KR20090073987A - 인간유두종바이러스 유전자형 검사를 위한 프라이머, 프로브 및 이를 포함하는 ｄｎａ칩, 이의 검사 방법 및 검사 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 유두종바이러스(human papilloma virus, HPV) 진단 및 유전자형 검사에 사용되는 프라이머, 프로브, DNA칩, 검사용 키트 및 HPV 유전자형 검사방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, HPV 유전자형을 높은 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)를 가지고 검사할 수 있으며 기존의 HPV를 검사하는 방법에서는 확인할 수 없는 HPV의 중복감염 여부를 진단할 수 있다.
human papillomavirus, HPV, 인간유두종바이러스, PCR, 프라이머, 프로브
Description
본 발명은 인간유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV)의 유전자형 검사를 위한 프라이머, 프로브 및 이를 포함하는 DNA칩에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 HPV 유전자의 PCR 증폭에 사용되는 프라이머, 상기 증폭된 유전자와 특이적으로 결합하는 프로브 및 이를 이용한 HPV 유전자 진단 및/또는 검사를 위한 키트와 방법에 대한 것이다.
HPV는 토끼(cottontail rabbit)의 유두종에서 발견되었고, 약 45-55 nm의 8kb 크기의 이중나선상 DNA 바이러스로서 종양바이러스의 하나로 알려져 있다. Papovavirus과에 속하는 HPV는 사람에게 사마귀류(watt), 콘딜로마(condyloma) 등의 감염을 일으키는 등 토끼 이외의 동물에도 보편적으로 존재하는 것으로 알려져 있다.
HPV는 여성의 자궁경부암을 유발하며 피부암, 후두암 등, 기타 여러 가지 악성종양들과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다. HPV 감염은 매우 흔하며 여성들 중 약 75%가 성생활을 시작할 때 감염이 된다. 자궁경부암은 HPV에 감염된 지 10~20년 뒤에 발생하며 감염자의 20~25%가 암 전단계로 진행된다.
현재 약 120 여종 이상의 다른 유전형의 HPV가 알려져 있다. 이들 HPV 유형 가운데 생식기에 감염되는 HPV 유형으로는 HPV-16, -31, -33, -35, -52, -58, -67, -40, -43, -7, -32, -42, -6, -11, -74, -44, -55, -13, -61, -72, -62, -2, -27, -57, -3, -28, -29, -10, -54, -18, -39, -45, -59, -68, -70, -26, -69, -51, -30, -53, -56, -66, -34, -64 및 -73 등의 45 유형으로 이 가운데 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 HPV 유형으로는 고위험군(high-risk group)에 속하는 HPV-16, -18, -26, -30, -31, -33, -35, -45, -51, -52, -53, -56, -57, -58, -59, -61, -67, -68, -70 및 -73, -74의 22 유형과 저위험군(low-risk group에 속하는 HPV-2a, -3, -6, -10, -11, -32, -34, -40, -43, -44, -54, -55, -66 및 -69의 유형이 있다. 고위험군의 경우 90% 이상이 자궁경부암 상피조직에서 검출이 되고 있다.
환자가 어떤 HPV 유형에 감염되어 있는지를 알면, 향후 질병의 진행 방향을 예측할 수 있다. 따라서 HPV의 존재 여부 및 유형을 정확하게 검사하는 것이 중요하다.
종래의 HPV의 감염진단을 위해 사용하고 있는 방법으로는 서던블랏 혼성화법(Southern blot hybridization), 닷(슬랏) 블랏 혼성화법(dot (slot) blot hybridization)(ViraPap), 인시투 혼성화법(In situ hybridization), 하이브리드 캡쳐 시스템(hybrid capture system), PCR(polymerase chain reaction) 등이 있다.
이러한 기존의 진단방법들은 일부 정량화가 가능하거나 간편하다는 장점이 있으나, 진단의 목적으로 사용되기에는 시간이 오래 걸리거나 실험기법이 어렵고 HPV 유전자형을 진단하기에는 불편한 점이 있다.
최근 개발된 DNA 칩 방법은 유전자 증폭반응과 결합한 형태로서, 대량의 검체로부터 HPV 유전자형을 경제적, 시간적 문제점들이 없이 편리하게 검사할 수 있는 장점이 있다. 따라서 이 방법은 자궁경부암의 조기 진단과 예방 및 예후 관리에 매우 유용하게 사용할 수 있다.
FDA에서는 2003년부터 자궁경부암 검사로 세포 도말(PAP semear)과 HPV 감염을 동시에 검사하는 것을 권고하고 있다. 현재 HPV-16 및 HPV-18에 대한 백신이 개발되어 적용되고 있는데, 이러한 백신 효과의 모니터링을 위해 HPV 유전자형을 진단할 수 있는 장치(키트)및 방법이 필요하다. 또한 다양한 HPV 유전자형 감염에 대한 검사가 필수적이므로 HPV 유전자형을 진단할 수 있는 HPV 진단검사 장치(키트) 및 검사방법이 필요한 실정이다.
본 발명은 HPV 유전자를 증폭시키는 PCR용 프라이머를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 HPV 유전자형을 특이도 높게 검사할 수 있는 프로브를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 수십 종류의 HPV 유전자형을 신속하게 검사할 수 있는 DNA칩 및 검사키트를 제공하기 위한 것이다.
또한 본 발명은 수십 종류의 HPV 유전자형을 한 번의 검사를 통해 동시에 검사할 수 있는 HPV 유전자형 검사 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 염기서열을 포함하는, 인간유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV) 증폭을 위한 프라이머를 제공한다.
상기 염기서열은 5' 말단에 위치에 형광염료가 부착될 수 있으며, 상기 형광염료는 Cy3, Cy5, 비오틴 결합물질, 알렉사 647(Alexa 647), 알렉사 555(Alexa 555), (5-(2-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산)(EDANS), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스레드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 9 내지 44로 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 및 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, HPV에 상보적으로 결합하는 프로브를 제공한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 HPV-6,11,16,18,31,32,33,34,35,39,40,42,43,44,45,51,52,53,54,56,58,59,61,62,66,67,68,69,70,71,72,81,82,83,84 및 90 유형에 대응될 수 있다.
상기 서열번호 9 내지 44에 표시된 염기서열의 5‘ 말단에 아민기가 부착될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 언급한 프로브를 포함하는 HPV 유전자형 검사용 DNA칩을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은
DNA를 추출하기 위한 시약;
상기 DNA를 증폭시키기 위한 PCR용 프라이머; 및
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 프로브를 포함하는 HPV 유전자형 검사용 DNA칩;
을 포함하는 HPV 유전자 탐지용 또는 HPV 유전자형 검사용 키트를 제공한다.
상기 PCR용 프라이머는 서열번호 1 내지 6로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 PCR용 프라이머는 서열번호 1 및 2로 이루어진 세트(‘JK1 세트’라고 명명함), 서열번호 3 및 4로 이루어진 세트(‘JK2 세트’라고 명명함) 및 서열번호 5 및 6으로 이루어진 세트(‘JK3 세트’라고 명명함) 중에서 선택되는 하나의 세트일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은
자궁경부 탈락 세포로부터 DNA를 추출하는 단계;
HPV 증폭용 프라이머를 포함하는 PCR을 이용하여 상기 DNA를 증폭시키는 단계;
서열번호 9 내지 44로 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 HPV 프로브를 포함하는 DNA칩에, 상기 증폭된 DNA를 교잡반응시키는 단계; 및
상기 프로브와 특이적으로 교잡된 반응물을 통해 HPV 유전자형을 확인하는 단계;
를 포함하는 HPV 유전자형 검사방법을 제공한다.
상기 PCR을 이용하여 증폭시키는 단계에서, 컨트롤 유전자로 서열번호 7 및 8로 표시되는 베타글로빈 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다.
상기 증폭된 DNA를 교잡반응시키는 단계에서, 상기 서열번호 9 내지 44에 표시된 염기서열의 5' 말단에 아민기가 부착될 수 있다.
상기 HPV 유전자형을 확인하는 단계에서, 상기 HPV 유전자형은 HPV-6,11,16,18,31,32,33,34,35,39,40,42,43,44,45,51,52,53,54,56,58,59,61,62,66,67,68,69,70,71,72,81,82,83,84, 90 및 이들의 혼합 유형으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따르면, 자궁경부 세포에 존재하는 36 종류의 HPV 유전자형을 특이도(specificity) 높게 검사할 수 있고, 서로 다른 유형의 HPV가 중복 감염된 경우도 검사할 수 있다. 또한 자궁경부 세포 검체로부터 DNA를 추출하여 DNA칩에 의한 HPV 유전자형을 확인하기까지의 시간이 약 6시간 이내로서, 짧은 시간 안에 HPV 유전자형 검사를 할 수 있다.
본 발명은 HPV 증폭용 프라이머를 포함하는 PCR을 이용하여 DNA를 증폭시키고; HPV 프로브를 포함하는 DNA칩에 상기 증폭된 DNA를 교잡반응시키고; 그리고 상기 프로브와 특이적으로 교잡된 반응물을 통해 HPV 유전자형을 확인하는 단계를 포함하여 구성된다. 이를 위해서 본 발명은 새로운 프라이머, 프로브, DNA칩, 및 검사 키트를 제공한다. 이하에서 구체적으로 살펴보기로 한다.
상기 프라이머는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 염기서열을 포함한다. 상기 프라이머는 하기 표 1에 나타내는 바와 같이, HPV 유전자에 특이적인 프라이머인 5' 프라이머 또는 3' 프라이머이다.
상기 염기서열은 5' 말단에 위치에 형광염료가 부착되어 검출을 용이하게 수행 할 수 있다. 상기 형광염료는 Cy3, Cy5, 비오틴 결합물질, 알렉사 647(Alexa 647), 알렉사 555(Alexa 555), (5-(2-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산)(EDANS), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스레드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상을 사용할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1 및 2로 이루어진 JK1 세트, 서열번호 3 및 4로 이루어진 JK2 세트 및 서열번호 5 및 6으로 이루어진 JK3 세트 중에서 선택되는 한 가지 세트를 프라이머 세트로 이용하는 것이다.
본 발명에서는 PCR 수행시 상기 프라이머와 함께 컨트롤 유전자로 서열번호 7 및 8로 표시되는 베타글로빈 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다. 상기 베타글로빈의 5‘ 프라이머 말단에 형광염료가 부착될 수 있다.
본 발명의 프로브는, 하기 표 2와 같이, 서열번호 9 내지 44로 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 및 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 하기 표 2에 나타난 바와 같이 본 발명의 프로브는 총 36개의 HPV 유전자형과 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 서열번호 9 내지 44로 표시된 염기서열의 5' 말단에는 아민기가 부착되어 DNA칩 제조에 이용될 수 있다. 이는 이 기술분야에 널리 알려진 내용이므로 구체적인 내용은 생략하기로 한다.
상기 ‘특이적으로 결합하는’이란, 이 기술분야에서 널리 사용되는 명칭으로서 서로 상보적으로 결합하는 염기 사이의 반응을 의미한다. 이러한 특이적 결합 반응을, ‘교잡반응’ 또는 ‘혼성화반응’이라고 한다.
앞서 언급한 프라이머가 HPV 유전자(DNA)를 증폭시키고, 상기 증폭된 유전자와 상기 프로브가 특이적으로 교잡하여 얻어진 반응물을 통해서 HPV 유전자형을 확인할 수 있다.
본 발명에서는 상기 프로브를 이용하여 유전자형 검사용 DNA칩을 제작할 수 있다(도 1). 이에 대한 내용은 하기 실시예에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 DNA를 추출하기 위한 시약; 상기 DNA를 증폭시키기 위한 PCR용 프라이머; 및 상기 언급한 프로브를 포함하는 HPV 유전자형 검사용 DNA칩을 포함하는 HPV 유전자 탐지 또는 HPV 유전자형 검사용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 자궁경부 탈락 세포로부터 DNA를 추출하는 단계; HPV 증폭용 프라이머를 포함하는 PCR을 이용하여 상기 DNA를 증폭시키는 단계; 상기 언급한 HPV 프로브를 포함하는 DNA칩에, 상기 증폭된 DNA를 교잡반응시키는 단계; 및 상기 프로브와 특이적으로 교잡된 반응물을 통해 HPV 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 HPV 유전자형 검사방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 HPV 유전자 탐지 및/또는 HPV 유전자형을 검사하기 위한 방법은 하기와 같은 구성을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
1) 버자이널 스와브(vaginal swab)를 통해서 얻은 자궁경부세포를 원심분리하여 세포만 모은 다음 DNA을 추출하기 위해 세포 용해용액으로 세포를 용해하여 DNA을 얻고,
2) 이것의 일부를 HPV 유전자에 특이적인 본 발명의 프라이머인 5' 프라이머와 3’ 프라이머를 이용하여 HPV 유전자를 증폭한 후,
3) 증폭된 HPV 유전자를 2.5% 아가로스겔에 걸어 PCR 생성물을 EtBr의 형광유무로 확인한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 HPV 유전자형 검사 DNA칩을 이용한 검사 방법은 하기와 같은 구성을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
1) 버자이널 스와브(vaginal swab)를 통해서 얻은 자궁경부세포를 원심분리하여 세포만 모은 다음 DNA을 추출하기 위해 세포 용해용액으로 세포를 용해하여 DNA을 얻고,
2) 이것의 일부를 HPV 유전자에 특이적인 본 발명의 프라이머인 5' 프라이머와 3’ 프라이머를 이용하여 HPV 유전자를 증폭한 후,
3) 증폭된 HPV 유전자의 유전자형을 분석하기 위한 DNA칩 제작은 36종류의 HPV 유전자에 특이적으로 결합하는 36종의 HPV 프로브의 올리고뉴클레오티드들을 약 30개의 염기(nucleotide)크기로 합성하여 제작한 후,
4) 마이크로어레이어(Microarray)장치를 이용하여 각 탐침을 일정한 간격과 배열로 칩 제작용 유리판 위에 붙인뒤 세척하여 고착시키고,
5) 여기에 2)의 HPV 유전자 PCR 산물을 일정한 온도에서 교잡반응(Hybridization)시킨 다음 세척하여 비특이적으로 결합된 것들을 제거한 후,
6) 칩 스캐너(Scanner)에서 HPV 탐침에 특이적으로 결합된 HPV 유전자형을 확인한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 HPV 유전자형 검사용 검사 키트는 다음과 같은 시약, 기구 및 장치로 구성될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
1) 세포로부터 DNA추출:
① 세포용해 완충용액( 7% chelex, 20mM Tris HCl, 100ug/ml proteinase K, 10mM CaCl2, pH 8.0)
2) HPV 유전자의 PCR:
① 프라이머 세트 각 20p㏖/㎕
② 10X PCR 완충용액
③ Taq. DNA 폴리머라아제 250 유니트( 솔젠트, 한국)
④ 2.5mM dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dUTP)
⑤ Uracil-N-Glycosylase 1U/㎕
3) HPV 유전자형 검사용 DNA칩을 제작:
① 5 말단에 아민기를 붙인 36종류의 HPV 유전자 올리고 탐침들, 농도 50p㏖/㎕
② 표면에 아민(silanated, amine-coated)기로 코팅된 유리 슬라이드
③ 교잡반응 챔버(8 well hybridization chamber, Grace, 미국)
④ 블로킹 버퍼(blocking buffer)(5XSSC, 1%BSA, 0.1%SDS)
⑤ 이소프로필 알콜(isopropyl alcohol)
⑥ 증류수
4) HPV DNA 칩과 HPV 유전자 PCR 산물의 교잡반응:
① 상기 3)에서 제작된 8구역으로 분할된 HPV 유전자형 검사 DNA칩
② 교잡반응 완충용액(0.4M Mes, 20mM MgCl2, 0.15% SDS, 0.15% BSA, pH 6.5)
5) 교잡반응이 끝난 DNA칩 세척:
① 세척액 I 용액(2X SSC, 0.2% SDS)
② 세척액 II용액(0.1X SSC)
6) HPV DNA칩 판독:
① 마이크로어레이어 스캐너(GSI Lumonics, USA)
상기 시약, 기구 및 장비들로 HPV 유전자형 검사를 위한 DNA칩을 제작하여 자궁경부에서 채취된 검체로부터 HPV유전자형을 확인할 수 있다. 그리고 이를 바탕으로 하기와 같은 구성으로 HPV 유전자 탐지 또는 HPV 유전자형 검사를 위한 키트를 구성할 수 있다. 하기 내용은 본 발명의 일 실시예에 불과하며, 본 발명은 하기 예에 국한되지 않는다.
1) 세포로부터 DNA 추출을 위한 키트:
① 유전자 추출용액(7% (w/v) chelex, 20mM Tris HCl, 100ug/ml proteinase K, 10mM CaCl2, pH 8.0)이 담겨진 30ml 튜브
② 10X 세척용액( 200mM Tris-HCl, 50mM KCl, 50mM NaH2PO4, 50mM Na2HPO4, pH 7.4)이 담겨진 30ml 튜브
2) HPV 유전자 PCR을 위한 키트:
① JK 1 내지 3 중 하나의 프라이머 세트가 각각 20p㏖/㎕ 농도가 들어 있는 1.5㎖ 튜브
② 10X PCR 완충용액의 1.5㎖튜브
③ Taq DNA 폴리머라아제 250유니트unit(Tag., 솔젠트, 한국)의 1.5㎖튜브
3) HPV 유전자 PCR 산물의 HPV 유전자형 검사를 위한 키트:
① HPV 유전자형 검사용 DNA칩
② 8 웰 교잡반응 챔버(Multiwell hybridization chamber, sigma, 미국)
상기 키트 중 HPV 감염 여부를 검사하는 경우 1), 2)의 키트를 사용할 수 있으며, HPV 유전자형검사를 하는 경우 1), 2), 및 3)의 키트를 사용할 수 있다. 본 발명에 따르면, 자궁경부로부터 채취된 세포에서 DNA를 간편히 추출하고 HPV 유전자를 PCR로 증폭한 후 HPV 유전자형을 HPV DNA칩으로 검사하는 데 약 6 시간이 소요된다. 또한 한 장의 HPV DNA칩에서 8 검체를 동시에 검사할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: HPV 유전자 증폭을 이용한 HPV 유전자 탐지
1-1: 자궁경부 탈락 세포로부터 DNA 추출
5㎖의 세척용액(PBS)에 보존된 사이토브러쉬(cytobrush)를 강하게 볼텍스하여 사이토브러쉬로부터 자궁경부세포를 분리시킨 후 1,300g에서 10분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 세척 버퍼( 200mM NaCl, 50mM KCl, 50mM NaH2PO4, 50mM Na2HPO4, pH 7.4)로 재부유하여 1.5㎖ 마이크로튜브에 옮긴 후 1,300g에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 7%(w/v) 킬렉스(chelex) 버퍼(7% chelex, 20mM Tris HCl, 100 ㎍/ml proteinase K, 10mM CaCl2, pH 8.0) 200㎕를 넣어 재부유하였다. 55℃ 항온조에서 3시간 동안 가온한 후 95℃ 에서 20분간 더 가온하여 프로테나아제 K의 활성도를 제거하고 자궁경부 탈락세포로 부터 DNA를 얻었다.
1-2: PCR에 의한 HPV 유전자의 증폭
상기 1-1에서 얻은 DNA을 증폭시키 위해서 상기 표 1의 JK1 및 JK2 프라이머 세트를 각각 독립적으로 사용하였다. 컨트롤로서 서열번호 7 및 8의 β-글로빈 프라이머를 사용하였는데 3' 프라이머의 5' 말단에 Cy5 형광염료를 부착하였다(5'-Cy5-CAA GAC AGG TTT AAG GAG ACC A-3'/ 5'- GGT TGG CCA ATC TAC TCC CAG G-3').
유전자 증폭은(PCR) 0.2㎖ PCR 튜브에 2.5㎕ 10×버퍼(750mM Tris-HCl (pH9.0), 150mM (NH4)2SO4, 25mM MgCl2, 1mg/ml BSA) 5㎕, 2.5mM dNTP 2.0㎕, Taq 폴리머라아제(5 units) 0.3㎕, 20pmol JK1 또는 JK2 프라이머 세트 각 1.0㎕, 주형 DNA 5㎕를 증류수로 25㎕가 되게 하였다. 유전자 증폭 혼합물을 PCR 시행 전에 50℃에서 3분, 95℃에서 15분 동안 전변성(pre-denaturation)하고 95℃에서 60초, 53℃에서 60초, 그리고 72℃에서 60초씩 40회를 PCR을 시행하고 72℃에서 3분동안 반응시켰다.(9700, Applied Biosystems).
컨트롤로 사용한 β-글로빈 유전자 증폭은 상기 조건에서 프라이머만 다르고 나머지 조건은 같이 실행하였다. PCR 증폭이 끝난 후 각 유전자증폭 생성물은 2.5% 아기로스 겔에 3.0㎕를 전기영동하고 이미지 분석을 시행하였다.(imageanalyzer, alphascan). 이때의 소요되는 시간은 1시간30분 정도이다. 상기 JK1, JK2 및 컨트롤 각각을 프라이머로 이용한 유전자 증폭 결과는 도 2 내지 에 나타내었다. 도 2 내지 4의 결과, 본 발명에 따른 프라이머의 유전자 증폭 효과가 우수함을 알 수 있다.
실시예 2: HPV 유전자 진단 및 유전자형 검사를 위한 DNA칩 제작
2-1: HPV 유전자형 검사를 위한 DNA칩 제작
마이크로어레이어 장치(Bio-Robotics, UK)를 이용하여 표면에 아민(silanated, amine-coated)기로 코팅된 유리 슬라이드를 8개 구역으로 분할하여 50p㏖/㎕농도로 맞춰진 36 종류의 HPV 유전자형 프로브(염기서열 구조는 표 2에 기재함)를 각 구역 마다 동일하게 붙여 주었다.
상기 프로브가 붙어 있는 유리 슬라이드를 2일 동안 암소에 방치한 후 80℃에서 4시간 이상 반응시켜 베이킹하고 블라킹 버퍼(5XSSC, 1%BSA, 0.1%SDS)로 42℃에서 45분 동안 쉐이킹 인큐베이션을 실시하였다. 이소프로판올을 넣고 1분 동안 쉐이킹 인큐베이션을 하고 상등액(반응액)을 버린 후 증류수로 1분 동안 쉐이킹 인큐베이션을 5회 반복하였고 실온에서 건조 후 밀봉된 상자에 보관하여 사용하였다.
2-2: HPV 유전자형 검사 DNA칩을 이용한 HPV 유전자 PCR 산물의 유전자형 검사
1) HPV 유전자형 검사 DNA칩 준비
실시예 2-1에서 제작된 HPV DNA칩에 교잡반응 챔버(8 well hybridization chamber, Grace, 미국)를 단단히 부착시켜 8개 구역으로 분할된 DNA칩을 준비하였다(도 1 참고).
2) HPV 유전자 PCR 산물과 DNA칩의 교잡반응.
1.5ml 튜브에 PCR 산물 8㎕, 2X 교잡반응 완충용액 32㎕를 첨가하여, HPV DNA칩에 스팟팅된 올리고뉴클레오티드를 교잡반응시키기 위해 PCR 산물을 95℃에서 5분 동안 변성시키고 교잡결합 반응액 32㎕는 사용 직전에 48℃에 10분간 반응시켰다. 교잡결합 반응액과 PCR 산물을 잘 혼합하여 DNA칩의 각 웰의 구멍에 1 웰당 1검체씩 조심스럽게 분주하고, 교잡결합용액이 증발하는 것을 방지하기 위해 셀로판 테이프로 웰 구멍 위에 붙인 후 48℃에서 1시간 동안 교잡반응을 실시하였다.
3) 교잡반응 후 DNA칩의 세척
교잡반응이 끝난 DNA칩은 세척액 I으로(2X SSC, 0.2% SDS) 10min/1회, 세척액 II로(0.1X SSC) 10min/1회 세척하였다. 세척 후 실온에서 건조시키거나 양압의 공기펌프를 이용하여 물기를 빠르게 제거한 후 빛이 차단된 곳에 보관하였다.
4) 세척 후 DNA칩의 HPV 유전자형 확인
칩 스캐너(GSI Lumonics, 미국)를 550nm의 여기 파장과 570㎚의 방출 파장을 검출할 수 있도록 설정한 후, 상기 3)에서 세척된 DNA칩을 넣고 HPV 유전자형의 프로브에 HPV 유전자 산물이 결합하여 발색된 프로브의 위치를 판독함으로써 HPV 유전자형을 확인하였다(도 5 및 6).
본 발명의 HPV 유전자형 검사를 위한 DNA칩과 시약들을 키트화하면 다량의 검체에 대한 HPV 유전자형 검사를 시간과 노력을 줄이면서 손쉽게 할 수 있다. 본 발명의 보호 범위에는 검사 방법 및 검사 키트 역시 포함되는 것으로, 키트화하는 방법을 하기 실시예 3에 기재한다.
실시예 3: HPV 유전자형 검사용 키트
본 발명의 HPV 유전자형 검사용 키트는 자궁경부로부터 세포를 채취하여 DNA를 추출하는 시약을 키트화 한 부분(도 7)과, HPV 유전자를 PCR하는 과정에서 프라이머를 포함하는 시약을 키트화 한 부분(도 8), 그리고 HPV 유전자 PCR산물의 유전자형을 확인하기 위한 HPV 유전자형 검사용 DNA칩(도 9)의 3부분으로 구성된다.
3-1: DNA 추출 방법의 키트화
실시예 1 및 2에 기재한 바에 따라 제조된 시약을 키트화 하는데, 그 구성은 ① 20ml PBS 용액이 담겨진 30ml 튜브의 10X 세척 용액과 ② 상기 유전자 추출 용액 100 ㎍/ml 농도의 단백질 분해효소(proteinase K, Sigma, 미국)와 chelex 7%가 담겨진 30ml 튜브로 구성되며 모두 실온에 보관하였다. 이 키트는 80개의 자궁경부 세포 검체를 처리 할 수 있는 분량이며 처리 조작 및 사용 방법은 실시예1 및 2와 동일하다.
3-2: HPV DNA 증폭용 PCR을 위해 구성된 시약의 키트화
실시예 2에 기재한 바와 같이 HPV 유전자의 PCR을 위해 사용되는 시약을 키트화 하였다.
그 구성은 ① HPV 유전자 PCR 프라이머인 염기서열 1 내지 6으로부터 선택되는 프라이머 각 20pmol/㎕, ② 10X PCR 완충용액 ③ 2.5mM dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dUTP)들의 혼합 용액, ④ 베타글로빈 프라이머 3pmol/㎕, 100ul 부피로 담겨진 1.5ml 튜브, ⑤ 우라실-N-글라이코실라아제(1U/㎕) 20ul, 주형 DNA 5ul를 넣은HPV용과 컨트롤용의 프라이머 혼합용액(premix), ⑥ Taq. DNA중합효소(솔젠트, 한국)가 250 유니트 포함된 1.5ml 튜브, ⑦ 2X 교잡반응 용액이 담긴 1.5ml 튜브, ⑧ 증류수 1ml가 담겨진 1.5ml 튜브이었다. 이들 모두는 -20℃ 냉동고에 보관하고 사용 방법은 실시예 2와 동일하다.
3-3: HPV 유전자 DNA칩의 키트화
실시예 2에 따라 제작된 HPV DNA칩은, 1장으로 8개의 검체를 처리할 수 있게 하고 이러한 DNA칩 10장을 하나의 키트로 구성하였다. 이 키트를 즉시 사용할 수 있도록 교잡반응용 챔버를 부착하였으며 사용 방법은 실시예 2와 동일하다. 상기 HPV 유전자형 검사를 위한 DNA 칩 키트는 완성된 DNA칩 10장을 기본으로 80개의 자궁경부 세포 검체를 처리할 수 있도록 구성하였다(도 9).
실시예 4: DNA칩과 염기서열 분석방법의 비교
본 발명에 따른 DNA칩 결과에 의해 각각의 HPV 유전자형을 결정하고, 본 발명의 DNA칩이 각각의 유전자형을 정확하게 보여주는 지를 다시 확인하기 위하여 염기서열분석을 시행하였다.
각각의 HPV DNA칩의 HPV 유전자형에 맞는 검체의 PCR 생성물(실시예 1-1의 PCR 산물) 5㎕에 시약(Bigdye) 8㎕, 각 유전자의 5' 프라이머 1㎕를 포함하여 총 20㎕가 되게 하고, 상기 혼합물은 95℃에서 2분 동안 변성하고 염기서열분석은 95℃ 20초, 50℃ 5초, 60℃ 2분을 25회 실시하고 염기서열을 분석하였다(ABI3100, Applied Biosystems). 그 결과를 도 10 내지 도 22에 나타내었고, 염기서열 분석결과, 각 HPV 유전자형에 대한 HPV DNA칩의 결과와 모두 일치함을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 HPV 유전자형 검사용 DNA칩을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 프라이머인 JK1 세트로 유전자 증폭을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 좌측으로부터 우측으로 각 HPV 유전자형은 다음과 같다: 6,11,16,18,31,32,33,34,35,39,40,42,43,44,45,51,52,53,54,56,58,59,61,62,66,67,68,69,70,71,72,81,82,83,84,90 양성대조, 및 음성대조.
도 3은 본 발명에 따른 프라이머인 JK2 세트로 유전자 증폭을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 좌측으로부터 우측으로 각 HPV 유전자형은 다음과 같다: 6,11,16,18,31,32,33,34,35,39,40,42,43,44,45,51,52,53,54,56,58,59,61,62,66,67,68,69,70,71,72,81,82,83,84,90 양성대조, 및 음성대조.
도 4는 컨트롤 프라이머 세트로 유전자 증폭을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 좌측으로부터 우측으로 각 HPV 유전자형은 다음과 같다: 6,11,16,18,31,32,33,34,35,39,40,42,43,44,45,51,52,53,54,56,58,59,61,62,66,67,68,69,70,71,72,81,82,83,84,90 양성대조, 및 음성대조.
도 5 내지 6은 본 발명에 따른 DNA칩을 이용하여 칩 스캐너로 HPV 유전자형을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일시예에 따른 DNA 추출 시약 키트를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일시예에 따른 PCR 프라이머를 포함하는 시약을 키트를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일시예에 따른 HPV 유전자형 검사용 DNA칩 키트를 나타낸다.
도 10 내지 22는 실시예 1-1에서 얻는 HPV 유전자형에 따른 각각의 PCR 산물에 대한 염기서열분석 결과를 나타낸 것이다.
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<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for cloning HPV gene
<400> 1
agtggstcta tggtwwcytc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for cloning HPV gene
<400> 2
catagtatgt awrtakgyca t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for cloning HPV gene
<400> 3
gccacaayaa tggyatwtgy t 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for cloning HPV gene
<400> 4
tgtaaatcat attcctcmmc atg 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for cloning HPV gene
<400> 5
ccacctatag gggaacactg g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for cloning HPV gene
<400> 6
gaggtaacca tagaaccact 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Beta globin primer
<400> 7
caagacaggt ttaaggagac ca 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Beta globin primer
<400> 8
ggttggccaa tctactccca gg 22
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV6
<400> 9
accaattctg attataaaga gtacatgcgt 30
<210> 10
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV11
<400> 10
ttcagattat aaggaataca tgcgccatgt 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Probe for HPV16
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ctacatataa aaatactaac tttaaggagt 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV18
<400> 12
ctcctgtacc tgggcaatat gatgctacca 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV31
<400> 13
ctacatttaa aagtagtaat tttaaagagt 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV32
<400> 14
gtgctactgt aacaactgaa gacacataca 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV33
<400> 15
cacacaagta actagtgaca gtacatataa 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV34
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tgcaaacagt aattttaagg aatacctcag 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV35
<400> 17
ctgctgtgtc ttctagtgac agtacatata 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV39
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tgatccttct aagtttaagg aatataccag 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV40
<400> 19
taataacagt aatttcaagg aatatttgcg 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV42
<400> 20
cagctgctaa ttttaaggaa tatttaagac 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV43
<400> 21
tatgacaatg caaagtttaa ggaatacttg 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV44
<400> 22
tactagtgaa caatataagc aatacatgcg 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV45
<400> 23
cctactaagt ttaagcagta tagtagacat 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV51
<400> 24
tccaagtaac tttaagcaat atattaggca 30
<210> 25
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<212> DNA
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<223> Probe for HPV52
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tgaaaatttt aaggaatacc ttcgtcatgg 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV53
<400> 26
agcaaattaa acagtatgtt agacatgcag 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV54
<400> 27
ttctgacttt agggagtata ttagacatgt 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV56
<400> 28
tgcacgaaaa attaatcagt accttagaca 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV58
<400> 29
aaaaatgata attttaagga atatgtacgt 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV59
<400> 30
cacacctacc agttttaaag aatatgccag 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV61
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tgtatctgaa tataaagcca caagctttag 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV62
<400> 32
tccactgctg cagcagaata caaggctacc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV66
<400> 33
atgatgcccg tgaaatcaat caataccttc 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV67
<400> 34
tgttctgagg aaaaatcaga ggctacatac 30
<210> 35
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV68
<400> 35
ttatgatcct aataaattta aggaatatat 30
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV69
<400> 36
taaaccatca gattataagc agtttataag 30
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<212> DNA
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<220>
<223> Probe for HPV70
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<212> DNA
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<220>
<223> Probe for HPV71
<400> 38
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<210> 39
<211> 30
<212> DNA
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<220>
<223> Probe for HPV72
<400> 39
gcgtcctctg tatcagaata tacagcttct 30
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV81
<400> 40
ggcctctaac tttaaggaat ttctgcgcca 30
<210> 41
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV82
<400> 41
ccatctgttg cacaaacatt tactccagc 29
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV83
<400> 42
cacaggctaa tgaatacaca gcctctaact 30
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV84
<400> 43
caccgaatca gaatataaac ctaccaattt 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for HPV90
<400> 44
gacacataca aggcttccaa ttttaaagag 30
Claims (15)
- 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 염기서열을 포함하는, 인간유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV) 증폭을 위한 프라이머.
- 제1항에 있어서,상기 염기서열은 5' 말단에 위치에 형광염료가 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 인간유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV) 증폭을 위한 프라이머.
- 제2항에 있어서,상기 형광염료는 Cy3, Cy5, 비오틴 결합물질, 알렉사 647(Alexa 647), 알렉사 555(Alexa 555), (5-(2-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산)(EDANS), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스레드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 프라이머.
- 서열번호 9 내지 44로 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 및 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, HPV에 상보적으로 결합하는 프로브.
- 제4항에 있어서,상기 올리고뉴클레오티드는 HPV-6,11,16,18,31,32,33,34,35,39,40,42,43,44,45,51,52,53,54,56,58,59,61,62,66,67,68,69,70,71,72,81,82,83,84 및 90 유형에 대응되는 것을 특징으로 하는, HPV에 상보적으로 결합하는 프로브.
- 제4항에 있어서,서열번호 9 내지 44에 표시된 염기서열의 5' 말단에 아민기가 부착되는 것을 특징으로 하는 HPV에 상보적으로 결합하는 프로브.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 프로브를 포함하는 HPV 유전자형 검사용 DNA칩.
- DNA를 추출하기 위한 시약;상기 DNA를 증폭시키기 위한 PCR용 프라이머; 및제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 프로브를 포함하는 HPV 유전자형 검사용 DNA칩;을 포함하는 HPV 유전자 탐지용 또는 HPV 유전자형 검사용 키트.
- 제8항에 있어서,상기 DNA를 추출하기 위한 시약은 단백질 분해효소와 킬렉스(chelex) 7%(w/v)가 포함되는 것을 특징으로 하는 HPV 유전자 탐지용 또는 HPV 유전자형 검사용 키트.
- 제8항에 있어서,상기 PCR용 프라이머는 서열번호 1 내지 6로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 유전자 탐지용 또는 HPV 유전자형 검사용 키트.
- 제8항에 있어서,상기 PCR용 프라이머는 서열번호 1 및 2로 이루어진 세트(JK1 세트), 서열번호 3 및 4로 이루어진 세트(JK2 세트) 및 서열번호 5 및 6으로 이루어진 세트(JK3 세트) 중에서 선택되는 하나의 세트인 것을 특징으로 하는, HPV 유전자 탐지용 또는 HPV 유전자형 검사용 키트.
- 자궁경부 탈락 세포로부터 DNA를 추출하는 단계;HPV 증폭용 프라이머를 포함하는 PCR을 이용하여 상기 DNA를 증폭시키는 단계;서열번호 9 내지 44로 표시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 HPV 프로브를 포함하는 DNA칩에, 상기 증폭된 DNA를 교잡반응시키는 단계; 및상기 프로브와 특이적으로 교잡된 반응물을 통해 HPV 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는 HPV 유전자형 검사방법.
- 제12항에 있어서,상기 PCR을 이용하여 증폭시키는 단계에서, 컨트롤 유전자로 서열번호 7 및 8로 표시되는 베타글로빈 프라이머 세트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 유전자형 검사방법.
- 제12항에 있어서,상기 증폭된 DNA를 교잡반응시키는 단계에서, 상기 서열번호 9 내지 44에 표시된 염기서열의 5' 말단에 아민기가 부착되는 것을 특징으로 하는 HPV 유전자형 검사방법.
- 제12항에 있어서,상기 HPV 유전자형을 확인하는 단계에서, 상기 HPV 유전자형은 HPV-6,11,16,18,31,32,33,34,35,39,40,42,43,44,45,51,52,53,54,56,58,59,61,62,66,67,68,69,70,71,72,81,82,83,84, 90 및 이들의 혼합 유형으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 HPV 유전자형 검사방법.
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