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KR20100090684A - 신규한 접합 단백질 및 펩티드 - Google Patents

신규한 접합 단백질 및 펩티드 Download PDF

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KR20100090684A
KR20100090684A KR1020107010204A KR20107010204A KR20100090684A KR 20100090684 A KR20100090684 A KR 20100090684A KR 1020107010204 A KR1020107010204 A KR 1020107010204A KR 20107010204 A KR20107010204 A KR 20107010204A KR 20100090684 A KR20100090684 A KR 20100090684A
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polymer
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electron
peptide
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스테판 브로치니
페니 브라이언트
유에후아 콩
안토니 고드윈
케이스 포웰
최지원
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폴리테릭스 리미티드
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Abstract

신규한 접합 단백질 및 펩티드
본 발명은 폴리히스티딘 태그에 의해서 접합이 발생하도록, 폴리머 접합제가 특정 조건하에서 폴리히스티딘 태그를 포함하는 단백질 또는 펩티드와 반응하는 단계를 포함하는 단백질 또는 펩티드에 폴리머, 특히, PEG를 접합시키는 신규한 방법을 제공한다. 이에 의한 접합체는 신규하다. 또한, 본 발명은 다음의 일반적인 화학식의 신규한 접합체에 관한 것이다.
Figure pct00027

상기 화학식에서,
X 및 X' 중 하나는 폴리머를 나타내고, 다른 하나는 수소 원자를 나타내고;
각각의 Q는 독립적으로 연결기를 나타내며;
W는 전자-구인 모이어티, 또는 전자-구인 모이어티의 환원에 의해 제조 가능한 모이어티를 나타내고; 또한, X'가 폴리머를 나타내면, X-Q-W-는 함께 전자-구인기를 나타낼 수 있으며; 추가로, X가 폴리머인 경우, X' 및 전자-구인기 W가 삽입 원자와 함께 고리를 형성할 수 있고;
Z는 각가의 히스티딘 잔기에 의해서 A 및 B에 결합된 단백질 또는 펩티드를 나타내며;
A는 C1-5 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬; 및
B는 결합 또는 C1 -4 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬이다.

Description

신규한 접합 단백질 및 펩티드{Novel Conjugated Proteins and Peptides}
본 발명은 신규한 접합 단백질 및 펩티드, 및 이의 제조에 관한 것이다.
수많은 치료 요법적 활성 분자, 예를 들어, 단백질은 임상적 치료 용도에서 효율을 얻기 위해서 요구되는 특성을 포함하지 않는다. 예를 들어, 많은 천연 단백질은 환자에게 투여하는 것에 의존하기 때문에 좋은 치료약을 만들 수가 없으며, 다음을 포함하는 고질적인 결점이 있다: (1)단백질은 혈액 또는 조직 내에서 존재하는 수많은 엔도-또는 엑소-펩티다제(endo- and exo-peptidases)에 의해서 분해될 수 있다; (2) 많은 단백질은 몇 가지 크기에 면역성이 있고; 및 (3) 단백질은 투석 한외 여과(kidney ultrafiltration) 및 엔도카이토시스(endocytosis) 에 의해서 빠르게 방출될 수 있다. 의약 분야에서 활성 치료제로서 유용성을 발견할 수 있는 몇 가지 분자는 전신성적으로 독소이거나 또는 최적의 생체내에 이용효율 및 약물의 흡수율이 부족하다. 단백질이 신속하게 혈액의 순환으로 정화할 때, 전형적으로 이들은 빈번하게 환자에서 투여되어야한다. 빈번한 투여는 독성, 특히, 면역학적으로 유도된 독성의 피해를 더 증가시킨다.
수용성, 합성 폴리머, 특히, 폴리알킬렌 글리콜은 이러한 단백질로서 치료 요법적으로 활성 분자를 접합하는데 광범위하게 이용된다. 이러한 치료용법적 접합체(conjugate)는 장기 순환 시간에 의해서 양호한 약물의 흡수 변경하고 정화율을 감소시키는 것으로 나타나고 있으며, 전신성적 독성의 감소, 및 여러 경우에는, 임상적 효율에서 증가를 보여준다. 공유결합적으로 폴리에틸렌 글리콜, PEG를 단백질에 접합시키는 방법은 일반적으로 "페그화(PEGylation)" 알려져 있다.
단백질에 접합된 폴리머의 수가 각 분자에 대해서 동일하고, 각 폴리머 분자는 특이적으로 각 단백질 분자 내에서 동일한 아미노산 잔기와 공유결합적으로 접합되는 투여 단위의 일관성을 보장하기 위해서, 효율을 최적화하는 것이 중요하다. 단백질을 따르는 위치에서 비-특히 접합은 어렵고 순도가 높은 컴플렉스 혼합물을 제조하기 위해서, 접합생성물의 분포, 빈번하게는 미접합 단백질을 나타낸다.
WO 2005/007197는 신규한 접합제의 나열을 기재하였다. 이것은 단백질-폴리머 접합체를 생성하도록 생물학적 분자, 예를 들어, 단백질 내에서 친핵적 작용기(nucleophilic group)와 반응하는데 이용될 수 있다. 이러한 시약은 신규한 티오에테르 접합체를 제공하기 위해서 단백질 내에서 다이설피드(disulfide) 결합에서 유도된 두 개의 황원자와 접합하는 이들의 능력에 대한 특정 유용성을 발견하였다.
고정-금속 친화성 크로마토그래피(Immobilized-metal affinity chromatography, IMAC)는 단백질 및 펩티드의 정제를 위한 표준 방법이다. 이러한 방법에서, 폴리히스티딘 태그,"his-tag"로 자주 표시되는(연속적 히스티딘 잔기의 짧은 사슬, 전형적으로 5 또는 6의 잔기, 천연 단백질 내에는 존재하지 않는), 일반적으로 아미노산 사슬의 말단들 중 하나에서, 합성 방법으로 단백질에 결합된다. 생성된 단백질 또는 펩티드는 "태그화된 히스티딘"으로 명명된다. 폴리히스티딘 태그는 적어도 두 개의 히스티딘 잔기에 의해서 니켈 및 코발트와 같은 금속에 강하게 결합한다. IMAC에서, 폴리히스티딘 태그 단백질은 니켈- 또는 코발트-함유 컬럼에 통과된다. 폴리히스티딘 태그는 컬럼에 강하게 결합되기에 혼합물로부터 분리되도록 표지 단백질을 이용할 수 있다. 폴리히스티딘 태그는 다음의 데이타에서 혼합물에서 분리되도록 이로부터 유도된 생성물 또는 이들을 이용가능하도록 넓은 범위의 단백질 및 펩티드에 부착되어져 광범위하게 사용된다.
몇 가지 비표지 단백질은 서로 간에 매우 밀접한 히스티딘 잔기를 포함하고, 또한, 상기 단백질은 폴리히스티딘 태그 단백질에 비해 일반적으로 보다 강하지 않지만, 니켈 및 코발트 IMAC 컬럼에 결합될 수 있다.
현재 우리는 폴리머, 특히, PEG를 단백질 및 펩티드에 접합시키(conjugating)는 개선된 방법을 발견하였다. 이러한 방법에서, 폴리머는 폴리히스티딘 태그에 접합된다. 놀랍게도, 히스티딘 잔기에 결합하는 시약의 능력은 천연 단백질에서 존재하는 단일 히스티딘 잔기보다는 폴리히스티딘 태그에 더 우선적으로 반응하다는 것으로 이해된다. 생성된 접합체는 신규하다. WO　2005/007197의 시약은 신규 접합체를 생성하기 위해서 천연 단백질(native protein)내에 유사한 히스티딘 구조를 포함하는 단백질 및 펩티드 뿐만 아니라 폴리히스티딘 태그를 포함하는 단백질 및 펩티에 대해 매우 효과적이고, 안정적인 접합제로서 작용한다.
따라서, 본 발명은 상기 폴리히스티딘 태그에 의해서 접합이 발생하도록 특정 조건 하에서 상기 단백질 또는 펩티드와 폴리머 접합제(polymeric conjugation reagent)의 반응 단계를 포함하는, 폴리히스티딘 태그를 포함하는 단백질 또는 펩티드에 폴리머를 접합하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리히스티딘 태그를 도입하는 단계 및 실질적으로 상기 폴리히스티딘 태그에 의해서 접합이 발생하도록 특정 조건 하에서 폴리머 접합제와 상기 단백질 또는 펩티드과 반응하는 단계를 포함하는 단백질 또는 펩티드에 폴리머를 접합하는 방법을 제공한다.
본 발명의 폴리머 접합체는 신규하고, 그러므로, 본 발명은 접합이 그 자체, 폴리히스티딘 태그에 의해서 이루어지는, 상기 단백질 또는 펩티드에 접합된 폴리머를 포함하는 화합물도 제공한다.
상기 화합물은 일반적인 화학식으로 나타낼 수 있다:
Figure pct00001
상기 화학식에서, X는 폴리머를 나타내고; Q'는 연결기를 나타내며; (his)u 는 u의 히스티딘 구성 단위를 포함하는 폴리히스티딘 태그; 및 Z는 상기 폴리히스티딘 태그에 의해 결합된 단백질 또는 펩티드를 나타낸다. 폴리히스티딘 태그에 결합 가능한 임의의 폴리머 접합제는 본 발명의 제조 방법에서 이용될 수 있다.
상기 시약은 폴리히스티딘 태그에 결합할 뿐만 아니라 예를 들어, 천연 단백질 또는 단백질(폴리히스티딘 태그에는 존재하지 않는) 내에 존재하는 두 개의 히스티딘 잔기에 결합가능한 것으로도 발견되어진 WO 2005/007197의 이기능성 시약을 포함하고, 상기 잔기는 상기 두 개의 히스티딘 잔기에 상기 이기능성 시약의 접합이 가능하도록 자연적 구조 내에서 서로 간에 충분히 밀접하게 배치되어 있다. 따라서, 본 발명은 다음의 일반적인 화학식을 더 제공한다.
Figure pct00002
상기 화학식에서,
X 및 X' 중 하나는 폴리머를 나타내고, 다른 하나는 수소 원자를 나타내고;
각각의 Q는 독립적으로 연결기를 나타내며;
W는 전자-구인 모이어티 또는 전자 구인 모이어티의 환원에 의해서 제조가능한 모이어티를 나타내고; 또는 X'가 폴리머를 나타내면, X-Q-W-는 함께 전자-구인기(electron withdrawing group)를 나타낼 수 있으며; 및 추가로, X가 폴리머이며, X' 및 전자-구인기 W는 삽입 원자( interjacent atoms)와 함께 고리를 형성할 수 있고; Z는 각가의 히스티딘 잔기에 의해서 A 및 B에 결합된 단백질 또는 펩티드를 나타내며;
A는 C1-5 알킬렌 또는 알케닐렌(alkenylene) 사슬; 및 B는 결합, 또는 C1-4 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬이다.
본 발명의 신규한 화합물의 다른 작용기는 다음의 일반적인 화학식으로 나타낸다:
Figure pct00003
상기 화학식에서,
X는 폴리머를 나타내고; Q가 연결기를 나타내고; W는 전자-구인 모이어티 또는 전자-구인 모이어티의 환원에 의해서 제조가능한 모이어티를 나타내며; v는 0 또는 1 내지 4의 정수를 나타내고; v'는 1 내지 8의 정수를 나타내며; 및 Z는 폴리히스티딘 태그에 의해서 결합된 단백질 또는 펩티드를 나타낸다. 이러한 화합물에서, 바람직하게는 v'는 1 내지 6의 정수를 나타내고, 바람직하게는 1 내지 4이고, 예를 들어, 이다. 바람직하게는 v는 0이다.
본 발명의 제조 방법에서 사용될 수 있는 다른 시약은 아실화(acylation) 또는 알킬화가 가능한 시약을 포함한다. 상기 시약은 예를 들어, 모노 또는 다기능성(multifunctional)일 수 있고, 예를 들어, PEG 카보네이트 (예를 들어, PEG-p-니트로페닐 카보네이트(PEG-p-nitrophenyl carbonate), PEG-숙신이미딜 카르보네이트(PEG-succinimidyl carbonate), PEG-벤조트리아졸릴 카보네이트(PEG-benzotriazolyl carbonate)), PEG 카르복실레이트 및 PEG 에스테르(예를 들어, PEG-숙신이미딜 에스테르 및 PEG-p-니트로페닐 에스테르 및 이의 유도체들), PEG 알데하이드, PEG 트레실-(PEG-tresyl) 또는-토실(-tosyl), PEG-다이클로로트리아진(dichlortriazine) 또는 -클로로트리아진(chlorotriazine), PEG 비닐 설폰(vinyl sulfone), PEG말레이미드(maleiimide) 및 PEG-아이오도아세타민(iodoacetamide); 및 PEG와 다른 폴리머를 포함하는 이와 상응하는 시약를 포함할 수 있다.
본 발명의 신규한 접합체에서 Z는 단백질 또는 펩티드에서 유도될 수 있다. 보다 구체적으로, "단백질"은 편의상 사용될 것이고, 달리 요구된 것을 제외하고는, "단백질"에 관한 언급은 "단백질 또는 펩티드"에 관련된 것으로 이해될 수 있다.
화학식 Ia의 신규한 접합체의 일부로 형성한 단백질은 적어도 두 개 이상의 히스티딘 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 두 개의 잔기는 천연 단백질 내에서 존재 할 수 있다면, 상기 두 개의 잔기는 작용기 A 및 B에 접합가능하도록 자연적 구조(native structure) 내에서 서로 간에 충분히 밀접하게 배치될 수 있다. 이것은 두 개의 히스티딘 잔기가 단백질 사슬 내에서 서로 간에 인접할 경우에 발생될 수 있거나 또는 이들은 단백질의 접힙으로 인하여 함께 접근할 수 있다.
이와 같은 단백질은 일반적으로 IMAC 컬럼에 결합한다. 예를 들어, 원핵 생물 대장균(prokaryotic organism EscherichiColi)은 IMAC 컬럼에 결합할 수 있는 YODA로 알려진 하나의 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 그러나, 두 개의 히스티딘 잔기는 폴리히스티딘 태그(polyhistidine tag)의 일부를 형성한다. 즉, 천연 단백질 또는 펩티드에서는 발견될 수 없고, 적절한 수단에 의해서 단백질 또는 펩티드에 부착된 히스티딘 잔기이다. 예를 들어, 상기 적절한 수단은, 폴리히스티딘 태그를 포함하는 폴리히스티딘 태그 또는 모이어티로 번역후(post-translational)라벨링하는 화학적 수단, 또는, 예를 들어, 원하는 길이의 폴리히스티딘 태그에 대해 암호화하는 짧은 암호화 서열을 포함하는 염색체의 이용으로, 표적 단백질과 함께 융합 내(in fusion)에 히스티딘 서열의 삽입하는 단백질 엔지니어링을 이용할 수 있다.
폴리히스티딘 태그는 임의의 원하는 수의 히스티딘 잔기를 포함할 수 있고, 예를 들어, 약 12잔기까지 될 수 있다. 이들은 적어도 2개 이상의 잔기를 포함하여야 한다; 바람직하게는 이들은 3개 이상의 잔기를 포함하고, 특히, 4 내지 10 개의 잔기, 특히, 5 내지 8 잔기를 포함할 수 있고, 예를 들어, 5 또는 6개의 잔기이다. 이들은 단지 히스티딘 잔기만 포함할 수 있거나 또한, 이들은 히스티딘 잔기 이외에 하나 이상의 스페이스(spacer) 잔기 또는 서열(sequences)을 포함할 수도 있다.
본 발명의 접합체 내에 존재하는 결합의 명확한 특성은 현재로서는 알려지지 않았다. SO2R가 이탈기를 나타내고, 바람직하게는 R이 알킬, 아릴, 알카릴(alkaryl), 아르알킬기, 특히, 톨릴기를 나타내는 특정 시약을 사용하여 기술된 가능한 하나의 접합체의 제조는 첨부된 도면의 도 1에 나타내었다. 도 2(a) 및 2(b)는 도 1의 제조 방법으로 제조 가능한 서로 다른 접합체를 보여준다. 도 1 및 2에서 확인가능한 것으로, 결합은 인접한 히스티딘 잔기에서 이루어지지만, 떨어져 있는 접합체의 형성을 방해할 정도로 차지하는 공간이 너무 크지 않다면, 떨어져 있는 히스티딘 잔기와의 결합이 제외될 수는 없다.
폴리히스티딘 태그의 운반 외에, 단백질은 원한다면, 유도화되거나 또는 기능화될 수 있다. 특히, 종래의 천연 단백질의 접합은 그 자체의 민간함 작용기(sensitive group)를 보호하도록 다양한 블럭킹 작용기(blocking group)와 반응할 수 있었다; 또는 본 발명의 방법 또는 다른 방법 중에서 하나를 사용하여 하나 이상의 폴리머 또는 다른 분자와 미리 접합될 수도 있었다. 더욱이, 본 발명의 접합체는 본 발명에 따른 접합 이후에 단백질에 접합된 하나 이상의 추가 폴리머 또는 다른 분자를 가질 수 있다. 단백질이 하나 또는 두 개의 추가 폴리머에 접합된 본 발명에 따른 신규한 접합체는 첨부된 도 3(a), 3(b) 및 3(c)에 나타내었다. 이러한 도면에서, 폴리머는 이들의 연결기와 함께 A, B 및 C로 도시적으로 나타내었고, 반면에, x, y 및 z는 임의의 조합으로 히스티딘 잔기에 의해서 단백질과 접합된 폴리머 A, B 및 C의 전체 수를 나타내었다. 물론, 히스티딘 보다는 잔기에 의해서 하나의 이상의 폴리머의 접합도 가능할 수 있다. 하나 이상의 추가 폴리머(단백질을 포함하는)에 접합 될 뿐만 아니라, 단백질은 저분자, 예들 들어, 치료 요법용 또는 진단용 저분자; 시알산(sialic acid); 당류; 및 녹말류에서 선택되는 하나 이상의 분자와 접합될 수 있다. 도 3에서 B 및 C는 상기 분자들을 나타내었다. 추가로, 도 3은 서로 인접하게 위치한 A, B 및 C를 보여주지만, 이것은 대부분 단지 도시적이고, 이들은 서로 떨어질 수 있다.
단백질이 IMAC 방법으로 미리 정제되었졌거나 또는 단백질 그 자체 또는 이로부터 유도된 생성물을 추가 정제를 보조하기 위해서 상업적으로 구입가능한 많은 단백질은 폴리히스티딘 태그를 포함한다. 폴리머에 단백질을 접합하는 것을 원한다면, 폴리히스티딘 태그와의 접합은 미리 예상되지 못한, 매우 편리한 방법을 제공한다.
접합된 생성물, 특히 페그화된 생성물은 높은 수준의 일관성(consistency)으로 제공될 수 있다. 두 개의 히스티딘 잔기를 접합을 이루게하는 WO　2005/007197의 접합용 시약의 이용은 일반적인 고수율로 획득가능한, 특히 안정적이고 선택적인 접합체를 유도하도록, 장기 주기(macrocycle)로 이루어진다.
일반적으로 폴리히스티딘 태그가 단백질의 표면, 일반적으로 단백질 사슬에서 하나의 말단에서 부착되고, 단백질의 임의의 원하는 부위에 위치될 수 있기 때문에, 단백질의 생물학적 활성은 크게 유지되어지고, 폴리히스티딘 태그을 도입하는 방법 및 폴리폴리머에 폴리히스티딘 태그에서 위치 특이적 접합(site-specific conjugation)의 서열화 공정도 다음에 이어진다. 이러한 이유로 인하여, 본 발명은 전통적인 접합 제조 방법에서 다루기 힘든 것을 미리 해결하여 단백질의 접합체를 형성하는데 이용될 수 있다,
폴리히스티딘 태그가 충분한 수의 히스티딘 잔기를 포함한다면, 본 발명의 접합체는 IMAC를 이용하여 더 정제될 수 있다. 보다 효과적으로, 폴리히스티딘 태그에서 적어도 두 개, 바람직하게는 보다 많은 수의 히스티딘 잔기는 미접합된 것을 남겨서 IMAC 컬럼 내에서 니켈과 결합하는데 필요한다. 접합 후의 자유 히스티딘 잔기 수의 감소는 펩티드 또는 단백질 및 접합된 유도체 간에 IMAC 컬럼과 결합에 대한 선택성을 가능하게 한다. 다중 접합이 동일한 생물학적 분자내에서 발생한 곳에서, IMAC는 다중-접합된 유도체(multi-conjugated derivatives)의 분리를 가능하게 한다.
본 발명의 접합체에서 폴리머(예를 들어, X 또는 X') 폴리알킬렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리아크릴레이트일 수 있고, 예를 들어, 폴리아크릴로일 모르폴린(polyacryloyl morpholine), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate), 폴리옥사졸린(polyoxazoline), 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 또는 폴리메타아크릴아미드(polymethacrylamide)일 수 있으며, 예를 들어, 폴리카르복시메타아크릴아미드(polycarboxymethacrylamide) 또는 폴리아크릴레이트, 또는 2-메타아크릴로일옥세틸 포스파티딜 콜린(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine), 또는 HPMA 코폴리머와 같은 포스파티딜 콜린 곁가지기(phosphatidyl choline pendent group)를 가진 폴리메타크릴레이트(polyacrylate)일 수 있다. 또한, 상기 폴리머는 효소적 또는 가수분해성 붕괴(hydrolytic degradation)에 민감한 것 중 하나일 수 있다.
상기 폴리머는, 예를 들어, 폴리에스테르계(polyesters), 폴리아세탈계(polyacetals), 폴리(오르소 에스테르)계, 폴리카보네이트계(polycarbonates), 폴리(이미노 카보네이트계), 및 폴리(아미노산류)(poly(amino acids))와 같은 폴리아미드계(polyamides)포함할 수 있다. 상기 폴리머는 호모폴리머, 램덤 코폴리머 또는 블럭 코폴리머와 같은 구조적으로 형성된 코폴리머일 수 있고, 예를 들어, 두 개 이상의 알킬렌 옥사이드계에서 유도되거나 또는 폴리(알킬렌 옥사이드)에서 유도된 블럭 코폴리머 및 폴리에스테르(polyester), 폴리아세탈, 폴리(오르소 에스테르)(poly(ortho ester)), 또는 폴리(아미노산)에서 하나일 수 있다. 사용되어진 다기능 폴리머(Polyfunctional polymer)는 다이비닐에테르-무수 말레인산(divinylether-maleic anhydride) 및 스티렌-무수말레인산 (styrene-maleic anhydride)의 코폴리머를 포함할 수 있다.
자연 발생적인 폴리머도 이용될 수 있으며, 예를 들어, 키틴(chitin), 데스트란(dextran), 테스트린(dextrin), 키토산(chitosan), 녹말(starch), 셀루로오스(cellulose), 글리코겐, 폴리(시알릴산))(poly(sialylic acid)) 및 이의 유도체일 수 있다. 단백질는 폴리머로 이용될 수 있다. 이것은 예를 들어, 항체 또는 항체 단편의 하나의 단백질을 제2 단백질, 예를 들어, 효소 또는 다른 활성 단백질과 접합을 허용한다. 또한, 예를 들어, 당전이효소(glycosyltransferase)에 대한 O-글리칸 수용체 위치(O-glycan acceptor site)와 같은, 촉매성 서열(catalytic sequence)을 포함하는 펩티드가 이용된다면, 서열 효소 반응에 대한 기질 또는 표적의 결합(incorporation)을 일으킨다. 폴리글루타민산(polyglutamic acid)과 같은 폴리머는 당류 또는 아미노산과 같은 자연적 발생적 모노머에서 유도된 혼성 폴리 및 에틸렌 옥사이드 또는 메타아크릴산(methacrylic acid)과 같은 합성 모노머로서 이용될 수도 있다.
만약 폴리머가 폴리알킬렌 글리콜(polyalkylene glycol)이다면, 바람직하게는 C2 및/또는 C3 단위체를 포함하는 것이고, 특히, 폴리에틸렌 글리콜이다. 폴리머, 특히, 폴리알킬렌 글리콜는 단일직쇄(single linear chain)를 포함할 수 있거나, 또는 작거나 또는 클수 있는 사슬로 이루어 질 수 있는 분지 형태(branched morphology)를 가질 수 있다. 풀루로닉스(Pluronics)로 불려지는 것은 PEG 블럭 코폴리머의 주류이다. 이것은 에틸렌 옥사이드 및 포르필렌 옥사이드 블럭에서 유도될 수 있다. 예를 들어 메톡시프폴리에틸렌 글리콜(methoxypolyethylene glycol)과 같은 치환된 폴리알킬렌 글리콜이 이용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 단일-사슬 폴리에틸렌 글리콜은 예를 들어, 메톡시, 알릴록시(aryloxy), 카르복시(carboxy) 또는 하이드록시기인 알콕시와 같은 적절한 작용기에 의해서 개시될 수 있고, 다음에 기술되는 바와 같이 연결기(linking group) Q 또는 Q'와 사슬의 나머지 말단이 연결된다. 폴리머는 임의의 원하는 방향으로 선택적으로 유도화되거나 또는 기능화될 수 있다.
반응기(Reactive groups)는 폴리머 말단terminus) 또는 말단기, 펜던트 연결기(pendent linker)를 통하여 폴리머 사슬을 따라 결합될 수 있다. 이런 경우에, 폴리머는 예를 들어, 폴리아크릴아미드, 폴리메타아크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 또는 무수말레인산 코폴리머일 수 있다. 하나 이상의 생물학적 분자(biological molecule)를 포함하는 다중 결합(Multimeric)접합체는 상호작용적(synergistic) 및 부가적 이익을 일으킬 수 있다. 만약 원한다면, 상기 폴리머는 통상적인 방법을 이용하여 고체 지지체와 커플링될 수 있다. 물론, 폴리머의 최적 분자량은 의도되는 적용(application)에 의존한다. 바람직하게는, 수평균분자량은 250 g/mol 예를 들어, 500 g/mole에서 약 75,000 g/mole까지의 범위 내에 있다.
일반적인 화학식 I의 화합물이 예를 들어, 종양(malignancy), 감염 또는 자가 면역 질환(autoimmune disease), 또는 트라우마(trauma)에 의한 염증의 치료에 이용하기 위해, 순환 및 투과조직(penetrate tissue)를 이탈하도록 의도된다면, 2000-30,000 g/mole 범위 내의 저분자량 폴리머를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 적용에서, 일반적인 화학식 I의 화합물이 순환 조직 내에서 남겨지도록 의도된다면, 예를 들어, 20,000-75,000 g/mole 범위 내의 고분자량 폴리머의 사용이 유리할 수 있다. 이용된 폴리머는 접합체가 이의 의도된 용도를 위해 용매 매질 내에서 용해가능하도록 선택될 수 있다. 생물학적 적용에서, 특히, 포유 동물에 임상 치료 요법적 투여에 대한 진단적 적용(diagnostic application) 및 치료 요법적 적용(therapeutic application)에서, 접합체는 수용성 매질 내에서 용해가능할 것이다. 효소와 같은 많은 단백질은 예를 들어, 화학 반응을 촉진하기 위한 산업적 활용성을 가진다. 이와 같은 적용에서 용도로 의도된 접합체에서, 접합체가 수용성 및 유기성 매질 중 하나 또는 이들 모두에서 가용성이 필수적일 수 있다. 물론, 폴리머는 단잭질의 의도된 기능을 과도하게 손상시키지 않는다. 바람직하게는, 폴리머는 합성 폴리머, 및 바람직하게는 수용성 폴리머이다. 수용성 폴리에틸렌 글리콜의 용도는 특히 많은 적용을 위해서 바람직하다.
폴리머는 연결기에 의해서 폴리히스티딘 태그에 안정적인 공유결합으로 연결되어 진다. 화학식 I에서 연결기 Q'는 작용기를 포함할 수 있다(예를 들어, Q'는 화학식 Ia -Q-W-와 동일할 수 있다.) 연결기 Q', 또는 Q는 예를 들어, 직접 결합(direct bond), 하나 이상의 산소 원자, 황원자, -NR기(R이 다음에 정의된 바와 같다), 케토기, -O-CO-기 및/또는 -CO-O-기에 의해서 말단화 또는 중단(interrupted)될 수 있는 알킬렌기 (바람직하게는 C1-10 알킬렌기), 또는 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴기이다.
적절한 아릴기는 페닐 또는 나프탈기를 포함하고, 반면에 적절한 헤테로아릴기는 피리딘, 피롤, 퓨란, 피란, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 피리다진, 피리미딘 및 퓨린(purine)일 수 있다. 폴리머에서 연결제(linkage)는 가수분해적으로 분해성 결합(hydrolytically labile bond) 또는 비-분해성(non-labile bond)결합일 수 있다.
치환기는 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴기에 존재할 수 있는 치환기는, 예를 들어, -CN, -NO2, -CO2R, -COH, -CH2OH, -COR, -OR, -OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, -NR'O2R, -NO, -NHOH, -NR'OH, -C=N-NHCOR, -C=N-NR'COR, -N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R, 할로겐, 예를 들어 불소 또는 염소, -C≡CR, -C=CR2 및 -C=CHR로 부터 선택된 동일 또는 상이한 치환체의 하나 이상을 포함할 수 있다. 각각 R 또는 R'가 독립적으로 수소 원자, 알킬 (바람직하게는 C1-6 알킬) 또는 아릴 (바람직하게는 페닐)기를 나타낸다. 전자-구인기의 존재가 특히 바람직하다.
바람직하게는 화학식 Ia 화합물에서 수소 원자에 결합하는 작용기 Q는 알킬렌기 또는 직접 결합이다. 가장 바람직하게는, 화학식 IA에서 X는 폴리머이고, -X'-Q-는 H-이다.
W는 예를 들어, 케토 또는 알데하이드기 CO, 에스테르기 -O-CO- 또는 설폰기 -SO2-, 또는 예를 들어, CH.OH기, 에테르기CH.OR, 에스테르기 CH.O.C(O)R, 아민기 CH.NH2, CH.NHR 또는 CH.NR2, 또는 아미드 CH.NHC(O)R 또는 CH.N(C(O)R)2와 같은 작용기의 환원에 의해서 획득되는 작용기를 나타낸다. X-Q-W-가 함께 전자-구인기를 나타내면, 이 작용기는 예를 들어, 시아노기이다.
본 발명의 접합 방법에서 사용되는 명확한 조건은 사용되어지는 접합 시약 및 접합되는 단백질 또는 펩티드에 의존할 수 있다. 상기 조건은 당업자에 의해서 일반적으로 알려진 것에 포함된다. 예를 들어, 일반적으로, 반응에 대한 pH는 pH 4 내지 pH 10 사이일 수 있고, 전형적으로 약 6 및 약8.5, 예를 들어 약6.5 내지 8.0, 바람직하게는 약7.0-7.5일 수 있다. 반응 혼합물에서 단백질 또는 펩티드의 농도는 일반적으로 약 0.20 mg/ml 이상일 수 있고, 전형적으로 0.4 mg/ml이상, 예를 들어 0.5 mg/ml 내지 1.5 mg/ml일 수 있다.
제조 방법이 WO　2005/007197의 다기능 시약을 사용한다면, 상기 제조 방법은 다음의 일반적일 화학식 중에서 하나와 적어도 두 개의 히스티딘 잔기를 포함하는 단백질 또는 펩티드의 반응하는 단계를 포함한다:
(II) 다음의 일반적인 화학식
Figure pct00004
X 및 X' 중 하나는 폴리머를 나타내고, 다른 하나는 수소 원자를 나타내고;Q가 연결기를 나타내고; W는 전자-구인기, 예를 들어, 케토기, 에스테르기 -O-CO- 또는 설폰기 -SO2-를 나타내고; 또는, X'가 폴리머인 경우, X-Q-W는 함께 전자-구인기를 나타낼 수 있고;
A는 C1-5 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬을 나타내며;
B는 결합 또는 C1-4 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬을 나타내고; 및
각각의 L이 독립적으로 이탈기를 나타내며,
또는 (III) 다음의 일반적인 화학식
Figure pct00005
X, X', Q, W, A 및 L은 일반적인 화학식 II에 대해 언급된 의미를 가지고, 추가로, X가 폴리머라면, X' 및 전자-구인기 W는 삽입 원자와 함께 고기를 형성하며, m은
1 내지 4의 정수를 나타낸다.
접합제 II 및 III는 서로간에 화학적으로 동일하고, WO 2005/007197에 기술되어 있다. 이들은 두 개의 친핵체에 대한 선택성이 있는 가교-기능화된(cross-functionalised), 잠재적 가교-접합된(latently cross-conjugated), 비스-알킬화 모이어티를 가짐으로써 특성화되어진다. 반응은 시약이 접합되도록 단백질 내에서 두 개의 히스티딘 잔기와 결합하는 조건 하에서 수행되어 진다. 두 개의 히스티딘 잔기에 높은 선택성이 획득된나는 것을 놀라운 것이다. 다른 접합 방법은 생성물의 혼합하여 생성하도록 한다; 예를 들어, 라이신 잔기 보다는 히스티딘 잔기에 선택적으로 결합하는데 어려움이 있다는 것이 이미 발견되었다.
각각의 이탈기 L은 예를 들어, -SR, -SO2R, -OSO2R,-N+R3,-N+HR2,-N+H2R, 할로겐, 또는 -OØ , R은 상기 제시된 의미를 가지고, Ø는 다음의 전자-구인 치환체를 적어도 하나를 포함하는, 치환된 아릴, 특히 페닐기를 나타낸다:
예를 들어, -CN,-NO2, -CO2R, -COH, -CH2OH, -COR, -OR, -OCOR, -OCO2R, -SR,-SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, -NR'O2R, -NO, -NHOH, -NROH, -C=N-NHCOR,-C=N-NR'COR,-N+R3, -N+HR2, -N+H2R, 할로겐, 특히 염소 또는, 특히, 불소, -C≡CR, -C=CR2 및 -C=CHR이다.
R 및 R'이 상기 언급한 의미를 가진다.
W' 및 X'가 함께 고리를 형성하는 다음을 포함하는 전형적인 구조이다:
Figure pct00006
n이 1 내지 4이고, 및
Figure pct00007
본 발명의 바람직한 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 제조 방법은 다음의 일반적인 화학식의 시약을 이용하여:
Figure pct00008
다음의 일반적적인 화학식의 신규한 접합체를 제조한다:
Figure pct00009
본 발명의 제조 방법에 대한 바람직한 구현예의 주요 특징은 알파-메틸렌 이탈기 및 이중 결합이 Michael 활성화 모이어티로 작용하는 전자-구인기로 가교-접합되는 것이다. 상기 이탈기가 직접 교체 보다는 가교-기능화제에서 제거하는 것이 쉽고, 전자-구인기는 Michael 반응으로 모이어티를 적절하게 활성화하고, 다음으로 순차적으로 분자 내의 비스-알킬화가 연속적으로 Michael 및 retro-Michael 반응에 의해서 발생할 수 있다. 이탈 모이어티는 J. Am. Chem. Soc. 1979, 101, 3098-3110 and J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 5211-5212.)에서 기술되어진 순차적 및 상호작용적 Michael 및 retro-Michael 반응에서 처음 알킬화가 발생된 이후에 비스-알킬화가 일어날 때까지 노출되지 않는 잠재적 접합된 이중 결합을 마스크하는 작용을 한다. 전자-구인기 및 이탈기는 순차적 Michael 및 retro-Michael 반응으로 비스-알킬화이 발생하도록 최적으로 선택된다. J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 5211-5212에서 기술된 바와 같은 이탈기 및 전자-구인기 사이 또는 이중 결합과 접합된 추가 다중 결합을 가진 가교 기능화 알킬화제를 제조하는 것이 가능한다.
본 발명에 따른 신규한 접합체의 몇가지 예는 다음과 같다:
Figure pct00010
본 발명에 따른 반응에 사용된 몇가지 시약의 실시예는 다음을 포함한다:
Figure pct00011
단백질에 대하여, 히스티딘 잔기는 천연 단백질 또는 폴리히스티딘 태그 중에서 하나와, 서로간에 밀접한, 바람직하게는 서로 인접하게 배치된다. 물론, 폴리에틸렌 글리콜에 비해 폴리머는 상기 화학식에서의 PEG를 교체할 수 있다. 이론적으로 제한되지 않는다면, 히스티딘 잔기에 결합은 다음의 화학식으로 나타낼 수 있다:
Figure pct00012
그러나, 히스티딘에서 나머지 질소 원자의 결합도 가능한다.
상기 제조 방법에서 중간 생성물은 W가 전자-구인기인 일반적인 화학식 Ia 화합물이다. 상기 화합물은 그 자체로 유용성을 가진다; 본 발명의 제조 방법이 적절한 조건을 가역적이기 때문이고, 추가적으로 W가 전자 구인 모이어티인 화학식 Ia 화합물은 자유 단백질의 방출이 요구되는, 예를 들어, 직접적인 임상 적용과 같은 적용에서 유용성을 가진다. 그러나, 전자 구인 모이어티 W는 단백질의 방출을 방해하는 모이어티를 제공하기 위해서 환원될 수 있고, 또한, 이와 같은 화합물은 임상적, 산업적 및 진단적 적용에서 유용성을 가진다. 더욱이, W가 환원되어 가역 반응이 더 이상 발생하지 않는다는 것은, 만약 더 강한 친핵체가 첨가되어도 감지되는 변화가 없다는 것을 의미한다. 그러므로, 예를 들어, 폴리히스티딘 태그에 의서 페그화(PEGylate)되는 것이 가능하게 한다; W를 환원한다; 다음으로,단백질 내에서 다이설파이드 결합을 환원하고; 환원된 다이설파이드 결합을 건너 서열 페그화(PEGylation)가 수행한다.단백질에 대해, W기를 환원 없이 상기 반응을 수행하는 것도 가능할 수 있다.
그러므로, 예를 들어, 케토기를 포함하는 모이어티 W는 CH(OH)기를 포함하는 모이어티 W로 환원될 수 있다; 에테르 기 CH.OR는 에테르화와 함께 수소기의 환원으로 획득될 수 있다; 에스테르기 CH.O.C(O)R는 아실화제를 이용한 수소기의 환원으로 획득될 수 있다; 아민기 CH.NH2, CH.NHR 또는 CH.NR2는 환원성 아민화(reductive amination)에 의해 케톤 또는 알데하이드로부터 제조될 수 있다; 또는 아미드 CH.NHC(O)R 또는 CH.N(C(O)R)2 는 아민의 아실화에 의해서 형성될 수 있다. 시아노기인 X-Q-W-기는 아민기에서 환원될 수 있다.
상기 제조 방법은 모든 반응 물이 가용성인 용매 또는 용매 혼합물 내에서 수행될 수 있다. 단백질은 수용성 반응 매질 내에서 일반적인 화학식 II 또는 III 의 화합물과 직접적으로 반응되어질 수 있다. 이러한 반응 매질은 또한, 버퍼화되고, 친핵체의 요구 pH에 의존한다. 반응에 대한 최적의 pH는 일반적으로 적어도 6.0, 전형적으로 약6.8 내지 약8.5 , 예를 들어, 약6.5 또는 7.0 내지 8.0, 예를 들어, 약 7.5-8.0, 그러나, 바람직하게는 약7.0 내지 7.5일 수 있다. 본 발명에 따른 제조 방법은 염기성 pH에서 히스티딘 잔기(특히, 폴리히스티딘 태그 내에)과 반응에 선택성이 있는 것은, 염기성 조건은 비-선택적 페그화를 일으키는 것으로 제안되고, 라이신 잔기와의 페그화를 포함하고, 히스티딘의 페그화는 pH 6.0 내지 6.5에서 최적화되는 것으로 이루어진 페그화의 문헌상의 방법에 비하여 놀라운 것이다. 비록, 문헌상의 방법은 라이신과 페그화단계를 포함하는, 비-선택적 페그화를 제안하고 있다. 죄적의 반응 조적은 이용된 특정 반응물에 의존할 수 있으며, 그러나, 일반적으로, 상기 범위 내의 가장 낮은 부분을 향하는 pH의 이용은 히스티딘 결합에 대한 선택성이 증가되는 경향을 보이고, 반면에, 상기 범위 내의 가장 높은 부분을 향하는 pH의 이용은 수율이 증대되는 경향을 나타낸다.
3-37℃ 사이의 반응 온도는 일반적으로 적절한다: 만약, 접합 반응이 이러한 제조 방법에 발생할 수 있는 온도에서 실시된다면, 단백질은 분해되거나 또는 변성될 수 있어 기능을 저하시킨다. 유기 매질에서 실시되는 반응(예를 들어 THF, 에틸아세테이트, 아세톤)는 전형적으로 상온까지의 온도에서 실시되어진다.
단백질은 화학량적인 당량(stoichiometric equivalent)을 이용한 원하는 시약, 또는 약간 과량의 시약, 상이한 많은 시약들을 이용하여 효과적으로 접합될 수 있다. 그러나, 시약이 단백질을 용매화하도록 이용된 수용성 매질과 경쟁 반응을 수반하지 않으므로, 과량의 화학량적인 당량의 시약으로 접합 반응을 실시하는 것이 가능하다. 과량의 시약 및 생성물은 용이하게 단백질의 정제 단계에서 이온 교환 크로마토그래피 또는 니켈을 이용한 분리에 의해서 용이하게 분리될 수 있다.
폴리히스티딘 태그에 접합하는데 유용한 화합물의 다른 종류는 다음의 일반적인 화학식으로 나타낸다:
Figure pct00013
화학식에서,
X, Q, v 및 v'는 상기 언급한 의미를 가지고, W는 전자-구인기를 나타내며, L은 이탈기를 나타낸다. 이와 같은 접합 과정에서 생성된 직접적인 생성물은 W가 전자-구인기인 화학식 Ib의 화합물이다. 만약 원한다면, 이러한 생성된 화학식 Ib의 화합물은 다른 원하는 생성물로 전환될 수 있다. 특히, 전자-구인기는 상기 언급된 바와 같이 환원될 수 있다.
특히, 하기의 일반적인 화학식 (Ic)의 신규한 접합을 제조하기 위한 일반적인 화학식 IV의 바람직한 시약은 다음의 일반적인 화학식 IVa을 가진다:
Figure pct00014
화학식에서, Ar는 비치환된 또는 치환된 아릴기, 특히 페닐기를 나타내고, 선택적으로 치환체가 연결기 Q에서 포한된 아릴기에 대해 상기 언급한 것 중에서 선택되고; 및 R, W', v 및 v'는 상기 언급한 의미를 가진다:
Figure pct00015
이러한 바람직한 화합물에서, 바람직하게는 v는 0이고, 바람직하게는 v'는 1 내지 4의 정수, 특히, 1이다. 바람직하게는 W는 CO기를 나타내고, W는 CO기를 나타내거나 또는 CH.OH기이다. 바람직하게는 R은 C1 - 4알킬-아릴기, 특히, p-톨릴(p-tolyl)이다. 바람직하게는 Ar은 비치환된 페닐기이다. 바람직하게는 X는 폴리알킬렌 글리콜, 특히, 폴리에틸렌 글리콜이다.
일반적인 화학식 IV의 시약으로 작업이 이루어질 때 이용을 이해 적절한 반응 조건은 상기 II 및 III 시약의 설명 부분에서 언급된 바와 같다.
화학식 IV의 시약을 이용하는 접합 과정(conjugation process)은 일반적인 화학식의 중간체 화합물의 제조로 진행하는 것으로 이해된다.
Figure pct00016
상기 화학식에서,
X, Q, W', v 및 v'은 상기 언급한 의미를 가진다. 상기 화학식 V의 화합물은 상기 분자의 존재 하에서 "in situ"에 의해서 제조되어 접합되는 것이 바람직하다면, 상대적으로 높은 pH가 반응 내내 적절하게 이용된다. 또한, 상기 화학식 V의 화합물이 분리 단계에서 제조되고, 다음으로, 분자가 첨가되어 접합되는 것이 바람직하다면, 처음 단계는 상대적으로 높은 pH(예를 들어, 7.5 내지 8.0)에서 적절하게 수행되고, 반면에, 다음 단계는 보다 낮은 pH(예를 들어, 6.0 내지 6.5)에서 적절하게 수행된다. 상기 언급된 바와 같이, 히스티딘 잔기 존재 수에 의존하는, 하나 이상의 폴리머는 적절한 단백질에 접합될 수 있다. 이것은 도 3에서 도시적으로 나타내었다.
예를 들어, 두 개의 폴리머는 6-잔기 폴리히스티딘 태그에 접합될 수 있다.
이것은 단백질의 다중 폴리머 잔기를 부착하는 유용한 방법을 제공한다. 이것은 저분자량 PEG를 이용하여 고분자량 생성물을 얻기를 희망할 때, 예를 들어, 3 개의 20 kD PEG 사슬을 이용하여 60 kD분자량 생성물을 얻기를 원하고; 또는 단백질 및 PEG와 같은 두 개의 상이한 폴리머를 첨가하고, 복합적인 효과를 획득하기 위해서 다른 단백질을 첨가하기를 원할 때; 또는 단일 단계에서 예를 들어, 글리코라겐 당화(glycosylation) 및 페그화를 획득하기;를 원할 때 바람직할 수 있다. 이와 같은 다중 접합은 통상적인 접합 방법으로 수득하기에는 매우 어렵다.
많은 단백질은 자유 시스테인 잔기 및/또는 다이설파이드 가교(bridges)를 포함하고, 본 발명의 신규한 접합체를 제조하는데 이용된 접합제는 노출된 시스테인 잔기와 반응하고, 다이설파이드 가교(bridges)를 환원시킬 수 있다. 반응 상태 및 단백질 구조에의 의존으로, 이들은 바람직하게는 폴리히스티딘 태그 내에서 히스티딘 잔기와 반응하기 위해서 모이어티와 반응할 수 있다. 그러므로, 폴리히스티딘 태그 뿐만 아니라 이와 같은 모이어티를 포함하는 단백질을 접합하기를 원한다면, 적절한 블럭킹이 요구된다면, 이용될 수 있다. 예를 들어,이와 같은 모이어티는 폴리머는 상대적으로 저분자량 모이어티인 상기 언급한 일반적인 화학식 II, III 또는 IV에 대응하는 시약으로 접합에 의해서 블럭킹될 수 있다. 이에, 히스티딘 잔기와 접합은 원하는 시약을 이용하여 수행될 수 있다.
일반적인 화학식 I의 화합물은 수많은 적용을 가진다. 이들은 예를 들어, 환자에게 직접적인 임상 적용을 위해서 이용될 수 있고, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 더 제공한다. 본 발명은 치료 요법에 이용하기 위한 본 발명의 화합물 및 본 발명의 화합물 또는 약학적 조성물의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 횐자를 치료하기 위한 방법을 더 제공한다.
예를 들어, 트라우마 치료(trauma treatment), 효소 치료(enzyme replacement), 단백질 치료, 창상관리(wound management), 독소 제거, 항염증제(anti-inflammatory), 항감염약(anti-infective), 면역활성(immunomodulatory), 백신 접종(vaccination) 또는 항암제와 같은 원하는 약학적 효과는 단백질의 적절한 선택에 의해서 회득될 수 있다.
본 발명의 화합물은 비-임상 적용에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 효소와 같은 많은 약학적 활성 화합물은 유기 용매 내에서 촉매화 반응이 가능하도록 한다. 본 발명의 화합물은 이와 같은 적용에 이용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 화합물은 진단 수단으로 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 조영제(imaging agent)를 포함할 수 있고, 예를 들어, 라디오 핵산염(radio nucleotide)이고, 생체 내에서 (in vivo.) 화합물의 트랙킹(tracking)을 가능하게 한다.
단백질은 예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 항체 단편, 효소, 사이토카인, 케모카인(chemokine), 수용체, 혈액 인자(blood factor), 펩티드 호르몬, 독소, 전사 단백질(transcription protein), 또는 복합 단백질(multimeric protein)일 수 있다.
다음에 제시된 특정 단백질은 원하는 적용에 따라 본 발명에서 유용성을 가질 수 있다. 효소는 카르보하이드레이트-특이적 효소(carbohydrate-specific enzymes), 단백질 가수 분해 효소 (proteolytic enzymes) 및 등등 일 수 있다.
관심 대상의 효소는는 일반적이고, 치료 요법적 적용에서 산업적((organic based reactions, 유기 염기성 반응)및 생물학적 적용에 대한 것이고, 특히, US 4,179,337에서 개시된 산화환원 효소(oxidoreductases), 전이 효소( transferases), 가수분해 효소(hydrolases), 리아제(lyases), 이성화 효소(isomerases) 및 리가아제(ligases)일 수 있다. 관심 대상의 특정 효소는 아스파라기나아제(asparaginase), 아르기나아제(arginase), 아데노신 데아미나아제(adenosine deaminase), 과산화물 디스무타아제 (superoxide dismutase), 카탈라아(catalase), 키모트립신(chymotrypsin), 리파아제(lipase), 요산 분해 효소(uricase), 빌리루빈 옥시데이스(bilirubin oxidase), 글루코오스옥시데이스(glucose oxidase), 글루쿠로니다제(glucuronidase), 갈락토시다아제(galactosidase), 글루코세레브로시데이즈(glucocerebrosidase), 글구크로니데이스 (glucuronidase), 글루타미나아제(glutaminase)일 수 있다.
본 발명의 화합물 내에서 이용되는 단백질은 예를 들어, 팩터(factor) VII, VIII 또는 IX 및 다른 혈액 인자, 인슐린(insulin) ACTH, 글루카겐(glucagen), 소마토스타틴(somatostatin), 스마토트로핀(somatotropins), 티모신(thymosin), 파라티롤이드(parathyroid)호르몬, 피그멘트라이(pigmentary) 호르몬, 소마토메딘(somatomedins), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 항체 형성 호르몬(luteinizing hormone), 시상하부유리인자(hypothalamic releasing factors), 항이뇨 호르몬(antidiuretic hormones), 프로락틴(prolactin), 인터루킨(interleukins), 인터페론(interferons), 과립구 콜로니 자극 인자(colony stimulating factors), 헤모글로빈(hemoglobin), 사이토킨(cytokines), 항체( antibodies), 융모성 고나도트로핀(chorionicgonadotropin), 난포-자극 호르몬(follicle-stimulating hormone), 갑상선 자극 호르몬(thyroid-stimulating hormone) 및 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator)일 수 있다. 인터루킨(interleukins), 인터페론(interferons) 및 과립구 콜로니 자극 인자와 같은 상기 단백질 중의 일부는 비-글리코실화(non-glycosylated) 형태로 존재할 수 있고, 일반적으로, 재조합 단백질 방법에 의해서 제조될 수 있다. 비-글리코실화 형태는 본 발명에 이용될 수 있다.
관심있는 다른 단백질은 Dreborg et al Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990) 6 315 365 에서 기술된 알레르기 유발 단백질이고, 폴리(알킬렌 옥사이드)과 같은 폴리머와 접합되는 경우에 알레르기 유발가능성을 줄이고, 결과적으로 내성 저해제(tolerance inducers)로서의 이용이 적절할 수 있다. 개시된 알레르기 유발 단백질은 "Ragweed 알레르기 항원E(antigen E), 밀봉독(honeybee venom), 진드기 알레르기 항원(mite allergen) 및 등등 일 수 있다.
면역글로불린(immunoglobulins), 난백 알부민(ovalbumin), 리파제(lipase), 효소단백질(glucocerebrosidase), 렉딘(lectins), 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator) 및 글리코실 인터루킨(glycosilated interleukins)와 같은 글리코폴리펩티드, 인터페론 및 과립구 콜로니 자극 인자는 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 이의 단편(fragments)과 같은 면역글로블린으로서 관심대상이다.
특정 관심 대상은 수용체 및 리간드 결합 단백질 및 항체 및 항체 단편은 치료 요법적 및 진단적 목적에 대한 임상적 치료약으로 이용되어진다. 항체는 단독으로 사용될 수 있거나 또는 다른 원자 또는 분자와 공유결합적으로 접합("로드된(loaded) ")될 수 있다. 상기 원자 또는 분자는 라디오이소토퍼(radioisotope) 또는 사이토신/항-감염제(cytotoxic/anti-infective drug)이다. 에피토프(Epitopes)는 면역성의 폴리머-단백질 접합을 생성하도록 백신에 이용될 수 있다.
다음의 실시예는 본 발명에 대해 기술하였다. 실시예의 결과는 도 4 내지 20를 참조하여 제시하였다. 실시예에서, 6 히스티딘 잔기의 폴리히스티딘 태그를 포함하는 단백질 pro-BNP 및 8 히스티딘 잔기의 폴리히스티딘 태그를 포함하는 베타 시누클레인(beta synuclein)이 사용되었다. 심장 조직에서, 뇌성나트륨이뇨펩티드(Brain Natriuretic Peptide, BNP)는 108 아미노산 pro-BNP를 형성하도록 프로테아제에의해서 절단되는 134 아미노산 전구체(prepro-BNP)로 합성된다. 베타 시누클레인은 작고, 주로 뇌조직에서 발견되는 용해성 단백질이며, 샤페논(chaperone)과 같은 활성을 가진다. 사용된 다른 단백질은 인터페론α-2b, 엔도스타틴(endostatin), 항-TNF 알파 도메인 항체 단편이다.
실시예 1: His 6 - proBNP 의 12 kDa 페그화
PEG 시약 구조:
Figure pct00017

12 kDa PEG 모노-설폰 (구조(2))은 5시간 동안, pH 7.8, 50 mM 인산 나트륨 버퍼 (10 mg/mL) 내에서 PEG 비스-설폰(구조(1))의 배양에 의해 제조되었다. pH 7.8, 50 mM 인산 나트륨 (10 ㎕, 0.5 mg/mL) 내의 C-터미널 6 x 히스티딘 태그화된 ProBNP (Abcam, ab51402, 13 kDa)의 두 개의 분액(aliquot)은 얼음으로 냉각되었고, 다음으로, 12 kDa PEG 모노-설폰의 1 몰당량 (molar equivalent, 단백질 농도에 대해) 또는 3 몰당량 중 하나가 첨가되었다(각각 1.6 ㎕ 또는 4.8 ㎕). 반응 혼합물은 바로 냉장고에 놓여지고, 16시간 동안 보관되었다. 반응 혼합물은 이들 구성성분의 크기 의존형 분리를 위한 SDS-PAGE 이용하여 분리되고, Instant blue stain (Novexin)을 이용한 염색 이후에 반응 겔은 도 4에서 도시하였다. 도 4에서, M 라벨 레인(lane)은 보정물질로 사용된 Novex Sharp 단백질 표지자(Invitrogen)를 보여준다. 레인 1에서 B라벨 레인은 구입된 (Abcam, 1 mg/mL)His6-proBNP의 샘플이다. 밴드 A는 불순물이다. 레인 2는 12 kDa PEG 반응 혼합물의 1당량에서 획득되었고, 각각의 모노-페그화된 생성물, 다이-페그화된 생성물 및 트리-페그화된 생성물에 대응하는 밴드, 라벨 C, D 및 E를 보여준다. 보다더 낮은 밴드, 라벨 A 및 B는 각각 미반응된 His6 -proBNP 및 구입된 샘플 내의 불순물에 상응한다.레인 3은 12 kDa PEG 반응 혼합물의 3 당량에서 획득되었고, 대응하는 각각 모노-페그화된 생성물, 다이-페그화된 생성물 및 트리-페그화된 생성물에 대응하는 밴드, 라벨 C, D 및 E를 보여준다. 보다더 낮은 밴드, 라벨 B 및 A는 각각 미반응된 His6 -proBNP 및 구입된 샘플 내의 불순물에 상응한다. 다음으로, 겔은 도 5에서 도시된 결과로서, PEG의 가시화(visualisation)를 위해 요오드화 바륨(barium iodide)으로 염색도 하였다. 레인 1에서 미반응 PEG 시약에 대응하는 밴드는 C로 라벨되고, D, E 및 F 라벨 밴드는 각각 모노-페그화된 생성물, 다이-페그화된 생성물 및 트리-페그화된 생성물에 대응한다. 보다 더 낮은 밴드, 라벨 B 및 A는 각각 미반응된 His6 -proBNP 및 구입된 샘플 내의 불순물에 상응한다. 12 kDa PEG 반응 혼합물의 3 당량에서 획득된 레인 3은 미반응 PEG 시약에 대응하는 C 라벨 밴드 및 각각 모노-페그화된 생성물, 다이-페그화된 생성물 및 트리-페그화된 생성물에 대응하는 D, E 및 F 라벨 밴드를 보여준다. 보다더 낮은 밴드, 라벨 B 및 A는 각각 미반응된 His6 -proBNP 및 구입된 샘플 내의 불순물에 대응한다.
실시예 2: His 6 - proBNP 의 30 kDa 페그화
30 kDa PEG 모노-설폰 (실시예 1에서 구조(2))는 5시간 동안 pH 7.8, 50 mM 인산 나트륨 버퍼 (10　mg/mL) 내에서 PEG 비스-설폰의 (구조(1), 실시예 1)의 배양으로 제조되었다. pH 7.8, 50 mM 인산 나트륨 (10 ㎕, 0.5 mg/mL) 내의 C-터미널 6 x히스티딘 태그화된 ProBNP(Abcam, ab51402)두 개의 분액은 얼음으로 냉각되었고, 다음으로, 1 몰당량(단백질 농도에 대해) 또는 30 kDa PEG 모노-설폰의 3 당량 중 하나가 첨가되었다(각각 2.0 ㎕ 또는 6.0 ㎕). 반응물은 냉장실에 놓여지고, 16시간 동안 보관되었다. 반응 혼합물은 이의 구성성분의 크기-의존형 분리에 대한 SDS-PAGE를 이용하여 분리되고, Instant blue (Novexin)로 염색된 이후의 반응 겔은 도 6에서 보여준다. M 라벨 레인은 보정물질로 사용된 Novex Sharp 단백질 표지자(Invitrogen)를 보여준다. 레인 1에서 B라벨 레인은 His6-proBNP의 구입된 샘플(Abcam, 1 mg/mL)이다. 밴드 A는 불순물이다. 2 라벨 레인은 30 kDa PEG 반응 혼합물의 1당량에서 획득되었고 모노-페그화된 생성물에 대응하는 밴드 라벨 C 및 각각의 미반응된 His6 -proBNP 및 구입된 샘플 내의 불순물에 대응하는 보다더 낮은 밴드, 라벨 A 및 B를 보여준다. 3 라벨 레인은 30 kDa PEG 반응 혼합물의 3 당량에서 획득되었고, 모노-페그화된 생성물 및 다이-페그화된 생성물에 대응하는 밴드, 라벨 C, 및 D 및 각각 미반응된 His6 -proBNP 및 구입된 샘플 내의 불순물에 대응하는 보다더 낮은 밴드, 라벨 B 및 A를 보여준다. 겔은 PEG의 가시화를 위해 요오드화 바륨으로 염색하였고, 반응 겔은 도 7에 나타내었다. M 라벨 레인은 보정물질로 사용된 Novex Sharp 단백질 표지자(Invitrogen)를 보여준다. 레인 1에서 B라벨 레인 이 His6-proBNP의 구입된 샘플 (Abcam, 1 mg/mL)이고, 밴드 A는 불순물이다. 2 라벨 레인은 30 kDa PEG 반응 혼합물의 1 당량에서 획득되었고, 미반응 PEG 시약에 대응하는 C 라벨 밴드, PEG 불순물에 대응하는 F라벨 밴드, 각각 모노-페그화된 및 다이-페그화된 생성물에 대응하는 D, E 및 F 라벨 밴드, 및 각각 미반응된 His6 -proBNP 및 구입된 샘플 내의 불순물에 대응하는 보다 더 낮은 밴드, 라벨 B 및 A를 보여준다. 3 라벨 레인은 30 kDa PEG 반응 혼합물의 3 당량으로 획득되었고, 미반응 PEG 시약에 대응하는 C 라벨 밴드, PEG 불순물에 대응하는 F 라벨 밴드, 각각 모노-페그화된 및 다이-페그화된 생성물에 대응하는 D 및 E 라벨 밴드, 및 각각 미반응된 His6 -proBNP 및 구입된 샘플 내의 불순물에 대응하는 보다더 낮은 밴드, 라벨 B 및 A를 보여준다.
실시예 3: His 8 -베타 시누클레인의 12 kDa 페그화 및 히스티딘이 태그화되지 않은 베타 시누클레인과의 반응 비교
12 kDa PEG 모노-설폰(실시예 1에서 구조(2))은 5시간 동안 pH 7.8, 50 mM 인산 나트륨 버퍼 (10　mg/mL) 내에서 PEG 비스-설폰의 (구조(1), 실시예 1)의 배양으로 제조되었다. pH 7.8, 50 mM 인산 나트륨 (10 ㎕, 0.39 mg/mL) 내의 N-터미널 8 x 히스티딘이 표지된 베타 시누클레인(Abcam cat. no. ab40545, 15　kDa)의 두 개의 분액은 얼음으로 냉각 되었고, 다음으로, 12 kDa PEG 모노-설폰의 1 몰당량(단백질 농도에 대해) 또는 3 당량이 첨가되었다(1.6 ㎕ 또는 4.7 ㎕ 각각). 반응물은 냉장실에 놓여지고, 16 시간 동안 보관되었다. 반응 혼합물은 이의 구성성분의 크기-의존형 분리에 의한 SDS-PAGE 이용하여 분리되고, Instant blue(Novexin)로 염색된 이후의 반응 겔은 도 8에 나타내었다. M 라벨 레인은 보정물질로 사용된 Novex Sharp 단백질 표지자(Invitrogen)를 보여준다. 레인 1에서 B라벨 레인은 His8-베타 시누크레인의 구입된 샘플이다(Abcam (0.8 mg/mL)). 밴드 A는 불순물이다. 2 라벨 레인은 12 kDa PEG 반응 혼합물의 1 당량에서 획득되었고, 각각 모노-페그화된 생성물 및 다이-페그화된 생성물에 대응하는 밴드, 라벨 C 및 D, 및 각각 미반응된 His8-베타 시누클레인 및 구입된 샘플 내의 불순물에 대응하는 보다더 낮은 밴드, 라벨 A 및 B를 보여준다. 3라벨 레인은 12 kDa PEG 반응 혼합물의 3 당량에서 획득되었고, 각각 모노-페그화된 생성물, 다이-페그화된 생성물, 트리-페그화된 생성물 및 테트라-페그화된 생성물에 대응하는 밴드, 라벨 C, D, E 및 F, 및 각각 미반응된 His8-베타 시누클레인 및 구입된 샘플 내의 불순물에 대응하는 보다더 낮은 밴드, 라벨 B 및 A를 보여준다. 겔은 PEG의 가시화를 위해 요오드화 바륨으로 염색하였고, 반응 겔은 도 9에 나타내었다. 도 9에서, M 라벨 레인은 보정물질로 사용된 Novex Sharp 단백질 표지자(Invitrogen)를 보여준다. 1 라벨 밴드는 Abcam에서 구입된 His8-베타 시누클레인에서 획득되었다. 2 라벨 레인은 12 kDa PEG 반응 혼합물의 1 당량에서 획득되었고, 각각 모노-페그화된 생성물, 다이-페그화된 생성물 및 트리-페그화된 생성물에 대응하는 밴드 라벨 C, D 및 E, 및 각각 미반응된 His8-베타 시누클레인 및 구입된 샘플 내의 불순물에 대응하는 보다 더 낮은 밴드, 라벨 B 및 A을 보여준다. 3라벨 레인은 12 kDa PEG 반응 혼합물의 3 당량에서 획득되었고, 각각 모노-페그화된 생성물, 다이-페그화된 생성물, 트리-페그화된 생성물 및 테트라-페그화된 생성물에 대응하는 D, E 및 F 라벨 밴드, 및 각각 미반응된 His8-베타 시누클레인 및 구입된 샘플 내의 불순물에 대응하는 보다더 낮은 밴드, 라벨 B 및 A를 보여준다. 밴드 C는 PEG 불순물이다.
12 kDa 페그화 비교 연구는 pH 7.0에서 PEG 시약 (2)의 1 당량을 사용하여 His8-베타 시누클레인 및 히스티딘이 태그화되지 않은 베타 시누클레인(Abcam. cat no. ab48853) 간에 이루어졌다. SDS-PAGE결과는 도 10에 나타내었다. M 라벨 레인은 보정물질로 사용된 Novex Sharp 단백질 표지자(Invitrogen)를 보여준다.
His8-베타 시누클레인 결과는 1 라벨 밴드에 나타내었다. 레인 1에서, B라벨 레인은 미반응된 His8-베타 시누클레인이고, C 라벨 밴드는 모노-페그화된 His8-베타 시누클레인이다. 2 라벨 레인은 히스티딘이 태그화되지 않은 베타 시누클레인 반응을 보여주고, 단지 가시화된 밴드는 A로 라벨되고, 히스티딘이 태그화되지 않은 베타 시누클레인이다. 레인 2에서 페그화된 단백질 밴드는 존재하지 않는다.
실시예 4: His 8 -베타 시누클레인의 30 kDa 페그화
30 kDa PEG 모노-설폰 (실시예 1에서 구조(2))는 5시간 동안 pH 7.8, 50 mM 인산 나트륨 버퍼(10　mg/mL) 내에서 PEG 비스-설폰의 (구조(1), 실시예 1)의 배양으로 제조되었다. pH 7.8, 50 mM 인산 나트륨 (10 ㎕, 0.39 mg/mL) 내의 N-터미널 8 x 히스티딘이 표지된 베타 시누클레인(Abcam, ab40545, 15 kDa)의 분액은 얼음으로 냉각되었고, 다음으로, 30 kDa PEG 모노-설폰의 1 몰당량(단백질 농도에 대해)(1.6 ㎕)이 첨가되었다. 반응물은 냉장실에 놓여지고, 16시간 동안 보관되었다.
생성된 반응 혼합물은 이의 구성성분의 크기-의존형 분리에 의한 SDS-PAGE를 이용하여 분석되고, Instant blue(Novexin)로 염색된 이후의 반응 겔은 도 11에 나타내었다. 도 11에서, M 라벨 레인은 보정물질로 사용된 Novex Sharp 단백질 표지자(Invitrogen)를 보여준다. 1 라벨 밴드는 Abcam에서 구입된(0.8 mg/mL)His8-베타 시누클레인의 샘플에서 획득되어 지고, B 라벨 레인은 폴리히스티딘 태그 단백질이고, 반면에, 라벨 A 밴드가 불순물이다. 2 라벨 레인은 30 kDa PEG 반응 혼합물의 1 당량에서 획득되었고, 모노-페그화된 생성물에 대응하는 라벨 C 밴드 및 각각 미반응된 His8-베타 시누클레인 및 구입된 샘플 내의 불순물에 대응하는 보다더 낮은 밴드, 라벨 A 및 B를 보여준다.
겔은 PEG의 가시화를 위해 요오드화 바륨으로 염색하였고, 반응 겔은 도 12에 나타내었다. 도 12에서, M 라벨 레인은 보정물질로 사용된 Novex Sharp 단백질 표지자(Invitrogen)를 보여준다. 1 라벨 밴드는 Abcam에서 구입된 His8-베타 시누클레인으로 획득되었다. 2 라벨 레인은 30 kDa PEG 반응 혼합물의 1 당량에서 획득되었고, 미반응 PEG 시약에 대응하는 C 라벨 밴드, PEG 불순물들에 대응하는 라벨 E 및 G 밴드, 각각 모노-페그화된 생성물 및 다이-페그화된 생성물에 대응하는 라벨 D 및 F 밴드, 및 각각 미반응된 His8-베타 시누클레인 및 구입된 샘플 내의 불순물에 대응하는 보다더 낮은 밴드, 라벨 B 및 A를 나타낸다.
실시예 5. 10 kDa 및 20 kDa PEG 시약 3을 이용하여 C 터미널에 8 히스티딘 서열을 가진 IFN α-2b에서 히스티딘의 페그화 .
Figure pct00018
단계 1: p- 카르복시 -3- 피페리디노프로프리오페논 하이드로클로라이드3(p- carboxy -3-piperidinopropriophenone hydrochloride , 2)의 합성
Figure pct00019
250 ml의 둥근 바닥 플라스크는 p-아세틸벤조산(15.0 g, 3(1)), 11.11g 피페리딘 하이드로 콜르라이드 및 8.23g 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)으로 채워졌다. 무수 에탄올 (90 ml) 및 진한 염산 (1 ml)이 첨가되고, 생성된 서스펜션은 아르곤 하에서 교반 하면서 10 h 동안 환류 상태에서 가열되었고, 환류를 정지한 이후에, 아세톤 (150ml)이 첨가되고, 반응 혼합물은 상온으로 냉각하도록 하였다. 생성된 백색의 침전물은 필터 유리로 분리되고(G3), 차가운 아세톤으로 두 번 세척되었다. 고체는 진공 하에서 건조되어, 백색의 결정화 분말을 제공하였다(3(2)(9.72 g).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.79, 2.96, 3.45 (br m, CH2 of 피페리딘 모이어티), 3.36 (t, 2H, COCH2), 3.74 (t, 2H, NCH2), 8.09 (m, 4H, ArH).
단계 2: 4-(3-(p- 톨릴티오 ) 프로파노일 ) 벤조산3 (4-(3-(p-톨릴티오)프로파노일)벤조산, 5)의 합성
p-카르복시-3-피페리디노프로프리오페논 하이드로클로라이드 3(2) (1.0 g) 및 4-메틸벤젠티올(methylbenzenethiol, 417 mg, 3(3))이 무수 에탄올 (7.5 ml) 및 메탄올(5 ml)의 혼합물에서 부유 되었다. 피페리딘(Piperidinem, 50 ml)이 첨가되었고, 서스펜션은 아르곤 분위기에서 6시간 동안 교반하면서 환류하도록 가열되었다. 상온으로 냉각한 이후에 백색 분말이 제공되었고, 필터 유리 (G3)로 여과되어, 차가운 아세톤으로 세척되고, 진공 하에서 건조되어, 상기 화합물 3(3)을 제공하였다(614 mg).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.27 (s, 3H, phenyl-CH3), 3.24, 3.39 (t, 2 x 2H, CH2), 7.14, 7.26 (d, 2 x 2H, ArH of tolyl moiety), 8.03 (m, 4H, ArH of carboxylic acid moiety).
단계 3: 4-(3- 토실프로파노일 )벤조산 3(4)(4-(3-tosylpropanoyl)benzoic acid)의 합성.
4-(3-(p-톨릴티오)프로파노일)벤조산 3(4) (160 mg)이 물(10ml) 및 메탄올(10 ml)의 혼합물에 부유되었다. 아이스 배스에서 냉각한 이후에, 옥손(oxone, 720 mg, Aldrich)이 첨가되고 반응 혼합물은 하룻밤 동안 교반하면서(15 h) 상온으로 올렸다. 생성된 서스펜션은 여분의 물(40 ml)로 묽혀서 거의 균일하게 부유 되도록 하고, 혼합물은 클로로포름으로 세번 추출하였다(전체 100 ml). 수집된 클로로포름 추출액은 식염수로 세척되고, 다음으로 MgSO4로 수분이 제거되었다. 휘발성 물질은 30 ℃에서 진공 하에서 휘발성 물질의 증발은 백색 고체3(4) (149　mg)를 제공하였다3(4) (149　mg).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.41 (s, 3H, phenyl-CH3), 3.42 (t, 2H, CO-CH2), 3.64 (t, 2H, SO2-CH2), 7.46, 7.82 (d, 2 x 2H, ArH of tolyl moiety), 8.03 (m, 4H, ArH of carboxylic acid moiety).
단계 4, 페그화된 4-(3- 토실프로파노일 )벤조산의 합성, PEG 시약 3.
4-(3-토실프로파노일)벤조산 3(4) (133 mg) 및 O-(2-아미노에틸)-O'-메틸-PEG (O-(2-aminoethyl)-O' methyl-PEG, MW 10 kDa, 502 mg, BioVectra)은 건조 톨루엔 (5 ml)에서 용해되었다. 용매는 가열 없이 진공하에서 제거되었고, 건조 고체 잔여물은 아르곤 하에서, 건조 다이클로로메탄(15 ml) 내에서 재용해되었다. 아이스 배스에서 냉각된, 생성된 용액에 아르곤 하에서 다이이소프로필카르보다이이미드(diisopropylcarbodiimide, DIPC, 60 mg)가 천천히 첨가되었다. 다음으로, 반응 혼합물은 상온에서 하룻밤 동안 (15 h) 교반되어 졌다. 휘발성 물질은 진공 하에서 (30 ℃, 물 배스)에서 제거되어 아세톤 (20 ml) 내에서 약하게 열을 가하여 재용해되는 고체 잔여물을 제공하였다. 용액은 비흡수 코튼 울로 여과되고 비용해성 물질이 제거되었다. 용액은 드라이 아이스 배스 내에서 냉각되어 원심분리기로 분리된 백색 침전물을 제공하였다(4600 rpm, 30 분). 액체상은 경사되어지고(decanted off), 이러한 침전 방법은 세 번 반복되었다. 진공 하에서 회색빛이 도는 백색 고체의 잔여물은 진공하에서 건조되어 PEG 시약 3(437 mg)을 제공하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ2.46 (s,3H, phenyl-CH3), 3.38 (s, 3H, PEG-OCH3), 3.44-3.82 (br m, PEG), 7.38, 7.83 (d, 2 x 2H, ArH of tolyl moiety), 7.95 (m, 4H, ArH of carboxylic acid moiety).
단계 5: C-터미널 his 8 - 표지된 IFN α-2b의 히스티딘에 페그화
IFN α-2b (pH　7.5, 2 mM EDTA 및 150 mM NaCl를 포함하는 10 mM 인산 나트륨 버퍼 내에서 1.13 mg/ml)의 용액 20 ㎕에 10 kDa PEG 시약 3 (탈이온수 내에서 6 mg/ml 용액의 1.8 ㎕)의 1 몰당량이 첨가되었고, 생성된 용액은 상온에서 하룻밤 동안 배양되었다. 반복(repeat)은 20 kDa PEG 시약의 1 몰당량으로 다시 수행되어 지고, 상기 언급된 바와 같은 동일한 방법으로 다시 제조되었다(탈이온수 내의 6.6 mg/ml 용액의 3.3 ㎕).
다음으로, 두 개의 샘플은 (NuPAGE® Novex 4-12% 비스-트리 겔, MES 작용 버퍼, 인비트로젠에서 모두, 및 InstantBlue stain (Expedeon cat. No. ISB1L))SDS-PAGE으로 분석되었다. 그 결과는 도 13에 나타내었다. 레인에서 라벨 1은 단백질 표지자이다.
레인 2는 단지 개시 IFN이다. 레인 3은 10 kDa PEG 시약 반응의 결과를 보여준다. 접합된 1 내지 5 PEG 사슬을 가진 IFN에 대응하는 30 및 160 KDa 단백질 표지자 간에 5개의 구별되는 밴드가 있다. 레인 4는 20kDa PEG 시약 반응의 결과를 보여준다. 접합된 1 내지 3 PEG 사슬을 가진 IFN에 대응하는 60 및 110 KDa 단백질 표지자 간에 3개의 구별되는 밴드가 있다. 라벨 5 레인은 염색하지 않는 20 kDa PEG 시약이기에 밴드가 가시화된 것을 없다. 라벨 6 레인은 염색하지 않는 10 kDa PEG 시약이기에 밴드가 가시화된 것을 없다.
실시예 6: His 8 -β- 시누클레인의 5 kDa 페그화
Figure pct00020
5 kDa PEG 모노-설폰(구조(5))는 3시간 동안 pH 7.8, 50 mM 인산 나트륨 버퍼 (5 mg/mL) 내에서 PEG 비스-설폰의 배양으로 (구조(4))에서 제조되었다. pH 7.4, 50 mM 인산 나트륨 (10 ㎕, 0.38 mg/mL) 내에서 N-터미널 8 x 히스티딘이 표지된 베타 시누클레인(Abcam cat. no. ab40545, 15.4 kDa)의 두 개의 분액은 얼음으로 냉각 되었고, 다음으로, 5 kDa PEG 모노-설폰 (5)의 1 몰당량(단백질 농도에 대해) 또는 3 당량이 첨가되었다(0.25 ㎕ 또는 0.74 ㎕ 각각).
베타 시누클레인(Abcam cat. no. ab48853, 14.3 kDa)의 두 개의 분액은 동일한 방법으로 처리되고, 5 kDa PEG 모노-설폰의 1 몰당량(0.18 ㎕) 또는 3 당량 (0.52 ㎕) 중 하나를 제공하였다. 다음으로, 상기 반응액은 6 h 동안 주위 온도에서 배양되었다. 생성된 반응 용액은 SDS-PAGE 이용하여 분리되고, 도 14에서 도시된 바와 같이 Instant blue(Expedeon)으로 염색되었다. M 라벨 레인은 보정물질로 사용된 Novex Sharp 단백질 표지자(Invitrogen)를 보여준다. 1 및 2 라벨 레인은 각각 5 kDa PEG 반응 혼합물의 1 당량 및 PEG 반응 혼합물의 3 당량에서 획득되어 진다. A 라벨 밴드는 His8-beta 시누클레인이다. 이보다 아래의 희미한 밴드는 Abcam에서 구입된 단백질에 기인한 불순물이다. 밴드, 라벨 B, C, D 및 E는 각각 모노-페그화된, 다이-페그화된, 트리-페그화된 및 테트라-페그화된 단백질 생성물에 대응한다.
실시예 7: 상이한 pH 에서 His 6 - 안티 TNF-α-도메인( domain ) 항체 단편의 10 kDa 페그화
pH 7.8, 50 mM 인산 나트륨 버퍼 (5 mg/mL) 내의 10 kDa PEG 모노-설폰 (실시예 1에서 구조(2)), PEG 비스-설폰(구조(1), 실시예 1, 10 mg/mL)의 3 h 동안 배양으로 제조되었다. 50 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨 및 2 mM EDTA 내의 C-터미널 6 x 히스티딘이 표지된 항-TNF 알파 도메인 항체 단편(12.7 kDa) 용액 (0.6 mg/mL)은 4개의 pH(pH 6.2, pH 6.7, pH 7.0 및 pH 7.4)로 제조되었다. 10 kDa PEG 모노-설폰 ((2), 1.41 ㎕)의 3 몰당량은 각각 4개의 상이한 pH(10　㎕, 0.6 mg/mL)에서 His6-도메인용액에 첨가되었다. 상기 반응물은 상온에서 3시간 동안 배양되었다. 생성된 반응 용액은 SDS-PAGE 이용하여 분리되고, 도 15에서 도시된 바와 같이 Instant blue (Expedeon)으로 염색되었다. M 라벨 레인은 Novex Sharp 단백질 표지자(Invitrogen)를 보여준다. 1 내지 4 라벨 레인은 각각의 pH 6.2, pH 6.7, pH 7.0 및 pH 7.4에서 10 kDa PEG 3 몰당량을 사용하는 반응 혼합물에서 획득되었다. A 라벨 밴드는 미반응된 His6-항-TNF 알파 도메인 항체 단편이다. B 라벨 레인은 모노-페그화된 도메인 생성물이다. 밴드 라벨 C 및 D는 각각 다이-페그화된 및 트리-페그화된 도메인 단편에 대응한다. 페그화는 각각 4 개의 pH에서 나타내었고, pH가 증가되면 페그화의 정도(extent)도 증가하였다.
실시예 8: 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa 및 40 kDa PEG를 이용한 His 6 -안티 TNF-a 도메인 항체 단편의 페그화
10 kDa, 20 kDa, 30 kDa 및 40 kDa PEG 비스-설폰 (실시예 1의 구조(1))은 상온에서 3시간 동안 pH 7.8, 50　mM 인산 나트륨 버퍼 내에서 개별적으로 배양되어 상응하는 PEG 모노-설폰(실시예 1에서 구조(2))을 제공하였다. PEG의 농도는 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa 및 40 kDa PEG에 대해 각각 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL 및 40 mg/mL이다.
50 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨 및 2 mM EDTA 내의 C-터미널 6 x히스티딘이 표지된 항-TNF 도메인 항체 (12.7kDa)(1.25 mg/mL, 5 ㎕)의 용액의 4 개의 분획은 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa 및 40 kDa PEG 모노-설폰 용액(0.74 ㎕, 1.5 몰당량)과 함께 첨가되었다. 반응물은 8시간 동안 4 ℃에서 배양되었다. 반응 용액은 도 16에서 나타낸바와 같이 SDS-PAGE에 의해서 분석되었다. M 라벨 레인은 보정물질로 사용된 Novex Sharp 단백질 표지자(Invitrogen)를 보여준다. 1 라벨 밴드는 참조로서 제시된 His6-안티 TNF 도메인 항체 단편이다. 2 내지 5 라벨 레인은 각각 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa 및 40 kDa PEGs과 반응하여 획득되어 졌다. 밴드 라벨 A은 미반응된 His6-항-TNF 도메인이다. B 라벨 밴드(B10, B20, B30 및 B40)은 각각 10, 20, 30 및 40 kDa PEG에 대한 모노-페그화된 도메인 단편에 대응한다. C 라벨 밴드10는 10 kDa PEG 반응에 대한 다이-페그화된 생성물에 대응하고, C20 밴드는 20 kDa PEG 반응에 대한 다이-페그화된 생성물에 대응한다.
실시예 9: His 6 -엔도스타틴의 2 kDa 페그화 및 폴리히스티딘 태그를 포함하는 엔도스타틴과의 비교 반응
2 kDa PEG 모노-설폰 (실시예 1에서 구조(2))은 4 시간 동안 pH 7.8, 50 mM 인산 나트륨 버퍼 (1　mg/mL) 내에서 PEG 비스-설폰(실시예 1의 구조(1)의 배양으로 제조되었다. pH 6.2, 50 mM 인산 나트륨 (30 ㎕, 0.5 mg/mL) 내에서 C-터미널 6 x 히스티딘이 표지된 엔도스타틴(Calbiochem cat. no. 324743)의 두 개의 분액은 얼음으로 냉각 되었고, 다음으로, 2 kDa PEG 모노-설폰의 1 몰당량(단백질 농도에 대해) 또는 3 당량이 첨가되었다(1.4 ㎕ 또는 4.2 ㎕ 각각). 반응 혼합물은 냉장실에 놓아두고, 16시간 동안 보관되었다. pH 6.2, 50 mM 인산 나트륨 (10 ㎕, 0.2 mg/mL) 내에서 비태그화된 엔도스타틴(Calbiochem cat. no. 324769)의 두 개의 분액은 얼음으로 냉각되고, 다음으로, 2　kDa PEG 모노-설폰(0.1 mg/mL)의 1 몰당량(단백질 농도에 대해) 또는 3 당량이 첨가되었다(2.0 ㎕ 또는 6.0　㎕ 각각). 반응물은 냉장실에 놓여지고, 16시간 동안 보관되었다.
생성된 반응 용액은 이들 구성성분의 크기 의존형 분리에 대한 SDS-PAGE 이용하여 분리되고, Instant blue (Expedeon)로 염색한 반응겔은 도 17에 나타내었다.
도 17에서, M 라벨 스팟의 오른쪽 컬럼은 Novex Sharp 단백질 표지자(Invitrogen)를 보여준다. 1 라벨 밴드는 His6-엔도스타틴 반응와 반응한 2kDa PEG1 당량의 샘플에서 획득되었고, 각각의 미반응 단백질, 및 모노-페그화된 생성물에 대응하는 밴드, 라벨 B 및 C를 보여준다. 2 라벨 레인은 His6-엔도스타틴과 2kDa PEG 3 당량의 반응의 샘플에서 획득되었고, 각각의 미반응 단백질 및 모노-페그화된 생성물에 대응하는 밴드, 라벨 B 및 C를 보여준다. 3 및 4 라벨 레인은 엔도스타틴과 2kDa PEG 1 당량 및 엔도스타틴과 2kDa PEG 3 당량과의 반응에서 획득되었다. 미반응 단백질에 대응하는 각각의 단일 결합 라벨 A 및 B는 단지 2 kDa PEG이 His6-엔도스타틴과 반응하는 것만을 보여주는 두 개의 반응에 대해 나타낸다.
실시예 10. His 8 -인터페론 알파의 20 kDa 및 30 kDa 페그화 및 히스티딘이 태그화되지 않은 인터페론 알파와의 반응 비교
150 mM 염화 나트륨 (PBS)를 포함하는 pH 7.4, 50 mM 인산 나트륨 버퍼 내에서 N-터미널 8 x 히스티딘이 표지된 인터페론α-2b(2.63 mL, 1.14 mg/mL)의 용액이 제조되었고, 다음으로, 20 kDa PEG 비스-설폰 (실시예 1의 구조(1))의 1.7 몰당량(단백질 농도에 대한)이 첨가되었다(탈이온수 내에서 11.5 mg/mL 20 kDa PEG 비스-설폰 용액의 420 ㎕). 반응물은 18 시간 동안 냉장실에 보관되었다. 생성된 반응 혼합물은 SDS-PAGE에 의해서 분석되고, 그 결과는 도 18에서 도시하였다. 도 18에서, M 라벨 레인은 보정물질로 사용된 Novex Sharp 단백질 표지자(Invitrogen)를 보여준다. 1 라벨 밴드는 라벨 A 밴드가 미반응IFN에 대응하고, B 라벨 레인은 모노 페그화된 IFN에 대응하며, C 라벨 밴드는 다이 페그화된 IFN대응하고, D 라벨 밴드는 트리 페그화된 IFN에 대응하는 반응 용액을 보여준다.
0.5　mg/ml에서 1 당량의 30 kDa PEG 및 pH 7.5에서 N-터미널 8 x 히스티딘이 표지된 인터페론α-2b (3.2 mL, 0.793 mg/mL) 용액을 이용하는 제2 반응. 그 결과는 단백질 표지자 60 및 80 kDa 사이에 시각화한 모노-페그화된 IFN 밴드, 다이-페그화된 IFN에 대응하는 110 과 160 kDa 사이의 밴드, 및 트리-페그화된 IFN에 대응하는 단백질 표지자 160 및 260 kDa 사이의 세번째 밴드를 가진 20 kDa 반응과 유사하다.
도 18의 레인 2에서 나타낸 결과를 참조하여 히스티딘이 태그화되지 않은 IFN 알파-2b와 비교하면, 18 시간 이후 및 동일한 조건 하에서, 1 당량의 PEG 시약(1)과의 반응이 나타나지 않았다.
실시예 11. N-터미널 8 x 히스티딘이 표지된 인터페론 알파에 접합하기 위한 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP 비스-설폰)의 이용
터미널 아민기를 가진 PVP의 제조 : 압력관은 시스테아민(cysteamine, 0.042 g), 다이옥산(dioxane, 8 ml) 및 마그네틱 바로 채웠다. 용액이 형성하도록 일정하게 열을 가한 이후에, 용액은 5 분 동안 상온에서 아르곤 가스로 퍼징되었다. 퍼징을 계속하면서, 1-비닐-2-피롤리돈(1-vinyl-2-pyrrolidone, 2.0 g)이 첨가되었고, 추가로 5분 후에, 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴) (2,2'-azobis(2-methylpropionitrile, 0.089 g)이 첨가되었다. 2분 이후에, 압력관은 아르곤 하에서 마개로 밀봉되고, 교반이 유지되면서 23시간 동안 60℃에서 오일 배스 내에서 배치되었다. 튜브 및 성분이 상온으로 냉각한 이후에, 폴리머 생성을 침전하도록 다이에틸 에테르(15 ml)가 첨가되었다. 액체층은 버려지고, 고체 잔여물은 아세톤 (3 ml)에서 재용해되었다. 생성된 아세톤 용액은 빠른 속도로 교합하면서 다이에틸 에테르(iethyl ether, 25　ml)에 적하되고, no. 2에서 분리된 침전물은 약한 진공 버스트(burst)를 가진 유리 퍼널에서 소결되었다. 고체는 프레시(fresh) 다이에틸 에테르 (10 ml)로 세척되어, 다음으로 상온에서 진공 하에서 건조되었다(mass = 1.24 g, 백색).
PVP-아민에 단백질 반응성 말단기의 접합:
PVP-아민(500 mg), 4-[2,2-비스[(p-톨릴서포닐)메틸]아세틸]-벤조산(4-[2,2-bis[(p-tolylsulfonyl)methyl]acetyl]-benzoic acid, 125 mg), 및 4-다이메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine, 6 mg)이 아르곤 하에서 무수 다이클로로메탄(dichloromethane, 10 ml)으로 혼합되고, 교반하면서 1,3-다이이소프로필카르보다이이미드(80 ㎕)이 첨가되었다. 생성된 혼합물은 상온에서 20 시간 동안 교반되도록하였다. 다음으로, 비흡후 코튼-울을 이용하여 여과되었다. 다이에틸 에테르 (20　ml)가 여액에 첨가되고,(2,000 rpm, 2 분, 2 ℃)여과에 의해서 생성된 침전물을 분리되었다. 액체층은 버려지고, 남아있는 잔여물은 여러번 에틸 아세테이트(5 ml)로 혼합되었다(vortexed). 에틸 아세테이트를 버린 이후에, 고체 잔여물은 다이클로로메탄(5 ml)에 용해되고, 에틸 아세테이트(15 ml)가 첨가되어진다. 용액은 15분 동안 드라이 아이스에 담겨져 최종 고체 침전물이 생성되고, 원심 분리에 의해서 분리되었다(2,000 rpm, 2 분, 2 ℃). 획득된 끈적한 잔여물은 프레시 에틸아세테이트(5 ml)로 혼합되고, 상온에서 진공 건조되었다(mass　= 0.118 g).
PVP 비스-설폰의 분획(Fractionation):
상기 단계에서 획득된 고체 물질은 pH 4.0, 수용성 20 mM 아세트산 나트륨 버퍼, 150 mM NaCl으로 교반되고, 이후에 맑은 용액이 보일때 까지 13,000 rpm으로 원심분리되었다. 용액층은 고체 잔여물에서 제거되고, 다음으로, 1 ml/min에서 pH 4.0, 20 mM 아세트산 나트륨 버퍼, 150 mM을 이용하여 HiLoad 16/60 SuperdexTM 200 prep 급 크기 배제 컬럼(grade size exclusion column, GE Healthcare)으로 분회되었다. 용리가 최고점 이르는 동안 매회 1분 마다 분획을 수집하였다. 72 내지 80 min으로 용리한 분획이 단백질 접합에 이용되었다.
N-터미널 8 x 히스티딘이 표지된 IFN 알파에 PVP의 접합:
IFN (0.025 mg, 0.5 mg/ml)은 150 mM 염화 나트륨(PBS)를 포함하는 7.5, 50 mM 인산 나트륨 버퍼 내에서 제조되었다. IFN (25 ㎍, 0.5 mg/ml)50 ㎕에 분획된 PVP 비스-설폰 용액 (분획: 72 min, 74　min, 76 min, 78 min 및 80 min)의 50 ㎕ 가 첨가되었다. 생성된 용액은 일정하게 혼합되, 4℃에서 하룻밤 동안 보관하였다. 그 결과물인 반응 용액은 SDS-PAGE에 의해서 분석되고, 그 결과는 도 19에 나타내었다. 도 19에서, M 라벨 레인은 보정물질로 사용된 Novex Sharp 단백질 표지자(Invitrogen)를 보여준다. 2 내지 5 라벨 레인은 사용된 상이한 크기의 PVP 시약 분획에 따른 반응 용액을 보여준다(각각 2 내지 5의 72 min 내지 80 min PVP 분획). 밴드 라벨 B는 획득된 모노 및 다중 PVP화된(multi-PVPylated)IFN를 보여준다.
실시예 12. N-터미널 8 x 히스티딘이 표지된 인터페론 알파을 이용하여 인터페론 알파와 인터페론 알파의 다중결합식 접합
Figure pct00021
150 mM 염화 나트륨 (PBS)를 포함하는 pH 7.5, 50 mM 인산 나트륨 버퍼 내에서 N-터미널 8 x 히스티딘이 표지된 인터페론α-2b(50 ㎕, 1.14 mg/mL)의 용액을 제조하고, 다음으로, 10 kDa PEG 이기능성(bifunctional) PEG 시약 (6)의 0.125 몰당량 (단백질 농도에 대해)이 첨가되었다(물 내에서 (6)의 8 mg/mL 용액의 0.47 ㎕). 반응물은 18 시간 동안 상온에서 보관하였다. 생성된 반응 혼합물은 DS-PAGE로 분석되었다. 그 결과물인 겔은 Instant Blue (Expedeon)로 염색한 이후에 IFN-PEG-IFN 융합 접합체(fusion conjugate)에 대응하는 50 kDa 및 60 kDa Novex sharp 단백질 표지자(Invitrogen)사이에 밴드를 보여준다.
실시예 13. 자유 시스테인을 포함하는 인간 세럼 알부민(human serum albumin, HSA)과 N-터미널 8 x 히스티딘이 표지된 인터페론 알파의 다중결합 접합(Multimeric conjugation)
150 mM 염화 나트륨 (PBS)을 포함하는 pH 7.5, 50 mM 인산 나트륨 버퍼 내에서 제조된 N-터미널 8 x 히스티딘이 표지된 인터페론α-2b (1 mL, 1.14 mg/mL)의 용액에 인간 세럼 알부민(3 몰당량, IFN, 10.77　mg)이 첨가되고 용해시켰다. 이 용액에 10　kDa PEG 비스(비스-설폰)(실시예 12에서 제조된 구조(6))(IFN에 1 몰당량, 물 내에서 8 mg/mL 10 kDa PEG 비스(비스-설폰) (6) 용액, 75 ㎕)이 첨가되었다. 반응 혼합물은 18 시간 동안 상온에서 보관되었다. 생성된 반응 혼합물은 이온 교환 크로마토그래피, 다음으로, 금속 이온 친화성 크로마토그래피(metal-ion affinity chromatography)순으로 정제되고, SDS-PAGE로 분석되어, 그 결과는 도 20에 나타내었다. 도 20에서, M 라벨 레인은 보정물질로 사용된 Novex Sharp단백질 표지자(Invitrogen)를 보여준다. 1 라벨 밴드는 A 라벨 밴드가 미반응 IFN이고, B 라벨 레인이 모노-페그화된 IFN, 및 라벨 C가 IFN-PEG-IFN이고, D 라벨 밴드가 IFN-PEG-알부민인 정제된 반응 용액을 보여준다.

Claims (28)

  1. 폴리머가 단백질 또는 펩티드에 접합되고,
    상기 접합이 폴리히스티딘 태그를 통해서 이루어지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리히스티딘 태그가 2 내지 12의 히스티딘 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 폴리히스티딘 태그가 4 내지 10의 히스티딘 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 전항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머가 폴리알킬렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리옥사졸린, 폴리비닐알콜, 폴리아크릴아미드, 폴리메타아크릴아미드, HPMA 코폴리머, 폴리에스테르, 폴리아세탈, 폴리(오르소 에스테르), 폴리카보네이트, 폴리(이미노 카보네이트), 폴리아미드, 알킬렌 옥사이드와 폴리에스테르, 폴리아세탈, 폴리(오르소 에스테르) 또는 폴리(아미노산)의 코폴리머, 다당류, 단백질, 폴리글루타민산, 단당류 또는 아미노산와 합성 모노머의 코폴리머, 또는 다이비닐에테르-무수 말레인산 및 스티렌-무수 말레인산의 코폴리머인 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 폴리머가 폴리알킬렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 폴리머가 C2 및/또는 C3 단위체를 포함하는 폴리알킬렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 폴리머가 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 폴리머가 단백질인 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 전항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합된 단백질 또는 펩티드가 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 항체 단편, 효소, 사이토카인, 케모카인, 수용체, 혈액 인자, 펩티드 호르몬, 독소, 전사 단백질, 또는 복합 단백질인 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 제9항에 있어서,
    접합된 단백질 또는 펩티드가 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 전항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합된 단백질 또는 펩티드가 그의 민감한 작용기를 보호하기 위해 하나 이상의 블럭킹 작용기와 반응되어지는 천연 단백질; 또는 하나 이상의 폴리머, 치료용 또는 진단용인 저분자, 시알산, 당류, 및/또는 녹말류와 추가적으로 접합된 단백질인 것을 특징으로 하는 화합물.
  12. 전항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물이 다음의 일반적인 화학식으로 표현되는 것을 특징으로 화합물:
    Figure pct00022

    상기 화학식에서,
    X 및 X' 중 하나가 폴리머를 나타내고, 다른 하나는 수소 원자를 나타내며;
    각 Q가 독립적으로 연결기를 나타내고;
    W가 전자 구인 모이어티 또는 전자 구인 모이어티의 환원에 의해서 제조가능한 모이어티를 나타내지거나; 또는, X'가 폴리머인 경우, X-Q-W-가 함께 전자-구인기를 나타낼 수 있으며; 추가로, X가 폴리머인 경우, X' 및 전자-구인기 W가 삽입 원자와 함께 고리를 형성할 수 있고;
    Z가 폴리히스티딘 태그에 의해서 A 및 B에 연결된 단백질 또는 펩티드를 나타내며,
    A가 C1-5 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬이고;
    B가 결합 또는 C1-4 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬이다.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 각각의 Q가 직접 결합, C1-10 알킬렌기, 또는 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴기를 독립적으로 나타내고, 이들 중 적어도 하나는 산소 원자, 황원자, R이 수소 원자, 또는 알킬 또는 아릴기를 나타내는 -NR, 케토기(keto group), -O-CO-기 및/또는 -CO-O-기 중 하나 이상에 의해서 종결되거나 또는 중지될 수 있는 것을 특징으로 하는 화합물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 Q가 알킬렌기 또는 직접 결합인 것을 특징으로 하는 화합물.
  15. 제13 항 또는 제14항에 있어서,
    상기 W가 케토 또는 알데하이드기 CO, 에스테르기-O-CO- 또는 설폰기-SO2-, 또는 상기 작용기의 환원에 의해서 획득가능한 작용기를 나타내거나; 또는, X-Q-W-가 함께 전자-구인기를 나타내는 것을 특징으로 하는 화합물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 X가 폴리머이고, X'-Q-가 H-인 것을 특징으로 하는 화합물.
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물이 다음의 일반적인 화학식으로 표현되는 것을 특징으로 하는 화합물:
    Figure pct00023

    X가 폴리머를 나타내고; Q가 연결기를 나타내며;
    W가 전자-구인 모이어티 또는 전자-구인 모이어티의 환원에 의해서 제조 가능한 모이어티를 나타내고; v가 0 또는 1 내지 4의 정수를 나타내고; v'가 1 내지 8의 정수를 나타내며; Z가 폴리히스티딘 태그에 의해서 결합된 단백질 또는 펩티드를 나타낸다.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 v가 0인 것을 특징으로 하는 화합물.
  19. 폴리히스티딘 태그에 의해서 접합이 발생하는 조건 하에서 폴리머 접합제와 폴리히스티딘 태그를 포함하는 단백질 또는 펩티드가 반응하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 전항 중 어느 항의 화합물의 제조 방법.
  20. 다음의 일반적인 화학식으로 표현되는 특징으로 하는 화합물:
    Figure pct00024

    X 및 X' 중 하나가 폴리머를 나타내고, 다른 하나가 수소 원자를 나타내며;
    각각의 Q가 독립적으로 연결기를 나타내며;
    W가 전자 구인 모이어티 또는 전자 구인 모이어티의 환원에 의해서 제조가능한 모이어티; 또는, X'가 폴리머인 경우, X-Q-W-가 함께 전자-구인기를 나타낼 수 있으며; 추가로, X가 폴리머인 경우, X' 및 전자-구인기 W가 삽입 원자와 함께 고리를 형성할 수 있고;
    Z가 각가의 히스티딘 잔기에 의해서 A 및 B에 결합된 단백질 또는 펩티드를 나타내며;
    A가 C1-5 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬이고;
    B가 결합 또는 C1-4 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬이다.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 각각의 히스티딘 잔기가 천연 단백질 또는 펩티드 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  22. 적어도 둘 이상의 히스티딘 잔기를 포함하는 단백질 또는 펩티드와 (i) 하기 화학식(II) 또는 (ii) 하기 화학식(III)의 화합물의 반응단계; 및 만약 원한다면, 전자-구인기 W'의 환원 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제12항 내지 제16항, 제20항 및 제21항 중 어느 한 항의 화합물의 제조 방법:
    (i)
    Figure pct00025

    X 및 X' 중 하나는 폴리머를 나타내고, 다른 하나는 수소 원자를 나타내고;
    Q가 연결기를 나타내고;
    W'가 전자-구인기를 나타내고; 또는, X'가 폴리머인 경우, X-Q-W'가 함께 전자-구인기를 나타낼 수 있으며;
    A가 C1-5 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬이고;
    B가 결합 또는 C1-4 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬이며;
    각각의 L이 독립적으로 이탈기를 나타내고;
    또는
    (ii)
    Figure pct00026

    X, X', Q, W', A 및 L이 일반적인 화학식 II에서 제시된 의미를 가지고,
    추가적으로, X가 폴리머라면, X' 및 전자-구인기 W가 삽입 원자와 함께 고리를 형성할 수 있으며,
    m이 1 내지 4의 정수를 나타낸다.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 방법이 약6.8 내지 약8.5 범위 내의 pH에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 방법이 약7.0 내지 약8.0 범위 내의 pH에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 방법이 약7.5 내지 약8.0 범위 내의 pH에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제1항 내지 제18항, 제20항 및 제21항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  27. 제1항 내지 제18항, 제20항, 제21항 및 제26항 중 어느 항 항에 있어서,
    상기 화합물 또는 약학적 조성물이 치료 요법에 사용되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  28. 제1항 내지 제18항, 제20항 및 제21항 중 어느 항 항의 화합물 또는 제26항의 약학적 조성물의 약학적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자의 치료 방법.
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