KR20090026258A

KR20090026258A - 신규 항ｃｄ98 항체

Info

Publication number: KR20090026258A
Application number: KR1020087027290A
Authority: KR
Inventors: 도모유끼 다하라; 요시카쯔 가나이; 히또시 엔도; 쉬로 가따오까; 가즈마사 하세가와; 데쯔야 요시노
Original assignee: 기린 파마 가부시끼가이샤
Priority date: 2006-04-06
Filing date: 2007-04-05
Publication date: 2009-03-12
Anticipated expiration: 2027-04-05
Also published as: TW200808962A; US8486402B2; US20100143367A1; US20140037636A1; CA2648618C; JP5160501B2; EP2011869B1; EP2011869A4; JPWO2007114496A1; US9051374B2; CN102659947A; US20150307621A1; US9688770B2; EP2527437A1; CN101460623A; WO2007114496A1; JP2009189376A; AU2007232706A1; JP4324637B2; US20110280884A1

Abstract

본 발명에는, 암 세포의 세포막에서 유래하는 CD98로서, 아미노산 수송 활성을 갖는 단백질(예를 들면, LAT1)과 복합체를 형성하고 있는 CD98에 대해 특이적 결합능을 갖는 인간 항체 및 그의 기능적 단편이 개시되어 있다. 이 항체는, LAT1과 암 세포 표면에서 이량체를 형성하고 있는 CD98에 결합하여, CD98을 발현하는 암 세포를, ADCC나 CDC에 의한 면역 시스템을 이용하여 특이적으로 공격하고, LAT1을 통한 암 세포의 아미노산 흡수를 저해함으로써 그 증식을 억제한다. 따라서, 이 항체 또는 이 항체 단편을 포함하는, 다양한 종류의 암에 작용하며 암에 특이적이고 부작용이 없는, 암의 예방 및 치료제가 제공된다.

Description

신규 항ＣＤ98 항체{NOVEL ANTI-CD98 ANTIBODY}

관련 출원의 참조

본 특허 출원은, 일본 특허 출원 제2006-105013호(출원일: 2006년 4월 6일)에 기초한 우선권의 주장을 동반하는 것이다. 일본 특허 출원 제2006-105013호에 있어서의 전체 개시 내용은, 인용함으로써 본 명세서의 일부가 된다.

발명의 배경

본 발명은, 독립 행정 법인 과학 기술 진흥 기구의 "항-아미노산 수송체 단백질 항체 항암약"에 관한 신기술 개발 위탁에 따른 개발의 성과에 따른 발명이다.

<발명의 분야>

본 발명은 암 세포의 세포막에서 유래하고, 아미노산 수송체 활성을 갖는 단백질과의 복합체 형태인 CD98에 대해 특이적 결합능을 갖는 모노클로날 항체 및 그의 종양 증식 억제 또는 암 치료를 위한 의약 용도에 관한 것이다.

암(악성 종양)은, 일본에 있어서의 사망 원인 제1위를 차지한다. 암 환자수는 해마다 증가하고 있으며, 유효성 및 안정성이 높은 약제나 치료법의 개발이 강하게 요망되고 있다. 현재까지의 항암제는 종종 암 세포를 특이적으로 죽이는 능력이 낮고 정상적인 세포에도 작용하여, 많은 약물 부작용이 일어났다. 최근, 암 세포에서 높은 수준으로 발현되는 분자(암 관련 항원)를 표적으로 한 항암제의 개발이 진행되고 있으며, 이들 약제는 백혈병, 유방암, 폐암 등에 있어서 유효한 치료제가 되었다.

세포막 위에 발현되는 암 관련 항원에 대하여 특이적으로 결합하는 항체는, 항체 의존성 세포성 세포 상해 활성(antibody dependent cell cytotoxicity(ADCC))이나 보체 의존성 세포 상해 활성(complement-dependent cell-mediated cytotoxicity(CDC)) 등의 면역 반응을 통해 암 세포를 공격하거나, 암 세포의 증식에 필요한 세포 증식 신호 전달을 억제하므로 암 치료에 유용하다고 알려져 있다.

그러나, 항체는 유방암, 난치성 만성 림프종, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병 등 한정된 암종의 치료에만 사용되고 있으며, 하나의 항체로 다양한 암종의 치료에 사용할 수 있는 항체는 아직도 없다. 그 때문에, 다양한 종류의 암 세포에 강하게 결합하여 항암 활성을 갖는 항체의 취득이 요구되고 있었다.

CD98(4F2)은, 다양한 종류의 암 세포에서 높은 수준으로 발현된다고 알려져 있는 529개의 아미노산 잔기로 구성된 약 80 kDa의 타입 II 막 관통 당단백질쇄이다. CD98은, 아미노산 수송체 활성을 갖는 약 40 kDa의 단백질과 디술피드 결합에 의해 헤테로 이량체를 형성하여, 세포막 위에 발현된다. CD98에 결합하는 것으로 생각되는 아미노산 수송 단백질로서는 6종이 알려져 있다. CD98은 림프구의 활성화 항원으로서 동정되었지만, 세포 증식 신호 전달, 인테그린의 활성화, 세포 융합 등 많은 생물학적 기능에 관여한다고 생각되고 있다(Haynes B. F et al., J. Immunol., (1981), 126, 1409-1414, Lindsten T. et al., Mol . Cell Biol ., (1988), 8, 3820-3826, Teixeira S. et al., Eur . J. Biochem ., (1991), 202, 819-826, L. A. Diaz Jr. et al., J Biol Regul Homeost Agents, (1998) 12, 25-32).

암 세포는 증식의 우위성을 확보하기 위해 다양한 기작을 가진다. 예를 들면, 암 세포가 증식에 필요한 필수 아미노산을 주변 세포에 대하여 우선적으로 흡수하기 위해 중성 아미노산 수송체를 과잉 발현하는 것도 그 중 하나라고 생각된다. 최근, 암 세포에 특이적으로 높은 수준으로 발현되는 아미노산 수송체인 L-타입 아미노산 트랜스포터 1(LAT1)이 클로닝되었다(Kanai et al., J. Biol . Chem . (1998), 273, 23629-23632). LAT1은 CD98과 복합체를 형성하고, 류신, 발린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 히스티딘 등의 대형의 측쇄를 갖는 중성 아미노산을 나트륨 이온-비의존적으로 수송한다. 또한, LAT1은 뇌, 태반, 골수, 정소를 제외한 대부분의 정상 조직에서는 발현이 낮거나 전혀 발현되지 않지만, 대장암, 위암, 유방암, 췌장암, 신장암, 후두암, 식도암, 폐암 등의 인간 악성 종양 조직에서 CD98과 함께 발현이 증가된다고 알려져 있다(Yanagida et al., Biochem. Biophys. Acta, (2001), 1514, 291-302). LAT1의 발현을 저하시켜 아미노산 흡수를 억제하면, 종양의 증식이 억제된다는 것이 암 이식 마우스 모델에서 보고되어 있기 때문에(일본 특허 공개 제2000-157286호 공보), LAT1의 활성을 억제하는 것은 암의 치료법에 유망하다고 생각된다.

인간 CD98에 대한 항체에 대해서는, 인간 CD98 발현 세포주로 마우스 등의 비인간 포유 동물을 면역화함으로써 제조된 마우스 모노클로날 항체가 보고되어 있다(Haynes et al (상개 논문), Masuko T. et al., Cancer Res ., (1986), 46, 1478-1484 및 Freidman AW. et al., Cell . Immunol ., (1994), 154, 253-263). 그러나, 이들 항-CD98 항체가 LAT1의 아미노산 흡수를 억제하는지 여부에 대해서는 알려져 있지 않다. 또한, LAT1의 세포 내 영역의 항체는 얻어졌지만, 살아있는 세포의 세포막 상에 존재하는 LAT1에 결합할 수 있는 항체는 보고되어 있지 않다. 따라서, 암 세포막 위에 발현된 CD98 또는 LAT1에 결합하여 LAT1의 아미노산 흡수를 억제할 수 있는 항체가 얻어지면, 그러한 항체는 광범위한 암에 대한 우수한 암 치료약이 된다고 생각된다.

[도 1] 인간 항-CD98 모노클로날 항체의 인간 CD98/인간 LAT1-발현 CT26 세포주에 대한 결합성을 나타낸 도면이다.

[도 2A] 인간 항-CD98 모노클로날 항체의 인간 CD98-발현 L929 세포주에 대한 결합성을 나타낸 도면이다.

[도 2B] 인간 항-CD98 모노클로날 항체의 인간 CD98-발현 L929 세포주에 대한 결합성을 나타낸 도면이다.

[도 3] 인간 항-CD98 모노클로날 항체의, 튜니카마이신으로 처리된 K562 인간 세포주에 대한 결합성을 나타낸 도면이다.

[도 4A] 인간 항-CD98 모노클로날 항체의 각종 마우스/인간 키메라 CD98-발현 L929 세포주에 대한 결합성을 나타낸 도면이다.

[도 4B] 인간 항-CD98 모노클로날 항체의 각종 마우스/인간 키메라 CD98-발현 L929 세포주에 대한 결합성을 나타낸 도면이다.

[도 5] 인간 항-CD98 모노클로날 항체의 T24 인간 방광암 세포주의 아미노산 흡수 억제 활성을 나타낸 도면이다.

[도 6A] 인간 항-CD98 모노클로날 항체의 인간 말초혈 T 세포, B 세포 및 단구 세포에 대한 결합성을 나타낸 도면이다.

[도 6B] 인간 항-CD98 모노클로날 항체의 인간 말초혈 T 세포, B 세포 및 단구 세포에 대한 결합성을 나타낸 도면이다.

[도 7] 인간 항-CD98 모노클로날 항체의 PHA-활성화 인간 말초혈 T 세포 및 B 세포에 대한 결합성을 나타낸 도면이다.

[도 8] 인간 항-CD98 모노클로날 항체의 인간 대동맥 내피 세포주(HAEC)와 인간 대장암 세포주(DLD-1)에 대한 결합성을 나타낸 도면이다.

[도 9A] 인간 항-CD98 모노클로날 항체의 각종 암 세포주에 대한 결합성을 나타낸 도면이다.

[도 9B] 인간 항-CD98 모노클로날 항체의 각종 암 세포주에 대한 결합성을 나타낸 도면이다.

[도 10A] 인간 항-CD98 모노클로날 항체의 각종 암 세포주에 대한 결합성을 나타낸 도면이다.

[도 10B] 인간 항-CD98 모노클로날 항체의 각종 암 세포주에 대한 결합성을 나타낸 도면이다.

[도 11] 인간 항-CD98 모노클로날 항체 K3, 3-69-6 또는 C2IgG1을 종양 세포를 이식한 누드 마우스에 투여했을 때 관찰되는 각각의 누드 마우스에서의 종양 부피를 나타낸 도면이다.

[도 12] 90 ㎣로 성장한 종양을 갖는 담암(cancer-bearing) 마우스에 대하여, 인간 항-CD98 모노클로날 항체 C2IgG1을 100 ㎍/마우스 개체로 격일로 3회 투여한 후 종양 부피를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.

[도 13] 인간 항-CD98 모노클로날 항체 K3 및 C2IgG1의 원숭이 세포주 COS-7에 대한 교차 반응성을 나타낸 도면이다.

[도 14] 버킷 림프종 세포주 Ramos를 이식하여 종양이 30 내지 140 ㎣로 성장한 담암 마우스에 대해, 인간 항-CD98 모노클로날 항체 C2IgG1 및 리툭시맵을 100 ㎎/마우스 개체로 각각 3회/주 투여했을 때의 종양 부피를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.

[도 15] HPLC로 측정한, 인간 항-CD98 모노클로날 항체 C2IgG1NS 아미노산 개변 항체의 정제 후의 응집체 함유율을 나타낸 도면이다.

[도 16A] 인간 항-CD98 모노클로날 항체 K3과 C2IgG1 및 C2IgG1의 각 아미노산 개변 항체의 인간 CD98 또는 인간 LAT1-발현 L929 세포주에 대한 결합성을 나타낸 도면이다.

[도 16B] 인간 항-CD98 모노클로날 항체 K3과 C2IgG1, 및 C2IgG1의 각 아미노산 개변 항체의, 인간 대장암 세포주(DLD-1), 버킷 림프종 세포주(Ramos), 인간 대장암 세포주(Colo205) 및 인간 대동맥 내피 세포(HAEC)에 대한 결합성을 나타낸 도면이다.

<발명의 구체적인 설명>

미생물의 기탁

본 발명에 의해 제공되는 인간 항체의 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 벡터 C2IgG1/pCR4 및 K3/pCR4는, 2006년 3월 14일자로 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본 이바라끼껜 쯔구바시 히가시 1쪼메 1방 1 주오 제6)에 각각 FERM BP-10551(식별을 위한 표시: C2IgG1/pCR4) 및 FERM BP-10552(식별을 위한 표시: K3/pCR4)로서 기탁되어 있다.

정의

본 명세서 및 도면에 있어서 아미노산을 표기하기 위해 사용되는 1문자 기호는, 각각 하기 나타내는 아미노산을 의미한다: (G) 글리신, (A) 알라닌, (V) 발린, (L) 류신, (I) 이소류신, (S) 세린, (T) 트레오닌, (D) 아스파르트산, (E) 글루탐산, (N) 아스파라긴, (Q) 글루타민, (K) 리신, (R) 아르기닌, (C) 시스테인, (M) 메티오닌, (F) 페닐알라닌, (Y) 티로신, (W) 트립토판, (H) 히스티딘, 및 (P) 프롤린. 또한, DNA를 표기하기 위해 사용되는 1문자 기호는, 각각 하기와 같다: (A) 아데닌, (C) 시토신, (G) 구아닌, 및 (T) 티민.

CD98 및 그에 대한 모노클로날 항체

본 발명에 따른 인간 모노클로날 항체 및 그의 기능적 단편(이하, 특별히 언급하지 않는 한, "본 발명에 따른 항체"라고 함)이 특이적 결합능을 갖는 CD98은, 상술한 바와 같이 529개의 아미노산 잔기로 구성된 타입 II 막 관통 당단백질쇄이고, 아미노산 수송체 활성을 갖는 단백질과 세포막 위에서 헤테로 이량체 형태를 이룬다. 여기서, 아미노산 수송체 활성을 갖는 단백질의 바람직한 구체예로서는 LAT1을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, CD98은 인간 CD98이다. 인간 CD98의 단백질 1차 구조는 공지되어 있으며(서열 번호 66; GenBank/EMBL/DDBJ accession No. AB018010), 인간 LAT1의 단백질 1차 구조도 공지되어 있다(서열 번호 68; GenBank/EMBL/DDBJ accession no. AB018009).

본 발명에 따른 항체는 암 세포의 세포막에서 유래하는 CD98로서, 아미노산 수송체 활성을 갖는 단백질과의 복합체 형태인 CD98에 대해 특이적 결합능을 갖는 한편, 인간 정상 세포, 예를 들면 정상 인간 혈관 내피 세포, 정상 인간 말초혈 단구 또는 림프구에는 결합하지 않는다. 상기 항체가 결합능을 갖는 암 세포의 예로서는, 대장암, 결장암, 폐암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 뇌종양, 림프종, 방광암, 췌장암, 다발성 골수종, 신장 세포 암종, 백혈병, T 세포 림프종, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 난소암, 식도암, 간암, 두경부 편평상피암종, 피부암, 요로암, 전립선암, 융모막 암종, 인두암, 후두암, 흉막종, 남성 배종, 자궁 내막 과형성, 자궁 내막증, 배아종, 선유육종, 카포지육종, 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관아종, 망막아종, 성상 세포종, 신경선유종, 희돌기교종, 수아종, 신경아종, 신경교종, 횡문근육종, 교아종, 골원성 육종, 평활 근육종, 갑상육종, 빌름스 종양 등을 구성하는 암 세포를 들 수 있으며, 보다 구체적으로는 대장암 세포주(DLD-1, Colo205, SW480, SW620, LOVO, LS180 및 HT29), 폐암 세포주(H226), 전립선암 세포주(DU145), 흑색종 세포주(G361, SKMEL28 및 CRL1579), 비호지킨 림프종 세포주(Ramos), 방광암 세포주(T24), 유방암 세포주(MCF 및 MDA-MB-231), 췌장암 세포주(HS766T), 다발성 골수종 세포주(IM9), 적아구계 백혈병 세포주(K562)를 들 수 있다. 본 발명에 따른 항체는, 이러한 다양한 암 세포에 대해 결합능을 갖는다는 점에서 유리하다.

본 발명에 따른 항체의 암 세포에 대한 특이적인 결합능은, 본 발명에 따른 항체의 유용성을 높인다. 즉, 후술하는 바와 같이, 본 발명의 바람직한 양태의 항체는, LAT1을 통한 세포 내로의 아미노산 흡수를 유의하게 저해하기 위해, 암 세포에만 결합하는 점이 유리하며, 본 발명에 따른 항체를 다른 약제와 결합시켜 이 약제를 암 세포로 송달하기 위한 표적화제로서 유리하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항체는 항종양 활성을 갖는다. 본 발명의 바람직한 양태에 따른 항체는, LAT1을 통한 세포 내로의 아미노산 흡수를 유의하게 저해하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 항체의 항종양 활성은, ADCC 및 CDC에 의한 면역 시스템을 이용한 특이적 상해뿐만 아니라, 이러한 아미노산 흡수 저해에 의해 초래된다고 생각된다. 본 발명의 보다 구체적인 양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체는 방광암 세포주 T24 세포의 아미노산 흡수를 유의하게 저해한다.

본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체는 후술하는 (a) 서열 번호 29 및 31, (b) 서열 번호 41 및 47 및 (c) 서열 번호 43 및 47 중 임의의 서열 쌍을 그의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로서 갖는다. 또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체는 플라스미드 벡터 K3/pCR4(FERM BP-10552) 또는 C2IgG1/pCR4(FERM BP-10551)에 포함되는, 벡터 pCR4에서 유래하는 서열 이외의 서열에 의해 코딩되는 서열을 가변 영역으로서 갖는다. 이 양태에 따른 항체의 가변 영역의 아미노산 서열은 BglII-BsiWI 단편(경쇄 가변 영역) 및 SalI-NheI 단편(중쇄 가변 영역)에 의해 코딩되는 것이며, 이는 상기 어느 하나의 플라스미드 벡터로부터 얻어지고, 벡터 pCR4에서 유래하는 서열을 포함하지 않다.

본 발명에 따른 항체의 기능적 단편이란, 본 발명에 따른 항체가 특이적으로 결합하는 항원에 대하여 특이적으로 결합하는 항체의 단편을 의미하고, 보다 구체적으로는 F(ab')₂, Fab', Fab, Fv, 디술파이드-연결된 FV, 단일쇄 FV(scFV) 및 이들 중합체 등을 들 수 있다(D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998, T. J. International Ltd). 이러한 항체 단편은 관용법, 예를 들면 파파인, 펩신 등의 프로테아제에 의한 항체 분자의 소화(digestion), 또는 공지된 유전공학적 수법에 의해 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, "인간 항체"란 인간에서 유래하는 항체 유전자의 발현 산물인 항체를 의미한다. 인간 항체는 인간 항체 유전자좌를 도입하여 인간에서 유래하는 항체를 생산하는 능력을 갖는 트랜스제닉 동물에게 항원을 투여함으로써 얻을 수 있다. 상기 트랜스제닉 동물의 예로서 마우스를 들 수 있으며, 인간 항체를 생산할 수 있는 마우스의 작출 방법은, 예를 들면 국제 공개 제WO02/43478호 공보에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 항체에는, 항체를 구성하는 중쇄 및/또는 경쇄의 각각의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 수개의 아미노산이 결실(缺失), 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및/또는 경쇄로 구성된 모노클로날 항체도 포함된다. 본 발명에 따른 항체의 아미노산 서열 중으로의 이러한 아미노산의 부분적 개변(결실, 치환, 삽입 또는 부가)는, 이 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 부분적으로 변이함으로써 도입할 수 있다. 이 염기 서열의 부분적 개변은, 공지된 부위 특이적 돌연변이 도입법(Site specific mutagenesis)을 이용하여 통상법에 의해 도입할 수 있다(Proc Natl Acsd Sci USA., 1984 Vol 8, 15662; Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual(1989) Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체는 경쇄 117번째의 이소류신이 다른 아미노산 잔기, 예를 들면 메티오닌, 아스파라긴, 류신 또는 시스테인으로 치환된 항체이다. 이러한 항체의 바람직한 예로서는, (d) 서열 번호 43 및 77, (e) 서열 번호 43 및 79, (f) 서열 번호 43 및 81, 및 (g) 서열 번호 43 및 83 중 임의의 서열 쌍을 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로서 갖는 것을 들 수 있다.

본 발명에 따른 항체에는 임의의 면역 글로불린 클래스 및 서브 클래스를 갖는 항체도 포함된다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면 이 항체는 인간 면역 글로불린 클래스 및 서브 클래스를 갖는 항체이며, 바람직한 클래스 및 서브 클래스는 면역 글로불린 G(IgG), 특히 IgG1이고, 바람직한 경쇄는 κ이다.

또한, 본 발명에 따른 항체에는, 당업자에게 널리 알려진 유전공학적 개변(예를 들면, EP 0 314 161호 공보)에 의해 상이한 서브 클래스로 변환된 항체도 포함된다. 즉, 본 발명에 따른 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 사용하여, 유전공학적 수법에 의해 본래의 서브 클래스와는 상이한 서브 클래스의 항체를 얻을 수 있다.

ADCC는, 대식 세포, NK 세포, 호중구 등의 표면에 발현되는 Fc 수용체를 통해 항체의 불변 영역과 결합함으로써 세포를 인식하고, 인식한 세포가 활성화됨으로써 유도되는 세포 장해 활성을 의미한다. 한편, CDC는 항체가 항원과 결합함으로써 활성화된 보체계에 의해 발생되는 세포 장해 활성을 의미한다. 이들 활성은 항체의 서브 클래스에 따라 그 활성의 강약이 상이하며, 이는 항체의 불변 영역의 구조의 차이에 기인한다는 것이 밝혀졌다(Charles A. Janeway et. al. Immunobiology, 1997, Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.).

따라서, 예를 들면 본 발명에 따른 항체의 서브 클래스를 IgG2 또는 IgG4로 변환함으로써, Fc 수용체에 대한 결합도가 낮은 항체를 얻을 수 있다. 반대로, 본 발명의 항체의 서브 클래스를 IgG1 또는 IgG3으로 변환함으로써, Fc 수용체에 대한 결합도가 높은 항체를 얻을 수 있다. 상기 ADCC 및 CDC 활성을 기대하는 경우에는, 항체 서브 클래스가 IgG1인 것이 바람직하다.

상이한 서브 클래스의 항체를 IgG1로 변환하는 경우, IgG1은 예를 들면 항체 생산 하이브리도마로부터 가변 영역만을 단리하여, 인간 IgG1의 불변 영역을 포함하는 벡터, 예를 들면 N5KG1-Val Lark 벡터(IDEC Pharmaceuticals, N5KG1(미국 특허 제6001358호)에 도입함으로써 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항체의 불변 영역의 아미노산 서열을 유전공학적으로 개변시키거나, 또는 이러한 서열 갖는 불변 영역 서열과 결합시킴으로써, Fc 수용체에 대한 결합력을 변화시키거나(Janeway CA. Jr. and Travers P.(1997), Immunobiology, Third Edition, Current Biology Ltd./Garland Phulishing Inc. 참조), 또는 보체에 대한 결합력을 변화시키는 것(Mi-Hua Tao, et al. 1993. J. Exp. Med 참조)이 가능하다. 예를 들면, 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링 시스템(Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242를 참조)에 따른 331번째의 프롤린(P)을 코딩하는 서열 CCC를 세린(S)을 코딩하는 TCC로 변이시켜 프롤린을 세린으로 치환함으로써 보체에 대한 결합력을 변화시킬 수 있다.

예를 들면, 만일 본 발명에 따른 항체가 단독으로는 세포사 유도 활성이 없는 경우, Fc 수용체를 통한 항체 의존성 세포 장해 활성(ADCC)이나 보체 의존성 세포 상해 활성(CDC)에 기한 항종양 활성을 갖는 항체가 바람직하다. 그러나, 항체 단독으로도 세포사 유도 활성이 있는 경우에는, Fc 수용체와의 결합력이 낮은 항체가 보다 바람직한 경우도 있다.

면역 억제제에 대해서는, T 세포와 항원 제시 세포의 결합만을 입체적으로 저해하는 경우 등, ADCC 활성 또는 CDC 활성을 갖지 않는 항체가 바람직하다. 또한, ADCC 활성 또는 CDC 활성이 독성의 원인이 될 수 있는 경우, 독성의 원인이 되는 활성을 Fc 부분의 변이 또는 서브 클래스를 변경함으로써 회피한 항체가 바람직한 경우도 있다.

이상을 고려하여, 필요에 따라 상이한 서브 클래스로 유전공학적으로 개변함으로써, 본 발명에 따른 항체를 ADCC 또는 CDC에 의해 암 세포를 특이적으로 상해시킬 수 있는 것으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 인간 CD98의 아미노산 서열(서열 번호 66) 중의 연속적 또는 불연속적인 8개 이상의 아미노산 잔기에 의해 구성되는 에피토프를 인식한다. 본 발명의 보다 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체는 인간 CD98의 아미노산 서열 중의 371 내지 529번 아미노산 영역의 일부분에 결합능을 갖거나, 또는 1 내지 371번 아미노산 영역의 일부분에 결합능을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체로서, 인간 CD98 및 원숭이 CD98에 대하여 교차 반응성을 갖는 항체가 제공된다. 이러한 항체는, 인간 CD98과 원숭이 CD98에 있어서 동일하거나 매우 유사한 에피토프 구조를 인식하는 것으로 상정되기 때문에, 인간에 대한 임상 시험에 앞서서 원숭이를 실험 동물로 한 다양한 시험이 가능하다는 이점을 갖는다.

CD98 항체의 제조

본 발명에 따른 항체는, 예를 들면 이하 설명하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 CD98/인간 LAT1 또는 그의 일부, 또는 항원의 항원성을 높이기 위한 적당한 물질(예를 들면, 소 혈청 알부민 등)과의 접합체, 또는 인간 CD98/인간 LAT1을 세포 표면에 다량으로 발현하는 세포를 필요에 따라 면역 부활제(프로인트 보조제 등)와 함께 마우스, 토끼, 염소, 말 등의 비인간 포유 동물에 면역화하거나, 또는 인간 CD98/인간 LAT1을 조합한 발현 벡터를 비인간 포유 동물에 투여함으로써 면역화를 행한다. 본 발명에 따른 항체는, 면역화된 동물로부터 얻은 항체 생산 세포와 자기 항체 생산능이 없는 미엘로마 세포로부터 하이브리도마를 제조하고, 하이브리도마를 클론화하여, 면역화에 사용한 항원에 대하여 특이적 친화성을 나타내는 모노클로날 항체를 생산하는 클론을 선택함으로써 얻을 수 있다.

이하에 더욱 구체적으로 본 발명에 따른 항체의 제조법에 대하여 설명하지만, 항체의 제조법은 이것으로 제한되지 않으며, 예를 들면 췌장 세포 이외의 항체 생산 세포 및 미엘로마를 사용할 수도 있다.

항원으로서는, CD98을 코딩하는 DNA를 동물 세포용 발현 벡터에 조합하고, 상기 발현 벡터를 동물 세포에 도입하여 얻은 형질 전환주(transformant)를 사용할 수 있다.

CD98은 많은 암 세포 표면에서 LAT1과 헤테로 이량체를 형성하고 있기 때문에, LAT1을 코딩하는 DNA를 마찬가지로 발현 벡터에 조합하고, CD98과 LAT1을 공발현하는 형질 전환주를 항원으로서 사용함으로써, LAT1에 의한 아미노산 흡수를 저해하는 항체의 취득을 기대할 수 있다.

동물 세포용 발현 벡터로서는, 예를 들면 pEGF-N1(벡톤 디킨슨 바이오사이언스 클론테크사 제조) 등의 벡터를 사용할 수 있으며, 적당한 제한 효소로 삽입 부위를 개열(開裂)하고, 동일한 효소로 개열된 인간 CD98 또는 인간 LAT1을 연결함으로써, 목적 유전자 도입용 벡터를 제조할 수 있다. 또한, 제조한 발현 벡터를 예를 들면 L929 세포(American Type Culture Collection No. CCL-1)와 같은 세포를 숙주로서 도입함으로써, 인간 CD98 및 인간 LAT1을 고발현하는 세포를 제조할 수 있다.

숙주로의 유전자의 도입 방법은 공지되어 있으며, 임의의 방법(예를 들면 칼슘 이온을 사용하는 방법, 전기 천공법, 스페로플라스트(spheroplast)법, 아세트산리튬법, 인산칼슘법, 리포펙션법 등)을 예로 들 수 있다.

이렇게 하여 제조한 형질 전환된 세포는 CD98 항체를 제조하기 위한 면역원으로 사용할 수 있다. 또한, 발현 벡터 그 자체를 면역원으로 사용할 수도 있다.

인간 CD98은 공지된 염기 서열 또는 아미노산 서열에 기초하여, 유전자 재조합 기술뿐만 아니라 화학적 합성법, 세포 배양 방법 등과 같은 당업계에 알려진 방법을 적절하게 이용함으로써 제조할 수 있다. 또한, 이렇게 하여 얻어진 인간 CD98 단백질을 항원으로 사용하여 CD98 항체를 제조하는 것도 가능하다. 인간 CD98의 부분 서열은, 후술하는 당업계에 알려진 방법에 따라, 유전자 재조합 기술 또는 화학적 합성법에 의해 제조할 수도 있으며, 인간 CD98을 단백질 분해 효소 등을 사용하여 적절하게 절단함으로써 제조할 수 있다.

상술한 바와 같이 하여 얻은 항원을 이하와 같이 면역화에 사용한다. 구체적으로, 제조한 항원을 항원성을 높이기 위한 적당한 물질(예를 들면, 소 혈청 알부민 등) 및 필요에 따라 면역 부활제(프로인트 완전 또는 불완전 보조제 등)와 함께 혼합하여, 마우스, 토끼, 염소, 말 등의 비인간 포유 동물의 면역화에 사용한다. 또한, 바람직하게는 재 배열되어 있지 않은 인간 항체 유전자를 보유하고 면역화에 의해 해당 면역원에 특이적인 인간 항체를 생산하는 비인간 동물을 사용함으로써, 본 발명의 항체는 인간 항체로서 얻어질 수도 있다. 이 경우, 인간 항체 생산 동물로서는, 예를 들면 도미즈까 등의 문헌 [Tomizuka et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 2000 Vol 97:722]에 기재되어 있는 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스를 들 수 있다.

모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마의 제조는, 쾰러 및 밀스타인 등의 방법(Kohler and Milstein, Nature, 1975 Vol. 256:495-497) 및 그에 준하여 행할 수 있다. 즉, 상술한 바와 같이 면역화된 동물로부터 얻어지는 췌장, 림프절, 골수, 편도 등, 바람직하게는 림프절 또는 췌장에 포함되는 항체 생산 세포와, 바람직하게는 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 토끼, 인간 등의 포유 동물에서 유래하는 자기 항체 생산능이 없는 미엘로마 세포를 세포 융합시킴으로써 제조된다. 세포 융합은, 폴리에틸렌글리콜(예를 들면 분자량 1500 내지 6000) 등의 고농도 중합체 용액 중, 통상적으로 약 30 내지 40 ℃에서 약 1 내지 10분간 항체 생산 세포와 미엘로마 세포를 혼합함으로써 행할 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 클론의 스크리닝은, 하이브리도마를 예를 들면 마이크로타이터 플레이트 중에서 배양하고, 하이브리도마의 증식이 관찰된 웰 중의 배양 상청의 면역화 항원에 대한 반응성을, 효소 면역 측정법(예를 들면 ELISA), 방사성 면역 측정법 또는 형광 항체법 등의 면역학적 방법을 이용하여 측정함으로써 행할 수 있다.

하이브리도마로부터의 모노클로날 항체의 제조는, 하이브리도마를 시험관내에서 배양한 뒤 모노클로날 항체를 배양 상청으로부터 단리하여 행할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체는 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 토끼 등의 복수 중 등에서의 생체 내에서 하이브리도마를 배양하여, 복수로부터 모노클로날 항체를 단리하여 제조할 수도 있다. 또한, 하이브리도마 등의 항체 생산 세포로부터 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 클로닝하고, 이 유전자를 적당한 벡터에 조합하고, 이 벡터를 숙주(예를 들면 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 등의 포유류 세포주, 대장균, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)에 도입함으로써, 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있다(P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J. W. Goding., Monoclonal Antibodies:principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS). 또한, 트랜스제닉 동물 제조 기술을 이용하여, 목적 항체의 유전자가 내재성 유전자에 조합된 트랜스제닉 소, 염소, 양 또는 돼지를 제조함으로써, 이 트랜스제닉 동물의 우유 중으로부터 그 항체 유전자에서 유래하는 모노클로날 항체를 대량으로 얻는 것도 가능하다. 하이브리도마를 시험관내에서 배양하는 경우에는, 배양하는 세포종의 특성, 시험 연구의 목적 및 배양 방법 등의 다양한 조건에 따라, 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시키고, 배양 상청 중에 모노클로날 항체를 생산하기 위해 사용되는 공지된 영양 배지 또는 공지된 기본 배지로부터 유도 제조되는 임의의 영양 배지를 사용하여 실시하는 것이 가능하다.

생산된 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 방법, 예를 들면 단백질 A 칼럼을 이용한 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 황산암모늄 염석출법, 겔 여과, 친화성 크로마토그래피 등을 적절하게 조합함으로써 정제할 수 있다.

항체의 의약 용도

본 발명에 따른 항체는, 우선 그 암 세포의 세포막에서 유래하는 CD98로서, 아미노산 수송체 활성을 갖는 단백질과의 복합체 형태인 CD98에 대한 특이적 결합능 때문에, 치료용 약제와 항체를 접합(conjugate)시킴으로써, 암 세포로의 약물 전달 또는 미사일 요법 등의 치료 목적에 사용할 수 있는 복합체를 형성할 수 있다.

항체에 접합시키는 치료용 약제의 예로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 요오드(¹³Iodine: ¹³¹I, ¹²⁵Iodine ¹²⁵I), 이트륨(⁹⁰Yttrium: ⁹⁰Y), 인듐(¹¹¹Indium: ¹¹¹In), 테크네튬(⁹⁹ ^mTechnetium: ⁹⁹ ^mTc) 등의 방사성 핵종(J. W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS); 녹농균 외독소(Pseudomonas exotoxin), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 리신(Ricin)과 같은 세균 독소; 및 메토트렉세이트, 미토마이신, 칼리케아마이신 등의 화학 요법제(D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T. J. International Ltd, M. L. Grossbard., Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc) 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 라디칼 생성을 유도하는 셀레늄 화합물을 들 수 있다.

항체는 공유 또는 비공유 결합(예를 들면 이온 결합)을 통해 치료용 약제와 결합될 수 있다. 예를 들면, 분자 중의 반응성 기(예를 들면 아민기, 카르복실기 또는 수산기) 또는 배위성 기를 이용하여, 필요에 따라 반응성이 보다 높은 기에 결합시키거나 또는 반응성 기로 변환한 후, 상기 반응성 기와 반응하여 결합을 형성할 수 있는 관능기(세균 독소, 화학 요법제의 경우) 또는 상기 배위성 기와 착체를 형성할 수 있는 이온성 기(방사성 핵종의 경우)를 갖는 치료용 약제와 항체를 접촉시킴으로써, 본 발명의 복합체를 얻을 수 있다. 또는, 복합체의 형성시에 비오틴-아비딘계의 이용도 가능하다.

또한, 치료용 약제가 단백질 또는 펩티드인 경우에는, 유전공학적 수법에 의해 항체와 상기 단백질 또는 펩티드의 융합 단백질로서 생산하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 항체는 항종양 활성을 갖기 때문에, 항체 자체를 항종양제로서 사용할 수 있다. 또한, 상기 항체를 의약 조성물, 특히 종양의 예방 또는 치료제의 활성 성분으로서 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 항체 또는 의약 조성물은, 인간 CD98/인간 LAT1을 발현하는 세포에 기인할 수 있는, 다양한 질환 또는 증상의 치료 또는 예방으로의 적용이 가능하다. 질환 또는 증상의 예로는 각종 악성 종양을 들 수 있으며, 종양의 예로는 대장암, 결장암, 폐암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 뇌종양, 림프종, 방광암, 췌장암, 다발성 골수종, 신장 세포 암종, 백혈병, T 세포 림프종, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 난소암, 식도암, 간암, 두경부 편평상피암종, 피부암, 요로암, 전립선암, 융모막 암종, 인두암, 후두암, 흉막종, 남성 배종, 자궁 내막 과형성, 자궁 내막증, 배아종, 선유육종, 카포지육종, 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관아종, 망막아종, 성상 세포종, 신경선유종, 희돌기교종, 수아종, 신경아종, 신경교종, 횡문근육종, 교아종, 골원성 육종, 평활 근육종, 갑상육종, 빌름스 종양 등이다. 본 발명의 항체를 적용할 때의 종양은 1종으로 한정되지 않으며, 복수종의 종양이 합병한 것일 수도 있다. 또한, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는, 원발성의 국소암에 걸린 환자의 연명에도 적용 가능하다. 또한, CD98를 발현하는 면역 담당 세포에 대하여 본 발명의 의약 조성물을 선택적으로 작용시킬 수 있다.

본 발명에 따른 항체, 또는 치료용 약제와 결합한 항체를 함유하는 의약은, 의약 조성물로서 제공되는 것이 바람직하다.

이러한 의약 조성물에는 치료상 유효량의 치료용 약제가 포함되며, 경구 또는 비경구 투여용의 다양한 형태로 제제화된다. 여기서, 치료상 유효량이란, 소정 투여 계획에서 소정의 증상에 대하여 치료 효과를 나타내는 양을 말한다.

본 발명의 조성물은, 항체 뿐만 아니라 생리학적으로 허용될 수 있는 제약학상 첨가제, 예를 들면 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보조제, 산화 방지제, 등장화제, 부형제 및 담체 1종 이상을 포함할 수 있다. 또한, 다른 항체 또는 항생 물질과 같은 다른 약제와의 혼합물로 할 수도 있다.

적절한 담체에는 생리적 식염수, 인산 완충 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수 글루코스액 및 완충 생리 식염수가 포함되지만, 이것으로 한정되지 않는다. 또한, 당업계에 공지된 아미노산, 당류, 계면활성제 등의 안정화제 및 표면으로의 흡착 방지제를 포함할 수도 있다.

제제의 형태로서는, 동결 건조 제제(이 경우 상기한 바와 같은 완충 수용액을 첨가함으로써 재구성하여 사용 가능함), 서방성 제제, 장용성 제제, 주사제, 점적제 등을 포함하는 제제를 치료 목적, 치료 계획에 따라 선택 가능하다.

투여 경로는 적절하게 결정될 수 있지만, 예를 들면 경구 경로, 및 정맥 내, 근육 내, 피하 및 복강 내의 주사 또는 약물 전달을 포함하는 비경구적 경로가 고려된다. 또는, 환자의 환부에 직접 본 발명의 조성물을 접촉시키는 방법도 가능하다.

투여량은 동물 시험 및 임상 시험에 따라 적절하게 결정되지만, 일반적으로 환자의 상태 또는 경중도, 연령, 체중, 성별 등을 고려하여 결정되어야 한다. 통상적으로, 경구 투여에서는 성인에 대하여 1일 약 0.01 ㎎ 내지 1000 ㎎이고, 이들을 하루에 1회 또는 수회에 나누어 투여할 수 있다. 또한, 비경구 투여에서는 1회 약 0.01 ㎎ 내지 1000 ㎎을 피하 주사, 근육내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 투여할 수 있다.

본 발명은, 본 발명에 따른 항체 또는 의약 조성물을 사용한 상술된 질환의 예방 또는 치료 방법도 포함하며, 본 발명의 항체의 상술된 질환의 예방 또는 치료제의 제조를 위한 용도도 포함한다.

본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체는 물 또는 약리학적으로 허용할 수 있는 용액에 용해시켜 얻은 무균성 용액 또는 현탁액을 함유하는 앰플로 사용된다. 또한, 무균 분말 제제(본 발명의 분자를 동결 건조하는 것이 바람직함)를 앰플에 충전하고, 사용시에 약리학적으로 허용할 수 있는 용액으로 재구성할 수도 있다.

<발명의 개요>

본 발명자들은 암 세포의 세포막에서 유래하는 CD98로서, 아미노산 수송체 활성을 갖는 단백질과의 복합체 형태인 CD98에 대해 특이적 결합능을 갖는 항체를 얻는 것에 성공하여, 해당 항체가 암 세포의 증식을 억제하는 작용을 갖기 때문에 의약 조성물의 활성 성분, 보다 구체적으로는 종양의 예방 또는 치료제의 활성 성분으로서 유용하다는 지견을 얻었다. 본 발명은 이러한 지견에 기초한 것이다.

따라서, 본 발명은 암 세포의 세포막에서 유래하는 CD98로서, 아미노산 수송체 활성을 갖는 단백질과의 복합체 형태인 CD98에 대해 특이적 결합능을 갖는 인간 항체 및 그의 기능적 단편의 제공을 목적으로 하고 있다.

또한, 본 발명은, 상기한 본 발명에 따른 인간 항체 및 그의 기능적 단편을 활성 성분으로 하는 의약 조성물 또는 종양의 예방 또는 치료제의 제공을 다른 목적으로 하고 있다.

본 발명에 따른 인간 항체 및 그의 기능적 단편은, 암 세포의 세포막에서 유래하는 CD98로서, 아미노산 수송체 활성을 갖는 단백질과의 복합체 형태인 CD98에 대해 특이적 결합능을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 의약 조성물 또는 종양의 예방 또는 치료제는, 상기 본 발명에 따른 인간 항체 및 그의 기능적 단편을 활성 성분으로서 포함한다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 기재된 양태로 한정되지 않는다.

실시예 1: 인간 CD98 또는 인간 LAT1 발현 벡터의 제조

인간 CD98(hCD98, GenBank/EMBL/DDBJ accession no. AB018010; 서열 번호 65) 및 인간 LAT1(hLAT1, GenBank/EMBL/DDBJ accession no. AB018009; 서열 번호 67)의 DNA를 포함하는 플라스미드 벡터 pcDNA3.1-hCD98 및 pcDNA3.1-hLAT1을 각각 주형으로 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 행하였다. 완전 길이의 인간 CD98 cDNA의 5' 말단에 EcoRI 서열을, 그의 3' 말단에 NotI 서열과 종지 코돈을 부가하기 위해, 프라이머 5'-CCG GAA TTC CCA CCA TGA GCC AGG ACA CCG AGG TGG ATA TGA-3'(서열 번호 59) 및 5'-AAG GAA AAA AGC GGC CGC TCA TCA GGC CGC GTA GGG GAA GCG GAG CAG CAG-3'(서열 번호 60)를 사용하고, KOD-Plus DNA 폴리머라제(도요보사 제조) 및 hCD98 cDNA(약 20 ng)를 주형으로 사용하여, 94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초 및 68 ℃ 1분 30초간 30사이클의 PCR 반응을 행하였다. 수식된 hCD98 서열을 EcoRI-NotI 단편으로서 단리하고, 동일한 효소로 개열된 pTracer-EF/Bsd 벡터(인비트로젠사 제조)에 결찰(ligate)하였다. 얻어진 플라스미드를 주형으로 사용하고 CD98 v2 U(5'-AGT CTC TTG CAA TCG GCT AAG AAG AAG AGC ATC CGT GTC ATT CTG-3'(서열 번호 61)) 프라이머와 CD98 v2 L(5'-CAG AAT GAC ACG GAT GCT CTT CTT CTT AGC CGA TTG CAA GAG ACT-3'(서열 번호 62)) 프라이머를 사용하여, hCD98 DNA의 591과 594번째(서열 번호 65에 있어서의 702번째 및 705번째)의 A를 G로 변경하였다. 얻어진 플라스미드로부터 EcoRI-hCD98-NotI 단편을 제조하고, 동일한 효소로 개열된 pEF6myc-His/Bsd(인비트로젠사 제조) 벡터에 연결하였다. 얻어진 플라스미드를 pEF6/hCD98로 명명하였다.

동일한 방법으로, 완전 길이의 인간 LAT1 cDNA의 5' 말단에 EcoRI 서열을, 그의 3' 말단에 KpnI 서열을 부가하기 위해, 프라이머 5'-CCG GAA TTC CCA CCA TGG CGG GTG CGG GCC CGA AGC GGC-3'(서열 번호 63) 및 5'-CGG GGT ACC GTC TCC TGG GGG ACC ACC TGC ATG AGC TTC-3'(서열 번호 64)를 사용하고, KOD-Plus DNA 폴리머라제 및 hLAT1cDNA(약 20 ng)를 주형으로 사용하여, 94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초 및 68 ℃ 1분 30초간 30사이클의 PCR 반응을 행하였다. 수식된 hLAT1 서열을 EcoRI-KpnI 단편으로서 단리하고, 동일한 효소로 개열된 pEGFP-N1(클론테크사 제조) 벡터에 결찰하였다. 또한, 얻어진 플라스미드를 EcoRI-NotI 단편으로서 단리하고, 동일한 효소로 개열된 pEF1V5His/Neo(인비트로젠사 제조) 벡터에 결찰하였다. 얻어진 플라스미드를 pEF1/hLAT1-EGFP로 명명하였다.

실시예 2: hCD98 / hLAT1 발현 세포의 제조

hCD98/hLAT1 발현 세포는, 실시예 1에서 제조된 발현 벡터 pEF6/hCD98 및 pEF1/hLAT1-EGFP(hLAT1-E)를 인비트로젠사 제조의 리포펙타민과 플러스 시약을 사용하여, Colon 26(CT26) 세포와 L929 세포(American Type Culture Collection No. CCL-1)에 도입하여 제조하였다. 유전자 도입은 메뉴얼에 기재된 방법에 따라 행하였다. 트랜스제닉 세포를 세포 배양용 플레이트(6웰 플레이트, 벡톤 디킨슨사 제조)에, 37 ℃에서 5 ％ 탄산 가스하에 24 시간 동안 배양한 후, CT26 세포주의 경우 블라스티시딘(5 ㎍/mL)과 G418(500 ㎍/mL) 포함 배지에서, L929 세포주의 경우 블라스티시딘(5 ㎍/mL)과 G418(1 ㎎/mL) 포함 배지에서 추가로 3일간 배양하였다. 이어서, RPE 형광-표지 마우스 항-인간 CD98 항체(벡톤 디킨슨사 제조, Ca. No. 556076)를 사용한 FACS Vantage에 의해 hLAT1-E와 CD98 양성 세포를 분리하였다. 동일한 방법으로, hCD98 발현 L929 세포 또는 hLAT1-E 발현 L929 세포를 제조하였다.

실시예 3: 인간 항체 생산 마우스의 제조

면역화에 사용한 마우스는, 내인성 Ig 중쇄 및 κ 경쇄 양자의 파괴에 대하여 동종접합체이고, 인간 Ig 중쇄 유전자좌를 포함하는 14번 염색체 단편(SC20) 및 인간 Ig κ쇄 트랜스 유전자(KCo5)를 동시에 보유하는 유전적 배경을 가진다. 이 마우스는 인간 Ig 중쇄 유전자좌를 갖는 계통 A의 마우스와, 인간 Ig κ쇄 트랜스 유전자를 갖는 계통 B의 마우스의 교배에 의해 제조하였다. 계통 A의 마우스는, 내인성 Ig 중쇄 및 κ 경쇄 양자의 파괴에 대하여 동종접합체이며, 자손 전달 가능한 14번 염색체 단편(SC20)을 보유하고, 예를 들면 도미즈까 등의 보고(Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA ., 2000, Vol 97:722)에 기재되어 있다. 또한, 계통 B의 마우스는 내인성 Ig 중쇄 및 κ 경쇄 양자의 파괴에 대하여 동종접합체이며, 인간 Ig κ쇄 트랜스 유전자(KCo5)를 보유하는 트랜스제닉 마우스이고, 예를 들면 피쉬윌드(Fishwild) 등의 보고(Nat Biotechnol ., 1996, Vol 14:845)에 기재되어 있다.

계통 A의 수컷 마우스와 계통 B의 암컷 마우스, 또는 계통 A의 암컷 마우스와 계통 B의 수컷 마우스의 교배에 의해 얻어지는 자손 마우스를 도미즈까 등의 보고(Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA ., 2000, Vol 97:722)에 기재된 방법으로 분석하고, 혈청 중에 인간 Ig 중쇄 및 κ 경쇄가 동시에 검출되는 개체(인간 항체 생산 마우스)를 선발하여(Ishida & Lonberg, IBC's 11th Antibody Engineering, Abstract, 2000; Ishida, I. et al., Cloning & Stem Cells 4, 85-96(2002)), 이하의 면역화 실험에 사용하였다. 면역화 실험에는, 상기 마우스의 유전적 배경을 변경한 마우스 등(이시다 이사오(2002) 실험 의학 20, 6846851)도 사용하였다.

실시예 4: 인간 모노클로날 항체의 제조

모노클로날 항체는, 예를 들어, "단클론 항체 실험 조작 입문" (안도 다미에 등 저작, 고단샤 발행 1991)에 기재된 일반적인 방법에 따라 제조하였다.

면역원인 hCD98/hLAT1로서, 실시예 2에서 제조한 hCD98/hLAT1-E 발현 CT26 세포, 및 hCD98 발현이 확인된 인간 대장암 세포주 Colo205 세포를 사용하였다.

면역화를 위한 동물은, 실시예 3에서 제조한 인간 면역 글로불린을 생산하는 인간 항체 생산 마우스를 사용하였다.

hCD98/hLAT1-E 발현 CT26 세포를 사용하는 경우, 5×10⁶ 개의 세포를 RIBI 보조제(코릭사(Corixa)사 제조)와 혼합하여 복강 내에 초회 면역화하였다. 초회 면역화로부터 7일 및 24일째에 마우스 1 마리 당 5×10⁶ 개의 세포를 복강 내에 추가(booster) 면역화하였다. 또한, 이하에 설명하는 췌장 세포의 취득 3일 전에 세포를 동일한 방법으로 면역화하였다.

Colo205 세포를 사용한 경우, 5×10⁶ 개의 세포를 복강 내에 초회 면역화하였다. 초회 면역화로부터 14일째에 마우스 1 마리 당 5×10⁶ 개의 세포를 복강 내에 추가 면역화하고, 3일 후에 이하에 설명하는 췌장 세포를 얻었다.

면역화된 마우스로부터 췌장을 외과적으로 얻고, 회수한 췌장 세포를 마우스 미엘로마 SP2/0(ATCC No. CRL1581) 세포와 5:1의 비로 혼합하고, 융합제로서 폴리에틸렌글리콜 1500(로슈사 제조)을 사용하여 세포를 융합시켜, 다수의 하이브리도마를 제조하였다. 하이브리도마는, 10 ％의 소 태아 혈청(Fetal Calf Serum, FCS)과 히포크산틴(H), 아미노프테린(A) 및 티미딘(T)을 함유하는 HAT 함유 DMEM 배지(기브코(Gibco)사 제조) 중에서 배양하여 선택하였다. 또한, HT 함유 DMEM 배지를 사용하여 한계 희석법에 의해 단일 클론으로 하였다. 배양에, 96웰 마이크로타이터 플레이트(벡톤 디킨슨사 제조)를 사용하였다. 목적으로 하는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 클론의 선택(스크리닝) 및 각각의 하이브리도마가 생산되는 인간 모노클로날 항체의 특성화는, 후술하는 형광 활성화 셀 소터(FACS)를 이용해 측정함으로써 행하였다.

인간 모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 스크리닝은 이하와 같이 행하였다. 즉, 이하에 설명하는 FACS 분석에 의해, 인간 면역 글로불린 μ쇄(hIgμ), γ쇄(hIgγ) 및 인간 면역 글로불린 경쇄 κ(hIgκ)를 포함하고, hCD98/hLAT1-E 발현 CT26 세포에 대해 특이적인 반응성을 갖는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 200개 이상 얻었다.

본 명세서에서의 실시예에서는, 결과를 나타낸 표 또는 도면 중에 있어서, 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 기호를 사용하여 각각 명명하였다. 이하의 하이브리도마 클론은 단일 클론을 나타낸다. 4-35-14(C2), 4-32-9(K3), 7-95-8, 10-60-7, 3-69-6, 5-80-1(이상, hCD98/hLAT1-E 발현 CT26 세포가 면역원인 클론), 1-40-1(이상 Colo205 세포를 면역원으로 하는 클론).

실시예 5: 각 모노클로날 항체의 서브 클래스 동정

실시예 4에서 얻은 각 모노클로날 항체의 서브 클래스를 FACS 분석에 의해 동정하였다. 2×10⁶ 개/㎖의 Colo205 세포를 1 mM EDTA, 0.1 ％ NaN₃, 5 ％ FCS 함유 PBS의 SB(염색 완충액)에 현탁시켰다. 세포 현탁액을 96웰 환저 플레이트(벡톤 디킨슨사 제조)에 50 ㎕/웰로 분주(分注)하였다. 또한, 실시예 4에서 배양한 하이브리도마의 배양 상청(50 ㎕)을 거기에 첨가하여 교반하고, 빙온하에 30분간 반응시킨 후, 원심 분리(2000 rpm, 4 ℃, 2분)하여 상청을 제거하였다. 펠릿을 100 ㎕/웰의 SB로 1회 세정한 후, FITC 형광 표지된 토끼 항-인간 Igμ F(ab')₂ 항체(다코 사이토메이션사 제조)를 SB로 50배 희석하거나, 또는 RPE 형광-표지 염소 항-인간 Igγ F(ab')₂ 항체(서던 바이오테크사 제조)를 SB로 200배 희석하거나, 또는 RPE 형광-표지 토끼 항-인간 Igκ F(ab')₂ 항체(다코 사이토메이션사 제조)를 SB로 200배 희석하여 거기에 첨가하고, 빙온 하에 30분간 반응시켰다. SB로 1회 세정한 후, 세포를 300 ㎕의 SB에 현탁하여, FACS(FACSCan, 벡톤 디킨슨사 제조)로 항체의 결합을 나타내는 형광 강도를 측정하였다. 얻어진 항체의 일부 결과를 표 1에 나타낸다. C2는 중쇄가 μ쇄이고, 경쇄가 κ쇄이고, K3, 3-69-6, 7-95-8, 10-60-7, 1-40-1 및 5-80-1은 모두 중쇄가 γ쇄이고, 경쇄가 κ쇄였다.

실시예 6: 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자의 제조 및 재조합 항체 발현 벡터의 구축

C2, K3, 7-95-8, 10-60-7, 3-69-6 및 1-40-1의 각 항체 유전자의 클로닝과 발현 벡터의 구축을 이하에 기술하는 방법에 따라 실시하였다.

(1) 항체 유전자의 cDNA 클로닝과 발현 벡터의 제조

하이브리도마를 10 ％ FCS 함유 DMEM 배지(기브코사 제조)에서 배양하고, 원심 분리에 의해 세포를 모은 후, 이소젠(ISOGEN; 닛본 진사 제조)을 첨가하여 취급 설명서에 따라 전체 RNA를 추출하였다. 항체 cDNA의 가변 영역의 클로닝은, 스마트 레이스(SMART RACE) cDNA 증폭 키트(클론테크사 제조)를 사용하여, 첨부된 설명서에 따라 행하였다.

5 ㎍의 전체 RNA를 주형으로 사용하여, 제1 스트랜드 cDNA를 제조하였다.

(a) 제1 스트랜드 cDNA의 합성

전체 RNA 5 ㎍/3 ㎕, 5' CDS 1 ㎕ 및 SMART oligo 1 ㎕를 포함하는 조성을 가지는 반응액을 70 ℃에서 2분간 배양한 후, 5x 완충제 2 ㎕, DTT 1 ㎕, dNTP 믹스 1 ㎕, 슈퍼스크립트(Superscript) II 1 ㎕를 첨가하여 반응 혼합물을 42 ℃에서 15 시간 동안 배양하였다. 또한, 100 ㎕의 트리신 완충제를 첨가한 후, 생성된 혼합물을 72 ℃에서 7분간 배양하여, 제1 스트랜드 cDNA를 얻었다.

(b) PCR에 의한 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자의 증폭 및 재조합 항체 발현 벡터의 구축

cDNA의 증폭에는, 도요보사의 KOD-Plus cDNA를 사용하였다.

cDNA 15 ㎕, 10x KOD-Plus 완충제 5 ㎕, dNTP 믹스 5 ㎕, KOD-Plus 1 ㎕, 25 mM MgSO₄ 3 ㎕, 프라이머 1 및 프라이머 2의 조성을 가지는 반응액을 재증류수로 최종 용량 50 ㎕로 제조하여 PCR에 사용하였다.

K3, 1-40-1, 3-69-6 및 C2에 대하여 구체적으로 실험예를 나타내면, 이하와 같다.

K3

경쇄의 증폭을 위해, UMP와 hk-2(5'-GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA GC-3'(서열 번호 1)) 프라이머를 사용하여, 94 ℃ 5초, 72 ℃ 3분의 사이클을 5회 반복하고, 이어서 94 ℃ 5초, 70 ℃ 10초, 72 ℃ 3분간의 사이클을 5회 반복하고, 추가로 94 ℃ 5초, 68 ℃ 10초, 72 ℃ 3분의 사이클을 25회 반복하였다. 또한, 이 반응액의 5배 희석액 1 ㎕를 주형으로 사용하고, NUMP와 hk5(5'-AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CCA GAT TTC-3'(서열 번호 2)) 프라이머를 사용하여, 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 30회 반복하였다. 이 반응액을 2 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 증폭된 PCR 산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트(퀴아젠사 제조)에 의해 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 pCR4Blunt-TOPO 벡터(인비트로젠사 제조)에 결찰하여, 첨부 설명서에 따라 서브 클로닝하였다. 이어서, T3(5'-ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA-3'(서열 번호 3))과 hk5를 프라이머로 사용하여 염기 서열을 결정하였다. 서열 정보를 기초로 DNPL15Bglp(5'-AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAG CCC CAG CTC AGC TTC TCT-3'(서열 번호 4))를 합성하였다. pCR4Blunt-TOPO 벡터로 서브 클로닝된 경쇄 유전자를 주형으로 사용하고 DNPL15Bglp와 202LR(5'-AGA GAG AGA GCG TAC GTT TAA TCT CCA GTC GTG TCC CTT GGC-3'(서열 번호 5)) 프라이머를 사용하여, 94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 30회 반복하였다. 이 반응액을 2 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 약 400 bp의 단편을 QIA 퀵 겔 추출 키트(퀴아젠사 제조)에 의해 정제하였다. 증폭된 경쇄 cDNA 단편을 BglII 및 BsiWI로 소화하고, 소화된 산물을 동일한 효소로 개열된 N5KG1-Val Lark 벡터(IDEC Pharmaceuticals, N5KG1(미국 특허 제6001358호의 변형 벡터)에 도입하였다. 이렇게 얻은 벡터를 N5KG1-Val K3L로 명명하였다.

중쇄의 증폭을 위해, UMP와 IgG1p(5'-TCT TGT CCA CCT TGG TGT TGC TGG GCT TGT G-3'(서열 번호 6)) 프라이머를 사용하여, 94 ℃ 5초, 72 ℃ 3분의 사이클을 5회 반복하고, 이어서 94 ℃ 5초, 70 ℃ 10초, 72 ℃ 3분의 사이클을 5회 반복하고, 추가로 94 ℃ 5초, 68 ℃ 10초, 72 ℃ 3분의 사이클을 25회 반복하였다. 또한, 이 반응액의 5배 희석액 1 ㎕를 주형으로 사용하고, NUMP와 IgG2p(5'-TGC ACG CCG CTG GTC AGG GCG CCT GAG TTC C-3'(서열 번호 7))를 사용하여, 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 30회 반복하였다. 이 반응액을 2 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 증폭된 PCR 산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 pCR4Blunt-TOPO 벡터에 결찰하여 서브 클로닝하였다. 이어서, T3과 hh2(5'-GCT GGA GGG CAC GGT CAC CAC GCT G-3'(서열 번호 8))를 프라이머로 사용하여, 염기 서열을 결정하였다. 서열 정보를 기초로 K3HcSalI(5'-AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGG GGT CAA CCG CCA TCC TCG CCC TCC TC-3'(서열 번호 9))를 합성하였다. pCR4Blunt-TOPO 벡터로 서브 클로닝된 중쇄 유전자를 주형으로 사용하고 K3HcSalI와 F24HNhe(5'-AGA GAG AGA GGC TAG CTG AGG AGA CGG TGA CCA GGG TTC-3'(서열 번호 10))를 사용하여, 94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 2 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 약 450 bp의 단편을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 증폭된 중쇄 cDNA 단편을 SalI 및 NheI로 소화하고, 소화된 산물을 동일한 효소로 개열된 N5KG1-Val K3L에 도입하였다. 삽입 부분의 DNA 염기 서열을 결정하여, PCR에 의해 증폭하여 삽입한 서열이 주형으로 사용한 유전자 서열과 동일하다는 것을 확인하였다. 얻어진 벡터를 N5KG1-Val K3IgG1로 명명하였다. N5KG1-Val K3IgG1을 후술하는 자유형 293 세포에 도입시켜 얻은 재조합체 K3 항체가 K3 하이브리도마에서 유래하는 항체와 동일한지 여부는, hCD98/hLAT1 발현 세포주에 대한 결합 활성을 조사하여 확인하였다.

1-40-1

중쇄의 증폭을 위해, UMP와 IgG1p 프라이머를 사용하여 94 ℃ 5초, 72 ℃ 3분의 사이클을 5회 반복하고, 이어서 94 ℃ 5초, 70 ℃ 10초, 72 ℃ 3분의 사이클을 5회 반복하고, 추가로 94 ℃ 5초, 68 ℃ 10초, 72 ℃ 3분의 사이클을 25회 반복하였다. 또한, 이 반응액의 5배 희석액 1 ㎕를 주형으로 사용하고, NUMP와 IgG2p 프라이머를 사용하여 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 30회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 증폭된 PCR 산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 pCR4Blunt-TOPO 벡터에 결찰하여 서브 클로닝하였다. 이어서, T3과 hh2를 프라이머로 사용하여 염기 서열을 결정하였다. 서열 정보를 기초로 205HP5SalI(5'-AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGG AGT TTG GGC TGA GCT GGG TTT-3'(서열 번호 11))를 합성하였다. pCR4Blunt-TOPO 벡터로 서브 클로닝된 중쇄 유전자를 주형으로 사용하고 205HP5SalI와 F24Hnhe 프라이머를 사용하여 94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 2 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 약 450 bp의 단편을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 증폭된 중쇄 cDNA 단편을 SalI 및 NheI로 소화하고, 소화된 산물을 동일한 효소로 개열된 N5KG1-Val Lark 벡터에 도입하였다. 얻어진 벡터를 N5KG1-Val 1-40-1H로 명명하였다.

경쇄의 증폭을 위해, UMP와 hk-2 프라이머를 사용하여 94 ℃ 5초, 72 ℃ 3분의 사이클을 5회 반복하고, 이어서 94 ℃ 5초, 70 ℃ 10초, 72 ℃ 3분의 사이클을 5회 반복하고, 추가로 94 ℃ 5초, 68 ℃ 10초, 72 ℃ 3분의 사이클을 25회 반복하였다. 또한, 이 반응액의 5배 희석액 1 ㎕를 주형으로 사용하고, NUMP와 hk5를 사용하여 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 30회 반복하였다. 이 반응액을 2 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 증폭된 PCR 산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 pCR4Blunt-TOPO 벡터에 결찰하여 서브 클로닝하였다. 이어서, T3과 hk5를 프라이머로 사용하여 염기 서열을 결정하였다. 서열 정보를 기초로 A27RN202(5'-AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA TTT CCA CCT TGG TCC CTT GGC-3'(서열 번호 12))를 합성하였다. pCR4Blunt-TOPO 벡터로 서브 클로닝된 경쇄 유전자를 주형으로 사용하고 DNPL15Bglp와 A27RN202를 사용하여, 94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 2 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 약 400 bp의 단편을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 증폭된 경쇄 cDNA 단편을 BglII 및 BsiWI로 소화하고, 소화된 산물을 동일한 효소로 개열된 N5KG1-Val 1-40-1H 벡터에 도입하였다. 삽입 부분의 DNA 염기 서열을 결정하여, PCR에 의해 증폭하여 삽입한 서열이 주형으로 사용한 유전자 서열과 동일하다는 것을 확인하였다. 얻어진 벡터를 N5KG1-Val 1-40-1IgG1로 명명하였다. N5KG1-Val 1-40-1IgG1을 후술하는 자유형 293 세포에 도입시켜 얻은 재조합체 1-40-1 항체가 1-40-1 하이브리도마에서 유래하는 항체와 동일한지 여부는, hCD98/hLAT1 발현 세포주에 대한 결합 활성을 조사하여 확인하였다.

3-69-6

경쇄의 증폭을 위해, UMP와 hk-2 프라이머를 사용하여 94 ℃ 15초, 72 ℃ 3분의 사이클을 5회 반복하고, 이어서 94 ℃ 15초, 70 ℃ 10초, 72 ℃ 3분의 사이클을 5회 반복하고, 추가로 94 ℃ 15초, 68 ℃ 15초, 72 ℃ 3분의 사이클을 25회 반복하였다. 또한, 이 반응액의 5배 희석액 2 ㎕를 주형으로 사용하고, NUMP와 hk5를 사용하여 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 30회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 증폭된 PCR 산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 pCR4Blunt-TOPO 벡터에 결찰하여 서브 클로닝하였다. 이어서, M13 정방향(-20) 프라이머(5'-GTA AAA CGA CGG CCA G-3'(서열 번호 13)), M13 역방향 프라이머(5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3'(서열 번호 14))와 hk5(5'-AGG CACACA ACA GAG GCAG TTCCAGA TTT C-3'(서열 번호 2))를 프라이머로 사용하여 염기 서열을 결정하였다. 서열 정보를 기초로 A27_F(5'-AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TTC TCT TC-3'(서열 번호 15))와 39_20_L3Bsi(5'-AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA TCT CCA GCT TGG TCC CCT G-3'(서열 번호 16))를 합성하였다. pCR4Blunt-TOPO 벡터로 서브 클로닝된 경쇄 유전자를 주형으로 사용하고 A27_F와 39_20_L3Bsi를 사용하여, 94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 약 400 bp의 단편을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 증폭된 경쇄 cDNA 단편을 BglII 및 BsiWI로 소화하고, 소화된 산물을 동일한 효소로 개열된 N5KG1-Val Lark 벡터에 도입하였다. 얻어진 벡터를 N5KG1-Val 3-69-6L로 명명하였다.

중쇄의 증폭을 위해, UMP와 IgG1p(5'-TCT TGT CCA CCT TGG TGT TGC TGG GCT TGT G-3'(서열 번호 6)) 프라이머를 사용하여 94 ℃ 15초, 72 ℃ 3분의 사이클을 5회 반복하고, 이어서 94 ℃ 15초, 70 ℃ 10초, 72 ℃ 3분의 사이클을 5회 반복하고, 추가로 94 ℃ 15초, 68 ℃ 15초, 72 ℃ 3분의 사이클을 30회 반복하였다. 또한, 이 반응액의 5배 희석액 2 ㎕를 주형으로 사용하고, NUMP와 IgG2p(IgG1.3.4)(5'-TGC ACG CCG CTG GTCAGG GCG CCT GAG TTC C-3'(서열 번호 7))를 사용하여 94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 증폭된 PCR 산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 pCR4 Blunt-TOPO 벡터에 결찰하여 서브 클로닝하였다. 이어서, M13F, M13R과 IgG2p를 프라이머로 사용하여 염기 서열을 결정하였다. 서열 정보를 기초로 Z3HP5Sal(5'-AGA GAG AGA GGT CGA CCCACCATG GAC TGG AGCATC CTT TT-3'(서열 번호 17))와 F24HNhe(5'-AGA GAG AGA GGC TAG CTG AGG AGA CGG TGA CCA GGG TTC-3'(서열 번호 10))를 합성하였다. pCR4Blunt-TOPO 벡터로 서브 클로닝된 중쇄 유전자를 주형으로 사용하고 Z3HP5SalF와 F24HNhe를 사용하여, 94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 약 450 bp의 단편을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 증폭된 중쇄 cDNA 단편을 SalI 및 NheI로 소화하고, 소화된 산물을 동일한 효소로 개열된 N5KG1-Val 3-69-6L 벡터에 도입하였다. 삽입 부분의 DNA 염기 서열을 결정하여, PCR에 의해 증폭하여 삽입한 서열이 주형으로 사용한 유전자 서열과 동일하다는 것을 확인하였다. 얻어진 벡터를 N5KG1-Val 3-69-6IgG1로 명명하였다. N5KG1-Val 3-69-6IgG1을 후술하는 자유형 293 세포에 형질감염시켜 얻은 재조합체 3-69-6 항체가 3-69-6 하이브리도마에서 유래하는 항체와 동일한지 여부는, hCD98/hLAT1 발현 세포주에 대한 결합 활성을 조사하여 확인하였다.

C2IgG1

하이브리도마 생산 C2의 서브 클래스는 IgM이기 때문에, 동일한 생식 계열에서 유래하는 IgG로부터 상정되는 가변 영역을 포함하도록 설계한 프라이머를 사용한 PCR에 의해 C2 항체 가변 영역을 단리하였다(C2 IgG1).

경쇄의 증폭을 위해, UMP와 hk-2 프라이머를 사용하여 94 ℃ 5초, 72 ℃ 3분의 사이클을 5회 반복하고, 이어서 94 ℃ 5초, 70 ℃ 10초, 72 ℃ 3분의 사이클을 5회 반복하고, 추가로 94 ℃ 5초, 68 ℃ 10초, 72 ℃ 3분의 사이클을 25회 반복하였다. 또한, 이 반응액의 5배 희석액 1 ㎕를 주형으로 사용하고, NUMP와 hk5를 사용하여 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 30회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 증폭된 PCR 산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 pCR4Blunt-TOPO 벡터에 결찰하여 서브 클로닝하였다. 이어서, M13F, M13R과 hk5를 프라이머로 사용하여 염기 서열을 결정하였다. 서열 정보를 기초로 C2-1 Lc Bgl IIF(5'-AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TTC TCT TC-3'(서열 번호 18))와 C2-1 Lc BsiWI R(5'-AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA TAT CCA CTT TGG TCC CAG GG-3'(서열 번호 19))을 합성하고, pCR4Blunt-TOPO 벡터로 서브 클로닝된 경쇄 유전자를 주형으로 사용하고 C2-1 Lc Bgl II F와 C2-1 Lc BsiWI R을 사용하여, 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 약 400 bp의 단편을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 증폭된 경쇄 cDNA 단편을 BglII 및 BsiWI로 소화하고, 소화된 산물을 동일한 효소로 개열된 N5KG1-Val Lark 벡터에 도입하였다. 얻어진 벡터를 N5KG1-Val C2L로 명명하였다.

중쇄의 증폭을 위해, UMP와 M655R(5'-GGC GAA GAC CCG GAT GGC TAT GTC-3'(서열 번호 20)) 프라이머를 사용하여 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 30회 반복하였다. 또한, 이 반응액의 5배 희석액 1 ㎕를 주형으로 사용하고, NUMP와 M393R(5'-AAA CCC GTG GCC TGG CAG ATG AGC-3'(서열 번호 21))를 사용하여, 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 30회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 증폭된 PCR 산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 pCR4Blunt-TOPO 벡터에 결찰하여 서브 클로닝하였다. 이어서, M13 정방향(-20) 프라이머(5'-GTA AAA CGA CGG CCA G-3'(서열 번호 13)), M13 역방향 프라이머(5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3'(서열 번호 14))와 M393R을 프라이머로 사용하여 염기 서열을 결정하였다. 서열 정보를 기초로 C2hcSalIF(5'-AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGA AGCACC TGT GGT TCT TCC TCC TGC T-3'(서열 번호 22))와 C2hcNheI(5'-AGA GAG AGA GGC TAG CTG AGG AGA CGG TGA CCA GGG TTC CCT GG-3'(서열 번호 58))를 합성하였다. pCR4Blunt-TOPO 벡터로 서브 클로닝된 중쇄 유전자를 주형으로 사용하고 C2hcSalIF와 C2hcNheI를 사용하여, 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 30초의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 약 450 bp의 단편을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 증폭된 중쇄 cDNA 단편을 SalI 및 NheI로 소화하고, 소화된 산물을 동일한 효소로 개열된 N5KG1-Val C2L 벡터에 도입하였다. 삽입 부분의 DNA 염기 서열을 결정하여, PCR에 의해 증폭하여 삽입한 서열이 주형으로 사용한 유전자 서열과 동일하다는 것을 확인하였다. 얻어진 벡터를 N5KG1-Val C2IgG1로 명명하였다.

C2IgG1NS

상술한 바와 같이 클로닝한 C2IgG1 유전자에 있어서 중쇄의 프레임 영역에 본래의 생식 계열에서는 관찰되지 않는 돌연변이가 발생하였다. 따라서, 본래의 생식 계열의 서열을 갖는 C2의 가변 영역 서열을 이하의 방법에 의해 단리하였다.

상기에서 얻어진 벡터 N5KG1-Val C2IgG1을 주형으로서 사용하고, C2hc NS F(5'-CGT CCA AGA ACC AGT TCT CCC TGA AGC TGA-3'(서열 번호 23)) 프라이머와 C2hc NS R(5'-TCA GCT TCA GGG AGA ACT GGT TCT TGG ACG-3'(서열 번호 24)) 프라이머를 사용하여, C2 항체 중쇄의 290과 299번째의 G와 T를 각각 A와 C로 변경하고, N5KG1-Val C2IgG1NS를 제조하였다. N5KG1-Val C2IgG1과 N5KG1-Val C2IgG1NS를 후술하는 자유형 293 세포에 각각 도입시켜 얻은 재조합체 C2IgG1과 C2IgG1NS 항체가 C2 하이브리도마에서 유래하는 IgM 항체와 특이성이 동일한지 여부는, hCD98/hLAT1 발현 세포주에 대한 결합 활성을 조사하여 확인하였다. C2IgG1과 C2IgG1NS의 결합 활성은 거의 동일하였다.

C2Ig μ G1

상술한 C2IgG1에 사용한 방법을 사용하는 경우 중쇄와 경쇄의 결합 부위의 형태가 본래의 IgM과 상이해질 가능성이 있기 때문에, 이하의 서열 전환을 행하였다. 즉, IgG의 γ쇄와 IgM의 μ쇄의 CH1 불변 영역에 있는 공통 서열(GCL 서열)로부터 가변 영역측에 인접하는 26개의 아미노산을 μ쇄 서열로 사용하고, GCL 서열로부터 불변 영역측 모든 아미노산을 γ쇄로 변환하였다(C2 IgμG1). 이상의 서열 전환을 이하의 방법에 의해 행하였다.

C2 cDNA의 중쇄의 증폭을 위해, UMP와 M655R 프라이머를 사용하여, 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 30회 반복하였다. 또한, 이 반응액의 5배 희석액 1 ㎕를 주형으로 사용하고, NUMP와 M393R을 사용하여 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 30회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, 증폭된 PCR 산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 pCR4 Blunt-TOPO 벡터에 결찰하여 서브 클로닝하였다. 이어서, M13 정방향(-20) 프라이머(5'-GTA AAA CGA CGG CCA G-3'(서열 번호 13)), M13 역방향 프라이머(5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3'(서열 번호 14))와 M393R을 프라이머로 사용하여 염기 서열을 결정하였다. 서열 정보를 기초로 C2hcSalIF(5'-AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGA AGCACC TGT GGT TCT TCC TCC TGC T-3'(서열 번호 22))와 Mu-GCL-감마 L(5'-CAC CGG TTC GGG GAA GTA GTC CTT GAC GAG GCA GCA AAC GGC CAC GCT GCT CGT-3'(서열 번호 25))을 합성하였다. pCR4Blunt-TOPO 벡터로 서브 클로닝된 중쇄 유전자를 주형으로 사용하고 C2hcSalIF와 Mu-GCL-감마 L을 사용하여, 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, PCR 증폭 산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 이 PCR 증폭 산물을 C2Vμ로 명명하였다. 이어서, N5KG1-Val Lark 벡터를 주형으로 사용하고 Mu-GCL-감마 U(5'-ACG AGCAGC GTG GCC GTT GGC TGC CTC GTCAAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG-3'(서열 번호 26))와 hIgG1 BamHI L(5'-CGC GGA TCC TCA TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG GCT-3'(서열 번호 27))를 사용하여 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 90초의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, PCR 증폭 산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 이 PCR 증폭 산물을 Cγ1로 명명하였다. C2Vμ과 Cγ1의 3배 희석액을 각 5 ㎕ 넣고, 프라이머 없이 94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초, 68 ℃ 2분의 사이클을 3회 반복하였다. 이 반응액을 99 ℃에서 5분간 가열한 후 10배 희석하였다. 5 ㎕를 주형으로 사용하고 C2hcSalIF와 hIgG1 BamHI L을 사용하여 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 2분의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, PCR 증폭 산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 이 PCR 증폭 cDNA 단편을 SalI 및 SmaI로 소화하고, 소화된 산물을 동일한 효소로 개열된 상기 C2 경쇄 유전자를 포함하는 N5KG1-Val Lark 벡터에 도입하였다. 삽입 부분의 DNA 염기 서열을 결정하여, PCR에 의해 증폭하여 삽입한 서열이 주형으로 사용한 유전자 서열과 동일하다는 것을 확인하였다. 얻어진 벡터를 N5KG1-Val C2IgμG1로 명명하였다. C2IgμG1 항체의 결합 활성은, N5KG1-Val C2IgμG1을 후술하는 자유형 293 세포에 유전자 도입시켜 얻은 재조합체의 hCD98/hLAT1 발현 세포주에 대한 결합 활성을 조사하여 확인하였다.

K3, 1-40-1 및 3-69-6의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 DNA 서열, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 아미노산 서열은, 각각 이하의 서열 번호의 서열이었다.

<K3 중쇄 가변 영역 핵산 서열>(서열 번호 28)

<K3 중쇄 가변 영역 아미노산 서열>(서열 번호 29)

<K3 경쇄 가변 영역 핵산 서열>(서열 번호 30)

<K3 경쇄 가변 영역 아미노산 서열>(서열 번호 31)

<1-40-1 중쇄 가변 영역 핵산 서열>(서열 번호 32)

<1-40-1 중쇄 가변 영역 아미노산 서열>(서열 번호 33)

<1-40-1 경쇄 가변 영역 핵산 서열>(서열 번호 34)

<1-40-1 경쇄 가변 영역 아미노산 서열>(서열 번호 35)

<3-69-6 중쇄 가변 영역 핵산 서열>(서열 번호 36)

<3-69-6 중쇄 가변 영역 아미노산 서열>(서열 번호 37)

<3-69-6 경쇄 가변 영역 핵산 서열>(서열 번호 38)

<3-69-6 경쇄 가변 영역 아미노산 서열>(서열 번호 39)

C2 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 DNA 서열, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 아미노산 서열을 각각 이하에 나타낸다.

<C2IgG1 중쇄 가변 영역 핵산 서열>(서열 번호 40)

<C2IgG1 중쇄 가변 영역 아미노산 서열>(서열 번호 41)

<C2IgG1NS 중쇄 가변 영역 핵산 서열>(서열 번호 42)

<C2IgG1NS 중쇄 가변 영역 아미노산 서열>(서열 번호 43)

<C2IgμG1 중쇄 가변 영역으로부터 인간 IgG1과의 결합 부위 핵산 서열>(서열 번호 44)

<C2IgμG1 중쇄 가변 영역으로부터 인간 IgG1과의 결합 부위 아미노산 서열>(서열 번호 45)

<C2IgG1과 C2IgμG1의 경쇄 가변 영역 핵산 서열>(서열 번호 46)

<C2IgG1과 C2IgμG1의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열>(서열 번호 47)

상기 각 항체 서열 중, K3 및 C2IgG1의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역(즉, 서열 번호 28 및 30 및 서열 번호 40 및 46의 서열의 핵산)을 pCR4Blunt-TOPO 벡터에 도입하고, 생성물을 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁하여, 각각 FERM BP-10552(식별을 위한 표시: K3/pCR4) 및 FERM BP-10551(식별을 위한 표시: C2IgG1/pCR4)의 기탁 번호가 부여되었다.

상기 각 항체 가변 영역은 중쇄 및 경쇄 뿐만 아니라 결합 및 단리에 사용하는 제한 효소 인식 서열을 포함하고 있다. 각 항체의 경쇄 가변 영역은 BglII 및 BsiWI 제한 효소를 사용하여 단리할 수 있고, 중쇄 가변 영역은 SalI 및 NheI 제한 효소를 사용하여 단리할 수 있다. 이하에 pCR4Blunt-TOPO 벡터에 삽입한 각 항체 가변 영역과 제한 효소 인식 부위 등을 포함한 유전자 서열을 나타낸다.

<K3/pCR4>(서열 번호 48)

<C2IgG1/pCR4>(서열 번호 49)

실시예 7: 재조합형 항체의 제조

실시예 6에서 구축한 재조합형 항체 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여, 재조합형 항체 발현 세포를 제조하였다. 발현을 위한 숙주 세포로서 CHO 세포의 dhfr 결손주(ATCC CRL-9096)를 사용하였다. 숙주 세포로의 벡터의 도입은 전기 천공에 의해 실시하였다. 항체 발현 벡터 약 2 ㎍을 제한 효소로 선상화하고, Bio-Rad electrophoreter를 사용하여 350 V, 500 μF의 조건으로 4×10⁶개의 CHO 세포에 유전자를 도입하고, 세포를 96 웰 컬쳐 플레이트에 파종하였다. 발현 벡터의 선택 마커에 대응하는 약제를 첨가하여 세포의 배양을 계속하였다. 콜로니의 출현을 확인한 후, 실시예 4에 나타낸 방법에 의해 항체 발현주를 선별하였다. 선별한 세포로부터의 항체 정제는, 실시예 8에 따라 행하였다. 또한, 재조합형 항체 발현 벡터를 첨부 설명서에 따라 자유형 293 세포(인비트로젠사 제조)에 도입하여, 재조합형 항체를 발현시켰다.

실시예 8: 항체의 정제

인간 IgG 항체를 포함하는 하이브리도마 배양 상청의 제조는, 이하의 방법으로 행하였다. 항체 생산 하이브리도마를 소 인슐린(5 ㎍/㎖, 기브코사 제조), 인간 트랜스페린(5 ㎍/㎖, 기브코사 제조), 에탄올아민(0.01 mM, 시그마사 제조) 및 아셀레늄산나트륨(2.5×10^-5 mM, 시그마사 제조) 함유 eRDF 배지(교꾸또 세이야꾸사 제조)에 순화하였다. 하이브리도마를 조직 배양 플라스크에서 배양하고, 하이브리도마의 생존율이 90 ％가 된 시점에 배양 상청을 회수하였다. 회수한 상청을 10 ㎛와 0.2 ㎛의 필터(겔만 사이언스사 제조)로 여과하여, 하이브리도마 등의 잡배물을 제거하였다. 항체를 포함하는 배양 상청을, 단백질 A(아머샴)를 사용하고 흡착 완충액으로서 PBS, 용출 완충액으로서 20 mM 시트르산나트륨 완충액(pH 3.0)을 사용하여 친화성 정제하였다. 용출 분획은 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)을 첨가하여 pH 6.0 부근으로 조정하였다. 제조된 항체 용액은, 투석막(10,000 커트, 스펙트럼 래보러토리즈사 제조)을 사용하여 PBS로 치환하고, 공경 0.22 ㎛의 막필터 MILLEX-GV(밀리포어사 제조)로 여과 멸균하여, 정제 항체를 얻었다. 정제 항체의 농도는 280 ㎚의 흡광도를 측정하여, 측정된 값을 1.45 최적 밀도에서 1 ㎎/㎖로 전환하였다.

실시예 9: 각 모노클로날 항체의 특이성

실시예 4에서 얻은 각 모노클로날 항체의 반응성의 검토를 실시예 5에 명기한 FACS 분석과 동일한 방법으로 행하였다. 실시예 2에서 제조한 세포주를 염색 완충액(SB)을 사용하여 2×10⁶/㎖로 제조하고, 그 세포 현탁액을 96웰 환저 플레이트(벡톤 디킨슨사 제조)에 50 ㎕/웰로 분주하였다. 실시예 4 내지 실시예 8에서 제조한 각 재조합체 항체를 SB로 5 ㎍/㎖로 제조하고, 50 ㎕를 각 웰에 첨가하여 교반하였다. 음성 대조군은, KM 마우스로 제조한 항디니트로페닐(DNP) 인간 IgG1 항체를 사용하였다. 빙온하에 30분간 반응시킨 후, 혼합물을 원심 분리(2000 rpm, 4 ℃, 2분)하여 상청을 제거하였다. 펠릿을 100 ㎕/웰의 SB로 1회 세정한 후, 200배 희석한 RPE 형광-표지 토끼 항-인간 Igκ F(ab')₂ 항체(다코 사이토메이션사 제조)를 50 ㎕/웰로 첨가하고, 생성된 용액을 빙온하에 30분간 반응시켰다. SB로 1회 세정한 후, 생성된 펠렛을 300 ㎕의 SB에 현탁하고, FACS로 항체의 결합을 나타내는 형광 강도를 측정하였다.

그 결과, 모든 항체가 hCD98/hLAT1-E 발현 CT26 세포(도 1) 또는 hCD98/hLAT1-E 발현 L929 세포(도 2)에 대하여 강한 결합 활성을 가졌으며, 한편 CT26 세포 및 L929 세포에 대한 결합 활성은 관찰되지 않았다. 또한, 어떠한 항체도 hLAT1-E 발현 L929 세포에는 결합하지 않았으나, hCD98 발현 L929 세포에는 결합하였다. 따라서, C2, K3, 7-95-8, 10-60-7, 3-69-6 및 1-40-1 항체의 결합 부위는 hCD98에 위치한다는 것을 알 수 있었다(도 2).

실시예 10: 각 모노클로날 항체의 항원 결합에 관계된 hCD98 단백질의 영역

각 모노클로날 항체의 결합에 중요한 hCD98 분자의 영역을 검토하였다.

우선, 튜니카마이신 처리된 K562 세포주에 대한 반응성을 조사하였다. 2×10⁵ 개의 K562 세포를 6웰 플레이트에 파종하고(4 ㎖/웰), 5 ㎍/㎖의 튜니카마이신(시그마사 제조) 존재/비존재 하에 72 시간 동안 37 ℃에서 5 ％ CO₂하에 배양하였다. 이 조건 하에서, 본래 분자량이 약 80 KDa인 hCD98가, N-결합 탄화수소 쇄가 제거된 후의 이론값인 약 60 kDa가 된다는 것을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 배양 후, 세포를 회수하여 2×10⁶/㎖의 세포주를 염색 완충액(SB)에 현탁시켰다. 세포 현탁액을 96-웰 환저 플레이트(벡톤 디킨슨사 제조)에 50 ㎕/웰로 분주하였다. SB로 5 ㎍/mL로 제조된 각 재조합체 항체를 50 ㎕/웰 첨가하고, 빙온하에 30분간 반응시켰다. 음성 대조군은 항-DNP 인간 IgG1 항체를 사용하였다. SB로 1회 세정한 후, RPE 형광-표지 염소 항-인간 Igγ F(ab')₂ 항체(서던 바이오테크사 제조)를 SB로 200배 희석하여 첨가하고, 혼합물을 빙온하에 30분간 배양하였다. SB로 1회 세정한 후, 세포를 300 ㎕의 FACS 완충액에 현탁하고, FACS로 항체의 결합을 나타내는 형광 강도를 측정하였다.

그 결과, 어떠한 항체에 대해서도 튜니카마이신 비처리 K562 세포보다 처리 세포에 대한 결합 활성이 저하되지 않았다(도 3). 이상의 결과로부터, 각 항체의 결합 부위는 N-결합 탄화수소 쇄가 아니라는 것을 알 수 있었으며, 이들 모노클로날 항체는 hCD98의 항체라는 것이 강하게 시사되었다. 또한, 각 모노클로날 항체의 결합에 중요한 hCD98의 영역을 실시예 11에서 검토하였다.

실시예 11: 각 항체의 결합 반응에 중요한 인간 CD98 단백질의 영역

각 항체는 마우스 CD98(mCD98)에 교차 반응성을 나타내지 않기 때문에, mCD98과 hCD98을 인공적으로 결합한 키메라 CD98을 이용하여, 각 항체의 결합 반응에 중요한 인간 CD98 단백질의 영역을 검토하였다.

키메라 CD98은 이하와 같이 제조하였다. mCD98과 hCD98의 서열 정보로부터, EcoRI hCD98U(5'-CCG GAA TTC cCa cCa TGA GCC AGG ACA CCG AGG TGG ATA TGA-3'(서열 번호 50)), NotI hCD98(5'-AAG GAA AAA AGC GGC CGC TCA TCA GGC CGC GTA GGG GAA GCG GAG CAG CAG-3'(서열 번호 51)), EcoRI mCD98(5'-CCG GAA TTC CCA CCA TGA GCC AGG ACA CCG AAG TGG ACA TGA AA-3'(서열 번호 52)), NotI mCD98L(5'-AAG GAA AAA AGC GGC CGC TCA TCA GGC CAC AAA GGG GAA CTG TAA CAG CA-3'(서열 번호 53)), cCD98 D2-F(5'-TCA TTC TGG ACC TTA CTC CCA ACT ACC-3'(서열 번호 54)), cCD98 D2-R(5'-GGT AGT TGG GAG TAA GGT CCA GAA TGA-3'(서열 번호 55)), cCD98 D3-F(5'-TGC TCT TCA CCC TGC CAG GGA CCC CTG TTT T-3'(서열 번호 56)), cCD98 D3-R(5'-AAA ACA GGG GTC CCT GGC AGG GTG AAG AGC A-3'(서열 번호 57))을 합성하였다. PCR을 행할 때 주형으로서 사용한 것은, mCD98(GenBank/EMBL/DDBJ accession no. U25708) 및 인간 CD98을 코딩하는 cDNA를 보유하는 플라스미드 벡터 pcDNA3.1-mCD98 및 실시예 1에서 제조한 pEF6/hCD98이다.

cDNA의 증폭에는, 도요보사의 KOD-Plus를 사용하였다. cDNA 15 ㎕, 10x KOD-Plus 완충액 5 ㎕, dNTP 믹스 5 ㎕, KOD-Plus 1 ㎕, 25 mM MgSO₄ 3 ㎕, F 프라이머 및 R 프라이머의 조성을 가지는 반응액을 재증류수로 최종 용량 50 ㎕로 제조하여, PCR에 사용하였다.

cDNA1과 F 프라이머 1과 R 프라이머 1, 또는 cDNA2와 F 프라이머 2와 R 프라이머 2를 사용하여, 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 90초(94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초, 68 ℃ 50초)의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, PCR 증폭산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 이 PCR 증폭산물을 각각 P1, P2로 명명하였다. 이어서, P1과 P2의 2 내지 3배 희석액을 각 5 ㎕ 넣고, 프라이머 없이 94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초, 68 ℃ 2분의 사이클을 3회 반복하였다. 이 반응액을 99 ℃에서 5분간 가열한 후 5 내지 10배 희석하였다. 이 용액의 5 ㎕를 주형으로 사용하고 F 프라이머 1과 R 프라이머 2를 사용하여, 94 ℃ 15초, 60(55 ℃) ℃ 30초, 68 ℃ 2분의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, PCR 증폭산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다.

키메라 CD98-1, 키메라 CD98-2 및 키메라 CD98-3은, 각각 이하의 (cDNA1:F 프라이머 1:R 프라이머 1; 및 cDNA2:F 프라이머 2:R 프라이머 2)의 조합 (pEF6/hCD98:EcoRIhCD98U:cCD98D2-R; 및 pcDNA3.1-mCD98:cCD98D2-F:NotImCD98L), (pEF6/hCD98:EcoRIhCD98U:cCD98D3-R; 및 pcDNA3.1-mCD98:cCD98D3-F:NotImCD98L), (pcDNA3.1-mCD98:EcoRImCD98U:cCD98D2-R; 및 pEF6/hCD98:cCD98D2-F:NotIhCD98L)를 이용하여 제조하였다. 각 PCR 증폭 cDNA 단편을 EcoRI 및 NotI로 소화하고, 동일한 효소로 개열된 pEF6myc-His/Bsd 벡터(인비트로젠사 제조)에 결찰하였다. 삽입 부분의 DNA 염기 서열을 결정하여, PCR에 의해 증폭하여 삽입한 서열이 주형으로 사용한 유전자 서열과 동일하다는 것을 확인하였다. 실시예 2와 동일한 방법으로 각 벡터를 실시예 1에서 제조한 pEF1/hLAT1-EGFP 벡터와 함께 L929 세포에서 발현시키고, 실시예 10과 동일한 방법의 FACS 분석으로 각 FITC-표지 항체의 결합을 조사하였다. 그 결과(도 4), K3, 7-95-8, 10-60-7 및 3-69-6 항체는, 시판된 FITC-표지 항-인간 CD98 항체(클론 UM7F8, 벡톤 디킨슨사 제조 Ca. No. 556076)와 마찬가지로, 키메라 CD98-3을 발현하는 L929 세포에만 결합하기 때문에, hCD98의 372번 아미노산 잔기로부터 530번 아미노산 잔기의 영역이 이들 항체의 결합에 중요하다는 것이 시사되었다. 한편, C2 항체와 1-40-1 중화 항체는 키메라 CD98-2에만 강하게 결합하기 때문에, hCD98의 104번 아미노산 잔기 내지 371번 아미노산 잔기가 이들 항체의 결합에 중요하다는 것을 알 수 있었다.

실시예 12: 각 모노클로날 항체의 아미노산 흡수 억제 활성

모노클로날 항체가 인간 방광암 세포주 T24 세포의 아미노산의 흡수에 영향을 주는지를, 기질로서 류신을 사용하여, 기질의 흡수 실험을 가나이 등(Kanail et al.)의 방법(Kim et al., Biochim . Biophys . Acta 1565: 112-122, 2002)에 준하여 이하와 같이 행하였다. 1×10⁵ 개의 T24 세포주를 24-구멍 배양 플레이트에 파종하고, 10 ％ FCS를 함유하는 MEM 배지(시그마 알드리치사 제조)에서 37 ℃, 5 ％ CO₂하에 2일간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 200 ㎍/mL의 항체를 포함하는 HBSS(-(Na+-결여)를 0.25 mL/웰 첨가하고, 세포를 37 ℃에서 5 ％ CO₂하에 추가로 10분간 배양하였다. C2, K3, 7-95-8, 10-60-7, 3-69-6, 1-40-1 및 항-DNP 인간 항체는 재조합체 항체를 사용하고, 5-80-1은 하이브리도마에서 유래하는 항체를 사용하였다. 그 후, 상청을 제거하고, 1 μM의 ¹⁴C-Leu(모라베크 바이오케미컬즈사 제조)를 포함하는 HBSS(-)(Na+-결여)를 0.5 mL/웰 첨가하여 세포를 1분간 배양하였다. 빙냉 HBSS(-)(Na+-결여) 용액으로 3회 세정한 후, 0.1 N 수산화나트륨을 0.5 mL/웰 첨가하고 세포를 회수하였다. 회수된 용액 중의 ¹⁴C-Leu량은, 액체 섬광 계수기 모델 LSC-5100(ALOKA사 제조)으로 측정하였다. 각 세포의 ¹⁴C-Leu 흡수량은, 회수한 용액 중의 단백질 농도를 BCA법으로 측정하고, 단백질량으로 표준화하였다. 그 결과(도 5), 1-40-1, K3, C2IgG1, 10-60-7 및 3-69-6은, 대조군 항체(DNP 인간 항체)에 비해 유의하게 류신의 흡수를 억제하였다. 이하의 실험은, 유의하게 류신의 흡수를 억제한 1-40-1, K3, C2IgG1, 10-60-7 및 3-69-6을 사용하여 실시하였다.

실시예 13: 각 모노클로날 항체의 항- hCD98 / hLAT1 항체의 형광 표지

각 항체의 형광 표지화는 이하의 방법으로 행하였다. 형광 물질인 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC, 시그마사 제조)를 부속 설명서에 따라, 실시예 4 내지 실시예 8에서 제조한 각 재조합체 항체에 결합시켰다. 200 mM의 탄산나트륨 완충액(pH 8.3 내지 8.5) 중 1 내지 2 ㎎/㎖의 항체에, 디메틸포름아미드에 용해한 FITC를 항체 분자의 20 내지 40배량 첨가하고, 혼합물을 교반하면서 실온에서 2 내지 3 시간 동안 반응시켰다. PBS로 평형화한 겔 여과 칼럼(NAP5, 아머샴 파마시아 바이오테크사 제조)에 혼합액을 가하여 항체에 미결합된 FITC를 제거하였다. 이 조건 하에서, 항체 1 분자에 약 3개의 FITC가 결합하였다. 형광 표지된 항체는 모두 hCD98의 발현이 확인된 인간 대장암 세포주 DLD-1 세포주에 결합하였다.

실시예 14: 각 모노클로날 항체의 인간 말초혈에서 유래하는 T 세포, B세포, 단구 세포와 정상 인간 대동맥 내피 세포( HAEC )로의 반응성

단구 세포, 활성화 T 세포, 배양한 정상 내피 세포에서는 CD98이 발현된다고 알려져 있다. 따라서, 각 항체의 인간 말초혈에서 유래하는 T 세포, B 세포 및 단구 세포와 인간 대동맥 내피 세포(HAEC)에 대한 반응성을 조사하였다. 인간 말초혈에서 유래하는 세포는 이하의 방법으로 제조하였다. 1 ㎖ 헤파린(노보사 제조) 함유 인간 말초혈 10 ㎖를 PBS로 2배로 희석하고, 20 ㎖의 Ficoll-Paque PLUS 액(아머샴 파마시아 바이오테크사 제조) 위에 중층하여, 1500 rpm으로 30분간 원심 q분리한 후 세포를 회수하였다. PBS로 2회 세정하여 단핵구 세포를 제조하였다. 일부의 단핵구 세포는, 10 ㎍/㎖의 피토헤마글루티닌(시그마사 제조, PHA), 10 ％ FCS, 0.1 mM 비필수 아미노산 용액(기브코사 제조), 5.5×10^-6 M 2-메르캅토에탄올(기브코사 제조) 및 페니실린/스트렙토마이신/글루타민(기브코사 제조) 함유 RPMI 배지(기브코사 제조)에서 5 ％ CO₂, 37 ℃하에 72 시간 동안 배양하였다. PHA 자극에 의해 인간 말초혈에서 유래하는 T 세포 및 B 세포에 활성화 마커인 CD25 발현이 관찰되었다(FITC-표지 항-인간 CD25 항체(벡톤 디킨슨사 제조 Ca. 555431)를 사용한 FACS 분석). 제조된 각 세포는 염색 완충액(SB)에 2×10⁶/㎖로 현탁시키고, 세포 현탁액을 96-웰 환저 플레이트(벡톤 디킨슨사 제조)에 50 ㎕/웰로 분주하였다. 실시예 13에서 제조된 각각의 FITC-표지 항체를 5 ㎍/㎖의 농도로 항-인간 CD3 항체(벡톤 디킨슨사 제조 Ca. No. 555340), 항-인간 CD14 항체(벡톤 디킨슨사 제조 Ca. No. 347497) 또는 항-인간 CD19 항체(이뮤노테크사 제조 Ca. No. IM1285)와 함께 빙온하에 30분간 반응시켰다. 양성 대조군으로서 시판된 FITC-표지 항-인간 CD98 항체(클론 UM7F8)를, 음성 대조군은 FITC-표지 항-DNP 인간 IgG1 항체를 사용하였다. SB로 1회 세정한 후, 생성물을 300 ㎕의 FACS 완충액에 현탁하고, FACS로 각 항체의 반응성을 조사하였다.

그 결과, C2IgG1 이외의 항체는 UM7F8과 유사한 결합 양식을 나타내었으며, 따라서, 단구 세포, 활성화 T 세포 및 활성화 B 세포에 유의하게 결합하였다(도 6 및 도 7). 한편, C2IgG1은 어떠한 세포에 대해서도 유의한 결합은 관찰되지 않았다(도 6 및 도 7).

HAEC(캠브렉스사 제조)는 첨부 설명서에 따라 배양하고, 계대수가 4회 이내인 세포를 사용하였다. 배양한 HAEC에 대한 C2IgG1, K3, 7-95-8, 10-60-7, 3-69-6 및 1-40-1 항체의 반응성을 상기와 동일한 방법으로 조사하였다. 3.2 ng/㎖ 내지 50 ㎍/㎖의 농도로 각 항체 반응시킨 결과, K3, 7-95-8, 10-60-7, 3-69-6 및 1-40-1은 HAEC에 결합했지만, C2IgG1은 HAEC에 결합하지 않았다(도 8).

한편, 항체들을 동일한 조건하에 인간 대장암 세포주 DLD-1에 반응시키면, 모든 항체가 특정 조건하(본 실시예에서는, 3 ㎍/㎖ 이하의 항체 농도)에서는 UM7F8보다 DLD-1 암 세포에 대한 특이성이 높다는 것을 알 수 있었다(도 8). 특히 C2IgG1은, 암 특이성이 높은 항체라는 것이 강하게 시사되었다. 이하의 실험은 C2IgG1, K3 및 3-69-6을 사용하여 실시하였다.

실시예 15: 암 세포주에 대한 각 모노클로날 항체의 반응성

C2IgG1, K3 및 3-69-6의 대장암 세포주(DLD-1), 폐암 세포주(H226), 전립선 암 세포주(DU145), 흑색종 세포주(G361, SKMEL28, CRL1579), 비호지킨 림프종 세포주(Ramos), 방광암 세포주(T24), 유방암 세포주(MCF, MDA-MB-231), 췌장암 세포주(HS766T), 다발성 골수종 세포주(IM9), 적아구계 백혈병 세포주(K562, 도 3 참조)에 대한 각 항체의 반응성의 검토를 실시예 9와 동일한 방법의 FACS 분석으로 행하였다. 세포주를 염색 완충액(SB)로 2×10⁶/㎖로 세포 현탁액을 제조하고, 96웰 환저 플레이트(벡톤 디킨슨사 제조)에 50 ㎕/웰로 분주하였다. 5 ㎍/㎖로 제조된 항체 또는 FITC-표지 항체를 50 ㎕/웰 첨가하고, 빙온하에 30분간 반응시켰다. 음성 대조군은 항-DNP 인간 IgG1 항체 또는 FITC-표지 항-DNP 인간 IgG1 항체를 사용하였다. SB로 1회 세정한 후, RPE 형광-표지 염소 항-인간 Igγ F(ab')₂ 항체(서던 바이오테크 사 제조)를 SB로 200배 희석한 것 50 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 빙온하에 30분간 배양하였다. FITC-표지 항체의 경우에는, 이 조작을 생략하였다. SB로 1회 세정한 후, 생성물을 300 ㎕의 FACS 완충액에 현탁하고, FACS로 각 세포의 평균 형광 강도를 측정하였다.

그 결과, 모든 항체가 각 암 세포주에 대해 결합 활성을 갖는다는 것을 알 수 있었다(도 9 및 도 10). 또한, 모든 항체가 Colo205, SW480, SW620, LOVO, LS180 및 HT29의 인간 대장암 세포주에 강하게 결합하였다.

실시예 16: 마우스 암 모델에서의 K3 , C2IgG1 및 3-69-6의 항종양 효과

실시예 4 내지 실시예 8에서 제조된 재조합체 모노클로날 항체 K3, C2IgG1 및 3-69-6의 항종양 효과를, 이하에 기재하는 방법에 따라 마우스 암 모델을 사용하여 검토하였다. 개

5주령의 Balb/c 누드 마우스(닛본 구레아(주)사로부터 구입)를 각 개체의 체중을 기준으로 5 마리를 1군으로서 나누었다. 100 ㎕의 PBS에 5×10⁶ 개의 대장암 세포 Colo205와 5 ㎍의 항체를 혼합한 것을 복부 피하에 이식하였다. 이식 후 2일째, 4일째, 6일째에 100 ㎍/100 ㎕로 용매(1 ％ 마우스 혈청 함유 PBS)에 용해시킨 항체를 마우스 복강 내에 투여하고, 종양의 크기를 측정하였다. 항체의 음성 대조군으로서 용매를 사용하였다.

상기 실험 결과는, 도 11에 도시된 바와 같다. 도면 중의 각 절선은 개별 마우스의 데이터를 나타낸다. 대조군은, 5일째에는 모든 개체에서 암 세포주의 생착이 관찰되었으며, 12일째의 종양의 평균 부피(장경×단경×단경×0.5로 산출)±SE는 165.55±31.71 ㎣였다. 한편, C2IgG1군은 1 개체만 대조군과 동일하게 종양 증식을 나타내었지만(12일째에 종양괴가 169.44 ㎣), 다른 개체는 C2IgG1 항체 투여에 의해 강한 항종양 활성이 관찰되었다. 28일째의 대조군의 종양괴의 평균 부피±SE는 1977.64±442.04이고, C2IgG1 항체 투여군은 775.31±622.47로, C2IgG1 항체는 유의하게 Cdo205 암 세포에서 유래하는 종양의 증식을 억제하였다(p<0.01). K3군과 3-69-6군은 모든 개체에서 30일 이상 경과하여도 암의 생착은 관찰되지 않았다. 평균 체중은 대조군에서만 저하되었다(이식 30일째에는 K3군보다 약 20 ％ 저하).

이들 결과로부터, K3, C2IgG1 및 3-69-6은 암 세포 증식 억제 활성을 갖는 다는 것을 발견하였다.

실시예 17: 마우스 동계 담암 모델에서의 C2IgG1 모노클로날 항체의 항종양 효과

실시예 4 내지 실시예 8에서 제조된 재조합체 모노클로날 항체 C2IgG1의 항종양 효과를 이하에 기재하는 방법에 따라 마우스 동계 암 모델을 사용하여 검토하였다.

실시예 2에서 제조한 hCD98/hLAT1-E 발현 CT26 세포 5×10⁶ 개를 이식한 Balb/c(암컷)를 종양의 부피로부터 5 마리씩 2군으로 나누었다. 종양 부피가 약 90 ㎣(장경×단경×단경×0.5로 산출)로 증가한 시점(0일째)과, 3일째, 5일째에 100 ㎍/100 ㎕의 용매(1 ％ 마우스 혈청 함유 PBS) 중의 C2IgG1을 마우스 복강 내에 투여하였다. 대조군은 용매를 투여하였다. 그 결과, C2IgG1은 유의하게 생착 종양의 증식을 강하게 억제하는 활성이 있다는 것이 관찰되었다(도 12).

실시예 18: C2IgG1 및 K3 항체의 원숭이 세포로의 교차 반응성

C2IgG1 및 K3의 원숭이 세포(COS-7 세포)로의 교차 반응성을 FACS 분석으로 조사하였다. 2×10⁶/㎖의 세포를 염색 완충액(SB)에 현탁시켰다. 세포 현탁액을 96-웰 환저 플레이트(벡톤 디킨슨사 제조)에 50 ㎕/웰로 분주하였다. SB로 5 ㎍/mL로 제조된 항체를 50 ㎕ 첨가하고, 생성물을 빙온하에 30분간 반응시켰다. 음성 대조군은 DNP 인간 IgG1 항체를 사용하였다. SB로 1회 세정한 후, SB로 200배 희석한 RPE 형광-표지 염소 항-인간 Igγ F(ab')₂ 항체(서던 바이오테크 사 제조)를 50 ㎕/웰 첨가하고, 빙온하에 30분간 반응시켰다. SB로 1회 세정한 후, 생성물을 300 ㎕의 FACS 완충액에 현탁하고, FACS로 항체의 결합을 나타내는 형광 강도를 측정하였다. 그 결과, 두 항체 모두 COS-7 세포주에 결합하였고, C2IgG1 및 K3이 원숭이 세포에 교차 반응성을 갖는 항체라는 것을 알 수 있었다(도 13).

실시예 19: 마우스 담암 모델에 대한 C2IgG1의 효과

C2IgG1의 항종양 활성을 이하에 기재하는 방법에 따라 마우스 담암 모델을 사용하여 검토하였다.

6주령의 Balb/c-SCID 마우스(닛본 구레아(주)사로부터 구입)의 배부 피하에, 버킷 림프종 세포주 Ramos(ATCC로부터 구입)를 3×10⁶/마우스 개체로 이식하였다. 이식 13일 후 생착한 종양의 크기를 측정하여, 종양의 크기가 30 내지 140 ㎣인 담암 마우스를 6 마리 1군으로서 나누었다. 복강 내에, C2IgG1을 100 ㎎/마우스 개체(200 ㎖의 PBS에 용해한 것)를 3회/주로 투여하였다. 양성 대조군으로서 리툭시맵(젠야꾸 고교 가부시끼가이샤)을, 음성 대조군으로서 PBS를 사용하였다. 종양 부피 및 체중을 주 3회 측정하였다. 종양괴의 장경, 단경, 높이를 측정하여, (장경)×(단경)×(높이)÷ 2의 값을 종양 부피로 하였다.

결과를 도 14에 나타낸다. C2IgG1 투여에 의해, 종양 이식 후 16일째부터 유의한 종양 증식 억제 효과가 관찰되었다.

실시예 20: C2IgG1NS 아미노산 개변체

C2IgG1 및 C2IgG1NS는 모두 재조합 항체를 제조했을 때 응집체 함량이 높다. 따라서, 서열 번호 47로 표시되는 C2IgG1NS의 경쇄 가변 영역 서열에 있어서, 번역 개시 코돈 ATG에 상당하는 5번째 M(메티오닌)을 1번 위치 아미노산으로 하고, 그로부터 계산하여 117번째의 I(이소류신)를 다른 아미노산으로 치환한 개변체의 제조를 행하였다.

C2IgG1NS / I117N 벡터의 제조

경쇄 117번 위치 이소류신을 아스파라긴으로 치환한 C2IgG1NS/I117N을 제조하는 것을 목적으로서, 실시예 6에서 제조한 N5KG1-Val C2IgGlNS 벡터를 주형으로 사용하여 Gene Editor^TM in vitro Site-Directed Mutagenesis System(프로메가사 No. Q9280)을 사용한 부위 특이적 돌연변이 도입법에 의해, 아미노산 치환체를 코딩하는 각종 돌연변이 DNA를 제조하였다.

변이 도입용 올리고뉴클레오티드(5' 말단 인산화 종료)로서, C2NS Lc 117I/HYND-p:(5'-TCAGTATGGT AGCTCACCTN ATTTCACTTT CGGCCCTGGG ACC-3'(N=AㆍTㆍGㆍC)(서열 번호69))를 사용하였다. 목적으로 하는 변이 도입용 올리고뉴클레오티드와 상기 키트 부속의 Selection Oligonucleotide를 주형 DNA와 어닐링시켜 변이 도입쇄를 합성한 후, GeneEditor^TM Antibiotic Selection Mix 존재하에서는 변이체만이 증식한다는 사실을 이용하여 돌연변이체를 선택하였다. 보다 구체적으로는, dsDNA 템플릿을 알칼리 조건하에(0.2 M NaOH, 0.2 mM EDTA(최종 농도)) 실온에서 5분간 배양한 후, 2 M 아세트산암모늄(pH 4.6)을 10분의 1 용량 첨가하여 중화한 후 주형을 에탄올 침전에 의해 회수하였다. 알칼리 변성 처리한 주형 DNA에, 변이 도입용 올리고뉴클레오티드와 새로운 항생 물질 내성 획득용 Selection Oligonucleotide(Bottom Select Oligo, 5' 말단 인산화 5'-CCGCGAGACC CACCCTTGGA GGCTCCAGAT TTATC-3'(서열 번호 85)) 및 키트 첨부의 어닐링 완충제를 첨가한 후, 75 ℃에서 5분간 보온하고, 37 ℃로 천천히 낮춤으로써 어닐링을 행하였다. 이어서, 변이쇄의 합성 및 결찰을 위해, 키트 부속의 Synthesis 10x 완충액, T4 DNA 폴리머라제 및 T4 DNA 리가아제를 첨가하여, 37 ℃에서 90분간 반응을 행하였다. GeneEditor^TM Antibiotic Selection Mix 존재하에 컴피턴트셀 BMH 71-18 mutS로 형질 전환하여 배양한 형질 전환체 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 제조하고, 그 DNA를 전기 천공법에 의해 ElectroMAX. DH10B Cells(인비트로젠사 No. 18290-015)에 형질 전환한 후, GeneEditor^TM Antibiotic Selection Mix를 포함하는 LB 플레이트에 파종하였다. 플레이트에 생성된 형질 전환체를 배양하고, 플라스미드 DNA를 정제하여 DNA 염기 서열을 해석하였다. DNA 염기 서열의 결과, 목적으로 하는 아미노산 변이가 도입된 C2IgG1NS 이변체의 발현 벡터를 얻었다. 얻어진 1 아미노산 치환 변이체 단백질을 발현하는 플라스미드 DNA를 N5KG1-Val C2IgG1NS/I117N 벡터로 명명하였다.

C2IgG1NS/I117C 벡터의 제조

경쇄 117번 위치 이소류신을 시스테인으로 치환한 C2IgG1NS/I117C를 제조하는 것을 목적으로서, 실시예 6에서 제조한 N5KG1-Val C2IgG1NS 벡터를 주형으로서 GeneEditor^TM in vitro Site-Directed Mutagenesis System(프로메가사 No. Q9280)을 사용한 부위 특이적 돌연변이 도입법에 의해, 아미노산 치환체를 코딩하는 각종 돌연변이 DNA를 제조하였다.

변이 도입용 올리고뉴클레오티드(5' 말단 인산화 종료)로서, C2NS Lc 117I/GRC-p(5'-TCAGTATGGT AGCTCACCTB GTTTCACTTT CGGCCCTGGG ACC-3'(B=CㆍGㆍT)(서열 번호 70))를 사용하였다. 목적으로 하는 변이 도입용 올리고뉴클레오티드와 상기 키트 부속의 Selection Oligonucleotide를 주형 DNA와 어닐링시켜 변이 도입쇄를 합성한 후, GeneEditor^TM Antibiotic Selection Mix 존재하에서는 변이체만이 증식한다는 사실을 이용하여 돌연변이체를 선택하였다. 보다 구체적으로는, dsDNA 템플릿을 알칼리 조건하에(0.2 M NaOH, 0.2 mM EDTA(최종 농도)) 실온에서 5분간 배양한 후, 2 M 아세트산암모늄(pH 4.6)을 10분의 1 용량 첨가하여 중화한 후 주형을 에탄올 침전에 의해 회수하였다. 알칼리 변성 처리한 주형 DNA에 변이 도입용 올리고뉴클레오티드와 새로운 항생 물질 내성 획득용 Selection Oligonucleotide(Bottom Select Oligo, 5' 말단 인산화 5'-CCGCGAGACC CACCCTTGGA GGCTCCAGAT TTATC-3'(서열 번호 85)) 및 키트 첨부의 어닐링 완충제를 첨가한 후, 75 ℃에서 5분간 보온하고, 37 ℃로 천천히 낮춤으로써 어닐링을 행하였다. 이어서, 변이쇄의 합성 및 결찰을 위해, 키트 부속의 Synthesis 10x 완충액, T4 DNA 폴리머라제 및 T4 DNA 리가아제를 첨가하고, 37 ℃에서 90분간 반응을 행하였다. GeneEditor^TM Antibiotic Selection Mix 존재하에 컴피턴트셀 BMH 71-18 mutS로 형질 전환하여 배양한 형질 전환체 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 제조하고, 그 DNA를 전기 천공법에 의해, ElectroMAX. DH10B Cells(인비트로젠사 No. 18290-015)에 형질 전환한 후, GeneEditor^TM Atibiotic Selection Mix를 포함하는 LB 플레이트에 파종하였다. 플레이트에 생성된 형질 전환체를 배양하고, 플라스미드 DNA를 정제하여 DNA 염기 서열을 분석하였다. DNA 염기 서열의 결과, 목적으로 하는 아미노산 변이가 도입된 C2IgG1NS 변이체의 발현 벡터를 얻었다. 얻어진 1 아미노산 치환을 가진 변이체 단백질을 발현하는 플라스미드 DNA를 N5KG1-Val C2IgG1NS/I117C 벡터로 명명하였다.

C2IgG1NS /117 IL 벡터의 제조

경쇄 117번 위치 이소류신을 류신으로 치환한 C2IgG1NS/I117L을, 실시예 6에서 제조한 N5KG1-Val C2IgG1NS 벡터를 주형으로 사용하여 이하의 방법에 의해 제조하였다.

DNA의 증폭에는, 도요보사의 KOD-Plus를 사용하였다. cDNA 1 ㎕, 10×KOD-Plus 완충액 5 ㎕, dNTP 믹스 5 ㎕, KOD-Plus 1 ㎕, 25 mM MgSO₄ 2 ㎕, F 프라이머 및 R 프라이머의 조성을 가지는 반응액을 재증류수로 최종 용량 50 ㎕로 제조하여, PCR에 사용하였다.

C2NS Lc 117IL R(5'-GGTCCCAGGG CCGAAAGTGA ATAGAGGTGA GCTACCATAC TGCTG-3'(서열 번호 71))을 합성하고, C2NS Lc 117IL R과 C2-1 Lc Bgl IIF(5'-AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TTCTCT TC-3'(서열 번호 18))를 사용하여, N5KG1-Val C2IgG1NS 벡터를 주형으로 사용하여 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, PCR 증폭산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 이 PCR 증폭산물을 C2NSI117L-F로 명명하였다. 이어서, C2NS Lc 117IL F(5'-GCAGTATGGT AGCTCACCTC TATTCACTTT CGGCCCTGGG ACC-3'(서열 번호 72))와 C2NS EcoRI R(5'-CCGGAATTCA ACACTCTCCC CTGTTGAAGC TCTTTGTGAC GG-3'(서열 번호 73))를 사용하여, N5KG1-Val C2IgG1NS 벡터를 주형으로서 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, PCR 증폭산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 이 PCR 증폭산물을 C2NSI117L-R로 명명하였다. 이어서 C2NSI117L-F와 C2NSI117L-R의 2배 희석액을 각 5 ㎕ 넣고, 프라이머 없이 94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초, 68 ℃ 60초의 사이클을 3회 반복하였다. 이 반응액을 99 ℃에서 5분간 가열한 후 5배 희석하고, 이 용액의 5 ㎕를 주형으로 사용하고 C2-1 Lc Bgl II F 프라이머와 C2NS EcoRI R 프라이머를 사용하여, 94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초, 68 ℃ 60초의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, PCR 증폭산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 이 PCR 증폭 cDNA 단편을 BglII 및 EcoRI로 소화하고, 동일한 효소로 개열된 상기 C2 중쇄 유전자를 포함하는 N5KG1-Val Lark 벡터에 도입하였다. 삽입 부분의 DNA 염기 서열을 결정하여, PCR에 의해 증폭하여 삽입한 서열이 주형으로 사용한 유전자 서열과 동일하다는 것을 확인하였다. 얻어진 1 아미노산 치환 변이체 단백질을 발현하는 플라스미드 DNA를 N5KG1-Val C2IgG1NS/I117L 벡터로 명명하였다.

C2IgG1NS/117IM 벡터의 제조

경쇄 117번 위치 이소류신을 메티오닌으로 치환한 C2IgG1NS/I117M을 실시예 6에서 제조한 N5KG1-Val C2IgG1NS 벡터를 주형으로 사용하여 이하의 방법에 의해 제조하였다.

C2NS Lc 117IM R(5'-GGTCCCAGGG CCGAAAGTGA ACATAGGTGA GCTACCATAC TGCTG-3'(서열 번호 74))을 합성하고, C2NS Lc 117IM R과 C2-1 Lc Bgl IIF(5'-AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TTC TCT TC-3'(서열 번호 18))를 사용하여, N5KG1-Val C2IgG1NS 벡터를 주형으로 사용하여 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, PCR 증폭산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 이 PCR 증폭산물을 C2NSI117M-F로 명명하였다. 이어서, C2NS Lc 117IM F(5'-GCAGTATGGT AGCTCACCTA TGTTCACTTT CGGCCCTGGG ACC-3'(서열 번호 75))와 C2NS EcoRI R(5'-CCGGAATTCA ACACTCTCCC CTGTTGAAGC TCTTTGTGAC GG-3'(서열 번호 76))를 사용하여, N5KG1-Val C2IgG1NS 벡터를 주형으로 사용하여 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 68 ℃ 1분의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, PCR 증폭산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 이 PCR 증폭산물을 C2NSI117M-R로 명명하였다. 이어서, C2NSI117M-F와 C2NSI117M-R의 2배 희석액을 각 5 ㎕ 넣고, 프라이머 없이 94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초, 68 ℃ 60초의 사이클을 3회 반복하였다. 이 반응액을 99 ℃에서 5분간 가열한 후 5배 희석하고, 이 용액 5 ㎕를 주형으로 사용하고 C2-1 Lc Bgl II F 프라이머와 C2NS EcoRI R 프라이머를 사용하여, 94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초, 68 ℃ 60초의 사이클을 25회 반복하였다. 이 반응액을 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 사용하여, PCR 증폭산물을 QIA 퀵 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 이 PCR 증폭 cDNA 단편을 BglII 및 EcoRI로 소화하고, 동일한 효소로 개열된 상기 C2 중쇄 유전자를 포함하는 N5KG1-Val Lark 벡터에 도입하였다. 삽입 부분의 DNA 염기 서열을 결정하여, PCR에 의해 증폭하여 삽입한 서열이 주형으로 사용한 유전자 서열과 동일하다는 것을 확인하였다. 얻어진 1 아미노산 치환을 가지는 변이체 단백질을 발현하는 플라스미드 DNA를 N5KG1-Val C2IgG1NS/I117M 벡터로 명명하였다.

C2IgG1NS 아미노산 개변체의 제조

실시예 7에서 나타낸 방법에 의해, C2IgG1NS/I117L 벡터, C2IgG1NS/I117M 벡터, C2IgG1NS/I117N, C2IgG1NS/I117C 벡터를 첨부 설명서에 따라 자유형 293 세포(인비트로젠사 제조)에 도입하여, 재조합형 항체를 발현시켰다. 항체의 정제는 실시예 8에 나타낸 방법을 일부 개량하여 행하였다. 6일째의 배양 상청을 회수하고, Steriflip-GP(밀리포어, SCGP00525)로 여과함으로써 세포 등의 잡배물을 제거하였다. 항체를 포함하는 배양 상청을, 단백질 A(아머샴)를 사용하고 흡착 완충액으로서 PBS를, 용출 완충액으로서 20 mM 시트르산나트륨 완충액(pH 3.4)을 사용하여 친화성 정제하였다. 용출 분획은 200 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)을 첨가하여 pH 약 5.5로 조정하였다. 제조된 항체 용액은 비바스핀 6(10 KMW cut 비바사이언스, VS0601)을 사용하여 3000 rpm에서 농축하고, 추가로 PBS를 첨가하여 혼합물을 원심분리함으로써 PBS로 치환된 정제 항체를 얻었다. 정제 항체의 농도는 280 ㎚의 흡광도를 측정하여, 1 ㎎/㎖를 1.45 최적 밀도로서 산출하였다.

C2IgG1NS 아미노산 개변체의 응집체 함유율의 측정

얻어진 아미노산 개변 항체 10 ㎍(0.1 ㎎/㎖)을 사용하여, 각 정제 항체의 응집체 함유율을 측정하였다.

항체 용액의 응집체 함유율은, 고속 액체 크로마토그래프 장치(시마즈사 제조) 및 TSK-G3000SW 칼럼(도소사 제조)과 용매로서 20 mM 인산나트륨, 500 mM NaCl pH 7.0을 사용하여 분석을 행하였다. 용출 위치를 겔 여과 HPLC용 분자량 마커(오리엔탈 고보사)(Cat No. 40403701)와 비교함으로써, 항체 단백질의 단량체와 응집체의 피크를 동정하여, 각각의 피크 면적으로부터 응집체의 함유율을 산출하였다.

결과를 도 15에 나타낸다. 도 15에 따르면, 상술한 아미노산의 변이에 의해 응집체 함유율이 감소된다는 것을 나타낸다.

C2IgG1NS 아미노산 개변체의 응집체 함량의 측정

실시예 14 및 15의 방법에 따라, C2IgG1NS 아미노산 개변체의 종양 세포주, 인간 CD98/인간 LAT1 강제 발현주 및 HAEC에 대한 반응성을 FACS에 의해 분석하였다.

결과를 도 16A 및 도 16B에 나타낸다. 상술한 아미노산 개변 항체, 특히 C2IgG1NS/I117L은, 인간 CD98과 LAT1을 강제 발현시킨 L929 세포에 결합하고, 비처리한 L929에 대해서는 결합하지 않았다(도 16A). 또한, 이들 아미노산 개변 항체는 HAEC에 결합하지 않고, colo205, Ramos 및 DLD-1과 같은 각종 암 세포에 대하여 결합성을 나타내었다(도 16B).

이들의 결과는 도 2A 및 도 8에 도시된 C2IgG1의 결합 특성과 유사하기 때문에, 상술한 아미노산 개변 항체, 특히 C2IgG1NS/I117L은 응집체 함유율이 낮고, 암 세포에 대하여 C2IgG1과 유사한 결합 특이성을 갖고, C2IgG1과 유사한 항종양 활성을 기대할 수 있는 항체라고 할 수 있다.

<C2IgG1NS 아미노산 개변체의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열(C2IgG1 중쇄 가변 영역 아미노산 서열과 동일)>(서열 번호 43)

<C2IgG1NS 아미노산 개변체의 중쇄 가변 영역 핵산 서열(C2IgG1NS 중쇄 가변 영역 핵산 서열과 동일)>(서열 번호 42)

<C2IgG1NS/117IL의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열>(서열 번호 77)

<C2IgG1NS/117IL의 경쇄 가변 영역 핵산 서열>(서열 번호 78)

<C2IgG1NS/117IM의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열>(서열 번호 79)

<C2IgG1NS/117IM의 경쇄 가변 영역 핵산 서열>(서열 번호 80)

<C2IgG1NS/117IN의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열>(서열 번호 81)

<C2IgG1NS/117IN의 경쇄 가변 영역 핵산 서열>(서열 번호 82)

<C2IgG1NS/117IC의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열>(서열 번호 83)

<C2IgG1NS/117IC의 경쇄 가변 영역 핵산 서열>(서열 번호 84)

SEQUENCE LISTING <110> KIRIN BREWERY COMPANY, LIMITED <120> Novel Anti-CD98 Antibody <130> 165882 <150> JP 2006-105013 <151> 2006-04-06 <160> 85 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 1 gttgaagctc tttgtgacgg gcgagc 26 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 2 aggcacacaa cagaggcagt tccagatttc 30 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 3 attaaccctc actaaaggga 20 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 4 agagagagag atctctcacc atggaagccc cagctcagct tctct 45 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 5 agagagagag cgtacgttta atctccagtc gtgtcccttg gc 42 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 6 tcttgtccac cttggtgttg ctgggcttgt g 31 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 7 tgcacgccgc tggtcagggc gcctgagttc c 31 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 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<400> 41 Ser Thr Thr Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala 1 5 10 15 Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly 20 25 30 Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly 35 40 45 Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 85 90 95 Thr Ser Lys Ser Gln Phe Phe Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala 100 105 110 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Thr Gly Leu Ala Leu 115 120 125 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 42 <211> 427 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> H-chain variable region of antibody C2IgG1NS <400> 42 gtcgaccacc atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatgggt 60 cctgtcccag ctgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct 120 gtccctcacc tgcactgtct ctggtggctc catcagcagt agtagttact actggggctg 180 gatccgccag cccccaggga aggggctgga gtggattggg agtatctatt atagtgggag 240 tacctactac aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tccgtagaca cgtccaagaa 300 ccagttctcc ctgaagctga gctctgtgac cgccgcagac acggctgtgt attactgtgc 360 gagacaaggg acggggctcg ccctatttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt 420 ctcctca 427 <210> 43 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> H-chain variable region of antibody C2IgG1NS <400> 43 Ser Thr Thr Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala 1 5 10 15 Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly 20 25 30 Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly 35 40 45 Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 85 90 95 Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala 100 105 110 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Thr Gly Leu Ala Leu 115 120 125 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gtctccaggg 120 gaaagagcca ccctctcctg cagggccagt cagagtgtta gcagcagctt cttagcctgg 180 taccagcaga aacctggcca ggctcccagg ctcctcatct atggtgcatc cagcagggcc 240 actggcatcc cagacaggtt cagtggcagt gggtctggga cagacttcac tctcaccatc 300 agcagactgg agcctgaaga tttcgcagtg tattactgtc agcagtatgg tagctcacct 360 atattcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaa 399 <210> 47 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L-chain variable region of antibody C2IgG1 or C2Ig꺤G1 <400> 47 Arg Ser Leu Thr Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 20 25 30 Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 35 40 45 Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala 65 70 75 80 Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Gln Gln Tyr Gly 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gggcccagga ctggtgaagc 540 cttcggagac cctgtccctc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtagtagtt 600 actactgggg ctggatccgc cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggagtatct 660 attatagtgg gagtacctac tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatccgtag 720 acacgtccaa gagccagttc ttcctgaagc tgagctctgt gaccgccgca gacacggctg 780 tgtattactg tgcgagacaa gggacggggc tcgccctatt tgactactgg ggccagggaa 840 ccctggtcac cgtctcctca gctagcctct ctctct 876 <210> 50 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 50 ccggaattcc caccatgagc caggacaccg aggtggatat ga 42 <210> 51 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 51 aaggaaaaaa gcggccgctc atcaggccgc gtaggggaag cggagcagca g 51 <210> 52 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 52 ccggaattcc caccatgagc caggacaccg aagtggacat gaaa 44 <210> 53 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 53 aaggaaaaaa gcggccgctc atcaggccac aaaggggaac tgtaacagca 50 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 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Ala Ala Lys Phe Thr Gly Leu Ser Lys Glu 55 60 65 gag ctg ctg aag gtg gca ggc agc ccc ggc tgg gta cgc acc cgc tgg 357 Glu Leu Leu Lys Val Ala Gly Ser Pro Gly Trp Val Arg Thr Arg Trp 70 75 80 gca ctg ctg ctg ctc ttc tgg ctc ggc tgg ctc ggc atg ctt gct ggt 405 Ala Leu Leu Leu Leu Phe Trp Leu Gly Trp Leu Gly Met Leu Ala Gly 85 90 95 gcc gtg gtc ata atc gtg cga gcg ccg cgt tgt cgc gag cta ccg gcg 453 Ala Val Val Ile Ile Val Arg Ala Pro Arg Cys Arg Glu Leu Pro Ala 100 105 110 cag aag tgg tgg cac acg ggc gcc ctc tac cgc atc ggc gac ctt cag 501 Gln Lys Trp Trp His Thr Gly Ala Leu Tyr Arg Ile Gly Asp Leu Gln 115 120 125 130 gcc ttc cag ggc cac ggc gcg ggc aac ctg gcg ggt ctg aag ggg cgt 549 Ala Phe Gln Gly His Gly Ala Gly Asn Leu Ala Gly Leu Lys Gly Arg 135 140 145 ctc gat tac ctg agc tct ctg aag gtg aag ggc ctt gtg ctg ggt cca 597 Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Leu Lys Val Lys Gly Leu Val Leu Gly Pro 150 155 160 att cac aag aac cag aag gat gat gtc gct cag act gac ttg ctg cag 645 Ile His Lys Asn Gln Lys Asp Asp Val Ala Gln Thr Asp Leu Leu Gln 165 170 175 atc gac ccc aat ttt ggc tcc aag gaa gat ttt gac agt ctc ttg caa 693 Ile Asp Pro Asn Phe Gly Ser Lys Glu Asp Phe Asp Ser Leu Leu Gln 180 185 190 tcg gct aaa aaa aag agc atc cgt gtc att ctg gac ctt act ccc aac 741 Ser Ala Lys Lys Lys Ser Ile Arg Val Ile Leu Asp Leu Thr Pro Asn 195 200 205 210 tac cgg ggt gag aac tcg tgg ttc tcc act cag gtt gac act gtg gcc 789 Tyr Arg Gly Glu Asn Ser Trp Phe Ser Thr Gln Val Asp Thr Val Ala 215 220 225 acc aag gtg aag gat gct ctg gag ttt tgg ctg caa gct ggc gtg gat 837 Thr Lys Val Lys Asp Ala Leu Glu Phe Trp Leu Gln Ala Gly Val Asp 230 235 240 ggg ttc cag gtt cgg gac ata gag aat ctg aag gat gca tcc tca ttc 885 Gly Phe Gln Val Arg Asp Ile Glu Asn Leu Lys Asp Ala Ser Ser Phe 245 250 255 ttg gct gag tgg caa aat atc acc aag ggc ttc agt gaa gac agg ctc 933 Leu Ala Glu Trp Gln Asn Ile Thr Lys Gly Phe Ser Glu Asp Arg Leu 260 265 270 ttg att gcg ggg act aac tcc tcc gac ctt cag cag atc ctg agc cta 981 Leu Ile Ala Gly Thr Asn Ser Ser Asp Leu Gln Gln Ile Leu Ser Leu 275 280 285 290 ctc gaa tcc aac aaa gac ttg ctg ttg act agc tca tac ctg tct gat 1029 Leu Glu Ser Asn Lys Asp Leu Leu Leu Thr Ser Ser Tyr Leu Ser Asp 295 300 305 tct ggt tct act ggg gag cat aca aaa tcc cta gtc aca cag tat ttg 1077 Ser Gly Ser Thr Gly Glu His Thr Lys Ser Leu Val Thr Gln Tyr Leu 310 315 320 aat gcc act ggc aat cgc tgg tgc agc tgg agt ttg tct cag gca agg 1125 Asn Ala Thr Gly Asn Arg Trp Cys Ser Trp Ser Leu Ser Gln Ala Arg 325 330 335 ctc ctg act tcc ttc ttg ccg gct caa ctt ctc cga ctc tac cag ctg 1173 Leu Leu Thr Ser Phe Leu Pro Ala Gln Leu Leu Arg Leu Tyr Gln Leu 340 345 350 atg ctc ttc acc ctg cca ggg acc cct gtt ttc agc tac ggg gat gag 1221 Met Leu Phe Thr Leu Pro Gly Thr Pro Val Phe Ser Tyr Gly Asp Glu 355 360 365 370 att ggc ctg gat gca gct gcc ctt cct gga cag cct atg gag gct cca 1269 Ile Gly Leu Asp Ala Ala Ala Leu Pro Gly Gln Pro Met Glu Ala Pro 375 380 385 gtc atg ctg tgg gat gag tcc agc ttc cct gac atc cca ggg gct gta 1317 Val Met Leu Trp Asp Glu Ser Ser Phe Pro Asp Ile Pro Gly Ala Val 390 395 400 agt gcc aac atg act gtg aag ggc cag agt gaa gac cct ggc tcc ctc 1365 Ser Ala Asn Met Thr Val Lys Gly Gln Ser Glu Asp Pro Gly Ser Leu 405 410 415 ctt tcc ttg ttc cgg cgg ctg agt gac cag cgg agt aag gag cgc tcc 1413 Leu Ser Leu Phe Arg Arg Leu Ser Asp Gln Arg Ser Lys Glu Arg Ser 420 425 430 cta ctg cat ggg gac ttc cac gcg ttc tcc gct ggg cct gga ctc ttc 1461 Leu Leu His Gly Asp Phe His Ala Phe Ser Ala Gly Pro Gly Leu Phe 435 440 445 450 tcc tat atc cgc cac tgg gac cag aat gag cgt ttt ctg gta gtg ctt 1509 Ser Tyr Ile Arg His Trp Asp Gln Asn Glu Arg Phe Leu Val Val Leu 455 460 465 aac ttt ggg gat gtg ggc ctc tcg gct gga ctg cag gcc tcc gac ctg 1557 Asn Phe Gly Asp Val Gly Leu Ser Ala Gly Leu Gln Ala Ser Asp Leu 470 475 480 cct gcc agc gcc agc ctg cca gcc aag gct gac ctc ctg ctc agc acc 1605 Pro Ala Ser Ala Ser Leu Pro Ala Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ser Thr 485 490 495 cag cca ggc cgt gag gag ggc tcc cct ctt gag ctg gaa cgc ctg aaa 1653 Gln Pro Gly Arg Glu Glu Gly Ser Pro Leu Glu Leu Glu Arg Leu Lys 500 505 510 ctg gag cct cac gaa ggg ctg ctg ctc cgc ttc ccc tac gcg gcc 1698 Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Leu Leu Arg Phe Pro Tyr Ala Ala 515 520 525 tgacttcagc ctgacatgga cccactaccc ttctcctttc cttcccaggc cctttggctt 1758 ctgatttttc tcttttttaa aaacaaacaa acaaactgtt gcagattatg agtgaacccc 1818 caaatagggt gttttctgcc ttcaaataaa agtcacccct gcatggtgaa gtcttccctc 1878 t 1879 <210> 66 <211> 529 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Met Ser Gln Asp Thr Glu Val Asp Met Lys Glu Val Glu Leu Asn Glu 1 5 10 15 Leu Glu Pro Glu Lys Gln Pro Met Asn Ala Ala Ser Gly Ala Ala Met 20 25 30 Ser Leu Ala Gly Ala Glu Lys Asn Gly Leu Val Lys Ile Lys Val Ala 35 40 45 Glu Asp Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Lys Phe Thr Gly Leu Ser 50 55 60 Lys Glu Glu Leu Leu Lys Val Ala Gly Ser Pro Gly Trp Val Arg Thr 65 70 75 80 Arg Trp Ala Leu Leu Leu Leu Phe Trp Leu Gly Trp Leu Gly Met Leu 85 90 95 Ala Gly Ala Val Val Ile Ile Val 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variable region of antibody C2IgG1NS/117IM <400> 80 agatctctca ccatggaaac cccagcgcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca 60 gataccaccg gagaaattgt gttgacgcag tctccaggca ccctgtcttt gtctccaggg 120 gaaagagcca ccctctcctg cagggccagt cagagtgtta gcagcagctt cttagcctgg 180 taccagcaga aacctggcca ggctcccagg ctcctcatct atggtgcatc cagcagggcc 240 actggcatcc cagacaggtt cagtggcagt gggtctggga cagacttcac tctcaccatc 300 agcagactgg agcctgaaga tttcgcagtg tattactgtc agcagtatgg tagctcacct 360 atgttcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaa 399 <210> 81 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L-chain variable region of antibody C2IgG1NS/117IN <400> 81 Arg Ser Leu Thr Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 20 25 30 Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 35 40 45 Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala 65 70 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Leu Phe Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 20 25 30 Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 35 40 45 Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala 65 70 75 80 Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Cys Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr 115 120 125 Lys Val Asp Ile Lys 130 <210> 84 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> L-chain variable region of antibody C2IgG1NS/117IC <400> 84 agatctctca ccatggaaac cccagcgcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca 60 gataccaccg gagaaattgt gttgacgcag tctccaggca ccctgtcttt gtctccaggg 120 gaaagagcca ccctctcctg cagggccagt cagagtgtta gcagcagctt cttagcctgg 180 taccagcaga aacctggcca ggctcccagg ctcctcatct atggtgcatc cagcagggcc 240 actggcatcc cagacaggtt cagtggcagt gggtctggga cagacttcac tctcaccatc 300 agcagactgg agcctgaaga tttcgcagtg tattactgtc agcagtatgg tagctcacct 360 tgtttcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaa 399 <210> 85 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 85 ccgcgagacc cacccttgga ggctccagat ttatc 35

Claims

암 세포의 세포막에서 유래하는 CD98로서, 아미노산 수송체 활성을 갖는 단백질과의 복합체 형태인 CD98에 대해 특이적 결합능을 갖는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서, 항종양 활성을 갖는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서, 상기 CD98이 발현된 세포로의 아미노산 수송을 저해하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서, 정상 인간 혈관 내피 세포, 정상 인간 말초혈 단구 및 림프구에 결합하지 않는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서, 아미노산 수송체 활성을 갖는 단백질이 LAT1인 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서, CD98이 인간 CD98인 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역의 서브 클래스가 IgG인 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서, (a) 서열 번호 29 및 31, (b) 서열 번호 41 및 47, 및 (c) 서열 번호 43 및 47 중 임의의 서열 쌍을 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로서 갖는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서, (d) 서열 번호 43 및 77, (e) 서열 번호 43 및 79, (f) 서열 번호 43 및 81, 및 (g) 서열 번호 43 및 83 중 임의의 서열 쌍을 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로서 갖는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서, 가변 영역의 아미노산 서열이 플라스미드 벡터 K3/pCR4(FERM BP-10552) 또는 C2IgG1/pCR4(FERM BP-10551)로부터 얻어지는 BglII-BsiWI 단편 및 SalI-NheI 단편에 의해 코딩되고, 벡터 pCR4에서 유래하는 서열을 포함하지 않는 것인 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서, 방광암 세포 T24의 류신 흡수에 대하여 유의한 저해 효과를 갖는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서, 인간 CD98의 1 내지 529번 아미노산 서열(서열 번호 66) 중의 연속적 또는 불연속적인 8개 이상의 아미노산 잔기에 의해 구성되는 에피토프를 인식하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편.
제12항에 있어서, 인간 CD98의 371 내지 529번 아미노산의 영역의 일부분에 결합능을 갖는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편.
제12항에 있어서, 인간 CD98의 1 내지 371 아미노산의 영역의 일부분에 결합능을 갖는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서, 상기 기능적 단편이 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역(V_H 및 V_L), Fab, Fab', (Fab')₂, Fv, Fd, scFv, sdFv 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편, 및

결합 단백질, 효소, 약물, 독소, 면역 모듈레이터, 검출 가능 부분 또는 태그를 포함하는 이종 도메인

을 포함하는 접합체.
벡터 pCR4에서 유래하는 서열을 제외하고, 플라스미드 벡터 K3/pCR4(FERM BP-10552) 또는 C2IgG1/pCR4(FERM BP-10551)에 포함되는 서열을 갖는 핵산.
제17항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편을 발현하는 세포.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편을 활성 성분으로서 포함하는 의약 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편을 활성 성분으로서 포함하는 종양의 예방 또는 치료제.
제21항에 있어서, 상기 종양이 LAT1과의 복합체 형태인 CD98을 발현하는 암 세포를 포함하는 것인, 예방 또는 치료제.
제21항에 있어서, 상기 종양이 대장암 또는 결장암인, 예방 또는 치료제.
제18항에 따른 벡터를 숙주에 도입하고,

상기 숙주를 배양하고,

배양물로부터 항체를 얻는 것

을 포함하는, 항체의 제조 방법.
(a) 서열 번호 28 및 30, (b) 서열 번호 40 및 46, 및 (c) 서열 번호 42 및 46 중 임의의 서열 쌍 또는 그 핵산 서열 축중물을 포함하는 발현 벡터를 숙주에 도입하고,

상기 숙주를 배양하고,

배양물로부터 항체를 얻는 것

을 포함하는, 항체의 제조 방법.
(d) 서열 번호 42 및 78, (e) 서열 번호 42 및 80, (f) 서열 번호 42 및 82, 및 (g) 서열 번호 42 및 84 중 임의의 서열 쌍 또는 그 핵산 서열 축퇴물을 포함하는 발현 벡터를 숙주에 도입하고,

상기 숙주를 배양하고,

배양물로부터 상기 항체를 얻는 것

을 포함하는 항체의 제조 방법.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주가 대장균, 효모 세포, 곤충 세포, 포유 동물 세포, 식물 세포, 식물 및 포유 동물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제조 방법.
CD98 및 LAT1을 코딩하는 핵산을 도입하여 얻어진 CD98/LAT1 발현 세포로 동물을 면역화하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편을 얻는 방법.
제28항에 있어서, 도입하는 CD98 및 LAT1이 인간 CD98 및 인간 LAT1인 방법.
치료상 유효량의 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편을 투여하는 것을 포함하는 종양의 예방 또는 치료 방법.
제30항에 있어서, 상기 종양이 LAT1과의 복합체 형태인 CD98을 발현하는 암 세포를 포함하는 것인 방법.
제30항에 있어서, 상기 종양이 대장암 또는 결장암인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편의, 종양의 예방제 또는 치료제의 제조를 위한 용도.
제33항에 있어서, 상기 종양이 LAT1과의 복합체 형태인 CD98을 발현하는 암 세포를 포함하는 것인 용도.
제33항에 있어서, 상기 종양이 대장암 또는 결장암인 용도.