KR20090120480A - 허혈/뇌졸중-유도된 기억 장애 및 뇌 손상에 대한 브리오스타틴, 브리오로그 및 기타 관련된 물질의 치료학적 효과 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뇌졸중을 치료하기 위한, 단백질 키나제 활성제 또는, 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유도된 신경영양 인자(BDNF) 또는 기타 신경영양 인자의 촉진제(booster)의 용도를 제공한다. 특히, 본 발명은 뇌졸중을 겪은 대상을 확인하는 단계 및 대상에게 단백질 키나제 C(PKC) 활성제 또는 4-메틸카테콜 아세트산(MCBA) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 뇌졸중의 하나 이상의 증상을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 뇌졸중의 치료 방법을 제공한다.

뇌졸중, 단백질 키나제 C 활성제, 브리오스타틴, 기억 장애

Description

허혈/뇌졸중-유도된 기억 장애 및 뇌 손상에 대한 브리오스타틴, 브리오로그 및 기타 관련된 물질의 치료학적 효과{Therapeutic effects of bryostatins, bryologs, and other related substances on ischemia/stroke-induced memory impairment and brain injury}

본 명세서는 2007년 2월 9일자로 출원된 미국 가출원 제60/900,339호 및 2007년 5월 24일자로 출원된 미국 가출원 제60/924,662호의 이득을 청구하고, 이들은 모두 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

본 발명은 단백질 키나제 C(PKC)를 활성화시키거나 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유도된 신경영양 인자(BDNF) 또는 기타 신경영양 인자를 증가시키는 화합물을 사용한 뇌졸중의 치료에 관한 것이다.

A. 뇌졸중

대뇌혈관 사고(cerebrovascular accident: CVA)라고도 불리는 뇌졸중은 뇌의 일부분으로 혈액 공급이 중단되는 급성 신경학적 손상이다. 뇌로의 혈액 공급은 폐색(허혈성, 색전성 또는 혈전성 뇌졸중) 또는 혈관 파열(출혈성 뇌졸중)을 포함한 몇가지 방식으로 중단될 수 있다. 뇌졸중은 대뇌 관류에서의 방해로 의한 신경 기능의 갑작스런 손실을 포함한다. 이러한 관류에서의 방해는 일반적으로 동맥이지만 정맥일 수도 있다.

관류가 방해된 뇌의 부분은 더 이상 충분한 산소를 공급받지 못한다. 이로써 뇌 세포 사멸 또는 심각한 손상을 유발하는 허혈성 케스케이드가 시작되고, 이는 국소적 뇌 기능을 손상시킨다. 뇌졸중은 의료적 응급상황이고, 즉시 진단되고 치료되지 않는 경우, 영구적인 신경학적 손상을 유발하거나 심지어 사망할 수 있다. 이는 미국 및 선진 유럽 국가에서 세번째 주요 사망 원인 및 주요 성인 장애 원인이다. 평균적으로, 뇌졸중은 45초 마다 발생하고, 누군가 3분 마다 사망한다. 뇌졸중에 의한 사망 5건 중, 2건은 남성에게서 발생하고, 3건은 여성에게서 발생한다.

의료적 응급상황이고, 전임상 연구에서 대뇌 허혈의 병리학적 진행을 중단시키는데 효과적임을 나타낸 다중 제제가 존재함에도 불구하고, rTPA를 사용하는 혈전용해 요법이 현재 허혈성 뇌졸중의 치료를 위해 사용할 수 있는 유일한 선택이다. 치료는 시간 의존적인(사건 이후 3시간 내에 효과적임) 조기 동맥 재소통을 달성하도록 설계된다. rTPA 및 경색 발달을 중단시키는 기타 잠재적인 제제의 효과는 조기 투여 또는 심지어, 가능하다면, 허혈성 사건 전 투여에 따라 좌우된다. 허혈성 뇌졸중의 치료에서 좁은 치료학적 시간 시기(time window) 때문에 단지 약 5%의 후보 환자만이 효과적인 정맥내 혈전용해 요법을 받는다.

상당한 뇌 손상은 즉각적인 허혈성 사건 후 허혈성 뇌졸중에서 발생한다. 대뇌 허혈/뇌졸중에서 "지연된" 뇌 손상 및 세포 사멸은 치료학적 기회를 나타내는 잘 정립된 현상이다. 병소, 심각한 뇌졸중의 경색 핵심부의 신경세포는 즉시 사멸하고, 이를 약리학적 개입으로 구할 수 없다. 하지만, 병소 허혈성 뇌졸중에서 핵심부 주변의 뇌 조직으로 이루어진 허혈성 경계영역 및 전체적인 대뇌 허혈의 민감한 신경세포/네트워크는 감소된 혈액 공급에 의해 유지된다. 당해 경계영역 뇌 조직에 대한 손상은 대뇌 허혈/뇌졸중 발생 후, 제2 단계로서 4 내지 6시간 또는 소위 제3 단계라고 불리우는 수 일 및 수 주 후에 개시되는 "지연된" 방식으로 발생한다. 약 15분 후, 대뇌 허혈, 예를 들면, 해마 CA1 추체 세포는 2 내지 3일 내에 퇴화하기 시작하고, 허혈성 사건 1주일 후 최대 범위의 세포 사멸에 도달한다. 전반적인 대뇌 허혈에서 민감한 뉴론 구조 및 허혈성 경계영역은 "위험한 상태"의 조직이다. 개입을 통한 이들의 구조 또는 후속되는 수 일 또는 수 주 내의 추가의 손상은 장기간 장애에서 극적인 차이를 결정한다.

본 발명은 대뇌 허혈/뇌졸중을 겪고 있는 대상에게 허혈성 사건 후, 수 시간 내지 수 일 내지 수 주와 같이 넓은 치료 시기 동안 PKC 활성제, 기타 화합물 및 이의 배합물의 일시적, 주기적 또는 만성 투여를 포함하는 신규한 치료학적 전략을 제공한다.

B. 단백질 키나제 C

PKC는 비-수용체 세린-트레오닌 단백질 키나제의 가장 큰 유전자 부류 중 하 나로 확인되었다. 80년대 초반 니시츠카(Nishizuka)와 동료들에 의한 PKC의 발견[참조: Kikkawa et al., (1982) J. Biol. Chem. 257: 13341] 및 이의 포르볼 에스테르에 대한 주요 수용체로서의 확인[참조: Ashendel et al., (1983) Cancer Res., 43: 4333] 이후로, 다수의 생리학적 신호 메카니즘은 이 효소 때문인 것으로 생각되어 왔다. PKC에 대한 강한 관심은 칼슘 및 디아실글리세롤(및 이의 포르볼 에스테르 유사체)에 의해 시험관 내에서 활성화되는 이의 고유한 능력으로부터 시작되고, 이의 형성에 대한 작동기는 성장 및 분화 인자의 작용에 의해 인지질 전환에 커플링된다.

PKC의 활성화는 학습 및 기억을 개선시키는 것으로 나타났다[참조: 본원에 전문이 참조로서 인용되는 미국 특허 출원 연속 번호 제PCT/US02/13784호 및 제PCT/US03/07102호; 미국 특허 제60/287,721호, 제60/362,081호, 제10/172,005호 및 제10/476,459호]. 그러나, 본 발명의 공개 전에, 학습 및 기억의 PKC-매개된 개선은 뇌졸중 후 기억 장애 및 뇌 손상의 치료를 위한 메카니즘으로서 인식되지 않았다. 또한, 본원에 기재된 PKC 활성제, 특히 학습 및 기억을 개선시키는 이들 화합물은 대뇌 허혈/뇌졸중 후 뇌 기능-복원 활성을 가지는 것으로 인식되지 않았다.

역사적으로 뇌졸중 치료법은 소수의 가능한 치료 선택으로 제한되어 왔다. 현재 사용가능한 유일한 약물 요법은, 예를 들면, 항혈전제로 이루어지고(혈전용해 요법, 예를 들면, 조직 플라스미노겐 활성제의 정맥내 주사), 이는 허혈성 사건 3시간 내에 투여되어야 한다. 다양한 유형의 잠재적인 신경보호제가 임상 실험에서 시험되었음에도 불구하고, 특히 뇌졸중 후에 사용된 경우의 무효능 및 관련 독성 때문에, 어느 것도 임상학적 용도로 승인되지 않았다. 본 발명의 명세서에 기재된 화합물은, 사람에서 내약성이 좋다고 이미 입증된 용량(브리오스타틴-1 용량)으로 동물 모델에서 허혈 후 24시간에 치료를 시작하는 경우, 효과적이었다. 아마도 PKC 표적의 하나인, 단백질 키나제 C(PKC), 예를 들면, 브리오스타틴-1, 직접 PKC 활성제, 및 메틸카테콜 디아세트산, 메틸카테콜의 유도체, 신경 성장 인자(NGF)의 강화제 또는 이의 활성 또는 가동 수단, 뇌 유도된 신경영양 인자(BDNF) 또는 기타 신경영양 인자를 표적으로 하는 화합물은 래트에서 대뇌 허혈로 유도된 뇌 손상 및 기억 장애에 대해 치료학적 가치를 갖는 것으로 밝혀졌다(동물 뇌졸중 모델). 뇌졸중 치료에서 치료제로서 이들 물질의 개발은 본 발명에 의해 제공된다.

발명의 개요

본 발명은 뇌졸중은 겪은 대상을 확인하는 단계 및 대상에게 단백질 키나제 C(PKC) 활성제 또는 4-메틸카테콜 아세트산(MCBA) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 뇌졸중의 하나 이상의 증상을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 뇌졸중의 치료 방법을 제공한다.

하나의 양태에서, PKC 활성제는 FGF-18, 마크로사이클릭 락톤, 벤조락탐, 피롤리디논 또는 이의 배합물이다. 바람직한 양태에서, 마크로사이클릭 락톤은 브리오스타틴 또는 네리스타틴이다. 또 다른 양태에서, 네리스타틴은 네리스타틴-1이다. 또 다른 양태에서, 브리오스타틴은 브리오스타틴-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18이다. 보다 바람직하게, 브리오스타틴은 브리오스타틴-1이다.

또 다른 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 4-메틸카테콜 아세트산(MCBA), 메틸카테콜의 기타 유도체 또는 뇌 유도된 신경영양 인자를 포함한다. MCBA 및 메틸카테콜의 기타 유도체는 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유도된 신경영양 인자(BDNF) 또는 기타 신경영양 인자를 활성화하거나 상향조절한다. NGF는 PKC의 활성을 활성화하거나, 상향조절하거나, 강화시키고, 이는 차례로 NGF를 상향조절하고, 활성화하고, 강화시킨다.

하나의 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여는 뇌졸중의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 내에 시작한다. 또 다른 양태에서, 투여는 뇌졸중의 1 내지 2일, 1 내지 3일, 1 내지 4일, 1 내지 5일, 또는 1 내지 7일에 시작한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여는 뇌졸중의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간 내에 시작한다. 또한 또 다른 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여는 뇌졸중의 1 내지 3시간, 1 내지 5시간, 1 내지 10시간, 1 내지 24시간, 3 내지 5시간, 3 내지 10시간, 3 내지 24시간, 5 내지 10시간, 5 내지 24시간, 또는 10 내지 24시간에 시작한다. 또한 또 다른 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여는 뇌졸중/허혈성 사건 후 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간 후에 시작한다. 또한 또 다른 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여는 뇌졸중/허혈성 사건 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일 후 에 시작한다.

하나의 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여를 포함하는 치료는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12주 동안 계속된다.

도 1은 훈련 시행 동안 래트의 공간 수중 미로 능력을 나타낸다. 데이타는 평균 ± SEM으로 나타낸다. Bry, 브리오스타틴-1; Isch, 대뇌 허혈; MCDA, 4-메틸카테콜-디아세트산.

도 2는 프로브 시험 동안 표적 4분면 비율을 나타낸다. Bry, 브리오스타틴-1; Isch, 허혈; MCDA, 4-메틸카테콜-디아세트산 ^*: p < 0.05. NS: p > 0.05.

A. 정의

본원에서 사용된 조성물의 "투여"는 경구, 피하, 복막내 및 근육내를 포함하는 임의의 투여 경로를 포함한다.

본원에서 사용된 "유효량"은 뇌졸중과 관련된 하나 이상의 증상을 감소시키는데 충분한 양이다.

본원에서 사용된 "단백질 키나제 C 활성제" 또는 "PKC 활성제"는 단백질 키나제 C에 결합함으로써 단백질 키나제 C에 의해 촉매된 반응의 속도를 증가시키는 물질을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "대상"은 포유동물이다.

본원에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분과 배합될 수 있고, 배합 후 활성 성분을 대상에 투여하는데 사용될 수 있는 화학적 조성물을 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "생리학적으로 허용되는" 에스테르 또는 염은 약제학적 조성물의 임의의 다른 성분들과 혼화성이고 조성물이 투여되는 대상에 해롭지 않은 활성 성분의 에스테르 또는 염 형태를 의미한다.

또한, 본원에서 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체"는, 이로써 제한되지는 않지만, 부형제; 계면활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 향미제; 착색제; 보존제; 생리학적으로 분해가능한 조성물, 예를 들면, 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁제; 분산제 또는 습윤제; 유화제, 완화제; 완충제; 염; 증점제; 충전제; 유화제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 안정화제 및 약제학적으로 허용되는 중합체성 또는 소수성 물질 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 다른 "추가의 성분"은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 본원에 참조로서 인용되는 문헌[참조: Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa.]에 기재되어 있다.

본원에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 분야에 공지된 임의의 방법 또는 이후로 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 예비 방법은 활성 성분을 담체 또는 하나 이상의 기타 보조 성분과 회합시킨 다음, 필요하거나 목적되는 경우, 생성물을 목적하는 단일 또는 다중 용량 단위로 성형하거나 포장하는 단계를 포함한다.

본원에 제공된 약제학적 조성물의 기재가 원칙적으로 사람에 대해 전문의 처방(ethical) 투여에 적합한 약제학적 조성물을 지시하지만, 당해 분야의 숙련가들는 이러한 조성물은 일반적으로 모든 종류의 동물에 대한 투여에 적합함을 이해할 것이다. 다양한 동물에 대한 투여에 적합한 조성물을 만들기 위한, 사람에 대한 투여에 적합한 약제학적 조성물의 개질은 잘 이해되고, 통상 숙련된 수의학 약학자는, 만약에 있다면, 단지 통상적인 실험만을 수행함으로써 이러한 개질을 설계하고 수행할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여가 계획되는 대상은, 이로써 제한되지는 않지만, 사람 및 기타 영장류, 및 기타 포유동물을 포함한다.

신규한 치료제 및 몇몇 동물 모델에서의 이용가능성의 개발을 향한 진행에도 불구하고, 여전히 스크리닝을 위한 개선된 동물 모델에 대한 긴급한 요구가 존재한다.

B. 단백질 키나제 C(PKC)

PKC 유전자 부류는 현재 다음 4개의 하위 그룹으로 나뉘는 11개의 유전자로 이루어진다: 1) 종래의 PKCα, β₁, β₂(β₁ 및 β₂는 동일한 유전자의 대안적인 삽입 형태이다) 및 γ; 2) 신규한 PKCδ, ε, η 및 θ; 3) 부정형 PKCζ, λ, η 및 i; 및 4) PKCμ. PKCμ는 측정되지 않은 트랜스멤브레인 도메인을 가짐으로써 상이한 신규한 PKC 동형과 유사하다[리뷰 참조: Blohe et al., (1994) Cancer Metast. Rev. 13: 411; Ilug et al., (1993) Biochem J. 291: 329; Kikkawa et al., (1989) Ann. Rev. Biochem. 58: 31]. α, β₁, β₂ 및 γ 동형은 C^{2 +}, 인지질 및 디아실글리세롤-의존성이고, PKC의 종래의 동형을 나타내는 반면, 다른 동형은 인지질 및 디아실글리세롤에 의해 활성화되지만 Ca²⁺에 의존하지는 않는다. 모든 동형은 5종의 다양한(V1-V5) 영역을 포함하며, α, β 및 γ 동형은 높게 보존되는 4개(C1-C4)의 구조적 도메인을 함유한다. PKC α, β 및 γ를 제외한 모든 동형은 C2 도메인을 갖지 않고, λ η 및 동형은 또한 디아실글리세롤이 결합하는 C1에서의 2개의 시스테인-풍부 아연 핑거 도메인 중의 9개를 갖지 않는다. C1 도메인은 또한 모든 동형 중에서 높게 보존되고, 효소의 불활성 배열을 생성하는 기질-결합 위치를 차단함으로써 자가조절 기능을 제공하는 의사기판(pseudosubstrate) 서열을 함유한다[참조: House et al., (1987) Science 238, 1726].

이러한 구조적 특징 때문에, 다양한 PKC 동형은 생리학적 자극에 반응하는 신호 전달[참조: Nishizuka(1989) Cancer 10: 1892] 뿐만 아니라 신생물의 변형 및 분화[참조: Glazer(1994) Protein Kinase C, J. F. Kuo, ed., Oxford U. Press at pages 171-198]에서 고도로 특수한 역할을 하는 것으로 생각된다. 공지된 PKC 조절제에 대한 논의는 국제공개공보 제PCT/US97/08141호, 미국 특허 제5,652,232호, 제6,080,784호, 제5,891,906호, 제5,962,498호, 제5,955,501호, 제5,891,870호 및 제5,962,504호를 참조한다(상기 각각은 전문이 본원에 참조로서 인용된다).

개별적인 PKC 동질효소가 약리학적 개척을 위한 기반을 제공하는 생리학적 과정에 중요한 역할을 한다는 증거가 증가하고 있다. 그 중 하나는 PKC의 특이적인(바람직하게는 동질효소 특이적인) 활성제의 설계이다. 당해 접근법은 촉매 도메인이 PKC의 동질효소 특이성에 우선적으로 반응하는 도메인이 아니라는 사실 때문에 복잡하다. 이들은 반대되는 생물학적 효과와 함께 다른 신호 전달 경로의 효과에 우선하는 방식을 제공할 수 있다. 대안적으로, 급성 활성화 후 PKC의 하향조절을 유도함으로써, PKC 활성제는 장기간 길항작용을 유발할 수 있다. 브리오스타틴은 현재 항암제로서 임상 실험 중에 있다. 브리오스타틴은 PKC의 하향조절 도메인에 결합하고 효소를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 브리오스타틴은 PKC의 동질효소-선택적 활성제의 예이다[참조: 예를 들면, 전문이 본원에 참조로서 인용되는 국제공개공보 제WO 97/43268호]. 공지된 PKC 조절제에 대한 논의를 위하여 국제공개공보 제PCT/US97/08141호, 미국 특허 제5,652,232호, 제6,043,270호, 제6,080,784호, 제5,891,906호, 제5,962,498호, 제5,955,501호, 제5,891,870호 및 제5,962,504호를 참조한다(상기 각각은 전문이 본원에 참조로서 인용된다).

PKC 활성제의 몇몇 부류는 확인되었다. 하지만, 포르볼 에스테르는 이의 종양 촉진 활성 때문에 최종적으로는 약물 개발에 적합한 화합물이 아니다[참조: Ibarreta et al., (1999) Neuro Report 10(5&6): 1035-40]. 특히 흥미로운 것은 PKC를 자극하는 작용을 하는 마크로사이클릭 락톤(즉, 브리오스타틴 부류 및 네리스타틴 부류)이다. 브리오스타틴 부류 화합물 중에서, 브리오스타틴-1은 PKC를 활성화시키는 것으로 보여지고 종양 촉진 활성이 없는 것으로 입증되었다. 또한 브리오스타틴-1의 용량 반응 곡선이 이중상(biphasic)이기 때문에, PKC 활성제로서 브리오스타틴-1은 유용하다. 추가로, 브리오스타틴-1은 PKCα, PKCδ 및 PKCε을 포함하는 PKC 동질효소의 차별적인 조절을 입증한다. 브리오스타틴-1은 동물 및 사람에서 독성 및 안정성 연구가 진행되고, 항암제로서 활발하게 조사되었다. 당해 연구에서 브리오스타틴-1의 용도는 사람에서 주요 부작용이 근육통임을 입증하였다. 유효한 용량의 일례는 정맥내 주사로 40μg/m²/주이다.

마크로사이클릭 락톤, 특히 브리오스타틴-1은 미국 특허 제4,560,774호(전문이 본원에 참조로서 인용된다)에 기재되어 있다. 마크로사이클릭 락톤 및 이의 유도체는 또한 미국 특허 제6,187,568호, 제6,043,270호, 제5,393,897호, 제5,072,004호, 제5,196,447호, 제4,833,257호 및 제4,611,066호(전문이 본원에 참조로서 인용된다)에 기재되어 있다. 상기 특허에는 다양한 화합물 및 소염제 또는 항종양제로서의 이의 용도를 포함한 마크로사이클릭 락톤에 대한 다양한 용도가 기재되어 있다[참조: Szallasi et al., (1994) Journal of Biological Chemistry 269(3): 2118-24; Zhang et al., (1996) Caner Research 56: 802-808; Hennings et al., (1987) Carcinogenesis 8(9): 1343-1346; Varterasian et al., (2000) Clinical Cancer Research 6: 825-828; Mutter et al., (2000) Bioorganic & Medicinal Chemistry 8: 1841-1860; 각각은 전문이 본원에 참조로서 인용된다].

또한 당해 분야의 숙련가가 인식할 수 있는 바와 같이, 마크로사이클릭 락톤 화합물 및 이의 유도체, 특히 브리오스타틴 부류는 조합 합성 기술의 여지가 많고, 따라서 화합물 라이브러리는, 이로써 제한되지는 않지만, 조성물의 효능 및 안정성을 포함하는 약리학적 매개변수를 최적화시키도록 생성될 수 있다. 추가로, 이들 화합물 라이브러리를 검정하여 바람직하게는 α-세크레타제 및/또는 PKC를 조절하는 이들 일원을 결정할 수 있다.

천연 생성물 및 발효 브로쓰의 조합 라이브러리 고 처리량 스크리닝은 몇몇의 신규한 약물의 발견을 야기하였다. 오늘날에는, 화학적 다양성의 생성 및 스크리닝을 주요 화합물의 발견을 위한 주요 기술로서 광범위하게 사용하고, 이는 약물 발견 분야에서 확실히 주요한 기초적 진보이다. 추가로, 심지어 "주요" 화합물을 확인한 후에도, 조합 기술은 목적하는 생물학적 활성의 최적화를 위한 가치있는 도구를 제공한다. 인식될 수 있는 바와 같이, 주요 반응은 약제학적, 또는 기타 생물학적 또는 의학적으로 관련된 활성 또는 물질 관련된 특질의 스크리닝을 위해 화합물의 조합 라이브러리의 생성에 용이하게 적합하다. 본 발명의 목적을 위한 조합 라이브러리는 목적하는 특성을 위해 함께 스크리닝될 수 있는 화학적으로 관련된 화합물의 혼합물이고, 상기 라이브러리는 용액 중에 있거나 상기 지지체에 공유 결합될 수 있다. 단일 반응으로 다수의 관련된 화합물을 제조하는 것은 수행될 필요가 있는 스크리닝 과정의 수를 상당히 감소시키고 단순화시킨다. 적절한 생물학적 특성을 위한 스크리닝은 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 결합하여 α-세크레타제 및/또는 PKC를 효과적으로 조절하는 하나 이상의 본 발명의 화합물의 능력을 측정하기 위한 방법을 제공한다.

하기 기재된 조합 라이브러리를 생성하기 위하여 당해 분야에서 다양한 기술을 사용할 수 있지만, 본 발명은 하기 실시예 및 설명에 의해 제한되는 것을 의도하지 않음이 이해될 것이다[참조: 예를 들면, Blondelle et al., (1995) Trends Anal. Chem. 14: 83; 미국 특허 제5,359,115호, 제5,362,899호, 제5,288,514호: PCT 국제공개공보 제WO 94/08051호; Chen et al., (1994) JACCS 1 6:266 1: Kerr et al., (1993) JACCS I 1 5:252; PCT 국제공개공보 제W0 92/10092호, 제W0 93/09668호, 제W0 91/07087호 및 제W0 93/20242호; 상기 각각은 본원에 참조로서 인용된다]. 따라서, 약 16 내지 1,000,000 이상의 디버소머(diversomer)의 순서로 다양한 라이브러리를 합성하고 특정한 활성 또는 특성에 대해 스크리닝할 수 있다.

일반적으로 브리오로그라고 불리는 브리오스타틴의 유사체는 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 PKC 활성제의 하나의 특정한 부류이다. 하기 표는 몇몇 브리오로그의 구조적 특징을 요약하고, 이는 브리오로그가 PKC에 대한 이들의 친화력에서 매우 다양함(0.25nM 내지 10μM)을 입증한다. 구조적으로, 이들은 모두 유사하다. 브리오스타틴-1이 2개의 피란 환 및 하나의 6원 사이클릭 아세탈을 가지고 있는 반면, 대부분의 브리오로그에서 브리오스타틴-1의 피란 중 하나는 제2의 6원 아세탈 환으로 대체된다. 이러한 개질은 브리오스타틴-1에 비해, 예를 들면, 강한 산 또는 염기 둘 다에서 브리오로그의 안정성을 감소시키지만, 생리학적 pH에서는 거의 의미가 없다. 브리오로그는 또한 브리오스타틴-1(988)과 비교하여 보다 낮은 분자량(약 600 내지 755 범위)를 갖고, 이는 혈액-뇌 장벽을 통하는 이동을 촉진시키는 성질이 있다.

유사체 1[참조: Wender et al., (2004) Curr Drug Discov Technol. 1: 1; Wender et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 6624; Wender et al., (2002) Am Chem Soc. 124: 13648; 각각은 전문이 본원에 참조로서 인용된다]은 PKC에 대한 가장 높은 친화력을 갖는다. 당해 브리오로그는 브리오스타틴-1 보다 약 100배 더 효능이 있다. 유사체 1만이 브리오스타틴 보다 높은 PKC에 대한 친화력을 나타낸다. 브리오스타틴-1의 A 환을 갖지 않는 유사체 2는 PKC에 대한 높은 친화력을 유지하는 가장 단순한 유사체이다. 활성 브리오로그 이외에, 위치 26에서 아세틸화되는 유사체 7d는 실질적으로 PKC에 대한 친화력을 갖지 않는다.

또한 B-환 브리오로그는 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합하다. 이들 합성 브리오로그는 낮은 나노몰 범위의 친화력을 갖는다[참조: Wender et al., (2006) Org Lett. 8: 5299; 전문이 본원에 참조로서 인용된다]. B-환 브리오로그는 완전하게 합성되는 이점을 갖고, 천연 공급원으로부터 정제할 필요가 없다.

B-환 브리오로그에 대한 PKC 결합 친화력

적합한 브리오스타틴 유사체의 세번째 부류는 A-환 브리오로그이다. 이들 브리오로그는 브리오스타틴 I보다 약간 더 낮은 PKC에 대한 친화력을 갖지만(브리오로그 3, 4 및 5에 대해 각각 6.5, 2.3 및 1.9nM), 보다 낮은 분자량을 갖는다.

다수의 디아실글리세롤(DAG) 유도체는 단백질 키나제 C에 결합하여 이를 활성화시킨다[참조: Niedel et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 36; Mori et al., (1982) J. Biochem(Tokyo) 91: 427; Kaibuchi et al., (1983) J. Biol. Chem. 258: 6701]. 하지만, DAG 및 DAG 유도체는 약물로서의 가치가 제한된다. 디아실글리세롤에 의한 PKC의 활성은 이들이 디아실글리세롤 키나제 및 리파제에 의해 빠르게 물질대사되기 때문에 일시적이다[참조: Bishop et al., (1986) J. Biol. Chem. 261: 6993; Chung et al., (1993) Am. J. Physiol. 265: C927; 전문이 본원에 참조로서 인용된다]. 지방산 치환은 활성의 강도를 결정한다. 불포화 지방산을 갖는 디아실글리세롤이 가장 활성이다. 입체이성체 배열이 또한 중요하다. 1,2-sn 배열을 가진 지방산이 활성인 반면, 2,3-sn-디아실글리세롤 및 1,3-디아실글리세롤은 PKC에 결합하지 않는다. Cis-불포화 지방산은 디아실글리세롤과 상승작용한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 용어 "PKC 활성제"는 DAG 또는 DAG 유도체, 예를 들면, 포르볼 에스테르를 명시적으로 제외한다.

이소프레노이드는 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 PKC 활성제이다. 예를 들면, 파르네실 티오트리아졸은 Kd가 2.5μM인 PKC를 활성화시키는 합성 이소프레노이드이다. 예를 들면, 파르네실 티오트리아졸은 디올레오일글리세롤과 동등한 효능을 갖지만[참조: Gilbert et al., (1995) Biochemistry 34: 3916; 이는 전문이 본원에 참조로서 인용된다], 지방산의 가수분해성 에스테르를 갖지 않는다. 파르네실 티오트리아졸 및 관련된 화합물은 안정하고 지속적인 PKC 활성제이다. 이의 낮은 MW(305.5) 및 하전된 그룹의 부재로 인해, 파르네실 티오트리아졸은 혈액-뇌 장벽을 쉽게 건널 수 있다.

옥틸인돌락탐 V는 텔레오시딘과 관련된 비-프로볼 단백질 키나제 C 활성제이다. 옥틸인돌락탐 V, 특히 (-)-에난티오머의 이점은 보다 큰 대사 안정성, 높은 효능[참조: Fujiki et al., (1987) Adv. Cancer Res. 49: 223; Collins et al., (1982) Biochem. Biophys. Res. Commun. 104: 1159; 각각은 전문이 본원에 참조로서 인용된다](EC50 = 29nM) 및 혈액-뇌 장벽을 통하는 이동을 촉진하는 낮은 분자량을 포함한다.

그니디마크린은 뮤린 백혈병 및 고형 종양에서 0.1 내지 1nM의 농도로 강력한 항종양 활성을 나타내는 다프난 유형의 디테르펜이다. 이는 K562 세포에서 약 3nM의 농도로 PKC 활성제로서 작용하고, Cdc25A의 억제 및 사이클린 의존 키나제 2(Cdk2)의 후속적인 억제(100% 억제는 5ng/ml에서 달성된다)를 통해 G1/S 상에서 세포 주기 진행을 조절한다. 그니디마크린은 브리오스타틴과 유사하지만 다소 작은(MW = 774.9) 헤테로사이클릭 천연 생성물이다.

이리팔리달은 이리스 팔리다로부터 분리된 바이사이클릭 트리테르페노이드이다. 이리팔리달은 마이크로몰 내지 나노몰 범위의 GI50(성장을 50% 억제하는데 필요한 농도) 값과 함께, NCI 60 세포주 스크린에서 항증식성 활성을 나타낸다. 이는 PKCα에 높은 친화력(Ki = 75.6nM)으로 결합한다. 이는 RasGRP3-의존 방식으로 ERK1/2의 인산화를 유도한다. M.W. 486.7. 이리팔리달은 브리오스타틴의 크기의 단지 약 반 정도의 크기이고, 하전된 그룹을 갖지 않는다.

인게놀은 포르볼과 관련된 디테르페노이드이지만 이보다 매우 낮은 독성을 갖는다. 이는 유액 식물 유럽 작은땅빈대(Euphorbia peplus)로부터 유도된다. 인게놀 3,20-디벤조에이트는, 예를 들면, PKC에 대한 결합력이 [3H]포르볼 디부티레이트에 필적한다(결합 Ki = 240nM)[참조: Winkler et al., (1995) J. Org. Chem. 60: 1381; 본원에 참조로서 인용된다]. 인게놀-3-안겔레이트는 국소적으로 사용되는 경우 편평 세포 암종 및 흑색종에 대해 항종양 활성을 갖는다[참조: Ogbourne et al., (2007) Anticancer Drugs. 18: 357; 본원에 참조로서 인용된다].

N-(n-헵틸)-5-클로로-1-나프탈렌설폰아미드(SC-10) 및 N-(6-페닐헥실)-5-클로로-1-나프탈렌설폰아미드를 포함하는 나프탈렌설폰아미드는 또 다른 부류의 PKC 활성제의 일원이다. SC-10은 포스파티딜세린과 유사한 메카니즘을 사용하여 칼슘-의존 방식으로 PKC를 활성화시킨다[참조: Ito et al., (1986) Biochemistry 25: 4179; 본원에 참조로서 인용된다]. 나프탈렌설폰아미드는 브리오스타틴과 상이한 메카니즘으로 작용하고, 브리오스타틴 또는 또 다른 부류의 PKC 활성제의 일원과 상승작용적 효과를 나타낼 것으로 예상된다. 구조적으로, 나프탈렌설폰아미드는 칼모둘린(CaM) 길항제 W-7과 유사하지만, CaM 키나제에 대한 효과는 없는 것으로 보고된다.

리놀레산 유도체 DCP-LA(2-[(2-펜틸사이클로프로필)메틸]사이클로프로판옥탄산)는 공지된 PKC의 소수의 공지된 동형-특이적 활성제 중 하나이다. DCP-LA는 100nM에서 최대 효과로 PKCε를 선택적으로 활성화시킨다[참조: Kanno et al., (2006) J. Lipid Res. 47: 1146]. SC-10와 같이, DCP-LA는 디아실글리세롤 결합 위치 대신, PKC의 포스파티딜세린 결합 위치와 상호작용한다.

직접적인 PKC 활성화에 대한 대안적인 접근은 내인성 활성제, 디아실글리세롤의 수준을 증가시키는 것이다. 디아실글리세롤 키나제 억제제, 예를 들면, 6-(2-(4-[(4-플루오로페닐)페닐메틸렌]-1-피페리디닐)에틸)-7-메틸-5H-티아졸로[3,2-a]피리미딘-5-온(R59022) 및 [3-[2-[4-(비스-(4-플루오로페닐)메틸렌]피페리딘-1-일)에틸]-2,3-디하이드로-2-티옥소-4(1H)-퀴나졸리논(R59949)은 내인성 리간드 디아실글리세롤의 수준을 강화시키고, 이에 따라 PKC 활성을 야기한다[참조: Meinhardt el al., (2002) Anti-Cancer Drugs 13: 725].

다양한 성장 인자, 예를 들면, 섬유아세포 성장 인자 18(FGF-18) 및 인슐린 성장 인자는 PKC 경로를 통해 기능한다. FGF-18 발현은 학습에서 상향조절되고, 인슐린 성장 인자의 수용체는 학습과 연관된다. 이들 또는 기타 성장 인자에 의한 PKC 신호 경로의 활성화는 단백질 키나제 C를 활성화시키는 추가의 잠재적인 수단을 제공한다.

NGF 및 BDNF와 같은 성장 인자의 합성 및/또는 활성화를 자극하는 성장 인자 활성제, 예를 들면, 4-메틸 카테콜 유도체, 예를 들면, 4-메틸카테콜 아세트산(MCBA)은 또한 PKC 뿐만 아니라 시냅스 형성 및/또는 신경 브랜칭(neuritic branching)을 야기하는 수렴 경로를 활성화시킨다.

본 발명의 화합물은 경구, 직장, 비경구(예를 들면, 피하, 근육내 및 정맥내), 경막외, 경막내, 관절내, 국소적 및 구강 투여를 포함하는 다양한 경로 및 다양한 용량 형태로 투여될 수 있다. 성인 사람을 위한 용량 범위는 환자의 연령, 체중 및 상태 및 투여 경로를 포함하는 다수의 안자에 따라 좌우될 것이다.

모든 문헌, 논문, 특허 또는 기타 공보 및 참조문헌은 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 본원에서 임의의 화합물에 대한 언급은 라세미체 뿐만 아니라 단일 에난티오머도 포함한다.

하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되지 않는다.

실시예 1: 뇌졸중의 전반적인 허혈 모델

래트(수컷, 위스타(Wistar), 200 내지 225g)를 6개의 그룹(각각 8마리)으로 무작위로 나누고, 실험 전 1주일 동안 사육하였다. 대뇌 혈류 및 산소 공급의 일시적 또는 영구적 제한으로 허혈성 뇌졸중을 야기하였다. 혈관성 기억 장애를 유도하기 위해 사용한 전반적인 허혈 모델은 단기간 전신성 저산소증와 결합된 이중 혈관 폐색이었다. 양측의 일반 경동맥의 결찰을 마취하에(펜토바르비탈, 60mg/kg, i.p.) 수행하였다. 수술로부터 1주 회복 후, 래트를 14분 저산소(유리 단지에서 산소 5%)에 노출시켰다. 대조군 래트(허위 수행 및 비히클 대조군)를 양측 일반 경동맥으로부터 분리하는 동일한 절개 및 14분 공기(유리 단지 내에서)에 적용하였다. 수술 과정 동안과 동물이 완전히 회복될 때까지 가열 광원을 사용하여 체온을 37 내지 37.5℃로 유지시켰다.

실시예 2: 브리오스타틴 및 MCDA 치료

브리오스타틴-1을 20μg/m²으로 투여하고(꼬리 i.v., 2용량/주, 10 용량), 이는 저산소성 사건의 후 24시간에 시작하였다. 4-메틸카테콜-디아세트산(MCDA, 잠재적인 NGF 및 BDNF 촉진제(booster))을 개별적인 래트 그룹에서 1.0mg/kg으로 투여하였다(i.p., 동일한 5주 기간 동안 매일).

마지막 브리오스타틴-1, MCDA 또는 비히클 투여 일주일 후, 래트를 수중 미로 공간 학습 과제에서 훈련시킨 후(4일 동안 1일 당 2회 시행 훈련), 프로브 시험을 하였다. 프로브 시험 후 가시적인 플랫폼 시험이 제공되었다. 결과를 도 1에 기재한다.

전반적으로, 6개의 그룹 사이에서 상당한 학습 차이가 존재하였다(도 1; F_5,383 = 27.480, p < 0.001; 아노바(ANOVA)). 상세한 분석으로, 대조군 그룹에 비해, 시행 동안 탈출 시간의 유의한 차이점이 없고(F_7,63 = 0.102, p > 0.05), 상당히 손상된 학습이 존재하는 반면(그룹 차이: F_1,127 = 79.751, p < 0.001), 다른 5개의 그룹의 래트는 모두 과제를 학습하였기 때문에(시행 동안 MCDA 치료한 허혈 래트: p < 0.05 및 다른 4개의 그룹: p < 0.001), 허혈 그룹이 공간 미로 과제를 학습하지 않았음이 밝혀졌다. 브리오스타틴-1 요법은 대조군 래트로부터 통계적으로 상이하지 않은 수행 수준에 대해(브리오스타틴-1 치료된 허혈 그룹 대 대조군 래트: F_1,127 = 0.001, p > 0.05) 수행을 크게 개선시켰다(브리오스타틴-1 치료된 허혈 그룹 대 허혈 래트: F_1,127 = 72.782, p < 0.001). 또한, MCDA 치료는 허혈 래트의 학습을 개선시키지만(NCDA 치료된 허혈 래트 대 허혈 래트: F_1,127 = 15.584, p < 0.001), MCDA 치료된 허혈 래트와 대조군 래트 간의 차이점이 5주 치료 후 유의하게 남았다(NCDA 치료된 허혈 래트 대 대조군 래트: F_1,127 = 16.618, p < 0.001). 대조군과 브리오스타틴-1-단독 그룹 간의 차이(브리오스타틴-1 대 대조군: F_1,127 = 0.010, p > 0.05) 및 대조군 및 MCDA-단독 그룹 간의 차이(MCDA 대 대조군: F_1,127 = 0.272, p > 0.05)는 없었다.

허혈 그룹의 래트는 프로브 시험에서 표적 선호를 나타내지 않았고(F_3,31 = 0.096, p > 0.05), 다른 5개의 그룹의 래트는 모두 프로브 시험에서 표적 4분면 선호를 나타내었다(모두 p < 0.005). 데이타를 표적 4분면 비율을 사용하여 분석하였다(프로브 시험 동안, 표적 4분면 거리를 비표적 4분면 값의 평균으로 나눈다; 도 2). 그룹 간의 표적 4분면 비율에서 유의한 차이가 있었다(F_5,47 = 5.081, p < 0.001). 상세한 분석으로, 대조군과 허혈 래트 간의 그룹 차이(F_1,15 = 9.451, p < 0.01), 허혈 및 브리오스타틴-1 치료된 허혈 간의 그룹 차이(F_1,15 = 10.328, p < 0.01) 및 MCDA 치료된 허혈과 허혈 래트 간의 그룹 차이(F_1,15 = 5.623, p < 0.05)가 존재하지만, 대조군과 브리오스타틴-1 치료된 허혈 래트 간의 차이(F_1,15 = 0.013, p > 0.05), MCDA 치료된 허혈 및 대조군 그룹 간의 차이(F_1,15 = 2.997, p > 0.05), 대조군과 브리오스타틴-1-단독 래트 간의 차이(F_1,15 = 0.064, p > 0.05) 및 대조군과 MCDA-단독 래트 간의 차이(F_1,15 = 0.0392, p > 0.05)는 없는 것으로 밝혀졌다. 프로브 시험 후 측정된 가시적인 플랫폼 시험으로 그룹 간의 유의한 차이는 없는 것으로 밝혀졌고(F_5,47 = 0.115, p > 0.05), 이는 래트의 감각운동 능력 간의 유의한 그룹 차이가 없음을 지시한다.

실시예 3: 브리오스타틴 치료

약 14분 동안 낮은 산소(약 5%)와 함께, 양측의 일반 경동맥을 영구적으로 차단하여, 전반적인 대뇌 허혈/저산소증을 숫컷 위스타 래트(225 내지 250g)에서 유도하였다. 브리오스타틴-1을 15μg/m²으로 투여하고(꼬리 정맥을 통해, 2용량/주, 10 용량), 이는 허혈/저산소증 사건 후 약 24시간에 시작하였다. 공간 학습(4일 동안 2시행/일) 및 기억(1분의 프로브 시험, 마지막 시행 후 24시간) 과제를 마지막 용량 후 9일에 수행하였다. 전반적으로, 그룹(F_3,255 = 31.856, p < 0.001) 및 그룹 x 시행(F_21,255 =1.648, p < 0.05) 간의 유의한 차이가 있었다. 전반적인 대뇌 허혈은 공간 학습을 손상시켰다(허혈 대 허위 수행: F_1,127 = 79.751, p > 0.001). 학습 장애는 브리오스타틴-1 치료에 의해 회복되고(브리오스타틴-1 + 허혈 대 허혈: F_1,127 = 50.233, p < 0.001), 반면 브리오스타틴-1 단독은 학습에 영향을 주지 않았다(브리오스타틴-1 대 허위 수행: F_1,127 = 2.258, p > 0.05; 마지막 용량 후 9일).

기억 보존 시험에서, 허위 수행 래트는 표적 4분면 선호를 나타내었다. 이러한 우수한 기억 보존은 허혈 래트에서 관찰되지 않았고, 이는 손상된 공간 기억을 의미한다. 브리오스타틴-1 요법은 허위 수행 래트의 수준에 비해 허혈 후 기억 보존을 효과적으로 회복시켰다. 브리오스타틴-1 단독은 허위 수행 대조군 래트와 비교하여 표적 4분면 선호에 유의한 효과를 갖지 않았다. 그룹 간의 4분면 비율(표적 4분면 수영 거리를 비-표적 4분면에서의 평균 수영 거리로 나누어 계산한다: F_3,31 = 6.181, p < 0.005)에서의 유의한 차이가 있었다. 상세한 분석으로, 허혈 래트와 허위 수행 대조군 래트 간의 차이(F_1,15 = 9.451, p < 0.01) 및 허혈 래트와 브리오스타틴-1 치료된 허혈 래트 간의 차이(F_1,15 = 10.328, p < 0.01)는 유의하지만, 브리오스타틴-1 치료된 허혈 래트와 허위 수행 대조군 간의 차이(F_1,15 = 0.0131, p > 0.05) 및 허위 수행 대조군 래트와 브리오스타틴-1 단독 래트 간의 차이(F_1,15 = 0.161, p > 0.05)는 유의하지 않음이 밝혀졌다. 이들 결과는, 허혈성 사건 후 약 7주 동안 시험한 바, 대뇌 허혈/저산소증이 공간 학습 및 기억의 손상을 야기함을 증명한다. 적절한 개입 없이는 시간 프레임 동안 손상은 지속되고 회복 불가능하지만, 만성 브리오스타틴-1 치료에 의해, 심지어 치료가 허혈성 사건 후 24시간에 시작된 넓은 치료학적 시간-시기의 경우에도 회복되었다.

Claims (41)

1. 허혈성 사건을 겪은 대상을 확인하는 단계 및 상기 대상에게 단백질 키나제 C(PKC) 활성제 또는 4-메틸카테콜 아세트산(MCBA), 또는 메틸카테콜의 기타 유도체, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 뇌졸중의 하나 이상의 증상을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 뇌졸중의 치료 방법으로서,

   여기서, PKC 활성제는 브리오로그, 포르볼 에스테르 이외의 디아실글리세롤 유도체, 이소프레노이드, 다프난-유형 디테르펜, 바이사이클릭 트리테르페노이드, 나프탈렌설폰아미드, 리놀레산 유도체, 디아실글리세롤 키나제 억제제, 성장 인자 활성제 또는 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
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7. 제1항에 있어서, 약제학적 조성물이 4-메틸카테콜 아세트산을 포함하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 투여가 뇌졸중 발생 후 1일 내에 시작되는 방법.
9. 제1항에 있어서, 투여가 뇌졸중 발생 후 2일 내에 시작되는 방법.
10. 제1항에 있어서, 투여가 뇌졸중 발생 후 3일 내에 시작되는 방법.
11. 제1항에 있어서, 투여가 뇌졸중 발생 후 1 내지 2일에 시작되는 방법.
12. 제1항에 있어서, 투여가 뇌졸중 발생 후 1 내지 3일에 시작되는 방법.
13. 제1항에 있어서, 치료가 1주의 기간 동안 계속되는 방법.
14. 제1항에 있어서, 치료가 2주의 기간 동안 계속되는 방법.
15. 제1항에 있어서, 치료가 3주의 기간 동안 계속되는 방법.
16. 제1항에 있어서, 치료가 4주의 기간 동안 계속되는 방법.
17. 제1항에 있어서, 치료가 6주의 기간 동안 계속되는 방법.
18. 제1항에 있어서, 치료가 뇌졸중-유도된 뇌 손상을 역전시키는 방법.
19. 제1항에 있어서, 치료가 뇌졸중-유도된 기억 장애를 역전시키는 방법.
20. 제1항에 있어서, 브리오로그가 B-환 브리오로그 또는 A-환 브리오로그인 방법.
21. 제20항에 있어서, B-환 또는 A-환 브리오로그가 약 600 내지 755의 분자량을 갖고, 0.25nM 내지 10μM의 PKC에 대한 친화력을 갖는 방법.
22. 제1항에 있어서, 브리오로그가

    

    인 방법.
23. 제1항에 있어서, 브리오로그가

    

    인 방법.
24. 제20항에 있어서, B-환 브리오로그가

    

    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
25. 제20항에 있어서, A-환 유사체가

    

    이고,

    R이 t-Bu, Ph 또는 (CH₂)₃p-Br-Ph인 방법.
26. 제1항에 있어서, 디아실글리세롤 유도체가 불포화 지방산으로 이루어진 방법.
27. 제26항에 있어서, 지방산이 1,2-sn 배열인 방법.
28. 제26항에 있어서, 지방산이 cis-불포화 지방산인 방법.
29. 제1항에 있어서, PKC 활성제가 옥틸인돌락탐 V인 방법.
30. 제29항에 있어서, 옥틸인돌락탐 V가 (-)-에난티오머인 방법.
31. 제1항에 있어서, 다프난 유형의 디테르펜이 그니디마크린인 방법.
32. 제1항에 있어서, 바이사이클릭 트리테르페노이드가 이리팔리달인 방법.
33. 제1항에 있어서, 디테르페노이드가 인게놀인 방법.
34. 제1항에 있어서, 디테르페노이드가 인게놀 3,20-디벤조에이트인 방법.
35. 제1항에 있어서, 디테르페노이드가 인게놀-3-안겔레이트인 방법.
36. 제1항에 있어서, 나프탈렌설폰아미드가 N-(n-헵틸)-5-클로로-1-나프탈렌설폰아미드 또는 N-(6-페닐헥실)-5-클로로-1-나프탈렌설폰아미드인 방법.
37. 제1항에 있어서, 린콜산 유도체가 2-[(2-펜틸사이클로프로필)메틸]사이클로프로판옥탄산인 방법.
38. 제1항에 있어서, 디아실글리세롤 키나제 억제제가 6-(2-(4-[(4-플루오로페닐)페닐메틸렌]-1-피페리디닐)에틸)-7-메틸-5H-티아졸로[3,2-a]피리미딘-5-온인 방법.
39. 제1항에 있어서, 디아실글리세롤 키나제 억제제가 [3-[2-[4-(비스-(4-플루오로페닐)메틸렌]피페리딘-1-일)에틸]-2,3-디하이드로-2-티옥소-4(1H)-퀴나졸리논인 방법.
40. 제1항에 있어서, 성장 인자 활성제가 메틸 카테콜 유도체인 방법.
41. 제1항에 있어서, 성장 인자 활성제가 4-메틸카테콜 아세트산인 방법.

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