KR20110032561A - Methods for Regulating Target Specificity of Drug Carriers, Target Specific Drug Carriers, and Target-Non-Drug Long-Term Drug Delivery - Google Patents
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Abstract
본 발명은 히알루론산 유도체를 포함한 약물 전달체의 표적 특이성 조절 방법, 상기와 같은 표적 특이성 조절 방법에 의한 표적 특이적 약물 전달체 및 표적-비특이적 약효 장기 지속성 약물 전달체에 관한 것이다.The present invention relates to a method for regulating a target specificity of a drug carrier including a hyaluronic acid derivative, a target specific drug carrier and a target-nonspecific drug long-term long-acting drug carrier by the target specificity control method as described above.
상기와 같은 본 발명의 표적 특이성 조절 방법은 히알루론산 유도체의 카르복실기 치환율을 조절하여, 상기 유도체를 포함하는 약물 전달체를 표적 특이적 특성 또는 표적-비특이적 약효 장기 지속성을 갖도록 조절하는 것이다. 따라서, 상기한 방법에 따라 용이하게 목적에 맞는 약물 전달체를 구현할 수 있어, 본 발명의 표적 특이성 조절 방법 및 이에 의한 표적 특이적 약물 전달체 및 표적-비특이적 약효 장기 지속성 약물 전달체는 약물 전달체 제조에 관한 산업 분야에 널리 유용하게 사용할 수 있다.The target specificity control method of the present invention as described above is to adjust the carboxyl group substitution rate of the hyaluronic acid derivative, to adjust the drug carrier containing the derivative to have target specific characteristics or target-non-specific drug long-term persistence. Accordingly, according to the above-described method, it is possible to easily implement a drug carrier that meets the purpose, and thus, the target specificity control method of the present invention and the target specific drug carrier and the target-nonspecific drug-effective long-term persistent drug carrier according to the present invention can It can be widely used in the field.
Description
본 발명은 약물 전달체의 표적 특이성 조절 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기와 같은 표적 특이성 조절 방법에 의한 표적 특이적 약물 전달체, 및 표적-비특이적 약효 장기 지속성 약물 전달체에 관한 것이다. The present invention relates to a method of modulating target specificity of a drug carrier. In addition, the present invention relates to a target specific drug carrier and a target-nonspecific drug long-term persistent drug carrier by the target specificity control method as described above.
바이오산업은 생물학적 지식의 도움에 힘입어 엄청난 성장을 보이고 있다. 단백질이나 펩티드와 같은 제약은 바이오제약 성장의 원동력이 되고 있으며, 약물 전달에 대한 많은 연구는 단백질과 펩티드 약의 표면 형상을 변화시켰으며 그에 따라서 약의 효능은 매우 향상되었다.The bio industry is growing tremendously with the help of biological knowledge. Pharmaceuticals, such as proteins and peptides, are the driving force behind biopharmaceutical growth, and many studies of drug delivery have changed the surface shape of protein and peptide drugs, and thus the drug's efficacy is greatly improved.
한편, 생체 내에서 처리되지 않은 본래의 단백질이나 펩티드의 안정성은 매우 낮고, 이에 따라 치료 효과는 떨어지게 된다. 따라서, 상기와 같은 약물을 전달하기 위한 생분해성, 생적합성 고분자를 이용한 약물 전달 시스템에 관한 응용 기술에 관심이 집중되고 있다.On the other hand, the stability of the original protein or peptide untreated in vivo is very low, thereby reducing the therapeutic effect. Therefore, attention has been focused on application technologies related to drug delivery systems using biodegradable and biocompatible polymers for delivering such drugs.
구체적으로, Roche 그룹은 C형 간염 치료제인 α-interferon 을 PEGylation화한 PEGASYS를 출시하였다. PEGASYS와 같이 Interferon과 생체적합성 고분자인 Poly Ethylene Glycol (PEG)의 결합을 통해 체내 순환 시간과 용해도가 향상되고, 효능이 향상된 약을 제공할 수 있게 되었다. 그러나, PEG는 체내에서 분해가 잘되지 않아 축적에 의한 부정적인 특성들이 야기될 수 있다고 보고된 바 있다. 구체적으로, 약물전달체로 활용되는 PEG-Liposome 접합체를 반복 주사하게 되면 체내에서 투여된 약물의 소실이 빨리 일어나는 Accelerated blood clearance(ABC) 현상이 일어나는 것으로 보고되고 있다.Specifically, Roche Group has released PEGASYS, which is a PEGylation of α-interferon, a hepatitis C treatment. The combination of Interferon and Poly Ethylene Glycol (PEG), a biocompatible polymer, such as PEGASYS, improves the body's circulation time, solubility, and improves efficacy. However, it has been reported that PEG is poorly degraded in the body and may cause negative properties due to accumulation. Specifically, repeated injections of PEG-Liposome conjugates, which are used as drug carriers, have been reported to cause Accelerated blood clearance (ABC), which causes rapid loss of the administered drug in the body.
따라서, 상기와 같은 PEG를 대체하기 위한 새로운 생체적합성 생분해성 고분자로, 체내에 존재하는 바이오 고분자에 관심이 주목되고 있다. Therefore, as a new biocompatible biodegradable polymer for replacing such PEG, attention has been paid to the biopolymer present in the body.
따라서, 본 발명의 발명자들은 생분해성, 생체적합성 고분자를 이용한 약물 전달체, 및 이와 같은 약물 전달체를 이용하여 약물 전달체의 표적 특이성을 조절하는 방법에 관한 연구를 거듭하던 중 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the inventors of the present invention completed the present invention while continuously researching a drug carrier using a biodegradable, biocompatible polymer, and a method of controlling the target specificity of the drug carrier using the drug carrier.
본 발명은 생분해성, 생체적합성 고분자를 이용한 약물 전달체의 표적 특이성 조절 방법, 및 상기와 같은 조절 방법에 이용되는 표적 특이적 약물 전달체, 및 표적-비특이적 약효 장기 지속성 약물 전달체를 제공한다.The present invention provides a method for regulating the target specificity of a drug carrier using a biodegradable, biocompatible polymer, and a target specific drug carrier for use in such a control method, and a target-nonspecific drug long-term sustained drug carrier.
본 발명은 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)유도체를 포함한 약물 전달체의 표적 특이성을 조절하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method of modulating the target specificity of a drug delivery agent including a hyaluronic acid (HA) derivative.
또한, 본 발명은 5몰% 이상 45몰% 미만의 카르복실기가 치환된 히알루론산 유도체를 포함하는 표적 특이적 약물 전달체를 제공한다.The present invention also provides a target specific drug delivery agent comprising a hyaluronic acid derivative substituted with at least 5 mol% and less than 45 mol% of carboxyl groups.
또한, 본 발명은 45몰% 이상 100몰% 미만의 카르복실기가 치환된 히알루론산 유도체를 포함하는 표적-비특이적 약효 장기 지속성 약물 전달체를 제공한다.The present invention also provides a target-nonspecific drug long-acting drug delivery agent comprising a hyaluronic acid derivative substituted with at least 45 mol% and less than 100 mol% of carboxyl groups.
이하, 발명의 구현예에 따른 히알루론산 유도체를 포함한 약물 전달체의 표적 특이성을 조절하는 방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, a method of controlling target specificity of a drug delivery agent including a hyaluronic acid derivative according to an embodiment of the present invention will be described in more detail.
발명의 일 구현예에 따라, 히알루론산 유도체의 카르복실기 치환율을 조절하여, 상기 히알루론산 유도체를 포함한 약물 전달체의 표적 특이성을 조절하는 방법을 제공한다.According to one embodiment of the invention, by adjusting the substitution rate of the carboxyl group of the hyaluronic acid derivative, it provides a method for controlling the target specificity of the drug carrier including the hyaluronic acid derivative.
한편, 명시적인 기재가 없는 한, 본 명세서 전체에서 사용되는 몇 가지 용어는 다음과 같이 정의된다. 본 명세서 전체에서, '히알루론산'은 하기 화학식 1로 표현되는 반복단위를 갖는 고분자를 지칭한다.On the other hand, unless explicitly stated, some terms used throughout the present specification are defined as follows. Throughout this specification, 'hyaluronic acid' refers to a polymer having a repeating unit represented by the following formula (1).
화학식 1
이 때, m은 1 이상의 정수일 수 있다.In this case, m may be an integer of 1 or more.
또한, '히알루론산 유도체'는 상기와 같은 히알루론산의 적어도 하나의 카르복실기가 다른 화합물로 치환된 고분자를 지칭한다.In addition, the hyaluronic acid derivative refers to a polymer in which at least one carboxyl group of the hyaluronic acid is substituted with another compound.
그리고, '카르복실기의 치환율'은 히알루론산 유도체에 있어서, 전체 히알루론산 반복단위 중 카르복실기가 치환된 반복단위의 몰 비율로 정의되며, 정의상 0 초과 1 이하의 수치 또는 0몰% 초과 100몰% 이하의 수치로 표현될 수 있다.And, the 'substitution rate of the carboxyl group' in the hyaluronic acid derivative, is defined as the molar ratio of the repeating unit in which the carboxyl group is substituted among all the hyaluronic acid repeating units, and by definition is greater than 0 or less than 1 or greater than 0 mol% or less than 100 mol% Can be expressed numerically.
한편, 상기와 같은 히알루론산 유도체의 준비에 사용되는 히알루론산은 대부분의 동물에 존재하며 생분해성, 생적합성, 면역반응이 없는 선형적인 다당류의 고분자이다. 히알루론산은 체내에서 분자량에 따라 여러 가지 다른 역할을 수행하기 때문에 여러 가지 용도로 사용될 수 있다. 구체적으로, 미국의 경우 2003년에 히알루론산을 이용한 생체재료 시장은 5억 달러 정도이며, 연간성장률 (Compound Annual Growth Rate, CAGR)은 평균 12.51% 로 2010년에는 11억 4천만 달러로 예상된다. 현재, 히알루론산은 관절염 치료나 안과 수술 등에 응용되고 있으며, 약물 전달에도 응용 가능성이 높을 것으로 예상 된다.On the other hand, hyaluronic acid used in the preparation of the hyaluronic acid derivatives as described above is a polymer of linear polysaccharides present in most animals and without biodegradability, biocompatibility, and immune responses. Hyaluronic acid can be used for various purposes because it plays several different roles in the body depending on the molecular weight. Specifically, in the US, the biomaterials market using hyaluronic acid in 2003 is about $ 500 million, and the annual annual growth rate (CAGR) is 12.51%, which is expected to be $ 1.14 billion in 2010. Currently, hyaluronic acid has been applied to the treatment of arthritis, eye surgery, etc., and is expected to be highly applicable to drug delivery.
또한, 히알루론산은 화학적인 방법에 의한 표면 개질이 용이해 생체 내에서 분해 시간을 조절 할 수 있으며, 세포의 수용체와의 반응 정도를 조절할 수 있을 것으로 기대된다. 알려진 바와 같이, Biomatrix 사의 Hyalns 은 히알루론산이 단백질이나 포름알데하이드와 혼합체를 이루고 있는 하이드로젤 (hydrogel)형태로, 이를 이용해 퇴행성 관절염이나 류마티스성 관절염 치료에 응용되고 있다.In addition, hyaluronic acid is expected to be able to control the degradation time in vivo, and to control the degree of reaction with the cell because it is easy to modify the surface by a chemical method. As is known, Bioaltrix Hyalns is a hydrogel in which hyaluronic acid is mixed with protein or formaldehyde, and has been used to treat degenerative arthritis or rheumatoid arthritis.
본 발명의 발명자들은 상기와 같은 '히알루론산' 고분자 내에 포함된 카르복실기를 치환하여 준비된 서로 다른 치환율을 갖는 히알루론산 유도체들을 이용하여 실험하여 본 결과, 각기 다른 카르복실기 치환율을 갖는 히알루론산 유도체에 따라 생체 내 거동이 표적 특이적 또는 표적-비특이적 약효 장기 지속성을 나타내는 것을 관찰하고 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention have experimented with hyaluronic acid derivatives having different substitution rates prepared by substituting the carboxyl groups contained in the 'hyaluronic acid' polymer as described above, and in vivo according to hyaluronic acid derivatives having different carboxyl group substitution rates. The present invention was completed by observing the behavior exhibiting target specific or target non-specific drug long-term persistence.
구체적으로, 히알루론산 유도체의 카르복실기 치환율이 낮은 경우 표적 수용체에 약물을 전달하는 표적 특이적 특성을 나타내고, 히알루론산 유도체의 카르복실기 치환율이 높은 경우 표적-비특이적 약효 장기 지속성을 나타내는 것을 관찰할 수 있었다.Specifically, it was observed that when the hyaluronic acid derivative has a low carboxyl substitution rate, it shows a target specific characteristic of delivering a drug to the target receptor, and when the hyaluronic acid derivative has a high carboxyl substitution rate, it exhibits a target-nonspecific drug long-term persistence.
본 발명은 다른 구현예에 따라 상기와 같은 히알루론산 유도체의 카르복실기 치환율을 5몰% 이상 45몰% 미만으로 조절하여, 히알루론산 유도체를 포함한 약물 전달체를 간 표적 특이적 특성으로 조절하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method of controlling the drug delivery group including the hyaluronic acid derivative to liver target specific properties by adjusting the carboxyl group substitution rate of the hyaluronic acid derivative as described above according to another
상기와 같은 카르복실기 치환율을 갖는 히알루론산 유도체는 유도체 중 히알루론산의 카르복실기의 치환율이 낮아, 히알루론산에 대한 수용체를 갖는 세포에 대해 강한 표적 특이성을 나타낸다. 따라서, 상기와 같은 치환율을 갖는 히알루론산 유도체를 포함한 약물 전달체는 특정 표적 수용체에 약물을 전달하는 약물 전달체로 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 상기와 같이 히알루론산 유도체의 카르복실 기 치환율을 조절하여, 약물전달체가 간 표적 특이적 특성을 갖도록 조절할 수 있다. 한편, 표적 특이성을 더욱 높이기 위해, 바람직하게는 히알루론산 유도체의 카르복실기 치환율을 15내지 35몰%로 더욱 조절할 수 있다.The hyaluronic acid derivative having the carboxyl group substitution rate as described above has a low substitution rate of the carboxyl group of hyaluronic acid in the derivative, and thus shows strong target specificity for cells having a receptor for hyaluronic acid. Therefore, a drug delivery agent including a hyaluronic acid derivative having such a substitution rate may be usefully used as a drug delivery agent for delivering a drug to a specific target receptor. In particular, by adjusting the carboxyl group substitution rate of the hyaluronic acid derivative as described above, the drug carrier can be adjusted to have liver target specific properties. On the other hand, in order to further increase the target specificity, preferably the carboxyl group substitution rate of the hyaluronic acid derivative can be further adjusted to 15 to 35 mol%.
한편, 본 발명은 또 다른 구현예에 따라, 카르복실기의 치환율을 45몰% 이상 100몰% 미만으로 조절하여, 히알루론산 유도체를 포함한 약물 전달체를 표적 비특이적 특성으로 조절하는 방법을 제공한다.On the other hand, the present invention provides a method for adjusting the drug carrier including a hyaluronic acid derivative to the target nonspecific properties by adjusting the substitution rate of the carboxyl group to 45 mol% or more and less than 100 mol% according to another embodiment.
본 발명의 발명자들은 카르복실기 치환율이 높은 히알루론산 유도체의 경우에는 세포 흡수 정도가 낮아 표면 비특이적 특성을 나타내고, 따라서 장기 지속형 약물 전달체에 응용 가능함을 알아내었다. 바람직하게는 카르복실기 치환율을 50 내지 70몰%로 조절하여, 히알루론산 유도체를 포함한 약물 전달체를 표적-비특이적 약효 장기 지속성을 갖도록 조절할 수 있다.The inventors of the present invention have found that the hyaluronic acid derivative having a high carboxyl group substitution rate has a low level of cellular uptake and thus exhibits surface nonspecific properties, and thus is applicable to long-term sustained drug delivery. Preferably, the carboxyl group substitution rate is adjusted to 50 to 70 mole%, so that the drug delivery agent including the hyaluronic acid derivative can be adjusted to have target-nonspecific drug long-term persistence.
한편, 상기와 같이 히알루론산 유도체를 포함한 약물 전달체의 표적 특이성을 조절하기 위해서는 필수적으로 히알루론산의 카르복실기 치환율을 조절하여 달성한다. 이때, 히알루론산 의 카르복실기를 치환하기 위해서는 카르복실기와 용이하게 반응하는 치환기를 갖고, 생체 유해성이 없는 화합물이라면 그 구성의 한정이 없이 선택될 수 있다.On the other hand, in order to control the target specificity of the drug carrier including the hyaluronic acid derivative as described above is achieved by controlling the carboxyl group substitution rate of hyaluronic acid. In this case, in order to substitute the carboxyl group of hyaluronic acid, any compound having a substituent which reacts easily with the carboxyl group and having no biohazard may be selected without limiting its configuration.
바람직하게는 아디프산 다이히드라지드(Adipic acid dihydrazide), 헥사메틸렌디아민(Hexamethylene diamine), 시스타민(Cystamine), 티올(Thiol), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide), 3-2(피리딜디티오) 프로피오닐 히드라지드 (3-(2-Pyridyldithio) propionyl hydrazide), 요오드 아세트 아마이 드(Iodoacetamide, I), 티라민(Tyramine, Tyr), 도파민(Dopamine, Dopa), 아미노에틸메타크릴레이트(Aminoethylmethacrylate, AEMA), 아미노프로필메타크릴레이트(Aminopropylmethacrylate, APMAm), 및 비닐술폰(Vinyl sulfone, VS)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 이용하여, 히알루론산의 카르복실기를 치환할 수 있다.Preferably, adipic acid dihydrazide, hexamethylenediamine, cystamine, thiol, N-hydroxysuccinimide, 3-2 (Pyridyldithio) propionyl hydrazide (3- (2-Pyridyldithio) propionyl hydrazide), iodine acetamide (I), tyramine (Tyr), dopamine (Dopamine, Dopa), aminoethylmethacryl A carboxyl group of hyaluronic acid can be substituted using one or more selected from the group consisting of acrylate (Aminoethylmethacrylate, AEMA), aminopropylmethacrylate (APMAm), and vinyl sulfone (VS).
상기와 같은 화합물들은 생체 내 약물 전달체로 사용되기에 적합하고, 카르복실기와의 치환 반응이 비교적 용이하게 일어날 수 있는 것들을 나열한 것이나, 본 발명이 상술한 예에 한정되지는 않는다.Such compounds are suitable for use as drug carriers in vivo, and those that can be substituted relatively easily with a carboxyl group are listed, but the present invention is not limited to the examples described above.
한편, 상기와 같은 화합물을 이용하여 히알루론산의 카르복실기를 치환하여 준비되는 가능한 히알루론산 유도체는 하기와 같다.On the other hand, possible hyaluronic acid derivatives prepared by substituting the carboxyl groups of hyaluronic acid using the above compounds are as follows.
히알루론산(Hyaluronic acid, HA)의 적어도 하나의 카르복실기가 아디프산 다이히드라지드(Adipic acid dihydrazide, ADH)로 치환된 히알루론산-ADH 유도체는 하기 화학식 2와 같다.The hyaluronic acid-ADH derivative in which at least one carboxyl group of hyaluronic acid (HA) is substituted with adipic acid dihydrazide (ADH) is represented by the following Chemical Formula 2.
화학식 2 Formula 2
또한, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)의 적어도 하나의 카르복실기가 헥사메틸렌디아민(Hexamethylene diamine, HMDA)으로 치환된 히알루론산-HMDA 유도체는 하기 화학식 3과 같다.In addition, the hyaluronic acid-HMDA derivative in which at least one carboxyl group of hyaluronic acid (HA) is substituted with hexamethylenediamine (HMDA) is represented by the following Chemical Formula 3.
화학식 3
또한, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)의 적어도 하나의 카르복실기가 시스타민(Cystamine, Cys)으로 치환된 히알루론산-Cys 유도체는 하기 화학식 4와 같다. In addition, the hyaluronic acid-Cys derivative in which at least one carboxyl group of hyaluronic acid (HA) is substituted with cystamine (Cystamine, Cys) is represented by Chemical Formula 4 below.
화학식 4Formula 4
또한, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)의 적어도 하나의 카르복실기가 티올(Thiol, SH)로 치환된 히알루론산-SH 유도체는 하기 화학식 5와 같다. In addition, the hyaluronic acid-SH derivative in which at least one carboxyl group of hyaluronic acid (HA) is substituted with thiol (Thiol, SH) is represented by the following Chemical Formula 5.
화학식 5
또한, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)의 적어도 하나의 카르복실기가 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)로 치환된 히알루론산-NHS 유도체는 하기 화학식 6과 같다.In addition, the hyaluronic acid-NHS derivative in which at least one carboxyl group of hyaluronic acid (HA) is substituted with N-hydroxysuccinimide (NHS) is represented by the following Chemical Formula 6.
화학식 66
또한, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)의 적어도 하나의 카르복실기가 3-2(피리딜디티오) 프로피오닐 히드라지드 (3-(2-Pyridyldithio) propionyl hydrazide, PDPH)로 치환된 히알루론산-PDPH 유도체는 하기 화학식 7과 같다. Also, hyaluronic acid-PDPH derivatives wherein at least one carboxyl group of hyaluronic acid (HA) is substituted with 3-2 (pyridyldithio) propionyl hydrazide (3- (2-Pyridyldithio) propionyl hydrazide (PDPH) Is the same as the formula (7).
화학식 7Formula 7
또한, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)의 적어도 하나의 카르복실기가 요오드 아세트 아마이드(Iodoacetamide, I)로 치환된 히알루론산-I 유도체는 하기 화학식 8과 같다. In addition, the hyaluronic acid-I derivative in which at least one carboxyl group of hyaluronic acid (HA) is substituted with iodine acetamide (I) is represented by the following Chemical Formula 8.
화학식 8
또한, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)의 적어도 하나의 카르복실기가 티라민(Tyramine, Tyr)으로 치환된 히알루론산-Tyr 유도체는 하기 화학식 9와 같다.In addition, a hyaluronic acid-Tyr derivative in which at least one carboxyl group of hyaluronic acid (HA) is substituted with tyramine (Tyramine, Tyr) is represented by Formula 9 below.
화학식 9Formula 9
또한, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)의 적어도 하나의 카르복실기가 도파민(Dopamine, Dopa)으로 치환된 히알루론산-Dopa 유도체는 하기 화학식 10과 같다.In addition, the hyaluronic acid-Dopa derivative in which at least one carboxyl group of hyaluronic acid (HA) is substituted with dopamine (Dopamine, Dopa) is represented by the following Chemical Formula 10.
화학식 10Formula 10
또한, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)의 적어도 하나의 카르복실기가 아미노에틸메타크릴레이트(Aminoethylmethacrylate, AEMA)로 치환된 히알루론산-AEMA 유도체는 하기 화학식 11과 같다. In addition, a hyaluronic acid-AEMA derivative in which at least one carboxyl group of hyaluronic acid (HA) is substituted with aminoethylmethacrylate (AEMA) is represented by Formula 11 below.
화학식 11Formula 11
또한, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)의 적어도 하나의 카르복실기가 아미노프로필메타크릴레이트(Aminopropylmethacrylate, APMAm)로 치환된 히알루론산-APMAm 유도체는 하기 화학식 12와 같다. In addition, the hyaluronic acid-APMAm derivative in which at least one carboxyl group of hyaluronic acid (HA) is substituted with aminopropylmethacrylate (APMAm) is represented by the following Chemical Formula 12.
화학식 12Formula 12
또한, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)의 적어도 하나의 카르복실기가 비닐술폰(Vinyl sulfone, VS)로 치환된 히알루론산-VS 유도체는 하기 화학식 13과 같다.In addition, the hyaluronic acid-VS derivative in which at least one carboxyl group of hyaluronic acid (HA) is substituted with vinyl sulfone (Vinyl sulfone, VS) is represented by the following Chemical Formula 13.
화학식 13Formula 13
단, 상기 화학식 2 내지 13에 있어서, n 및 m은 1내지 10000의 정수이며, 표적 특이적 또는 표적 비특이적 특성으로 조절되기 위해 각각 상술한 범위 내에서, n/n+m 은 0.05 이상 0.45 미만, 0.45 이상 1 미만의 수치로 조절될 수 있다. However, in the above Chemical Formulas 2 to 13, n and m are integers of 1 to 10000, and within the above-mentioned ranges in order to be adjusted to target specific or target nonspecific characteristics, n / n + m is 0.05 or more and less than 0.45, It may be adjusted to a value of 0.45 or more but less than 1.
한편, 상술한 구현예에 따라 카르복실기의 치환율을 5 이상 45몰% 미만으로 조절하여, 상기 히알루론산 유도체를 포함한 약물 전달체를 간 표적 특이성을 갖도록 조절할 수 있는데, 이때 상기 약물 전달체의 표적 수용체는 CD44, LYVE-1, RHAMM, 및 HARE 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있다.On the other hand, according to the above-described embodiment by adjusting the substitution rate of the
또한, 상기와 같이 카르복실기 치환율이 조절된 히알루론산 유도체를 포함한 약물 전달체는 간에 대한 표적 특이성을 나타내어, 바람직하게 간질환의 예방 또는 치료용 약물을 봉입 또는 접합하여 사용할 수 있다. 후술할 표적 특이적 약물 전달체에서 보다 상세히 설명하겠지만, 바람직하게 급성간염, 만성간염, 간경변증, 간경화 또는 지방간 등의 간질환을 예방 또는 치료하기 위한 약물을 봉입 또는 접합하여, 상기와 같은 간질환의 예방 또는 치료용 약물 전달체로 사용될 수 있다. In addition, the drug carrier including the hyaluronic acid derivative having a carboxyl group substitution rate as described above exhibits a target specificity to the liver, and may be preferably used by enclosing or conjugating a drug for preventing or treating liver disease. As will be described in more detail in a target specific drug carrier to be described later, preferably by enclosing or conjugating a drug for preventing or treating liver diseases such as acute hepatitis, chronic hepatitis, cirrhosis, cirrhosis or fatty liver, the prevention of such liver diseases Or as a therapeutic drug carrier.
그리고, 상술한 구현예들에서 히알루론산 유도체 중 히알루론산의 분자량은 그 구성의 한정은 없으나, 바람직하게 10,000내지 4,000,000 달톤(Da) 일 수 있다. 상기와 같은 분자량을 갖는 히알루론산은 생체적합성이 뛰어나고, 손쉽게 구할 수 있다는 점에서 유리하다.In the above-described embodiments, the molecular weight of hyaluronic acid in the hyaluronic acid derivative is not limited in configuration, but may preferably be 10,000 to 4,000,000 Daltons (Da). Hyaluronic acid having a molecular weight as described above is advantageous in that it is excellent in biocompatibility and can be easily obtained.
한편, 본 발명은 또 다른 구현예에 따라 5몰% 이상 45몰% 미만의 카르복실기가 치환된 히알루론산 (Hyaluronic acid, HA) 유도체를 포함하는 표적 특이적 약물 전달체를 제공한다.On the other hand, the present invention provides a target specific drug delivery agent comprising a hyaluronic acid (HA) derivative substituted with at least 5 mol% less than 45 mol% of carboxyl groups according to another embodiment.
상술한 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 히알루론산 고분자에 포함된 카르복실기의 치환율을 5몰% 이상 45몰% 미만으로 조절하여 상기와 같은 히알루론산 유도체를 포함하는 약물 전달체의 표적 특이성을 조절할 수 있었다. 상기와 같은 치환율을 갖는 히알루론산 유도체를 포함하는 약물 전달체는 표적 특이적 약물 전달체로 사용될 수 있다. As described above, the inventors of the present invention were able to adjust the target specificity of the drug carrier including the hyaluronic acid derivative as described above by adjusting the substitution rate of the carboxyl groups contained in the hyaluronic acid polymer to 5 mol% or more and less than 45 mol%. Drug carriers containing hyaluronic acid derivatives having such substitution rates can be used as target specific drug carriers.
상술한 바와 같이, 상기와 같은 표적 특이적 약물 전달체를 준비하기 위해, 카르복실기를 치환하는 화합물은 그 구성의 한정은 없으나, 아디프산 다이히드라지드(Adipic acid dihydrazide), 헥사메틸렌디아민(Hexamethylene diamine), 시스타민(Cystamine), 티올(Thiol), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide), 3-2(피리딜디티오) 프로피오닐 히드라지드 (3-(2-Pyridyldithio) propionyl hydrazide), 요오드 아세트 아마이드(Iodoacetamide, I), 티라민(Tyramine, Tyr), 도파민(Dopamine, Dopa), 아미노에틸메타크릴레이트(Aminoethylmethacrylate, AEMA), 아미노프로필메타크릴레이트(Aminopropylmethacrylate, APMAm), 및 비닐술 폰(Vinyl sulfone, VS)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 행해질 수 있다.As described above, in order to prepare the target specific drug carrier as described above, the compound replacing the carboxyl group is not limited in its composition, but it is adipic acid dihydrazide, hexamethylenediamine (Hexamethylene diamine) Cystamine, thiol, N-hydroxysuccinimide, 3-2 (pyridyldithio) propionyl hydrazide (3- (2-Pyridyldithio) propionyl hydrazide), Iodoacetamide (I), tyramine (Tyramine, Tyr), dopamine (Dopamine, Dopa), aminoethylmethacrylate (AEMA), aminopropylmethacrylate (Aminopropylmethacrylate, APMAm), and vinylsulfone ( Vinyl sulfone, VS).
이때, 상기 표적 특이적 약물 전달체는 특히 간 표적 특이적 약물 전달체로 사용될 수 있는데, 이와 같은 약물 전달체의 표적 수용체는 CD44, LYVE-1, RHAMM, 및 HARE 로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 이때, 상기 히할루론산 유도체 중 히알루론산의 분자량은 바람직하게 10,000내지 4,000,000 달톤(Da)일 수 있음은 상술한 바와 같다.In this case, the target specific drug carrier may be particularly used as a liver target specific drug carrier, and the target receptor of the drug carrier may be selected from the group consisting of CD44, LYVE-1, RHAMM, and HARE. At this time, the molecular weight of the hyaluronic acid in the hyaluronic acid derivative is preferably as described above may be 10,000 to 4,000,000 Daltons (Da).
한편, 상기 표적 특이적 약물 전달체는 특히 간 표적 특이적 특성을 나타내는데, 따라서 간질환의 예방 또는 치료용 약물이 봉입 또는 접합된 형태일 수 있다. 이때, 상기 간질환은 그 구성의 한정은 없으나 급성간염, 만성간염, 간경변증, 간경화 또는 지방간 등의 간질환 일 수 있다.On the other hand, the target specific drug delivery vehicle exhibits particularly liver target specific properties, and thus may be in the form of a sealed or conjugated drug for preventing or treating liver disease. At this time, the liver disease is not limited in composition, but may be a liver disease such as acute hepatitis, chronic hepatitis, cirrhosis, liver cirrhosis or fatty liver.
본 발명은 또 다른 구현예에 따라 45몰% 이상 100몰% 미만의 카르복실기가 치환된 히알루론산 (Hyaluronic acid, HA) 유도체를 포함한 표적-비특이적 약효 장기 지속성 약물 전달체를 제공한다. 상술한 바와 같이 본 발명의 발명자들은 히알루론산 유도체 내의 카르복실기 치환율을 상기와 같은 범위로 조절하여 약물 전달체가 표적-비특이적 약효 장기 지속성을 지니도록 조절할 수 있었다.The present invention provides a target-nonspecific drug long-acting drug delivery agent comprising a hyaluronic acid (HA) derivative in which at least 45 mol% and less than 100 mol% of carboxyl groups are substituted according to another embodiment. As described above, the inventors of the present invention were able to adjust the rate of substitution of the carboxyl group in the hyaluronic acid derivative to such a range so that the drug delivery system has target-nonspecific drug long-term persistence.
특히, 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 세포 내 흡수 정도 관찰을 통해 카르복실기 치환율이 높게 나타나는 히알루론산 유도체는 세포 안으로 흡수되는 정도가 매우 적게 나타났는데, 이와 같은 결과를 토대로 상기와 같은 표적-비특이적 특성을 나타내는 약물전달체는 약효 장기 지속성 약물 전달체로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.In particular, the hyaluronic acid derivatives having high carboxyl substitution rate were observed to be absorbed into the cells very little by observing the degree of cellular uptake of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate. Drug delivery can be seen that can be used as a long-term drug delivery drug.
한편, 상기와 같은 약효 장기 지속성 약물 전달체에 봉입될 수 있는 유효 약물로는 탁솔, 독소루비신으로 이루어진 군을 포함하여, 화합물, 유전자 단백질로 이루어진 약물에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 상술한 예에 한정되지 않는다.On the other hand, the effective drug that can be encapsulated in the above-mentioned long-term long-acting drug carrier may be one or more selected from drugs consisting of compounds, gene proteins, including the group consisting of Taxol, doxorubicin, but is not limited to the above examples Do not.
한편, 상기와 같은 히알루론산 유도체를 포함하는 약물 전달체에 있어서, 상기 히알루론산 유도체 중 히알루론산의 분자량은 한정이 없으나, 약물 전달체로 이용하기 위해서는 10,000내지 4,000,000 달톤(Da)의 히알루론산을 사용할 수 있다. 상기와 같은 분자량을 갖는 히알루론산은 생체적합성이 뛰어나고, 손쉽게 구할 수 있다는 점에서 유리하다.Meanwhile, in the drug carrier including the hyaluronic acid derivative as described above, the molecular weight of hyaluronic acid in the hyaluronic acid derivative is not limited, but in order to use it as a drug carrier, hyaluronic acid of 10,000 to 4,000,000 Daltons (Da) may be used. . Hyaluronic acid having a molecular weight as described above is advantageous in that it is excellent in biocompatibility and can be easily obtained.
본 발명의 표적 특이성 조절 방법은 히알루론산 유도체의 카르복실기 치환율을 조절하여, 상기 유도체를 포함하는 약물 전달체를 표적 특이적 특성 또는 표적-비특이적 약효 장기 지속성을 갖도록 용이하게 조절 가능하다. 따라서, 상기한 방법에 따라 용이하게 목적에 맞는 약물 전달체를 구현할 수 있어, 본 발명의 표적 특이성 조절 방법 및 이에 이용되는 표적 특이적 약물 전달체 및 표적-비특이적 약효 장기 지속성 약물 전달체는 약물 전달체의 제조에 관한 산업 분야에 널리 유용하게 사용할 수 있다.The target specificity control method of the present invention can be easily adjusted to adjust the carboxyl group substitution rate of the hyaluronic acid derivative so that the drug carrier including the derivative has target specific properties or target-nonspecific drug long-term persistence. Accordingly, according to the above-described method, it is possible to easily implement a drug carrier that meets the purpose, so that the target specificity control method of the present invention and the target specific drug carrier and the target-nonspecific drug-effective long-term persistent drug carrier used therein are used for the preparation of the drug carrier. It can be widely used in related industrial fields.
이하, 발명의 다양한 실시예에 대해 설명하기로 한다. 다만, 이는 발명의 예 시로 제시되는 것으로, 이에 의해 발명의 권리 범위가 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, various embodiments of the present invention will be described. However, this is presented as an example of the invention, whereby the scope of the invention is not limited.
실시예Example 1: 히알루론산 유도체의 제조 1: Preparation of hyaluronic acid derivative
히알루론산 유도체의 카르복실기 치환율을 달리함에 따라 히알루론산 유도체의 표적 특이성을 조절할 수 있는지 알아보기 위해, 히알루론산의 카르복실기와 다양한 화합물을 결합시켜, 다양한 치환율을 갖는 히알루론산 유도체를 제조하였다. ADH, Dopamine, Tyramine, Iodoacetamide, HMDA, PDPH의 경우, 물을 용매로 하여, EDC, NHS 촉매하에서 히알루론산의 카르복실기를 치환하였고, AEMA, APMA, VS의 경우, HA-Tetrabutylammonium(TBA)를 제조한뒤, DMSO 상에서 (Benzotriazol-1-yloxy) tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP), N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) 촉매 존재 하에서 제조하였다.In order to determine whether the target specificity of the hyaluronic acid derivative can be adjusted by changing the substitution rate of the hyaluronic acid derivative, a hyaluronic acid derivative having various substitution rates was prepared by combining various compounds with the carboxyl group of the hyaluronic acid. In the case of ADH, Dopamine, Tyramine, Iodoacetamide, HMDA, and PDPH, water was used as a solvent, and the carboxyl group of hyaluronic acid was substituted under EDC and NHS catalysts. Subsequently, (Benzotriazol-1-yloxy) tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP), N, and N-diisopropylethylamine (DIPEA) catalysts were prepared on DMSO.
특히, 후술할 실시예들에서 히알루론산 유도체의 카르복실기의 치환율 조절에 따라 이들의 표적 특이성을 여러 가지 실시예를 통해 알아보기 위해서, 대표적으로 히알루론산-ADH(Adipic acid dihydrazide) 유도체를 준비하였다. 각각, 히알루론산 유도체의 치환율이 14, 22, 45, 70 mol %인 유도체를 반응물인 ADH의 농도를 각기 달리하여 제조하였다. In particular, the hyaluronic acid-ADH (Adipic acid dihydrazide) derivative was prepared in order to find out their target specificity through various examples according to the substitution rate of the carboxyl group of the hyaluronic acid derivative in the following examples. In each case, derivatives having substitution rates of 14, 22, 45, and 70 mol% of hyaluronic acid derivatives were prepared at different concentrations of the reactant ADH.
실시예Example 2 : 히알루론산 유도체- 2: hyaluronic acid derivative- 양자점Quantum dots 접합체의 합성 Synthesis of Conjugates
2-1: 히알루론산-2-1: hyaluronic acid ADHADH 유도체에 To derivatives 양자점을Quantum dots 접합한 히알루론산 유도체- Conjugated Hyaluronic Acid Derivatives- 양자점Quantum dots 접합체의 제조 Preparation of the conjugate
히알루론산 유도체의 카르복실기 치환율에 따라 각기 다른 표적 특이성을 나 타내는지 알아보기 위하여 각각 치환율이 다른 4가지 히알루론산-ADH(Adipic acid dihydrazide)(HA-ADH) 유도체를 상술한 실시예 1에 따른 방법으로 준비하였다. 실시예 1에 나타난 바와 같이, 준비된 히알루론산-ADH 유도체 4가지의 카르복실기 치환율은 각각 14, 22, 45, 70몰%였다. 상기와 같은 각기 다른 카르복실기 치환율을 갖는 히알루론산 유도체에 양자점을 각가 접합하여, 4가지의 다른 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 제조하였다. Four different hyaluronic acid-ADH (Adipic acid dihydrazide) (HA-ADH) derivatives having different substitution rates were used in the method according to Example 1 to determine whether the target specificity was different according to the carboxyl substitution rate of the hyaluronic acid derivative. Ready. As shown in Example 1, the carboxyl group substitution rates of the four prepared hyaluronic acid-ADH derivatives were 14, 22, 45, and 70 mol%, respectively. Four different hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugates were prepared by conjugating quantum dots to hyaluronic acid derivatives having different carboxyl group substitution rates as described above.
구체적으로, 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이, 히알루론산-ADH유도체는 1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC) 촉매 존재 하에, 히알루론산의 카르복실기를 ADH로 치환시키는 방법으로 준비되었다.Specifically, as shown in
한편, 하기 반응식 1의 (a)에서와 같이, EDC 촉매의 존재 하에, 카르복시기가 도입된 양자점과 N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (sulfo-NHS)를 결합하여, 양자점-NHS(Quantum dot-NHS)를 결합하였다. 이와 같이 준비된 양자점-NHS(Quantum dot-NHS)의 sulfo-NHS와 상기에서 준비된 히알루론산-ADH 유도체를 결합시켜, 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 준비하였다.On the other hand, as shown in (a) of
보다 구체적으로 히알루론산-ADH 유도체10nmol을 0.1M, pH 6.4의 인산염 완충액(phosphate buffer)에 녹였다. 10μL의 인산염 버퍼에 양자점, EDC 및 sulfo-NHS를 각각 0.2nmol, 400nmol, 1000nmol씩 녹인 후, 20분 동안 반응시켜서 양자점의 카르복실기(COOH)를 치환시키고, 카르복시기가 도입된 양자점과 sulfo-NHS를 결합시켰다. 그리고 나서, 1.4μL 의 2-mercaptoethanol을 넣고 2분간 반응시켜 남아있는 EDC를 비활성화 시켜, 양자점 용액을 준비하였다.More specifically, 10 nmol of the hyaluronic acid-ADH derivative was dissolved in phosphate buffer at 0.1 M and pH 6.4. Dissolve quantum dots, EDC and sulfo-NHS in 0.2 μmol, 400 nmol and 1000 nmol in 10 μL phosphate buffer, respectively, and react for 20 minutes to replace the carboxyl group (COOH) of the quantum dots, and combine the carboxyl group-introduced quantum dots with sulfo-NHS I was. Then, 1.4 μL of 2-mercaptoethanol was added and reacted for 2 minutes to deactivate the remaining EDC, thereby preparing a quantum dot solution.
마지막으로, 상기에서 준비된 히알루론산-ADH용액과 양자점 용액을 혼합한 후, 2시간 동안 반응시키고, 이 용액을 0.2μm PVDF 주사기 필터를 이용하여 완충액을 바꾼 PD-10 칼럼에 통과시켰다. 이때 365nm의 UV 램프를 이용하여 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 모아준 후, 냉장 보관하였다.Finally, the hyaluronic acid-ADH solution prepared above and the quantum dot solution were mixed, and then reacted for 2 hours, and the solution was passed through a PD-10 column in which buffer was changed using a 0.2 μm PVDF syringe filter. At this time, the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate was collected using a UV lamp of 365 nm, and then refrigerated.
반응식 1
상기와 같은 방법으로 준비된 실시예2의 4가지 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 이용하여, 하기와 같은 실험을 진행하였다.Using the four hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate of Example 2 prepared in the above manner, the following experiment was carried out.
2-2: 겔 전기영동법에 의한 히알루론산 유도체-2-2: Hyaluronic Acid Derivatives by Gel Electrophoresis 양자접Bilateral 접합체 합성 확인 Confirm conjugate synthesis
1) 실험 방법1) Experiment Method
상기와 같은 방법으로 제조된 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 합성여부를 확인하기 위해 겔 전기영동법을 사용하였다.Gel electrophoresis was used to confirm the synthesis of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate prepared as described above.
전기영동을 위한 기질로 사용하기 위해, 1.0 wt % 로 아가로스 겔을 붕산염 완충액(borate buffer) 에 녹였다. 양자점과 상기에서 제조된 히알루론산 유도체-양자점 접합체(HA-QDot)를 각각 4μL를 추출하여 2μL의 염료와 함께 섞은 후에 아가로스 겔 용기에 담았다. 이것을 50mM의 붕산염 완충액 (pH 8.98)에서 50분 동안 전극을 통해 50V를 인가하였다.For use as a substrate for electrophoresis, agarose gel was dissolved in borate buffer at 1.0 wt%. 4 μL of the quantum dot and the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate (HA-QDot) prepared above were extracted, mixed with 2 μL of dye, and placed in an agarose gel container. This was applied 50 V through the electrode for 50 minutes in 50 mM borate buffer (pH 8.98).
또한, 대조군으로 히알루론산-ADH 유도체, 히알루론산-ADH 유도체와 양자점을 단순 혼합한 시료 각각에 황녹색형광(fluorescein isothiocyanate: FITC)처리를 하여 함께 실험을 진행했다.In addition, a hyaluronic acid-ADH derivative, a hyaluronic acid-ADH derivative and a fluorescein isothiocyanate (FITC) treatment of each sample simply mixed with quantum dots were treated together.
2) 실험 결과2) Experiment result
상기 겔 전기영동법의 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 1번 라인에 표시된 것은 양자점(QDot)으로, 음극의 카르복실기에 의해 전기영동을 하는 동안 양극의 전극으로 이동하였다. 한편, 2번 라인에 표시된 대조군으로 설정한 FITC가 처리된 히알루론산-ADH유도체(FITC-HA)는 히알루론산 분자의 다분산에 의해 녹색의 넓은 띠가 나타났다. 한편, 3번 라인에 표시된 히알루론산-ADH 유도체와 양자점의 단순 혼합물에 FITC를 처리한 대조군(HA+QDot)은 붉은색의 양자점과 녹색의 FITC가 처리된 히알루론산-ADH이 각각 두 개로 분리된 띠 형태로 각각의 위치에 보였다.The results of the gel electrophoresis method are shown in FIG. 1. As shown in FIG. 1, the one marked on
한편, 4번 라인에 표시된 히알루론산 유도체-양자점 접합체(HA-QDot)의 경우에는 상대적으로 커진 입자들의 크기와 약해진 음극성으로 양극방향으로의 이동이 느려졌으며, 그 결과 히알루론산 유도체의 치환율에 따라서 넓은 띠 형태를 나타내 었고, 양자점과 같은 붉은 색을 나타내었다.On the other hand, in the case of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate (HA-QDot) shown in line 4, the movement of the hyaluronic acid derivative in accordance with the substitution rate of the hyaluronic acid derivative was slowed due to the size of the larger particles and the weaker negative polarity. It showed a wide band shape and showed the same red color as the quantum dot.
상기와 같은 겔 전기영동의 결과로부터 히알루론산-ADH 와 양자점이 성공적으로 접합되었다는 것을 알 수 있었다.As a result of the gel electrophoresis, it was found that the hyaluronic acid-ADH and the quantum dot were successfully conjugated.
실시예Example 3: 3: 히알루론산 유도체-Hyaluronic Acid Derivatives- 양자점Quantum dots 접합체의 세포 내 흡수 정도 관찰 Observation of Intracellular Uptake of Conjugates
카르복실기 치환율을 달리한 히알루론산 유도체의 세포 내 흡수 정도를 관찰하기 위해, 상기 실시예 2에 따라 준비된 각각 4 가지의 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 준비하였다.In order to observe the degree of cellular uptake of hyaluronic acid derivatives having different carboxyl substitution rates, four hyaluronic acid derivatives-quantum dot conjugates prepared according to Example 2 were prepared.
세포 내 흡수 정도를 알아보기 위해, B16F1 세포를 사용하였는데, B16F1 세포는 CD44 나 LYVE-1과 같은 히알루론산에 대한 수용체(receptor)를 가지고 있어서, 상기 세포를 사용하여 히알루론산의 세포 내의 이물 흡수(endocytosis)정도를 관찰 할 수 있었다. 이때, B16F1세포의 세포 내 이물 흡수와 관련되는 것은 히알루론산의 카르복실기이다.B16F1 cells were used to determine the degree of intracellular uptake. B16F1 cells have a receptor for hyaluronic acid, such as CD44 or LYVE-1. the degree of endocytosis was observed. At this time, the carboxyl group of hyaluronic acid is related to the foreign body uptake of B16F1 cells.
히알루론산 유도체-양자점 접합체의 전구체인 히알루론산-ADH유도체의 경우 히알루론산의 카르복실기에 ADH가 결합을 하는 것이므로, 히알루론산의 카르복실기의 ADH에 의한 치환율에 따라 히알루론산 수용체에 의한 세포 내 이물 흡수 정도가 달라질 것을 예상할 수 있다.In the case of the hyaluronic acid-ADH derivative, which is a precursor of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate, ADH binds to the carboxyl group of hyaluronic acid. It can be expected to vary.
이를 확인하기 위해 B16F1세포를 흡착시킨 세포 배양 슬라이드에 ADH에 의한 카르복실기의 치환율이 각기 다른 히알루론산-ADH 유도체로 합성된 각각의 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 넣고 공초점 주사 현미경으로 확인하였다.To confirm this, each hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate synthesized with hyaluronic acid-ADH derivatives having different substitution rates of carboxyl groups by ADH was inserted into a cell culture slide to which B16F1 cells were adsorbed, and confirmed by confocal scanning microscopy.
1) 세포 배양 및 히알루론산 유도체-1) Cell Culture and Hyaluronic Acid Derivatives- 양자점Quantum dots 접합체의 주입 Injection of conjugates
구체적으로, B16F1을 10%의 fetal bovine serum (FBS) 와 1%의 항생제(penicillin)가 첨가된 Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM)에서 배양하였다. 세포 배양 슬라이드에 poly-D-lysine(0.1mg/mL의 농도로 100μL)을 코팅한 후 1시간 동안 CO2 세포배양기에 보관하여 세포의 흡착도를 향상시켰다. 살균처리 된 증류수로 세척한 후에 무균 작업대(clean bench)에서 건조시킨 후, 세포 배양 슬라이드 각각의 용기에 1 × 104씩의 세포를 담았다.Specifically, B16F1 was incubated in Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% antibiotic (penicillin). Poly-D-lysine (100 μL at a concentration of 0.1 mg / mL) was coated on the cell culture slides and stored in a CO 2 cell incubator for 1 hour to improve cell adsorption. After washing with sterile distilled water and drying on a sterile bench, each cell culture slide contained 1 × 10 4 cells.
용기에 배지를 넣어준 상태에서 37℃ 와 5%의 CO2 환경에서 3일 동안 배양한 후, 배지를 FBS가 1% 첨가된 DMEM으로 교체하였다. 이후에 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 최종 농도가 5nM이 되도록 배양 슬라이드에 첨가해준 후에, PBS에 4% 농도로 paraformaldehyde를 처리하여 세포들을 고정하고, PBS로 두 번 더 세척 하였다.After culturing for 3 days at 37 ° C. and 5% CO 2 with the medium in the container, the medium was replaced with DMEM with 1% FBS. Thereafter, the final concentration of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate was added to the culture slide, and then treated with paraformaldehyde at 4% concentration in PBS to fix the cells and washed twice with PBS.
한편, 상기 실험에 사용된 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 전구체인 히알루론산-ADH유도체에서 카르복실기의 치환율(ADH의 성분비)은 상술한 바와 같이 각각 14, 22, 45, 70 mol %였으며, 사용된 양자점의 방출 파장대역은 650nm였다.Meanwhile, in the hyaluronic acid-ADH derivative which is a precursor of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate used in the above experiment, the substitution rate of the carboxyl group (component ratio of ADH) was 14, 22, 45, and 70 mol%, respectively, as described above. The emission wavelength band of was 650 nm.
2) 히알루론산 유도체-2) Hyaluronic Acid Derivatives- 양자점Quantum dots 접합체의 세포 내 흡수 정도 관찰 Observation of Intracellular Uptake of Conjugates
도 2는 B16F1 세포에 양자점, 각기 다른 ADH의 치환율을 갖는 히알루론산- ADH와 양자점을 접합한 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 2시간 동안 배양시킨 후, 공 초점 주사 현미경으로 촬영한 이미지(scale bar=15μm)를 나타낸 것이다. 광원은 532nm의 아르곤 레이저가 사용되었으며, 세포 안의 형광은 긴 경로의 방출 필터를(long-pass emission filter, cutoff = 650nm) 통해 영상화한 것이다.2 is a hyaluronic acid derivative having a substitution rate of quantum dots and different ADHs in B16F1 cells, and a hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate conjugated to quantum dots for 2 hours, and then taken by a confocal scanning microscope (scale bar = 15 μm). The light source used an 532 nm argon laser and the fluorescence in the cell was imaged through a long-pass emission filter (cutoff = 650 nm).
도 2a는 14몰% ADH로 치환된 히알루론산-ADH가 접합된 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 공 초점 주사 현미경 사진이다. 도 2a에서 볼 수 있는 바와 같이, 히알루론산 유도체-양자점 접합체가 세포 안으로 선명하게 잘 들어간 것이 확인되었다. FIG. 2A is a confocal scanning micrograph of a hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate conjugated with a hyaluronic acid-ADH substituted with 14 mol% ADH. FIG. As can be seen in Figure 2a, it was confirmed that the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate clearly entered the cells.
한편, 도 2b는 치환율이 각기 다른 히알루론산-ADH로 접합된 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 공 초점 주사 현미경 사진이다. 도 2b에서 볼 수 있는 바와 같이, 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 전구체인 히알루론산-ADH에서 ADH의 치환율이 높아질수록 형광의 정도가 낮아지는 것을 알 수 있다. ADH의 치환율이 45, 70 mol %의 경우 14, 22 mol %의 경우에 비해 세포 안으로 흡수되는 정도가 매우 적은 것을 알 수 있었다.2B is a confocal scanning micrograph of a hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate conjugated with hyaluronic acid-ADH having different substitution rates. As can be seen in Figure 2b, it can be seen that the higher the substitution rate of ADH in the hyaluronic acid-ADH precursor of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate, the lower the degree of fluorescence. The substitution rate of ADH was 45, 70 mol%, the degree of absorption into the cell is less than that of 14, 22 mol%.
한편, 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 세포 내 흡수 정도를 정량화하여 그래프로 표시한 것이 도 3이다. 히알루론산 유도체-양자점 접합체가 주입된 세포 배양 용기를 ADH에 의한 카르복실기의 치환율에 따라 각각 4개씩 준비하여 형광 세기를 측정하고 평균을 내었다. 도 3에서도, 히알루론산의 치환 정도가 증가할수록 히알루론산의 세포 내 이물 흡수 정도가 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있다. ADH의 성분비(즉, ADH에 의한 카르복실기의 치환율)가 22 mol %에서 45 mol %로 2 배 증가 했을 때, 형광 세기는 대략 6472에서 1658로 4배 감소하였다. 이러한 결과는 히알루론산 수용체와 히알루론산이 3개 이상의 카르복실기를 매개로 결합한다는 이론을 설명해주는 것이다. On the other hand, Figure 3 is a graphical representation of the degree of intracellular uptake of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate. Four cell culture vessels in which the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate was injected were prepared according to the substitution rate of the carboxyl group by ADH, and the fluorescence intensity was measured and averaged. 3, it can be seen that as the degree of substitution of hyaluronic acid increases, the degree of foreign body uptake of hyaluronic acid rapidly decreases. When the component ratio of ADH (that is, the substitution rate of carboxyl groups by ADH) was increased by 2 times from 22 mol% to 45 mol%, the fluorescence intensity decreased 4 times from approximately 6472 to 1658. These results explain the theory that the hyaluronic acid receptor and hyaluronic acid bind three or more carboxyl groups.
3) 세포에 히알루론산을 먼저 배양하고, 히알루론산 유도체-3) Incubating hyaluronic acid in the cell first, hyaluronic acid derivative- 양자점Quantum dots 접합체를 배양한 경우의 히알루론산 유도체- Hyaluronic Acid Derivatives When Cultured Conjugates- 양자점Quantum dots 접합체의 세포 내 흡수 정도 관찰 Observation of Intracellular Uptake of Conjugates
한편, 세포에 히알루론산을 먼저 배양시킨 후, 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 배양시킨 경우, 히알루론산 수용체에 대한 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 세포 내 이물 흡수정도가 감소하고, 형광의 세기 또한 감소하는 것을 확인하였다(도3의 빨간 막대 그래프). 히알루론산 및 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 세포 내 배양 시간은 1시간으로 같게 하였다.On the other hand, when the hyaluronic acid incubated in the cell first, followed by culturing the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate, the degree of foreign body uptake of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate to the hyaluronic acid receptor decreases and the intensity of fluorescence also decreases. It was confirmed (red bar graph of Figure 3). The intracellular incubation time of hyaluronic acid and hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate was equal to 1 hour.
도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 세포에 히알루론산을 먼저 배양시켰을 때의 감소하는 형광의 세기는 ADH에 의한 카르복실기의 치환율이 45, 70 mol % 일때 보다 14, 22 mol % 일 때 더 크게 나타난다. 상기와 같은 결과로부터 히알루론산의 카르복실기의 치환율이 수용체를 매개로 한 세포 내 이물 흡수에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다. As can be seen in Figure 3, the decrease in the intensity of fluorescence when hyaluronic acid is first incubated in the cells is greater when the substitution rate of the carboxyl group by ADH is 14, 22 mol% than 45, 70 mol%. From the above results, it was found that the substitution rate of the carboxyl group of hyaluronic acid influences the uptake of foreign substances through the receptor.
실시예Example 4: 4: 생체내In vivo ( ( inin vivovivo ) 히알루론산 유도체-) Hyaluronic Acid Derivatives- 양자점Quantum dots 접합체의 영상화 Imaging of Conjugates
생체 내에 약물 전달의 유효성을 실험하기 위해, 생체 조건 안(in vivo)에서 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 세포 내 이물 흡수(endocytosis) 정도를 실험 하였다. 이를 위해, ADH에 의한 카르복실기의 치환율이 각각 35, 68 mol %인 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 준비하여 발광 이미지 분석기(luminescent image analyzer)로 실험 쥐의 이물 흡수(endocytosis) 정도를 확인하였다.In order to test the efficacy of drug delivery in vivo, the degree of intracellular foreign uptake of hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate was tested in vivo. To this end, a hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate having a substitution rate of 35 to 68 mol% of the carboxyl group by ADH was prepared, and the degree of endocytosis of the rats was confirmed by a luminescent image analyzer.
가시광선은 7-10 mm 의 생체의 투과도를 가지는 반면에 자외선은 5-6 cm 의 높은 투과도를 가지는 점을 고려하여, in vivo 실험에는 방출 파장이 800 nm (적외선)인 것을 사용하였다. 참고로, 상기 in vitro 실험에서는 방출 파장이 650 nm (가시광선)인 것을 사용하였다.In view of the fact that visible light has a transmittance of 7-10 mm while ultraviolet light has a high transmittance of 5-6 cm, an in vivo experiment used an emission wavelength of 800 nm (infrared). For reference, in the in vitro experiment, an emission wavelength of 650 nm (visible light) was used.
ADH에 의한 카르복실기의 치환율이 35 mol% 와 68 mol%인 히알루론산 유도체-양자점 접합체 (150μL, 약 0.01 nmol)를 준비하였다. 평균적으로 8주령 쥐(Nude mouse)의 꼬리에 정맥 주사를 (tail-vein injection) 주사하고 6분, 6시간, 및1일의 시간이 지난 후에 발광 이미지 분석기를 이용해 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 형광을 측정하였다.A hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate (150 μL, about 0.01 nmol) having a substitution rate of 35 mol% and 68 mol% of carboxyl groups by ADH was prepared. On average, 6 minutes, 6 hours, and 1 day after intravenous tail-vein injection into the tail of 8-week-old mice, the fluorescence of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate was measured using a luminescent image analyzer. Was measured.
또한, 정맥 주사 후 하루가 지난 이후에 쥐의 간, 비장, 간을 적출하여 영상 분석기를 사용해 분석하였다. 이때 사용된 광원은 625 nm의 필터를 가진 할로겐 램프였으며 790nm 의 방출 필터를 통해서 얻어진 형광 이미지를 분석하였다. 대조군으로는 같은 몰의 비율로 방출 파장이 800nm인 양자점을 정맥주사 하였다.In addition, one day after intravenous injection, the liver, spleen and liver of the rats were extracted and analyzed using an image analyzer. The light source used was a halogen lamp with a filter of 625 nm, and the fluorescent image obtained through the emission filter of 790 nm was analyzed. As a control, quantum dots with an emission wavelength of 800 nm were injected intravenously at the same molar ratio.
도 4는 쥐의 꼬리에 정맥 주사를 놓은 6분 뒤에 촬영한 형광 사진이다. 양자점에 비해서 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 형광이 각 장기에 오래 남아 센 형광을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 또한 ADH에 의한 카르복실기의 치환율이 35mol%인 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 형광은 간에 집중되어 있는 것을 확 인할 수 있다. 카르복실기의 치환율이 68mol%의 경우, 35mol%에 비해서는 전체적으로 형광이 쥐의 온 몸에 잘 퍼져있었으며, 대부분의 형광이 간에 집중이 되어 있지만, ADH의 치환율이35mol%인 히알루론산 유도체-양자점 접합체와 비교하였을 때, 그 정도가 약했다. 한편, 비장과 신장에서는 ADH에 의한 카르복실기의 치환율이 68mol%인 히알루론산 유도체-양자점 접합체가, ADH에 의한 카르복실기의 치환율이 35mol%인 히알루론산 유도체-양자점 접합체보다 형광이 더 세게 분포하는 것을 확인할 수 있다.4 is a fluorescence photograph taken 6 minutes after the intravenous injection into the tail of the rat. It can be seen that the fluorescence of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate shows long-lasting fluorescence in each organ compared to the quantum dot. In addition, it can be confirmed that the fluorescence of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate in which the substitution rate of the carboxyl group by ADH is 35 mol% is concentrated in the liver. When the substitution rate of the carboxyl group was 68 mol%, the fluorescence was more widely spread throughout the rat than the 35 mol%, and most of the fluorescence was concentrated in the liver, but the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate having the substitution rate of 35 mol% of ADH In comparison, the degree was weak. On the other hand, in the spleen and kidney, it can be seen that the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate having a substitution rate of carboxyl group by ADH is 68 mol%, and the fluorescence distribution is stronger than that of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate having 35 mol% substitution rate of carboxyl group by ADH. have.
한편, 도 5a은 도 4에서 실험한 쥐에게 양자점, ADH 에 의한 카르복실기 치환율이 35몰%인 히알루론산 유도체-양자점 접합체, 및 ADH에 의한 카르복실기 치환율이 68몰%인 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 주입하고 하루가 지난 뒤에 쥐의 간, 비장, 신장을 적출한 뒤에 촬영한 형광사진이다. 비장이나 신장에 비해 간에서의 형광의 세기가 매우 강하게 나타났고, 이런 현상은 ADH의 치환율이 낮은 히알루론산 유도체-양자점에서 더 크게 나타났다.On the other hand, Fig. 5a is a quantum dot, a hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate having a carboxyl group substitution rate of 35 mol% by ADH, and a hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate having a carboxyl group substitution rate of 68 mol% by ADH is injected into the mice tested in FIG. After one day, the liver, spleen, and kidneys of the rat were extracted and taken with fluorescence. The intensity of fluorescence in the liver was much stronger than that of the spleen or kidney, and this phenomenon was more pronounced at the hyaluronic acid derivative-quantum point with lower substitution rate of ADH.
도 5b은 region-of-interest(ROI) 방법을 이용한 상대적인 형광 세기 분석법을 이용해 실험 쥐의 간에서 양자점, ADH에 의한 카르복실기 치환율이 35몰%인 히알루론산 유도체-양자점 접합체, 및 ADH 에 의한 카르복실기 치환율이 68몰%인 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 형광 강도를 측정한 것이다. 양자점 단독의 경우보다, 히알루론산 유도체-양자점 접합체에서 형광 강도가 더 크게 나타났으며, ADH에 의한 카르복실기 치환율이 35몰%인 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 간에서의 형광 강도가 치환율이 높은 접합체(ADH에 의한 카르복실기 치환율이 68%인 히알 루론산 유도체-양자점 접합체)보다 크게 나타났다.5B is a quantum dot, hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate having 35 mol% carboxyl substitution rate by ADH, and carboxyl substitution rate by ADH using relative fluorescence intensity analysis using region-of-interest (ROI) method. The fluorescence intensity of this 68 mol% hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate was measured. In the case of the quantum dots alone, the fluorescence intensity was higher in the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate, and the fluorescence intensity in the liver of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate in which the carboxyl substitution rate was 35 mol% by ADH was higher. The carboxyl substitution rate by ADH was greater than that of hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate (68%).
이를 통해, 수용체를 매개로 하는 세포와 히알루론산 유도체-양자점 접합체와의 연결이 히알루론산 유도체의 카르복실기 치환 정도에 의존한다는 것을 확인할 수 있다. Through this, it can be confirmed that the connection between the receptor-mediated cell and the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate depends on the degree of carboxyl substitution of the hyaluronic acid derivative.
실시예Example 5: 간 질환 표적 특이적 전달 5: Liver Disease Target Specific Delivery
히알루론산-ADH유도체의 카르복실기 치환율에 따라 목적에 맞는 약물전달 시스템에의 적용 가능성 여부를 실험하기 위해, 실험 쥐의 간경화모델에서 히알루론산 약물전달체의 표적 특이적 전달을 적용하였다. To test the applicability of the hyaluronic acid-ADH derivative to the desired drug delivery system according to the carboxyl substitution rate, the target specific delivery of the hyaluronic acid drug carrier was applied in the liver cirrhosis model of the experimental rat.
사염화탄소(CCl4)를 이용하여 쥐에 간경화 모델을 만들고, 카르복실기 치환율이 25mol%인 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 쥐의 꼬리에 정맥 주사하여 간경화 표적 특이적 전달 실험을 실시하였다. 대조군으로는, 정상 쥐에 카르복실기 치환율이 5mol%의 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 쥐의 꼬리에 정맥 주사를 하였다. A liver cirrhosis model was made in rats using carbon tetrachloride (CCl 4 ), and a liver cirrhosis target specific delivery experiment was performed by intravenously injecting a hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate having a carboxyl substitution rate of 25 mol% to the tail of the rat. As a control group, a hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate having a carboxyl substitution rate of 5 mol% was injected intravenously into the tail of a normal rat.
도 6은 간경화 모델에서 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 이용하여 생체 영상을 수행한 결과이다. 도 6a에 나타난 바와 같이, 간경화 모델에서 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 형광이 세고, 더 오래 지속된다는 사실을 확인하였다. 쥐의 꼬리에 정맥 주사를 한 후, 3일 뒤에 각 장기를 해부해서 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 형광을 측정하여 도 6b에 나타내었다. 도 6b에 나타난 바와 같이, 간경화 모델에서의 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 형광이 정상 쥐 모델에 비해 월등히 세게 발하는 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로, 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 이용하여 성공적으로 간질환 모델 바이오 영상을 수행할 수 있었다. FIG. 6 shows the results of biopsies using a hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate in a liver cirrhosis model. As shown in FIG. 6A, it was confirmed that the fluorescence of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate was strong and lasted longer in the cirrhosis model. After intravenous injection into the tail of the rat, each organ was dissected three days later, and the fluorescence of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate was measured and shown in FIG. 6B. As shown in FIG. 6B, the fluorescence of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate in the liver cirrhosis model was confirmed to be much stronger than that of the normal rat model. As a result, it was possible to successfully perform liver disease model bioimaging using a hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 전기영동 결과를 나타낸 것이다. Figure 1 shows the results of electrophoresis of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate according to an embodiment of the present invention.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 유도체-양자점 접합체의 B16F1세포 내 흡수 정도를 나타내는 공초점 현미경을 이용한 이미지 이다. Figure 2a is an image using a confocal microscope showing the degree of absorption in the B16F1 cells of the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate according to an embodiment of the present invention.
도 2b는 B16F1 세포에 양자점, 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 2시간 동안 배양시킨 후, 공 초점 주사 현미경으로 촬영한 이미지이다.2B is an image taken by confocal scanning microscopy after incubating the quantum dot and hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate for 2 hours in B16F1 cells.
도 3는 양자점, 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 2시간 동안 배양시킨 후, 형광의 세기를 간단히 비교하여 나타낸 그래프이다. Figure 3 is a graph showing the quantum dots, hyaluronic acid derivatives-quantum dot conjugate after incubation for 2 hours, a brief comparison of the intensity of fluorescence.
도 4는 쥐의 꼬리에 양자점, 히알루론산 유도체-양자점 접합체 (ADH에 의한 치환율 각각35mol%, 68mol%)의 정맥 주사를 놓은 후, 6분 뒤에 촬영한 형광 사진이다. 4 is a fluorescence photograph taken 6 minutes after intravenous injection of a quantum dot and a hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate (35 mol% and 68 mol%, respectively, substitution rate by ADH) in a rat's tail.
도 5a는 쥐의 꼬리에 양자점, 히알루론산 유도체-양자점 접합체 (35mol%, 68mol%)의 정맥 주사를 놓은 후, 하루가 지난 뒤에 쥐의 간, 비장, 신장을 적출한 뒤에 촬영한 형광사진이다. Figure 5a is a fluorescence picture taken after the liver, spleen, kidney of the rat after one day after intravenous injection of quantum dots, hyaluronic acid derivatives-quantum dot conjugate (35 mol%, 68 mol%) in the tail of the rat.
도 5b는 ROI (region-of-interest) 방법을 이용한 상대적인 형광 세기 분석법을 이용해 간에서, 양자점 및 히알루론산 유도체-양자점 접합체(ADH에 의한 카르복실기 치환율이 각각35mol%, 68mol%)의 형광 강도를 측정한 것이다. Figure 5b is measured the fluorescence intensity of the quantum dots and hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate (35 mol%, 68 mol% carboxyl substitution rate by ADH, respectively) in the liver using the relative fluorescence intensity analysis method using the region-of-interest (ROI) method It is.
도 6a는 정상 쥐와 간경화 모델 쥐에게 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 주입하고 시간에 따라 변화하는 형광을 촬영한 사진이다. FIG. 6A is a photograph of a hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate injected into a normal rat and a cirrhosis model rat, and photographing fluorescence that changes with time.
도 6b는 정상 쥐와 간경화 모델 쥐에게 히알루론산 유도체-양자점 접합체를 주입하고 사흘이 지난 뒤에 쥐의 간, 비장, 신장을 적출한 뒤에 촬영한 형광사진이다. FIG. 6B is a fluorescence photograph taken after the hyaluronic acid derivative-quantum dot conjugate was injected to normal rats and liver cirrhosis model rats, and three days after the liver, spleen and kidneys of the rats were extracted.
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Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20110613 Patent event code: PE09021S01D |
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| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20120220 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20110613 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |