관련 통증 또는 염증을 억제 또는 감소시키기 위하여 치료 부위로 치료물을 투여하는 것을 포함하는 방법. - 청구항 49에 있어서, 치료는 외과적 방법 또는 스테로이드성 또는 비스테로이드성 소염제 투여에서 선택되는 방법.
- 관절-관련 통증 또는 염증을 억제 또는 감소시키는 방법으로서, 피브로넥틴- 어그레칸 복합체 길항제를 환자에 투여하여, 환자의 하나 이상의 관절에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 길항시키는 방법.
- 청구항 51에 있어서, 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제는 대상체의 척추에서 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 형성을 억제 또는 감소시키고, 피브로넥틴-어그레칸 복합체를 해리시키고, 또는 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 생물학적 활성을 억제 또는 감소시키는 방법.
- 청구항 52에 있어서, 피브로넥틴-어그레칸 복합체 길항제는 폴리펩티드인 방법.
- 청구항 53에 있어서, 피브로넥틴-어그레칸 복합체는 피브로넥틴, 어그레칸, 또는 이의 단편들에 의해 형성된 피브로넥틴-어그레칸 복합체의 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 방법.
- 청구항 54에 있어서, 항체는 피브로넥틴 단독 또는 어그레칸에 비교하여, 피브로넥틴-어그레칸 복합체에 선택적으로 결합하는 방법.
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