KR20100089858A

KR20100089858A - 신규 아밀로이드 친화성 화합물의 사용 및 제조 방법

Info

Publication number: KR20100089858A
Application number: KR1020107011449A
Authority: KR
Inventors: 시게유키 타니후지; 다이사쿠 나카무라; 신야 타카사키
Original assignee: 니혼 메디피직스 가부시키가이샤
Priority date: 2007-10-30
Filing date: 2008-10-28
Publication date: 2010-08-12
Also published as: CA2704172A1; CN101909657A; US20100267952A1; JPWO2009057576A1; AU2008319985A1; WO2009057576A1; TW200920408A; EP2218463A1

Abstract

아밀로이드로의 친화성을 갖고, 또한 변이원성 등의 독성이 억제된 화합물을 이용하여 인비트로 및 인비보에서 아밀로이드를 고감도로 검출할 수 있는 생체조직 중의 아밀로이드의 검출 시약을 제공한다.
하기 식(1)으로 나타내어지는 화합물 또는 그 염을 함유하여 이루어지는 생체조직에 침착된 아밀로이드의 검출 시약.

(식 중, A₁, A₂, A₃ 및 A₄는 각각 독립적으로 탄소 또는 질소, R¹은 할로겐 치환기, R²는 할로겐 치환기, m은 0∼2의 정수이다. 단, R¹ 및 R² 중 적어도 어느 한쪽은 방사성 할로겐 치환기이며, 또한, A₁, A₂, A₃ 및 A₄ 중 적어도 하나는 탄소이며, R¹은 탄소인 A₁, A₂, A₃ 또는 A₄에 결합된다.)

Description

신규 아밀로이드 친화성 화합물의 사용 및 제조 방법{USE OF NOVEL COMPOUND HAVING AFFINITY FOR AMYLOID, AND PROCESS FOR PRODUCTION OF THE SAME}

본 발명은 신규 아밀로이드 친화성 화합물의 사용 및 제조 방법, 특히, 전신성 아밀로이드증(amyloidosis)을 비롯한 아밀로이드가 축적되는 질환의 진단에 있어서, 병소 부위에 있어서의 아밀로이드의 검출에 유용한 생체조직 중의 아밀로이드 검사 시약에 관한 것이다.

아밀로이드라고 불리는 섬유상 단백질이 체내의 여러 가지 기관 또는 조직에 침착됨으로써 발증하는 질환은 아밀로이드증이라 총칭되고 있다. 아밀로이드증에 공통되고 있는 것은 아밀로이드라고 불리는 β-시트 구조에 풍부한 섬유상 단백질이 전신의 여러 장기 또는 국소에 침착되어 그 장기나 조직에 있어서의 기능 이상을 발생시키는 점이다. 아밀로이드란 아밀로이드-β나 변이 트란스시레틴(Transthyretin), β2 마이크로글로블린 등 여러 가지 아밀로이드 전구체 단백이 생체 내에 있어서 응집함으로써 형성되는 단백질 응집체의 총칭을 말한다. 아밀로이드는 어느 아밀로이드 전구체 단백으로부터 형성되어도 β-시트에 풍부한 특징적인 구조를 갖고 있다. 그 때문에, β-시트와의 결합성을 갖는 콩고레드나 티오플라빈 T 등의 화합물은 아밀로이드와의 친화성을 갖는다고 하는 특징이 있다.

아밀로이드증은 아밀로이드의 침착 양식에 따라 전신성 아밀로이드증과 국한성 아밀로이드증으로 분류된다.

전신성 아밀로이드증은 전신의 다양한 부분에 아밀로이드 침착이 일어나는 질환이다. 전신성 아밀로이드증으로서는, 예를 들면 간장에서 아밀로이드를 만들어 내고, 그것이 전신의 기관에 침착해서 장해를 일으키는 가족성 아밀로이드증, 심장 및 손 관절 등의 대관절에 아밀로이드가 침착되는 노인성 TTR 아밀로이드증, 장기 투석환자의 뼈, 관절 등에 발증하는 투석 아밀로이드증, 만성 관절 류머티즘 등의 만성의 염증성 질환에 속발(續發)하는 급성 기단백인 혈청 아밀로이드 A(serum amyloid A) 유래의 아밀로이드가 침착해서 발증하는 반응성 AA 아밀로이드증(속발성 아밀로이드증), 면역글로블린 유래의 아밀로이드가 전신 여러 장기에 침착되는 면역세포성 아밀로이드증 등이 있다.

국한성 아밀로이드증은 일부의 장기에만 아밀로이드 침착이 일어나는 질환이다. 국한성 아밀로이드증으로서는, 예를 들면 아밀로이드가 뇌에 축적되는 알츠하이머병, 뇌혈관 아밀로이드증, 크로이츠펠트-야콥병 등의 뇌 아밀로이드증 외에, Ⅱ형 당뇨병에 수반되는 췌도(pancreatic islet)나 인슐린종(insulinoma)에 아밀로이드가 침착되거나, 심방에 아밀로이드가 침착되는 내분비 아밀로이드증, 피부에 아밀로이드가 침착되는 피부 아밀로이드증, 피부나 폐에 결절상의 아밀로이드 침착이 발생하는 국한성 결절성 아밀로이드증 등을 들 수 있다.

아밀로이드증의 진단은 전신성 아밀로이드증의 경우, 우선 피부, 신장, 위장 등의 생검 가능한 부위로부터 조직을 채취하고, 콩고레드 염색 또는 티오플라빈 T 염색함으로써 행해지고 있다. 콩고레드는 아밀로이드의 β-시트 구조 부분에 친화성이 높은 형광성의 화합물이며, 그 배향성에 의해 편광 현미경 하에서 복굴절을 나타내기 때문에 조직 내의 아밀로이드 침착을 선택적으로 염색할 수 있다. 마찬가지로, 티오플라빈 T도 아밀로이드에 친화성을 갖는 형광성의 화합물이며, 콩고레드 와 마찬가지로 사용되고 있다. 그리고, 이 조직 염색에 의해 양성의 소견이 얻어진 후, 항체를 사용한 면역염색 등을 조합하여 확정 진단이 행하여진다. 그러나, 콩고레드나 티오플라빈 T에 의한 염색에서는 편광 현미경 하에서 관찰해도 양성의 판정이 어려울 경우가 있다.

한편, 최근 PET, SPECT, MRI 등의 화상진단장치가 현저하게 보급된 것에 따라 전신성 아밀로이드증을 화상진단하는 것도 검토되고 있다.

그러나, 콩고레드나 티오플라빈 T는 표식해서 화상진단 프로브로서 사용했을 경우, 아밀로이드에 대한 결합 특이성이 떨어져서 양호한 검출 감도가 얻어지지 않는다고 하는 결점이 있었다.

또한, 콩고레드는 발암성을 갖기 때문에 인체의 진단 용도로는 사용할 수 없다.

그래서, 전신성 아밀로이드에 친화성 및 검출 감도가 높고, 인비보(in vivo)의 검출에도 사용할 수 있는 아밀로이드 검출용 형광시약으로서, 콩고레드 유도체인 비스-(3-히드록시카르보닐-4-히드록시)스티릴벤젠(BSB)이나 그 유도체가 제안되어 있다(비특허문헌 14, 특허문헌 7). BSB는 뇌 아밀로이드증 및 전신 아밀로이드증에 의한 아밀로이드에 대한 친화성이 높고, 그 구조에 벤지딘 구조를 가지지 않기 때문에 발암성의 문제성이 적어, 방사성 표식해서 화상진단 프로브로서 사용할 수도 있는 것이 보고되어 있다.

한편, 뇌 아밀로이드증의 대표예인 알츠하이머병(이하, AD라고 한다)에 대해서는, 생검을 채취하는 것이 불가능하기 때문에 아밀로이드에 높은 친화성을 갖는 화합물을 마커로서 사용하고, AD를 인비보에서 검출하는 시도가 이미 이루어져 있다.

이러한 뇌 내 아밀로이드 화상진단용 프로브의 대부분은 아밀로이드에 대한 친화성이 높고, 또한 뇌 이행성이 높은 소수성의 저분자 화합물을 여러 가지 방사성 핵종, 예를 들면 ¹¹C, ¹⁸F 및 ¹²³I 등으로 표식한 화합물이다. 구체예로서, 6-요오드-2-[4'-(N,N-디메틸아미노)페닐]벤조티아졸(이하, TZDM이라고 한다)이나 6-히드록시-2-[4'-N-메틸아미노)페닐]벤조티아졸(이하, 6-OH-BTA-1이라고 한다)을 비롯한 여러 가지 티오플라빈 유도체(특허문헌 1, 비특허문헌 3), (E)-4-메틸아미노-4'-히드록시스틸벤(이하, SB-13이라고 한다)이나 (E)-4-디메틸아미노-4'-요오드스틸벤(이하, m-I-SB라고 한다)을 비롯한 스틸벤 화합물(특허문헌 2, 비특허문헌 4, 비특허문헌 5), 6-요오드-2-[4'-(N,N-디메틸아미노)페닐]벤조옥사졸(이하, IBOX라고 한다), 6-[2-(플루오로)에톡시]-2-[2-(2-디메틸아미노티아졸-5-일)에테닐]벤조옥사졸을 비롯한 벤조옥사졸 유도체(비특허문헌 6, 비특허문헌 7), 2-(1-{6-[(2-플루오로에틸)(메틸)아미노]-2-나프틸}에틸리덴)말로노나이트릴(이하, FDDNP라고 한다)을 비롯한 DDNP 유도체(특허문헌 4, 비특허문헌 8) 및 6-요오드-2-[4'-(N,N-디메틸아미노)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘(이하, IMPY라고 한다)을 비롯한 이미다조피리딘 유도체(특허문헌 3, 비특허문헌 9) 등을 ¹¹C나 방사성 할로겐으로 표식한 화합물이 보고되어 있다. 또한, 이들 화상진단용 프로브의 일부에 대해서는 인간 이미징 연구가 실시되어, AD 환자에 있어서 건강한 예와는 분명하게 다른 뇌로의 방사능 집적을 나타내는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 10, 비특허문헌 11, 비특허문헌 12, 비특허문헌 13).

또한, 국제공개 제2007/002540호 팜플릿에는 아밀로이드 친화성기에 에틸렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜을 통해서 방사성 동위체를 표식 부위에 결합시킨 일련의 화합물이 개시되어 있다(특허문헌 5).

또한, 국제공개 제2007/063946호 팜플릿에는 뇌 내에서의 대사를 억제할 목적으로 5원의 방향족 복소환식 기를 결합시킨 일련의 화합물이 개시되어 있다(특허문헌 6).

일본 특허공표 2004-506723호 공보 일본 특허공표 2005-504055호 공보 일본 특허공표 2005-512945호 공보 일본 특허공표 2002-523383호 공보 국제공개 제2007/002540호 팜플릿 국제공개 제2007/063946호 팜플릿 국제공개 제2005/016888호 팜플릿

J. A. Hardy & G. A. Higgins, "Alzheimer's Disease : The Amyloid Cascade Hypohesis.", Science, 1992, 256, p.184-185 G. McKhann et al., "Clinical diagnosis of Alzheimer's disease : Report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's Disease.", Neurology, 1984, 34, p.939-944 Z.-P. Zhuang et al., "Radioiodinated Styrylbenzenes and Thioflavins as Probes for Amyloid Aggregates.", J. Med. Chem., 2001, 44, p.1905-1914 Masahiro Ono et al., "11C-labeled stilbene derivatives as Aβ-aggregate-specific PET imaging agents for Alzheimer's disease.", Nuclear Medicine and Biology, 2003, 30, p.565-571 H. F. Kung et al., "Novel Stilbenes as Probes for amyloid plaques.", J. American Chemical Society, 2001, 123, p.12740-12741 Zhi-Ping Zhuang et al., "IBOX(2-(4'-dimethylaminophenyl)-6-iodobensoxazole) : a ligand for imaging amyloid plaques in the brain.", Nuclear Medicine and Biology, 2001, 28, p.887-894 Furumoto Y et al., "[11C]BF-227 : A New 11C-Labeled 2-Ethenylbenzoxazole Derivative for Amyloid-β Plaques Imaging.", European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, 2005, 32, Sup.1, P759 Eric D. Agdeppa et al., "2-Dialkylamino-6-Acylmalononitrile Substituted Naphthalenes(DDNP Analogs) : Novel Diagnostic and Therapeutic Tools in Alzheimer's Disease.", Molecular Imaging and Biology, 2003, 5, p.404-417 Zhi-Ping Zhuang et al., "Structure-Activity Relationship of Imidazo[1,2-a]pyridines as Ligands for Detectingβ-Amyloid Plaques in the Brain.", J. Med. Chem, 2003, 46, p.237-243 W. E. Klunk et al., "Imaging brain amyloid in Alzheumer's disease with Pittsburgh Compound-B.", Ann. Neurol., 2004, 55, p.306-319 Nicolaas P. L. G. Verhoeff et al., "In-Vivo Imaging of Alzheimer Disease β-Amyloid With [11C]SB-13 PET.", American Journal of Geriatric Psychiatry, 2004, 12, p.584-595 Hiroyuki Arai et al., "[11C]-BF-227 AND PET to Visualize Amyloid in Alzheimer's Disease Patients", Alzheimer's & Dementia : The Journal of the Alzheimer's Association, 2006, 2, Sup.1, S312 Christopher M. Clark et al., "Imaging Amyloid with I123 IMPY SPECT", Alzheimer's & Dementia : The Journal of the Alzheimer's Association, 2006, 2, Sup.1, S342 D. M. Skovronsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 7609

상기와 같이, 아밀로이드를 대상으로 한 화상진단 프로브로서 다양한 화합물이 개시되어 임상응용을 목적으로 해서 검토가 진행되고 있다.

TZDM, IBOX 및 m-I-SB의 요오드를 [¹²⁵I]로 표식한 화합물은 정상 마우스(mouse)를 사용한 실험의 결과, 투여 후 2분점에 있어서 모두 뇌 내로의 이행이 확인되고 있다. 그러나 이들 화합물은 정상 조직으로부터의 클리어런스가 충분하지는 않고, 투여 후의 시간 경과에 따라 서서히 뇌 내에 집적되는 경향을 나타내고 있다(일본 특허공표 2005-512945호 공보, Zhi-Ping Zhuang et al., Nuclear Medicine and Biology, 2001, 28, p.887-894, H. F. Kung et al., J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, p.12740-12741). 정상 조직으로부터의 클리어런스가 충분하지 않으면 아밀로이드 직접부위에 있어서 충분한 콘트라스트가 얻어지지 않는다고 하는 문제가 있다. SB-13을 [¹¹C]로 표식한 화합물에 대해서는 래트(rat)를 사용한 실험에 의해 정상 조직으로부터의 클리어런스를 갖는 것이 나타내어져 있지만, 그 클리어런스 속도는 충분하게 빠르다고는 말할 수 없다(Masahiro Ono et al., Nuclear Medicine and Biology, 2003, 30, p.565-571).

한편, IMPY를 비롯한 이미다조피리딘 골격을 갖는 화합물은 투여 후에 뇌 내로 이행해서 아밀로이드에 집적된다고 하는 성질을 가짐과 아울러, 상술한 화합물 과는 달리 정상 조직으로부터의 클리어런스가 빠르다고 하는 뛰어난 성질을 갖는 것이 [¹²⁵I] 표식 화합물을 사용한 실험의 결과 명확하게 되어 있다. 그러나, IMPY는 복귀 돌연변이 시험에서 양성을 나타내는 화합물이며, 이 화합물을 화상진단 프로브로서 사용하기 위해서는 그 투여량이나 투여 형태에 대해 충분한 주의가 필요하다.(국제공개 제03/106439호 팜플릿)

FDDNP에 대해서도 복귀 돌연변이 시험에서 양성을 나타내는 것이 보고되어 있다.(국제공개 제03/106439호 팜플릿)

아밀로이드를 표적으로 한 화상진단 프로브로서는 아밀로이드로의 친화성을 갖고, 정상 조직으로부터의 클리어런스가 충분하게 빠르다고 하는 IMPY의 뛰어난 성능을 유지하면서, 변이원성 등의 독성이 억제된 화합물을 사용하는 것이 바람직하지만, 현재 시점에서 그러한 성능을 갖춘 화합물은 개시되어 있지 않다.

또한, IMPY에 있어서 아밀로이드가 침착되어 있지 않은 백질(white matter) 등으로의 비특이적인 집적이 보여지는 것이, 우리들의 검토의 결과 확인되어 있다. AD 진단제로서 사용하기 위해서는 아밀로이드 침착부위 이외에 있어서의 비특이적인 집적이 억제된 화합물을 사용할 필요가 있지만, 그러한 화합물은 지금까지 개시되어 있지 않다.

본 발명은 아밀로이드를 표적으로 한 프로브로서 다양한 화합물이 개시되어 있지만, 임상 사용에 견딜 수 있는 성능을 갖는 것이 확인된 화합물은 아직 존재 하지 않는다라고 하는 상기 사정을 고려하여 이루어진 것으로, 아밀로이드 친화성을 갖는 신규 화합물을 제공함으로써, 인비트로(in vitro) 및 인비보(in vivo)에서 아밀로이드를 고감도로 검출할 수 있게 하는 것을 목적으로 했다.

발명자는 이미다조피리딘-페닐 골격 또는 그것에 유사한 골격을 갖는 화합물로서, 그 페닐기의 탄소에 산소를 결합시킨 특정의 신규화합물이 아밀로이드에 대한 친화성을 구비하고, 또한, 변이원성 등의 독성이 낮은 것, 및 상기 화합물군을 프로브로서 사용함으로써 인비트로(in vitro) 및 인비보(in vivo)에서 아밀로이드를 고감도로 검출할 수 있는 것을 찾아내고, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 일측면에 의하면, 하기 식(1) :

으로 나타내어지는 화합물 또는 그 염을 함유해서 이루어지는, 생체조직에 침착된 아밀로이드의 검출 시약을 제공한다.

생체조직으로서는 아밀로이드증에 있어서 아밀로이드가 침착되는 것이 알려져 있는 여러 가지 조직으로 할 수 있다. 이러한 생체조직의 대표예로서는 뇌, 심장, 폐, 췌장, 뼈, 관절 등을 들 수 있고, 가장 대표적인 생체조직으로서는 뇌를 들 수 있다. 뇌를 대상으로 했을 경우에 있어서의 대표적인 아밀로이드증는 알츠하이머병 및 루이 소체 치매(dementia with Lewy bodies)이다.

식(1) 중, R¹ 및 R²는 할로겐 치환기이며, R¹ 및 R²중 적어도 어느 한쪽은 방사성 할로겐 치환기이다. 할로겐으로서는 여러 가지 핵종을 사용할 수 있고, 불소, 브롬 또는 요오드를 바람직하게 사용할 수 있다. 방사성 할로겐으로서는 여러 가지 원소를 사용할 수 있고, ¹⁸F, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I 또는 ¹³¹I로부터 선택되는 할로겐을 사용하는 것이 바람직하고, ¹⁸F, ¹²³I 또는 ¹²⁵I로부터 선택되는 할로겐을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

A₁, A₂, A₃ 및 A₄는 각각 독립적으로 탄소 또는 질소이지만, 적어도 하나는 탄소일 필요가 있다. A₁, A₂, A₃ 및 A₄ 중 3개 이상이 탄소인 것이 바람직하고, 모두가 탄소인 것이 보다 바람직하다. 또한, 식(1)에 있어서 R¹은 탄소인 A₁, A₂, A₃ 또는 A₄에 결합된다.

또한, m은 0∼2의 정수이다. 또한, R¹의 결합부위는 탄소인 A₃, 즉, 6위치의 탄소인 것이 바람직하다.

상기 식(1)의 화합물은 신규화합물이며, 본 발명은 별도의 일측면에 의하면 하기 식(2) :

(식 중, A₁, A₂, A₃ 및 A₄는 각각 독립적으로 탄소 또는 질소,

R³은 비방사성 할로겐 치환기, 니트로 치환기, 알킬쇄의 탄소수가 1∼4인 트리알킬암모늄 치환기, 알킬쇄의 탄소수가 1∼4인 트리알킬스타닐 치환기, 및 트리페닐스타닐기로 이루어지는 군으로부터 선택된 기,

R⁴는 비방사성 할로겐 치환기, 메탄술폰산 치환기, 트리플루오로메탄술폰산 치환기 및 방향족 술폰산 치환기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기,

m은 0∼2의 정수이다.

단, A₁, A₂, A₃ 및 A₄ 중 적어도 하나는 탄소이며, R³은 탄소인 A₁, A₂, A₃ 또는 A₄에 결합된다.)으로 나타내어지는 화합물 또는 그 염과, 방사성 할로겐 이온을 함유하는 반응 용액을 조제하는 공정과,

상기 반응 용액에 반응 조건을 부여함으로써 하기 식(1) :

R¹은 할로겐 치환기,

R²는 할로겐 치환기,

m은 0∼2의 정수이다.

단, R¹ 및 R² 중 적어도 어느 한쪽은 방사성 할로겐 치환기이며, 또한, A₁, A₂, A₃ 및 A₄ 중 적어도 하나는 탄소이며, R¹은 탄소인 A₁, A₂, A₃ 또는 A₄에 결합된다.)으로 나타내어지는 화합물 또는 그 염을 합성하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방사성 할로겐 표식 유기화합물의 제조 방법을 제공한다.

식(2) 중, R³은 비방사성 할로겐 치환기, 니트로 치환기, 알킬쇄의 탄소수가 1∼4인 트리알킬암모늄 치환기, 알킬쇄의 탄소수가 1∼4인 트리알킬스타닐 치환기, 및 트리페닐스타닐 치환기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기이다. 트리알킬스타닐 치환기로서는 여러 가지 치환기를 사용할 수 있고, 트림메틸스타닐 치환기 및 트리부틸스타닐 치환기를 바람직하게 사용할 수 있다.

R⁴는 비방사성 할로겐 치환기, 메탄술폰산 치환기, 트리플루오로메탄술폰산 치환기 및 방향족 술폰산 치환기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기이다. 방향족 술폰산 치환기로서는 톨루엔술폰산, 니트로벤젠술폰산 및 벤젠술폰산을 바람직하게 사용할 수 있다.

R³ 및 R⁴의 비방사성 할로겐 치환기로서는 여러 가지 할로겐을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 방사성 불소를 사용한 구핵 치환 반응에 있어서의 표적이 될 수 있는 할로겐 또는 방사성 요오드와의 사이의 동위체 교환반응의 표적이 될 수 있는 할로겐을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 염소, 요오드 또는 브롬을 사용할 수 있다. R³ 및 R⁴ 중 적어도 한쪽이 비방사성 할로겐 치환기인 것이 바람직하다.

A₁, A₂, A₃ 및 A₄는 각각 독립적으로 탄소 또는 질소이지만, 적어도 하나는 탄소일 필요가 있다. A₁, A₂, A₃ 및 A₄ 중 3개 이상을 탄소로 하는 것이 바람직하고, 모두를 탄소로 하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 식(2)에 있어서 R³은 탄소인 A₁, A₂, A₃ 또는 A₄에 결합된다.

또한, m은 0∼2의 정수이다.

또한, 본 발명에 의하면 이미다조피리딘페닐 골격 페닐기의 탄소에 산소를 통해서 말단이 치환된 알킬기를 결합시킨 화합물이 제공되지만, 이 산소의 결합부위는 페닐기의 4'위치 탄소인 것이 바람직하다. 또한, R³의 결합부위는 탄소인 A₃, 즉 6위치의 탄소인 것이 바람직하다.

상기 식(2)으로 나타내어지는 전구체 화합물 또는 그 염과 방사성 할로겐 이온을 함유하는 반응 용액을 조제하는 공정은, 예를 들면, 상기 전구체 화합물 또는 그 염을 불활성 유기용매에 용해하고, 이것에 공지의 방법으로 얻어진 방사성 할로겐 이온 함유 용액을 첨가함으로써 행할 수 있다.

불활성 유기용매는 상기 전구체 화합물 또는 그 염 및 방사성 할로겐 이온과의 사이에서 반응성을 갖지 않는 여러 가지 용매를 사용할 수 있고, 예를 들면 사용하는 방사성 할로겐이 방사성 요오드인 경우에는 메탄올을 바람직하게 사용할 수 있고, 사용하는 방사성 할로겐이 방사성 불소인 경우에는 아세토니트릴을 바람직하게 사용할 수 있다.

상기 식(1)으로 나타내어지는 화합물 또는 그 염을 합성하는 공정에 있어서 반응 용액에 부여하는 반응 조건은, 식(2)의 화합물의 R³또는 R⁴를 반응 용액에 첨가된 방사성 할로겐 이온으로 치환하는 반응을 진행시키는 조건이면 특별하게 한정은 되지 않고, 방사성 할로겐 이온의 종류에 따른 공지의 반응 조건을 사용할 수 있다.

본 발명의 방사성 할로겐 표식 유기화합물의 제조 방법에 있어서, 방사성 할로겐 이온으로서는, 예를 들면 ¹⁸F, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I 또는 ¹³¹I를 사용할 수 있다. R¹로 나타내어지는 방사성 할로겐 치환기가 ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I 또는 ¹³¹I인 식(1)의 화합물을 제조할 경우, 방사성 할로겐 이온으로서 ¹²³I 이온, ¹²⁴I 이온, ¹²⁵I 이온 또는 ¹³¹I 이온이 각각 사용되고, 식(2)의 화합물로서는 R³이 비방사성 요오드, 알킬기의 탄소수가 1∼4인 트리알킬스타닐 치환기 또는 트리페닐스타닐 치환기인 화합물을 사용하는 것이 보다 바람직하다(이 경우, R² 및 R⁴는 비방사성 할로겐 치환기이다).

R¹로 나타내어지는 할로겐 치환기가 ¹⁸F인 식(1)의 화합물을 제조할 경우, 방사성 할로겐 이온으로서 ¹⁸F 이온이 사용되고, 식(2)의 화합물로서는 R³이 니트로 치환기 또는 알킬기의 탄소수가 1∼4인 트리알킬암모늄 치환기인 화합물을 사용하는 것이 바람직하다(이 경우, R² 및 R⁴는 비방사성 할로겐 치환기이다).

R¹로 나타내어지는 할로겐 치환기가 ⁷⁵Br 또는 ⁷⁶Br인 식(1)의 화합물을 제조할 경우에 방사성 할로겐 이온으로서 ⁷⁵Br 이온 또는 ⁷⁶Br 이온이 각각 사용되고, 식(2)의 화합물로서는 R³이 비방사성 브롬인 화합물을 사용하는 것이 바람직하다(이 경우, R² 및 R⁴는 비방사성 할로겐 치환기이다).

R²로 나타내어지는 할로겐 치환기가 ¹⁸F인 식(1)의 화합물을 제조할 경우, 방사성 할로겐 이온으로서 ¹⁸F 이온이 사용되고, 식(2)의 화합물로서는 R⁴가 메탄술폰산 치환기, 트리플루오로메탄술폰산 치환기 또는 방향족 술폰산 치환기인 화합물을 사용하는 것이 바람직하다(이 경우, R¹ 및 R³은 비방사성 할로겐 치환기이다).

R²로 나타내어지는 할로겐 치환기가 ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I 또는 ¹³¹I인 식(1)의 화합물을 제조하는 경우, 방사성 할로겐 이온으로서 ¹²³I 이온, ¹²⁴I 이온, ¹²⁵I 이온 또는 ¹³¹I 이온이 각각 사용되고, 식(2)의 화합물로서는 R⁴가 비방사성 요오드인 화합물을 사용하는 것이 바람직하다(이 경우, R¹ 및 R³은 비방사성 할로겐 치환기이다).

R²로 나타내어지는 할로겐 치환기가 ⁷⁵Br 또는 ⁷⁶Br인 식(1)의 화합물을 제조할 경우, 방사성 할로겐 이온으로서 ⁷⁵Br 이온 또는 ⁷⁶Br 이온이 각각 사용되고, 식(2)의 화합물로서는 R⁴가 비방사성 브롬인 화합물을 사용하는 것이 바람직하다(이 경우, R¹ 및 R³은 비방사성 할로겐 치환기이다).

또한, 본 발명은 또 다른 일측면에 의하면, 하기 식(2) :

R³은 비방사성 할로겐 치환기, 니트로 치환기, 알킬쇄의 탄소수가 1∼4인 트리알킬암모늄 치환기, 알킬쇄의 탄소수가 1∼4인 트리알킬스타닐 치환기, 및 트리페닐스타닐기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기,

m은 0∼2의 정수이다.

단, A₁, A₂, A₃ 및 A₄ 중 적어도 하나는 탄소이며, R³은 탄소인 A₁, A₂, A₃ 또는 A₄에 결합된다.)으로 나타내어지는 방사성 할로겐 표식 유기화합물 합성용의 전구체 화합물 또는 그 염을 제공한다.

식(2)에 있어서, A₁, A₂, A₃ 및 A₄, 및 R³ 및 R⁴의 바람직한 형태는 상기 제조 방법에 관해서 기재한 것과 같다.

(발명의 효과)

본 발명에 의해 아밀로이드로의 친화성을 갖고, 또한 변이원성 등의 독성이 억제되어 있기 때문에 광범위의 아밀로이드증에 관련되는 아밀로이드의 인비트로 및 인비보에서의 검출에 사용 가능한 아밀로이드 검출 시약, 그 제조 방법 및 제조용 중간체를 얻는 것이 가능해진다.

도 1은 6-트리부틸스타닐-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 합성 스킴.
도 2는 6-브로모-2-[4'-(3"-파라톨루엔술포닐옥시프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 합성 스킴
도 3은 6-브로모-2-[4'-(2"-파라톨루엔술포닐옥시에톡시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 합성 스킴
도 4는 6-브로모-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 합성 스킴.
도 5는 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘의 합성 스킴.
도 6은 6-브로모-2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 합성 스킴.
도 7은 2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘의 합성 스킴.
도 8은 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리미딘의 합성 스킴.
도 9는 [¹²⁵I]-2-(4'-히드록시페닐)-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘의 합성 스킴.
도 10은 2-(4'-히드록시페닐)-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘의 합성 스킴.
도 11은 시료용액 중의 아밀로이드 농도와 방사능 농도의 관계.
도 12의 (a)는 화합물 Ⅰ-7 투여 후의 뇌절편에 있어서의 오토라디오그램(autofadiogram) 및 (b)는 티오플라빈 T 염색 시료의 형광현미경상(아밀로이드 현탁액 투여부위의 확대 표시.)
도 13은 6-트리부틸스타닐-2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 합성 스킴.
도 14의 (a)는 화합물 Ⅰ-9 투여 후의 뇌절편에 있어서의 오토라디오그램 및 (b)는 티오플라빈 T 염색 시료의 형광현미경상(아밀로이드 현탁액 투여부위의 확대 표시.).

(방사성 할로겐 표식 유기화합물 조제용 전구체 화합물의 합성 방법)

이하, 6-트리부틸스타닐-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘을 예로 들어, 본 발명의 하나의 측면에 의한 방사성 할로겐 표식 유기화합물 조제용 전구체 화합물의 합성 방법을 설명한다.

우선, 4'-히드록시아세토페논과 브롬화제2구리를 반응시켜 2-브로모-4'-히드록시아세토페논을 합성한다(도 1, 공정 1). 이 때의 반응은 정법, 예를 들면 문헌[King L. Carroll & Ostrum G. Kenneth, Journal of Organic Chemistry, 1964, 29(12), p.3459-3461] 기재의 방법에 따라서 행할 수 있다.

이어서, 상기에서 합성한 2-브로모-4'-히드록시아세토페논을 2-아미노-5-브로모피리딘과 반응시켜 6-브로모-2-(4'-히드록시)페닐이미다조[1,2-a]피리딘을 합성한다(도 1, 공정 2). 이 공정은 하기의 요령으로 행할 수 있다.

우선, 2-브로모-4'-히드록시아세토페논과 2-아미노-5-브로모피리딘을 아세토니트릴 등의 불활성 용매에 용해하고, 환류 온도에서 2∼6시간 반응시키면 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘의 브롬화수소산염이 생성되고, 백색 침전을 발생시킨다. 이 때의 용매로서는 아세토니트릴 외에 메탄올이나 아세톤이라고 하는, 같은 반응에서 통상 사용되는 용매를 사용할 수 있다. 또한, 반응온도는 환류할 수 있는 온도이면 되고, 예를 들면 아세토니트릴을 용매로 한 경우에는 90℃로 할 수 있다. 또한, 사용하는 용매의 양은 반응에 충분한 양이면 좋지만, 지나치게 많으면 반응물의 침전을 얻을 수 없기 때문에 주의가 필요하다. 예를 들면, 10mmol 상당의 2-브로모-4'-히드록시아세토페논을 이용하여 반응시키는 경우에는 약 40∼50mL의 용매를 사용하면 좋다.

이어서, 반응액을 여과해서 침전물을 여과 선별 후, 이 백색 침전을 메탄올/물 혼합액(1 : 1)에 현탁하고, 이것에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 침전물에 대하여 대과잉으로 되도록 첨가하면, 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘이 유리되어 침전이 생긴다. 이 새롭게 생긴 침전을 여과 채취함으로써 본 공정의 목적물인 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘을 얻을 수 있다(도 1, 공정 2). 메탄올/물 혼합액의 양은 반응시키기 위해서 충분한 양이면 특별하게 한정할 필요는 없지만, 지나치게 많으면 생성물의 석출의 방해가 되기 때문에 주의가 필요하다. 예를 들면, 10mmol 상당의 2-브로모-4'-히드록시아세토페논을 사용했을 경우이면 40∼100mL 정도의 메탄올/물 혼합액을 사용하면 좋다. 또한, 탄산수소나트륨의 양은 반응 기질인 상기 침전물에 대하여 대과잉이면 특별하게 한정할 필요는 없고, 예를 들면, 상기 조건으로 반응시킬 경우이면 25mL 정도의 포화 탄산수소나트륨 수용액을 반응액에 첨가하면 좋다.

이어서, 합성한 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘을 충분하게 건조시킨 후에 N,N-디메틸포름아미드에 용해하고, 탄산칼륨 및 3-브로모-1-플루오로프로판을 첨가해서 실온하 하룻밤 정도 교반함으로써 6-브로모-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘을 얻는다(도 1, 공정 3). 탄산칼륨의 양은 반응 중에 3-브로모-1-플루오로프로판으로부터 발생하는 브롬화수소산을 중화할 수 있는 양이면 되고, 전형적으로는 부원료인 3-브로모-1-플루오로프로판에 대하여 몰비로 해서 2배 정도 사용하면 좋다. 또한, 3-브로모-1-플루오로프로판의 양은 반응 기질에 대하여 과잉량이면 되고, 전형적으로는 반응 기질인 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘에 대하여 몰비로 해서 1.5배 정도 사용하면 좋다.

얻어진 6-브로모-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘을 디옥산에 용해하고, 트리에틸아민을 첨가한 후, 비스트리부틸주석 및 촉매량의 테트라키스트리페닐포스핀팔라듐을 첨가한다. 이 반응액을 약 90℃로 가열해서 약 24시간 반응시킨 후, 용매를 증류 제거하고, 크로마토그램 정제를 행해서 목적물인 6-트리부틸스타닐-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘을 얻을 수 있다(도 1, 공정 4). 이 때, 비스트리부틸주석의 양은 반응 기질에 대하여 과잉량이 되는 조건을 만족시키는 양이면 되고, 구체적으로는 반응 기질인 6-브로모-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘에 대하여 몰비로 해서 1.5배 정도이면 된다.

또한, 6위치의 치환기를 트리부틸스타닐 치환기 이외의 트리알킬스타닐 치환기로 한 화합물을 얻는 경우에는, 공정 4에서 비스트리부틸주석를 사용하는 대신에 목적에 따른 여러 가지 비스트리알킬주석을 사용하면 된다. 예를 들면, 6위치의 치환기를 트리메틸스타닐 치환기로 한 화합물을 합성하는 경우에는, 공정 3에 있어서 비스트리메틸주석을 이용하여 상기와 같은 반응을 행하면 된다.

이미다조피리딘환에 있어서의 관능기의 결합부위를, 6위치의 탄소 이외의 탄소로 한 화합물은, 공정 2에서 사용한 2-아미노-5-브로모피리딘 대신에 피리딘환에 있어서의 브롬의 결합부위가 다양한 다른 화합물을 사용함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, 관능기의 결합부위를 이미다조피리딘환의 8위치의 탄소로 하는 경우에는, 공정 2에 있어서 2-아미노-5-브로모피리딘 대신에 2-아미노-3-브로모피리딘을 사용하면 된다.

또한, 방사성 할로겐에 의한 표식부위를 이미다조피리딘환의 2위치의 탄소에 결합한 알콕시페닐 치환기로 하는 전구체 화합물은, 공정 3에 있어서 3-브로모-1-플루오로프로판 대신에 3-브로모-1-프로판올을 사용하고, 생성한 화합물에 파라톨루엔술포닐글로리드 등을 반응시킴으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, 6-브로모-2-[4'-(3"-파라톨루엔술포닐옥시프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 경우에는 하기의 요령으로 합성할 수 있다.

우선, 상기 합성한 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘을 N,N-디메틸포름아미드에 용해하고, 탄산칼륨 및 3-브로모-1-프로판올을 첨가해서 실온 하에서 하룻밤 정도 교반함으로써 6-브로모-2-[4'-(3"-히드록시프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘을 얻는다. 이것을 피리딘에 용해하고, 빙욕 하에서 파라톨루엔술포닐클로리드를 첨가한 한 후, 실온에서 반응시켜 목적물인 6-브로모-2-[4'-(3"-파라톨루엔술포닐옥시프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘을 얻을 수 있다. 이 때, 파라톨루엔술포닐클로리드의 양은 반응 기질에 대하여 과잉량이면 되고, 구체적으로는 반응 기질인 6-브로모-2-[4'-(3"-히드록시프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘에 대하여 몰비로 해서 2배 정도이면 된다.

또한, 이미다조피리딘환의 2위치 페닐기에 결합하는 알콕시 치환기가 4'위치 이외에 결합하는 화합물, 예를 들면 3'위치에 플루오로프로폭시기가 결합된 6-트리부틸스타닐-2-[3'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘을 합성하기 위해서는, 공정 1에 있어서 4'-히드록시아세토페논 대신에 3'-히드록시아세토페논을 원료로 사용하고, 상기와 같은 반응을 행하면 된다.

(방사성 할로겐 표식 유기화합물의 합성 방법)

다음에, 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-[¹²³I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘을 예로 들어, 본 발명의 다른 일측면에 의한 방사성 할로겐 표식 유기화합물의 제조 방법에 대하여 설명한다.

2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-[¹²³I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘의 제조에 있어서는, 우선, 표식에 제공하는 [¹²³I]요오드화나트륨 용액을 얻는다. [¹²³I]방사성 요오드는, 예를 들면 크세논 가스를 타깃으로 해서 프로톤 조사를 행한다고 하는 공지의 방법으로 얻을 수 있다. 이 [¹²³I]방사성 요오드를 공지의 방법 을 이용하여 [¹²³I]요오드화나트륨 용액으로 해서 표식에 사용한다.

이어서, 표식 전구체인 6-트리부틸스타닐-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘을 불활성 유기용매에 용해하고, 상기 [¹²³I]요오드 벌크를 물로 용해한 액, 산 및 산화제를 첨가해서 반응시켜 목적물인 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-[¹²³I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘을 얻는다. 전구체를 용해시키는 불활성 유기용매로서는 표식 전구체 및 [¹²³I]요오드 벌크와의 사이에서 반응성을 갖지 않는 여러 가지 용매를 사용할 수 있고, 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다.

산은 여러 가지의 것을 사용할 수 있고, 바람직하게는 염산을 사용할 수 있다.

산화제는 반응액 중의 요오드를 산화시킬 수 있는 것이면 특별하게 한정할 필요는 없고, 바람직하게는 과산화수소 또는 과아세트산을 사용할 수 있다. 산화제의 첨가량은 반응 용액 중의 요오드를 산화시키는데에 충분한 양이면 된다.

요오드 이외의 방사성 할로겐 표식체는 합성 목적에 따른 표식 전구체를 목적에 따른 방사성 할로겐으로 표식함으로써 합성할 수 있다. 예를 들면. 2-[4'-(3"-[¹⁸F]플루오로프로폭시)페닐]-6-브로모이미다조[1,2-a]피리딘을 합성하는 경우에는, 표식 전구체인 6-브로모-2-[4'-(3"-파라톨루엔술포닐옥시프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘을 상간 이동 촉매와 탄산칼륨의 존재 하에서 [¹⁸F]불화물 이온과 반응시키면 된다.

(본 발명에 의한 검출 시약의 사용 방법 및 조제 방법)

아밀로이드는 전구 단백의 종류에 따라 많은 다른 구조를 갖지만, β-시트 구조를 갖는 점에서 공통되고 있다. 티오플라빈 T나 콩고레드를 비롯한 아밀로이드를 대상으로 한 많은 염색 시약은 이 β-시트 구조를 인식 타깃으로 하고 있고, 아밀로이드의 종류에 의하지 않고 같은 염색능을 갖고 있는 것이 알려져 있다.

본 발명에 의한 식(1)의 화합물은 아밀로이드 β단백질(이하, Aβ라고 함)을 전구체로 하는 아밀로이드에 친화성을 갖고, 또한 광범위의 아밀로이드에 결합되는 것이 알려져 있는 티오플라빈 T의 아밀로이드에 대한 결합 저해 작용을 갖는다.

따라서, 본 발명에 의한 식(1)의 화합물은 티오플라빈 T와 마찬가지로, 아밀로이드 단백질의 β-시트 구조에 친화성을 갖고 있다고 생각된다. 이것은 본 발명에 의한 식(1)의 화합물이 다종의 아밀로이드에 대하여 같은 친화성을 갖고 있는 것을 시사하고 있다.

즉, 본 발명의 아밀로이드 검출 시약은 티오플라빈 T나 콩고레드와 마찬가지로, 전신성 아밀로이드증 및 국한성 아밀로이드증의 진단에 사용할 수 있다. 여기에 있어서, 전신성 아밀로이드증으로서는 면역글로블린성 아밀로이드증, 반응성 AA 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드증, 투석 아밀로이드증, 노인성 아밀로이드증 등을 들 수 있다. 국한성 아밀로이드증으로서는 뇌 아밀로이드증, 내분비 아밀로이드증, 피부 아밀로이드증, 국한성 결절성 아밀로이드증 등을 들 수 있다.

본 발명의 아밀로이드 검출 시약은 생검을 대상으로 한 인비트로에서 사용하는 시약으로서 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 또한, 변이원성 등의 독성이 억제된 화합물을 이용하고 있으므로 방사성 진단제로서 인비보에서 사용하는 시약으로서 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 아밀로이드 검출 시약은 다른 일반적으로 알려져 있는 방사성 진단제와 마찬가지로, 상기 식(1)으로 나타내어지는 방사성 할로겐 표식 화합물을 소망에 의해 적당한 pH로 조정된 물 또는 생리식염수, 또는 링겔액 등에 배합시킨 액으로서 조제할 수 있다. 이 경우에 있어서의 본 화합물의 농도는 배합된 본 화합물의 안정성이 얻어지는 농도 이하로 할 필요가 있다. 본 화합물의 투여량은 투여된 약제의 분포를 화상화하기 위해서 충분한 양이면 특별하게 한정할 필요는 없다. 예를 들면, 요오드-123(¹²³I) 표식 화합물 및 불소-18(¹⁸F) 표식 화합물의 경우에는, 체중 60㎏의 성인 1명당 50∼600MBq 정도, 정맥 투여 또는 국소 투여해서 사용할 수 있다. 투여된 약제의 분포는 공지의 방법으로 화상화할 수 있고, 예를 들면, 요오드-123(¹²³I) 표식 화합물의 경우에는 SPECT 장치, 불소-18(¹⁸F) 표식 화합물의 경우에는 PET 장치를 이용하여 화상화할 수 있다.

본 발명의 아밀로이드 검출 시약을 생체에 투여함으로써 뇌, 심장, 폐, 소화관, 혈관, 간장, 췌장, 신장, 관절, 뼈 등의 생체조직에 침착한 아밀로이드를 화상화할 수 있어, 생검의 채취가 곤란한 생체조직, 예를 들면 뇌, 심장, 폐, 췌장, 뼈 및 관절에 있어서의 아밀로이드 침착을 화상화하기 위해서 유용하다.

실시예

이하, 실시예, 비교예 및 참고예를 기재해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들의 내용에 한정되는 것은 아니다.

(실시예 Ⅰ)

하기 실시예에 있어서 실험에 제공하는 각 화합물의 명칭을, 표 1-1과 같이 정의했다.

[표 1-1]

(실시예 Ⅰ-1) 6-트리부틸스타닐-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 합성

브롬화제2구리 28.17g(126mmol 상당)에 아세트산 에틸 50mL를 첨가해서 현탁시키고, 이것에 4'-히드록시아세토페논 8.18g(60.0mmol 상당)의 아세트산 에틸 50mL-클로로포름 50mL 혼합액을 첨가하여 가열 환류했다. 5시간 후, 반응액을 실온까지 냉각해서 여과를 행하고, 여과액을 감압 농축했다. 잔사를 아세트산 에틸에 용해하고, 활성탄을 첨가해서 탈색 조작을 행한 후에 용액을 여과, 농축했다. 얻어진 조(粗) 생성물을 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액 : 클로로포름/메탄올=20/1)로 정제하고, 또한, 아세트산 에틸-석유 에테르로부터 재결정을 행하여 2-브로모-4'-히드록시아세토페논 7.25g(33.7mmol 상당)을 얻었다(도 1, 공정 1).

2-브로모-4'-히드록시아세토페논 2.15g(10.0mmol 상당)과 2-아미노-5-브로모피리딘 1.74g(10.0mmol 상당)을 아세토니트릴 50mL에 용해하고, 105℃의 유욕(Oil Bath)에서 6시간 가열 환류했다. 반응 종료 후, 반응액을 실온까지 냉각하고, 침전물을 여과 선별한 후에 아세토니트릴로 세정하여 감압 하에 건조시켰다. 얻어진 조 결정은 물 20mL-메탄올 20mL 혼합액에 현탁시킨 후, 이것에 포화 탄산수소나트륨 용액을 약 25mL 첨가하고, 초음파 세정기로 5분간 진탕했다. 얻어진 혼합물로부터 침전물을 여과 선별해서 물로 잘 세정하고, 감압 하에 건조하여 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘 2.41g(8.32mmol 상당)을 얻었다(도 1, 공정 2).

충분하게 건조시켜 수분을 제거한 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘 290㎎(1.0mmol 상당)을 N,N-디메틸포름아미드 10mL에 용해하고, 이것에 탄산칼륨 413㎎(3.0mmol 상당)을 첨가했다. 이것에 1-브로모-3-플루오로프로판 138μL(1.5mmol 상당)를 첨가하고, 실온 하에서 20.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 물에 쏟아 클로로포름으로 3회 추출했다. 합쳐진 클로로포름층은 포화식염수로 세정한 뒤, 무수황산나트륨으로 건조하고, 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 리사이클 분취 HPLC[HPLC 장치 : LC-908(제품명, 니혼 분세키 고교사 제), 컬럼 : JAIGEL 2H(제품명, 니혼 분세키 고교사 제)를 2개 연결, 이동상 : 클로로포름]를 이용하여 정제하여 6-브로모-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘 302㎎(0.866mmol 상당)을 얻었다(도 1, 공정 3).

6-브로모-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘 85(0.24mmol 상당)을 디옥산 10mL에 용해하고, 트리에틸아민 2mL를 첨가한 후, 이것에 비스트리부틸주석 185μL(0.36mmol 상당)와 테트라키스트리페닐포스핀팔라듐 20㎎(촉매량)을 첨가했다. 반응 혼합물을 90℃에서 24시간 교반한 후, 용매를 감압 하에 증류 제거하고, 잔사를 분취 TLC(용리액 : 헥산/아세트산 에틸=6/4)로 정제했다. 또한 얻어진 조 생성물을 리사이클 분취 HPLC[HPLC 장치 : LC-908(제품명, 니혼 분세키 고교사 제), 컬럼 : JAIGEL 2H(제품명, 니혼 분세키 고교사 제)를 2개 연결, 이동상 : 클로로포름]를 이용하여 정제하여 6-트리부틸스타닐-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘 42㎎(74.2㎛ol 상당)을 얻었다(도 1, 공정 4).

얻어진 6-트리부틸스타닐-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 NMR 측정 결과(내부 표준물질 : 테트라메틸실란)는 이하와 같았다.

사용 NMR 장치 : JNM-ECP-500(니혼 덴시 가부시키가이샤 제)

¹H-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 : 500㎒) : δ8.01-7.93(m, 1H), 7.91-7.87(m, 2H), 7.75-7.74(m, 1H), 7.63-7.58(m, 1H), 7.20-7.11(m, 1H), 7.00-6.95(m, 2H), 4.67(dt, J_HF=47.0Hz, J=6.0Hz, 2H), 4.15(t, J=6.0Hz, 2H), 2.20(dquint, J_HF=26.1Hz, J=6.0Hz, 2H), 1.64-1.47(m, 6H), 1.39-1.31(m, 6H), 1.19-1.04(m, 6H), 0.91(t, J=7.2Hz, 9H)

(실시예 Ⅰ-2) 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-[¹²⁵I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘의 합성

6-트리부틸스타닐-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 메탄올 용액(농도 : 1㎎/mL) 53μL에 1mol/L 염산 100μL, 11.1MBq의 [¹²⁵I]요오드화나트륨(용량으로서 20μL), 10%(W/V) 과산화수소 10μL를 첨가했다. 상기 혼합액을 실온에서 10분간 정치한 후, 하기 조건의 HPLC에 제공하여 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-[¹²⁵I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘 획분을 분취했다.

HPLC 조건 :

컬럼 : Phenomenex Luna C18(상품명, Phenomenex사 제, 사이즈 : 4.6×150㎜)

이동상 : 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 물/0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 아세토니트릴 =80/20→0/100(17분, 직선 그라디언트)

유속 : 1.0mL/분

검출기 : 자외 가시 흡광 광도계(검출 파장 : 282㎚) 및 방사선 검출기(형식 : STEFFI형, raytest사 제)

상기 획분에 물 10mL를 첨가한 액을 역상 컬럼[상품명 : Sep-Pak(등록상표) Light C18 Cartridges, Waters사 제, 충전제의 충전량 : 130㎎]에 통액하여 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-[¹²⁵I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘을 상기 컬럼에 흡착 포집했다. 이 컬럼을 물 1mL로 세정한 후, 에탄올 1mL를 통액해서 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-[¹²⁵I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘을 용출시켰다. 얻어진 화합물의 방사능량은 5.5MBq(제조 직후)이었다. 또한 하기의 조건에 의한 TLC 분석으로 측정한 결과, 그 방사 화학적 순도는 96.0%이었다.

TLC 분석 조건 :

TLC 플레이트 : RP-18F254(제품명, 메르크사 제)

전개상 : 메탄올/물=20/1

검출기 : 바이오이미징 분석기(Bio-imaging Analyzer), BAS-2500(형식 : BAS-2500, 후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제)

(실시예 Ⅰ-3) 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-[¹²³I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘의 합성

6-트리부틸스타닐-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 메탄올 용액(농도 : 1㎎/mL) 70μL에 1mol/L 염산 100μL, 260∼330MBq의 [¹²³I]요오드화나트륨(용량으로서 30∼60μL), 1mmol/L 요오드화나트륨 용액 20μL, 10%(W/V) 과산화수소 20μL를 첨가했다. 상기 혼합액을 50℃에서 10분간 가열한 후, 실시예 Ⅰ-2와 같은 조건의 HPLC에 제공하여 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-[¹²³I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘 획분을 분취하고, 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-[¹²³I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘을 얻었다.

상기 획분에 물 10mL를 첨가한 액을 역상 컬럼[상품명 : Sep-Pak(등록상표) Light C18 Cartridges, Waters사 제, 충전제의 충전량 : 130㎎]에 통액하여 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-[¹²³I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘을 상기 컬럼에 흡착 포집했다. 이 컬럼을 물 1mL로 세정한 후, 에탄올 1mL를 통액해서 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-[¹²³I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘을 용출시켰다. 얻어진 방사능량은 합성 직후에 있어서 112∼153MBq이었다. 또한, 실시예 Ⅰ-2와 같은 조건에서 TLC 분석을 한 결과, 그 방사 화학적 순도는 97.0%이었다.

(실시예 Ⅰ-4) 6-브로모-2-[4'-(3"-파라톨루엔술포닐옥시프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 합성

브롬화제2구리 28.17g(126mmol 상당)에 아세트산 에틸 50mL를 첨가해서 현탁시킨 액에 4'-히드록시아세토페논 8.18g(60.0mmol 상당)을 아세트산 에틸 50mL-클로로포름 50mL 혼합액에 용해시킨 액을 첨가하여 가열 환류했다. 5시간 후, 반응 혼합물을 실온까지 냉각해서 여과를 행하고, 여과액을 감압 농축했다. 잔사를 아세트산 에틸에 용해하고, 활성탄을 첨가해서 탈색 조작을 행한 후에 용액을 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액 : 클로로포름/메탄올=20/1)로 정제하고, 또한, 아세트산 에틸-석유 에테르로부터 재결정을 행하여 2-브로모-4'-히드록시아세토페논 7.25g(33.7mmol 상당)을 얻었다(도 2, 공정 1).

2-브로모-4'-히드록시아세토페논 2.15g(10.0mmol 상당)과 2-아미노-5-브로모피리딘 1.74g(10.0mmol 상당)을 아세토니트릴 50mL에 용해하여 105℃의 유욕에서 6시간 가열 환류했다. 반응 종료 후, 반응액을 실온까지 냉각하고 침전물을 여과 선별한 후 아세토니트릴로 세정하여 감압 하에 건조시켰다. 얻어진 조 결정은 물 20mL-메탄올 20mL 혼합액에 현탁시킨 후, 이것에 포화 탄산수소나트륨 용액을 약 25mL 첨가하고, 초음파 세정기로 5분간 진탕했다. 얻어진 혼합물로부터 침전물을 여과 선별해서 물로 잘 세정하고, 감압 하에 건조하여 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘 2.41g(8.32mmol 상당)을 얻었다(도 2, 공정 2).

충분하게 건조시켜 수분을 제거한 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘 1.45g(5.0mmol 상당)을 N,N-디메틸포름아미드 50mL에 용해하고, 이것에 탄산칼륨 2.07g(15.0mmol 상당)을 첨가했다. 이것에 3-브로모-1-프로판올 680μL(7.5mmol 상당)를 첨가하여 실온 하 17시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 물에 쏟아 클로로포름으로 3회 추출했다. 합쳐진 클로로포름층은 포화식염수로 세정한 뒤, 무수황산나트륨으로 건조하고, 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 메탄올로부터 재결정하여 6-브로모-2-[4'-(3"-히드록시프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘 1.28g(3.67mmol 상당)을 얻었다(도 2, 공정 3).

6-브로모-2-[4'-(3"-히드록시프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘 177㎎(0.5mmol 상당)을 피리딘 10mL에 용해하고, 빙욕 하에 파라톨루엔술포닐클로리드 197㎎(1.0mmol 상당)을 첨가했다. 이것을 실온에서 16시간 교반한 후, 물에 쏟고 클로로포름으로 3회 추출했다. 합쳐진 클로로포름층을 포화식염수로 세정한 후, 무수황산나트륨으로 건조하여 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 리사이클 분취HPLC[HPLC 장치 : LC-908(제품명, 니혼 분세키 고교사 제), 컬럼 : JAIGEL 2H(제품명, 니혼 분세키 고교사 제)를 2개 연결, 이동상 : 클로로포름]를 이용하여 정제하여 6-브로모-2-[4'-(3"-파라톨루엔술포닐옥시프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘 87㎎(0.17mmol 상당)을 얻었다(도 2, 공정 4).

얻어진 6-브로모-2-[4'-(3"-파라톨루엔술포닐옥시프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 NMR 측정 결과(내부 표준물질 : 테트라메틸실란)는 이하와 같았다.δ

사용 NMR 장치 : JNM-ECP-500(니혼 덴시 가부시키가이샤 제)

¹H-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 : 500㎒) : δ8.26-8.24(m, 1H), 7.84-7.80(m, 2H), 7.77-7.74(m, 2H), 7.74(s, 1H), 7.50(d, J=9.7Hz, 1H), 7.26-7.23(m, 2H), 7.21(dd, J=9.7, 2.0Hz, 1H), 6.84-6.80(m, 2H), 4.26(t, J=6.0Hz, 2H), 3.98(t, J=6.0Hz, 2H), 2.35(s, 3H), 2.13(quint., J=6.0Hz, 2H).

¹³C-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 : 125㎒) : δ158.67, 146.53, 144.79, 144.08, 132.77, 129.80, 127.87, 127.81, 127.28, 126.20, 125.43, 117.87, 114.63, 107.40, 106.76, 66.97, 63.08, 28.85, 21.60.

(실시예 Ⅰ-5) 6-브로모-2-[4'-(3"-[¹⁸F]플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘

[¹⁸F]불화물 이온 함유 H₂ ¹⁸O(방사능량 4210MBq, 합성 개시시 보정값)를 Sep-Pak Light QMA(상품명, 니혼 워터즈 가부시키가이샤 제)에 통액하여 [¹⁸F]불화물 이온을 흡착 포집했다. 이어서, 상기 컬럼에 탄산칼륨 수용액(66.7mmol/L, 0.3mL) 및 20㎎(53.2μmol 상당)의 클립토픽스 222(상품명, 메르크사 제)의 아세토니트릴 1.5mL 용액을 통액하여 [¹⁸F]불화물 이온을 용출했다.

이것을 헬륨 가스의 통기 하, 100℃로 가열해서 물을 증발시킨 후, 아세토니트릴(0.3mL×2)을 첨가하여 공비시켜 건고시켰다. 여기에 상기 실시예 Ⅰ-4에서 합성한 6-브로모-2-[4'-(3"-파라톨루엔술포닐옥시프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘 5㎎(10.0μmol 상당)의 디메틸포름아미드 1.0mL 용액을 첨가하여 130℃에서 10분간 가열했다. 반응액을 30℃까지 냉각한 뒤, 반응액에 에테르(3.5mL×3)를 첨가하고, 그 때마다 Sep-Pak Plus Silica(상품명, 니혼 워터즈사 제)에 통액했다. 통액 후의 에테르 용액을 헬륨 가스의 통기 하 60℃로 가온해서 농축하고, 농축액에 메탄올/물/트리에틸아민=800:200:1의 혼합액 2mL를 첨가하여 희석했다.

얻어진 용액을 HPLC[컬럼 : Capcell Pak C18 MG(15mmi.d.×250㎜, 가부시키가이샤 시세이도 제), 용리액 : 메탄올/물/트리에틸아민=700/300/1]를 이용하여 정제를 행하였다. 목적물을 함유하는 용리액의 소량에 물 100mL를 첨가해서 희석한 후, 이 액을 Sep-Pak Plus C18(상품명, 니혼 워터즈사 제)에 통액하여 목적물을 흡착 포집했다. 이어서, 상기 컬럼을 물 20mL를 통액해서 세정한 후, 에탄올 4mL를 통액해서 용출하여 6-브로모-2-[4'-(3"-[¹⁸F]플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 에탄올 용액을 얻었다. 얻어진 방사능량은 769MBq(합성 개시 후 107분)이며, 하기 조건에서 TLC 분석을 행한 결과 그 방사 화학적 순도는 95.9%이었다.

TLC 분석 조건 :

TLC 플레이트 : Silica Gel 60 F₂₅₄(제품명, 메르크사 제)

전개상 : 클로로포름/메탄올/트리에틸아민=500/10/0.5

검출기 : Rita Star(제품명, raytest사 제)

(실시예 Ⅰ-6) 6-브로모-2-[4'-(2"-파라톨루엔술포닐옥시에톡시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 합성

브롬화제2구리 28.17g(126mmol 상당)에 아세트산 에틸 50mL를 첨가해서 현탁시키고, 이것에 4'-히드록시아세토페논 8.18g(60.0mmol 상당)의 아세트산 에틸 50mL-클로로포름 50mL 혼합액을 첨가하여 가열 환류했다. 5시간 후, 반응액을 실온까지 냉각해서 여과를 행하고, 여과액을 감압 농축했다. 잔사를 아세트산 에틸에 용해하고, 활성탄을 첨가해서 탈색 조작을 행한 후에 용액을 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액 : 클로로포름/메탄올=20/1)로 정제하고, 또한 아세트산 에틸-석유 에테르로부터 재결정을 행하여 2-브로모-4'-히드록시아세토페논 7.25g(33.7mmol 상당)을 얻었다(도 3, 공정 1).

2-브로모-4'-히드록시아세토페논 2.15g(10.0mmol 상당)과 2-아미노-5-브로모피리딘 1.74g(10.0mmol 상당)을 아세토니트릴 50mL에 용해하고, 105℃의 유욕에서 6시간 가열 환류했다. 반응 종료 후, 반응액을 실온까지 냉각하고, 침전물을 여과 선별한 후에 아세토니트릴로 세정하여 감압 하에 건조시켰다. 얻어진 조 결정은 물 20mL-메탄올 20mL 혼합액에 현탁시킨 후, 이것에 포화 탄산수소나트륨 용액을 약 25mL 첨가하여 초음파 세정기에서 5분간 진탕했다. 얻어진 혼합물로부터 침전물을 여과 선별해서 물로 잘 세정하고, 감압 하에 건조하여 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘 2.41g(8.32mmol 상당)을 얻었다(도 3, 공정 2).

에틸렌글리콜 621㎎(10.0mmol 상당)을 염화메틸렌 100mL에 용해하고, 빙욕 하에 이것에 산화은 3.49g(15.0mmol 상당), 요오드화칼륨 350㎎(2.1mmol 상당) 및 파라톨루엔술포닐클로리드 2.10g(11.0mmol 상당)을 첨가하여 0℃에서 2시간 교반하였다. 반응 혼합물로부터 불용분을 여과하고, 또한 불용분을 아세트산 에틸로 세정했다. 여과액과 세정액을 합쳐서 농축하고, 얻어진 조 생성물을 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액 : 헥산/아세트산 에틸=1/1)로 정제하여 2-히드록시에틸파라톨루엔술포네이트 643㎎(2.97mmol 상당)을 얻었다(도 3, 공정 3).

2-히드록시에틸파라톨루엔술포네이트 639㎎(2.95mmol 상당)의 테트라히드로푸란 10mL 용액에 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘 388㎎(1.34mmol 상당)과 트리페닐포스핀 780㎎(2.97mmol 상당)을 첨가하고, 또한 N,N-디메틸포름아미드 6mL를 첨가해서 내용물을 완전히 용해시켰다. 반응 혼합물에 디이소프로필아조디카르복실레이트 0.58mL(2.95mmol 상당)을 첨가하여 실온 하 17시간 교반한 후, 반응액을 농축했다. 얻어진 조 생성물을 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액 : 헥산/아세트산 에틸=65/35)로 정제하고, 목적물을 함유하는 부분으로부터 클로로포름 불용성분을 여과 선별한 후, 또한 리사이클 분취HPLC[HPLC 장치 : LC-908(제품명, 니혼 분세키 고교사 제), 컬럼 : JAIGEL 2H(제품명, 니혼 분세키 고교사 제)를 2개 연결, 이동상 : 클로로포름]를 이용하여 정제하여 6-브로모-2-[4'-(2"-파라톨루엔술포닐옥시에톡시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘79.7㎎(164μmol 상당)을 얻었다(도 3, 공정 4).

얻어진 6-브로모-2-[4'-(2"-파라톨루엔술포닐옥시에톡시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 NMR 측정 결과는 이하와 같았다.

사용 NMR 장치 : JNM-ECP-500(니혼 덴시 가부시키가이샤 제)

¹H-NMR(용매 : 중디메틸포름아미드, 공명 주파수 : 500㎒) : δ8.73-8.71(m, 1H), 8.19-8.17(m, 1H), 7.81-7.77(m, 2H), 7.73-7.70(m, 2H), 7.41-7.38(m, 1H), 7.39-7.36(m, 2H), 7.20(dd, J=9.5, 1.9Hz), 6.85-6.81(m, 2H), 4.34-4.31(m, 2H), 4.19-4.15(m, 2H).

¹³C-NMR(용매 : 중디메틸포름아미드, 공명 주파수 : 125㎒) : δ158.32, 145.91, 145.24, 143.84, 133.15, 130.18, 127.83, 127.54, 127.19, 127.15, 126.90, 117.56, 114.86, 108.73, 105.80, 69.28, 65.88, 20.69.

(참고예 Ⅰ-1) 6-브로모-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘(비방사성 불소화체)의 합성

본 발명에 의한 화합물의 아밀로이드로의 친화성, 지용성 및 변이원성을 조사하기 위한 시료로서 6-브로모-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 비방사성 불소화체의 합성을 행하였다.

브롬화제2구리 28.17g(126mmol 상당)에 아세트산 에틸 50mL를 첨가해서 현탁시키고, 이것에 4'-히드록시아세토페논 8.18g(60.0mmol 상당)의 아세트산 에틸 50mL-클로로포름 50mL 혼합액을 첨가하여 가열 환류했다. 5시간 후, 반응액을 실온까지 냉각해서 여과를 행하고, 여과액을 감압 농축했다. 잔사를 아세트산 에틸에 용해하고, 활성탄을 첨가해서 탈색 조작을 행한 후에 용액을 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액 : 클로로포름/메탄올=20/1)로 정제하고, 또한 아세트산 에틸-석유 에테르로부터 재결정을 행하여 2-브로모-4'-히드록시아세토페논 7.25g(33.7mmol 상당)을 얻었다(도 4, 공정 1).

2-브로모-4'-히드록시아세토페논 2.15g(10.0mmol 상당)과 2-아미노-5-브로모피리딘 1.74g(10.0mmol 상당)을 아세토니트릴 50mL에 용해하고, 105℃의 유욕에서 6시간 가열 환류했다. 반응 종료 후, 반응액을 실온까지 냉각하고, 침전물을 여과 선별한 후에 아세토니트릴로 세정하고, 감압 하에 건조시켰다. 얻어진 조 결정은 물 20mL-메탄올 20mL 혼합액에 현탁시킨 후, 이것에 포화 탄산수소나트륨 용액을 약 25mL 첨가하여 초음파 세정기에서 5분간 진탕했다. 얻어진 혼합물로부터 침전물을 여과 선별해서 물로 잘 세정하고, 감압 하에 건조하여 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘 2.41g(8.32mmol 상당)을 얻었다(도 4, 공정 2).

충분하게 건조시켜 수분을 제거한 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘 290㎎(1.0mmol 상당)을 N,N-디메틸포름아미드 10mL에 용해하고, 이것에 탄산칼륨 413㎎(3.0mmol 상당)을 첨가했다. 이것에 1-브로모-3-플루오로프로판 138μL(1.5mmol 상당)를 첨가하고, 실온 하 20.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 물에 쏟아 클로로포름으로 3회 추출했다. 합쳐진 클로로포름층은 포화식염수로 세정한 뒤, 무수황산나트륨으로 건조하여 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 리사이클 분취 HPLC[HPLC 장치 : LC-908(제품명, 니혼 분세키 고교사 제), 컬럼 : JAIGEL 2H(제품명, 니혼 분세키 고교사 제)을 2개 연결, 이동상 : 클로로포름]를 이용하여 정제하여 6-브로모-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘 302㎎(0.866mmol 상당)을 얻었다(도 4, 공정 3).

얻어진 6-브로모-2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 NMR 측정 결과(내부 표준물질 : 테트라메틸실란)는 이하와 같았다.

사용 NMR 장치 : JNM-ECP-500(니혼 덴시 가부시키가이샤 제)

¹H-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 : 500㎒) : δ8.23(dd, J=1.9, 0.2Hz, 1H), 7.88-7.83(m, 2H), 7.51-7.48(m, 1H), 8.21(dd, J=9.5, 1.9Hz, 1H), 6.99-6.95(m, 2H), 4.67(dt, ²J_HF=47.1Hz, J=5.9Hz, 2H), 4.15(t, J=5.9Hz, 2H), 2.19(dquint, ³J_HF=25.9Hz, J=5.9Hz, 2H).

¹³C-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 : 125㎒) : δ159.01, 146.61, 144.07, 127.81, 127.38, 126.15, 125.41, 117.87, 114.78, 107.41, 106.71, 80.71(d, ¹J_CF=164.6Hz), 63.59(d, ³J_CF=5.3Hz), 30.43(d, ²J_CF=19.7Hz).

¹⁹F-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 : 470㎒) : δ-222.07(dd, ²J_HF=47.1Hz, ³J_HF=25.9Hz).

(참고예 Ⅰ-2) 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘(비방사성 불소화체)의 합성

본 발명에 의한 화합물의 아밀로이드로의 친화성, 지용성 및 변이원성을 조사하기 위한 시료로서 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘의 비방사성 불소화체의 합성을 행하였다.

브롬화제2구리 28.17g(126mmol 상당)에 아세트산 에틸 50mL를 첨가해서 현탁시키고, 이것에 4'-히드록시아세토페논 8.18g(60.0mmol 상당)의 아세트산 에틸 50mL-클로로포름 50mL 혼합액을 첨가하여 가열 환류했다. 5시간 후, 반응액을 실온까지 냉각해서 여과를 행하고, 여과액을 감압 농축했다. 잔사를 아세트산 에틸에 용해하고, 활성탄을 첨가해서 탈색 조작을 행한 후에 용액을 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액 : 클로로포름/메탄올=20/1)로 정제하고, 또한 아세트산 에틸-석유 에테르로부터 재결정을 행하여 2-브로모-4'-히드록시아세토페논 7.25g(33.7mmol 상당)을 얻었다(도 5, 공정 1).

2-브로모-4'-히드록시아세토페논 441㎎(2.0mmol 상당)과 2-아미노-5-요오드피리딘 449㎎(2.0mmol 상당)을 아세토니트릴 15mL에 용해하고, 110℃의 유욕에서 5시간 가열 환류했다. 반응 종료 후, 반응액을 실온까지 냉각하고, 침전물을 여과 선별한 후에 아세토니트릴로 세정하여 감압 하에 건조시켰다. 얻어진 조 결정은 물 10mL-메탄올 10mL 혼합액에 현탁시킨 후, 이것에 포화 탄산수소나트륨 용액을 약 10mL 첨가하여 초음파 세정기에서 5분간 진탕했다. 얻어진 혼합물로부터 침전물을 여과 선별해서 물로 잘 세정하고, 감압 하에 건조하여 2-(4'-히드록시페닐)-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘 526㎎(1.56mmol 상당)을 얻었다(도 5, 공정 2).

충분하게 건조시켜 수분을 제거한 2-(4'-히드록시페닐)-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘 673㎎(2.0mmol 상당)을 N,N-디메틸포름아미드 25mL에 용해하고, 이것에 탄산칼륨 831㎎(6.0mmol 상당)을 첨가했다. 이것에 1-브로모-3-플루오로프로판 275μL(3.0mmol 상당)를 첨가하고, 실온 하에 24시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 물에 쏟아 클로로포름으로 3회 추출했다. 합쳐진 클로로포름층은 물과 포화식염수로 세정한 뒤 무수황산나트륨으로 건조하고, 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액 : 클로로포름)로 정제하고, 또한 리사이클 분취 HPLC[HPLC 장치 : LC-908(제품명, 니혼 분세키 고교사 제), 컬럼 : JAIGEL 2H(제품명, 니혼 분세키 고교사 제)을 2개 연결, 이동상 : 클로로포름]를 이용하여 정제하여 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘 349㎎(0.881mmol 상당)을 얻었다(도 5, 공정 3).

얻어진 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘의 NMR 측정 결과(내부 표준물질 : 테트라메틸실란)는 이하와 같았다.

사용 NMR 장치 : JNM-ECP-500(니혼 덴시 가부시키가이샤 제)

¹H-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 : 500㎒) : δ8.37-8.35(m, 1H), 7.88-7.84(m, 2H), 7.72(s, 1H), 7.42-7.39(m, 1H), 7.32(dd, J=9.4, 1.6Hz, 1H), 6.99-6.96(m, 2H), 4.67(dt, ²J_HF=47.0Hz, J=6.0Hz, 2H), 4.15(t, J=6.0Hz, 2H), 2.20(dquint, ³J_HF=25.9Hz, J=6.0Hz, 2H).

¹³C-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 : 125㎒) : δ159.01, 146.23, 144.16, 132.36, 130.28, 127.42, 126.05, 118.31, 114.77, 106.90, 80.72(d, ¹J_CF=164.6Hz), 74.80, 63.57(d, ³J_CF=5.3Hz), 30.42(d, ²J_CF=20.2Hz).

¹⁹F-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 : 470㎒) : δ-222.09(dd, ²J_HF=47.0Hz, ³J_HF=25.9Hz).

(참고예 Ⅰ-3) 6-브로모-2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘(비방사성 불소화체)의 합성

본 발명에 의한 화합물의 아밀로이드로의 친화성, 지용성 및 변이원성을 조사하기 위한 시료로서 6-브로모-2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 비방사성 불소화체의 합성을 행하였다.

브롬화제2구리 28.17g(126mmol 상당)에 아세트산 에틸 50mL를 첨가해서 현탁시키고, 이것에 4'-히드록시아세토페논 8.18g(60.0mmol 상당)의 아세트산 에틸 50mL-클로로포름 50mL 혼합액을 첨가하여 가열 환류했다. 5시간 후, 반응액을 실온까지 냉각해서 여과를 행하고, 여과액을 감압 농축했다. 잔사를 아세트산 에틸에 용해하고, 활성탄을 첨가해서 탈색 조작을 행한 후에 용액을 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액 : 클로로포름/메탄올=20/1)로 정제하고, 또한 아세트산 에틸-석유 에테르로부터 재결정을 행하여 2-브로모-4'-히드록시아세토페논 7.25g(33.7mmol 상당)을 얻었다(도 6, 공정 1).

2-브로모-4'-히드록시아세토페논 2.15g(10.0mmol 상당)과 2-아미노-5-브로모피리딘 1.74g(10.0mmol 상당)을 아세토니트릴 50mL에 용해하고, 105℃의 유욕에서 6시간 가열 환류했다. 반응 종료 후, 반응액을 실온까지 냉각하고, 침전물을 여과 선별한 후에 아세토니트릴로 세정하여 감압 하에 건조시켰다. 얻어진 조 결정은 물 20mL-메탄올 20mL 혼합액에 현탁시킨 후, 이것에 포화 탄산수소나트륨 용액을 약 25mL 첨가하여 초음파 세정기에서 5분간 진탕했다. 얻어진 혼합물로부터 침전물을 여과 선별해서 물로 잘 세정하고, 감압 하에 건조하여 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘 2.41g(8.32mmol 상당)을 얻었다(도 6, 공정 2).

충분하게 건조시켜 수분을 제거한 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘 578㎎(2.0mmol 상당)을 N,N-디메틸포름아미드 20mL에 용해하고, 이것에 탄산칼륨 830㎎(6.0mmol 상당)을 첨가했다. 이것에 2-플루오로에틸파라톨루엔술포네이트 510μL(3.0mmol 상당)를 첨가하여 실온 하에 44.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 물에 쏟아 클로로포름으로 3회 추출했다. 합쳐진 클로로포름층은 물 및 포화식염수로 세정한 뒤, 무수황산나트륨으로 건조하여 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액 : 클로로포름/메탄올=100/1)로 정제하고, 리사이클 분취 HPLC[HPLC 장치 : LC-908(제품명, 니혼 분세키 고교사 제), 컬럼 : JAIGEL 2H(제품명, 니혼 분세키 고교사 제)를 2개 연결, 이동상 : 클로로포름]를 이용하여 정제한 후, 또한 분취 TLC(용리액 : 클로로포름/메탄올=50:1)로 정제해서 6-브로모-2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘 446㎎(1.33mmol 상당)을 얻었다(도 6, 공정 3).

얻어진 6-브로모-2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 NMR 측정 결과(내부 표준물질 : 테트라메틸실란)는 이하와 같았다.

사용 NMR 장치 : JNM-ECP-500(니혼 덴시 가부시키가이샤 제)

¹H-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 : 500㎒) : δ8.23-8.21(m, 1H), 7.87-7.84(m, 1H), 7.72(s, 1H), 7.51-7.47(m, 1H), 7.20(dd, J=9.5, 1.9Hz, 1H), 7.01-6.97(m, 2H), 4.84-4.71(m, 2H), 4.30-4.21(m, 2H).

¹³C-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 : 125㎒) : δ158.62, 146.46, 144.06, 127.85, 127.41, 126.58, 125.42, 117.87, 114.91, 107.49, 106.74, 81.86(d, ¹J_CF=170.8Hz), 67.15(d, ²J_CF=20.2Hz).

¹⁹F-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 : 470㎒) : δ-223.80(dd, ²J_HF=47.4Hz, ³J_HF=27.6Hz).

(참고예 Ⅰ-4) 2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘(비방사성 불소화체)의 합성

본 발명에 의한 화합물의 아밀로이드로의 친화성, 지용성 및 변이원성을 조사하기 위한 시료로서 2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘의 비방사성 불소화체의 합성을 행하였다.

브롬화제2구리 28.17g(126mmol 상당)에 아세트산 에틸 50mL를 첨가해서 현탁시키고, 이것에 4'-히드록시아세토페논 8.18g(60.0mmol 상당)의 아세트산 에틸 50mL-클로로포름 50mL 혼합액을 첨가하여 가열 환류했다. 5시간 후, 반응액을 실온까지 냉각해서 여과를 행하고, 여과액을 감압 농축했다. 잔사를 아세트산 에틸에 용해하고, 활성탄을 첨가해서 탈색 조작을 행한 후에 용액을 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액 : 클로로포름/메탄올=20/1)로 정제하고, 또한 아세트산 에틸-석유 에테르로부터 재결정을 행하여 2-브로모-4'-히드록시아세토페논 7.25g(33.7mmol 상당)을 얻었다(도 7, 공정 1).

2-브로모-4'-히드록시아세토페논 441㎎(2.0mmol 상당)과 2-아미노-5-요오드 피리딘 449㎎(2.0mmol 상당)을 아세토니트릴 15mL에 용해하고, 110℃의 유욕에서 5시간 가열 환류했다. 반응 종료 후, 반응액을 실온까지 냉각하고, 침전물을 여과 선별한 후에 아세토니트릴로 세정하여 감압 하에 건조시켰다. 얻어진 조 결정은 물 10mL-메탄올 10mL 혼합액에 현탁시킨 후, 이것에 포화 탄산수소나트륨 용액을 약 10mL 첨가하여 초음파 세정기에서 5분간 진탕했다. 얻어진 혼합물로부터 침전물을 여과 선별해서 물로 잘 세정하고, 감압 하에 건조하여 2-(4'-히드록시페닐)-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘 526㎎(1.56mmol 상당)을 얻었다(도 7, 공정 2).

충분하게 건조시켜 수분을 제거한 2-(4'-히드록시페닐)-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘 368㎎(1.1mmol 상당)을 N,N-디메틸포름아미드 15mL에 용해하고, 이것에 탄산칼륨 453㎎(3.3mmol 상당)을 첨가했다. 이것에 2-플루오로에틸파라톨루엔술포네이트 280μL(1.6mmol 상당)를 첨가하여 실온 하에 22시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 물에 쏟아 클로로포름으로 3회 추출했다. 합쳐진 클로로포름층은 물 및 포화식염수로 세정한 뒤, 무수황산나트륨으로 건조하여 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액 : 헥산/아세트산 에틸=1/1)로 정제하고, 또한 리사이클 분취 HPLC[HPLC 장치 : LC-908(제품명, 니혼 분세키 고교사 제), 컬럼 : JAIGEL 2H(제품명, 니혼 분세키 고교사 제)를 2개 연결, 이동상 : 클로로포름]를 이용하여 정제하여 2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘 222㎎(0.580mmol 상당)을 얻었다(도 7, 공정 3).

얻어진 2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘의 NMR 측정 결과(내부 표준물질 : 테트라메틸실란)는 이하와 같았다.

사용 NMR 장치 : JNM-ECP-500(니혼 덴시 가부시키가이샤 제)

¹H-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 : 500㎒) : δ8.35-8.33(m, 1H), 7.88-7.84(m, 2H), 7.70(s, 1H), 7.39(d, J=9.4Hz, 1H), 7.31(dd, J=9.4, 1.8Hz, 1H), 7.01-6.97(m, 2H), 4.84-4.71(m, 2H), 4.30-4.22(m, 2H).

¹³C-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 : 125㎒) : δ158.62, 146.08, 144.16, 132.38, 130.30, 127.44, 126.52, 118.30, 114.91, 106.99, 81.86(d, ²J_CF=170.8Hz), 74.82, 67.15(d, ³J_CF=20.6Hz).

¹⁹F-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 : 470㎒) : δ-223.74(dd, ²J_HF=47.4Hz, ³J_HF=27.7Hz).

(참고예 Ⅰ-5) 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리미딘(비방사성 불소화체)의 합성

본 발명에 의한 화합물의 아밀로이드로의 친화성, 지용성 및 변이원성을 조사하기 위한 시료로서 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리미딘의 비방사성 불소화체의 합성을 행하였다.

브롬화제2구리 28.17g(126mmol 상당)에 아세트산 에틸 50mL를 첨가해서 현탁시키고, 이것에 4'-히드록시아세토페논 8.18g(60.0mmol 상당)을 아세트산 에틸 50mL-클로로포름 50mL 혼합액에 용해시킨 액을 첨가하여 가열 환류했다. 5시간 후, 반응 혼합물을 실온까지 냉각해서 여과를 행하고, 여과액을 감압 농축했다. 잔사를 아세트산 에틸에 용해하고, 활성탄을 첨가해서 탈색 조작을 행한 후에 용액을 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액 : 클로로포름/메탄올=20/1)로 정제하고, 또한 아세트산 에틸-석유 에테르로부터 재결정을 행하여 2-브로모-4'-히드록시아세토페논 7.25g(33.7mmol 상당)을 얻었다(도 8, 공정 1).

2-브로모-4'-히드록시아세토페논 646㎎(3.0mmol 상당)과 2-아미노-5-요오드피리미딘 668㎎(3.0mmol 상당)을 아세토니트릴 20mL에 용해하고, 110℃의 유욕에서 8시간 가열 환류했다. 반응 종료 후, 반응액을 실온까지 냉각하고, 침전물을 여과 선별한 후에 아세토니트릴로 세정하여 감압 하에 건조시켰다. 얻어진 조 결정은 물 10mL-메탄올 10mL 혼합액에 현탁시킨 후, 이것에 포화 탄산수소나트륨 용액을 약 15mL 첨가하고, 초음파 세정기에서 3분간 진탕했다. 얻어진 혼합물로부터 침전물을 여과 선별해서 물로 잘 세정하고, 감압 하에 건조하여 2-(4'-히드록시페닐)-6-요오드이미다조[1,2-a]피리미딘 737㎎(2.19mmol 상당)을 얻었다(도 8, 공정 2).

충분하게 건조시켜 수분을 제거한 2-(4'-히드록시페닐)-6-요오드이미다조[1,2-a]피리미딘 339㎎(1.0mmol 상당)을 N,N-디메틸포름아미드 20mL에 용해하고, 이것에 탄산칼륨 414㎎(3.0mmol 상당)을 첨가했다. 이것에 1-브로모-3-플루오로프로판 138μL(1.5mmol 상당)를 첨가하여 실온 하에 22시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 물에 쏟아 클로로포름으로 3회 추출했다. 합쳐진 클로로포름층은 포화식염수로 세정한 뒤, 무수황산나트륨으로 건조하여 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 N,N-디메틸포름아미드로부터 재결정하여 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리미딘 236㎎(0.594mmol 상당)을 얻었다(도 8, 공정 3).

얻어진 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리미딘의 NMR 측정 결과(내부 표준물질 : 디메틸술폭시드)는 이하와 같았다.

사용 NMR 장치 : JNM-ECP-500(니혼 덴시 가부시키가이샤 제)

¹H-NMR(용매 : 중디메틸술폭시드, 공명 주파수 : 500㎒) : δ9.27(d, J=2.3Hz, 1H), 8.55(d, J=2.3Hz, 1H), 8.15(s, 1H), 7.94-7.90(m, 2H), 7.06-7.02(m, 2H), 4.62(dt, ²J_HF=47.2Hz, J=6.1, 2H), 4.14(t, J=6.1Hz, 2H), 2.13(dquint, ³J_HF=25.5Hz, J=6.1Hz, 2H).

¹³C-NMR(용매 : 중디메틸술폭시드, 공명 주파수 : 125㎒) : δ159.16, 154.12, 146.54, 146.26, 139.00, 127.60, 126.06, 115.21, 106.52, 81.15(d, ¹J_CF=161.7Hz), 74.43, 64.07(d, ³J_CF=5.8Hz), 30.13(d, ²J_CF =19.7Hz).

¹⁹F-NMR(용매 : 중디메틸술폭시드, 공명 주파수 : 470㎒) : δ-220.13(tt, ²J_HF=47.2Hz, ³J_HF=25.5Hz).

(참고예 Ⅰ-6) [¹²⁵I]-IMPY의 합성

아밀로이드 결합성에 관한 검토에 있어서의 비교예에 사용하기 위해서, 하기의 공정에 따라 [¹²⁵I]-IMPY를 합성했다.

문헌(Zhi-Ping Zhuang et al., J. Med. Chem, 2003, 46, p.237-243) 기재의 방법에 따라, 6-트리부틸스타닐-2-[4'-(N,N-디메틸아미노)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘을 합성하고, 메탄올에 용해했다(농도 : 1㎎/mL). 상기 용액 53μL에 1mol/L 염산 75μL, 13.5MBq의 [¹²⁵I]요오드화나트륨 20μL, 10%(W/V) 과산화수소 10μL를 첨가했다. 상기 혼합액을 50℃에서 10분간 정치한 후, 실시예 Ⅰ-2와 같은 조건의 HPLC에 제공하여 [¹²⁵I]-IMPY 획분을 분취했다.

상기 획분에 물 10mL를 첨가한 액을 역상 컬럼[상품명 : Sep-Pak(등록상표) Light C18 Cartridges, Waters사 제, 충전제의 충전량 : 130㎎]에 통액하여 [¹²⁵I]-IMPY를 상기 컬럼에 흡착 포집했다. 이 컬럼을 물 1mL로 세정한 후, 에탄올 1mL를 통액해서 [¹²⁵I]-IMPY를 용출시켰다. 얻어진 방사능량은 합성 직후에 있어서 2.6MBq이었다. 또한, 실시예 Ⅰ-2와 같은 조건으로 TLC 분석을 행한 결과, 그 방사 화학적 순도는 98.0%이었다.

(참고예 Ⅰ-7) [¹²³I]-IMPY의 합성

logP_octanol 및 뇌 집적성에 관한 검토에 있어서의 비교예에 사용하기 위해서, 하기의 공정에 따라 [¹²³I]-IMPY를 합성했다.

문헌(Zhi-Ping Zhuang et al., J. Med. Chem, 2003, 46, p.237-243) 기재의 방법에 따라, 6-트리부틸스타닐-2-[4'-(N,N-디메틸아미노)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘을 합성하고, 메탄올에 용해했다(농도 : 1㎎/mL). 상기 용액 53μL에 1mol/L 염산 100μL, 190∼240MBq의 [¹²³I]요오드화나트륨 20∼50μL, 1mmol/L 요오드화나트륨 용액 10μL, 10%(W/V) 과산화수소 10μL를 첨가했다. 상기 혼합액을 50℃에서 10분간 정치한 후, 실시예 Ⅰ-2와 같은 조건의 HPLC에 제공하여 [¹²³I]-IMPY 획분을 분취했다.

상기 획분에 물 10mL를 첨가한 액을 역상 컬럼[상품명 : Sep-Pak(등록상표) Light C18 Cartridges, Waters사 제, 충전제의 충전량 : 130㎎]에 통액하여 [¹²³I]-IMPY를 상기 컬럼에 흡착 포집했다. 이 컬럼을 물 1mL로 세정한 후, 에탄올 1mL를 통액해서 [¹²³I]-IMPY를 용출시켰다. 얻어진 방사능량은 합성 직후에 있어서 47∼56MBq이었다. 또한, 실시예 Ⅰ-2와 같은 조건에서 TLC 분석을 행한 결과, 그 방사 화학적 순도는 98.0%이었다.

(참고예 Ⅰ-8) 2-(4'-히드록시페닐)-6-[¹²⁵I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘의 합성

logP_HPLC의 산출에 사용하는 계산식을 작성할 목적으로, 하기의 공정에 따라 2-(4'-히드록시페닐)-6-[¹²⁵I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘을 합성했다.

브롬화제2구리 28.17g(126mmol 상당)에 아세트산 에틸 50mL를 첨가해서 현탁시키고, 이것에 4'-히드록시아세토페논 8.18g(60.0mmol 상당)을 아세트산 에틸 50mL-클로로포름 50mL 혼합액에 용해시킨 액을 첨가하여 가열 환류했다. 5시간 후, 반응 혼합물을 실온까지 냉각해서 여과를 행하고, 여과액을 감압 농축했다. 잔사를 아세트산 에틸에 용해하고, 활성탄을 첨가해서 탈색 조작을 행한 후에 용액을 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액 : 클로로포름/메탄올=20/1)로 정제하고, 또한 아세트산 에틸-석유 에테르로부터 재결정을 행하여 2-브로모-4'-히드록시아세토페논 7.25g(33.7mmol 상당)을 얻었다(도 9, 공정 1).

2-브로모-4'-히드록시아세토페논 2.15g(10.0mmol 상당)과 2-아미노-5-브로모피리딘 1.74g(10.0mmol 상당)을 아세토니트릴 50mL에 용해하고, 105℃의 유욕에서 6시간 가열 환류했다. 반응 종료 후, 반응액을 실온까지 냉각하고, 침전물을 여과 선별한 후에 아세토니트릴로 세정하여 감압 하에 건조시켰다. 얻어진 조 결정은 물 20mL-메탄올 20mL 혼합액에 현탁시킨 후, 이것에 포화 탄산수소나트륨 용액을 약25mL 첨가하고, 초음파 세정기에서 5분간 진탕했다. 얻어진 혼합물로부터 침전물을 여과 선별해서 물로 잘 세정하고, 감압 하에 건조하여 6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘 2.41g(8.32mmol 상당)을 얻었다(도 9, 공정 2).

6-브로모-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘 138㎎(0.476mmol 상당)을 디옥산 20mL에 용해하고, 트리에틸아민 2mL를 첨가한 후, 비스트리부틸주석 360μL(0.713mmol 상당)와 촉매량의 테트라키스트리페닐포스핀팔라듐 20㎎을 첨가했다. 반응 혼합물을 90℃에서 22시간 교반한 후, 용매를 감압 하에 증류 제거하고, 잔사를 분취 TLC(용리액 : 헥산/아세트산 에틸=1/4)로 정제했다. 또한, 얻어진 조 생성물을 리사이클 분취 HPLC[HPLC 장치 : LC-908(제품명, 니혼 분세키 고교사 제), 컬럼 : JAIGEL 2H(제품명, 니혼 분세키 고교사 제)를 2개 연결, 이동상 : 클로로포름]를 이용하여 정제하여 6-트리부틸스타닐-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘 47㎎(94.9μmol 상당)을 얻었다(도 9, 공정 3).

6-트리부틸스타닐-2-(4'-히드록시페닐)이미다조[1,2-a]피리딘의 메탄올 용액(농도 : 1㎎/mL) 53μL에 1mol/L 염산 75μL, 136MBq의 [¹²⁵I]요오드화나트륨 40μL, 10%(W/V) 과산화수소 10μL를 첨가했다. 상기 혼합액을 50℃에서 10분간 정치한 후, 실시예 Ⅰ-2와 같은 조건의 HPLC에 제공하여 2-(4'-히드록시페닐)-6-[¹²⁵I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘 획분을 분취했다(도 9, 공정 4).

상기 획분에 물 10mL를 첨가한 액을 역상 컬럼[상품명 : Sep-Pak(등록상표) Light C18 Cartridges, Waters사 제, 충전제의 충전량 : 130㎎]에 통액하여 2-(4'- 히드록시페닐)-6-[¹²⁵I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘을 상기 컬럼에 흡착 포집했다. 이 컬럼을 물 1mL로 세정한 후, 에탄올 1mL를 통액해서 2-(4'-히드록시페닐)-6-[¹²⁵I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘을 용출시켰다. 얻어진 방사능량은 합성 직후에 있어서 37.5MBq이었다. 또한, 실시예 Ⅰ-2와 같은 조건에서 TLC 분석을 행한 결과, 그 방사 화학적 순도는 96.5%이었다.

(참고예 Ⅰ-9) 2-(4'-히드록시페닐)-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘의 합성

브롬화제2구리 28.17g(126mmol 상당)에 아세트산 에틸 50mL를 첨가해서 현탁시키고, 이것에 4'-히드록시아세토페논 8.18g(60.0mmol 상당)의 아세트산 에틸 50mL-클로로포름 50mL 혼합액을 첨가하여 가열 환류했다. 5시간 후, 반응액을 실온까지 냉각해서 여과를 행하고, 여과액을 감압 농축했다. 잔사를 아세트산 에틸에 용해하고, 활성탄을 첨가해서 탈색 조작을 행한 후에 용액을 여과, 농축했다. 얻어진 조 생성물을 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액 : 클로로포름/메탄올=20/1)로 정제하고, 또한 아세트산 에틸-석유 에테르로부터 재결정을 행하여 2-브로모-4'-히드록시아세토페논 7.25g(33.7mmol 상당)을 얻었다(도 10, 공정 1).

2-브로모-4'-히드록시아세토페논 441㎎(2.0mmol 상당)과 2-아미노-5-요오드 피리딘 449㎎(2.0mmol 상당)을 아세토니트릴 15mL에 용해하고, 110℃의 유욕에서 5시간 가열 환류했다. 반응 종료 후, 반응액을 실온까지 냉각하고, 침전물을 여과 선별한 후에 아세토니트릴로 세정하여 감압 하에 건조시켰다. 얻어진 조 결정은 물 10mL-메탄올 10mL 혼합액에 현탁시킨 후, 이것에 포화 탄산수소나트륨 용액을 약10mL 첨가하여 초음파 세정기에서 5분간 진탕했다. 얻어진 혼합물로부터 침전물을 여과 선별해서 물로 잘 세정하고, 감압 하에 건조하여 2-(4'-히드록시페닐)-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘 526㎎(1.56mmol 상당)을 얻었다(도 10, 공정 2).

얻어진 2-(4'-히드록시페닐)-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘의 NMR 측정 결과(내부 표준물질 : 디메틸술폭시드)는 이하와 같았다.

사용 NMR 장치 : JNM-ECP-500(니혼 덴시 가부시키가이샤 제)

¹H-NMR(용매 : 중디메틸술폭시드, 공명 주파수 : 500㎒) : δ8.86-8.84(m, 1H), 8.14(s, 1H), 7.78-7.74(m, 2H), 7.40-7.35(m, 2H), 6.86-6.82(m, 2H).

¹³C-NMR(용매 : 중디메틸술폭시드, 공명 주파수 : 125㎒) : δ158.08, 145.87, 143.87, 132.48, 131.72, 127.67, 124.99, 118.14, 116.14, 108.02, 75.85.

(실시예 Ⅰ-7 및 비교예 Ⅰ-1) 아밀로이드 결합성의 측정

본 발명 화합물의 아밀로이드 친화성을, 이하의 인비트로 결합 시험에 의해 평가했다.

(1) Aβ_1-40(펩티드 켄큐쇼)을 인산완충액(pH7.4)으로 용해해서 37℃에서 72시간 진탕함으로써 1㎎ /mL의 응집된 Aβ(이하, 본 실시예에서 아밀로이드라고 함) 현탁액(이하, 본 실시예에 있어서 아밀로이드 현탁액이라 함)을 얻었다.

(2) 상기 아밀로이드 현탁액에 대해 문헌[Naiki, H. 등, Laboratory Investigation.74, p.374-383(1996)] 기재의 방법에 따라 티오플라빈 T(Fluka사 제)를 사용한 형광 광도 측정에 의한 정성 실험을 행하여, (1)에서 얻은 응집화 Aβ가 아밀로이드인 것을 확인했다(측정 조건 : 여기 파장 446㎚, 형광 파장 490㎚).

(3) 상기 실시예 Ⅰ-2의 방법으로 합성한 화합물 Ⅰ-6의 에탄올 용액(방사능 농도 37MBq/mL)을 조제하고, 이것을 0.1% 소혈청 알부민을 함유하는 인산완충액(pH7.4)으로 희석해서 2-[4'-(3"-플루오로프로폭시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘 총량으로서 2nmol/L 상당의 용액을 조제했다.

(4) 96구멍 마이크로플레이트의 각 웰에 상기 (3)에서 조제한 용액 50μL(최종 농도 400pM), 아밀로이드 현탁액을 0.1% 소혈청 알부민 함유 인산완충액(pH7.4)에 용해한 액(아밀로이드의 농도는 시료용액 중의 아밀로이드 농도에 따라 조정) 50μL를 첨가한 후, 동 완충액 150μL를 첨가하여 아밀로이드의 최종 농도가 2.5, 12.5, 25, 62.5, 125, 250, 625, 1000nmol/L의 액을 조제했다.

(5) 상기 마이크로플레이트를 22℃에서 3시간, 일정 속도(400회전/분)로 진탕한 후, 각 웰의 혼합액을 글래스 파이버 필터(밀리포어사, Mulutiscreen^TM-FC)로 여과함으로써 아밀로이드에 결합된 화합물 Ⅰ-6 및 유리의 화합물 Ⅰ-6을 분리했다.

(6) 혼합액을 여과한 글래스 파이버 필터에 대해서, 0.1% 소혈청 알부민을 함유하는 인산완충액으로 세정(0.5mL×5회)한 후, 글래스 파이버 필터의 방사능을 오토웰 감마 시스템(Aloka사, ARC-301B)으로 측정했다.

(7) (6)의 측정 결과로부터 화합물 Ⅰ-6의 아밀로이드로의 결합량과 첨가한 아밀로이드량의 관계를 평가했다. 비특이적 결합에 대해서는 상기 (4)에 있어서 화합물 Ⅰ-2(비RI 표식 화합물)를 100nM(최종 농도)이 되도록 첨가한 샘플로부터 구했다(실시예 Ⅰ-7).

(8) 또한, 상기 참고예 Ⅰ-6에서 합성한 [¹²⁵I]-IMPY에 대해 상기 (2)∼(6)과 같은 조작을 행하여 대상 데이터를 얻었다(비교예 Ⅰ-1).

시료용액 중의 아밀로이드 농도와, 상기 (6)에서 측정한 글래스 파이버 필터 상의 방사능 카운트의 관계를 도 11에 나타낸다. 글래스 파이버 필터 상의 방사능이 아밀로이드 농도(첨가량)에 비례해서 증가하고 있었다(실시예 Ⅰ-7). 본 실험에 있어서의 조건에서는, 아밀로이드 및 그것에 결합한 화합물은 글래스 파이버에 유지된다. 따라서, 글래스 파이버 상의 방사능 카운트는 아밀로이드에 결합한 화합물량을 반영한 값이며, 그 방사능 카운트를 아밀로이드 농도에 대하여 플롯한 그래프의 경사는, 화합물의 아밀로이드 결합성의 강도를 나타내는 지표가 될 수 있는 값이라고 할 수 있다. 화합물 Ⅰ-6에 있어서의 글래스 파이버 필터 상의 방사능 카운트의 값이, 아밀로이드 농도의 증가에 따라 증가하고 있었던 것으로부터 화합물 Ⅰ-6은 아밀로이드에 결합하는 성질을 갖는 화합물인 것이 시사되었다. 또한, 그 직선의 경사는 [¹²⁵I]-IMPY에 있어서의 같은 플롯에 있어서의 경사와 동등 이상이며, 화합물 Ⅰ-6의 아밀로이드 결합성의 강도는 아밀로이드로의 강한 친화성을 갖는 것이 알려져 있는 [¹²⁵I]-IMPY와 동등 이상인 것이 시사되었다.

이상의 결과로부터, 화합물 Ⅰ-6은 높은 아밀로이드 결합성을 갖는 것이 시사되었다.

(실시예 Ⅰ-8∼Ⅰ-12, 비교예 Ⅰ-2∼Ⅰ-6) 아밀로이드 친화성의 측정

(1) Aβ_1-40(펩티드 켄큐쇼)을 인산완충액(pH7.4)으로 용해해서 37℃에서 62∼72시간 진탕시켜 1㎎ /mL의 응집 Aβ 현탁액(이하, 본 실시예에서 아밀로이드 현탁액이라고 함)을 얻었다.

(3) 문헌[Wang, Y. 등, J. Labelled Compounds Radiopharmaceut.44, S239(2001)] 기재의 방법에 따라 2-(4'-아미노페닐)벤조티아졸을 표식 전구체로 해서 [¹²⁵I]2-(3'-요오드-4'-아미노페닐)벤조티아졸(이하, [¹²⁵I]3'-I-BTA-0이라고 함)을 조제하고, 에탄올에 용해했다. 콩고레드, 티오플라빈 T 및 6-메틸-2-[4'-(N,N-디메틸아미노)페닐]벤조티아졸(이하, 6-Me-BTA-2라고 함)은 시판의 시약을 그대로 칭량해서 사용했다.

(4) 2-(3'-요오드-4'-아미노페닐)벤조티아졸(이하, 3'-I-BTA-0이라고 함) 및 IMPY를, 각각 문헌[Wang, Y. 등, J. Labelled Compounds Radiopharmaceut.44, S239(2001)] 및 문헌[Zhuang, Z.P. 등, J. Med. Chem.46, 237(2003)] 기재의 방법에 따라서 합성했다.

(5) [¹²⁵I]3'-I-BTA-0, 각 평가 화합물 및 아밀로이드의 최종 농도가 표 1-2 기재의 농도가 되도록 0.1% 소혈청 알부민 함유 인산완충액(pH7.4)에 용해한 시료를 조제하고, 96구멍 마이크로플레이트의 각 웰(용량 약 0.3mL)에 충전했다.

[표 1-2]

(6) 시료용액을 충전한 마이크로플레이트를 22℃에서 3시간, 일정 속도(400회전/분)로 진탕한 후, 각 시료용액을 글래스 파이버 필터(상품명 : Mulutiscreen^TM-FC, 밀리포어사 제)로 여과함으로써 아밀로이드에 결합된 [¹²⁵I]3'-I-BTA-0와 결합되어 있지 않은 [¹²⁵I]3'-I-BTA-0을 분리했다.

(7) 각 시료용액의 여과에 사용한 글래스 파이버 필터를 0.1% 소혈청 알부민 함유 인산완충액(pH7.4)으로 세정(0.5mL×5회)하고, 글래스 파이버 필터의 방사능을 오토웰 감마 시스템(Aloka사 제, 형식 : ARC-301B)으로 측정하여, 각 시료용액의 방사능량으로 해서 저해율의 계산에 사용했다(이하, 각 평가 화합물 농도가 0인 시료에 있어서의 방사능량을 A, 평가 화합물 농도가 0.001nmol/L 이상인 시료에 있어서의 방사능량을 B라고 한다).

(8) 별도로, 6-Me-BTA-2를 15㎛ol/L, [¹²⁵I]3'-I-BTA-0을 400pmol/L, Aβ_1-40을 1㎛ol/L 배합시킨 액을 조제하고, 상기 (6) 및(7)과 같은 조작을 행하여 방사능량을 측정했다. 구한 방사능량을 백그라운드 방사능량으로 하여, 저해율의 계산에 사용했다(이하, BG라고 함).

(9) 상기 (7) 및(8)에 있어서 측정한 방사능량을 사용하여, 하기 식(1-1) :

으로부터 저해율을 구했다. 얻어진 저해율을 프로빗(probit) 변환한 값을 평가 화합물의 농도의 대수에 대하여 플롯한 그래프를 작성하고, 최소제곱법으로 근사 직선을 작성했다. 이 직선을 사용하여 방사능량이 각 평가 화합물 무첨가 시료에 있어서의 값의 절반 정도가 되는 각 평가 화합물 농도를 구하고, 각 화합물의 50% 저해 농도(이하, IC_50%값이라고 함)로 했다. 이 값을 지표로서 사용하여 각 평가 화합물의 아밀로이드(응집화 Aβ_1-40) 친화성을 평가했다.

각 평가 화합물에 있어서의 IC_50%값을 표 1-3에 나타낸다. 화합물 Ⅰ-1∼Ⅰ-5는 모두 100 미만의 IC_50%값을 나타내고, 콩고레드 및 티오플라빈 T보다 높은 아밀로이드(응집화 Aβ_1-40) 친화성을 갖고 있었다. 이 결과로부터 화합물 Ⅰ-1∼Ⅰ-5는 양호한 아밀로이드(응집화 Aβ_1-40) 친화성을 갖는 화합물인 것이 나타내어졌다. 특히, 화합물 Ⅰ-1∼Ⅰ-4에 있어서는 3'-I-BTA-0 및 6-Me-BTA-2보다 높고 IMPY와 동등한 아밀로이드(응집화 Aβ_1-40) 친화성을 갖고 있었다.

[표 1-3]

(실시예 Ⅰ-13∼Ⅰ-14, 비교예 Ⅰ-7) 옥타놀 추출법을 사용한 분배계수의 측정

화합물의 혈액뇌관문(이하, BBB라고 함) 투과성의 지표로서 일반적으로 알려져 있는 옥타놀 추출법을 사용한 분배계수(이하, logP_octanol이라고 함)를 측정했다.

옥타놀 2mL에 화합물 Ⅰ-7(실시예 Ⅰ-13) 및 화합물 Ⅰ-8(실시예 Ⅰ-14)을 함유하는 용액 10μL 및 10mmol/L 인산완충액(pH7.4) 2mL를 첨가하여 30초간 교반하였다. 이 혼합액을 저속 원심기로 원심분리(2000회전/분×60분간)한 후, 옥타놀층 및 물층을 각 1mL 분취하여 각각의 방사능 카운트를 오토웰 감마 시스템(Aloka사 제, 형식 : ARC-301B)으로 계측했다. 얻어진 방사능 카운트를 사용하여 식(1-2)으로부터 logP_octanol값을 산출했다.

결과를 표 1-4에 나타낸다. logP_octanol의 값은 화합물 Ⅰ-7 및 화합물 Ⅰ-8 모두 1∼3의 값을 나타내고 있었다. BBB를 투과 가능한 화합물에 있어서는 logP_octanol값은 1∼3 사이의 값인 것이 알려져 있다[Douglas D. Dischino et al., J. Nucl. Med.,(1983), 24, p.1030-1038]. 이상의 결과로부터 양 화합물은 IMPY와 마찬가지로 BBB 투과성을 갖는 것으로 시사되었다.

[표 1-4]

(실시예 Ⅰ-15∼I-19, 비교예 Ⅰ-8) HPLC를 사용한 분배계수의 측정

HPLC에 의한 분배계수(이하, logP_HPLC라고 함)를 하기의 방법에 의해 측정했다. 이 logP_HPLC는 화합물의 BBB 투과성의 지표로서 일반적으로 알려져 있는 logP_octanol과, pH7.2∼7.4에 있어서 동등의 값을 갖는 것이 알려져 있는 값이다[Franco Lombardo et al., J. Med. Chem.,(2000), 43, p.2922-2927].

우선, 표 1-5 기재의 각 평가 화합물을 농도 1㎎/mL가 되도록 10% 디메틸술폭시드 함유 메탄올에 용해하고, 시료용액을 조제했다. 이 시료용액 1μL에 대해 하기의 조건에 의한 HPLC 분석을 행하고, 용매의 용출시간(t₀) 및 화합물의 용출시간(t_R)을 구했다.

[표 1-5]

HPLC 조건 :

컬럼 : Prodigy ODS(3)(제품명, phenomenex사 제, 사이즈 : 4.6×250㎜)

이동상 : 50mM 트리에틸아민인산(pH7.2)/아세토니트릴=40/60 혼합액

유속 : 0.7mL/분

검출기 : 자외 가시 흡광 광도계(검출 파장 : 282㎚)

얻어진 t₀ 및 t_R을 사용하여 하기 계산식(1-3)으로부터 각 평가 화합물의 보유인자(이하, K'_HPLC값이라고 함)를 구했다.

별도로, 상기 참고예 Ⅰ-8에서 합성한 2-(4'-히드록시페닐)-6-[¹²⁵I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘 용액(방사능 농도 37MBq/mL) 및 화합물 Ⅰ-6 용액(방사능 농도 37MBq/mL)을, 각각 준비한 옥타놀 2mL에 10μL씩 첨가하고, 또한 각각의 용액에 10mmol/L 인산완충액(pH7.4) 2mL를 첨가했다. 각 액을 30초간 교반한 후, 2000회전/분의 조건으로 60분간 원심 분리를 행하였다. 옥타놀상 및 수상을 각 1mL 분취하고, 방사능을 오토웰 감마 시스템(Aloka사, 형식 : ARC-301B)으로 계측했다. 얻어진 방사능량으로부터 상기의 식(1-2)을 이용하여 logP_octanol값을 산출했다.

또한, 화합물 Ⅰ-2 및 참고예 Ⅰ-9에서 조제한 2-(4'-히드록시페닐)-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘 용액의 각각에 대해서 상기와 같은 HPLC 분석을 행하고, 각각의 화합물에 있어서의 K'_HPLC값을 구했다.

화합물 Ⅰ-2 및 2-(4'-히드록시페닐)-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘에 있어서의 log₁₀K'_HPLC에 대하여, 화합물 Ⅰ-6 및 2-(4'-히드록시페닐)-6-[¹²⁵I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘에 있어서의 logP_octanol값을 플롯한 그래프를 작성하고, 직선의 경사와 y절편을 견적하였다. 이 값을 사용하여 logP_octanol값과 logP_HPLC값이 pH7.2∼7.4에 있어서 마찬가지라고 가정하고, 하기 식(1-4)을 구했다.

각 평가 화합물에 대해서 구한 K'_HPLC를 사용하여 상기 계산식(1-4)에 따라서 각 평가 화합물에 있어서의 logP_HPLC값을 구했다.

결과를 표 1-6에 나타낸다. 이 표에 나타내는 바와 같이, logP_HPLC값은 화합물 Ⅰ-1∼I-5 중 어디에 있어서나 1∼3 사이의 값을 나타내고 있었다. 상술한 바와 같이, BBB를 투과 가능한 화합물에 있어서는 logP_octanol값은 1∼3 사이의 값인 것이 보고되어 있다[Douglas D. Dischino et al., J. Nucl. Med.,(1983), 24, p.1030-1038]. 또한, 상술한 바와 같이, logP_octanol과 logP_HPLC는 pH7.2∼7.4에 있어서 동등의 값을 갖는 것이 알려져 있다[Franco Lombardoet al., J. Med. Chem.,(2000), 43, p.2922-2927]. 이상의 결과로부터 화합물 Ⅰ-1∼I-5는 BBB를 투과하는 성질을 갖는 것이 시사되었다.

[표 1-6]

(실시예 Ⅰ-20∼Ⅰ-21, 비교예 Ⅰ-9) 뇌내 이행성 및 클리어런스의 측정(그 1)

화합물 Ⅰ-7(실시예 Ⅰ-20) 및 8(실시예 Ⅰ-21)을 사용하여 웅성의 Wistar계 래트(7주령)에 있어서의 뇌로의 방사능 집적의 경시적 변화를 측정했다.

화합물 Ⅰ-7(실시예 Ⅰ-20)을 10㎎/mL 아스코르브산 함유 생리식염액에 용해한 액, 화합물 Ⅰ-8(실시예 Ⅰ-21)을 10㎎/mL 아스코르브산 함유 생리식염액에 용해한 액, 및 상기 참고예 Ⅰ-7에서 조제한 [¹²³I]-IMPY(비교예 Ⅰ-9)를 10㎎/mL 아스코르브산 함유 생리식염액에 용해한 액(방사능 농도 20∼30MBq/mL) 각 0.05mL를 티오펜탈 마취 하에서 꼬리정맥으로부터 상기 래트에 투여했다. 투여 후 2분, 5분, 30분, 60분에 복부 대동맥으로부터 탈혈(脫血)한 후 뇌를 채취하여 뇌의 방사능을 오토웰 감마 시스템(형식 : ARC-301B, Aloka사 제)을 이용하여 계측하고(이하, 본 실시예에서 A라고 함), 또한 뇌의 질량을 측정했다. 또한, 투여액을 1000배 희석한 용액 0.05mL에 대한 방사능량을 마찬가지로 측정했다(이하, 본 실시예에서 B라고 함). 이들의 측정 결과를 이용하여 하기 식(1-5)으로부터, 각 해부 시간점에 있어서의 뇌로의 단위중량당의 방사능 분포율(%ID/g)을 산출했다.

각 시간점에 있어서 실시예 Ⅰ-20 및 비교예 Ⅰ-9에 대해서는 3마리, 실시예 Ⅰ-21에 대해서는 2마리의 동물을 이용하여 실험을 행하였다.

결과를 표 1-7에 나타낸다. 표 1-7에 나타내는 바와 같이, 화합물 Ⅰ-7 및 화합물 Ⅰ-8은 투여 후 2분점에 있어서 [¹²³I]-IMPY와 동등 이상의 집적이 확인되고, 그 후 60분에 걸쳐서 빠르게 소실되는 경향을 나타내고 있었다. 이 결과로부터, 화합물 Ⅰ-7 및 화합물 Ⅰ-8은 [¹²³I]-IMPY와 마찬가지로 높은 뇌 이행성 및 신속한 뇌로부터의 클리어런스를 갖는 것이 시사되었다.

[표 1-7]

(실시예 Ⅰ-22) 뇌내 아밀로이드의 묘출의 확인

본 발명에 의한 화합물이 뇌내 아밀로이드를 묘출할 수 있는지를 평가하기 위해서 하기의 실험을 행하였다.

(1) Aβ_1-40(펩티드 켄큐쇼 제)을 인산완충액(pH7.4)으로 용해해서 37℃에서 72시간 진탕시키고, 1㎎ /mL의 응집 Aβ 현탁액(이하, 본 실시예에서 아밀로이드 현탁액이라고 함)을 얻었다.

(2) 웅성 Wistar계 래트(7주령)의 한쪽 편도핵(amygdaloid nucleus)으로 상기 아밀로이드 현탁액을 25μL(25μg 상당) 주입하고, 대조로서 반대측의 편도핵에 인산완충 생리식염액(pH7.4)을 25μL 주입했다. 아밀로이드 현탁액 및 인산완충 생리식염액(pH7.4) 주입 1일 후의 래트를 검체로 했다.

(3) 화합물 Ⅰ-7을 10㎎/mL 아스코르브산 함유 생리식염액에 용해하여 시료용액으로 했다(방사능 농도 32MBq/mL). 이 용액을 상기 래트에 꼬리정맥으로부터 투여했다(투여량 : 0.5mL, 투여한 방사능 : 16MBq 상당).

(4) 투여 60분 후에 뇌를 적출하고, 마이크로톰(형식 : CM3050S, LEICA사 제)을 이용하여 두께 10㎛의 뇌절편을 제작했다. 상기 뇌절편을 이미징 플레이트 상에서 20시간 노광시킨 후, 바이오이미징 분석기(형식 : BAS-2500, 후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제)를 이용하여 화상 해석을 행하였다.

(5) 바이오이미징 분석기를 사용한 상기 화상 해석의 종료 후, 티오플라빈 T에 의한 병리 염색을 행해서 형광현미경(가부시키가이샤 니콘 제, 형식 : TE2000-U형, 여기 파장 : 400∼440㎚, 검출 파장 : 470㎚)을 사용한 이미징을 행하고, 상기 절편 상에 아밀로이드가 침착되어 있는 것을 확인했다(도 12b).

아밀로이드 뇌내 주입 래트의 뇌절편에 있어서의 오토라디오그램 및 티오플라빈 T 염색의 이미지를 도 12에 나타낸다. 이 도면에 나타내는 바와 같이, 아밀로이드 현탁액을 주입한 측의 편도핵에 있어서 명확한 방사능 집적이 확인되었다. 또한, 방사능 직접부위에 있어서의 티오플라빈 T 염색의 결과로부터 상기 부위에 있어서 아밀로이드가 존재하고 있는 것이 확인되었다. 한편, 생리식염액을 주입한 측의 편도핵에 있어서는 다른 부위와 비교한 유의한 방사능 집적은 확인되지 않았다.

이 결과로부터, 화합물 Ⅰ-7은 뇌내 아밀로이드에 집적되는 성능을 갖고, 뇌내 아밀로이드의 묘출능을 갖는 것이 시사되었다.

(실시예 Ⅰ-23∼Ⅰ-26) 복귀 돌연변이 시험

화합물 Ⅰ-1, 화합물 Ⅰ-2, 화합물 Ⅰ-4 및 화합물 Ⅰ-5의 유전자 돌연변이 유발성을 조사하기 위해서 살로넬라균(Salmonella typhimurium)의 TA98 및 TA100을 사용하는 복귀 돌연변이 시험(이하, Ames시험이라고 함)을 행하였다.

시험은 S9mix 무첨가와 S9mix 첨가의 경우에 대해서 실시했다. 음성 대상은 디메틸술폭사이드를 사용하고, 양성 대상은 S9mix 무첨가의 경우에는 2-(2-푸릴)-3-(5-니트로-2-푸릴)아크릴아미드를 사용하고, S9mix 첨가의 경우에는 2-아미노안트라센을 사용했다.

시험용 플레이트로의 각 시료의 첨가량은 화합물 Ⅰ-1 및 화합물 Ⅰ-5에 대해서는 1250μg/플레이트를 최고 용량으로 해서 7용량(공비 4)으로 하고, 화합물 Ⅰ-2 및 화합물 Ⅰ-4에 대해서는 5000μg/플레이트를 최고 용량으로 해서 7용량(공비 3)으로 했다. 피검 물질과 시험 균주(TA98 또는 TA100), 또는 피검 물질과 S9mix와 시험 균주를 혼합 후, 연한천을 이용하여 시험용 플레이트 상의 배지에 중층하고, 37℃에서 48시간 배양했다. 판정은 배양 후의 플레이트에 있어서의 복귀 돌연변이 콜로니수를 카운트함으로써 행하고, 복귀 돌연변이 콜로니수가 음성 대조의 2배 이상의 값을 나타내고, 또한 농도에 의존해서 증가했을 경우를 양성이라고 했다.

결과를 표 1-8에 나타낸다. 화합물 Ⅰ-1, 화합물 Ⅰ-2, 화합물 Ⅰ-4 및 화합물 Ⅰ-5 처리군에 있어서의 복귀 변이 콜로니수는 어떤 균주라도 S9mix 첨가의 유무 및 피검 물질 첨가량에 관계없이, 음성 대조물질 처리군의 2배 미만이었다. 이상의 결과로부터, 화합물 Ⅰ-1, 화합물 Ⅰ-2, 화합물 Ⅰ-4 및 화합물 Ⅰ-5는 Ames 음성이라 판정되어, 어느 것이나 유전자 돌연변이 유발성은 없는 것이라고 판단되었다.

[표 1-8]

(실시예 Ⅰ-27) 6-트리부틸스타닐-2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 합성

참고예 Ⅰ-3에서 얻어진 6-브로모-2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘 88㎎(0.260mmol 상당)을 디옥산 10.0mL에 용해하고, 트리에틸아민 2.0mL를 첨가한 후, 비스트리부틸주석 0.20mL(0.39mmol 상당)와 테트라키스트리페닐포스핀팔라듐 20.1㎎(촉매량)을 첨가했다. 반응 혼합물을 90℃에서 9시간 교반한 후, 용매를 감압 하에 증류 제거하고, 잔사를 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액 : 헥산/아세트산 에틸=4/1)로 정제를 행하여 6-트리부틸스타닐-2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘 71.6㎎(0.131mmol 상당)을 얻었다(도 13, 공정 1).

얻어진 6-트리부틸스타닐-2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 NMR 측정 결과(내부 표준물질 : 테트라메틸실란)는 이하와 같았다.

사용 NMR 장치 : JNM-ECP-500(니혼 덴시 가부시키가이샤 제)

¹H-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 : 500㎒) : δ7.97(s, 1H), 7.90(d, J=8.7Hz, 2H), 7.58(d, J=8.7Hz, 1H), 7.14(d, J=8.7Hz, 1H), 6.99(d, J=8.7Hz, 2H), 4.77,(dt, J=47.2, 4.1Hz, 2H), 3.99(dt, J=28.0, 4.1Hz, 2H), 1.59-1.53(m, 6H), 1.39-1.32(m, 6H), 1.13-1.10(m, 6H), 0.92(t, J=7.3Hz, 9H).

¹³C-NMR(용매 : 중클로로포름, 공명 주파수 500㎒) : δ158.3, 145.6, 144.9, 131.2, 130.0, 127.4, 121.9, 116.9, 114.9, 106.4, 82.6, 81.3, 67.2, 29.0, 27.3, 13.6, 9.8.

(실시예 Ⅰ-28) 2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]-6-[¹²³I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘의 합성

6-트리부틸스타닐-2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 메탄올 용액(농도 : 1㎎/mL) 35μL에 1mol/L 염산 100μL, 614MBq의 [¹²³I]요오드화나트륨(용량으로서 100μL), 1mmol/L 요오드화나트륨 용액 10μL, 10%(W/V) 과산화수소 20μL를 첨가했다. 상기 혼합액을 50℃에서 10분간 가열한 후, 실시예 Ⅰ-2와 같은 조건의 HPLC에 제공하여 2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]-6-[¹²³I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘 획분을 분취하고, 2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]-6-[¹²³I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘을 얻었다.

상기 획분에 물 10mL를 첨가한 액을 역상 컬럼[상품명 : Sep-Pak(등록상표) Light C8 Cartridges, Waters사 제, 충전제의 충전량 : 145㎎]에 통액하여 2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]-6-[¹²³I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘을 상기 컬럼에 흡착 포집했다. 이 컬럼을 물 1mL로 세정한 후, 에탄올 1mL를 통액해서 2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]-6-[¹²³I]요오드이미다조[1,2-a]피리딘을 용출시켰다. 얻어진 방사능량은 합성 직후에 있어서 64MBq이었다. 또한, 하기의 조건으로 TLC 분석을 행한 결과, 그 방사 화학적 순도는 97.0%이었다.

TLC 분석 조건 :

TLC 플레이트 : Silica Gel 60 F₂₅₄(제품명, 메르크사 제)

전개상 : 클로로포름/메탄올/트리에틸아민=100/1/2

검출기 : Rita Star(제품명, raytest사 제)

(실시예 Ⅰ-29, 비교예 Ⅰ-10) 옥타놀 추출법을 사용한 분배계수의 측정

실시예 Ⅰ-28에서 조제한 화합물 Ⅰ-9의 디에틸에테르 용액(실시예 Ⅰ-29) 및 [¹²³I]-IMPY의 디에틸에테르 용액(비교예 Ⅰ-10)을, 각각 10㎎/mL 아스코르브산 함유 생리식염액으로 희석하고, 방사능 농도 20∼30MBq/mL가 되도록 조정했다. 조제한 시료용액 각 10μL를 각각 옥타놀 2mL에 첨가하고, 또한, 10mmol/L 인산완충액(pH7.4) 2mL를 첨가하여 30초간 교반하였다. 이 혼합액을 저속 원심기에서 원심분리(2000회전/분×60분간)한 후, 옥타놀층 및 물층을 각 1mL 분취하고, 각각의 방사능 카운트를 오토웰 감마 시스템(형식:ARC-301B, Aloka사 제)으로 계측했다. 얻어진 방사능 카운트를 사용하여 식(1-6)을 이용하여 logP_octanol값을 산출했다.

결과를 표 1-9에 나타낸다. logP_octanol의 값은 화합물 Ⅰ-9에 있어서도 1∼3 사이의 값을 나타내고 있었다. BBB를 투과 가능한 화합물에 있어서는 logP_octanol값은 1∼3 사이의 값인 것이 알려져 있다[Douglas D. Dischino et al., J. Nucl. Med.,(1983), 24, p.1030-1038]. 이상의 결과로부터 화합물 Ⅰ-9는 IMPY와 마찬가지로 BBB 투과성을 갖는 것이라 시사되었다.

[표 1-9]

(실시예 Ⅰ-30, 비교예 Ⅰ-11) 뇌내 이행성 및 클리어런스의 측정(그 2)

화합물 Ⅰ-9를 사용하여 웅성의 Wistar계 래트(7주령)에 있어서의 뇌로의 방사능 집적의 경시적 변화를 측정했다.

화합물 Ⅰ-9(실시예 Ⅰ-30) 및 상기 참고예에서 조제한 [¹²³I]-IMPY(비교예 Ⅰ-11)를 각각 10㎎/mL 아스코르브산 함유 생리식염액에 용해한 액(방사능 농도 20∼31MBq/mL)을 조제했다. 이들의 액 각각 0.05mL를 각각의 Wistar계 래트(7주령)에 티오펜탈 마취 하에서 꼬리정맥으로부터 투여했다. 투여 후 2분, 5분, 30분, 60분에 복부 대동맥으로부터 탈혈한 후에 뇌를 채취하여 뇌의 질량을 측정하고, 또한, 뇌의 방사능을 단일 통로 분석기(single channel analyzer)(검출기 형번 : SP-20, 오요 코켄 고교 가부시키가이샤 제)를 이용하여 계측했다(이하, 본 실시예에서 A라고 함). 또한, 나머지 전신의 방사능량을 마찬가지로 측정했다(이하, 본 실시예에서 B라고 함). 이들의 측정 결과를 이용하여 하기 식(1-7)으로부터 각 해부 시간점에 있어서의 뇌로의 단위질량당의 방사능 분포율(%ID/g)을 산출했다.

또한, 실험은 각 시간점에 있어서 3마리의 동물을 사용해 행하였다.

결과를 표 1-10에 나타낸다. 표 1-10에 나타내는 바와 같이, 화합물 Ⅰ-9는 [¹²³I]-IMPY와 같이 투여 후 2분점에 있어서 높은 방사능 집적이 확인되고, 그 후 60분에 걸쳐서 신속하게 소실되는 경향을 나타내고 있었다. 이 결과로부터 화합물 Ⅰ-9는 [¹²³I]-IMPY와 같이 높은 뇌 이행성 및 신속한 뇌로부터의 클리어런스를 갖는 것이 시사되었다.

[표 1-10]

(실시예 Ⅰ-31) 뇌내 아밀로이드 묘출의 확인

(1) Aβ_1-42(와코 쥰야쿠 고교)를 인산완충액(pH7.4)으로 용해해서 37℃에서 72시간 진탕시켜 1㎎/mL의 응집 Aβ 현탁액(이하, 본 실시예에서 아밀로이드 현탁액이라고 함)을 얻었다.

(2) 웅성 Wistar계 래트(7주령)의 한쪽 편도핵에 상기 아밀로이드 현탁액을 2.5μL(25μg 상당) 주입하고, 대조로서 반대측의 편도핵에 인산완충 생리식염액(pH7.4)을 2.5μL 주입했다. 아밀로이드 현탁액 및 인산완충 생리식염액(pH7.4) 주입 1일 후의 래트를 검체로 했다.

(3) 화합물 Ⅰ-9를 10㎎/mL 아스코르브산 함유 생리식염액에 용해하여 시료용액(시료용액 중의 방사능 농도 21MBq/mL, 실시예 Ⅰ-31)을 조제했다. 이 용액을 상기 래트에 티오펜탈 마취 하에서 꼬리정맥으로부터 투여했다(투여량 : 0.5mL, 투여한 방사능 11∼15MBq 상당).

(5) 바이오이미징 분석기를 사용한 상기 화상 해석의 종료 후, 티오플라빈 T에 의한 병리 염색을 행하여 형광현미경(가부시키가이샤 니콘제, 형식 : TE2000-U형, 여기 파장 : 400∼440㎚, 검출 파장 : 470㎚)을 사용한 이미징을 행하고, 상기 절편 상에 아밀로이드가 침착되어 있는 것을 확인했다(도 14).

아밀로이드 뇌내 주입 래트의 뇌절편에 있어서의 오토라디오그램 및 티오플라빈 T 염색의 이미지를 도 14에 나타낸다. 이 도면에 나타낸 바와 같이, 화합물 Ⅰ-9를 투여한 검체에 있어서도 아밀로이드 현탁액을 주입한 측의 편도핵에 있어서 명확한 방사능 집적이 확인되었다. 한편, 생리식염액을 주입한 측의 편도핵에 있어서는 다른 부위와 비교한 유의한 방사능 집적은 확인되지 않았다. 또한, 이 오토라디오그램 상에 있어서 아밀로이드 주입부위 이외에 있어서의 방사능 집적은 거의 보여지지 않았다. 또한, 티오플라빈 T 염색의 결과로부터 방사능 직접부위에 있어서 아밀로이드가 존재하고 있는 것이 확인되어 있다(도 14). 이 결과로부터, 화합물 Ⅰ-9는 뇌내 아밀로이드에 집적되는 성능을 갖고, 뇌내 아밀로이드의 묘출능을 갖는 것이 시사되었다.

(실시예 Ⅰ-32) 염색체이상 시험

화합물 Ⅰ-4의 염색체이상 유발성의 유무를 검토하기 위해서 차이니즈 햄스터 선 섬유아세포주(CHL/IU 세포)를 이용하여, 단시간 처리법의 S9 무첨가 및 S9 첨가 배양 계열과 연속 처리법의 24시간 배양 계열에서 염색체이상 시험을 실시했다. 피검물질의 첨가량은 모든 배양 계열에 있어서 1.2, 0.6, 0.3, 0.15㎎/mL의 합계 4용량으로 했다.

염색체이상을 갖는 세포의 출현 빈도가 음성 대조군과 비교해서 분명하게 상승하고, 또한 용량의존성이 확인된 경우, 또는, 단독의 용량에서 분명하게 상승하고, 또한 재현성이 확인된 경우에는 양성이라 판정하고, 그 이외는 음성이라 판정했다.

시험의 결과, 화합물 Ⅰ-4에서 처리한 모든 배양 계열에 있어서, 구조 이상 또는 수적 이상(배수체)을 갖는 세포의 출현 빈도는 음성 대조군과 같은 정도이었다. 한편, 각 배양 계열의 양성 대조군에서는 구조 이상을 갖는 세포의 출현 빈도에 현저한 증가가 확인되었다. 이상의 결과로부터, 상기 시험 조건 하에 있어서의 화합물 Ⅰ-4의 염색체이상 유발성은 음성이라고 판단되었다.

(실시예 Ⅰ-33) 소핵 시험

화합물 Ⅰ-4의 변이원성(in vivo)을 검토하기 위해서, Crlj : CD1(ICR)계의 웅성 마우스의 골수세포를 이용하여 소핵을 갖는 다염성 적혈구(이하, MNPCE라고 함)의 유발성을 조사했다.

시험의 용량으로서 0㎎/㎏(음성 대조군), 250, 500, 1000 및 2000㎎/㎏(피검물질군)을 설정했다. 단회 경구투여 후 24 및 48시간 후에 마우스를 도살하고, 골수 도말표본을 제작해서 관찰했다. 또한, 양성 대조군에서는 MMC를 2㎎/㎏ 단회 복강내 투여하고, 투여 후 24시간에 마우스를 도살 후, 골수 도말표본을 제작해서 관찰했다.

각 투여군에 있어서의 소핵을 갖는 MNPCE의 출현 빈도에, 용량의존성을 수반하는 증가, 또는 음성 대조군과 비교해서 통계학적으로 유의한 증가가 확인된 경우에 양성이라 판정하고, 그 이외는 음성이라 판정했다. 통계학적 해석으로서 각 투여군의 MNPCE의 출현 빈도 및 다염성 적혈구(이하, PCE라고 함)와 총 적혈구(이하, RBC라고 함)의 비율에 대해서 음성 대조군과 피검물질군 및 양성 대조군 사이 또는 각 군 사이에서 Wilcoxon의 순위합 검정에 의해 유의차 검정을 실시했다. 또한, 유의수준은 각각 위험율 5% 미만 및 1% 미만으로 했다.

시험의 결과, 피검물질군의 소핵을 갖는 MNPCE의 출현 빈도 및, RBC에 대한PCE의 비율은 음성 대조군과 비교해서 통계학적으로 유의한 차는 확인되지 않았다. 한편, 양성 대조군의 소핵을 갖는 MNPCE의 출현 빈도는 음성 대조군과 비교해서 유의하게 증가했다. 이상의 결과로부터, 상기 시험 조건 하에서 화합물 Ⅰ-4에 마우스 골수세포에 대한 소핵 유발 작용은 확인되지 않기 때문에 본 피검물질의 변이원성(in vivo)은 음성이라고 판단되었다.

(실시예 Ⅱ-1∼실시예 Ⅱ-2) 아밀로이드 결합성의 확인

본 발명에 의한 화합물의 결합 기서를 조사하기 위해서, 아밀린을 전구체로 하는 아밀로이드를 사용하여 티오플라빈 T와의 결합 저해 실험을 행하였다. 아밀린은 Ⅱ형 당뇨병에 있어서 췌장에 축적되는 아밀로이드이다.

(방법)

(1) 아밀린(인간)(와코 쥰야쿠 고교)을 인산완충액(pH7.4)으로 용해해서 37℃에서 72시간 진탕시켜 1㎎/mL의 응집화 아밀린 현탁액(이하, 본 실시예에서 아밀로이드 현탁액이라고 함)을 얻었다.

(2) 상기 아밀로이드 현탁액에 대해 문헌[Naiki, H. 등, Laboratory Investigation.74, p.374-383(1996)] 기재의 방법에 따라 티오플라빈 T(Fluka사 제)를 사용한 형광 광도 측정에 의한 정성 실험을 행하고, (1)에서 얻은 응집화 아밀린이 아밀로이드인 것을 확인했다(측정 조건 : 여기 파장 446㎚, 형광 파장 490㎚).

(3) 아밀로이드 현탁액 중의 아밀린 농도가 15μM이 되도록 50mM 인산완충액(pH7.4)에 용해했다. 또한, 티오플라빈 T의 농도가 15μM이 되도록 50mM 글리신-NaOH 완충액(pH8.5)에 용해했다.

(4) 각 평가 화합물 및 아밀로이드의 최종 농도가 표 2-1 기재의 농도가 되도록 50mM 인산완충액(pH7.4)에 용해한 것을 시료용액으로 하고, (3)에서 조제한 아밀로이드액 및 티오플라빈 T액 각 50μL, 시료용액 50μL를 96구멍 마이크로플레이트의 각 웰(용량 약 0.3mL)에 충전했다.

[표 2-1]

(5) 50mM 인산완충액(pH7.4) 100μL 및 50mM 글리신-NaOH 완충액 50μL를 혼합한 샘플을 블랭크로 하고, (4)와 마찬가지로 조작해서 저해율의 계산에 사용했다(이하, BG라고 함).

(6) 시료용액을 충전한 마이크로플레이트를 실온에서 30분간 정치한 후, 각 시료용액의 형광 강도를 마이크로플레이트 리더(형식 : SPECTRA MAX GEMINI XS, Molecular Devices사 제)로 측정(측정 조건 : 여기 파장 446㎚, 형광 파장 490㎚)했다(이하, 각 평가 화합물 농도가 0인 시료에 있어서의 형광 강도를 A, 평가 화합물 농도가 1.5㎛ol/L 이상인 시료에 있어서의 형광 강도를 B라고 함).

(7) 상기 (6)에 있어서 측정한 형광 강도를 사용하여 하기 식(2-1) :

으로부터 저해율을 구했다.

각 평가 화합물에 있어서의 저해율을 표 2-2에 나타낸다. 화합물 Ⅰ-1 및 화합물 Ⅰ-2 모두 어느 농도에 있어서나 티오플라빈 T의 결합을 저해하고 있었다. 이 결과로부터, 화합물 Ⅰ-1 및 화합물 Ⅰ-2는 티오플라빈 T의 결합을 경합적으로 저해하는 것이 나타내어졌다. 티오플라빈 T는 아밀로이드의 β-시트 구조를 인식해서 결합하는 것이 일반적으로 알려져 있다. 따라서, 화합물 Ⅰ-1 및 화합물 Ⅰ-2는 티오플라빈 T와 같은 아밀로이드로의 결합 기서, 즉 β-시트 구조를 인식해서 결합하는 것이 시사되었다.

[표 2-2]

(실시예 Ⅲ) 각 장기에 있어서의 방사능 분포율의 측정

본 발명에 의한 화합물이 목적으로 하는 장기에 분포될 수 있는 것, 및 양호한 체외로의 클리어런스를 갖는 것을 확인하기 위해서, 화합물 Ⅰ-9를 사용하여 SD계 래트(8주령)에 있어서의 각 장기로의 방사능 집적의 경시적 변화를 측정했다.

6-트리부틸스타닐-2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]이미다조[1,2-a]피리딘의 아세토니트릴 용액(농도 : 1㎎/mL) 100μL에 1mol/L 황산 100μL, 1mmol/mL 요오드화나트륨 10μL, 981MBq의 [¹²³I]요오드화나트륨 60μL, 30%(W/V) 과산화수소 10μL를 첨가했다. 상기 혼합액을 40℃에서 10분간 정치한 후, 하기 조건의 HPLC에 제공해서 [¹²³I]-2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘 획분을 분취했다.

HPLC 조건 :

컬럼 : YMC-Pack Pro C8(상품명, YMC사 제, 사이즈 : 4.6×150㎜)

이동상 : 10mM 포름산 완충액(pH3.0)/아세토니트릴=80/20→10/90(0분→30분)

유속 : 1.0mL/분

검출기 : 자외 가시 흡광 광도계(검출 파장 : 254㎚) 및 방사선 검출기(raytest사 STEFFI형)

상기 획분에 물 10mL를 첨가한 액을 Sep-Pak C18 컬럼[상품명 : Sep-Pak(등록상표） Light C18 Cartridges, Waters사 제, 충전제의 충전량 130㎎]에 통액하여 [¹²³I]-2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘을 상기 컬럼에 흡착 포집했다. 이 컬럼을 물 1mL로 세정한 후, 디에틸에테르 1mL를 통액해서 [¹²³I]-2-[4'-(2"-플루오로에톡시)페닐]-6-요오드이미다조[1,2-a]피리딘(화합물 Ⅰ-9)을 용출시켰다. 얻어진 방사능량은 합성 직후에 있어서 473MBq이었다. 하기의 조건에 의한 TLC 분석을 행한 결과, 그 방사 화학적 순도는 98%이었다.

TLC 분석 조건 :

TLC 플레이트 : Silica Gel 60 F₂₅₄(제품명, 메르크사 제)

전개상 : 아세트산 에틸/메탄올/디에틸아민=100/4/1

검출기 : Rita Star(제품명, raytest사 제)

화합물 Ⅰ-9의 디에틸에테르 용액을 10㎎/mL 아스코르브산 함유 생리식염액으로 희석하고, 방사능 농도 8∼12MBq/mL가 되도록 조정했다. 조제한 시료용액 각 0.2mL를 상기 래트에 무마취 하에서 꼬리정맥으로부터 투여했다. 투여 후 5분, 30분, 60분, 180분에 복부 대동맥으로부터 탈혈한 후, 표 3 기재의 각 장기를 채취했다. 채취한 각 장기의 질량 및 방사능을 실시예 Ⅰ-30과 같은 방법으로 계측했다. 또한, 장기를 채취한 후의 래트의 전신(이하, 나머지 전신이라고 칭함)의 방사능도 계측했다. 이들의 측정 결과를 사용하여 하기 식(3)으로부터 각 시간점에 있어서의 각 장기로의 단위질량당의 방사능 분포율(%ID/g)을 산출했다.

결과를 표 3에 나타낸다. 표 3에 나타내는 바와 같이, 화합물 Ⅰ-9는 투여 후 5분에 있어서 각 장기에 분포된 후, 그 방사능의 대부분이 소장이나 대장에 분포되어 있었다. 또한, 그 방사능 분포율이 소장으로부터 대장으로 이행하고 있었다. 이것으로부터, 화합물 Ⅰ-9는 투여 후 신속하게 담즙 배설되어 양호한 체외로의 클리어런스를 갖는 것이 나타내어졌다. 또한, 아밀로이드가 축적되게 되는 뇌, 심장, 폐, 췌장, 뼈 등을 보아 보면, 각 조직 모두에 투여 후 5분에 있어서 명확한 방사능 집적이 보여져, 화합물 Ⅰ-9가 분포되어 있는 것이 확인되었다. 또한, 투여 후 5분과 투여 후 180분의 비[(투여 후 5분의 %ID/g)/(투여 후 180분의 %ID/g)]가, 각각 뇌가 94, 심장이 18, 폐가 9, 췌장이 9, 뼈가 6으로 높은 값을 나타내고 있었다. 이것으로부터, 아밀로이드가 축적되게 되는 조직에 있어서 신속한 방사능 분포 및 신속한 클리어런스가 이루어지고 있는 것이 나타내어졌다.

이상으로부터, 생체조직 중에 있어서 아밀로이드 검출 시약으로서 필요한, 투여 후 조기에 있어서의 방사능 분포 및 신속한 체외 클리어런스가 달성되어 있는 것이 나타내어졌다.

[표 3]

(산업상의 이용 가능성)

본 발명에 의한 생체조직 중의 아밀로이드 검출 시약은 전신성 아밀로이드증을 비롯한 아밀로이드증에 있어서의 아밀로이드 단백질의 인비트로 및 인비보에서의 진단제에 이용할 수 있다.

Claims

하기 식(1)

[식 중, A₁, A₂, A₃ 및 A₄는 각각 독립적으로 탄소 또는 질소,
R¹은 할로겐 치환기,
R²는 할로겐 치환기,
m은 0∼2의 정수이다.
단, R¹ 및 R² 중 적어도 어느 한쪽은 방사성 할로겐 치환기이고, 또한 A₁, A₂, A₃ 및 A₄ 중 하나 이상은 탄소이며, R¹은 탄소인 A₁, A₂, A₃ 또는 A₄에 결합된다.]으로 나타내어지는 화합물 또는 그 염을 함유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 생체조직에 침착된 아밀로이드의 검출 시약.
제 1 항에 있어서,
상기 A₁, A₂, A₃ 및 A₄ 중 3개 이상은 탄소인 것을 특징으로 하는 생체조직에 침착된 아밀로이드의 검출 시약.
제 2 항에 있어서,
상기 A₁, A₂, A₃ 및 A₄는 모두 탄소인 것을 특징으로 하는 생체조직에 침착된 아밀로이드의 검출 시약.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 R¹은 ¹⁸F, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I 및 ¹³¹I로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생체조직에 침착된 아밀로이드의 검출 시약.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 R²는 ¹⁸F, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I 및 ¹³¹I로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생체조직에 침착된 아밀로이드의 검출 시약.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생체조직은 뇌, 심장, 폐, 췌장, 뼈 또는 관절인 것을 특징으로 하는 생체조직에 침착된 아밀로이드의 검출 시약.
하기 식(2)

[식 중, A₁, A₂, A₃ 및 A₄는 각각 독립적으로 탄소 또는 질소,
R³은 비방사성 할로겐 치환기, 니트로 치환기, 알킬쇄의 탄소수가 1∼4인 트리알킬암모늄 치환기, 알킬쇄의 탄소수가 1∼4인 트리알킬스타닐 치환기, 및 트리페닐스타닐기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기,
R⁴는 비방사성 할로겐 치환기, 메탄술폰산 치환기, 트리플루오로메탄술폰산 치환기 및 방향족 술폰산 치환기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기,
m은 0∼2의 정수이다.
단, A₁, A₂, A₃ 및 A₄ 중 하나 이상은 탄소이며, R³은 탄소인 A₁, A₂, A₃ 또는 A₄에 결합된다.]으로 나타내어지는 화합물 또는 그 염과 방사성 할로겐 이온을 함유하는 반응 용액을 조제하는 공정; 및
상기 반응 용액에 반응 조건을 부여함으로써 하기 식(1)

[식 중, A₁, A₂, A₃ 및 A₄는 각각 독립적으로 탄소 또는 질소,
R¹은 할로겐 치환기,
R²는 할로겐 치환기,
m은 0∼2의 정수이다.
단, R¹ 및 R² 중 적어도 어느 한쪽은 방사성 할로겐 치환기이고, 또한 A₁, A₂, A₃ 및 A₄ 중 하나 이상은 탄소이며, R¹은 탄소인 A₁, A₂, A₃ 또는 A₄에 결합된다.]으로 나타내어지는 화합물 또는 그 염으로 나타내어지는 화합물 또는 그 염을 합성하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방사성 할로겐 표식 유기화합물의 제조 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 A₁, A₂, A₃ 및 A₄ 중 3개 이상은 탄소인 것을 특징으로 하는 방사성 할로겐 표식 유기화합물의 제조 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 A₁, A₂, A₃ 및 A₄는 모두 탄소인 것을 특징으로 하는 방사성 할로겐 표식 유기화합물의 제조 방법.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 R³은 비방사성 요오드, 알킬쇄의 탄소수가 1∼4인 트리알킬스타닐 치환기, 및 트리페닐스타닐 치환기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기,
상기 R² 및 R⁴는 비방사성 할로겐 치환기,
상기 방사성 할로겐 이온은 ¹²³I 이온, ¹²⁴I 이온, ¹²⁵I 이온 및 ¹³¹I 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것,
상기 R¹은 ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I 및 ¹³¹I로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방사성 할로겐 표식 유기화합물의 제조 방법.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 R³은 니트로 치환기 또는 알킬쇄의 탄소수가 1∼4인 트리알킬암모늄 치환기,
상기 R² 및 R⁴는 비방사성 할로겐 치환기,
상기 방사성 할로겐 이온은 ¹⁸F 이온,
상기 R¹은 ¹⁸F인 것을 특징으로 하는 방사성 할로겐 표식 유기화합물의 제조 방법.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 R³은 비방사성 브롬,
상기 R² 및 R⁴는 비방사성 할로겐 치환기,
상기 방사성 할로겐 이온은 ⁷⁵Br 이온 또는 ⁷⁶Br 이온,
상기 R¹은 ⁷⁵Br 또는 ⁷⁶Br인 것을 특징으로 하는 방사성 할로겐 표식 유기화합물의 제조 방법.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 R¹ 및 R³은 비방사성 할로겐 치환기,
상기 R⁴는 메탄술폰산 치환기, 트리플루오로메탄술폰산 치환기 및 방향족 술폰산 치환기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기,
상기 방사성 할로겐 이온은 ¹⁸F 이온,
상기 R²는 ¹⁸F인 것을 특징으로 하는 방사성 할로겐 표식 유기화합물의 제조 방법.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 R¹ 및 R³은 비방사성 할로겐 치환기,
상기 R⁴는 비방사성 요오드,
상기 방사성 할로겐 이온은 ¹²³I 이온, ¹²⁴I 이온, ¹²⁵I 이온 및 ¹³¹I 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것,
상기 R²는 ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I 및 ¹³¹I로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방사성 할로겐 표식 유기화합물의 제조 방법.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 R¹ 및 R³은 비방사성 할로겐 치환기,
상기 R⁴는 비방사성 브롬,
상기 방사성 할로겐 이온은 ⁷⁵Br 이온 또는 ⁷⁶Br 이온,
상기 R²는 ⁷⁵Br 또는 ⁷⁶Br인 것을 특징으로 하는 방사성 할로겐 표식 유기화합물의 제조 방법.
하기 식(2)

[식 중, A₁, A₂, A₃ 및 A₄는 각각 독립적으로 탄소 또는 질소,
R³은 비방사성 할로겐 치환기, 니트로 치환기, 알킬쇄의 탄소수가 1∼4인 트리알킬암모늄 치환기, 알킬쇄의 탄소수가 1∼4인 트리알킬스타닐 치환기, 및 트리페닐스타닐기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기,
R⁴는 비방사성 할로겐 치환기, 메탄술폰산 치환기, 트리플루오로메탄술폰산 치환기 및 방향족 술폰산 치환기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기,
m은 0∼2의 정수이다.
단, A₁, A₂, A₃ 및 A₄ 중 하나 이상은 탄소이며, R³은 탄소인 A₁, A₂, A₃ 또는 A₄에 결합된다.]으로 나타내어지는 것을 특징으로 하는 방사성 할로겐 표식 유기화합물 합성용의 전구체 화합물 또는 그 염.
제 16 항에 있어서,
상기 A₁, A₂, A₃ 및 A₄ 중 3개 이상은 탄소인 것을 특징으로 하는 방사성 할로겐 표식 유기화합물 합성용의 전구체 화합물 또는 그 염.
제 17 항에 있어서,
상기 A₁, A₂, A₃ 및 A₄는 모두 탄소인 것을 특징으로 하는 방사성 할로겐 표식 유기화합물 합성용의 전구체 화합물 또는 그 염.