KR20090069514A - 벤트랄 중뇌 내 티로신 하이드록실라제 및 Νｕｒｒ1 발현증강제로서 비타민 Ｃ 및 비타민 Ｅ - Google Patents
벤트랄 중뇌 내 티로신 하이드록실라제 및 Νｕｒｒ1 발현증강제로서 비타민 Ｃ 및 비타민 Ｅ Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 벤트랄 중뇌에서 도파민 신경세포의 생성을 위한 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 발현 증강제로서 비타민 C 및 비타민 E를 제공한다. 또한 상기 증강제로서 함량은 래트 태아 벤트랄 중뇌 세포 106 세포수에 대해 0.4∼0.6 mM 비타민 C 및 0.8∼1.2 μM 비타민 E임을 특징으로 하고, 상기 래트 태아 벤트랄 중뇌 세포는 임신 13.5일째에 채취된 세포임을 특징으로 한다.
비타민 C, 비타민 E, 발현 증강제, 벤트랄 중뇌, 티로신 하이드록실라제, Nurr1
Description
본 발명은 벤트랄 중뇌 내 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 발현 증강제로서 비타민 C 및 비타민 E에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 래트 태아 벤트랄 중뇌 내에서 도파민 신경세포의 생성을 위한 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 발현 증강제로서 비타민 C 및 비타민 E에 관한 것이다.
비타민 C(아스코르브산) 수용성 산화방지제로서 잘 알려져 있다. 더욱이 카테콜라민 합성을 포함한 여러 가지 생화학적 반응에서 보조인자로서 작용한다. 또한 비타민 E(α-토코페롤)는 강력한 산화방지제이고 뇌에서 효과적인 자유 라디칼 제거제로서 항산화 작용을 지닌다. 또한 세포막의 다중불포화 지질에서 산화 적 손상을 방지한다. 중뇌 도파민(DA) 신경세포는 생장되는 벤트랄 중뇌(VM)의 뇌실영역에서 전구세포로부터 발생하기 때문에 배양 및 도파민 신경생물학의 이식 연구에서 사용하기 위한 공여자 세포 공급원의 후보물질로서 관심 받고 있다.
그러나 VM 세포를 효과적으로 획득하기 위해서는 시간적 제한이 존재한다; 이는 래트에서 임신 13.5∼14.5일째에 채취할 수 있다. 티로신 하이드록실라제는 카테콜라민의 합성에서 속도제한효소이고 도파민 세포의 마커로서 사용된다. 전사인자의 세포핵 수용체 수퍼패밀리의 구성요소인 Nurr1 유전자는 중추신경계에서 상향 발현되고 중뇌 도파민 세포 발달 및 생존에 중요하다.
또한 배측부 중뇌 지역에서 Nurr1 발현의 징후는 도파민 신경세포의 발생(임신 11.5일째) 하루 전인 임신 10.5일째 초기 단계에서 나타난다. Backman 등은 대부분의(91%∼96%) 성숙한 도파민 신경세포 A8-A10에서 Nurr1 mRNA이 발현됨을 밝혀냈다. 벤트랄 도파민 신경세포 분화 및 성체 세포에서 계속적인 발현에 의한 Nurr1의 효과는 이 유전자가 성체 세포의 벤트랄 중뇌의 도파민 신경세포의 유지뿐만 아니라 분화에 필수적인 역할을 한다는 것을 의미한다.
티로신 하이드록실라제 단백질 수치 및 티로신 하이드록실라제 유전자 발현은 비타민 C 처리에 의해 상향 조절됨을 측정하였고 RT-PCR 분석으로 티로신 하이 드록실라제 mRNA 발현이 비타민 C를 처리한 세포에서 증가된다는 것을 확인하였다. 또한 Nurr1 역시 비타민 C 및/또는 비타민 E를 투여시 상향 발현됨을 확인하였다.
이에 본 발명자들은 래트 태아 임신 13.5일째 벤트랄 중뇌에서 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 발현시 비타민 C 및 비타민 E가 발현 증강제로서 효과적임을 측정함으로서 본 발명을 완성하게 된 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 래트 태아 벤트랄 중뇌에서 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 발현에 효과적인 증가제로서 비타민 C 및 비타민 E를 개발코자 한 것이다.
본 발명의 목적은 벤트랄 중뇌에서 도파민 신경세포의 생성을 위한 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 발현 증강제로서 비타민 C 및 비타민 E를 제공하는 것이다.
상기 증강제로서 함량은 래트 태아 벤트랄 중뇌 세포 106 세포수에 대해 0.4∼0.6 mM 비타민 C 및 0.8∼1.2 μM 비타민 E임을 특징으로 한다.
또한 상기 래트 태아 벤트랄 중뇌 세포는 임신 13.5일째에 채취된 세포임을 특징으로 한다.
본 발명의 효과는 래트 태아 벤트랄 중뇌에서 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 발현에 효과적인 증가제로서 비타민 C 및 비타민 E를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 임신 13.5일째 래트의 벤트랄 중뇌 세포에서 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 발현시 비타민 C 및 비타민 E의 동시투여의 효과를 실험했다. 실험과 내에서 일차 배양을 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 그룹으로 분류하였다.
각 그룹은 하기 4개의 그룹으로 다시 나누었다: 대조군, 비타민 C 투여 그룹, 비타민 E 투여 그룹, 비타민 C 및 비타민 E 투여 그룹. 배양물은 3일 동안 비타민을 투여하였다. 배양된 세포를 웨스턴 블럿 분석 및 면역세포화학을 사용하여 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 함량을 측정하였다.
본 발명은 비타민 C 및 비타민 E 투여 그룹에서 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 발현이 가장 증가되는 것을 측정하였다. 티로신 하이드록실라제 발현은 대조군보다 비타민 C 투여 그룹에서 더 증가되었으나: 비타민 E 투여 그룹에서의 발 현은 유의적인 변화는 없었다.
그러나 비타민 C 그룹 및 비타민 E 그룹 모두 대조군과 비교하였을 때 Nurr1 단백질의 발현 수치는 명백히 증가하였다. 본 실험 결과는 비타민 C 투여 그룹이 티로신 하이드록실라제 단백질 발현을 조절할 수 있음을 확인하였다. 그러나 Nurr1 수치는 비타민 C 또는 비타민 E 단독으로 투여한 경우에도 모두 증가하였다. 더욱이 비타민 E는 임신 13.5일째 벤트랄 중뇌 세포에서 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 발현을 증가시키기 위해 비타민 C와 함께 병용 투여하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
웨스턴 블럿 분석은 비타민 C 및 비타민 E 처리가 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 단백질 발현에 효과적인지 여부를 확인하기 위해 실시되었다. 티로신 하이드록실라제에 대한 표본 밴드는 도 1에 나타내었다. 비타민 C 및 비타민 E 투여 그룹에서, 티로신 하이드록실라제 단백질은 60 kDa에서 최대 신호를 나타내었다. 두 번째로 높은 티로신 하이드록실라제의 발현은 비타민 C 투여 그룹에서 나타났다. 비타민 E 투여 그룹에서 티로신 하이드록실라제 단백질의 수치는 대조군의 수치와 현격한 차이는 없었다. 그러나 비타민 C 투여 그룹 대비 비타민 C 및 비타민 E 투여 그룹 및 비타민 E 투여 그룹 대비 비타민 C 투여 그룹도 통계적으로 유의적이지 않았다.
Nurr1 웨스턴 블럿 분석에서 비타민 C 투여 그룹, 비타민 E 투여 그룹 및 비타민 C 및 비타민 E 투여 그룹 모두 대조군과 비교시 Nurr1 단백질 수치가 명백히 증가되었다(도 2). 더욱이 비타민 C 및 비타민 E 투여 그룹은 Nurr1 단백질의 최대 발현을 나타내었다. 그러나 비타민 C 투여 그룹은 비타민 E 투여 그룹과는 통계적인 차이는 없었다.
티로신 하이드록실라제 및 Nurr1에 대한 면역-양성 세포는 갈색으로 염색되었다. Nurr1(도 4)에 대해 염색된 세포 밀도는 티로신 하이드록실라제(도 3)보다 적었다. 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 모두에 염색된 밀도는 각각 상이하였다.
종래의 연구의 결과와 유사하게 티로신 하이드록실라제 단백질의 발현은 비타민 C 투여 그룹에서 증가되었다. 자료에서 티로신 하이드록실라제 유전자의 비타민 E 조절과 관련된 연구는 나타나 있지 않지만, 본 발명자들의 자료에 따르면 비타민 E와 비타민 C 사이의 공동작용은 티로신 하이드록실라제 발현을 증가시킴을 나타낸다. 더욱이 Nurr1 단백질 수치는 비타민 C 및 비타민 E의 처리에 따른 증가뿐만 아니라 비타민 C 및 비타민 E의 공동 투여에 따른 Nurr1 단백질의 최대 발현도 나타낸다. 종래의 연구는 마우스는 Nurr1이 결실될 경우 티로신 하이드록실라제 발현을 개시할 수 없음을 입증하였다. 티로신 하이드록실라제 발현은 Nurr1 에 의해서 직접적으로 조절된다. 따라서 티로신 하이드록실라제 발현은 비타민 C 및 비타민 E 투여에 따른 Nurr1 상향-조절에 의해 증가될 수 있다. 그러나 비타민 C와 비타민 E의 공동 효과의 확실한 메커니즘은 불확실하다. 더욱이 연구는 명확한 메커니즘을 필요로 한다. 임상 수기, 특별히 신경 수술에서는 비타민 E 및 비타민 C 모두 항산화제로 작용하고 따라서 신경보호 효과를 지닌다. 따라서 비타민 C는 파킨슨병(PD) 환자의 흑색질 세포에서 산화 스트레스를 최소화하기 위해 비타민 E와 협력하여 사용된다. 그러나 티로신 하이드록실라제 발현시 비타민 C 및 비타민 E의 공동 효과는 아직 널리 임상학적으로는 연구되지 않았다. 파킨슨병의 기본적인 치료는 레보도파(levodopa)를 사용하여 도파민 교체와 관련되나 이것의 부작용은 중요한 문제점을 내포하고 있다. 그러므로 비타민 C 및 비타민 E의 사용은 초기 파킨슨병 치료에 대한 두 가지 이점을 제공한다. 본 발명자들은 비타민 C가 임신 13.5일째 VM 세포에서 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 단백질의 발현을 상향 조절할 수 있다고 결론지었다. 더욱이 비타민 E는 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 발현을 증가시키기 위해서 비타민 C와 공동으로 작용한다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
동물 및 조직의 준비
임신기간은 질점액전(vaginal plug)을 위한 조사에 의해 날짜를 정했고 플러그의 날짜는 임신 13.5일째 임신한 래트로부터 관찰된 임신 0.5일째 VM 조직으로 한정하였고, 그 후 30분간 37℃에서 0.1% 트립신/0.04% DNase/HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)에서 침지시켰다. 상기 조직은 HBSS에서 0.04% DNase로 세척하였고, 그 후 해리된 세포 현탁액을 형성하기 위해 파스퇴르 피펫으로 분쇄시켰다. 상기 세포는 6.5×105 cell/dish의 밀도에서 폴리-L-리신(PBS에서 50 μg/ml)-코팅된 60 mm 디쉬 상에서 평판 배양되었고 5% CO2, 95% 공기와 37℃에서 26mM NaHCO3, 20mM HEPES, 20% 우혈청 및 1% 항생물질의 항진균제를 포함한 DMEM에서 배양되었다. 배양은 48시간 동안 동일한 배지에서 실시되었다. 이후 세포들을 3일간 각각 대조군, 0.5mM 비타민 C, 1μM 비타민 E(시그마) 및 0.5mM 비타민 C + 1μM 비타민 E 배지로 덮었다. 그 후 상기 세포들을 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 웨스턴 블럿 분석으로 시험하였다.
(실시예 1) 임신 13.5일 째의 VM으로부터 초기 세포 배양과 웨스턴 블럿팅
배양된 VM 세포는 고무 폴리스맨으로 분리시키고 3,000 rpm으로 미세원심분리기에서 회전시킴으로써 PBS로 2회 세척한다. 이후 1% Nonidet P-40(NP-40), 0.1% 디옥시콜산나트륨e, 150mM NaCl, 50mM Tris-HCl (pH7.5), 1mM 페닐메틸 술포닐 플로라이드(PMSF) 및 0.2U/ml 아프로티닌을 포함한 100 ㎕ 세포용해 완충액으로 균질화한다. 용해물을 4℃에서 10분 동안 20,000 g로 원심분리함으로써 분리하고 액화질소에서 동결시키고 사용할 때까지 -80℃에서 저장한다. 상청액에서 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 에세이를 사용하여 측정한다(Bio-Rad Laboratories, Richmond, VA). 전체 단백질(30 ㎍)과 동일한 양을 제공하기 위해서 소량의 부피를 보정한 후 다른 배양 접시의 상청액을 SDS-샘플 완충용액에 즉시 첨가하고 가열하고 그 후 환원 조건에서 12.5% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 시킨다. 전기영동 단백질을 이동 완충액 시스템 및 반건조 전기영동 트랜스퍼(39mM 글리신, 48mM 트리스, 20% MeOH 및 0.037% SDS 일렉트로트랜스퍼) 세포(15V, 90분)를 사용하여 PVDF 세포막으로 이동시킨다. 세포막은 비특이적인 결합을 감소시키기 위해 0.1% 트윈 20, 5% 탈지분유를 포함한 트리스 완충 식염수(TBS)에서 블록되었다. 이들은 4℃에서 24시간 동안 1차 항체(토끼 항-래트 티로신 하이드록실라제, 1:500 희석, Pel-Freez Biologicals; 토끼 항-래트 Nurr1, 1:500 희석, Santa Cruz Biotechnology)에서 배양되었고 뒤이어 실온에서 2시간 동안 두 번째 항체(홍당무 과산화효소-컨쥬게이트된 염소 항-토끼 IgG, Bio-Rad 1:1000)를 배양하였다. 항원 단백질을 제작자의 지침에 따라 ECL-검출 시약(Amersham pharmacia biotech, 웨스턴 블롯팅 검출 시약)을 사용하여 화학발광시켜 검출하였다. 웨스턴 블럿을 컴퓨터-기반 시그마 겔(SPSS Inc. 시카고, 미국) 시스템을 이용하여 농도계로 분석하였다. 밀도 수치는 3번 실험 수치의 평균±표준편차로 표현하였다. 통계적인 분석은 Student's t-테스트를 사용하여 실시되었다.
(실시예 2) 면역세포화학
면역세포화학은 시험관 내에서 폴리-D-리신으로 코팅된 둥근 챔버 글라스 커버슬립 상에서 성장하는 임신 13.5일 째 프라이머리 신경세포 배양 VM을 수행하였다. 배양을 4% NBP로 5분 동안 고정하였고 5분 동안 PBS에서 0.3% 트리톤 X-100에 투과시킨 후 PBS로 2회 세척하였다. 상기 세포는 37℃에서 1시간 동안 PBS에서 10% BSA로 예비 배양되었다. 슬라이드는 15분간 0.02M 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척되었다. 정상 염소 혈청을 비특이적 결합의 환원을 위해 실온에서 90분간 처리한 후(1:20) 밤새 4℃에서 1차 항체(PBS에 희석된)에 노출시켰다. 사용된 1차 항체는 토끼 항-래트 티로신 하이드록실라제(1:500, Pel-Freez Biologicals) 및 토끼 항 래트 Nurr1(1:500, Santa Cruz Biotechnology)이었다. 0.5 % 과요오드산으로 처리한 후 실온에서 90분간 2차 항체(1:200, 비오틴화된 염소 항-토끼 IgG)를 배양시켰다. 슬라이드를 PBS로 세척한 후 표본을 실온에서 90분간 아비딘-비오틴화 퍼옥시다아제 복합체로 표지하였다. 이후 5분간 PBS에서 3, 3'-디아미노벤지딘-H2O2로 염색시키고 세척하였다. 슬라이드를 명시야에서 현미경으로 관찰한 후 사진 촬영했다.
도 1은 대조군 및 태아의 벤트랄 중뇌 세포에 비타민 C- 및 비타민 E-처리시 티로신 하이드록실라제의 표본 웨스턴 블럿 분석을 나타낸 것이다. A: 벤트랄 중뇌 세포에서 티로신 하이드록실라제 발현의 면역블럿. 면역블럿은 토끼 항-티로신 하이드록실라제 항체로 표지된다. 티로신 하이드록실라제 단백질은 60 kDa에서 밴드에 따라 블럿에서 확인된다. C: 대조군; V-C, 0.5mM 아스코르브산; V-E, 1μM α-토코페롤; V-C & V-E, 0.5mM 아스코르브산 + 1μM α-토코페롤. B: A에서 밴드의 농도계측 평가.
도 2는 대조군 및 태아의 벤트랄 중뇌 세포에 비타민 C- 및 비타민 E-처리시 Nurr1의 표본 웨스턴 블럿 분석을 나타낸 것이다. A : 벤트랄 중뇌 세포에서 Nurr1 발현의 면역블로트. 면역블로트는 토끼 항-Nurr1 다클론 항체로 표지된다. Nurr1 단백질은 91 kDa에서 밴드에 따라 블럿에서 확인된다. C, 대조군; V-C, 0.5mM 아스코르브산; V-E, 1μM α-토코페롤; V-C & V-E, 0.5mM 아스코르브산 ＋ 1μM α-토코페롤. B: A에서 밴드의 농도계측 평가.
도 3은 임신 13.5일 째 VM으로부터 배양된 1차 세포 상에서 티로신 하이드록실라제에 대한 면역조직화학적 염색을 나타낸 것이다. 모든 양성 염색은 갈색을 나타낸다. 태아의 벤트랄 중뇌 세포에 비타민 C 및 비타민 E로 처리시 티로신 하 이드록실라제에 대한 양성 세포 밀도는 정상(B)보다 높게 나타난다. A, 음성 대조군; B, 정상; C, 비타민 C를 처리함; D, 비타민 C 및 비타민 E를 처리함, 축척 막대 = 50 ㎛
도 4는 임신 13.5일째 VM으로부터 배양된 1차 세포 상에서 Nurr1에 대한 면역조직화학적 염색을 나타낸 것이다. 모든 양성 염색은 갈색을 나타낸다. 태아의 벤트랄 중뇌 세포에 비타민 C 및 비타민 E를 처리시, Nurr1에 대한 양성 세포 밀도는 정상(B)보다 높게 나타난다. A, 정상; B, 비타민 C 및 비타민 E를 처리함, 축척 막대 = 30 ㎛
Claims (3)
- 벤트랄 중뇌에서 도파민 신경세포의 생성을 위한 티로신 하이드록실라제 및 Nurr1 비타민 C 및 비타민 E 발현 증강제
- 제 1항에 있어서, 상기 증강제로서 함량은 래트 태아 벤트랄 중뇌 세포 106 세포수에 대해 0.4∼0.6 mM 비타민 C 및 0.8∼1.2 μM 비타민 E임을 특징으로 하는 발현 증강제
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 래트 태아 벤트랄 중뇌 세포는 임신 13.5일째에 채취된 세포임을 특징으로 하는 발현 증강제
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