KR20100135260A

KR20100135260A - 올레오좀으로부터 활성 약제의 방출 조절

Info

Publication number: KR20100135260A
Application number: KR1020107023149A
Authority: KR
Inventors: 제이콥 구트; 존 퍼구손
Original assignee: 셈바이오시스 제네틱스 인코포레이티드
Priority date: 2008-04-11
Filing date: 2009-04-10
Publication date: 2010-12-24
Also published as: BRPI0910878A2; EP2274015A2; MX2010011105A; CA2720755A1; JP2011516548A; EA201071166A1; CN102026663A; AU2009234384A1; WO2009126301A2; AU2009234384A8; US20110081386A1; IL208481A0; NZ588441A; WO2009126301A3

Abstract

다가 알콜과 같은 방출 조절제를 사용하여 올레오좀을 제제화함으로써 올레오좀으로부터 활성 약제의 방출율을 조절할 수 있다. 이와 관련하여, 활성 약제를 함유하는 올레오좀은 국소용 제제를 비롯하여 다양한 제제에 사용될 수 있다.

Description

올레오좀으로부터 활성 약제의 방출 조절{CONTROLLED RELEASE OF ACTIVE AGENTS FROM OLEOSOMES}

본 발명은 올레오좀(oleosome)으로 이루어진 신규 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 특히 인체 표면적에 국소 적용하기 위한 제품을 제조하는데 유용하다.

팜유, 해바라기유 및 평지씨(캐놀라)유와 같은 식물 종자유는 전 세계적으로 다양한 산업 및 영양적 용도를 갖는 주요 농산물이다. 미국에서만도 매년 150억 파운드가 넘는 식물 종자유가 생산되고 있다[참조: Wallis J., et al, "Seed oils and their metabolic engineering," in: SEED TECHNOLOGY AND ITS BIOLOGICAL BASIS, M. Black & J.D. Bewley (eds.), Sheffield Biological Sciences (2000)]. 미국에서 생산되는 식물 종자유의 98%는 예컨대 조리용 기름 및 마아가린 제조에 사용되는 것과 같이 영양 목적으로 사용된다. 나머지 식물유들은 비누, 가소제, 중합체, 계면활성제 및 윤활유와 같은 공업 제품을 제조하는데 원료로 사용된다.

식물유는 트리아실글리세롤, 즉 각 하이드록실 그룹이 지방산으로 에스테르화되는 글리세롤 부분이다. 트리아실 글리세롤의 글리세롤 백본은 구조가 변하지 않으나, 글리세롤에 결합된 지방산은 식물유에 따라 상당히 변한다.

지방산 구조는 식물유의 물리화학적 성질을 결정한다. 예를 들어, 종종 "불포화도"로 언급되기도 하는 변수로서 지방산의 이중결합 수는 기름의 융점에 영향을 미치는데 반해, 지방산의 사슬 길이는 그의 점도, 윤활성 및 용해도에 영향을 미친다.

트리아실글리세롤 분자는 수성 환경에 불용성이고, 유적으로 합쳐지려는 경향이 있다. 이들 수불용성 트리아실글리세롤을 저장하기 위해서, 식물에는 식물 종자 세포내에 "유체(oil body)" "올레오좀," "지방체" 및 "스페로솜"(총괄적으로 "올레오좀")으로서 다양하게 알려진 직경 약 1 내지 10 μm의 독특한 종자유 저장 구획이 생겨났다[참조: Huang, Ann. Rev. Plant Mol. Biol. 43: 177-200 (1992)]. 식물유 외에, 이들 올레오좀은 인지질 및 당업계에서 유체 단백질로 불리는 일종의 단백질로 이루어진 두가지 화학 성분을 포함한다. 구조적 관점에서 보면, 올레오좀은 인지질 단위막 반으로 둘러싸인 트리아실글리세롤 코어로서, 그 안에 유체 단백질이 들어 있다. 유체 단백질은 올레오좀이 더 큰 유적으로 합체되지 못하도록 방지하는 작용을 할 것으로 판단된다.

식물유를 추출하는 경우, 종자를 파쇄하거나 압착한 다음, 전형적으로 유기 용매의 사용을 포함하는 공정을 이용하여 정제함으로써 종자 단백질 및 탄수화물과 같은 다른 종자 성분으로부터 식물유를 분리하게 된다. 예를 들어, 엠봉(Embong) 및 젤렌(Jelen)에 의한 문헌[Can. Inst. Food Sci. Techn. J. 10: 239-43 (1977)]에 기술된 바와 같이, 비유기 용매를 기반으로 한 식물유 추출 방법이 또한 개발되었다.

이들 추출 공정의 일차 목적은 순수한 식물유를 얻는 것이기 때문에, 이들 공정에서는 전형적으로 올레오좀 구조가 파괴된다. 즉, 식물유로부터 제조된 통상의 조성물은 일반적으로 원형 그대로의 올레오좀을 포함하지 않는다.

예를 들어, 보울터리(Voultoury) 등에 의한 미국 특허 제5,683,740호 및 제5,613,583호에는 지질 소포를 포함하는 유지 식물의 파쇄 종자로부터 제조된 에멀젼이 개시되었다. 이들 특허에 기술된 파쇄 공정 과정에서, 올레오좀은 그의 구조적 완전성을 실질적으로 잃게 된다. 따라서, 파쇄 공정에서 종자유의 70% 내지 90%가 유리 오일(free oil) 형태로 방출된다.

한편, 구조적으로 온전한 형태로 식물 종자로부터 분리된 올레오좀은 실용성이 있는 것으로 인식되어 있다. 특히, 올레오좀은 외래 유화제의 부재하에 실온에서 수성 화합물 및 오일의 복합 혼합물이 형성되도록 할 수 있고(참조: 구트(Guth) 등에 의한 PCT 출원 제2005/097059호), 머레이(Murray) 등에 의한 PCT 출원 제2005/030169호에 기술된 바와 같이, 올레오좀에 활성 성분이 로딩될 수 있다.

올레오좀을 비파괴적으로 제조하는 방법이 덱커스(Deckers) 등에 의한 미국 특허 제6,146,645호, 제6,183,762호, 제6,210,742호, 제6,372,234호, 제6,582,710호, 제6,596,287호, 제6,599,513호 및 제6,761,914호(총괄하여 "덱커스 특허")에 기술되어 있다. 덱커스 특허에 따르면, 정제된 올레오좀 제제를 얻을 수 있고, 이를 이용하여 목적하는 유화, 점도 및 외관 균형을 이루기 위해 다른 다수의 물질 존재하에 에멀젼을 제조할 수 있으며, 이들 에멀젼은 특히 화장품, 식품, 약제, 공업적 적용에 적합하다.

보통 활성 성분을 함유하는 올레오좀을 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 제제는 PCT 출원 제2005/030169호에 기술된 바와 같이, 활성 성분을 올레오좀과 혼합하거나, 또는 활성 성분을 올레오좀에 선택적으로 분배시키는 최적화 방법을 이용함으로써 수득할 수 있다. 여러가지 이유로 해서, 올레오좀에 활성 성분을 캡슐화하는 것이 유리하다. 예를 들어, 전통적으로 불안정한 활성 성분의 안정화 뿐만 아니라, 상호 접촉시 해로운 약제들을 분리하는 것이 가능하다.

이렇게 해서 얻은 활성 성분을 포함하는 올레오좀 제제는 최종 제제를 제조하기 위한 성분으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 피부에 적용하거나 섭취하는데 상기 최종 제제를 사용하게 되면 올레오좀 구조의 파괴로 활성 성분이 방출하게 될 것이다.

이 경우에는, 올레오좀으로부터 활성 약제(들)의 방출을 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 주어진 조성물에서 올레오좀은 올레오좀 제제에 내재된 방출 프로파일만을 제공하며, 이는 전형적으로 올레오좀 전달시 활성제의 비교적 신속한 방출을 수반한다.

약제 및 그밖의 다른 것에서, 이러한 신속한 방출에 이은 활성제 방출율의 급격한 저하는 준최적 활성제 전달을 나타낸다. 대신, 활성 성분을 보다 점차적으로 서서히 방출하는 것이 바람직한 경우가 종종 있다.

통상적인 올레오좀 제제는 구성 올레오좀으로부터 활성 성분의 방출을 선택적으로 조절할 수 없다. 다시 말해, 올레오좀으로부터 활성 성분의 방출 동태를 가변 적용시킬 수 없어서, 최적의 방출 동태를 이루기 위해서는 활성 성분의 성질 변화와 활성 성분의 작용 개시 및 기간차가 고려되어야 한다.

이용가능한 방법에서 이와 같은 단점으로 인해, 활성제를 함유라는 올레오좀 조성물을 다른 방식으로 제조하는 것이 필요하다. 특히, 구성 활성 약제의 방출을 조절하는 올레오좀 제제를 어떠한 방식으로 수득할 수 있는지, 또는 심지어는 이를 수득할 수 있는지 조차도 확실치가 않다.

발명의 개요

본 발명은 올레오좀을 포함하는 신규 제제를 제공한다. 본 발명의 제제는 올레오좀으로부터 활성 약제의 방출을 조절할 수 있는 시스템을 제공한다.

따라서, 본 발명은

(i) 캡슐화된 활성 약제 및 방출 조절제를 포함하는 올레오좀 제제를 제공하는 단계; 및

(ii) 상기 올레오좀 제제를 표면에 적용하여 활성 약제가 올레오좀 제제로부터 방출되도록 하는 단계를 포함하는,

올레오좀으로부터 활성 약제를 방출시키는 방법을 포함한다.

바람직한 구체예에 있어서, 방출 조절제가 존재하는 경우 올레오좀으로부터 활성 약제의 평균 방출 속도는, 방출 조절제 부재시 활성 약제의 평균 방출 속도와 비교할 경우 적어도 15% 미만이다. 평균 방출 속도는, 예를 들면 후술하는 바와 같이 헥산 추출로 측정될 수 있다.

다른 바람직한 구체예에 있어서, 방출 조절제는 다가 알콜이다. 바람직하게, 다가 알콜은 비방향족 디올, 비방향족 트리올 또는 비방향족 폴리올 또는 비할로겐화 다가 알콜이다. 특히 바람직한 구체예에 있어서, 방출 조절제는 글리세린 또는 PEG이다.

본 발명에 사용될 수 있는 활성 약제는 다양하고, 목적하는 것에 따를 수 있다. 일반적으로, 본 발명과 관련하여 "활성 약제"는 생물체에 전달된 경우, 약리 효과를 예로 들 수 있으나, 이로 한정되지는 않는 검출가능한 생물학적 효과를 발휘한다.

다수의 올레오좀 제제내에 분산된 다양한 방출 조절제의 농도에서 활성제의 방출 동태를 측정하여, 특히 목적하는 방출 동태를 갖는 올레오좀 제제를 얻도록 활성 약제의 방출 조절 동태를 최적화할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 활성 약제의 방출 동태가 최적화된, 활성 약제로 이루어진 올레오좀 제제를 수득하는 방법을 구상한다. 본 발명의 방법은

(i) 각각 활성 약제 및 방출 조절제를 포함하고, 방출 조절제의 농도는 다수의 제제마다 달라지는 다수의 올레오좀 제제를 제조하는 단계,

(ii) 각 올레오좀 제제에서 활성 약제의 방출 동태를 결정하는 단계; 및

(iii) 다수의 올레오좀 제제로부터 활성 약제 방출 동태가 최적화된 올레오좀 제제를 선택하는 단계를 포함한다.

다른 측면으로, 본 발명은 그밖에 (i) 올레오좀; (ii) 활성 약제; 및 (iii) 방출 조절제를 포함하는 신규 조성물을 제공한다.

본 발명에 따라 수득된 올레오좀 제제는 여러가지 제품, 예컨대 그중에서도 특히, 화장품, 식품, 농산물, 가정용품, 잉크, 코팅제, 페인트, 약품 및 공업 제품을 제조하는데 유용하다.

그밖의 다른 본 발명의 특징 및 이점들은 이하 상세한 설명으로부터 명확해 질 것이다. 그러나, 당업자들에게는 본 발명의 취지 및 영역내에서 상세한 설명으로부터 다양한 변경 및 변형이 이루어지는 것은 당연한 것으로 받아들여지기 때문에, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내면서 설명만을 목적으로 주어지는 것으로 이해하여야 한다.

도 1은 각각 글리세린의 존재 및 부재하에 건조 올레오좀의 입도 분석을 도시한 것이다.
도 2는 15% 증류수, PEG 200 또는 글리세린과 혼합된 OMC-로딩(loaded) 올레오좀의 입도 분석을 도시한 것이다. 샘플들은 방출(35 ℃에서 2 시간)후 분석되었다.
도 3은 5%, 10%, 15% 또는 20% PEG 200과 혼합된 OMC-로딩 올레오좀의 입도 분석을 도시한 것이다. 샘플들은 방출(35 ℃에서 2 시간)후 분석되었다. 2008-094 샘플은 로딩되지 않은 올레오좀이고, 15% OMC는 방출 조절제를 첨가하기 전 로딩되는 올레오좀의 출발 원료이다. 양 대조군은 방출 조건에 노출되지 않았다.
도 4는 10% 글리세린 또는 PEG 200과 혼합된 다음, 35 ℃에서 최대 4 시간 인큐베이션 된 OMC-로딩 올레오좀의 입도 분석을 도시한 것이다. "0 시"는 건조 전 샘플을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 올레오좀으로 이루어진 제제로부터 활성 성분의 방출을 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 활성 성분이 캡슐화된 올레오좀으로 이루어진 제제의 경우, 증발이 빠르면 방출이 더 빨라지고 방출이 빨라지면 증발이 빠르다는 것이 상관관계에 있어서, 올레오좀 제제로부터 수분 증발율에 영향을 미치는 다가 알콜과 같은 제제("방출 조절제")를 포함시키게 되면 올레오좀으로부터 활성 성분의 방출을 조절할 수 있음을 발견하였다. 다시 말해, 증발을 빠른 속도로 일어나게 하는 제제는 제제 건조시 올레오좀에서 완전성을 잃게 하여 캡슐화된 활성 성분을 보다 신속히 방출시킨다는 것을 발견하였다. 즉, 본 발명의 올레오좀 제제는 올레오좀으로부터 활성 성분의 방출 동태를 조절할 수 있게 됨에 따라 활성 성분의 지속 시간 및 작용을 최적화하는 것이 가능하다.

따라서, 본 발명은 올레오좀으로부터 활성 약제를 방출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은

(ii) 상기 올레오좀 제제를 표면에 적용하여 활성 약제가 올레오좀 제제로부터 방출되도록 하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따라 수득된 올레오좀 제제는 활성 약제의 방출 조절을 특징으로 한다. 바람직하게, 방출 조절제가 존재하는 경우 올레오좀으로부터 활성 약제의 평균 방출 속도는, 방출 조절제 부재시 활성 약제의 평균 방출 속도와 비교할 경우 적어도 15% 미만이다.

올레오좀 제제

본 원에서 용어 "올레오좀"은 생 세포로부터 얻을 수 있는 임의의 불연속 세포하 기름 또는 왁스 저장 소기관을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 올레오좀은 식물 세포, 진균 세포, 효모 세포(Leber, R. et al ., 1994, Yeast 10: 1421-28), 박테리아 세포(Pieper-Fuerst et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 4328-37) 및 조류 세포(Roessler, P.G., 1988, J. Phycol. (London) 24: 394-400)를 비롯하여, 상기 소기관을 함유하는 임의의 세포로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 올레오좀은 식물 세포로부터 수득되며, 이때 "세포"는 각각 올레오좀이 존재하는 꽃가루, 포자, 종자 및 영양 식물 기관의 세포를 포함한다. [일반예: Huang, Ann. Rev. Plant Physiol. 43: 177-200 (1992)]. 보다 바람직하게, 본 발명에서 사용되는 올레오좀은 식물 종자로부터 수득된다.

본 원에서 유용한 식물 종자 중에서 아몬드(Prunus dulcis); 아니스(Pimpinella anisum); 아보카도(Persea spp.); 비치 너트(Fagus sylvatica); 보리지(Boragio officinalis); 브라질 너트(Bertholletia excelsa); 켄들 너트(Aleuritis tiglium); 카라파(carapa)(Carapa guineensis); 캐슈 너트(Ancardium occidentale); 피마자(Ricinus communis); 코코넛(Cocus nucifera); 코리앤더(Coriandrum sativum); 면실(Gossypium spp.); 갯배추(crambe)(Crambe abyssinica); 그레피스 알피나(Crepis alpina); 크로톤(croton)(Croton tiglium); 오이(Cucumis sativus); 쿠페아 종(Cuphea spp.); 딜(dill)(Anethum gravealis); 유포르비아 라가스카에(Euphorbia lagascae); 달맞이꽃 종자(Oenothera biennis); 디모르포테카 플루비알리스(Dimorphoteca pluvialis); 아마(false flax)(Camolina sativa); 회향(Foeniculum vulgaris); 땅콩(Arachis hypogaea); 헤이즐넛(coryllus avellana); 삼(Cannabis sativa); 어네스티 플랜트(honesty plant)(Lunnaria annua); 호호바(Simmondsia chinensis); 케이폭 열매(Ceiba pentandra); 쿠쿠이 너트(Aleuritis moluccana); 레스쿠에렐라 종(Lesquerella spp.), 아마인(linseed/flax)(Linum usitatissimum); 루핀(Lupinus spp.); 마카데미아 너트(Macademia spp.); 옥수수(Zea mays); 메도우 폼(meadow foam)(Limnanthes alba); 겨자(Brassica spp. 및 Sinapis alba); 올리브(Olea spp.); 오일팜(Elaeis guineeis); 오이티시아(oiticia)(Licania rigida); 파파야(Assimina triloba); 피칸(Juglandaceae spp.); 들깨(Perilla frutescens); 피직 너트(physic nut)(Gatropha curcas); 필리 너트(Canarium ovatum); 파인 너트(pine spp.); 피스타치오(Pistachia vera); 폰감(pongam)(Bongamin glabra); 양귀비씨(Papaver soniferum); 호박(Cucurbita pepo); 평지씨(Brassica spp.); 홍화(Carthamus tinctorius); 참깨(Sesamum indicum); 대두(Glycine max); 스쿼시(Cucurbita maxima); 살 트리(sal tree)(Shorea rubusha); 스톡스 아스터(Stokes aster)(Stokesia laevis); 해바라기(Helianthus annuus); 투쿠마(tukuma) (Astocarya spp.); 텅 너트(tung nut)(Aleuritis cordata); 베로니아(Vernonia galamensis); 및 이들의 혼합물로 구성된 식물 종 그룹으로부터 선택되는 식물 종으로부터 얻을 수 있는 종자가 바람직하다. 가장 바람직하게, 식물 종자는 평지씨(Brassica spp.), 대두(Glycine max), 해바라기(Helianthus annum), 오일팜(Elaeis guineeis), 면실(Gossypium spp.), 땅콩(Arachis hypogaea), 코코넛(Cocus nucifera), 피마자(Ricinus communis), 홍화(Carthamus tinctorius), 겨자(Brassica spp. 및 Sinapis alba), 코리앤더(Coriandrum sativum), 스쿼시(Cucurbita maxima), 아마인(Linum usitatissimum), 브라질 너트(Bertholletia excelsa), 호호바(Simmondsia chinensis), 옥수수(Zea mays), 갯배추(Crambe abyssinica) 및 에루카(eruca)(Eruca sativa)를 포함하는 식물 종 그룹으로부터 선택된다. 본 원에서는 홍화(Carthamus tinctorius)로부터 생성된 유체가 가장 바람직하다.

식물로부터 올레오좀을 제조하기 위해서는, 식물을 통상적인 농업 재배 양식에 따라 재배하여 종자를 맺게 한다. 종자를 수확하고, 필요에 따라서는, 예를 들어, 체질하거나 세척하여 핵 또는 종자 깍지와 같은 물질을 제거한 후(탈깍지), 임의로 종자를 건조시킨 다음, 계속해서 종자를 기계적 분쇄 처리한다. 바람직하게는, 종자 분쇄 전에 액상이 첨가된다. 이는 "습윤 제분"으로서 알려져 있다. 오일 추출 공정에서 습윤 제분은 겨자(Aguilar et al. 1991, J. Texture Studies 22: 59-84), 대두(미국 특허 제3,971,856호, 문헌 [Cater et al ., 1974, J. Am . Oil Chem. Soc. 51:137-41]), 땅콩(미국 특허 제4,025,658호 및 제4,362,759호), 면실(Lawhon et al ., 1977, J. Am . Oil Chem . Soc. 54: 75-80), 코코넛(Kumar et al., 1995, INFORM 6: 1217-40) 및 홍화(미국 특허 제6,146,645호)를 포함한 각종 식물 종의 종자에 대해서 보고되었다.

바람직하게, 액체는 물이지만, 에탄올과 같은 유기 용매 또한 사용될 수 있다. 분쇄에 앞서, 종자를 약 15 분 내지 약 이틀동안 액상에서 흡액되도록 하는 것이 또한 유리할 수 있다. 흡액은 세포벽을 부드럽게 하여 분쇄 공정을 용이하게 할 수 있다. 장시간 흡액은 발아 과정을 모방할 수 있어서 종자 성분의 조성을 특정하게 유리한 정도로 변경할 수 있다.

종자는 바람직하게는 콜로이드 밀을 이용하여 분쇄된다. 본 원에서는 콜로이드 밀 외에, 공업적 규모량의 종자를 처리할 수 있는 다른 제분 및 분쇄 장비가 또한 이용될 수 있으며, 이로는 디스크 밀(disk mill), 콜로이드 밀, 핀 밀(pin mill), 오비탈 밀(orbital mill), IKA 밀 및 공업적 규모의 호모지나이저(homogenizer)가 포함된다. 밀의 선택은 필요한 종자 처리량뿐 아니라 사용되는 종자원에 따라 달라질 수 있다.

본 발명에 따르면, 분쇄 공정동안 종자 유체가 손상되지 않고 남아 있는 것이 중요하다. 따라서, 통상 오일 종자 처리공정에 사용되는 임의의 작업 조건은 유체를 파괴하려는 경향이 있어서 본 발명의 공정을 위해서는 적합치 않다.

분쇄 온도는 바람직하게는 1O ℃ 내지 90 ℃이다. 더욱 바람직하게, 분쇄 온도는 15 ℃ 내지 50 ℃이고, 가장 바람직하게는 18 ℃ 내지 30 ℃인 반면, pH는 바람직하게는 2.0 내지 11.0, 보다 바람직하게는 6.0 내지 9.0, 및 가장 바람직하게는 7.0 내지 9.0으로 유지된다.

고체 오염물, 예컨대 종자 깍지, 섬유 물질, 비용해 탄수화물 및 단백질, 및 기타 불용성 오염물은 분쇄된 종자 분획으로부터 제거된다. 고체 오염물의 분리는 경사 원심분리기(decantation centrifuge)를 사용하여 행할 수 있다. 필요한 종자 처리량에 따라, 다른 경사 원심분리기 모델, 예컨대 3-상 데칸터(decanter)를 사용함으로써 경사 원심분리기 용량을 변경시킬 수 있다. 작업 조건은 사용되는 특정 원심분리기에 따라 달라질 수 있으며, 불용 오염 물질이 침강되고, 경사분리시 침강물이 남도록 조정되어야 한다. 이러한 조건하에서 유체상 및 액상의 부분 분리가 관찰될 수 있다.

불용 오염물의 제거 후, 올레오좀 분획을 수성상으로부터 분리한다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 관형 보울(tubular bowl) 원심분리기가 이용된다. 바람직한 구체예에 있어서, 디스크 스택(disc stack) 원심분리기가 이용된다. 다른 한편으로는, 하이드로사이클론(hydrocyclon) 또는 자연 중력하에 상 침강 또는 임의의 다른 중력식 분리 기술이 이용된다. 여과와 같은 크기 배제 방법, 예를 들면 막 한외여과 및 교차류 정밀여과(crossflow microfiltration)를 통해 수성 분획으로부터 올레오좀 분획을 분리하는 것이 또한 가능하다.

이 목적으로 원심분리기가 이용될 경우, 중요한 변수는 원심분리기를 작동시키기 위해 사용되는 링 댐(ring dam) 규격이다. 링 댐은 중심에 다양한 크기의 원형 개구부를 가지는 탈착가능한 링이며, 올레오좀 상으로부터 수성상의 분리를 조절하여 수득되는 다수의 올레오좀 분획을 관리할 수 있다. 선택되는 링 댐의 규격은 원심분리기의 종류 및 사용되는 오일 종자의 종류 뿐만 아니라 올레오좀 제제의 목적하는 최종 점조도에 따라 달라진다.

본 발명의 일 구체예에 따라, 홍화 올레오좀은 SA-7(Westfalia) 디스크 스택 원심분리기를 링 댐의 규격을 69 내지 75 mm로 사용하여 수득된다. 분리 효율은 유량에 의해 추가로 영향을 받으며, 이는 본 구체예에 있어서, 전형적으로 0.5 내지 7.0 1/분으로 유지된다. 온도는 바람직하게는 26 ℃ 내지 40 ℃로 유지된다.

사용된 원심분리기 모델에 따라, 수성상으로부터 올레오좀 분획이 최적으로 분리되도록 유량 및 링 댐 규격을 조절할 수 있다. 프로세스 공학 분야에 지식을 가지고 있는 사람이라면 이러한 조정에 대해 용이하게 이해할 것이다.

올레오좀 분획으로부터 수성상 분리 및 고체 분리는 동시에 수행될 수 있다. 이는 3-상 관형 보울 원심분리기와 같은 중력식 분리 방법, 데칸터, 하이드로사이클로논 또는 크기 배제식 분리 방법의 수단으로 행해질 수 있다.

본 발명의 공정중 상기 단계에서 얻은 올레오좀 조성물은 일반적으로 글리코실화 및 비글리코실화된 다수의 종자 단백질, 및 글루코시닐레이트 또는 그의 분해 산물과 같은 다른 오염물을 포함하는 비교적 미가공 상태의 것이다. 본 발명은 이와 같은 조성물을 포함하나, 바람직한 구체예에 있어서, 안정화된 올레오좀 제제를 제조하기 전에 상당량의 종자 오염물이 제거된다.

오염된 종자 물질을 제거하기 위해서는, 올레오좀 분획을 액상에 재현탁시키고, 재현탁된 분획을 원심분리함으로써 상술된 바와 같이 수성상으로부터 분리시 얻은 오일 올레오좀 제제를 적어도 한번 세척하여 "세척된 올레오좀 제제"를 제공하면 된다.

본 발명에 따라, 세척 조건은 일반적으로 목적하는 올레오좀 제제의 순도에 따라서 선택된다. 이와 관련하여, 조건은 제어된 방식으로 달라질 수 있어서 올레오좀의 순도가 상이한 올레오좀 제제를 얻기 위해서는 세척에 사용되는 액상 구성, 세척 시간, 액상 대 올레오좀 상의 비 및 pH가 조건에 포함된다. 예를 들어, 액상은 물이거나, 유기 용매일 수 있다. 전형적으로는, 완충 액상이 (i) 올레오좀의 등점전으로부터 적어도 하나의 pH 점에서 제거되는 pH를 가지도록 선택하는 것이, 이같은 조건이 올레오좀 및 오염물의 분리를 용이하게 하기 때문에 유리한데, 상기 pH 점은 일반적으로 올레오좀 공급원에 따라 4 내지 6으로 달라진다. 완충 액상이 (ii) 올레오좀이 안정한 pH를 가지는 것이 또한 유리한데, 이는 일반적으로 약염기성 pH 범위(pH 7.0 내지 9.0)이다.

본 발명에 적절한 완충제 시스템은 0.01M 내지 2M 농도의 염화나트륨, 25 mM 내지 50 mM 농도의 중탄산나트륨 완충제; 및 pH 7.5의 50 mM 트리스-HCl과 같은 저 염 완충제로 구성된 시스템으로 이루어진다. 홍화 올레오좀이 제조되는 경우에는, 비교적 순수한 올레오좀 제제를 얻기 위해 pH 8.2의 45 mM 중탄산나트륨 완충제가 특히 적합하다.

이같은 완충제를 이용함으로써, 예를 들면 2% 이하의 비유체 단백질을 포함하는 올레오좀 제제를 수득할 수 있다. 본 발명에 따라 올레오좀 순도에 영향을 미치는 추가의 조건은 세척 시간 및 올레오좀/액상의 상대량이다. 세척 시간의 연장 및/또는 세척 횟수의 증가와 다량의 액상을 사용함으로써, 프로세스 공학업자들이 알고 있는 바와 같이, 전형적으로는 산출량에 희생이 따르더라도 고도의 올레오좀 순도를 얻는 것이 가능하다.

세척 조건은 제조된 올레오좀 공급원에 따라 조정될 수 있다. 특히, 상술된 완충제 조성물, 세척 시간, pH 등의 변수들은 공급원에 따라 달라지기 때문에, 올레오좀 제제의 구성 성분 및 오염 성분에 영향을 미치도록 변경될 수 있다.

따라서, 세척 조건에 따라서, "실질적으로 순수한" 올레오좀 제제를 얻을 수 있으며; 즉 존재하는 유일한 단백질은 유체 단백질이다. 바람직한 구체예에 있어서, 올레오좀 분획은 30% (w/w) 미만, 보다 바람직하게는 20% (w/w) 미만, 및 보다 더 바람직하게는 10% (w/w) 미만의 비유체 단백질을 함유한다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 올레오좀 분획은 비유체 단백질을 2% (w/w) 이하로 함유한다.

오염물, 특히 단백질을 단계적으로 제거할 수 있도록 하기 때문에, 다수의 상이한 pH 값에서 세척하는 것이 유익할 수 있다. 올레오좀 세척시 종자 단백질 및 기타 오염물의 제거를 관찰하는데 SDS 겔 전기이동 또는 다른 분석 기술이 편리하게 이용될 수 있다. 또한, 세척 단계가 다회 수행되는 경우, 세척 조건은 상이한 세척 단계마다 달라질 수 있다.

세척 단계 사이에 모든 수성상을 제거할 필요는 없으며, 최종 세척 올레오좀 제제는 물, 완충제 시스템, 예를 들어, 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 또는 임의의 다른 액상에 현탁될 수 있다. 필요에 따라, pH는 pH 2.0 내지 11.0, 바람직하게는 6.0 내지 9.0, 및 가장 바람직하게는 7.0 내지 8.5 사이에서 임의의 pH로 조정될 수 있다. 올레오좀 제제에서 물의 양은 변할 수 있으며, 본 발명에 따르면, 물의 양에 따라서, 더 점성이거나 점성이 덜한 올레오좀 제제가 수득될 수 있다. 요컨대, 본 발명의 올레오좀 제제는 바람직하게는 10 부피% 초과 내지 65 부피% 미만, 보다 바람직하게는 15 부피% 초과 내지 50 부피% 미만, 및 가장 바람직하게는 20 부피% 초과 내지 50 부피% 미만의 물을 포함한다.

본 발명에 따라, 올레오좀 제제의 제조방법은 배치식 공정 또는 연속 플로우 공정으로 수행될 수 있다. 특히, 디스크 스택 원심분리기가 사용되는 경우, 편의상 펌프 시스템을 설치하여 연속 플로우를 발생시킬 수 있다. 이용할 수 있는 예시적인 펌프로는 공기 작동식, 이중-다이아프램(double-diaphragm) 펌프 및 수압 용적형 또는 연동식 펌프가 있다.

경사 원심분리기 및 관형 보울 원심분리기에 균일한 점조도 공급을 유지하기 위해, IKA 호모지나이저와 같은 호모지나이저가 분리 단계 사이에 가해질 수 있다.인라인(in-line) 호모지나이저가 또한 유체 제제를 세척하기 위해 사용되는 다양한 원심분리기 또는 크기 배제식 분리 장치 사이에 가해질 수 있다. 링 댐 규격, 완충제 조성물, 온도 및 pH는 각 세척 단계마다 상이할 수 있다.

상술된 바에 따라 수득되는 올레오좀 제제는 이하 보다 상세히 기술되는 방식으로 사용될 수 있다.

방출 조절제

상술한 바와 같이, 방출 조절제는 본 발명의 조성물로부터 수분 증발율에 영향을 미침으로써 방출 동태에 영향을 준다. 이와 관련하여, "방출 조절제"라는 문구는 활성 약제를 함유하거나 이를 "캡슐화"하는 올레오좀 조성물과 혼합되는 경우, 방출 조절제를 함유하지 않는 조성물에 비해 올레오좀으로부터 활성 약제의 방출 동태를 조정하는 물질을 가리킨다. 이와 관련하여는, 물의 비점(증기압)을 변경시켜 본 발명에 사용되는 경우 수분 증발율에 영향을 미치는 성분이 예시된다. 이에 따라, 방출 조절제는 방출 속도를 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 메틸, 에틸 및 이소프로필 알콜은 증기압을 증가시켜 방출을 촉진시키는 반면, 글리세린, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜은 증기압을 감소시켜 방출을 지연시킨다. 따라서, 일반적으로 용어, 상이한 방출 조절제는 수분 증발률에 상이하게 영향을 미침으로써 상이한 방출 동태를 나타낼 수 있다.

바람직한 구체예에 있어서, 방출 조절제는 다가 알콜이다. "다가 알콜"은 2 이상의 하이드록실 그룹을 가지는 하이드록실-함유 유기 화합물이다. 임의의 적절한 다가 알콜이 사용될 수 있으나, 비할로겐화 다가 알콜, 및 바람직하게는 분자량이 소 내지 중, 즉 50,000 달톤 미만인 것이 바람직하다. 따라서, 다가 알콜은 적합하다면 비방향족 디올, 트리올 또는 폴리올이다.

다가 알콜이 디올인 경우, 이는 글리콜 또는 비방향족 글리콜 유도체일 수 있다. 적절한 글리콜 유도체는 부틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 헥산디올, 또는 폴리부틸렌 글리콜이다.

트리올인 경우, 다가 알콜은 1, 2, 6 헥산트리올 또는 글리세롤일 수 있다. 글리세롤 중합체, 예를 들면, 디, 트리, 테트라, 펜타, 헥사, 셉타, 옥타, 노나 또는 데카글리세롤 뿐만 아니라 약간 치환된 글리세롤 유도체 및 이들의 중합체도 또한 사용될 수 있다.

다가 알콜이 폴리올인 경우, 바람직하게 적어도 하나의 탄소원자는 여기에 하이드록실 그룹이 결합되어 있지 않다. 모든 탄소원자에 하이드록실 그룹이 결합된 예시적인 폴리올은 글리세롤 및 소르비톨과 같은 당이다. 이러한 폴리올의 일부 에톡실레이트가 실온에서 액체이거나, 수용성이라면 본 발명의 제제에 사용하기에 적절하며, 예로는 sorbeth 6, sorbeth 20, sorbeth 30 및 sorbeth 40을 들 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 그밖의 다른 폴리올의 예로는 폴리비닐 알콜을 들 수 있다.

본 발명에서는 글루코스 및 프럭토스와 같은 단당류 당, 및 수크로스와 같은 이당류 당뿐 아니라 전분 및 셀룰로스와 같은 복합 다가 당을 포함하여 다가의 당을 사용하는 것이 가능할 수 있다. 또한, 약간 치환된 당 에스테르가 다가로 존재한다면 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 다가 알콜은 바람직하게는 글리세롤 및 그의 선형 및 비선형 중합 유사체로부터 선택된다. 프로세스 공학에 지식을 갖고 있는 사람이라면 본 원에 구체적으로 언급된 이외의 것 및 다가 알콜의 혼합물을 포함하여, 본 발명의 내용에 따라 그의 취지 및 영역을 벗어나지 않고 본 발명에서 사용될 수 있는 다가 알콜을 인지할 것이다.

활성 약제

원칙적으로, 임의의 외부 활성 성분이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본 원에서 "활성제", "활성 약제" 및 "활성 성분"은 표면적에 전달되는 경우, 임의의 생물학적, 생리학적, 약리학적, 치료적 또는 예방적 효과를 비롯하여, 표면적에 대해 검출가능한 물리적 및 화학적 효과를 지니는 임의의 화합물을 나타내고자 사용된다. 따라서, 활성제는 임의 표면적의 물리적 외관, 건강, 적합성 또는 성능 특성을 증진시키거나 향상시킬 수 있다.

특정 구체예에 따라, 표면적은 인체 또는 다른 포유동물의 내부 또는 외부, 예를 들면 인간 피부, 체모, 가죽, 치아 및 손발톱일 수 있다.

올레오좀내에 캡슐화될 수 있는 임의의 활성제가 사용될 수 있다. 이와 관련하여, "캡슐화된"이란 활성제가 전체 또는 부분적으로 올레오좀의 트리아실 글리세리드 코어내 또는 올레오좀의 지질막내에 위치하는 것을 의미한다.

바람직한 구체예에 있어서, 활성제는 소수성 화합물, 즉 물과 같은 극성 용매에 잘 용해되지 않는 화합물이다. 화합물의 상대적인 소수성을 정량하기 위해 사용되는 일반적인 척도는 화합물이 2 상 물/옥탄올 시스템에 용해된 경우, 옥탄올 및 물에서 화합물의 상대적인 농도의 비를 반영하는 LogP 값이다. 바람직한 구체예에 있어서, 이에 따라 사용되는 활성제의 LogP 값은 0 내지 8이고; 보다 바람직한 구체예에 있어서, 활성제의 LogP 값은 1 내지 7이며, 가장 바람직한 구체예에 있어서, 활성제의 LogP 값은 2 내지 7이다. 일반적으로, 화합물의 LogP 값은, 예를 들어, 역상 HPLC를 사용하거나[참조: Yagam and Haraguchi, 2000, Chem. Pharm. Bulletin (Tokyo): 1973-7], 또는 예를 들어, 메윌란(Meylan) 및 하워드(Howard)에 의한 문헌 [1995, J. Pharm. Sci. 84: 83-92]에 기술된 바와 같이 코우윈(KowWin) 프로그램 등의 소프트웨어 모델을 사용함으로써 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명은 또한 "양극성" 또는 "양친매성" 활성 약제, 즉 용매 친화성이 다른 두개의 상이한 부분을 갖는 분자의 사용을 포함한다. 분자의 한 부분은 극성 용매에 친화성을 갖고, 친수성이라 불리며, 분자의 제2 부분은 비극성 용매에 친화성을 갖고, 소수성이라 불린다. 이들 분자를 분류하는데 양친매성 분자내 소수성 부분과 친수성 부분 간 균형("소수-친지 균형" 또는 "HLB")이 이용된다. 일반적으로 사용되는 양친매성 분자의 HLB 값은 예를 들어, HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS(Pharmaceutical Press, 1994)로부터 용이하게 입수할 수 있다. 본 발명에 사용된 양극성 활성제의 HLB는 1 내지 15, 보다 바람직하게는 5 내지 13 및 가장 바람직하게는 7 내지 11이다.

활성제를 함유하는 올레오좀 제제는 단순히 활성 성분을 올레오좀과 혼합하거나, 또는 머레이(Murray) 등에 의한 PCT 출원 제2005/030169호에 기술된 바와 같이, 활성 성분을 올레오좀에 선택적으로 분배화시키는 최적화 방법으로 수득할 수 있다.

활성 약제 및 방출 조절제를 함유하는 올레오좀 제제

본 원에서 사용되는 올레오좀 제제는 바람직하게는 적어도 5 부피%의 올레오좀을 포함한다. 보다 바람직하게, 올레오좀 제제는 적어도 10 부피% 또는 20 부피% 또는 30 부피% 또는 40 부피% 또는 50 부피% 또는 60 부피% 또는 75 부피%의 올레오좀을 포함한다.

본 발명에 따라, 이 올레오좀 제제에는 방출 조절제가 바람직하게는 활성 약제에 올레오좀을 분배시킨 후에 첨가된다. 첨가시, 방출 조절제는 단순 혼합하거나, 또는 예를 들어, 저전단 오버헤드 교반기(overhead stirrer)(전형적으로 500 rpm 미만) 또는 자석 교반기 및 교반바를 사용하여 교반시킴으로써 올레오좀 제제에 분산된다. 대형 작업에서는, 균일한 혼합물을 얻기 위해 표준 인라인 믹서 또는 호모지나이저가 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 예컨대 코울스 날(Cowles blade)을 3000 rpm으로 15 내지 20 분 사용하는 피그먼트 밀(pigment mill)과 같이 균일한 혼합물을 얻는데 필요한 임의의 다른 수단이 사용될 수 있는데, 단 혼합 장비는 혼합 또는 교반 공정동안 발생되는 전단력이 적정하면서 올레오좀을 무손상 상태로 남아 있도록 선택되어야 한다.

상기 언급된 바와 같이, 올레오좀 제제내 수성상의 양은 변할 수 있다. 방출 조절제는 바람직하게는 올레오좀 제제의 수성상 부분을 형성하며, 그의 농도는 바람직하게는 올레오좀 제제의 수성상에 대해 1 내지 99 부피% 범위이다. 방출 조절제의 농도는 목적하는 방출 동태에 따라 선택되며, 따라서 가변적일 수 있다.

본 발명에 따라, 다수의 올레오좀 제제내에 분산된 다양한 방출 조절제 농도에서 활성 약제의 방출 동태를 측정함으로써 활성제의 방출 조절 동태를 조절하여 특히 목적하는 방출 동태("최적화")의 제제를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 활성 약제의 방출 동태가 최적화된, 활성 약제 함유 올레오좀 제제를 수득하는 방법을 포함한다. 이 방법은

(i) 각각 활성 약제 및 방출 조절제를 포함하고, 방출 조절제의 농도가 상이한 다수의 올레오좀 제제를 제조하는 단계,

이와 관련하여, 활성제의 방출 동태를 결정하기 위하여, 입도 분석기, 예컨대 말번사(Malvern Instruments Ltd.)(매사추세츠 웨스트보로 소재) 제품인 입자 분석기를 이용하여 올레오좀 제제내 올레오좀의 입도가 측정될 수 있다. 올레오좀 제제를 표면적에 적용하고, 샘플을 상이한 시점에 평균 또는 중간 입자 크기 및 샘플내 입자 분포 패턴에 대해 분석할 수 있다. 일반적으로, 올레오좀 제제내에 존재하는 입자 분포 프로파일 및/또는 평균 또는 중간 입자 크기 변화가 올레오좀 분해에 대한 지표가 되며, 따라서, 올레오좀으로부터 활성 약제의 방출을 나타내는 지표도 된다. 휘발성 활성 약제의 경우에는, 분석 도구로서 가스 크로마토그래피 장치와 함께 상부 공간 분석을 이용하여 올레오좀 제제로부터 활성제의 방출 동태를 평가할 수 있다. 다른 한편으로, 헥산과 같은 용매를 사용한 추출로 올레오좀으로부터 방출된 활성제를 선택적으로 포획하여 분광분석 또는 다른 정량적인 기술을 통해 정량화를 이룰 수 있다.

글리세린이 방출 조절제로 사용되는 경우, 5 내지 20 부피%의 글리세린 농도는 표면적, 외부 조건 및 적용 부피에 따라 달라지기는 하지만, 방출 조절제를 포함하지 않는 대조 제제에 비해 올레오좀으로부터 활성 약제의 방출을 1 시간 이상 지연시킬 것이다.

일반적으로, 방출 조절제의 농도 변화는 방출 조절제를 포함하지 않는 올레오좀 제제에 비해 방출 동태를 변화시킬 것으로 예측된다. 예를 들어, 증가된 농도의 PEG 200을 사용하게 되면, 저속 방출 동태가 관찰된다(실시예 6 참조). 바람직한 구체예에 있어서, 방출 조절제가 존재하는 경우 올레오좀으로부터 활성 약제의 평균 방출 속도는, 방출 조절제 부재시 활성 약제의 평균 방출 속도와 비교할 경우 적어도 15% 미만이다.

본 발명은 또한 신규 올레오좀 제제를 포함한다. 따라서, 본 발명은 그 측면에 있어서, (i) 올레오좀, (ii) 활성 약제 및 (iii) 방출 조절제로 구성된 조성물을 추가로 제공한다. 언급된 바와 같이, 방출 조절제는 바람직하게는 다가 알콜이다.

활성 약제 방출

본 발명의 올레오좀 제제는 임의의 표면적에 적용될 수 있다. 이와 관련하여, 표면적의 선택은 주로 올레오좀을 포함하는 주어진 최종 제제의 목적하는 용도에 좌우된다(이하 설명 참조). 최종 제제를 표면적에 적용할 경우, 올레오좀 구조는 일반적으로 실질적으로 붕괴되어 활성 약제를 방출할 때까지 서서히 약해진다. 활성 약제의 방출 동태는 올레오좀의 붕괴 속도 함수이며, 따라서 올레오좀을 표면적에 적용하기 위해 가해지는 물리적인 힘과 표면적의 물리화학적 성질 및 노출 조건의 함수이다. 본 발명에 따르면, 다가 알콜 방출 조절제를 포함하는 올레오좀 제제에서, 올레오좀 안정성이 일반적으로 증대되어 올레오좀 붕괴 속도가 감소되며, 따라서 활성 약제의 방출 동태는 방출제를 포함하고 있지 않은 올레오좀 제제보다 느려진다.

올레오좀 제제가 적용되는 경우에, 예를 들어, 올레오좀 제제를 피부 또는 임의의 다른 표면적에 문지르거나, 또는 표면적에 적용 후 올레오좀 제제를 건조시킴으로써 물리적인 힘이 가해져 활성 약제가 방출될 수 있다. 방향제와 같은 휘발성 활성 약제가 사용되는 경우, 활성제가 방출되면서 활성 약제가 증발할 것이다. 올레오좀 제제를 표면에 적용한 후 표면적에 물리적인 힘 또는 화합물이 적용되어 활성제의 방출이 또한 일어날 수 있다. 후자의 경우, 화합물은 올레오좀과 반응하여 올레오좀 구조를 붕괴시킴으로써 활성제를 방출할 것이다. 특정 필름-형성 또는 코팅 적용에 있어서, 예를 들어, 필름 또는 코팅 마멸에 의해서나, 코팅 또는 필름이 올레오좀으로부터 활성 약제의 방출을 개시할 수 있는 화합물과 반응함으로써 활성제의 방출이 개시될 수 있다.

방출 동태는 활성 약제의 방출 속도 또는 방출된 활성 약제의 양으로 특정될 수 있다. 후자의 양은 주어진 시점에 유체 외부의 활성 약제의 양을 측정하는 헥산 추출과 같은 분석 방법으로 결정될 수 있다. 활성 약제의 방출 속도는 샘플의 입도 분포를 반영하는, 시간 경과에 따른 입도 분포 변화와 같은 분석 측정으로 결정될 수 있다. 샘플의 입도 변화는 올레오좀 붕괴를 나타내며, 따라서 활성 약제의 방출을 제시한다. 시간 경과에 따른 방출량 또는 속도를 계산하여 평균 방출 속도를 제공한다.

활성제의 방출 동태(들) 외에, 본 발명에 따라 올레오좀 제제의 특정한 다른 성질들이 변경될 수 있다. 이러한 성질로는 전기 전도도, 표면 장력 및 필름 또는 코팅 형성능이 예시된다. 이들뿐 아니라 섬유 및 체모와 같은 표면상의 윅킹 (wicking) 또는 모세관 작용의 비율이 변경될 수 있다.

올레오좀 제제의 유용성

본 원에서 "최종 제제"라는 문구는 의도하는 최종 용도를 위해 준비된 제제를 나타내기 사용된다. 본 발명에 따라 수득된 올레오좀 제제는, 예를 들어 덱커스 특허 및 PCT 출원 제2005/030169호 및 제2005/097059호에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 추가의 화합물의 올레오좀 제제에 첨가함으로써 다수의 최종 제제를 제조하기 위한 성분으로 사용될 수 있다.

제제는 크림, 겔, 로션, 왁스성 고체, 연고, 고약, 페이스트, 스프레이 또는 밀크를 예로 들 수 있으나, 이들에만 한정되지 않는 임의의 다양한 형태를 취할 수 있다. 유리하게, 이러한 제품의 제조는 외부 유화제의 존재없이 수행된다. 본 발명에 따른 최종 제제로는 포유동물의 표면적에 국소 적용하기 위한 제제, 예컨대 퍼스널 케어 제품, 화장품, 국소 적용 약품, 스킨 케어 제품, 약용 화장품, 피부과 제품 및 국소 적용되는 수의약품이 예시된다. 본 발명에 따라 수득되는 올레오좀 제제를 사용하여 제제화될 수 있는 다른 제품들로는 식품, 영양 보조식품 및 영양제뿐 아니라 농산물, 가정용품, 잉크, 코팅제, 페인트, 약제 및 공업 제품을 들 수 있다.

실시예

실시예 1. 홍화로부터 올레오좀 제제 수득

본 실시예는 홍화로부터 올레오좀 분획을 회수하는 것에 대해 설명한다. 생성된 제제는 원형 그대로의 세척 올레오좀을 함유한다.

종자 오염 제거

총 45 kg의 건조 홍화(Carthamus tinctorius) 종자를 약 120L 정도의 65 ℃ 수도물로 2회, 약 120L 정도의 약 15 ℃ 수도물로 1회 세척하였다. 폐수를 분리하기 위한 스크린 메쉬를 구비한 배럴내에서 세척을 수행하였다.

종자 분쇄

세척한 종자를 MZ-130 십자형 톱니 회전자(crosswise toothed rotor)/고정자 분쇄 세트 및 상부 선적 호퍼(top loading hopper)가 장착된 콜로이드 밀(Colloid Mill, MZ-130 (Fryma); 용량: 350 kg/hr)의 호퍼를 통해 붓고, 제분전에 외부 연결된 호스를 통해 약 100L 정도의 45 mM 중탄산나트륨 완충제(pH 8.2)를 공급하였다. 18 ℃ 및 30 ℃에서 입도가 100 미크론 미만이 되도록 선택된 1R의 갭 세팅으로 밀을 조작하였다. 모두 45 kg의 종자가 10 분만에 분쇄되었다.

균일화 및 고체 제거

생성된 슬러리를 나이프 인라인 호모지나이저(Dispax Reactor^® DR 3-6/A, IKA^® Works, Inc.)에 약 7 L/분의 속도로 펌프하였다. 원심분리기를 최고 작동 속도 3250 rpm으로 한 후, 생산 슬러리를 경사 원심분리기(NX-314B-31, Alfa-Laval)에 직접 공급하였다. 25 분만에 종자 분쇄 슬러리의 약 160 kg이 경사분리되었다. 이 단계에서 슬러리를 이송시키는데 Watson-Marlow(모델 704) 연동 펌프가 이용되었다.

올레오좀 분리

3 상 분리 및 자정 보울(self-cleaning bowl)과 탈착가능한 링 댐 시리즈(최대 용량: 83 L/분; 링 댐: 69 mm)가 장착된 디스크-스택 원심분리기(SB 7, Westfalia)를 이용하여 올레오좀 분획의 분리를 수행하였다. 작업 속도는 약 8520 rpm이었다. 최고 작업 속도에 이른 후에 Watson-Marlow(모델 704) 연동 펌프를 이용하여 경사분리된 액상(DL)을 원심분리기로 압송하였다. 그 결과, 경사분리된 액상이 물 및 가용성 종자 단백질을 포함하는 무거운 상(HP1) 및 유체를 포함하는 가벼운 상(LP1)으로 분리되었다. 원심분리기 통과 후 얻은 올레오좀 분획을 비세척 올레오좀 제제로 언급하겠다. 이어서, 비세척 올레오좀 분획을 45 mM 중탄산나트륨 완충제(pH 8.2, 35 ℃, 4L/분)와 혼합되도록 정적 인라인 믹서에 통과시켜 제2 디스크-스택 원심분리기(SA 7, Westfalia)[최대 용량: 83 L/분; 링 댐: 73 mm]로 이송시켰다. 작업 속도는 약 8520 rpm이었다. 그 다음, 올레오좀을 포함하는 분리된 가벼운 상(LP2)을 45 mM 중탄산나트륨 완충제(pH 8.2, 35 ℃, 4L/분)와 혼합되도록 다른 정적 인라인 믹서에 통과시켜 제3의 디스크-스택 원심분리기(SA 7, Westfalia)[최대 용량: 83 L/분; 링 댐: 75 mm]로 이송시켰다. 작업 속도는 약 8520 rpm이었다. 전체 공정은 실온에서 수행되었다. 제2 분리 후 수득한 제제는 모두 세척 올레오좀 제제로 언급된다.

실시예 2. 방출 조절제를 포함하는 홍화 올레오좀 제제의 제조

홍화 올레오좀의 75% 고체 분산물 100 g에 25 g의 순수한 글리세린(>99% 순도)을 저전단 혼합하면서 첨가하였다. 그 결과, 총 올레오좀 수준이 60%로 감소되었다. 이 분산물의 pH는 전형적으로 >8.5이었다. 분산물에 글루코노 델타 락톤 및 벤조산의 블렌드로 이루어진 시판 보존제 지오가드 울트라(Geogard Ultra) 1.25 g을 저전단 교반하면서 첨가하여 분산물의 pH를 4.2 내지 4.5로 감소시켰다. 분산물은 미생물 챌린지 테스트(microbial challenge testing)를 통과하였으며, 25 ℃에서 6 개월 경과후에도 올레오좀 누출이 관찰되지 않았다.

실시예 3. 방출 조절제의 존재 및 부재하에 홍화 올레오좀 제제의 물리적 안정성 비교

방출제로 글리세린을 함유하거나 함유하지 않는 총 100 ㎕의 홍화 올레오좀 제제를 50 ml 원심분리기관 뚜껑 내면에 분포시켰다. 샘플을 실온에서 다양한 시간동안 공기 건조시켰다. 이어서, 샘플을 20 ml의 0.025M 중탄산염 완충제에 재현탁시키고, 1 ml 분취물을 레이저 회절로 분석하여 입도를 평가하였다. 표준 유체는 네올론(Neolone) 및 글리카실(Glycacil)로 보존되고 중탄산염 완충제를 함유하는 원 제제이다. 글리세린 유체를 글리세린 및 지오가드 울트라로 제제화하였다.

도 1에 도시된 바와 같이, 올레오좀 및 방출 조절제로서 글리세린을 포함하는 제제의 경우, 입도 분포는 90 분동안 변하지 않고 남아 있었다. 이에 반해, 글리세린을 포함하지 않는 올레오좀 함유 제제는 90 분의 건조 기간동안 입도가 점차적으로 변화되었고, 더 작은 크기의 입자가 사라지면서 더 큰 크기의 입자가 나타났는데, 이는 올레오좀 구조가 붕괴되고 올레오좀의 친지성 내용물이 방출되었음을 의미한다.

실시예 4. 방출 조절제의 존재 및 부재하에 올레오좀 제제로부터 OMC의 방출 동태 비교

올레오좀의 75% 분산물 샘플 90 g에 충분한 OMC(2-에틸헥실 트랜스-4-메톡시-신나메이트, 시그마 알드리히(Sigma Aldrich)사 제품)를 첨가하여 15% 건조 중량 또는 10% 샘플 중량의 OMC인 최종 혼합물을 수득하였다. 이어서, 혼합물을 저속 믹서로 실온에서 2 분간 교반하여 올레오좀으로의 OMC 흡수를 촉진하였다.

샘플을 두개의 5 g 샘플로 나누었다. 제1 샘플을 0.5 g의 증류수로 희석시킨 후, 5 분동안 혼합하였다. 로딩된 올레오좀 대 희석제의 최종 비는 68/32이었다.

제2 샘플을 0.5 g의 순수한 글리세린으로 희석하고 5 분간 혼합하여 올레오좀/글리세린/물의 비가 각각 68%/9%/23%인 최종 혼합물을 수득하였다.

두 샘플 각각으로부터 분취물(90-92 mg)을 제거하여 은박지 위 1.2 cm² 면적에 분포시켰다. 샘플을 함유하는 은박지 조각을 인큐베이터에서 35 ℃에 1, 2, 3 또는 4 시간동안 노출시켰다. 은박지를 유리 추출관에 놓고, 10 ml의 순수한 헥산으로 올레오좀이 가시적으로 재현탁될 때까지 추출하였다. 샘플을 원심분리하고, 추출물을 새로운 관으로 이동시켰다.

310 nm의 파장을 이용하여 분광광도법으로 OMC를 검출할 수 있다. 수개의 추출물 희석액이 분광광도 측정에 필요하다. 얻은 흡광도 값을 희석에 대해 보정하였다. 헥산 추출 결과를 표 1에 나타내었다. 헥산 추출을 이용하여 시간이 경과함에 따라 방출된 OMC의 농도를 추적한 결과(이하 참조), 방출 조절제로서 글리세린과 함께 제제화된 올레오좀 샘플이 물로 희석된 샘플보다 상당히 긴 시간동안 OMC를 보유하고 있음을 알 수 있었다.

헥산-추출된 OMC-로딩 올레오좀에 대한 보정된 상대 흡광도 값

방출제	0 시간	1 시간	2 시간	3 시간	4 시간
10% 글리세린	4.9	11.0	7.5	7.7	9.7
10% 물(대조군)	6.7	91.6	57.9	55.1	58.5

올레오좀을 35 ℃에서 0 내지 4 시간의 방출 조건에 노출시킨 다음, 헥산으로 추출하였다. 헥산 추출물의 OMC 함량을 310 nm에서 분광광도법으로 평가하였다. 샘플의 희석을 반영하도록 흡광도 값을 조정하였다.

실시예 5. 올레오좀 제제로부터 OMC의 방출 동태에 영향을 미치는 글리세린 및 PEG 200의 효과 비교

15% 건조 중량의 OMC를 함유하는 샘플을 실시예 4에 기술된 방법에 따라 제조하였다. 이어, 로딩된 올레오좀을 15 중량%의 글리세린 또는 PEG 200(폴리에틸렌 글리콜 180-210 MW, 시그마 알드리히사 제품)과 혼합하였다. 각 올레오좀 제제(90-92 mg) 샘플을 1.2 cm²의 은박지상에 균일하게 분포시키고, 35 ℃에서 2 시간동안 인큐베이션하였다.

레이저 회절 입도 분석을 이용하여 올레오좀 분해 또는 OMC 방출에 대해 평가하였다. 샘플을 함유하는 은박지를 샘플 안쪽으로 살짝 접어서 25 mM 중탄산나트륨 완충제 10 ml를 함유하는 15 ml 원뿔형 관에 넣었다. 육안 분석으로 올레오좀이 은박지로부터 제거된 것으로 결정될 때까지 샘플을 진탕하였다. 그 다음에, Mastersizer 2000(말번 인스트루먼트사(Malvern Instruments) 제품) 입도 분석기를 이용하여 샘플의 입도 분포를 분석하였다.

결과를 표 2 및 도 2에 나타내었다. 변수 "d(0.5)"는 입자 분포의 50%에 미치지 않는 크기(μm)를 나타낸다. 결과는 사용된 방출 조절제 타입이 올레오좀 제제로부터 활성 약제의 방출 동태에 영향을 미침을 보여준다. 중량이 더 많이 나가는 분자인 글리세린(PEG 200 비중 약 1.13에 비해 비중 약 1.26)은, 로딩된 올레오좀을 분해로부터 더 잘 보호하여, PEG 보다 올레오좀으로부터 OMC가 서서히 방출되도록 해준다.

15% PEG 200 또는 글리세린이 혼합된 OMC-로딩된 올레오좀의 평균 입도

샘플명	d(0.5)
15% 글리세린, 35 ℃에서 2 시간	3.674
15% PEG, 35 ℃에서 2 시간	7.283
15% 물, 35 ℃에서 2 시간	10.93
15% OMC 로딩 올레오좀	2.868
비로딩 Hydresia 2008-094	2.646

"2008-094" 샘플은 비로딩 올레오좀으로 이루어지고, 15% OMC는 방출 조절제를 첨가하기 전 로딩되는 올레오좀의 출발 원료이다. 양 대조군은 방출 조건에 노출되지 않았다.

실시예 6. 방출 조절제로서 다양한 농도의 PEG 200을 사용하는 경우 올레오좀 제제로부터 OMC 방출 동태에 미치는 효과 비교

15% 건조 중량의 OMC를 함유하는 샘플을 실시예 4에 기술된 방법에 따라 제조하였다. 이어, 로딩된 올레오좀을 5 중량%, 10 중량%, 15 중량% 또는 20 중량%의 PEG 200(폴리에틸렌 글리콜 180-210 MW, 시그마 알드리히사 제품) 또는 증류수(대조군)와 혼합하였다. 각 올레오좀 제제(90-92 mg) 샘플을 1.2 cm²의 은박지상에 균일하게 분포시키고, 35 ℃에서 2 시간동안 인큐베이션하였다.

레이저 회절 입도 분석을 이용하여 올레오좀 분해에 대해 상술한 바와 같이 평가하였다. 결과를 표 3 및 도 3에 나타내었다. 상기 언급된 바와 같이, "d(0.5)"는 입자 분포의 50%에 미치지 않는 크기(μm)이다.

결과는 방출 조절제의 사용 농도가 올레오좀 제제로부터 활성 약제의 방출 동태에 영향을 미침을 보여준다. 방출 조절제(PEG)의 농도가 높을수록 d(0.5) 값이 낮아지며, 이는 올레오좀이 덜 변질됨에 따라 OMC 방출 속도가 더 낮다는 것을 제시한다. 방출제 농도가 최저(5%)인 샘플은 d(0.5) 값이 가장 크고, 이는 올레오좀에 피해를 가장 많이 주었음을 제시한다.

35 ℃에서 2 시간 후 5, 10, 15 또는 20% PEG 200과 혼합된 OMC-로딩된 올레오좀의 평균 입도

샘플명	d(0.5)
5% PEG, 35 ℃에서 2 시간	9.894
10% PEG, 35 ℃에서 2 시간	6.741
15% PEG, 35 ℃에서 2 시간	7.283
20% PEG, 35 ℃에서 2 시간	5.699
15% OMC 로딩 올레오좀	2.868
비로딩 Hydresia 2008-094	2.646

실시예 7. 방출 조절제로서 글리세린 또는 PEG 200을 함유하는 올레오좀 제제로부터 OMC의 방출 속도

15% 건조 중량의 OMC를 함유하는 샘플을 실시예 4에 기술된 방법에 따라 제조하였다. 이어, 로딩된 올레오좀을 10 중량%의 글리세린 또는 PEG 200(폴리에틸렌 글리콜 180-210 MW, 시그마 알드리히사 제품)과 혼합하였다. 올레오좀 제제(90-92 mg) 샘플을 1.2 cm²의 은박지상에 균일하게 분포시키고, 35 ℃에서 1, 2, 3 또는 4 시간동안 인큐베이션하였다.

상술한 바와 같이 올레오좀 분해에 대해 평가하였다. 결과를 표 4, 5 및 도 4에 나타내었는 바, PEG 200의 존재시 올레오좀 제제로부터 OMC의 평균 방출 속도는 방출 조절제를 함유하지 않는 올레오좀 제제로부터의 방출 속도의 약 18% 미만이었다. 글리세린의 존재시 올레오좀 제제로부터 OMC의 평균 방출 속도는 방출 조절제를 함유하지 않는 올레오좀 제제로부터의 방출 속도의 약 93% 미만이었다(표 4 참조). 인큐베이션 시간이 길수록 d(0.5) 값이 더 크고, 입도 분포 곡선의 오른쪽으로 이동되었으며(표 5 및 도 4 참조), 이는 시간 경과에 따라 제제중 올레오좀의 변질이 증가하였음을 제시한다.

방출 조절제(글리세린 또는 PEG 200) 존재하에 로딩된 올레오좀으로부터 방출된 OMC의 양을 방출 조절제 부재(물 대조군)하의 올레오좀과 비교한 결과

방출제	0 시간	1 시간	2 시간	3 시간	4 시간	평균 방출	방출율 (%)	평균 방출 속도	대조군에 대한 비율차 (%)
10% 글리세린	4.9	11.0	7.5	7.7	9.7	8.98	13.6	1.0	93.2
10% PEG	7.1	55.8	53.8	47.9	64.8	55.6	84.5	12.1	18.2
10% 물 (대조군)	6.7	91.6	57.9	55.1	58.5	65.8	100	14.8	0.0

올레오좀을 35 ℃에서 0 내지 4 시간의 방출 조건에 노출시킨 다음, 헥산으로 추출하였다. 헥산 추출물의 OMC 함량을 310 nm에서 분광광도법으로 평가하였다. 샘플의 희석을 반영하도록 흡광도 값을 조정하였다. 변수 "방출율(%)"은 물 대조군에서 방출된 OMC를 100%로 하여 이와 비교하여 계산된 것이다. "평균 방출 속도"는 시간 경과에 따라 방출된 활성제의 평균량이다.

35 ℃에서 최대 4 시간 후 10% PEG와 혼합된 OMC-로딩된 올레오좀의 평균 입도

샘플명	d(0.5)	입도 분포 변화(%)
10% PEG, 35 ℃에서 0 시간	2.91	100
10% PEG, 35 ℃에서 1 시간	3.68	126
10% PEG, 35 ℃에서 2 시간	5.18	178
10% PEG, 35 ℃에서 3 시간	8.19	281
10% PEG, 35 ℃에서 4 시간	8.74	300

이상과 같이 본 발명이 바람직한 실시예인 것으로 여겨지고 있는 것과 관련하여 기술되었지만, 본 발명이 기술된 실시예로 한정되는 것으로 이해하여서는 안된다. 이와는 반대로, 본 발명은 이하 청구범위의 취지 및 영역내에 포함되는 각종 변형 및 동등한 방식을 포함하고자 한다

모든 문헌, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 문헌, 특허 및 특허 출원이 그의 전체가 참고로 포함된다고 각기 구체적으로 명시된 것처럼 동일한 정도로 그의 전체가 참고로 포함된다.

Claims

(i) 캡슐화된 활성 약제 및 방출 조절제를 포함하는 올레오좀 제제를 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 올레오좀 제제를 표면에 적용하여 상기 활성 약제가 올레오좀 제제로부터 방출되도록 하는 단계를 포함하는,
올레오좀으로부터 활성 약제를 방출시키는 방법.
제1항에 있어서, 방출 조절제의 존재시 상기 올레오좀으로부터 활성 약제의 평균 방출 속도가 방출 조절제의 부재시 활성 약제의 평균 방출 속도에 비해 적어도 15% 미만인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방출 조절제가 다가 알콜인 방법.
제3항에 있어서, 상기 다가 알콜이 비방향족 디올, 비방향족 트리올, 비방향족 폴리올 또는 비할로겐화 다가 알콜인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방출 조절제가 글리세린인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방출 조절제가 PEG인 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 글리세린 또는 PEG가 제제중에 5 내지 20 부피%의 양으로 존재하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면적이 피부인 방법.
올레오좀내에 캡슐화된 활성 약제 및 방출 조절제를 포함하는 방출 조절형 올레오좀 제제.
제9항에 있어서, 방출 조절제의 존재시 상기 올레오좀으로부터 활성 약제의 평균 방출 속도가 방출 조절제의 부재시 활성 약제의 평균 방출 속도에 비해 적어도 15% 미만인 제제.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 방출 조절제가 다가 알콜인 제제.
제11항에 있어서, 상기 다가 알콜이 비방향족 디올, 비방향족 트리올, 비방향족 폴리올 또는 비할로겐화 다가 알콜인 제제.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방출 조절제가 글리세린인 제제.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방출 조절제가 PEG인 제제.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 글리세린 또는 PEG가 제제중에 5 내지 20 부피%의 양으로 존재하는 제제.
제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 최종 제제.
제16항에 있어서, 퍼스널 케어 제품, 화장품, 국소 적용 약품, 스킨 케어 제품, 약용 화장품, 피부과 제품, 국소 적용되는 수의약품, 식품 또는 공업 제품인 최종 제제.
(i) 각각 활성 약제 및 상이한 농도의 방출 조절제를 포함하는 다수의 올레오좀 제제를 제조하는 단계;
(ii) 각 올레오좀 제제에서 활성 약제의 방출 동태를 결정하는 단계; 및
(iii) 다수의 올레오좀 제제로부터 활성 약제 방출 동태가 최적화된 올레오좀 제제를 선택하는 단계를 포함하는,
활성 약제의 방출 동태가 최적화된, 활성 약제 함유 올레오좀 제제를 수득하는 방법.