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KR20100100875A - 스테롤-개질된 양친매성 지질 - Google Patents

스테롤-개질된 양친매성 지질 Download PDF

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KR20100100875A
KR20100100875A KR1020107013100A KR20107013100A KR20100100875A KR 20100100875 A KR20100100875 A KR 20100100875A KR 1020107013100 A KR1020107013100 A KR 1020107013100A KR 20107013100 A KR20107013100 A KR 20107013100A KR 20100100875 A KR20100100875 A KR 20100100875A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sterol
lipid
sml
compound
liposomes
Prior art date
Application number
KR1020107013100A
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English (en)
Inventor
프란씨스 씨. 주니어 스조카
차오후아 후앙
Original Assignee
더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 filed Critical 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명은 2개 이상의 소수성 테일 (적어도 1개는 스테롤임)을 갖는 스테롤-개질된 양친매성 지질 화합물을 개시한다. 또한, 상기 화합물의 합성 방법, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 및 관심 작용제, 예를 들어 치료제, 영상화제, 초음파 사용을 위한 조영 물질, 백신, 바이오센서, 영양 보충제 및 피부 관리 제품의 전달에 있어서 상기 화합물의 용도를 개시한다.

Description

스테롤-개질된 양친매성 지질 {STEROL-MODIFIED AMPHIPHILIC LIPIDS}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2007년 11월 14일자로 출원된 미국 가출원 제60/988,038호를 우선권 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
정부 지원
본 발명은 미국립보건원 (The National Institute of Health)이 제공하는 연방 보조 제R01-GM061851호의 정부 지원하에 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에서 일부 권리를 갖는다.
기술분야
본 발명은 양친매성 지질 화합물 및 또한 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.
진핵 막은 이중층 구조를 가지며, 주로 인지질, 스핑고리피드 및 콜레스테롤로 이루어진다. 이들 성분 중에서, 콜레스테롤 또는 콜레스테롤-유사 스테롤은 진핵 막에서 가장 풍부한 단일 화학 종이다. 따라서, 생물학적 막에서의 콜레스테롤의 특성과 기능 및 특정 질환에 있어서 콜레스테롤의 역할에 관한 이해에 상당한 관심이 있다.
인공 소포는 인지질, 스핑고리피드 및 기타 양친매성 합성 지질로부터 제조될 수 있다. 이러한 인공 소포는 리포좀이라 알려져 있고, 이중층 막의 모델 및 약물 전달 비히클과 같은 여러 용도에 사용되고 있다.
유리 콜레스테롤은 리포좀 조성물의 성분으로서 널리 사용되어 왔다. 유리 콜레스테롤은 지질 혼합물 중에 약 30 몰％ 초과로 존재하는 경우에 리포좀 이중층 안정화를 용이하게 한다. 이러한 유리 콜레스테롤-함유 리포좀은 영상화제를 위한 약물 전달 용도 및 생체물리 연구에서 사용된다. 유리 콜레스테롤과 합성 인지질의 혼합물의 특성은 널리 특징규명되어 있다. 유리 콜레스테롤 및 인지질을 함유하는 2종 성분의 혼합물의 경우, 콜레스테롤의 몰％ + 인지질의 몰％ = 100 몰％이다. 이러한 지질 혼합물 중에 포함될 수 있는 콜레스테롤의 최대 몰％는 약 50 몰％인 것으로 밝혀졌다. 합성 인지질을 함유하는 조성물 중에 유리 콜레스테롤이 높은 몰％ (30 몰％ 초과)로 포함되면, 디아실 인지질 전이의 검출가능한 열이 사라지고, 합성 인지질로부터 형성된 리포좀에서 관찰되는 검출가능한 상 전이가 사라질 것이다. 유리 콜레스테롤을 높은 몰％로 함유하는 리포좀은 일반적으로 더 안정적이고 유리 콜레스테롤이 없는 경우보다 누출이 덜하며 화학요법 약물의 제조시에 널리 사용된다.
그러나, 유리 콜레스테롤 및 인지질로 이루어진 리포좀이 다른 생물학적 지질 및 혈청을 함유하는 생물학적 유체 중에 존재하게 되면, 유리 콜레스테롤은 리포좀으로부터 생물학적 지질로 신속하게 이동된다. 이와 같이 리포좀으로부터 유리 콜레스테롤이 손실되면 일반적으로 지질 이중층의 안정성 감소가 야기되고 이후에 피막에 둘러싸인 내용물이 리포좀으로부터 손실된다. 유리 콜레스테롤이 리포좀으로부터 콜레스테롤을 함유하지 않는 과량의 지질로 이동되는 반감기는 약 2시간이다. 추가로, 혈청이 존재하면 혈청 지단백질에 의한 유리 콜레스테롤의 흡수로 인해 유리 콜레스테롤이 리포좀으로부터 단백질로 전달되어 리포좀의 누출이 유의하게 증가될 것이다. 유리 콜레스테롤이 리포좀으로부터 생물학적 막으로 신속하게 이동하는 것과 관련된 이러한 누출 문제는, 유리 콜레스테롤이 다른 양친매성 지질 성분과 물리적으로 혼합되어 있는 통상적인 리포좀 제제에 의해서는 충분히 해결될 수 없다.
따라서, 시험관내 및 생체내 둘다에서 안정적인 리포좀을 형성하는데 사용될 수 있는 지질을 개발하는 것이 바람직하다. 원하는 분자는 제제 중에 충분한 양의 스테롤을 혼입하여 안정화 효과를 제공할 수 있어야 할 뿐만이 아니라 또한 제제 중의 스테롤이 생물학적 유체에 노출되는 경우에 상기 스테롤을 유지할 수도 있어야 한다.
수용성 스테롤 유도체의 사용이 기재된 바 있다. 다양한 친수성 기를 스테롤에 부착시켜 스테롤-헤미숙시네이트, 스테롤-포스포콜린, 스테롤-폴리에틸렌 글리콜 및 스테롤-술페이트와 같은 수용성 스테롤 유도체를 제조해 왔다. 이러한 분자는 오직 1개의 스테롤만을 소수성 잔기로 갖고 상대적으로 커다란 친수성 헤드기 (head group)를 갖기 때문에, 이것들은 스스로 미셀을 형성하고 리포좀 이중층으로부터 생물학적 지질로 신속하게 이동되는 경향이 있다. 따라서, 이러한 수용성 스테롤은 안정적인 리포좀 제제에 적합한 성분이 아니다.
소수성 스테롤은 스테롤 유도체의 또다른 공지된 카테고리로서, 지방산 에스테르 또는 알킬 에테르가 스테롤에 부착된다. 이들 분자는 지방족 쇄로 인하여 스테롤이 리포좀 이중층 중에 유지되도록 돕지만, 단지 낮은 몰％ (15 몰％ 미만)만이 제제 중에 혼입될 수 있다. 유리 콜레스테롤 에스테르의 비율(％)이 약 15 몰％ 초과인 경우에는 콜레스테롤 에스테르 상이 이중층으로 혼입되지 않는 별개의 상으로 분리된다. 따라서, 상 전이를 피하고 리포좀 이중층을 안정화시키기 위해서는 이러한 소수성 스테롤을 지질 조성물에 충분한 몰％의 스테롤로 도입할 수 없다.
본 발명은 이러한 문제를 해결할 수 있는 화합물을 제공하며, 원하는 물리적 특성을 갖는 리포좀을 제공한다.
문헌
스테롤, 지질 및 전달 제제는 일반적으로 하기 문헌에서 검토된다:
Figure pct00001
지질 화합물, 및 콜레스테롤을 함유하는 조성물은 예를 들어 하기 문헌에 개시되어 있다:
Figure pct00002
예를 들어, 문헌 [Bhattacharya et al. (Curr. Opin. Chem. Biol. 2005, 9:647-55)]은 지질 디자인 및 이것들의 다양한 생화학적, 물리적 및 화학적 용도에서의 사용을 검토한다.
지질 화합물, 및 핵산 전달을 위한 조성물은 예를 들어 하기 특허 문헌에 개시되어 있다:
Figure pct00003
Figure pct00004
루이스 (Lewis) 등의 미국 특허 출원 공개 제20030125281호, 맥라클란 (MacLachlan)의 PCT 공개 제WO/2003/077829호, 맥라클란의 PCT 공개 제WO 05/007196호, 바르기스 (Vargeese) 등의 PCT 공개 제WO2005007854호, 맥스위겐 (McSwiggen) 등의 PCT 공개 제WO 05/019453호, 동 제WO 03/70918호, 동 제WO 03/74654호 및 미국 특허 출원 공개 제20050020525호 및 동 제20050032733호 및 첸 (Chen) 등의 PCT 공개 제WO/2007/086883호. 예를 들어, 첸 등 (PCT 공개 제WO/2007/086883호)은 짧은 간섭 핵산 (siNA)을 형질감염시키거나 전달하는 양이온성 지질, 마이크로입자, 나노입자 및 형질감염제를 개시한다.
요약
본 발명은 일반적으로 스테롤-개질된 양친매성 지질 화합물에 관한 것이다. 또한, 이러한 화합물을 합성하는 방법, 이러한 화합물을 포함하는 조성물, 및 관심 작용제, 예를 들어 치료제, 백신, 영상화제, 초음파 사용을 위한 조영 물질, 바이오센서, 영양 보충제, 피부 관리 제품 및 화장제의 전달에 있어서 이러한 화합물의 용도가 제공된다.
본 발명의 스테롤-개질된 양친매성 지질 화합물은 친수성 헤드기 및 2개 이상의 소수성 테일기 (tail group)를 포함하며, 상기 소수성 테일기 중 적어도 1개는 스테롤을 포함한다.
본 발명의 화합물 및 조성물은 다양한 제약, 화장품 및 의학 용도에 적합할 수 있고, 또한 지질 시스템이 사용되는 다양한 산업적 및 상업적 용도에도 적합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 개시내용의 화합물은 예를 들어 이중층, 단층, 입방 상, 6방정계 상, 오일 및 물의 에멀젼 (수중유 또는 유중수 에멀젼), 겔, 발포체, 로션 및 크림을 안정화시키는데 사용될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 친수성 헤드기 및 2개 이상의 소수성 테일기를 가지며 상기 소수성 테일기 중 적어도 1개는 스테롤을 포함하는 것인 스테롤-개질된 양친매성 지질을 포함하는 화합물을 제공한다. 한 실시양태에서, 스테롤은 동물스테롤 및 식물스테롤로 이루어진 군에서 선택된다. 관련 실시양태에서, 스테롤은 콜레스테롤, 스테로이드 호르몬, 캄페스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군에서 선택된다.
추가의 실시양태에서, 친수성 헤드기는 하전된 극성 헤드기 및 하전된 헤드기와 극성 헤드기의 조합물로 이루어진 군에서 선택된다. 관련 실시양태에서, 친수성 헤드기는 포스페이트, 포스포콜린, 포스포글리세롤, 포스포에탄올아민, 포스포세린, 포스포이노시톨, 에틸포스포스포릴콜린, 폴리에틸렌글리콜, 폴리글리세롤, 멜라민, 글루코사민, 트리메틸아민, 폴리아민, 히드록실 (OH), 카르복실레이트 (COO-), 술페이트(SO4 -), 술포네이트 (SO3 -) 및 탄수화물로 이루어진 군에서 선택된다.
추가의 실시양태에서, 소수성 테일기 중 적어도 1개는 비-스테롤을 포함한다. 관련 실시양태에서, 비-스테롤은 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 지방족 탄화수소이다. 추가의 관련 실시양태에서, 비-스테롤 잔기는 포화된 지방족 탄화수소 쇄, 예컨대 알킬기로 포화된 쇄를 기재로 하는 치환된 지방족 탄화수소 쇄이다. 추가의 관련 실시양태에서, 알킬렌기의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그보다 많은 수의 탄소 원자 (일반적으로는 약 10개 이하의 탄소 원자)가 산소, 규소, 황 또는 질소 원자로부터 선택된 헤테로원자로 치환되고/되거나 알킬렌기의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그보다 많은 수소 원자 (일반적으로는 수소 원자의 총 수 이하)가 플루오라이드로 치환된다.
추가의 실시양태에서, 스테롤-개질된 양친매성 지질은 모노스테롤-개질된 양친매성 지질 및 디스테롤-개질된 양친매성 지질로 이루어진 군에서 선택된다. 관련 실시양태에서, 디스테롤-개질된 양친매성 지질은 동일한 스테롤 소수성 테일을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 스테롤-개질된 양친매성 지질은 글리세로포스포리피드, 스핑고포스포리피드, 카르니틴 지질 및 아미노산 지질로 이루어진 군에서 선택된다.
추가의 실시양태에서, 친수성 헤드기 및 소수성 테일기는 1,2-디히드록시,3-아미노 프로판을 통해 연결된다.
한 실시양태에서, 소수성 테일기 중 1개는 전구약물, 예컨대 레티노산이다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 친수성 헤드기 및 2개 이상의 소수성 테일기를 가지며 상기 소수성 테일기 중 적어도 1개는 스테롤을 포함하는 것인 스테롤-개질된 양친매성 지질을 포함하는 조성물을 제공한다. 관련 실시양태에서, 스테롤-개질된 양친매성 지질은 모노스테롤-개질된 양친매성 지질 및 디스테롤-개질된 양친매성 지질로 이루어진 군에서 선택된다. 추가의 실시양태에서, 스테롤-개질된 양친매성 지질은 콜레스테롤, 스테로이드 호르몬, 캄페스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군에서 선택된다.
관련 실시양태에서, 상기 조성물은 에멀젼이다. 추가의 관련 실시양태에서, 상기 조성물은 리포좀이고, 이것은 임의로 페이로드 (payload)를 포함한다. 리포좀이 페이로드를 포함하는 실시양태에서, 상기 페이로드는 치료제, 화장제 및 검출가능한 표지 중 1종 이상을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 리포좀은 비-스테롤 양친매성 지질을 포함한다. 관련 실시양태에서, 상기 리포좀은 1종 이상의 부형제를 포함하고, 제약 제제 또는 화장 제제로서 제공될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 스테롤-개질된 양친매성 지질은 치료제를 포함하고, 스테롤-개질된 양친매성 지질은 리포좀으로 제공될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 비-스테롤 양친매성 지질은 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 지방족 탄화수소로 이루어진 군에서 선택된다. 추가의 실시양태에서, 스테롤-개질된 양친매성 지질 및 비-스테롤 양친매성 지질은 대략 동일한 길이의 소수성 테일기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물의 스테롤-개질된 양친매성 지질은 모노스테롤-개질된 양친매성 지질이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 1개 이상의 스테롤 테일기를 분지 코어를 통해 친수성 헤드기에 커플링시켜서 소수성 테일기 중 적어도 1개가 스테롤 테일기를 포함하는 2개 이상의 소수성 테일기에 연결된 친수성 헤드기를 갖는 스테롤-개질된 양친매성 지질을 생성하는 것을 포함하는, 스테롤-개질된 양친매성 지질을 합성하는 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 스테롤-개질된 양친매성 지질을 비-스테롤 양친매성 지질, 치료제, 화장제, 검출가능한 표지, 완충액, 용매 및 부형제 중 1종 이상과 혼합하는 것을 포함하는, 스테롤-개질된 양친매성 지질을 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 관련 실시양태에서, 상기 방법은 상기 조성물을 정제하는 것을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 동물을 본 발명의 개시내용의 스테롤-개질된 지질 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 스테롤-개질된 양친매성 지질을 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 세포를 본 발명의 개시내용의 스테롤-개질된 지질 조성물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 스테롤-개질된 양친매성 지질을 포함하는 조성물을 세포에 투여하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 유체를 본 발명의 개시내용의 스테롤-개질된 지질 조성물을 포함하는 조성물과 접촉시키고, 상기 지질 조성물 또는 유체의 검출가능한 특성에 있어서의 1개 이상의 변화를 검출하는 것을 포함하는, 유체 중 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 관련 실시양태에서, 상기 유체는 생물학적 유체이다. 추가의 관련 실시양태에서, 검출은 지질 조성물의 특성을 평가하여 이루어진다.
본 발명의 다른 측면 및 실시양태는 본 발명의 개시내용으로부터 매우 명백할 것이다.
본 발명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 하기 상세한 설명으로부터 가장 잘 이해될 수 있다:
도 1은 SChcPC와 DSPC의 혼합물의 시차 주사 열량계 (DSC) 온도기록도이다.
도 2는 스테롤-개질된 양친매성 지질 ("SML")/디아실 지질 혼합물의 전이 온도 및 엔탈피를 다양한％의 콜레스테롤에 대해 도시하는 그래프이다. 도 2에 도시된 결과에서, SML은 쇄 길이가 동일한 디아실 지질과 혼합한다.
도 3은 삼투 스트레스-유도성 누출 분석 결과를 도시한 그래프이다. 리포좀으로부터의 칼세인 방출을 다양한 삼투압 하에 측정하였다. 리포좀 내에 남아 있는 칼세인 분율을 계산하고, 삼투 구배에 대해 플로팅하였다. 데이타 오차는 0.5％ 내이다.
도 4는 포스페이트 완충 염수 중의 30 부피％ 소 태아 혈청 중에서 리포좀 조성물의 누출 분석 결과를 도시하는 그래프이다. 37℃에서 30 부피％ 소 태아 혈청 중에 있는 리포좀으로부터의 칼세인 방출은 출발 형광 세기로부터 형광 세기의 변화를 여러 인큐베이션 시간에서 측정함으로써 모니터링하였다. 리포좀 내에 남아 있는 칼세인 분율을 계산하여 인큐베이션 시간에 대하여 플로팅하였다. 대조군 제제 (DSPC/Chol 및 DMPC/Chol) 중에는 40％ 콜레스테롤이 존재하였다.
도 5는 37℃에서 콜레스테롤 교환의 상대적 비율의 분석 결과를 도시하는 그래프이다.
도 6은 C26 결장 암종 세포에 대한 선택된 스테롤-개질된 양친매성 지질의 세포독성을 도시하는 그래프이다.
도 7은 스테롤-개질된 양친매성 지질로부터 올-트랜스-레티노산(all-trans-retinoic acid)의 포스포리파제 A2에 의한 가수분해를 나타내는 그래프이다.
도 8은 독소루비신 캡슐화 SPL 리포좀의 다양한 제제 (15 mg/kg i.v.)로 치료되는 s.c. C-26 종양에 걸린 BALB/c 마우스에 대한 종양 성장 곡선을 나타내는 그래프이다 (여기서, F1은 SeChcPC/DSPE-PEG2000/α-토코페롤 (94.8/5.0/0.2)이고; F2는 SeChcPC/DSPE-PEG5000/α-토코페롤 (94.8/5.0/0.2)이고; F3은 DChcPC/DSPC/DSPE-PEG2000/α-토코페롤 (10.6/84.2/5.0/0.2)이고; F4는 PChcPC/DSPE-PEG2000/α-토코페롤 (94.8/5.0/0.2)이고; F5는 DCHEMSPC/DSPC/DSPE-PEG2000/α-토코페롤 (33/61.8/5.0/0.2)이고; F6은 DCHEMSPC/DSPE-PEG2000/α-토코페롤 (94.8/5.0/0.2)임).
도 9는 독소루비신 캡슐화 SPL 리포좀의 다양한 제제 (15 mg/kg i.v.)로 치료되는 s.c. C-26 종양에 걸린 BALB/c 마우스에 대한 생존 곡선을 나타내는 그래프이다 (여기서, F1은 SeChcPC/DSPE-PEG2000/α-토코페롤 (94.8/5.0/0.2)이고; F2는 SeChcPC/DSPE-PEG5000/α-토코페롤 (94.8/5.0/0.2)이고; F3은 DChcPC/DSPC/DSPE-PEG2000/α-토코페롤 (10.6/84.2/5.0/0.2)이고; F4는 PChcPC/DSPE-PEG2000/α-토코페롤 (94.8/5.0/0.2)이고; F5는 DCHEMSPC/DSPC/DSPE-PEG2000/α-토코페롤 (33/61.8/5.0/0.2)이고; F6은 DCHEMSPC/DSPE-PEG2000/α-토코페롤 (94.8/5.0/0.2)임).
도 10은 DChcPC/DPPC 혼합물의 시차 주사 열량계 (DSC) 온도기록도이다.
도 11은 환원-민감성 SML 지질을 사용한 나노지질입자의 순차적 어셈블리를 도시하는 반응식이다. 먼저, DNA를 투석 방법에 의해 나노-크기의 양이온성 리포좀 내로 캡슐화시킨다. 그 후, 입자 표면을 환원제 HSR'를 사용한 디술파이드 교환에 의해 개질시킨다. 마지막으로, 표적 리간드를 미셀 전달 방법에 의해 또는 디술파이드 교환을 통해 입자의 표면 상에 혼입한다. SML-SSR: 헤드기 (R)에 디술파이드 결합 (SS)을 갖는 양이온성 스테롤-개질된 지질; SML-SSR': 헤드기가 교환된 스테롤-개질된 양친매성 지질.
도 12는 HEPES 완충 염수 중의 30 부피％ 소 태아 혈청 중에서 리포좀 조성물의 누출 분석 결과를 도시하는 그래프이다. 37℃에서 30 부피％ 소 태아 혈청 중에 있는 리포좀으로부터의 5-카르폭시플루오레세인 (CF) 방출은 출발 형광 세기로부터 형광 세기의 변화를 여러 인큐베이션 시간에서 측정함으로써 모니터링하였다. 제28일에 리포좀으로부터 방출된 CF의 백분율을 계산하여 리포좀 제제 중의 알킬쇄 길이에 대하여 플로팅하였다.
도 13은 37℃에서 HEPES 완충 염수 중 30 부피％ 소 태아 혈청 중에서 디아실/SML6b로 구성된 리포좀으로부터의 CF 방출 프로파일을 도시하는 그래프이다. 표지는 리포좀에서 사용된 디아실 지질의 쇄 길이를 나타낸다.
본 발명의 예시적인 실시양태를 기재하기 전에, 본 발명이, 기재된 특정 실시양태에 한정되지 않고, 물론 그 자체로 다양할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 본원에 사용된 용어가 단지 특정 실시양태를 기재하는 목적을 위한 것이고, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 한정될 것이기 때문에, 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아님을 이해할 것이다.
값의 범위가 제공되는 경우, 그러한 범위의 상한 내지 하한 사이의 각 개재 값(intervening value) (그 내용이 달리 명확하게 묘사되지 않는 한, 하한의 유닛의 1/10까지)이 또한 구체적으로 개시된다. 정해진 범위 내의 임의의 소정 값 또는 개재 값 내지 상기 정해진 범위 내의 임의의 다른 소정 값 또는 개재 값 사이의 각각의 더 작은 범위가 본 발명에 포괄된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 그 범위에 포함되거나 또는 배제될 수 있고, 상기 더 작은 범위에 상한 및 하한 중 하나, 또는 둘다가 포함되거나 또는 둘다 포함되지 않은 각각의 범위가 또한 본 발명에 포함되어, 정해진 범위 내에서 임의의 구체적으로 배제된 한계가 적용된다. 정해진 범위가 상한 및 하한 중 하나 또는 둘다를 포함하는 경우, 포함된 상한 및 하한 중 하나 또는 둘다를 배제한 범위도 또한 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 숙련자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 일부 잠재적이고 예시적인 방법 및 물질이 본원에서야 기재될 수 있다. 본원에 언급된 임의의 문헌 및 모든 문헌은 이들 문헌이 언급된 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시 및 기재하기 위해 참고로 본원에 포함된다. 모순되지 않는 범위라면 본 발명의 개시가 포함된 문헌의 임의의 개시를 대체한다는 것으로 이해된다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는, 내용이 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 다수의 대상물을 포함한다는 것을 주의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "스테롤-개질된 양친매성 지질"에 대한 언급은 다수의 상기 스테롤-개질된 양친매성 지질을 나타내고, "리포좀"에 대한 언급은 하나 이상의 리포좀에 대한 언급을 포함하는 등이다.
추가로, 임의적일 수 있는 임의의 요소를 배제하도록 청구범위의 초안이 작성될 수 있음을 주의한다. 이에 따라, 이러한 언급은 청구범위 요소의 언급 또는 "부정적인" 한계의 사용과 관련하여 "단독으로", "단지" 등과 같은 독점 용어를 사용하기 위한 선행 기반으로서 작용하는 것으로 의도된다.
본원에 논의된 문헌은 본 출원의 출원일 이전의 이들의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명의 이유로 상기 문헌을 선행하는 표제를 붙이지 않도록 하는 것으로 해석되지는 않는다. 추가로, 제공된 문헌의 일자는 실제 공개 일자 (독립적으로 확인할 필요가 있을 수 있음)와는 상이할 수 있다.
정의
"양친매성 지질"은, 구조에 있어서 대부분 지질-유사 (소수성) 분자이지만, 한쪽 말단에서 극성, 하전, 또는 극성과 하전의 조합 (친수성) 부분을 갖는 분자를 지칭한다. 친수성 부분은 헤드기로서 지칭되고, 지질 부분은 테일기(들)로서 공지되어 있다. 양친매성 지질의 예로는 인지질, 글리코리피드 및 스핑고리피드가 포함된다.
"분석물질"은 적정, 면역검정, 크로마토그래피, 분광광도법, 온도기록법 등과 같은 분석 또는 정량 검출 절차에서 측정되어 지는 성분 또는 화학적 구성요소를 지칭한다. 통상적으로 분석물질 그 자체는 측정될 수 없지만, 분석물질의 측정가능한 성질은 측정될 수 있다. 예를 들어, 측정 또는 검출되는 전형적인 성질은 농도, 흡광도, 분자량, 융점, 결합능, 생물학적 활성 등이다.
"유리 스테롤"은 다른 화합물에 공유 결합되지 않은 스테롤을 지칭한다. 따라서, "유리 콜레스테롤"은 다른 화합물에 공유 결합되지 않은 콜레스테롤을 지칭한다. 예를 들어, 지질에 유리 콜레스테롤을 첨가하는 것은 리포좀 안정성을 증대시키기 위해 제공되는 통상적인 기술로서 사용되어 왔다. 따라서 "유리 콜레스테롤"은 특히 스테롤-개질된 양친매성 지질 화합물 내의 한 잔기로서 공유 결합되지 않은 콜레스테롤을 지칭한다.
"약제"는 제약으로서의 개발 또는 적용 시험에서 용도가 밝혀진 작용제를 지칭하며, 건강기능 식품이 포함된다.
"다중소포 리포좀 (MVL)"은 각각의 리포좀 입자 내에 다중 비-중심성 챔버를 함유한 리포좀을 지칭하며, "발포체형" 매트릭스와 닮았다.
"다중층형(multilamellar) 리포좀" (다중층형 소포 또는 "MLV"로도 공지됨)은 각각의 리포좀 입자 내에 이중층으로 구성된 다중 중심성 챔버를 함유한 리포좀을 지칭하며, "양파 층"과 닮았다.
"모노스테롤-개질된 양친매성 지질" 또는 "m-SML"은 구조 내에 단 하나의 스테롤을 갖는 SML을 지칭한다.
"디스테롤-개질된 양친매성 지질" 또는 "디-SML"은 구조 내에 2개의 스테롤을 갖는 SML을 지칭한다.
"트리스테롤-개질된 양친매성 지질" 또는 "트리-SML"은 구조 내에 3개의 스테롤을 갖는 SML을 지칭한다.
"테트라스테롤-개질된 양친매성 지질" 또는 "테트라-SML"은 구조 내에 4개의 스테롤을 갖는 SML을 지칭한다.
"스테롤" 또는 스테로이드 알콜은 유리 히드록실을 갖는 하위 그룹의 스테로이드 또는 그의 유도체를 지칭하며, 예컨대 콜레스테롤 부류 및 그의 유도체, 및 또한 식물스테롤 부류 및 그의 유도체, 및 진균 스테롤 및 그의 유도체에 의해 예시되고 이에 포함된다. 스테롤은 천연일 수 있거나 또는 합성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "스테롤-개질된 양친매성 지질"은 일반적으로 하나의 친수성 헤드기, 및 적어도 1개가 스테롤인 2개 이상의 소수성 테일을 갖는 양친매성 지질 화합물을 지칭한다. "스테롤-개질된 양친매성 인지질" 또는 "SPL"은 포스페이트-함유 잔기를 포함하는 스테롤-개질된 양친매성 지질, 예컨대 포스포콜린 또는 포스포글리세롤을 지칭한다.
"치료제"는 치료제로서의 개발 또는 적용 시험에서 용도가 밝혀진 작용제를 지칭하며, 약제가 포함된다.
"영상화제"는 동물 내의 지질 입자의 위치를 정하는 것에 있어서데 용도가 밝혀진 작용제를 지칭하며, 광학 작용제, 초음파 조영제, 고질량 X-선 조영제, 방사성 영상화제 또는 핵자기 영상화제가 포함된다.
"화장제"는 화장품으로서의 개발 또는 적용 시험에서 용도가 밝혀진 작용제를 지칭한다.
용어 "치료상 허용되는", "제약상 허용되는" 및 "화장용으로 허용되는"은 생물학적으로나 다르게도 바람직한 물질을 지칭하며, 즉 상기 물질은 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않거나 또는 이것이 함유되어 있는 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않는, 선택된 활성 성분과 함께 개체에게 투여될 수 있는 허용되는 품질 및 조성의 물질이다.
용어 "에멀젼"은 2개의 혼화성 (블렌딩 가능하지 않은) 성분의 혼합물을 지칭한다.
용어 "이중층"은 표면 내부에는 소수성 테일 및 표면 외부에는 극성 헤드기를 갖는, 2개의 분자층으로서 배열되는 양친매성 지질 분자 (종종 인지질)로 구성된 "샌드위치형" 구조를 지칭한다.
용어 "단층"은, 헤드기가 한편에 풍부하고 상당히 정렬되어 있고, 소수성 기가 그 반대편에 풍부하고 상당히 정렬되어 있는 양친매성 분자의 분자층으로 정의된 구조를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "부형제"는 소정 목적 용도를 위해, 예컨대 대상체에게 관심 화합물(들)의 적용 또는 투여 시에 허용가능한 비히클을 제공하는 임의의 적합한 성분을 지칭한다. 부형제의 예로는 희석제, 첨가제, 보조제 및 담체로 지칭되는 성분이 포함된다. 예를 들어 "제약상 허용되는 부형제", "제약상 허용되는 희석제", "제약상 허용되는 담체" 및 "제약상 허용되는 보조제"로는 일반적으로 안전하고 비독성이고 생물학적으로나 다르게도 바람직한 제약 조성물의 제조에 유용한 부형제, 희석제, 담체 및 보조제가 포함되고, 수의학적 용도 및 또한 인간 제약 용도를 위해 허용되는 부형제, 희석제, 담체 및 보조제가 포함되고, 하나의 이러한 부형제, 희석제, 담체 및 보조제 외에도 하나 및 그 이상을 포함할 수 있다.
용어 "생리학적 조건"은 살아있는 세포와 친화성인 조건, 예들 들어 살아있는 세포와 친화성인 온도, pH, 염도 등의 우세한 수성 조건을 포괄하는 것으로 의도된다.
용어 "치료 조성물", "제약 조성물", "화장 조성물", "치료 제제", "제약 제제" 또는 "화장 제제"는 대상체, 예컨대 포유동물, 특히 인간에게의 적용 또는 투여에 적합한 조성물을 포괄하는 것으로 의도된다. 일반적으로 상기 조성물은 안전하고 보통 멸균되고 바람직하게는 대상체의 바람직하지 않은 반응을 도출할 수 있는 오염물질을 함유하지 않는다 (예를 들어, 조성물 중의 화합물(들)은 소정 목적 용도를 위해 허용되는 등급임). 조성물은 국소, 경구, 구강, 직장, 비경구, 피하, 정맥내, 복막내, 피내, 기관내, 협막내, 폐 등을 비롯한 다수의 다양한 투여 경로를 통해 이것이 필요한 대상체 또는 환자에게 적용 또는 투여하기 위해 디자인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 경피 경로에 의한 적용 또는 투여에 적합하다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 경피 투여 이외의 경로에 의한 적용 또는 투여에 적합하다.
용어 본 발명의 화합물의 "유도체"로는 그의 염, 에스테르, 에놀 에테르, 에놀 에스테르, 아세탈, 히드라존, 케탈, 오르토에스테르, 헤미아세탈, 헤미케탈, 산, 염기, 용매화물, 수화물 또는 전구약물을 들 수 있다. 이러한 유도체는 유도체화를 위한 공지된 방법을 이용하여 당업자들에 의해 용이하게 제조될 수 있다.
용어 화합물의 "그의 염"은 모 화합물의 목적하는 활성을 소유한 염을 의미한다. 이러한 염에는 (1) 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 붕산 등과 함께 형성되거나, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 헥산산, 시클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일)벤조산, 1,2,3,4-부탄-테트라카르복실산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 1,2-에탄디술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 벤젠술폰산, 4-클로로벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 4-톨루엔술폰산, 캄포르술폰산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-(3-히드록시-2-엔-1-카르복실산), 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산 등과 함께 형성된 산 부가염, 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온, 예를 들어 알칼리 금속 이온, 알칼리 토이온, 또는 알루미늄 이온에 의해 교체되거나, 또는 유기 염기, 예컨대 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민, 트리에틸아민 등과 배위된 경우에 형성된 염이 포함된다.
용어 본 발명의 화합물의 "용매화물 또는 수화물"은 모 화합물의 목적하는 약리 활성을 소유한 용매화물 또는 수화물 복합체를 의미하며, 본 발명의 화합물과 하나 이상의 용매 또는 물 분자, 또는 1 내지 약 100개, 또는 1 내지 약 10개, 또는 1 내지 약 2, 3 또는 4개의 용매 또는 물 분자의 복합체가 포함되나, 이로 한정되는 것은 아니다.
용어 "보호기"는 관능기를 그의 정상적인 화학 반응성으로부터 보호하거나 차단하기 위해 관능기를 화학적으로 변형시킴으로써 분자에 도입된 화학적 기를 의미한다. 보호기, 그의 첨가 및 제거는 널리 공지되어 있다 (문헌 [T. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley-Interscience, New York, 2005]). 보호기를 제거하면 원래의 관능기가 생성되며, 이는 "보호되지 않은 기"로 지칭될 수 있다.
용어 "전구약물"은 포유동물 대상체에게 이러한 전구약물을 투여할 때 생체내에서 활성 모 약물을 방출시키는 임의의 화합물을 의미한다. 전구약물은 생체내에서 절단되어 모 화합물을 방출시킬 수 있도록 화합물에 존재하는 관능기를 변형시킴으로써 제조된다. 전구약물에는 히드록실, 아미노, 카르복실, 또는 술프히드릴 기가 생체내에서 각각 유리 히드록실, 아미노, 카르복실 또는 술프히드릴 기를 재생하도록 절단될 수 있는 임의의 기에 결합된 화합물이 포함된다. 전구약물의 예로는 에스테르, 카르바메이트, 히드라존, 디술파이드 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
용어 "대상체", "숙주", "환자", 및 "개체"는 진단 또는 치료가 필요한 임의의 포유동물 대상체, 특히 인간을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 다른 대상체로는 소, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 어류 등이 있다. 실험적인 조사를 위해 인간이 아닌 동물 모델, 특히 포유동물, 예를 들어 영장류, 쥐과, 토끼목 등을 사용할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "결정", "측정", 및 "평가", 및 "검정"은 상호교환적으로 사용되며, 정량적 및 정성적 결정 둘 다를 포함한다.
본 개시내용의 전반에 걸쳐, 양친매성 지질 화합물을 기재하기 위해 사용된 명명법은 다음과 같다. 먼저, 화합물의 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 스티그마스테롤, 및 시토스테롤에 대해서는 통상적인 명칭을 사용한다. 기재의 편의를 위해, 골격으로서 글리세롤을 가진 스테롤-개질된 양친매성 지질은 글리세로포스포리피드의 일반명에 대한 것과 유사한 규칙에 따라 약칭된다. 예를 들어, 1-콜레스테릴카르보노일-2-팔미틸-글리세로-3-포스파티딜콜린은 ChcPePC로 약칭되며, 여기서 1) sn-1/sn-2 위치에 있는 기들은 그들의 치환 위치의 순서에 따라 대문자로 쓴 약어로 나타내어지고 (예를 들어, 콜레스테롤의 경우 "Ch", 콜레스테릴 헤미숙시닐의 경우 "CHEMS", 팔미토일의 경우 "P"); 2) 아래첨자 또는 소문자는 연결 유형을 나타내기 위해 사용되며 (예컨대, 관례에 따라 카르보네이트의 경우 "c", 에테르의 경우 "e", 카르바메이트의 경우 "a", 및 에스테르의 경우 블랭크 (또는 소문자도 아래첨자도 아님)); 3) 헤드기는 관례에 따라 명명된다 (예컨대, 포스포콜린의 경우 "PC", 및 포스포글리세롤의 경우 "PG").
서론
본 개시내용은 2개 이상의 소수성 테일을 가지며, 이 중 1개 이상은 스테롤인 양친매성 지질 화합물 (본원에서 "스테롤-개질된 양친매성 지질"로 지칭되고, "SML" 또는 "SMLs"로 약칭됨)을 제공한다. 본 개시내용은 또한 이러한 SML 화합물의 제조 방법, 및 그를 함유하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 SML을 이용하는 방법, 뿐만 아니라 하나 이상의 SML 화합물 및/또는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 화합물 및 조성물은 양친매성 지질의 사용이 확인되거나 유익한 다양한 적용을 위해, 예를 들어 치료제, 화장제 및 영상화제 자체로서, 치료제, 화장제, 검출가능한 표지, 및 다른 관심 작용제의 전달을 용이하게 하기 위해, 분석물질, 바이오센서 등의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 적합화될 수 있다. SML은 화장품 또는 영양제품에 사용하기 위한 유중수 또는 수중유 에멀젼을 안정화시키도록 디자인될 수 있다. SML은 또한 하기에 더욱 상세히 기재되는 바와 같이 약물 또는 전구약물로서 작용하도록 디자인될 수 있다.
본 개시내용의 화합물은 본래 양친매성이며, 단독으로 또는 다른 성분들과 함께 용액, 에멀젼, 또는 건조 분말의 다양한 구조체를 형성할 수 있고, 따라서 여러 용도로 이용될 수 있다. 예를 들어, SML 화합물은 응집물, 층, 입자, 에멀젼, 구조화된 상 등을 형성할 수 있고, 이러한 목적을 위해 정밀하게 조정될 수 있다. 따라서, 상기 화합물은 하나 이상의 이러한 구조체를 포함하는 조성물로서, 예를 들어 에멀젼 또는 리포좀 조성물로서, 특히 치료 조성물, 제약 조성물, 화장 조성물, 및 검출 조성물로서 제조될 수 있다.
SML 화합물 및 조성물은 독특한 성질을 갖는다. 이러한 한 성질은 유리 스테롤이 사용되지 않거나 안정화제로서 유리 스테롤이 사용된 것에 비해 다양한 지질 시스템의 안정성을 개선시키는 SML의 능력이다. 예를 들어, SML이 지질 시스템 뿐만 아니라 상응하는 유리 스테롤을 안정화시킬 수 있으며, SML은 지질 시스템으로부터 훨씬 더 천천히 이동하고, 그에 따라 시험관내 및 생체내 둘 다에서 지질 시스템의 안정성을 개선시킨다 (예를 들어, 전형적으로 표준 지질 시스템의 사용을 제한하는 다양한 생리학적 및 기타 조건하에서의 해리, 분해 또는 누출에 대한 증진된 내성). 따라서, 하나 이상의 SML 화합물을 함유하는 지질 시스템은 안정화제가 사용되지 않거나 유리 스테롤 (예를 들어, 유리 콜레스테롤)이 안정화제로서 사용된 통상적인 지질 시스템에 비해 더욱 효과적인 적용을 제공한다. SML은 본원에서 추가로 논의되는 바와 같이 다른 유리한 성질을 갖는다.
한 이점은, SML 화합물이 관심 작용제로서 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 예컨대 관심 작용제의 전달을 위해 다른 성분들과 함께 사용될 수 있다는 것이다. 예를 들어, SML 자체가 치료제, 화장제 또는 검출가능한 작용제를 포함할 수 있다. 치료용 또는 화장용 SML로서, SML의 친수성 헤드기 및/또는 하나 이상의 친수성 테일기는 치료제 또는 화장제를 포함할 수 있으며, 예컨대 테일기는 스테로이드 호르몬 또는 그의 유도체가 포함된 스테롤을 포함할 수 있고/있거나 헤드기는 친수성 작용제, 예컨대 카르니틴을 포함할 수 있다. 검출가능한 SML로서, 상기 화합물은 검출가능한 표지로 태그가 부착될 수 있거나, 또는 SML 자체가 대조 영상화 적용에 적합한 마이크로버블을 형성하는 조영제로서 이용될 수 있다.
다른 이점으로는, 표준 지질 시스템과 비교할 때, 안정화된 지질 시스템의 사용에 의해 이익을 얻을 수 있는 광범위한 적용이 있다. 예를 들어, 관심 작용제의 전달을 위해 다른 성분들과 함께 사용되는 경우, SML은 안정화된 지질 제형, 예컨대 안정화된 에멀젼 또는 리포좀 제형으로서 제공될 수 있다.
특별한 관심의 지질 시스템 적용의 예로는 독성 약물, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 캄프토텐신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 5-플루오로우라실, 시타라빈, 시스-플라틴, 타목시펜, 이마티닙, 이리노테칸 등을 위한 안정한 약물 담체로서 SML 및 조성물의 사용이 있다. 다른 예로는 동일한 담체 중의 2종 이상의 약물을 위한 안정한 약물 담체로서 SML 및 조성물의 사용이 있다. 다른 예로는 흡입에 의해 폐로 전달되는 항미생물 화합물, 예컨대 토브라마이신을 위한 안정한 약물 담체로서, 수 난용성을 가진 약물, 예컨대 암포테리신 B 또는 레티노산을 위한 약물 전달 시스템으로서 SML의 사용이 있다. 추가의 예로는 보조제 및/또는 백신 담체로서의 안정한 소포로서 SML의 사용이 있다. 추가의 예로는 영상화제, 예컨대 자기 공명 영상화제 또는 방사선활성 영상화제의 안정한 담체로서 SML의 사용이 있다. 추가의 예로는 효소-감수성 약물 전달을 위한 리포좀 전구약물, 환원-반응성 약물 전달을 위한 지질 조성물로서 SML의 사용, 지질 래프트(raft)의 모델링 및 막 단백질의 전달을 위해 스핑고신을 갖는 SML, 피부 관리 제품을 위해 레티노산을 갖는 SML 에멀젼, 및 초음파 진단에서 마이크로버블을 위한 SML의 사용이 있다. 또다른 예로는 생물학적 거대분자, 예컨대 단백질, DNA, RNA, siRNA, 올리고뉴클레오티드, 개질된 핵산의 전달을 위한 나노입자로서, 또는 단백질의 안정화를 위한 나노입자로서 SML 및 조성물의 사용, 고콜레스테롤혈증의 치료를 위한 영양제품에서 시토스테롤 또는 스티그마스테롤을 함유하는 SML의 사용, 및 바이오센서로서 SML 및 조성물의 사용이 있다.
스테롤- 개질된 양친매성 지질
본 개시내용의 화합물은 2개 이상의 소수성 테일을 가지며, 이 중 1개 이상은 스테롤인 양친매성 지질 화합물이다. 친수성 헤드기는 전형적으로 2 또는 3개의 소수성 테일기에 연결되지만, 더 많이 함유할 수 있으며, 예컨대 4개의 소수성 테일기를 갖는 디포스파티딜 글리세롤 헤드 구조체 (카르디올리핀과 같이)를 기재로 하는 스테롤-개질된 양친매성 지질이 있다.
상기 화합물은 2가지 이상의 일반 원칙을 기반으로 하여 디자인된다: 1) 스테롤은 친수성 헤드기에 공유 부착되고, 2) 상기 화합물은 2개 이상의 소수성 테일을 가진 양친매성 분자이다. 따라서, SML 화합물은 그의 디자인에서 상당한 융통성을 제공하고, 주어진 최종 용도를 위한 성질, 예컨대 1) 2개의 테일의 전반적인 소수성과 헤드기의 소수성 사이의 균형, 및 2) 특이적 스테롤-개질된 양친매성 지질의 목적하는 기능 (예를 들어, 전구약물로서 또는 약물 자체로서의 기능에 대해 전달을 용이하게 하기 위해 에멀젼 또는 리포좀으로 사용 등)의 정밀 조정을 제공한다.
대상 화합물은 스테롤-개질된 양친매성 지질이 존재하는 시스템을 안정화시키기 위해 지질 시스템에 충분한 스테롤을 도입시키는 것을 도와줄 수 있을 뿐만 아니라, 스테롤이 공유 결합되어 상기 시스템과 강하게 회합되어 있기 때문에 상기 구조체로부터 스테롤의 이동을 억제할 수 있다. 예를 들어, 리포좀 중의 스테롤-개질된 양친매성 지질은 상기 리포좀을 안정화시킬 수 있으며, 생리학적 조건하에 (예를 들어 생물학적 유체의 존재하에, 예를 들어 혈청의 존재하에, 37℃에서) 리포좀 내용물의 누출에 대한 증진된 내성을 제공할 수 있다.
SML 화합물의 스테롤 성분과 관련하여, 스테롤 기는 일반적으로 SML의 친수성 헤드기에 공유 부착시키기 위해 사용되는 관능기를 보유한 (또는 보유하도록 개질된) 스테롤 화합물을 기재로 하거나 또는 그로부터 유래된 천연 또는 합성 구조체이다. 예를 들어, 생물학적 공급원으로부터의 스테롤은 보통 유리 스테롤 알코올, 아실화 (스테롤 에스테르), 알킬화 (스테릴 알킬 에테르), 술페이트화 (콜레스테롤 술페이트)로서 발견되거나, 또는 그 자체가 아실화될 수 있는 글리코시드 잔기 (스테릴 글리코시드)에 연결된다 (아실화 스테롤 글리코시드) (예를 들어, 문헌 [Fahy et al., J. Lipid Research (2005) 46:839-861] 참조, 상기 문헌은 그의 전문이 참고로 포함됨). 그 예로는 (1) 동물 공급원으로부터 얻을 수 있는 스테롤 (본원에서 "동물스테롤"로 지칭됨), 예컨대 동물스테롤인 콜레스테롤 및 특정한 스테로이드 호르몬; 및 (2) 식물, 진균 및 해양 공급원으로부터 얻을 수 있는 스테롤 (본원에서 "식물스테롤"로 지칭됨), 예컨대 식물스테롤인 캄페스테롤, 시토스테롤, 스티그마스테롤, 및 에르고스테롤이 있다. 이들 스테롤은 일반적으로 보통 고리 A의 3 위치에, 다른 위치에, 또는 이들의 조합 위치에 1개 이상의 유리 히드록실기를 보유하거나, 또는 필요에 따라 적합한 히드록실 또는 다른 관능기를 도입하도록 개질될 수 있다. 따라서, SML 구조, 조성 및/또는 주어진 최종 용도에 따라, 스테롤 성분은 스테롤 구조체의 다양한 위치에서 SML 화합물에 부착될 수 있다.
특별한 관심의 스테롤은 SML의 헤드기로의 부착을 위한 독특한 관능기를 보유하는 단순 스테롤이다. 독특한 관능기가 히드록실인 단순 스테롤, 특히 고리 A의 3 위치에 히드록실기를 갖는 단순 스테롤 알코올 (예를 들어, 콜레스테롤, β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤, 및 브라시카스테롤, 에르고스테롤 등, 및 그의 유도체)이 특별한 관심의 대상이다.
일부 실시양태에서, SML은 하나 이상의 단순 스테롤을 포함한다. 다른 실시양태에서, SML은 스테롤의 고리 A의 3 위치에서 SML 헤드기에 부착된 하나 이상의 단순 스테롤을 포함한다. 특정한 실시양태에서, SML은 스테롤의 고리 A의 3 위치에서 SML 헤드기에 부착된 하나 이상의 단순 스테롤을 포함하며, 여기서 상기 스테롤, 예컨대 티오콜레스테롤은 고리 A의 3 위치에 단일 히드록실기를 갖는 단순 스테롤을 기재로 하거나 그로부터 유래된 것이다 (예를 들어, 콜레스테롤, β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤, 및 브라시카스테롤, 에르고스테롤 등, 및 그의 유도체).
특정 실시양태에서, SML의 스테롤 성분은 담즙산 또는 담즙염 이외의 것이다. 다른 실시양태에서, SML의 스테롤 성분은 스테로이드 이외의 것이다. 일부 실시양태에서, SML의 스테롤 성분은 스테로이드 접합체 이외의 것이다. 특정 실시양태에서, SML의 스테롤 성분은 세코스테로이드 이외의 것이다.
다른 실시양태에서, SML 화합물은 담즙산 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특별한 관심의 담즙산 성분을 함유하는 SML 화합물의 한 부류는, 담즙산의 카르복실기가 하기 분자의 아민에 부착되어 있는 종이다: D-에리트로-스핑고신, 스핑고신-1-포스페이트, 스핑고신 포스포릴콜린 (리소스핑고미엘린), 글리코실화 스핑고신, 스핑가닌, 스핑가닌-1-포스페이트, 스핑가닌 포스포릴콜린 등 (여기서, 소수성 쇄는 변경될 수 있음). 관심 담즙산 성분을 함유하는 SML 화합물의 두번째 부류는, 담즙산이 글리세롤 포스포콜린의 1 또는 2개의 히드록실기에 부착된 것이다.
또다른 실시양태에서, SML 화합물은 적합한 연결기를 통해 하기 분자에 부착되어 있거나 또는 다른 실시양태에서 다른 인지질 기에 부착되어 있는 스테로이드 성분, 스테로이드 접합체 성분, 및/또는 세코스테로이드 성분을 포함할 수 있다: D-에리트로-스핑고신, 스핑고신-1-포스페이트, 스핑고신 포스포릴콜린 (리소스핑고미엘린), 글리코실화 스핑고신, 스핑가닌, 스핑가닌-1-포스페이트, 스핑가닌 포스포릴콜린 등 (여기서, 소수성 쇄는 변경될 수 있음).
특별한 관심의 예시적인 SML은 다음과 같다: 치환 또는 비치환된 콜레스테롤을 포함하는 SML, 치환 또는 비치환된 β-시토스테롤을 포함하는 SML, 치환 또는 비치환된 스티그마스테롤을 포함하는 SML, 치환 또는 비치환된 캄페스테롤을 포함하는 SML, 치환 또는 비치환된 브라시카스테롤을 포함하는 SML, 및 치환 또는 비치환된 에르고스테롤을 포함하는 SML.
콜레스테롤이 특별한 관심의 대상이다. 관심 콜레스테롤 부류 (치환된 콜레스테롤 포함)의 대표적인 스테롤은 예를 들어 다음과 같다 (표 1 참조): (1) 천연 및 합성 스테롤, 예컨대 콜레스테롤 (양모), 콜레스테롤 (식물 유래), 데스모스테롤, 스티그마스테롤, β-시토스테롤, 티오콜레스테롤, 3-콜레스테릴 아크릴레이트; (2) A-고리 치환된 옥시스테롤, 예컨대 콜레스탄올, 및 콜레스텐온; (3) B-고리 치환된 옥시스테롤, 예컨대 7-케토콜레스테롤, 5α,6α-에폭시콜레스탄올, 5β,6β-에폭시콜레스탄올, 및 7-데히드로콜레스테롤; (4) D-고리 치환된 옥시스테롤, 예컨대 15-케토콜레스텐, 및 15-케토콜레스탄; (5) 측쇄 치환된 옥시스테롤, 예컨대 25-히드록시콜레스테롤, 27-히드록시콜레스테롤, 24(R/S)-히드록시콜레스테롤, 24(R/S),25-에폭시콜레스테롤, 및 24(S),25-에폭시콜레스테롤; (6) 라노스테롤, 예컨대 24-디히드로라노스테롤 및 라노스테롤; (7) 불소화 스테롤, 예컨대 F7-콜레스테롤, F7-5α,6α-에폭시콜레스탄올, F7-5β,6β-에폭시콜레스탄올, 및 F7-7-케토콜레스테롤; (8) 형광 콜레스테롤, 예컨대 25-NBD 콜레스테롤, 데히드로에르고스테롤, 및 콜레스테롤 트리엔. 이들 화합물은 또한 중수소화 및 비-중수소화 형태를 포함할 수 있으며, 예컨대 아반티 폴라 리피즈, 인크. (Avanti Polar Lipids, Inc.)로부터 상업적으로 입수가능하다.
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SML 화합물은 라세미 또는 입체적으로 순수한 화합물로서 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, SML 화합물은 입체화학적으로 순수하다. 다른 실시양태에서는, 라세미 SML이 제공된다. 예를 들어, 리소스핑고미엘린 및 리소 PC 제공을 포함하는 SML이 하나의 이성질체를 제공하도록 합성될 수 있지만 (부착된 것이 라세미가 아닌 경우), 다른 경로는 라세미 화합물을 제공한다. 아미노산 분지 코어를 헤드기의 일부로서 갖는 SML의 경우, 이들은 D 또는 L 형태로서, 또는 라세미 화합물로서 존재할 수 있다. 따라서, SML은 (합성에서 어떠한 형태가 사용되는지에 따라) D 또는 L 이성질체로서, 또는 라세미 화합물로서 제공될 수 있다. 분지 코어로서 특히 유용한 아미노산에는 리신, 오르니틴, 디아미노프로피온산, 디아미노부티르산, 디아미노 아세트산, 아미노에틸 글리신, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인, 티로신, 세린, 트레오닌, 히스티딘, 히드록실 프롤린, δ',δ'-비스아미노프로필 오르니틴, 프로파르길 글리신 및 3,5-아미노-벤조산이 포함된다.
적어도 1개의 비-스테롤 소수성 테일을 함유하는 SML 화합물에 있어서, 비-스테롤 소수성 테일(들)은 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 지방족 쇄를 포함한다. 길이 방향으로 약 2 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함하며 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 것일 수 있는 비-스테롤 소수성 테일이 특히 중요하다. 예를 들어, 상기 경우에서 SML의 비-스테롤 잔기는 2 내지 40개의 탄소 원자, 통상 4 내지 30개의 탄소 원자, 통상 4 내지 25개의 탄소 원자, 더욱 통상 6 내지 24개의 탄소 원자, 더욱 통상 10 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 탄화수소 쇄이다.
비-스테롤 잔기가, 포화 지방족 탄화수소 쇄, 예컨대 알킬기로 포화된 쇄 기재의 치환된 지방족 탄화수소 쇄인 경우, 알킬렌기 내 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 탄소 원자 (일반적으로 약 10개 이하의 탄소 원자)가 산소, 규소, 황 또는 질소 원자로부터 선택되는 헤테로원자에 의해 치환될 수 있고, 알킬렌기 내 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 수소 원자 (일반적으로 수소 원자의 총 수 이하)가 플루오라이드로 치환될 수 있다.
특히 관심있는 비-스테롤 쇄의 예는 다양한 지질, 예컨대 지방족 산, 글리세로리피드, 글리세로포스포리피드, 스핑고리피드, 프레놀 지질 및 사카로리피드, 예컨대 문헌 [Fahy et al, J. Lipid Research (2005) 46:839-861]에 기재된 지질을 기재로 하거나 또는 이로부터 유도된 것들이다.
SML 화합물의 소수성 테일의 탄화수소 쇄 내 탄소의 수는 분자의 소기의 친지성에 따라 선택될 수 있음이 주목되어야 한다. 분자의 친지성은 선택된 쇄 길이와 직접적으로 연관된다. 스테롤-개질된 양친매성 지질이 리포좀에 사용되는 경우, 10 내지 24개의 탄소를 갖는 분자가 특히 관심을 받는데, 이는 그 자체로서 분자에 적합한 소수성을 제공하여 안정한 소포를 형성하기 때문이다. 헤테로원자, 예컨대 산소를 갖는 탄화수소 쇄 내 알킬렌기에 대한 탄소 원자(들)의 치환은 분자의 친지성에 대하여 소기의 효과를 제공할 수 있다. 동일한 원리가 불소화 탄화수소 쇄에 적용된다. 따라서, 1개 이상의 소수성 테일에 대하여 바람직한 탄화수소 쇄 길이는 헤테로원자 치환도에 따라 다양할 수 있다. 치환된 지방족 탄화수소 쇄는 1개 이상의 아릴 또는 헤테로아릴기, 예컨대 방향족 (예, 페닐 또는 치환된 페닐) 또는 헤테로방향족 (예, 피리딘 또는 치환된 피리딘)으로 치환된 것들을 포함할 수 있음이 또한 주목된다.
SML 화합물은 또한, 내부의 소수성 테일기가 절단 (예, 효소적 또는 화학적 절단)을 통해 모 화합물로부터 이탈될 수 있는 것들을 포함한다. 예를 들어, SML 내 공유 결합 중 1개 이상이 미리선택된 조건 하에 (예컨대 에스테라제 또는 알칼리성 pH 조건에 노출된 에스테르 연결) 절단될 수 있다. 또다른 예로서, 환원 조건 하에 절단될 수 있는 디술파이드 연결이 SML에 존재한다. 내부의 소수성 테일 중 적어도 1개가, 절단가능한 결합을 통해 SML에 연결된 소수성 제제 또는 약물을 포함하는 SML이 특히 중요하다.
특정 실시양태에서, SML의 소수성 테일기 중 적어도 1개는 중합가능한 지방족 산, 예컨대 10,12-트리코사디인 산이다. 다른 실시양태에서, SML은 하기를 포함하는 소수성 테일기 중 적어도 하나를 포함한다: (i) 6 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 폴리프로필렌글리콜 단쇄; (ii) 3 내지 30개의 규소 원자를 갖는 규소-함유 선형 또는 분지형 쇄; 및/또는 (iii) 5 내지 40개의 탄소 원자를 갖는 프레놀 지질.
친수성 헤드기에 관하여, SML 화합물의 상기 성분은 하전 기, 극성 기, 또는 하전 및 극성 기의 조합을 포함한다. 하전 기는 음이온성 및 양이온성 잔기를 포함한다. 상기 맥락에서 R로 나타내어진 분자의 분지 코어 부분 및 소수성 테일을 갖는 음이온성 기의 예에는 붕산 (RBO2H2), 카르복실레이트 (RCO2 -), 술페이트 (RSO4 -), 술포네이트 (RSO3 -) 및 포스페이트 (RPO4H-), 포스포네이트 (RPO3H-)가 비제한적으로 포함되며, 이는 양친매성 지질의 헤드기의 통상적 하전 관능기를 나타낸다. 양이온성 기의 예에는 아민 (RNH3 +), 메틸화 아민, 폴리아민, 예컨대 스페르민 등 뿐만 아니라 산성 및 염기성 기를 둘 다 함유하며 (그러므로, 양쪽성) 특정 pH에서 쯔비터이온 또는 양이온으로서 존재하는 (예, 히스티딘) 양쪽성물질이 비제한적으로 포함되며, 이 또한 양친매성 지질의 헤드기의 하전 관능기를 나타낸다. 극성 비하전 기는 알코올 (-OH), 예컨대 글리세롤, 당분, 극성 아미노산 (예컨대 쯔비터이온성 아미노산), 및 올리고에틸렌글리콜로 예시된다. 특정 실시양태에서, 친수성 헤드기는 양친매성 지질 헤드기, 예컨대 콜린, 에탄올아민, 글리세롤, 핵산, 당분, 이노시톨, 아지드, 프로파르길 및 세린의 기타 부가적 요소를 포함한다.
친수성 헤드기는 천연 또는 합성 헤드기, 예컨대 아미노산 또는 유도체, 펩티드, 금속 킬레이트화합물, 아릴 또는 헤테로아릴 유도체이거나, 또는 테일기를 부착시키고 하전 또는 극성 특성을 갖기에 적합한 임의의 적절한 구조일 수 있으며, 단, 전체적 헤드기는 친수성이어야 한다. 친수성 헤드기는 또한 SML의 소수성 테일에 대한 공유 부착에 사용되는 1개 이상의 관능기를 갖는 (또한 갖도록 개질된) 양친매성 지질을 기재로 하거나 또는 이로부터 유도된 구조일 수 있다. 예를 들어, 친수성 헤드기는 양친매성 지질, 예컨대 글리세로리피드, 글리세로포스포리피드, 스핑고리피드 및 사카로리피드의 생물학적 공급원, 예컨대 문헌 [Fahy et al, J. Lipid Research (2005) 46:839-861]에 기재된 지질을 기재로 하거나 또는 이로부터 유도될 수 있다.
특히 관심있는 친수성 헤드기의 예에는, 붕산 (RBO2H2), 카르복실레이트 (RCO2 -), 술페이트 (RSO4 -), 술포네이트 (RSO3 -) 및 포스페이트 (RPO4H-), 포스포네이트 (RPO3H-), 아민 (RNH3 +), 글리세롤, 당분, 예컨대 락토오스로부터 선택되거나 또는 히알루론산, 극성 아미노산, 폴리에틸렌 옥사이드 (폴리에틸렌 글리콜이라고도 공지됨) 예컨대 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜, 분지형 폴리에틸렌 글리콜 및 올리고에틸렌글리콜로부터 유도되는 제1 분자를 포함하고 이것이 콜린, 에탄올아민, 글리세롤, 핵산, 당분, 이노시톨 및 세린으로부터 선택되는 제2 분자의 잔기로 임의로 공액되는 헤드기가 비제한적으로 포함된다. 여기서, 다시 헤드기는 다양한 기타 개질부위를 함유할 수 있으며, 예를 들어, 올리고에틸렌글리콜 및 폴리에틸렌 옥사이드 (PEG) 헤드기의 경우, 상기 PEG 쇄가 메틸기로 종결되거나 또는 추가의 개질부위에 대하여 원위(distal) 관능기를 가질 수 있다.
특히 관심있는 친수성 헤드기의 예에는 포스페이트, 포스포콜린, 포스포글리세롤, 포스포에탄올아민, 포스포세린, 포스포이노시톨, 에틸포스포스포릴콜린, 폴리에틸렌글리콜, 폴리글리세롤, 트리-니트릴로트리아세트산, 멜라민, 글루코스아민, 트리메틸아민, 스페르민, 스페르미딘 및 공액된 카르복실레이트, 술페이트, 붕산, 술포네이트, 술페이트 및 탄수화물이 비제한적으로 포함된다. 다시, 헤드기는, 아지드, 말레이미드, 브로모아세틸, 2-피리딜디티올, 알켄 또는 프로파르길과 같이 활성화된 관능기로 말단-관능화된 폴리에틸렌글리콜 헤드기와 같이, 다양한 개질부위를 함유할 수 있다. 친수성 헤드기는 또한 제2 분자를 포함하고/하거나 이로 공액될 수 있고, 포스포에탄올아민-N-[모노메톡시폴리에틸렌글리콜] 2000 및 포스포에탄올아민-N-숙시닐-N-트리-니트릴로아세트산은 특히 관심있는 몇몇 예이다.
따라서, 특정 실시양태에서, SML은 천연 아미노산을 포함하는 분지 코어 및/또는 헤드기를 포함한다. 다른 실시양태에서, SML은 합성 아미노산을 포함하는 분지 코어 및/또는 헤드기를 포함한다. "천연 아미노산"이란 생물학적 기원으로부터 수득될 수 있는 아미노산, 예컨대 유전적으로 인코딩된 아미노산 및 기타 자연 발생의 리보솜적으로 인스톨된 아미노산으로 의도된다. "합성 아미노산"이란 생물학적 공급원으로부터 단리될 수 있는 것 이외의 아미노산으로 의도된다. 상기 논의된 바와 같이, 이러한 천연 및 합성 아미노산의 예에는 리신, 오르니틴, 디아미노프로피온산, 디아미노부티르산, 디아미노 아세트산, 아미노에틸 글리신, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인, 티로신, 세린, 트레오닌, 히스티딘, 히드록실 프롤린, δ',δ'-비스아미노프로필 오르니틴, 프로파르길 글리신 및 3,5-아미노-벤조산이 포함되며, (합성에 어떠한 형태가 사용되는지에 따라) SML에서 D 또는 L 이성질체로서, 또는 라세미 화합물로서 존재할 수 있다.
추가의 실시양태에서, SML은 리간드 결합 잔기, 예컨대 표적 리간드를 갖는 친수성 헤드기를 포함한다. 표적 리간드로 적합화된 SML은, 특정 에피토프와 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 절편과 같은, 표적 분자와 고 친화도 결합 쌍을 선택적으로 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 리간드는 금속 킬레이트화합물이다. 금속 킬레이트화합물의 예에는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DPTA), 니트릴로트리아세트산 (NTA) 및 그의 유도체가 비제한적으로 포함된다. 예를 들어, 트리-니트릴로트리아세트산 (tri-NTA) 및 그의 다양한 유도체가 문헌 [Huang et al, Bioconj. Chem. 2006, 77: 1592-1600]에 기재되어 있다. 특징적 SML은 트리-니트릴로트리아세트산 및 그의 유도체, 예컨대 포스포에탄올아민-N-숙시닐-N-트리-니트릴로아세트산을 포함하는 헤드기를 포함하고, 상기 SML은 히스티딘-태그 분자와 고 친화도로 결합하는 것에 있어서 특히 유용하다.
하기 화학식을 포함하는 SML이 특히 중요하다:
<화학식 I>
(R1)(R2)G-X
상기 식에서, R1 및 R2는 소수성 테일기이고, G는 분지 코어이고, X는 친수성 헤드기이고, R1 및 R2 중 적어도 하나는 스테롤이다.
화학식 I의 X, G, R1 및 R2기는 각각 개별적으로 화학식 I의 화합물의 하나 이상의 다른 특징에 기여할 수 있으며, 단 화합물은 적어도 1개의 헤드기 및 적어도 2개의 소수성 테일을 포함하고, 테일 중 적어도 1개는 스테롤이다(예, 화학식 III 참조). 화학식 I의 화합물은 1개 이상의 부가적 분지점, 1개 이상의 부가적 테일, 및/또는 1개 이상의 헤드기를 갖는 화합물을 추가로 포함할 수 있고, 단 화합물은 또한 적어도 1개의 친수성 헤드기 및 적어도 2개의 소수성 테일을 포함하고, 테일 중 적어도 1개는 스테롤이다. 예로서 화학식 (R1)(R2)G-X-G(R3)(R4)의 SML 화합물 (여기서, R3 및 R4는 각각 개별적으로 존재 또는 부재할 수 있음), 예컨대 카디오리핀 헤드/분지 코어 구성 기재의 SML (여기서, R1, R2, R3 및 R4는 존재함)이 포함된다. 단일 헤드/분지 코어 기에 연결된 2개의 소수성 테일을 갖는 화학식 I의 모노스테롤 및 디스테롤 양친매성 지질로 예시되는 SML이 특히 중요하다.
한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물이 1개의 스테롤 잔기 (즉, R1 또는 R2에 위치한 스테롤)만을 함유하는 경우, 비-스테롤 잔기는 길이 방향으로 약 2 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함하는 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 것일 수 있는 지방족 쇄를 포함한다. 예를 들어, (해당 R1 또는 R2에서의) 비-스테롤 잔기는 2 내지 40개의 탄소 원자, 통상 4 내지 30개의 탄소 원자, 통상 4 내지 25 탄소 원자, 더욱 통상 6 내지 24 탄소 원자, 더욱 통상 10 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 탄화수소 쇄이며, 여기서 R1 또는 R2의 알킬렌기 내 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 탄소 원자 (일반적으로 약 10개 이하의 탄소 원자)는 산소, 규소, 황 또는 질소 원자로부터 선택되는 헤테로 원자에 의해 치환될 수 있고, R1 또는 R2의 알킬렌기 내 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 수소 원자 (일반적으로 수소 원자의 총 수 이하)는 플루오라이드로 치환될 수 있다. 여기서, 다시 탄소의 수 및 SML 화합물의 비-스테롤 소수성 테일의 치환의 유형 및 양은 분자의 소기의 특성에 따라 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 모노스테롤 양친매성 지질은 화학식 I의 것이고, 여기서 R1 또는 R2 중 하나는 동물스테롤 또는 식물스테롤 (예, 예컨대 콜레스테롤, 스테로이드 호르몬, 캄페스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤 및 스티그마스테롤)을 포함하는 스테롤이고, R1 및 R2 중 하나는 2 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 탄화수소 쇄를 포함하는 비-스테롤 잔기이며, G는 친수성 헤드기 X에 R1 및 R2를 부착시키는 분지 코어이다.
또다른 실시양태에서, 화학식 I의 R1 또는 R2 중 하나는 2 내지 40개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 탄화수소 쇄이다. 특정 실시양태에서, 화학식 I의 R1 또는 R2 중 하나는 4 내지 24개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 탄화수소 쇄이다. 다른 실시양태에서, 화학식 I의 R1 또는 R2 중 하나는 6 내지 24개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 탄화수소 쇄이다. 추가의 실시양태에서, 화학식 I의 R1 또는 R2 중 하나는 10 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 탄화수소 쇄이다.
일반적으로, 화학식 I의 R1 또는 R2 중 하나가 1개 이상의 알킬렌기를 갖는 불포화, 치환된 지방족 탄화수소 쇄를 기재로 할 경우, 추가의 R1 또는 R2기는 그 내부의 알킬렌기 내 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 탄소 원자 (그러나, 일반적으로 약 10개 이하의 탄소 원자)가 산소, 규소, 황 또는 질소 원자로부터 선택되는 헤테로 원자에 의해 치환될 수 있는 것들을 포함한다. 또한, 불포화 R1 또는 R2 지방족 탄화수소 쇄의 알킬렌기 내 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 수소 원자 (일반적으로 수소 원자의 총 수 이하)가 플루오라이드로 치환될 수 있다.
특히 관심있는 비-스테롤 쇄의 예는 다양한 지질, 예컨대 지방족 산, 글리세로리피드, 글리세로포스포리피드, 스핑고리피드, 프레놀 지질 및 사카로리피드, 예컨대 문헌 [Fahy et al, J. Lipid Research (2005) 46:839-861]에 기재된 지질을 기재로 하거나 또는 이로부터 유도될 수 있는 것들이다.
또다른 실시양태에서, 상기 화학식 I의 화합물의 R1 또는 R2는 효소적 절단을 통해 모 화합물로부터 이탈될 수 있는 소수성 약물이다. 또다른 실시양태에서, 상기 화학식 I의 화합물에 따라, R1, R2 및 X는 공유 결합을 통해 G에 연결되며, 이들 중 하나 이상은 미리-선택된 조건 (예컨대, 환원 조건에 노출된 디술파이드 연결 또는 알칼리성 조건에 노출된 에스테르)하에 절단될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 상기 화학식 I의 화합물의 R1 또는 R2는 중합될 수 있는 지방족 산, 예컨대 10,12-트리코사디인산이다. 또다른 실시양태에서, 상기 화학식 I의 화합물의 R1 또는 R2는 6 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 단쇄 폴리프로필렌글리콜이다. 또다른 실시양태에서, 상기 화학식 I의 화합물의 R1 또는 R2는 3 내지 30개의 규소 원자를 갖는 규소-함유 직쇄 또는 분지쇄이다. 또다른 실시양태에서, 상기 화학식 I의 화합물의 R1 또는 R2는 5 내지 40개의 탄소 원자를 갖는 프레놀 지질이다.
한 실시양태에서, 상기 화학식 I의 화합물의 G는 3개 이상의 부착점을 갖는 분지 코어이고, 여기서 한 부착점은 친수성 헤드기 X에 연결되고, 2개의 부착점은 친수성 테일기 R1 및 R2에 각각 단독으로 연결된다. 따라서, 특정 실시양태에서 G는 R1, R2 및 X의 부착을 위한 3개 이상의 관능기를 갖는 화합물, 예컨대 다음 구조:
Figure pct00009
(여기서, n은 0, 1, 2 또는 3일 수 있음)로부터 선택된 화합물로부터 유래된 분지 코어이다. 상기 실시양태에서, R1 및 R2가 모든 위치에 있을 수 있으며, 나머지 위치를 X가 차지한다. 따라서, 친수성 헤드기 X는 하나의 관능기 (예컨대, 카르복실 (-COOH), 아민 (-NH2) 또는 알코올 (-OH))에 부착되고, 친수성 테일기 R1 및 R2는 나머지 관능기 (예컨대, 카르복실 (-COOH), 아민 (-NH2) 또는 알코올 (-OH))에 부착된다.
화학식 I의 X는 친수성 기, 통상적으로 친수성 헤드기이다. 특정 실시양태에서, 친수성 기는 하전된 기, 극성 기, 또는 하전된 기와 극성 기의 조합을 포함한다. 따라서, 친수성 기 X (또는 G-X)는 합성 기, 예컨대 아미노산 또는 유도체, 아릴 또는 헤테로아릴 유도체, 또는 하전되거나 극성인 특성을 갖고 테일기를 부착하기 위한 임의의 적합한 구조일 수 있고, 단 모든 SML의 헤드기는 친수성이다. 친수성 기 X의 특히 관심의 대상이 되는 아릴 또는 헤테로아릴 유도체의 예에는 크로몰린 및 크로몰린 글리콜레이트가 있다 (G-X). 친수성 기 X (또는 G-X)는 또한 SML의 소수성 테일에 대한 공유 부착에 사용되는 하나 이상의 관능기를 갖는 (또는 이를 갖기 위해 개질된) 양친매성 지질에 기초한 구조이거나, 그로부터 유래한 구조일 수 있다. 예를 들어, 친수성 기 X (또는 G-X)는 양친매성 지질, 예를 들어 글리세로리피드, 글리세로포스포리피드, 스핑고리피드 및 사카로리피드, 예컨대 문헌 [Fahy et al., J. Lipid Research (2005) 46:839-861]에 기재된 지질에 기초하거나, 또는 그로부터 유래될 수 있다. X 및 G-X의 예시적인 기에는 포스페이트, 포스포콜린, 포스포글리세롤, 포스포에탄올아민, 포스포세린, 포스포이노시톨, 에틸포스포스포릴콜린, 폴리에틸렌글리콜, 폴리글리세롤, 멜라민, 글루코사민, 히알루론산 및 트리메틸아민이 포함되나, 반드시 이들로 한정되지는 않는다.
일부 실시양태에서, G-X는 관심의 대상이 되는 잔기로 제공된다. 예를 들어, 하기 보다 상세히 논의되는 바와 같이, G-X는 카르니틴으로 제공될 수 있고, 이는 이어서 화학식 I에 따른 R1 및 R2에 연결된다.
다른 실시양태에서, G-X는 디포스파티딜글리세롤 (예컨대, 카르디올리핀을 함유하여)로 제공되고, 이는 이어서 화학식 I에 따른 (2개 이상 내지 4개 이하의) R1 및 R2에 연결된다.
특히 관심의 대상이 되는 예시적인 화합물은 G가 글리세롤이고, X가 포스포콜린인 화학식 I의 화합물이다.
또다른 실시양태에서, 상기 화학식 I의 화합물의 R'-G는 스핑고신 및 스핑고닌으로부터 선택된다. 또다른 실시양태에서, 상기 화학식 I의 화합물의 G-X는 카르니틴이다.
스테롤 글리세로포스포리피드가 특히 관심의 대상이 되며, 이는 지방산 테일기 대신에 치환된 하나 이상의 스테롤을 함유하는 글리세롤 코어를 갖는 지질을 의미하는 것으로 의도된다. 스테롤 글리세로포스포리피드의 예에는 글리세롤 잔기에 부착된 하나 이상의 스테롤 잔기를 함유하는 sn-글리세로-3-포스포르산의 임의의 유도체, 및 예를 들어 질소계 염기, 글리세롤 또는 이노시톨 유닛으로 이루어진 극성 헤드기가 포함된다. 모노스테롤 글리세로포스포리피드에 대해, 스테롤은 글리세롤 잔기의 한 잔기에 부착되고, 글리세롤 잔기의 또다른 잔기는, 예를 들어 O-아실, O-알킬, O-알크-1'-에닐 또는 O-카르바메이트이다. 이들은 스테롤 및 지방산의 동일하거나 상이한 서브유닛일 수 있다.
스테롤 글리세로포스포리피드의 특정 예시적인 실시양태에서, 화합물은 G가 글리세롤이고, X가 포스포콜린인 화학식 I의 화합물이다. 특히 관심의 대상이 되는 화합물은 하기 화학식 II를 갖는 것 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 기재된다.
<화학식 II>
Figure pct00010
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 소수성 잔기이고, 여기서 R1 및 R2 중 하나 이상은 스테롤이고, R1 또는 R2 중 하나만이 스테롤인 경우, 비-스테롤 잔기는 2 내지 40개의 탄소 원자, 통상적으로 4 내지 25개의 탄소 원자, 보다 통상적으로 6 내지 24개의 탄소 원자, 보다 통상적으로 10 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 지방족 탄화수소 탄화수소 사슬이고, 여기서 R1 (또는 R2)의 알킬렌기의 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 탄소 원자는 산소, 황 또는 질소 원자로부터 선택된 헤테로원자로 치환될 수 있고, 여기서 R1 (또는 R2)의 알킬렌기의 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 수소 원자는 불소로 치환될 수 있다. R1 (또는 R2)의 비-스테롤 잔기는 상기 논의된 바와 같은 임의의 비-스테롤 잔기일 수 있다.
특정 실시양태에서, 화학식 II의 화합물은 하기 표 2에 기재된 바와 같은 화학식을 갖는다.
Figure pct00011
a전반적 구조를 위해 화학식 II 참조; b,c, en = 18, 16, 14; d, fn = 17, 15, 13.
gCHEMS: 콜레스테릴헤미숙신산; hStigHS: 스티그마스테릴헤미숙신산; iSitoHS: 시토스테릴헤미숙신산.
추가의 특정 실시양태에서, R1, G 및 X가 스핑고신 포스포릴콜린 (리소스핑고미엘린)에 함유되고, R2가 스테롤인 하기 화학식 III의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 제공된다.
<화학식 III>
Figure pct00012
특정 관심의 대상이 되는 화학식 III의 화합물의 예는 R2가 콜레스테롤 헤미숙시네이트 또는 다른 스테롤 유도체인 것이다.
상기 화학식 I에 반영된 바와 같이, 본 개시내용은 R1 또는 R2 중 하나가 스테롤인 화합물, 뿐만 아니라 R1 및 R2 모두가 스테롤인 화합물을 고려한다. 이러한 실시양태에서, R1 및 R2는 이들이 동일하거나 상이한 스테롤일 수 있도록 독립적으로 선택된다. 특히 유용한 스테로이드 조합의 예에는 콜레스테롤과 에르고스테롤, 콜레스테롤과 시토스테롤, 콜레스테롤과 스티그마스테롤, 및 스티그마스테롤과 시토스테롤 사이의 조합이 있다.
특정 관심의 대상이 되는 예시적인 SML에는 글리세로포스포리피드, 스핑고포스포리피드, 카르니틴 지질 및 아미노산 지질로부터 선택된 양친매성 지질에 기초한 것들, 또는 그로부터 유래된 것들이 포함된다. 예를 들어, 아미노산 인지질은 포스페이트-개질된 아미노산 친수성 헤드기에 접합된 지질이다.
그 예에는
(1) 화학식 II에 따른 스테롤-개질된 글리세로포스포리피드, 예컨대 SML1a. SML1b, SML1c, SML2a, SML2b, SML2c, SML2d, SML3a, SML3b, SML3c, SML3d, SML4a, SML4b, SML4c, SML4d, SML5a, SML5b, SML5c, SML5d, SML6a, SML6b, SML6c, SML6d, SML7a, SML7b, SML9a, SML9b, SML9c, SMLlOa, SMLlOb, SMLlOc, SMLlOd, SMLlOe, SMLlOf, SML13a, SML13b, SML13c, SML13d, SML13e, SML13f, SML13g, SML13h, SML15a, SML15b, SML15c, SML15d, SML15e, SML15f, SML15g, SML15h, SML15i, SML15j, SML15k, SML16a, SML16b, SML16c, SML16d, SML16e, SML16f, SML16g, SML16h, SML16i, SML16j, SML16k, SML16l 및 SML16m으로부터 선택된 화합물 및 이들의 유도체;
(2) 화학식 III에 따른 스테롤-개질된 스핑고포스포리피드, 예컨대 SML8a, SML8b, SML8c, SML8d, SML8e 및 SML8f로부터 선택된 화합물 및 이들의 유도체;
(3) 화학식 I에 따른 스테롤-개질된 카르니틴 지질, 예컨대 SML11a, SML11b, SML11c, SML11d, SML11e 및 SML11f로부터 선택된 화합물 및 이들의 유도체;
(4) 화학식 I에 따른 스테롤-개질된 아미노산 지질, 특히 친수성 헤드기가 아미노산을 포함하는 것들, 예컨대 SML12a, SML12b, SML12c, SML12d, SML12e, SML12f, SML13i, SML13j 및 SML13k로부터 선택된 화합물 및 이들의 유도체; 및
(5) 활성화된 잔기, 예컨대 아지드, 말레이미드, 브로모아세틸, 2-피리딜디티올, 알켄 및 프로파르길로 말단-관능화된 활성화 친수성 헤드기를 갖는 화학식 I에 따른 스테롤-개질된 양친매성 지질, 예컨대 L14a, SML14b, SML14c, SML14d, SML14e 및 SML14f로부터 선택된 화합물 및 이들의 유도체
가 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
이와 같이, 특정 실시양태는 SML1a, SML1b, SML1c, SML2a, SML2b, SML2c, SML2d, SML3a, SML3b, SML3c, SML3d, SML4a, SML4b, SML4c, SML4d, SML5a, SML5b, SML5c, SML5d, SML6a, SML6b, SML6c, SML6d, SML7a, SML7b, SML8a, SML8b, SML8c, SML8d, SML8e, SNL8f, SML9a, SML9b, SML9c, SML1Oa, SML1Ob, SML1Oc, SML1Od, SML1Oe, SML1Of, SML11a, SML11b, SML11c, SML11d, SML11e, SML11f, SML12a, SML12b, SML12c, SML12d, SML12e, SML12f, SML13a, SML13b, SML13c, SML13d, SML13e, SML13f, SML13g, SML13h, SML13i, SML13j, SML13k, SML14a, SML14b, SML14c, SML14d, SML14e, SML14f, SML15a, SML15b, SML15c, SML15d, SML15e, SML15f, SML15g, SML15h, SML15i, SML15j, SML15k, SML16a, SML16b, SML16c, SML16d, SML16e, SML16f, SML16g, SML16h, SML16i, SML16j, SML16k, SML16l 및 SML16m으로부터 선택된 SML 화합물 (상기 화합물은 하기 표 3에 도시되어 있음) 및 이들의 유도체를 포함한다.
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
스테롤- 개질된 양친매성 지질의 특성
본 개시내용의 스테롤-개질된 양친매성 지질은 리포좀에서와 같이 이중층에 존재하는 경우에 다양한 물리적 특성을 나타내도록 설계될 수 있다. 이러한 물리적 특성의 예에는 상 전이 거동, 엔탈피, 및 리포좀 내용물 누출에 대한 내성이 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 SML을 함유하는 리포좀의 안정성은 하나 이상의 내용물 누출 검정 (생리학적 조건 (예컨대, 세럼의 존재하에 37℃)하에서의 누출 또는 삼투 스트레스에 노출된 경우의 누출)에 의해 평가될 수 있다. 전이 온도 상에서의 SML의 효과 및 합성 디아실포스포리피드의 엔탈피가 또한 그를 특성화하는데 이용될 수 있다.
한 실시양태에서, 스테롤-개질된 양친매성 지질은 생체내 생리적 조건 (또는 상기 생체내 생리적 조건을 모델로 한 시험관내 조건) 하에서 누출에 내성이 있어서, 약 7일의 기간에 걸쳐 리포좀 내용물의 누출이 30％ 미만, 25％ 미만, 20％ 미만, 15％ 미만, 10％ 미만 또는 5％ 미만이 검출 내지 검출불가능한 안정화된 리포좀을 제공한다. 추가 실시양태에서, 스테롤-개질된 양친매성 지질은 생리적 조건 하에서 누출에 내성이 있어서, 약 14일의 기간에 걸쳐 리포좀 내용물의 누출이 25％ 미만, 20％ 미만, 15％ 미만, 10％ 미만, 5％ 미만 또는 1％ 미만이 검출 내지 검출불가능한 리포좀을 제공할 수 있다. 추가로, 스테롤-개질된 양친매성 지질은 누출에 내성이 있어서, 리포좀 내용물의 약 80％, 90％, 또는 그 이상이 생리적 조건 하에서 약 7일 동안 유지되고/거나; 리포좀 내용물의 약 60％, 70％, 80％, 90％, 또는 그 이상이 생리적 조건 하에서 약 14일 동안 유지되고/거나; 리포좀 내용물의 약 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 또는 그 이상이 생리적 조건 하에서 약 21일 동안 유지되고/거나; 리포좀 내용물의 약 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 또는 그 이상이 생리적 조건 하에서 약 28일 동안 유지되는 리포좀을 제공할 수 있다.
특정 실시양태에서, 안정화된 리포좀 조성물은 통상적으로 리포좀의 총 지질 몰 함량의 적어도 15％, 적어도 20％, 적어도 25％, 적어도 30％이고, 15％ 내지 90％, 15％ 내지 35％, 30％ 내지 70％, 35％ 내지 80％, 35％ 내지 65％ 또는 40％ 내지 70％일 수 있고, 보다 높은 양으로 존재, 예를 들어 90％ 내지 95％, 또는 그 이상일 수 있는 스테롤-개질된 양친매성 지질의 몰 함량을 포함한다. 특정 실시양태에서, 스테롤-개질된 양친매성 지질의 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤)은 적어도 25％, 적어도 30％, 적어도 50％, 적어도 60％, 적어도 70％, 또는 그 이상의 스테롤의 몰 함량을 제공하도록 리포좀 조성물에 존재한다. 특정 실시양태에서, 리포좀 조성물은 적어도 30％, 적어도 35％, 적어도 70％, 적어도 85％, 또는 그 이상인 모노스테롤-개질된 양친매성 지질의 몰 함량을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 리포좀 조성물은 약 15％ 내지 35％이고, 적어도 30％, 적어도 40％, 적어도 45％, 또는 그 이상일 수 있는 디스테롤-개질된 양친매성 지질의 몰 함량을 포함한다.
전구약물 , 약물로서의 스테롤- 개질된 양친매성 지질, 및 요망되는 특성
본 개시내용의 스테롤-개질된 양친매성 지질은 요망되는 특성, 예컨대 요망되는 물성 (예를 들어, 지질친화성) 및/또는 기능적 활성 (예를 들어, 약물 또는 전구약물로서의 활성)을 제공하도록 디자인될 수 있다.
예를 들어, 본 개시내용의 스테롤-개질된 양친매성 지질은 전구약물, 즉, (일반적으로, 화합물이 투여되는 대상체의 신체에서) 덜 활성인 형태로부터 보다 더 활성인 형태로 전환될 수 있는 화합물로서 작용하도록 디자인될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 상기 화학식 I의 화합물의 R1 또는 R2는 효소 절단을 통해 모 화합물로부터 방출될 수 있는 소수성 약물이다. 따라서, 예를 들어, 화학식 I은 R1이 관심 약물이고, R2가 스테롤인 화합물이 고려된다. 단독 또는 최소의 상보적 성분과 함께 스테롤-개질된 양친매성 지질 전구약물에 의해 안정한 리포좀이 달성될 수 있고 이에 따라 전구약물 제제를 단순화시킬 수 있기 때문에, 단일 스테롤-개질된 양친매성 지질에의 스테롤 및 약물의 혼입은 통상적인 리포좀 전구약물에 대해 유리할 수 있다. 또한, 공유 부착된 스테롤은 생물학적 유체에서 리포좀 전구약물의 안정화를 촉진시켜 리포좀이 표적화된 치료 부위, 예를 들어 전구약물의 절단이 신체의 다른 부위에 비해 강화된 부위 (예를 들어, 증가된 효소 활성 부위, 또는 7.4 미만 또는 초과의 pH 등)에 서서히 축적될 수 있다.
화학식 I에 따른 화합물이 전구약물인 경우, R1 및 R2 중 적어도 하나는 스테롤이고, 1개 이상의 R1 및 R2는 소수성 약물이다. 예시적인 소수성 약물로는 스테롤 (예컨대, 스테로이드), 카로테노이드, 비타민, 지방산, 소분자 소수성 약물, 감별 인자 및 마취제가 포함된다. 소수성 약물의 예로는 레티노산 (예를 들어, 모든 트랜스 레티노산; 13-시스 레티노산), 스테로이드 및 유도체 (예를 들어, C18 스테로이드 (에스트로겐) 및 유도체; C19 스테로이드 (안드로겐, 예컨대 테스토스테론 및 안드로스테론) 및 유도체; C21 스테로이드 (글루코/무기코르티코이드, 프로게스토겐, 및 글루코코르티코이드 및 무기코르티코이드, 및 유도체) 및 세코스테로이드 및 유도체 (예를 들어, 개방 B 고리의 코어 구조를 특징으로 하는 비타민 D2 및 유도체; 비타민 D3 및 유도체, 이하 "세코" 접두어)가 포함되나, 반드시 이들로 제한되지는 않는다. 특히 흥미로운 것은, R1이 단순 스테롤이고, R2가 소수성 약물인 화학식 I의 전구약물 화합물이다. 한 특정 실시양태에서, R1은 스테롤이고, R2는 레티노산이다. G-X가 포스포콜린인 경우, sn-2 위치의 에스테르 결합은 포스포리파제 A2에 의해 절단되어 레티노산의 방출을 야기할 수 있다. 당업자는 다수의 변경 및 변형이 목적하는 약물의 SML 리포좀 전구약물의 제조에서 이루어질 수 있음을 인지할 것이다.
스테롤-개질된 양친매성 지질을 전구약물로서 제공하기 위해 필요한 경우, R1, R2 및 X는 적어도 하나가 바람직한 조건 하에서 쉽게 절단될 수 있도록 공유 결합을 통해 화학식 I의 G에 결합된다. 예를 들어, 스테롤-개질된 양친매성 지질은 효소적으로 절단될 수 있거나, 환원 조건 하에서 절단될 수 있거나 또는 낮은 pH 하에서 절단될 수 있다. 예를 들어, R1, R2 및 X는 적어도 하나가 환원 조건 하에서 절단될 수 있는 공유 결합을 통해 화학식 I의 G에 결합될 수 있다. 예를 들어, 디술파이드 결합이 R2와 X 사이에 도입되어, 환원 환경에 의해 절단이 유발될 수 있다. 본 발명의 화합물은, 예컨대 세포내 환경, 예를 들어 시토졸에서, 세포내 소포 (예를 들어, 엔도솜, 포식 소포) 안 등에서 발견될 수 있는, 환원 환경의 특징을 나타내는 특정 부위에서 유발되는 약물의 방출에 대해 유용하다.
스테롤-개질된 양친매성 지질은 또한 양이온성 헤드기를 가져 비공유 전하-전하 상호작용을 통해 음으로 하전된 치료 잔기의 전달을 촉진시키도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 화학식 I의 G-X는 신체 대사 과정에서 필수적 분자인 카르니틴일 수 있다. 본 발명의 화합물은 배양물의 세포 안으로 및 생체내 세포 안으로의 핵산, 예컨대 RNA, DNA, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA의 전달에 대한 유용한 도구로 제공될 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 핵산은 상기 목적상 디자인된 SML의 양이온성 헤드기에 의해 착화되어 표적 부위로 전달될 수 있다.
스테롤-개질된 양친매성 지질은 또한 R1 및/또는 R2 기가 화합물의 어셈블리에, 예컨대 리포좀에서 영향을 미칠 수 있도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 스테롤-개질된 양친매성 지질은 중합성 쇄를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 화학식 I의 화합물의 R1 또는 R2는 10,12-트리코사디인산과 같은 중합성 지방족 산을 함유한다. 스테롤-개질된 양친매성 지질의 1개 이상의 쇄의 중합은 기초 생체의학 연구, 센서 용도 또는 제약 용도에 대해 유용할 수 있는 상 거동 (phase behavior)과 같은 특성을 분자에 부여할 수 있다.
R1 또는 R2는 또한 요망되는 지질친화성을 갖는 스테롤-개질된 양친매성 지질을 제공하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 화학식 I의 화합물의 R1 또는 R2는 6개 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 단쇄 알킬렌글리콜, 예를 들어 폴리프로필렌글리콜 쇄일 수 있다. 스테롤-개질된 양친매성 지질에의 단쇄 폴리프로필렌글리콜의 도입은 분자의 소수성에 영향을 미칠 수 있고, 스테롤-개질된 양친매성 지질의 어셈블리에 영향을 줄 수 있다. 콜레스테릭 액체 결정상은 스테롤-개질된 양친매성 지질의 구조가 미세하게 조정되는 경우에 달성될 수 있다.
스테롤-개질된 양친매성 지질은 또한 "지질 래프트"로서 기능하도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, R2는 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤)일 수 있고, 화학식 I의 R1-G는 스핑고신 및 스핑고닌으로부터 선택될 수 있다. 이러한 화합물은 예를 들어 스핑고신과 콜레스테롤 사이의 상호작용에 의해 인공 지질 래프트를 형성할 수 있다. 인공 지질 래프트는 막 단백질 신호전달 및 병원체의 침입에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지는 단백질-지질 래프트 상호작용의 연구에 대한 도구로서 이용될 수 있다. 이들 스테롤-개질된 양친매성 지질은 또한 단백질의 전달, 또는 병원체의 침입을 예방하기 위한 세포막 도메인의 조절에서 유용한 것으로 여겨질 수 있다.
스테롤- 개질된 양친매성 지질의 제조 방법
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물의 합성에 대해 다양한 방법을 제공한다. 일반적으로, 방법은 1개 이상의 스테롤 테일기를 분지 코어를 통해 친수성 헤드기에 커플링시켜, 소수성 테일기 중 적어도 1개가 스테롤 테일기를 포함하는 2개 이상의 소수성 테일기에 분지 코어를 통해 연결된 친수성 헤드기를 갖는 스테롤-개질된 양친매성 지질을 생성하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 방법은 (i) 1개 이상의 스테롤 테일기를 포함하는 분지 코어를 친수성 헤드기에 커플링시키는 단계; 및 (ii) 소수성 테일기 중 적어도 1개가 스테롤 테일기를 포함하는 2개 이상의 소수성 테일기에 분지 코어를 통해 연결된 친수성 헤드기를 갖는 스테롤-개질된 양친매성 지질을 형성하는 단계를 포함한다.
다른 특정 실시양태에서, 방법은 (i) 1개 이상의 스테롤 테일기를 친수성 헤드기에 결합된 분지 코어에 커플링시키는 단계; 및 (ii) 소수성 테일기 중 적어도 1개가 스테롤 테일기를 포함하는 2개 이상의 소수성 테일기에 분지 코어를 통해 연결된 친수성 헤드기를 갖는 스테롤-개질된 양친매성 지질을 형성하는 단계를 포함한다.
상기 방법에서, 스테롤-개질된 양친매성 지질이 1개 이상의 비-스테롤 테일기를 포함하는 경우, 비-스테롤 테일기는 스테롤 테일기가 부착되기 이전에, 이와 동시에 또는 이후에 분지 코어에 부착될 수 있다.
따라서, 방법은 최종 목적하는 생성물까지 다수의 상이한 경로를 제공하는 다양한 여러 합성 전략을 포함한다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물은 일반적으로, (i) 성분 (a)가 분지 코어 G이고, 성분 (b)가 R1 및 R2를 포함하는 소수성 테일기이고, 성분 (c)가 친수성 헤드기 X인 성분 (a)-(c)를 커플링을 위해 미리형성된 개별적 성분으로서 제공한 다음, (ii) 성분 (a)-(c)를 커플링시켜 화학식 I의 분자를 생성함으로써 제조할 수 있다. 별법으로, 화학식 I의 화합물은 일반적으로, (i) 성분 (d)가 소수성 테일기 성분 R1 및 R2의 일부를 포함하거나 또는 이들에 결합된 분지 코어 G이고 (즉, (R1)(R2)-G'), 성분 (e)가 친수성 헤드기 X인 중간체 성분 (d) 및 (e)를 커플링을 위해 제공한 다음, (ii) 성분 (d) 및 (e)를 커플링시켜 화학식 I의 분자를 생성함으로써 제조할 수 있다. 표준 유기 합성 방법, 예컨대 화학선택적 커플링 전략, 직교 보호기 및 제거 등의 사용이 상기 목적상 이용될 수 있다.
일반적으로, 특정 합성 경로의 길이는 특정 표적 분자의 복잡성 및 출발 물질의 입수가능성에 따라 좌우된다. 예를 들어, 디스테롤 포스포콜린은 출발 물질로서 글리세로포스포콜린을 사용하여 1-단계 반응으로 합성할 수 있다. 그러나, 에테르 연결기를 함유하는 지질의 합성은 더 많은 단계를 필요로 한다.
특히, 글리세로포스포콜린은 화학식 II의 스테롤-개질된 양친매성 지질의 제조에 대해 유용한 출발 물질이지만, 이는 대부분의 반응 용매에서 미약한 용해도를 갖는다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 양친매성 지질을 함유하는 포스포콜린의 효율적이고 고수율의 합성에 대해 콜린의 반대이온으로서, 구체적으로는 상 전이 촉매로서 테트라페닐 보레이트를 사용함으로써 유기 용매 중에 글리세로포스포콜린을 가용화시키는 효율적인 방법을 제공한다.
특정 실시양태로서, (i) 1개 이상의 관능기를 갖는 포스포콜린 화합물을 유기 용매에서 테트라페닐 보레이트와 착화시키는 단계 및 (ii) 포스포콜린 화합물의 관능기와 반응할 수 있고 여기에 커플링될 수 있는 1개 이상의 관능기를 포함하는 1개 이상의 지질을 포스포콜린 화합물의 관능기에 커플링시키는 단계를 포함하는, 양친매성 지질을 함유하는 포스포콜린의 합성 방법이 제공된다. 본 발명의 이러한 측면에서, 유기 용매, 관능화된 포스포콜린 화합물 및 관능화된 지질(들)은 반응과의 상용성에 대해 선택된다. 커플링에 대한 용매 및 다른 시약은 표준물질 (예를 들어, 메탄올, 피리딘, 4,4-디메틸아미노피리딘 등)이었다. 관능기는 반응에서 화학선택적인 임의의 것, 예컨대 지질의 클로로포르메이트 에스테르 및 포스포콜린 화합물 상의 관능기의 히드록실일 수 있다. 관능화된 포스포콜린의 예로는 글리세로포스포콜린, 아미노산 관능화된 포스포콜린 등이 포함되나 이들로 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 다양한 보호기 전략이 단일 지질 부착 계획뿐만 아니라 상이한 지질의 직교 부착에 대해 이용될 수 있다. 방법은 (iii) 양친매성 지질을 함유하는 포스포콜린을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 스테롤-개질된 양친매성 지질을 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은 스테롤-개질된 양친매성 지질을 비-스테롤 양친매성 지질, 치료제, 화장제, 검출가능한 표지, 완충액, 용매 및 부형제 중 1종 이상과 혼합시키는 것을 포함한다. 이 방법은 추가로 조성물의 정제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 지질-함유 조성물의 제조 방법은 잘 알려져 있으며, 따라서, 본 발명의 SML 조성물의 제조에서 이용될 수 있다. 방법은 리포좀 및 에멀젼의 제조에 특히 유용하다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 스테롤-개질된 양친매성 지질 화합물을 포함하는 리포좀의 형성 방법을 제공한다. 일반적으로, 방법은 스테롤-개질된 양친매성 지질을 리포좀이 형성되는 리포좀 형성 조건에 적용시키는 것을 포함한다. 리포좀 형성 조건은 통상적으로 리포좀 분야에서 잘 알려진 표준 조건이다. 방법은 임의로, 스테롤-개질된 양친매성 지질을 다른 양친매성 지질, 작용제, 완충액, 용매 및/또는 부형제 중 1종 이상과 혼합시킨 다음, 상기 혼합물을 리포좀 형성 조건에 적용시키는 것을 포함할 수 있다. 방법은 또한 다양한 잘 알려진 방법, 예컨대 크로마토그래피, 상 분리, 용매 추출, 동결건조, 재수화 등에 의해 리포좀을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 리포좀의 스테롤-개질된 양친매성 지질 함량은 1％ 이상 100％ 이하의 범위이고, 이는 구체적으로 그 사이에서 분획 증분, 예컨대 0.5％, 1％, 1.5％, 2％, 2.5％, 3％, 3.5％, 4％, 4.5％ 및 5％ 증분, 예를 들어 5％ 증분으로의 범위를 포함하며, 여기서 스테롤-개질된 양친매성 지질 함량은 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 및 100％로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 리포좀의 제조 방법은 리포좀 형성 조건 하에서, (i) 1개 이상의 양친매성 지질을 (ii) 소수성 테일기 중 적어도 1개가 스테롤을 포함하는 2개 이상의 소수성 테일기에 분지 코어를 통해 연결된 헤드기를 포함하는 1개 이상의 스테롤-개질된 양친매성 지질과 혼합시켜 리포좀을 형성하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 양친매성 지질 및 스테롤-개질된 양친매성 지질은 스테롤-개질된 양친매성 지질의 몰％가 1％ 이상인 리포좀 조성물을 제공하도록 하는 몰비로 혼합된다. 따라서, 특정 실시양태에서, 양친매성 지질 및 스테롤-개질된 양친매성 지질은, 스테롤-개질된 양친매성 지질의 몰 함량이 1％ 이상 100％ 미만의 범위이고, 구체적으로 그 사이에서 분획 증분, 예컨대 0.5％, 1％, 1.5％, 2％, 2.5％, 3％, 3.5％, 4％, 4.5％ 및 5％ 증분, 예를 들어 5％ 증분으로의 범위를 포함하며, 여기서 스테롤-개질된 양친매성 지질 함량이 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％로부터 선택되는 리포좀 조성물을 제공하도록 하는 몰비로 혼합된다.
본 발명의 특성화된 측면은, 스테롤-개질된 양친매성 지질의 몰 함량이 통상적으로 리포좀의 총 지질 몰 함량의 적어도 15％, 적어도 20％, 적어도 25％, 적어도 30％이고, 15％ 내지 90％, 15％ 내지 35％, 30％ 내지 70％, 35％ 내지 80％, 35％ 내지 65％ 또는 40％ 내지 70％일 수 있고, 보다 높은 양으로 존재, 예를 들어 90％ 내지 95％, 또는 그 이상일 수 있는 리포좀 조성물이다. 특정 실시양태에서, 스테롤-개질된 양친매성 지질의 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤)은 적어도 25％, 적어도 30％, 적어도 50％, 적어도 60％, 적어도 70％, 또는 그 이상의 스테롤의 몰 함량을 제공하도록 리포좀 조성물에 존재한다. 특정 실시양태에서, 리포좀 조성물은 적어도 30％, 적어도 35％, 적어도 70％, 적어도 85％, 또는 그 이상인 모노스테롤-개질된 양친매성 지질의 몰 함량을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 리포좀 조성물은 약 15％ 내지 35％이고, 적어도 30％, 적어도 40％, 적어도 45％, 또는 그 이상일 수 있는 디스테롤-개질된 양친매성 지질의 몰 함량을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 스테롤-개질된 양친매성 지질 화합물을 포함하는 에멀젼의 형성 방법을 제공한다. 일반적으로, 본 방법은 스테롤-개질된 양친매성 지질을 에멀젼 형성 조건에 적용하는 것을 포함하며, 이에 따라 에멀젼이 형성된다. 본 방법을 이용하여 수중유 형태의 SML 에멀젼 또는 유중수 형태의 SML 에멀젼 등을 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 SML 미셀 (예를 들어, 수중유 시스템) 뿐만 아니라 역 SML 미셀 (예를 들어, 유중수 시스템)의 구조에 대해 활용될 수 있다.
에멀젼 형성 조건은 통상 에멀젼 업계에 널리 공지되어 있는 표준 조건이다. 예를 들어, 에멀젼 형성 조건은 수성 연속상에 SML을 분산시켜 SML의 유중수 에멀젼을 생성하는 것을 포함한다. 별법으로, 에멀젼 형성 조건은 수성상을 SML의 연속상에 분산시켜 SML의 수중유 에멀젼을 생성하는 것을 포함한다.
에멀젼 형성 방법은 임의로, 스테롤-개질된 양친매성 지질을 다른 양친매성 지질, 작용제, 완충액, 용매 및/또는 부형제 중 1종 이상과 혼합하는 단계, 및 상기 혼합물을 에멀젼 형성 조건에 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 또한 에멀젼을 널리 공지된 다양한 방법으로 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
필요에 따라, 진탕, 교반, 균질화 또는 분무 방법으로 에멀젼화를 촉진시켜 에멀젼을 형성할 수 있다. SML을 다른 에멀젼에서 계면활성제 또는 유화제로 사용하여, 예를 들어 보관시, 특히 치료제, 화장제 및 제약용 에멀젼 (예를 들어, 제제, 크림 및 로션)의 제조에서 사용시 에멀젼을 안정화할 수 있다.
에멀젼이 유중수 에멀젼이 되는지 또는 수중유 에멀젼이 되는지 여부는 두 상의 부피 분율 및 유화제의 유형에 따라 일부 좌우된다. 일반적으로, 반크로프트 규칙(Bancroft rule: 유화제 및 유화 입자는 이들이 매우 잘 용해되지 않는 상의 분산을 촉진함)이 적용된다.
특정 실시양태에서, 분산상에서 입자의 크기가 1000 nm 미만인 나노에멀젼이 제공된다.
스테롤- 개질된 양친매성 지질을 포함하는 조성물
본 개시내용은 본 개시내용의 스테롤-개질된 양친매성 지질을 함유하는 다양한 조성물을 고려한다. 이러한 조성물은 스테롤-개질된 양친매성 지질 화합물에 대하여 균질할 수 있거나, 또는 본원에 개시된 1종 이상의 다양한 스테롤-개질된 양친매성 지질 화합물을 포함할 수 있다. 다양한 스테롤-개질된 양친매성 지질, 예를 들어 다양한 스테롤-개질된 양친매성 인지질의 혼합물을 갖는 조성물은 조성물의 물리적 특성의 양호한 전환을 제공할 수 있으며, 특히 여기서 이러한 조성물은 리포좀이다.
예를 들어, 양친매성 지질 및 스테롤-개질된 양친매성 지질 (예를 들어, 모노스테롤-개질된 양친매성 지질 (또는 "m-SML"), 디스테롤-개질된 양친매성 지질 (또는 "d-SML") 또는 이들 둘의 조합물)의 상대적 양을 변화시켜 목적하는 물리적 특성, 예컨대 상 전이 온도, 생리적 조건하 누출에 대한 리포좀의 내성, 원하는 기간 (예를 들어, 일주일 이상, 한달 이상, 일년 이상 등) 동안 (예를 들어, 약 4℃에서의) 저장 안정성 등을 제공할 수 있다. 일반적으로, "안정한 제제"는 정해진 기간에 걸쳐 캡슐화된 내용물의 약 90％를 보유하는 제제이다.
따라서, 특정 실시양태에서, 지질-함유 조성물 (예를 들어, 리포좀 또는 에멀젼)의 스테롤-개질된 양친매성 지질 함량은 1％ 이상 100％ 이하의 범위일 수 있으며, 이는 구체적으로 단편적 증분, 예컨대 0.5％, 1％, 1.5％, 2％, 2.5％, 3％, 3.5％, 4％, 4.5％ 및 5％ 증분으로, 예를 들어 스테롤-개질된 양친매성 지질 함량이 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 및 100％로부터 선택되는 5％ 증분으로 상기 범위 사이의 범위를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 지질-함유 조성물은, 통상 리포좀의 총 지질 몰 함량의 15％ 이상, 20％ 이상, 25％ 이상, 30％ 이상이고, 15％ 내지 90％, 15％ 내지 35％, 30％ 내지 70％, 35％ 내지 80％, 35％ 내지 65％, 또는 40％ 내지 70％일 수 있으며, 보다 많은 양, 예를 들어 90％ 내지 95％ 또는 그 이상으로 존재할 수 있는 스테롤-개질된 양친매성 지질의 몰 함량을 함유한다. 구체적인 실시양태에서, 스테롤-개질된 양친매성 지질의 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤)은 적어도 25％, 적어도 30％, 적어도 50％, 적어도 60％, 적어도 70％ 또는 그 이상의 스테롤의 몰 함량을 제공하도록 리포좀 조성물 내에 존재한다. 구체적인 실시양태에서, 리포좀 조성물은 적어도 30％, 적어도 35％, 적어도 70％, 적어도 85％ 또는 그 이상의 모노스테롤-개질된 양친매성 지질의 몰 함량을 포함한다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 리포좀 조성물은, 약 15％ 내지 35％이고, 적어도 30％ 또는 그 이상, 적어도 40％, 적어도 45％ 또는 그 이상일 수 있는 디스테롤-개질된 양친매성 지질의 몰 함량을 포함한다.
지질-함유 조성물은 또한, 스테롤-개질된 양친매성 지질 함량이 1％ 이상인 지질-함유 조성물을 제공하도록 비-스테롤 개질된 양친매성 지질 및 스테롤-개질된 양친매성 지질의 몰 비율을 갖는 조성물을 고려한다. 따라서, 특정 실시양태, 예를 들어 리포좀에서, 비-스테롤 개질된 양친매성 지질 및 스테롤-개질된 양친매성 지질은 1％ 이상 내지 100％ 미만 범위의 스테롤-개질된 양친매성 지질 함량을 갖는 리포좀 조성물을 제공하는 몰 비율로 혼합된 지질-함유 조성물 내에 존재하고, 이는 구체적으로 단편적 증분, 예컨대 0.5％, 1％, 1.5％, 2％, 2.5％, 3％, 3.5％, 4％, 4.5％ 및 5％ 증분으로, 예를 들어 스테롤-개질된 양친매성 지질 함량이 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％로부터 선택되는 5％ 증분으로 상기 범위 사이의 범위를 포함한다.
SML-함유 조성물 내 비-스테롤 양친매성 지질은 임의의 적합한 양친매성 지질 (시판되는 지질을 비롯한 임의의 다양한 통상적인 지질 포함), 예컨대 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 및/또는 치환 또는 비치환된 지방족 탄화수소 쇄를 갖는 비-스테롤 개질된 양친매성 지질일 수 있다. SML이 모노스테롤-개질된 양친매성 지질인 경우, 비-스테롤 양친매성 지질 및 m-SML의 소수성 테일기의 특성이 유사하도록, 예를 들어 대략 동일한 길이의 비-스테롤 양친매성 지질 및 m-SML의 소수성 테일기가 유사하게 치환되는 등으로 조성물 내 m-SML 및 비-스테롤 양친매성 지질을 선택하는 것이 바람직할 수 있다.
비-스테롤 양친매성 지질의 지방족 탄화수소 쇄는 임의의 다양한 서로 다른 쇄 길이, 예를 들어 2 내지 약 40개의 탄소 원자 길이일 수 있고, 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환될 수 있다. 예를 들어, 상기 예에서 비-스테롤 잔기는 2 내지 40개의 탄소 원자, 일반적으로 4 내지 30개의 탄소 원자, 일반적으로 4 내지 25개의 탄소 원자, 보다 일반적으로 6 내지 24개의 탄소 원자, 보다 일반적으로 10 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환 탄화수소 쇄이다. 비-스테롤 잔기가, 알케닐 기로 포화된 쇄와 같은 포화 지방족 탄화수소 쇄 기반의 치환된 지방족 탄화수소 쇄인 경우, 알킬렌 기의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 탄소 원자 (일반적으로, 약 10개 이하의 탄소 원자)가 산소, 황 또는 질소 원자로부터 선택되는 헤테로원자로 치환될 수 있으며, 여기서 알킬렌 기의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 수소 원자 (일반적으로, 수소 원자의 총 갯수 이하임)는 불소로 치환될 수 있다.
조성물을 대상체에게 투여하는 경우, 일반적으로 조성물을 멸균하고, 멸균 용기 (예를 들어, 멸균 바이알) 내에 저장할 수 있는 것이 바람직하다. 조성물은 비경구, 경장, 비강 및 폐 투여를 비롯한 다양한 서로 다른 투여 경로에 대해 제제화될 수 있으며, 1종 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 예시적인 제제로는 국소, 주사용, 에어로졸 및 경구 제제를 들 수 있고, 제약 제제, 약용화장 제제, 약용영양 제제 등으로서 제제화될 수 있다. 스테롤-개질된 양친매성 지질을 함유하는 조성물을 건조 분말로서 동결 건조 및 보관할 수 있거나, 또는 용액으로 보관할 수 있다.
스테롤- 개질된 양친매성 지질을 포함하는 지질 입자
본 개시내용의 SML-함유 조성물은 다양한 서로 다른 형태로 제공될 수 있으며, 이는 일반적으로 본원에서 지질 입자로 지칭된다. 본원에서 사용된 "지질 입자"는 정해지거나 정해지지 않은 구조의 SML-함유 입자를 포함하고자 한다. 양친매성 분자는 수성 환경에서 친수성 및 소수성 단편으로 이루어져 있으므로, SML 헤드기는 물 쪽을 향하는 반면, 이의 소수성 테일기는 서로 상호작용하여 층형 이중층을 형성하고, 지질 조성물 및 조건에 따라 보다 적은 정도로 다른 집합체 구조를 형성한다. 따라서, SML 화합물은 지질 및 물 함량, 및 온도에 따라 구형 (소포), 막대형 (튜브) 및 층형 (플레이트)을 비롯한 다양한 서로 다른 형태를 형성할 수 있다. 이러한 형태는, 상호작용하여 층형 상 (예를 들어, 이중층 플레이트, 폐쇄 구형), 6방정계 상 (예를 들어, 막대형) 또는 입방 상 (예를 들어, 용매 채널에 연결된 구형, 막대형 또는 층형)으로 분류된 2-차원 및 3-차원 격자 매트릭스 구조를 형성하는 기본 단위를 나타낸다.
분자를 용매 중에 분산시키는 경우 단편을 조직화하는 가장 선호되는 방식은, 소수성 및 친수성 부분이 상이한 영역으로 분리된 구조를 형성하는 방식이다. 이들 영역 및 조직화된 영역으로부터 발생하는 구조를 용매-유도된 액정 상이라 칭한다. 이러한 상의 예로는 미셀 상, 층형 상, 6방정계 상, 입방 상 및 해면 상이 있다. 상은 정상적인 것과 그 반대 모두일 수 있다. 전자의 경우에 계면은 오일을 향해 곡선화되고, 반대의 경우에 계면은 물을 향해 곡선화된다. 상의 유형은 포괄적인 파라미터 (예컨대, 혼합물의 물 대 오일 비) 및 양친매성 분자의 보다 구체적인 특성 모두에 의해 좌우된다. 6방정계 상의 경우, 양친매성 분자는 정해지지 않은 길이의 원통형 구조로 집합되고, 이들 원통형 집합체는 6방정계 격자 위에 배치되어 상에 장거리의 배향 순서를 제공한다. 양쪽연속성(bicontinuous) 입방 상도 또한 존재할 수 있다. 약물 전달에 있어서 보다 중요한 상은 미셀 상, 입방 상 및 층형 상이다. 본원에 기재된 양친매성 분자는 하나 이상의 이러한 상의 일부로서 또는 이를 형성하는 데 적합하다.
예시적인 지질 입자로는 리포좀 (예를 들어, 다중소포, 다중층형 리포좀, 소수층형 리포좀, 단일층형 리포좀 등), 에멀젼 (오일 및 물 에멀젼, 예를 들어 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼 등, 여기서 오일은 예를 들어 트리글리세라이드임), 솔리드 코어 에멀젼, 지질 집합체 (예를 들어, 6방정계 상, 입방 상), 지질 단층 (예를 들어, 표면 상에 존재할 수 있음), 지질 포움 등을 들 수 있다.
페이로드로서 관심 작용제를 추가로 임의로 포함할 수 있는 스테롤-개질된 양친매성 지질-함유 리포좀 및 에멀젼이 특히 중요하다. 용어 "리포좀"은 지질 이중층 시스템에 의해 둘러싸인 임의의 구획을 포함한다. 또한, 지질 소포로도 지칭될 수 있는 "리포좀"은 다양한 형태의 리포좀, 예컨대 다중층형 리포좀 (일반적으로 0.5 내지 10 ㎛ 범위의 평균 직경을 가지며, 임의의 장소에서 수성 상의 층과 교대하는 2개 내지 수백개의 집중 지질 이중층으로 구성됨), 단일층형 소포 (일반적으로 단일 지질 층으로 이루어져 있으며, 일반적으로 약 20 내지 약 400 nm, 약 50 내지 약 300 nm, 약 300 내지 약 400 nm, 약 100 내지 약 200 nm 범위의 평균 직경을 가짐), 및 다른 소포 형태, 예컨대 소수층형 소포 또는 다중소포 리포좀을 포함하고자 한다.
스테롤- 개질된 양친매성 지질을 갖는 조성물의 제조 방법
본 개시내용은 또한 스테롤-개질된 양친매성 지질을 포함하는 조성물의 생성 방법을 제공한다. 일반적으로, 이러한 방법은, 스테롤-개질된 양친매성 지질을 1종 이상의 비-스테롤 양친매성 지질과 혼합하는 단계, 및 임의로 상기 조성물을, 예를 들어 치료제 (예를 들어, 약제, 약용영양제), 화장제, 검출가능한 작용제 (예를 들어, 영상화제)일 수 있는 페이로드와 함께 적재하는 단계를 포함한다. 상기 조성물을 완충액, 용매 및 부형제 중 1종 이상의 존재하에 혼합할 수 있다. 본 방법은 또한 리포좀을 사이징(sizing)하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 리포좀을 페이로드와 함께 적재하기 전 또는 후에 수행할 수 있다. 임의로, 본 방법은 리포좀을 널리 공지된 다양한 방법, 예컨대 크로마토그래피, 상 분리, 용매 추출, 동결 건조, 재-수화 등으로 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법으로 생성된 조성물을 정제하여, 조성물로부터 불순물을 60％ 이상, 일반적으로 75％ 이상, 가장 일반적으로 90％ 이상 제거한다.
상기 방법은, 상술한 조성물의 스테롤-개질된 양친매성 지질 함량을 갖는 지질-함유 조성물을 제공하도록 양친매성 지질 및 스테롤-개질된 양친매성 지질의 몰 비율을 갖는 지질-함유 조성물의 생성을 포함한다.
1종 이상의 스테롤-개질된 양친매성 지질 입자를 함유한 조성물은 이용가능한 기술에 의해 용이하게 형성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조성물은, 스테롤-개질된 양친매성 지질을 포함할 지질을 수용액에 두고, 상기 용액을 수 초 내지 수 시간 동안 교반하여 용이하게 형성할 수 있다. 간단한 절차로 약 1 내지 10 ㎛ 범위의 직경을 갖는 대형, 다중층형 리포좀 또는 소포를 자발적으로 수득한다. 이러한 리포좀은 지질 내부에 존재하는 수성 상의 층과 교대할 수 있는 2개 내지 수백개의 중심 지질 이중층으로 이루어져 있다. 리포좀을 생성하는 추가의 예시적인 방법은 하기에서 제공된다.
리포좀과 캡슐화된 페이로드 (예를 들어, 캡슐제, 치료제, 영상화제 등)를 함유하는 조성물을 제공하기를 원하는 경우, 이러한 작용제는 캡슐화 양의 1종 이상의 스테롤-개질된 양친매성 지질, 예를 들어 1종 이상의 스테롤-개질된 양친매성 인지질과 함께 수성 상 내부에 포함될 수 있다. 별법으로, 관심 작용제가 소수성이어서 수 난용성인 경우, 이러한 작용제는 지질 이중층 내부에 포함될 수 있다. 용어 "캡슐화 양"은, 관심 작용제를 캡슐화하고 원하는 크기의 리포좀을 형성하는 데 필요한 지질의 양을 지칭한다. 일반적으로, 평균 리포좀 크기는 직경 10,000 nm 미만, 보다 일반적으로 5,000 nm 미만, 보다 더 일반적으로 약 20-600 nm이다. 캡슐화 양은 선택된 특정 화합물 및 방법 조건에 따라 달라질 것이지만, 일반적으로 약 2:1 내지 약 1:100 화합물:지질, 일반적으로 약 1:1 내지 약 1:20 범위일 것이다. 별법으로, 원격 제어 적재 방법을 이용하여 페이로드를 리포좀으로 투입할 수 있다. 상술한 적재 방법과는 대조적으로, 원격 적재는 먼저 리포좀을 생성한 후, 이온-구배를 이용하여 페이로드를 리포좀에 투입하는 것을 포함한다.
페이로드의 도입
스테롤-개질된 양친매성 지질-함유 조성물은 운송을 위해서 지질 입자 (예를 들어, 리포좀)와 함께 페이로드를 포함할 수 있다. "페이로드"는 SML-함유 조성물과 함께 운송되거나 SML-함유 조성물에 의해 전달되는 스테롤-개질된 양친매성 지질-함유 조성물의 성분을 가리킨다. 대표적인 페이로드는 SML 지질 그 자체의 일부 (예를 들어, SML 전구약물)로서 지질 입자의 이중층 또는 단일층에 존재하는 지질 입자의 구조 (예를 들어, 리포좀) 내에 포함되거나, 또는 (예를 들어, 공유 또는 비공유 결합에 의해) 지질 입자의 표면에 부착되는 성분을 포함한다. 따라서, "페이로드"는 지질 입자 (예를 들어, 약제, 약용영양제, 약용화장제, 영상화제 (예를 들어, 공기를 비롯한 기체), 방사성의약품, 핵자기공명 조영제 등)에 의해 캡슐화된 성분들을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 캡슐화된 페이로드는 전형적으로 결정, 분말, 또는 이들의 조합으로 용액 중에 존재한다. 일부 실시양태에서, 페이로드는 (예를 들어, 스테롤-개질된 양친매성 지질이 전구약물로서 기능하는 경우) 화합물에 존재하는 분열성 결합의 분열에 의해 배출될 수 있는 스테롤-개질된 양친매성 지질의 성분이다. 일부 실시양태에서, 페이로드는 바이러스 (예를 들어, 불활성화된 또는 약화된 바이러스) 또는 박테리아 (예를 들어, 불활성화된 또는 약화된 박테리아) 또는 핵산일 수 있다.
약물-함유 리포좀 현탁액의 제조 방법은 일반적으로 종래의 리포좀 제조 방법을 따른다. 예시적인 방법에서, 스테롤-개질된 양친매성 지질은 적합한 유기 용매 또는 용매계에 흡수되고, 진공 또는 불활성 기체 하에 지질 필름으로 건조된다. 친유성 관심 작용제는 필름을 형성하는 지질 중에 포함될 수 있다. 지질 입자 중에 및/또는 지질 입자 이중층 내에 캡슐화될 페이로드는 지질 용액 중에 제공되어 (예를 들어, 리포좀 중 작용제의 과량의 바람직한 최종 최대의 몰 농도로) 최대 포획 (entrapment)을 용이하게 할 수 있다. 별법으로, 관심 작용제가 수용성인 경우 (예를 들어, 더 친수성인 경우), 작용제는 지질을 수화시키기 위해서 사용되는 수성 매질 중에 포함될 수 있다. 별법으로, 지질 입자 (예를 들어, 리포좀)가 우선 생성된 후, 원격 로딩 방법, 예를 들어 관심 작용제의 리포좀으로의 이동을 용이하게 하는 이온-구배 (예를 들어, 황산암모늄 구배)를 제공함으로써 페이로드가 입자로 도입될 수 있다.
페이로드의 지질 입자 표면에의 부착은, 예를 들어 지질 입자의 스테롤-개질된 양친매성 지질의 말단 관능기에의 공유 부착에 의해 달성될 수 있다 (실시예 14). 페이로드 부착 용도에 적합거나 또는 페이로드 부착 용도에 맞게 조정될 수 있는 다양한 방법들은, 예를 들어 문헌 [Liposomes: 2nd edition, Oxford University Press, 2003, V. Torchilin and V. Weissig., Ed.]에 기술되어 있다.
사이징
리포좀 현탁액은 약 1 마이크로미터 미만, 보통 약 0.05 내지 0.5 마이크로미터, 가장 보편적으로는 약 0.05 내지 0.2 마이크로미터 범위로 소포의 바람직한 크기 분포를 얻도록 크기를 조정할 수 있다. 사이징은 더 큰 리포좀을 제거하고, 최적의 약동학적 특성을 갖는 결정된 크기 범위를 산출하는 역할을 한다.
리포좀의 크기 및 크기 불균질을 감소시키기 위해서 몇몇 기술을 이용할 수 있다. 조 (bath) 또는 탐침 (probe) 초음파처리에 의해 리포좀 현탁액을 초음파처리하면 크기가 약 0.05 마이크로미터 미만인 소형 단일층형 소포 (SUV)로 급격하게 크기가 감소한다. 균질화는 큰 리포좀을 더 작은 리포좀으로 절단하기 위해서 전단 (shearing) 에너지에 의존하는 또다른 방법이다. 전형적인 균질화 절차에서, MLV는 선택된 리포좀 크기, 전형적으로는 약 0.1 내지 0.5 마이크로미터의 크기가 관찰될 때까지 표준 에멀젼 균질기를 통해 재순환된다. 이중 비대칭 원심분리기에 위치한 바이알 중 경질의 구형 비드의 존재 하에 지질 분산액을 처리하여 리포좀 입자의 직경을 0.04 내지 0.3 마이크로미터로 감소시킬 수 있다. 상기 세가지 방법에서, 입자 크기 분포는 종래의 레이저-빔 입자 크기 구별에 의해 모니터링할 수 있다.
작은 기공 (small-pore) 폴리카보네이트 막을 통한 리포좀의 압출은 막의 기공 크기에 따라 평균 약 0.05 내지 8 마이크로미터 범위인, 상대적으로 잘 정의된 크기 분포로 리포좀 크기를 감소시키는 효과적인 방법이다. 전형적으로, 현탁액은 바람직한 리포좀 크기 분포가 얻어질 때까지 수차례 막을 통해 순환된다. 리포좀을 연속적으로 더 작은 기공의 막을 통해 압출하여 리포좀의 크기를 점차적으로 감소시킬 수 있다.
원심분리 및 분자 체 크로마토그래피는 1 마이크로미터 미만의 선택된 임계값 아래의 입자 크기를 갖는 리포좀 현택액을 생산하기 위해 이용할 수 있는 다른 방법이다. 상기 두가지 방법은 모두 큰 입자의 더 작은 입자로의 전환보다는 더 큰 리포좀의 제거를 포함한다. 리포좀 수율은 이에 상응하여 감소된다.
유리 페이로드 물질의 제거
비도입 페이로드, 또는 "유리" 페이로드는, 예를 들어 조성물 중에 존재하는 리포좀-포획된 페이로드의 비율을 증가시키기 위해서 제거될 수 있다. 상기 제거는 조성물 중에 존재하는 총 페이로드 (예를 들어, 총 약물)의 약 20％ 미만, 보통 약 10％ 미만으로 유리 작용제의 최종 농도를 감소시키도록 설계될 수 있다.
리포좀 현탁액으로부터 유리 페이로드를 제거하기 위해서 몇몇 방법을 이용할 수 있다. 사이징된 리포좀 현탁액은 고속 원심분리로 상청액에 유리 페이로드 및 매우 작은 리포좀을 남기면서 펠렛화될 수 있다. 또다른 방법은 한외여과에 의해 현탁액을 농축시킨 후, 작용제가 없는 대체 매질에 농축된 리포좀을 재현탁시키는 것을 포함한다. 별법으로, 겔 여과를 사용하여 매질 분자들로부터 더 큰 리포좀 입자들을 분리할 수 있다.
유리 페이로드를 제거하기 위한 절차의 한 예는 리포좀-결합된 형태는 아닌 유리 형태로 작용제를 결합할 수 있는 이온-교환 수지를 이용한다. 양이온-교환 또는 음이온-교환 수지의 선택은, 예를 들어 중성 pH에서 유리 작용제의 하전에 기반할 수 있다.
스테롤- 개질된 양친매성 지질-함유 조성물의 페이로드
스테롤-개질된 양친매성 지질-함유 조성물을 이용하여 조성물과 조합된 페이로드의 전달을 용이하게 할 수 있다. 상기 명시된 것과 같이, "페이로드"는 스테롤-개질된 양친매성 지질-함유 조성물과 함께 운송되어 지질 입자의 이중층 중에 존재하는 지질 입자의 구조 (예를 들어, 리포좀) 내에 포함되거나, 또는 (예를 들어, 공유 또는 비공유 결합에 의해) 지질 입자의 표면에 부착된 성분을 포괄할 수 있는 스테롤-개질된 양친매성 지질-함유 조성물의 성분을 가리킨다.
따라서, 페이로드는 제약, 약용영양, 약용화장 및 진단 용도를 비롯한 다양하고 상이한 용도에 대해 적합하게 조정될 수 있는 임의의 다양하고 상이한 작용제일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 작용제의 예로는 비스포스포네이트, 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살로플라틴, 카르무스틴, 캄프토테신, 시프로플록사신, 클로로메탄, 시클로포스파미드, 시클로파민, 사이토신 아라비노시드, 다카르바진, 레티노산, 독시플루리딘, 플루오로오르트산, 겔다나마이신, 겜시타빈, 고시폴, 이포스파미드, 히드록시타목시펜, 인리노테칸, 피트산, 단백질 키나제 억제제, 파클리탁셀, 레스베라트롤, 탁산, 메틸셀라노-시스테인, 메토트렉세이트, 6-티오구아닌, 티르포스틴, 우고닌, 에토포시드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 화학적으로 개질된 RNA, 시트레이트, 1,2,3,4 부탄 테트라카르복실산, 옥타술페이트 수크로스, 폴리포스페이트, 시프로플록시신, 모르핀, 옥시모르폰, 부프레노르핀 및 메타돈이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 작용제들은 단독으로 또는 상승 효과를 제공하기 위해서 동일한 리포좀 내 또다른 작용제 (예를 들어, 하나 이상의 작용제, 또는 둘 이상의 작용제)와 함께 캡슐화될 수 있다.
특정 관심 페이로드는 항암 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신, 다노루비신, 캄프토테신, 시스플라틴 등), 항생제 (예를 들어, 항박테리아제, 항진균제, 항바이러스제, 항-기생제 (anti-parasitic agent) 등), 진통제, 마취제, 항-여드름 작용제, 생체 분자 (예를 들어, 핵산 (예를 들어, RNA, DNA, siRNA 등), 폴리펩티드 (예를 들어, 자연적으로 또는 화학적으로 개질된 폴리펩티드 및 펩티드 (예를 들어, 페길화된 폴리펩티드)를 포함하는 재조합 폴리펩티드 및 펩티드를 비롯한 펩티드)), 항체 등), 항원 물질 (예를 들어, 백신의 한 성분일 수 있음), 혈액 항응고제, 퇴행성 신경질환을 치료하기 위한 화합물, 마취제, 예를 들어 벤조카인, 클로로프로카인, 코카인, 프로카인, 테트라카인, 부피바카인, 리도카인, 메피바카인, 펜타닐 및 트리메카인, 진통제, 예를 들어 디클로페낙, 및 리포좀으로의 이온-구배 로딩을 가능하게 하는 분자, 예를 들어 황산암모늄, 트리에틸아민 술페이트, 수크로스 옥타술페이트의 트리에틸아민 염, 트리에틸아민 폴리포스페이트, 피트산의 암모늄염, 아세트산의 나트륨, 트리에틸아민 또는 암모늄염, 옥살산의 나트륨, 트리에틸아민 또는 암모늄염, 프로판산의 나트륨, 트리에틸아민 또는 암모늄염, 숙신산의 나트륨, 트리에틸아민 또는 암모늄염, 1,2,3,4 부탄 테트라카르복실산의 나트륨, 트리에틸아민 또는 암모늄염, 피리딘-2,3,5,6 테트라카르복실산의 나트륨, 트리에틸아민 또는 암모늄염, 1,2,4,5-벤젠테트라카르복실산의 나트륨, 트리에틸아민 또는 암모늄염, 1,2,4,5-시클로헥산테트라카르복실산의 나트륨, 트리에틸아민 또는 암모늄염, 1,3,5-벤젠트리카르복실산의 나트륨, 트리에틸아민 또는 암모늄염, 폴리아민, 예를 들어 스페르민, 스페르미딘, 트리스 아미노에틸아민 등의 아세테이트염을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
약용영양제 (예를 들어, 플라보노이드, 항산화제, 예를 들어 감마-리놀렌산, 베타 카로틴, 안토시아닌, 베타-시토스테롤) 및 식이 보충제 (예를 들어, 비타민)도 또한 본 개시 내용의 지질 조성물에서 페이로드로서 사용될 수 있다.
본 개시내용의 조성물의 페이로드로서 기능할 수 있는 약용화장제의 예로는 보습제, 단백질 (예를 들어, 콜라겐), 비타민, 피토케미칼 (phytochemical), 효소, 항산화제, 에센셜 오일, UV 보호제 (예를 들어, 옥시벤존), 세정제, 염료, 향수 등 (예를 들어, 화장품, 세면용품, 향수, 퍼퓸, 피부 관리 제품 및 미용 보조제로 사용될 수 있는 것들)을 포함할 수 있다. 레티노산, 특히 피부 관리 제품을 위해 레티노산을 갖는 스테롤-개질된 양친매성 지질의 에멀젼에 특히 관심이 있다.
진단제는 방사성 표지, 형광단, 발광단, 핵자기공명 조영제, 예를 들어 가돌리눔, 양성자 방출 단층촬영 표지 등일 수 있는 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포좀 자체는 진단제로서, 예를 들어 초음파 진단에서 마이크로 버블로서 사용될 수 있다.
독성 약물 (예를 들어, 다양한 암 화학요법제, 독소루비신, 다노루비신, 캄프토테신 등) 및/또는 수용해도가 낮은 약물 (예를 들어, 암포테리신 B, 레티노산 등)을 위한 약물 담체로서 기능하는 스테롤-개질된 양친매성 지질-함유 조성물에 특히 관심이 있다. 또한, 백신 담체, 특히 (예를 들어, 상온 및/또는 4℃에서) 저장 안정성을 보이는 백신 담체로 기능하는 스테롤-개질된 양친매성 지질-함유 조성물에 특히 관심이 있다.
활성 작용제 또는 전구약물로서의 스테롤- 개질된 양친매성 지질
일부 실시양태에서, 스테롤-개질된 양친매성 지질 또는 화합물의 성분이 페이로드로서 기능한다. 예를 들어, 스테롤-개질된 양친매성 지질은 그 자체로 약물 또는 전구약물일 수 있다. 예를 들어, 스테롤-개질된 양친매성 지질의 스테롤은 스테롤-개질된 양친매성 지질에 존재할 때, 및/또는 분열성 링커의 분열 후 스테롤-개질된 양친매성 지질로부터 배출될 때 이로운 효과를 제공하는 작용제일 수 있다. 한 예시적 실시양태에서, 스테롤-개질된 양친매성 지질의 스테롤은 과콜레스테롤혈증 요법에서 사용될 수 있는 β-시토스테롤이다. 별법으로 또는 추가로, 스테롤-개질된 양친매성 지질의 비-스테롤 소수성 테일은 스테롤-개질된 양친매성 지질에 존재할 때, 및/또는 분열성 링커 (linker)의 분열 후 화합물로부터 배출될 때 이로운 효과를 제공하는 작용제일 수 있다. 예를 들어, 스테롤-개질된 양친매성 지질의 비-스테롤 소수성 테일은 레티노산일 수 있다.
기타 성분
스테롤-개질된 양친매성 지질-함유 조성물은 페이로드에 추가하여 다른 활성 또는 불활성 작용제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 리포좀 조성물은 조성물 및/또는 감소된 독성의 리포좀의 성분을 사용하여 전달될 약물의 감소된 독성을 제공할 수 있는 약물-보호성 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 추가의 작용제는 친유성 유리 라디칼 포획제, 예를 들어 알파-토코페롤, 또는 약리적으로 허용되는 유사체 또는 그의 에스테르, 예를 들어 알파-토코페롤 숙시네이트를 포함할 수 있다. 다른 적합한 유리 라디칼 켄쳐 (quencher)는 부틸화된 히드록시톨루엔 (BHT), 프로필 갈레이트 (아우구스틴 (Augustin)), 및 그의 약리적으로 허용되는 염들을 포함한다. 인간 투여에 대해 허용되는 추가의 친유성 유리 라디칼 켄쳐도 또한 사용될 수 있다. 이러한 추가의 작용제는, 예를 들어 캡슐화 또는 막 결합에 의해 관심 작용제와 공동-포획될 수 있다. 스테롤-개질된 양친매성 지질-함유 조성물은 또한 하나 이상의 영상화제를 포함하여 약물-로딩된 리포좀의 침착이 측정되고/거나 생체 내에서 뒤따를 수 있다.
본 개시내용의 리포좀의 수성 현탁액은 유리하게는 리포좀 지질의 감소된 산화 분해에 대한 리포좀의 내성을 높이기 위해서 작용제를 포함할 수 있다. 수용성의 철-특이적 킬레이트제, 예를 들어 데스페랄 (페리옥사민)이 이러한 작용제의 예이다.
제제
조성물은 비경구, 경장, 비강 및 폐 투여를 비롯한 다양하고 상이한 투여 경로를 위해 제제화될 수 있고, 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 제제의 예로는 국소, 경피, 주사용 (예를 들어, 정맥 주사, 근육내 주사, 피하 주사), 에어로졸 및 경구 제제가 포함되고, 제약 제제, 약용화장 제제, 약용영양 제제 등으로서 제제화될 수 있다. 스테롤-개질된 양친매성 지질을 함유하는 조성물은 동결건조시키거나 또는 용액 중에 저장할 수 있다.
따라서, 스테롤-개질된 양친매성 지질-함유 조성물은 스테롤-개질된 양친매성 지질 및 허용되는 담체 또는 비히클을 포함하는 제제를 포함한다. 제제에 대해 허용되는 제형은 수용액, 현탁액, 분산액, 완화제, 로션, 크림, 고약, 밤 및 연고를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 스테롤-개질된 양친매성 지질 조성물은 또한, 예를 들어 좌제뿐만 아니라 소화관에서 용해되는 정제 또는 캡슐 형태로 투여될 수 있다. 조성물은 또한 패치, 밴드 등과 같은 장치로 제공될 수 있다.
스테롤-개질된 양친매성 지질 및, 바람직한 경우, 페이로드 작용제에 추가하여 국소 제제는 동물의 피부 또는 점막에 적용하기에 적합한 약리적으로 허용되는 국소 담체를 포함할 수 있다. 국소 제제는 로션, 겔, 고약, 크림, 밤, 연고 등을 비롯한 다양하고 적합한 제형으로 제공될 수 있으나, 이에 꼭 한정되지는 않는다. 이러한 조성물들은 수용액 형태, 또는 에멀젼 형태, 예를 들어 오일과 물의 에멀젼 (예를 들어, 수중유 에멀젼, 또는 유중수 에멀젼)의 형태일 수 있다. 바람직한 경우, 국소 제제는 투과 촉진제 또는 피부를 통한 전달을 보조하는 다른 작용제를 포함할 수 있다.
본원에서 고려되는 제형은 일반적으로 생리적으로 허용되는 담체, 부형제, 안정화제 등을 사용하여 제제화될 수 있고, 지속형 방출 (sustained release) 또는 시간지연형 방출 (timed release) 제제로 공급될 수 있다. 치료 용도를 위해서 허용되는 담체, 부형제 및 희석제는 제약 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science (A. R. Gennaro Edit., Mack Publishing Co., 1985)]에 기술되어 있다. 이러한 물질들은 적용되는 투여량 및 농도에서 수용체에 비독성이고 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트 및 다른 유기산 염과 같은 완충제, 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 저분자량 (약 10개 미만의 잔기)의 펩티드, 예를 들어 폴리아르기닌, 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 및 이뮤노글로불린, 친수성 중합체, 예를 들어 폴리(비닐 피롤리디논), 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루탐산, 아스파르트산 및 아르기닌, 단당류, 이당류, 및 셀룰로스 및 그의 유도체, 글루코스, 만노스 및 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물, 킬레이트제, 예를 들어 EDTA, 당 알코올, 예를 들어 만니톨 및 소르비톨을 포함하고, 국소 제제 중에 종래의 양이온성 및 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈 (TWEEN), 플루로닉스 (PLURONICS) 및 PEG를 포함한다.
치료적 투여를 위해서 사용되는 투약 제제는 무균성이어야 한다. 무균성은 무균 막을 통해 여과시켜, 또는 조사 (irradiation) 또는 가스, 열 또는 고압 처리와 같은 종래의 다른 방법에 의해 쉽게 달성될 수 있다. 본 발명의 투약 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 더욱 바람직하게는 5 내지 9일 것이다. 본 발명의 투약 제제를 이용하는 치료를 필요로 하는 대상체 (전형적으로는 포유동물)에는 최적 효능을 제공하는 용량이 투여될 수 있다. 투여 용량 및 방법은 대상체별로 다양할 것이고, 치료될 숙주의 유형, 및 동물의 경우 성별, 체중, 식단, 수반하는 약물, 전반적인 임상적 상태, 사용되는 특정 소수성 화합물, 이러한 화합물들이 적용되는 특이적 용도와 같은 인자들, 및 당업자들이 인지하고 있을 다른 인자들에 의해 좌우될 것이다. 효과적인 투여 수준, 즉 바람직한 결과를 달성하기 위해서 필요한 투여 수준의 결정은 당업자의 지식 내에 포함될 것이다.
임의의 페이로드의 활성 보존 뿐만 아니라 스테롤-개질된 양친매성 지질 및 존재할 수 있는 다른 지질의 일체성 유지에 적합한 조건 하에서의 저장을 위한 제제를 제조할 수 있다. 실시예에 예시된 바와 같이, 스테롤-개질된 양친매성 지질을 함유하는 리포좀은 4℃에서 1년 이상 동안 안정하였고, 따라서 4℃에서의 저장은 본원에 기재된 스테롤-개질된 양친매성 지질 조성물의 장기간 유지에 적합하다.
스테롤- 개질된 양친매성 지질의 사용 방법
스테롤-개질된 양친매성 지질 함유 조성물은 각종 상이한 제약, 약용화장품, 진단 및 생의학 용도에 사용될 수 있다. 예시적 용도를 하기에 기재한다.
예를 들어, 제약, 약용영양 및 약용화장 응용은 일반적으로, 스테롤-개질된 양친매성 지질을 포함하는 조성물을 동물 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 투여는 일반적으로 동물을 조성물과 접촉시킴으로써 달성되고, 이는 임의의 적합한 경로 (예를 들어, 비경구, 장내, 비내, 폐내 등)에 의한 것일 수 있다. 이들 응용에 있어서, 동물은 치료를 필요로 하는 대상체 또는 대상체가 치료를 필요로 하거나 이러한 치료로부터 이익을 얻을 수 있음으로써 치료가 요망되는 대상체이다. 본원에서 사용되는 "동물 대상체"는 일반적으로, 치료 방법에 있어서는 치료를 필요로 하는 대상체, 및/또는 진단 방법에 있어서는 그 진단 방법에 의해 검출가능한 질환을 갖는 것으로 의심되는 대상체를 지칭한다. 대상체는 포유동물, 예컨대 인간, 가축, 가정 애완동물 등을 비롯한 동물을 포함한다.
용어 "치료", "치료하는", "치료하다" 등은 일반적으로, 요망되는 약리 및/또는 생리 효과를 얻는 것을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 효과는 질병 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방함에 있어서 예방적인 것일 수 있고/거나, 질병 및/또는 그 질병에 기인하는 부작용의 부분적인 또는 완전한 안정화 또는 치유에 있어서 치료적인 것일 수 있다. 본원에서 사용되는 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서의 질병의 임의의 치료를 포함하고, 이는 (a) 질병 또는 증상을 갖기 쉬울 수 있으나 아직 이를 갖는 것으로 진단되지는 않은 대상체에서 그 질병 또는 증상이 일어나는 것을 방지하는 것; (b) 질병 증상을 억제하는 것, 즉 그의 발현을 저지하는 것; 또는 (c) 질병 증상을 완화시키는 것, 즉 질병 또는 증상의 퇴행을 일으키는 것을 포함한다.
스테롤-개질된 양친매성 지질 함유 조성물 및 그의 페이로드는 치료되는 질환 및 대상체 뿐만 아니라 투여로부터 추구되는 이점에 따라 선택된다.
스테롤-개질된 양친매성 지질 함유 조성물은 또한 진단 방법에서의 용도를 갖는다. 이러한 방법은 동물 대상체로부터의 생체 샘플 중에 존재하는 분석물질의 검출에 의한 질환의 진단을 포함한다.
본원에서 사용되는 "진단"은 일반적으로, 질병 또는 장애에 대한 대상체의 감수성 결정, 대상체가 질병 또는 장애에 현재 걸려있는지의 여부 결정, 질병 또는 장애에 걸려있는 대상체의 예상, 및 치료계측법(therametrics) (예를 들어, 대상체의 질환을 모니터링하여 치료의 효과 또는 효능에 대한 정보를 제공하는 것)의 이용을 포함한다. 용어 "생체 샘플"은 유기체로부터 얻어진 각종 샘플 유형을 포함하며, 이는 진단 또는 모니터링 분석에 사용될 수 있다. 상기 용어는, 혈액 및 생물 기원의 기타 액체 샘플, 고형 조직 샘플, 예컨대 생검 시험편 또는 조직 배양물 또는 이로부터 유도된 세포 및 이들의 자손을 포함한다. 상기 용어는, 샘플의 획득 후 임의의 방식으로, 예컨대 시약으로의 처리, 가용화 또는 특정 성분의 농축에 의해 조작된 샘플을 포함한다. 상기 용어는 임상 샘플을 포함하며, 또한 세포 배양물에서의 세포, 세포 상청액, 세포 용균물, 혈청, 혈장, 생체액 및 조직 샘플을 포함한다.
일반적으로, 스테롤-개질된 양친매성 지질 함유 조성물을 사용하는 진단 방법은, 유체 중의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며, 이 방법은 유체를 스테롤-개질된 양친매성 지질 함유 조성물과 접촉시키고, 지질 조성물에서의 변화 (여기서, 지질 조성물에서의 변화는 분석물질의 존재 또는 부재에 대한 지표임)를 검출하는 것을 포함한다. 지질 조성물에서의 변화는, 예를 들어 스테롤-개질된 양친매성 지질 함유 조성물 중에 존재하는 중합성 스테롤-개질된 양친매성 지질의 중합 증가 또는 감소로 인한 색 변화 (예를 들어, 캡슐화된 형광단의 발광 파장 변화에 기인함), 스테롤-개질된 양친매성 지질 함유 리포좀의 크기 또는 일체성 변화 등일 수 있다. 이와 같이, 지질 조성물에서의 변화는 광학 특성 (예를 들어, 반사율), 상 전이 등과 같은 지질 조성물의 특성 평가에 의해 검출될 수 있다.
기타 용도
스테롤-개질된 양친매성 지질 함유 조성물은 또한, 치료 또는 진단에 직접 관련되지 않은 응용에서 다양한 용도를 갖는다. 예를 들어, 스테롤-개질된 양친매성 지질 함유 조성물을 사용하여 시험관내 세포로의 페이로드 (예를 들어, 핵산, 폴리펩티드)의 전달을 용이하게 할 수 있다. 이 방법에서는, 배양된 동물 세포 (예를 들어, 배양된 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포)를 관심 페이로드를 함유하는 스테롤-개질된 양친매성 지질 조성물과 접촉시켜 세포로의 페이로드의 전달을 용이하게 한다. 이러한 방법을 이용하여 핵산, 폴리펩티드, 또는 동물 세포막을 용이하게 횡단하지 않는 기타 화합물의 도입을 달성할 수 있다.
또다른 예로, 스핑고신을 갖는 스테롤-개질된 양친매성 지질은 지질 래프트의 모델링 뿐만 아니라 막 단백질의 전달에서의 용도를 갖는다.
또한, 스테롤-개질된 양친매성 지질은 인공 이중층으로서 사용될 수 있고, 따라서 바이오센서 등의 설비에 사용될 수 있다. 인공 이중층의 사용을 포함하는 바이오센서는 당업계에 공지되어 있다. 이들은 특히, 지질 표면이 세포, 단백질 또는 지질을 함유하는 혈액, 혈장, 혈청 또는 기타 체액과 직접 접촉되어 위치하는 경우에 적합하다.
키트 및 시스템
본원에 개시된 조성물의 제조 및/또는 사용을 용이하게 할 수 있는 키트 및 시스템이 제공된다. 본원에서 고려되는 키트는 1종 이상의 스테롤-개질된 양친매성 지질, 전달을 위한 관심 작용제 (이들은 별도의 용기 내에, 또는 보다 통상적으로는 단일 조성물로 멸균 용기 내에 제공될 수 있음)를 포함할 수 있다.
추가로, 키트는 키트 성분, 특히 키트 내에 함유된 본 발명의 조성물의 사용을 위한 지침을 함유할 수 있다.
< 실시예 >
하기 실시예는, 본 발명을 실시하고 이용하는 방법에 대한 충분한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 기재된 것이며, 이는 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 범위를 제한하도록 의도되지 않으며, 또한 하기 실험들이 수행된 모든 또는 유일한 실험이라는 것을 나타내도록 의도되지 않는다. 사용된 수치 (예를 들어, 양, 온도 등)에 대한 정확도를 보장하기 위해 노력하였으나, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
방법 및 재료
하기 실시예에서 사용된 일반적 재료 및 프로토콜을 하기에 기재한다.
시약: 글리세로포스포콜린은 바켐(BACHEM; 미국 캘리포니아주 토란스 소재)으로부터 구입하였다. 리소(lyso)-인지질은 아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids; 미국 알라바마주 알라바스터 소재)로부터 구입하였다. 기타 시약은 알드리치(Aldrich; 미국 위스콘신주 밀와우키 소재)로부터 구입하였다. 용매는 직접 사용하거나 또는 표준 프로토콜에 따라 사용 전에 정제 및 건조시켰다.
기술. TLC 분석은 하기 각종 전개시스템을 사용하여 0.25-mm 실리카 겔 F254 플레이트 상에서 수행하였다: (A) CHCl3/MeOH/NH4OH (65/25/4), (B) CHCl3/MeOH/NH4OH (65/35/5), (C) CHCl3/MeOH/H2O (65/25/4), (D) 헥산/EtOAc (2/1), (E) 헥산/EtOAc (10/1), (F) 헥산/EtOAc (5/1), (G) 톨루엔/에테르 (9/1), (H) 톨루엔/에테르 (1/1). 고성능 플래쉬 크로마토그래피 (HPFC)는, 예비충전된 실리카 겔 컬럼 (60 Å, 40 내지 63 ㎛)을 사용하여 바이오티지(Biotage; 미국 버지니아주 샬로테스빌 소재) 호리즌(Horizon)™ HPFC™ 시스템 상에서 수행하였다. 달리 언급되지 않는 한, 용매 혼합물의 조성을 설명하는 비율은 상대적 부피를 나타낸다. 1H NMR 스펙트럼은 배리언(Varian) 400 MHz 기기 상에서 또는 브루커(Bruker) 300 mHz 기기 상에서 얻었다. 화학적 쉬프트는 내부 표준물로서 테트라메틸실란을 사용하여 백만분율(parts per million)로 나타내었다. J 값은 헤르츠(Hertz) 단위이다. MALDI-TOF 질량 스펙트럼은 미국 캘리포니아 대학 샌프란시스코의 질량 분광측정 시설(Mass Spectrometry Facility, University of California San Francisco)에서 얻었다.
합성 방법. 합성에 이용된 일반적 방법을 하기에 기재한다.
1-치환된 글리세롤의 3-히드록시기의 보호: 무수 피리딘 중의 1-치환된 글리세롤 및 트리페닐 클로라이드 (1.5 당량)의 혼합물을 50℃에서 18시간 동안 무수 조건 하에 교반하였다. 실온 (실온, 약 23℃)까지 냉각시킨 후, 혼합물을 빙냉수에 붓고, 3 부분의 헥산으로 추출하였다. 용해되지 않은 트리페닐메탄올을 여과 제거하였다. 여액을 물로 3회 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 최소량의 헥산 중에 용해시켰다. 4℃에서 밤새 방치함으로써 용액으로부터 추가의 트리페닐 메탄올을 침전시켰다. 고체를 여과시키고, 여액을 건조물로 증발시켰다. 잔류물을 고진공 하에 건조시키고, 다음 단계 반응에 직접 사용하였다. 반응을 TLC로 모니터링하였고, 수율은 일반적으로 80 내지 90％였다.
1,2-치환된-3- 트리틸 글리세롤로부터 트리틸기의 제거: 클로로포름 중의 1,2-치환된 3-트리틸 글리세롤을 0℃에서 3시간 동안 보론 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트 (4 당량)로 처리하였다. 용액을 물/클로로포름/메탄올 (2:2:1)로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 증발시켰다. 잔류물을 건조시키고, 다음 단계 반응에 직접 사용하였다. 반응을 TLC로 모니터링하였고, 수율은 90％ 초과였다.
1,2-치환된 글리세롤의 인산화: 무수 테트라히드로푸란 (THF) 중의 1,2-치환된 글리세롤 및 무수 피리딘 (2 당량)의 용액을 0℃에서 교반하며 바로 증류된 THF 중의 옥시염화인 (1.1 당량)에 적가하였다. 교반을 0℃에서 2 내지 3시간 동안 계속하였다. 이어서, 10％ 중탄산나트륨 (약 5 당량)을 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 빙수에 붓고, HCl로 산성화시키고 (pH 약 2), 디에틸 에테르로 추출하였다. 아세톤을 물에 첨가함으로써 수성층 중의 생성물을 침전시켰다. 침전물을 에테르 추출물로부터의 생성물과 합하고, 톨루엔으로 공비 건조시키고, 다음 단계 반응에 직접 사용하였다. 수율은 일반적으로 90％ 초과였다.
1,2-치환된- 글리세로 - 포스포콜린 : 1,2-치환된-글리세로 포스페이트, 콜린 테트라페닐 보레이트 (2 당량) 및 2,4,6-트리이소프로필벤젠 술포닐 클로라이드 (TPS) (2.5 당량)를 잠시 가온시키며 무수 피리딘 중에 용해시키고, 이어서 70℃에서 1시간, 또한 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 물 첨가 후, 용매를 회전 증발로 제거하였다. 잔류물을 디에틸 에테르로 2회 추출하였다. 추출물을 합하여 증발시켰다. 조 생성물을 HPFC로 정제하였다. 이 단계의 수율은 일반적으로 80 내지 90％였다.
실시예 1; 지질 SML1A , SML1B , 및 SML1C 의 제조
본원에서 SML1a, SML1b 및 SML1c로 지칭 (일괄하여 SML1a-SML1c로 지칭)되는 지질의 합성에 대한 합성 반응식을 하기 반응식 1에 요약하였다. 이 반응식은 지질 SML1a-c의 합성에 대한 상세한 설명에 의해 하기에 예시된다.
<반응식 1>
Figure pct00017
a시약 및 조건. (A) 트리틸 클로라이드 (1.03 당량), ZnCl2 (0.95 당량), DMF, 4℃, 10시간; (B) 알킬 이소시아네이트 (1.0 당량), DMSO, 100℃, 24시간; (C) CHCl3 중 TFA (16.7％), 실온, 4시간; (D) 콜레스테릴 클로로포르메이트 (5 당량), DIPEA (5.2 당량), CHCl3, 실온, 16시간. "Tr"은 트리틸기를 나타냄. "Chol-OH" = 콜레스테롤.
1-O- 트리틸 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 (6): 염화아연 분말 (무수, 25 g, 175 mmol)을 무수 DMF (500 mL) 중의 글리세로포스포콜린 (50 g, 185 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 4℃에서 트리틸 클로라이드 (53 g, 190 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 4℃에서 10시간 동안 유지하였다. 이어서, 조 생성물을 1 L 디에틸 에테르 첨가에 의해 침전시켰다. 오일상 생성물을 1 L 클로로포름/이소부탄올 (2:1) 중에 용해시키고, 300 ml 4％ 수성 암모니아로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 휘발성 물질을 증발시킨 후, 조 생성물을 톨루엔으로 공비 건조시켰다. 잔류물을 실온에서 5시간 동안 아세토니트릴로 연화처리(trituration)하였다. 이어서, 백색 침전물을 수거하고, 고진공 하에 건조시켰다.
Figure pct00018
1-O- 트리틸 -2- 스테아릴카르바모일 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 (7a): 디메틸술폭시드 (무수, 10 mL) 중의 6 (1 g, 2 mmol)의 용액에 옥타데실이소시아네이트 (0.6 g, 2 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 N2 하에 100℃에서 24시간 동안 교반하였다. 용매 증발 후, 잔류물을 메탄올로 추출하였다. 백색 고체를 여과하고, 여액을 건조물로 증발시켰다. 조 생성물을 HPFC (CHCl3/MeOH/H2O, 35/13/2)로 정제하였다.
Figure pct00019
1-O- 트리틸 -2- 팔미틸카르바모일 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 (7b): 이 화합물을 7a와 동일한 절차에 따라 합성하고, 다음 단계 반응에 직접 사용하였다.
1-O- 트리틸 -2- 미리스틸카르바모일 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 (7c): 이 화합물을 7a와 동일한 절차에 따라 합성하고,다음 단계 반응에 직접 사용하였다.
1-히드록시-2- 스테아릴카르바모일 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 (8a): 화합물 7a (420 mg, 0.52 mmol)를 실온에서 4시간 동안 클로로포름 (5 mL) 중의 트리플루오로아세트산 (TFA, 1 mL)으로 처리하였다. 휘발성 물질을 증발시키고, 잔류물을 HPFC (CHCl3/MeOH/H2O, 10/5/1)로 정제하였다.
Figure pct00020
1-히드록시-2- 팔미틸카르바모일 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 (8b): 이 화합물을 8a와 동일한 절차에 따라 합성하였다.
Figure pct00021
1-히드록시-2- 미리스틸카르바모일 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 (8c): 이 화합물을 8a와 동일한 절차에 따라 합성하였다.
Figure pct00022
1- 콜레스테릴카르보노일 -2- 스테아릴카르바모일 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 (SML1a, Ch c S a PC ): 실온에서 무수 에탄올-비함유 클로로포름 (10 mL) 중의 8a (0.3 g, 0.54 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 0.5 mL, 2.8 mmol)의 용액에 무수 에탄올-비함유 클로로포름 (5 mL) 중의 콜레스테릴 클로로포르메이트 (1.21 g, 2.7 mmol)의 용액을 적가하였다. 실온에서 16시간 반응 후, 휘발성 물질을 증발시키고, 잔류물을 HPFC (CHCl3/MeOH/H2O, 40/18/3)로 정제하였다.
Figure pct00023
1- 콜레스테릴카르보노일 -2- 팔미틸카르바모일 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 (SML1b, Ch c P a PC ): 이 화합물을 SML1a와 동일한 절차에 따라 합성하였다.
Figure pct00024
1- 콜레스테릴카르보노일 -2- 미리스틸카르바모일 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 (SML1c, Ch c M a PC ): 이 화합물을 SML1a와 동일한 절차에 따라 합성하였다.
Figure pct00025
실시예 2; 지질 SML2A , SML2B , SML2C , 및 SML2D 의 제조
본원에서 SML2a, SML2b, SML2c 및 SML2d로 지칭 (일괄하여 SML2a-SML2d로 지칭)되는 지질의 합성에 대한 합성 반응식을 하기 반응식 2에 요약하였다. 이 반응식은 지질 SML2a-d의 합성에 대한 상세한 설명에 의해 하기에 예시된다.
<반응식 2>
Figure pct00026
a시약 및 조건. (A) 1) NaH (1.2 당량), 톨루엔, 실온, 30분; 2) 요오도알칸 (1.25 당량), 환류, 밤새; (B) MeOH 중 HCl (농축) (10％), 환류, 5시간; (C) 콜레스테릴 클로로포르메이트 (1.05 당량), DIPEA (1.4 당량), DMAP (0.5 당량), CHCl3, 0℃, 0.5시간, 이어서 실온, 밤새; (D) POCl3 (1.1 당량), 피리딘 (2 당량), THF, 0℃, 2 내지 3시간; (E) 콜린 테트라페닐 보레이트 (2 당량), TPS (2.5 당량), 피리딘, 70℃, 1시간, 이어서 실온, 3시간. "Chol-OH" = 콜레스테롤.
1,3- 벤질리덴 -2- 스테아릴 -글리세롤 (9a): 톨루엔 (100 mL) 중의 1,3-벤질리덴 글리세롤 (7.2 g, 40 mmol)의 용액을 교반하며 실온에서 톨루엔 (30 mL) 중의 NaH (광유 중 60％, 1.92 g, 48 mmol, 헥산으로 세척)에 첨가하였다. 이어서, 톨루엔 (40 mL) 중의 1-요오도-옥타데칸 (20 g, 50 mmol)을 반응 혼합물에 적가하였다. 첨가 후, 혼합물을 질소 하에 밤새 환류시키고, 실온까지 냉각시켰다. 혼합물에 물을 주의깊게 첨가함으로써 과량의 NaH를 파괴시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 물 (100 mL x 2)로 세척하였다. 유기층을 수거하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 다음 단계 반응에 직접 사용하였다.
1,3- 벤질리덴 -2- 팔미틸 -글리세롤 (9b): 이 화합물을 9a와 동일한 절차에 따라 합성하였다.
1,3- 벤질리덴 -2- 미리스틸 -글리세롤 (9c): 이 화합물을 9a와 동일한 절차에 따라 합성하였다.
1,3- 벤질리덴 -2- 올레일 -글리세롤 (9d): 이 화합물을 9a와 동일한 절차에 따라 합성하였다.
2- 스테아릴 -글리세롤 (10a): 9a의 조 생성물을 HCl (농축, 30 mL) 및 메탄올 (270 mL)의 혼합 용액 중에서 5시간 동안 환류시킴으로써 가수분해시켰다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 디에틸 에테르 (300 mL) 중에서 용해시키고, 수산화나트륨 용액 (0.5 M, 100 mL) 및 물 (150 mL x 2)로 연속하여 세척하였다. 이어서, 에테르층을 건조시키고, 증발시켰다. 조 생성물을 HPFC (헥산 중 30 내지 80％ 에틸 아세테이트)로 정제하였다.
Figure pct00027
2- 팔미틸 -글리세롤 (10b): 이 화합물을 10a와 동일한 절차에 따라 합성하였다.
Figure pct00028
2- 미리스틸 -글리세롤 (10c): 이 화합물을 10a와 동일한 절차에 따라 합성하였다.
Figure pct00029
2- 올레일 -글리세롤 (10d): 이 화합물을 10a와 동일한 절차에 따라 합성하였다.
Figure pct00030
1- 콜레스테릴카르보노일 -2- 스테아릴 -글리세롤 (11a): 0℃에서 무수 에탄올-비함유 클로로포름 (10 mL) 중의 10a (0.7 g, 2 mmol), DIPEA (0.5 mL, 2.8 mmol) 및 DMAP (0.12 g, 1 mmol)의 용액에 콜레스테릴 클로로포르메이트 (0.94 g, 2.1 mmol) 클로로포름 용액 (10 mL)을 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 0.5시간 동안, 이어서 실온에서 밤새 교반하였다. 휘발성 물질을 증발시키고, 조 생성물을 HPFC (헥산 중 5 내지 15％ 에틸 아세테이트)로 정제하였다.
Figure pct00031
1- 콜레스테릴카르보노일 -2- 팔미틸 -글리세롤 (11b): 이 화합물을 11a와 동일한 절차에 따라 합성하였다.
Figure pct00032
1- 콜레스테릴카르보노일 -2- 미리스틸 -글리세롤 (11c): 이 화합물을 11a와 동일한 절차에 따라 합성하였다.
Figure pct00033
1- 콜레스테릴카르보노일 -2- 올레일 -글리세롤 (11d): 이 화합물을 11a와 동일한 절차에 따라 합성하였다.
Figure pct00034
1- 콜레스테릴카르보노일 -2- 스테아릴 - rac - 글리세로 -3- 포스페이트 (12a): 이 화합물을 인산화의 일반적 절차에 따라 합성하였다.
Figure pct00035
1- 콜레스테릴카르보노일 -2- 팔미틸 - rac - 글리세로 -3- 포스페이트 (12b): 이 화합물을 인산화의 일반적 절차에 따라 합성하였다.
Figure pct00036
1- 콜레스테릴카르보노일 -2- 미리스틸 - rac - 글리세로 -3- 포스페이트 (12c): 이 화합물을 인산화의 일반적 절차에 따라 합성하였다.
Figure pct00037
1- 콜레스테릴카르보노일 -2- 올레일 - rac - 글리세로 -3- 포스페이트 (12d): 이 화합물을 인산화의 일반적 절차에 따라 합성하였다.
Figure pct00038
1- 콜레스테릴카르보노일 -2- 스테아릴 - rac - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML2a , Ch c S e PC): 이 화합물을 포스포콜린 합성의 일반적 절차에 따라 합성하였다.
Figure pct00039
1- 콜레스테릴카르보닐 -2- 팔미틸 - rac - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML2b , Ch c P e PC ): 일반적인 포스포콜린 합성 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00040
1- 콜레스테릴카르보닐 -2- 미리스틸 - rac - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML2c , Ch c M e PC) : 일반적인 포스포콜린 합성 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00041
1- 콜레스테릴카르보닐 -2- 올레일 - rac - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML2d , Ch c O e PC) : 일반적인 포스포콜린 합성 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00042
실시예 3 지질 SML3 A , SML3 B , SML3 C 및 SML3 D 의 제조
지질 SML3a , SML3b , SML3c 및 SML3d (총체적으로 SML3a-SML3d라 칭함)의 합성을 위한 합성 반응식을 반응식 3에 개괄하였다. 이러한 반응식은 지질 SML3a -d 합성의 상세한 설명에 의해 하기에 예시된다.
<반응식 3>
Figure pct00043
3-(2,3- 이소프로필리덴 -1- 글리세릴 ) 콜레스테롤 ( 13 ): 톨루엔 (50 mL) 중 콜레스테릴 토실레이트 (50 g, 90 mmol) 및 솔케탈 (250 mL, 2 mol)의 혼합물을 질소하에서 80 내지 90℃에서 4시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각 후, 톨루엔 (300 mL)을 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 염수 (300 mL)로 세척하였다. 분리 후, 추가 200 mL의 톨루엔을 유기층에 첨가하였다. 이어서, 유기층을 염수 (300 mL)로 세척하고, 건조시키고, 건조될 때까지 증발시켰다. 조질 생성물을 다음 단계 반응에 바로 사용하였다. TLC: R f = 0.55 (용리액 G).
1- 글리세릴 콜레스테롤 ( 14 ): 조질 생성물 13을 THF (130 mL)-TFA (40 mL)-HCl (진함, 20 mL)의 혼합 용매 중에 용해시켰다. 혼합물을 4시간 동안 실온으로 유지하였다. 휘발성 물질을 감압하에 증발시켰다. 잔류물을 CHCl3/MeOH (400 mL/100 mL) 중에 용해시키고, 물 (100 mL)로 세척하였다. 이어서, 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 조질 생성물을 -20℃에서 에탄올로부터 재결정화하여 정제하였다.
Figure pct00044
1- 콜레스테릴 -3- 트리틸 글리세롤 ( 15 ): 14의 3-히드록시기의 트리틸기로의 보호를 일반적인 절차에 따라 수행하였다. 생성물을 HPFC (헥산 중 9％에서 25％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하였다.
Figure pct00045
1- 콜레스테릴 -2- 스테아로일 -3- 트리틸 글리세롤 ( 16a ): 에탄올-무함유 무수 클로로포름 (20 mL) 중 15 (2.11 g, 3 mmol), 스테아르산 (0.94 g, 3.15 mmol), 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 0.13 g)의 용액에 0℃에서 DCC (0.65 g, 3.15 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안, 이어서 실온에서 밤새 교반하였다. 백색 침전물을 여과 제거하고, 여과액을 건조될 때까지 증발시켰다. 조질 생성물을 HPFC (헥산 중 1％에서 10％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하였다.
Figure pct00046
1- 콜레스테릴 -2- 팔미토일 -3- 트리틸 글리세롤 ( 16b ): 16a와 동일한 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00047
1- 콜레스테릴 -2- 미리스토일 -3- 트리틸 글리세롤 ( 16c ): 16a와 동일한 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00048
1- 콜레스테릴 -2- 올레오일 -3- 트리틸 글리세롤 ( 16d ): 16a와 동일한 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00049
1- 콜레스테릴 -2- 스테아로일 글리세롤 ( 17a ): 트리틸기의 제거를 일반적인 절차에 따라 수행하였다. 조질 생성물을 다음 단계 반응에 바로 사용하였다. TLC: R f = 0.08 (용리액 E).
1- 콜레스테릴 -2- 팔미토일 글리세롤 ( 17b ): 트리틸기의 제거를 일반적인 절차에 따라 수행하였다. 조질 생성물을 다음 단계 반응에 바로 사용하였다. TLC: R f = 0.08 (용리액 E).
1- 콜레스테릴 -2- 미리스토일 글리세롤 ( 17c ): 트리틸기의 제거를 일반적인 절차에 따라 수행하였다. 조질 생성물을 다음 단계 반응에 바로 사용하였다. TLC: R f = 헥산/EtOAc (10/1) 중 0.08.
1- 콜레스테릴 -2- 올레오일 글리세롤 ( 17d ): 트리틸기의 제거를 일반적인 절차에 따라 수행하였다. 조질 생성물을 다음 단계 반응에 바로 사용하였다. TLC: R f = 0.08 (용리액 E).
1- 콜레스테릴 -2- 스테아로일 - rac - 글리세로 -3- 포스페이트 ( 18a ): 일반적인 인산화 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다. TLC: R f = 0.05 (용리액 A).
1- 콜레스테릴 -2- 팔미토일 - rac - 글리세로 -3- 포스페이트 ( 18b ): 일반적인 인산화 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다. TLC: R f = 0.05 (용리액 A).
1- 콜레스테릴 -2- 미리스토일 - rac - 글리세로 -3- 포스페이트 ( 18c ): 일반적인 인산화 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다. TLC: R f = 0.05 (용리액 A).
1- 콜레스테릴 -2- 올레오일 - rac - 글리세로 -3- 포스페이트 ( 18d ): 일반적인 인산화 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다. TLC: R f = 0.05 (용리액 A).
1- 콜레스테릴 -2- 스테아로일 - rac - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML3a , Ch e SPC ): 일반적인 포스포콜린 합성 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00050
1- 콜레스테릴 -2- 팔미토일 - rac - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML3b , Ch e PPC ): 일반적인 포스포콜린 합성 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00051
1- 콜레스테릴 -2- 미리스토일 - rac - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML3c , Ch e MPC ): 일반적인 포스포콜린 합성 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00052
1- 콜레스테릴 -2- 올레오일 - rac - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SM3d , Ch e OPC ): 일반적인 포스포콜린 합성 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00053
실시예 4 지질 SML4 A -4 D 의 제조
지질 SML4a , SML4b , SML4c 및 SML4d (총체적으로 SML4a-d라 칭함)의 합성을 위한 합성 반응식을 반응식 4에 개괄하였다. 이러한 반응식은 지질 SML4a -d 합성의 상세한 설명에 의해 하기에 예시된다.
<반응식 4>
Figure pct00054
1- 팔미틸 -2,3- 이소프로필리덴 글리세롤 ( 19b ): 50 mL의 무수 톨루엔 중 NaH (9 g, 0.225 mol)의 현탁액에 솔케탈 (19.8 g, 0.15 mol)을 적가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 120℃에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 1-브로모테트라데칸 (40 mL, 0.134 mol)을 혼합물에 첨가하고 반응을 120℃에서 밤새 유지하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (400 mL)을 조심스럽게 첨가하여 과량의 NaH를 파괴한 후, 헥산 (400 mL)을 첨가하였다. 이어서, 유기층을 물 (200 mL x 2)로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 다음 단계 반응에 바로 사용하였다.
1- 미리스틸 -2,3- 이소프로필리덴 글리세롤 ( 19c ): 19b와 동일한 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
1- 올레일 -2,3- 이소프로필리덴 글리세롤 ( 19d) : 19b와 동일한 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
1- 팔미틸 글리세롤 ( 20b ): 조질 생성물 19b를 200 mL의 메탄올 및 40 mL의 진한 HCl 중에 용해시키고 1.5시간 동안 환류하였다. 이어서, 상기 혼합물을 실온으로 냉각시키고 밤새 4℃에 두었다. 결정을 수집하고 메탄올로부터 재결정화하였다.
Figure pct00055
1- 미리스틸 글리세롤 ( 20c ): 20b와 동일한 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00056
1- 올레일 글리세롤 ( 2 Od ): 20b와 동일한 절차에 따라 본 화합물을 합성하였으나, HPFC (헥산 중 30에서 70％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하였다.
Figure pct00057
1- 스테아릴 -3- 트리틸 글리세롤 ( 21a ): 일반적인 절차에 따라 3-트리틸기를 도입하였다.
Figure pct00058
1- 팔미틸 -3- 트리틸 글리세롤 ( 21b ): 일반적인 절차에 따라 3-트리틸기를 도입하였다.
Figure pct00059
1- 미리스틸 -3- 트리틸 글리세롤 ( 21c ): 일반적인 절차에 따라 3-트리틸기를 도입하였다.
Figure pct00060
1- 올레일 -3- 트리틸 글리세롤 ( 21d ): 일반적인 절차에 따라 3-트리틸기를 도입하였다.
Figure pct00061
1- 스테아릴 -2- 콜레스테릴카르보닐 -3- 트리틸 글리세롤 ( 22a ): 에탄올 무함유 무수 클로로포름 (10 mL) 중 21a (2.4 g, 4 mmol) 및 DMAP (0.6 g)의 용액에 클로로포름 (5 mL) 중 콜레스테릴 클로로포르메이트 (2.2 g, 4.8 mmol)의 용액을 실온에서 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, CHCl3/MeOH/H2O (40 mL/ 20 mL/ 30 mL)의 용매 혼합물에 상기 반응 혼합물을 첨가하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 조질 생성물을 HPFC (헥산 중 0에서 10％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하였다.
Figure pct00062
1- 팔미틸 -2- 콜레스테릴카르보닐 -3- 트리틸 글리세롤 ( 22b ): 22a와 동일한 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00063
1- 미리스틸 -2- 콜레스테릴카르보닐 -3- 트리틸 글리세롤 ( 22c ): 22a와 동일한 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00064
1- 올레일 -2- 콜레스테릴카르보닐 -3- 트리틸 글리세롤 ( 22d ): 22a와 동일한 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00065
1- 스테아릴 -2- 콜레스테릴카르보닐 글리세롤 ( 23a ): 트리틸기의 일반적인 제거 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다. TLC: R f = 0.63 (용리액 D).
1- 팔미틸 -2- 콜레스테릴카르보닐 글리세롤 ( 23b ): 트리틸기의 일반적인 제거 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다. TLC: R f = 0.63 (용리액 D).
1- 미리스틸 -2- 콜레스테릴카르보닐 글리세롤 ( 23c ): 트리틸기의 일반적인 제거 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다. TLC: R f = 0.63 (용리액 D).
1- 올레일 -2- 콜레스테릴카르보닐 글리세롤 ( 23d ): 트리틸기의 일반적인 제거 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다. TLC: R f = 0.63 (용리액 D).
1- 스테아릴 -2- 콜레스테릴카르보닐 - rac - 글리세로 -3- 포스페이트 ( 24a ): 일반적인 인산화 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다. TLC: R f = 0.57 (용리액 C).
1- 팔미틸 -2- 콜레스테릴카르보닐 - rac - 글리세로 -3- 포스페이트 ( 24b ): 일반적인 인산화 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다. TLC: R f = 0.57 (용리액 C).
1- 미리스틸 -2- 콜레스테릴카르보닐 - rac - 글리세로 -3- 포스페이트 ( 24c ): 일반적인 인산화 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다. TLC: R f = 0.57 (용리액 C).
1- 올레일 -2- 콜레스테릴카르보닐 - rac - 글리세로 -3- 포스페이트 ( 24d ): 일반적인 인산화 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다. TLC: R f = 0.57 (용리액 C).
1- 스테아릴 -2- 콜레스테릴카르보닐 - rac - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML4a , S e Ch c PC ): 일반적인 포스포콜린 합성 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00066
1- 팔미틸 -2- 콜레스테릴카르보닐 - rac - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML4b , P e Ch c PC ): 일반적인 포스포콜린 합성 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00067
1- 미리스틸 -2- 콜레스테릴카르보닐 - rac - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML4c , M e Ch c PC ): 일반적인 포스포콜린 합성 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00068
1- 올레일 -2- 콜레스테릴카르보닐 - rac - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML4d , O e Ch c PC ): 일반적인 포스포콜린 합성 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00069
실시예 5 지질 SML5 A -5 D 의 제조
지질 SML5a , SML5b , SML5c 및 SML5d (총체적으로 SML5a-d라 칭함)의 합성을 위한 합성 반응식을 반응식 5에 개괄하였다. 이러한 반응식은 지질 SML5a -d 합성의 상세한 설명에 의해 하기에 예시된다.
<반응식 5>
Figure pct00070
1- 스테아로일 -2- 콜레스테릴카르보닐 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML5a , SCh c PC ): 에탄올-무함유 무수 클로로포름 (50 mL) 중 1-스테아로일-2-히드록시-sn-글리세로-포스포콜린 (1 g, 1.91 mmol) 및 DMAP (1 g)의 용액에 콜레스테릴 클로로포르메이트 (2 g, 4.45 mmol)의 클로로포름 용액 (10 mL)을 실온에서 적가하였다. 실온에서 16시간 반응 후, 용매를 증발시키고 잔류물을 HPFC (CHCl3에서 CHCl3-MeOH-H2O 65/25/4)에 의해 정제하였다.
Figure pct00071
1- 팔미토일 -2- 콜레스테릴카르보닐 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML5b , PCh c PC ): 5a와 동일한 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00072
1- 미리스토일 -2- 콜레스테릴카르보닐 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML5c , MCh c PC ): 5a와 동일한 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00073
1- 올레오일 -2- 콜레스테릴카르보닐 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML5d , OCh c PC ): 5a와 동일한 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다.
Figure pct00074
실시예 6 지질 SML6 A -D 의 제조
지질 SML6a , SML6b , SML6c 및 SML6d (총체적으로 SML6a-d라 칭함)의 합성을 위한 합성 반응식을 반응식 6에 개괄하였다. 이러한 반응식은 지질 SML6a -d 합성의 상세한 설명에 의해 하기에 예시된다.
<반응식 6>
Figure pct00075
1,2- 디콜레스테릴카르보닐 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML6a , DCh c PC ): 글리세로포스포콜린 (0.514 g, 2 mmol) 및 나트륨 테트라페닐보레이트 (0.719 g, 1.05 당량)를 15 mL의 메탄올 중에 용해시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 톨루엔과 함께 공비 건조시켰다. 이어서, 건조된 고체를 무수 피리딘 (60 mL) 중에 용해시킨 후, 4,4-디메틸아미노피리딘 (0.732 g, 6 mmol)을 첨가하였다. 콜레스테릴 클로로포르메이트 (2.70, 6 mmol)를 격렬하게 교반하면서 실온에서 반응 혼합물에 나누어 첨가하였다. 이어서, 반응 플라스크를 질소로 퍼징 (purging)하고 암흑하에 3일 동안 유지하였다. 휘발성 물질은 회전 증발시켰다. 조질 생성물을 클로로포름-메탄올 (2:1, 150 mL) 중에 용해시키고, 50 mL의 증류수로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 잔여물을 추가 정제를 위해 HPFC (CHCl3에서 CHCl3/MeOH/H2O (65/25/4))에 적용하였다.
Figure pct00076
1,2- 디콜레스테릴헤미석시노일 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML6b , DCHEMSPC ): 글리세로포스포콜린 (1.03 g, 4 mmol) 및 나트륨 테트라페닐보레이트 (1.33 g, 1 당량)를 30 mL의 메탄올 중에 용해시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 톨루엔과 함께 공비 건조시켰다. 이어서, 건조된 고체를 무수 피리딘 (120 mL) 중에 용해시킨 후, 4,4-디메틸아미노피리딘 (0.9 g) 및 콜레스테릴헤미석시네이트 (4.86 g, 10 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 온화하게 가온하여 고체가 완전히 용해되게 하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후 디시클로헥실카르보디이미드 (2.32 g, 11 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3일 동안 질소하에 교반하였다. 휘발성 물질을 회전 증발시키고, 잔류물을 클로로포름-메탄올 (2:1, 300 mL) 중에 용해시키고, 80 mL의 증류수로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 증발시키고, 추가 정제를 위해 HPFC (CHCl3에서 CHCl3/MeOH/H2O (65/25/4))에 적용하였다.
Figure pct00077
1,2- 디스티그마스테릴헤미석시노일 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML6c , DStigHSPC ): SML6b와 동일한 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다. TLC: R f = 0.36 (용리액 A). 구조를 NMR 및 MALDI-MS에 의해 확인하였다.
1,2- 디시토스테릴헤미석시노일 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 ( SML6d , DSitoHSPC ): SML6b와 동일한 절차에 따라 본 화합물을 합성하였다. TLC: R f = 0.40 (용리액 A). 구조를 NMR 및 MALDI-MS에 의해 확인하였다.
실시예 7 전구약물 지질 SML7 A -B 의 제조
레티노산 전구약물 SML7a 및 SML7b (총체적으로 SML7a-b라 칭함)를 실시예 3에 나타내어진 유사한 합성 방식에 따라 합성하였다. SML7a -b 합성을 위한 간략한 합성 방식을 반응식 7에 개괄하였다. 이러한 반응식은 지질 SML7a -b 합성의 설명에 의해 하기에 예시된다.
<반응식 7>
Figure pct00078
상기 실시예 3에 기재된 동일한 절차에 따라 선택적으로 보호된 콜레스테릴 글리세롤 중간체를 합성하였다. 이어서, 레티노산을 에스테르 결합을 통해 sn-2 히드록시기와 결합시킨 후 트리틸기 (Tr)를 3-히드록실기로부터 제거하였다. 이어서, 실시예의 일반적인 프로토콜에 기재된 표준 절차에 따라 중간체를 상응하는 포스포콜린으로 즉시 변환하였다. 최종 생성물을 HPFC에 의해 정제하고 구조를 TLC, NMR 및 MALDI-MS에 의해 확인하였다.
실시예 8: 지질 SML8A -F의 제조
지질 SML8a, SML8b, SML8c, SML8d, SML8e, 및 SML8f (집합적으로 SML8a-f로 지칭함)의 합성을 위한 합성 반응식을 반응식 8에 나타내었다. 상기 반응식을 지질 SML8a-f의 합성의 상세한 설명에 의해 하기에 설명하였다.
<반응식 8>
Figure pct00079
스테롤-리소스핑고미엘린 접합체 (SML8a-c)를 반응식 8에 나타낸 합성 경로에 따라 합성하였다. 먼저 스테롤의 헤미숙시네이트를 DCC에 의한 N-히드록시숙신이미드로 활성화시켰다. 이어서 활성화된 스테롤의 에스테르를 리소-스핑고미엘린의 아미노기에 커플링시켰다. 최종 생성물을 추가로 HPFC에 의해 정제하였다.
SML8d-f를 각각 리소-스핑고미엘린 및 콜레스테릴 클로로포르메이트, 콜레스테릴 토실레이트, 및 콜레스테릴 아크릴레이트의 반응에 의해 합성하였다.
콜레스테릴옥시-4-옥소부탄아미도-3-히드록시옥타데스-4-에닐 2-(트리메틸암모니오)에틸 포스페이트 (SML8a): 실온에서 에탄올-무함유 무수 클로로포름 (6 mL) 중 리소-스핑고미엘린 (25 mg, 53 μmol)의 용액에 숙신이미딜 콜레스테릴 숙시네이트 (62 mg, 106 μmol) 및 DMAP (10 mg)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시켰다. 잔류물을 정제를 위해 HPFC에 적용하였다 (CHCl3 내지 CHCl3-MeOH-H2O 65/25/4). TLC: Rf = 0.33 (용리액 C).
Figure pct00080
2-콜레스테릴옥시카르보닐아미노-3-히드록시옥타데스-4-에닐 2-(트리메틸암모니오)에틸 포스페이트(SML8d): 실온에서 에탄올-무함유 무수 클로로포름 (4 mL) 중 리소-스핑고미엘린 (25 mg, 53 μmol) 및 DMAP (20 mg)의 용액에 2 mL의 무수 에탄올 무함유 클로로포름 중 콜레스테릴 클로로포르메이트 (48 mg, 106 μmol)를 첨가하였다. 실온에서 24시간 동안 교반한 후에, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 정제를 위해 HPFC에 적용하였다 (CHCl3 내지 CHCl3-MeOH-H2O 65/25/4). TLC: Rf = 0.41 (용리액 C).
Figure pct00081
실시예 9: 지질 SML9A -C의 제조
지질 SML9a-c의 합성을 위한 특정 합성 반응식을 반응식 9에 나타내었다. 상기 반응식을 지질 SML9a-c의 합성의 상세한 설명에 의해 하기에 설명하였다.
<반응식 9>
Figure pct00082
중합가능한 SML 지질 (SML9a-c)은 반응식 9에 나타낸 합성 경로에 따라 합성할 수 있다. 먼저 스테롤의 헤미숙시네이트를 글리세로포스포콜린의 sn-1 자리에 선택적으로 커플링시킬 수 있다. 이어서, 10,12-트리코소디노산 (tricosodiynoic acid)을 sn-2 자리에 접합시켜 최종 생성물을 형성할 수 있다. 조 생성물을 HPFC에 의해 정제할 수 있다.
실시예 10: 분지형 지질 SML10 A -F 의 제조
지질 SML10a-f의 합성을 위한 특정 합성 반응식을 반응식 10에 나타내었다. 상기 반응식을 지질 SML10a-f의 합성의 상세한 설명에 의해 하기에 설명하였다.
<반응식 10>
Figure pct00083
분지형 이소-스테아르산을, 상이한 몰 비율의 출발 물질을 갖는 실시예 6에 기재된 SML6b의 유사한 합성 방법에 의해 글리세로포콜린의 sn-1 자리에 접합시켰다. 이어서 모노-이소-스테아로일 포스포콜린을 HPFC에 의해 분리하고, 디시클로헥실카르보디이미드에 의해 스테롤의 헤미숙시네이트에 접합시켰다. 최종 생성물을 HPFC에 의해 정제하였다.
실시예 11: 분지형 지질 SML11 A -F 의 제조
지질 SML11a-f의 합성을 위한 특정 합성 반응식을 반응식 11에 나타내었다. 상기 반응식을 지질 SML11a-f의 합성의 상세한 설명에 의해 하기에 설명하였다.
<반응식 11>
Figure pct00084
표적 SML 지질인 SML11a-f는 출발 물질로서 카르니틴을 사용하여 2개의 단계에서 합성할 수 있었다. 먼저, 활성화된 지방족 산을 에스테르 결합에 의해 히드록실기에 접합시켰다. 이어서 스테롤을 또한 에스테르 결합을 통해 카르복실기에 연결시켰다. 최종 생성물을 HPFC에 의해 정제할 수 있었다.
실시예 12: 티로신을 갖는 SML 인 SML12 A -F 의 제조
지질 SML12a-f의 합성을 위한 특정 합성 반응식을 반응식 12에 나타내었다. 상기 반응식은 지질 SML12a-f의 합성의 상세한 설명에 의해 하기에 설명하였다.
<반응식 12>
Figure pct00085
스테롤-개질된 양친매성 지질 SML12a-f를 반응식 12에 나타낸 경로에 따라 합성할 수 있었다. 먼저, 지방족 알콜을 선택적으로 보호된 티로신의 카르복실기에 접합시키고 피페리딘에 의해 Fmoc기를 제거하였다. 이어서 스테롤 헤미숙시네이트를 아미노기에 커플링시켰다. tert-부틸기의 제거 후에, 페놀기를 황산화시켰다. 또한 상기 페놀기는 포스페이트, 포스포네이트, 술포네이트, 보레이트, 또는 히드라존으로 전환될 수 있다. 상기 경로는 다른 아미노산 기재 스테롤-개질된 지질의 합성 경로를 제공하고 여기서 적절하게 보호된 아미노산은 분지 코어로 사용된다.
실시예 13: 환원- 감응성 SML13 A -H 의 제조
환원-감응성 SML 지질은 세포 시토졸에서 발견되는 것과 같은 생물학적 환원 환경 하에 선택적으로 제거될 수 있는 분자에서 환원가능한 결합을 갖도록 디자인하였다. 이는 지질 입자를 불안정화시키고 약물의 방출을 선택적으로 용이하게 할 것이다. 디술파이드 결합은 분자의 상이한 부분, 예컨대 측쇄 (SML13a-h), 또는 헤드기 (SML13i-k)에 배치될 수 있다. 지질 SML13a-k의 합성은 반응식 13.1, 반응식 13.2, 및 반응식 13.3에 나타내었다. 상기 반응식을 지질 SML13a-k의 합성의 상세한 설명에 의해 하기에 설명하였다.
<반응식 13>
반응식 13.1
Figure pct00086
반응식 13.2
Figure pct00087
반응식 13.3
Figure pct00088
SML13a-d는 상기 실시예 4에 기재한 SML4a-d의 방법과 유사하게 합성할 수 있었다. 콜레스테릴 클로로포르메이트 대신에, 2-콜레스테릴디술파닐 아세트산을 sn-2 히드록실기에 접합시켰다. SML13e-h를, 콜레스테릴 클로로포르메이트를 2-콜레스테릴디술파닐 아세트산으로 대체하여 SML5a-d와 동일한 방법에 따라 합성할 수 있었다. SML13i-k의 합성에서, 2-티오피리딘 활성화된 디술파이드 잔기를 먼저 아미노기에 연결시켰다. 이어서 스테롤을 1차 알콜에 접합시키고 지방산을 2차 알콜에 부착시켰다. 마지막으로, 양이온성 헤드기를 디술파이드 교환 반응에 의해 도입하였다. SML13i-k는 환원-감응성의 양이온성 SML 화합물이었다. 이들은 유전자 및 siRNA 전달에 매우 유용할 수 있다.
실시예 14: 헤드기의 말단에 아지드를 갖는 SML 인 SML14A -F의 제조
표적 리포좀의 디자인은 대부분 양호하게-조절된 생접합 반응의 전개에 따라 달라지고, 이는 대부분의 경우에 리간드가 관능화된 지질 앵커 (anchor)를 가지는 예비형성된 소포의 표면에 커플링하는 것을 포함한다. 이용가능한 다수의 접합 방법 중 특히, 가장 많이 쓰이는 방법은 티올-반응성 관능기, 예컨대 말레이미드, 브로모아세틸, 또는 2-피리딜디티오 결합을 갖고, 티오에테르 또는 디술파이드 결합, 또는 아지드를 생성하며, "클릭-화학"에 의해 알킨과 고리화되는 앵커와 티올 함유 리간드의 반응을 포함한다. 표적 리간드 또는 표면 표지를 위한 앵커리지 (anchorage)로서 말단-관능화된 SML을 사용하는 것은, 통상적인 지질보다 이중층의 상 분리 또는 구분을 덜 용이하게 하므로 유리할 수 있다. SML 화합물인 SML14a-f는 "클릭-화학"을 통해 리간드 또는 바이오마커를 부착시키는 데에 사용될 수 있는 헤드기의 말단에 아지드기를 갖는 일부 모델 화합물이다. 다른 관능기, 예컨대 프로파르길기는 유사한 방식으로 도입할 수 있다. 지질 SML14a-f의 합성을 위한 특정 합성 반응식을 반응식 14에 나타내었다. 상기 반응식을 지질 SML14a-f의 합성의 상세한 설명에 의해 하기에 설명하였다.
<반응식 14>
Figure pct00089
SML14a-f의 합성은 복잡하지 않다. 먼저, 아지드-관능화된 폴리에틸렌 옥시드를 보다 반응성인 아민에 부착시켰다. 이어서 스테롤 헤미숙시네이트를 1차 알콜에 접합시켰다. 최종 단계에서, 지방산을 가장 반응성이 낮은 2차 알콜에 연결시켰다. 관능기의 반응성의 차이로 인해, 보호기는 필요하지 않았다.
실시예 15: 선택된 SML 의 시차 주사 열량측정
SML 화합물의 성질을 조사하기 위해 특정 SML을 모델 화합물로서 사용하였다. 상 거동은 지질 이중층의 가장 중요한 성질 중 하나이고 세포막의 다양한 생물학적 기능과 연관된다. 유리 콜레스테롤의 인지질 이중층에의 첨가는, 유리 콜레스테롤과 글리세롤리피드 및 스핑고리피드의 혼합 뿐만 아니라 이중층에서 유리 콜레스테롤의 이소프레놀 테일이 아실 쇄 패킹에 미치는 영향으로 인해 이중층의 상 거동을 변화시킬 것이다. 시차 주사 열량측정을 사용하여 SML이 합성 지질로 구성된 이중층에서 아실 쇄 패킹에 유리 콜레스테롤과 같은 유사한 영향을 미친다는 것을 나타내었다. 따라서, DSC 조사를 위해 다양한 결합을 갖는 C-16 쇄를 함유하는 SML (SML1b-5b) 및 상이한 쇄를 갖는 하나의 기의 SML (SML 5a-5d)를 선택하였다.
시차 주사 열량측정 (DSC) 조사를 개선된 고온 MC-DSC 4100 열량계 (유타주 린던 소재의 칼로리메트리 사이언스 코포레이션 (Calorimetry Sciences Corp.))에서 재사용가능한 3개의 해스텔로이 (Hastelloy) 샘플 앰플 및 참조 앰플을 사용하여 수행하였다. 통상적으로 참조로서 밀리-큐 (Milli-Q, 등록상표) 물을 사용하여 0.5℃/분에서 5 내지 85℃의 범위에 걸쳐 데이터를 수집하였다. CSC로부터의 CpCalc 2.1 소프트웨어 패키지를 사용하여 원래의 데이터를 몰 열용량 (MHC)으로 변환하였다. 이어서 데이터를 추가 처리 및 계산을 위해 오리진 (Origin) 6.0 (메사추세츠주 노샘프턴 소재의 마이크로컬 (Microcal))으로 넘겼다. 지질 필름 (10 μmol)을 아르곤 하에 65℃에서 15분 동안 간헐적 와류에 의해 밀리-큐 (등록상표) 물 (200 μL)에 수화시켜 DSC 측정에 사용되는 리포좀을 제조하였다. 이어서 샘플을 실온으로 냉각시키고, 탈기시키고, 기밀 (gas-tight) 해밀턴 (Hamilton, 등록상표) 시린지를 사용하여 샘플 앰플로 도입하였다 (샘플 당 100 μL). 가열-냉각-가열 사이클을 통해 샘플을 주사하고 제2 가열 주사 데이터를 분석에 사용하였다.
유리 콜레스테롤 및 디아실 인지질의 통상적인 지질 혼합물에서, 총 지질 중 콜레스테롤 (콜)의 몰 백분율을 하기 식에 의해 계산하였다:
콜％ = n콜/(n콜+n디아실)×100, 식 중:
n콜은 콜레스테롤의 몰 수를 지칭하고,
n디아실은 디아실 지질의 몰 수를 지칭한다.
m-SML (모노스테롤 SML)을 디아실 인지질과 혼합하는 경우, 디아실 지질의 총 몰의 계산에 고려되는 m-SML 중 추가의 아실 쇄가 존재한다. m-SML 및 디아실 지질의 혼합물 중 등가 스테롤 몰 백분율은 하기 식에 의해 통상적인 지질 혼합물의 방법에 따라 계산하였다:
스테롤％ = nm - SML/(1.5×nm - SML+n디아실)×100, 식 중:
nm - SML은 m-SML의 몰 수를 지칭하고,
n디아실은 디아실 지질의 몰 수를 지칭한다.
예를 들어, 순수한 m-SML은 하나의 스테롤 및 하나의 아실 쇄를 갖고, 이에 따라 등가 유리 스테롤 백분율은 1/1.5×100=67이었다. m-SML 및 디아실 지질의 1:1 몰 혼합물에서, 등가 유리 스테롤 백분율은 1/(1.5+1)×100=40이었다. 동일한 계산 방법을 기타 m-SML 제형 모두에 적용하였다. DSC 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1에서, 등가 콜레스테롤 (콜)의 백분율 값은 몰 백분율을 지칭한다. DSPC는 디스테아로일포스파티딜콜린을 지칭하고; SChcPC는 하나의 스테롤을 갖는 SML, 구체적으로 1-스테아로일-2-콜레스테릴카르보노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML5a)을 지칭한다.
도 2에서, 다양한 몰 백분율의 유리 콜레스테롤을 갖는 SML/디아실 지질 혼합물의 전이 온도 및 엔탈피를 나타내었다. SML을 동일한 쇄 길이의 디아실 지질과 혼합하였다. 도 2에서 시험한 SML은 하기와 같다:
ㆍ1-콜레스테릴카르보노일-2-팔미틸카르바모일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML1b, ChcPaPC)
ㆍ1-콜레스테릴카르보노일-2-팔미틸-rac-글리세로-3-포스포콜린 (SML2b, ChcPePC)
ㆍ1-콜레스테릴-2-팔미토일-rac-글리세로-3-포스포콜린 (SML3b, ChePPC)
ㆍ1-팔미틸-2-콜레스테릴카르보노일-rac-글리세로-3-포스포콜린 (SML4b, PeChcPC):
ㆍ1-스테아로일-2-콜레스테릴카르보노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML5a, SChcPC)
ㆍ1-팔미토일-2-콜레스테릴카르보노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML5b, PChcPC)
ㆍ1-미리스토일-2-콜레스테릴카르보노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML5c, MChcPC)
ㆍ1-올레오일-2-콜레스테릴카르보노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML5d, OChcPC).
SChcPC 및 DSPC와의 혼합물의 DSC 온도기록도 (thermogram) (도 1)는 대부분의 시험한 SML에 대한 통상적인 결과였다. 주요 전이 온도 (Tm) 및 엔탈피 (△H)를 지질 혼합물 중 콜레스테롤의 백분율에 대해 플로팅하였다 (도 2). SML의 화학적 구조와 관계없이 시험한 SML 모두에 대해 온도 범위 10 내지 80℃에서 검출가능한 상 변이가 없었다. 따라서, 콜레스테롤 및 지방족 쇄가 서로 가깝게 유지되는 경우에 높은 콜레스테롤 농도 (약 67％)의 균일한 액상의 정열된 이중층을 얻을 수 있었다. 생 세포에서, 막 단백질이 지질 쇄 및 콜레스테롤 모두에 대해 강한 친화도를 갖는 경우에 유사한 도메인이 원형질 막 상에 형성될 수 있다.
유리 콜레스테롤의 첨가와 마찬가지로, SML의 상응하는 디아실 지질로의 첨가는 전이 피크를 넓히고, 전이 온도 및 엔탈피 모두를 감소시켰다. 상기 효과는 농도에 의존하고 결국 콜레스테롤이 특정 농도에 도달하였을 때 상 전이의 제거를 초래하였다.
상이한 결합의 SML의 농축 효과가 유사하더라도, 특히 이성질체인 ChcPePC 및 PeChcPC 사이에서 Tm 및 △H에 대한 주목할만한 차이가 존재하였다. ChcPePC는 Tm 및 △H를 급속하게 낮출 수 있고 30％의 등가 콜레스테롤에서 상 전이를 완전히 제거할 수 있었으나, 동일한 쇄 길이를 갖는 다른 SML은 35％ 이상의 등가 콜레스테롤을 필요로 하였다. ChcPePC를 ChcPaPC 및 PeChcPC와 비교하여 ChcPePC의 2-에테르 결합이 차이를 야기하는 것으로 보였다. 또한 콜레스테롤이 20％ 이하인 경우에, OChcPC의 DSPC에의 첨가가 매우 넓은 전이 피크를 초래한다는 것에 주목했다. 이는 SChcPC의 DSPC에 대한 효과 (도 1)와 상당히 달랐고, 불포화 올레오일 쇄 및 포화 스테아로일 쇄 사이의 쇄 오결합의 결과일 수 있다.
실시예 16: 리포좀에서 칼세인 페이로드의 캡슐화
50％의 수산화나트륨 (695 μL, 13.2 mmol)을 첨가한 후에, 형광 염료 칼세인 (2.49 g, 4 mmol)을 Tris-HCl 완충액 (10 mM, pH 7.5, 6 mL) 중에 용해시켰다. 이어서 상기 모액을 세파덱스(Sephadex) LH-20 컬럼 (2.5 cm x 40 cm)에 적재시키고 Tris-HCl 완충액 (10 mM, pH 7.5)으로 용리하였다. pH 9에서 희석된 샘플의 흡광도 (494 nm)를 측정함으로써 모인 (pooled) 분획의 칼세인 농도를 결정하였다. 이어서 누출 시험을 위해 정제된 칼세인 (56 mM)을 리포좀에 캡슐화하였다. 일반적으로, 주어진 제형의 건조 지질 필름 (10 μmol)을 60℃에서 아르곤 하에 15분 동안 간헐적 와류에 의해 완충액을 함유하는 1 mL 칼세인에 수화시켰다. 이어서 샘플을 60℃에서 폴리카르보네이트 막을 통해 11번 압출하고 상응하는 등장성 용리액을 포함하는 세파덱스 G-50 컬럼에 통과시켰다. 이어서 모인 리포좀 분획을분석하여 칼세인 농도를 결정하고, 하기에서 논의되는 누출 조사를 위해 선형 형광 범위로 희석하였다.
실시예 17: 누출을 유도하는 삼투 스트레스
SML-함유 리포좀의 유리한 성질은 리포좀으로부터 리포좀 내용물 (예를 들어 약물)의 누출에 대한 내성이다. 지질 이중층에서 SML의 포함은 일반적으로 리포좀이 체외로 덜 누출되게 할 것이다. 삼투압 하에 리포좀의 누출 시험은 지질 막의 탄성 변형 및 결정적인 실패를 평가하기 위한 효과적인 방법으로 증명되었다. 리포좀에 높은 삼투압을 가하는 경우에, 막은 팽윤되고 임계점에서 파열되어 그 내용물을 급속도로 방출할 것이다. 이어서 내용물이 충분히 방출되면 소포가 기계적으로 안정한 구조로 재밀봉될 것이다. 따라서 삼투 누설 프로파일은 인공적인 삼투 구배 하에서의 신속한 평형에 근거한다.
상기 조사에 사용되는 리포좀을 상기 언급한 방법 (실시예 11)에 따라 고농도 내용물 (56 mM 칼세인, 10 mM Tris, 711 mM NaCl)을 사용하여 제조하고 100 nm 막을 통해 압출하고, 등장성 완충액 (50 mM HEPES, 775 mM NaCl)에 의해 용리하였다. 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린 (DMPC) 그 자체, 및 DMPC 및 콜레스테롤 (1:1 몰비)의 리포좀을 SML 화합물 ChcMaPC (1-콜레스테릴카르보노일-2-미리스틸카르바모일-sn-글리세로-3-포스포콜린; SML1c) 리포좀의 누설 조사에서 양성 조절자로서 사용하였다. 칼세인 유리 등장성 완충액 (1600 mOsm) 및 50 mOsm 희석 완충액 (50mM HEPES)를 혼합하여 다양한 삼투 농도의 용액을 제조하였다. 이어서 37℃에서 10 μL의 리포좀을 990 μL의 시험 완충액과 혼합하여 리포좀을 다양한 삼투 농도의 용액에 노출시켰다. 517 nm (ext.: 494nm)에서 형광 신호 (signal)을, 퀀테크 (Quantech, 상표명) 형광계 (아이오와주 더뷰크 소재의 바른스테드/터몰린 (Barnstead/Thermolyne))를 사용하여 평형 5분 후에 읽었다. 이어서 100 μL의 10％ 트리톤 (Triton) X-100을 첨가하여 리포좀을 용해시켜 칼세인을 완전히 방출시켰다. 총 칼세인의 형광을 측정하고 100％ 신호 (F100％)로 사용하였다. 용해 전에 리포좀에 남아있는 칼세인의 분획은 1-(F신호-F블랭크)/(F100％-F블랭크)로 정의되고, 여기서 F신호는 샘플의 형광 세기이고 F블랭크는 등장성 완충액에서의 리포좀의 형광 세기이다. 결과를 도 3에 나타내었다.
삼투압의 구배 하에서 37℃로 ChcMaPC 및 DMPC/콜레스테롤 (1:1)의 누출을 모니터링하였다 (도 3). 리포좀 둘다는 DMPC 리포좀에 비교하여 유사한 삼투압 누출 프로파일 및 우수한 안정성을 나타냈다. 다른 SML은 ChcMaPC의 것에 대해 유사한 삼투압 누출 프로파일을 나타냈다. 따라서 SML 리포좀은 적어도 그의 함유량을 유지하고, 삼투압 구배 하에서 대응하는 콜레스테롤/디아실 지질 혼합물을 시험하였다.
실시예 18: 30％ 소태아 혈청 중 누출에 대한 SML -함유 리포좀의 평가
생리학적 환경은 생체 내 리포좀 약물 전달을 위한 또 다른 도전, 즉 리포좀 이중층으로부터 유리 콜레스테롤을 추출하여 누출시키는 혈청 단백질 및 생물학적 막의 경향을 나타낸다. 이 상호작용은 리포좀 표면을 PEG (폴리에틸렌 글리콜)으로 보호함으로써 크게 감소시킬 수 있다. SML 리포좀의 안정성 및 유지성을 시험하였다.
칼세인을 상기 기재된 방법으로 리포좀 내에 캡슐화하였다. 리포좀을 200 nm 막을 통해 압출하고, 유리 칼세인을 등삼투 용리액으로서 HEPES 완충액 (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, pH 7.4)을 이용하여 세파덱스 (Sephadex) G-50 컬럼을 통해 리포좀에 통과시킴으로써 제거하였다. 40％ 콜레스테롤 (몰％)를 함유하는 통상의 리포좀 제제를 장기 누출 검정에서 대조군으로서 이용하였다. 리포좀 시료의 부분 표본 (20 내지 50 μL)을 30％ 소태아 혈청으로 희석하여 총 부피를 2 mL로 하였다. 이어서 시료를 유리 튜브에 밀봉하고, 37℃로 인큐베이션하였다. 시료의 형광 강도를 상이한 시점에서 모니터링하고, 리포좀 내에 잔존하는 칼세인 분획물을 삼투압으로 유도된 누출과 동일한 방법으로 측정하였다. 시험된 SML은 이하를 포함하였다:
○ 1-콜레스테릴카르보노일-2-미리스틸카르바모일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML1c, ChcMaPC)
○ 1-스테아로일-2-콜레스테릴카르보노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML5a, SChcPC)
○ 1-콜레스테릴-2-미리스토일-rac-글리세로-3-포스포콜린 (SML3c, CheMPC)
○ 1-미리스토일-2-콜레스테릴카르보노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML5c, MChcPC).
대조군으로서 유리 콜레스테롤을 갖는 DSP (DSPC/Chol) 및 유리 콜레스테롤을 갖는 DMPC (DMPC/Chol)C의 리포좀을 제공하였다.
도 4에 나타낸 결과에서 보는 바와 같이, ChcMaPC 리포좀은 온전히 남아 있고, DSPC/콜레스테롤 리포좀의 내용물을 다음 4 주에 걸쳐 서서히 방출하였다. 2:1 몰비의 ChcSaPC 및 콜레스테롤로 이루어진 리포좀은 ChcMaPC의 것과 유사한 누출 프로파일을 나타냈다. ChcSaPC/콜레스테롤 (2:1) 및 DSPC/콜레스테롤 (1:1)의 리포좀은 동일한 비율의 콜레스테롤 (50％) 및 쇄 길이 (C-18)을 갖기 때문에, 그들의 누출 프로파일 차이는 주로 콜레스테롤이 이중층 중에 도입되는 방법으로부터 비롯되었다.
ChcMaPC 리포좀은 온전히 남아있고, DSPC/콜레스테롤 리포좀의 내용물을 시험된 4 주간에 걸쳐 방출하였다는 것을 놀라운 관찰 결과였다. 2:1 몰비의 ChcSaPC 및 콜레스테롤로 이루어진 리포좀은 ChcMaPC의 것과 유사한 누출 프로파일을 나타냈다. ChcSaPC/콜레스테롤 (2:1) 및 DSPC/콜레스테롤 (1:1)의 리포좀은 동일한 비율의 콜레스테롤 (50％) 및 쇄 길이 (C-18)을 갖기 때문에, 그들의 누출 프로파일 차이는 주로 콜레스테롤이 이중층 중에 도입되는 방법으로부터 비롯되었다. SML 중 공유 결합은 혈청 단백질로부터의 임의 형태의 비공유 친화성에 의해 이중층으로부터 콜레스테롤의 추출을 방지하기에 충분히 강했다.
이 결과는 여기에 개시된 화학식 I의 화합물이 통상의 리포좀에 비해 더 안정한 리포좀을 형성한다는 것을 나타낸다.
실시예 19: 콜레스테롤 교환의 분석
단일층상 리포좀을 압출법으로 제조하였다. 공여 리포좀은 40％ 콜레스테롤 (또는 SML로부터의 몰당량), 10％ 음전하의 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤 (DPPG), 및 50％ 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC)(또는 SML로부터의 몰당량)으로 이루어졌다. 구체적으로, 3개의 공여 리포좀을 하기의 몰비로 배합하였다: 1) PChcPC/DPPC/DPPG (50/40/10), 2) DChcPC/DPPC/DPPG (25/65/10), 3) Chol/DPPC/DPPG (40/50/10). 중성 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-프리오스포콜린 (POPC) 리포좀을 수용자로서 사용하였다. 압출 후, 공여 리포좀의 직경은 대략 100 nm이고, 수용 리포좀의 경우 140 nm이었다.
교환 실험의 경우, 1 mL 공여 리포좀 (10 mM) 및 1 mL 수용 리포좀 (100 mM, 10 배)을 먼저 37℃로 가온하고, 이어서 혼합하고 37℃로 인큐베이션하였다. 혼합물의 부분 표본 (250 μL)을 소정의 시점에서 샘플링하고 작은 (길이로 약 1 cm) 음이온 교환 컬럼 (Q-세파로스 (Sepharose) XL)에 적용하였다. 컬럼을 교환 시료의 충전 전에 0.1 mL의 10 mM POPC로 예비 적정하여, 중성 리포좀의 비특이 결합을 감소시켰다. 컬럼을 1 mL의 10 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7.4 완충액으로 용리하였다. 용리액을 동결 건조하고, 콜레스테롤 검정에 의해 분석하여, 교환된 콜레스테롤의 양을 정량화하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, DChcPC 또는 PChcPC을 함유하는 리포좀은 특히 Chol/DPPC/DPPG의 대조군 리포좀에 비해 매우 소량의 또는 거의 검출되지 않는 콜레스테롤의 교환을 가능하게 했다. 이 데이터는 SML 화합물 중 공유 결합된 콜레스테롤이 이중층으로부터 유의한 양으로 이동하지 않으며, 통상의 리포좀 내 유리 콜레스테롤은 콜레스테롤 교환에 대해 약 2 시간의 절반 시간이 걸린다는 것을 나타낸다.
따라서, 콜레스테롤 교환 실험의 결과는 또한 화학식 I의 화합물 중 공유 결합된 콜레스테롤이 유의 또는 검출가능한 수준으로 이중층으로부터 이동하지 않으며, 통상의 리포좀 내 유리 콜레스테롤은 콜레스테롤 교환에 대해 약 2 시간의 절반 시간이 걸린다는 것을 나타낸다.
실시예 20: 세포 독성 평가
SML 지질의 세포 독성을 표준 MTT (3-(4,5-디메틸티아졸릴-2)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 검정법에 의해 평가하였다. 간단히, C26 세포를 37℃에서 일정 시간 동안 다양한 농도의 지질과 인큐베이션하였다. 이후, 배지를 MTT 작업 시약으로 대체하고, 세포를 2 시간 더 인큐베이션하였다. 이후 시약을 신중히 제거하였다. 전환된 염료를 산성 이소프로판올에 용해시켰다. 염료의 흡수율을 570 nm에서 650 nm에서의 배경 제거법에 의해 측정하였다. 이후 세포 생존율 데이터를 처리된 세포와 비처리된 세포의 결과를 비교함으로써 얻었다. 선택된 SML 지질의 결과는 도 6에 요약하였다. 대부분의 SML은 1 mM만큼 높은 농도에서도 명백한 세포 독성을 나타내지 않았다. 카르바메이트 결합을 함유하는 일부 SML은 ChcPaPC 및 ChcSaPC과 같은 특정 세포 독성을 보였다. 따라서, R1, R2 및 화학식 I의 화합물의 결합 유형의 조합을 변경함으로써 SML의 독성을 조정하는 것이 가능하다.
실시예 21: 포스포리파아제 A2에 의한 약물 방출
레티노인산을 효소 촉발 약물 방출의 연구를 위한 모델 약물로서 사용하였다. SML7a (1-콜레스테릴-2-all-트랜스-레티노일-sn-글리세로포스포콜린)으로부터의 all-트랜스 레티노인산의 방출을 소, 나자 모삼비카 (naja mossambica), 및 스트렙토미세스 비알라세오루베르 (streptomyces vialaceoruber)를 포함하는 다양한 소스로부터 포스포리파아제 A2 (PLA2)에 의해 평가하였다. 모든 PLA2는 알드리치-시그마 (Aldrich-Sigma)제였다. 50 mL 둥근바닥 플라스크 중 SML7a (50 μmol)의 클로로포름 용액을 회전증발기로 증발시켰다. 플라스크를 고 진공 하에 밤새 두었다. 지질 필름을 20 mM 트리톤 (Triton) X-100, 10 mM CaCl2, 10 mM HEPES 및 50 mM KCl을 함유하는 10 mL의 pH 8.8 완충액에서 수화하였다. 실온에서 간헐적인 와류 10분 후 투명한 용액을 얻었다. 용액의 부분 표본 (250 μL)을 10 분간 37℃로 예비 인큐베이션한 후, PLA2 검정에 이용하였다. PLA2 용액의 부분 표본 (10 mM HEPES 및 50 mM KCl의 250 μL 중 25 유닛 pH 8.8 완충액)을 10 분간 37℃에서 예비 인큐베이션하고, SML7a의 예비 가온된 용액의 부분 표본과 혼합하였다. 상이한 시점에서, 가수분해 시료를 TLC로 분석하고, 밀도계로 정량화하였다. 결과를 도 7에 나타냈다. 3개의 PLA2 효소 모두는 SML7a로부터 all-트랜스 레티노인산을 완전히 방출할 수 있고, 나자 모삼비카에서의 PLA2가 가장 높은 활성을 나타냈다.
실시예 22: C26 결장암이 발병된 BALB /c 마우스에서 각종 조성물의 리포좀 내 캡슐화된 독소루비신의 암 진행 및 동물 생존율에 대한 효과의 비교
약물 담체로서 SML-함유 리포좀의 일반적인 이용을 입증하기 위해, 항암 약물을 각종 스테롤포스포리피드를 함유한 다수의 리포좀 조성물 중에 캡슐화하였다. 암 진행 및 동물 생존율에 대한 이 제제의 효과를 비캡슐화된 독소루비신 또는 독실™ (Doxil™)(C26 결장암이 발병된 BALB/c 마우스에 있어서 식약청이 승인한 독소루비신의 시판용 리포좀 제제)의 효과에 대해 비교하였다 (도 8 및 9, 표 3).
비히클 PBS을 함유하는 비-약물로 처리된 이 모델 동물은 22일의 평균 생존기간을 가지며, 어떤 동물도 60일까지 생존하지는 않았다 (표 3). 최대 내성 용량의 비캡슐화된 독소루비신 (10 mg/kg 체중)으로 처리한 동물은 26일의 평균 생존기간을 가지며, 어떤 동물도 60일까지 생존하지는 않았다. 독실™ 15 mg/kg으로 처리된 동물은 평균 생존기간이 60일보다 길고, 5 마리 중 4 마리의 동물이 60일까지 생존했다. 제제 DCHEMSPC-DSPC-PEGDSPE2000-αT, 33:61.8:5.0:0.2를 함유하는 디-스테롤 중 독소루비신을 15 mg/kg 처리한 동물은 평균 생존기간이 60일보다 길고, 5 마리 중 5 마리가 60일까지 생존했다 (표 3). 제제를 함유하는 각종 스테로일 지질에 캡슐화된 독소루비신은 스테로일 지질을 함유하지 않는 현재 승인된 지질 제제만큼 우수하거나 보다 더 우수한 C26 결장암 모델에서의 현저한 치료 효과를 제공하였다.
모든 합성 인지질은 아반티 폴라 리피드 (알라바마주 버밍햄 소재)로부터 구입하였다. SML 인지질을 상기 기재한 바와 같이 합성하였다. 콜레스테롤 (Chol)은 시그마 케미칼 컴퍼니 (Sigma Chemical Co., 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 구입하였다. 도웩스 (Dowex) 50WX4 수지는 알드리치 (위스콘신주 밀워키 소재)로부터 구입하였다. 독소루비신 (DOX)은 벨포드 래보레이토리스 (Bedford Laboratories, 오하이오주 벨포드 소재)로부터 구입하였다. 배양 배지 (Earle's BSS (EBSS)를 함유한 MEM Eagle's)를 UCSF 셀 컬쳐 퍼실러티 (UCSF Cell Culture Facility)로부터 구입하였다. 모든 다른 시약은 분석 등급의 것이었다. 용액을 0.2 마이크로미터의 멸균막을 통해 멸균 용기로 여과하였다. 모든 용액은 멸균되어 있고 발열원이 없었다.
규정된 크기의 약물 로딩된 리포좀을 당업계에 공지된 방법으로 제조하고, 또한 예를 들어 문헌[Liposomes: 2nd edition, Oxford University Press, 2003, V. Torchilin and V. Weissig., Ed.]에 기재된 방법에 의해 제조하였다. 지질 필름을 실온에서 회전식 증발기를 이용하여 유리 튜브 내 감압 하에 클로로포름 중에 용해된 지질 혼합물 10 마이크로몰을 건조시킨 후, 고 진공에 밤새 노출시켜 제조하였다. 나사-뚜껑이 있는 유리 튜브에서 멸균 250 mM 황산암모늄 용액 중에 지질의 전이 온도 이상으로 얇은 지질 필름을 다시 수화시킨 후, 60℃로 10 분간 배쓰형 초음파기에서 초음파 분해하여 리포좀을 제조하였다. 이후 리포좀 제제를 0.1 마이크로미터의 폴리카보네이트 막을 통해 압출하였다. 비캡슐화된 황산암모늄을 4℃에서 24 시간 동안 한 번 변경된 5％ 글루코스의 100 배 부피에 대해서 투석에 의해 제거하였다. 5％ 글루코스 중에 용해된 독소루비신의 용액을 리포좀을 함유하는 황산암모늄에 의해 60℃에서 2 시간 동안 인큐베이션함으로써 독소루비신을 캡슐화하였다. 비캡슐화된 독소루비신을 도웩스 50WX4를 함유하는 컬럼을 통해 제제를 통과시킴으로써 리포좀으로부터 제거하였다. 캡슐화 효율은 약 100 μg/μmol 총 지질의 약물:인지질 비로 통상 70％ 초과였다. 멀티모드 프로그램을 이용하여 동적 광산란법에 의해 측정된 평균 소포 직경은 단순 분산 입자 크기 분포로 85 내지 140 nm 범위에 있다 (말베른 인스트루먼츠 (Malvern Instruments), 영국 소재). 리포좀 캡슐화된 독소루비신 제제를 멸균 0.2 마이크로미터 막을 통해 15 mL 멸균 원뿔형 원심분리기 튜브로 여과하고, 동물에게 주사하기 전까지 40℃로 저장하였다.
모든 동물 실험을 샌프란시스코 소재 캘리포니아 대학의 동물 연구 위원회에 의해 승인된 조약 하의 동물 연구를 위한 NIH 지침서에 따라서 수행하였다. 모든 화학요법 실험의 경우, 0일부터, BALB/c 마우스의 오른쪽 옆구리에 C26 암 세포 (마우스당 4 x 105 세포)의 피하 주사를 주입하고, 이후 그룹당 5 마리를 임의 추출하여 순서를 정하였다. 마우스 무게를 재고, 실험 기간 동안 종양 크기를 매일 모니터링하였다. 종양 부피를 3 개의 직교 직경 (a, b 및 c)을 캘리퍼스에 의해 측정하고, 부피를 (α x b x c) x 0.5 cm3로서 계산함으로써 평가하였다. 바로 감지할 수 있는 종양은 1 mm x 1 mm x 1 mm로서 정의하였다. 각각의 실험에서, 마우스는 60일 후-인큐베이션까지 또는 이하 안락사의 조건 중 하나를 만족시킬 때까지 모니터링하였다: 1) 그의 체중이 그의 초기 무게의 15％ 미만으로 감소된 경우; 2) 그의 종양이 임의 치수에 걸쳐서 2.0 cm보다 큰 경우; 3) 그들이 혼수상태이거나 아프고 먹지 못하게 된 경우; 또는 4) 그들이 죽은 채로 발견되는 경우. 60일째에 생존한 모든 마우스를 안락사시켰다; 그러나, 임의의 생존 마우스가 60일째에 감지할 수 있는 종양을 가진 경우, 실험에 존재하는 모든 마우스의 모니터링을 마우스를 안락사시키는 시점이 되는 90일까지 계속하였다. 60일까지 생존한 모든 동물은 90일까지도 생존하였다.
<표 3>
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제제 성분의 몰비는 하기 각각의 제제에 나타냈다. DCHEMSPC=SML6b; DSPC=디스테아로일포스파티딜콜린; PEGDSPE=1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올-아민-N-[폴리-(에틸렌글리콜)-2000]; αT=α-토코페롤; SeCHcPC=1-스테아릴-2-콜레스테릴카르보노일-rac-글리세로-S-포스포콜린.
실시예 23: 리포좀 캡슐화된 암포테리신 B
선택된 SML을 암포테리신 B의 캡슐화에 대해 평가하였다. SML을 대응하는 디아실 PC (동일한 쇄 길이)와 배합하여 암포테리신 B를 다양한 비로 캡슐화하였다. 우선, 소정의 비로 SML/디아실 PC 지질 혼합물의 클로로포름 용액을 증발시키고, 지질 필름을 고 진공 하에 밤새 두었다. 소정량의 암포테리신 B DMSO 용액 (20 mg/mL)을 이후 지질 필름에 가한 후, pH 7.4 PBS를 가하였다. 혼합물을 아르곤 하에 1 시간 동안 60℃에서 초음파처리하였다. 이어서 혼합물을 pH 7.4 PBS으로 투석하였다. 얻어진 황색 용액을 220 nm 막을 통해 여과시킴으로써 멸균하였다. 생성물을 앞으로의 연구를 위해 4℃로 저장하였다. 암포테리신 B를 SML과 적절하게, 예를 들어 SML:PC:AmB=2:2:1 (몰)로 배합하고, 대부분의 제제는 PeChcPC, MeChcPC, SChcPC 및 PChcPC을 함유하는 제제와 같이 1년 넘는 동안에 4℃에서 안정적이었다. 이러한 결과는 암포테리신 B의 캡슐화에 대해서도 SML에 의해 최적화된 제제를 달성할 수 있다는 것을 나타냈다.
실시예 24: 단백질 전달을 위한 리포좀
특정 치료용 단백질은 리포좀 표면에 결합가능하다. 이는 리포좀 단백질 착체를 동물에게 주사하는 경우, 단백질을 안정화하고 순환 시간을 길게 할 수 있다. 예를 들어, 재조합형 FVIII는 외부 리포좀 표면에 비공유적이지만 높은 친화도로 결합한다. 인자 VIII는, 90％ (wt/wt) 팔미토일올레오일-포스파티딜콜린 (POPC) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올-아민-N-[폴리-(에틸렌글리콜)-2000] (DSPE-PEG 2000) (97:3) 몰비로 이루어지며 50-mM 시트르산나트륨 완충액 (9％ wt/vol 용액)에 현탁된 합성 페길화 리포좀에 의해 재구성되는 경우, 인자 VIII의 순환 시간을 연장시키고 예비 임상 모델 및 인간에 있어서 출혈을 감소시키는 데 이용되어 왔다. 이 제제는 콜레스테롤의 부재하에 순환으로부터 너무 빠르게 제거되기 때문에 최적 상태가 아니다.
단백질 전달을 나타내는 안정화된 SML 리포좀 제제는 이하와 같다. 각각 실시예 3에 기재된 바와 같이 합성된 SML3d 및 DSPE-PEG 2000 (아반티 폴라 리피드)가 97:3 몰비로 이루어지는 SML 리포좀 제제는, 100 마이크로몰의 지질 혼합물을 50 mM 시트르산나트륨 pH 7.0에 재현탁시킨 것을 제외하고는, 독소루비신 실시예에 기재된 바와 같이 제조하였다. 1 mL의 단층 SML3d-DSPE-PEG2000 리포좀을 100 IU 유닛의 재조합형 인자 VIII (코게네이트 (Kogenate) FS (바이엘 헬스케어 파마수티컬스 (Bayer HealthCare Pharmaceuticals), 버클리 소재))와 혼합하였다. SML3d-DSPE-PEG2000 리포좀 제제는 인자 VIII을 배합하는 경우, 팔미토일올레일-포스파티딜콜린 (POPC) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올-아민-N-[폴리-(에틸렌글리콜)-2000] (DSPE-PEG 2000) (97:3 몰비)와 같은 콜레스테롤이 결핍된 제제가 제공하는 것보다 더 안정한 리포좀을 제공한다. SML3d-DSPE-PEG2000 리포좀을 이용하여 인자 VIII의 생체 내 활성을 향상시킨다.
단백질은 활성을 저해하지 않으면서 SML 리포좀을 갖는 안정한 입자를 형성할 수 있다. 폴리히스티딘 태그를 갖는 단백질을 문헌[Bioconj. Chem. 2006, 17, 1592-1600]에 기재된 DOD-트리-NTA과 같은 지질-트리-니트릴로트리아세트산을 통해 SML 리포좀에 고정시켰다. 대표적인 제제는 5％ DOD-트리-NTA, 50％ 디아실 포스포콜린 및 45％ m-SML을 포함한다. 단백질을 NTA-Ni-히스티딘 상호작용을 통해 리포좀에 도입한다. 단백질 로딩된 리포좀을 크기 배제 컬럼에 통과시켜 정제하였다. 이후 제제 안정성 및 단백질 활성을 적절한 방법으로 평가하였다.
실시예 25: 과다콜레스테롤에 대한 SML 의 사용
β-시토스테롤 및 β-스티그마스테롤과 같은 식물스테롤은 인체에서 콜레스테롤 흡수를 억제하고 혈장 콜레스테롤 수준을 감소시킨다고 알려져 있다. β-시토스테롤을 함유하는 SML은 과다콜레스테롤의 치료에 유용하다.
β-시토스테롤을 함유하는 SML은 음식 첨가제, 또는 혈중 콜레스테롤 수준을 낮추는 것을 보조하기 위한 주사제로서 배합한다. 예를 들어, SML 디스테롤 지질 SML6d를 tert-부탄올에 30 mg/mL의 농도로 용해시킨 후 0.1 마이크로미터 유리 필터에 통과시켜 여과에 의해 멸균하였다. 지질 용액을 -70℃로 얼린 후 동결 건조기에서 24 시간 동안 동결 건조하여 완전히 건조시켰다. 건조 지질 분말 (150 mg)을 30 mg 펙틴, 42 mg 칼슘 (디-칼슘 포스페이트로서), 26 mg 인 (디-칼슘 포스페이트로서) 및 미세결정 셀룰로오스와 혼합하였다. 건조 분말을 젤라틴 캡슐에 충전하여 디시토스테롤포스파티딜콜린 150 mg의 투여량을 제공하였다. 식사 직전에 이 시토스테롤 유도체를 경구 복용하는 경우를 이용하여 콜레스테롤 흡수를 억제할 수 있다.
실시예 26: SML 을 이용한 마이크로버블의 제조
마이크로버블은 지질 단층에 의해 안정화되는 기체 충전된 버블이다. 과거 마이크로버블은 콜레스테롤이 없는 합성 인지질 혼합물로 제조해 왔다. 이는 마이크로버블이 생물학적 막과 지질단백질에 접촉해 있는 경우 콜레스테롤이 빠르게 단층을 떠나기 때문이다: 이는 마이크로버블을 불안정하게 한다.
SML은 마이크로버블의 제제 중에 이용할 수 있다. SML로부터 제조된 리포좀은 혈청의 존재 하에 증가된 함량 유지율을 가졌다 (실시예 18). 마이크로버블을 데카플루오로부탄으로부터 제조하고, SML4a (실시예 4) 및 PEG-DSPE-2000 (아반티 폴라 리피즈, 알라바마주 알바스터 소재)의 혼합물이 90:10의 몰비로 구성된 단층에 의해 안정화한다. 클로로포름 중 적절량의 SML4a, PEG-DSPE-2000 (90:10, 몰비)을 유리 시험 튜브에 첨가하였다. 클로로포름을 N2 하에서 제거하고, 2 시간 이상 진공 하에서 증발시켰다. 100 mM 트리스 (pH 7.4):글리세롤:프로필렌글리콜 (80:10:10, 부피비)로 이루어지는 완충 희석제를 건조된 지질에 첨가하여 지질 농도 1 mM (1 mg/mL)을 만들었다. 지질 현탁액을 지질의 상 전이 온도 (60℃) 이상에서 잘 혼합하여 다중층상 소포의 우윳빛 용액을 형성하였다. 현탁액을 배쓰형 초음파기 (20 kHz, 100 W, 10 분)를 이용하여 초음파처리하여 투명하게 하였다. 최종 농도 1 mg/mL의 리포좀 용액을 1 mL 양으로 2-mL 바이알로 부분 표본화하였다. 이후, 10 cm3의 데카플루오로부탄 기체 (플루라 (Flura), 미국 테네시주 뉴포트 소재)를 고무 마개를 통해 바이알로 서서히 주입하고, 환기구로서 바늘 (20G1, 단사면, 벡톤-디킨슨 (Becton-Dickinson))을 이용하여 공기를 교환하였다. 바이알을 알루미늄 밀봉을 이용하여 고무 마개 상에 즉시 캡핑하였다. 데카플루오로부탄 공간 부분을 갖는 리포좀 용액 함유 밀봉 바이알을 사용 전까지 4℃로 저장할 수 있다. 마이크로버블은 바이오헤드 쉐이커를 이용하여 리포좀 용액의 바이알의 기계 교반을 통해 형성하였다. 45 초간 바이알을 진탕하면, 용액은 우윳빛이 되고, 3-mL 시린지로 뽑고, 10 mM 인산염 완충 염수 (PBS, pH 7.4)를 이용하여 3 mL의 최종 부피로 희석할 수 있다. 리포좀 (마이크로버블로 도입되지 않음) 및 서브-마이크로 크기의 버블을 3 분간 300 x g으로 부유에 의해 용액으로부터 제거할 수 있다.
화합물 SML4a를 함유하는 조성물로부터 형성된 마이크로버블을 이후 동물의 규정된 위치에 초음파 파괴를 이용하여 분자의 영상화 또는 전달을 위해 주사할 수 있었다. 물리화학적 특성의 범위에 의한 SML의 이용가능성은 정확히 제어된 특성을 갖는 마이크로버블의 제제를 가능하게 하였다.
실시예 27: 폴리디아세틸렌 소포 또는 화합물 SML9A 로부터 제조된 단 층을 이용하는 진단 검정대
이중층 소포로 폴리디아세틸렌을 형성하는 리포좀 기재 색체계 검정은, 중합된 소포의 표면으로 도입된 수용체에 대한 분석물질의 결합시에 폴리디아세틸렌 물질의 흡수 스펙트럼에서의 큰 이동으로 인해, 진단 검정의 사용 시점에 대해 제안되어 있다. 이 검정의 감도는 폴리디아세틸렌의 중합체의 길이 및 그의 배향에 의존한다. 본 발명에서 통상 이용하는 조성물은 10,12-트리코사디이논산 (TRCDA)과 혼합한 미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC)과 같은 합성 인지질로 이루어진다. TRCDA 및 DMPC의 스탁 용액을 염화메틸렌 중에 6/4 몰비로 제조하였다. 이 조성물로부터 제조된 리포좀을 계속해서 휴대용 UV 램프 하에 254 nm에서 중합하였다. 이 조성물은 유체로부터의 단백질이 리포좀 표면과 상호작용하고 비특이적 색채 변화를 초래하기 때문에 다수의 생물학적 유체에서의 사용에 적절하지 않았다. 유리 콜레스테롤을 이 혼합물 내에 포함시켜 단백질 흡수율을 감소시키려는 시도는, TRCDA의 중합시, 콜레스테롤 상이 분리하여 분석물질에 대해 반응하는 리포좀의 잠재력을 위태롭게 하기 때문에 만족스럽지 못했다. 상기 조성물 중 DMPC는 SML2c로 대체되어 더 안정한 TRCDA 조성물을 제공하였다.
또 다른 접근법은 실시예 9에 기재된 SML 화합물 SML9a를 사용하여 안정성을 향상시키는 것이었다. SML9a는 포스파티딜콜린 헤드기를 함유하는 콜레스테롤에 부착된 중합가능한 트리코사디이논산을 함유하였다. 리포좀 이중층에서, TRCDA를 인접한 콜레스테롤에 의해 순조롭게 배향하여 중합을 용이하게 하였다. 중합시 콜레스테롤을 상 분리할 수 없었는데, 이것이 인지질에 부착되어 있기 때문이었다. SML9a 지질을 클로로포름 용액으로부터 97/3 몰비로 강글리오시드 GM1와 같은 지질-결합 수용체와 함께 유리 튜브의 측면 상으로 건조시키고, 용매를 증발시켰다. 인산염 완충 염수를 건조된 지질 혼합물 (최종 농도, 1 mM 총 지질)에 첨가하고 배쓰형 초음파처리를 수행하였다. 지질이 주요 상 전이 온도를 초과하는 것을 보장하기 위해서 시료를 초음파처리시 45℃로 가열하였다. SML 중 공유 부착된 콜레스테롤의 존재로 인해, 리포좀의 생성을 저온에서 행할 수 있다; 이는 검정에 포함될 수 있는 다수의 생물학적 표적 (예를 들어, 수용체)의 안정성에 중요하다.
SML 리포좀 제제를 가온된 채로 0.8 μM 폴리카보네이트 막을 통해 여과하고, 4℃로 밤새 저장하였다. 시료를 실온에 두고, 254 nm광 휴대용 UV 램프를 이용하여 중합함으로써, 중합된 소포의 감청색/회색 용액을 얻었다. 장독소가 GM1에 결합하기 때문에, 이 중합된 모노스테롤 SML 리포좀 조성물을 이용하여 생물학적 유체 중 대장균 장독소의 존재를 검출할 수 있다. SML 중 공유 부착된 콜레스테롤 잔기는 생체상 (biophase)에서 확인되는 단백질의 삽입으로부터 중합된 리포좀을 안정화시키고, 유리 콜레스테롤 의지로서 생체상에서 리포좀으로부터 생체막으로 이동하지 않았다. 따라서 SML은 더 민감하고 더 안정한 진단 시스템 사용 시점을 가능하게 한다.
실시예 28: 활기를 되찾게 하는 헤어 컨디셔너를 위한 모노스테롤 SML 의 이용
인지질 및 콜레스테롤은 인체의 필수 요소이며, 피부 및 모발에 영양분 공급, 수분 공급, 청결 및 컨디셔닝하는 개인 관리 제품의 통상의 성분이다. 모노 및 디스테롤 SML 글리세로리피드 및 SML 스핑고리피드는 하나의 분자에서 이들 두 가지 주요 성분을 결합하였다. 이들은 또한 생분해성 또는 생안정성 버전을 제공한다.
이 실시예에서, 헤어 컨디셔닝 조성물은 모두 중량％로 첨가된 하기 성분으로부터 제조하였다: 물 86.6％, 히드록시에틸 셀룰로스 0.7％, 글리세롤 디스테아레이트 0.7％, 세틸 알콜 2.0％, SML 화합물 SML4d (실시예 4) 10％. 이 혼합물을 제조하기 위해서, 히드록시에틸 셀룰로스를 고속의 일정한 교반 조건 하에서 물에 가하고, 60℃로 가열하였다. 계속 교반하면서 나머지 성분을 가하고 온도를 70℃로 증가시켰다. 착색제, 방향제 및 항균제를 이 시점에 가할 수 있다. 성분이 만족스러운 농도의 부드러운 유체를 형성할 때까지 혼합물을 교반하였다. 조성물을 실온으로 냉각시켰다. 이 헤어 컨디셔너를 모발에 적용하여 건강하고 만족스러운 외관을 제공하였다. 본 발명에서 이용된 에테르 결합된 모노스테롤 SML은 장기간의 유통 기한 및 제제에서의 각종 성분들의 우수한 혼합을 제공한다.
실시예 29: 모노스테롤 및 디스테롤 SML 을 이용하는 나노에멀젼
나노에멀젼 또는 서브-마이크로 에멀젼은 평균 액적 직경 50 내지 1000 nm 범위의 수중유 에멀젼이다. 통상, 평균 액적 크기는 100 내지 500 nm이다. 통상, 나노에멀젼은 0.5 내지 2％ 달걀 또는 대두 렉시틴으로 안정화된 10 내지 20％ 오일을 함유한다. 이 실시예에 기재된 SML은 유리 콜레스테롤이 가능한 바와 같이 스테롤 성분을 양친매성 헤드기로부터 상 분리되는 것을 방지하는 이상적인 유화제이다.
이 실시예에서 SML 나노에멀젼의 제조는 고압 균질 및 SML 화합물 SML5d를 이용하였다. 형성된 입자는 인지질의 일분자층에 의해 주변 수성 상으로부터 분리된 액상 친유성 코어를 나타낸다. 이와 같은 렉시틴 안정화 오일 액적의 구조는 유미입자에 비교할 수 있다. 이에 따라 나노에멀젼은 리포좀과 상이하며, 인지질 이중층은 친수성 외부 상으로부터 수성 코어를 분리하였다. 별법으로, 과량의 인지질로 제조된 나노에멀젼은 동시에 리포좀을 형성할 수 있다.
피부 관리 목적의 나노에멀젼은 생분해성 SML과 배합할 수 있다. 예를 들어, SML이 시간에 걸쳐 가수분해됨에 따라 SML5d는 콜레스테롤 및 올레인산을 생성하고, 이후 피부 관리 제품에 이용할 수 있다. 이하 표 4는 SML 나노에멀젼 피부 관리 조성물을 나타낸다.
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상기 피부 관리 제제의 변경은 상기 제제 (표 4) 중 1 중량％의 SML5d 지질 (실시예 5)을 1％의 SML7a (실시예 7)로 대체시키는 것이다. SML7a 지질은 트랜스-레티노인산의 지속적인 방출 형태를 갖는 피부 관리 조성물을 제공하였다. 이 이후의 피부 관리 제제는 피부가 활기를 되찾게 하고 주름을 제거하는 데 이용할 수 있다.
실시예 30: 동일한 리포좀으로부터 2종 이상의 약물의 캡슐화 및 전달
약물 조합의 이용은 임상 암 치료에서 널리 채택된 전략이다. 상이한 약물 비에서 약물 상호작용은 시험관 내에서 체계적으로 연구될 수 있지만, 이 비는 상이한 약물의 상이한 약동학적 특성으로 인해 생체 내에서 용이하게 해석되지 않을 수 있다. 리포좀으로의 2종 약물의 공캡슐화는 약물을 안정하게 내부에 포착할 수 있는 경우 약물의 분포를 "동시발생 (synchronize)"시킬 수 있다. 이는 이론적으로 생체 내에 대한 시험관 내 결과의 더 직접적인 해석을 가능하게 한다. 그러나, 불량한 안정성 및 표준 리포좀으로부터 물질 누출이 있다면, 캡슐화된 약물을 상이한 속도로 방출할 수 있어, 유효한 유리 약물 농도를 예측하기 곤란할 수 있다.
이 실시예에서, 안정화된 SML 리포좀은 각종 약물 조합의 제어되고 동시발생되는 방출에 이용된다. 상기에서 입증된 바와 같이, 시험관 내 조건 하에서 SML-기재 인지질 SML1c (ChcMaPC)으로부터 제조된 DMPC/유리 콜레스테롤 조성물 및 리포좀 간의 모델 화합물의 삼투 유도 방출에서 차이는 없다. 그러나, 시험관 내 조건을 모방한 조건 하에서, SML-기재 SML1c 리포좀으로부터 28일에 1％ 미만의 누출에 비하여, DMPC/유리 콜레스테롤 조성물로부터 7일까지 80％ 이하의 누출로부터, 30％ 소태아 혈청의 존재 하에 칼세인의 방출에서 실질적인 차이가 있다 (도 4). 따라서, 시험관 내 데이터로부터 생체 내 방출을 더 우수하게 예측하는 것을 비롯하여, SML로 이루어지는 리포좀 내의 2종 약물의 공캡슐화는 시험관 내 방출과 생체 내 방출 간의 차이를 크게 감소시킬 수 있다.
하기 2종의 약물 조합의 안정한 공캡슐화는 SML로부터 제조된 리포좀으로부터 생체내로 그들의 전달을 동시에 발생시킨다: 이리노테칸/플루옥수리딘, 다우노루비신/시타라빈, 시스플라틴/다우노루비신, 시스플라틴/독소루비신, 비노렐빈/시스플라틴, 단백질 키나제 억제제/독소루비신, 미트라마이신/질소 머스터드, 파클리탁셀/토포테칸, 7-히드록시스타우로스포린/캄프토테신, 류코보린/5-플루오로우라실, 루코보린/플루오로오로트산, 메르캅토푸린/사이토신 아라비노시드, 비노렐빈/파클리탁셀, 비노렐빈/독소루비신, 사이토신 아라비노시드/시스플라틴, 레베르사트롤/사이토신 아라비노시드, 카르보플라틴/검시토빈, 토포테칸/시스플라틴 또는 siRNA 또는 기타 올리고뉴클레오티드와 약물의 배합물. 상기 약물은 그들의 공지된 생체내 유효 투여량 및 캡슐화된 약물을 방출된 약물로부터 크기 배제 크로마토그래피 상에서 분리함으로써 결정된 시험관내 방출 프로파일에 따라 공캡슐화한다.
실시예 31 폐 약물 전달용 SMLS 로 이루어진 리포좀 .
폐내 약물 전달 시스템은 천식, 기종과 같은 호흡기 장애, 그람 음성 박테리아 감염 및 진균 감염의 치료를 위한 약물의 전달에 수년간 사용되어 왔다. 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)을 앓는 환자에게 토브라마이신과 같은 아미노글리코시드를 전달하는 것은 CF 환자에 있어서 항박테리아성 치료의 중심이 되었다. 진보된 기술은 식균 작용, 입자 크기 최적화 및 분해의 문제를 극복하여 거대한 면적의 폐를 이용하여 약물을 혈관으로 전달 가능하게 하였다. 폐는 위장관을 우회하는 것이 필요한 약물, 예컨대 인슐린과 같은 단백질의 가장 좋은 대안으로 여겨진다.
상기와 같이 매우 요구되는 것임에도 불구하고, 폐로의 전달을 위한 캡슐화된 리포좀은 승인된 것이 없다. 폐내 약물 전달용 리포좀을 사용하지 않는 이유는 폐가 현재 사용되는 합성 지질로 제조된 리포좀을 붕괴시킬 수 있는 계면활성제로 채워져 있기 때문이다. 유리 콜레스테롤은 리포좀으로부터 폐 계면활성제로 빠르게 교환되기 때문에, 유리 콜레스테롤을 사용하여 현재 리포좀을 안정화시킬 수 없다.
본원에 기재된 SML 화합물은 폐 계면활성제에 의한 리포좀 붕괴의 문제를 피할 수 있으면서, 또한 리포좀을 빠져나와 폐로 약물이 제어 방출되는 것을 가능하게 한다.
본 실시예에서, 암포테리신 B를 함유하는 SML 리포좀은 실시예 23에 기재된 SML 및 디아실포스포리피드의 혼합물로부터, 당업계에 널리 공지되어 있는, 예를 들어 문헌 [Liposomes : 2 nd edition, Oxford University Press, 2003, V. Torchilin and V. Weissig., Ed.]에 기재된 방법으로 제조하였다. 암포테리신 B 로딩된 SML 리포좀을 아스페르길루스증 (aspergillosis)과 같은 진균 감염의 치료법으로서, 시험 동물 또는 환자의 폐로 에어로졸화 하였다. 또 다른 실시예에서, 실시예 23에 기재된 제제에 따라 제조된 암포테리신 B 로딩된 SML 리포좀을 동결 건조하거나 냉동 건조하여, 건조 분말로 폐에 전달하였다. 이는 환자에게 보다 간편한 투여 형태이고, 보다 안정한 투여 형태이기 때문에 특히 유용하다.
또 다른 실시예에서, 실시예 6에 기재된 디스테롤 SML 리피드를 사용하여 폐 계면활성제의 존재하에 안정한 항생제 로딩된 리포좀을 제조하였다. 토브라마이신 또는 시프로플록사신과 같은 항생제를 상기 목적을 위해 사용할 수 있다. 리포좀은 순수한 SML6b 또는 SML6b 및 각종 합성 디아실포스포리피드, 예컨대 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC) 또는 디스테아로일포스파티딜에탄올아민-PEG2000 (PEG-DSPE-2000)의 조합물로부터 제조할 수 있다. 규정된 크기의 리포좀은 당업계에 널리 공지된, 예를 들어 문헌 [Liposomes : 2 nd edition, Oxford University Press, 2003, V. Torchilin and V. Weissig., Ed.]에 기재된 방법으로 제조하였다. 지질 필름은 클로로포름 중에 용해된 100 μmol의 지질 혼합물을 실온에서 회전식 증발기를 사용하여 유리 튜브 내에서 감압하에 건조한 후, 고진공에 밤새 노출시켜 제조하였다. 구체적인 조성은 95 μmol의 SML6b 및 5 μmol의 DSPE-PEG 또는 40 μmol의 SML6b, 55 μmol의 DSPC 및 5 μmol의 PEG-DSPE-2000 또는 SML2a 및 5 μmol의 PEG-DSPE-2000이다. 리포좀은 스크류 캡핑된 유리 튜브에서 멸균한 200 mg/mL 토브라마이신 용액 중에 지질의 전이 온도보다 높은 온도에서 박막의 지질 필름을 재수화시킨 후, 60℃에서 10분 동안 배쓰형 초음파처리기에서 초음파처리하여 제조하였다. 이후에 리포좀 조제 물질을 0.1 마이크로미터 폴리카보네이트 막을 통해 압출하였다. 비캡슐화된 토브라마이신은 4℃에서 100-배 부피의 50 mM 트리스/HCL pH 7.4에 대해, 24 시간 간격으로 1회 변경하여 투석으로 제거하였다. 캡슐화율은 보통 10％를 초과하고, 약물:인지질 비율이 대략 200 μg/μmol 총 지질이다. 동적 광산란 (맬번 인스트루먼츠, UK 소재)에 의해 측정한 소포 평균 직경은 선택된 제제에 따라 100 nm 내지 150 nm 범위이다. 리포좀 캡슐화 토브라마이신 조제 물질은 멸균한 0.2 마이크로미터 막을 통해 15 mL 멸균한 코니칼 원심분리기 튜브로 여과하고 시험 동물에게 에어로졸화할 때까지 4℃에서 저장하였다. 본 조성물의 제약상 허용되는 제제는 환자에게 에어로졸화 할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 카르니틴계 SML 화합물 (실시예 11)로부터 제조된 양이온성 지질 제제를 사용하여 음이온성 올리고뉴클레오티드, 예컨대 siRNA 또는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA와 복합체를 형성하였다. 지질 필름은 클로로포름 중에 용해된 100 μmol의 지질 혼합물을 실온에서 회전식 증발기를 사용하여 유리 튜브 내에서 감압하에 건조한 후, 고진공에 밤새 노출시켜 제조하였다. 구체적인 조성은 30 μmol의 SML6a 및 70 μmol의 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP)이다. 리포좀은 스크류 캡핑된 유리 튜브에서 멸균한 10 mM 트리스/HCl pH 7.0 중에 지질의 전이 온도보다 높은 온도에서 박막의 지질 필름을 재수화시킨 후, 25℃에서 10분 동안 배쓰형 초음파처리기에서 초음파처리하여 제조하였다. 이후에 리포좀 조제 물질을 0.1 마이크로미터 폴리카보네이트 막을 통해 압출하였다. 전달되는 핵산은 트리메틸암모늄기 대 핵산 포스페이트기를 3/1의 몰비로 리포좀 조제 물질과 혼합하였다. 이와 같은 조건 하에서 대부분의 핵산은 지질 입자와 결합되었다. 동적 광산란 (맬번 인스트루먼츠, UK 소재)으로 측정한 평균 직경은 선택된 제제에 따라, 100 nm 내지 200 nm 범위이다. 리포좀 결합 핵산 제조 물질은 멸균한 0.4 마이크로미터 막을 통해 멸균한 15 mL 코니칼 원심분리기 튜브로 여과하고 동물에게 에어로졸할 때까지 4℃에서 저장하였다. 상기 제제 또는 이들의 제약상 허용되는 제제는 폴리뉴클레오티드 또는 siRNA를 시험 동물 또는 환자의 폐로 전달하기 적합하다.
실시예 32 백신 유도를 위한 항원 전달용 SMLS 및, SML 및 비- SML 지질의 혼합물로 이루어진 리포좀 및 지질 입자
SML 화합물은 높은 유동성은 유지하면서 체액내에서 뛰어난 안정성을 갖는다. 이와 같은 특성으로 인해 이들은 항원을 전달하는 우수한 후보 물질이 된다.
한 실시예에서, 백신 적용을 위한 SML계 제제는 SML8a (실시예 8) 및 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP)을 1/1의 몰비율로 혼합하여 제조하였다. 또 다른 실시예에서, 양이온성 카르니틴 기재의 SML (SML11a)을 DOTAP 대시에 치환하였다. 지질 필름은 클로로포름 중에 용해된 100 μmol의 지질 혼합물을 실온에서 회전식 증발기를 사용하여 유리 튜브 내에서 감압하에 건조한 후, 고진공에 밤새 노출시켜 제조하였다. 리포좀은 스크류 캡핑된 유리 튜브에서 멸균한 10 mM 트리스/HCl, pH 7.0 중에 지질의 전이 온도보다 높은 온도에서 박막의 지질 필름을 재수화시킨 후, 25℃에서 10분 동안 배쓰형 초음파처리기에서 초음파처리하여 제조하였다. 이후에 리포좀 조제 물질을 0.1 마이크로미터 폴리카보네이트 막을 통해 압출하였다. 항원으로 알려져 있는, 단백질 또는 펩타이트 에피토프를 30/1의 지질/항원 내지 1/1의 지질/항원의 다양한 중량 비율로 리포좀 조제 물질과 혼합하였다. 항원이 최종적으로 음전하를 갖는 경우 (항원의 등전점에 의존함), 항원은 양이온성 SML 제제를 포함하는 지질 입자와 결합한다. 동적 광산란 (맬번 인스트루먼츠, UK 소재)으로 측정한 평균 직경은 선택된 제제에 따라, 100 nm 내지 300 nm 범위이다. SML 리포좀 결합 항원 제조 물질은 멸균한 0.4 마이크로미터 막을 통해 멸균한 15 mL 코니칼 원심분리기 튜브로 여과하고 시험 동물에게 투여할 때까지 4℃에서 저장하였다. 상기 제제 또는 이들의 제약상 허용되는 제제는 폴리뉴클레오티드 또는 siRNA를 시험 동물 또는 환자의 폐로 전달하기 적합하다. 제제는 피부내, 근육내, 피하, 경비, 경구, 폐내 또는 비경구 경로로, 투여 경로 및 동물의 종에 적합한 용량으로 투여하였다. 본 조성물의 제약상 허용되는 제제는 환자에게 투여할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 음이온성 SML 리포좀 제제는 디스테아로일포스파티딜글리세롤이 SML8a과 9 대 1의 몰비율로 혼합된 SML 화합물을 사용하여 제조하였다. 또한, 1 mg의 지질에 대해 모노포스포릴 지질 A (시그마, 미주리주 세인트 루이스 소재)를 25 μg의 비율로 상기와 같이 제조하였다. 상기 음이온성 SML 리포좀 제제로부터 면역 반응을 높이기 위해서, 펩티드 또는 단백질 항원을 mg의 지질 당 25 내지 100 마이크로그램의 항원의 비율로 리포좀 이중층에 부착시켰다. 상기 부착은 공유 결합적으로 또는 비공유 결합 수단, 예컨대 전하 상호 작용을 통하거나 리포좀 표면 상의 킬레이트된 금속과 항원 상의 히스티딘 태그 ("His-Tag") 사이의 금속 킬레이션 상호 작용을 사용할 수 있다. 제제는 피부내, 근육내, 피하, 경비, 경구, 폐내 또는 비경구 경로로, 투여 경로 및 동물의 종에 적합한 용량으로 투여하였다. 본 조성물의 제약상 허용되는 제제는 환자에게 투여할 수 있다.
추가의 실시예에서, 고체 코어 SML계 지질 에멀젼은 항원 전달을 위해 제조된다. 고체 코어 SML 입자는 25℃에서 스테아로일 또는 팔미토일 쇄를 함유하는 트리글리세리드로부터 제조된다. 적합한 SML계 백신 제제는 상기 기재된 바와 같이, 1/1의 몰 비율로 SML8a (실시예 8) 및 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP)으로부터 제조하였다.
실시예 33: 핵산 전달용 SML 함유 리포플렉스
양이온성 지질 시스템은 핵산, 예컨대 RNA, DNA, 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 기타 올리고 및 폴리뉴클레오티드를 배양 중의 셀 및 동물 또는 환자의 셀로 전달하기 위해 사용할 수 있다. 다수의 양이온성 지질 및 양이온성 지질을 함유하는 시스템은 문헌에 기재되어 있다. 이들 모두는 입자가 생체내에서 안정하지 않기 때문에 생체내 핵산 전이 효율이 한정되었다. 예를 들어, 콜레스테롤이 전혀 없는 양이온성 시스템은 동물 또는 환자에게 주사했을 때 빠르게 단백질로 피복된다는 사실 때문에 안정성이 부족할 수 있다. 지질 시스템을 안정화시키기 위해 유리 콜레스테롤을 함유하는 것을 생체내로 투여하는 경우 셀 막으로 유리 콜레스테롤이 소실된다. SML 화합물을 함유하는 리포플렉스 조성물은 이러한 문제점을 피한다.
상기 기재된 바와 같이 제조된 양이온성 SML계 리포좀 또는 양이온성 SML계 미셀은 양이온성 핵산과 혼합하여 헥산 상의 음전하와 양이온성 SML계 지질 입자 상의 양전하 사이의 전하 상호 작용을 통해 복합체를 형성한다. 이들 복합체는 리포플렉스 또는 SML 리포플렉스로 알려져 있다. DNA가 양이온성 SML계 리포좀 또는 양이온성 SML계 미셀과 복합체를 형성한 폴리뉴클레오티드인 경우, SML 제제를 사용하여 DNA를 전달할 수 있다 (예를 들면, "유전자 도입(gene transfer)"). siRNA와 같은 올리고뉴클레오티드를 양이온성 SML계 리포좀 또는 양이온성 SML계 미셀과 복합체를 형성하는 경우, SML 제제를 사용하여 siRNA 또는 개질된 siRNA를 전달할 수 있다 (예를 들면, "유전자 침묵(gene silencing)").
한 실시예에서, 화합물 SML6a과 같은 디스테롤 SML을 포함하는 지질 혼합물은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP)과 클로로포름 용액 중에서 1/4: SML/DOTAP의 몰 비율로 혼합하였다. 지질 필름은 클로로포름 중에 용해된 100 μmol의 지질 혼합물을 실온에서 회전식 증발기를 사용하여 유리 튜브 내에서 감압하에 건조한 후, 고진공에 밤새 노출시켜 제조하였다. 리포좀은 스크류 캡핑된 유리 튜브에서 멸균 0 mM 트리스/HCl pH 7.0 중에 지질의 전이 온도보다 높은 온도에서 박막의 지질 필름을 재수화시킨 후, 25℃에서 10분 동안 배쓰형 초음파처리기에서 초음파처리하여 제조하였다. 이후에 리포좀 조제 물질을 0.2 마이크로미터 폴리카보네이트 막을 통해 압출하였다. 이후에, 10 mM 트리스/HCl pH 8.0에 용해시킨 핵산을 양이온성 SML 리포좀에 첨가하여 양이온성 지질 양전하 대 핵산 음전하가 3 대 1이 되고, 이를 SML 리포플렉스로 명명한다. 이후에, SML 리포플렉스는 배양 중 셀에 첨가하거나 다양한 경로, 예컨대 주사로 투여한다. 본 조성물의 제약상 허용되는 제제는 환자에 투여할 수 있다.
지질 SML6a은 수성상을 통해 생체막으로 쉽게 도입되지 않는 형태로 리포플렉스에 콜레스테롤을 제공한다. 따라서, 리포플렉스는 유리 콜레스테롤로 형성된 것보다 생체상에서 훨씬 더 안정하다. 또한, 지질 SML6a는 새로운 상의 형성을 유도하여, 콜레스테롤 대 지질의 비율이 약 30 mole％ 콜레스테롤을 초과하여 증가한다. 이는 당량의 유리 콜레스테롤 mole％가 30 mole％인 경우 20℃ 부근에 새로운 전이가 관찰되는 도 10의 DSC 추적으로부터 분명하다. 상기 지질 혼합물로부터 제조된 리포플렉스는 우수한 폴리뉴클레오티드 도입제이다. 본 실시예의 양이온성 지질은 DOTAP이지만, DOTAP 대신에 임의의 양이온성 지질 단양이온성 또는 다양이온성을 사용할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 카르니틴계 SML 화합물 (실시예 11)은 단일 종으로 사용되어 양이온성 SML 입자를 형성하고 siRNA와 같은 핵산과 상호 작용한다. 이러한 양이온성 SML 입자의 특성은 스테롤 잔기 및 지방족 잔기의 부착 부분을 기준으로 조정될 뿐만 아니라 지방족 쇄 길이, 불포화도 또는 지방족 쇄의 분지에 따라 조정된다. 양이온성 SML계 리포좀 및 핵산의 복합체는 10 mM 트리스/HCl pH 8.0 중의 핵산을 10 mM 트리스/HCl pH 7.0 중에서 미리 형성한 양이온성 입자에 3/1의 양이온성 대 음이온성 전하 비율로 첨가한다. 이렇게 형성된 SML 리포플렉스는 셀 배양 및 생체내 모두에서 효율적인 핵산 전달 비히클이다. 단일 SML 화합물 및 핵산으로부터 형성된 SML계 리포플렉스의 추가 이점은 이들을 용이하게 동결 건조시키고 빠르게 핵산 도입-활성 리포플렉스로 재수화시킬 수 있다는 것이다.
따라서, 본 실시예에서 설명한 바와 같이, 다양한 일가 및 다가 SML 화합물을 리포플렉스로서 용이하게 형성하여 핵산 전달 비히클로 사용할 수 있다.
실시예 34: 핵산 약물 전달을 위한 환원가능한 SML 를 함유하는 나노리포입자 조성물
핵산을 한정된 표적으로 생체내에서 전달할 수 있는 장기간의 순환 나노입자를 얻기 위해서는, 나노 입자 표현 상의 양이온성 전하를 제거하거나 효과적으로 차단하는 것이 필요하다. 종래에는 pH 7.4에서 양이온화되지 않는 적정가능한 양이온성 기를 사용하거나, 나노입자를 형성한 후 양이온성기를 제거하거나 이를 반응시켜 음이온성 또는 중성 종으로 형성하거나, 또는 디술파이드 교환 반응으로 양이온성 기를 음이온성 또는 중성 종으로 교환하는 시도를 해왔다. 다른 접근 방법으로는 양이온 종의 사용을 피하고 정전기 상호 작용을 pH 7.4에서 양이온성이 아닌 수소 결합 종과 대체하는 것이다. 이러한 노력에도 불구하고, 나노포스포리피드 입자의 안정성은 생체내에서의 안정성의 결여, 특히 혈액 및 기타 체액에서 발견되는 혈장 단백질 및 지방 단백질과의 붕괴 상호 작용에 의해 손상되었다. 본원에 기재된 SML 화합물을 사용하여 비-교환가능성 스테롤을 제공함으로써 나노리포입자의 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라, 나노입자 표면 상의 양이온성 전하를 제거하거나 효율적으로 차단할 수 있다.
한 실시예에서, SML 나노입자는 생체내 생체반응성 폴리뉴클레오티드 전달을 위한 절단성 연결로서 디술파이드 결합을 이용하여 제조한다. 생체내 링커의 절단은 산화 세포 밖 공간 및 환원 세포 내 환경 사이의 높은 산화환원 전위차에 의존한다. 예를 들어, 양이온성 SML 나노입자를 함유하는 디술파이드-연결되고 양이온성 관능화된 지질은 세포 밖 매트릭스에서는 안정하지만, 세포질 내 환원성 환경에서는 지질 앵커로부터 절단된다. 지질로부터 양이온성 잔기의 절단은 나노입자로부터 전하 농축 DNA를 방출하여, DNA가 핵으로 이동한다. 본 실시예에서, 양이온성 디술파이드 함유 SML 화합물 SML13i (실시예 13)을 갖는 투석 방법이 사용되어 플라스미드 DNA를 PEG-차폐된 나노포스포리피드 입자로 캡슐화하였다 (도 11). 이후에, 표면 양전하는 각각 시스테인 (Cys) 및 글루타티온 (GSH)으로 디술파이드 교환 반응에 의해 중성 또는 음전하로 전환시킨다. 이와 같은 상기 방법을 이용하여 중성, 즈비터이온성 또는 비이온성 표면을 갖는 입자를 생성할 수 있다. 또한, 현재 비-양이온성 SML 나노입자는 SML에 의해 안정화된다. 비-양이온성 나노포스포리피드 입자는 셀 표면 분자에 대해 반응성이 있는 항체와 같은 표적 리간드의 결합에 의해 추가로 개질되어 나노입자를 세포 표면에 결합시킬 수 있다.
구체적인 실시예에서, 플라스미드 DNA는 28 mM 옥틸글루코시드 중의 PEG-지질/SML5d/양이온성 디술파이드 SML13i 몰 비율 (1/5/5)의 지질 혼합물에 첨가하고 옥틸글루코시드는 20 mM 헤페스 pH 8.5에 대하여 투석하여 제거하였다. 총 건조 지질 2.5 μmol (PEG-지질/SML5d/SML13i의 몰 비율이 몰 비율 1/5/5)은 5 mM 트리스히드록시메틸 아미노메탄 (트리스) 완충액 (pH 8.5) 중 1.47 ml의 28 mM n-옥틸-β-D-글루코피라노시드 (OG)로 0.5 시간 동안 수화시켰다. 동일한 부피의 세제 완충액 중에 DNA 플라스미드 (137.3 μg)를 30초 동안 온화하게 보텍스하면서 지질 용액에 첨가하였다. 이후에 용액을 슬라이드-A-라이저™ (Slide-A-Lyzer™) 투석 카세트 (MWCO 10 K, 피어스 (Pierce), 일리노이주 록포드 소재)로 옮기고 1 리터의 20 mM 헤페스 완충액 (pH 7.4)에 대하여 4℃에서 2일 동안 투석 완충액을 4회 교환하면서 투석하였다.
입자의 표면 전하를 개질하기 위해서, 입자 형성에 사용되는 SML13i의 양보다 10배 많은 몰 비율을 갖는 GSH 또는 Cys를 SML 나노포스포리피드 입자 용액으로 첨가하고 용액을 5분 동안 인큐베이션 한 후, 투석 카세트에 위치시키고 즉시 1 리터의 20 mM 헤페스 완충액 (pH 7.4)에 대하여 4℃에서 투석하여 환원 시약을 제거하였다.
제조된 SML 나노포스포리피드 입자의 직경은 동일한 전하 비율에서 리포플렉스 제제 (170 내지 360 nm)에 비해 실질적으로 작다 (대략 100 nm 직경). 입자 표면은 SML 나노포스포리피드 입자를 과잉의 환원 시약: GSH 및 Cys와 각각 단기간 동안 혼합하여 추가로 개질시킬 수 있다. 반응하지 않은 환원 시약은 투석하여 SML 나노포스포리피드 혼합물로부터 제거하였다. 제조된 SML 나노포스포리피드 입자의 직경은 보통 40 nm까지 증가한다. 양이온성 리포플렉스에서 86％ 캡슐화 값을 갖는 것에 비해, 약 50％의 캡슐화 DNA 플라스미드는 표면 개질 후 입자 내에 잔류한다. GSH 또는 Cys로 처리한 양이온성 SML 나노포스포리피드 입자의 표면 전하는 각각 양이온성 또는 중성 전하로 전환된다. 표면 전하의 변경은 음으로 하전된 GSH 또는 즈비터이온성 Cys 둘 다와 양이온성 헤드기가 교환하여 이루어진 것이다. 또한, 이들 SML 나노포스포리피드 입자는 생체내 폴리뉴클레오티드 또는 siRNA 전달에 적합하고, 지질-결합 표적 리간드의 결합에 의해 사용되는 지질 혼합물로 추가로 개질하여 표적화 SML 나노포스포리피드 입자를 제조할 수 있다.
실시예 35: 지질 SML15A -J의 제조
지질 SML15a, SML15b, SML15c, SML15d, SML15e, SML15f, SML15g, SML15h, SML15i 및 SML15j (공통적으로 SML15a-j로 지칭함)의 합성을 위한 구체적인 합성 반응식을 반응식 15에서 서술한다. 본 반응식은 지질 SML15f의 합성의 상세한 설명을 하기에 예시하였다.
<반응식 15> SML15a -j의 합성
Figure pct00092
1- 팔미토일 -1- 콜레스테릴헤미숙시노일 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 (SMLlSf, PChemsPC): 에탄올-무함유 건조 클로로포름 (50 mL) 중의 1-팔미토일-2-히드록시-sn-글리세로-포스포콜린 (0.95 g, 1.91 mmol) 및 콜레스테릴헤미숙시네이트 (1.86 g, 3.82 mmol)의 용액에 실온에서 DMAP (0.24 g, 1.91 mmol) 및 DCC (0.79 g, 3.82 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 여과하고 여과된 액을 회전식 증발기에서 농축하였다. 잔류물을 HPFC에 적용하여 정제하였다 (CHCl3 내지 CHCl3-MeOH-H2O 65/25/4). TLC: R f = 0.54 (용리액 C).
Figure pct00093
실시예 36 지질 SML16A -M의 제조
SML16의 합성을 하기 반응식 16에 나타내었다. 대표적인 공정을 하기에 기재하였다.
<반응식 16> SML16a -m의 합성
Figure pct00094
1-콜레스테릴헤미숙시노일-2-히드록실-3-글리세로-포스포콜린은 SML6B (실시예 6 참조)의 합성에서의 부생성물이고 SML16a -m의 합성시 출발 물질로 사용되었다.
1- 콜레스테릴헤미숙시노일 -2- 팔미토일 - sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 (SMLl 6f, ChemsPPC): 에탄올 무함유 건조클로로포름 (6 mL) 중 1-콜레스테릴헤미숙시노일-2-히드록실-3-글리세로- 포스포콜린 (206 mg, 0.28 mmol) 및 팔미트산 (87.3 m g, 0.34 mmol)의 용액에 실온에서 DMAP (35 mg, 0.28 mmol) 및 DCC (70.2 mg, 0.34 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 48 시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 여과하고 여과된 액을 회전식 증발기에서 농축하였다. 잔류물을 HPFC에 적용하여 정제하였다 (CHCl3 내지 CHCl3-MeOH-H2O 65/25/4). TLC: R f = 0.34 (용리액 C).
Figure pct00095
1- 콜레스테릴헤미숙시노일 -2-(2,5,8,11,14,17,20,23- 옥타옥사헥사코산 -26-오일)- sn - 글리세로 -3- 포스포콜린 (SMLl6m, ChemsPE08PC ): 에탄올 무함유 건조클로로포름 (6 mL) 중 1-콜레스테릴헤미숙시노일-2-히드록실-3-글리세로-포스포콜린 (140 mg, 0.193 mmol) 및 2,5,8,11,14,17,20,23-옥타옥사헥사코산-26-오익산 (100 m g, 0.242 mmol)의 용액에 실온에서 DMAP (20 mg) 및 DCC (60 mg, 0.29 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 48 시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 여과하고 여과된 액을 회전식 증발기에서 농축하였다. 잔류물을 HPFC에 적용하여 정제하였다 (CHCl3 내지 CHCl3-MeOH-H2O 65/25/4). TLC: R f = 0.47 (용리액 C).
Figure pct00096
실시예 37; SML16M 의 적용
SMLl6m은 소수성 지질 쇄를 양친매성 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로 대체하여 통상적인 인지질보다 넓은 표면적을 갖도록 디자인되었다. SMLl6m은 물에 용이하게 용해된다. 10 mM의 농도에서, SMLl6m은 물 중에 검출가능한 입자를 형성하지 않았다. 통상적인 양친매성 분자와는 달리, SML16m 용액은 진탕시 거품이 발생하지 않았으나, 용액 표면 위에 유리 벽을 따라 얇은 막을 형성하였다. SML16m은 1:1 이상의 몰 비율로 암포테리신 B를 효과적으로 용해시켜 5 mg/mL 농도를 얻을 수 있다. SMLl6m은 다른 지질과 제형되어 소형 리포좀을 형성할 수도 있다. 예를 들어, DPPC의 다중층형 비히클 직경은 20 mol％의 SML16m을 첨가하는 경우 상당히 감소하였다.
실시예 38: 30％ 소 태아 혈청 중 SML -함유 리포좀으로부터의 5- 카르복시플루오레신의 제어 방출
리포좀으로부터의 약물 방출 속도는 지질 이중층의 경도 및 투과성에 의해 제어된다. 알킬 쇄 길이 및 포화도는 리포좀 제제에서 중요한 역할을 한다. SML 리포좀으로부터의 5-카르복시플루오레신 (CF)의 방출은 헤페스 완충액 염수 (10 mM 헤페스, 140 mM NaCl, pH 7.4) (HBS) 및 30％ 소 태아 혈청 (FBS)에서 평가하였다.
CF는 실시예 16에 기재된 것과 동일한 방법으로 리포좀으로 캡슐화하였다. 리포좀을 200 nm 폴리카보네이트 막을 통해 압출하고, 유리 CF는 등삼투 용리액으로 HBS를 갖는 PD-10 컬럼 (GE 헬쓰케어 (GE Healthcare), 뉴저지주 피츠카타웨이 소재)에 로딩하여 리포좀을 용리하여 제거하였다. 리포좀 샘플 (10 μL)의 부분 표본을 0.02％의 나트륨 아지드를 함유하는 HBS 또는 FBS로 총 부피가 200 μL가 되도록 96-웰 플레이트에서 희석하였다. 이후에, 플레이트를 투명한 플라스틱 필름으로 밀봉하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 샘플의 형광 강도를 상이한 시점으로 모니터하여 리포좀으로부터 방출된 CF의 백분율을 하기 수학식에 의해 결정하였다.
<수학식>
CF％ = (Ft - F0)/(Fa - F0) * 100％
식 중, F0 = 바탕의 형광 신호
Fa = 총 형광 신호
Ft = 시간 측정에서의 형광 신호
시험한 SML는 하기를 포함한다:
o 1-헥사노일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML15a)
o 1-데카노일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML15c)
o 1-도데카노일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML15d)
o 1-테트라데카노일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML15e)
o 1-헥사데카노일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-S-포스포콜린 (SML15f)
o 1-옥타데카노일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-S-포스포콜린 (SML15g)
o 1-올레일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML15h)
o 1-이코사노일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML15i)
o 1-도코사노일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML15j)
o 1,2-디콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (SML6b)
4종류의 리포좀 제제를 CF 방출 시험에 사용하였다:
(1) 도 12에서 F1로 표시한, SML6b 및 45 mol％ 당량 콜레스테롤을 함유하는 디아실 포스포리피드의 리포좀;
(2) 도 12에서 F2로 표시한, 1-아실-2-켐스-포스포콜린 및 동일한 쇄 길이의 디아실 포스포리피드의 리포좀;
(3) 도 12에서 F3으로 표시한, 콜레스테롤 및 45 mol％의 콜레스테롤을 함유하는 디아실 포스포리피드의 리포좀; 및
(4) 도 12에서 F4로 표시한, 순수한 1-아실-2-켐스-포스포콜린 (SML15 시리즈)의 리포좀.
도 12에 나타낸 결과에서 보는 바와 같이, 긴 쇄를 갖는 지질을 함유하는 모든 제제는 누출에 대하여 우수한 안정성 및 내성을 나타내었다. 순수한 1-아실-2-켐-PC의 리포좀은 C10 정도로 낮은 것으로부터 넓은 범위의 쇄 길이까지 30％ 미만의 CF 방출을 갖는 안정성을 나타내었다. 그러나, 디아실 지질과의 혼합은 긴 알킬 쇄쪽으로 급격하게 쉬프트되었다. 디아실/SML6b 리포좀은 CF의 방출을 감소시키기 위해서 통상의 디아실/콜레스테롤 리포좀보다 약간 긴 알킬 쇄를 필요로 한다. 디아실 쇄 길이가 12 미만인 디아실/콜레스테롤 혼합물로부터 안정한 리포좀은 제조할 수 없다. 이는 SML 제제 F4의 추가의 이점이다. 디아실/SML6b의 전체 방출 프로파일을 도 13에 도시하였다. 3개의 SML 제제가 함께 목적하는 속도로 약물을 제어 방출을 하기 위한 광범위한 선택을 제공한다.

Claims (23)

  1. 친수성 헤드기 (head group) 및 2개 이상의 소수성 테일기 (tail group)를 갖는 스테롤-개질된 양친매성 지질 (SML)을 포함하며, 상기 소수성 테일기 중 적어도 1개는 스테롤을 포함하는 것인 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 헤드기가 포스페이트를 포함하는 것인 화합물.
  3. 제2항에 있어서, 친수성 헤드기가 포스페이트, 포스포콜린, 포스포글리세롤, 포스포에탄올아민, 포스포세린, 포스포이노시톨 및 에틸포스포스포릴콜린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 포스포에탄올아민 헤드기가 포스포에탄올아민-N-[모노메톡시폴리에틸렌글리콜] 2000 및 포스포에탄올아민-N-숙시닐-N-트리-니트릴로아세트산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  5. 제2항에 있어서, 스테롤이 동물스테롤 및 식물스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 스테롤이 콜레스테롤, 스테로이드 호르몬, 캄페스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  7. 제2항에 있어서, 소수성 테일기 중 적어도 1개가 비-스테롤을 포함하는 것인 화합물.
  8. 제7항에 있어서, 비-스테롤 소수성 테일이 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 지방족 탄화수소를 포함하는 것인 화합물.
  9. 제2항에 있어서, SML이 모노스테롤-개질된 양친매성 지질 및 디스테롤-개질된 양친매성 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  10. 제1항에 있어서, SML이 스테롤-개질된 글리세로포스포리피드, 스테롤-개질된 스핑고포스포리피드, 스테롤-개질된 카르니틴 지질 및 스테롤-개질된 아미노산 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  11. 제1항에 있어서, 친수성 헤드기가 아미노산, 활성화 관능기, 멜라민, 글루코사민, 폴리아민, 카르복실레이트 (COO-), 술페이트 (SO4 -), 술포네이트 (SO3 -), 분지형 폴리에틸렌 글리콜, 폴리글리세롤, 트리-니트릴로아세트산 및 탄수화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  12. 제1항에 있어서, 소수성 테일기 중 1개가 전구약물인 화합물.
  13. SML1a, SML1b, SML1c, SML2a, SML2b, SML2c, SML2d, SML3a, SML3b, SML3c, SML3d, SML4a, SML4b, SML4c, SML4d, SML5a, SML5b, SML5c, SML5d, SML6a, SML6b, SML6c, SML6d, SML7a, SML7b, SML8a, SML8b, SML8c, SML8d, SML8e, SML8f, SML9a, SML9b, SML9c, SML1Oa, SML1Ob, SML1Oc, SML1Od, SML1Oe, SML1Of, SML11a, SML11b, SML11c, SML11d, SML11e, SML11f, SML12a, SML12b, SML12c, SML12d, SML12e, SML12f, SML13a, SML13b, SML13c, SML13d, SML13e, SML13f, SML13g, SML13h, SML13i, SML13j, SML13k, SML14a, SML14b, SML14c, SML14d, SML14e, SML14f, SML15a, SML15b, SML15c, SML15d, SML15e, SML15f, SML15g, SML15h, SML15i, SML15j, SML15k, SML16a, SML16b, SML16c, SML16d, SML16e, SML16f, SML16g, SML16h, SML16i, SML16j, SML16k, SML16l 및 SML16m, 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 스테롤-개질된 양친매성 지질.
  14. 제1항에 따른 스테롤-개질된 양친매성 지질 (SML)을 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, SML이 스테롤-개질된 양친매성 인지질 (SPL)인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 치료제, 화장제 및 검출가능한 표지 중 1종 이상을 추가로 포함하는 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 지방족 탄화수소를 포함하는 비-스테롤 양친매성 지질을 추가로 포함하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, SPL 및 비-스테롤 양친매성 지질이 대략 동일한 길이인 소수성 테일기를 포함하는 것인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, SPL이 모노스테롤-개질된 양친매성 인지질이고, 비-스테롤 양친매성 지질이 디아실 인지질이며, 이들 각각은 약 6개 내지 24개 탄소의 쇄 길이를 갖는 비-스테롤 소수성 테일을 포함하는 것인 조성물.
  20. 1개 이상의 스테롤 테일기를 분지 코어를 통해 친수성 헤드기에 커플링시켜서 소수성 테일기 중 적어도 1개가 스테롤 테일기를 포함하는 2개 이상의 소수성 테일기에 연결된 친수성 헤드기를 갖는 스테롤-개질된 양친매성 지질을 생성하는 단계를 포함하는, 스테롤-개질된 양친매성 지질의 합성 방법.
  21. 스테롤-개질된 양친매성 지질을 비-스테롤 양친매성 지질, 치료제, 화장제, 검출가능한 표지, 완충액, 용매 및 부형제 중 1종 이상과 혼합하는 단계를 포함하는, 스테롤-개질된 양친매성 지질을 포함하는 조성물의 제조 방법.
  22. 동물 또는 세포를 제14항에 따른 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 스테롤-개질된 양친매성 지질을 포함하는 조성물을 동물 또는 세포에 투여하는 방법.
  23. 유체를 제14항에 따른 조성물과 접촉시키는 단계, 및 지질 조성물 또는 유체의 검출가능한 성질에서 1개 이상의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 유체 중 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하는 방법.
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