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KR20100105894A - 림프관내 화학요법 약물 담체 - Google Patents

림프관내 화학요법 약물 담체 Download PDF

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KR20100105894A
KR20100105894A KR1020107018901A KR20107018901A KR20100105894A KR 20100105894 A KR20100105894 A KR 20100105894A KR 1020107018901 A KR1020107018901 A KR 1020107018901A KR 20107018901 A KR20107018901 A KR 20107018901A KR 20100105894 A KR20100105894 A KR 20100105894A
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Abstract

화학요법 조성물은 독성이 아닌 치료 전신 농도를 제공하면서도, 림프관내 우선 축적을 위한 피하 투여용으로 맞춰질 수 있다. 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및 피하 투여 이후에 림프관내 우선 축적용으로 맞춰진 나노컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 상기 나노컨쥬게이트는 피하 또는 간질 투여 이후에 림프관내 우선 축적을 위해 맞춰진 나노담체 및 상기 나노담체에 결합된 복수개의 화학요법제들을 포함할 수 있다. 상기 나노컨쥬게이트는 약 10 ㎚ 내지 약 50 ㎚ 치수를 가질 수 있다. 또한, 상기 나노컨쥬게이트는 약 10% 내지 약 50% w/w에 이르는 상기 화학요법제들로 채워질 수 있다. 상기 나노담체는 약 3 kDa 내지 약 50 kDa의 히알루로난 중합체일 수 있다. 또한, 상기 나노담체는 덴드리머일 수 있다.

Description

림프관내 화학요법 약물 담체{INTRALYMPHATIC CHEMOTHERAPY DRUG CARRIERS}
본 발명은 2008년 1월 30일에 제출된 미국 가출원 번호 제61/024,837호의 우선권을 주장하며, 이의 출원은 여기에 전체로서 참조로 포함된다.
본 발명은 림프관내 화학요법 약물 담체에 관한 것이다.
암은 한 그룹의 세포들이 통제되지 않은 정상 범위를 넘어 성장과 분열을 하는 것이고, 인근 조직으로의 침투, 파괴 그리고 때로는 림프관 또는 혈관을 통해 인체의 다른 부분으로 전이되는 질병의 한 종류이다. 암의 이러한 악성종양적 특성은, 자가치유를 갖고 다른 조직에 침투하거나 전이하지 않는 양성종양으로부터 자신들과 차별화한다. 대부분의 암은 종양을 형성하나 일부는, 백혈병의 경우와 같이 그렇지 않다. 암은 모든 연령에, 심지어 태아에 까지도 영향을 미치지만, 나이가 들수록 다양한 암에 걸릴 위험이 높아진다. 암은 전체 사망원인의 13%를 차지한다. 미국 암학회(American Cancer Society)에 따르면, 미국에서 2007년에 760만 명이 암으로 사망했다. 암은 모든 동물에서 발병한다.
거의 모든 암이 변형된 세포의 유전 물질이 기형화됨으로써 시작된다. 이들 기형은 담배 연기, 방사선, 화학물질 또는 감염체와 같은 발암물질의 영향에 기인한다고 할 수 있다. 암을 유발하는 다른 유전적 기형은 DNA 복제나 유전에 의해 무작위적으로 생겨나며, 따라서 출생 시부터 모든 세포에 존재한다. 암의 유전성은 발암물질과 숙주의 게놈 간의 복잡한 상호작용에 통상 영향을 받는다.
악성종양의 최초 징후가 환자의 주관적 증상(symptoms)이나 방사선 이미지로 나타난다고 해도 암의 진단을 위해서는 보통 병리학자에 의해 조직 생검 시편에 대한 조직검사가 요구된다. 대부분의 암은 치료되며, 특정 유형, 부위 그리고 진행 단계에 따라 어떤 경우 완치되기도 한다. 일단 진단되면, 암의 치료는 수술, 화학요법, 그리고 방사선요법이 결합된 형태로 통상 이루어진다. 연구가 발전함에 따라, 치료는 암의 다양성에 대응하여 점점 특이적이 되고 있다. 특정 종양의 검출가능한 분자 차원의 기형 특이적으로 작용하고 정상 세포에는 손상을 최소화하는 표적 요법 약물의 개발에 현저한 진척이 있어 왔다. 암 환자에 대한 예진은 암의 유형뿐만 아니라, 진행 단계, 퍼진 정도에 대부분 영향을 받는다. 또한, 조직학적 등급과 특정 분자 표지의 존재도 예진을 내리는데 뿐 아니라 개별적인 치료를 결정하는데 유용하다.
시스플라틴(cisplatin, 즉, 시스-디아미네디클로로백금(cis-diamminedichloroplatinum) 또는 CDDP)은 많은 고형 종양(solid tumor)의 중요한 화학요법제로 사용되어 왔다. 그러나, 더 부작용이 적은 새로은 백금 계열의 신약들이 발견되어 왔고 그런 약물들은 중요한 화학요법제가 될 수 있을 것이다. 시스플라틴을 비롯한 다른 화학요법제 또는 잠재적 화학요법제들의 한가지 약점은 이들의 현저한 독성이다.
기관 독성은 화학요법을 방해하기 때문에 암전문의들은 발병 조직이나 기관을 일시적으로 전신 순환에서 분리시킨 후 화학요법제를 주입하여 질병부위에 화학요법을 한정시키는 절차를 발전시켜 왔다. 예를 들면, 동맥내 경피적 골반관류(intra-arterial percutaneous pelvic perfusion)시 고 용량 화학요법제 투여는 진행된 자궁경부암 치료에 적은 부작용으로 치료 효과를 제공할 수 있다. 그러나, 이들 치료는 고도로 침습적이고 전문적 기술과 장비를 필요로 하여 대형 의료 연구 센터에서나 통상 가능하다. 또한, 림프 조직으로 현저히 침습한 국소성 진행 유방암을 포함하여 많은 경우에 조직 고립이 가능하지 않다.
만약 원격 전이를 치료하기 위해 적절한 전신 레벨를 유지하면서 유방 림프관에 화학요법이 집중된다면 국소성 진행성 유방암 치료는 개선될 수 있다. 신보조제 전신 화학요법(neoadjuvant systemic chemotherapy)이 국소성 진행성 유방암의 표준적 치료(LABC)이지만, 이 치료 후 암은 통상 전신적인 질병으로 발전하기 전에 간질(stroma)에는 거의 침범하지 않으면서 우선 림프관을 통해 전파된다. 초기 유방암의 수술적 치료는 배출 감시림프절(draining sentinel lymph node)을 따라 원발적(primary) 종양을 절제하며, 더 나아가 필요하다면 추가 림프완 절제를 한다. 그러나, 이 절차는 만약 감시림프 검체에 대한 완전한 면역조직화학적 분석이 주기적으로 실시되지 않는다면 림프절에서 나노 차원의 전이를 놓칠 수 있으며, 이는 재발 위험을 두 배로 높이는(림프절이 완전히 음성인 경우와 비교해서) 것으로 추정된다. 전신 화학요법과 병행하여 유방과 림프관에 대한 국소적 방사선 조사는 재발 위험을 낮추나 이들 치료는 건강한 조직에 광범위한 손상을 유발한다.
원발 부위가 어디든 많은 암이 림프계를 이용하여(예컨대, 유방암, 난소암, 흑색종) 전이한다. 림프관은 신체의 배출 시스템으로서 조직에서 나오는 폐기물을 치우는데, 전이성 암들은 우선 국소 림프관에“심기(seed)”위해 이 배출 시스템을 따른다. 수술과 화학요법은 이런 초기 전이를 많이 파괴할 수 있으나 많은 이환율(예컨대, 독성 부작용, 고통스러운 림프부종)을 가져 온다. 따라서, 초기 암 치료에 있어 암 조직에 화학요법제를 직접 전달함으로써 이들 부작용을 피할 수 있는 화학요법 치료제가 있다면 이로울 것이다. 또한, 화학요법제가 우선적으로 림프관에 들어 가도록 지시된다면 신체 다른 부위에 있는 정상 세포에 대한 부작용을 피할 수 있을 것이고, 수술 후 및 전신 화학요법 후 암을 재발할 수 있는“씨(seeds)를 파괴하므로 유리할 것이다.
일 실시예에서, 본 발명은 경피성 투여에 의하여 국소 투여용으로 맞춰진 화학요법 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체; 및 경피성(여기서, 경피성은 피하, 피내, 종양주변, 점막하 또는 경피(transdermal)를 칭함) 투여 이후에 림프관내 우선 축적(preferential intralymphatic accumulation)용으로 맞춰진 나노컨쥬게이트(nanoconjugate)를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 경피성 또는 간질 투여 이후에 림프관내 우선 축적용으로 맞춰진 나노담체; 및 상기 나노담체에 결합된 복수개의 화학요법제들을 포함하는 나노컨쥬게이트를 포함한다. 상기 나노컨쥬게이트는 약 10 ㎚ 내지 약 80 ㎚의 치수를 가질 수 있다. 또한, 상기 나노컨쥬게이트는 약 10% 내지 약 50% w/w의 상기 화학요법제들로 채워질 수 있다. 상기 나노담체는 약 20 kDa 내지 약 150 kDa의 히알루로난 중합체일 수 있다. 또한, 상기 나노담체는 덴드리머일 수 있다. 상기 화학요법제들은 시스플라틴(cisplatin), 다른 백금 화학요법 약물류, 멜팔란(melphalan), 위타페린(withaferin) A, 미토마이신(mytomycin) C, 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 도세탁셀(docetaxel), 다우노루비신(daunorubicin) 및 이들의 조합 등으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 상기 화학요법제들은 생분해성 링커를 통해 상기 나노담체에 결합된다. 예를 들면, 상기 생분해성 링커는 산 불안정성(acid-labile) 또는 분해성이다.
일 실시예에서, 상기 화학요법 조성물 및/또는 나노컨쥬게이트는 PEG, HPMA, 폴리글루탐 및/또는 은이 실질적으로 결여되어 있다.
일 실시예에서, 상기 화학요법제는 상기 화학요법제의 표준 정맥내 투여와 비교하여 더 높은 림프 AUC 및 더 낮은 혈장 Cmax를 제공하기 위하여 치료적 유효량으로 존재한다.
일 실시예에서, 본 발명은 암 치료 및/또는 억제 방법을 포함한다. 상기 방법은 약학적으로 허용가능한 담체를 갖는 조성물, 및 피하 투여 이후에 림프관내 우선 축적용으로 맞춰진 나노컨쥬게이트 갖는 조성물을 경피성으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 나노컨쥬게이트는 여기에 기술된 바와 같이 임의의 실시예일 수 있다.
본 발명의 모든 실시예들 및 특징들은 하기 설명 및 첨부된 청구의 범위로부터 더욱더 명확해 질 것이며, 또는 이하 기재된 발명의 실시에 의하여 숙지될 수 있다.
상기 본 발명의 이점과 특징 및 다른 이점과 특징을 더 명백하게 하기 위해서, 발명의 더 특정한 설명이 첨부된 도면들에서 도시된 특이적인 실시예들로 참고로 포함될 것이다. 이 도면들은 발명의 실시예를 예시적으로만 서술하는 것이지 그 범위를 한정하는 것으로 인식하여서는 안 된다는 것을 알아야한다. 본 발명은 첨부한 도면의 사용을 통해 더 특이적으로 상세히 기술되고 설명될 것이다:
도 1a 내지 1b는 화학요법제들의 조직 및 혈장 농도를 예시하는 그래프들을 포함한다. 도 1a는 시스플라틴을 정맥내로 주사하거나 HA-시스플라틴(3.3 ㎎/㎏ 시스플라틴-주성분)을 우측 유방 지방체(right mammary fatpad)로 피하 주사한 이후에 동측(오른쪽) 액와절 및 대측(왼쪽) 액와절에서의 백금의 조직 농도를 보여주는 그래프이다. 도 1b는 시스플라틴(3.3 ㎎/㎏)을 정맥내 주사하거나 HA-시스플라틴을 우측 유방 지방체에 피하 주사한 이후에 시스플라틴의 혈장 농도를 보여주는 농도 대 시간 약물 동력학 그래프이다.
도 2a 내지 2b는 피하 HA-시스플라틴을 우측 유방 지방체에 단일 용량 투여한 이후에 시간에 따른 소변속의 크레아틴 농도를 예시하는 그래프들을 포함한다. 도 2A는 은을 포함하거나 포함하지 않은 3.3 ㎎/㎏ HA-시스플라틴을 투여받은 동물들의 뇨 크레아틴 농도를 보여주는 그래프이다. 도 2B는 은을 포함하거나 포함하지 않은 1.0 ㎎/㎏ HA-시스플라틴을 투여받은 동물들의 소변속의 크레아틴 농도를 보여주는 그래프이다. 도 2A에서, 뇨 크레아틴이 낮은 것은 은을 함유한 고용량 표본들에서 관찰되는 바와 같이 신장 손상의 징후인 반면에, 도 2B에서는 낮은 용량에서는 두 제형들 간에는 현저한 차이가 없었다.
도 3a 내지 3f는 약물 화합물로 단일 주사한 지 30 일 후에 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 신장 조직의 사진들이다. 도 3a는 피하 HA를 투여받은 동물들이 정상 조직들(대조군)을 가졌다는 것을 보여준다. 도 3b는 3.3 ㎎/㎏ 시스플라틴을 정맥내 투여받은 동물들이 피질수질(corticomedullary) 관세포에서 농축핵(pyknotic nuclei)과 같은 퇴행성 변화를 가졌다는 것을 보여준다. 도 3c는 은이 없는 3.3 ㎎/㎏ HA-시스플라틴을 피하로 투여받은 동물들이 피질수질 접합체에서 관세포 괴사의 소병소(minor foci)를 제외하고 상당히 정상적인 소견을 가졌다는 것을 보여준다. 도 3d는 은이 있는 1.0 ㎎/㎏ 피하 HA-시스플라틴을 투여받은 동물들이 수질 관 상피세포에서 광범위하게 농축핵을 가졌다는 것을 보여준다. 도 3E는 1.0 ㎎/㎏ 시스플라틴을 정맥내로 투여받은 동물들이 수질 관 상피 세포에서 농축핵을 가졌다는 것을 보여주며, 짙은 자주색 염색이 증가한 것은 핵 염색과 세포자살이 퍼졌다는 것을 암시한다. 도 3f는 1.0 ㎎/㎏ HA-시스플라틴을 피하로 투여받은 동물들이 최소한의 신장 관세포 팽창 및 퇴화를 제외하고는 정상적인 소견을 가졌다는 것을 보여준다.
도 4a 내지 4f는 약물로 단일 주사한 지 30 일 후에 H&E로 염색된 간 조직의 사진들이다. 도 4a는 HA를 피하로 투여받은 동물들은 정상적인 조직(대조군)을 가졌다는 것을 보여준다. 도 4b는 3.3 ㎎/㎏ 시스플라틴을 투여받은 동물들이 중간정도의 괴사를 드러내었다는 것을 보여준다. 도 4c는 3.3 ㎎/㎏ 시스플라틴을 피하로 투여받은 동물들이 매우 경미한 퇴화를 제외하고는 상당히 정상적인 소견을 가졌다는 것을 보여준다. 도 4d는 은이 있는 1.0 ㎎/㎏ HA-시스플라틴을 투여받은 동물들이 매우 경미한 퇴화를 제외하고는 상당히 정상적인 소견을 가졌다는 것을 보여준다. 도 4E는 1.0 ㎎/㎏ 시스플라틴을 정맥내로 투여받은 동물들이 매우 경미한 퇴화를 제외하고는 상당히 정상적인 소견을 가졌다는 것을 보여준다. 도 4f는 1.0 ㎎/㎏ HA-시스플라틴을 피하로 투여받은 동물들이 정상적인 소견을 가졌다는 것을 보여준다.
도 5a 내지 5f는 약물로 단일 주사한 지 30 일 후에 H&E로 염색된 뇌 조직의 사진들이다. HA(대조군) 및 모든 연구 화합물들(예컨대, 정맥내 시스플라틴 3.3 ㎎/㎏, 피하 HA-시스플라틴 3.3 ㎎/㎏, 은 1 ㎎/㎏이 있는 피하 HA-시스플라틴, 정맥내 시스플라틴 1 ㎎/㎏, 피하 HA-시스플라틴 1 ㎎/㎏)을 피하로 주사받은 동물들은 정상적인 연구결과를 보였다.
도 6a 내지 6f는 주사한 지 30 일 후에 H&E로 염색된 림프 조직의 사진들이다. HA(대조군) 및 모든 연구 화합물들(예컨대, 정맥내 시스플라틴 3.3 ㎎/㎏, 피하 HA-시스플라틴 3.3 ㎎/㎏, 은 1 ㎎/㎏이 있는 피하 HA-시스플라틴, 정맥내 시스플라틴 1 ㎎/㎏, 피하 HA-시스플라틴 1 ㎎/㎏)을 피하로 주사받은 동물들은 정상적인 연구결과를 보였다.
도 7A 내지 7D는 주사한 지 30 일 후에 주사 조직에서의 기본 조직의 사진들이다. HA(대조군) 및 모든 연구 화합물들(예컨대, 정맥내 시스플라틴 3.3 ㎎/㎏, 피하 HA-시스플라틴 3.3 ㎎/㎏, 은 1 ㎎/㎏이 있는 피하 HA-시스플라틴, 정맥내 시스플라틴 1 ㎎/㎏, 피하 HA-시스플라틴 1 ㎎/㎏)을 피하로 주사받은 동물들은 정상적인 연구결과를 보였다.
도 8a 내지 8h는 시스플라틴(3.3 ㎎/㎏ 시스플라틴 주성분)을 정맥내 주사하거나 HA-시스플라틴(3.3 ㎎/㎏ 시스플라틴 주성분)을 우측 유방 지방체로 피하 주사한 이후 백금의 조직 농도들을 도시하는 그래프들이다. 도 8a는 방광에 관한 것이다. 도 8b는 뇌에 관한 것이다. 도 8C는 심장에 관한 것이다. 도 8d는 신장에 관한 것이다. 도 8e는 간에 관한 것이다. 도 8F는 폐에 관한 것이다. 도 8g는 근육에 관한 것이다. 도 8h는 비장에 관한 것이다.
도 9는 림프관내 화학요법제의 합성 및 화학요법에서의 그 기능을 간략히 재현한 것이다.
도 10a 내지 10b는 피하 주사 이후 작용제의 전량을 도시하는 그래프들이다. 도 10a는 시스플라틴 또는 시스플라틴-HA(3.3 ㎎/㎏ 시스플라틴 주성분)을 우측 유방 지방체로 피하 주사한 이후 오른쪽 액와 림프절(RLN) 및 왼쪽 액와 림프절(LLN)에서의 시스플라틴의 조직 농도를 보여준다. 도 10b는 동일한 절차하에서 시스플라틴의 혈장 농도를 보여준다. 주목할 것은 정맥내 시스플라틴에 대한 혈청 Cmax는 4 마이크로그램/mL인 반면에, HA-시스플라틴에 대하여는 3 마이크로그램/mL 미만이다. 시스플라틴이 있는 높은 Cmax는 이 약물과 연관된 내이독성, 신독성 및 말초 신경병증과 직접적으로 연계되어 있다. 이 자료는 HA-시스플라틴이 정맥내 시스플라틴보다 독성이 덜 할 수 있다는 것을 지지하는 것이다.
도 11a 내지 11h는 시스플라틴-HA(10 ㎎/㎏ 시스플라틴 주성분)을 우측 유방 지방체로 피하 주사한 이후 시스플라틴의 농도에 대하여 다양한 조직(예컨대 도 11a는 방광이고, 도 11b는 뇌이고, 도 11C는 심장이고, 도 11d는 신장이고, 도 11e는 간이고, 도 11f는 폐이고, 도 11g는 근육이며, 도 11h는 비장이다)에 대한 조직 농도 그래프들이다.
도 12는 72 시간 이후 시스플라틴 및 시스플라틴-HA에 의한 인간 암 세포 성장 억제를 통한 세포 생존율을 도시하는 그래프이다. 주목할 것은 HA는 독자적으로 검사 농도(최대 10 ㎎/㎏, 데이터 미도시)에 대하여 독성을 전혀 보이지 않았다. 이 그래프는 HA를 CDDP로 컨쥬게이팅하면 모든 세포주들이 유사한 IC50 레벨을 보여줬던 바와 같이 체외 시스플라틴의 항암 효과를 불리하게 영향주지 않았다는 것을 보여준다.
도 13a 내지 13c는 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 MDA-MB-468 유방 림프질 종양을 보유한 누드 마우스들에 피하 주사한 이후 림프관내 담체의 국소화를 도시하는 사진들이다. 도 13a는 마우스들이 좌 유방 지방체에 텍사스 적색-HA 6로 피하로 주사된 시간에 유방 림프 종양 4를 도시한다. 5 시간 및 18 시간 후(각각 도 13b 및 도 13c), 사진들은 HA가 드레이닝 절에서 현저히 국소화되었으며 종양과 함께 발견되었다는 것을 보여준다(GFP-채널은 녹색의 4로 마킹되었고, 텍사스 적색 채널은 적색의 6으로 마킹되었고, 청색 화살 2는 주사 부위이다).
도 14a 내지 14c는 나노컨쥬게이트의 합성의 간략한 다이아그램들이다.
도 15a는 덴드리머의 합성을 도시하는 간략한 다이아그램이다.
도 15b는 작용제들을 나노컨쥬게이트들에 표적시키는 컨쥬게이션을 도시하는 간략한 다이아그램이다.
도 17a 내지 17b는 종양 성장이 HA-시스플라틴 처리에 의하여 음성 대조군과 비교하여 5 주 동안 그리고 종래 시스플라틴 처리와 비교하여 2 주 동안 지연되었음을 보여준다.
도 18은 독소루비신의 방출을 pH 함수로 도시한다. 방출 반감기는 pH 7.4에서 167 시간, pH 6.0에서 107 시간 및 pH 5.0에서 45 시간으로 나타났다.
도 19는 종양 성장이 3 주 및 5 주에서 2 주간 투여한 이후 나노담체-DOX 처리에 의하여 멈춰진 것을 보여주는데, 이는 표준 정맥내 독소루비신(자주색 선)에 비하여 효능이 현저히 향상된 것이다.
도 20a는 포스포에스테르-HA를 도시한다.
도 20b는 포스포에스테르-HA를 사용한 나노컨쥬게이트들의 합성을 도시하는 간략한 다이아그램이다.
도 21a는 피하 HA-시스플라틴 투여의 체내 효능을 도시하는 그래프이다.
도 21b 내지 21c는 2 개의 인간 두경부 편평상피 암종 세포주들(JMAR 및 MDA-1986)에 대한 표준 CDDP 제형(도 21b)의 체외 항증식 특성을 HA-시스플라틴(도 21C)과 비교한 MTS 검사에 의한 표준 세포 생존율 대 약물 농도 곡선을 도시하는 그래프들이다. 주목할 것은 IC50 레벨들이 양 약물들에서 매우 유사한데, 이는 또한 HA 컨쥬게이션이 체외 CDDP의 항종양 활성에 불리하게 영향을 주지 않는다는 것을 시사하는 것이다.
도 22a 내지 22f는 생쥐의 우측 유방 지방체에 HA-독소루비신을 단일 주사한 이후의 분포를 도시하는 사진들이다. 독소루비신은 고유 형광을 가지며 상기 약물-담체 컨쥬게이트의 분포 및 수명은 이러한 시간이 잘 맞춰진 평가에서 잘 관찰될 수 있다. 주목할 것은 대량의 약물-담체가 약물이 9 일의 기간에 걸쳐서 서서히 방출되며 9 일 이후에도 여전히 일부가 잔류 활성이 있는 액와 림프절로 이송된다는 것이다. 계란 모양은 유방에서 주사 부위를 표시하며 가장 짙은 농도(적색)은 액와에서이다.
도 23은 체내에서 상당히 진행된 유방암 종양에서 말기 종양주변 HA-독소루비신 처리를 1 회 한 이후에도 종양 반응이 있음을 도시하는 그래프이다.
도 24a 내지 24e는 마에스트로(Maestro) 다중채널 형광 이미징 시스템상에 영상화된 바와 같이 HA-독소루비신의 체내 트래피킹(trackfficking)을 도시하는 사진들이다. 마우스들에서 생쥐 유방의 국소구역(locoregional) 조직 및 림프절로 약물 및 담체의 섭취는 림프에 4 일 후-주사에서 양호하게 체류한다.
일반적으로, 본 발명은 새로운 화학요법제, 상기 화학요법제를 갖는 약학적 조성물, 상기 화학요법제의 제조방법 및 림프계에 우선 축적을 위해 상기 화학요법제의 투여방법에 관한 것이다. 상기 화학요법제는 종양과 인접한 것과 같이 체내의 실질적으로 임의의 간질 부위로 투여시에 림프계로 우선적으로 경로가 연결되지만, 전신으로 투여되지는 않는 나노담체를 포함한다. 즉, 상기 제형은 정맥내 투여를 통해 투여되지 않는다. 이와 같이, 상기 화학요법제는 림프계 내에서 임의의 크기의 종양, 암세포 또는 다른 악성 종양을 우선적으로 표적한다. 상기 접근법으로 인하여 최초 암으로부터 신체의 다른 부위로 암세포가 퍼지는 것을 효과적으로 억제할 수 있다.
나노컨쥬게이트인 상기 화학요법제의 설계로 인하여 독성인 최대 전신 농도를 생성하지 않도록 림프계를 통한 주사/투여의 부위로부터 전좌(translocation)가 가능하게 된다. 정맥내와 같은 전통적인 투여 경로는 주로 독성으로 회피해야만 하는 약물의 일차-통과 약물동력학을 통해 높은 최대 전신 농도를 생성하게 된다. 그러므로, 상기 화학요법제는 림프계로 우선적으로 전좌하며 림프절에 존재할 수 있는 세포들을 포함하는 림프계에 있는 암세포들을 치료할 수 있다. 이러한 전좌의 모드는 그 제1 촛점으로부터 최초로 퍼지는 경우 많은 암세포들이 따르는 경로를 따르므로, 국소구역 조직을 통한 암세포의 전파를 치료하거나 억제하는데 사용될 수 있다.
상기 화학요법제는 전신으로 퍼져서 농축되기보다는 림프계에 우선적으로 전좌되는 크기와 조성에서 최적화된 나노담체를 포함한다. 여기에 기술된 바와 같은 히알루로난 중합체 담체 및 일부 수지상 담체는 림프계에 특징적인 선택적인 전좌를 갖는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 상기 화학요법제는 피부암 인근에 침전되며 암세포와 유사한 림프계로 들어갈 수 있다.
시스플라틴은 고형 종양에 대하여 가장 광범위하게 사용되는 화학요법제들 중 하나이다; 그러나, 그 독성 및 내성으로 인하여 많은 환자들에게서 그 용량 및 사용을 심각하게 제한하게 된다. 전신 시스플라틴을 림프관으로 침투하는 것은 빈약할 수 있으며(주사된 약물의 1 내지 5% 미만), 국소화된 암에 대한 대체 치료(예컨대, 수술적 제거 또는 방사요법)으로 인해 감염 및 림프부종과 같은 심각한 부작용으로 이어질 수 있다. 이와 같이, 림프계에서 암세포의 축적의 치료 또는 억제방법은 바람직하며, 현재는 국소구역 조직 및 림프관으로 우선적으로 전좌하는 나노컨쥬게이트의 피하 또는 간질 투여를 통해 달성될 수 있다. 상기 나노컨쥬게이트는 화학요법 약물(예컨대, 시스플라틴)과 결합된 FDA-승인 생체적합성(biocompatible) 담체의 나노담체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 나노컨쥬게이트는 시스플라틴을 사용한 통상적인 정맥내 요법과 비교하여 전신 독성을 감소시킬 수 있다. 이로 인하여 림프계가 상기 질병 전파의 초기 내지 말기 단계에 관여된 바와 같이, 유방, 비소세포 폐, 난소 및 두경부 편평상피 세포 암종 및 다른 시스플라틴-민감성 종양과 같은 수많은 시스플라틴 반응성 암의 치료, 억제 및/또는 방지를 가능하게 한다. 또한, 시스플라틴은 실시예 및 도면에서와 같이 여기서는 CDDP 및 Pt라고도 한다.
종래에는, 표적하기 및 나노담체 전략으로 인하여 정상적인 조직들을 독성 용량으로부터 보호해 주면서, 시스플라틴이 종양을 보유한 조직들에 도달하는 용량을 증가시키는 것으로 보고되어 왔다. 이러한 기술은 비표적 또는 수동적으로 표적된 담체들(예컨대, 비수용체) 및 능동적으로 표적된 담체들(예컨대, 항체)로 구분될 수 있다. 중합체 미셀(micelles) 제형(예컨대, NC-6004)과 같은 비표적 담체들 중에는 예비 임상 연구에서 감소된 비특이적 독성을 보였으며 초기 임상 시험으로 발전한 것도 있다. 단계 I 시험에서, N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드(HMPA) 및 백금(예컨대, AP5280)의 비표적 선형 중합체 컨쥬게이트는 정맥내 시스플라틴과 비교하여 최소한의 독성으로 인간에서의 백금의 지속적인 혈장 레벨이 더 높다는 것을 보여주었다. 이러한 비표적 담체들은 향상된 투과성 및 보유 효과(EPR)에 의존하여 약물의 종양 축적을 개선시키지만, 고도로 혈관이 발달되지 않은 종양에서는 EPR 효과는 크게 감소되며 비표적 나노담체들은 장점이 줄어든다. 따라서, 수동적인 표적하기는 림프계에서 볼 수 있는 암세포와 같은 낮은 혈관분포를 갖는 종양의 치료에는 효과적이지 않다.
본 발명에 의하여 림프계 내에서 발견되는 세포와 같이 혈관이 발달되지 않은 암 세포는 종양 부위에 피하 주사를 통해 종양의 국소구역 림프에서 화학요법제를 선택적으로 축적하여 상기 화학요법 약물을 종양이 초기에 가장 전이할 것 같은 림프계 경로를 따라 전달되도록 하여 치료되거나 억제될 수 있다. 이는 생체적합성 나노담체 및 화학요법 약물의 나노컨쥬게이트를 사용하여 수행될 수 있는데, 여기서 상기 나노담체는 담체 없이는 전달하기 곤란한 약물의 부위 선택적 축적을 제공한다.
림프관내 조직에서 축적할 수 있는 나노컨쥬게이트의 피하 투여는 유방암과 같은 수많은 암의 치료에 유익하다. 예를 들면, 유방암은 통상적으로 원발 종양으로부터 일단 퍼져나가면 구역 림프절로 전파되어, 액와 림프절의 적절한 평가 및 치료는 초기 단계 질병에서 중요하다. 현재 사용되는 요법이 안고 있는 현저한 문제점 중에 하나는 화학요법제가 단독 또는 조합하여 전신으로 생성하는 부작용이다. 본 발명의 나노컨쥬게이트는 경이적으로 림프계 및/또는 림프관내 조직에 존재하는 암세포 내에서 축적할 수 있어서 바람직하지 않은 전신 독성 없이 림프 전이에 작용할 수 있다. 나노컨쥬게이트는 림프관내 조직에서 축적용으로 피하 투여될 수 있다. 이와 같이, 나노컨쥬게이트는 유방암을 치료하는데 사용되어 위험에 처해있는 구역 림프절을 우선적으로 치료하고 전신 독성을 회피할 수 있다.
본 발명은 다당류 히알루로난(HA)과 화학요법 약물(예컨대, 시스플라틴 또는 다른 백금)과의 나노컨쥬게이트, 이와 관련된 약학적 조성물 및 방법, 특히 치료성 림프관내 국소화 및 비독성 전신 농도에 도달하기 위한 피하 주사와 관련된 약학적 조성물 및 방법을 포함할 수 있다. 상기 HA 나노컨쥬게이트는 시스플라틴을 유방 림프계로 농축시키는데 효과적인 HA의 분자 중량/크기로 제형되며 독성인 최대 혈장 농도를 감소시킨다. 시스플라틴이 대표적인 화학요법 약물로 여기에 사용된 반면에, 화학요법에 효과적인 것으로 나타나 있는 다른 약물들은 본 발명의 나노컨쥬게이트들에 컨쥬게이트될 수 있다. 또한, HA는 대표적인 나노담체로 사용되지만, 덴드리머와 같은 동일하거나 유사한 생리학적 전달 프로파일과 특성을 갖는 다른 나노담체들이 사용될 수 있다. 시스플라틴은 원자 흡수 스펙트럼에 의하여 기관, 조직 및 림프계에서의 백금 증착을 측정하는데 용이함으로 인하여 여기에 사용되고 기재되었다. 이와 같이, 투여 후 시스플라틴 증착은 상기 나노담체에 컨쥬게이트될 수 있는 다른 화학요법 약물들 중 대표적인 것이다.
일 실시예에서, 상기 화학요법 약물은 수많은 고형 종양에 대하여 우수한 항종양제인 것으로 나타난 시스플라틴이지만, 시스플라틴의 표준 제형은 전신 독성이 현저한 것으로 나타나 있다. 시스플라틴의 나노컨쥬게이트는 전신 독성을 줄여주면서 초기 전이가 가장 나타날 것 같은 림프관에서 백금 레벨을 증가시키기 위해 국소구역 전달계로서 피하에 투여될 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 시스플라틴은 경이적으로 현저한 전신 독성 없이 치료적으로 유효한 적당한 전신 농도를 제공할 수 있다. 본 출원의 도면에서 도시된 바와 같이, HA-시스플라틴은 치료적으로 유효하지만, 표준 정맥내 CDDP의 높은 독성 Cmax 레벨이 없는 혈청 및 전신 AUCs를 제공할 수 있다. 치료적으로 유효한 림프관내 축적용 피하 투여(예컨대, 종양 근방)를 통하여 국소적으로 전달될 수 있는 것과 독성 지속 방출 특성이 더 낮은 것을 조합하면 표준 CDDP보다 더 유리해 진다.
예를 들면, 시스플라틴은 약 20 w/w%의 접합도(conjugation degree)로 히알루로난과 같은 생체적합성 중합체에 접합될 수 있다. 상기 나노컨쥬게이트는 치료적으로 유효한 림프관내 축적 및 전신 농도를 위해 피하 주사를 통해(예컨대, 생쥐의 유방 조직으로) 전달될 수 있다. HA-시스플라틴 나노컨쥬게이트는 체외 인간 유방암에서 표준 시스플라틴 제형과 유사한 항증식 효능을 보였다. 상기 나노컨쥬게이트는 정상 시스플라틴에 비하여 혈장 곡선하 면적(AUC)를 2.7 배 증가시켰지만, 최고 혈장 레벨(Cmax)이 감소되었는데, 이는 전신 독성 감소에 유익한 것이다. 상기 나노컨쥬게이트는 시스플라틴에 비하여 동측 림프절 AUC를 3.8 배 증가시켰다. 상기 나노컨쥬게이트 치료를 받는 동물들의 병리학 연구에 의하면 정맥내 투여된 시스플라틴에 비하여 신장 및 간에서의 괴사 및 염증이 줄어든 반면에 뇌와 림프절은 정상적인 소견을 보였다. 따라서, 상기 나노컨쥬게이트는 히알루로난계 화학요법 약물들은 종양 부담이 최고인 국소 구역 조직 용기(tissue basin)에 화학요법 약물의 "가속(boost)" 용량을 제공하면서 정맥내 요법보다 독성이 덜하면서 약물 용량 레벨을 더 낮출 수 있다.
일반적으로, 상기 나노담체는 클로람부실, 아미오다론, 토포테칸, 위다페린 A, 17-AAG, VEGF 억제제, 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 택솔, 파클리탁셀, 도세탁셀 등을 포함하는 탁산류 중 임의의 것을 포함하는 HSP90 억제제를 포함하는 멜팔란 이외에 펩티드류, 항체들(단일클론성 및 다중클론성), 인터페론, 다른 질소 겨자 클래스 약물들과 접합될 수 있다. 상기 나노컨쥬게이트에 접합될 수 있는 약물들의 일부 예들은 시스플라틴, 다른 백금 약물류, 멜팔란, 미토마이신 C, 독소루비신, 에피루비신, 도세탁셀, 다우노루비신, 클로람부실, 5FU, 파클리탁셀, 빈크리스틴, Her2 항체 및 펩티드, EGFR 항체 및 펩티드, 라파마이신, mTOR 억제제, 위다페린 A, HDAC 억제제, SAHA, Hsp90 억제제, 17-AAG 및 17-DMAG를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 나노담체는 피하 투여에서와 같이 간질 공간으로부터 림프 순환(lymphatic drainage)을 따르는 것으로 나타난 고도의 생체적합성 중합체인 히알루로난(HA) 중합체이다. HA 및 시스플라틴의 나노컨쥬게이트는 비공유 접합에 의하거나 에스테르 또는 히드라진 결합과 같은 생분해성 결합을 통해 형성될 수 있다. 상기 나노컨쥬게이트들은 신체의 어느 곳에나 피하로 주사될 수 있다. 이의 예는 유방암 치료를 위해 암 피검자의 상부 유방 지방체로의 주사를 포함한다.
히알루로난(HA) 중합체는 신체의 연결 조직에서 발견되고 주로 림프계에 의하여 맑게 되는(12 내지 72 시간 턴오버(turnover) 반감기) D-글루쿠론산 및 N -아세틸 D-글루코사민이 교대하는 다당류이다. 림프관을 들어간 후, HA는 수용체 매개 엔도시토시스 및 리소좀 분해에 의하여 대사작용으로 분해되는 림프절로 수송된다. 몇몇 연구에 의하면 HA 합성 및 섭취 증가를 암 진전 및 전이 능력과 상관시켰다. 유방암 세포는 정상 조직보다 HA의 섭취를 더 많이 하여 HA가 높은 P-당단백질 발현에 필요하게 되어 다중 약물 내성에 주요한 공헌자인 것으로 알려져 있다. 또한, 침습성 유방암 세포는 HA에 대한 주요 수용체인 CD-44를 과다발현시켜며 CD44-흡수된 HA가 증식하는데 고농도인 것에 의존하다. 따라서, HA와 화학요법 약물 나노컨쥬게이트는 림프 전이에 대하여 효능이 있을 수 있다.
따라서, HA-약물 나노컨쥬게이트는 림프계로 방향되어 CD-44 수용체들이 과다발현되는 림프절 표면 및 암세포상의 CD-44와 결합하여 림프절에서 축적될 수 있다. 또한, 히알루로난은 CD44 수용체에 대한 리간드이며 CD44 수용체-매개 엔도시토시스 후에 리소좀 분해에 의하여 상기 절에서 대사작용으로 분해되는 림프계에 의해 주로 맑아지게 된다. 이로 인하여 상기 나노컨쥬게이트에 있는 약물이 최초 종양 전파의 부위로 전달되도록 하여 림프절에서의 그 효과를 집중시킨다. 전신 흡수를 림프 섭취와 대항하도록 하여 HA 나노컨쥬게이트는 네이키드(naked) 약물을 사용한 현재 화학요법 전달 기술에 비하여 기관 및 전신 독성을 더 낮게 제공한다.
상기 HA의 분자량은 변화될 수 있지만, 림프계로의 섭취에 현저한 효과를 갖게 되어, 림프 약물 농도에 영향을 주게 된다. 히알루로난은 35 kDa에서 뛰어난 효능을 갖지만, 75 및 150 kDa에서도 투여용으로 사용될 수 있다. 염증 반응으로 인하여, 10 kDa 미만이 가능할 수 있으며, 높은 점도로 인하여 700 kDa 초과는 현실성이 없을 수 있다.
따라서, HA의 분자량은 약 20 kDa 내지 약 150 kDa로, 더 바람직하게는 약 25 kDa 내지 약 100 kDa, 가장 바람직하게는 약 30 kDa 내지 약 75 kDa로 최적화될 수 있다. 이러한 더 낮은 분자량 HA 중합체는 혼합된 약물 및 림프계에서의 나노컨쥬게이트의 축적 특성에 의존하여 더 정교해 질 수 있다. 예를 들면, 30 kDA 내지 50 kDa의 분자량은 약 35 kDa 중합체만큼 유리할 수 있다. 이러한 HA 중합체는 충분히 가용되어 컨쥬게이트된 약물을 림프계로 수송할 수 있다.
또한, 상기 나노담체는 덴드리머일 수 있다. 덴드리머 생성은 림프 섭취 대 모세관 섭취 비율을 최적화하도록 선택될 수 있다. 덴드리머 나노입자들은 물질의 생성 및 말단기 화학에 따라 과도하게 명확한(well-defined) 크기 및 표면 전하를 갖는다. 이의 예로는 PAMAM 덴드리머(폴리아미도아민), 포스포에스테르 덴드리머, 비스(3-히드록시프로필) 인산염 덴드리머, 카르복시 에스테르 덴드리머, 아미노산 덴드리머, 초분지(hyperbranched) 폴리에스테르(예컨대, 분지 폴리아미노산, 분지 폴리에스테르, 분지 폴리포스포에스테르), 다당류(히알루로난, 덱스트란 및 그 술폰산염 유도체들, 셀룰로오스) 등을 포함한다.
상기 나노컨쥬게이트는 전신 노출이 제한되도록 림프계로 우선 전좌되기 위해 종양부근 및 피하 주사용으로 제형될 수 있다. 상기 나노컨쥬게이트는 중성 또는 음성 전하를 사용한 모세관 섭취를 회피하도록 약 10 내지 약 30 ㎚, 바람직하게는 약 15 내지 25 ㎚, 가장 바람직하게는 약 20 ㎚일 수 있다. 피하로 주사된 입자들의 림프 섭취에 대한 최적 크기 범위가 있다: 100 ㎚ 초과 입자들은 대개는 주사 부위로 한정될 것이고, 10 내지 80 ㎚ 입자들은 림프계에 의하여 섭취되며, (20 kDa 미만)의 작은 입자와 분자들은 모세혈관 그물에 의하여 흡수되어 전신 순환하게 될 것이다. 100 ㎚ 초과 또는 5 ㎚ 미만 나노컨쥬게이트는 그다지 실용적이지 않다. 바람직하게는, 상기 나노컨쥬게이트는 10 내지 80 ㎚ 사이, 더 바람직하게는 15 내지 50 사이, 그리고 가장 바람직하게는 20 내지 40 ㎚ 사이일 수 있다.
선행 보고들은 백금 약물들과 안정한 컨쥬게이트들을 형성하는 HA의 능력을 보여준다; 그러나, 본 발명의 나노컨쥬게이트는 HA의 분자량, 약물 혼합 및 피하 투여용 제형과 같은 다른 특징을 갖는다. HA-약물 컨쥬게이트가 림프 증착 및 유지를 위한 피하 투여용뿐만 아니라 적절한 전신 농도용으로 설계되고 제형된 적이 없다. 또한, 피하 HA 나노컨쥬게이트는 유방 지방체로 피하 주사된 이후 생쥐의 액와 수세대(axilla basin)로 배출되는 것으로 나타났다. 따라서, 상기 조성물은 림프계에서 축적되어 림프절과 같은 림프계에서 발견될 수 있는 전이를 치료하도록 종양으로 직접 주사 및/또는 피하 주사용으로 맞춰질 수 있다.
예를 들면, 피하로 주사되는 시스플라틴-HA 나노컨쥬게이트는 시스플라틴을 최대 0.25 w/w 함유하며 식염수에서 10 시간의 반감기로 약물을 방출하였다. 시스플라틴-HA 나노컨쥬게이트는 자유 시스플라틴과 유사한 높은 체외 항종양 활성을 가졌다: MCF7 및 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 시스플라틴-HA IC50 7 ㎍/mL(자유 시스플라틴 IC50 7 ㎍/mL). 시스플라틴-HA 컨쥬게이트는 투여한 지 96 시간 후 주사 부위 이환율(morbidity) 또는 주요 기관 독성의 징후 없이 설치류에서 잘 견뎌졌다. 시스플라틴-HA로 주사한 이후 액와 림프절에서의 시스플라틴의 AUC는 정상 시스플라틴에 비하여 74% 증가하였다.
나노컨쥬게이트에 의하여 전달된 화학요법 약물의 전신 농도는 실질적으로 비독성의 충분히 낮은 레벨로 임의의 전이 또는 전신 암세포를 치료하는데 유효한 충분히 높은 레벨에 도달할 수 있다. 종래에는, 화학요법 섭생에 네이키드 백금 약물을 포함시키면 백혈구 감소, 멀미, 탈모, 급성 신독성, 만성 신독성 및 빈혈과 같은 위험이 증가되는 것을 포함한 몇 가지 독성과 관련되어 왔다. 이와 같이, 유방 및 액와에 한정된 암에 대한 국소구역 치료 접근법은 백금 약물들의 유방암 화학요법에의 사용을 크게 개선시킬 수 있다. 이런 목적으로, 히알루로난은 시스플라틴을 림프절로 국소화시키는 이상적인 담체일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 나노담체는 생분해성 링커를 통해 화학요법 약물에 접합된다. 즉, 상기 링커는 암세포 부근 또는 내에서 상기 화학요법제를 방출하도록 분해되도록 할 수 있다. HA의 경우, 상기 링커는 산-분해성 링커일 수 있다. 산-분해성 링커는 세포로 흡수되고 리소좀으로 전좌되어 상기 링커를 산성화시키고 분해시키는 HA의 능력으로 인하여 HA와 함께 활용될 수 있다. 또한, 상기 암세포를 주변의 저산소성 미세환경은 이러한 링커들을 분해시킬 수 있다. 이로 인하여 상기 HA 나노컨쥬게이트를 흡수하는 암세포들로 직접 약물을 방출시킨다.
산-분해성 링커들의 예로는 히드라존, 에스테르류, 케탈류, 생분해성 중합체 링커류, 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 그 공중합체류, 그 조합들 등을 포함한다. 산 분해성 이황화물에 더하여, 대부분의 비-표적 조직에서보다 이러한 조직에서 더 높은 레벨로 발현될 수 있는 종양 및 주변 조직, 림프계 및 림프절에서 발견되는 효소들에 의하여 인지되는 짧은 펩티드 서열에 한정되지 않는 1,6 제거 링커, 인에스테르 링커, 효소적으로 쪼갤수 있는 링커를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 나노컨쥬게이트는 페질화되지 않는다. 이와 같이, 상기 나노컨쥬게이트는 PEG가 실질적으로 결여될 수 있다. 또한, 상기 나노컨쥬게이트는 HPMA 또는 폴리글루탐류가 결여될 수 있다. 상기 나노컨쥬게이트는 켑슐화되지 않고 제형될 수 있다.
상기 나노컨쥬게이트를 투여하고 림프계에 국소화된 화학요법을 제공하는 능력으로 인하여 다양한 암의 치료가 가능해진다. 더 특이적으로는, 림프계를 통해 전좌하기 시작하는 초기 단계 암의 치료가 가능해 진다. 따라서, 이 투여 경로 및 림프계에서의 축적으로 인하여 상기 나노컨쥬게이트가 유방암, 결장암, 폐암, 비소세포폐, 흑색종, 두경부 암(예컨대, 두경부 편평상피 세포 암종), 난소암, 림프종뿐만 아니라 기타 다른 암과 같은 다양한 암에 국소 요법을 제공하게 한다.
비록 시스플라틴의 국소 주사가 조직 손상으로 인하여 가능한 것은 아니지만 시스플라틴의 은-활성 나노컨쥬게이트를 사용하여 시스플라틴의 생쥐 유방 조직으로의 직접 주사는 연구되었다. 또한, 종양 연구에 의하면 상기 은 활성 나노컨쥬게이트가 조숙한 동물 사망을 유발한다는 것을 보여주었다. 이와 같이, 본 발명의 나노컨쥬게이트는 개발되었으며 은의 사용을 요구하지 않아(즉, 나노담체는 은 활성화되지 않는다), 본 발명의 나노컨쥬게이트는 은과 관련한 독성 부작용을 갖지 않는다. 피하 투여 이후에 은이 없는 나노컨쥬게이트 화학요법제(예컨대, HA-시스플라틴 나노컨쥬게이트)를 사용한 국소화된 화학요법은 다른 치료에 대응하여 주요 기관 병리에 대한 표준 정맥내 투여 시스플라틴과 비교되었다. 상기 나노컨쥬게이트의 피하 투여는 전신 투여보다 현저히 증가된 림프 조직 농도를 이용한 국소화된 나노컨쥬게이트 화학요법을 제공하였으며 생쥐의 신독성을 포함한 기관 독성을 감소시켰다.
종래에는, 히알루로난이 접합 효율을 개선시키는 것으로 보고된 바와 같이, 시스플라틴과 접합되기 전에 질산은과 활성화되었다. 그러나, 심지어 물에 대한 투석을 수차례 연장한 이후에도 컨쥬게이트로부터 은의 모든 자취를 제거하는 것이 극히 곤란하다는 것을 알게 되었다. 상기 치료에 은의 존재로 인하여 병리 검사에서 측정된 바와 같이 은-유도 독성에 빠지는 동물들의 숫자가 현저하였다. 이는 인간 치료에서는 허용되는 것이 아니며, 제형 계획의 변경을 통해 접합 절차로부터 은을 제거하기에 이르렀다. 이후, 결합 반응은 HA-백금 컨쥬게이트의 형성에 궁극적으로 손상을 주지 않는 최상의 접합 효능을 얻기 위하여 은 활성화 없이 재처리되었다. 이는 FDA가 시스플라틴과 HA 양쪽 모두를 인간에의 사용을 위해 승인하고 다른 약물이 복합체의 형성에 필요하지 않으므로 임상적 발전 측면에서 현저한 향상인 것이다. 이렇게 생성된 나노컨쥬게이트는 여전히 체외 다중 유방암 라인에 대하여 뛰어난 항증식 활성을 갖는데, 이는 제형 방법에의 변화로 세포계 약물 효능에 영향을 주지 않는다는 것을 나타내는 것이다.
나노컨쥬게이트에 대한 약물동력학 및 조직 분포는 정맥내 시스플라틴 용량에 비해 HA-시스플라틴 나노컨쥬게이트의 림프 전달이 국소 림프 수대(local lymph basin)에서의 약물 레벨을 향상시켰다는 것을 지시하였다. 동등한 백금 투여량에서, HA-시스플라틴 담체는 림프절 수대 농도를 크게 증가시켰는데, 이는 상기 담체가 정맥내 약물 투여 경로에 비하여 훨씬 더 효과적으로 림프계를 통해 림프절로 백금을 전달시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다. 또한, 상기 HA-시스플라틴 나노컨쥬게이트는 체외 안정성을 충분히 오랫동안 유지하여 접합된 약물을 방출하기 이전에 림프계로 트래픽하거나 국소화되는 것처럼 보였다.
림프계에서 나노컨쥬게이트가 우선적으로 축적하는 것은 정맥내로 전달된 시스플라틴과 비교하여 백금에의 전신 조직 노출을 감소시키지만, 그 서방 특성(예컨대, 링커의 선택적 전좌 및 선택적 분해)로 인하여 HA-시스플라틴 나노컨쥬게이트는 정맥내 시스플라틴과 비교하여 대부분의 조직들에서 백금 AUC를 평균 200% 증가시켰다. 이는 정맥내 단회 주입(bolus infusion)을 통한 신속한 퇴화 및 제거와 비교하여 더 서방 프로파일로부터 시간에 걸쳐 (HA-시스플라틴 전달된 피하로부터) 백금의 축적에 의한 것인 것 같다. 또한, 이러한 증가된 조직 레벨은 2 가지 장점을 갖고 있다: (1) HA-시스플라틴 용량을 50% 감소시키고 동등한 조직 레벨을 여전히 유지할 수 있도록 하여 동일한 조직 결과를 달성하는데 요구되는 백금의 용량이 더 낮음; 및 (2) 국소 구역 림프절로 전이한 유방암을 갖는 대부분의 환자들은 전신으로 매크로전이는 하지 않는다고 해도 마이크로전이는 할 것 같다는 것이 공지되어 있기 때문에 약물의 치료 전신 레벨을 유지하는 것이 이 약물을 보조제 요법으로 활용하는데 중요하다. 그러므로, 이 치료법은 국소구역 종양 수대 및 림프계에 약물 전달의 국소 "가속"을 동시에 제공하면서, 덜 침습적이고 투여 스케줄이 줄어든, 예컨대, 매일 정맥내 주입인 현재 이용되는 요법에 비하여 매주 피하 투여를 활용하여 매일 전신 정맥내 요법을 대신하여 이용될 수 있다. 또한, 시스플라틴의 장기간의 독성이하 레벨이 단회의 고 용량에 비하여 종양 세포 세포자살을 실질적으로 개선시킬 수 있기 때문에 HA-시스플라틴의 AUC가 크면 클수록 종양 세포자살의 비율을 증가시킬 수 있다.
시스플라틴의 더 심각한 부작용은 정맥내 투여 직후 경험되는 높은 최대 혈장 레벨(Cmax )로 인한 것일 수 있기 때문에, 최근의 출원에는 기계적으로 규칙적인 투여 요법이 비록 환자들에게 불편과 비용을 증가시키지만 독성을 감소시키는 것을 관찰되었음을 포함하고 있다. 이와 같이, 국소적으로 투여된 나노컨쥬게이트는 식염수에서의 반감기가 표준 정맥내 시스플라틴 제형에 대하여 1 시간 미만인 것에 비해 약 10 시간 정도 담체로부터 약물을 서서히 방출하고, 상기 담체로부터 방출된 이후에 시스플라틴이 조직 또는 림프로부터 전신 순환으로 확산하는데 시간이 걸린다는 것 때문에 높은 최대 레벨에 이르는 것이 방지된다. 비록 전체 혈장 백금 AUC가 정맥내 시스플라틴을 사용한 것에 비하여 훨씬 크다고 하지만, 피하 HA-시스플라틴은 정맥내 시스플라틴(도 1a 내지 1b)에 비하여 훨씬 낮은 최대 혈장 농도를 갖는다. 피하 HA-시스플라틴 주사 이후에, 혈장 백금이 최고에 달해 평평해져서 일정한 레벨로 유지되기까지 2 시간의 지체가 있었다. 이 방출 프로파일은 림프 조직으로부터 지체되고 지속된 방출과 일치하는 것이다.
도 2A 내지 2B는 나노컨쥬게이트 백금의 훨씬 높은 AUC에도 불구하고 정맥내 시스플라틴과 국소화된 나노컨쥬게이트 사이에 신장 독성에서 현저한 차이가 있음을 지시하지는 않았다. 고 용량 은 제형은 제 1 주일 내에 뇨 크레아틴 레벨의 감소 및 동물 사망을 유발하였는데, 이는 바람직스럽지 않은 것이다. 은 제형의 심각한 체내 독성은 은 제형의 약간 더 높은 체내 항증식 활성(표 1)은 비특이적인 은 독성으로 인한 것일 수 있음을 시사하는 것이다. 비록 어떠한 손상도 검출되지 않았지만, 크레아틴 시험은 단일 중간 투여 이후에 미미한 신장 손상을 검출할 만큼 충분히 민감할 수 없을 수 있지만, 우리는 백금 독성의 좀 더 직접적인 증거를 위해 병리학적 검사를 수행하였다. 따라서, 일 실시예에서, 나노컨쥬게이트 제형은 실질적으로 은이 결여되어 있다.
시스플라틴의 단일 용량 주사 이후 30 일에 수행한 병리학적 검사로 인하여 피하 HA-시스플라틴과 정맥내 시스플라틴 제형들 사이에는 현저한 신장 및 간 차이가 존재한다는 것을 드러내 보였다. HA-시스플라틴의 신장 백금 AUC가 시스플라틴의 것보다 2 배라고 할지라도, HA-시스플라틴 처리된 동물들에서 신장 세포 괴사의 발생이 더 낮고 상태가 덜 심각한 것은 정맥내 시스플라틴에 비해 인내도(tolerability)가 향상되었다는 것을 시사하는 것이다. 신장에서 HA-시스플라틴의 백금 AUC가 크면 클수록 관찰된 독성이 더 낮다는 것을 반박하는 것 같지만, 정맥내 시스플라틴에 비하여 신장에 의하여 여과된 혈청 약물 레벨이 더 낮은 최대 피크(Cmax)로 인한 것일 수 있다.
간 병리학에 의하면, 시스플라틴에 비하여 HA-시스플라틴의 독성이 감소되었음을 시사하지만, 어느 동물도 팔에 3.3 ㎎/㎏ 시스플라틴이 투여된 이후 정상적인 병리상태를 갖지 않았다. 시스플라틴-유도 간독성 반응성 산소종의 생성으로 인하여 발생하는 것으로 알려져 있다. 히알루로난은 간에서 대사하며 글리코사미노글리칸류는 간보호 효과를 갖는 공지된 항산화제이므로, HA 나노컨쥬게이트는 백금 간독성으로부터 보호할 수 있다.
따라서, 일 실시예는 유방 지방체로 피하 주사한 이후에 유방 림프계에서 시스플라틴을 농축시키는 HA와 시스플라틴의 나노컨쥬게이트를 포함한다. 이러한 나노컨쥬게이트는 서방 특성으로 인하여 표준 정맥내 시스플라틴에 비하여 더 높은 림프계 AUC 및 더 낮은 혈장 Cmax로 이어진다. 상기 나노컨쥬게이트는 신장, 간, 신경 또는 간독성과 같은 실질적인 기관 독성을 유발하지 않으며; 병리 검사에서 표준 정맥내 시스플라틴에 비하여 기관 독성을 낮추는 것으로 보였다. 상기 나노컨쥬게이트는 주사 부위 또는 림프절에 독성을 유발시키지 않는다. 나노컨쥬게이트의 림프관내 우선 전좌 및 축적으로 인하여 유방암 요법을 다른 화학요법제들과 조합하여 사용하는 장점을 제공한다.
본 발명에 따라, 상기 나노컨쥬게이트는 단독으로 사용되거나 독성이 현저하게 덜한 조합 요법의 일부로 사용되도록 시스플라틴을 효과적으로 전달할 수 있다. 나노컨쥬게이트를 사용한 림프관내 전달 모델은 표준 시스플라틴 제형 이상으로 현저하게 국소구역 절 조직에서의 약물 농도를 증가시킬 뿐만 아니라 서방 약물 속도를 보여주어 더 낮은 Cmax 레벨로 시간에 따라 기관 독성을 더 낮춰 준다. 현저하게 다른 유일한 조직 레벨은 약물 주사에 동측인 액와 림프절이었다. 이는 피하로 유방에 직접 주사되는 나노컨쥬게이트를 사용한 국소구역 절을 투과하는 시스플라틴의 농도를 거의 두배로 하는 것이라는 것으로 전달되는 것이다. 그러므로, 림프계에 우선적으로 전좌되는 나노컨쥬게이트는 약물의 농도를 현저하게 가속시켜 림프계에 국소구역 종양 세포 발전을 치료하고/하거나 억제하게 된다.
또한, 나노컨쥬게이트는 액와에 대한 표적 나노담체로서 히알루로난을 사용하는 화학요법제의 림프관내 전달로 인하여 담의 전파를 치료하고/하거나 억제하는데 성공적일 수 있다. 림프관내 우선 전달은 위험에 처한 국소 림프절을 우선적으로 치료하고 정맥내 또는 경구 약물 투여와 관련된 전신 독성을 회피할 수 있다. 림프관내 우선 전달은 전신 농도를 감소시키지만, 전신 순환으로 퍼져있는 암세포의 전파를 치료하고/하거나 억제하는데 적당한 레벨을 유지한다. 이와 같이, 상기 나노컨쥬게이트는 림프절 절개에 통상적으로 제공되지 않을 나노전이를 포함하는 감시 림프절이 있는 환자에게 치료법을 제공할 수 있다. 상기 나노컨쥬게이트는 표준 요법에 비하여 좀 더 서방인 방식으로 적절한 전신 약물 레벨을 제공하지만, 림프절 절개로 제거되지 않는 종양 세포를 함유할 위험이 있는 국소 구역 절 조직에 매우 요구되는(much-needed) 가속도 제공한다. 또한, 상기 나노컨쥬게이트는 국소적으로 향상된 유방암에 대한 신보조제(neoadjuvant)로서 사용될 수 있으며, 암의 퇴행을 치료하거나 억제할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 나노컨쥬게이트를 갖는 약학적 제형은 하기 전달 경로용으로 제형되지 않는다: 경구, 전신, 경피, 비강내, 좌약, 정맥내 또는 내벽(intraluminal) 투여.
상기 약학적 제형은 경피성, 피내, 점막 또는 점막하, 피하, 간질, 지방내(intrafat), 종양주변, 근육내 주사 점막, 종양주변으로, 흡입 및 점적주입(instillation) 용으로 맞춰질 수 있다.
피하 또는 간질 투여 이후 림프계로 우선적으로 전좌하는 본 발명의 나노컨쥬게이트는 놀랍고도 예상밖이다. 이는 유방 조직에서와 같이, 피하 또는 간질 주사 이후 림프계에 우선적으로 전좌하고 축적하는 것에 부분적으로 기인한다. 또한, HA 또는 덴드리머를 시스플라틴과 같은 화학요법제와의 나노컨쥬게이트는 표준 정맥내 작용제(예컨대, 시스플라틴 및 독소루비신)보다 유사하거나 조금 높은 AUC 이지만 Cmax 농도는 더 낮은 치료제 전신 용량을 제공한다. 이러한 발견들을 조합하면 이러한 약물들이 Cmax는 더 낮으며 이것은 시스플라틴 및 독소루비신 독성과 관련되어 있기 때문에 독성은 낮으면서 전신 질병을 치료할 수 있는 다른 이점을 가지고, 국소 구역 질병을 갖고 있는 환자들에 대한 뛰어난 보조제 요법으로 사용가능해진다. 또한, HA 나노컨쥬게이트는 OAE 및 신장 병리학 분석에 의하여 국소 주사 부위, 신장 및 내이 신경 독성에 관하여 표준 시스플라틴 또는 독소루비신보다 실질적으로 덜 독성이 있다는 것은 놀라운 것이다. 독성이 낮다는 것은 건강한 조직에 손상을 주지 않고 조직 또는 간질 공간으로, 옆 또는 인접하게 직접 주사를 가능하게 한다는 것이다. 따라서, 나노컨쥬게이트는 원발성 종양, 림프네 암세포 및 전신 암세포에 치료법을 제공할 수 있다.
요약하면, 나노담체 전달 시스템은 (1) 동물의 암을 치료하는 효능 및 능력, (2) 독성 프로파일이 낮다는 점 및 (3) 더 오랜 용량 구간(정맥내 작용제를 매주 또는 2주 대 매일)이라는 점에서 표준 약물 제형보다 뛰어나다. 피하 주사는 약물 분출의 위험을 안은 정맥내 주입 펌프에 부착되는 것보다 덜 침습성인 치료 옵션을 환자에게 제공한다.
상기 나노컨쥬게이트는 피하와 같은 적당한 투여를 위해 상기 나노컨쥬게이트를 제형하는 허용가능한 담체와 함께 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 피하 투여용으로 적합한 제제는 주로 예를 들면, 물에 녹을 수 있는 염인 물에 녹을 수 있는 형태인 활성 성분의 수용액 및 또는, 예를 들면, 참기름과 같은 지방 오일 또는 예를 들면, 올레산 에틸 또는 트리글리세라이드류와 같은 합성 지방산 에스테르류와 같은 적당한 친유성 용매 또는 운반체를 사용하는 적당한 유성 주사 현탁액과 같은 활성 성분의 다른 현탁액, 또는 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 소르비톨 및/또는 덱스트란과 같은 점도 증진제 및 필요하다면, 안정화제를 함유하는 수용성 주사 현탁액이다.
본 발명의 방법에 따르면, 본 발명의 조성물은 시간에 걸쳐 점진적으로 주입하는 주사에 의하거나 임의의 다른 의학적으로 허용가능한 모드에 의하여 투여될 수 있다. 임의의 의학적으로 허용가능한 방법은 상기 조성물을 환자에게 투여하는데 사용될 수 있다. 여기에 선택되는 특정 모드는 물론, 선택된 특정 약물, 치료되는 피검자의 상태의 심각성 또는 치료 효능에 요구되는 용량에 의존할 것이다. 일반적으로 본 발명의 방법은 임상적으로 허용가능하지 않은 부작용을 유발하지 않고 활성 성분의 유효 레벨을 생성하는 임의의 모드를 의미하는 의학적으로 허용되는 임의의 투여 모드를 이용하여 수행될 수 있다.
투여를 위해, 상기 나노컨쥬게이트는 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방산 글리세리드류, 고급 지방산류 또는 프로필렌 글리콜의 에스테르류와 같은 수용성 또는 비수용성 용매에 이를 용해, 현탁 또는 유화시키고, 필요하다면 가용화제, 등장화제, 현탁제, 유화제, 안정화제 및 보존제와 같은 통상적인 첨가제와 함께 제제로 제형될 수 있다. 바람직하게는, 상기 나노컨쥬게이트는 수용액에서, 바람직하게는 행크 용액(Hanks's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 생리 식염 완충액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액에서 제형될 수 있다.
상기 나노컨쥬게이트는 예컨대, 단회 주사 또는 연속 주입과 같은 주사에 의한 피하 투여용으로 제형될 수 있다. 주사용 제형은 첨가된 보존제와 함께 앰플 또는 다중 투여 용기와 같은 단위 투여량 형태로 제시될 수 있다. 상기 조성물은 유성 또는 수용성 운반체에서의 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제조제(formulator agent)를 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물의 멸균 주사 형태는 수용성 또는 실질적으로 지방족 현탁액일 수 있다. 이러한 현탁액은 적당한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용한 업계에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 또한, 살균 주사제는 예를 들면, 1,3-부탄디올에 녹은 용액과 같이, 비독성인 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매에 녹은 살균 주사 용액 또는 현탁액일 수 있다. 이에 채용될 수 있는 허용가능한 운반체 및 용매 중에는 물, 링거 용액 및 등장 염화 나트륨 용액이 있다. 또한, 살균 고정유는 용매 또는 현탁 매질로 통상적으로 채용된다. 이 목적을 위해, 합성 모노글리세라이드류 또는 디글리세라이드류를 포함하는 임의의 풍미없는 고정유가 채용될 수 있다. 올레산과 같은 지방산류 및 그 글리세리드 유도체들은 특히, 그 폴리옥시에틸화된 형태인 올리브유 또는 피마자유와 같은 천연의 약학적으로 허용가능한 오일류인 주사제의 제조에 유용하다. 또한, 이러한 유성 용액 또는 현탁액은 장쇄 알코올 희석제 도는 분산제를 포함할 수 있다.
유방암 전이에 림프계가 관여한다는 것은 확고부동하지만, 림프절 전이 및 질병 발전을 극복하는데 효과적인 비수술적인 치료법은 아직 존재하지 않는다. 림프 전이의 화학요법이 처한 가장 큰 도전은 전신 흡수 및 독성을 회피하면서 림프절에 실제로 보유되는 작용제의 양을 최대화시키는 것이다.
본 발명에 의하여 제공된 림프적으로 국소화된 화학요법은 유방암 요법에 있어서 혁신적인 도약이다. 화학요법 약물에 대한 HA 또는 덴드리머 나노담체는 표적화되고 림프 전달 접근법을 활용하여 국소적으로 진전된 유방암을 치료할 수 있다. 림프관내 약물 전달용 림프 표적 나노담체를 유방암에 사용하는 용도는 고도로 혁신적이며 지금까지 수행되어 본 적이 없다. 표준 화학요법 약물에 의하여 도달될 수 있는 것보다 더 약물 국소 구역 AUC를 증가시킴으로써, 이 기술은 국소적으로 진전된 유방암에 현저한 신보조제 요법을 제공한다. 또한, 약물 보유력과 약물을 림프계로부터 서방하는 표적 접근법을 갖는 것은 약물의 전신 독성을 감소시켜 종양 효능은 더 나으면서 독성은 낮춘 조합으로 이어지게 된다.
본 발명은 그 사상 또는 본질적인 특징들로부터 벗어나지 않으면서 다른 특이적인 형태로 실시될 수 있다. 기재된 실시예들은 모든 태양에서 예시적인 것이지 한정적이지 않은 것으로 고려되어야 한다. 그러므로, 본 발명의 범위는 앞선 발명의 설명에 의하기보다는 첨부된 청구의 범위에 의하여 지시된다. 청구의 범위의 균등의 의미 및 범위 내에 오는 모든 변화는 그 범위 내에 포용된다. 여기에 재인용되고/되거나 도시된 모든 참고 자료들은 여기에 특이적인 참고 자료로 포함된다.
실험
미생물 발효로 얻어 지는 히알루로난(HA)은 히알루론산 나트륨(Sodium hyaluronate)으로 라이프코어 바이오메디칼사(Lifecore Biomedical, 챠스카, 미네소타)에서 구입하였으며, 더 이상의 정제 없이 사용하였다. 헤파린 용액은 아브락시스 제약(Abraxis Pharmaceutical Products(숌벅, 일리노이))에서 구입하였다. 다른 모든 시약은 피셔 사이언티픽(Fischer Scientific, 피츠버그, 펜실베니아) 또는 시그마 알드리치(Sigma Aldrich, 센 루이스, 몬태나)에서 구입하였는데 ACS 등급 또는 그 이상이었다. 밀리 큐(Mili-Q) 물이 모든 실험에서 사용되었다. MDA-MB-468LN 세포주는 런던 헬스사이언스 센터의 앤 챔버스(Ann Chambers, London Health Sciences Center, 런던, 온타리오)의 협찬으로 제공되었고, MCF-7과 MDA-MB-231 세포들은 미 티슈 컬쳐 컬렉션(American Tissue Culture Collection, ATCC, 마나사스, 버지니아)에서 구입하였다. 동물 실험 과정은 캔자스 대 동물 치료 및 사용 위원회(University of Kensas Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다. 스프라그-돌리(Sprague-dawley)쥐는 찰스 리버 랩(Charles River Laboratory, 윌밍톤, 메사추세츠)에서 구입하였다.
1. HA-시스플라틴 컨쥬게이트의 합성
앞서 보고한 절차에 의해 활성제인 실버 니트레이트를 첨가 및 첨가 없이 시스플라틴을 HA(35,000g/mol)에 접합시켰다(S. Cai, Y. Xie, T. Bagby, M. S. Cohen, M. L. Forrest. HA-시스플라틴 컨쥬게이트를 이용한 림프관내 화학요법(Intralymphatic chemotherapy using hyaluronan-cisplatin conjugate). J. Surg . Res . 147:247-252 (2008); Y. I. Jeong, S.T. Kim, S. G. Jin, H. H. Ryu, Y. H. Jin, T. Y. Jung, I. Y. Kim, S. Jung 이온복합체 형성에 기초하여 시스플라틴이 포함된 히알루론산의 나노입자 Cisplatin-incorporated hyaluronic acid nanoparticles based on ion-complex formation. J Pharm Sci . (Epub): (2008)), 통상적으로, HA(100 mg) 및 시스플라틴 (45 mg)을 H2O (20 mL)에 녹여 상온(약 25℃), 암실, 아르곤 하에서 4일 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 여과(0.2-㎛ 나일론 멤브레인)하고 빛이 차단된 상태로 4℃에서 48 시간 동안 H2O (10,000 MWCO; Pierce, 록포드, 일리노이)에 투석하였다. 투석에 이어, 정제되지 않은 생성물을 농축하고 4℃에서 저장하였다. 시스플라틴 대체율은 원자 흡수 분광법 (Atomic Absorption spectroscopy, AAS) (Varian SpectrAA GTA-110 흑연로)으로 결정되었다. 상기 노(furnace) 프로그램은 다음과 같다. 섭씨 25도에서 80도로 가열, 2초간 유지, 120도까지 가열, 10초간 유지, 1000도까지 가열, 5초간 유지, 2700도까지 가열, 2초간 유지, 25도까지 20초에 걸쳐 냉각. 흑연 파티션 튜브는 40 개 표본들 처리 마다 2800℃에서 7 초간 굽는 것으로 청소하였다. 아르곤이 주사 및 담체 기체로 사용되었다. 이로 생성한 컨쥬게이트는 [PtCl(H2O)(NH3)2]OOCO-HA이지만 HA-시스플라틴, 시스플라틴-HA, HA-CDDP, HA-Pt로 불린다(도 9).
시스플라틴 구조는 폴리카르복실 중합체와 함께 착물형성에 자신을 사용하는데, 하나 또는 이상의 염화물이 대체됨으로써 폴리머와 함께 불안정한 에스테르 결합이 가능해 지기 때문이다. 시스플라틴은 HA와 통상 0.20 w/w 플라티넘/착물( 약 65% 시스플라틴 결합 효율)로 고도로 접합되었다. 종래 연구에서 시스플라틴 컨쥬게이트는 HA를 AgNO3와 우선 활성화시켜 합성되었다. 그러나, 이후 이 단계를 제거하는 것이 접합을 현저하게 감소시키는 것이 아니며 이로써 잠재적인 은 독성을 낮춘다고 알려졌다. AAS는 5 ng/ml 검출 한계에서 10 내지 450 ng/mL (R²=0.999) 범위의 선형 곡선을 생성하였다. 농축된 표본들은 물로 희석하여 분석에 앞서 선형 분석 범위 내로 넣었다. HA와의 형광 컨쥬게이트는 텍사스 레드 하이드라지드(Texas Red Hydrezide)를 HA에 농축함으로써 형성되었다. 30% H2O: EtOH 10 mL 내의 HA(35,000 MW, 100 mg)가 2-클로로-1-메틸피리디님 요오드(33mg)와 트리에틸아민(35 μL)과 함께 활성화되었다. 텍사스 레드 하이드라지드(Anaspec Inc., 산호세, 캘리포니아)(DMSO 0.4mL에 2mg)를 첨가한 후 그 혼합물을 24 시간 동안 환류시켰다. 상온에서 48시간 동안 물로 투석하여 정밀검사(workup)가 진행되었고 이후 동결건조되었다. 결합 효율은 λ 588 nm에서 81,800 M-1cm-1 몰 흡수계수(molar extinction coefficient)를 이용하여 결정되었다.
시스플라틴은 개시 비율 0.5 w/w 시스플레인/HA를 이용하여 전형적인 0.25 w/w 시스플레인/착물 접합으로 HA에 고도로 접합되었다. 0.75 w/w 시스플레인/착물을 시도하였으나 효율은 감소하였다(표 4).
2. 체내 세포 독성
림프관을 타고 전이하는 유방암 세포주 MDA-MB-468LN을 10% 우태 혈장, 1% L-글루타민 및 0.4 mg/mL G418(제네티신)이 보충된 수정된 Eagle's 배양액 알파에서 유지시켰다. 다른 유방암 세포주 MDA-MB-231과 MCF-7이 ATCC에서 제공한 프로토콜에 따라 유지되었다. 앞선 증식 연구에서 세포들을 트립신처리 하였고 96-웰 플레이트(5,000 세포/웰)에 파종되었다. 24시간 후, 시스플라틴, HA-시스플라틴(은 활성화된 또는 되지 않은) 또는 HA를 첨가하고(n=12; 7 개 농도) 72시간 후 인산염 완충 식염수 10 ㎕에 용해된 레사주린 블루(resazurin blue) 각 웰에 첨가하였다(최종 농도 5 nM). 4시간 후, 형관광도측정기(fluorophotometer) (SpectraMax Gemini;Molecular Devices, 서니베일, 캘리포니아)를 이용하여 웰 형광도를 측정(λex 560 nm, λex 590nm)하였다. 각 플레이트에 대한 식염수(양성)와 무세포(음성) 대조 사이의 중간점에서 IC50이 결정되었다.
72시간에 걸쳐 세포 증식의 감소로서 세포 독성이 결정되었다. 은이 있거나 은이 없는 HA-시스플라틴 컨쥬게이트 모두 세포배양에서 자유 약물(free drug)과 유사한 세포독성을 가졌다(표 1). 세 가지 다른 인간 유방암 세포주를 이용하였을 때 시스플라틴과 HA-시스플라틴 간에 주목할 만한 독성의 차이는 검출되지 않았다 (표 1). HA는 10 mg/ml에서 아무 독성을 보이지 않았는데, 식염수 대조군과 비교하여 모든 세포주에서의 테스트의 상한치이다(데이타 미도시).
3. 약물동력학과 조직 분배(tissue distribution)
스프라그-돌리 생쥐의 왼쪽 경정맥에 이소플루렌(isoflurane) 마취 하에 캐뉼라를 삽관하고 밤새 회복되도록 하였다. 이후 이소플루렌 마취 하에 정맥에 시스플라틴(1.0 또는 3.3 mg/kg; n=5) 또는 피하에 HA-시스플라틴(1.0 또는 3.3 mg/kg 해당 시스플라틴; n=5)을 주사하였다. 상기 동물의 최우측 유방 지방체에 피하 주사하였다. 투약 후 0, 5 분, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48 및 96 시간에 캐뉼라를 통해 전혈을 채혈(100 ㎕)하고 헤파린으로 사전처리된 2-ml 원심분리 튜브에 넣었다. 상기 캐뉼라는 채혈 전후에 식염수로 세척하고 헤파린 처리하였다. 전혈은 5분 간 17,000 X g 로 원심분리하였고 혈장은 분석 시까지 -80℃로 동결하였다. 동물들은 치료 후 안락사시켰다. 우측 동측 액와 림프절(처리측), 좌측 대측 액와 림프절(대조측) 그리고 주요 기관들(간, 신장, 심장, 비장, 폐, 뇌, 근육, 방광)을 절제하고 0.9% 식염수로 세척한 후 -80℃에서 분석 시까지 보관하였다. 조직 표본은 앞서 보고한 절차 (S. Cai, Y. Xie, T. Bagby, M. S. Cohen, M. L. Forrest. HA- 시스플라틴 결합체를 이용한 림프관내 화학요법(Intralymphatic chemotherapy using hyaluronan-cisplatin conjugate). J. Surg . Res . 147:247-252 (2008))로 준비하였다. 통상적으로, 조직 표본 50 mg을 6.7% 질산 1.5 ml로 80℃에서 2 시간 동안 소화시켰다. 소화 후 샘플들을 균질화시키고(Tissue Tearor, BioSpec Products Inc., 바틀스빌, 오클라호마) 원심분리 하였다. 상청액과 혈장 표본은 합성 섹션에서 기술한대로 AAS로 분석하였다. 스프라그-돌리 생쥐의 피하 HA-시스플라틴과 정맥내 시스플라틴이 약물동력학적으로 비교되었다. HA-시스플라틴이 동측 배출 액와 림프절에, 정맥내 시스플라틴 대조군이 축적된 것보다 우선적으로 축적되었다(도 1); 이 우선적 축적은, 체외에서 HA로 부터 시스플라틴이 해리하는 반감기가 10시간임에도 불구하고 주사 후 48시간에도 명백하게 이루어졌다. 국소적으로 주사될 경우 HA-시스플라틴의 동측 액와 림프절 AUC0 -96 HRS은 정맥내 시스플라틴(P<0.001) 보다 3.8배 더 높았고, HA-시스플라틴의 림프절 농도 피크치(CMAX)는 정맥내 시스플라틴보다 6.2배 높았다.
시스플라틴 요법의 용량을 제한하는 가장 주목할만한 요소인 독성은 신독성이며, 다음이 신경독성인데 둘 다 최대 혈장 농도에 크게 영향을 받는다. 최대 혈장 농도 시 정맥내 시스플라틴은 피하 HA-시스플라틴 보다 3.1배 더 강했다. 시스플라틴이 전신 순환으로의 방출은 느렸고, 이로인한 HA-시스플라틴의 혈장 AUC는 시스플리틴의 정맥내 요법보다 3.9 배 많았는데, 이는 나노담체 HA-시스플라틴이 림프관에 더 오래 머무는 것과 부합한다(도 1b, 표 2). 모든 조직의 농도 그래프들은 보조자료에 포함되어 있다(도 8A 내지 8H).
또한, 스프라그-돌리 생쥐(200 내지 250 g 암컷, Charles River)에 이소플루렌 마취하에 0.9% 식염수에 시스플라틴-HA 또는 시스플라틴(3.5 mg/kg 당량 시스플라틴) (n=5)을 우측 유방 지방체에 피하 주사(100 ㎕)하였다. 동물들은 음식과 물을 섭취하여 회복하게 하였다. 동물들을 주사 1, 4, 12, 24, 48 및 96 시간 후 이소플루렌 과다용량으로 안락사시켰다. 기관과 조직들을 0.9% 식염수로 세척하여 분석 시까지 동결(-80℃) 하였다. 시스플라틴의 HA로의 접합은 배출 림프절의 국소 시스플라틴 농도에 충격을 주었고 전신 농도에는 가벼운 영향을 미쳤다(도. 10A-10B, 표. 5). 96 시간에 걸친 실험에서, 시스플라틴-HA의 곡선하 면적(AUC)은 우측 림프절에 접합하는데 이곳은 주사 부위를 배출하고, 시스플라틴 보다 식염수(P=0.0001)가 74% 더 많았으며, RLN은 검사 기간 중 조직 농도를 증가시켰다(도 10A). 비배출 좌측 림프절(LLN)에서의 시스플라틴-HA의 AUC는 식염수(p=0.12)의 시스플라틴과 크게 다르지 않았다.
자유 시스플라틴의 돌발 방출은 혈장 농도 프로파일에서 보인 반면에(도 10B), 시스플라틴-HA는 혈장으로 더 오래 지속된 방출을 보여주었다. 이는 시스플라틴 요법의 용량-제한적 독성이 최대 혈장 농도에 크게 영향받기 때문에 현저한 것이다. 시스플라틴-HA와 시스플라틴 사이에 혈장 AUC에 현저한 차이는 없다(p=0.13). 따라서, 시스플라틴-HA를 사용한 국소 요법은 유방 림프관에 가속 요법을 제공하면서, 원격 전이를 치료하는데 충분한 혈청 농도를 생성할 수 있다. 시스플라틴의 다른 기관들로의 분포는 연구 기간 동안에 현저히 상이하지 않았다(도 11, 표 5).
4. 장기적인 독성연구
스프라그-돌리 생쥐(암컷 35 마리)를 각 5 마리 씩 다음의 7 개 연구 그룹으로 무작위로 나누었다; 1.0 mg/kg 피하 주사 HA-시스플라틴(은 포함 및 불포함; 백금은 1.0 mg/kg 시스플라틴에 해당), 3.3 mg/kg 피하 주사 HA-시스플라틴(은 포함 및 불포함), 1.0 및 3,3 mg/kg 정맥내 시스플라틴, 및 피하 HA (대조군; HA는 3.3 mg/kg HA-Pt에 해당). 각 동물에게는 30 내지 40일 간의 연구 기간 초에 단회 대용량을 투여하였다. 연구 첫 두 주일 간 소변 표본을 매일 수거하였고 3 주와 4 주째에는(은 포함 HA-시스플라틴을 3,3 mg/kg 투여하는 그룹 제외) 매 4 일 마다 수거하였다. 동물들의 스트레스를 줄이기 위해 피검자들을 대사 케이지(metabolic cage)에 12 시간 동안 넣고 약 5 ㎖의 소변을 채취하였으며, 그 후 짚이 깔린 케이지로 보내 다음 번 채취 시까지 있게 하였다. 소변 표본은 17,000 X g 에서 5 분 간 원심분리하였고 크레아티닌 분석 때까지 -80 ℃에서 보관하였다.
뇨 크레아티닌을 퀀티크롬 크레아티닌 분석 키트(QuantiChromeTM Creatinine Assay Kit)를 사용하여 제조자 지침(BioAssay Systems, 헤이워드, 캘리포니아)에 따라 분석하였다. 표본의 크레아티닌 농도는 (OD표본 5 - OD표본 1) /(OD연구 5 - OD연구 1)X [STD] (mb/dL)와 같이 계산되었다. OD표본 5, OD표본 1, OD연구 5, OD연구 1 은 각각 5 분 및 1 분에서 표본과 표준의 OD510 nm 값들이다.
동물들은 연구 마지막에(30일) 안락사시켰고 간, 양쪽 신장, 비장, 폐, 심장, 우측(동측) 및 좌측(대측) 액와 림프절 및 뇌를 손상 없이 절제하여 고정을 위해 80% 알코올 포르말린 용액에 밤새 저장한 후 슬라이드 마운팅하였다. 헤마토실린 & 이오신 염색(H&E)을 이용한 마운팅은 Veterinary Lab Resources사(켄자스 시티, 캔자스)에 의해 수행되었다. 병리학적 검사는 본 연구에 연관 없는(blinded) 면허된 수의 병리학자(캔자스대 메디칼센터, 캔자스 시티, 캔자스주)가 실시하였다.
뇨 크레아티닌 레벨은 신장 기능과 신장 독성의 간접적인 지표가 되는데, 크레아티닌 배출 감소는 신 기능 감소에 해당하며, 신장 독성 또는 손상을 의미할 수도 있다. 고 용량 은 요법(3.3 mg/kg)을 받은 쥐들에게서 현저한 신독성을 관찰한 바, 3일에 크레아티닌 배출은 30% 감소하였고 4 일에 70%가 감소하였다. 이 그룹의 모든 동물들이 약과 관련된 악액질(achexia)로 인해 1 주일 내에 죽었다. 반면에, 은 없는 고용량 HA-시스플라틴을 투여 받은 쥐들은 현저한 독성을 보이지 않았고 연구 기간 중 크레아티닌 레벨은 거의 투여 전 수준을 유지하였다. 두 그룹에서 동물들이 저 용량(1.0 mg/kg) 은 함유 HA-시스플라틴 또는 은 불포함 HA-시스플라틴 치료(p>0.05, 1 일 내지 30일)를 받은 경우 두 그룹 모두에서 유사한 신 기능이 관찰되었다(도 2A 및 2B).
30 일 간에 걸친 독성 연구의 마지막에 쥐들을 안락사시키고 완전한 병리검사를 실시하였다. 뇌조직과 주사 부위의 아래 조직(underlying tissue)은 모든 연구 그룹에서 현미경적 변화가 없었다. 고 용량 시스플라틴 정맥 주사 및 은 없이 제형된 HA-시스플라틴 피하 주사에서 림프절의 매우 미약한 변화가 검출되었다. 은 함유 HA-시스플라틴의 저 용량 피하 주사에서 잘 증식된 소형 림프구들이 거의 또는 전혀 난포 구조를 보이지 않음으로써 림프 조직은 정상 소견을 보였다(도 6A-6F). 저 용량 시스플라틴 정맥과 저 용량 HA-시스플라틴 피하 주사 모두를 투여받은 쥐들에 있어서 동양혈관(sinusoids)에 약간의 염증이 생김으로써 아주 미약한 변화가 간에서 관찰되었다(도 4A-4F). 고 용량 시스플라틴 정맥과 고 용량 HA-시스플라틴 피하 주사를 투여받은 쥐들에 있어 약간의 동양혈관 괴사가 관찰되었는데; 괴사는 정맥내 시스플라틴을 투여받은 그룹에서 더 심하였다. 또한, 저 용량 정맥내 시스플라틴을 투여받은 쥐들의 60%가 요세관(renal tubule) 부종을 동반한 요세관으로의 출혈을 포함하여 경미한 신장 괴사를 보였다(도 3A 내지 3F). 반면에, 저 용량 피하 HA-시스플라틴를 투여받은 쥐들은 한 마리도 신장 괴사를 보이지 않았다. 이와 유사하게, 고 용량 피하 HA-시스플라틴을 투여받은 5 중 1(20%)과 비교하여 고 용량 정맥 시스플라틴을 투여받은 경우 5 중 4 마리(80%)가 경미한 신장 괴사를 진단받았다(표 3). 전체적으로, 병리학적 연구에 의하면 은 없는 HA-시스플라틴 컨쥬게이트가 종래 정맥내 시스플라틴 치료에 비해 모든 용량 범위에서 간 및 신장에 모두 낮은 독성을 보였다. 또한, 치료된 동물에 있어서 뇌에서의 신경독성, 또는 아래 근육 조직에 국소 주사 부위 독성은 관찰되지 않았다(도 7A 내지 7D).
5. 체외 약물 방출
시스플라틴-HA로부터 시스플라틴의 체외 방출 속도는 식염수가 섞이고 섞이지 않은 인산염 완충액에서 측정되었다. 시스플라틴-HA를 3,500 MCWO 투석 백(bag)(Pierce 사)에 첨가하고 인산염 완충 워터 배스(water bath) (pH 7.4, 37℃) 또는 생리 식염수(140mM)에 두었다. 샘플들을 소정의 시점에서 투석 백으로부터 꺼내고, 남은 시스플라틴의 농도를 AAS로 결정하였다. 복합체로부터 시스플라틴이 방출되는 속도를 인산염 완충 식염수와 물에서 각각 결정하였다. 식염수 내의 염소 이온이 시스플라틴을 더 빨리 치환시켜 방출 속도를 높일 것으로 예상되었다. 약물의 방출은 물에서 42시간, 생리 식염수에서 10 시간의 반감기를 갖고 일차 방출 약동학(first order release kinetics) 수치에 근접하였다. AAS가 검출 한계를 5 ng/mL, 수량화 한계를 10 ng/mL (5% 표준편차)으로 하여 10 내지 450 ng/mL (R²=0.9998) 까지 선형 농도 곡선을 생성하였다. 시스플라틴-HA 스파이크 된(spiked) 조직으로부터의 시스플라틴 회복은: 혈장, 82±4%(STD); 림프절, 92±2%; 방광, 88±1%; 뇌, 94±0.3%; 심장, 97±1%; 두 신장, 98±1%; 간, 100±1%; 폐, 94±1%; 근육, 95±1%; 비장, 97±1% 이었다. 시스플라틴 스파이크된 조직의 시스플라틴 회복은: 혈장, 80±3%; 림프절, 92±6%; 방광, 86±3%; 뇌, 93±10%; 심장, 93±5%; 두 신장, 100±2%; 간, 100±7%; 폐, 95±8%; 근육, 100±5%; 비장, 96±9% 이었다.
도 16은 37℃에서 물과 PBS 용액에 대한 체외 HA-시스플라틴 방출 속도를 도시한다. 도 6은 관련 반감기를 나타낸다.
6. 체외 세포 독성
5% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에서 96-웰 플레이트에 세포주들을 살포하였다. 24시간 후, 시스플라틴, 시스플라틴-HA, 또는 HA를 첨가하였고(n=12 및 7 개 농도), 첨가 72시간 후, 10 μL PBS에 용해된 레아주린 블루를 각 웰에 도포하였다(최종 농도는 5 mM). 4 시간 후, 웰 형광도를 측정(λex 560 nm, λem 590 nm) (SpecraMax Gemini, Molecular devices) 하였고, IC50은 식염수(양성) 및 무세포(음성) 대조군 사이의 중간점으로 측정되었다.
시스플라틴-HA 컨쥬게이트는 세포배양시 자유 시스플라틴과 비슷한 독성을 보였다. 독성은 고도로 전이적인 인간 유방암 세포주 MCF7과 MDA-MB-231에서 평가하였다(도 12). 두 세포주 모두에서, 시스플라틴-HA(IC50 7 ㎍/mL, 시스플라틴 기준)와 시스플라틴(IC50 7 ㎍/mL)의 독성에서 유의할만한 차이가 없었다. HA는 검사한(최대 10 mg/mL, 데이타 미도시) 농도 범위에 걸쳐서 인간 세포에 독성을 보이지 않았다. 표 7은 IC50 수치들을 보여주고 있다.
7. 원자 흡수 분광법( AAS )
체외 표본들(n=3)과 혈장 표본들(n=5)을 0.1% 질산으로 각각 200 배와 10 배 희석하여 분석하였다. 조직 표본들(림프절 제외)을 50 mg 조직을 6.7% 질산 1.5 mL에 80℃에서 1 시간 동안 소화시켜 제조하였다. 림프절들을 조직 10 mg을 사용하여 유사하게 처리하였다. 소화 후 표본들을 균질화하였다.(Tissue Tearor, BioSpec Products Inc, 바틀스빌, 오클라호마). 모든 표본들을 원심분리하고(17,000 X g, 20분) 상청액을 분석하였다. 분석은 흑연로와 파티션 튜브를 갖는 Varian SpectrAA GTA-110 상에서 수행하였다. 샘플들(21 μL)은 오토샘플러(autosampler)를 사용하여 주사되었고 0.1% 질산 19 μL를 더하였다. 캘리브레이션 기준 150, 300, 및 450 ng/mL 마다 샘플들을 각각 10개 단위로 묶었고, 품질 대조 표본(150 또는 300 ng/mL)은 5개 단위로 묶었다. 전체 캘리브레이션 곡선을 0.1% 질산에서 1 내지 450 ng/mL 범위(10 개 농도)에서 준비하였다. 시스플라틴 회복은 조직 블랭크(tissue blanks)을 시스플라틴 또는 시스플라틴-HA(50 ㎍/g)로 스파이킹하고 상기와 같이 처리함으로써 측정되었다. 노 프로그램은 다음과 같다: 섭씨 25 에서 80℃로 가열, 2초간 유지, 120℃까지 가열, 10초간 유지, 1000℃까지 가열, 5초간 유지, 2700℃까지 가열, 2초간 유지, 25℃까지 20 초에 걸쳐 냉각. 흑연 파티션 튜브는 40 샘플 처리 마다 2800℃에서 7 초간 굽는 것으로 청소하였다. 아르곤이 주사 및 담체 기체로 사용되었다.
8. 체내 이미지화( In vivo imaging )
나노담체가 항암 약물을 유방 국소구역 림프관에서 나노 및 미세전이 부분으로 전달하기 위해, 담체는 유방 부위로부터 발병된 림프절로 배출되어야 한다. 음 이온 나노담체가 그 역할을 하는 것을 증명하기 위해, 우리는 EDAC-매개 아미드 커플링(EDAC-mediated amide coupling)을 이용하고, 이어 투석하여 자유 염료(0.1% w/w 염료/담체는 분광분석적으로 측정됨)를 제거함으로써 35 kDa 히알루로난(hyaluronan)을 텍사스 레드 하이드라지드(AnaSpec, 산호세, 캘리포니아)와 커플링하여 형광 음이온 나노담체를 만들었다. 우리는 형광 나노 입자들(50 μL 식염수에 0.25 ㎍)을 림프관 전이를 보유하는 이종이식편의 유두 하에 피하 주사하였다.
형광도는 자동노출 기능이 있는 냉각된 CCD 카메라를 사용하여 10-nm 띠 별로 구획하여 520 내지 720nm 범위에서 측정되었다. 이미지들은 자동 디컨볼류션 툴(deconvolution tool)을 사용하여 스펙트럼별로 섞이지 않게 하였는데, 이는 음식물 중에 함유된 클로로필로 인한 피부와 내장의 자동 형광을 제한하기 위한 것이다.
림프관 유방 종양 전이를 챔버스와 연구진이 수립한 절차에 따라 누드 마우스에 유도하였는데 림프관 전이 유방 종양 세포주 MDA-MB-468LN은 이들 연구진이 제공한 것임을 밝힌다. 누드 마우스(25 내지 30g 암컷, Charles River)를 펜토바비탈(50 mg/kg)로 마취하고 MDA-MB-468LN 100 μL(107 세포/mL)을 정상 체위에서 좌측 두 번째 흉부 유방 지방체에 작은 절개를 통해 주사하고 나중에 상처 클립으로 막았다. 4 내지 5주 후 종양이 만져 졌다(100 내지 300 mm3). 이미징 이전에 쥐들을 안락사시켰고 텍사스 레드-HA(식염수에 10 mg/mL, 20 μL)를 좌측 유방 지방체에 피하 주사하였다. 주사 부위를 5분 동안 부드럽게 마사지하고 5시간 및 18시간 후(CRI Maestro Flex, CRI 사, 워번, 메사추세츠) 445 내지 490 nm 여과된 할로겐 여기 광선과 515-nm 롱패스 에미션 필터(emission filter)를 이용하여 형광 이미지를 찍었다.
주사 4시간 후, 형광 이미지 (λex 480 nm, λem 500 내지 720 nm 스펙트럼 디컨볼류티드)는 음이온 나노 입자들이 액와 림프절 그룹과 부합하는 구역에서 축적됨을 보여준다(도 13A). 이러한 초기 시점에, 일부 담체가 액와 림프절 종양으로의 트래피킹이 명백하지만, 많은 담체들이 여전히 주사 부위 주변에 있다. 이 이미지들은 꼬여 있지 않기(deconvoluted) 때문에, GFP와 텍사스 레드 신호들은 노랗게 보이지 않는다. 소프트웨어는 텍사스 레드가 종양 부위에 있음을 확인하는 겹치기 도구(colocalization tool)를 포함한다. 텍사스 레드 라벨된(labeled) 나노담체들의 축적이 관상 영상(coronal view)에서 더 확실히 나타난다(도 13B).
주사 18 시간 후, 나노담체는 종양을 감싸는 액와 림프절에 집중되어 있었다(도 13C). 주목할 것은 담체 형광이 주사 부위에 없을 뿐 아니라, 간으로의 외견상 전파도 없는데 이는 액와 림프절에서의 매우 높은 레벨과 대비된다. 관상 영상에서 담체가 종양부근에서 국소화된 명백한 부분들이 나타난다. 코바야시(Kobayashi) 등은 양이온 PANAM 나노 입자들이 림프관 종양으로 들어가지 않고 그 주위로 이동하는 것을 관찰하였다. 그러나, 음이온 운반체들은 체류 시간이 더 길었고, 그럼으로써 담체와 항암 약물들로 하여금 종양 속으로 들어가게 한다.
도 13A 내지 13C는 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 MDA-MB-468 유방 림프질 종양을 보유한 누드 마우스들에 피하 주사한 이후 림프관내 담체의 국소화를 보여준다. 도 13A는 마우스들이 좌 유방 지방체에 텍사스 적색-HA 6로 피하로 주사된 시간에 유방 림프 종양 4를 도시한다. 5 시간 및 18 시간 후(각각 도 13B 및 도 13C), 사진들은 HA가 드레이닝 절에서 현저히 국소화되었으며 종양과 함께 발견되었다는 것을 보여준다(GFP-채널은 녹색의 4로 마킹되었고, 텍사스 적색 채널은 적색의 6으로 마킹되었고, 청색 화살 2는 주사 부위이다).
9. 활성( Activity )
독소루비신이 나노담체에 접합한 경우 유방암 세포에 대한 이들의 항암 활성에 현저히 영향을 주지 않았다. 10% w/w 컨쥬게이트가 세포에 도포되었고, 그로부터 72시간 후 세포 증식이 알라마 블루 분석법(ssay) (Invitrogen 사)를 이용하여 측정되었다. 세 개의 공격형(aggressive) 인간 유방암 세포주에서 상기 컨쥬게이트와 자유 독소루비신 사이에 항암 활성에 대한 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 이와 유사하게, 시스플라틴 컨쥬게이트를 배양 중인 유방암 세포에 도포하였다. 전반적으로, 항암 약물의 나노담체와의 접합은 체외 증식 억제를 감소시키지 못했다. 이것은 나노담체로부터 항암 약물이 배양액으로 방출되고, 이후 자유 약물로 흡수되기 때문일 것이다. 그러나, 현미경 검사에 의한 흡수 연구 결과 약물들은 음이온 담체와의 접합에도 불구하고 활성을 가질 수 있는 것으로 보인다.
10. 합성 계획
도 14A는 덴드리머-시스플라틴 컨쥬게이트의 합성을 보여준다. 덴드리머의 비스-염히드록시프로필 인산염 말단은 카르복실산으로 전환되고 이후, 염소를 치환함으로써 시스플라틴과 복합체를 형성한다. 이로 생성된 복합체는 강력한 DNA 가교제인 시스-[Pt(NH3)2Cl(H2O)]+ 를 생리학적 조건에서 천천히 방출할 것이다. 예비 연구에서, 우리는 플라티넘 클로라이드를 담체 카르복실산으로 치환함으로써 -C(=O)OO-PtCl(NH3)2 컨쥬게이트를 형성하여 히알루로난 담체에 결합한 시스플라틴 컨쥬게이트를 형성하였다. 유사한 계획이 시스플라틴을 음이온 덴드리머 담체와 접합하는데 사용될 수 있다. 덴드리머의 비스-염히드록시프로필 인산염 말단을 데스마르틴 페리오디네인(DesMartin periodinane, DMP), IBX, 또는 IBA 등으로 완만히 환원하고 카르복실산으로 오존화 반응하여 카르복실산으로 전환하였다. 또한, 숙신 무수화물/DMAP를 사용하여 처리함으로써, 이것이 탄소 4개로 말단을 연장하고 나노담체를 확대한다 해도, 히드록실록실을 카르복실산으로 전환할 수 있다. 복합체들은 투석 또는 세파덱스(Sephadex)에 의해 정제되고, 나노담체상의 약물의 양은 흑연로 원자 흡수 분광법에 의해 측정될 것이다. 시스플라틴 컨쥬게이트의 최적량은 10% 내지 50% 치환, 더 바람직하게는 약 20% 내지 40%, 그리고 가장 바람직하게는 약 25% 내지 35% 치환일 수 있다. 예를 들면, 최대 25% w/w 접합으로 인하여 체내 Pt(II)-히알루로난 나노 입자들의 림프관 섭취가 현저할 수 있었다.
도 14B는 덴드리머-에피루비신 컨쥬게이트의 합성을 보여준다. 비스-염히드록시프로필 인산염 말단은 하이드라지드로 전환되고, 이는 에피루비신과 함께 pH에 민감한 히드라존(hydrazone)을 형성한다. 이로 생성된 복합물은 세포(예컨대, 종양 세포)의 세포내 관(endocytic vessels)의 pH가 낮은 것에 반응하여 에피루비신을 방출할 것이다. 나노담체 컨쥬게이트들은 암 세포에 축적된 안트라사이클린(anthracyclines)의 양을 대폭 증가시킬 것이다.
히드라존 링커를 이용하여 나노담체 상에 안트라사이클린 13-카르보닐과 이식된 히드라지드 사이에 pH에 민감한 컨쥬게이트들을 형성하였다. 히드라지드 링커는 문헌 절차를 이용하여 애디픽 디히드라지드(adipic dihydrazide)를 카르복실산 잔기로 그래핑(graphing)함으로서 형성되었으나, 더 직접적인 전략은 나노담체 히드록실 말단을 직접 히드라지드로 전환하는 것인데, 이는 덴드리머의 크기를 유지할 것이다. 아민 말단은 담체의 양이온적 특성을 증가시킬 것으로 예상되나, 히드라지드(약 pH 4.5)의 낮은 pKa는 세포외적으로 이 효과를 최소화시킬 것이다. 또한, 히드록실 말단의 부분적인 전환은 소기의 약물 로드(drug load)를 접합하기 위해 충분한 히드라지드를 생성할 수 있다. 덴드리머의 비스-염히드록시프로필 인산염 말단를 카르복실산으로 전환한 후, 활성화하고 그 말단를 히드라진으로 처리하여 히드라지드 말단을 형성하였다. pH 6.5에서 가역 하이드라존 링커를 형성하기 위해 담체와 에피루비신을 배양하고 이후 접합되지 않은 약물을 제거하기 위해 투석 또는 세파덱스 정밀검사(Sephadex workup)를 실시하여 에피루비신 컨쥬게이트가 형성된다. 에피루비신 접합의 최적량은 약 5% 내지 0%가 될 수 있고, 더 바람직하게는 약 8 내지 15%, 가장 바람직하게는 약 10% 내지 12%일 수 있다.
도 14C는 덴드리머-도세탁셀 컨쥬게이트의 합성을 보여준다. 상기 도세탁셀은 보호된 말릭산으로 전환되고, 새 카르복실산이 에스터 결합을 통해 덴드리머의 비스-염히드록시프로필 인산염 말단에 직접 링크된다. 이로 생성된 복합체는 컨쥬게이트가 세포내 용기와 내인성 에스트라제의 낮아진 pH에 반응하여 도세탁셀을 방출할 때까지 도세탁셀 독성으로부터 조직을 보호할 것이다. 에스터 결합을 사용한 도세탁셀의 C2 위치상으로 이식된 말릭산 링커를 이용하여, 도세탁셀은 수정되지 않은 덴드리머의 비스-염히드록시프로필 인산염 말단과 접합할 수 있다. 도세탁셀 C2-OH는 1, 2-O-이소프로필리덴-말릭산과 축합되어, 도세탁셀의 보호된(protected) 말릭산을 형성할 수 있다. 아세트산으로 탈보호하면 말릭산을 산출하고 이는 덴드리머의 하이드록실 팔과 직접 결합될 수 있다. 이로 생성된 컨쥬게이트는 pH 또는 산성 소포에 있는 내인성 에스트라제에 반응하여 도세탁셀을 방출할 수 있다. 주사 후 예상된 반감기는 4 시간을 초과하는 것으로 예상되며, 우리의 음이온 림프관 나노담체의 관한 예비 연구에 기초하여 림프관 흡수에 필요한 충분한 시간을 허용하게 된다. 도세탁셀 접합의 최적량은 약 5% 내지 20% 사이가 될 수 있으며, 더 바람직하게는 약 8% 내지 15%, 가장 바람직하게는 약 10% 내지 12%일 수 있다.
도 15A는 본 발명에 따른 덴드리머의 합성을 보여주며, 우리가 현재 흡수를 더 향상할 수 있는 다른 "팔" 그룹과 치환체를 시험하고 있음에도 불구하고, 전반적인 합성 전략을 제시한다. 다중-팔 중심으로부터 카보디이미드 커플링(carbodimide coupling) 후에 펜던트 히드록실을 탈보호함으로써 우리는 여러 세대의 폴리에스터 중심을 구축하고 있다. 다른 세대들은 이들 펜던트 그룹에서 구축된다. 2 내지 4 세대 이후에, 우리는 아인산염 가지 단위(phosphite branching unit)(P3)으로 전환한다. P3 브랜치와 펜던트 히드록실이 짝이 되고 이어서 셀레니윰 전환(selenium conversion)으로 셀레노포스페이트(selenophosphate)와 짝이 되는데 테트라졸(tetrazole)이 사용된다. "결함" 브랜치들(붉은 별표시)은 탈보호되는 경우, 이온화 가능한 그룹을 산출하기 위해 선택적으로 포함되며, 그리하여 이온화 가능한 그룹의 집합을 제한하고 용해도을 높이기 위해 중심 내에 이온화 가능한 그룹들을 통합시킨다. 결함 브랜치의 비율을 바꿈으로써 전하도(charge degree)는 임의로 조절 가능하다. 2 내지 3 세대 후, 폴리-셀레노포스포에스터 브랜치들은 유기 과산화물과 완전히 산화되고, 말단 히드록실은 표준적인 방법으로 독소루비신 접합을 위해 시스플라틴 접합 또는 히드라존을 위해 카르복실산으로 전환된다. 우리의 예비 연구에서 이 양 중심 전략이 합성을 용이하게 할 수 있다고 결정하였다. 인산염기는 셀레늄 보호될 수 있는데, 만약 그렇지 않다면 그 인산염기는 접합 과정 중에 팔 그룹을 쪼개기 위해 충분히 반응성이 있다; 그러나, 나중의 세대들에 있어서 내부 셀레노포스페이트들은 후속 세대들에게 탈보호 산화를 위해 너무 방해가 된다. 이 문제들을 극복하기 위해, 우리는 카르복시 에스터 중심을 도입하는데, 이는 생분해능을 개선하고 바깥 쪽 인산염기의 산화 과정 중 입체적 조밀도를 경감시킨다. 완전한 카르복실산 덴드리머들을 개발하였으나, 이들은 소수성 약물들과 고도로 대체되면 수용성이 되지 않을 것이다. 우리는 항암제로서 시스플라틴과 독소루비신을 사용하는데 이들이 두경부암(HNC)과 유방암을 포함하는 다수의 암에 일차 치료약으로서 대단히 효과가 좋기 때문이다.
도 15B는 표적 덴드리머의 합성을 보여 준다. 비스-염히드록시프로필 인산염 말단은 프로피오릭산과 축합되어 알카인-덴드리머를 형성한다. 또한, COOH 또는 CONHNH2 를 프로파길(propargyl)과 축합하여 알카인-덴드리머를 형성한다. "클릭(click)" 방법론을 이용하여, 덴드리머와 EGF의 아지드가 수성 조건에서 결합된다. 이 전략은 예컨대, HER2 항체, EGFR 항체, PSMA 등과 같은 다른 표적 작용제들에 적용될 수 있다.
나노컨쥬게이트들은 상피 성장 인자 수용체(GFR)를 통해 유방암 세포를 표적할 수 있는데, EGFR은, 나쁜 예후를 가져 오며 공격형 유방암 세포에 의해, 고도로 과다표현(overexpressed)된다. 또한, EGFR은 세포 내로 삼켜져 EGF에 접합된 나노담체들을 흡수하는데 사용될 수 있다. 비록 EGFR이 다른 조직들에 의해 더 낮은 수준으로 표현된다고 해도, 림프관에 나노담체가 수동적으로 국소화함으로써 비특이적 상호작용을 최소화할 것이다. 전신 나노담체와는 달리, 물리적 특성만으로 음이온 나노담체들을 림프절에 국소화할 수 있듯이, 표적 부분(targeting moiety)은 세포 섭취를 개선시킬 수 있다.
상피 성장 인자(EGF)는 세포와의 상호작용을 감소시키지 않고 나노 입자들을 링크시키는데 사용될 수 있는 라이신 잔기(lysine residue)를 갖는 6054-Da 단백질이다. 덴드리머의 말단기는 덴드리머가 시스플라틴(COOH), 도세탁셀(OH)또는 에피루비신(C=ONHNH2)에 사용되는냐에 의존하므로, "클릭" 유형의 링커를 사용하기가 가장 용이하여 모든 화학 반응이 최종 단계로서 수용성 용액 내에서 이루어질 수 있다. EGF는 azido-PEG-NHS 에스터르(Quanta Biodesign Ltd, 포웰, 오하이오)를 이용하여 기능화된다. 또한, 다른 표적 치료제들이 각각의 아지드(azide)를 형성함으로써 용이하게 첨가된다. 알카인은 덴드리머 말단에, DCC/DMAP 화학과 프로파길 알코올(COOH 말단) 또는 프로피오릭산(OH와 C=ONHNH2 말단)중 어느 하나를 이용하여 첨가될 수 있다. 이로 생성된 표적 알카인-덴드리머는 컨쥬게이트를 형성하기 위해 소량의 구리 촉매를 갖는 EGF-아지드와 혼합되고, 이어서 세파덱스 또는 투석 정제를 거쳐 결합되지 않은 EGF를 제거하게 된다.
11. 종양 반응
100 내지 200 ㎣ 종양이 액와 림프절 패키지에서 발달된 지 약 4 주 후에 누드 nu/nu 마우스에게 1x106 세포(MDA-MB-468LN 인간 유방암 세포)가 유방 지방체로 이식되었다. 동물들은 무작위로 각 5 마리의 4 개 치료 그룹으로 구분되었다: 정맥내 식염수, 피하 HA, 정맥내 시스플라틴 또는 피하 HA-시스플라틴. 이 지점에서, 상기 동물들에게 각 용량이 투여되었다. 상기 HA-시스플라틴 및 HA 그룹들에서, HA-시스플라틴(Pt 함량 기준으로 3.3 ㎎/㎏) 또는 HA(3.3 ㎎/㎏)는 100 mcL 식염수에 용해되어 종양주변으로 피하 주사되었다. 상기 시스플라틴 및 식염수 그룹에서, 100 mcL 식염수 또는 바로 단순 식염수에 용해된 시스플라틴(3.3 ㎎/㎏, Pt-기준)은 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사되었다. 모든 연구 그룹들에서, 제 2 용량이 1 주일 후에 투여되었다. 종양 부피는 캘리퍼스와 하기 식을 이용하여 매주 측정되었다: 부피 = 0.52 x (폭2 * 길이). 동물들은 종양 부피가 1000 ㎟을 초과하거나 신체 점수 지수가 2 미만으로 떨어지는 경우 안락사되었다.
도 17A 내지 17B는 종양 성장이 HA-시스플라틴 처리에 의하여 음성 대조군과 비교하여 5 주 동안 그리고 종래 시스플라틴 처리와 비교하여 2 주 동안 지연되었음을 보여준다.
상기 HA-시스플라틴 제형은 시스플라틴과 비교하여 종양 성장 5 주 만큼 지연시켰으며 상기 HA-시스플라틴 처리된 동물들에게서는 아무런 독성도 관찰되지 않았다. HA-시스플라틴이 정맥내 시스플라틴과 유사한 효능을 가질 것으로 예상된 반면에, 예상밖으로 현저한 것은 HA-시스플라틴이 초기에 종양 성장에서 더 오래 지체되었는데, 이는 종양에 도달하는 약물의 더 높은 농도로 인하여 초기 치료 기간 동안에 종양 성장을 더 효과적으로 억제시켜 준다는 것을 시사하는 것이다. 이는 피하로 투여된 HA-시스플라틴이 이러한 체내 유방암 모델에서의 표준 시스플라틴 제형보다 더 나은 효능은 아니더라도 적어도 동일한 효능을 갖는다는 확고히 지지하는 증거를 제공한다.
12. 독소루비신 방출
HA는 HA에서 글루콘산의 카르복실산기에 있는 아디픽 디히드라자이드(ADH)와 축합되었다. 우선, ADH 및 HA(HA 이당류 1 당량당 ADH 1 당량)가 HCl로 pH 4.7로 조절된 물에 용해된 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염(N-3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride) 2 당량과 혼합되어 최종 HA 농도가 약 1% w/w가 되었다. 20 분 후에, 상기 혼합물은 13000 MWCO 투석관을 사용하여 물에 대하여 2 시간 동안 투석되었다. 이후 상기 생성물은 암실에서 pH 6.5 인산염 완충액에 있는 독소루비신(DOX)와 24 시간 동안 접합되었다(DOX 1 당량당 HA 이당류 2 당량). 이후, 상기 혼합물은 pH 6.5 인산염 완충액에 대하여 2 일 동안 투석되었다. 최종 물질은 동결건조되었으며 사용하기 전에 식염수에서 재구성되었다. 방출 실험을 위해, 재구성된 HA-DOX 또는 DOX가 투석관에 놓고 37℃의 pH 5, 6.0 또는 7.4 인산염 완충액중 어느 하나를 함유하는 수조에 놓는다. 상기 투석관으로부터 표본들을 채취하며 남아있는 총 약물은 표준 측정 곡선을 사용하여, 형광 검출기가 있는 HPLC에 의하여 측정되었다.
도 18은 독소루비신의 방출을 pH 함수로 도시한다. 방출 반감기는 pH 7.4에서 167 시간, pH 6.0에서 107 시간 및 pH 5.0에서 45 시간으로 나타났다.
상기 HA-DOX는 그 환경의 pH에 의존하는 매우 지속적인 방출을 제공하였다. 고형 종양의 내부가 저산소성이며 감소된 pH를 갖는 것으로 공지되어 있어서, HA-DOX로부터 DOX 방출은 정상적인 조직과 비교하여 종양 조직에서 가속될 수 있다.
정맥내 독소루비신과 비교하여 생쥐 유방에 피하로 주사된 HA-독소루비신 컨쥬게이트의 효능을 평가하기 위하여, 하기 실험이 수행되었다. MDA-MB-468LN 종양 세포들이 기술된 바와 같이 누드 마우스로 이식되었으며 각 5 마리 동물의 4 그룹으로 나뉘어졌다. 3 주 후에, HA-DOX는 3.3 ㎎/㎏(DOX 기준)으로 종양주변에 주사되었고, DOX는 꼬리 정맥을 통해 식염수로 주사되었고, HA는 종양주변으로 주사되었으며, 식염수는 꼬리 정맥을 통해 주사되었다. 동물들에게 5 주 후-이식에 제 2 용량이 주어졌다.
도 19는 종양 성장은 3 주 및 5 주에서 2 주간 투여한 이후 나노담체-DOX 처리에 의하여 멈춰진 것을 보여준다.
HA-시스플라틴이 정맥내 시스플라틴과 유사한 효능을 가질 것으로 예상된 반면에, 예상밖으로 현저한 것은 HA-시스플라틴이 처리하여 종양 성장을 완전히 정지시켰는데, 이는 종양에 도달하는 약물의 더 높은 농도로 인하여 초기 치료 기간 동안에 종양 성장을 더 효과적으로 억제시켜 준다는 것을 시사하는 것이다. 이는 피하로 투여된 HA-시스플라틴이 이러한 체내 유방암 모델에서의 표준 시스플라틴 제형보다 효능면에서 우월하다는 확고히 지지하는 증거를 제공한다.
HA-DOX는 정맥내 DOX 또는 HA 및 식염수 대조군과 비교하여 동물들에서 종양 성장을 실질적으로 지체시킨다. 6 주 후-이식 이후에, 상기 DOX와 HA 및 식염수 대조군은 300 ㎣를 초과하는 종양 부피를 갖는 반면에, 상기 HA-DOX 처리군의 종양은 50 ㎣ 미만이었다. DOX-HA는 종양 성장의 효과적인 국소화 조절을 제공할 뿐만 아니라 새로운 국소, 구역 또는 원격 성장이 출현하는 것을 방지하므로 경이적인 것이었다. HA-DOX 동물들은 투여로 인한 독성을 전혀 보여주지 않았다. 상기 HA-DOX는 종양의 국소구역 림프계 및 조직에 "가속" 투여로서 우수한 국소구역 대조를 제공할 수 있으며, 약물의 서방으로 인하여 수많은 다중 투여에 대한 필요를 대체할 수 있다. 또한, 상기 HA-DOX는 정맥내 DOX와 비교하여 약물의 지속적인 혈장 레벨을 제공할 수 있어서, 추가적인 전신 치료에 대한 요구를 대체하게 된다. 다시 한 번 더, 약물 지속 방출로 인하여 반복 투여에 대한 요구를 감소시킬 수 있다. 이 결과는 국소화된 화학요법이 원격 종양 대조군을 제공하기 위하여 약물의 충분한 혈장 레벨을 제공하는 것이 예상되지 않으므로 경이적이었다.
13. 포스포에스테르 - 히알루로난 나노담체
도 20A는 고도로 물에 녹을수 있으며 생분해성인 포스포에스테르 히알루로난(phHA) 나노담체를 도시한다. 이러한 나노담체는 여기에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.
도 20B는 phHA-약물 컨쥬게이트들의 합성을 도시한다. 상기 phHA는 기능기화되어 항암 약물인 시스플라틴(위), 에피루비신(중간) 및 도세탁셀(아래)와 불안정한 컨쥬게이트들(예컨대, 에스테르 또는 히드라존)을 형성할 수 있다. 이로 생성된 복합체들은 컨쥬게이트들이 엔도사이트 용기 내인성 에스테라제류에서 pH가 감소된 것에 대한 반응으로 약물들을 방출할 때까지 조직을 독성으로부터 보호해 줄 것이다. 림프계에서 AP에 의하여 phHA의 탈인산화(dephosphoration)로 인하여 컨쥬게이트 축적과 약물들이 림프계 내에서 서서히 방출하는 것을 촉진시킬 것이다.
HA의 카르복실기(30 내지 50 kDa, 10 내지 20 ㎚에 해당)는 보호될 수 있다(예컨대, NMM/CDMT를 사용하여 첨가된 DMT를 사용하여). HA의 1차 알코올은 포스포에스테르로 전환될 수 있다(예컨대, 수용성 H3PO4 및 과레늄산 1:1을 사용하여). 시스플라틴과의 접합을 위해, 상기 DMT는 카르복실산을 내는 산이 있는 phHA로부터 제거될 수 있다. 에피루비신 및 도세탁셀에 대하여, DMT는 아디픽 디히드라진(ADH)과 같은 강한 구핵원자(nucleophil)로 교체될 수 있어서 약물들과 pH-민감성 불안정한 히드라존의 형성을 가능하게 한다.
phHA 나트륨은 시스플라틴(20 내지 40% w/w)과의 하룻밤 반응 및 물에 대한 투석으로 정제되는, HA를 사용한 예비 연구에서와 같은 동일한 절차를 이용한 접합된 시스플라틴일 수 있다. 접합 정도는 흑연-로 AAS에 의하여 측정될 수 있다.
안트라사이클린류(독소루비신, 에피루비신 및 다우노루비신)는 안트라사이클린 13-카르보닐 및 HA상에 이식된 히드라자이드 사이의 히드라존 링커를 사용하여 구조적으로 유사한 독소루비신의 pH-민감성 컨쥬게이트들을 형성하는데 사용될 수 있다. 히드라자이드 phHA(상술한)는 pH 5에서 배양하고, 이후 투석 정제하여 에피루비신에 접합될 수 있다.
도세탁셀 및 파클리탁셀을 포함하는 탁산류는 폴리소르베이트가 없는 제형으로 제조될 수 있다. 이는 항-종양 활성에 손상을 주지 않고 상기 나노담체와 결합하는 C7 탄소에서 떨어져 나간 에스테르류를 형성하여 달성될 수 있다. 도세탁셀은 도세탁셀의 C2 위치로 이식된 불안정한 말산 링커를 사용하여 phHA의 COOH와 접합될 수 있다.
14. HA - 시스플라틴의 체내 효능
HA-시스플라틴의 체내 효능이 연구되었다. 모든 처리는 동물 HNSCC 종양들이 100 ㎣ 부피에 도달하면 시작되었다. 처리는 3 주 동안 시작하였다. 모든 동물들에게 왼쪽 볼의 구강 점막에 5x105 MDA-1986이 주어졌으며(이는 금년에 개발된 신규한 정위적 HNSCC 모델 I이다) 종양들은 2 내지 3 주 후에 발전한다.
도 21a는 그자신(경피), 대조군(식염 경피)에 의하여 HA 담체로 처리된 Nu/Nu 암컷 무흉선 누드 마우스들, 3.3 ㎎/㎏의 HA-시스플라틴을 3 주 동안 매주 투여받은 5 마리 마우스들 및 (3.3 ㎎/㎏의 매주 용량을 3 주 동안) 정맥내 시스플라틴을 받은 3 마리 마우스들의 효능 그래프를 포함한다. 본 그래프는 모든 5 마리 동물들에서 HA-시스플라틴 지연 종양 성장으로, 이들 중 2 마리(HA-시스 3 및 HA-시스 4)는 정맥내 시스플라틴(대조)가 약 3 주간 만큼 성장을 지연시켰던 속도와 유사하였다는 것을 보여준다. 반면에, 다른 3 마리에서는 2 마리가 치료법에 완전한 반응을 보였고 3 번째(HA-시스 1)는 실험을 위해 희생되기 전에 치료법에 부분적인 반응을 보였다. 전체적으로 이는 체내 두경부 편평상피 세포암의 치료에 있어서 표준 정맥내 시스플라틴보다 향상된 효능을 보여준다.
2 개의 인간 두경부 편평상피 세포 암종 세포주들(JMAR 및 MDA-1986)에서 체외 표준 CDDP와 비교하여 항암 효과, 구체적으로는 항증식 효과를 평가하기 위하여, 표준 MTS 분석이 제조자의 특정 프로토콜에 따라 수행되었다.
일단 75% 융합하면 세포들은 성장 배지 100 μL의 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 트립신처리되고(0.25% 트립신), 세포수가 측정되고 플레이트되었다. 하룻밤의 부착 기간 후에, 세포들은 KU135 및 17-AAG 단독 및 조합하여 농도를 달리하여 3 일 동안 노출되었다. 모든 연구는 3 벌씩 수행되었으며 적어도 3 회 독립적으로 반복되었다. 상기 3 일의 처리 기간 이후에, 생존가능한 세포들의 숫자는 전자 결합 시약 PMS(페나진 메토설페이트)의 존재하에 신진대사상으로 활성인 세포들을 가용성 포르마존(formazon) 생성물로 생성하는 탈수소효소에 의하여 MTS (3-[4,5-디메틸티아졸-2일]-5-[3-카르복시메톡시페닐]-2-[4-설포페닐]-2H 테트라졸리움)의 생물학적 환원을 측정하는 열량측정 세포 증식 분석법(CellTiter96 수용성 비방사성 세포 증식 분석법; 프로메가, 메디슨 웨스트인디주, 미국)을 이용하여 측정되었다. 상기 분석법을 수행하기 위해, 완충액(0.2 g/L KCl, 8.0 g/L NaCl, 0.2 g/L KH2PO4, 1.15 g/L, 133 ㎎/mL CaCl2-2H2O, 100 ㎎/mL, MgCl2.6H2O, pH 7.35)에 2 ㎎/mL MTS 및 150 μM PMS를 함유하는 조합된 MTS/PMS 용액 20 μL는 각각의 웰에 첨가되었으며, 이후 5% CO2의 습기찬 대기 37″℃에서 3 시간 배양한 후에, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 490 ㎚에서 흡광도가 측정되었다. 소정의 세포 숫자를 갖는 3 벌의 웰들은 시험 표본들과 병렬로 상기 분석법을 거쳐 흡광도 판독을 정규화하였다; 또한, 이로 인해 상기 분석법은 측정된 흡광도 및 세포 숫자의 범위에 걸쳐서 선형이었다는 내적 확신을 제공하였다. 데이터는 약물 농도(x-축) 대 대조군으로부터 % 생존율(세포 생존율)의 함수로 플롯팅되었다. 세포 50%가 성장이 억제되는 약물의 농도(IC50 레벨)는 표준 흡광도-농도 곡선상의 변곡점으로 측정되었다.
도 21b는 10 nM 내지 100 마이크로몰 농도에 이르는 약물의 가변 농도에서 72 시간 약물 처리 후에 양쪽 세포주들에 대하여 표준 시스플라틴에 대한 약물 농도 대 퍼센트 세포 생존율 곡선을 보여준다.
도 21C는 10 nM 내지 100 마이크로몰 농도에 이르는 약물의 가변 농도에서 72 시간 약물 처리 후에 양쪽 세포주들에 대하여 HA-시스플라틴에 대한 약물 농도 대 퍼센트 세포 생존율 곡선을 보여준다. IC50 농도들은 세포 성장 50%가 억제되는 변곡점으로서 이 그래프들로부터 계산되었다. 주목할 것은 CDDP 및 HA-시스플라틴에 대한 IC50 레벨들간에 어느 세포주에서나 현저한 차이가 없었다는 것인데, 이는 체외 HA 접합은 암세포 성장 및 생존율을 억제하는 시스플라틴의 능력에 불리하게 영향을 주지 않는다는 것을 시사하는 것이다.
15. 독소루비신의 체외 방출
도 22A 내지 22F는 생쥐의 우측 유방 지방체에 HA-독소루비신을 단일 주사한 이후의 분포를 도시하는 사진들이다. 독소루비신은 고유 형광을 가지며 상기 약물-담체 컨쥬게이트의 분포 및 수명은 이러한 시간이 잘 맞춰진 평가에서 잘 관찰될 수 있다. 주목할 것은 대량의 약물-담체가 약물이 9 일의 기간에 걸쳐서 서서히 방출되며 9 일 이후에도 여전히 일부가 잔류 활성이 있는 액와 림프절로 이송된다는 것이다. 계란 모양은 유방에서 주사 부위를 표시하며 가장 짙은 농도(적색)은 액와에서이다.
도 23은 체내에서 상당히 진전된 유방암 종양에서 말기 종양주변 HA-독소루비신 처리를 1 회 한 이후에도 종양 반응이 있음을 도시하는 그래프이다.
도 24A 내지 24E는 마에스트로(Maestro) 다중채널 형광 이미징 시스템상에 영상화된 바와 같이 HA-독소루비신의 체내 트래피킹(trackfficking)을 도시하는 사진들이다. 마우스들에서 생쥐 유방의 국소구역(locoregional) 조직 및 림프절로 약물 및 담체의 섭취는 림프에 4 일 후-주사에서 양호하게 체류한다.
표
표 1은 인간 유방암 세포주 MDA-MB-468LN, MDA-MB-231 및 MCF-7에 대한 시스플라틴의 IC50 수치들을 보여준다. HA 담체들에 대한 IC50들은 시스플라틴에 상당한 Pt-기준으로 주어져 있다.
세포주/IC50 ㎍/mL(μM) 시스플라틴 HA-시스플라틴
(은 없음)		 HA-시스플라틴
(은 있음)

MDA-MB-468LN		 5 ㎍/mL
(17 μM)		 10 ㎍/mL
(33 μM)		 9 ㎍/mL
(30 μM)
MDA-MB-231 6 ㎍/mL
(20 μM)		 10 ㎍/mL
(33 μM)		 4 ㎍/mL
(13 μM)
MCF-7 6 ㎍/mL
(20 μM)		 11 ㎍/mL
(37 μM)		 6 ㎍/mL
(20 μM)
표 2는 3.3 ㎎/㎏ 정맥내 시스플라틴 및 피하 HA-시스플라틴 연구 그룹들의 조직 AUC(평균 ± SEM) 및 Cmax(평균 ± SEM)를 제공한다. 투웨이(two-way) ANOVA 분석으로 인하여 연구 그룹들(시스플라틴 및 HA-시스플라틴)은 모든 조직들에 대하여 현저히 상이하였음을 밝혀주었다. 제1 혈장 표본검출은 5 분이었다.
조직
 AUC0 -96 시간, ㎍/gㆍh
시스플라틴, 정맥내 HA-시스플라틴, 피하		 Cmax, ㎍/g(Tmax)
시스플라틴, 정맥내* HA-시스플라틴, 피하
심장 128±8 465±23 1.7±0.1(1 시간) 14.7±1.1(1 시간)
폐 139±7 347±13 2.2±0.1(1 시간) 7.5±0.7(1 시간)
신장 291±8 669±28 4.6±0.4(1 시간) 12.3±2.5(4 시간)
뇌 152±11 344±22 2.3±0.1(1 시간) 7.5±2.0(4 시간)
간 178±5 495±20 2.9±0.2(4 시간) 10.6±2.2(4 시간)
비장 201±7 384±15 3.0±0.4(1 시간) 6.6±0.6(4 시간)
근육 151±9 262±15 2.2±0.2(1 시간) 8.5±2.1(4 시간)
방광 162±10 194±6 3.1±0.4(1 시간) 2.9±0.4(4 시간)
동측 액와절 205±12 776±9 3.3±0.3(1 시간) 20.4±1.4(1 시간)
대측 액와절 205±12 413±17 3.3±0.3(1 시간) 4.6±0.3(4 시간)
혈장 17±3 67±10 3.1±0.2(5 분) 1.0±0.3(2 시간)
*제1 조직 표본추출은 1 시간이었기에, 이 이전의 Cmax는 검출되지 않을 것이다.
표 3은 각 치료군에 대한 조직 손상의 분류는 하기 스케일에 따라 이루어졌음을 보여준다: 신장, 0 점: 정상(증상 없음); 1 점: 최소 괴사; 2 점: 미약한 괴사(퇴화 및 핵 농축 포함). 간, 0 점: 정상(증상 없음); 1 점: 염증(육아종, 미세육아종 및 간염 포함) 또는 세포함유물; 2 점: 퇴화 또는 괴사. 액와 림프절, 0 점: 정상(증상 없음); 1 점: 미약한 림프 과형성 또는 고갈. 병상은 맹인 수의 병리학자에 의하여 점수가 부여되었으며, 각각의 처리군은 5 마리 동물들을 포함하였다.
처리군 간 신장 액와 림프절
1.0 ㎎/㎏ 시스플라틴 40% 0 점
40% 1 점
20% 2 점		 20% 0 점
20% 1 점
60% 2 점		 100% 0 점
1.0 ㎎/㎏ HA-Pt(Pt는 시스플라틴을 선호한다) 20% 0 점
60% 1 점
20% 2 점		 20% 0 점
80% 1 점		 60% 0 점
40% 1 점
3.3 ㎎/㎏ 시스플라틴 60% 1 점
40% 2 점		 20% 1 점
80% 2 점		 80% 0 점
20% 1 점
3.3 ㎎/㎏ HA-Pt 20% 0 점
60% 1 점
20% 2 점		 20% 0 점
60% 1 점
20% 2 점		 60% 0 점
40% 1 점
표 4는 시스플라틴의 HA로의 접합 효율을 보여준다. 효율은 (첨가된 시스플라틴/포함된 시스플라틴)x 100%로 계산되었다.
첨가된 시스플라틴
w/w 시스플라틴/HA		 컨쥬게이트된
w/w 시스플라틴/HA		 접합 효율, %
0.03
0.08
0.15
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70		 0.022
0.040
0.086
0.119
0.149
0.210
0.254
0.263
0.241		 73%
50%
57%
60%
50%
53%
51%
44%
34%
표 5는 시스플라틴 및 시스플라틴-HA의 조직 AUC를 보여준다. 시스플라틴 또는 시스플라틴-HA를 생쥐 암컷의 오른쪽 유방 지방체로 피하 투여한 이후 시스플라틴의 곡선하 면적(AUC).
조직 AUC(0-96 시간), ㎍ㆍhr/g
시스플라틴 시스프라틴-HA
방광
뇌
심장
신장
간
폐
근육
비장
좌 림프절(LLN)
우 림프절(RLN)
혈장		 208.5 194.5
442.5 343.7
459.0 465.3
650.9 668.6
415.6 495.0
409.8 347.3
371.5 262.1
349.1 383.4
349.5 413.4
446.0† 776.0†
174.1 186.1
†p<0.05.
약물/담체 방출 반감기,
(PBS), 시간		 방출 반감기,
(H2O), 시간
시스플라틴-HA 10 42
시스플라틴 대조 0.6 0.9
약물/담체 IC50:
시스플라틴		 IC50:
시스플라틴-HA
MDA-MB-468LN 3 ㎍/mL*
(10 μM)		 3 ㎍/mL*
(10 μM)
MDA-MB-231 4 ㎍/mL*
(13 μM)		 7 ㎍/mL*
(23 μM)
MCF-7 7 ㎍/mL*
(23 μM)		 7 ㎍/mL*
(23 μM)

Claims (20)

  1. 경피성, 피내, 점막, 점막하, 피하, 간질, 지방내(intrafat), 종양주변, 또는 근육내 주사 투여를 위해 구성된 화학요법 조성물에 있어서,
    상기 조성물이:
    약학적으로 허용가능한 담체; 및
    피하 투여 후에 림프관 내의 우선적 축적을 위해 구성된 나노컨쥬게이트를 포함하고,
    상기 나노컨쥬게이트가:
    피하 또는 간질 투여 후에 림프관 내의 우선적 축적을 위해 구성된 나노 담체; 및
    상기 나노담체에 결합된 복수개의 화학요법제들을 포함하는 것을 특징으로 하는 화학요법 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 나노컨쥬게이트가 약 10 ㎚ 내지 약 50 ㎚의 치수를 갖는 것을 특징으로 하는 화학요법 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 나노컨쥬게이트가 약 10% 내지 약 50%(w/w)의 화학요법제로 채워지는 것을 특징으로 하는 화학요법 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 나노담체가 약 3 kDa 내지 약 50 kDa의 히알루로난 중합체인 것을 특징으로 하는 화학요법 조성물.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 나노담체가 덴드리머인 것을 특징으로 하는 화학요법 조성물.
  6. 제 3 항에 있어서,
    상기 화학요법제가 시스플라틴, 다른 백금 약물류, 멜팔란, 미토마이신 C, 독소루비신, 에피루비신, 도세탁셀, 다우노루비신, 펩티드류, 항체들(단일클론성 및 다중클론성), 인터페론, 질소 겨자 클래스 약물류, 클로람부실, 아미오다론, 토포테칸, 위다페론 A, HSP90 억제제류, 17-AAG, VEGF 억제제류, 히스톤 디아세틸라아제 억제제류, 탁산류, 택솔, 파클리탁셀, 도세탁셀, 그 조합물들 등으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화학요법 조성물.
  7. 제 3항에 있어서,
    상기 화학요법제가 생분해성 링커를 통해 상기 나노담체에 결합되는 것을 특징으로 하는 화학요법 조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 생분해성 링커가 산 불안정성(acid-labile)인 것을 특징으로 하는 화학요법 조성물.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 조성물 및/또는 나노컨쥬게이트가 PEG, HPMA, 폴리글루탐류 및/또는 은이 실질적으로 결여되어 있는 것을 특징으로 하는 화학요법 조성물.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 화학요법제가 상기 화학요법제의 표준 정맥내 투여에 비하여 더 높은 림프 AUC 및 더 낮은 혈장 Cmax를 제공하기 위하여 치료적 유효량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 화학요법 조성물.
  11. 암 치료 및/억제 방법에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 담체; 및
    피하 투여 이후에 림프관내 우선 축적을 위해서 구성된 나노컨쥬게이트에 있어서, 상기 나노컨쥬게이트가 피하 또는 간질 투여 이후에 림프관내 우선 축적을 위해서 구성된 나노담체; 및
    상기 나노담체에 결합된 복수개의 화학요법제을 가지는 나노컨쥬게이트를 포함하는 조성물을 피하로 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료 및/억제 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 나노담체가 약 10 ㎚ 내지 약 50 ㎚의 치수를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 나노담체가 약 10% 내지 약 50%(w/w)의 화학요법제들로 채워지는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 나노담체가 약 3 kDa 내지 약 50 kDa의 히알루로난 중합체인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 나노담체가 덴드리머인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 13항에 있어서,
    상기 화학요법제가 시스플라틴, 다른 백금 약물류, 멜팔란, 미토마이신 C, 독소루비신, 에피루비신, 도세탁셀, 다우노루비신, 펩티드류, 항체들(단일클론성 및 다중클론성), 인터페론, 질소 겨자 클래스 약물류, 클로람부실, 아미오다론, 토포테칸, 위다페론 A, HSP90 억제제류, 17-AAG, VEGF 억제제류, 히스톤 디아세틸라아제 억제제류, 탁산류, 택솔, 파클리탁셀, 도세탁셀, 그 조합물들 등으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 13항에 있어서,
    상기 화학요법제가 생분해성 링커를 통해 상기 나노담체에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 생분해성 링커가 산 불안정성인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17항에 있어서,
    상기 조성물 및/또는 나노컨쥬게이트가 PEG, HPMA, 폴리글루탐류 및/또는 은이 실질적으로 결여되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 화학요법제는 상기 화학요법제의 표준 정맥내 투여에 비하여 더 높은 림프 AUC 및 더 낮은 혈장 Cmax를 제공하기 위하여 치료적 유효량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
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