KR20100095280A

KR20100095280A - 함초 추출물을 함유한 면역 증강 활성 약학 조성물

Info

Publication number: KR20100095280A
Application number: KR1020090014476A
Authority: KR
Inventors: 류덕선; 김선희; 이동석
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2009-02-20
Filing date: 2009-02-20
Publication date: 2010-08-30

Abstract

본 발명은 면역세포 활성 증진 효과를 나타내는 함초 유래 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역 증강 활성 약학 조성물 및 건강식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 함초 유래 추출물은 시험관 내 실험에서 마우스 비장세포와 T 세포에서 세포증식 활성을 나타내고, 림프아구 생성자극 및 CD4⁺, CD8⁺ T 세포 활성화 효과를 향상시킴이 확인되었고, 생체 내 실험에서 함초 유래 추출물을 경구투여한 결과 비장세포의 세포증식능을 향상시킴이 확인됨으로써 본원발명의 함초 유래 추출물이 면역활성세포 활성증진 효과가 있다.

함초, 면역증강, 비장세포, T 세포

Description

함초 추출물을 함유한 면역 증강 활성 약학 조성물{A pharmaceutical composition for the immunity stimulatory activity comprising Salicornia herbacea L. extracts}

본 발명은 면역 증강 활성 함초 추출물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 면역세포 활성 증진 효과를 나타내는 함초 유래 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역 증강 활성 약학 조성물 및 건강식품 조성물에 관한 것이다.

현대인은 서구화된 식생활문화와 더불어 환경오염, 운동부족, 스트레스 등의 여러 가지 요인으로 비만인구 증가 및 심혈관계 질환등의 만성 성인병 질환이 증가하고 있는 추세이다. 이와 관련하여 우리나라에서는 건강 증진을 위한 생리활성 물질탐색과 기능성 식품 개발에 관한 연구로서 해양식물에 대한 관심이 증대되고 있는 실정이다. 해양자원식물에 대한 항암, 면역증강, 혈당강하, 체중조절, 지질대사 개선 등의 다양한 효과가 알려지면서 생체 생리활성물질로 기대되는 좋은 소재로 각광받고 있다. 최근 이러한 생리활성기능이 기대되는 해양자원식물 중 하나 인 함초에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 본 연구에서도 함초의 여러 가지 생리활성 효과 중 면역 증강 효과를 검증해 보고자 한다.

함초 (Salicornia herbacea L.)는 우리나라 남해안과 서해안 간척지 바닷가의 염습지대에서 자생하는 명아주과 (Chenopdiaceae)에 속하는 일년초 식물로서 우리말로는 퉁퉁마디라고 부른다. 갯벌식물인 함초는 다량의 염분을 체내에 축적할뿐만 아니라 90여종의 천연 미네랄이 풍부하고 리놀렌산도 약 50%로 다량 함유하고 있으며, 필수 아미노산도 총 아미노산 함량 대비 약 40%를 함유한 것으로 알려져 있다⁸⁾. 또한, 함초에는 식이 섬유소가 50～70% 정도 들어 있어 숙변과 변비를 예방하는 작용도 탁월하다고 알려져 있다.

또한 함초는 중국 최고의 의서인 “신농본초경”과 일본의 “대화본초”에 맛이 몹시 짜다고 하여 함초, 염초로 기록되어 있으며 예로부터 민간요법으로 많이 이용되었던 자원식물로서 암, 축농증, 관절염, 고혈압, 요통, 비만증, 치질, 당뇨병, 갑상선염, 천식, 기관지염 및 간 질환 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으나 이에 대한 체계적인 연구는 아직 미흡한 실정이다.

이와 같이 다양한 약리작용이 기대되는 함초의 개발은 많은 부가 가치 창출이 기대되나 생리활성에 대한 기초 자료가 부족하므로 과학적이고 실증적인 연구가 필요하다고 사료된다.

따라서 본 발명에서는 함초로부터 조추출물, 다당체Ⅰ, 다당체Ⅱ를 얻어 기능성 식품으로서 활용도를 높이기 위해 면역세포 활성화에 미치는 효과를 규명하고 자 한다.

따라서 본 발명의 목적은 면역 증강 활성을 갖는 함초 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물 및 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 함초로 부터 조 다당체 추출물을 제조한 후, 이로부터 함초 다당체를 제조하여 이들의 면역 증강 활성을 시험관 내 및 생체내 실험을 통해 확인함으로써 달성되었다.

본 발명은 함초 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강 활성 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 함초 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강 활성 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 함초 추출물이 함초 다당체인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, “유효성분”이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능·효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 함초 추출물를 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

또한, 면역 증강 활성을 위한 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

본 발명에서는 함초 조추출물인 함초 조 다당체 추출물(Crude S. herbacea polysaccharide extract; CSP)를 세파덱스(sephadex) G-50으로 충전된 칼럼에 주입하여 겔투과 크로마토그래피로 다당체 분획을 확인하였으며, 이 분획은 페놀-황산법으로 총 당량을 측정하여 16～30 KDa 와 250～3300 Da의 분자량으로 추정되었다(도 2 참조).

상기의 분자량을 포함한 다당체 혼합물을 얻기 위하여 CSP를 1kD 멤브레인을 사용하여 한외 여과시킨 후 함초 다당체 I(S. herbacea polysaccharideⅠ; SPⅠ)을 얻었으며, CSP를 겔투과 크로마토그래피시킨 후 다당체로 추정되는 해당 분획을 수집하여 함초 다당체 II(S. herbacea polysaccharideⅡ; SPⅡ)를 얻었다(도 1 참조). 함초 추출물의 SPⅠ 활성은 선행 연구 결과에서 보고한 바와 같이 항당뇨 및 지질 대사 개선 등의 효과가 있음이 확인된 바 있다.

본 발명에 사용한 함초 추출물의 일반조성은 표 1에 나타낸 바와 같다. 함초 추출물 CSP, SPⅠ, SPⅡ의 건물당 탄수화물의 함량은 42.41, 61.42, 56.51% 로 함초 추출물의 주성분으로 한외여과를 통한 추출물인 SPⅠ의 탄수화물 함량이 가장 높았다. 그리고 조단백질, 조지방, 수분, 회분의 함량이 SPⅠ의 경우 각각 8.36, 5.05, 4.39, 20.72% 순으로 나타났다. 회분의 함량이 높은 것은 NaCl의 함량등 해수의 무기염과 해조 자체의 무기염 때문으로 여겨진다.

비장(spleen)은 혈액에서 유래되는 항원에 대한 주된 보호 면역 반응 부위로 B 및 T 림프구의 성숙과 항원의 자극에 의한 림프구의 분화가 이루어지는 주요 림프 기관으로 비장 내 림프구의 증식은 면역 시스템에서 매우 중요한 의미를 갖는다. 비장 세포의 증식반응을 알아보기 위하여, 분리한 비장 세포를 5 × 10⁵ cells/well로 넣고 시료를 농도별로 첨가하여 24, 48 및 72시간 배양하여 증식정도를 비교한 결과를 도 4에 나타내었다. 함초 추출물을 첨가하여 배양한 경우 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비해 농도 의존적으로 비장 세포의 증식 반응이 나타났다. 함초 추출물에 의한 비장 세포 증식능의 변화를 살펴보면, 4 ㎎/mL 농도에서 24시간 배양한 경우 CSP, SPⅠ, SPⅡ군 모두 세포 증식능이 205.01, 320.62, 307.32 수준으로 향상되어 유의적인 수치를 나타내었다. 특히 SPⅠ과 SPⅡ군이 CSP군보다 세포 증식능이 효과적이었다. 다당체와 관련하여 종래 연구에서는 상백피로부터 분리한 다당체의 경우 면역 세포인 B 및 T 세포의 증식을 최대 6.7배 촉진 시키는 효과가 있음을 보고하였고, 큰느타리버섯 조다당체가 비장 세포 및 B 세포 증식을 직접적으로 유도한다고 보고하였다. 이상의 결과와 본 연구의 결과로 판단하면 함초 추출물 중 특히 SPⅠ과 SPⅡ가 비장 세포를 자극하여 T 세포와 B세포 증식을 촉진하여 면역능을 증진시키는 것으로 사료된다.

위 실험에서 함초 추출물이 비장 세포의 증식을 유도하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 이때, 증식하는 비장 세포는 T 세포 또는 B 세포 중 하나일 가능성이 높다. 종래 연구에서 보고된 바와 같이 우리 몸의 전체 림프구 중 비장에 분포되어 있는 림프구는 T 세포가 60%, B 세포가 30% 정도로 T 세포의 비율이 높다. 따라서, 비장 세포에서 T세포만을 따로 분리하여 함초 추출물을 첨가한 후에 직접적으로 증식 반응을 유도하는지를 알아보았다. 나일론 울(Nylon wool)을 이용하여, 비장세포 중에서 부착성을 가진 B세포와 대식 세포를 제거한 다음, 순수한 T세포만을 분리하여 5 × 10⁵ cells/well을 넣고 시료를 농도별로 첨가하여 24, 48 및 72시간 배양하여 증식 정도를 측정하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 분리된 T 세포는 함초 추출물을 첨가하여 배양한 경우 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비해 농도의존적으로 세포 증식 반응이 나타났으며, 함초 추출물에 의한 T 세포 증식능의 변화를 살펴보면, 4 ㎎/mL 농도에서 24시간 배양한 경우 CSP, SPⅠ, SPⅡ군 모두 세포 증식능이 176.76, 350.39, 330.08 수준으로 향상되어 유의적인 수치를 나타내었다. 특히 SPⅠ과 SPⅡ군이 CSP군보다 세포 증식능이 효과적이었다. 적응 면역에는 B 세포에 의해 생성되는 체액 성 면역과 T 세포에 의해 매개되는 세포성 면역의 두 유형이 있는데, 함초 추출물 중 특히 SPⅠ과 SPⅡ가 T 세포를 자극하여 세포 증식을 촉진시킨 것으로 보아 세포성 면역에 자극효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

항원의 자극을 받지 않은 휴지기 상태의 림프구는 작은 림프구 (samll lymphocyte)로 체내에 존재하며, 항원의 자극반응으로 휴지상태의 림프구는 큰 림프구 (large lymphocyte)인 림프아세포 (lymphoblasts)로 전환된다. 비장세포에 대한 함초 추출물 CSP, SPⅠ, SPⅡ의 림프아세포 생성 자극 효과를 알아보기 위하여, 분리한 비장 세포를 5×10⁷ cells/well로 넣고 시료를 농도별로 0.5, 1, 2, 4 ㎎/mL첨가하여 8, 16, 24 및 48시간 배양한 후, 세포 직경과 비례하는 FSC 값을 유세포분석(유세포분석)를 이용하여 측정한 결과를 표 2에 나타내었다. 함초 추출물을 첨가하여 배양한 경우 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비해 농도 의존적으로 FSC값을 유의성 있게 증가시킴으로써 림프아세포 생성 자극효과를 나타내었다. 최대의 림프아세포 생성 자극효과를 보인 48시간 배양의 경우를 살펴보면, 대조군에서 전체 임파구의 FSC 값은 281.76이었으나, CSP, SPⅠ, SPⅡ를 첨가한 경우 농도 의존적으로 FSC 값이 증가하여 4 ㎎/mL에서 304.03, 319.05, 321.27 수준으로 각각 7.90, 13.23, 14.02%의 증가가 확인되었다. 종래 연구에서는 FSC 값이 세포직경과 비례하는 변수임을 감안할 때 FSC 값의 11.4% 증가는 전체 세포들의 평균 용적을 54% 정도 증가시켰음을 의미한다고 보고하였다. 또한 함초 추출물이 모든 종류의 임파구에 미치는 것으로 보기 보다는 어느 특정 집단에 미치는 것으로 보는 것이 타당성이 높을 것이며 이러한 근거를 바탕으로 생각할 때 전체 세포 집단의 평균 세포 용적을 증가시킨 결과는 매우 의미있는 결과로 받아 들여 진다.

한편 이들 임파구 중 면역능에서 중요한 역할 을 담당하는 T 세포에 대한 영향을 알아보기 위하여 T 세포를 CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포로 구별하여 분석한 결과는 도 3과 같다. 분리한 비장 세포를 5 × 10⁷ cells/well로 넣고 시료를 농도별로 0.5, 1, 2, 4 ㎎/mL첨가하여 8, 16, 24 및 48시간 배양한 후, PE로 표지된 CD4⁺ mAb와 FITC로 표지된 CD8⁺ mAb로 직접면역형광염색을 실시하여 유세포분석을 이용하여 측정한 결과, T 보조 세포로 작용하는 CD4⁺ T세포에 대하여 현저한 활성화 효과를 보이는 것으로 나타났다. 함초 추출물을 첨가하여 배양한 경우 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비해 농도 의존적으로 CD4⁺ T 세포의 평균 FSC값을 유의성 있게 증가시킴으로써 CD4⁺ T 세포의 활성화 효과를 나타내었다. 최대의 CD4⁺ T 세포의 활성 효과를 보인 48시간 배양의 경우를 살펴보면, 대조군에서 전체 임파구의 CD4⁺ T 세포의 평균 FSC 값은 280.38이었으나, CSP, SPⅠ, SPⅡ를 첨가한 경우 농도 의존적으로 평균 FSC 값이 증가하여 4 ㎎/mL에서 309.29, 359.41, 339.73 수준으로 각각 9.02, 24.67, 18.52%의 증가가 확인되었다. 반면, 암세포 등 표적세포를 직접 공격하는 cytotoxic T 세포로 작용하는 CD8⁺ T 세포에 대하여 CSP, SPⅠ, SPⅡ를 첨 가한 경우, 평균 FSC 값이 277.71, 305.04, 302.52 수준으로 그 증가율이 0.79, 10.71, 9.80%에 머물렀다. 이는 함초 추출물중 특히 SPⅠ과 SPⅡ가 T 립프구 중 CD4⁺ T 세포를 더 많이 림프아세포로 전환시켰음을 의미하며, CD4⁺ T 세포의 활성 증가는 보조 T 세포의 작용으로 B cell, CD8⁺ T 세포, 단구, 대식세포 등의 세포를 활성화시키기 때문에 CD4⁺ T 세포의 활성화는 전반적인 면역세포의 활성화로 면역능 증가 효과가 기대된다. 뿐만 아니라, CD4/CD8 비율에서도 보여지듯이 24시간 배양시 대조군의 경우 2.574였으나, CSP, SPⅠ, SPⅡ의 경우 농도 의존적으로 4 ㎎/mL에서 6.050, 6.726, 3.500 수준으로 향상되었음을 확인 할 수 있었다(표 4 참조). 이와 관련하여 위 실험 중 비장세포의 세포 증식능만으로는 함초 추출물이 B 세포와 관련이 있는 체액성 면역과 T 세포와 관련이 있는 세포성 면역 중 어떤 반응을 더 효과적으로 유도하는지에 대해서는 알 수 없었다. 그러나 유세포분석을 이용한 유세포분석에서 양성 대조군으로 사용한 ConA 와 LPS를 통하여 함초 추출물이 T 세포와 관련이 있는 세포성 면역을 B 세포와 관련이 있는 체액성 면역 보다 더 선택적으로 활성화시킴을 재확인 할 수 있었다. 표 2 및 3 에 나타난 것과 같이, 분리한 비장세포를 5 × 10⁷ cells/well로 넣고 T 세포의 증식을 특이적으로 유도하는 ConA (5 ㎍/mL)와 B세포의 증식을 특이적으로 유도하는 LPS (15 ㎍/mL)를 첨가하여 8, 16, 24 및 48시간 배양한 후, 유세포분석을 이용하여 FSC 값을 측정한 결과, 48시간 배양시 ConA의 경우 491.82 수준으로 대조군에 비해 74.55% 증가율을 보인 반 면, LPS의 경우 305.96 수준으로 대조군에 비해 8.59% 증가율에 머물렀다. 이는 비장세포의 증식능 결과가 T 세포와 관련이 있는 세포성면역을 반영하는 것이라고 사료된다.

혈액 및 혈액생화학적 검사는 조혈계 및 생체의 기능적 변화를 나타내는 지표로써, 정확한 질병의 진단이나 이상치를 확인하는데 반드시 필요하다. Balb/c 마우스의 함초 추출물에 대한 혈액학적 분석결과는 표 6에 나타낸 바와 같다. 혈액학 분석 결과 유의성 있는 변화는 HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT에서 나타났고, 개체간 변동이 가장 큰 항목은 PLT이고 MCV수치가 개체간 변동이 가장 작았다. 본 연구에서 혈액학적 수치는 시료에 관계없이 WBC를 제외하고는 측정치가 높게 나타났으나 비교적 다른 연구와 비슷한 경향을 보였다. 본 발명의 RBC 측정치는 대조군에 비해 CSP(11.52 ± 1.06), SPⅠ(10.66 ± 1.40), SPⅡ(11.67 ± 1.68)으로 높은 수치를 보였는데 이는 종래의 연구와 비교해 볼때 RBC 수치가 상대적으로 높음을 알 수 있다. 이와 관련하여 적혈구 지수인 MCV, MCH, MCHC 은 비슷한 수치를 보였는데, 이는 적혈구 수와 더불어 적혈구의 크기도 커졌음을 의미한다. 특히, SPⅡ가 CSP에 비해 적혈구 수 및 적혈구 지수 모두 높게 측정되었다. 혈액학적 검사에서 RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC 수치가 높게 측정되었는데, 이는 설치류의 RBC 수 및 적혈구 지수를 시험한 종래의 연구와 일치한다.

본 발명의 WBC 수치는 타 연구에 비해 매우 낮은 경향을 보였다. WBC 수는 같은 동물이라도 채혈 시간 및 채혈 위치에 따라 다른 변화를 보이고, 분석기기의 종류에 따라서도 서로 다르게 측정된다. 또한 타 연구에서도 보여지듯이 WBC 수치 는 수컷과 암컷의 차이에 따라서도 다르게 나타나고, 주령에 따라서도 차이를 보였다. 종래의 연구결과에서 WBC 수치는 Balb/c 마우스가 C57BL/6 마우스보다 높았고, Balb/c 마우스에서 WBC 수치는 수컷보다 암컷이 약간 높았으며, C57BL/6 마우스에서는 수컷이 암컷보다 높은 경향을 보였는데, 이는 WBC수치가 종에 따라 유동적인 변화를 보이는 것으로 사료된다.

PLT는 타 연구에 비해 극히 적은 측정치를 보였다. PLT는 혈액응고에 의해 그 수가 급격히 떨어지고 측정기기에 의한 변화도 나타난다. 본 발명에서 PLT 수는 대조군 (166.00 ± 22.07)과 CSP (178.33 ± 71.02)군에 비해 SPⅠ (195.00 ± 11.79)과 SPⅡ (188.33 ± 46.09)이 유의적으로 높게 나타났다. 이는 표 10 에 보여진 것과 같이 비장의 비정상적인 증대 지표인 비장 지수가 CSP, SPⅠ, SPⅡ에서 1.057 ± 0.315, 0.972 ± 0.127, 0.813 ± 0.144 수준으로 혈액내 PLT 수치에 반비례하여 측정되었음을 확인 할 수 있다. 이는 비장이 비대해 지면 비장에 머무르는 PLT수가 증가하여 혈액내 PLT수가 상대적으로 감소하기 때문에 PLT 수치에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 백혈구 백분율 감별결과는 표 7에 나타낸 바와 같다. 호중구는 SPⅡ군에서 39.67 ± 8.62으로 높은 비율이었고, CSP군에서 10.33 ± 3.21으로 감소되었다. 호산구는 모든 군에서 비슷한 비율을 나타내었다. 림프구는 CSP군에서 86.33 ± 4.51으로 높은 비율을 차지하였으며, 단구는 타 연구에 비해 높은 비율로 나타났다. 호염기성세포는 대조군과 CSP군에서 낮은 비율로 나타났으며, SPⅠ과 SPⅡ군에서는 관찰되지 않았다. 혈액생화학적 분석 결과 간, 담도질환 등 세포 파괴와 괴사를 동반하는 질환을 반영하는 AST와 간조직의 비대화와 간의상 태를 반영하는 ALT의 활성을 측정한 결과는 표 8에 나타낸 바와 같다.

AST활성은 대조군에 비해 CSP군과 SPⅠ군은 유의적차이를 보이지 않았으나 SPⅡ군은 유의적으로 감소하였다. ALT활성은 대조군에 비해 CSP군의 수치가 증가하였으며, SPⅠ군과 SPⅡ군의 수치는 감소하였으나 유의적 차이는 없었다. 이는 정상군에 비해 함초 추출물을 공급한군이 간독성유발 위험이 적은 것을 보여주며, 특히 SPⅠ과 SPⅡ가 간독성에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 최근 함초의 간독성과 관련하여 종래의 연구에서는 간독성을 현저히 저하시키고, CCl₄에 의해 손상된 흰쥐의 간세포를 회복시키는데 유용한 베타인(betain)을 함초로부터 분리정량한 바가 있으며, CCl₄를 투여한 흰쥐의 간 독성 발현정도를 조사한 연구에서 함초추출물이 간독성에 대한 보호효과가 있음이 보고된 바 있다.

실험 기간 동안 실험 동물의 체중 증가량을 관찰한 결과는 도 8에 나타낸 바와 같다. 체중 증가량은 함초 추출물을 공급하지 않은 대조군과 함초 추출물을 공급한 실험군 간에 유의적 차이는 없었으나 실험 기간 동안 실험군의 체중이 계속적으로 증가하는 경향을 보였다. 종래의 연구에 의하면 함초 추출액 투여 시 투여량이 증가할수록 체중 증가율이 감소되어 함초가 체중 증가 억제에 영향을 미친다고 보고한 것과 달리 본 실험 결과에서 체중 증가 경향을 보인 것은 실험군의 식이 조성이 양호하고 실험마우스의 성장 발육이 활발한 시기 때문으로 사료된다. 이는 함초 첨가 식이군이 정상식이군에 비해 체중 증가량을 보인 종래의 보고와 유사하다.

그리고 각 실험군의 장기 중량을 관찰할 결과는 표 9에 나타낸 바와 같다. 즉, 간장 중량, 신장 중량 및 흉선 중량은 각 군간에 다소 차이는 있으나 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았으며, 비장 중량은 대조군 (0.077 ± 0.006), CSP군 (0.097 ± 0.021), SPⅠ군 (0.095 ± 0.021), SPⅡ군 (0.080 ± 0.014)으로 나타나 정상 대조군에 비해 함초 추출물 투여군이 다소 증가 경향은 보였으나 유의적 차이는 없었다.

비장 무게 지수는 비장의 무게를 표준으로 환산하여 측정지표로 삼는 것으로 비장의 무게에 대한 체중의 비로 나타낸다. 세포 매개성 면역반응인 GVH 반응 (graft-versus-host reaction)에서는 비장의 비정상적인 증대가 양성 반응의 지표로 활용되므로 비장 지수가 1.3 이상일 때 양성 반응으로 결정하기도 하고, 각 실험군마다 비장 무게 지수를 구하여 대조군의 값과 비교하여 이상 유무를 판단하기도 한다.

식이 섭취가 생체 내에 미치는 영향을 알아보기 위한 방법으로 장기 또는 혈액을 채취하여 시험관 내 실험을 하는 연구가 다양하게 진행되고 있다. 이 중 비장 세포는 혈액에서 유래된 항원에 대한 면역 반응이 개시되고 발전되는 부위로서 말초 림프 기관에 속하며, 그 크기나 세포의 수가 직접적인 지표로 이용될 수 있으므로 대표적인 면역 지표로 사용된다. 시험관 내 실험 결과 함초 추출물이 마우스 비장 세포 및 T 세포 증식능에 영향을 미치는 것으로 나타났으므로, 이 결과를 바탕으로 함초 추출물을 마우스에 경구 투여하여 비장 세포 증식능을 관찰하였다. 먼저, 함초 추출물을 투여한 군과 투여하지 않은 대조군으로 나누어 비장 세포 증식능을 측정하였고, 세포 배양 시 미토겐(림프구 비특이 활성제)인 Con A (5 ㎍/mL) 와 LPS (15 ㎍/mL)를 각 웰에 첨가하였고 이에 대한 대조군으로 미토겐 대신 3차 증류수를 동량 첨가하여 비장 세포 증식 계수를 구하여 비교하였다. 마우스에서 분리한 비장 세포를 5 × 10⁵ cells/well로 넣고 미토겐을 첨가하여 24, 48 및 72시간 배양하여 증식 정도를 비교한 결과는 도 9에 나타낸 바와 같다. B세포의 증식을 특이적으로 유도하는 LPS와 T 세포의 증식을 특이적으로 유도하는 Con A 에 의해서 비장 세포는 72시간 배양 후 유의적으로 최대 증식 반응을 나타내었다. 그리고, 함초 추출물을 투여하고 미토겐을 처리하지 않은 경우에는 세포 증식능이 저하되었으나, Con A나 LPS로 처리 시에는 72시간 배양 시 SPⅠ과 SPⅡ군에서 각각 최대의 증식능 (65.38 ± 2.55, 54.55 ± 2.86)을 보였다. 특히 SPⅠ과 SPⅡ군이 CSP군보다 세포 증식능이 효과적이었다. 이는 함초 추출물의 투여로 인해 세포성 면역이 증가하고, 체액성 면역도 영향을 받는 것으로 사료된다.

한편, 미토겐과 관련하여 종래 연구에서는 다시마 분말 투여에 의한 당뇨쥐의 비장 세포 기능에 관한 연구에서 4주간의 투여에 의해 비당뇨군의 비장 세포 증식능이 촉진되었고, 특히 LPS와 Con A 첨가에 의해 비장 세포 증식능이 3배까지 상승하였음을 보고하였으며, 동충하초를 4주간 투여한 마우스의 비장세포를 미토겐과 같이 배양 시 비장세포 증식능이 상승하였음을 보고하였다.

이상의 결과로부터 본 발명에 따른 함초 유래 추출물은 시험관 내 실험에서 마우스 비장세포와 T 세포에서 세포증식 활성을 나타내고, 림프아구 생성자극 및 CD4⁺, CD8⁺ T 세포 활성화 효과를 향상시킴이 확인되었고, 생체 내 실험에서 함초 유래 추출물을 경구투여한 결과 비장세포의 세포증식능을 향상시킴이 확인됨으로써 본원발명의 함초 유래 추출물이 면역활성세포 활성증진 효과가 있음이 입증되었다. 따라서 본 발명의 함초 추출물은 바이오헬스 소재 개발과 관련된 제약학 및 건강식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 함초( S. herbacea )로부터 조추출물 및 다당체 추출

본 실시예에 사용한 동결건조된 실험재료는 (주)다사랑으로부터 건조된 함초를 구입한 후 분말화하여 사용하였다. 건조된 함초를 잘게 분쇄하여 고온, 가압 조건 하에서 3시간 동안 열수 추출한 후에 여과지(Whatman No. 1)로 여과하여 조추출물인 함초 조 다당체 추출물(CSP)를 얻었다. 여과지로 여과 후 고온 가압 멸균시킨 2차 증류수로 세파덱스G-50 (Sigma, USA)을 칼럼(2.5 cm × 50 cm, Sigma Chemical Co.)에 충전시켰으며, 충전 후 CSP를 칼럼에 2 mL 주입하여 분당 3 mL 유속으로 2.5 mL씩의 분획을 얻었다. 각각의 분획은 페놀-황산법으로 총 당량을 측정 하였고, 블루 덱스트란(blue dextran; Sigma, USA)을 표준물질로 하여 CSP로부터 분리되어 나온 다당체의 분자량을 추정하여 다당체 Ⅱ인 함초 다당체 Ⅱ (SPⅡ)을 얻었다. 다당체 Ⅰ인 함초 다당체Ⅰ (SPⅠ)은 CSP를 한외 여과기 (ProFlux M12, Millipore, USA)에서 1 kD 멤브레인(Millipore, USA)을 사용하여 여과한 후에 얻었다(도 1 및 2 참조).

실시예 2 : 함초 추출물의 일반 성분 분석

상기 실시예 1에서 제조한 함초의 3개 추출물 (CSP, SPⅠ, SPⅡ)의 일반성분은 AOAC법에 따라 수분함량은 상압건조법, 조지방은 속슬렛 추출법, 조단백질은 켈달(Kjeldahl)법, 조회분은 건식회화법으로 분석하고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

<표 1>

함초 추출물의 일반성분(%, 건조 중량 기준)

각 값은 평균± SD (n=3)임.

^a)100 - (단백질 + 지방 + 수분 + 회분).

CSP; 함초 조 추출물

SPⅠ; 함초 다당체 Ⅰ

SPⅡ; 함초 다당체 Ⅱ.

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 함초 추출물 CSP, SPⅠ, SPⅡ의 건물당 탄수화물의 함량은 42.41, 61.42, 56.51% 로 함초 추출물의 주성분으로 한외여과를 통한 추출물인 SPⅠ의 탄수화물 함량이 가장 높았다. 그리고 조단백질, 조지방, 수분, 회분의 함량이 CSP의 경우 각각 8.00, 7.49, 7.22, 37.55% 순으로 나타났고, SPⅠ의 경우 8.36, 5.05, 4.39, 20.72% 순으로 나타났으며, SPⅡ의 경우 8.51, 3.60, 3.84, 28.74% 순으로 탄수화물을 제외한 일반성분들 중 회분의 함량이 높게 나타났다.

실험예 1 : 함초 다당체의 마우스 면역 증강 활성에 대한 시험관 내 실험

실험동물은 효창 사이언스로부터 특정병원체부재 (specific pathogen free) Balb/c 마우스를 공급받아 사용하였다. 이들 마우스는 1주일간 실온에서 물과 사료를 충분히 공급하고, 가능한 스트레스를 최소화하여 사육하면서, 생후 7～8주 된 암컷을 사용하였다. 실험 동물의 사육 조건은 실내 온도 25℃, 습도는 50% 전후로 하였고, 명암은 12시간 (day light 06:00～18:00)을 주기로 조절하였다. 본 연구는 실험동물의 사육에 대한 인제대학교 동물실험 윤리위원회의 가이드라인을 토대로 진행하였다.

시험관 내 실험을 위하여 함초의 3개 추출물 (CSP, SPⅠ, SPⅡ)을 3차 증류수에 용해시킨 다음 단일 여과 유닛(Single Filter Unit; Sartorius Minisart, Germany)으로 여과시킨 후 고온 가압 멸균하여 실험하고자 하는 농도가 되도록 희석하여 세포 배양 시 첨가하였다.

면역세포의 증식에 미치는 효과를 측정하기 위하여 마우스의 비장을 이용하였다. 먼저 마우스의 비장을 무균적으로 적출하여 RPMI 1640으로 씻은 다음 핀셋과 멸균 슬라이드를 이용하여 단일세포 부유액을 만들었다. 단일세포 부유액을 RPMI 1640으로 2회 세척한 다음 용리 완충액(lysing buffer; BD PharmLyse^™ Lysis Buffer)에 3분간 현탁시켜 적혈구를 제거하고 다시 원심 세척한 다음 5 × 10⁵ cells/well 농도가 되게 희석한 후 96 웰 플레이트에 웰 당 90 μL씩 첨가하여 세포 증식능 측정에 이용하였다.

분리한 마우스의 비장 세포를 10% FBS-RPMI 1640배지 1 mL에 희석하여 나일론 울 컬럼(Polysciences, Inc.)에 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에 60분간 배양한 후, 나일론 울 컬럼을 37℃로 미리 데워진 배지로 세척하여 비부착성인 T세포만을 순수 분리하여 사용하였다.

함초의 3개 추출물 (CSP, SPⅠ, SPⅡ)을 3차 증류수에 용해시킨 다음 단일 여과 유닛(Single Filter Unit; Sartorius Minisart, Germany)으로 여과시킨 후 고온 가압 멸균하여 최종농도가 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6 ㎎/mL 이 되도록 희석하여 96 웰 플레이트에 세포 90 μL와 각각의 추출물을 10 μL씩 각 웰에 분주한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24, 48, 72시간 배양하였다. 농도에 따른 각각의 추출물에 대한 비장세포 증식능을 측정하여 세포 증식 활성이 극대화되는 농도를 결정하였다. 세포 증식 측정은 Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, USA)를 사용하였으며, 세포 배양액 100 μL에 세 적정 용액을 20 μL씩 첨가하여 4시간 동안 배양한 다음 포Fluorescence Multi-Detection Reader (Synergy HT, BIOTEK, USA)로 490 ㎚에서 O.D.값을 측정하여 증식 정도를 측정하였다.

준비된 96 웰 플레이트에 세포 90 μL와 최종 농도가 0.5, 1, 2, 4 ㎎/mL이 되도록 조제된 각각의 추출물을 10 μL씩 각 웰에 분주한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24, 48, 72시간 배양하였다. 세포 증식 측정은 Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, USA)를 사용하였으며, 세포 배양액 100 μL에 세포 적정 용액을 20 μL씩 첨가하여 4시간 동안 배양한 다음 Fluorescence Multi-Detection Reader (Synergy HT, BIOTEK, USA)로 490 ㎚에서 O.D.값을 측정하여 증식 정도를 측정하였다.

준비된 96 웰 플레이트에 세포 90 μL와 최종 농도가 0.5, 1, 2, 4 ㎎/mL이 되도록 조제된 각각의 추출물을 10 μL씩 각 웰에 분주한 후, 각 플레이트는 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 8, 16, 24, 48시간 배양하였다. 배양이 완료된 세포를 팔콘(Falcon) 시험관 (Beckton-Dickinson, USA)으로 옮긴 후, 피코에리트 린(phycoerythrin; PE) 또는 형광 이소티오사이네이트(fluorescein isothiocyanate; FITC)-공액화 항-마우스 CD4 (BD Biosciences, USA), CD8 (BD Biosciences, USA) 모노클로날 항체를 가하여 면역형광염색(direct immunofluorescence staining)을 시행하였다.

형광염색된 비장세포 현탁액에 프로디늄 아이오다이드(propidium iodide; PI, 최종농도 : 25 ㎍/mL)를 가하고 3～4분 후에 유세포분석기 FACSCalibur (유세포분석 System, BD Biosciences, USA)로 시료당 10,000개의 세포에 대하여 FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 등의 파라미터에 대한 자료를 취합하여 CellQuest Pro 프로그램으로 분석하였다. 취합한 자료를 1차적으로 FSC/SSC 도트 플롯에 나타내어 분석 대상 영역을 설정한 후, 이 영역을 만족시키는 세포들을 2차적으로 FSC/FL3 도트 플롯에 나타내었다. FSC/FL3 도트 플롯에서 FL3^-(viable cell) 영역을 설정하여 이 두 영역을 동시에 만족시키는 세포들을 전체 임파구 (total lymphocyte)로 간주하고 림프아세포 자극 효과 및 임파구 아형별 활성화정도를 각각 분석하였다(도 6 및 7 참조).

전체임파구를 세포들만의 세포크기에 비례하는 파라미터인 FSC값에 따라 FSC 히스토그램에 나타내고 아래의 공식에 따라 FSC값 증가율을 구해 이를 시료의 림프아세포 생성 촉진 효과 지표로 사용하였다.

FSC(실험군) - FSC(대조군)

FSC 증가 %= ____________________________ × 100

FSC(대조군)

T 임파구 표면의 CD4 및 CD8분자를 PE 및 FITC 로 각각 형광표지한 전체 임파구를 FL1/FL2 도트 플롯 상에 나타내고 CD4⁺ T cell인 FL1^-FL2⁺세포들을 포함하는 영역과 CD8⁺ T cell인 FL1⁺FL2^-세포들을 포함하는 영역을 설정한 후, 사분면 분석을 통해 CD4/CD8 비율을 계산하고 FSC 히스토그램을 통해 FSC 값의 증가 정도를 분석하였다.

모든 실험 결과는 통계 프로그램인 SAS (Statistic Analysis System)를 이용하여 평균과 표준 편차를 구하였다. 통계 처리는 일방 분산 분석법(one-way analysis of variance; ANOVA)에 의해 수행하였고 p<0.05 수준에서 스튜던츠 t-테스트(Student's t-test)에 의해 유의차를 검증하였다.

실험예 1-1 : 시료의 첨가가 비장 세포 증식능에 미치는 영향

시료의 경구투여로 조혈계 및 생체의 기능적 변화를 비교 분석한 결과 함초 추출물 중 SPⅠ과 SPⅡ의 효과가 두드러졌다. 이와 관련하여 시험관 내 실험을 실시하기 전 함초 추출물 CSP, SPⅠ, SPⅡ를 중심으로 적정 농도와 반응 시간에 따른 비장세포 활성 변화 등을 측정하여 실험을 위한 최적 조건을 확립하고자 하였다.

농도에 따른 비장세포 활성 차이를 알아보기 위하여, 분리한 비장 세포를 5 × 10⁵ cells/well로 넣고 시료를 농도별로 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6 ㎎/mL첨가하여 24, 48 및 72시간 배양하여 증식정도를 비교한 결과는 도 3과 같다. CSP, SPⅠ, SPⅡ의 비장세포 활성은 각 농도별로 대조군에 비해 높게 나타났으며, 24시간 배양시 CSP는 3.5 ㎎/mL에서 172.5, SPⅠ과 SPⅡ는 5.5 ㎎/mL에서 362, 322 수준으로 대조군에 비해 농도 의존적으로 향상되었다. 48시간 배양시 CSP와 SPⅡ는 6 ㎎/mL에서 156.5, 261.5, SPⅠ은 5.5 ㎎/mL에서 291.5 수준으로 대조군에 비해 농도 의존적으로 향상되었으며, 72시간 배양시 CSP는 6 ㎎/mL에서 133, SPⅠ과 SPⅡ는 5.5 ㎎/mL에서 240, 181 수준으로 대조군에 비해 농도 의존적으로 향상되었다. 특히, 24시간 배양시 SPⅠ과 SPⅡ에서 최대 증식능을 보였다. 본 연구에서 비장세포 활성능 측정을 위한 실험 조건의 균일성을 위해 시료의 첨가 농도는 0.5, 1, 2, 4 ㎎/mL 로 정하고, 반응시간은 24, 48, 72 시간으로 결정하였다.

비장 세포의 증식반응을 알아보기 위하여, 분리한 비장 세포를 5 × 10⁵ cells/well로 넣고 시료를 농도별로 첨가하여 24, 48 및 72시간 배양하여 증식정도를 비교한 결과는 도 4 와 같다. 함초 추출물을 첨가하여 배양한 경우 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비해 농도 의존적으로 비장 세포의 증식 반응이 나타났다. 함초 추출물에 의한 비장 세포 증식능의 변화를 살펴보면, 4 ㎎/mL 농도에서 24시간 배양한 경우 CSP, SPⅠ, SPⅡ군 모두 세포 증식능이 205.01, 320.62, 307.32 수준으로 향상되어 유의적인 수치를 나타내었다. 특히 SPⅠ과 SPⅡ군이 CSP군보다 세포 증식능이 효과적이었다.

비장세포의 세포 증식능 실험에서 함초 추출물이 비장 세포의 증식을 유도하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 이때, 증식하는 비장 세포는 T 세포 또는 B 세포 중 하나일 가능성이 높다. 따라서, 비장 세포에서 T세포만을 따로 분리하여 함초 추출물을 첨가한 후에 직접적으로 증식 반응을 유도하는지를 알아보았다. Nylon wool을 이용하여, 비장세포 중에서 부착성을 가진 B세포와 대식 세포를 제거한 다음, 순수한 T세포만을 분리하여 5 × 10⁵ cells/well을 넣고 시료를 농도별로 첨가하여 24, 48 및 72시간 배양하여 증식 정도를 측정하였다. 도 5 에 나타난 것과 같이, 분리된 T 세포는 함초 추출물을 첨가하여 배양한 경우 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비해 농도의존적으로 세포 증식 반응이 나타났으며, 함초 추출물에 의한 T 세포 증식능의 변화를 살펴보면, 4 ㎎/mL 농도에서 24시간 배양한 경우 CSP, SPⅠ, SPⅡ군 모두 세포 증식능이 176.76, 350.39, 330.08 수준으로 향상되어 유의적인 수치를 나타내었다. 특히 SPⅠ과 SPⅡ군이 CSP군보다 세포 증식능이 효과적이었다.

실험예 1-2 : 림프아세포 생성 자극 효과

항원의 자극을 받지 않은 휴지기 상태의 림프구는 작은 림프구 (samll lymphocyte)로 체내에 존재하며, 항원의 자극반응으로 휴지상태의 림프구는 큰 림프구 (large lymphocyte)인 림프아세포 (lymphoblasts)로 전환된다. 비장세포에 대한 함초 추출물 CSP, SPⅠ, SPⅡ의 림프아세포 생성 자극 효과를 알아보기 위하여, 분리한 비장 세포를 5 × 10⁷ cells/well로 넣고 시료를 농도별로 0.5, 1, 2, 4 ㎎/mL첨가하여 8, 16, 24 및 48시간 배양한 후, 세포 직경과 비례하는 FSC 값을 유세포분석을 이용하여 측정한 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

<표 2>

마우스 비장세포에 대한 함초 추출물의 림프아세포 형성 촉진 효과

비장세포(5×10⁷ cells/well)를 상이한 농도의 CSP, SPⅠ 및 SPⅡ로 8, 16, 24 및 48 시간 동안 처리함. FSC 평균은 분석한 10,000 세포의 평균 전방 산란 값( Foward Scatter; FSC)임.

총 세포 수 : 10,000.

각 값은 평균 ± SD (n=3)임.

^a)% 증가율 = 시험군의 FSC 평균 - 시험군의 FSC 평균/대조군의 FSC 평균× 100.

CSP; 함초 조 추출물

SPⅠ; 함초 다당체 Ⅰ

SPⅡ; 함초 다당체 Ⅱ.

함초 추출물을 첨가하여 배양한 경우 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비해 농도 의존적으로 FSC값을 유의성 있게 증가시킴으로써 림프아세포 생성 자극효과를 나타내었다. 최대의 림프아세포 생성 자극효과를 보인 48시간 배양의 경우를 살펴보면, 대조군에서 전체 임파구의 FSC 값은 281.76이었으나, CSP, SPⅠ, SPⅡ를 첨가한 경우 농도 의존적으로 FSC 값이 증가하여 4 ㎎/mL에서 304.03, 319.05, 321.27 수준으로 각각 7.90, 13.23, 14.02%의 증가가 확인되었다.

실시예 1-3 : CD4 ⁺ 및 CD8 ⁺ T 세포의 활성화 효과

한편 이들 임파구 중 면역능에서 중요한 역할 을 담당하는 T 세포에 대한 영향을 알아보기 위하여 T 세포를 CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포로 구별하여 분석한 결과는 표 3과 같다. 분리한 비장 세포를 5×10⁷ cells/well로 넣고 시료를 농도별로 0.5, 1, 2, 4 ㎎/mL첨가하여 8, 16, 24 및 48시간 배양한 후, PE로 표지된 CD4⁺ mAb와 FITC로 표지된 CD8⁺ mAb로 직접면역형광염색을 실시하여 유세포분석를 이용하여 측정한 결과, T 보조 세포로 작용하는 CD4⁺ T세포에 대하여 현저한 활성화 효과를 보이는 것으로 나타났다. 함초 추출물을 첨가하여 배양한 경우 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비해 농도 의존적으로 CD4⁺ T 세포의 평균 FSC값을 유의성 있게 증가시킴으로써 CD4⁺ T 세포의 활성화 효과를 나타내었다. 최대의 CD4⁺ T 세포의 활성 효과를 보인 48시간 배양의 경우를 살펴보면, 대조군에서 전체 임파구의 CD4⁺ T 세포의 평균 FSC 값은 280.38이었으나, CSP, SPⅠ, SPⅡ를 첨가한 경우 농도 의존적으로 평균 FSC 값이 증가하여 4 ㎎/mL에서 309.29, 359.41, 339.73 수준으로 각각 9.02, 24.67, 18.52%의 증가가 확인되었다. 반면, 암세포 등 표적세포를 직접 공격하는 세포독성 T 세포로 작용하는 CD8⁺ T 세포에 대하여 CSP, SPⅠ, SPⅡ를 첨가한 경우, 평균 FSC 값이 277.71, 305.04, 302.52 수준으로 그 증가율이 0.79, 10.71, 9.80%에 머물렀다. 이는 함초 추출물중 특히 SPⅠ과 SPⅡ가 T 림프세포 중 CD4⁺ T 세포를 더 많이 림프아세포로 전환시켰음을 의미한다. 뿐만 아니라, CD4/CD8 비율에서도 보여지듯이 24시간 배양시 대조군의 경우 2.574였으나, CSP, SPⅠ, SPⅡ의 경우 농도 의존적으로 4 ㎎/mL에서 6.050, 6.726, 3.500 수준으로 향상되었음을 확인 할 수 있었다(표 4 참조).

<표 3>

마우스 비장세포에 대한 함초 추출물의 CD4⁺ 및 CD8⁺ 림프아세포 촉진 효과

배양한 림프세포를 직접 염색법으로 PE-공액화 항-마우스 CD4 mAb 및 FITC-공액화 항-마우스 CD8 mAb으로 이중 표지한 후, FACSCalibur 유세포분석 시스템을 이용하여 분석함.

총 세포 수 : 10,000.

각 값은 평균 ± SD (n=3)임.

CSP; 함초 조 추출물

SPⅠ; 함초 다당체 Ⅰ

SPⅡ; 함초 다당체 Ⅱ.

<표 4>

마우스 비장세포에 대한 함초 추출물의 CD4/CD8 비율

비장세포(5×10⁷ cells/well)를 상이한 농도의 CSP, SPⅠ 및 SPⅡ로 8, 16, 및 24 시간 동안 처리함. 배양한 림프세포를 직접 염색법으로 PE-공액화 항-마우스 CD4 mAb 및 FITC-공액화 항-마우스 CD8 mAb으로 이중 표지한 후, FACSCalibur 유세포분석 시스템을 이용하여 분석함.

총 세포 수 : 10,000.

각 값은 평균 ± SD (n=3)임.

CSP; 함초 조 추출물

SPⅠ; 함초 다당체 Ⅰ

SPⅡ; 함초 다당체 Ⅱ.

실험예 2 : 함초 다당체의 마우스 면역 증강 활성에 대한 생체 내 실험

생체 내 실험에서는 함초의 3개 추출물 (CSP, SPⅠ, SPⅡ)을 3차 멸균 증류수로 용해시킨 후 적정 농도로 희석하여 사용하였다. 마우스를 임의 배치법에 의해 대조군과 투여군으로 나누었으며, 실험군마다 6마리씩 사용하였다. 함초의 3개 추출물 (CSP, SPⅠ, SPⅡ)을 투여 직전 3차 멸균 증류수에 현탁하여 마우스 체중 10g당 함초 추출물 현탁액 0.1 mL를 투여할 수 있는 농도로 조제한 다음, LD₅₀(25,550 ㎎/㎏)와 EPA의 면역 독성 지침서 (U. S. EPA, 1996)를 기준으로 하여 결정한 용량을 하루 1회 (200 ㎎/㎏ body weight) 14일간 경구 투여하였다. 대조군에는 동량의 3차 멸균 증류수를 같은 방법으로 투여하였다.

모든 실험 동물에 대한 체중은 시험 물질 투여 개시 직전에 1회 측정하였고, 투여 개시 이후에는 매일 1회씩 동일한 시간에 측정하였다. 실험 종료 후 실험 동물에 대해 urethane (3 g/㎏ body weight; Sigma Chemical Co., St. Louis)을 복강에 주사하여 마취하에 복강을 절개하여 주요 장기인 간장, 신장 (좌, 우), 흉선, 비장을 적출하여 중량을 측정하였다.

무균적으로 비장을 적출하여 비장의 무게를 측정한 뒤, 실험 동물 체중의 차 이에 따른 변이를 없애고 이를 표준화하기 위하여 적출 비장의 무게와 마우스의 체중을 바탕으로 아래의 공식에 따라 비장 지수를 구하였다.

모든 동물에 대해 우레탄 (3 g/㎏ body weight; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)을 복강에 주사하여 마취하에 복강을 절개하여 후대정맥에서 혈액을 채취하였다. 채혈한 혈액의 일부는 혈액학적 검사를 하기 위해 EDTA-2K처리된 CBC 채혈병에 넣고 10분간 혼합하여 응고를 방지하였고, 나머지 혈액은 혈액생화학 검사를 위해 채혈 후 40분 이내에 3,000 rpm으로 10분간 원심분리를 실시한 후 분리된 혈청을 -80℃에서 보관하였다.

채혈 전 약 6시간 절식을 시켜 후대정맥으로부터 채혈하였으며, 채혈 후 자동혈구계측장치 (XE-2100, Sysmex Co., Japan)를 사용하여 WBC, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT를 측정하였고, -80℃에 보관된 혈청을 검사실시 1시간 전에 꺼내어 상온에서 해동한 후 혈액생화학 분석기기 (ABVIA-2400, SIENEMX Co., Japan)를 이용하여 AST, ALT를 측정하였다(표 2 참조).

<표 5>

약어, 단위 및 혈액작용 및 생화학 항목의 분석 방법

면역세포의 증식에 미치는 효과를 측정하기 위하여 마우스의 비장을 이용하였다. 먼저 마우스의 비장을 무균적으로 적출하여 RPMI 1640으로 씻은 다음 핀셋과 멸균 슬라이드를 이용하여 단일세포 부유액을 만들었다. 단일세포 부유액을 RPMI 1640으로 2회 세척한 다음 lysing buffer (BD PharmLyse^™ Lysis Buffer)에 3분간 현탁시켜 적혈구를 제거하고 다시 원심 세척한 다음 5 × 10⁵ cells/well 농도가 되게 희석한 후 96 웰 플레이트에 웰 당 90 μL씩 첨가하여 세포 증식능 측정에 이용하였다.

준비된 96 웰 플레이트에 세포를 90 μL씩 분주하고 각 군당 양성 대조군으 로서 콘카나발린 A(concanavalin A; Con A, 5 ㎍/mL)와 리포다당류(lipopolysaccharide; LPS, 15 ㎍/mL)를 각각 10 μL씩 분주하고 대조군에는 3차 멸균 증류수를 동량 분주한 후, 각 plate는 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24, 48, 72시간 배양하였다. 세포 증식 측정은 Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, USA)를 사용하였으며, 세포 배양액 100 μL에 Cell titer 용액을 20 μL씩 첨가하여 4시간 동안 배양한 다음 Fluorescence Multi-Detection Reader (Synergy HT, BIOTEK, USA)로 490 ㎚에서 O.D.값을 측정하여 증식 정도를 측정하였다.

실험예 2-1 : 혈액 및 혈액생화학적 검사

혈액 및 혈액생화학적 검사는 조혈계 및 생체의 기능적 변화를 나타내는 지표로써, 정확한 질병의 진단이나 이상치를 확인하는데 반드시 필요하다. Balb/c 마우스의 함초 추출물에 대한 혈액학적 분석결과는 표 6에 나타낸 바와 같다.

<표 6>

3 가지 상이한 함초 추출물을 경구 투여한 마우스에서의 혈액작용 효과

각 값은 평균± SD (n=3)임.

^* p<0.05에서 대조군과 유의적으로 차이를 보임.

CSP; 함초 조 추출물

SPⅠ; 함초 다당체 Ⅰ

SPⅡ; 함초 다당체 Ⅱ.

혈액학 분석 결과 유의성 있는 변화는 HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT에서 나타났고, 개체간 변동이 가장 큰 항목은 PLT이고 MCV수치가 개체간 변동이 가장 작았다. 본 연구에서 혈액학적 수치는 시료에 관계없이 WBC를 제외하고는 측정치가 높게 나타났다. RBC 측정치는 대조군에 비해 CSP (11.52 ± 1.06), SPⅠ (10.66 ± 1.40), SPⅡ (11.67 ± 1.68) 으로 높은 수치를 보였고, 적혈구 지수인 MCV, MCH, MCHC 은 비슷한 수치를 보였다. 특히, SPⅡ가 CSP에 비해 적혈구 수 및 적혈구 지수 모두 높게 측정되었다. 본 연구에서 PLT 수는 대조군 (166.00 ± 22.07)과 CSP (178.33 ± 71.02)군에 비해 SPⅠ (195.00 ± 11.79)과 SPⅡ (188.33 ± 46.09)이 유의적으로 높게 나타났다. 이는 표 10 에 보여진 것과 같이 비장의 비정상적인 증대 지표인 비장 지수(Spleen index)가 CSP, SPⅠ, SPⅡ에서 1.057 ± 0.315, 0.972 ± 0.127, 0.813 ± 0.144 수준으로 혈액내 PLT 수치에 반비례하여 측정되었음을 확인 할 수 있다. 백혈구 백분율 감별결과를 하기 표 7에 나타내었다.

<표 7>

세 가지 상이한 함초 추출물을 경구 투여한 마우스의 WBC 감별 계수 결과

각 값은 평균 ± SD (n=6)임.

^* p<0.05에서 대조군과 유의적으로 차이를 보임.

CSP; 함초 조추출물

SPⅠ; 함초 다당체Ⅰ

SPⅡ; 함초 다당체 Ⅱ.

호중구(neutrophil)는 SPⅡ군에서 39.67 ± 8.62으로 높은 비율이었고, CSP군에서 10.33 ± 3.21으로 감소되었다. 호산구(eosinophil)는 모든군에서 비슷한 비율을 나타내었다. 림프구(lymphocyte)는 CSP군에서 86.33 ± 4.51으로 높은 비율을 차지하였으며, 단구(monocyte)는 타 연구에 비해 높은 비율로 나타났다. 호염기성세포(basophil)은 대조군과 CSP군에서 낮은 비율로 나타났으며, SPⅠ과 SPⅡ군에서는 관찰되지 않았다. 혈액생화학적 분석 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

<표 8>

세 가지 상이한 함초 추출물을 경구투여한 마우스의 생화학적 수치

각 값은 평균 ± SD (n=6)임.

^* p<0.05에서 대조군과 유의적으로 차이를 보임.

CSP; 함초 조추출물

SPⅠ; 함초 다당체Ⅰ

SPⅡ; 함초 다당체 Ⅱ.

AST활성은 대조군에 비해 CSP군과 SPⅠ군은 유의적차이를 보이지 않았으나 SPⅡ군은 유의적으로 감소하였다. ALT활성은 대조군에 비해 CSP군의 수치가 증가하였으며, SPⅠ군과 SPⅡ군의 수치는 감소하였으나 유의적 차이는 없었다.

실험예 2-2 : 체중 및 장기 무게의 변화 분석

실험 기간 동안 실험 동물의 체중 증가량을 관찰한 결과는 도 8와 같다. 체중 증가량은 함초 추출물을 공급하지 않은 대조군과 함초 추출물을 공급한 실험군 간에 유의적 차이는 없었으나 실험 기간 동안 실험군의 체중이 계속적으로 증가하는 경향을 보였다. 그리고 각 실험군의 장기 중량을 관찰할 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

<표 9>

장기 중량

각 값은 평균 ± SD (n=6)임.

^* p<0.05에서 대조군과 유의적으로 차이를 보임.

CSP; 함초 조추출물

SPⅠ; 함초 다당체Ⅰ

SPⅡ; 함초 다당체 Ⅱ.

즉, 간장 중량, 신장 중량 및 흉선 중량은 각 군간에 다소 차이는 있으나 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았으며, 비장 중량은 대조군 (0.077 ± 0.006), CSP군 (0.097 ± 0.021), SPⅠ군 (0.095 ± 0.021), SPⅡ군 (0.080 ± 0.014)으로 나타나 정상 대조군에 비해 함초 추출물 투여군이 다소 증가 경향은 보였으나 유의적 차이는 없었다.

실험예 2-3 : 비장 무게 측정

비장 지수 (spleen weight index)는 비장의 무게를 표준으로 환산하여 측정지표로 삼는 것으로 비장의 무게에 대한 체중의 비로 나타낸다. 세포 매개성 면역반응인 GVH 반응 (graft-versus-host reaction)에서는 비장의 비정상적인 증대가 양성 반응의 지표로 활용되므로 비장 지수가 1.3 이상일 때 양성 반응으로 결정하기도 하고, 각 실험군마다 비장 무게 지수를 구하여 대조군의 값과 비교하여 이상 유무를 판단하기도 한다. 본 실험예에서 측정한 대조군과 실험군의 비장 무게 지수 및 비장 지수(spleen weight index and spleen index)를 하기 표 10에 나타내었다.

<표 10>

세 가지 상이한 함초 추출물을 경구투여한 마우스의 비장 지수

각 값은 평균 ± SD (n=6)임.

^* p<0.05에서 대조군과 유의적으로 차이를 보임.

^a)비장-무게 지수 = 비장 무게(g)/체중(g)×100

^b)비장지수 = 시험군의 비장-무게 지수의 평균/대조군의 비장-무게 지수의 평균.

CSP; 함초 조추출물

SPⅠ; 함초 다당체Ⅰ

SPⅡ; 함초 다당체 Ⅱ.

함초 추출물을 투여한 실험군의 경우 함초 추출물을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 비장지수가 CSP, SPⅠ, SPⅡ에서 1.057, 0.972, 0.813 수준으로 감소하는 경향을 보였다.

실험예 2-4 : 비장 세포 증식능 측정

본 실험예에서는 함초 추출물을 마우스에 경구 투여하여 비장 세포 증식능을 관찰하였다. 먼저, 함초 추출물을 투여한 군과 투여하지 않은 대조군으로 나누어 비장 세포 증식능을 측정하였고, 세포 배양 시 미토겐(mitogen; 림프구 비특이 활성제)인 Con A (5 ㎍/mL)와 LPS (15 ㎍/mL)를 각 웰에 첨가하였고 이에 대한 대조군으로 미토겐 대신 3차 증류수를 동량 첨가하여 비장 세포 증식 계수를 구하여 비교하였다. 마우스에서 분리한 비장 세포를 5 × 10⁵ cells/well로 넣고 미토겐을 첨가하여 24, 48 및 72시간 배양하여 증식 정도를 비교한 결과는 도 10과 같다. B세포의 증식을 특이적으로 유도하는 LPS와 T 세포의 증식을 특이적으로 유도하는 Con A 에 의해서 비장 세포는 72시간 배양 후 유의적으로 최대 증식 반응을 나타내었 다. 그리고 함초 추출물을 투여하고 미토겐을 처리하지 않은 경우에는 세포 증식능이 저하되었으나, Con A 처리 시에는 72시간 배양 시 SPⅠ과 SPⅡ군에서 각각 최대의 증식능(65.38 ± 2.55, 54.55 ± 2.86)을 보였다. 특히 SPⅠ과 SPⅡ군이 CSP군보다 세포 증식능이 효과적이었다.

도 1은 함초로부터 다당체를 정제하기 위한 개략적인 과정을 나타낸 공정도이다.

도 2는 함초 다당체 II(SP II)의 겔투과 크로마토그래피 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 마우스 비장세포에 대한 CSP, SP I 및 SPII의 세포 증식 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 마우스 비장세포에 대한 CSP(a), SPⅠ(b) 및 SPⅡ(c)의 세포 증식 결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 마우스 비장세포에서 분리한 R 세포에 대한 CSP(a), SPⅠ(b) 및 SPⅡ(c)의 세포 증식 결과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 각각 림프세포 및 생존 세포를 위한 게이트 1(G1) 및 게이트 2(G2)를 나타내는 대표 도트 플롯이다.

도 7은 게이트 3(G3) 및 게이트 4(G4)를 나타내는 대표 도트 플롯이다.

도 8은 연령에 따른 Balb/c 마우스의 체중 변화를 나타낸 그래프이다.

도 9는 세 개의 상이한 함초 추출물을 경구 투여한 마우스로부터 분리한 비장세포의 증식에 대한 미토게의 효과를 나타낸 그래프이다.

Claims

함초 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강 활성 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 함초 추출물이 함초 다당체인 것을 특징으로 하는 면역 증강 활성 약학 조성물.
함초 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강 활성 건강식품 조성물.
제3항에 있어서, 상기 함초 추출물이 함초 다당체인 것을 특징으로 하는 면역 증강 활성 건강식품 조성물.