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KR20090130335A - 암 세포 세포독성을 매개하는 인간화 및 키메라 항-ｃｄ５９ 항체 - Google Patents

암 세포 세포독성을 매개하는 인간화 및 키메라 항-ｃｄ５９ 항체 Download PDF

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KR20090130335A
KR20090130335A KR1020097024852A KR20097024852A KR20090130335A KR 20090130335 A KR20090130335 A KR 20090130335A KR 1020097024852 A KR1020097024852 A KR 1020097024852A KR 20097024852 A KR20097024852 A KR 20097024852A KR 20090130335 A KR20090130335 A KR 20090130335A
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KR
South Korea
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monoclonal antibody
isolated monoclonal
antibody
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cdmab
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Withdrawn
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KR1020097024852A
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English (en)
Inventor
데이비드 에스 에프 영
헬렌 피 핀들레이
수잔 이 한
리사 엠 케체토
크루즈 루이스 에이 지 다
Original Assignee
에프. 호프만-라 로슈 아게
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Publication date
Application filed by 에프. 호프만-라 로슈 아게 filed Critical 에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

CD59 인 18 - 20 kDa 의 글리코실 포스파티딜이노시톨 (GPI)-고정된 막 당단백질은 일부 정상 및 암 조직에서 발현된다. 등록 번호 280104-02 로 캐나다 국제 기탁 기관 (IDAC) 에 기탁된 하이브리도마 AR36A36.11.1 로부터의 CD59 에 대한 단일클론 항체는 세포독성에 의한 전립선암 및 유방암을 포함하는 일부 암 모델에서, 종양 성장을 예방하고 종양 부하량을 감소시키는 암성 질환 조절 항체 (CDMAB) 라는 것을 이미 나타냈다. 단일클론 항체의 가변 영역은 이제 단리 및 서열화되고, 상보성 결정 부위 (CDR) 가 결정되고, 모 단일클론 항체와 동일한 항-CD59 결합 활성 및 항-암 활성을 갖는 키메라 및 인간화 항체가 생성된다. 단일클론, 키메라 및 인간화 항체는 암을 치료하기 위해 독소, 효소, 방사성 화합물, 시토킨, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분 및 혈행성 세포에 컨쥬게이션될 수 있다. 이러한 항체는 또한 세포 상에서의 CD59 발현을 측정하기 위한 결합 검정에도 사용된다.

Description

암 세포 세포독성을 매개하는 인간화 및 키메라 항-ＣＤ５９ 항체 {HUMANIZED AND CHIMERIC ANTI-CD59 ANTIBODIES THAT MEDIATE CANCER CELL CYTOTOXICITY}
본 발명은 암성 질환의 진단 및 치료, 특히, 종양 세포의 세포독성의 매개, 및 가장 특히, 세포독성 반응을 개시하는 수단으로서, 임의로 하나 이상의 CDMAB/화학요법제와 조합인 암성 질환 조절 항체 (cancerous disease modifying antibody, CDMAB) 의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 CDMAB 를 사용하는 결합 검정법에 관한 것이다.
CD59 는 18-20 kDa 의 글리코실 포스파티딜이노시톨 (GPI)-고정 막 당단백질이다. 그것은 우선 인간 적혈구의 표면으로부터 단리되고, 보체 작용의 억제제로서 기능한다. 이어서, 보체-매개 용해를 개선시키기 위해 개발된 일부 항체는 표적 CD59 로 발견되었다. 그들의 개별적인 개발로 CD59 는, MEM-43 항원, 반응성 용해 (MIRL) 의 막 억제제, H19, 막공격 복합체-억제 인자 (MACIF), m.w. 20,000 (HRF20) 을 갖는 상동 제한 인자 및 보호기를 포함하는, 수많은 이름으로 불린다 (Walsh, Tone et al. 1992).
CD59 항원은 아미노산 분석 및 NMR 에 의해 잘 특징화된다. 이는 처음 25 개가 신호 서열을 포함하는, 128 개의 아미노산으로 이루어진다. 10 개의 시스테인 잔기가 있으며, 이는 단단하게 접힌 분자를 유발한다. 위치 18 에서의 아스파라긴 잔기는 N-글리코실화된 것으로 알려져 있고, 위치 77 에서의 아스파라긴 잔기는 CPI 고정기에 연결되어 있다. C-말단 잔기는 CPI-고정 단백질의 특징이다 (Davies and Lachmann 1993).
CD59 는 초기에는 인간 적혈구의 표면 상에서 발견되었으나, 광범위하게 발현되는 분자이다. 흐름 세포측정, 면역조직화학 및 노던 블롯 분석으로부터 세포 분포에 대한 많은 데이타를 수집하여, 혈소판, 백혈구 및 섬유모세포뿐만 아니라 적혈구와 같은 조혈 세포를 포함하는, 많은 유형의 세포 및 조직에 대해서도 발현되는 것을 나타냈다 (Meri, Waldmann et al. 1991). CD59 는 신체, 특히, 신장, 기관지, 이자, 피부 표피 및 쓸개 및 침샘을 통해 혈관 및 도관 내피 상에 풍부하다 (Meri, Waldmann et al. 1991).
발현은 폐, 간, 태반, 갑상선 및 정자에서 주목되고 있다 (Davies and Lachmann 1993). CD59 의 가용성 형태는 침, 소변, 눈물, 땀, 뇌척수액, 모유, 양수 및 정장액에서 검출되고 있다 (Davies and Lachmann 1993). 가용성 CD59 의 기원은 아직 측정되지 않았다; 그것이 분비되는 것과는 상관없이 인지질분해효소에 의해 분해되거나, 다른 수단에 의해 세포로부터 흐르는 것은 알려져 있지 않다 (Davies and Lachmann 1993). CD59 는 많은 B 세포주, CNS 조직, 간 실질 및 랑게르한스의 이자섬에는 없는 것으로 나타난다 (Meri, Waldmann et al. 1991).
CD59 가 정상 세포 및 조직에서 광범위하게 발현되나, 또한 악성 종양에서도 광범위하게 발현된다. CD59 의 발현은 정상 조직에 비해 특정 유형의 암에서 증가하고, 발현 수준은 종양의 분화 단계와 관련있다는 증거가 있다. 높은 수준의 CD59 발현에 대한 조절이 갑상선, 전립선, 유방, 난소, 폐, 직장, 이자, 위, 신장 및 피부 암뿐만 아니라 악성 신경아교종, 백혈병 및 림프종에 보고되어 있다 (Fishelson, Donin et al. 2003).
종양 등급을 제외하고, CD59 발현과 종양/환자 특징, 예컨대, 종양 유형, 크기, 혈관 전이, 환자 연령, 성별 또는 폐경 상태 (오직 유방암만) 간의 연관성은 관찰되지 않았다 (Madjd, Pinder et al., 2003; Watson, Durrant et al., 2006). 유방, 결장직장 및 전립선을 포함하는 상이한 종양 조직을 사용하는 연구에서, CD59 의 발현은 잘-분화된 종양 등급을 조절하는 것과 매우 관련있다 (Madjd, Pinder et al., 2003; Watson, Durrant et al., 2006, Jarvis, Li et al., 1997; Koretz, Bruderlein et al., 1993). 그러나, 잘 분화된 종양에서의 CD59 발현과 환자 예후 간의 연관성은 미해결된 문제로 남아있다. 유방 및 결장직장 암 시료를 사용하는 두 개의 분리된 연구는 매우 분화된 세포에서의 CD59 발현이 좋은 환자 예후와 관련있다는 것을 나타낸다 (Madjd, Pinder et al., 2003; Koretz, Bruderlein et al., 1993). 대안적으로, 결장직장암 조직을 사용하는 또 다른 연구 (Watson et al) 는, 높은 CD59 의 수준과 분화된 종양 등급간의 연관성이 초기 내지 후기 단계 질환으로 하위-분리될 수 있다는 것을 보고한다. 이들 저자는 잘 분화된 초기 내지 후기 단계의 종양이 질환 특정 환자 생존을 감소시키는 것과 관련있다는 것을 나타낸다 (Watson, Durrant et al., 2006).
반대로, 탈-분화된 종양 세포는 CD59 오염의 부재와 매우 관련되고, 이는 전이와 밀접한 관련성을 가질 수 있다. 일부 연구는 증가된 CD59 의 발현이 반대로 종양 전이와 관련된다는 것을 제시하였다. 유방암종 및 결장직장 암에서, 많은 CD59 발현은 전이가 없는 종양 시료에서 발생한다 (Madjd, Pinder et al., 2003; Koretz, Bruderlein et al., 1993). 유사하게는, 간 및 결장직장 전이 종양에서 높은 CD59 수준을 갖는 세포가 적은 비율로 발견되었다 (Hosch, Scheunemann et al., 2001). 또한, 머리 및 목의 편평 세포 암종에서의 CD59 의 발현은 오직 T1/T2N0M0 종양 등급을 갖는 시료에서만 상승하고, N1 및 M1 아래의 종양 등급에서는 상승하지 않는다 (Ravindranath, Shuler et al., 2006).
CD59 의 가장 특징적인 기능은 보체 활성화에 따른 막 공격 복합체 (MAC) 의 형성을 억제하는 그의 능력이다. MAC 형성은 결국 세포의 용해를 유발하는 세포막에 구멍을 형성하는 보체 캐스캐이드에서 발생한다. CD59 는 C5b-8 에 결합하고, C9 분자의 연속 중합을 방해하며, MAC 형성을 위해 상기 단계가 요구된다. 차단 및 비-차단 단일클론 항체로 수행되는 CD59 의 항원결정기의 경쟁 및 변이 분석으로 CD59 의 활성 부위의 위치를 맵핑하고, CD59 활성에 필요한 아미노 Tyr-40, Arg-53 및 Glu-56 을 확인하였다 (Bodian, Davies et al., 1997).
보체 활성화는 표적화된 세포 또는 세포 활성화의 파괴를 유발하고, 이는 백혈구를 보충하고, 주변 평활근을 수축시키고, 혈관 투과성을 증가시킨다. 보체는 또한 항체-의존성 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDCC) 에서 역할을 수행한다. 이는 잘 조절되지 않는 경우, 표적화된 조직을 손상시킬 수 있는 염증성 반응을 유발할 수 있다. CD59 및 다른 보체 억제 단백질, 예컨대, 보체 수용체 유형-1 (CR1; CD35), 막 보조인자 단백질 (MCP; CD46) 및 붕괴 가속 인자 (DAF; CD55) 는 자가 조직 손상을 예방하기 위한 보체 캐스캐이드의 과잉 활성화를 억제하는 기능을 한다. 보체 억제 단백질, 예컨대, CD59 의 분화 발현, 종종 악성 종양을 얻게되는 보체 활성화에 대한 내성을 증가시키는데 공헌할 수 있다고 주장된다 (Jarvis, Li et al. 1997).
종양 세포에 의한 보체의 내성이 표적 CD59 에 의해 극복될 수 있는지를 평가하기 위해, 종양 세포의 용해를 증가시키는 CD59 차단 항체 YTH53.1 의 능력을 시험관 내에서 평가하였다. 유방암 (T47D 세포주) 및 난소 기형암종 (PA-I 세포주) 세포를 갖는 3 차원의 미세종양 구상체를 사용하는 연구에서, CD59 활성을 차단하는 상기 항체의 능력 및 그에 따른 보체 내성이 측정되었다. MTS 는 배양액에서 성장하는 다세포성 응집체이고, 단층 또는 현탁 배양액보다 생체 내에서 관찰하는 것에 더 근접한 모델을 나타낸다. 상기 군에 의한 이전의 연구는 MTS 로 성장한 PA-1 세포가 현탁액에서 성장한 PA-1 세포보다 보체 용해에 더욱 내성을 가진다는 것을 나타냈다. 세포독성은 크롬 방출 분석에 의해 측정되고, 세포 손상은 바이오티닐화 YTH53.1 을 갖는 MTS 의 전-처리에 따른 프로피디움 요오드 (PI) 의 흡수에 의해 시각화된다. YTH53.1 의 바이오티닐화는 CD59 에 대한 그의 친화성을 보유하나, 기존의 보채 경로를 활성화시키는 그의 능력은 감소된다. 유방암 세포 (S2 세포주) 에 대한 성장한 토끼 항-인간 다중클론 항체가 기존의 보체 경로를 활성화하는데 사용된다. 바이오티닐화 YTH53.1 를 밤새 인큐베이 션하여 MTS 의 전체적인 침윤을 야기하고, 크롬 방출 분석은 바이오티닐화 YTH53.1, S2 및 인간 보체의 존재 하에 1 내지 2-시간의 유도기 후 세포의 33 % 가 죽는다는 것을 나타냈다. 동일한 처리 하에, 전자 현미경은 평균 T47D 종양 부피가 28% 감소한다는 것을 나타냈다. PI 인큐베이션에 따른 형광 현미경은 T47D 및 PA-1 MTS 에 대한 몇몇 층의 세포 죽음을 나타냈다. 이러한 결과는 항-CD59 항체가 시험관 내에서 종양 세포의 보체-매개 용해를 증가시킬 수 있는 CD59 억제 작용을 차단할 수 있다는 것을 나타낸다 (Hakulinen and Meri 1998).
다른 연구에서, 인간 전이 전립선 선암성 세포주 DU145 및 PC3 에 의한 보체-매개 용해에 대한 내성은 시험관 내에서 YTH53.1 로 처리하여 극복될 수 있다. 크롬 방출 분석은 YTH53.1 및 바이오티닐화 YTH53.1 의 존재 및 부재 하에, 세포의 죽음을 측정하는데 사용된다. CD59 항체의 부재 하에서, 모든 세포주는 보체-매개 용해에 대해 완전한 내성을 가지나, YTH53.1 로의 처리는 56 % 의 PC3 세포 및 34 % 의 DU145 세포를 죽여 상기 내성을 부분적으로 극복한다. 바이오티닐화-YTH53.1 로의 처리는 보체 내성을 극복하는데 덜 효과적이며; 47 % 의 PC3 및 20 % 의 DU145 세포가 죽는다. DU145 세포에 비해 PC3 에 의한 CD59 의 더 우수한 발현 및 CD59 발현에 대한 가능하게는 그의 더 우수한 의존성 및 보체 매개 용해에 대한 내성을 갖는데 있어서의 기능이 DU145 에 비해 PC3 의 증가된 민감성에 의해 반영된다. 본래 및 바이오티닐화 항체의 분화 효과가 기존의 보체 경로 및 CD59 의 중화를 활성화하는데 있어서 개선된 효과를 증명한다 (Jarvis, Li et al. 1997). 그러나, 기존 경로에 의해 보체 활성화를 촉진하는 것만이 한계 량에 의해 활성을 증가시키는 바와 같이, 항체의 거대한 활성이 보체 억제 (CD59 의 중화) 의 블록킹에 기여할 수 있다 (예를 들어, PC3 세포 상에서 바이오티닐화-YTH53.1 47 % 대 YTH53.1 56 %) (Jarvis, Li et al. 1997). 이전에 기재된 것과 함께 본 연구는 항체를 사용하는 표적화 CD59 가 악성 종약에서 보체 활성화에 대한 블로킹 내성을 위한 효과적인 치료일 수 있다는 것을 증명하였다.
대안적인 접근으로, 가공된 이-특이적 항체를 사용하여 시험관 내에서 종양 세포에 대해 CD59 를 특이적으로 표적화하는 것을 목적으로 한다. CD59 는 세포-표적화 (항-CD 19 또는 항-CD38) 및 CD59-중화 부분 모두에 함유된, 두 개의 상이한 이특이성 F(ab'gamma)2 항체 구조 중 하나를 사용하여 중화된다. 이러한 실험에서, Fab'gamma Fc gamma2 키메라 항체 (인간 CD37 에 대해 특이적) 는 종양 B 림프구 세포 (Raji) 상에서 인간 보체의 기존 경로를 활성화하는데 사용된다. 이-특이적 구조를 갖는 CD59 의 중화는 15-25 % 의 Raji 세포를 용해시킨다. 표적 (Raji) 및 방관자 (K562) 세포, 항-CD38 × 항-CD59 이 특이적 구조는 CD59-발현 방관자 세포에 대한 현저한 흡수를 방지하는 Raji 로 특이적으로 전달될 수 있다. 상기 항-CD 19 × 항-CD59 이-특이적 항체 결합은 세포-특이적 표적화가 높은-친화성 항-종양 세포 Fab'gamma 에 의존하는 것을 나타내는 세포 유형과 매우 동일하다 (Harris, Kan et al., 1997). 이-특이적 항체를 사용하는 통상의 방관자 세포에 영향을 미치는 것을 방지하기 위해 표적화된 종양 특이적 CD59 의 전제를 호소함에도 불구하고, 상기 항체는 종양 특이적 표적에 대한 항체의 친화도에 의해 제한된다. 더욱이, 이-특이적 항체는 후-종양유전자적 결과를 유발할 수 있는 다른 종양 특이적 항원을 표적화하는 효과에 의해 복잡하게된다. 또한, 기재된 상기 연구에서, 이-특이적 항체는 세포 용해를 개선시키기 위한 보체의 전-활성화에 대한 요구에 의해 제한된다. 보체 활성화 능력을 갖는 CD59 에 대한 일-특이적 항체의 사용은 덜 복잡할 수 있고, 잠재적으로는 치료 수단으로 더욱 효과적일 수 있다. 현재까지, 항-CD59 항체 YTH53.1 의 생체 내 분석은 없었다.
종양 생존은 또한 치료의 다른 형태에 대한 내성이 수득되는 동안의 CD59 발현과 관련된다. 리턱시맵 (Rituxan®, Genentech, San Francisco, CA) 의 임상적 효능 및 CD59 수준 사이의 반대 관계가 림프종 세포에서 설명된다. 키메라 단일클론 항체 리턱시맵은 CD20 항원에 대한 것이고, 비-호지킨 림프종 (NHL) 의 치료에서 사용되는 것으로 입증되었다. 그러나, CD20+ 인 수많은 환자는 치료에 둔감하고, 결국 반응하는 대부분의 환자는 치료에 대한 내성이 발생할 것이다. 이는 마찬가지로 CD59 와 같은 보체 억제제의 도입으로 인한 것이다. 저농도의 리턱시맵 및 보체에 반복적으로 노출되는 리턱시맵-내성 B-림프종 세포주 (RAMOS) 를 사용하여, Takai 등은 CD59 발현이 리턱시맵 및 보체에 대한 내성을 확립하는 동안 증가된다는 것을 증명하였다 (Takai et al., 2006). 항호르몬에 의한 억제에 대한 반응에서, 유방암 세포는 에스트로겐 수용체 (ER) 차단의 최대 항-종양 효과를 제한하기 위한 대안적 신호를 모은다. 항에스트로겐 타목시펜 또는 파슬로덱스에 대해 MCF-7 세포가 반응하는 동안 CD59 발현이 상당히 증가되는 것이 보고되었고, 일단 치료 내성이 수득되면, 연속으로 감소하는 유전자 발현 수준을 갖는 항에스트로겐 억제의 급성기 동안에 일시적으로 나타났다 (Shaw, Gee et al., 2005). 그러므로 항체로의 CD59 의 표적화는 또한 CD59 발현이 증가된 상기 암에서의 다른 암의 치료에 대한 내성을 극복하기 위해 가능성있는 효과적인 치료적 접근이다.
다른 치료에 대한 내성을 극복하기 위한 수단으로서 CDCC 를 증가시키기 위한 항-CD59 항체의 사용이 연구되고 있다. 리턱산-내성 NHL 및 MM 세포주는 시험관 내에서 보체의 존재 하에 CD59 를 발현시키는 반면, 리턱산-민감성 NHL 및 MM 세포주는 CD59 를 발현시키지 않는다. 항-CD59 항체 (YTH53.1) 를 갖는 내성 세포주 중 하나의 예비-인큐베이션은 리턱시맵 및 인간 보체로의 치료에 대해 세포를 민감하게 한다. 또한, CD59 의 높은 수준의 발현이 CD20+ 인 환자로부터 단리된 종양에 대해 나타지만, 리턱시맵 처리로 질환은 진행된다 (Treon, Emmanouilides et al. 2005).
다른 연구에서, CD59 (MB-59) 에 대한 것이며 인간 항체 라이브러리로부터의 단일-쇄 가변 절편 (scFv) 으로 단리되고 인간 IgG1 의 Hinge-CH2-CH3 도메인을 함유하기 위해 가공된 인간 mAb 를 사용하여, 리턱시맵에 의해 자극된 보체-매개 손상을 겪는 두 개의 B 림프종 세포주 Karpas 422 및 Hu-SCID1 에 대한 표적화 CD59 의 효과를 평가하였다. 상기 분석에서, 항체 처리 후 MTT 분석에 의해 측정된 잔기 세포에서, 리턱시맵에 의해 민감하게되고 보체에 의해 죽은 세포의 수가 약 30 % 이나, MB-59 가 시험 시스템에 첨가되는 경우에는 그의 2 배가 된다 (Ziller et al, 2005). MB-59 의 단독 사용은 보체 매개 세포독성을 개선하는데 효과적이지 않다. 그러므로, 리턱시맵의 처리는 항-CD59 항체를 첨가하여 리턱시맵에 대한 부분적 내성을 극복하는 것을 돕고, 그에 따라 종양이 면역치료 또는 다른 치료에 더 잘 반응하도록 하면서, 종양 세포를 민감하게 한다. 현재까지, YTH53-1, MB-59 와 유사한 생체 내 효능이 분석되지는 않았다.
보체 조절에서의 그의 역할 이외에, CD59 는 혈관 신생과도 밀접한 관련이 있다. vanBeijnun 등의 연구에서, 유전자 발현 (SAGE) 태그의 일련 분석은 종양 및 정상 내피 세포 (EC) 로부터 생성되고, 삭감식 혼성화 (SSH) 를 억제하여 비교된다. 직장암종 조직, 비신경섬유종 혈관형성 태반성 조직 및 비혈관생성 정상 조직으로부터 CD59 는 혈관형성 및 비혈관형성 내피에 비해 종양 내피에서 과다발현되는 4 개의 표면-발현 종양 혈관형성 유전자 (TAG) 중에서 확인된다. 항체 표적화 CD59 은 EC 튜브 형성 (시험관 내) 및 계배융모요막 (CAM) (생체 내) 검정에서 측정된 바와 같이 혈관형성을 억제했다 (vanBeijnum, Ding et al., 2006). 항-CD59 항체로의 암의 치료는 종양 내에서의 혈관형성의 억제를 통해 추가 효능을 가질 수 있다.
다양한 암에서의 CD59 의 분화 발현의 관점에서, 약물 내성이 진전되는 동안의 그의 도입 및 혈관형성에서의 그의 역할, 정상 조직 상에서 여분의 CD59 는 표적화된 치료법으로서 항-CD59 항체를 사용하는데 있어서의 장벽으로 고려된다. 발작성야간혈색뇨증 (PNH) 은 보체 공격에 비정상적으로 민감한 세포를 유발하는 조혈 모세포에 영향을 미치는 드문 유전적 장애이다 (Davies and Lachmann 1993). 증상은 만성 용혈, 빈혈 및 혈전증을 포함한다 (Sugita and Masuho 1995). 적혈구, 과립백혈구, 단핵세포, 혈소판 및 때로는 림프구를 포함하는, PNH 에 의해 영향을 받는 세포는 아세틸콜린에스테라제, LFA-3, HUPAR 및 보체 조절인자 단백질 CD35, CD46, CD55 및 CD59 과 같은 GPI-고정 단백질에서 부족하다 (Davies and Lachmann 1993). CD59 가 완전히 없고, 다른 보체 조절인자 GPI-고정 단백질도 없는 개체에 대해 단독으로 보고된 경우가 있다. 상기 결핍은 용혈성 빈혈 및 혈전증과 같은 PNH-형 증상과 관련있다 (Davies and Lachmann 1993). CD59 기능의 결핍과 관련된 바람직하지 않은 효과가 있음에도 불구하고, 상기 개체는 모든 손실이 비-치사 (non-lethal) 이라는 것을 증명한다. 용혈성 부작용은 감소된 CD59 발현의 부작용이고, CD59 항체의 사용을 임상적으로 제한할 것이다.
CD59 유전자 중 하나가 녹아웃된 (knocked out) 마우스 모델은 CD59 결핍이 생체 내에서 비-치사인 것을 증명한다. 마우스들은 CD59, CD59a 및 CD59b 중 두 개의 형태를 발현한다. CD59a 는 혈액 세포를 포함하는 다양한 마우스 조직에서 광범위하게 발현되고, CD59b 발현은 오직 고환에서만 확인된다. Miwa 등은 생체 내의 자발적 보체 공격으로부터 적혈구를 보호하는 CD59 의 역할을 평가하기 위해 CD59a-결핍 마우스를 생성했다. 이러한 녹아웃 마우스는 성장하고, 일반적으로 용혈성 빈혈의 임의의 징후없이 살아있고, 상승된 헤모글로빈 수준을 가지지 않았다. 적혈구가 코브라 베놈 인자 (CVF) 의 주입에 의해 유도된 보체 공격에 더욱 민감함에도 불구하고, 자발적 보체 공격으로부터의 적혈구 제거는 많은 유형에 비해 현저히 상승되지 않았다 (Miwa, Zhou et al. 2002).
마침내, 6D1 의 F(ab')2 절편, 래트 억제 단백질 (RIP) 로 언급되는 21-kDa 의 막 당단백질에 대해 유도된 마우스 단일클론 항체, 인간 CD59 의 래트 상동체가 현저한 부작용없이 수컷 Wistar 래트의 군에 투여되었다. 동일한 연구에서, 5I2 의 절편, 상이한 래트 막-결합 보체 조절인자 단백질에 대해 유도된 항체가 또한 투여되었다. 6D1 절편의 주입 후, 결합이 폐, 심장 및 간에서 심장박동수 또는 혈압의 임의의 변화없이 측정되었다. 관찰된 효과는 오직 백혈구 수의 적은 증가 및 적혈구 수의 감소였다; 혈소판의 수에는 아무런 변화도 없었다. 반대로, 5I2 절편의 주입은 혈압의 신속한 증가, 백혈구 및 혈소판의 신속한 감소 및 연속적인 백혈구 수의 증가를 주입 후 2 시간 내에 유발하였다 (Matsuo, Ichida et al. 1994). 현재까지, 임상 연구 또는 생체 내 전임상 암 모델에서 치료적 효능을 나타내는 임의의 전장, 네이키드 항-CD59 항체에 대한 보고는 없었다.
암 치료요법으로서 단일클론 항체: 암을 나타내는 각각의 개체는 고유하며 사람의 고유성만큼 다른 암과 상이한 암을 갖는다. 이에도 불구하고, 현재 치료요법은 동일한 단계에서 동일한 유형의 암을 갖는 모든 환자를 동일한 방법으로 치료한다. 이들 환자 중 30 % 이상이 제 1선 치료요법에 실패하여, 추가적인 치료 단계를 야기하며, 치료 실패, 전이 및 최후에는 사망의 가능성이 증가하게 된다. 치료에 대한 우위적인 접근은 특정 개체를 위한 치료요법의 개별화이다. 개별화를 위해 자체 적합화된 현재 유일한 치료요법은 수술이다. 화학요법 및 방사선 치료는 환자에게 맞추어질 수 없으며, 수술 자체는 대부분의 경우 치료 에 불충분하다.
단일클론 항체의 등장으로, 개별화된 치료요법을 위한 개발 방법의 가능성이 보다 현실적으로 되었는데, 이는 각각의 항체가 단일 항원결정기로 유도될 수 있기 때문이다. 더욱이, 특정 개체의 종양을 고유하게 정의하는 항원결정기의 집합체에 유도되는 항체의 조합을 생성할 수 있다.
암성 세포와 정상 세포 사이의 유의한 차이가, 암성 세포가 형질전환된 세포에 특이적인 항원을 함유한다는 것임을 인지하여, 과학계는 오랫동안 단일클론 항체를 암 항원에 대해 특이적으로 결합시켜 형질전환된 세포를 특이적으로 표적화하도록 고안될 수 있다고 여겨왔는데; 따라서 단일클론 항체가 암 세포를 제거하기 위한 "마법의 탄환"으로서 역할을 할 수 있다는 믿음이 생겼다. 그러나, 단일 단일클론 항체가 모든 경우의 암에서 역할할 수 없고, 단일클론 항체가 표적된 암 치료의 부류로서 활용될 수 있다는 것이 현재 널리 인식되고 있다. 개시된 본 발명의 교시에 따라 단리된 단일클론 항체는 환자에게 유익한 방법으로 (예를 들어 종양 부하량을 감소시킴으로써) 암성 질환 과정을 개질시키는 것으로 나타났으며, 이는 암성 질환 조절 항체 (CDMAB) 또는 "항암" 항체로서 본원에서 다양하게 언급될 것이다.
현재, 암 환자는 통상적으로 소수 옵션의 치료를 받는다. 암 치료요법에 대한 조직화된 접근은 세계적 생존율 및 이환율을 개선시켰다. 그러나, 특정 개체에 대해, 이러한 개선된 통계 자료가 이들 개체의 상황에서의 개선과 반드시 관련되는 것은 아니다.
따라서, 전문가가 동 세대에서의 다른 환자의 각각의 암을 독립적으로 치료할 수 있도록 방법론이 발휘된다면, 이는 단 한 사람에 대한 맞춤 치료요법의 고유한 접근을 허용한다. 치료요법의 이러한 과정은, 이상적으로는 치료율을 증가시키고, 보다 양호한 성과를 내어, 이로 인해 오랜 필요성을 만족시킨다.
역사적으로, 다클론 항체의 사용은 인간 암의 치료에서 제한된 성공을 가지며 사용되어왔다. 림프종 및 백혈병은 인간 혈장으로 치료되었으나, 연장된 관해 또는 반응이 거의 없었다. 더욱이, 화학요법과 비교하여 추가적인 이점이 없고, 재현 가능성이 부족하였다. 고체 종양 예컨대 유방암, 흑색종 및 콩팥 세포 암종은 또한, 인간 혈액, 침팬지 혈청, 인간 혈장 및 말 혈청으로 치료되었으나, 이에 상응하는 결과는 예측불가능하고 비효과적이었다.
고체 종양에 대한 단일클론 항체의 많은 임상 실험이 있었다. 1980년대에, 특정 항원에 대한 항체를 사용하여 또는 조직 선택성을 기준으로 한, 인간 유방암에 대한 4번 이상의 임상 실험이 있었는데, 47 명 이상의 환자로부터 단 한 명의 반응자가 생겼다. 인간화 항-Her2/neu 항체 (Herceptin®)를 CISPLATIN 과 조합하여 사용한 성공적인 임상 실험은 1998년까지는 없었다. 상기 실험에서, 37 명의 환자를 반응에 대해 평가하였는데, 약 1/4이 부분적인 반응률을 가졌고 추가적인 1/4이 경미한 또는 안정적인 질환 진전을 가졌다. 반응자 중에서 진전에 대한 시간 중간값은 8.4개월이었고, 반응 지속 중간값은 5.3개월이었다.
Herceptin®은 1998년에 Taxol®과 조함으로 제 1 선 용도에 대해 승인되었 다. 임상 연구 결과는, Taxol® 단독만을 받은 군 (3.0 개월) 과 비교하여, Taxol® 과 함께 항체 치료요법을 받은 환자 (6.9개월) 에 대해, 질환 진전에 대한 시간 중간값이 증가된 것을 나타냈다. 또한, 생존 기간 중간값에서 약간의 증가가 있었다; Herceptin®과 Taxol® 치료 부분 대 Taxol® 단독 치료 부분에 대해, 22개월 대 18개월. 또한, 항체와 Taxol® 병용군에서, Taxol® 단독과 비교하여 완전 (8 % 대 2 %) 및 부분적 반응자 (34 % 대 15 %)의 수가 모두 증가하였다. 그러나, Herceptin® 및 Taxol® 로의 치료는 Taxol® 단독 치료와 비교하여 더 높은 심독성 발생을 일으킨다 (각각 13 % 대 1 %). 또한, Herceptin® 치료요법은, 현재 공지된 기능 또는 생물학적으로 중요한 리간드가 없는 수용체인 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (Her2/neu) (면역조직화학 (IHC) 분석을 통해 측정된 바와 같음)를 과다발현하는 환자; 전이성 유방암을 갖는 환자의 약 25%)에 대해서만 효과적이었다. 그러므로, 유방암 환자에 대한 큰 미충족된 필요성이 아직 존재한다. Herceptin® 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 환자라도 여전히 화학요법을 필요로 하며, 그 결과로 적어도 일부 정도, 이러한 종류의 치료의 부작용을 아직 처리해야만 한다.
결장직장암을 연구하는 임상 실험에서 당단백질 및 당지질 표적 모두에 대한 항체가 포함된다. 선암에 대한 일부 특이성을 갖는 항체 예컨대 17-1A는, 60 명이 넘는 환자에서 임상 제 2상 실험을 거쳐 오직 1 명의 환자만이 부분적인 반응을 가졌다. 다른 실험에서, 17-1A 의 사용은 추가적인 시클로포스파미드를 사용하는 프로토콜에서, 52명의 환자 중 오직 1 명의 완전한 반응, 및 2 명의 경미한 반응을 생성시켰다. 현재까지, 17-1A 의 임상 제 3 상 실험은 3 기 결장암에 대한 항원보조제 치료요법으로서의 개선된 효능을 증명하지 못했다. 영상화에 대해 초기 승인된 인간화 쥐과 단일클론 항체의 사용도 또한 종양을 퇴행시키지 못했다.
최근에, 단일클론 항체를 사용하는 결장직장암 임상 연구에서 임의의 긍정적인 결과가 존재하였다. 2004년에, ERBITUX® 는 이리노테칸 기초 화학요법에 대해 불응인 EGFR-발현 전이 결장직장암 환자의 제 2 선 치료에 대해 승인되었다. 2-군 (two-arm) 임상 제 2상 연구 및 단일군 (single arm) 연구 모두로부터의 결과는, 이리노테칸과 조합된 ERBITUX®가 각각 23% 및 15%의 반응률과 함께 각각 4.1개월 및 6.5개월의 질환 진전에 대한 시간 중간값을 갖는다는 것을 나타내었다. 동일한 2-군 임상 제 2상 연구 및 다른 단일군 연구로부터의 결과는, ERBITUX
Figure 112009073309005-PCT00001
단독 치료가 각각 11 % 및 9 % 반응률과 함께 각각 1.5개월 및 4.2개월의 질환 진전에 대한 시간 중간값을 야기하였다는 것을 나타냈다.
결과적으로 스위스 및 미국에서의 이리노테칸과 조합된 ERBITUX® 치료, 및 미국에서 ERBITUX® 단독 치료가 또한 제 1선 이리노테칸 치료요법에서 실패한 직장 암 환자의 제 2선 치료로 승인되었다. 그러므로, Herceptin® 과 같은 스위스에서의 치료는 단일클론 항체와 화학요법의 조합으로만 승인된다. 또한, 스위스 및 미국에서의 치료는 환자에 대한 제 2 선 치료요법으로서만 승인된다. 또한, 2004년에, AVASTIN® 이 전이성 결장직장암의 제 1선 치료로서 정맥내 5-플루오로우라실계 화학요법과의 병행 사용에 대해 승인되었다. 임상 제 3상 연구 결과는, 5-플루오로우라실 단독으로 치료한 환자와 비교하여 AVASTIN®과 5-플루오로우라실로 치료된 환자의 생존 기간 중간값에서의 연장을 나타내었다 (각각 16 개월 대 20 개월). 그러나, Herceptin® 및 ERBITUX® 에서와 같이 치료는 단일클론 항체 및 화학요법과의 조합으로서만 승인되었다.
또한 폐, 뇌, 난소, 췌장, 전립선 및 위암에 대한 취약한 결과가 지속된다. 비-소세포 폐암에 대해 가장 기대되는 최근의 결과는, 치료가 화학요법제 TAXOTERE®와 조합으로 세포-살해 약물 독소루비신에 컨쥬게이션된 단일클론 항체 (SGN-15; dox-BR96, 항-시알릴-LeX) 를 포함하는, 임상 제 2상 실험으로부터 나왔다. TAXOTERE®는 폐암의 제 2 선 치료에 대해 유일하게 FDA 승인된 화학요법이다. 초기 데이터는 단독인 TAXOTERE® 과 비교하여 개선된 전체 생존을 나타낸다. 연구를 위해 모집된 62 명의 환자 중에, 2/3는 TAXOTERE® 와 조합된 SGN- 15를 받고, 나머지 1/3은 TAXOTERE® 을 단독으로 받았다. TAXOTERE® 와 조합된 SGN-15를 받은 환자에 대해, 전반적인 생존 기간 중간값은, TAXOTERE® 을 단독으로 받은 환자에 대해서는 5.9개월인 것에 비교하여, 7.3개월이었다. 1 년 및 18 개월에서의 전반적인 생존은, SNG-15와 TAXOTERE® 를 받은 환자에 대해 각각 29% 및 18 %였고, TAXOTERE®을 단독으로 받은 환자에 대해 각각 24 % 및 8 %였다. 추가적인 임상 실험이 계획되고 있다.
전임상적으로, 흑색종에 대한 단일클론 항체의 사용에서의 일부 제한적인 성공이 있었다. 이들 항체의 극소수가 임상 실험에 도달하였고, 현재까지 임상 제 3 상 실험에서 유망한 결과를 나타내거나 승인된 것은 아무것도 없다.
질환을 치료하기 위한 신규 약물의 발견은, 질환 발병기전에 기여할 수 있는 30,000 개의 공지된 유전자의 생성물 중 관련 표적을 확인하지 못하는 것에 의해 방해된다. 종양학 연구에서, 잠재적인 약물 표적은 종종 단순히 이들이 종양 세포에서 과다발현된다는 사실로 인해 선택된다. 따라서 확인된 표적은 그 다음, 다수의 화합물과 상호작용으로 스크리닝된다. 가능성 있는 항체 치료요법의 경우에서, 이들 후보 화합물은 통상적으로 Kohler 및 Milstein 에 의해 규정된 기초 원리에 따른 전통적인 단일클론 항체 생성 방법 (1975, Nature, 256, 495-497, Kohler and Milstein)으로부터 유래된다. 비장 세포는 항원 (예를 들어, 전체 세포, 세포 분획, 정제된 항원) 으로 면역화된 마우스로부터 수집되고, 무한 증식 하이브리도마 파트너와 융합된다. 생성된 하이브리도마를 스크리닝하고, 표적에 가장 강력히 결합하는 항체를 분비하는 것을 선택한다. 암 세포에 대해 유도된 많은 치료 및 진단 항체 (Herceptin® 및 RITUXIMAB 포함) 는, 이러한 방법을 사용하여 생성되고 이의 친화성을 기초로 선택된다. 이러한 전략의 흠은 이중적이다. 첫 번째로, 치료적 또는 진단 항체 결합에 대해 적절한 표적의 선택이 조직 특이적 발암 과정을 둘러싼 지식의 부족, 및 그 결과로서 생긴, 이들 표적을 확인하는, 과발현에 의한 선택과 같은 단순화된 방법에 의해 제한된다. 두 번째로, 최대 친화성을 가지며 수용체에 결합하는 약물 분자가 통상 신호를 개시 또는 억제하기 위한 최고 확률을 갖는다는 가정이, 항상 그런 것이 아닐 수 있다.
유방 및 직장암의 치료에 대한 일부 진전에도 불구하고, 단일 제제 또는 공동 치료로서 유효한 항체 치료요법의 확인 및 개발은 모든 유형의 암에 대해 불충분하다.
선행 특허:
세계 출원 제 PCT/EP2006/009496 호는 결장직장 암종 조직에서 시판되는 항체로 결정되는 CD59 의 국소화를 개시한다. 그 다음, 상기 항체를 시험관 내 콜라겐-겔-기재 종자-형성 분석에 의해 결정하나, 여기서 현저한 활성은 검출되지 않았다. 그 다음 상기 항체를 계배의 융모요막 (CAM) 을 성장시키는데 있어서 실험적으로 시험하고, 이는 27 % 이하로 혈관신생을 억제함을 증명하였다.
미국 특허 제 5,750,102 호는 환자의 종양으로부터의 세포가 환자로부터의 세포 또는 조직으로부터 클로닝될 수 있는 MHC 유전자로 형질전환되는 방법을 개시한다. 이들 형질전환된 세포는 그 다음 환자에게 백신을 접종하는데 사용된다.
미국 특허 제 4,861,581 호는 포유류의 신생물 및 정상 세포의 내부 세포 성분에 특이적이나 외부 성분에는 특이적이지 않은, 단일클론 항체를 수득하고, 단일클론 항체를 표지하고, 신생물 세포를 사멸시키기 위한 치료요법을 받는 포유류의 조직과 표지된 항체를 접촉시키고, 퇴행하는 신생물 세포의 내부 세포 성분에 대한 표지된 항체의 결합을 측정함으로써 치료요법의 유효성을 측정하는 단계를 포함하는 방법을 개시한다. 인간 세포내 항원에 대해 유도된 항체를 제조하는 데 있어서, 당해 특허권자는 상기 항원의 편리한 원천을 나타내는 악성 세포를 인지한다.
미국 특허 제 5,171,665 호는 신규한 항체 및 이의 생성 방법을 제공한다. 특별하게는, 특허는 인간 종양 (예를 들어 결장 및 폐의 종양) 과 결합된 단백질 항원에 강하게 결합하는 반면, 정상 세포에는 훨씬 덜한 정도로 결합하는 특성을 갖는 단일클론 항체의 형성을 교시한다.
미국 특허 제 5,484,596 호는 인간 암 환자로부터 종양 조직을 수술적으로 제거하고, 종양 조직을 처리하여 종양 세포를 수득하고, 종양 세포를 조사 (irradiating)하여 생육가능하나 종양을 형성하지는 않게 하고, 이들 세포를 사용하여 제 1차 종양의 재발을 억제하면서 동시에 전이를 억제할 수 있는, 환자를 위한 백신을 제조하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 특허는 종양 세포의 표면 항원과 반응성인 단일클론 항체의 개발을 교시한다. 4번째 컬럼, 45 번째 줄 이하에서 설명된 바와 같이, 당해 특허권자는 인간 신생물에서 활성 특이적 면역요법을 나타내는 단일클론 항체의 개발에서 자발생 종양 세포를 이용한다.
미국 특허 제 5,693,763 호는 인간 암종에 특유한 것으로서 기원의 상피 조직에 비의존적인 당단백질 항원을 교시한다.
미국 특허 제 5,783,186 호는 Her2 발현 세포에서의 세포자멸사를 유도하는 항-Her2 항체, 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주, 상기 항체를 사용하는 암 치료 방법 및 상기 항체를 포함하는 약학 조성물을 명시한다.
미국 특허 제 5,849,876 호는 종양 및 비종양 조직 원천으로부터 정제된 점액소 항원에 대한 단일클론 항체의 생성을 위해 신규한 하이브리도마 세포주를 기재한다.
미국 특허 제 5,869,268 호는 원하는 항원에 특이적인 항체를 생성하는 인간 림프구를 생성하는 방법, 단일클론 항체를 생성하는 방법 뿐 아니라, 상기 방법에 의해 생성된 단일클론 항체를 명시한다. 특허는 특히 암의 진단 및 치료에 유용한 항-HD 인간 단일클론 항체의 생성을 명시한다.
미국 특허 제 5,869,045 호는 인간 암성 세포와 반응성인 항체, 항체 절편, 항체 컨쥬게이트 및 단일쇄 면역독소 반응에 관한 것이다. 이들 항체가 기능하는 메카니즘은 이중적이어서, 분자가 인간 암종의 표면에 존재하는 세포막 항원과 반응성이고, 또한 항체가 결합 후에 암성 세포 내에 내재화되는 능력을 가져, 이들이 항체-약물 및 항체-독소 컨쥬게이트를 형성하는데 특히 유용하게 된다. 이들의 비개질된 형태에서 항체는 또한 특정 농도에서 세포독성 특성을 명백히 보여 준다.
미국 특허 제 5,780,033 호는 종양 치료요법 및 예방을 위한 자가항체의 사용을 개시한다. 그러나, 상기 항체는 노화된 포유류로부터의 항핵 자가항체이다. 이러한 경우에서, 자가항체는 면역계에서 발견된 자연 항체 중 한 유형인 것으로 언급된다. 자가항체가 "노화된 포유류"로부터 나오기 때문에, 자가항체가 실제로 치료될 환자로부터 나온 것일 필요는 없다. 또한 상기 특허는 노화된 포유류로부터의 자연 및 단일클론 항핵 자가항체, 및 단일클론 항핵 자가항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 개시한다.
미국 특허 출원 20050032128A1 은 당뇨병의 치료용 항-당화 C59 항체의 용도를 개시한다.
발명의 개요
본 출원은 암성 질환 조절 단일클론 항체를 인코딩하는 하이브리도마 세포주를 단리시키기 위한 특허 U.S.6,180,357 에 교시된 항암 항체 제조를 위한 방법론을 이용한다. 이들 항체는 한 종양에 대해 특이적으로 생성될 수 있고, 따라서 암 치료요법의 개별화를 가능하게 한다. 본 출원의 문맥 내에서, 세포-살해 (세포독성) 또는 세포-성장 억제 (세포 증식 억제) 특성을 갖는 항암 항체는 이후 세포 독성으로 언급될 것이다. 이들 항체는 암의 단계화 및 진단을 지원하는데 사용될 수 있으며, 종양 전이를 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 또한 예방적 치료로서 암의 예방에 사용될 수 있다. 전통적인 약물 개발 패러다임에 따라 생성된 항체와는 달리, 이러한 방법으로 생성된 항체는 악성 조직의 성장 및/또는 생존에 필수인 것으로 이전에는 나타나지 않았던 통로 및 분자를 표적화할 수 있다. 더욱이, 이러한 항체의 결합 친화성은 더 강한 친화성 상호작용을 따르지 않을 수 있는 세포독성 사건의 개시를 위한 필요조건에 적합하다. 또한, 이는 표준 화학요법적 양식 (예를 들어, 방사선핵종) 을 본 발명의 CDMAB과 컨쥬게이션하여, 상기 화학요법의 용도에 초점을 맞추는 것도 본 발명의 범위 내에 있다. 상기 CDMAB 는 또한 독소, 세포독성 부분, 효소, 예를 들어 바이오틴 컨쥬게이션된 효소, 시토킨, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분 또는 혈행성 세포와 컨쥬게이션되어, 이로써 항체 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. CDMAB는 단독으로 또는 하나 이상의 CDMAB/화학요법제와 조합으로 사용될 수 있다.
개별화된 항암 치료의 전망은 환자가 관리되는 방식에서의 변화를 초래할 것이다. 있을 법한 임상 시나리오는 종양 시료가 제시되는 시기에 수득되고, 보관되는 것이다. 상기 시료로부터, 미리-존재하는 암성 질환 조절 항체의 패널로부터 종양을 유형화시킬 수 있다. 환자는 통상적으로 단계화되지만, 사용가능한 항체가 환자의 추가적인 단계화에 사용될 수 있다. 환자는 존재하는 항체로 즉시 치료될 수 있고, 이는 종양에 특이적인 항체의 패널이 본원에 개요로 나타낸 방법, 또는 본원에 개시된 스크리닝 방법과 함께 파지 디스플레이 라이브러리의 사용을 통해 생성될 수 있다. 생성된 모든 항체는 항암 항체의 라이브러리에 추가되는데, 이는 다른 종양이 치료되는 종양과 동일한 항원결정기 중 일부를 가질 수 있기 때문이다. 본 방법에 따라 생성된 항체는 이러한 항체에 결합하는 암을 갖는 많은 환자의 암성 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.
항암 항체 이외에, 환자는 치료의 다중양식 요법의 부분으로서 현재 권장된 치료요법을 받을지를 택할 수 있다. 본 방법론을 통해 단리된 항체가 비-암성 세포에 대해 상대적으로 비독성이라는 사실은, 항체의 조합을 높은 용량으로, 단독 또는 통상적인 치료요법과 함께 사용할 수 있게 한다. 높은 치료 지수는 또한 치료 내성 세포의 출현의 가능성이 감소되어야만 하는 단기간의 재치료를 허용하게 한다.
환자가 치료요법의 초기 과정에 대해 불응이거나 전이가 발전된다면, 종양에 대해 특이적인 항체를 생성하는 방법은 재치료를 위해 반복될 수 있다. 더욱이, 항암 항체는 환자로부터 수득한 적혈구에 컨쥬게이션되고 전이 치료를 위해 재융합될 수 있다. 전이성 암에 대한 효과적인 치료는 거의 없는데, 전이는 통상적으로 사망을 일으키는 좋지 않은 결과를 예고한다. 그러나, 전이성 암은 통상적으로 잘 혈관화되고, 적혈구에 의한 항암 항체의 전달은 종양 위치에 항체를 집중시키는 효과를 가질 수 있다. 전이되기 전에도, 대부분의 암 세포는 이의 생존을 위해 숙주의 혈액 공급에 의존하며, 적혈구에 컨쥬게이션된 항암 항체는 원위치 (in situ) 종양에 대해 서로 또한 효과적일 수 있다. 대안적으로는, 항체는 다른 혈행성 세포, 예를 들어 림프구, 대식세포, 단핵구, 자연 살해 세포 등에 컨쥬게이션될 수 있다.
5개 부류의 항체가 존재하며, 각각은 이의 중쇄에 의해 주어지는 기능과 관련된다. 네이키드 항체에 의한 암 세포 살해는 항체 의존성 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 을 통해 매개되는 것으로 통상적으로 고려된다. 예를 들어 쥐과 IgM 및 IgG2a 항체는 보체 시스템의 C-1 성분에 결합하여 인간 보체를 활성화시킬 수 있으며, 따라서 종양 감퇴를 일으킬 수 있는 보체 활성의 기존 통로를 활성화시킬 수 있다. 인간 항체에 대해 가장 효과적인 보체 활성 항체는 일반적으로 IgM 및 IgG1이다. IgG2a 및 IgG3 이소형의 쥐과 항체는 단핵구, 대식세포, 과립구 및 특정 림프구에 의한 세포사를 일으키는 Fc 수용체를 갖는 세포독성 세포를 보강하는데 효과적이다. IgG1 및 IgG3 이소형의 인간 항체는 ADCC를 매개한다.
Fc 영역을 통해 매개된 세포독성은 효과기 세포, 그의 상응하는 수용체 또는 단백질 예를 들어 NK 세포, T-세포 및 보체의 존재를 요구한다. 이러한 효과기 메카니즘의 부재 하에, 항체의 Fc 부위는 불활성이다. 항체의 Fc 부위는 생체 내에서 항체의 약동학에 영향을 주는 특성에 관여할 수 있으나, 시험관 내에서는 작용하지 않는다.
항체 매개된 암 살해의 또 다른 가능한 메카니즘은 세포막 및 이에 결합된 당단백질 또는 당지질에서의 다양한 화학적 결합의 가수분해를 촉진하도록 기능하는 항체, 소위 촉매적 항체의 사용을 통할 수 있다.
항체-매개 암 세포 살해의 세 가지 추가적인 메카니즘이 존재한다. 첫 번째는 암 세포 상의 잔류물인 추정의 항원에 대한 면역 반응을 생성하도록 신체를 유도하기 위한 백신으로서 항체를 사용하는 것이다. 두 번째는 성장 수용체를 표적화하고, 이의 기능으로 방해하거나 수용체를 강하 조절하여 이의 기능이 효과적으로 손실되도록 항체를 사용하는 것이다. 세 번째는 직접적인 세포사를 일으킬 수 있는 세포 표면 부분의 직접 연결 (예컨대 TRAIL R1 또는 TRAIL R2 와 같은 사멸 수용체, 또는 인테그린 분자 예컨대 알파 V 베타 3 등의 연결) 에 대한 이러한 항체의 효과이다.
암 약물의 임상적 이용은 환자에 대한 허용가능한 위험 프로파일 하에 약물의 이점을 기준으로 한다. 암 치료요법에서 생존은 통상적으로 가장 많이 구하는 이점이었지만, 삶을 연장시키는 것에 추가로 다른 잘 인식되는 이점이 많이 존재한다. 치료가 생존에 불리한 영향을 갖지 않는, 이들 다른 이점에는, 증상 완화, 유해 사례에 대한 보호, 재발까지의 시간 또는 무질환 생존 기간의 연장, 및 질병 진행까지의 시간 연장이 포함된다. 이들 기준은 일반적으로 허용되며, 미국 식품 의약품국 (FDA) 과 같은 규제 기관은 이러한 이점을 생성하는 약물을 승인한다 (Hirschfeld et al, Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42:137-143 2002). 이러한 기준 이외에, 이러한 유형의 이점을 예지할 수 있는 다른 결과변수 (endpoint)가 있다는 것이 잘 인식된다. 미국 F.D.A.에 의해 수여된 가속화된 승인 절차는, 환자 이점을 예측할 법한 대리지표가 있다는 것을 일부분 인정한다. 2003년 말 현재, 이러한 절차 하에 16 개의 약물이 승인되었으며, 이들 중, 네 개는 최종 승인으로 넘어갔는데, 즉 잇따른 연구가 대리 결과변수 (surrogate endpoint)에 의해 예측되는 바와 같은 직접적인 환자 이점을 나타내었다. 고체 종양에서 약물 효과를 측정하기 위해 중요한 한 가지 결과변수는 치료에 대한 반응을 측정함으로써 종양 부하량을 평가하는 것이다 (Therasse et al, Journal of the National Cancer Institute 92(3):205-216 2000). 이러한 평가를 위한 임상적 기준 (RECIST 기준) 은 국제 암 전문가 집단인 Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group 에 의해 공표되었다. RECIST 기준에 따른 객관적인 반응에 의해 나타내는 바와 같이, 종양 부하량에 대한 효과가 증명된 약물은, 적절한 대조군과 비교하여 궁극적으로 직접적인 환자 이점을 생성하는 경향이 있다. 전임상 환경에서 종양 부하량은 통상적으로 평가 및 기록하기에 보다 간단하다. 전임상 연구가 임상 환경으로 변형될 수 있는 것에서, 전임상 모델에서 생존을 연장시키는 약물은 최대 예견된 임상 효용을 갖는다. 임상 치료에 대한 긍정적인 반응을 생성하는 것과 유사하게, 전임상 환경에서 종양 부하량을 감소시키는 약물은 또한 질환에 대해 현저한 직접적인 영향을 갖는다. 생존의 연장이 암 약물 치료로부터 가장 많이 구하는 임상 결과이지만, 임상 효용을 갖는 다른 이점이 있으며, 질환 진전에서의 지연과 연관될 수 있는 종양 부하량 감소, 연장된 생존 또는 둘 다가 또한 직접적인 이점을 야기하고, 임상 영향을 가질 수 있다는 것이 명백하다 (Eckhardt et al, Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds; ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003, 209-219 쪽). 각각의 내용이 본원에 첨부로 인용되는 U.S. 6,180,357 의 방법, 및 미국 특허 S.N. 11/361,153 및 S.N. 11/067,366 에 개시된 바와 같은 방법을 실질적으로 사용하여, 인간 난소 종양 조직으로부터의 세포로 마우스를 면역화시켜 마우스 단일클론 항체, AR36A36.11.1 를 수득하였다. AR36A36.11.1 항원은 상이한 조직 기원으로부터의 광범위한 인간 세포주의 세포 표면에서 발현되었다. 난소 암 세포주 Ln Cap 는 AR36A36.11.1 의 시험관 내 세포독성 효과에 대해 민감하였다.
전립선 암 세포에 대한 시험관 내 AR36A36.11.1 세포독성의 결과는 이의 생체 내 항종양 활성을 증명함으로써 보다 연장되었다 (S.N. 11/067,366 호에 개시된 바와 같음). AR36A36.11.1 은 인간 전립선 암의 생체 내 예방적 모델에서 종양 성장을 예방하고 종양 부하량을 감소시켰다. 마지막 치료 투여 후 제 5 일인 이식 후 제 41 일에, AR36A36.11.1 처리군에서의 평균 종양 부피는 완충액 대조군-처리군에서의 종양 부피의 14% 였다 (p=0.0009, t-테스트). PC-3 전립선 암 이종이식 모델에서, 체중은 질환 진행의 대리 지표로서 사용될 수 있다 (Wang et al. Int J Cancer, 2003). 연구의 종료 (41 일) 까지, 대조군 동물은 연구의 시작에서의 체중보다 27% 감소한 것으로 나타났다. 반대로, AR36A36.11.1 로 처리되는 군은 대조군보다 현저히 높은 체중을 갖는다 (p=0.017). 전체적으로, AR36A36.11.1-처리군은 그의 체중의 6 % 만 손실하였고, 완충액 대조군은 27 % 로 훨씬 더 손실하였다. 그러므로, AR36A36.11.1 은 인간 전립선 암 이종이식 모델에서 우수한 내성을 갖고, 종양 부하량 및 악액질을 감소시켰다.
그의 항-전립선 암 효과이외에, AR36A36.11.1 은 예방적 생체 내 종양 모델에서 SW1116 결장암 세포에 대한 항-종양 활성을 증명하였다 (S.N. 11/067,366 에 개시된 바와 같음). 마지막 처리 투여 후 제 5 일인, 이식 후 제 55 일에, AR36A36.11.1-처리군에서의 평균 종양 부피는 완충액 대조군-처리군에서의 종양 부피의 51 % 였다 (p=0.0055, t-테스트). 연구 전체를 통해 독성의 임상 징후는 없었다. 1 주 간격으로 측정된 체중은 웰-빙 및 성장 실패의 대리 지표였다. 처리 기간의 말미에서 군들 간의 체중의 현저한 차이는 없었다 (p=0.4409, t-테스트). 그러므로, AR36A36.11.1 은 인간 결장암 이종이식 모델에서 우수한 내성을 갖고, 종양 부하량을 감소시켰다.
더욱이, AR36A36.11.1 는 예방적 생체 내 종양 모델에서 MDA-MB-231 유방암에 대한 항-종양 활성을 증명하였다 (S.N. 11/067,366 에 개시된 바와 같음). AR36A36.11.1 은 종양 성장을 완전히 예방하고, 종양 부하량을 감소시켰다. 마지막 처리 투여 후 제 6 일인, 이식 후 제 56 일에, AR36A36.11.1 처리군에서의 평균 종양 부피는 이소형 대조군-처리군에서의 종양 부피의 0 % 였다 (p=0.0002, t-테스트). 연구 전체에 걸쳐 독성의 임상 징후는 없었다. 1 주 간격으로 측정된 체중은 웰-빙 및 성장 실패의 대리지표였다. 처리 기간의 종료에서 군들 간의 체중의 현저한 차이는 없었다 (p=0.0676, t-테스트). 그러므로, AR36A36.11.1 은 인간 유방암 이종이식 모델에서 우수한 내성을 갖고, 종양 부하량을 감소시켰다.
또한, AR36A36.11.1 은 확정된 생체 내 종양 모델에서 MDA-MB-231 유방암에 대한 항-종양 활성을 증명하였다 (S.N. 11/067,366 에 개시된 바와 같음). AR36A36.11.1 은 인간 유방암의 확정된 생체 내 모델에서 종양 성장을 예방하고, 종양 부하량을 감소시켰다. 마지막 처리 투여 후 제 2 일인, 이식 후 제 83 일에, AR36A36.11.1-처리군에서의 평균 종양 부피는 완충액 대조군-처리군에서의 종양 부피의 46 % 였다 (p=0.0038, t-테스트). 이는 32 % 의 평균 T/C 에 해당한다. 연구 전체에 걸쳐 독성의 임상 징후는 없었다. 1 주 간격으로 측정된 체중은 웰-빙 및 성장 실패의 대리지표였다. 처리 기간의 종료에서 군들 간의 체중의 현저한 차이는 없었다 (p=0.6493, t-테스트).
처리의 장점이 사람을 포함하는 다른 포유류의 치료요법에 대한 상기 항체의 약리학적 및 약학적 이점 제안하는 인간 암성 질환의 몇몇 잘-인지된 모델에서 관찰되었다. 전체에서, 상기 데이타는 AR36A36.11.1 항원이 암 관련 항원이고, 임간 암 세포에 대해 발현되고, 병리학적으로 관련된 암 표적이라는 것을 증명하였다.
상기 개시된 바와 같이 (S.N. 11/361,153), 생화학적 데이타는 AR36A36.11.1 에 의해 인지된 항원이 CD59 라는 것을 나타냈다. 이는 면역침전에 의해 AR36A36.11.1 에 결합하는 단백질을 확인하는 CD59 에 대해 반응성인 단일클론 항체 (clone MEM-43, Serotec, Raleigh, NC) 를 나타내는 연구에 의해 지지되었다. AR36A36.11.1 항원결정기는 탄수화물 의존성인 것으로 나타나지는 않는다.
약물 표적으로서 AR36A36.11.1 항원결정기를 확인하기 위해, 정상 인간 조직 부분에서의 AR36A36.11.1 항원의 발현을 사전에 측정하였다 (S.N. 11/361,153 에 개시된 바와 같음). 59 정상 인간 조직에 대한 항체의 결합을 인간 정상 기관 조직 배열 (Imgenex, San Diego, CA) 을 사용하여 수행하였다. AR36A36.11.1 항체는 상피 조직(다양한 기관의 혈관의 내피, 피부 및 편도의 편평 상피, 유방의 수출 상피, 코 점막 상피, 침샘의 샘꽈리 및 도관 상피, 간의 담관 상피, 이자의 샘꽈리 상피 및 랑게한스섬, 방광의 점막 상피 및 전립선의 샘 상피) 에 주로 결합된다. AR36A36.11.1 항체는 항-CD59 항체로 상기 보고된 것으로 구성된 인간 조직에 대한 결합을 증명하였다.
AR36A36.11.1 의 가능성 있는 치료학적 이점을 추가로 확대하기 위해, 다양한 인간 암 조직 내의 항원의 빈도 및 국소화를 또한 측정할 수 있다 (S.N. 11/361,153 에 앞서 개시된 바와 같음). AR36A36.11.1 항체는 시험된 종양의 17/54 (32 %) 로 결합하였다. 상기 항체는 강하게는 2/17 종양, 적당히 2/17, 약하게 4/17, 애매하게는 9/17 가 결합하였다. 조직 특이성은 종양 세포 및 기질 혈관에 대한 것이다. 세포의 국소화는 확산된 얼룰 패턴을 갖는 막양세포성이다. 그러므로, AR36A36.11 항원은 다양한 종양 유형의 막에 위치하는 것으로 증명되었다. 이러한 결과는 AR36A36.11.1 항체가 피부, 간 및 이자의 암을 포함하나 그에만 제한되지 않는, 광범위한 암에서의 치료학적 약물로서 가능성을 갖는다는 것을 나타낸다.
본 발명은 AR36A36.11.1, 키메라 AR36A36.11.1 ((ch)AR36A36.11.1) 및 인간화 변이체 (hu)AR36A36.11.1 의 개발 및 용도를 기술한다. AR36A36.11.1 는 세포독성 분석, 및 동물 모델의 비-확정된 및 확정된 종양 성장에서의 이의 효과에 의해 확인되었다. 본 발명은 암 치료 분야에서 진보성을 나타내며, 이는 처음으로, 표적 분자에 존재하는 항원결정기 또는 항원결정기들에 특이적으로 결합하는 시약을 기술하고, 이는 또한 네이키드 항체로서 악성 종양 세포에 대해 (정상 세포에 대한 것은 아님) 시험관 내 세포독성 특성을 가지며, 이는 또한 네이키드 항체로서 인간 암의 생체 내 모델에서 종양 성장의 억제 및 생존의 연장을 직접적으로 매개한다. 유사한 특성을 갖는 것으로 나타나지 않았기 때문에, 이는 상기 기재된 임의의 다른 항-CD59 항체와 비교하여 진보된 것이다. 이는 또한 상기 분야에서의 진보성을 제공하는데, 이는 특정 유형의 종양의 성장 및 발달과 관련된 사건에서의 CD59 의 직접적 관여를 처음으로 명백히 증명하였기 때문이다. 이는 또한 암 치료요법에서 진보성을 나타내는데, 이는 인간 환자에서 유사한 항암 특성을 나타낼 가능성을 가지기 때문이다. 추가적인 진보는, 항암 항체의 라이브러리에 이러한 항체가 포함되는 것이, 종양의 성장 및 발달을 표적화하고 억제하는데 있어서 가장 효과적인 것을 발견하기 위해, 상이한 항암 항체의 적절한 조합을 결정하여 상이한 항원 표지자를 발현하는 종양을 표적화할 가능성을 개선시킬 것이라는 것이다.
모두에서, 본 발명은 치료제용 표적으로서 AR36A36.11.1 항원의 용도를 교시하는데, 이는 투여되는 경우 포유류에서 항원을 발현하는 암의 종양 부하량을 감소시킬 수 있고, 또한 치료된 포유류의 생존 연장을 야기할 수 있다. 본 발명은 또한, 포유류에서 항원을 발현하는 암의 종양 부하량을 감소시키고, 치료된 포유류의 생존을 연장시키도록 그의 항원을 표적하기 위한, CDMAB (AR36A36.11.1, (ch)AR36A36.11.1 및 인간화 변이체, (hu)AR36A36.11.1) 및 그의 유도체, 및 그의 항원 결합 절편, 및 그의 리간드를 유도하는 세포 독성의 용도를 교시한다. 더욱이, 본 발명은 또한 진단, 치료요법의 진단 예측, 및 상기 항원을 발현하는 종양을 갖는 포유류의 예후를 위해 유용할 수 있는 암성 세포에서 AR36A36.11.1 항원을 검출하는 용도를 교시한다.
따라서, 본 발명의 목적은 하이브리도마 세포주 및 상기 하이브리도마 세포주를 인코딩하는 상응하는 단리된 단일클론 항체 및 그의 항원 결합 절편을 단리시키기 위해, 특정 개체, 또는 하나 이상의 특정 암 세포주로부터 유래된 암성 세포에 대해 야기된 암성 질환 조절 항체 (CDMAB) 를 생성하는 방법을 이용하는 것이며, 여기서 CDMAB 는 암 세포에 대해서는 세포독성이면서 동시에 비-암성 세포에 대해서는 상대적으로 비독성이다.
본 발명의 추가적인 목적은 암성 질환 조절 항체, 그의 리간드 및 항원 결합 절편을 교시하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목적은 항체 의존성 세포독성을 통해 매개되는 세포독성을 갖는 암성 질환 조절 항체를 생성하는 것이다.
본 발명의 다른 추가적인 목적은 보체 의존성 세포독성을 통해 매개되는 세포독성을 갖는 암성 질환 조절 항체를 생성하는 것이다.
본 발명의 더욱 추가적인 목적은 세포 화학 결합의 가수분해를 촉진시키는 그의 능력의 기능으로 세포독성을 갖는 암성 질환 조절 항체를 생성하는 것이다.
본 발명의 훨씬 추가적인 목적은 암의 진단, 예후 및 모니터링을 위한 결합 분석에 유용한 암성 질환 조절 항체를 생성하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 본 발명의 도시 및 실시예, 특정 구현예에 의해 설명되는 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
발명의 상세한 설명
일반적으로, 하기의 단어 또는 구절은 본 개요, 상세한 설명, 실시예 및 청구항에 사용되는 경우 하기에 나타낸 정의를 갖는다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는, 예를 들어, 단독 단일클론 항체 (작용제, 길항제, 및 중화 항체, 탈-면역화, 쥐과, 키메라 또는 인간화 항체 포함), 폴리항원결정성 특이성 (polyepitopic specificity) 을 갖는 항체 조성물, 단쇄 항체, 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 면역컨쥬게이트 및 항체 절편을 포함한다 (하기 참조).
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 상동성인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 언급한다, 즉 상기 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 매우 특이적이며, 단독 항원 부위에 대해 유도된다. 더욱이, 상이한 결정자 (항원결정기) 에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와는 반대로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 유도된다. 그의 특이성 이외에, 상기 단일클론 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "단일클론" 은 실질적으로 상동성인 항체의 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특징을 나타내는 것이고, 임의의 특정 방법에 의한 상기 항체의 제조를 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 문헌 [Kohler et al, Nature, 256:495 (1975)] 에 최초 기재된 하이브리도마 (쥐과 또는 인간) 방법에 의해 제조될 수 있고, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 생성될 수도 있다 (예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호 참조). "단일클론 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 [Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)] 에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
"항체 절편" 은 비손상 (intact) 바람직하게는 이의 항원-결합 또는 가변 부위를 포함하는 항체의 일부분을 포함한다. 항체 절편의 예는 전장 (full length) 보다 짧은 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 절편들; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 단쇄 항체; 단일 도메인 항체 분자, 융합 단백질, 재조합 단백질 및 항체 절편(들)으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
"비손상" 항체는 항원-결합 가변 영역 뿐 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3 을 포함하는 것이다. 상기 불변 도메인은 본래 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 본래 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열의 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 비손상 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 갖는다.
그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 비손상 항체는 상이한 "부류"로 할당될 수 있다. 비손상 항체에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 의 5가지 주요 부류가 있으며, 이들 중 몇몇은 "하위부류" (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2 로 추가적으로 나뉠 수 있다. 상이한 항체 부류들에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 불린다. 상이한 면역글로불린 부류의 아단위 (subunit) 구조 및 3차원 형상은 잘 공지되어 있다.
항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역 (본래 서열의 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이의 Fc 부위) 에 기인할 수 있는 생물학적 활성인 것을 언급한다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 대식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR) 의 하향 조절 등을 포함한다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는, Fc 수용체 (FcR) 를 발현시키는 비특이적 세포독성 세포 (예컨대 자연 살해 (NK) 세포, 중성구 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인지한 다음, 상기 표적 세포의 용해를 일으키는, 세포-매개 반응을 언급한다. ADCC 를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현시키는는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 을 발현시킨다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch 및 Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)] 의 464 쪽의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제 5,500,362 호 또는 제 5,821,337 호에 기재된 것과 같은 시험관 내 ADCC 분석을 수행할 수도 있다. 상기 분석에 유용한 효과기 세포에는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포가 포함된다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성을 생체 내 예를 들어 문헌 [Clynes et al, PNAS (USA) 95:652-656 (1998)] 에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"효과기 세포" 는 하나 이상의 FcR 을 발현시키고, 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 상기 세포는 적어도 FcγRIII 를 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC 를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 중성구를 포함하며; PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 그의 본래 원천으로부터, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 혈액 또는 PBMC 로부터 단리될 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR" 은 항체의 Fc 부위에 결합하는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR 은 본래 서열의 인간 FcR 이다. 또한, 바람직한 FcR 은 IgG 항체 (감마 수용체) 에 결합하는 것이고, 이에는 대립유전자 변이체 및 이러한 수용체의 대안적 스플라이싱 (alternatively spliced) 형태를 포함하는, FcγRI, FcγRII 및 Fcγ RIII 하위부류의 수용체가 포함된다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체") 를 포함하며, 이는 그의 세포질 영역이 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체인 FcγRIIA 는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM) 를 포함한다. 저해 수용체인 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM) 를 포함한다 (M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) 참조). FcR 은 하기에 개관되어 있다: 문헌 [Ravetch 및 Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel et al, Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]. 미래에 확인될 것들을 포함하는, 다른 FcR 도 본원에서 용어 "FcR" 에 포함된다. 상기 용어는 또한, 모체 IgG 의 태아로의 전달을 담당하는 신생아 수용체인 FcRn 을 포함한다 (Guyer et al, J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al, Eur. J. Immunol. 24:2429 (1994)).
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적을 용해할 수 있는 분자의 능력을 언급한다. 보체 활성화 통로는 보체계의 제 1 성분 (C1q)이 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예를 들어, 항체) 에 결합하여 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)] 에 기재ehlsms 것과 같은, CDC 분석을 수행할 수 있다.
용어 "가변" 은, 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 간의 서열에서 광범위하게 상이하고, 그의 특정 항체에 대한 각 특정 항원체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 언급한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 고르게 분포하지는 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에 존재하는 과가변 (hypervariable) 영역으로 불리는 3 개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인에서 더욱 많이 보존된 부분은 구조형성 영역 (framework region, FR) 으로 불린다. 본래 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4 개의 FR 을 포함하는데, 이들은 주로 3 개의 과가변 영역으로 연결된 β-시트 배열을 취하며, 상기 과가변 영역들은 상기 β-시트 구조를 연결하는, 일부 경우에는 상기 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 사슬 내의 과가변 영역은 상기 FR에 의해 서로 아주 근접하게 결합되어 있고, 다른 쇄로부터의 과가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 영역의 형성에 기여한다 (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5 판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. pp 15-17; 48-53 (1991) 참조). 상기 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는데 있어서 직접적으로 관여하는 것은 아니나, 항체 의존성 세포독성 (ADCC) 에서 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다.
본원에서 사용되는 경우의 용어 "과가변 영역"는 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 과가변 영역은 통상적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 영역에서 잔기 24~34 (L1), 50~56 (L2) 및 89~97 (L3) 및 중쇄 가변 영역에서 31~35 (H1), 50~65 (H2) 및 95~102 (H3); Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "과가변 루프" 로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 영역에서 잔기 26~32 (L1), 50~52 (L2) 및 91~96 (L3) 및 중쇄 가변 영역에서 26~32 (H1), 53~55 (H2) 및 96~101 (H3); Chothia 및 Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) 를 포함한다. "구조형성 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의되는 바와 같은 과가변 영역 잔기가 아닌 가변 도메인 잔기이다. 항체를 파파인으로 절단하면, "Fab" 절편으로 불리는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2 개의 동일한 항원-결합 절편과, 쉽게 결정화하는 그의 능력이 명칭에 반영된 잔류 "Fc" 절편이 생성된다. 펩신 처리에 의해서는, 2개의 항원-결합 위치를 가지며 여전히 항원과 가교결합할 수 있는 F(ab')2 절편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부휘를 포함하는 최소 항체 절편이다. 상기 영역은 강한 비공유 결합 상태로 있는 1 개의 중쇄 및 1 개의 경쇄 가변 영역의 이량체로 이루어진다. 이러한 배열로, 각 가변 영역의 3 개의 과가변 부위는 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원-결합 위치를 정의한다. 집합적으로, 6개의 과가변 부위는 해당 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일의 가변 영역 (또는 항원에 특이적인 3 개의 과가변 부위만을 포함하는 Fv 의 절반) 이라도, 전체 결합 부위보다 친화력이 덜하긴 하지만, 항원을 인지하고 그에 결합하는 능력을 갖는다. Fab 절편은 또한 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 제 1 불변 영역 (CH1) 을 포함한다. Fab' 절편은 중쇄 CH1 영역의 카르복시 말단에서 항체 힌지 (hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 수 개의 잔기가 추가된 점에서 Fab 절편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 영역의 시스테인 잔기(들) 가 하나 이상의 유리 티올기를 갖는 Fab'를 나타낸다. F(ab')2 항체 절편은 원래 그들 사이에 힌지 시스테인이 존재하는 Fab' 절편의 쌍으로 생성된다. 항체 절편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물종로부터의 항체의 "경쇄" 는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ) 로 언급되는 두 개의 명확히 구분되는 유형 중 하나로 분류될 수 있다.
"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 절편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이러한 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 바람직하게는 Fv 폴리펩티드는 scFv 가 항원 결합을 위해 목적한 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 연결자를 VH 및 VL 도메인 사이에 추가로 포함한다. scFv 의 재고를 위해, [Pluckthunin, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)] 를 참조한다.
용어 "디아바디 (diabody)" 는 두 개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 절편을 언급하고, 상기 절편은 동일 폴리펩티드 쇄 (VH-VL) 에 가변 경쇄 도메인 (VL) 에 연결되어 있는 가변 중쇄 도메인 (VH) 을 포함한다. 너무 짧아서 동일한 쇄에서 상기 두 개의 도메인들 간의 쌍 형성 (pairing) 을 허용하지 않는 연결자를 사용하여 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루고, 두 개의 항원-결합 부위의 생성을 촉진한다. 디아바디는 예를 들어, [EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:6444-6448 (1993)] 에 더 상세히 기술되어 있다.
용어 "트리아바디" 또는 "3가 삼량체" 는 세 개의 단일 쇄 항체의 조합을 언급한다. 트리아바디는 임의의 연결자 서열이 없는 VL 또는 VH 도메인의 아미노산 말단으로 구성된다. 트리아바디는 시클릭, 헤드-투-테일 (head-to-tail) 방식으로 배열된 폴리펩티드를 갖는 세 개의 Fv 헤드를 갖는다. 트리아바디의 가능한 형태는 서로 120°의 각도로 한 면에 위치한 3 개의 결합 부위를 갖는 평면이다. 트리아바디은 일특이성, 이특이성 또는 삼특이성일 수 있다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수되는 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 상기 항체의 진단적 또는 치료적 사용을 방해하는 물질이고, 이는 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 원위치에 항체를 포함하는데, 이는 상기 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 수 있다.
관심 항원, 예를 들어, CD59 항원을 "결합하는" 항체는, 항체가 상기 항원을 발현시키는 세포를 표적화하여 치료제 또는 진단제로서 유용하도록 충분한 친화도를 갖는 항원에 결합할 수 있는 것이다. 상기 항체가 CD59 를 결합하는 경우, 이는 통상적으로 바람직하게는 다른 수용체에 반대되는 것으로서, CD59 를 결합할 것이고, 비-특이적 Fc 접촉과 같은 우연한 결합 또는 다른 항원에 공통인 번역-후 변형 부분에 대한 결합은 포함하지 않으며, 이는 다른 단백질과 유의미한 교차-반응을 하지 않는 것일 수 있다. 관심 항원을 결합하는 항체를 검출하기 위한 방법이 당업계에 잘 알려져 있고, FACS, 세포 ELISA 및 웨스턴 블롯과 같은 검정법을 포함할 수 있으나, 그에만 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양" 은 상호교환가능하게 사용되고, 모든 상기 표기는 자손을 포함한다. 또한 모든 자손은 인위적이거나 비인위적 돌연변이로 인해, DNA 내용이 정밀하게는 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 최초 변형 세포에서 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다. 각각의 표기가 의도하는 바는 문맥으로부터 명확해 질 것이다.
"치료 또는 치료하는" 은 치료적 치료 및 예방적 조치를 모두 언급하고, 그의 목적은 표적 병리학적 상태 또는 장애를 방지 또는 지연 (경감) 시키는 것이다. 치료를 필요로하는 자는 이미 상기 장애를 갖는 자들뿐만 아니라 장애를 가지기 쉬운 자 또는 상기 장애가 예방되어야 할 자들을 포함한다. 그러므로, 본원에서 치료될 포유류는 상기 장애를 갖는 것으로 진단되거나 장애에 걸리기 쉽거나 장애를 가질 여지가 있는 것 일 수 있다.
용어 "암" 및 "암성" 은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장 또는 죽음을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 상태를 언급 또는 기술한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 악성 림프종을 포함하나, 그에만 제한되는 것은 아니다. 상기 암의 더욱 특정한 예는 편평 세포 암 (예를 들어, 상피 편평 세포 암), 소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암 및 폐의 편평 암종을 포함하는 폐암, 복막암, 간세포암, 위장관 암을 포함하는 위 (gastric 또는 stomach) 암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포 선종 (hepatoma), 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종뿐만 아니라 두부 및 경부암을 포함한다.
"화학요법제" 는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 (thiotepa) 및 시클로포스파미드 (CYTOXANTM); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판 (busulfan), 임프로술판 (improsulfan) 및 피포술판 (piposulfan); 아지리딘, 예컨대 벤조도파 (benzodopa), 카르보쿠온 (carboquone), 메투레도파 (meturedopa) 및 우레도파 (uredopa); 알트레타민 (altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민 (trimethylolomelamine) 을 포함하는 메틸멜라민 (methylmelamine) 및 에틸렌이민; 질소 머스터드, 예컨대 클로람부실 (chlorambucil), 클로르나파진 (chlornaphazine), 콜로포스파미드 (cholophosphamide), 에스트라무스틴 (estramustine), 이포스파미드 (ifosfamide), 메클로레타민 (mechlorethamine), 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란 (melphalan), 노벰비킨 (novembichin), 페네스테린 (phenesterine), 프레드니무스틴 (prednimustine), 트로포스파미드 (trofosfamide), 우라실 머스타드 (uracil mustard); 니트로스우레아 (nitrosurea), 예컨대 카르무스틴 (carmustine), 클로로조토신 (chlorozotocin), 포테무스틴 (fotemustine), 로무스틴 (lomustine), 니무스틴 (nimustine), 라니무스틴 (ranimustine); 항생제, 예컨대 아클라시노마이신 (aclacinomycin), 악티노마이신 (actinomycin), 아우라마이신 (authramycin), 아자세린 (azaserine), 블레오마이신 (bleomycin), 칵티노마이신 (cactinomycin), 칼리케아미신 (calicheamicin), 카라비신 (carabicin), 카르노마이신 (carnomycin), 카르지노필린 (carzinophilin), 크로모마이신 (chromomycin), 닥티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 데토루비신 (detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르루신, 독소루비신, 에피루비신 (epirubicin), 에소루비신 (esorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 마르셀로마이신 (marcellomycin), 미토마이신 (mitomycin), 마이코페놀산 (mycophenolic acid), 노갈라마이신 (nogalamycin), 올리보마이신 (olivomycin), 페플로마이신 (peplomycin), 포트피로마이신 (potfiromycin), 푸로마이신 (puromycin), 쿠엘라마이신 (quelamycin), 로도루비신 (rodorubicin), 스트렙토니그린 (streptonigrin), 스트렙토조신 (streptozocin), 투베르시딘 (tubercidin), 우베니멕스 (ubenimex), 지노스타틴 (zinostatin), 조루비신 (zorubicin); 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 (methotrexate) 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린 (denopterin), 메토트렉세이트, 프테로프테린 (pteropterin), 트리메트렉세이트 (trimetrexate); 푸린 유사체, 예컨대 플루다라빈 (fludarabine), 6-메르캅토푸린, 티아미프린 (thiamiprine), 티오구아닌 (thioguanine); 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈 (ancitabine), 아자시티딘 (azacitidine), 6-아자우리딘 (6-azauridine), 카르모푸르 (carmofur), 시타라빈 (cytarabine), 디데옥시우리딘 (dideoxyuridine), 독시플루리딘 (doxifluridine), 에노시타빈 (enocitabine), 플록수리딘 (floxuridine), 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론 (calusterone), 드로모스타놀론 프로피오네이트 (dromostanolone propionate), 에피티오스탄올 (epitiostanol), 메피티오스탄 (mepitiostane), 테스토락톤 (testolactone); 항-부신제 (anti-adrenal), 예컨대 아미노글루테트이미드 (aminoglutethimide), 미토탄 (mitotane), 트리로스탄 (trilostane); 엽산 보충물, 예컨대 프롤린산 (frolinic acid); 아세글라톤 (aceglatone); 알도포스파미드 글리코시드 (aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산 (aminolevulinic acid); 암사크린 (amsacrine); 베스트라부실 (bestrabucil); 비산트렌 (bisantrene); 에다트락세이트 (edatraxate); 데포파민 (defofamine); 데메콜신 (demecolcine); 디아지쿠온 (diaziquone); 엘포르미틴 (elformithine); 엘리프티늄 아세테이트 (elliptinium acetate); 에토글루시드 (etoglucid); 갈륨 니트레이트 (gallium nitrate); 히드록시우레아; 렌티난 (lentinan); 로니다민 (lonidamine); 미토구아존 (mitoguazone); 미토잔트론 (mitoxantrone); 모피다몰 (mopidamol); 니트라크린 (nitracrine); 펜토스타틴 (pentostatin); 페나메트 (phenamet); 피라루비신 (pirarubicin); 포도필린산 (podophyllinic acid); 2-에틸히드라지드 (2-ethylhydrazide); 프로카르바진 (procarbazine); PSK®; 라족산 (razoxane); 시조피란 (sizofiran); 스피로게르마늄 (spirogermanium); 테누아존산 (tenuazonic acid); 트리아지쿠온 (triaziquone); 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 우레탄 (urethan); 빈데신 (vindesine); 다카르바진 (dacarbazine); 만노무스틴 (mannomustine); 미토브로니톨 (mitobronitol); 미토락톨 (mitolactol); 피포브로만 (pipobroman); 가시토신 (gacytosine); 아라비노시드 (arabinoside) ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁산 (taxane), 예를 들어, 파클리탁셀 (paclitaxel) (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀 (docetaxel) (TAXOTERE®, Aventis, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈 (gemcitabine); 6-티오구아닌; 메르캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 (cisplatin) 및 카르보플라틴 (carboplatin); 빈블라스틴 (vinblastine); 백금; 에토포시드 (etoposide) (VP-16); 이포스파미드 (ifosfamide); 미토마이신 C (mitomycin C); 미토잔트론; 빈크리스틴 (vincristine); 비노렐빈 (vinorelbine); 나벨빈 (navelbine); 노반트론 (novantrone); 테니포시드 (teniposide); 다우노마이신 (daunomycin); 아미노프테린 (aminopterin); 젤로다 (xeloda); 이반드로네이트 (ibandronate); CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신 (esperamicin); 카페시타빈 (capecitabine); 및 그의 임의의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한 상기 정의는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하기 위해 작용하는 항-호르몬제, 예컨대, 예를 들어 타목시펜 (tamoxifen), 랄록시펜 (raloxifene), 아로마타제 (aromatase) 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜 (trioxifene), 케옥시펜 (keoxifene), LY117018, 오나프리스톤 (onapristone) 및 토레미펜 (toremifene) (Fareston) 을 포함하는 항-에스트로겐; 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드 (flutamide), 닐루타미드 (nilutamide), 비카루타미드 (bicalutamide), 루프롤리드 (leuprolide), 및 고세렐린 (goserelin); 및 그의 임의의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
치료를 목적으로 하는 "포유류" 는 인간, 마우스, SCID 또는 누드 마우스 또는 마우스 변종, 가축 및 사육 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완용 동물, 예컨대, 양, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는, 포유류로 분류되는 임의의 동물을 언급한다. 바람직하게는, 본원에서 포유류는 인간이다.
"올리고뉴클레오티드" 는 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성되는 짧은 길이의 단일- 또는 이중-가닥 폴리데옥시뉴클레오티드이다 (예컨대, 1988 년 5 월 4 일에 공개된 EP 266,032 에 기술된 것과 같은 고체상 기술을 사용하거나 [Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14:5399-5407, 1986] 에 기술된 바와 같은 데옥시뉴클레오시드 H-포스포네이트 중간체를 통한, 포스포트리에스테르, 포스파이트 또는 포스포라미다이트 화학). 그 다음, 이들은 폴리아크릴아미드 겔에서 정제된다.
본 발명에 따르면, 비-인간 (예를 들어, 쥐과) 면역글로불린의 "인간화" 및/또는 "키메라" 형태는 원래 항체와 비교하여, 인간 항-마우스 항체 (HAMA), 인간 항-키메라 항체 (HACA) 또는 인간 항-인간 항체 (HAHA) 반응을 감소시키는, 특이적 키메라 면역글로불린, 그의 면역글로불린 쇄 또는 절편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열) 을 함유하고, 목적한 효과를 재현하는데 필요한 상기 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 필수 부분 (예를 들어, CDR(들), 항원 결합 영역(들), 가변 도메인(들) 등) 을 포함하는 한편, 동시에 상기 비-인간 면역글로불린에 필적할만한 결합 특성을 보유하는 항체에 관한 것이다. 대부분의 인간화 항체는 수용자 항체의 상보성 결정 영역 (CDR) 의 잔기가 목적한 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체) 예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR 의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린 (수용체 항체) 이다. 일부 경우에서, 인간 면역글로불린의 Fv 구조형성 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 FR 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 상기 인간화 항체는 수용자 항체 또는 이입된 CDR 또는 FR 서열에서 모두 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 항체 성능을 추가로 정련하고 최적화하기 위해 이러한 변형이 수행된다. 통상적으로, 인간화 항체는 실질적으로 하나 이상, 통상적으로는 두 개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 해당하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기는 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 상기 인간화 항체는 최적으로는 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 통상적으로는 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 것이다.
"탈면역화된" 항체는 주어진 종에 대해 비-면역원성 또는 덜 면역원성인 면역글로불린이다. 탈-면역화는 상기 항체에 대해 구조적 변경을 가하여 달성될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 탈-면역화 기술이 사용될 수 있다. 항체를 탈-면역화하는 적합한 기술 중 하나가 예를 들어, 2000 년 6 월 15 일에 공개된 WO 00/34317 에 기술되어 있다.
"세포사멸" 을 유도하는 항체는 아넥신 V 의 결합, 카스파제 활성, DNA 의 절편화, 세포 수축, 소포체 확장, 세포 절편화 및/또는 막 소포 (사멸세포체로 언급됨) 의 형성에 의해 예시되나 그에만 제한되는 것은 아닌, 임의의 수단에 의해 예정된 세포 죽음을 유도하는 것이다.
본원에서 사용되는 "항체 유도 세포독성" 은 하이브리도마 상청액 또는 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 항체, 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 인간화 항체, 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 키메라 항체, 항원 결합 절편 또는 그의 항체 리간드로부터 유래된 세포독성 효과를 의미하는 것으로 이해되며, 상기 효과는 반드시 결합 정도에 관련되는 것은 아니다.
본 명세서를 통해, 하이브리도마 세포주뿐만 아니라 그들로부터 생생되는 단리된 단일클론 항체는 대안적으로 그의 내부적 표시인, AR36A36.11.1 (쥐과), (ch)AR36A36.11.1 (키메라), (hu)AR36A36.11.1 (인간화) 또는 기탁 표기, IDAC 280104-02 로 언급된다.
본원에서 사용되는 "항체-리간드" 는 표적 항원의 하나 이상의 항원결정기에 대한 결합 특이성을 나타내는 부분을 포함하고, 이는 IDAC 280104-02 (IDAC 280104-02 항원) 로 표기된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체, 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 인간화 항체, 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 키메라 항체 및 항원 결합 절편에 의해 결합된 항원의 하나 이상의 항원결정기를 특이적으로 인지 또는 결합하는, 비손상 항체 분자, 항체 절편 및 적어도 항원-결합 영역 또는 그의 일부 (즉, 항체 분자의 가변 부분) 를 갖는 임의의 분자, 예를 들어, Fv 분자, Fab 분자, Fab' 분자, F(ab')2 분자, 이특이적 항체, 융합 단백질 또는 임의의 유전적으로 조작된 분자일 수 있다.
본원에서 사용되는 "암성 질환 조절 항체" (CDMAB) 는 환자에게 유리한 방식으로, 예를 들어, 종양 부하량을 감소시키거나 종양을 가진 개체의 생존을 연장시켜 암성 질환 과정을 조절하는 단일클론 항체 및 그의 항체-리간드를 언급한다.
넓은 의미로 "CDMAB 관련 결합제" 는 임의의 형태의 인간 또는 비-인간 항체, 항체 절편, 항체 리간드 등을 포함하나 그에만 제한되는 것으로 이해되며, 하나 이상의 CDMAB 표적 항원결정기에 경쟁적으로 결합한다.
"경쟁적 결합제" 는 하나 이상의 CDMAB 표적 항원결정기에 대한 결합 친화도를 갖는 임의의 형태의 인간 또는 비-인간 항체, 항체 절편, 항체 리간드 등을 포함하는 것으로 이해된다.
치료될 종양은 일차 종양 및 전이 종양뿐만 아니라 불응성 종양을 포함한다. 불응성 종양은 화학요법제 단독으로, 항체 단독으로, 조사 (radiation) 단독으로 또는 그의 조합으로의 치료에 대해 반응하지 않거나 내성인 종양을 포함한다. 불응성 종양은 또한 상기 제제로의 치료에 의해 억제되나, 치료의 중단 후 5 년, 때로는 10 년 이상의 기간 내에 재발하는 것으로 나타나는 종양을 포함한다.
치료될 수 있는 종양은 혈관에 분포되지 않거나 아직 실질적으로 혈관에 분포되지 않은 종양뿐만 아니라 혈관에 분포된 종양을 포함한다. 따라서 치료될 수 있는 고체 종양의 예는 유방암종, 폐암종, 결장직장 암종, 이자 암종, 신경아교종 및 림프종을 포함한다. 상기 종양의 일부 예는 표피양 종양, 편평 종양, 예컨대, 두부 및 경부 종양, 직장결정 종양, 전립선 종양, 유방 종양, 소세포 및 비-소세포 폐 종양을 포함하는 폐 종양, 이자 종양, 갑상선 종양, 난소 종양 및 간 종양을 포함한다. 다른 예는 카포시 육종, CNS 종양, 신경모세포종, 모세 혈관모세포종, 수막종 및 뇌전이, 흑색종, 위장 및 신장 암종 및 육종, 횡문근육종, 교모세포종, 바람직하게는 교모세포종 홍반 및 평활근육종을 포함한다.
본원에서 사용되는 "항원-결합 영역" 은 표적 항원을 인지하는 분자의 일부를 의미한다.
본원에서 사용되는 "경쟁적으로 억제함" 은 IDAC 280104-02 (IDAC 280104-02 항체) 로 표기된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단일클론 항체, 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 인간화 항체, 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 키메라 항체, 항원 결합 절편 또는 그의 항체 리간드에 대한 부위를 인지 또는 결합할 수 있음을 의미하고, 이는 통상의 상반된 항체 경쟁 반응을 사용하여 유도된다 (Belanger L., Sylvestre C. and Dufour D. (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta 48, 15).
본원에서 사용되는 "표적 항원" 은 IDAC 280104-02 항원 또는 그의 일부이다.
본원에서 사용되는 "면역컨쥬게이트" 는 임의의 분자 또는 CDMAB, 예컨대, 세포독소, 방사성 제제, 시토킨, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분, 효소, 독소, 항-종양 약물 또는 치료제에 화학적 또는 생물학적으로 결합된 항체를 의미한다. 상기 항체 또는 CDMAB 는 그것이 그의 표적에 결합될 수 있는 한, 상기 분자의 임의의 위치에서 세포독소, 방사성 제제, 시토킨, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분, 효소, 독소, 항-종양 약물 또는 치료제에 결합될 수 있다. 면역컨쥬게이트의 예는 항체 독소 화학적 컨쥬게이트 및 항체-독소 융합 단백질을 포함한다.
항-종양제로 사용하기에 적합한 방사성 제제가 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 131I 또는 211At 가 사용된다. 이러한 동위원소는 통상의 기술을 사용하여 항체에 부착된다 (예를 들어, Pedley et al., Br. J. Cancer 68, 69-73 (1993)). 대안적으로, 항체에 부착된 항-종양제는 전구약물을 활성화시키는 효소다. 일단 항체 복합체가 투여되면 전구약물이 투여될 수 있고, 그의 세포독소 형태로 전환되는 종양 부위에 도달할 때까지 그의 비활성 형태로 존재할 것이다. 실제로, 항체-효소 컨쥬게이트가 환자에게 투여되면, 치료될 조직의 영역에 위치하도록 한다. 그 다음, 세포독성 약물로의 전환이 치료될 조직의 영역에서 발생하도록 상기 전구 약물을 환자에게 투여한다. 대안적으로, 항체에 컨쥬게이션된 항-종양제는 시토킨, 예컨대, 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-4 (IL-4) 또는 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 이다. 항체는 시토킨이 다른 조직에 영향을 미치지 않고 종양에 대한 손상 또는 그의 파괴를 조절하도록 하는 종양에 대한 시토킨을 표적으로 한다. 상기 시토킨은 통상의 재조합 DNA 기술을 사용하는 DNA 수준으로 항체에 융합된다. 인터페론이 또한 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는, "융합 단백질" 은 임의의 키메라 단백질을 의미하고, 여기서 항원 결합 영역은 생물학적 활성 분자, 예를 들어, 독소, 효소, 형광 단백질, 발광 표지자, 폴리펩티드 태그, 시토킨, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분 또는 단백질 약물에 연결된다.
본 발명은 본 발명의 CDMAB 에 결합된 표적 또는 리포터 부분을 추가로 고려한다. 표적 부분은 결합 쌍의 일차 멤버이다. 항-종양제는 예를 들어, 상기 쌍의 이차 멤버에 컨쥬게이션되고, 그에 따라 항원-결합 단백질이 결합된 부위에 접한다. 상기 결합쌍의 통상적인 예는 아비딘 및 바이오틴이다. 바람직한 구현예에서, 바이오틴은 본 발명의 CDMAB 의 표적 항원에 컨쥬게이션되고, 그에 따라 항-종양제에 대한 표적 또는 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 컨쥬게이션되는 다른 부분을 제공한다. 대안적으로, 바이오틴 또는 다른 상기 부분은 본 발명의 CDMAB 의 표적 항원에 결합하고, 예를 들어, 검출가능한 신호-생성제가 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 컨쥬게이션되는 경우, 진단 시스템에서 리포터로 사용된다.
검출가능한 신호-생성제는 생체 내 및 시험관 내 진단용으로 유용하다. 신호 생성제는 외부 수단, 통상적으로는 전자기 조사의 측정에 의해 검출가능한 측정가능 신호를 생성한다. 대부분의 신호 생성제는 효소 또는 발색단이거나, 형광, 인광 또는 화학발광에 의해 빛을 방출한다. 발색단은 자외선 또는 가시광선 영역에서 빛을 흡수하는 염료를 포함하고, 효소 촉매 반응의 기질 또는 분해 생성물일 수 있다.
더욱이 당업계에 잘 알려진 임상 또는 진단법을 위한 생체 내 및 시험관 내에서의 상기 CDMAB 의 용도가 본 발명의 범주에 포함된다. 본원에서 고려되는 진단법을 수행하기 위해, 본 발명은 본 발명의 CDMAB 를 함유하는 키트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기 개체의 세포상에서의 CDMAB 의 표적 항원의 과다-발현을 검출하여, 특정 유형의 암에 대한 개체의 위험도를 확인하는데 유용할 것이다.
진단용 검정 키트
종양의 존재를 확인하기 위한 진단용 검정 키트의 형태로 본 발명의 CDMAB 를 사용하는 것이 고려된다. 상기 종양은 환자로부터 수득될 수 있는 생물학적 시료, 예컨대, 혈액, 혈청, 소변 및/또는 종양 생검에서 상기 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 종양-특이적 항원, 예를 들어, 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드의 존재를 기초로 환자에게서 통상적으로 검출될 수 있다.
단백질은 특정 종양, 예를 들어, 결장, 유방, 폐 또는 전립선 종양의 존재 또는 부재를 나타내는 표지자로 기능한다. 항원은 다른 암성 종양의 검출에 대해 유용성을 가질 수 있는 것으로 추가로 고려된다. 본 발명의 CDMAB 로 구성된 결합제, 또는 CDMAB 관련 결합제의 진단용 검정 키트는 생물학적 시료 중 제제에 결합되는 항원의 수준을 검출할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 프라이머 및 탐침은 종양 단백질을 인코딩하는 mRNA 의 수준을 검출하는데 사용될 수 있고, 이는 또한 암의 존재 및 부재를 나타낸다. 진단될 결합을 분석하기 위해, 결합을 인지하여 암성 종양의 존재를 명확히 진단하도록, 정상 조직에 존재하는 것과 관련된 통계적으로 현저한 수준의 항원을 연관시켜 데이타를 생성할 수 있다. 시료에서 폴리펩티드 표지자를 검출하기 위해 결합제를 사용하는, 당업자들에게 알려진 대부분의 포맷은 본 발명의 진단용 검정에 유용할 것으로 고려된다. 예를 들어, [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 에 예시되어 있다. 상기 기술된 진단용 검정 포맷의 임의의 및 모든 조합, 변경 또는 변형이 추가로 고려된다. 환자에서의 암의 존재 및 부재는 통상적으로 (a) 환자로부터 수득된 생물학적 시료를 결합제와 접촉시키고; (b) 결합제에 결합된 폴리펩티드의 수준을 시료에서 검출하고; (c) 폴리펩티드의 수준을 미리측정된 절삭값과 비교; 하여 결정될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 검정은 시료의 잔류물로부터 폴리펩티드를 제거하고, 그에 결합된 고체 지지체 상에 고정된 CDMAB 기재 결합제를 사용하는 것을 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 그 다음, 결합된 폴리펩티드는 리포터기를 함유하고 결합제/폴리펩티드 복합체에 특이적으로 결합하는 검출 시약을 사용하여 검출될 수 있다. 검출시약의 예는 폴리펩티드 또는 항체에 특이적으로 결합하는 CDMAB 기재 결합제 또는 결합제에 특이적으로 결합하는 다른 제제, 예컨대, 항-면역글로불린, 단백질 G, 단백질 A 또는 렉틴을 포함할 수 있다. 대안적인 구현예에서, 폴리펩티드를 리포터기로 표시하고, 결합제를 시료와 인큐베이션한 후 고정된 결합제에 결합하도록 하는, 경쟁적 검정법이 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 고정된 결합제와의 시료의 반응성을 나타내는 것은 결합제에 대해 표시된 폴리펩티드의 결합을 억제하는 시료의 성분으로 확장된다. 상기 검정법에 사용하기에 적합한 폴리펩티드는 전장 종양-특이적 단백질 및/또는 그의 일부를 포함하고, 결합제는 이에 대한 결합 친화도를 갖는다.
진단용 키트는 단백질이 부착될 수 있는 당업자에게 알려진 임의의 물질의 형태일 수 있는 고체 지지체로 제공될 수 있다. 적합한 예는 마이크로티터 플레이트에서의 시험 웰 또는 니트로셀룰로스 또는 다른 적합한 막을 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 지지체는 비드 또는 디스크, 예컨대, 유리, 유리섬유, 라텍스 또는 플라스틱 물질, 예컨대, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드일 수 있다. 상기 지지체는 또한 예를 들어, 미국 특허 제 5,359,681 호에 개시된 것과 같은 자성 입자 또는 광섬유 센서일 수 있다.
결합제는 당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 고체 지지체 상에 고정될 수 있는 것으로 고려되고, 이는 본 특허 및 과학 문헌에 충분히 기술되어 있다. 용어 "고정화" 는 비공유 회합, 예컨대 흡착, 및 본 발명의 문맥에서 지지체 상의 제제와 작용기 사이의 직접적인 결합 또는 가교 결합제에 의한 결합일 수 있는 공유 부착을 모두 언급한다. 바람직한 비-제한적 구현예에서, 마이크로티터 플레이트에서의 웰 또는 막에 대해 흡착에 의한 고정화가 바람직하다. 흡착은 결합제를 적합한 완충액에서 고체 지지체와 적절한 기간 동안 접촉시켜 달성될 수 있다. 접촉 기간은 온도에 따라 변할 수 있고, 통상적으로 약 1 시간 내지 약 1 일의 범위일 수 있다,
고체 지지체에 대한 결합제의 공유 부착은 통상적으로 우선 결합제 상에서 지지체 및 작용기, 예컨대, 히드록실기 또는 아미노기와 반응할 수 있는 이작용성 시약과 지지체를 반응시켜 달성될 수 있다. 예를 들어, 결합제는 벤조퀴논을 사용하거나 지지체 상의 알데히드기를 결합 파트너 상에서 아민 및 활성 수소와 축합하여, 적절한 폴리머 코팅을 갖는 지지체에 공유적으로 부착될 수 있다 (예를 들어, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, A12 A13 를 참조).
진단용 검정 키트는 두 개의 항체 샌드위치 검정의 형태를 취할 수 있는 것으로 추가로 고려된다. 상기 검정은 우선, 시료 내에 있는 폴리펩티드가 고정된 항체에 결합하도록, 항체, 예를 들어, 고체 지지체, 통상적으로는 마이크로티터 플레이트의 웰 상에 고정된 바로 앞서 개시된 CDMAB 를 시료와 접촉시켜 수행될 수 있다. 그 다음, 비결합된 시료를 고정된 폴리펩티드-항체 복합체로부터 제거하고, 리포터기를 함유하는 검출 시약 (바람직하게는 폴리펩티드 상의 상이한 부위에 결합할 수 있는 이차 항체) 을 첨가한다. 그 다음, 고체 지지체에 결합된 잔류하는 검출 시약의 양을 특이적 리포터기에 대해 적절한 방법을 사용하여 측정한다.
특정 구현예에서, 일단 항체가 상기 기재된 바와 같이 지지체 상에 고정되면, 지지체 상에 잔류하는 단백질 결합 부위는 당업자에게 알려진 임의의 적합한 차단제, 예컨대, 소혈청알부민 또는 Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St.Louis,Mo.) 을 사용하여 차단될 수 있다. 그 다음, 고정된 항체를 시료와 인큐베이션하고, 폴리펩티드가 항체에 결합하도록 할 수 있다. 시료는 인큐베이션하기 전에, 적합한 희석액, 예컨대, 포스페이트-완충 식염수 (PBS) 로 희석될 수 있다. 통상적으로, 적절한 접촉 기간 (즉, 인큐베이션 기간) 은 특이적으로 선택된 종양을 갖는 개체로부터 수득된 시료에서 폴리펩티드의 존재를 검출하기에 충분한 기간에 해당하는 것이 선택될 수 있다. 접촉 기간은 바람직하게는 결합 및 비결합 폴리펩티드 간의 평형이 약 95% 이상 달성된 결합 수준을 달성하기에 충분하다. 평형을 달성하는데 요구되는 시간은 상기 수준의 결합을 발생하는데 걸린 시간을 측정하여 미리 측정할 수 있는 것으로 당업자들에게 인식될 수 있다.
따라서, 비결합된 시료는 고체 지지체를 적절한 완충액으로 세정하여 제거될 수 있는 것으로 추가로 고려된다. 그 다음, 리포터기를 함유하는 이차 항체를 고체 지지체에 첨가할 수 있다. 그 다음, 검출 시약과 고정된 항체-폴리펩티드 복합체의 인큐베이션을 결합된 폴리펩티드를 검출하기에 충분한 기간 동안 수행할 수 있다. 이어서, 비결합된 검출 시약을 제거한 다음, 결합된 검출 시약을 리포터기를 사용하여 검출할 수 있다. 리포터기를 검출하는데 사용되는 방법은 예를 들어, 방사성기로 선택되는 상기 유형의 리포터기에 반드시 특이적이며, 섬광 계수법 또는 자가방사그래픽법이 통상적으로 적절하다. 분광법은 검출 염료, 발광기 및 형광기에 대해 사용될 수 있다. 바이오틴은 상이한 리포터기 (통상적으로 방사성 또는 형광기 또는 효소) 에 결합된 아비딘을 사용하여 검출될 수 있다. 효소 리포터기는 통상적으로 기질의 첨가한 후 (통상적으로 특정 기간 동안), 반응 생성물을 분광 또는 다른 분석을 수행하여 검출될 수 있다.
암, 예컨대, 전립선 암의 존재 또는 부재를 결정하는데, 본 발명의 진단용 검정 키트를 사용하기 위해, 고체 지지체 상에 결합된 잔류하는 리포터기로부터 검출된 신호를 통상적으로 미리측정된 절삭값에 상응하는 신호와 비교할 수 있다. 예를 들어, 암을 검출하기 위한 예시적인 절삭값은 고정된 항체가 암이 없는 환자로부터 수득된 시료와 인큐베이션되는 경우, 수득되는 평균 신호일 수 있다. 통상적으로, 미리측정된 절삭값의 3 배의 표준 편차를 갖는 신호를 발생시키는 시료는 암에 대해 양성인 것으로 고려될 수 있다. 대안적 구현예에서, 절삭값은 [Sackett et al., Clinical Epidemiology. A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p. 106-7] 의 방법에 따라, Receiver Operator Curve 를 사용하여 결정될 수 있다. 상기 구현예에서, 절삭값은 진단용 시험 결과에 대한 각각 가능한 절삭값에 해당하는 진양성률 (즉, 민감성) 및 위양성율 (100%-특이성) 의 쌍의 도면으로부터 결정될 수 있다. 상부 좌측 영역에 가장 근접한 도면의 절삭값 (즉, 가장 큰 면적을 포함하는 값) 이 가장 정확한 절삭값이고, 상기 방법에 의해 결정된 절삭값보다 큰 신호를 발생시키는 시료는 양성인 것으로 고려될 수 있다. 대안적으로, 절삭값은 위양성율을 최소화하기 위해 도면을 따라 왼쪽으로 또는 위양성율을 최소화하기 위해 오른쪽으로 이동될 수 있다. 통상적으로, 상기 방법에 의해 결정된 절삭값보다 큰 신호를 발생시키는 시료가 암에 대해 양성인 것으로 고려된다.
키트에 의해 가능한 진단용 검정은 유동-통과 또는 스트립 시험 포맷으로 수행될 수 있으며, 상기 결합체는 막, 예컨대, 니트로셀룰로스 상에 고정되는 것으로 고려된다. 유동-통과 시험에서, 시료 내에 있는 폴리펩티드는 막을 통과하는 시료로서 고정된 결합제에 결합한다. 두 번째로, 그 다음 이차 결합제를 함유하는 용액으로, 표시된 결합제는 막을 통해 흐르는 결합제-폴리펩티드 복합체에 결합한다. 그 다음, 결합된 이차 결합제의 검출을 상기 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 스트립 시험 포맷에서, 결합된 결합제에 대한 막의 한쪽 끝은 시료를 함유하는 용액에 침지될 것이다. 시료는 이차 결합제를 함유하는 영역을 통해 또는 고정된 결합제의 영역으로 막을 따라 이동한다. 고정된 항체의 영역에서의 이차 결합제의 농도는 암의 존재를 나타낸다. 시각적으로 판독될 수 있는, 결합 부위에서의 선과 같은 패턴의 생성은 양성 시험의 표시일 수 있다. 상기 패턴의 부재는 음성 결과를 나타낸다. 통상적으로, 막에 고정된 결합제의 양은 상기 거론된 포맷에서 생물학적 시료가 두 개의 항체 샌드위치 측정법으로 양성 신호를 생성하기에 충분한 수준의 폴리펩티드를 함유하는 경우, 시각적으로 인식될 수 있는 패턴을 생성하는 것이 선택된다. 본 진단용 검정에 사용되는 바람직한 결합제는 직전 개시된 항체, 그의 항원-결합 절편 및 본원에 기재된 임의의 CDMAB 관련 결합제이다. 막에 고정된 항체의 양은 진단용 검정을 수행하기에 효과적인 임의의 양일 수 있고, 약 25 ng 내지 약 1 ㎍ 의 범위일 수 있다. 전형적으로 상기 시험은 매우 소량의 생물학적 시료로도 수행될 수 있다.
추가로, 본 발명의 CDMAB 는 그의 표적 항원을 확인하는 그의 능력으로 인해 연구실에서 사용될 수 있다.
여기에 기술된 본 발명을 더욱 완전히 이해할 수 있도록 하기 위해, 하기에 상세히 설명할 것이다.
본 발명은 IDAC 280102-02 항원을 특이적으로 인식 및 결합하는 CDMAB (즉, IDAC 280102-02 CDMAB, 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 인간화 항체, 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 키메라 항체, 항원 결합 절편 또는 그의 항체 리간드) 를 제공한다.
등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 CDMAB 는 그것이 그의 표적 항원에 대해 하이브리도마 IDAC 280104-02 에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 면역특이적 결합을 경쟁적으로 억제하는 항원-결합 영역을 갖는 한, 임의의 형태일 수 있다. 따라서, IDAC 280104-02 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는 임의의 재조합 단백질 (예를 들어, 항체가 이차 단백질, 예컨대, 림포카인 또는 종양 억제 성장 인자와 조합된 융합 단백질) 이 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명의 한 구현예에서, CDMAB 는 IDAC 280104-02 항체이다.
다른 구현예에서, CDMAB 는 IDAC 280104-02 항체의 항원-결합 영역을 갖는 Fv 분자 (예컨대, 단쇄 Fv 분자), Fab 분자, Fab' 분자, F(ab')2 분자, 융합 단백질, 이특이적 항체, 이종항체 또는 임의의 재조합 분자일 수 있는 항원 결합 절편이다. 본 발명의 CDMAB 는 IDAC 280104-02 단일클론 항체가 의미하는 항원결정기를 의미한다.
본 발명의 CDMAB 를 분자 내의 아미노산의 변형으로 변형시켜, 유도체 분자를 생성할 수 있다. 화학적 변형이 또한 가능할 수 있다. 직접적인 돌연변이, 친화성 돌연변이의 방법, 파지 디스플레이 또는 쇄 셔플링에 의한 변형이 또한 가능할 수 있다.
친화도 및 특이성은 CDR 및/또는 페닐알라닌 트립토판 (FW) 잔기를 변이시키고, 목적한 특징을 갖는 항원 결합 부위를 선별하여 변형 또는 개선될 수 있다 (예를 들어, Yang et al., J. Mol.Biol., (1995) 254: 392-403). 한가지 방법은 각각 확인된 항원 결합 부위의 집단에서, 두 개 내지 20 개의 아미노산의 작은 집단이 특정 위치에서 발견되도록 개별 잔기 또는 잔기의 조합을 랜덤화하는 것이다. 대안적으로, 돌연변이는 잔기의 범위에서 오류 유발 PCR 방법에 의해 유도될 수 있다 (예를 들어,, Hawkins et al., J. Mol.Biol., (1992)226:889-96). 다른 예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를 함유하는 파지 디스플레이 벡터는 대장균 (E. coli) 의 돌연변이유발 균주로 전파될 수 있다 (예를 들어,, Low et al., J. Mol.Biol., (1996)250:359-68). 이러한 돌연변이유발 방법은 당업자에게 공지된 많은 방법에 의해 예시된다.
본 발명의 항체의 친화도를 증가시키는 다른 방법은 쇄 셔플링을 수행하는 것이고, 여기서 중쇄 또는 경쇄는 다른 중쇄 또는 경쇄와 램덤하게 쌍을 이루어 높은 친화도를 갖는 항체를 제조한다. 항체의 다양한 CDR 은 또한 다른 항체에서 상응하는 CDR 과 셔플링될 수 있다.
유도체 분자는 폴리펩티드의 작용기 특성을 지닌다, 즉, 상기 치환기를 갖는 분자는 IDAC 280104-02 항원 또는 그의 일부에 대한 폴리펩티드의 결합을 여전히 허용할 것이다.
이러한 아미노산 치환기에는 "보존성" 으로 당업계에 공지된 아미노산 치환기가 포함되나, 그에만 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, "보존성 아미노산 치환기" 로 언급되는 특정 아미노산 치환기는 단백질의 형태 또는 기능을 변경시키지 않고 단백질로 빈번히 제조될 수 있다는 것이, 단백질 화학에 있어서 잘-확립된 원리이다.
상기 변화는 임의의 이소루신 (I), 발린 (V) 및 루신 (L) 을 임의의 다른 이러한 소수성 아미노산으로; 아스파르트산 (D) 을 글루탐산 (E) 으로 및 그의 반대; 글루타민 (Q) 을 아스파라긴(N) 으로 및 그의 반대; 및 세린 (S) 을 트레오닌 (T) 으로 및 그의 반대로 치환하는 것을 포함한다. 다른 치환은 또한 특정 아미노산의 환경 및 단백질의 3 차원 구조에서 그의 역할에 따라 보존적인 것으로 고려될 수 있다. 예를 들어, 글리신 (G) 및 알라닌 (A) 은 알라닌 및 발린 (V) 이 그러할 수 있는 바와 같이 빈번히 상호교환가능할 수 있다. 상대적으로 소수성인 메티오닌 (M) 은 루신 및 이소루신과 빈번히, 발린과 종종 상호교환될 수 있다. 리신 (K) 및 아르기닌 (R) 은, 아미노산 잔기의 현저한 특징이 그의 전하이며 두 개의 아미노산 잔기의 상이한 pK 가 유의하지 않은 위치에서 빈번히 상호교환가능하다. 또 다른 변화가 특정 환경에서 "보존적" 인 것으로 고려될 수 있다.
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도 1 은 확정된 인간 PC-3 전립선 암 모델에서 종양 성장에 대한 AR36A36.11.1 의 효과를 증명한다. 수직 점선은 항체가 복강내로 투여되는 기간을 나타낸다. 데이타 점은 평균 +/- SEM 을 나타낸다.
도 2 는 확정된 PCPC-3 전립선 암 모델에서 마우스 체중에 대한 AR36A36.11.1 의 효과를 증명한다. 데이타 점은 평균 +/- SEM 을 나타낸다.
도 3 은 확정된 인간 유방 MDA-MB-468 암 모델에서 종양 성장에 대한 AR36A36.11.1 의 효과를 증명한다. 수직 점선은 항체가 복강내로 투여되는 기간을 나타낸다. 데이타 점은 평균 +/- SEM 을 나타낸다.
도 4 는 확정된 MDA-MB-468 유방암 모델에서 마우스 체중에 대한 AR36A36.11.1 의 효과를 증명한다. 데이타 점은 평균 +/- SEM 을 나타낸다.
도 5 는 확정된 인간 유방 (MDA-MB-231) 암 모델에서 종양 성장에 대한 투여량-의존 방식으로의 AR36A36.11.1 의 효과를 증명한다. 수직 점선은 항체가 복강내로 투여되는 기간을 나타낸다. 데이타 점은 평균 +/- SEM 을 나타낸다.
도 6 은 확정된 MDA-MB-231 유방암 모델에서 마우스 체중에 대한 AR36A36.11.1 의 효과를 증명한다. 데이타 점은 평균 +/- SEM 을 나타낸다.
도 7 은 예방적 NCI-H520 인간 폐 편평 세포 암종 모델에서 종양 성장에 대한 AR36A36.11.1 의 효과를 증명한다. 수직 점선은 항체가 복강내로 투여되는 기간을 나타낸다. 데이타 점은 평균 +/- SEM 을 나타낸다.
도 8 은 예방적 NCI-H520 인간 폐 편평 세포 암종 모델에서 마우스 생존에 대한 AR36A36.11.1 의 효과를 증명한다. 데이타 점은 생존 %를 나타낸다.
도 9 는 예방적 NCI-H520 인간 폐 편평 세포 암종 모델에서 마우스 체중에 대한 AR36A36.11.1 의 효과를 증명한다. 데이타 점은 평균 +/- SEM 을 나타낸다.
도 10. 상이한 일차 항체 용액으로 탐침 시험된 MDA-MB-231 유방암 세포의 전체 막 제제의 웨스턴 블롯. 레인 3 내지 7 은 각각 0.5 ㎍/mL, 5 ㎍/mL, 50 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 및 1000 ㎍/mL 의 비-바이오티닐화 AR36A36.11.1 와 혼합된 바이오티닐화 AR36A36.11.1 로 탐침 시험하였다. 레인 9-13 은 각각 0.5 ㎍/mL, 5 ㎍/mL, 50 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 및 1000 ㎍/mL 의 비-바이오티닐화 10A304.7 과 혼합된 바이오티닐화 AR36A36.11.1 로 탐침 시험하였다. 레인 15-19 는 각각 0.5 ㎍/mL, 5 ㎍/mL, 50 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 및 1000 ㎍/mL 의 비-바이오티닐화 8B1B.1 과 혼합된 바이오티닐화 AR36A36.11.1 로 탐침 시험하였다. 레인 8 및 14 는 음성 대조군 용액과 인큐베이션하고, 레인 8 은 이차 용액에서 인큐베이션하지 않았다. 레인 1, 2 및 20 은 TBST 와만 인큐베이션하였다.
도 11. 상이한 일차 항체 용액으로 탐침 시험된 MDA-MB-231 유방암 세포의 전체 막 제제의 웨스턴 블롯. 레인 3 내지 7 은 각각 0.5 ㎍/mL, 5 ㎍/mL, 50 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 및 1000 ㎍/mL 의 비-바이오티닐화 10A304.7 과 혼합된 바이오티닐화 10A304.7 로 탐침 시험하였다. 레인 9 내지 13 은 각각 0.5 ㎍/mL, 5 ㎍/mL, 50 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 및 1000 ㎍/mL 의 비-바이오티닐화 AR36A36.11.1 과 혼합된 바이오티닐화 10A304.7 과 탐침 시험하였다. 레인 15 내지 19 는 각각 0.5 ㎍/mL, 5 ㎍/mL, 50 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 및 1000 ㎍/mL 의 비-바이오티닐화 8A3 B.6 과 혼합된 바이오티닐화 10A304.7 로 탐침 시험하였다. 레인 8 및 14 는 음성 대조군 용액과 인큐베이션하고, 레인 8 은 이차 용액에서 인큐베이션하지 않았다. 레인 1, 2 및 20 은 TBST 와만 인큐베이션하였다.
도 12. CD59 아미노산 서열을 기준으로 합성된 CLIPS 펩티드에 대한 10A304.7 의 결합.
도 13. CD59 아미노산 서열을 기준으로 합성된 CLIPS 펩티드에 대한 AR36A36.11.1 의 결합.
도 14. CD59 의 아미노산 서열. 10A304.7 및 AR36A36.11.1 모두에 의해 인지되는 불연속 항원결정기는 밑줄 그은 서열 내에 포함된다.
도 15. 경쇄의 PCR 증폭에 사용되는 프라이머.
도 16. 중쇄의 PCR 증폭에 사용되는 프라이머.
도 17. 마우스 AR36A36.11.1 VH 서열. CDR 에 밑줄 그었다.
도 18. 마우스 AR36A36.11.1 VL 서열. CDR 에 밑줄 그었다.
도 19. 키메라 및 변이체 인간화 AR36A36.11.1 VH 서열의 생성에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
도 20. 키메라 및 변이체 인간화 AR36A36.11.1 VL 서열의 생성에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
도 21. 경쇄 및 중쇄 발현 벡터.
도 22 A 및 도 22 B. 인간화 AR36A36.11.1 VH 변이체. CDR 에 밑줄 그었다.
도 23 A 및 도 23 B. 인간화 AR36A36.11.1 VL 변이체. CDR 에 밑줄 그었다.
도 24. 인간화 AR36A36.11.1 VH 및 VL 변이체의 활성
도 25 는 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 에 대한 인간화 변이체, 키메라 및 쥐과 AR36A36.11.1 의 결합을 증명한다.
도 26 은 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 에 대한 AR36A36.11.1 의 쥐과 및 인간화 변이체의 시험관 내 CDC 활성을 증명한다.
실시예 1
인간 PC-3 암 세포를 이용한 생체 내 종양 실험
AR36A36.11.1 은 전립선 암의 예방적 생체 내 모델에서 이미 증명된 (S.N. 11/067,366 에 개시된 바와 같음) 효능을 가졌다. 상기 발견을 확장하기 위해, AR36A36.11.1 을 확정된 PC-3 전립선 암 이종이식 모델에서 시험하였다. 도 1 및 2 와 관련하여, 8 내지 10 주령 수컷 무흉선 누드 마우스에 100 ㎕ 의 PBS 용액 중 500 만 개의 인간 전립선 암 세포 (PC-3) 를 각각의 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 내 주사하여 이식하였다. 상기 마우스를 10 마리씩 2 개의 처리군으로 랜덤하게 나누었다. 이식 후 제 6 일에, 평균 마우스 종양 부피가 약 95 mm3 에 도달했을 때, 저장 농축액 (stock concentration) 을 2.7 mM 의 KCl, 1 mM 의 KH2PO4, 137 mM 의 NaCl 및 20 mM 의 Na2HPO4 를 함유하는 희석액으로 희석한 후, 20 mg/kg 의 AR36A36.11.1 시험 항체 또는 완충액 대조군을 300 ㎕ 의 부피로 각각의 코호트에 대해 복강 내 투여하였다. 그 다음, 약 3 주 동안 상기 항체 및 대조군 시료를 주 3 회 투여하였다. 종양 성장을 매 4-10 일 마다 캘리퍼스 (calipers) 로 측정하였다. 상기 처리를 항체 10 회 투여 후 완료하였다. 연구 기간 동안 주 1 회 동물의 체중을 기록하였다. 모든 동물을 상기 연구의 말미에서 그들이 종말점에 도달하였을 때, CCAC 지침에 따라 안락사시켰다.
AR36A36.11.1 은 인간 전립선 암의 PC-3 생체 내 확정 모델에서 종양 성장을 현저히 억제하였다. ARIUS 항체 AR36A36.11.1 로의 처리는 항체의 마지막 투여 44 일 후, 제 71 일에 측정된 PC-3 종양의 성장을 완충액-처리 군에 비해 81.1 % (p=0.0004084, t-테스트) 감소시켰다 (도 1). 종양 성장 억제는 대조군 및 처리군 모두에서 초기 종양 부피를 뺀 후 계산하였다.
연구 전체에 결쳐 독성의 명백한 임상 징후는 없었다. 1 주 간격으로 측정된 체중은 웰-빙 및 성장 실패에 대한 대리지표였다. 평균 체중은 연구 기간 동안 모든 군에서 증가하였다 (도 2). 제 6 일 내지 제 71 일 사이의 평균 체중은 대조군에서는 3.47 g (14.3 %) 및 AR36A36.11.1-처리군에서는 4.93 g (19.8 %) 이었다. 상기 처리 기간 동안 각 군들 간의 현저한 차이는 없었다.
요컨대, AR36A36.11.1 은 인간 전립선 암의 확정된 이종이식 모델에서 우수한 내성을 갖고, 종양 성장을 현저히 억제하였다.
실시예 2
인간 MDA-MB-468 유방암 세포를 이용한 생체 내 종양 실험
AR36A36.1l.1 은 MDA-MB-231 인간 유방암 이종이식 모델에서 이미 증명된 (S.N. 11/067,366 에 개시된 바와 같음) 효능을 가졌다. 상기 발견을 다른 인간 유방암 모델로 확장하기 위해, AR36A36.11.1 를 확정된 MDA-MB-468 인간 유방암 이종이식 모델에서 시험하였다. 도 3 및 4 과 관련하여, 8 내지 10 주령 암컷 무흉선 누드 마우스에 100 ㎕ 의 PBS 용액 중 500 만 개의 인간 유방암 세포 (MDA-MB-468) 를 각각의 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 내 주사하여 이식하였다. 마우스를 10 마리씩 2 개의 처리군으로 랜덤하게 나누었다. 이식 후 제 35 일에, 평균 마우스 종양 부피가 약 83 mm3 에 도달했을 때, 저장 농축액을 2.7 mM 의 KCl, 1 mM 의 KH2PO4, 137 mM 의 NaCl 및 20 mM 의 Na2HPO4 를 함유하는 희석액으로 희석한 후, 20 mg/kg 의 AR36A36.11.1 시험 항체 및 완충액 대조군을 300 ㎕ 의 부피로 각각의 코호트에 대해 복강 내 투여하였다. 그 다음, 항체 및 대조군 시료를 약 3 주 동안 주 3 회 투여하였다. 종양 성장을 주 1 회 캘리퍼스로 측정하였다. 처리를 항체 투여 10 회 후 완료하였다. 동물의 체중을 종양 측정과 동시에 기록하였다. 모든 동물을 상기 연구의 말미에서 그들이 종말점에 도달하였을 때, CCAC 지침에 따라 안락사시켰다.
AR36A36.11.1 은 인간 유방암의 MDA-MB-468 생체 내 확정된 모델에서 종양 성장을 현저히 억제하였다. ARIUS 항체 AR36A36.11.1 로의 처리는 항체의 마지막 투여 26 일 후, 제 79 일에 측정된 MDA-MB-468 종양의 성장을 완충액-처리군에 비해 98.6 % (ρ=0.000147, t-테스트) 감소시켰다. 종양 성장 억제를 대조군 및 처리군 모두에서 초기 종양 부피를 뺀 후 계산하였다. 연구 전체에 걸쳐 독성의 명백한 임상 징후는 없었다. 1 주 간격으로 측정된 체중은 웰-빙 및 성장 실패의 대리지표였다. 평균 체중은 연구 기간 동안 모든 군에서 증가하였다 (도 4). 제 35 일 내지 제 79 일 사이의 평균 체중은 대조군에서는 1.82 g (7.2 %) 및 AR36A36.11.1-처리군에서는 1.59 g (6.7 %) 이었다. 처리 기간 동안 각 군들 간의 현저한 차이는 없었다.
요컨대, AR36A36.11.1 은 다른 인간 유방암 이종이식 모델에서 우수한 내성을 갖고, 종양 성장을 현저히 억제하였다.
실시예 3
인간 MDA-MB-231 유방암 세포를 이용한 생체 내 종양 실험
AR36A36.1l.1 은 확정된 MDA-MB-231 인간 유방암 이종이식 모델에서 이미 증명된 (S.N. 11/067,366 에 개시된 바와 같음) 효능을 가졌다. 유효한 투여량 수준을 결정하기 위해, AR36A36.11.1 을 확정된 MDA-MB-31 인간 유방암 이종이식 모델에서 다양한 투여량으로 시험하였다. 도 5 및 6 과 관련하여, 8 내지 10 주령 암컷 SCID 마우스에 100 ㎕ 의 PBS 용액 중 500 만 개의 인간 유방암 세포 (MDA-MB-468) 를 각각의 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 내 주사하여 이식하였다. 평균 마우스 종양 부피가 약 100 mm3 에 도달했을 때, 마우스를 10 마리씩 5 개의 처리군으로 랜덤하게 나누었다. 이식 후 제 11 일에, 저장 농축액을 2.7 mM 의 KCl, 1 mM 의 KH2PO4, 137 mM 의 NaCl 및 20 mM 의 Na2HPO4 를 함유하는 희석액으로 희석한 후, 20, 10, 2 또는 0.2 mg/kg 의 AR36A36.11.1 시험 항체 및 완충액 대조군을 300 ㎕ 의 부피로 각각의 코호트에 대해 복강 내 투여하였다. 그 다음, 항체 및 대조군 시료를 약 3 주 동안 주 3 회 투여하였다. 종양 성장을 매 4-7 일 마다 캘리퍼스로 측정하였다. 처리를 항체 투여 10 회 후 완료하였다. 동물의 체중을 종양 측정과 동시에 기록하였다. 모든 동물을 상기 연구의 말미에서 그들이 종말점에 도달하였을 때, CCAC 지침에 따라 안락사시켰다.
AR36A36.11.1 은 처리 기간 동안 0.2 mg/kg 의 최저 투여량으로, 인간 유방암의 MDA-MB-231 생체 내 확정된 모델에서 투여량-의존적으로 종양 성장을 억제하고 퇴행시킨다는 것을 증명하였다. 처리 후, 최저 투여량으로도 또한 종양 성장 퇴행을 유지하였다. 투여량 20, 10 및 2 mg/kg 의 ARIUS 항체 AR36A36.11.1 로 처리한 항체의 마지막 투여 16 일 후, 제 48 일에 측정된 MDA-MB-231 종양 성장은 완충액-처리군에 비해 100 % (p<O.OOOO1, t-테스트) 완전히 제거되었고, 0.2 mg/kg 으로의 처리는 98 % (p<O.OOO1) 감소되었다 (도 5).
연구 전체에 걸쳐 독성의 명백한 임상 징후는 없었다. 4-7 일 간격으로 측정된 체중은 웰-빙 및 성장 실패의 대리지표였다. 평균 체중은 연구 기간 동안 모든 군에서 증가하였다 (도 6). 제 11 일 내지 제 48 일 사이의 평균 체중은 대조군에서는 2.5 g (13.4 %) 및 20, 10, 2 및 0.2 mg/kg 의 투여량으로 AR36A36.11.1-처리된 군에서는 각각 1.6g (8.4 %), 2.7 g (14.1 %), 2.6 g (13.6 %) 및 2.9 g (15.3 %) 이었다. 처리 기간 동안 군들 간의 현저한 차이는 없었다.
요컨대, 0.2 mg/kg 의 최저 투여량으로도 여전히 증명되는 현저한 효능을 갖는 AR36A36.11.1 은 상기 인간 유방암 이종이식 모델에서 우수한 내성을 가지고, 투여량-의존적으로 현저히 종양 성장을 억제하고 퇴행시킨다는 것을 증명하였다.
실시예 4
인간 NCI-H520 폐암 세포를 이용한 생체 내 종양 실험
AR36A36.1l.1 은 인간 유방, 전립선 및 결장암 이종이식 모델에서 이미 증명된 (S.N. 11/067,366 에 개시된 바와 같음) 효능을 가졌다. 폐암 모델에서 효능을 증명하기 위해, AR36A36.11.1 을 NCI-H520 인간 폐 편평 세포 암종 이종이식 모델에서 시험하였다. 도 7, 8 및 9 과 관련하여, 8 내지 10 주령 암컷 SCID 마우스에 100 ㎕ 의 PBS 용액 중 500 만 개의 인간 편평 세포 폐암성 세포 (NCI-H520) 를 각각의 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 내 주사하여 이식하였다. 마우스를 10 마리씩 2 개의 처리군으로 랜덤하게 나누었다. 이식 후 제 1 일에, 저장 농축액을 2.7 mM 의 KCl, 1 mM 의 KH2PO4, 137 mM 의 NaCl 및 20 mM 의 Na2HPO4 를 함유하는 희석액으로 희석한 후, 20 mg/kg 의 AR36A36.11.1 시험 항체 및 완충액 대조군을 300 ㎕ 의 부피로 각각의 코호트에 대해 복강 내 투여하였다. 그 다음, 항체 및 대조군 시료를 7 주 동안 주 1 회 투여하였다. 종양 성장을 주 1 회 캘리퍼스로 측정하였다. 처리를 항체 8 회 투여 후 완료하였다. 동물의 체중을 종양 측정과 동시에 기록하였다. 모든 동물을 상기 연구의 말미에서 그들이 종말점에 도달하였을 때, CCAC 지침에 따라 안락사시켰다.
AR36A36.11.1 은 인간 폐 편평 세포 암종의 NCI-H520 생체 내 예방적 모델에서 종양 성장을 현저히 억제하였다. ARIUS 항체 AR36A36.11.1 로의 처리는 항체의 마지막 투여 5 일 후, 제 55 일 측정된 NCI-H520 종양의 성장을 완충액-처리 군에 비해 58.9 % (p=0.03113, t-테스트) 감소시켰다 (도 7). 대조군 마우스의 90% (9/10) 가 종말점에 도달하여 연구에서 제외될 때인 마지막 투여 50 일 후, 제 100 일까지 상기 연구를 지속하고, 생존을 모니터하였다. 그러나, AR36A36.11.1-처리 군에서 마우스의 50% (5/10) 는 상기 시점에서 여전히 생존하였다 (도 8).
연구 전체를 걸쳐 독성의 명백한 임상 징후는 없었다. 1 주 간격으로 측정된 체중은 웰-빙 및 성장 실패에 대한 대리지표였다. 평균 체중은 연구 기간 동안 모든 군에서 증가하였다 (도 9). 제 0 일 내지 제 55 일 사이의 평균 체중은 대조군에서는 3.7 g (18.9 %) 및 AR36A36.11.1-처리군에서는 2.6 g (12.9 %) 이었다. 처리 기간 동안 각 군들 간의 현저한 차이는 없었다.
요컨대, AR36A36.11.1 은 인간 폐 편평 세포 암종 이종이식 모델에서 우수한 내성을 가지고, 종양 성장을 현저히 억제하고, 생존을 연장시켰다. AR36A36.11.1 은 4 개의 상이한 인간 암 징조: 폐 편평 세포, 전립선, 유방 및 결장에서 증명된 효능을 가졌다. 사람을 포함하는 다른 포유류의 치료에서 상기 항체의 약리학적 및 약학적 장점을 제시하는 인간 암성 질환의 몇몇 잘-인지된 모델로 상기 치료의 장점이 관찰되었다. 전체를 통해, 상기 데이타는 AR36A36.11.1 항원이 암 관련 항원이고, 인간 암 세포에서 발현되고, 병리학적으로 관련된 암 표적이라는 것을 증명하였다.
실시예 5
교차 경쟁 실험
AR36A36.11.1 의 결합 특성을 추가로 특징화하기 위해, 항체 경쟁 실험을 10A304.7 (사전에 개시된 다른 항-CD59 항체; S.N. 10/413,755 현재 미국특허 6,794,494, S.N. 10/944,664 및 S.N. 11/361,153) 로 수행하였다. 10A304.7 및 AR36A36.11.1 이 CD59 의 유사한 또는 별개의 항원결정기를 인식하는 경우, 측정을 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 500 ㎍ 의 MDA-MB-231 전체 막 제제를 전체 길이의 각각 두 개의 10 % 의 폴리아크릴아미드 겔로 채워진 예비 웰 콤브 (well comb) 를 사용하여 비-환원성 조건 하에 SDS-PAGE 로 처리하였다. 겔로부터의 단백질을 4 ℃ 에서 2 시간 동안 150 V 에서 PVDF 막으로 이동시켰다. 상기 막을 진동 플랫폼 상에서 4 ℃ 에서 약 17 시간 동안 TBST 중 5 % 의 탈지유로 차단하였다. 막을 약 20 mL 의 TBST 로 2 회 세정하고, 상이한 탐침 용액을 사용하는, 20 개의 분리된 채널을 생성하는 웨스턴 다중선별 장치에 놓았다. 이에 앞서, EZ-링크 NHS-PEO 고체상 바이오티닐화 키트 (Pierce, Rockford, IL) 를 사용하여 바이오티닐화 10A304.7 및 AR36A36.1l.1 을 제조하였다. 바이오티닐화 10A304.7 또는 바이오티닐화 AR36A36.11.1 을 다양한 농도의 비-바이오티닐화 항체와 혼합하여 일차 항체 용액을 제조하였다. 상세하게는, 0.5 ㎍/mL, 5 ㎍/mL, 50 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 또는 1000 ㎍/mL 의 비-바이오티닐화 항체가 첨가된 TBST 중 3 % 의 탈지유 중 0.05 ㎍/mL 의 바이오티닐화 AR36A36.11.1 를 함유하는 용액을 제조하였다. 사용되는 비-바이오티닐화 항체는 AR36A36.11.1, 10A304.7 및 대조군 항체 8B1B.1 (항-블루텅규 바이러스; IgG2b, 카파, 인-하우스 정제됨) 이었다. 0.05 ㎍/mL 의 바이오티닐화 10A304.7 를 함유하는 용액을 상기 열거된 것과 동일한 농도의 비-바이오티닐화 항체 10A304.7, AR36A36.11.1 및 대조군 항체 8A3B.6 (항-블루텅규 바이러스; IgG2a, 카파, 인-하우스 정제됨) 으로 제조하였다. TBST 중 3 % 의 탈지유로 이루어진 음성 대조군 용액을 각각의 막의 두 개의 채널에 첨가하였다.
실온에서 2 시간 동안 진동 플랫폼의 막 상의 분리된 채널에서 일차 항체 용액을 인큐베이션하였다. 진동 플랫폼의 각각의 채널을 10 분 동안 TBST 로 3 회 세정하였다. TBST 중 3 % 의 탈지유 중 0.01 ㎍/mL 의 과산화효소 컨쥬게이션 스트렙트아비딘 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) 으로 이루어진 이차 용액을 막의 각각의 채널에 적용하나, 음성 대조군에서는 막의 한 채널에 TBST 중 3 % 의 탈지유 중 그것을 단독으로 적용하는 것은 제외하였다. 상기 막을 진동 플랫폼에서 1 시간 동안 실온의 이차 용액에서 인큐베이션하였다. 각각의 채널을 진동 플랫폼에서 10 분 동안 TBST 로 3 회 세정하였다. 막을 다중선별 장치로부터 제거하고, 제조자의 지시에 따라 개선된 화학발광 검출 용액 (GE Healthcare, Life Sciences formerly Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 과 인큐베이션하였다. 그 다음, 상기 막을 필름에 노출시키고, 현상하였다.
도 10 및 11 은 항체 경쟁 실험의 결과를 나타냈다. 바이오티닐화 AR36A36.11.1 의 결합은 5 ㎍/mL 이상의 농도의 비-바이오티닐화 AR36A36.11.1 과 혼합되는 경우에 완전히 억제되었고 (10O 배 초과; 도 10 레인 3-7), 바이오티닐화 10A304.7 의 결합은 50 ㎍/mL 이상의 농도의 비-바이오티닐화 10A304.7 과 혼합되는 경우에도 완전히 억제되었다 (1000 배 초과; 도 11 레인 3-7). 바이오티닐화 AR36A36.11.1 의 결합은 IgG2b 이소형 대조군 항체를 함유하는 임의의 시료에서 는 억제되지 않았고 (도 10 레인 15-19), 바이오티닐화 10A304.7 의 결합은 IgG2a 이소형 대조군 항체를 함유하는 임의의 시료에서 억제되지 않았다. 이는 동일한 비-바이오티닐화 항체와 혼합된 바이오티닐화 항체로 관찰된 결합의 억제가 과량의 항체 단독으로의 비-특이적 상호작용뿐만 아니라, 비-바이오티닐화 항체에 의한 항원 결합 부위의 점유에 의한 것이라는 것을 나타냈다. 바이오티닐화 AR36A36.11.1 의 결합은 500 ㎍/mL 이상의 농도의 비-바이오티닐화 10A304.7 과 혼합되는 경우에 완전히 억제되지 않았고 (10000 배 초과; 도 10 레인 9-13), 바이오티닐화 10A304.7 의 결합은 시험되는 모든 농도의 비-바이오티닐화 AR36A36.11.1 과 혼합되는 경우에도 완전히 억제되지 않았다 (도 11 레인 9-13). 이러한 결과는 AR36A36.11.1 의 결합이 10A304.7 의 결합을 방지하고, 또 그 반대일 수 있다는 것을 나타냈다. 전체적으로, 경쟁 웨스턴 블롯의 결과는 AR36A36.11.1 및 10A304.7 에 의해 인식되는 CD59 분자의 항원결정기가 서로 유사하다는 것을 제시하였다.
실시예 6
항원결정기 맵핑
항원결정기 맵핑 실험을 10A304.7 (상기 개시된 다른 항-CD59 항체; S.N. 11/361,153) 및 AR36A36.11.1 에 의해 인식되는 CD59 분자의 영역 (들) 을 결정하기 위해 수행하였다. 오버랩핑 15-mer 의 펩티드를 표준 Fmoc-화학을 사용하여, CD59 의 아미노산 서열을 기준으로 합성하고 포집제로 트리플루오르산을 사용하여 탈보호하였다. 추가로, 30-mer 이하의 이중-루프형, 삼중-루프형 및 시트 형 펩티드를 펩티드를 화학적으로 지지체 상에 결합하는 (Chemically Linked Peptides on Scaffolds: CLIP) 기술을 사용하여, CD59 분자의 불연속 항원결정기를 재구성하기 위해 화학적 지지체 상에서 합성하였다. 디시스테인을 함유하는 루프형 펩티드를 합성하고, 이를 알파, 알파'-디브로모자일렌으로 처리하여 환형화하고, 가변 공간에 시스테인 잔기를 도입하여 루프의 크기를 변화시켰다. 새롭게 도입된 시스테인 이외에 다른 시스테인이 존재하는 경우, 그들을 알라닌으로 대체하였다. 펩티드 중 다중 시스테인의 측-쇄를 신용-카드 포맷 폴리프로필렌 PEPSCAN 카드 (455 펩티드 포맷/카드) 상에서 암모늄 비카르보네이트 (20 mM, pH 7.9)/아세토니트릴 (1:1(v/v)) 중 1,3-비스 (브로모메틸) 벤젠과 같은 CLIPS 템플레이트의 0.5 mM 의 용액과 반응시켜 CLIPS 템플레이트에 결합시켰다다. 상기 카드를 용액으로 완전히 덮으면서 30 내지 60 분 동안 용액에서 가볍게 진탕하였다. 마지막으로, 카드를 과량의 H2O 로 전체적으로 세정하고, 70 ℃ 에서 30 분 동안 PBS (pH 7.2) 중 1 % 의 SDS/0.1 % 의 베타-메르캅토에탄올을 함유하는 분열-완충액에서 초음파처리한 다음, H2O 에서 또 45 분 동안 초음파처리하였다. 전체에 거쳐, 3811 개의 상이한 펩티드를 합성하였다. 각각의 펩티드에 대한 항체의 결합을 PEPSCAN-방식 ELISA 로 시험하였다. 공유 결합된 펩티드를 함유하는 455-웰 신용 카드 포맷 폴리프로필렌 카드를 차단 용액 (PBS 중 5% 의 오브알부민 (w/v)) 으로 희석된 10 ㎍/mL 의 10A304.7 또는 AR36A36.11.1 로 이루어진 일차 항체 용액과 밤새 인큐베이션하였다. 세정 후, 펩티드를 토끼 항-마우스 항체 과산화효소의 1/1000 희석액과 25 ℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세정 후, 과산화효소 기질 2,2'-아지노-디-3-에틸벤즈티아졸린 술포네이트 (ABTS) 및 2 ㎕ 의 3 % 의 H2O2 를 첨가하였다. 1 시간 후, 발색을 측정하였다. 발색을 전하 결합 소자 (CCD)-카메라 및 화상 처리 시스템으로 정량화하였다.
20 개의 펩티드 (3811 개에서 제외된) 에 가장 강하게 결합된 10A304.7 및 AR36A36.11.1 를 도 12 및 13 에 열거하였다. 3 개의 아미노산 열점 영역 (VYNKCW, NFNDVT 및 LTYY) 을 두 개의 항체가 결합된 펩티드의 조성을 분석하여, 10A304.7 및 AR36A36.11.1 모두를 확인하였다. 서열 VYNKCW, NFNDVT 및 LTYY 의 다양한 조합이 10A304.7 에 대한 상위 20 개의 결합 펩티드 중 17 개 및 AR36A36.11.1 에 대한 상위 20 개의 결합 펩티드 중 16 개에 존재했다. 전체 CD59 분자 아미노산 서열 내에 있는 이러한 아미노산 서열의 위치를 도 14 에 나타냈다. 전제적으로, 이러한 결과는 10A304.7 및 AR36A36.11.1 가 CD59 의 서열 VYNKCWKFEHCNFNDVTTRLRENELTYY 에 함유된 3 개 부분의 유사한 불연속 항원결정기를 인식한다는 것을 나타냈다.
실시예 7
AR36A36.11.1 의 인간화
재조합 DNA 기술을 당업계에 잘 알려진 방법을 및 적절하게는 이러한 방법에서 사용되는 효소의 사용에 대한 공급자의 지시를 사용하여 수행하였다. 상세한 실험 방법을 하기에 기재할 것이다.
mRNA 를 제조자의 지시에 따라 폴리 A 트랙 시스템 1000 mRNA 추출 키트: (Promega Corp., Madison, WI) 를 사용하여 하이브리도마 AR36A36.11.1 세포에서 추출하였다. mRNA 를 하기와 같이 역전사시켰다: 카파 경쇄에 대해, 5.0 ㎕ 의 mRNA 를 20 pmol/㎕ 의 MuIgGκVL-3' 프라이머 OL040 (도 15) 및 5.5 ㎕ 의 핵산분해효소 비함유 물 (Promega Corp., Madison, WI) 과 혼합하였다. 람다 경쇄에 대해, 5.0 ㎕ 의 mRNA 를 1.0 ㎕ 의 20 pmol/㎕ 의 MuIgGλVL-3' 프라이머 OL042 (도 15) 및 5.5 ㎕ 핵산분해효소 비함유 물 (Promega Corp., Madison, WI) 과 혼합하였다. 감마 중쇄에 대해, 5 ㎕ 의 mRNA 를 1.0 ㎕ 의 20 pmol/㎕ 의 MuIgGVH-3' 프라이머 OL023 (표 1) 및 5.5 ㎕ 의 핵산분해효소 비함유 물 (Promega Corp., Madison, WI) 과 혼합하였다. 세 개의 모든 반응 혼합물을 70 ℃ 로 설정된 열 순환기의 예열 블록에 5 분 동안 두었다. 각각 4.0 ㎕ 의 ImPromII 5x 반응 완충액 (Promega Corp,. Madison, WI), 0.5 ㎕ 의 RNasin 리보핵산분해효소 억제제 (Promega Corp,. Madison, WI), 2.0 ㎕ 의 25 mM MgCl2 (Promega Corp,. Madison, WI), 1.0 ㎕ 의 1O mM dNTP 혼합물 (Invitrogen, Paisley, UK) 및 1.0 ㎕ 의 Improm II 역전사효소 (Promega Corp., Madison, WI) 를 첨가하기 전에 이들을 5 분 동안 얼음에서 냉각하였다. 상기 반응 혼합물을 1 시간 동안 42 ℃ 로 설정된 예열된 PCR 블록으로 이동시키기 전에, 5 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 상기 시간 후, 역전사효소를 PCR 블록에서 15 분 동안 70 ℃ 로 인큐베이션하여 가열 비활성화시켰다.
중쇄 및 경쇄 서열을 cDNA 로부터 하기와 같이 증폭시켰다: 273.75 ㎕ 의 핵산분해효소 비함유 물에 37.5 ㎕ 의 10x Hi-Fi Expand PCR 완충액: (Roche, Mannheim, Germany), 7.5 ㎕ 의 1OmM dNTP 혼합물 (Invitrogen, Paisley, UK) 및 3.75 ㎕ 의 Hi-Fi Expand DNA 중합효소 (Roche, Mannheim, Germany) 을 첨가하여 PCR 마스터 혼합물을 제조하였다. 상기 마스터 혼합물을 얼음에서 15 개의 박벽 PCR 반응 튜브에 21.5 ㎕ 의 분취액으로 분배하였다. 6 개의 이러한 튜브에 2.5 ㎕ 의 MuIgVH-3' 역전사 반응 혼합물 및 1.0 ㎕ 의 중쇄 5' 프라이머 풀 HA 내지 HF 를 첨가하였다 (프라이머 서열 및 프라이머 풀 성분에 대해서는 도 16 을 참조). 다른 7 개의 튜브에 2.5 ㎕ 의 MuIgKVL-3' 의 역전사 반응물 및 1.0 ㎕ 의 경쇄 5' 프라이머 풀 LA 내지 LG 를 첨가하였다 (도 15). 최종 튜브에 2.5 ㎕ 의 MuIgKVL-3' 역전사 반응물 및 1.0 ㎕ 의 람다 경쇄 프라이머 MuIgλVL5'-LI 를 첨가하였다. 반응물을 열 순환기의 블록에 놓고, 95 ℃ 로 2 분 동안 가열하였다. 상기 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 을 94 ℃ 에서 30 초, 55 ℃ 에서 1 분 및 72 ℃ 에서 30 초의 40 회의 순환주기로 수행하였다. 마지막으로, PCR 생성물을 72 ℃ 에서 5 분 동안 가열한 다음, 4 ℃ 에서 유지하였다.
증폭 생성물을 pGEM-T 이지 벡터 시스템 I (Promega Corp., Madison, WI) 키트를 사용하여 pGEM-T 이지 벡터 (easy Vector) 로 클론화하고, 서열화하였다. 수득된 VH 및 VL 서열을 각각 도 17 및 18 에 나타냈다.
키메라 항체를 생성하기 위해, VH 영역 유전자를 프라이머 OL330 및 OL331 을 사용하여 PCR 로 증폭시켰다 (도 19); 템플레이트로서 cDNA 클론 중 하나로부터 플라스미드 DNA 를 사용하여 5' MluI 및 3' HindIII 제한 효소 부위에서 조작하기 위해 고안되었다. 0.5 mL 의 PCR 튜브에서 41.5 ㎕ 의 핵산분해효소 비함유 물에 5 ㎕ 의 10x Hi-Fi Expand PCR 완충액 (Roche, Mannheim, Germany), 1.0 ㎕ 의 1O mM dNTP 혼합물 (Invitrogen, Paisley, UK), 0.5 ㎕ 의 프라이머 OL330, 0.5 ㎕ 의 프라이머 OL331, 1.0 ㎕ 의 템플레이트 DNA 및 0.5 ㎕ 의 Hi-Fi Expand DNA 중합효소 (Roche, Mannheim, Germany) 를 첨가하였다.
VL 영역을 BssHII 및 BamHI 제한 효소 부위에서 조작하기 위해 올리고뉴클레오티드 OL332 및 OL333 (도 20) 를 사용하여 유사한 방법으로 증폭시켰다. 반응물을 열 순환기의 블록에 놓고, 95 ℃ 로 2 분 동안 가열하였다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 을 94 ℃ 에서 30 초. 55 ℃ 에서 1 분 및 72 ℃ 에서 30 초의 30 회의 순환주기로 수행하였다. 마지막으로, PCR 생성물을 72 ℃ 에서 5 분 동안 가열한 다음, 4 ℃ 에서 유지하였다. 그 다음, VH 및 VL 영역 PCR 생성물을 각각 MluI/HindIII 및 BssHII/BamHI 부위에서 각각 벡터 pANT15 및 pANT13 으로 클론화하였다. pANT15 및 pANT13 모두는 인간 Ig 발현 카세트를 함유하는 pAT153-기재 플라스미드였다. pANT15 에서 중쇄 카세트는 다운스트림 인간 IgG polyA 영역을 갖는, hCMVie 프로모터에 의해 작동하는 인간 게놈 IgG1 불변 영역 유전자로 이루어졌다. pANT15 는 또한 다운 스트림 SV40 polyA 영역을 갖는 SV40 프로모터에 의해 작동하는 햄스터 dhfr 유전자를 함유한다. pANT13 의 경쇄 카세트는 다운스트림 경쇄 polyA 영역을 갖는 hCMVie 프로모터에 의해 움직이는 게놈 인간 카파 불변 영역으로 구성된다. 인간 Ig 선도 서열 및 불변 영역 간 의 클론화부위는 가변 영역 유전자가 삽입되도록 하였다.
NSO 세포 (ECACC 85110503, Porton, UK) 를 전기천공을 통해 이러한 두 개의 플리스미드로 동시에-형질전환시키고, DMEM (Invitrogen, Paisley, UK) + 5 % 의 FBS (Ultra low IgG Cat No. 16250-078 Invitrogen, Paisley, UK) + 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen, Paisley, UK) + 100 nM 의 메토트렉세이트 (Sigma, Poole, UK) 에서 선택하였다. 메토트렉세이트 내성 콜로니를 단리시키고, 항체를 제조사의 권장 조건에 따라 1 mL 의 HiTrap MabSelect SuRe 컬럼 (GE Healthcare, Amersham, UK) 을 사용하여 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
상기 키메라 항체를 바이오태크 마이크로 바이오티닐화 키트 (Sigma, Poole, UK) 를 사용하여 바이오티닐화된 AR36A36.11.1 마우스 항체를 사용하는 ELISA-방식 경쟁 측정법으로 시험하였다. 바이오티닐화 마우스 AR36A36.11.1 를 사용하여 다양한 농도의 경쟁적 항체의 존재 하에 MDA-MB-231 세포를 결합하였다. MDA-MB-231 세포를 처리될 조직 배양액의 평평한 바닥의 96 웰 플레이트에 거의 융합되도록 배양한 다음, 고정하였다. 바이오티닐화 마우스 AR36A36.11.1 항체를 0 내지 5 ㎍/mL 범위의 농도의 1 ㎍/mL 로 희석하고, 동일한 부피의 경쟁적 항체와 혼합하였다. 100 ㎕ 의 항체 혼합물을 MDA-MB-231 로 코팅된 플레이트의 웰로 이동하고, 이를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세정하고, 결합된 바이오티닐화 마우스 AR36A36.11.1 을 스트렙트아비딘-HRP 컨쥬게이트 (Sigma, Poole, UK) (1:500 으로 희석됨) 및 OPD 기질 (Sigma, Poole, UK) 을 첨가 하여 검출하였다. 상기 측정을 3 M 의 HCl 을 첨가하여 중단하기 전에, 5 분 동안 어두운 곳에서 진행하였다. 그 다음, 측정 플레이트를 흡광도 490nm 에서 MRX TCII 플레이트 판독기 (Dynex Technologies, Worthing, UK) 로 판독하였다. 상기 키메라 항체 ((ch)AR36A36.11.1) 는 MDA-MB-231 세포에 대한 결합에서 바이오티닐화 AR36A36.11.1 항체와 경쟁하는 마우스 AR36A36.11.1 항체와 동일한 것으로 나타났다.
인간화 VH 및 VL 서열을 마우스 AR36A36.11.1 서열 및 상동 인간 VH 및 VL 서열과 비교하여 고안하였다. VH 변이체의 서열을 도 22A 및 22B 에 나타내고, VL 변이체의 서열을 도 23A 및 23B 에 나타냈다. 상동 인간 VH 및 VL 서열으로부터 아미노산을 도입하기 위해, 인간화 V 영역 유전자를 긴 오버랩핑 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR 에 대해 마우스 AR36A36.11.1 VH 및 VL 템플레이트를 사용하여 구성하였다. 변이체 인간화 VH 및 VL 서열의 생성을 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드를 각각 도 19 및 20 에 나타냈다. US2004260069 (Hellendoorn, Carr and Baker) 에 상세히 설명된 바와 같이, 변이체 유전자를 발현 벡터 pSVgpt 및 pSVhyg 로 직접 클론화하였다.
변이체 인간화 중쇄 및 경쇄의 모든 조합 (키메라 구조를 포함) 을 CHO-K1 세포 (ECACC 85051005, Porton, UK) 로 일시적으로 형질전환시키고, 상청액을 48 시간후에 수확하였다. 표준으로 정제된 인간 IgG1/카파 (Sigma, Poole, UK) 를 사용하여, 상기 상청액을 IgG Fc/카파 ELISA 의 항체 발현에 대해 정량화하였다. 면역측정용 96 웰 플레이트 (Nalge nunc, Hereford, UK) 를 37 ℃ 에서 1 시간 동안 IX PBS (pH 7.4) 중 1:1500 로 희석된 마우스 항-인간 IgG Fc-특이적 항체 (16260 Sigma, Poole, UK) 로 코팅하였다. 시료 및 표준 시료를 첨가하기 전에, 2 % 의 BSA/PBS 로 희석된 플레이트를 PBS + 0.05 % Tween 20 으로 3 회 세정하였다. PBS/Tween 로 3 번 세정하고, 2 % 의 BSATPBS 중 1:1000 로 희석된 100 ㎕/웰의 검출용 항체 염소 항-인간 카파 경쇄 과산화효소 컨쥬게이트 (A7164 Sigma, Poole, UK) 를 첨가하기 전에, 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween 로 5 회 세정하고, OPD 기질을 사용하여 결합된 항체를 검출하기 (Sigma, Poole, UK) 전에, 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 측정을 3 M 의 HCl 을 첨가하여 중단하기 전에, 5 분 동안 어두운 곳에서 진행하였다. 그 다음, 측정 플레이트를 490 nm 에서 MRX TCII 플레이트 판독기 (Dynex Technologies, Worthing, UK) 에서 판독하였다.
인간화 변이체의 결합을 상기 기재된 경쟁 결합 ELISA 로 측정하였다. 96-웰 마이크로티터 플레이트 상에 고정된 MDA-MB-231 세포에 대해 마우스 AR36A36.11.1 와의 결합에서 경쟁하는 다양한 농도 (156.25 ng/mL 내지 5 ㎍/mL) 의 정제된 키메라 항체 ((ch)AR36A36.11.1) 로 표준 곡선을 생성하였다. MDA-MB-231 세포에 대한 마우스 AR36A36.11.1 의 결합을 염소 항- 마우스 IgG:HRP 컨쥬게이트 (A2179 Sigma, Poole, UK) 로 검출하고, TMB 기질 (Sigma, Poole, UK) 을 사용하여 진행하였다. 키메라 표준 곡선을 사용하여, 시험 농도에서 예상된 억제율을 각각의 변이체에 대해 계산하고, 실제 관찰된 것과 비교하였다. 그 다음, 시험 시료의 관찰된 억제율을 각각의 가변 중쇄/경쇄 조합에 대해 예상된 억제 율로 나누어 상기 결과를 정규화하였다. 따라서, 관찰/예상 비 = 1.0 인 시료는 키메라 항체와 동일한 결합 친화도를 갖고, 값이 1.0 초과인 시료는 CD59 에 대한 결합이 감소하였고, 비가 1.0 미만인 시료는 CD59 에 대한 결합이 향상되었다. 상기 결과를 도 24 에 나타냈다.
VH 및 VL 유전자의 조합을 이중 벡터 pANT18 (SpeI/PciI 제한 효소 부위로 클론화된 pANT13 로부터의 경쇄 카세트를 갖는, pANT18 벡터는 상기 기재된 플라스미드 pANT15 를 기준으로 함) 로 클론화하고, 전기천공에 의해 CHO/dhfr-세포 (ECACC, 94060607) 로 형질전환시키고, 히포크산틴 및 티미딘이 없는 배지 (L-글루타민 및 Na 피루베이트를 갖는 고농도 글루코스 DMEM (Invitrogen, Paisley, UK) + 5 % 의 투석된 FBS (Cat No. 26400-044 Invitrogen, Paisley, UK), 프롤린 (Sigma, Poole, UK) 및 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen, Paisley, UK)) 에서 선택하였다. 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 상기와 같이 정제하였다. 정제된 항체를 +4 ℃ 에서 저장 (PBS 중 pH 7.4) 하기 전에, 여과 살균하였다. 항체의 농도를 인간 IgG1/카파 캡춰 ELISA 로 상기와 같이 계산하였다.
경쟁 ELISA 를 통해 MDA-MB-231 세포 발현 인간 CD59 에 대한 세 개의 정제된 항체 시료의 결합을 상기와 같이 시험하였다. 다양한 농도의 각 항체 (156 ng/mL 내지 5 ㎍/mL) 를 정제된 마우스 AR36A36.11.1 과 혼합하고, 고정된 MDA-MB-231 세포로 코팅된 마이크로티터 플레이트에 첨가하였다. 마우스 AR36A36.11.1 의 결합을 염소 항-마우스 IgG (Fc):HRP 컨쥬게이트로 상기와 같이 검출하였다. 흡광도 450 nm 에서 플레이트 판독기로 측정하고, 이를 시험 항체 농도에 대해 도 면화하였다. MDA-MB-231 세포에 결합된 마우스 AR36.A36.11.1 를 50 % (IC50) 까지 억제하기 위해 요구되는 선택된 변이체의 농도를 계산하고, 키메라 항체와 비교하였다. 선두 변이체 인간화 항체 및 키메라에 대한 IC50 은 하기와 같았다;
(ch)AR36A36.11.1 = 26.27 ㎍/mL
(hu)AR36A36.11.1 변이체 HV3/KV3 = 11.71 ㎍/mL
(hu)AR36A36.11.1 변이체 HV2/KV3 = 11.68 ㎍/mL
(hu)AR36A36.11.1 변이체 HV2/KV4 = 13.30 ㎍/mL
실시예 8
쥐과 AR36A36.11.1, (ch)AR36A36.11.1 및 인간화 변이체, (hu)AR36A36.11.1 의 세포 ELISA
세포 ELISA 를 통해 이소형 대조군과 함께 세 개의 선두 인간화 변이체, 키메라 및 쥐과 AR36A36.11.1 의 MDA-MB-231 세포 발현 인간 CD59 에 대한 결합을 시험하였다. 상기 MDA-MB-231 세포를 평판배양하고, 사용하기 전에 고정시켰다. 상기 플레이트를 실온에서 MgCl2 및 CaCl2 를 함유하는 PBS 로 3 회 세정하였다. 100 ㎕ 의 PBS 로 희석된 2 % 파라포름알데히드를 실온에서 10 분 동안 각각의 웰에 첨가한 다음, 폐기하였다. 상기 플레이트를 실온에서 MgCl2 및 CaCl2 를 함유하는 PBS 로 3 회 다시 세정하였다. 실온에서 1 시간 동안 100 ㎕/웰의 세정 완충액 (PBS + 0.05 % 의 Tween) 중 5 % 우유로 차단하였다. 상기 플레이트를 세정 완충액으로 3 회 세정하고, 다양한 농도의 각 항체 (0.3 ng/mL 내지 10 ㎍ /mL) 를 1 시간 동안 실온에서 100 ㎕/웰의 세정 완충액 (PBS + 0.05 % 의 Tween) 중 1 % 우유에 첨가하였다. 플레이트를 세정 완충액으로 3 회 세정하고, 양고추냉이 과산화효소에 컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG 또는 염소 항-인간 IgG 항체의 1/10,000 희석액 (5 % 의 우유를 함유하는 PBS 로 희석됨) 100 ㎕/웰을 첨가하였다. 실온에서 1 시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 세정 완충액으로 3 회 세정하고, 100 ㎕/웰의 TMB 기질을 실온에서 1-3 분 동안 인큐베이션하였다. 상기 반응을 100 ㎕/웰의 2 M H2SO4 로 종결시키고, 플레이트를 595 nm 에서 흡광도를 뺀 450 nm 에서 Softmax Pro 소프트웨어를 사용하는 Spectramax M5 (분자 소자) 로 판독하였다. 50 % (EC50) 까지의 MDA-MB-231 세포에 대한 항체 결합을 계산하였다 (도 25). 세 개의 변이체 인간화 항체, 키메라 및 쥐과 AR36A36.11.1 에 대한 EC50 은 하기와 같았다:
쥐과 AR36A36.11.1 = 0.091 ㎍/mL
(ch)AR36A36.11.1 = 0.561 ㎍/mL
(hu)AR36A36.11.1 변이체 HV3/KV3 = 0.096 ㎍/mL
(hu)AR36A36.11.1 변이체 HV2/KV3 = 0.092 ㎍/mL
(hu)AR36A36.11.1 변이체 HV2/KV4 = 0.055 ㎍/mL
실시예 9
항체 AR36A36.1l.1 의 쥐과 및 인간화 변이체의 시험관 내 보체-의존성 세포독성 (CDC) 활성의 증명
쥐과 AR36A36.11.1 의 치료학적 효능은 이미 인간 유방암의 이종이식 종양 모델에서 증명하였다 (S.N.11/067,366 및 상기 실시예 2 및 3 에 개시된 바와 같음). 작용의 가능한 메카니즘을 설명하고, AR36A36.11.1 의 인간화 콜론의 시험관 내 효능을 증명하기 위해, CDC 활성을 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 에서 평가하였다. MD A-MB-231 세포의 확정된 단일층; 평판배양 2 일 후; 를 두 개의 쥐과 (20 ㎍/mL) 및 인간화 (2, 0.2 및 0.02 ㎍/mL) 항체로 처리하고, 한 시간 동안 결합하도록 하였다 (37 ℃; 5% 의 CO2). 토끼 보체를 첨가하여 10 % (v/v) 의 최종 농도를 수득하고, 37 ℃, 5% 의 CO2 에서 추가 3 시간 동안 인큐베이션하였다. Cytotox 96™ 키트 (Promega Corporation, Madison, WI, USA) 를 사용하여 손상되지 않은 세포에 존재하는 잔류 락테이트 탈수소효소를 측정하여 CDC 활성을 평가하였다. 각각의 시험 항체를 3 회 평가하고, 결과를 하기 식을 사용하여, 토끼 보체로만 처리된 웰과 비교해 세포독성 % 로 나타냈다: 세포독성 % = 100-[시험 항체(492nm) - 백그라운드(492nm)]/보체 단독(492nm) - 백그라운드(492nm)]*100.
상기 실험의 결과 (도 26) 는 AR36A36.11.1 의 인간화 변이체 클론이 MDA-MB-231 표적 세포에서 투여랑-의존 방식으로 토끼 보체를 보충할 수 있다는 것을 증명하였다. CDC 활성은 최고 농도 (20 ㎍/mL) 의 이소형-맞춤 대조군을 갖는 유방암 세포에서 관찰되지 않았다. 상기 데이타는 쥐과 AR36A36.11.1 의 보체 의존 활성이 인간화 과정 동안에 보존된다는 것을 증명하였다.
실시예 10
경쟁적 결합제의 단리
항체가 주어지면, 당업자들은 경쟁적으로 억제하는 CDMAB, 예를 들어, 경쟁적 항체를 생성할 수 있고, 이는 동일한 항원결정기 (Belanger L et al., Clinica Chimica Acta 48:15-18 (1973)) 를 인식하는 항체이다. 한 가지 방법은 항체에 의해 인식되는 항원을 발현하는 면역원으로 면역화를 일으키는 것이다. 상기 시료는 조직, 단리된 단백질(들) 또는 세포주(들) 를 포함할 수 있으나, 그에만 제한되는 것은 아니다. 수득된 하이브리도마는 경쟁적 측정을 사용하여 선별될 수 있고, 이는 시험 항체의 결합을 억제하는 항체를 확인하는 것으로, 예컨대, ELISA, FACS 또는 웨스턴 블롯팅이 있다. 또 다른 방법은 파지 디스플레이 항체 라이브러리 및 상기 항원의 하나 이상의 항원결정기를 인식하는 항체에 대한 패닝 (panning) 을 이용할 수 있다 (Rubinstein JL et al., Anal Biochem 314:294-300 (2003)). 모든 경우에서, 항체는 본래 표시된 항체의 결합을 그의 표적 항원의 하나 이상의 항원결정기로 치환하는 그의 능력을 기준으로 선택된다. 그러므로, 상기 항체는 본래 항체처럼 항원의 하나 이상의 항원결정기를 인식하는 특징을 가질 것이다.
실시예 11
AR36A36.11.1 단일클론 항체의 가변 영역의 클론화
AR36A36.11.1 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 단일클론 항체의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 로부터 가변 영역의 서열을 결정하였다 (상기 실시예 7 에 개시 된 바와 같음). 키메라 및 인간화 IgG 를 생성하기 위해, 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인을 적절한 발현용 벡터로 서브클론화할 수 있다 (상기 실시예 7 에 개시된 바와 같음).
다른 구현예에서, AR36A36.11.1 또는 그의 탈면역화된, 키메라 또는 인간화 버전을 항체가 발현되고 회수될 수 있도록, 유전자도입 동물에서 항체를 코딩하는 핵산을 발현시켜 생성하였다. 예를 들어, 상기 항체는 회수 및 정제를 촉진하는 조직 특이적 방법으로 발현될 수 있다. 한 상기 구현예에서, 본 발명의 항체는 수유하는 동안 분비를 위한 유선에서 발현되었다. 유전자도입 동물은 마우스, 염소 및 토끼를 포함하나, 그에만 제한되지 않는다.
(i) 단일클론 항체
단일클론 항체 (상기 실시예 7 에 개시된 바와 같음) 를 코딩하는 DNA 는 통상의 과정을 사용하여 (예를 들어, 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하여) 용이하게 단리 및 서열화하였다. 상기 하이브리도마 세포를 상기 DNA 에 대한 바람직한 공급원으로 제공하였다. 일단 단리되면, DNA 를 발현 벡터에 위치시킬 수 있고, 그 다음 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대, 대장균 (E.coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 로 형질전환시켜 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체를 합성하였다. 예를 들어, 상동 쥐과 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 대체하여, 상기 DNA 를 변경할 수 있다. 키메라 또는 하이브리드 항체는 또한 가교결 합제를 수반하는 것을 포함하는, 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 시험관 내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 사용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 구성될 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메트캅토부티르이미데이트를 포함한다.
(ii) 인간화 항체
인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그것으로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "이입 (import)" 잔기로 언급되며, 이는 통상적으로 "이입" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 대체하여, Winter 및 그의 동료들의 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science 239:1534-1536 (1988); reviewed in Clark, Immunol. Today 21:397-402 (2000)).
인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3 차원 모델을 사용하는 모 서열 및 다양한 개념의 인간화 생성물에 대한 분석 방법에 의해 제조될 수 있다. 3 차원 면역글로불린 모델이 통상적으로 사용가능하고, 당업자에게 익숙하다. 컴퓨터 프로그램이 사용가능하고, 이는 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3 차원 형상학적 구조를 도시하고 표시한다. 이렇게 나타난 것을 검토하는 것은 후보 면역글로불린 서열화에 있어서 상기 잔기의 유사한 역할에 대한 분석, 즉, 그의 항원을 결합하는데 있어서 상기 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔 기에 대한 분석을 허용한다. 상기 방법으로, 목표한 항체 특징, 예컨대, 표적 항원(들) 에 대한 친화도가 증가되도록, 컨센서스 및 이입 서열로부터 FR 잔기를 선택 및 조합할 수 있다. 통상적으로, CDR 잔기는 직접적이고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미치는 것과 연루되어 있다.
(iii) 항체 절편
항체 절편의 생성을 위해 다양한 기술이 개발되고 있다. 이러한 절편은 재조합 숙주 세포에 의해 생성될 수 있다 (Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11:548-557 (1999); Little et al., Immunol. Today 21:364-370 (2000) 에서 재고됨). 예를 들어, Fab'-SH 절편을 대장균에서 직접 회수하여 화학적으로 커플링하여 F(ab')2 절편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Biotechnology 10:163-167 (1992)). 다른 구현예에서, F(ab')2 분자의 조립을 촉진하는 루신 지퍼 GCN4 를 사용하여 F(ab')2 를 형성하였다. 다른 접근법에 따르면, Fv, Fab 또는 F(ab')2 절편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 바로 단리될 수 있다.
실시예 12
본 발명의 항체를 포함하는 조성물
본 발명의 항체를 암의 예방/치료를 위한 조성물로 사용할 수 있다. 본 발명의 항체를 포함하는, 암의 예방/치료를 위한 조성물은 액체 제제의 형태로, 또는 적합한 제제들의 약학 조성물로서 인간 또는 포유류 (예를 들어, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 경구적으로 또는 비경구적 (예를 들어, 혈관 내, 복강 내, 피하 내 등) 으로 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 그 자체로 투여될 수도 있거나 적절한 조성물로 투여될 수 있다. 상기 투여에 사용되는 조성물은 본 발명의 항체 또는 그의 염을 갖는 약리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 경구 또는 비경구 투여에 적합한 약학 제제의 형태로 제공된다.
비경구 투여를 위한 조성물의 예는 주사제, 좌제 등이다. 주사제는 정맥 내, 피하 내, 피 내 및 근육 내 주사, 점적 주입, 관절 내 주사 등과 같은 투여 형태를 포함한다. 이러한 주사제는 공지된 방법들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사제는, 본 발명의 항체 또는 그의 염을 주사제로 통상적으로 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질 중에 용해, 현탁 또는 유화시켜 제조될 수 있다. 주사용 수성 매질로서 예를 들어, 생리 식염수, 포도당 및 기타 보조제를 함유한 등장액 등이 있는데, 이는 알코올 (예를 들어, 에탄올), 다가알코올 (예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80, HCO-50 (수소화된 피마자유의 폴리옥시에틸렌 (50 몰) 부가물)) 등과 같은 적절한 가용화제와 조합으로 사용될 수 있다. 유성 매질로서, 예를 들어, 참깨유, 대두유 등을 이용하며, 이는 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 같은 가용화제와 조합으로 사용될 수 있다. 이렇게 제조된 주사제는 통상적으로 적절한 앰풀에 채워진다. 직장 투여에 사용되는 좌제는 본 발명의 항체 또는 그의 염을 통상의 좌제 기재와 배합하여 제조될 수 있다. 경구 투여용 조성물은 고체 또는 액체 제제를 포함하며, 상세하게는 정제 (당의정 (dragee) 및 필름코팅 된 정제를 포함), 알약, 과립, 분말 제제, 캡슐 (연질 캡슐 포함), 시럽, 유화제, 현탁액 등을 포함한다. 이러한 조성물은 공지의 방법들에 의해 제조되며, 약학 제제 분야에서 통상적으로 사용되는 비히클 (vehicle), 희석제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 정제용 비히클 또는 부형제의 예는 락토오스, 전분, 수크로오스, 마그네슘 스테아레이트 등이다. 유리하게는, 상기 기재된 경구 또는 비경구적 사용을 위한 조성물은 상기 활성 성분의 투여량에 맞춰진 적합한 단위 투여량을 갖는 약학 제제로 제조된다. 상기 단위 투여량 제제는 예를 들어, 정제, 알약, 캡슐, 주사제 (앰풀), 좌제 등을 포함한다. 상기 화합물의 함유량은 통상적으로 투여 단위 형태당 5 내지 500 mg 이며; 상기된 항체는 특별히 주사 형태로는 약 5 내지 약 100 mg, 및 기타 형태로는 10 내지 250 mg 으로 함유되는 것이 바람직하다.
본 발명의 항체를 포함하는 상기 예방/치료제 또는 조절자의 투여량은 투여되는 대상, 표적 질환, 상태, 투여 경로 등에 따라 변할할 수 있다. 예를 들어, 예컨대, 성인의 유방암을 치료/예방하기 위한 목적으로 사용되는 경우, 본 발명의 항체를 체중 1 kg 당 약 0.01 내지 약 20 mg, 바람직하게는 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 약 10 mg 및 더욱 바람직하게는 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 약 5 mg 의 투여량으로, 1 일 약 1 내지 5 회, 바람직하게는 1 일 약 1 내지 3 회 정맥 내 투여하는 것이 유리하다. 기타 비경구 및 경구 투여에서는, 상기 제제를 상기 제시된 용량에 상응하는 투여량으로 투여할 수 있다. 상태가 특별히 심한 경우, 상태에 따라 상기 투여량을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 항체는 그대로 또는 적 절한 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 상기 투여에 사용되는 조성물은 상기 항체 또는 그의 염을 갖는 약리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여 (예컨대, 혈관 내 주사, 피하 내 주사 등) 에 적합한 약학 제제의 형태로 제공된다. 상기 기재된 각 조성물은 기타의 활성 성분들을 추가로 함유할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 다른 약물, 예를 들어, 알킬화제 (예를 들어, 시클로포스파미드, 이포스파미드 등), 대사 길항제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 등), 항-종양 항생제 (예를 들어, 미토마이신, 아드리아마이신 등), 식물 유래 항-종양제 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈데신, 택솔 (Taxol) 등), 시스플라틴, 카르보플라틴, 에토포시드, 이리노테칸 등과 조합으로 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 및 상기 기재된 약물들은 환자에 동시에 또는 시차를 두고 투여될 수 있다.
본원에 기술된 특히, 암에 대한 치료 방법은 또한 다른 항체 또는 화학요법제의 투여로 수행될 수 있다. 예를 들어, EGFR 에 대한 항체, 예컨대 ERBITUX® (cetuximab) 는 또한 특히 결장암을 치료하는 경우 투여될 수 있다. ERBITUX® 는 또한 건선의 치료에 효과적인 것으로 나타났다. 조합으로 사용되는 다른 항체는 특히 유방암을 치료하는 경우 Herceptin® (trastuzumab), 특히 결장암을 치료하는 경우 AVASTIN®, 및 특히 비-소세포 폐암을 치료하는 경우 SGN-15 를 포함한다. 다른 항체/화학요법제를 갖는 본 발명의 항체의 투여는 동일하거나 상이한 경로를 통해, 동시에 또는 순차적으로 일어날 수 있다.
사용되는 상기 화학요법제/다른 항체 치료법은 환자의 상태를 치료하기 위해 최적화된 것으로 여겨지는 임의의 치료법을 포함한다. 상이한 악성종양은 특이적 항-종양 항체 및 특이적 화학요법제의 사용을 요구할 수 있고, 이는 환자 기준으로 환자에 대해 결정될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 화학요법은 동시에 또는 더욱 바람직하게는 항체 치료 후에 투여된다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 방법 또는 그의 투여 경로에만 제한되는 것은 아니라는 것을 강조해야만 한다.
우세한 증거는 AR36A36.11.1 이 CD59 상에 존재하는 항원결정기의 결찰을 통해 항-암 효과를 매개하고 생존을 연장시킨다는 것을 나타낸다. AR36A36.11.1 항체는 세포, 예컨대 MDA-MB-231 세포를 발현하여 동족 항원을 면역침전하는데 사용할 수 있다는 것이 S.N. 11/361,153 에 개시된 바와 같이 이미 나타났다. 더욱이, FACS, 세포 ELISA 또는 IHC 에 의해 예시되나 그에만 제한되지 않는 기술을 사용하여, AR36A36.11.1, 키메라 AR36A36.11.1 또는 인간화 변이체, (hu)AR36A36.11.1 를 특이적으로 거기에 결합된 CD59 항원성 부분을 발현하는 세포 및/또는 조직의 검출에 사용할 수 있다는 것을 나타낼 수 있다.
더욱이, AR51A630.3 항체가, 이에 제한되는 것은 아니나 FACS, 세포 ELISA 또는 IHC 로 예시되는 기법들을 이용하여 상기 항체에 의해 특이적으로 결합되는 항원결정기를 발현하는 세포를 검출하는데 있어 사용될 수 있는 것을 밝힐 수 있었다. AR36A36.11.1 항체로서, 다른 항-CD59 항체를 사용하여 다른 형태의 CD59 항원을 면역침전 및 단리시킬 수 있고, 항원을 또한 사용하여 동일 유형의 측정을 사용하여 항원을 발현하는 세포 또는 조직에 대한 상기 항체의 결합을 억제할 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공개물은 본 발명에 속한 당업자들의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공개물은, 각 개별 공개물이 상세하게 및 개별적으로 참조로서 인용되는 것으로 나타나는 경우, 동일한 범위에 대해 본원에서 참조로서 인용된다.
본 발명의 특정 형태가 예시되지만, 본원에 기술되고 나타난 부분들의 특정 형태 또는 배열에만 제한되는 것이 아니라는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 있을 수 있으며, 본 발명이 본 명세서에 나타나고 기술된 것에만 제한되는 것으로 고려되지는 않는다는 것이 당업자들에게 자명할 것이다. 당업자들은 본 발명이 상기 목적을 수행하고, 언급된 목표 및 이점뿐만 아니라 그에 내재된 것을 달성하기에 충분히 적합하다는 것을 용이하게 인식할 수 있이다. 본원에 기재된 임의의 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 생물학적으로 관련된 화합물, 방법, 절차 및 기술은 현바람직한 구현예를 대표하며, 예시로 의도되고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되는 것은 아니다. 당업자들은 본 발명의 주제에 포함되며 첨부된 청구항의 범위에 의해 정의되는, 상기 변화 및 기타 용도를 발생시킬 수 있다. 본 발명을 특정 바람직한 구현와 연관시켜 기술했지만, 청구된 본 발명이 상기 특정 구현예에만 지나치게 제한되는 것은 아님을 이해해야만 한다. 사실상, 당업자들에게 명백한 본 발명을 수행하는 기술된 양상들에 대한 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
SEQ ID:
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<110> YOUNG, DAVID S. F. FINDLAY, HELEN P. HAHN, SUSAN E. CECHETTO, LISA M. DE CRUZ, LUIS A.G. <120> CYTOTOXICITY MEDIATION OF CELLS EVIDENCING SURFACE EXPRESSION OF CD59 <130> 2056.090 <140> 11/807,681 <141> 2007-05-30 <150> 11/361,153 <151> 2006-02-24 <150> 10/944,664 <151> 2004-09-15 <150> 10/413,755 <151> 2003-04-14 <150> 11/067,366 <151> 2005-02-25 <150> 60/548,667 <151> 2004-02-26 <160> 111 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr His Tyr Pro Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Asp Gly Tyr Tyr Ala Glu Tyr Tyr Val Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Cys Leu Thr Tyr Tyr Ala Cys Leu Ala Asn Phe Asn Cys 1 5 10 <210> 43 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Gly Ile Gln Gly Gly Ser Val Leu Phe Gly Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Ala Val Phe Cys His Ser Gly His Ser Leu Gln Cys Tyr Asn Cys Pro 20 25 30 Asn Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr Ala Val Asn Cys Ser Ser Asp Phe 35 40 45 Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly Leu Gln Val Tyr Asn Lys Cys 50 55 60 Trp Lys Phe Glu His Cys Asn Phe Asn Asp Val Thr Thr Arg Leu Arg 65 70 75 80 Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe 85 90 95 Asn Glu Gln Leu Glu Asn Gly Gly Thr Ser Leu Ser Glu Lys Thr Val 100 105 110 Leu Leu Leu Val Thr Pro Phe Leu 115 120 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 44 atgragwcac akwcycaggt cttt 24 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 45 atggagacag acacactcct gctat 25 <210> 46 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 46 atggagwcag acacactsct gytatgggt 29 <210> 47 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (27) <223> Inosine <400> 47 atgaggrccc ctgctcagwt tyttggnwtc tt 32 <210> 48 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 48 atgggcwtca agatgragtc acakwyycwg g 31 <210> 49 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 49 atgagtgtgc ycactcaggt cctggsgtt 29 <210> 50 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 50 atgtggggay cgktttyamm cttttcaatt g 31 <210> 51 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 51 atggaagccc cagctcagct tctcttcc 28 <210> 52 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (6) <223> Inosine <220> <221> modified_base <222> (12) <223> Inosine <220> <221> modified_base <222> (18) <223> Inosine <400> 52 atgagnmmkt cnmttcantt cytggg 26 <210> 53 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (12) <223> Inosine <220> <221> modified_base <222> (24) <223> Inosine <400> 53 atgakgthcy cngctcagyt yctnrg 26 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 54 atggtrtccw casctcagtt ccttg 25 <210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 55 atgtatatat gtttgttgtc tatttct 27 <210> 56 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 56 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgct 29 <210> 57 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 57 atggatttwc argtgcagat twtcagctt 29 <210> 58 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 58 atggtyctya tvtccttgct gttctgg 27 <210> 59 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 59 atggtyctya tvttrctgct gctatgg 27 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 60 actggatggt gggaagatgg a 21 <210> 61 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 61 atggcctgga ytycwctywt mytct 25 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (15) <223> Inosine <400> 62 agctcytcwg wgganggygg raa 23 <210> 63 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 63 atgrasttsk ggytmarctk grttt 25 <210> 64 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 64 atgraatgsa sctgggtywt yctctt 26 <210> 65 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 65 atggactcca ggctcaattt agttttcct 29 <210> 66 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 66 atggctgtcy trgbgctgyt cytctg 26 <210> 67 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 67 atggvttggs tgtggamctt gcyattcct 29 <210> 68 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 68 atgaaatgca gctggrtyat sttctt 26 <210> 69 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 69 atggrcagrc ttacwtyytc attcct 26 <210> 70 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 70 atgatggtgt taagtcttct gtacct 26 <210> 71 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 71 atgggatgga gctrtatcat sytctt 26 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 72 atgaagwtgt ggbtraactg grt 23 <210> 73 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (15) <223> Inosine <400> 73 atggratgga sckknrtctt tmtct 25 <210> 74 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 74 atgaacttyg ggytsagmtt grttt 25 <210> 75 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 75 atgtacttgg gactgagctg tgtat 25 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 76 atgagagtgc tgattctttt gtg 23 <210> 77 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 77 atggattttg ggctgatttt ttttattg 28 <210> 78 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (21) <223> Inosine <400> 78 ccagggrcca rkggatarac ngrtgg 26 <210> 79 <211> 121 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 79 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Lys Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr His Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Tyr Ala Glu Tyr Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 80 <211> 107 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 80 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Arg Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg 100 105 <210> 81 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 gatcacgcgt gtccactccg aagtgcagct ggtggagtc 39 <210> 82 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 82 gtacaagctt acctgaggag acggtgactg agg 33 <210> 83 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 gatcacgcgt gtccactccg aagtgcagct gctggagtct gggggaggct tag 53 <210> 84 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 ggagtctggg ggaggcttag tgcagcctgg agggtccctg agactctcct gt 52 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 ctccagcccc tttcccggag cctggcgaac 30 <210> 86 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 gttcgccagg ctccgggaaa ggggctggag 30 <210> 87 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 87 cagccctcag actgttcatt tgcaggtaca gggtgttttt ggaattgtct ctg 53 <210> 88 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 88 caaatgaaca gtctgagggc tgaggacaca gccgtgtatt actgtgcacg cg 52 <210> 89 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 89 gatcaagctt acctgaggag acggtgacta aggttccttg 40 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 90 ctaatgtatg agacccactc c 21 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 91 ggagtgggtc tcatacatta g 21 <210> 92 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 92 catggcgcgc gatgtgacat ccagatgact cagtc 35 <210> 93 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 93 tgcgggatcc aactgaggaa gcaaagttta aattctactc acgtctcagc tccagcttgg 60 tcc 63 <210> 94 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 94 catggcgcgc gatgtgacat ccagatgact cagtctccat cctccctatc 50 <210> 95 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 95 cagtctccat cctccctatc tgcatctgtg ggagaccgtg tcaccatc 48 <210> 96 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 96 gaccaggagc ttaggagctt ttccctgt 28 <210> 97 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 97 acagggaaaa gctcctaagc tcctggtc 28 <210> 98 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 98 cttcaggctg caggctgctg atcgtcagag taaac 35 <210> 99 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 99 tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcga gttat 35 <210> 100 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 100 gatcggatcc aactgaggaa gcaaagttta aattctactc acgtttgatc tccagcttgg 60 tcccttgacc gaac 74 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 agcttttccc ggtttctgct g 21 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 cagcagaaac cgggaaaagc t 21 <210> 103 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 tcagagtaaa gtctgtgcct gac 23 <210> 104 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 gtcaggcaca gactttactc tga 23 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 acagtaataa gtcgcaaaat c 21 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 gattttgcga cttattactg t 21 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 107 gcattataga tcaggagctt a 21 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 taagctcctg atctataatg c 21 <210> 109 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 109 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr His Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Tyr Ala Glu Tyr Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 110 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 110 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 111 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 111 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

Claims (62)

  1. 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 를 포유류의 유방, 전립선, 폐 또는 결장 종양 부하량을 감소시키는데 효과적인 양으로 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 인간 유방, 전립선, 폐 또는 결장 종양을 감소시키는 방법으로서, 상기 인간 유방, 전립선, 폐 또는 결장 종양이 등록 번호 280104-02 로서 IDAC 에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 항원결정기를 발현시키고, 상기 CDMAB 가 그의 표적 항원에 대한 단리된 단일클론 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 세포독성 부분에 컨쥬게이션되는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 가 보체를 활성화시키는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 인간화 항체 또는 인간화 항체로부터 생성되는 항원 결합 절편인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 키메라 항체 또는 키메라 항체로부터 생성되는 항원 결합 절편인 방법.
  8. 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 를 포유류의 유방, 전립선, 폐 또는 결장 종양 부하량을 감소시키는데 효과적인 양으로 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 항체 유도 세포독성에 영향을 받기 쉬운 인간 유방, 전립선, 폐 또는 결장 종양을 감소시키는 방법으로서, 상기 인간 유방, 전립선, 폐 또는 결장 종양이 등록 번호 280104-02 로서 IDAC 에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 에 특이적으로 결합하는 항원 중 하나 이상의 항원결정기를 발현시키고, 상기 CDMAB 가 그의 표적 항원에 대한 단리된 단일클론 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 세포독성 부분에 컨쥬게이션되는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 가 보체를 활성화시키는 방법.
  12. 제 8 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 방법.
  13. 제 8 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 인간화 항체 또는 인간화 항체로부터 생성된 항원 결합 절편인 방법.
  14. 제 8 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 키메라 항체 또는 키메라 항체로부터 생성된 항원 결합 절편인 방법.
  15. 하나 이상의 화학요법제와 컨쥬게이션된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 를 포유류의 유방, 전립선, 폐 또는 결장 종양 부하량을 감소시키는데 효과적인 양으 로 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 인간 유방, 전립선, 폐 또는 결장 종양을 감소시키는 방법으로서, 상기 인간 유방, 전립선, 폐 또는 결장 종양이 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 항원결정기를 발현시키고, 상기 CDMAB 가 그의 표적 항원에 대한 단리된 단일클론 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 세포독성 부분에 컨쥬게이션되는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  18. 제 15 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 가 보체를 활성화시키는 방법.
  19. 제 15 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 방법.
  20. 제 15 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 인간화 항체 또 는 인간화 항체로부터 생성되는 항원 결합 절편인 방법.
  21. 제 15 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 키메라 항체 또는 키메라 항체로부터 생성되는 항원 결합 절편인 방법.
  22. 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 를 포유류의 인간 유방, 이자, 난소, 전립선 또는 결장 종양 부하량을 감소시키는데 효과적인 양으로 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 인간 유방, 이자, 난소, 전립선 또는 결장 종양 부하량을 감소시키기 위한 단일클론 항체의 용도로서, 상기 인간 유방, 이자, 난소, 전립선 또는 결장 종양이 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 항원결정기를 발현시키고, 상기 CDMAB 가 그의 표적 항원에 대한 단리된 단일클론 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력을 특징으로 하는 용도.
  23. 제 22 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 세포독성 부분에 컨쥬게이션되는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  25. 제 22 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 가 보체를 활성화시키는 방법.
  26. 제 22 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 방법.
  27. 제 22 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 인간화 항체인 방법.
  28. 제 22 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 키메라 항체인 방법.
  29. 하나 이상의 화학요법제와 컨쥬게이션된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 를 포유류의 인간 유방, 이자, 난소, 전립선 또는 결장 종양 부하량을 감소시키는데 효과적인 양으로 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 인간 유방, 이자, 난소, 전립선 또는 결장 종양 부하량을 감소시키기 위한 단일클론 항체의 용도로서, 상기 인간 유방, 이자, 난소, 전립선 또는 결장 종양이 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체에 특이적으로 결합하 는 항원의 하나 이상의 항원결정기를 발현시키고, 상기 CDMAB 가 그의 표적 항원에 대한 단리된 단일클론 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력을 특징으로 하는 용도.
  30. 제 29 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 세포독성 부분에 컨쥬게이션되는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  32. 제 29 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 가 보체를 활성화시키는 방법.
  33. 제 29 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 방법.
  34. 제 29 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 인간화 항체인 방법.
  35. 제 29 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 키메라 항체인 방법.
  36. 하기 단계를 포함하는, IDAC 등록 번호 280104-02 를 갖는 하이브리도마 세포주 AR36A36.11.1 에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체에 의해 특이적으로 결합되는 인간 CD59 항원의 하나 이상의 항원결정기를 발현시키는 인간 유방, 이자, 난소, 전립선 또는 결장 종양을 감소시키는 방법:
    IDAC 등록 번호 280104-02 를 갖는 하이브리도마 세포주 AR36A36.11.1 에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체에 의해 결합되는 것과 동일한 항원결정기 또는 항원결정기들을 결합하는 하나 이상의 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 를 상기 인간 종양을 겪는 개체에 투여하는 단계;
    여기서, 상기 항원결정기 또는 항원결정기들의 결합은 유방, 이자, 난소, 전립선 또는 결장 종양 부하량을 감소시킴.
  37. 하기 단계를 포함하는, IDAC 등록 번호 280104-02 를 갖는 하이브리도마 세포주 AR36A36.11.1 에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체에 의해 특이적으로 결합되는 인간 CD59 항원의 하나 이상의 항원결정기를 발현시키는 인간 유방, 이자, 난소, 전립선 또는 결장 종양을 감소시키는 방법:
    IDAC 등록 번호 280104-02 를 갖는 하이브리도마 세포주 AR36A36.11.1 에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체에 의해 결합되는 것과 동일한 항원결정기 또는 항원결정기들을 결합하는, 하나 이상의 화학요법제와 컨쥬게이션된 하나 이상의 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 를 상기 인간 종양을 겪는 개체에 투여하는 단계;
    여기서, 상기 투여는 종양 부하량을 감소시킴.
  38. 단일클론 항체를 포유류의 종양 부하량을 감소시키는데 효과적인 양으로 포유류에 투여하여 질환 진행을 지연시키고 생존을 연장시키는 것을 포함하는, 포유류에서 인간 유방, 이자, 난소, 전립선 또는 결장 종양을 치료하여 생존을 연장시키고 질환 진행을 지연시키는 방법으로서, 상기 종양이 IDAC 등록 번호 280104-02 를 갖는 하이브리도마 세포주 AR36A36.11.1 에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체 또는 단리된 단일클론 항체로부터 생성되는 항원 결합 절편에 특이적으로 결합하는 항원을 발현시키는 방법.
  39. 단일클론 항체를 포유류의 종양 부하량을 감소시키는데 효과적인 양으로 포유류에 투여하여 질환 진행을 지연시키고 생존을 연장시키는 것을 포함하는, 포유류에서 인간 유방, 이자, 난소, 전립선 또는 결장 종양을 치료하여 생존을 연장시키고 질환 진행을 지연시키는 방법으로서, 상기 종양이 IDAC 등록 번호 280104-02 를 갖는 하이브리도마 세포주 AR36A36.11.1 에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체에 특이적으로 결합하는 CD59 또는 단리된 단일클론 항체로부터 생성되는 CD59 결합 절편을 발현시키는 방법.
  40. 하기 단계를 포함하는, 세포의 표면 상에서 CD59 의 하나 이상의 항원결정기를 발현시키는 암성 세포의 보체 의존성 세포독성을 유도하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 항원결정기가 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체 또는 단리된 단일클론 항체로부터 생성되는 항원 결합 절편에 의해 결합하는 경우, 세포독성을 야기하는 방법:
    280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체 또는 단리된 단일클론 항체로부터 생성되는 항원 결합 절편을 제공하는 단계,
    상기 암성 세포를 단리된 단일 클론 항체 또는 항원 결합 절편과 접촉시키는 단계;
    이로써, 상기 단리된 단일클론 항체 또는 항원 결합 절편과 TROP-2 의 하나 이상의 항원결정기의 결합의 결과로서 세포독성을 야기함.
  41. 제 40 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 세포독성 부분에 컨쥬게이션되는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  43. 제 40 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 보체를 활성화시키는 방법.
  44. 제 40 항에 있어서, 단리된 단일클론 항체가 세포독성을 매개하는 방법.
  45. 제 40 항에 있어서, 단일클론 항체가 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 인간화 항체 또는 인간화 항체로부터 생성되는 항원 결합 절편인 방법.
  46. 제 40 항에 있어서, 단일클론 항체가 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체의 키메라 항체 또는 키메라 항체로부터 생성되는 항원 결합 절편인 방법.
  47. 하기 단계를 포함하는, 세포의 표면 상에서 CD59 의 하나 이상의 항원결정기를 발현시키는 암성 세포의 보체 의존성 세포독성을 유도하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 항원결정기가 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체 또는 단리된 단일클론 항체로부터 생성되는 항원 결합 절편에 의해 결합되는 경우, 세포독성을 야기하는 방법:
    CD59 의 하나 이상의 항원결정기에 의해 결합되는 경우 세포독성을 야기하고, 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체 또는 단리된 단일클론 항체로부터 생성되는 항원 결합 절편의 결합을 경쟁적으로 억제하는 단리된 단일클론 항체를 제공하는 단계; 및
    상기 암성 세포를 단리된 단일클론 항체 또는 항원 결합 절편과 접촉시키는 단계;
    이로써, 상기 단리된 단일클론 항체 또는 항원 결합 절편과 CD59 의 하나 이상의 항원결정기의 결합의 결과로서 세포독성을 야기함.
  48. 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체와 동일한 항원결정기 또는 항원결정기들에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
  49. IDAC 등록 번호 280104-02 를 갖는 하이브리도마 세포주 AR36A36.11.1 에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체와 동일한 인간 CD59 의 항원결정기 또는 항원 결정기들과 반응하며; 그의 표적 인간 CD59 항원에 대한 단리된 단일클론 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력을 특징으로 하는, 인간 CD59 에 특이적으로 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB.
  50. IDAC 등록 번호 280104-02 를 갖는 하이브리도마 세포주 AR36A36.11.1 에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체에 의해 인지되는 것과 동일한 항원결정기 또는 항원결정기들을 인지하며; 그의 표적 항원결정기 또는 항원결정기들에 대한 단리된 단일클론 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB.
  51. 하기를 포함하는, IDAC 등록 번호 280104-02 를 갖는 하이브리도마 세포주 AR36A36.11.1 에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체와 동일한 인간 CD59 의 항원결정기 또는 항원결정기들을 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 그의 인간 CD59 결합 절편:
    SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3 의 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6 의 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  52. 하기를 포함하는, IDAC 등록 번호 280104-02 를 갖는 하이브리도마 세포주 AR36A36.11.1 에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체와 동일한 인간 CD59 의 항원결정기 또는 항원결정기들을 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 그의 인간 CD59 결합 절편:
    SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3 의 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6 의 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 인간 항체 또는 인간 항체 컨센서스 구조형성의 중쇄 및 경쇄로부터의 가변 도메인 구조형성 영역.
  53. SEQ ID NO:7 의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; SEQ ID NO: 8 로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD59 를 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 그의 인간 CD59 결합 절편.
  54. 하기를 포함하는, IDAC 등록 번호 280104-02 를 갖는 하이브리도마 세포주 AR36A36.11.1 에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체와 동일한 인간 CD59 의 항원결정기 또는 항원결정기들을 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 그의 인간 CD59 결합 절편:
    SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3 의 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6 의 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  55. 하기를 포함하는, IDAC 등록 번호 280104-02 를 갖는 하이브리도마 세포주 AR36A36.11.1 에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체와 동일한 인간 CD59 의 항원 결정기 또는 항원결정기들을 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 그의 인간 CD59 결합 절편:
    SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3 의 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6 의 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 인간 항체 또는 인간 항체 컨센서스 구조형성의 중쇄 및 경쇄로부터의 가변 도메인 구조형성 영역.
  56. 단일클론 항체가 SEQ ID NO:7 의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및 SEQ ID NO:8 로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD59 를 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 그의 인간 CD59 결합 절편.
  57. 단일클론 항체가 SEQ ID NO:9 의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및 SEQ ID NO:8 로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD59 를 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 그의 인간 CD59 결합 절편.
  58. 단일클론 항체가 SEQ ID NO:9 의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및 SEQ ID NO:10 으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD59 를 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 그의 인간 CD59 결합 절편.
  59. 하기를 조합으로 포함하는, 인간 이자, 전립선, 난소, 유방 또는 결장 종양을 치료하는데 효과적인 조성물:
    제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항, 제 7 항, 제 8 항, 제 17 항, 제 49 항, 제 50 항, 제 54 항, 제 55 항, 제 56 항, 제 57 항 또는 제 58 항 중 어느 한 항의 항체 또는 CDMAB;
    항체 또는 그의 항원 결합 절편과, 세포독성 부분, 효소, 방사성 화합물, 시토킨, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분 및 혈행성 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 멤버와의 컨쥬게이트; 및
    필요량의 약리학적으로 허용가능한 담체,
    여기서, 상기 조성물은 인간 유방, 전립선, 폐 또는 결장 종양을 치료하는데 효과적임.
  60. 하기를 조합으로 포함하는, 인간 유방, 전립선, 폐 또는 결장 종양을 치료하는데 효과적인 조성물:
    제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항, 제 7 항, 제 8 항, 제 17 항, 제 49 항, 제 50 항, 제 54 항, 제 55 항, 제 56 항, 제 57 항 또는 제 58 항 중 어느 한 항의 항체 또는 CDMAB; 및 필요량의 약리학적으로 허용가능한 담체;
    여기서, 상기 조성물은 인간 유방, 전립선, 폐 또는 결장 종양을 치료하는데 효과적임.
  61. 하기를 조합으로 포함하는, 인간 유방, 전립선, 폐 또는 결장 종양을 치료하는데 효과적인 조성물:
    제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항, 제 7 항, 제 8 항, 제 17 항, 제 49 항, 제 50 항, 제 54 항, 제 55 항, 제 56 항, 제 57 항 또는 제 58 항 중 어느 한 항의 항체, 항원 결합 절편 또는 CDMAB 와, 세포독성 부분, 효소, 방사성 화합물, 시토킨, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분 및 혈행성 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 멤버와의 컨쥬게이션;
    및 필요량의 약리학적으로 허용가능한 담체;
    여기서, 상기 조성물은 인간 유방, 전립선, 폐 또는 결장 종양을 치료하는데 효과적임.
  62. 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB, 및 특정 절삭 수준에서의 존재가 인간 암성 종양의 존재를 진단하는 폴리펩티드에 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 가 결합되는 지의 여부를 검출하는 수단을 포함하는, 인간 암성 종양의 존재를 검출하는 검정 키트로서, 상기 인간 암성 종양이 등록 번호 280104-02 로 IDAC 에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 단리된 단일클론 항체 또는 그의 CDMAB 에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 항원결정기를 발현시키고, 상기 CDMAB 가 그의 표적 항원에 대한 단리된 단일클론 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력을 특징으로 하는 키트.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090263385A1 (en) * 2008-04-18 2009-10-22 Schulz Thadeus J Breast carcinoma treatment method
EP2776470A2 (en) 2011-11-11 2014-09-17 Rinat Neuroscience Corporation Antibodies specific for trop-2 and their uses
JP2015502378A (ja) * 2011-12-19 2015-01-22 ヤンセン・アールアンドデイ・アイルランド Ｈｉｖ膜融合阻害剤
JP6613490B2 (ja) * 2016-02-19 2019-12-04 国立大学法人 宮崎大学 腺癌の検出方法
WO2018085441A1 (en) * 2016-11-01 2018-05-11 Berg Llc Filamin b binding proteins and uses thereof
SMT202200111T1 (it) 2018-03-19 2022-05-12 4D Pharma Res Limited Composizioni di flagellina di enterococcus per l'utilizzo in terapia
US11721932B2 (en) 2019-07-09 2023-08-08 Arris Enterprises Llc Tool-less service cable connector and corresponding systems and methods
EP4003523A4 (en) * 2019-07-30 2023-09-06 Merck Sharp & Dohme LLC TRISPECIFIC ANTI-PD-1/LAG3/TIGIT ANTIBODIES AND BISPECIFIC ANTI-PD-1/LAG3 ANTIBODIES

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4433059A (en) * 1981-09-08 1984-02-21 Ortho Diagnostic Systems Inc. Double antibody conjugate
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4828991A (en) * 1984-01-31 1989-05-09 Akzo N.V. Tumor specific monoclonal antibodies
NZ222509A (en) * 1986-11-19 1993-03-26 Oncogen Hybridoma cell line producing antibodies binding to tumour-associated mucin antigen
US4861581A (en) * 1986-12-05 1989-08-29 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
IL85035A0 (en) * 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5338832A (en) * 1987-07-02 1994-08-16 Akzo N.V. Antigen recognized by MCA 16-88
US5171665A (en) * 1989-04-17 1992-12-15 Oncogen Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
LU91067I2 (fr) * 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
DE69229254T2 (de) * 1991-10-30 1999-09-23 Idemitsu Kosan Co. Ltd., Tokio/Tokyo Verfahren zur Herstellung von menschlichen Lymphozyten und menschlichen Antikörpern; und so hergestellte Antikörper
IL105008A0 (en) * 1992-03-13 1993-07-08 Yeda Res & Dev Double transfectants of mhc genes as cellular vaccines for immunoprevention of tumor metastasis
EP0686260B1 (en) * 1993-02-05 2003-07-09 Epigen, Inc. Human carcinoma antigen (hca), hca antibodies, hca immunoassays, methods of imaging and therapy
EP1018518A2 (en) * 1994-06-24 2000-07-12 Vladimir P. Torchilin Use of autoantibodies for tumor therapy and prophylaxis
US5783186A (en) * 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
US6180357B1 (en) * 1999-10-08 2001-01-30 Arius Research, Inc. Individualized patient-specific anti-cancer antibodies
US7252821B2 (en) * 1999-10-08 2007-08-07 Arius Research Inc. Cancerous disease modifying antibodies
US6794494B1 (en) * 2003-04-14 2004-09-21 Arius Research, Inc. Cancerous disease modifying antibodies
US20040001789A1 (en) * 1999-10-08 2004-01-01 Young David S. F. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of gp96 or precursors thereof
US6657048B2 (en) * 1999-10-08 2003-12-02 Arius Research, Inc. Individualized anti-cancer antibodies
US6824780B1 (en) * 1999-10-29 2004-11-30 Genentech, Inc. Anti-tumor antibody compositions and methods of use
US7439330B2 (en) * 2000-05-08 2008-10-21 President And Fellows Of Harvard College Anti-glycated CD59 antibodies and uses thereof
US6835545B2 (en) * 2000-05-08 2004-12-28 President And Fellows Of Harvard College Methods, products and treatments for diabetes
US7009040B2 (en) * 2003-01-21 2006-03-07 Arius Research, Inc. Cancerous disease modifying antibodies
US7361343B2 (en) * 2003-01-21 2008-04-22 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD63
WO2003024191A2 (en) * 2001-09-21 2003-03-27 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to cancer-associated antigen cytokeratin 8 and methods of use thereof
US7468254B2 (en) * 2003-01-21 2008-12-23 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP
US7393531B2 (en) * 2003-01-21 2008-07-01 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP
US7399835B2 (en) * 2004-02-26 2008-07-15 Arius Research Inc. Cancerous disease modifying antibodies
US7195764B2 (en) * 2003-04-14 2007-03-27 Arius Research Inc. Cancerous disease modifying antibodies
US20060140963A1 (en) * 2003-04-14 2006-06-29 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD59

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