KR20090016549A

KR20090016549A - 세포보호 약물 수득을 위한 콜레스트-4-엔-3-온 유도체의 용도

Info

Publication number: KR20090016549A
Application number: KR1020087026707A
Authority: KR
Inventors: 레베카 프뤼쓰; 브루노 뷔쏭; 티에리 보르데
Original assignee: 트로포스
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2007-03-28
Publication date: 2009-02-16
Anticipated expiration: 2027-03-28
Also published as: CA2647501A1; CA2647501C; MX2008012611A; FR2899108B1; JP2014051525A; WO2007118967A1; IL194293A0; US20090186863A1; DK2001483T3; HK1129841A1; RU2008143248A; RU2428189C2; AU2007239395B2; EP2001483B1; KR101409027B1; EP2001483A1; JP2009531397A; JP5662020B2; US9320745B2; FR2899108A1

Abstract

본 발명은 신경보호 약물 이외의 세포보호 약물 수득을 위한 콜레스트-4-엔-3-온 유도체의 용도에 관한 것이다.

콜레스트-4-엔-3-온 유도체, 세포보호 약물, 콜레스트-4-엔-3-온의 옥심

Description

세포보호 약물 수득을 위한 콜레스트-4-엔-3-온 유도체의 용도{USE OF CHOLEST-4-EN-3-ONE DERIVATIVES TO OBTAIN A CYTOPROTECTIVE MEDICINE}

세포 퇴행 과정은 종종 바람직하지 않은 세포 활동 및 세포사를 유발하는 세포 기능장애를 특징으로 한다.

세포는 그들의 수명을 연장시키거나 세포사를 지연 또는 예방하는, 스트레스에 대한 반응의 적응 메커니즘 (세포보호 메커니즘)을 발전시켜 왔다.

그러나 상기 세포보호 메커니즘은 때때로 불충분하고, 부적절하거나 너무 늦게 유도되어 효과를 발휘하지 못하며 세포사를 야기한다. 따라서, 세포보호를 촉진시키는 신규 세포보호 약물에 관심이 높은 것을 입증할 수 있다. 이것이 본 발명 목적의 하나이다.

용어 <<세포보호>>는 천연 약물 또는 비천연 약물의 세포사, 특히 병리학적 세포사에 대한 및/또는 세포사를 야기하는 세포 기능장애에 대한 세포보호 능력을 말한다. 상기 세포 기능장애는 미토콘드리아 기원의, 예를 들면 ATP 생성 능력의 감소, 칼슘 포획 및/또는 체류의 불능, 또는 유리 라디칼의 생성을 들 수 있다.

세포사의 주된 메커니즘 중에서도, 괴사(necrosis), 세포 자멸(apoptosis), 및 네크롭토시스(necroptosis) 간에는 본질적인 차이가 있다.

괴사(necrosis)는 소위 조직에 대한 손상 도중에 발생하는 "우발적인" 세포사이다. 가장 영향을 많이 받아 세포 항상성의 변형을 일으키는 것이 세포의 원형질막이다. 세포는 원형질막이 용해(lysis)를 일으킬 정도까지 물을 흡수할 것이다. 상기 세포 용해는 주변 환경(medium)으로의 세포질 내용물의 방출을 유도한다. 괴사는 염증 반응을 시초로 한다.

괴사는 다른 인접 부분이 여전히 생존하고 있는 동안에, 일군의 세포 또는 조직에 영향을 줄 수 있다. 결과적인 변환이 세포 또는 조직의 괴저이다.

즉, 괴사는 심각한 외상, 예를 들면 장기에의 혈액 공급 중단 또는 감소, 고열 (체온의 현저한 상승), 화학적, 물리적 충격에 의한 중독 등과 같은 사건의 결과로서 세포가 수명의 종말에 도달하는 경우에 발생하는 형태학적 변형으로 정의된다.

가장 잘 알려진 괴사 중 하나는 관상동맥의 폐색 (폐쇄)으로 인한 경색 (심근에의 혈류 공급의 중단)시 심근의 괴사이다.

세포 자멸은 생체의 정상 생리학의 없어서는 안될 일부이다. 이는 세포사의 고도로 조절되는 생리적 형태이고, 다세포 생물의 생존을 위해 요구된다. 세포 자멸은 배아형성 과정에서 근본적인 역할을 하는 과정이다.

세포 자멸 중인 세포 또는 아폽토시스 세포는 다른 세포로부터 그들 자신을 분리시킬 것이다. 세포 자멸은 일반적으로 조직 중 일개의 세포와 관련되며, 염증 을 유발하지 않는다. 세포 자멸의 특징적인 형태학적 상태의 하나는 세포 체적에서의 현저한 감소를 유도하는 핵 및 세포질 양자 모두에서의 현저한 응축이다. 이어서 핵은 조각으로 분해되며, 각 조각은 이중막으로 둘러싸인다. 아폽토시스체 (세포질 및 핵 성분)는 이어서 유리되고, 인접 세포의 포식작용을 통해 흡수될 것이다.

세포 자멸은 상이한 방식으로 유도될 수 있다. 예를 들면, 방사선, 화학물질 또는 호르몬의 존재는 세포 내 일련의 단계적인 세포자멸 과정을 유도할 수 있는 자극소(stimuli)이다. 세포내 신호, 예를 들면 불완전한 유사분열 또는 DNA 손상도 역시 세포 자멸을 유도할 수 있다.

또한, 세포 자멸은 유전독성(genotoxic) 약물의 작용 후 또는 질병의 과정에서 발생할 수 있다. 일부 병리는, 예를 들어 간독성, 망막병증, 심독성으로 특정 세포 집단의 손실을 야기하는 비정상적인 세포 자멸을 특징으로 한다.

따라서, 생리적 세포 자멸 및 병리적 세포 자멸 간에는 차이가 있다. 본 발명은 본질적으로 병리적 세포 자멸에 초점을 두고 있다.

세포사의 다른 메커니즘, 예를 들면 괴사 및 세포 자멸의 특징을 가지는 네크롭토시스가 존재한다. 네크롭토시스에 의해 죽어가는 세포는 괴사로 죽어가는 세포의 특징과 유사한 특징을 가지지만, 본 메커니즘의 생화학적 단계는 세포 자멸의 그것과 더욱 유사하다. 세포사의 상기 메커니즘은, 예를 들어 허혈시 발생한다.

따라서, 본 발명의 목적 중 하나는 또한 괴사 및/또는 병리적 세포 자멸 및/ 또는 네크롭토시스를 예방 및/또는 치료를 가능하게 할 수 있는 유용한 신규 약물 (항괴사 및/또는 항세포자멸 및/또는 항네크롭토시스 약물)을 제조하는 것이다.

세포 퇴행 과정은 그 중에서도 특히 퇴행성 질병 또는 질환, 외상 또는 다양한 인자에의 노출에 대한 조건에 따라 분류되는 병리적 상황으로부터 기인할 수 있다.

상기 외상 및 인자는 예로서 방사선 (UV, 감마 방사선)에의 노출, 저산소증 또는 산소의 부족, 영양 결핍, 성장 인자의 부족, 독극물, 세포 독소, 폐기물, 환경 독소, 유리 라디칼, 반응성 산소 또는 심지어 특정 의료 사고 및/또는 수술, 예컨대 세포, 조직 및 장기의 이식을 포함하는 외과적 외상을 포함할 수 있다. 의학적 치료, 예컨대 세포증식 억제제 또는 소염제 등과 관련하여 치료제로 사용되는 화학적 또는 생물학적 약물 역시 언급될 수 있다.

본 발명의 목적은 세포사를 일으킬 수 있는 병리의 세포외적 요인 또는 퇴행 과정을 치료하고자 하는 것이 아니라, 상기 병리적 과정 또는 상기 병리의 세포 수준에서의 결과를 실제로 치료하고 특히 상기 결과로부터 세포를 보호하는 것이다.

본 발명과 관련되지 않은 신경 또는 신경퇴행성 장애 이외의 퇴행성 과정을 특징으로 하는 가장 중요한 병리적 상태 중 하나로서, 하기 상태가 확인된다:

뼈, 관절, 결합 조직 및 연골의 질병, 예컨대 골다공증, 골수염, 골관절염, 류마티스 관절염 및 건선 관절염을 포함하는 관절염, 무혈관 괴사, 진행성 골화섬유 형성이상, 구루병, 쿠싱 증후군;

근육 질병, 예를 들어 근육퇴행위축, 예컨대 듀센형 근육퇴행위축 (Duchenne's muscular dystrophy), 근육긴장 퇴행위축, 근육병증 및 근무력증;

피부 질병, 예컨대 피부염, 습진, 건선, 노화 또는 심지어 흉터의 변화;

심혈관 질병, 예컨대 심장 및/또는 혈관 허혈, 심근경색, 허혈성 심근증, 만성 또는 급성 울혈성 심부전, 심부정맥, 심방세동, 심실세동, 발작성 빈맥(paroxystic tachycardia), 울혈성 심부전, 비대성 심장병증, 무산소증, 저산소증, 항암제 치료로 인한 부작용;

순환기 질병, 예컨대 죽상동맥경화증, 동맥경화증 및 말초 혈관 질병, 뇌졸중 (cerebrovascular stroke), 동맥류;

혈액 및 혈관 질병, 예컨대 빈혈, 혈관 아밀로이드증, 출혈, 겸상혈구증, 적혈구 파편 증후군 (red cell fragment syndrome), 호중구 감소증, 백혈구 감소증, 골수 무형성(medullar aplasia), 범혈구감소증(pantocytopenia), 저혈소판증, 혈우병;

폐렴, 천식을 포함하는 폐 질병; 폐의 폐색성 만성 질병, 예컨대 만성 기관지염 및 폐기종;

위장관 질병, 예컨대 궤양;

간 질병, 예컨대 간염, 특히 바이러스 기원 또는 병원체로서 다른 감염체를 가지는 간염, 알코올 간염, 자가면역성 간염, 전격성 간염, 특정 유전성 대사 장애, 윌슨병, 경화증, 알콜성 간질환 (ALD), 독소 및 약물로 인한 간 질병; 지방증 예컨대:

-　비알콜성 지방간염 (NASH), 또는 알콜, 약물로 인한 동반 외인성 중독, 바 이러스성 또는 독성 간염, 수술의 합병증, 대사성 질병 (예를 들면 당뇨, 글루코스 못견딤 증후군, 비만, 고지혈증), 시상하부-뇌하수체 축의 기능장애, 무베타지방단백혈증, 갈락토오스혈증, 글리코겐 질병, 윌슨병, 웨버-크리스찬병 (Weber-Christian's disease), 렙숨증후군 (Refsum's syndrom), 카르니틴 (carnitine) 결핍증,

- 소화관의 염증성 질병의 간 합병증,

- 자가면역성 간염.

원인과 무관하게 지방증 또는 간 세포 자멸에 대한 작용에 의해, 화합물은 간섬유증의 발병 및 경화증의 발생의 예방에 있어서 예방적 작용을 할 수 있다.

- 췌장의 질병, 예컨대 급성 또는 만성 췌장염;

- 대사성 질병, 예컨대 당뇨 및 요붕증, 갑상선염;

- 신장 질병, 예컨대 급성 신장애 또는 사구체신염;

- 화학물질, 독소 또는 약물로 인한 중증 중독;

-　후천성 면역결핍증후군 (AIDS)와 관련된 퇴행성 질병;

-　노화와 관련된 장애, 예컨대 가속 노화 증후군 (syndrome of accelerated aging);

- 치과 장애, 예컨대 치주염과 같이 조직의 퇴화를 야기하는 것들;

-　예컨대 당뇨망막병증, 녹내장, 안검하수증, 시각위축증, 만성진행성외안근마비, 황반변성, 망막변성, 색소성 망막염, 망막 원공 또는 열공, 망막 박리, 망막허혈, 외상, 염증성 변성, 외과수술 후 합병증과 관련된 급성 망막병증, 약물성 망 막병증 (medicinal retinopathies), 백내장을 포함하는 안과 질병 또는 장애;

-　청각 관의 장애, 예컨대 귀경화증 및 항생제에 의해 유발된 난청;

- 미토콘드리아 (미토콘드리아 병리)와 관련된 질병, 예컨대 프리드리히 운동실조 (Friedrich's ataxia), 구조적 미토콘드리아 이상이 있는 선천성 근육퇴행위축, 특정 근육병증 (MELAS 증후군, MERFF 증후군, 피어슨 증후군(Pearson's syndrome)), MIDD (미토콘드리아성 당뇨 및 난청) 증후군, 볼프람 증후군(Wolfram's syndrome), 근육긴장이상.

본 발명은 또한 장기이식 이전, 도중 (분리, 운반 및/또는 재삽입) 또는 이후에 상관없이 세포, 조직 및/또는 이식된 장기의 보호에 관심이 있다.

전술된 퇴행성 과정을 제어하는 약물학적 활성 화합물도 또한 찾고 있다.

본 발명은 세포보호 화합물에 대한 상기 요구에 부응한다. 실제로, 본 출원인은 콜레스트-4-엔-3-온 유도체, 및 특히 콜레스트-4-엔-3-온의 옥심이 주목할만한 세포보호 특징을 제공한다는 것을 발견하였다.

이 때문에 본 발명의 목적은 신경보호 약물 이외의 세포보호 약물 제조를 위한 하나 이상의 하기 화학식 I의 화합물 또는 하나의 그의 제약학상 허용되는 산과의 부가염, 또는 하나의 그의 에스테르 또는 상기 하나의 그의 에스테르의 제약학상 허용되는 산과의 부가염의 용도이다.

(상기 X는 =N-OH기를 나타내고,

R은

로부터 선택된 기를 나타내고,

A는 수소 원자 또는 B와의 탄소-탄소 결합을 나타내고,

B는 수소 원자, 히드록시기, 또는 A와의 탄소-탄소 결합을 나타내고,

C는 수소 원자 또는 D와의 탄소-탄소 결합을 나타내고,

D는 수소 원자 또는 C와의 탄소-탄소 결합을 나타내고,

E는 수소 원자 또는 F와의 탄소-탄소 결합을 나타내고,

F는 수소 원자 또는 E와의 탄소-탄소 결합을 나타냄)

상기와 같이 정의된 화학식 I의 화합물은 공지되었다 (WO2004/082581).

제약학상 허용되는 산과의 부가염은, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 벤조산, 말레산, 푸마르산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 옥살산, 글리옥실산, 아스파르트산, 알칸-술폰산, 예컨대 메탄- 또는 에탄-술폰산, 아릴술폰산, 예컨대 벤젠- 또는 파라톨루엔-술폰산, 또는 카르복실산과 형성되는 염일 수 있다.

본 발명에 따르면, 옥심기는 C=N 이중결합에 대한 N-O 결합의 배향과 관련되는, 순수 또는 혼합된 신(syn) 및 안티(anti) 이성질체를 나타낸다.

상술한 화합물 중, 구체적으로는

- A는 B와의 탄소-탄소 결합을 나타내고, C, D는 수소 원자를 나타내고, E, F는 수소 원자 또는 함께 탄소-탄소 결합을 나타내고, R은 R1을 의미하고,

- A는 B와의 탄소-탄소 결합을 나타내고, C, D는 수소 원자를 나타내고, E, F는 수소 원자를 나타내고, R은 R2 또는 R3 또는 R4를 의미하고,

- A는 B와의 이중 결합을 나타내고, C는 D와의 탄소-탄소 결합을 나타내고, E, F는 수소 원자를 나타내고, R은 R1 또는 R6을 의미하고,

- A는 B와의 이중 결합을 나타내고, C는 D와의 탄소-탄소 결합을 나타내고, E는 F와의 탄소-탄소 결합을 나타내고, R은 R1을 의미하고,

- E는 F와의 이중 결합을 나타내고, C, D, A, B는 수소 원자를 나타내고, R은 R1을 의미하는 상기 화합물 뿐만 아니라 그들의 제약학상 허용되는 산과의 부가염이 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따르면,

- 콜레스탄-3-온 옥심,

- 콜레스트-4-엔-3-온 옥심,

- 콜레스트-1,4-디엔-3-온 옥심

또는 하나의 그의 제약학상 허용되는 산과의 부가염, 또는 하나의 그의 에스테르 또는 상기 하나의 그의 에스테르의 제약학상 허용되는 산과의 부가염으로부터 선택된 하나 이상의 화학식 I의 화합물이 사용된다.

바람직하게는, 콜레스트-4-엔-3-온 옥심 또는 콜레스트-1,4-디엔-3-온 옥심 또는 하나의 그의 제약상 허용되는 산과의 부가염, 또는 하나의 그의 에스테르 또는 상기 하나의 그의 에스테르의 제약상 허용되는 산과의 부가염이 사용된다. 화학식 I의 화합물의 흥미로운 세포보호 특성은 특히 괴사 및/또는 병리적 세포 자멸 및/또는 네크롭토시스 또는 추가의 질병, 예를 들면

뼈, 관절, 결합 조직 및 연골의 질병,

근육 질병,

피부 질병,

심혈관 질병,

순환기 질병,

혈액 및 혈관 질병,

폐 질병,

위장관 질병,

간 질병,

췌장 질병,

대사성 질병,

신장 질병,

중증 중독,

후천성 면역결핍증후군 (AIDS)와 관련된 퇴행성 질병,

노화와 관련된 장애,

치과 장애,

안과 질병 또는 장애,

청각 관의 질병,

미토콘드리아 (미토콘드리아 병리)와 관련된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 목적의 세포보호 약물 (항괴사 및/또는 항세포자멸 및/또는 항네크롭토시스 약물)의 제조를 위한 그들의 용도를 정당화한다.

본 발명은 또한 장기이식 이전, 도중 (분리, 운반 및/또는 재삽입) 또는 이후에 상관없이 세포, 조직 또는 이식된 장기의 보호에 관심이 있다.

유리하게도, 화학식 I의 화합물은 심장 세포 보호 (심장보호 약물), 간세포 보호 (간 보호 약물) 목적의 약물 또는 미토콘드리아와 관련된 질병의 치료 또는 예방 목적의 약물의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 화학식 I의 화합물은 유리하게 생리학적 유효량으로 세포 보호 약물 내 존재하고; 상기 약물은 특히 유효 세포보호량의 하나 이상의 화학식 I의 화학물을 함유한다.

약물로서, 화학식 I의 화합물, 그의 에스테르, 그의 제약학상 허용되는 산과의 부가염 뿐만 아니라 그의 에스테르의 제약학상 허용되는 산과의 부가염이 장관 (digestive) 또는 비경구 경로용으로 제제화될 수 있다.

본 발명에 따른 약물은 특히 전술한 병리 중 하나에 해당하는 환자를 치료할 때, 동시, 별개 또는 넓은 시간에 걸친 사용을 위한, 동일하거나 상이한 병리에 활성이 있는 하나 이상의 다른 치료 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 화학식 I의 화합물은 하나 이상의 비활성 (즉, 제약학상 비활성 및 비독성) 부형제 또는 담체와 혼합된 약물로 사용될 수 있다. 그 예로서 제약 용도에 부합하고, 당업자에게 공지되어 있는 식염수, 생리학적, 등장성, 완충 용액 등을 언급할 수 있다. 상기 조성물은 분산제, 가용화제, 안정화제, 보존제 등으로부터 선택되는 하나 이상의 약제 (agent) 또는 담체를 함유할 수 있다. 제제 (액체 및/또는 주사용, 및/또는 고형 제제) 중에 사용될 수 있는 약제 또는 담체는 특히 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 사이클로덱스트린, 폴리소르베이트 80, 만니톨, 젤라틴, 락토오스, 식물성 또는 동물성 오일, 아카시아 등이다. 바람직하게는 식물성 오일이 사용된다. 조성물은 가능하게는 지속성 및/또는 지연 방출을 제공하는 투여 형태 또는 장치로 주사용 현탁액, 겔, 오일, 정제, 좌제, 분말, 젤라틴 캡슐, 캡슐 등으로 제제화될 수 있다. 상기 유형의 제제에 있어서, 셀룰로오스, 카르보네이트 또는 전분과 같은 약제가 유리하게 사용된다.

투여는 당업자에게 알려져 있는 임의의 방법, 바람직하게는 경구 또는 주사에 의하여, 통상적으로 복강내, 뇌내, 경막내, 정맥내, 동맥내, 또는 근육내 경로를 통해 수행될 수 있다. 경구 투여가 바람직하다. 장기간 치료인 경우, 바람직한 투여 경로는 설하, 경구 또는 경피가 될 것이다.

주사를 위하여, 화합물은 일반적으로 예를 들어, 주사기 또는 관류 (perfusion)에 의하여 주사할 수 있는 액체 현탁액으로 포장된다. 유속 및/또는 주사 용량 또는 일반적으로 투여되는 용량은 환자, 병리, 투여 방법 등에 따라서 당업자에 의해 조절될 수 있다고 이해된다. 가능하게는 다른 활성 성분 또는 임의의 제약학상 허용되는 담체 (안정화제 등의 존재 중 완충액, 식염수, 등장 용액)와 병용하여 반복 투여를 수행할 수 있다고 이해된다.

본 발명은 포유동물, 특히 인간에게 사용될 수 있다.

일반적으로, 화합물의 일일량은 원하는 치료 효과를 얻기 위한 최소 용량이 될 것이다. 전술된 화합물 및 예를 들어 콜레스트-4-엔-3-온 옥심의 용량은 일반적으로 인간에 있어서 1일 킬로그램 당 0.001 내지 100 mg일 것이다.

필요한 경우, 상기 일일량은 하루에 2, 3, 4, 5, 6회 이상의 복용, 또는 하루 중에 적절한 간격으로 투여되는 다수의 분할 용량 (sub-dose)으로 투여할 수 있다.

선택된 양은 다수의 인자, 특히 화합물의 투여 경로, 투여 기간, 투여 시점, 소실 속도, 화합물과 병용되는 다른 제품(들), 환자의 연령, 체중 및 신체적 상태 뿐만 아니라 그/그녀의 병력 및 약물에 알려져 있는 임의의 다른 정보에 따라서 달라질 것이다.

주치의 (attending physician)의 처방은 일반적으로 사용되는 용량보다 적은 용량으로 시작할 수 있으며, 이후에 이러한 용량은 가능한 부작용의 발생을 더욱 잘 조절할 수 있도록 점진적으로 증량될 것이다.

실시예 1: 콜레스트-4-엔-3-온 옥심의 항세포자멸 효과

콜레스트-4-엔-3-온 옥심의 항세포자멸 특성은 독소루비신에 의해 유도된 수축 기능장애 시험에 의해 심근세포 상에서 분석하였다.

100% DMSO 중 10mM의 농도로 콜레스트-4-엔-3-온 옥심의 모액을 사용하였다. 사용된 분자의 농도와는 관계 없이, DMSO 중 최종 농도는 모든 실험 시점에서 동일하다. 콜레스트-4-엔-3-온 옥심을 티로드(Tyrode)의 용액 (조성 (mmol/L): NaCl 135, KCL 5.4, NaH₂PO₄ 0.33, CaCl₂ 1.2, MgCl₂ 1.0, Hepes 10; NaOH로 pH를 7.4로 조정) 중에서 희석시킨 0.3, 1 및 3 μM의 농도에서 시험하였다.

방법

토끼 심실의 심근세포의 수축력 및 세포 자멸

A.1 토끼 심실의 심근세포의 분리된 세포의 수득

문헌 [A. d'Anglemont de Tassigny et al., Fund. Clin. Pharmacol., 18: pp. 531-38, 2004]에 기술된 바와 같이, 분리된 심실 세포를 뉴질랜드 수컷 토끼 심장으로부터 수득하였다. 간단히 말하면, 토끼 (2.0-2.5　kg)를 펜토바르비탈 (50　mg/kg) 용액으로 마취한 후, 헤파린 (200　IU/kg)을 투여하였다. 심장을 절개하고, 산소 첨가된 (무-칼슘) 티로드(tyrode) 등장 용액 (95%, 2-5% CO₂) (NaCl 135, KCl 5.4, Na₂PO₄ 0.33, MgCl₂ 1.0, HEPES 10 (mM 단위), 37℃에서 1N NaOH로 pH를 7.4로 조정, 280-300　mOsmol/kgH₂O)으로 재순환하지 않고 랑게도르프(Langendorff) 장치를 사용하여 10-15분 동안 즉시 관류시켰다. 다음으로, 모든 심장을 1　mg/mL의 유형 II 콜라겐분해효소 및 0.28　mg/mL의 유형 XIV 단백분해효소를 첨가한 상기와 동일한 무-칼슘 티로드 용액 (10-15　mL/분의 관상 혈류 속도)으로 "재순환" 모드에서 3분 동안 관류시켰다. 마지막으로, 모든 심장을 0.3　mM CaCl₂를 보충한 상기와 동일한 티로드 용액으로 재순환하지 않는 모드에서 10분 동안 관류시켰다. 좌심실을 분리하여 작은 조각으로 자르고, 세포 해리를 약한 기계적 교반에 의해 달성하였다. 1.0　mM의 생리적 농도에 도달하기 위해, 세포외 칼슘의 증가분을 매 15분마다 첨가하였다. 분리된 근세포를 혈청 없이 NaCl 110, KCl 5.4, Na₂PO₄ 0.33, NaHCO₃ 25, 글루코스 5, MgCl₂ 0.8, CaCl₂ 1 (mM 단위)를 함유하고, pH를 7.4로 조절한 배지에서 실험 전 1시간 30분 이하 전까지 유지시켰다. 모든 세포는 막대형이고, 광학 현미경 하에서 그의 표면에는 희미한 가로 무늬를 갖고 어떠한 수포도 갖지 않았다.

A.2 아넥신 V로 마킹

아넥신 V로 포스파티딜세린을 마킹하는 것은 미니맥스 세포 분리 키트 (MiniMacs cell isolation kit (독일 글라드바흐 베르기쉬 밀텐이 바이오텍 (Miltenyi Biotec, Bergisch, Gladbach, Germany))를 사용하여 세포 자멸을 측정하는 정량적 방법으로서 사용된다. 간단히 말하면, 포스파티딜세린에 노출된 세포는 아넥신 V 마이크로비즈(microbeads)에 의해 자기적으로 마킹된 후, 자기장에 위치하는 칼럼 내를 통과시켰다. 마킹되지 않은 것 (괴사 세포 및 비-세포 자멸 세포)이 남지 않는 반면, 마킹된 세포 (자기적으로 마킹된 포스파티딜세린을 가짐)는 칼럼에 남았다. 칼럼을 자기장으로부터 분리시켰고, 포스파티딜세린에 노출된 자기적으로 잔존하는 세포를 양성 분획으로 용출시키고, 말라세즈 세포 계수기 (Mallassez cell counter)로 계수하였다. 그 다음, 세포 자멸 세포의 퍼센트를 초기 세포 수로 나타낸다.

A.3 카스파제-3 (caspase-3) 활성의 측정

카스파제-3 활성을 세포 자멸의 측정을 위한 정량적인 방법으로서 사용하였다. 간단히 말하면, 세포를 용해시키고 상등액을 AK-005 키트 (미국 (Plymouth Meeting, PA, USA) 소재 바이오몰 리서치 레보러터리 (Biomol Research Laboratories) 제조)를 이용하여 카스파제-3 활성을 측정하기 위해 사용하였다. 카스파제-3 활성을 측정하기 위한 형광 기질 (DEVD)을 플루오로크롬, 7-아미노-4-메틸 쿠마린 (AMC)으로 마킹하였고, 이는 360/460 nm에서 UV 빛에 검출가능한 황녹색 형광을 210분간 생성시켰다. AMC는 카스파제-3에 의한 절단에 의해 기질로부터 방출되고, 효소의 발현을 fmol/분 단위로 표시하였다.

A.4 수축력의 측정

근세포를 37℃에서 연속적으로 관류되는 챔버 내로 이동시키고, 도립 현미경의 재물대 위에 위치시켰다. 챔버를 NaCl 140; KCl 5.4; CaCl₂ 1; MgCl₂ 0.8; HEPES 10 및 글루코스 5.6 (mM 단위) (pH=7.4; 290 mOsmol/kg H₂O)을 함유하는 생리 완충액으로 관류시켰다.

근세포의 수축은 챔버 내에 설치되고 자극기와 연결된 백금 장 전극을 이용하여 1초에 한번씩 (1 Hz) 유발되었다. 영상을 a X 20 대물렌즈로 연속적으로 담고, 240 샘플/초의 속도로 CCD 카메라에 전송시켰다. CCD 카메라의 영상을 비디오 스크린에 투사시켰다.

근세포를 하기 기준에 따른 연구를 위해 선택하였다: 1 mM Ca²⁺로 일정 휴지 길이 및 수축 진폭으로 자극된 경우, 매우 분명한 줄무늬가 있고 세포내 공포 (vacuola)는 없는 막대형 외관, 자발적인 수축이 없음. 사르코머 (sarcomer)의 길이를 비디오 영상 분석 프로그램에 의해 측정하고, 상기 데이터를 240 샘플/s의 속도에서 얻었다. 카메라 영상을 사르코머 길이 측정으로 전환하였다. 수축 퍼센트를 사르코머의 길이에 대한 상기 데이터로부터 산출하였다.

A.5 데이터 분석

모든 상기 데이터를 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 상이한 그룹간의 데이터의 비교를 아노바 (ANOVA) 후, p < 0.05에서 현저한 차이를 가지는 스튜던트 (Student) 시험에 의해 수행하였다. 　

■ 실험 절차

NaCl 110, KCl 5.4, Na₂PO₄ 0.33, NaHCO₃ 25, 글루코스 5, MgCl₂ 0.8, CaCl₂ 1 (mM 단위)을 함유하고 pH 7.4로 조정된 등장 용액에 첨가된 독소루비신 1 μM에의 3-8 시간 노출에 의해 분리된 심근세포 내 세포 자멸이 유발되었다. 아넥신 V 마킹은 세포 자멸 캐스케이드 중 매우 초기에 나타나는 현상이기 때문에, 독소루비신에의 노출 시작 3시간 후에 아넥신 V 마킹을 행하였다. 카스파제-3 활성 현상은 세포 자멸 현상의 후기에 발생하기 때문에, 카스파제-3 활성 측정을 독소루비신에 대한 노출 8 시간 후에 수행하였다. 심근세포의 수축력을 독소루비신에 대한 노출 8시간 동안 매 시간마다 측정하였다. 모든 처리 이후, 세포를 독소루비신에 노출되지 않은 대조군 심근세포와 비교하였다.

심근세포를 독소루비신에 대한 노출 전에 콜레스트-4-엔-3-온 옥심 화합물로 15분간 전처리 하였다. 상기 화합물의 0.3 μM, 1 μM 및 3 μM의 세 농도를 본 연구과정에서 실험하였다.

■ 결과

본 연구에서 사용된 세포의 사르코머 평균 길이는 상이한 그룹간에 현저하게 다르지 않았다.

▷ 근세포의 수축력 및 세포 자멸에 대한 독소루비신의 효과

독소루비신에의 노출은 사르코머의 축소 시간에 따라 감소하는 결과를 나타내었다. 독소루비신 피크의 축소는 초기 3시간 동안은 대조군과 유사하였고, 그 후 노출 4시간 이후 현저하게 감소되었다 (각각, 독소루비신 및 대조군의 베이스 라인에 비하여 -53.20 ± 7.70% 대 -19.49 ± 2.06%, (p<0.05, n=5)).

독소루비신 1 μM으로의 처리는 아넥신 V 마킹 및 카스파제-3 활성에서 현저한 증가를 가지는 세포 자멸을 유도하였다.

▷ 세포 자멸 및 독소루비신에 의해 유발된 수축력 정도에서의 기능 장애에 대한 콜레스트-4-엔-3-온 옥심의 효과

독소루비신 1 μM으로의 처리는 콜레스트-4-엔-3-온 옥심 (0.3, 1 및 3 μM)의 존재시에 없어지는 심실 심근세포 피크 축소의 현저한 감소 결과를 나타내었다. 실제로, 노출 4시간 이후, 독소루비신 하 피크의 축소 (-53.20 ± 7.70%)는 베이스 라인에 비하여 0.3 μM (-25.35 ± 0.18%), 1 μM (-15.66 ± 5.72%) 및 3 μM (-13.95 ± 3.17%)의 화합물로 현저하게 감소되었다.

또한, 독소루비신이 0.3, 1 및 3 μM의 콜레스트-4-엔-3-온 옥심에 의해 차단되어 아넥신 V 마킹 및 카스파제-3 활성이 증가하였다.

독소루비신 후 3시간, 아넥신 V 마킹에 있어서의 변화%로서 세포 자멸을 평가하여 하기 결과를 얻었다: 대조군: 100%; 독소루비신: 291% ± 32; 독소루비신 + 0.3 μM 콜레스트-4-엔-3-온 옥심: 130% ± 12.43; 독소루비신 + 1 μM 콜레스트-4-엔-3-온 옥심: 121% ± 4.74; 독소루비신 + 3 μM 콜레스트-4-엔-3-온: 115.5% ± 16.35. 카스파제-3 활성 측정과 관련된 결과는 이하와 같다: 대조군: 18 ± 9 fmol/분; 독소루비신: 120 ± 15 fmol/분; 독소루비신 + 0.3 μM 콜레스트-4-엔-3-온 옥심: 33 ± 9 fmol/분; 독소루비신 + 1 μM 콜레스트-4-엔-3-온 옥심: 18 ± 8 fmol/분; 독소루비신 + 3 μM 콜레스트-4-엔-3-온 옥심: 11 ± 4 fmol/분.

■ 설명 및 결론

콜레스트-4-엔-3-온 옥심 화합물은 분리된 토끼 심근세포에서의 독소루비신에 의해 유도된 수축력 기능장애에 대한 및 세포 자멸에 대한 심장보호 효과를 나타내었다. 그것이 적합한 용량으로 사용되는 경우, 상기 분자는 안트라사이클린과 함께 암 환자의 치료에서의 제한 인자로 알려져 있는 독소루비신에 의해 유도된 심독성에 대한 보호를 실제로 제공할 수 있다. 따라서, 콜레스트-4-엔-3-온 옥심 화합물은 이러한 환자에 있어 독소루비신 심독성을 제한하기 위해 사용될 수 있다.

실시예 2: 콜레스트-4-엔-3-온 옥심의 급성 간독성 생체 내 (in vivo) 모델에서의 효과

다수의 다른 세포와 마찬가지로 간세포는 원형질막에 Fas/CD95 수용체를 보유하고 있다. 상기 Fas 경로의 자극은 카스파제 캐스케이드의 활성화에 의해 세포사를 유도한다.

간 손상의 급성 모델은 Jo2 항Fas 항체 (문헌[Ogasawara et al., Nature, August 1993])의 1회 주사에 의해 유도될 수 있으며, 이는 중증 간 손상을 일으키고 바이러스성, 자가면역성 또는 약물 유발성 간염과 공통점이 있다.

혈청 글루탐산 피루브산 트랜스아미나제 (Serum Glutamic Pyruvic Transaminase(SGPT))로도 불리는 알라닌 아미노트랜스페라제 (Alanine Aminotransferase (ALAT))는 간세포에 존재하는 효소이다. 이의 활성은 간세포 용해 후 혈장에서 현저하게 증가하고, 따라서 간 손상 평가에 있어 좋은 마커가 된 다.

수행된 실험은 Jo2로 동물을 중독시킨 후, ALAT 및 콜레스트-4-엔-3-온 옥심의 간세포의 보호 능력을 시험하는 분석으로 이루어졌다.

재료 및 방법

동물

"엘레브아지 쟝비에(Elevage Janvier)" (Le Genest-Saint-Isle, France)로부터의 수컷 어른 CD1 마우스를 사용하였다. 상기 동물들을 개별적으로 구별하고, 물과 식량에 자유롭게 접근하게 하였다.

장치를 조절된 광 주기 (오전 7시 - 오후 7시) 및 50 ± 20% 습도 상태의 20 ± 2℃의 온도에서 유지시켰다.

Jo2 항체의 제조

파밍겐 (pharmingen, BD 바이오사이언스(BD Bioscience) 제조, 제품번호 554254 배치(batch) 32699)으로부터 Jo2로 불리는 단일클론 햄스터 항마우스 CD95 (Fas) 항체의 모액을 물 중 1 mg/ml의 농도로 제조하였다. 물 중 0.9% 염화나트륨으로 사용된 희석액을 제조하였다.

실험 대상 화합물의 제조

콜레스트-4-엔-3-온 옥심을 소정량 칭량하고, 미세 분말로 분쇄한 후, 옥수수유에 현탁 (60 mg/ml)하였다. 화합물을 5 ml/kg의 농도로 경구 투여하였다 (강제로 먹임).

절차

콜레스트-4-엔-3-온 옥심으로의 전처리를 Jo2 항체 투여 4 시간 전에 300 mg/kg의 용량으로 경구 투여에 의해 수행하였다. 상기 Jo2 항체는 5 mL/kg 체중의 부피 중 125 μg/kg의 용량으로 복강 내 주사하여 투여하였다.

대조군을 화합물 없이 실험 대상 화합물 제조시 사용된 동일한 부피의 옥수수유를 항체 투여 4시간 전에 경구 투여하는 전처리를 받은 동물로 수득하였다.

ALAT 분석

Jo2 투여 24시간 후, 마취된 마우스로부터 혈액을 취하였다. ALAT 분석을 IFCC (국제 임상화학 학회)에 의해 표준화된 방법에 따라, 분광 광도계 (히타치 모듈라(Hitachi Modualr) 제조)를 갖춘 키트 (로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics) 제조)를 사용하여 수행하였다.

결과 및 결론

125 μg/kg 용량의 Jo2의 복강 내 투여는 주사 후 24시간 이내에 대조군 19 마리 중 3마리의 마우스의 죽음을 유발하였다.

ALAT 활성은 300 mg/kg의 시험 화합물에 의해 현저하게 감소되었다.

Jo2 항체 투여 4시간 전에 300 mg/kg으로 투여된 콜레스트-4-엔-3-온 옥심으로

- 주사 후 24시간 내에 Jo2 항체를 받은 마우스의 죽음을 막고;

- 항체의 준치사량에 의해 유도되는 세포사를 제한하고; 혈장 내의 간세포 용해의 생체 표지인 ALAT 활성이 콜레스트-4-엔-3-온 옥심을 처리한 마우스에서 처리하지 않은 대조 마우스에서보다 훨씬 낮다.

결론

항Fas (Jo2) 항체에 의해 마우스에게 유도된 급성 간독성 모델은 콜레스트-4-엔-3-온 옥심의 간 보호 특성을 보여줄 수도 있다.

상기의 뛰어난 효과로, 화학식 I의 화합물은 일반적으로 세포보호 약물의 제조에서의 사용을 고려할 수 있다.

독성 연구

경구, 피하, 복강 내 및 정맥 내 경로를 통한, 300 mg/kg/day 이하의 범위의 용량으로, 28일까지 연장시킬 수도 있는 1일 투여의 처리에 의한 마우스로의 투여, 특히 콜레스트-4-엔-3-온 옥심의 투여는 어떠한 심각한 독성도 보이지 않았다.

원숭이에게 있어, 10일의 기간 동안 1,500　mg/kg 까지 일일량을 증가시킨 경구 투여는 어떠한 독성도 나타내지 않았다.

Claims

신경보호 약물 이외의 세포보호 약물 제조를 위한 하나 이상의 하기 화학식 I의 화합물 또는 하나의 그의 제약학상 허용되는 산과의 부가염, 또는 하나의 그의 에스테르 또는 상기 하나의 그의 에스테르의 제약학상 허용되는 산과의 부가염의 용도.

<화학식 I>

(상기 X는 =N-OH기를 나타내고,

R은

로부터 선택된 기를 나타내고,

A는 수소 원자 또는 B와의 탄소-탄소 결합을 나타내고,

B는 수소 원자, 히드록시기, 또는 A와의 탄소-탄소 결합을 나타내고,

C는 수소 원자 또는 D와의 탄소-탄소 결합을 나타내고,

D는 수소 원자 또는 C와의 탄소-탄소 결합을 나타내고,

E는 수소 원자 또는 F와의 탄소-탄소 결합을 나타내고,

F는 수소 원자 또는 E와의 탄소-탄소 결합을 나타냄)
제1항에 있어서, 상기 화학식 I에서 A는 B와의 탄소-탄소 결합을 나타내고, C, D는 수소 원자를 나타내고, E, F는 수소 원자 또는 함께 탄소-탄소 결합을 나타내고, R은 R1을 의미하는 것을 특징으로 하는 용도.
제1항에 있어서, 상기 화학식 I에서 A는 B와의 탄소-탄소 결합을 나타내고, C, D는 수소 원자를 나타내고, E, F는 수소 원자를 나타내고, R은 R2 또는 R3 또는 R4를 의미하는 것을 특징으로 하는 용도.
제1항에 있어서, 상기 화학식 I에서 A는 B와의 이중 결합을 나타내고, C는 D와의 탄소-탄소 결합을 나타내고, E, F는 수소 원자를 나타내고, R은 R1 또는 R6을 의미하는 것을 특징으로 하는 용도.
제1항에 있어서, 상기 화학식 I에서 A는 B와의 이중 결합을 나타내고, C는 D와의 탄소-탄소 결합을 나타내고, E는 F와의 탄소-탄소 결합을 나타내고, R은 R1을 의미하는 것을 특징으로 하는 용도.
제1항에 있어서, 상기 화학식 I에서 E는 F와의 이중 결합을 나타내고, C, D, A, B는 수소 원자를 나타내고, R은 R1을 의미하는 것을 특징으로 하는 용도.
제1항에 있어서, 상기 화학식의 화합물이

- 콜레스탄-3-온 옥심,

- 콜레스트-4-엔-3-온 옥심,

- 콜레스트-1,4-디엔-3-온 옥심

또는 하나의 그의 제약학상 허용되는 산과의 부가염, 또는 하나의 그의 에스테르 또는 상기 하나의 그의 에스테르의 제약학상 허용되는 산과의 부가염으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
제1항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물이 콜레스트-4-엔-3-온 옥심 또는 콜레스트-1,4-디엔-3-온 옥심 또는 하나의 그의 제약학상 허용되는 산과의 부가염 또는 하나의 그의 에스테르 또는 상기 하나의 그의 에스테르의 제약학상 허용가능한 산과의 부가염으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서, 상기 약물이 괴사 및/또는 병리적 세포 자멸 및/또는 네크롭토시스 (항괴사 및/또는 항세포자멸 및/또는 항네크롭토시스 약물) 또는 추가의 질병, 예를 들면

뼈, 관절, 결합 조직 및 연골의 질병,

근육 질병,

피부 질병,

심혈관 질병,

순환기 질병,

혈액 및 혈관 질병,

폐 질병,

위장관 질병,

간 질병,

췌장 질병,

대사성 질병,

신장 질병,

중증 중독,

후천성 면역결핍증후군 (AIDS)와 관련된 퇴행성 질병,

노화와 관련된 장애,

치과 장애,

안과 질병 또는 장애,

청각 관의 질병,

미토콘드리아 (미토콘드리아 병리)와 관련된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 목적인 것을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물이 심장 세포를 보호하기 위한 목적 (심장 보호 약물)인 것을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물이 간세포를 보호하기 위한 목적 (간 보호 약물)인 것을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물이 미토콘드리아와 관련된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 목적인 것을 특징으로 하는 용도. 　
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물이 이식 전, 도중 또는 후에 세포, 조직 또는 장기를 보호하기 위한 목적인 것을 특징으로 하는 용도.