KR20090008459A

KR20090008459A - Ｒａｇｅ 융합 단백질, 제제 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20090008459A
Application number: KR1020087029731A
Authority: KR
Inventors: 애드넌 엠.엠. 음잘리; 로버트 로들린; 예 에드워드 티안; 제프리 씨. 웹스터; 에릭 제이. 벤자민
Original assignee: 트랜스테크 파르마, 인크.
Priority date: 2006-05-05
Filing date: 2007-04-25
Publication date: 2009-01-21
Also published as: EA200870502A1; EP2380983A2; BRPI0711193A2; UY30324A1; US7981424B2; PE20080397A1; ZA200809394B; US8344120B2; AU2007248784A1; JP5558810B2; US20080045455A1; WO2007130302A3; TW200801036A; WO2007130302A2; EP2021474A2; US20110282035A1; AU2007248784B2; DOP2007000089A; AR060862A1; CN101548012A

Abstract

본 발명은 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 연결된 RAGE 폴리펩티드 서열을 포함하는 RAGE 융합 단백질을 기재한다. RAGE 융합 단백질은 RAGE 리간드 결합 부위 및 이뮤노글로불린 C_H2 도메인의 N-말단에 직접적으로 연결된 도메인간 링커를 포함하는 RAGE 폴리펩티드 도메인을 사용할 수 있다. 또한, RAGE 융합 단백질 제제 및 RAGE 융합 단백질 및 RAGE 융합 단백질 제제의 RAGE-매개성 병리에 대한 치료제로서의 용도를 기재한다.

RAGE 융합 단백질, 폴리펩티드, RAGE 리간드 결합 부위, 도메인간 링커, RAGE-매개성 병리

Description

ＲＡＧＥ 융합 단백질, 제제 및 이의 사용 방법{RAGE FUSION PROTEINS, FORMULATIONS, AND METHODS OF USE THEREOF}

관련 출원에 대한 상호 참고

본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2006년 5월 5일자로 출원된 미국 가특허출원 제60/798,455호로부터의 우선권을 주장한다. 미국 가특허출원 제60/798,455호의 기술 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.

본 발명은 최종당화산물에 대한 수용체 (Receptor for Advanced Glycated End Products (RAGE))의 조절에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질, 상기 융합 단백질의 제조 방법 및 상기 RAGE 융합 단백질의 제제, 및 RAGE에 기초한 질병을 치료하기 위한 상기 RAGE 융합 단백질의 용도에 관해 기술하고 있다.

단백질 또는 지질을 알도스 당과 함께 인큐베이션하면, 단백질 상의 아미노기가 비효소적으로 당화 및 산화되어 아마도리 (Amadori) 부가물이 형성된다. 시간이 지남에 따라, 이러한 부가물은 부가적인 재배열, 탈수 및 다른 단백질과 가교 결합되어 최종당화산물 (AGE)로 공지된 복합체를 형성한다. AGE의 형성을 증진시키는 요인으로는 단백질 전환의 지연 (예를 들어, 아밀로이드증 (amyloidoses)에서 와 같음), 리신 함량이 높은 거대 분자의 축적, 및 높은 혈중 글루코스 수준 (예를 들어, 당뇨병에서와 같음)이 있다 (문헌 [Hori et al., J. Biol. Chem. 270: 25752-761, (1995)]). AGE는 당뇨병 및 정상적인 노화와 연관된 합병증을 비롯한 다양한 질병에 연관되어 있다.

AGE는 단핵구, 대식 세포, 미소혈관계의 내피 세포, 평활근 세포, 혈관사이 세포, 및 뉴런 상의 세포 표면 수용체에 대한 특이적이고도 포화가능한 결합을 나타낸다. 최종당화산물에 대한 수용체 (RAGE)는 이뮤노글로불린 초유전자 분자 부류의 한 구성원이다. RAGE의 세포외 (N-말단) 도메인에는 하기 3가지 이뮤노글로불린-유형 영역이 포함된다: 1개의 V (가변) 유형 도메인에 이어 2개의 C-유형 (불변) 도메인 (문헌 [Neeper et al., J. Biol. Chem., 267:14998-15004 (1992)]; [Schmidt et al., Circ. (Suppl.) 96#194 (1997)]). 이러한 세포외 도메인 다음에는 단일 막횡단 도메인과, 고도로 하전된 짧은 세포질내 꼬리 부분이 존재한다. N-말단, 세포외 도메인은 RAGE의 단백질분해 또는 분자 생물학적 접근법에 의해 단리되어 V 및 C 도메인으로 구성된 가용성 RAGE (sRAGE)를 생성시킬 수 있다.

RAGE는 백혈구, 뉴런, 미세신경교 세포 및 혈관 내피를 비롯한 여러 세포 유형 상에서 발현된다 (예를 들어, 문헌 [Hori et al., J. Biol. Chem., 270:25752-761 (1995)]). RAGE 수준의 증가는 노화 조직 (문헌 [Schleicher et al., J. Clin. Invest., 99 (3): 457-468 (1997)]), 및 당뇨병성 망막, 혈관계 및 신장 (문헌 [Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004 (1995)])에서 발견되기도 한다.

AGE 이외에도, 다른 화합물이 RAGE와 결합하여 이를 조절할 수 있다. RAGE 는 아밀로이드 베타 (Aβ), 혈청 아밀로이드 A (SAA), 최종당화산물 (AGE), S100 (칼그라눌린 (Calgranulin) 부류의 전-염증성 구성원), 카르복시메틸 리신 (CML), 암포테린 및 CD11b/CD18를 포함하는 기능적, 구조적으로 다양한 여러 가지 리간드와 결합한다 (문헌 [Bucciarelli et al., Cell Mol. Life Sci., 59: 1117-128 (2002)]; [Chavakis et al., Microbes Infect., 6:1219-1225 (2004)]; [Kokkola et al., Scand. J. Immunol., 61:1-9 (2005)]; [Schmidt et al., J. Clin. Invest., 108:949-955 (2001)]; [Rocken et al., Am. J. Pathol, 162:1213-1220 (2003)]).

AGE, S100/칼그라눌린, β-아밀로이드, CML (N^ε-카르복시메틸 리신) 및 암포테린 등의 리간드를 RAGE에 결합시키는 것이 다양한 유전자의 발현을 변형시키는 것으로 밝혀졌다. 이들 상호작용은 이어서, 예를 들어 p38 활성화, p21ras, MAP 키나제, Erkl-2 인산화, 및 염증성 신호전달의 전사 매개인자인 NF-κB의 활성화를 포함하는 신호 변환 메카니즘을 개시시킬 수 있다 (문헌 [Yeh et al., Diabetes, 50:1495-1504 (2001)]). 예를 들어, 많은 세포 유형에서는 RAGE와 그의 리간드 간의 상호작용으로 인해 산화적 스트레스가 발생할 수 있고, 이로 인해 자유 라디칼 민감성 전사 인자 NF-κB가 활성화되고, NF-κB 조절된 유전자, 예를 들어 사이토킨 IL-1β 및 TNF-α가 활성화된다. 또한, RAGE 발현은 NF-κB를 통하여 상향 조절되고, 염증 또는 산화적 스트레스 부위에서 발현 증가를 나타낸다 (문헌 [Tanaka et al., J. Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)]). 따라서, 리간드 결합에 의해 개시된 양성 피드백 루프에 의해, 상행성이면서 종종 해로운 나선형이 더욱 자극될 수도 있다.

상이한 조직과 기관에서 RAGE를 활성화시키면, 수많은 병리생리적 결과가 초래될 수 있다. RAGE는 다음을 포함한 다양한 상태에 연관되어 있다: 급성 및 만성 염증 (문헌 [Hofmann et al., Cell 97:889-901 (1999)]), 당뇨병 말기 합병증 발병, 예를 들어 혈관 투과성 증가 (문헌 [Wautier et al., J. Clin. Invest., 97:238-243 (1995)]), 신병증 (문헌 [Teillet et al., J. Am. Soc. Nephrol., 11:1488-1497 (2000)]), 아테롬성 동맥경화증 (문헌 [Vlassara et al., The Finnish Medical Society DUODECIM, Ann. Med., 28:419-426 (1996)]), 및 망막병증 (문헌 [Hammes et al., Diabetologia, 42:603-607 (1999)]). RAGE는 또한, 알츠하이머병 (Alzheimer's disease) (문헌 [Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996)]), 및 종양 침입 및 전이 (문헌 [Taguchi et al., Nature, 405:354-357 (2000)])에 연관되어 있다.

RAGE가 광범위하게 발현되고 다양한 많은 질환 모델에서 뚜렷한 다면적 역할을 수행함에도 불구하고, RAGE는 정상적인 발육에 있어 필수적인 것으로 간주되지 않는다. 예를 들어, RAGE 녹아웃 (knockout) 마우스는 명백한 비정상적인 표현형을 지니고 있지 않은데, 이는 RAGE가 만성적으로 자극될 때 질환 병리에 있어 소정의 역할을 할 수 있긴 하지만, RAGE를 억제하는 것이 원하지 않는 임의의 급성 표현형에 기여하는 것으로 여겨지지는 않는다 (문헌 [Liliensiek et al., J. Clin. Invest., 113:1641-50 (2004)]).

생리적 리간드와 RAGE의 결합을 길항하는 것이, AGE 및 다른 RAGE 리간드의 과도한 농도로 인해 야기된 병리생리적 변화를 하향 조절할 수 있다. 내인성 리간드가 RAGE에 결합하는 것을 저하시킴으로써, RAGE-매개성 질병과 연관된 증상들을 경감시킬 수 있다. 가용성 RAGE (sRAGE)는 RAGE 리간드가 RAGE에 결합하는 것을 효과적으로 길항시킬 수 있다. 그러나, sRAGE는 생체 내에서 투여되는 경우에 반감기가 너무 짧아 한 가지 이상의 질병에 대해 치료적으로 유용할 수가 없다. 따라서, AGE 및 다른 생리적 리간드가 RAGE 수용체에 결합하는 것을 길항하는 화합물을 개발할 필요가 있는데, 이러한 화합물은 바람직한 약동학적 프로파일을 갖는다.

요약

본 발명의 한 실시양태는 RAGE 융합 단백질 및 이러한 단백질의 사용 방법을 포함한다. 본 발명은 다양한 방식으로 예시될 수 있다. 본 발명의 실시양태는 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 RAGE 융합 단백질을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, RAGE 융합 단백질이 RAGE 리간드 결합 부위를 포함한다. RAGE 융합 단백질은 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 이러한 C_H2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, RAGE 융합 단백질은 서열 56 또는 서열 57로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함한다. 예를 들어 몇몇 실시양태에서, 서열 56 또는 서열 57과 90% 이상 동일한 서열은 C-말단 리신 없이 서열 56 또는 서열 57의 서열을 포함한다.

본 발명은 또한, RAGE 융합 단백질의 제조 방법을 포함한다. 한 실시양태에서는, 이러한 방법이 RAGE 폴리펩티드를 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 연결시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 RAGE 리간드 결합 부위를 포함한다. 상기 방법은 RAGE 폴리펩티드를, 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 이러한 C_H2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, RAGE 융합 단백질은 서열 56 또는 서열 57로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함한다. 예를 들어 몇몇 실시양태에서, 서열 56 또는 서열 57과 90% 이상 동일한 서열은 C-말단 리신 없이 서열 56 또는 서열 57의 서열을 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 RAGE-매개성 질병을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 포함할 수 있다. 상기 방법은 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 조성물은 제약상 허용되는 담체 중에 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 포함할 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 동결건조 보호제, RAGE 융합 단백질, 및 완충액의 동결건조된 혼합물을 포함하는 제제를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 발명은 50 mg/mL 이상의 양의 RAGE 융합 단백질, 및 희석제를 포함하는 안정적인 재구성된 제제를 포함할 수 있고, 여기서 재구성된 제제는 RAGE 융합 단백질 및 동결건조 보호제의 동결건조된 혼합물로부터 제조된다.

본 발명의 실시양태는 또한 제조 약품을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제조 약품은 동결건조된 RAGE 융합 단백질을 포함하는 제제를 담고 있는 용기를 포함할 수 있다. 제조 약품은 또한 동결건조된 제제를 희석제와 재구성하는 지시사항을 포함할 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 RAGE 융합 단백질의 안정적인 재구성된 제제의 제조 방법을 또한 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 희석제 중 RAGE 융합 단백질 및 동결건조 보호제의 동결건조된 혼합물을 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도가 50 mg/mL 이상이도록 재구성하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 상기 방법은 RAGE 융합 단백질 및 동결건조 보호량의 동결건조 보호제를 포함하는 혼합물을 동결건조하는 단계, 및 희석제 중에 동결건조된 혼합물을 재구성하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 특정한 실시양태와 연관될 수 있는 다양한 이점이 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 대상체에게 투여되는 경우에 대사적으로 안정적일 수 있다. 또한, 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 RAGE 리간드에 대한 고 친화도 결합을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 높은 나노몰 내지 낮은 마이크로몰 범위의 친화도로 RAGE 리간드에 결합한다. 생리적 RAGE 리간드와 고 친화도로 결합함으로써, 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 내인성 리간드가 RAGE에 결합하는 것을 억제시켜, RAGE-매개성 질환을 개선시키기 위한 수단을 제공하는데 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 단백질 또는 핵산 형태로 제공될 수 있다. 한 가지 예시 실시양태에서는, RAGE 융합 단백질을 전신 투여하여 혈관계에 유지되도록 함으로써, 부분적으로 RAGE에 의해 매개된 혈관 질환을 잠재적으로 치료할 수 있다. 또 다른 예시 실시양태에서는, RAGE 융합 단백질을 국소 투여하여, RAGE 리간드가 해당 질환의 병리 상태에 기여하는 질환을 치료할 수 있다. 다르게는, RAGE 융합 단백질을 코딩하는 핵산 구축물을 적절한 담체, 예를 들어 바이러스 또는 네이키드 (naked) DNA를 사용함으로써 특정 부위에 전달할 수 있는데, 이 때 일시적인 국소 발현이 RAGE 리간드와 수용체 간의 상호작용을 국소적으로 억제시킬 수 있다. 따라서, 투여는 일시적이거나 (예를 들어, RAGE 융합 단백질을 투여하는 경우와 같음) 또는 사실상 보다 영구적일 수 있다 (예를 들어, RAGE 융합 단백질을 재조합 DNA로서 투여하는 경우와 같음).

본 발명의 부가의 특징이 다음에 기술될 것이다. 본 발명이 다음의 청구의 범위, 상세한 설명 및 도면에 제시된 상세 내용으로 그 적용 분야가 제한되지는 않음을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 실시양태들이 가능할 수 있고, 다양한 방법으로 실시 또는 수행할 수 있다.

본 발명의 다양한 특징, 국면 및 이점들은 다음 도면을 참고로 하여 보다 명백해질 것이다.

도 1은 본 발명의 또 다른 실시양태에 따른 다양한 RAGE 서열 및 이뮤노글로불린 서열을 도시한 것이다: 패널 A, 서열 1, 인간 RAGE에 대한 아미노산 서열; 및 서열 2, 아미노산 1 내지 22의 신호 서열을 수반하지 않은 인간 RAGE에 대한 아미노산 서열; 패널 B, 서열 3, 아미노산 1 내지 23의 신호 서열을 수반하지 않은 인간 RAGE에 대한 아미노산 서열; 패널 C, 서열 4, 인간 sRAGE의 아미노산 서열; 서열 5, 아미노산 1 내지 22의 신호 서열을 수반하지 않은 인간 sRAGE에 대한 아미노산 서열, 및 서열 6, 아미노산 1 내지 23의 신호 서열을 수반하지 않은 인간 sRAGE에 대한 아미노산 서열; 패널 D, 서열 7, 인간 RAGE의 V-도메인을 포함하는 아미노산 서열; 서열 8, 인간 RAGE의 V-도메인을 포함하는 또 다른 아미노산 서열; 서열 9, 인간 RAGE의 V-도메인의 N-말단 단편; 서열 10, 인간 RAGE의 V-도메인의 또 다른 N-말단 단편; 서열 11, 인간 RAGE의 아미노산 124 내지 221에 대한 아미노산 서열; 서열 12, 인간 RAGE의 아미노산 227 내지 317에 대한 아미노산 서열; 서열 13, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 123에 대한 아미노산 서열; 패널 E, 서열 14, 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 123에 대한 아미노산 서열; 서열 15, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 136에 대한 아미노산 서열; 서열 16, 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 136에 대한 아미노산 서열; 서열 17, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 226에 대한 아미노산 서열; 서열 18, 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 226에 대한 아미노산 서열; 패널 F, 서열 19, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 251에 대한 아미노산 서열; 서열 20, 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 251에 대한 아미노산 서열; 서열 21, RAGE 도메인간 링커; 서열 22, 제2의 RAGE 도메인간 링커; 서열 23, 제3의 RAGE 도메인간 링커; 서열 24, 제4의 RAGE 도메인간 링커; 패널 G, 서열 25, 인간 RAGE 아미노산 1 내지 118을 코딩하는 DNA; 서열 26, 인간 RAGE 아미노산 1 내지 123을 코딩하는 DNA; 및 서열 27, 인간 RAGE 아미노산 1 내지 136을 코딩하는 DNA; 패널 H, 서열 28, 인간 RAGE 아미노산 1 내지 230을 코딩하는 DNA; 및 서열 29, 인간 RAGE 아미노산 1 내지 251을 코딩하는 DNA; 패널 I, 서열 38, 인간 IgG의 C_H2 및 C_H3 도메인에 대한 부분 아미노산 서열; 서열 39, 인간 IgG의 인간 C_H2 및 C_H3 도메인의 일부를 코딩하는 DNA; 서열 40, 인간 IgG의 C_H2 및 C_H3 도메인에 대한 아미노산 서열; 패널 J, 서열 41, 인간 IgG의 인간 C_H2 및 C_H3 도메인을 코딩하는 DNA; 서열 42, 인간 IgG의 C_H2 도메인에 대한 아미노산 서열; 서열 43, 인간 IgG의 C_H3 도메인에 대한 아미노산 서열; 및 서열 44, 제5의 RAGE 도메인간 링커. 패널 K, 서열 45, N-말단에서 글루타민 잔기가 고리화되어 피로글루탐산을 형성하는 아미노산 1 내지 23의 신호 서열을 수반하지 않은 인간 sRAGE의 아미노산 서열; 서열 46, N-말단에서 글루타민 잔기가 고리화되어 피로글루탐산을 형성하는 인간 sRAGE의 V-도메인을 포함하는 또 다른 아미노산 서열, 서열 47, N-말단에서 글루타민 잔기가 고리화되어 피로글루탐산을 형성하는 인간 RAGE의 V-도메인의 또 다른 N-말단 단편, 서열 48, N-말단에서 글루타민 잔기가 고리화되어 피로글루탐산을 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 123에 대한 아미노산 서열; 패널 L, 서열 49, N-말단에서 글루타민 잔기가 고리화되어 피로글루탐산을 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 136에 대한 아미노산 서열, 서열 50, N-말단에서 글루타민 잔기가 고리화되어 피로글루탐산을 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 226에 대한 아미노산 서열, 서열 51, N-말단에서 글루타민 잔기가 고리화되어 피로글루탐산을 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 251에 대한 아미노산 서열; 패널 M, 서열 52, 서열 38 중 인간 IgG의 인간 C_H2 및 C_H3 도메인의 부분을 코딩하는 또 다른 DNA 서열, 서열 53, 서열 40 중 인간 IgG의 인간 C_H2 및 C_H3 도메인의 부분을 코딩하는 또 다른 DNA 서열.

도 2는 본 발명의 한 실시양태에 따른 제1 RAGE 융합 단백질 (TTP-4000) 코딩 영역을 코딩하는 DNA 서열인 서열 30 (패널 A) 및 서열 54 (패널 B)를 도시한 것이다. 진하게 강조한 코딩 서열 1 내지 753은 RAGE N-말단 단백질 서열을 코딩하는 반면, 서열 754 내지 1386은 힌지 영역 없이 인간 IgG Fc (γ1) 단백질 서열을 코딩한다.

도 3은 본 발명의 한 실시양태에 따른 제2 RAGE 융합 단백질 (TTP-3000) 코딩 영역의 DNA 서열인 서열 31 (패널 A) 및 서열 55 (패널 B)을 도시한 것이다. 진하게 강조한 코딩 서열 1 내지 408은 RAGE N-말단 단백질 서열을 코딩하는 반면, 서열 409 내지 1041은 힌지 영역 없이 인간 IgG Fc (γ1) 단백질 서열을 코딩한다.

도 4는 본 발명의 또 다른 실시양태에 따라, 각각 4개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩하는 아미노산 서열인 서열 32, 서열 33, 서열 34 및 서열 56을 도시한 것이다. RAGE 서열이 진하게 강조되었다.

도 5는 본 발명의 또 다른 실시양태에 따라, 각각 4개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩하는 아미노산 서열인 서열 35, 서열 36, 서열 37 및 서열 57을 도시한 것이다. RAGE 서열이 진하게 강조되었다.

도 6에서, 패널 A는 본 발명의 또 다른 실시양태에 따라, 인간 RAGE 중의 단백질 도메인 및 인간 Ig 감마-1 Fc 단백질 중의 단백질 도메인과, TTP-3000을 제조하기 위해 사용된 절단 지점 (위치 136) 및 TTP-4000을 제조하기 위해 사용된 절단 지점 (위치 251)을 비교하여 도시한 것이고; 패널 B는 본 발명의 또 다른 실시양태에 따른 TTP-3000 및 TTP-4000에 대한 도메인 구조를 도시한 것이다.

도 7은 본 발명의 한 실시양태에 따라, RAGE 리간드 아밀로이드-베타 (A-베타), S100b (S100), 및 암포테린 (Ampho)에 대한 sRAGE, 및 제1 RAGE 융합 단백질 TTP-4000 (TT4) 및 제2 RAGE 융합 단백질 TTP-3000 (TT3)의 시험관내 결합 검정 결과를 도시한 것이다.

도 8은 본 발명의 한 실시양태에 따라, 면역검출 시약만을 포함하는 음성 대조군 ("복합체 단독")에 비한 아밀로이드-베타에 대한 제1 RAGE 융합 단백질 TTP-4000 (TT4) ("단백질")의 시험관내 결합 검정 결과와, RAGE 길항제 ("RAGE 리간드")에 의한 상기 결합의 길항 작용을 도시한 것이다.

도 9는 본 발명의 한 실시양태에 따라, 면역검출 시약만을 포함하는 음성 대조군 ("복합체 단독")에 비한 아밀로이드-베타에 대한 제2 RAGE 융합 단백질 TTP-3000 (TT3) ("단백질")의 시험관내 결합 검정 결과와, RAGE 길항제 ("RAGE 리간드")에 의한 상기 결합의 길항 작용을 도시한 것이다.

도 10은 본 발명의 한 실시양태에 따라, RAGE 융합 단백질 TTP-3000 (TT3) 및 TTP-4000 (TT4), 및 sRAGE에 의한 TNF-α의 S100b-RAGE 유도된 생성 억제를 측정하는 세포에 기초한 검정 결과를 도시한 것이다.

도 11은 본 발명의 한 실시양태에 따라, RAGE 융합 단백질 TTP-4000 및 항-RAGE 항체에 의한 TNF-α의 HMGB1-RAGE 유도된 생성 억제를 측정하는 세포에 기초한 검정 결과를 도시한 것이다.

도 12는 본 발명의 한 실시양태에 따라, RAGE 융합 단백질 TTP-4000에 대한 약동학적 프로파일을 도시한 것으로, 여기서 각 곡선은 동일한 실험 조건 하의 상이한 동물을 나타낸다.

도 13은 본 발명의 한 실시양태에 따라, 염증 반응의 측정치로서 RAGE 융합 단백질 TTP-4000에 의한 자극과 인간 IgG 자극으로 인한 THP-1 세포로부터의 상대적 TNF-α 방출 수준을 도시한 것이다.

도 14는 본 발명의 또 다른 실시양태에 따라, RAGE 융합 단백질 TTP-4000을 사용하여 당뇨병 동물에게서 재발 협착증을 감소시키는 것을 도시한 것으로, 여기서 패널 A는 TTP-4000 RAGE-융합 단백질이 음성 대조군 (IgG)과 비교해서 혈관 내막/중막 비를 감소시켰음을 나타내고, 패널 B는 TTP-4000 RAGE-융합 단백질이 혈관 평활근 세포 증식을 투여량-반응성 방식으로 감소시켰음을 나타낸다.

도 15는 본 발명의 또 다른 실시양태에 따라, 알츠하이머병 (AD)에 걸린 동물에게서 아밀로이드 형성과 인지 기능질병을 감소시키기 위해 RAGE 융합 단백질 TTP-4000을 사용하는 것을 도시한 것으로, 여기서 패널 A는 TTP-4000 RAGE-융합 단백질이 뇌 중의 아밀로이드 로드를 감소시켰음을 나타내고, 패널 B는 TTP-4000 RAGE-융합 단백질이 인지 기능을 개선시켰음을 나타낸다.

도 16은 본 발명의 한 실시양태에 따라, 공지된 다양한 고정된 RAGE 리간드 에 대한 TTP-4000을 이용한 경우의 포화-결합 곡선을 도시한 것이다.

도 17은 본 발명의 또 다른 실시양태에 따라 RAGE 융합 단백질 TTP-4000을 사용하여 동종이계 췌장 랑게르한스 섬 세포 이식의 거부반응을 감소시키는 것을 도시한 것으로, 여기서 개방 (비어있는) 원은 처치하지 않은 대조군 동물을 나타내고; 대각선을 그려 넣은 원은 제1 투여량의 TTP-4000으로 처치한 동물을 나타내고; 물결무늬를 그려 넣은 원은 제2 투여량의 TTP-4000으로 처치한 동물을 나타내고; 다이아몬드형으로 채워진 원은 대조군 PBS로 처치한 동물을 나타내고; 안을 칠한 원은 대조군 IgG로 처치한 동물을 나타낸다.

도 18은 본 발명의 또 다른 실시양태에 따라 RAGE 융합 단백질 TTP-4000을 사용하여 동계 췌장 랑게르한스 섬 세포 이식의 거부반응을 감소시키는 것을 도시한 것으로, 여기서 개방 (비어있는) 원은 처치하지 않은 대조군 동물을 나타내고, 안을 칠한 원은 TTP-4000으로 처치한 동물을 나타낸다.

달리 지시되지 않는 한, 다음 명세서에 제시된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 수득하고자 하는 바람직한 특성에 따라서 달라질 수 있는 근사치이다. 적어도, 그리고 본 출원의 청구의 범위에 대한 균등론의 적용을 제한하려는 의도에서가 아니라, 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 숫자의 수를 고려하고 통상적인 반올림법을 적용하여 해석되어야 한다.

본 발명의 넓은 범위를 제시하는 수치 범위와 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 구체적인 실시예에 제시된 수치는 가능한 한 정확하게 보고되어 있다. 그러나, 어떠한 수치도 각각의 시험 측정치에서 발견되는 표준 편차로 인해 불가피하게 발생되는 특정 오차를 본래 함유하고 있다. 또한, 본원에 개시된 모든 범위는 그에 포함된 임의의 모든 하위 범위를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, "1 내지 10"으로 언급된 범위는 최소값 1과 최대값 10 사이의 임의의 모든 하위 범위, 즉 최소값 1 이상으로 시작하여 (예를 들어, 1 내지 6.1), 최대값 10 이하로 종결되는 (예를 들어, 5.5 내지 10) 임의의 모든 하위 범위를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 또한, "본원에 포함되는" 것으로 지칭된 모든 참고자료는 그의 전체가 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

추가로 본 명세서에 사용된 단수 형태 (부정관사 "a", "an", 및 정관사 "the")에는 하나의 지시 대상물로 직접적이고도 명료하게 제한하지 않는 한은 복수 지시 대상물이 포함된다는 것을 인지해야 한다. 용어 "또는"은 명료하게 달리 지시되지 않는 한은, 용어 "및/또는"과 상호 교환적으로 사용된다.

또한, 용어 "일부" 및 "단편"은 폴리펩티드, 핵산 또는 다른 분자 구축물의 일부를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다.

"폴리펩티드" 및 "단백질"은 부분 또는 전장 단백질을 포함할 수 있는 단백질 분자를 기재하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.

당업계에 공지된 바와 같이, "단백질", "펩티드", "폴리펩티드" 및 "올리고펩티드"는 알파 탄소가 어느 한 아미노산의 알파 탄소의 카르복실기와 다른 아미노산의 알파 탄소의 아미노기 사이의 축합 반응에 의해 형성된 펩티드 결합을 통해 연결된 연쇄 아미노산 (통상적으로, L-아미노산)이다. 통상적으로, 단백질을 구성하는 아미노산은 단백질의 아미노 말단 잔기에서 시작하여 카르복시 말단 잔기를 향하는 방향으로 증가하는 순서로 번호가 지정된다.

본원에 사용된 용어 "상류"는 분자가 단백질인 경우에는 제2 잔기에 대해 N-말단쪽인 잔기를 지칭하거나, 또는 분자가 핵산인 경우에는 제2 잔기에 대해 5'쪽인 잔기를 지칭한다. 또한 본원에 사용된 용어 "하류"는 분자가 단백질인 경우에는 제2 잔기에 대해 C-말단쪽인 잔기를 지칭하거나, 또는 분자가 핵산인 경우에는 제2 잔기에 대해 3'쪽인 잔기를 지칭한다.

달리 규정되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 당업자가 통상적으로 이해하고 있는 바와 동일한 의미를 갖는다. 실행자는 특히 당해 분야의 정의와 용어에 대해서 문헌 [Current Protocols In Molecular Biology (예를 들면, Ausubel, F.M. et al., Short Protocols in Molecular Biology, 4^th Ed., Chapter 2, John Wiley ＆ Sons, N.Y)]에 따른다. 아미노산 잔기에 대한 약어는 20개의 통상적인 L-아미노산 중의 하나를 지칭하기 위해 당업계에서 사용되고 있는 표준 3-문자 및/또는 1-문자 코드이다.

"핵산"은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)이다. 이 용어는 단일 가닥 핵산, 이중 가닥 핵산, 및 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유사체로부터 만든 RNA 및 DNA를 포함하기 위해 사용된다.

용어 "벡터"는 제2 핵산 분자를 세포에 수송하는데 사용될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 한 실시양태에서는, 벡터가 이러한 벡터 내로 삽입된 DNA 서열을 클로닝시킬 수 있다. 이 벡터는 적어도 몇몇 숙주 세포에서 핵산 분자의 발현을 향상시키는 프로모터를 포함할 수 있다. 벡터는 자기 클로닝할 수 있거나 (염색체외) 숙주 세포 염색체 내로 통합될 수도 있다. 한 실시양태에서는, 벡터가 이러한 벡터 내로 삽입된 핵산 서열의 적어도 일부로부터 유래된 단백질을 생산할 수 있는 발현 벡터를 포함할 수 있다.

당업계에 공지된 바와 같이, 핵산 서열을 서로 혼성화시키기 위한 조건은 낮은 엄격성 조건 내지 높은 엄격성 조건으로서 기재될 수 있다. 일반적으로, 고도로 엄격한 혼성화 조건은 하이브리드를 고온에서 저염 완충액 중에서 세척시키는 것을 지칭한다. 혼성화는 65℃에서 당업계에서 표준인 혼성화 용액, 예를 들어 0.5 M NaHPO₄, 7％ 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)를 사용하고, 프로브의 길이에 따라서 실온 내지 68℃ 하에 0.25 M NaHPO₄, 3.5％ SDS 중에서의 세척에 이어 0.1×SSC/0.1％ SDS 중에서 세척하여 결합된 DNA를 여과시키는 것일 수 있다. 예를 들어, 고도로 엄격한 세척은 14개 염기 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우에는 37℃에서, 17개 염기 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우에는 48℃에서, 20개 염기 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우에는 55℃에서, 25개 염기 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우에는 60℃에서, 또는 약 250개 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 프로브의 경우에는 65℃에서, 6×SSC/0.05％ 나트륨 피로포스페이트 중에서 세척하는 것을 포함한다. 핵산 프로브는, 예를 들어 [γ-³²P]ATP로 말단 표지시킴으로써 방사뉴클레오티드로 표지시킬 수 있거나, 또는 무작위 프라이머 표지화에 의해 [α-³²P]dCTP 등의 방사성 표지된 뉴클레오티드를 혼입시킴으로써 표지시킬 수 있다. 다르게는, 바이오티닐화 또는 플루오레세인 표지된 뉴클레오티드를 혼입시킴으로써 프로브를 표지시킬 수 있고, 스트렙타비딘 또는 항-플루오레세인 항체를 사용하여 프로브를 검출할 수 있다.

본원에 사용된 "유기 소분자"는 1개 이상의 탄소 원자를 함유하고 분자량이 2,000 달톤 미만인 분자이다.

용어 "융합 단백질"은 2가지 이상의 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 융합 단백질은 별개의 단백질로부터 유래된 아미노산 부분들 간의 아미노산의 연결성 영역을 포함할 수도 있다.

본원에 사용된 "비-RAGE 폴리펩티드"는 RAGE 또는 그의 단편으로부터 유래되지 않은 임의의 폴리펩티드이다. 이러한 비-RAGE 폴리펩티드에는 이뮤노글로불린 펩티드, 이량체화 폴리펩티드, 안정화 폴리펩티드, 양친매성 펩티드, 또는 단백질을 표적화 또는 정제하기 위한 "태그"를 제공해 주는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 포함된다.

본원에 사용된 "이뮤노글로불린 펩티드"는 이뮤노글로불린 중쇄 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 이러한 중쇄의 일부가 Fc 단편 또는 그의 일부일 수 있다. 본원에 사용된 Fc 단편은 중쇄 힌지 (hinge) 폴리펩티드, 및 단량체 또는 이량체 형태의 이뮤노글로불린 중쇄의 C_H2 및 C_H3 도메인을 포함한다. 또한, C_H1 및 Fc 단편이 이뮤노글로불린 폴리펩티드로서 사용될 수도 있다. 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 이소형 중 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), 또는 IgA (α). 또한, 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 아형 중 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2), 또는 생물학적 활성을 변경시키는 이들 이소형 또는 아형의 돌연변이물. 변경시킬 수 있는 생물학적 활성의 예에는, 예를 들어 힌지 영역을 변형시킴으로써, 몇몇 Fc 수용체와 결합할 수 있는 이소형의 능력을 저하시키는 것이 포함된다.

용어 "동일성" 또는 "동일률"은 두 아미노산 서열 간의 서열 동일성 또는 두 핵산 서열 간의 서열 동일성을 지칭한다. 동일률은 두 서열을 정렬시킴으로써 결정될 수 있고, 이는 비교된 서열들이 공유하고 있는 위치에서 동일한 잔기 (즉, 아미노산 또는 뉴클레오티드) 수를 지칭한다. 서열 정렬과 비교는 당업계에서 표준인 알고리즘을 사용하거나 (예를 들면 문헌 [Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482]; [Needleman and Wunsch, 1970, J Mol. Biol. 48:443]; [Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:2444]), 또는 BLAST 및 FASTA로서 공개적으로 입수 가능한, 이들 알고리즘의 컴퓨터 버젼 [Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI]에 의해 수행할 수 있다. 또한, 서열 비교를 위해 ENTREZ [미국 국립 보건원(National Institutes of Health; 미국 메릴랜드주 베데스다 소재)로부터 입수가능함]를 사용할 수도 있다. 한 실시양태에서, 두 서열의 동일률은 두 서열 간에 단일 아미노산 미스매치가 존재하는 것처럼 각 아미노산 갭을 칭량하 도록 하는, 갭 중량 1을 갖는 GCG를 사용하여 결정할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "보존된 잔기"는 동일한 구조 및/또는 기능을 지닌 복수 개의 단백질 중에서 동일한 아미노산을 지칭한다. 보존된 잔기 영역은 단백질 구조 또는 기능 면에서 중요할 수 있다. 따라서, 3차원적 단백질에서 확인된 바와 같은 연속되는 보존된 잔기는 단백질 구조 또는 기능에 중요할 수 있다. 보존된 잔기 또는 보존된 3차원 구조 영역을 밝혀내기 위해, 상이한 종으로부터의 동일하거나 유사한 단백질에 대한 서열을 비교하거나, 또는 동일한 종의 개개 서열을 비교할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "상동체"는 야생형 아미노산 서열과의 소정의 상동성 또는 동일성을 지닌 폴리펩티드를 의미한다. 상동성 비교는 육안으로 수행할 수 있거나, 보다 통상적으로는 용이하게 입수 가능한 서열 비교용 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 이들 시판용 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열들 간의 상동률을 계산할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Wilbur, W. J. and Lipman, D. J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:726-730]). 예를 들어, 상동성 서열에는 또 다른 실시양태들에서 서로 70％ 이상, 75％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 동일한 아미노산 서열이 포함될 수 있다.

본원에 사용된 "이와 90％ 이상 동일한"이라는 용어는 지정된 서열과의 동일성이 90 내지 99.99％ 범위인 서열을 포함하며, 그 사이의 모든 범위를 포함한다. 따라서, "이와 90％ 이상 동일한"이라는 용어는 지정된 서열과 91, 91.5, 92, 92.5, 93, 93.5. 94, 94.5, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99, 99.5％ 동일한 서열을 포함한다. 이와 유사하게, "70％ 이상 동일한"이라는 용어는 70 내지 99.99％의 범위 (그 사이의 모든 범위 포함)로 동일한 서열을 포함한다. 동일률 결정은 본원에 기재된 알고리즘을 사용하여 결정된다.

본원에 사용된 폴리펩티드 또는 단백질 "도메인"은 독립적 단위를 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질에 수반되는 영역을 포함한다. 도메인은 구조, 서열 및/또는 생물학적 활성 측면에서 규정될 수 있다. 한 실시양태에서는, 폴리펩티드 도메인이 실질적으로 나머지 단백질과는 독립적인 방식으로 폴딩되는 단백질 영역을 포함할 수 있다. 도메인은 도메인 데이터베이스, 예를 들어 PFAM, PRODOM, PROSITE, BLOCKS, PRINTS, SBASE, ISREC PROFILES, SAMRT, 및 PROCLASS 등을 사용하여 확인할 수 있다.

본원에 사용된 "이뮤노글로불린 도메인"은 이뮤노글로불린의 도메인과 구조적으로 상동성이거나 동일한 아미노산 서열이다. 이뮤노글로불린 도메인의 아미노산 서열 길이는 어떠한 길이일 수도 있다. 한 실시양태에서는, 이뮤노글로불린 도메인이 250개 미만 아미노산일 수 있다. 예시 실시양태에서는, 이뮤노글로불린 도메인 길이가 약 80 내지 150개 아미노산일 수 있다. 예를 들어, IgG의 가변 영역, 및 C_H1, C_H2, 및 C_H3 영역이 각각 이뮤노글로불린 도메인이다. 또 다른 예에서는, IgM의 가변 영역, 및 C_H1, C_H2, C_H3 및 C_H4영역이 각 이뮤노글로불린 도메인이다.

본원에 사용된 "RAGE 이뮤노글로불린 도메인"은 이뮤노글로불린의 도메인과 구조적으로 상동성이거나 동일한, RAGE 단백질로부터의 아미노산 서열이다. 예를 들어, RAGE 이뮤노글로불린 도메인은 RAGE V-도메인, RAGE Ig-유사 C1-유형 1 도메인 ("C1 도메인"), 또는 RAGE Ig-유사 C2-유형 2 도메인 ("C2 도메인")을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "도메인간 링커"는 2개의 도메인을 함께 연결시켜 주는 폴리펩티드를 포함한다. Fc 힌지 영역이 IgG에서의 도메인간 링커의 한 예이다.

본원에 사용된 "직접적으로 연결"이란 연결되는 2개 군 간에 어떠한 원자도 개재되지 않은 2개의 상이한 군 (예를 들면, 핵산 서열, 폴리펩티드, 폴리펩티드 도메인) 간의 공유적 연결을 의미한다.

본원에 사용된 "리간드 결합 도메인"은 리간드 결합에 책임이 있는 단백질의 도메인을 지칭한다. 용어 리간드 결합 도메인에는 리간드 결합 도메인의 상동체 또는 그의 일부가 포함된다. 이와 관련하여, 리간드 결합 도메인의 결합 특이성이 보존되는 한은, 해당 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성 또는 친수성에서의 유사성에 기초하여 리간드 결합 부위에서 계획적인 아미노산 치환이 이루어질 수 있다.

본원에 사용된 "리간드 결합 부위"는 리간드와 직접적으로 상호작용하는 단백질 내의 잔기, 또는 리간드와 직접적으로 상호작용하는 잔기에 아주 근접하게 리간드를 위치시키는 것에 관여하는 잔기를 포함한다. 이러한 리간드 결합 부위 내에서의 잔기들의 상호작용은 해당 모델 또는 구조 내에서 리간드에 대한 상기 잔기의 공간적 근접성으로써 규정될 수 있다. 용어 리간드 결합 부위에는 리간드 결합 부위의 상동체 또는 그의 일부가 포함된다. 이와 관련하여, 리간드 결합 부위의 결합 특이성이 보존되는 한은, 해당 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성 또는 친수성에서의 유사성에 기초하여 리간드 결합 부위에서 계획적인 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 리간드 결합 부위는 단백질 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 리간드 결합 도메인에 존재할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "상호작용"이란 특정 리간드 또는 화합물, 또는 그의 일부 또는 단편과, 관심있는 제2 분자의 일부 간의 근접한 상태를 지칭한다. 상호작용은, 예를 들어 수소-결합, 반 데르 발스 (van der Waals) 상호작용, 정전기 또는 소수성 상호작용의 결과로서 비-공유적이거나, 또는 공유적일 수 있다.

본원에 사용된 "리간드"는 리간드 결합 부위와 상호작용하는 분자 또는 화합물 또는 실재물 (그의 기질 또는 유사체 또는 일부 포함)을 지칭한다. 본원에 기재된 용어 "리간드"는 관심있는 단백질에 결합하는 화합물을 지칭할 수 있다. 리간드는 효능제, 길항제 또는 조절제일 수 있다. 또는, 리간드는 생물학적 효과를 지니지 않을 수 있다. 또는, 리간드는 다른 리간드의 결합을 차단시킴으로써 생물학적 효과를 억제시킬 수도 있다. 리간드에는 소분자 억제제가 포함될 수 있지만, 이들로 한정되지는 않는다. 이들 소분자에는 펩티드, 펩티드-모방제, 유기 화합물 등이 포함될 수 있다. 리간드에는 폴리펩티드 및/또는 단백질이 포함될 수도 있다.

본원에 사용된 "조절 화합물"은 관심있는 분자의 생물학적 활성을 변화 또는 변경시키는 분자를 지칭한다. 조절 화합물은 관심있는 분자의 활성을 증가 또는 저하시킬 수 있거나, 또는 관심있는 분자의 물리적 또는 화학적 특징, 또는 기능적 또는 면역학적 특성을 변화시킬 수 있다. RAGE의 경우에는, 조절 화합물이 RAGE 또는 그의 일부의 활성을 증가 또는 저하시킬 수 있거나, 또는 RAGE 또는 그의 일부의 특징, 또는 기능적 또는 면역학적 특성을 변화시킬 수 있다. 조절 화합물에는 천연 및/또는 화학적으로 합성되거나 인공적인 펩티드, 변형된 펩티드 (예를 들면, 포스포펩티드), 항체, 탄수화물, 단당류, 올리고당류, 다당류, 당지질, 헤테로사이클릭 화합물, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 또는 그의 일부, 및 유기 또는 무기 소분자가 포함될 수 있다. 조절 화합물은 내인성 생리적 화합물일 수 있거나, 또는 천연 또는 합성 화합물일 수 있다. 또는, 조절 화합물이 유기 소분자일 수 있다. 용어 "조절 화합물"에는 또한, 화학적으로 변형된 리간드 또는 화합물이 포함되고, 이성질체 및 라세미 형태도 포함된다.

"효능제"는 관련된 수용체에 대해 특이적인 약리학적 반응을 유발시키는 복합체를 형성하기 위해 이러한 수용체에 결합하는 화합물을 포함한다.

"길항제"는 실질적인 약리학적 반응을 유발시키지 않는 복합체를 형성하기 위해 효능제 또는 수용체에 결합하고, 효능제에 의해 유도된 생물학적 반응을 억제시킬 수 있는 화합물을 포함한다.

따라서, RAGE 효능제는 RAGE에 결합할 수 있고 RAGE-매개성 세포내 과정을 자극할 수 있으며, RAGE 길항제는 RAGE 효능제에 의해 RAGE-매개성 과정이 자극되는 것을 억제시킬 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는 RAGE 효능제에 의해 자극된 세포성 과정이 TNF-α 유전자 전사 활성화를 포함한다.

용어 "펩티드 모방제"는 분자들 간의 상호작용에서 펩티드에 대한 치환물로 서 제공되는 구축물을 지칭한다 (문헌 [Morgan et al., 1989, Ann. Reports Med. Chem., 24:243-252]). 펩티드 모방제에는 펩티드, 효능제 또는 길항제의 아미노산 및/또는 펩티드 결합은 함유하거나 함유하지 않을 수 있지만, 이러한 펩티드, 효능제 또는 길항제의 구조적 및 기능적 특징을 보유하고 있는 합성 구축물이 포함될 수 있다. 펩티드 모방제에는 또한, 펩토이드, 올리고펩토이드 (문헌 [Simon et al., 1972, Proc. Natl. Acad, Sci., USA, 89:9367]); 및 본 발명의 펩티드, 효능제 또는 길항제에 상응하는 아미노산의 가능한 모든 서열을 나타내는 고안된 길이의 펩티드를 함유하는 펩티드 라이브러리가 포함된다.

용어 "치료하는" 또는 "치료하다"는 질환 또는 질병 증상을 개선시키는 것을 지칭하고, 이는 이러한 질병을 치유하거나, 질병 발병을 실질적으로 예방하거나, 또는 대상체의 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "치료"는 환자를 고통스럽게 하는 소정의 질병에 대한 치료의 모든 범주를 지칭하는데, 이에는 해당 질병로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 특정 질병을 치유하거나, 또는 질병 발병을 예방하는 것이 포함된다.

본원에 사용된 용어 "EC50"은 측정된 생물학적 효과의 50％를 나타내는 제제의 농도로서 규정된다. 예를 들어, 측정 가능한 생물학적 효과를 지닌 치료제의 EC50은 이러한 치료제가 생물학적 효과의 50％를 나타내는 값을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "IC50"은 측정된 효과의 50％ 억제를 나타내는 제제의 농도로서 규정된다. 예를 들어, RAGE 결합 길항제의 IC50은 이러한 길항제가 RAGE의 리간드 결합 부위에 대한 리간드 결합을 50％ 정도 저하시키는 값을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "유효량"은 목적하는 효과를 대상체에서 생성하는데 효과적인 제제의 양을 의미한다. 용어 "치료상 유효량"은 동물 또는 인간에서 목적하는 치료적 반응을 나타내는 약물 또는 약제의 양을 의미한다. 유효량을 포함하는 실제 투여량은 투여 방식, 대상체의 크기와 건강 상태, 치료하고자 하는 질병 등에 따라서 달라질 수 있다.

본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 인간 또는 동물 대상체에서 사용하기 적합한 화합물 및 조성물, 예를 들어 RAGE-매개성 질병 또는 질환을 치료하기 위해 투여되는 치료적 조성물을 지칭할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "제약 조성물"은 통상적인 비독성 담체, 희석제, 아주반트, 비히클 등을 함유하는 단위 투여 제제로 포유동물 숙주에게, 예를 들어 경구, 비경구, 국소, 흡입 분무, 비내 또는 직장 투여할 수 있는 조성물을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "비경구"에는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 뇌조내 (intracisternal) 주사, 또는 주입 기술이 포함된다.

본원에 사용된 "거부반응"은 세포, 조직 또는 기관의 파괴를 초래하거나 또는 세포, 조직 또는 기관에 대한 손상을 나타내는 조직 상의 면역 또는 염증 반응을 지칭한다. 거부된 세포, 조직 또는 기관은 거부 반응이 발생한 동일한 대상체로부터 유래된 것일 수 있거나, 또는 상이한 대상체로부터 거부반응을 나타내는 대상체로 이식될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "세포"는 각각 독립적인 생체계를 포함하는 포유동물 생 체계의 구조적 및 기능적 단위를 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 세포는 핵, 세포질, 세포내 소기관, 및 세포 주위를 막아 다른 세포와 구분되도록 하는 세포벽을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "조직"은 유사한 구조 및 기능을 갖거나, 또한 함께 작용하여 특정 기능을 수행하는 세포들의 집단을 지칭한다. 조직은 유사한 세포의 집합체 및 세포 주변의 세포간 물질을 포함할 수 있다. 조직은 근육 조직, 신경 조직 및 뼈를 포함하나 이들로 한정되지는 않는다.

본원에 사용된 "기관"은 일부 특정 기능에 대해 특수화된, 동물에서 완전하게 분화된 구조적 및 기능적 단위를 지칭한다. 기관은 특정 기능 또는 여러 기능을 수행하는 조직의 집단을 포함할 수 있다. 기관은 심장, 폐, 뇌, 눈, 위, 비장, 췌장, 신장, 간, 장, 피부, 자궁, 방광 및 뼈를 포함하나 이들로 한정되지는 않는다.

"안정적인" 제제는 그 중의 RAGE 융합 단백질이 저장 중에도 본질적인 그의 물리적 및 화학적 안정성 및 생물학적 활성을 유지하는 것이다. 단백질의 안정성을 측정하는 다양한 분석 기술이 당업계에서 입수가능하고, 문헌[Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)] 및 [Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에서 그것이 검토되고 있다. 안정성은 정해진 온도에서 정해진 시간동안 측정될 수 있다. 빠른 스크리닝을 위해, 제제는 1주일 내지 1달 동안 40℃에서 두어, 시간 안정성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 동결건조 및 저장 후의 응집의 정 도가 RAGE 융합 단백질 안정성 (본원의 실시예 참조)의 척도로 사용될 수 있다. 예를 들어, "안정적인" 제제는 약 10% 미만 및 바람직하게는 약 5% 미만의 RAGE 융합 단백질이 제제 중에 응집물로 존재하는 것일 수 있는 것이다. 다른 실시양태에서, 동결건조된 제제의 동결건조 및 저장 후의 응집물 형성의 증가가 측정될 수 있다. 예를 들어, "안정적인" 동결건조된 제제는, 동결건조된 제제를 40℃에서 1주일 이상동안 인큐베이션할 때, 동결건조된 제제 중 응집물이 약 5% 미만 또는 약 3% 미만 증가하는 것일 수 있다. 다른 실시양태에서, RAGE 융합 단백질 제제의 안정성은 본원에 기술된 결합 분석과 같은 생물학적 활성 분석을 사용하여 측정될 수 있다.

"재구성된" 제제는 희석제 중에 동결건조된 RAGE 융합 단백질 제제를 용해하여 RAGE 융합 단백질을 분산시키고/시키거나 재구성된 제제에 용해시켜 제조한 것이다. 재구성된 제제는 융합 단백질로 치료할 환자에게 투여 (예를 들어, 비경구 투여)하기에 적합할 수 있고, 본 발명의 특정 실시양태에서, 피하 투여에 적합한 것일 수 있다.

"등장성"은 관심이 있는 제제가 약 240 내지 약 340 mOsm/kg의 삼투압을 갖는다는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 등장성 제제는 인간 혈액 (285-310 mOsm/kg)과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는 것이다. 등장성은 증기압 또는 어는점 내림형 삼투압계를 사용하여 측정될 수 있다.

"동결건조 보호제"는 RAGE 융합 단백질과 혼용될 때, 동결건조 및 후속적인 저장 중 단백질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 상당히 예방 또는 감소시키는 분자이다. 예시적인 동결건조 보호제는 당, 예를 들어 수크로즈 또는 트레할로스; 당알코올과 같은 폴리올, 예를 들어 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 및 만니톨; 또는 이의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, 동결건조 보호제는 당을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 동결건조 보호제는 비환원성 당을 포함할 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 동결건조 보호제는 수크로즈와 같은 비환원성 당을 포함할 수 있다. 동결건조 보호제는 "동결건조 보호량"으로 예비-동결건조된 제제에 첨가될 수 있는데, 이는 동결건조 보호량의 동결건조 보호제의 존재 하에 단백질을 동결건조 후, RAGE 융합 단백질이 본질적인 그의 물리적 및 화학적 안정성 및 생물학적 활성을 동결건조 및 저장 중에 유지하는 것을 의미한다.

본원에서 동결건조된 제제에 대한 "희석제"는 제약상 허용가능하고 (인간에게 투여하는데 있어 안전하고 비독성임), 재구성된 제제의 제조에 있어서 유용한 것이다. 예시적인 희석제는 멸균수, 정균성 주사용수 (BWFI), pH 완충액 (예를 들어, 인산염 완충 염수), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 한 실시양태에서, 희석제는 주사에 적합한 재구성된 제제를 제공한다. 다른 실시양태에서, 희석제가 주사에 적합한 재구성된 제제를 제공하는 경우, 상기 희석제는 주사용수 (WFI)를 포함할 수 있다.

재구성된 제제에 대한 "방부제"는 재구성된 제제에서의 박테리아의 활동을 본질적으로 감소시키기 위해 희석제 또는 재구성된 제제에 첨가될 수 있는 화합물이다. 한 실시양태에서, 방부제의 양은 다용도의 재구성된 제제의 생성을 용이하게 하는데 유용한 양으로 첨가될 수 있다. 가능한 방부제의 예는 옥타데실디메틸 벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 벤즈에토늄 클로라이드를 포함한다. 기타 방부제 유형은 방향족 알코올, 예를 들어 페놀, 부틸 및 벤질 알코올, 알릴 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올, 및 m-크레졸을 포함한다.

동결건조된 제제에 대한 "증량제"는 동결건조된 혼합물에 질량을 더하고 동결건조된 케이크의 물리적 구조에 기여하는 (예를 들어 개공 구조를 유지하는 본질적으로 균일한 동결건조된 케이크의 생성을 용이하게 하는) 화합물이다. 예시적인 증량제는 만니톨, 글리신, 및 조르비톨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

RAGE 융합 단백질

본 발명의 한 실시양태는 RAGE 융합 단백질, 이러한 융합 단백질의 제조 방법, 및 상기 융합 단백질의 사용 방법을 포함한다. 본 발명은 다양한 방식으로 실시될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 한 실시양태는 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 RAGE 융합 단백질을 제공한다. 한 실시양태에서는, RAGE 융합 단백질이 RAGE 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 리간드 결합 부위가 RAGE 융합 단백질의 가장 N-말단 도메인을 포함한다. RAGE 리간드 결합 부위는 RAGE의 V 도메인, 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, RAGE 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 서열 10 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 서열 47 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함한다 (도 1).

한 실시양태에서, RAGE 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 도메인 또는 이뮤노글로불린 도메인의 일부 (예를 들면, 그의 단편)을 포함하는 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 한 실시양태에서는, 이뮤노글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 적어도 인간 IgG의 C_H2 도메인 또는 C_H3 도메인 중의 하나 이상의 일부를 포함한다.

특정 실시양태에서, RAGE 융합 단백질은 서열 56 또는 서열 57로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함한다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 서열 56 또는 서열 57과 90% 이상 동일한 서열은 C-말단 리신을 수반하지 않은 서열 56 또는 서열 57의 서열을 포함한다.

RAGE 단백질 또는 폴리펩티드는 전장 인간 RAGE 단백질 (예를 들면, 서열 1), 또는 인간 RAGE의 단편을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 RAGE 폴리펩티드의 단편은 길이가 아미노산 5개 이상이고, 아미노산 30개를 초과하는 길이일 수도 있지만, 완전한 아미노산 서열 보다는 작다. 본 발명의 융합 단백질, 방법 및 조성물의 또 다른 실시양태에서, RAGE 폴리펩티드는 인간 RAGE 또는 그의 단편과 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96%, 97％, 98％ 또는 99％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 한 실시양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 인간 RAGE 또는 그의 단편을 포함할 수 있으며, 제1 잔기로서 메티오닌이 아닌 글리신을 갖는다 (예를 들어, [Neeper et al, (1992)]). 또는, 인간 RAGE가 신호 서열이 제거된 전 장 RAGE (예를 들어, 서열 2 또는 서열 3) (도 1A 및 1B) 또는 이러한 아미노산 서열의 일부를 포함할 수 있다.

본 발명의 RAGE 융합 단백질은 또한, sRAGE (예를 들면, 서열 4), sRAGE와 90％ 이상 동일한 폴리펩티드, 또는 sRAGE의 단편을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 sRAGE는 막횡단 영역 또는 세포질 꼬리 부분을 포함하지 않는 RAGE 단백질이다 (문헌 [Park et al., Nature Med., 4:1025-1031 (1998)]). 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 인간 sRAGE 또는 그의 단편을 포함할 수 있으며, 제1 잔기로서 메티오닌이 아닌 글리신을 갖는다 (예를 들어, [Neeper et al, (1992)]). 또는, RAGE 폴리펩티드는 신호 서열이 제거된 인간 sRAGE (예를 들어, 도 1C의 서열 5 또는 서열 6, 또는 도 1의 서열 45) 또는 이러한 아미노산 서열의 일부를 포함할 수 있다.

다른 실시양태에서, RAGE 단백질은 RAGE V 도메인 (예를 들면, 도 1의 서열 7, 서열 8 또는 서열 46 [Neeper et al., (1992); Schmidt et al. (1997)])을 포함할 수 있다. 또는, RAGE V 도메인 또는 그의 단편과 90％ 이상 동일한 서열을 사용할 수도 있다.

또는, RAGE 단백질은 RAGE V 도메인의 단편 (예를 들면, 도 1의 서열 9, 서열 10, 또는 서열 47)을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, RAGE 단백질이 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 이러한 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 서열 10 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 서열 47 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, RAGE 단편이 합성 펩티드이다.

다른 실시양태에서, 리간드 결합 부위는 서열 1의 아미노산 23 내지 53을 포함할 수 있다 (도 1). 다른 실시양태에서, 리간드 결합 부위는 서열 1의 아미노산 24 내지 52를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 리간드 결합 부위는 서열 1의 아미노산 31 내지 52를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 리간드 결합 부위는 서열 1의 아미노산 31 내지 116을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 리간드 결합 부위는 서열 1의 아미노산 19 내지 52을 포함할 수 있다. 예를 들어, 리간드 결합 부위는 RAGE V 도메인 또는 그의 부분, 예를 들어 RAGE 리간드 결합 도메인 (예를 들어, 서열 1의 아미노산 1 내지 118, 23 내지 118, 24 내지 118, 31 내지 118, 1 내지 116, 23 내지 116, 24 내지 116, 31 내지 116, 1 내지 54, 23 내지 54, 24 내지 54, 31 내지 54, 1 내지 53, 23 내지 53, 24 내지 53, 또는 31 내지 53, 또는 그의 단편)을 포함할 수 있다. 또는, 기능적으로 RAGE 리간드를 연결하는 폴리펩티드의 단편을 사용할 수 있다. 또는, RAGE V 도메인과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열 또는 그의 단편 (예를 들어, 상술한 바와 같음)을 사용할 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 바와 같이, 융합 단백질의 N-말단이 글루타민인 실시양태에서, 예를 들어 서열 1의 잔기 1 내지 23을 포함하는 신호 서열 (예를 들어, 폴리펩티드를 위한 Q24는 서열 1의 아미노산 24 내지 118을 포함함)을 제거할 때, 글루타민은 고리화되어 피로글루탐산 (pE)을 형성할 수 있다.

따라서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질에 사용된 RAGE 폴리펩티드는 전장 RAGE의 단편을 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, RAGE는 3가지 이뮤노글로 불린-유사 폴리펩티드 도메인, 즉 V 도메인과, 도메인간 링커에 의해 각각 서로 연결된 C1 및 C2 도메인을 포함한다. 전장 RAGE는 또한, 막횡단 폴리펩티드 및 C2 도메인의 하류의 C2 도메인에 연결된 세포질 꼬리 (C-말단)을 포함한다.

한 실시양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 어떠한 신호 서열 잔기도 포함하지 않는다. RAGE의 신호 서열은 전장 RAGE의 잔기 1 내지 22 또는 잔기 1 내지 23을 포함할 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 바와 같이, 융합 단백질의 N-말단이 글루타민인 실시양태 (예를 들면, 신호 서열이 잔기 1 내지 23을 포함함)에서는, N-말단 글루타민 (Q24)이 고리화되어 피로글루탐산 (pE)을 형성할 수 있다. 이러한 분자 구축물의 예로는 서열 45, 46, 47, 48, 49, 50 및 51로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 뿐만 아니라 서열 56 및 57로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 RAGE 융합 단백질이 있다 (도 4).

당업계에 인식되어 있는 바와 같이, 본 발명의 RAGE 융합 단백질의 C_H3 영역은 특정 재조합 시스템에서 발현시킬 때 번역후 변형을 통해 절단되는 C-말단 아미노산을 가질 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Li, et al., BioProcessing J., 2005;4, 23-30] 참조). 한 실시양태에서, 절단된 C-말단 아미노산은 리신 (K)이다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 C-말단 리신(K)을 수반하지 않은 서열 32 내지 37, 56 및 57로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

따라서, 다양한 실시양태에서, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인에 상응하 는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 116 (서열 7) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 116 (서열 8) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 Q24가 고리화되어 pE를 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 116 (서열 46) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또는, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 C1 도메인에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 124 내지 221 (서열 11) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 C2 도메인에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 227 내지 317 (서열 12) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또는, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인 및 하류 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 123 (서열 13) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 123 (서열 14) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또는, RAGE 폴리펩티드는 Q24가 고리화되어 pE를 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 123 (서열 48) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또는, RAGE 폴리펩티드는 V-도메인, C1 도메인 및 이들 2개 도메인을 연결하는 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 226 (서열 17) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 226 (서열 18) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또는, RAGE 폴리펩티드는 Q24가 고리화되어 pE를 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 226 (서열 50) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또는, RAGE 폴리펩티드는 sRAGE에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 339 (서열 5) 또는 이와 90％ 이 상 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 339 (서열 6) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열 (즉, V, C1 및 C2 도메인, 및 도메인간 링커를 코딩함)을 포함할 수 있다. 또는, RAGE 폴리펩티드는 Q24가 고리화되어 pE를 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 339 (서열 45) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또는, 이들 서열의 각각의 단편이 사용될 수 있다. 이들 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해서는 도 1을 참조한다.

RAGE 융합 단백질에는 RAGE 또는 그의 단편으로부터 유래되지 않은 몇 가지 유형의 펩티드가 포함될 수 있다. RAGE 융합 단백질의 제2 폴리펩티드는 이뮤노글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 이뮤노글로불린 폴리펩티드가 이뮤노글로불린 중쇄 또는 그의 일부 (즉, 단편)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 단편은 이뮤노글로불린의 Fc 단편으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함할 수 있는데, 이러한 Fc 단편은 중쇄 힌지 폴리펩티드, 및 단량체로서의 이뮤노글로불린 중쇄의 C_H2 및 C_H3 도메인을 포함한다. 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 이소형 중 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), 또는 IgA (α). 또한, 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 아형 중 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2), 또는 생물학적 활성을 변경시키는 이들 이소형 또는 아형의 돌연변이물. 제2 폴리펩티드는 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인, 또는 이들 도메인 중의 어느 하나, 또는 둘 다의 일부를 포함할 수 있다. 예시 실시양태로서, 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 서열 40 (도 1) 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 일부는 서열 38 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 이뮤노글로불린 펩티드는 서열 39 또는 서열 41의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다 (도 1). 서열 38 또는 서열 40의 이뮤노글로불린 서열은 또한 서열 52 또는 서열 53에 의해 코딩될 수 있으며, 여기서 상기 서열의 C-말단에서 프롤린 (CCG 내지 CCC) 및 글리신 (GGT 내지 GGG)를 코딩하는 코돈에 대한 사일런트 염기 변화가 종결 코돈 부위의 크립틱 (cryptic) RNA 스플라이스 부위를 제거한다 (즉, 서열 39의 뉴클레오티드 622-627은 서열 52를 생성하기 위해 변형되거나 또는 서열 41의 뉴클레오티드 652-657은 서열 53을 생성하기 위해 변형됨).

이뮤노글로불린 쇄의 Fc 부분은 생체 내에서 전염증성일 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서는, 본 발명의 RAGE 융합 단백질이 이뮤노글로불린으로부터 유래된 도메인간 힌지 폴리펩티드가 아니라, RAGE로부터 유래된 도메인간 링커를 포함한다.

따라서, 특정 실시양태에서는, RAGE 융합 단백질이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인, 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 단편 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, C_H2 도메인 또는 그의 단편이 서열 42를 포함한다 (도 1). 한 실시양태에서는, 서열 42의 단편이 Fc 힌지 영역의 일부를 적어도 포함하는 처음 10개의 아미노산이 제거된 서열 42를 포함한다. 한 실시양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 이러한 RAGE 리간드 결합 부위는 RAGE의 V 도메인, 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, RAGE 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 서열 10 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 서열 47 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함한다.

본 발명의 RAGE 융합 단백질에 사용된 RAGE 폴리펩티드는 RAGE 이뮤노글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 부가적으로 또는 다르게는, RAGE의 단편은 도메인간 링커를 포함할 수 있다. 또는, RAGE 폴리펩티드는 상류 (즉, N-말단에 더 가까움) 또는 하류 (즉, C-말단에 더 가까움) 도메인간 링커에 연결된 RAGE 이뮤노글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 2개 (이상)의 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 (이들 각각은 서로 도메인간 링커에 의해 연결된다)을 포함할 수 있다. RAGE 폴리펩티드는 서로 1개 이상의 도메인간 링커에 의해 연결되고 N-말단 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및/또는 C-말단 이뮤노글로불린 도메인에 부착된 말단 도메인간 링커를 갖는 다수의 RAGE 이뮤노글로불린 도메인을 추가로 포함할 수 있다. RAGE 이뮤노글로불린 도메인과 도메인간 링커의 다른 조합 역시 본 발명의 범위 내에 속한다.

한 실시양태에서, RAGE 폴리펩티드는 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, RAGE 이뮤노글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함한다. 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인, 또는 이들 도메인 중의 어느 하나, 또는 둘 다의 일부를 포함할 수 있다. 예시 실시양태로서, 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 서열 40 또는 그 일부를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 서열 38 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 또는, 인간 IgG1은 말단 리신 (K)이 제거된 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다.

상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 RAGE로부터의 단일 또는 다중 도메인을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 폴리펩티드 도메인에 연결된 도메인간 링커를 포함하는 RAGE 폴리펩티드는 전장 RAGE 단백질의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인 및 하류 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 136 (서열 15) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 136 (서열 16) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 Q24가 고리화되어 pE를 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 136 (서열 49) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또는, RAGE 폴리펩티드는 V 도메인, C1 도메인, 이들 두 도메인을 연결시켜 주는 도메인간 링커, 및 C1의 하류의 제2의 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 251 (서열 19) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 251 (서열 20) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 Q24가 고리화되어 pE를 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 251 (서열 51) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, 한 실시양태에서는, RAGE 융합 단백질이 RAGE 단백질로부터 유래된 2개의 이뮤노글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 이뮤노글로불린 도메인을 포함할 수 있다. RAGE 융합 단백질은 제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 C_H2 이뮤노글로불린 도메인의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제1 RAGE 도메인간 링커를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 4개 도메인 RAGE 융합 단백질은 서열 30 또는 서열 54 (도 2)에 의해 코딩된다. 한 실시양태에서는, 4개 도메인 RAGE 융합 단백질이 서열 32 (도 4)를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 4개 도메인 RAGE 융합 단백질이 서열 33, 서열 34 또는 서열 56 (도 4)을 포함한다.

다르게는, 3개 도메인 RAGE 융합 단백질은 RAGE로부터 유래된 1개의 이뮤노글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 이뮤노글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 융합 단백질은 RAGE 도메인간 링커를 통하여 C_H2 이뮤노글로불린 도메인 또는 C_H2 이뮤노글로불린 도메인의 일부의 N-말단 아미노산에 연결된 단일 RAGE 이뮤노글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 3개의 도메인 RAGE 융합 단백질은 서열 31 또는 서열 55 (도 3)에 의해 코딩된다. 한 실시양태에서는, 3개 도메인 RAGE 융합 단백질이 서열 35 (도 5)를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 3개 도메인 RAGE 융합 단백질이 서열 36, 서열 37 또는 서열 57 (도 5)을 포함할 수 있다.

RAGE 도메인간 링커 단편은 본래 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 하류에 위치하여, RAGE 이뮤노글로불린 도메인에 연결되는 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE V 도메인의 경우에는, 도메인간 링커가 이러한 V 도메인으로부터 본래 하류에 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 상기 링커가 전장 RAGE의 아미노산 117 내지 123에 상응하는 서열 21을 포함할 수 있다. 또는, 상기 링커는 천연 RAGE 서열의 부가 부분을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 21의 상류 및 하류에 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산)을 포함하는 도메인간 링커를 사용할 수도 있다. 따라서, 한 실시양태에서는 도메인간 링커가 전장 RAGE의 아미노산 117 내지 136을 포함하는 서열 23을 포함한다. 또는, 상기 링커 의 어느 한 말단으로부터, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산을 결실시킨 서열 21의 단편을 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 상기 링커가 서열 21 또는 서열 23과 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상 동일한 펩티드를 포함할 수 있다.

RAGE C1 도메인의 경우에는, 상기 링커가 본래 C1 도메인의 하류에 있는 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 상기 링커가 전장 RAGE의 아미노산 222 내지 251에 상응하는 서열 22를 포함할 수 있다. 또는, 상기 링커는 천연 RAGE 서열의 부가 부분을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 22의 상류 및 하류에 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산)을 포함하는 링커를 사용할 수도 있다. 또는, 상기 링커의 어느 한 말단으로부터, 예를 들어 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산을 결실시킨 서열 22의 단편을 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는 RAGE 도메인간 링커가 아미노산 222 내지 226에 상응하는 서열 24를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 링커가 서열 22 또는 서열 24과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 펩티드를 포함할 수 있다.

또는, 도메인간 링커는 RAGE 아미노산 318 내지 342에 상응하는 서열 44를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 링커가 서열 44과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 펩티드를 포함할 수 있다.

또한, 당업자라면 코딩된 서열에서 하나의 아미노산 또는 적은 비율의 아미 노산 (통상적으로는 약 5％ 미만, 보다 통상적으로는 약 1％ 미만)을 변형, 추가 또는 결실시키는 개별 치환, 결실 또는 추가가 이러한 변형이 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 보존적으로 변형되는 변화임을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 공지되어 있다. 다음과 같은 예시는 각각 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:

1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T);

2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);

3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);

4) 아르기닌 (R), 리신 (K);

5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 및

6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W).

보존적 치환은 치환 아미노산 (자연적으로 일어나거나 변형됨)이 치환될 아미노산과 구조적으로 관련이 있는 치환으로, 즉 아미노산은 치환될 아미노산과 대략 동일한 크기 및 전자 특성을 갖는다. 따라서, 치환 아미노산은 측쇄에 본래 아미노산과 동일하거나 유사한 관능기를 가질 것이다. "보존적 치환"은 또한 측쇄에 존재하는 관능기가 적합한 보호기로 보호되는 것을 제외하고는 치환될 아미노산과 동일한 치환 아미노산을 사용하는 것을 지칭한다.

당업계에 공지된 바와 같이, 아미노산은 효소적 또는 비-효소적 반응 메카니즘에 의해 이들의 본래 구조가 화학적으로 변형될 수 있을 것이다. 예를 들면, 한 실시양태에서, N-말단 글루탐산 또는 글루타민이 고리화되어 물이 손실되면서 피로 글루탐산 (피로E 또는 pE)을 형성한다 (문헌 [Chelius et al., Anal. Chem, 78: 2370-2376 (2006)] 및 [Burstein et al., Proc. National Acad. Sci., 73:2604-2608 (1976)]). 다르게는, 번역후 공정을 통해 N-말단이 되는 단백질 (예를 들어, 서열 1의 잔기 24가 글루타민이 아니라 글루타메이트인 경우) 중 위치에서 글루탐산을 위한 핵산 서열 인코딩을 통해 잠재적으로 N-말단 피로글루탐산을 갖는 융합 단백질에 접근할 수 있다.

RAGE 융합 단백질의 생성 방법

본 발명은 또한, RAGE 융합 단백질의 제조 방법을 포함한다. 따라서 한 실시양태에서는, 본 발명이 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 연결되는 RAGE 폴리펩티드를 공유결합으로 연결시키는 단계 (여기서, RAGE 폴리펩티드는 RAGE 리간드 결합 부위를 포함한다)를 포함하는, RAGE 융합 단백질을 제조하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 연결된 RAGE 폴리펩티드와 제2의 비-RAGE 폴리펩티드는 재조합 DNA 구축물에 의해 코딩될 수 있다. 상기 방법은 이러한 DNA 구축물을 발현 벡터 내로 혼입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 이러한 발현 벡터를 숙주 세포 내로 삽입하는 단계를 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 실시양태는 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 RAGE 융합 단백질을 제공한다. 한 실시양태에서는, RAGE 융합 단백질이 RAGE 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 리간드 결합 부위가 RAGE 융합 단백질의 가장 N-말단 도메인을 포함한다. RAGE 리간드 결합 부위는 RAGE의 V 도메인, 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 한 실시양태 에서는, RAGE 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 서열 47 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, RAGE 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 도메인 또는 이뮤노글로불린 도메인의 일부 (예를 들면, 그의 단편)를 포함하는 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 한 실시양태에서는, 이뮤노글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 인간 IgG의 C_H2 도메인 또는 C_H3 도메인 중의 하나 이상의 일부를 포함한다.

따라서, 본 발명의 실시양태는 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 코딩하는 단리된 DNA 분자를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 분자는 서열 56 또는 서열 57로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 RAGE 융합 단백질에 대해 코딩한다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 서열 56 또는 서열 57과 90% 이상 동일한 서열은 C-말단 리신을 수반하지 않은 서열 56 또는 서열 57의 서열을 포함한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 54 또는 서열 55로 나타낸 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 갖는 DNA 분자를 포함할 수 있다.

RAGE 융합 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 공학적으로 처리할 수 있다. 예를 들어 한 실시양태에서는, 본 발명이 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 연결된 RAGE 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이에 상보적이거나 또는 이와 상당한 동일성을 갖는 단리된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양 태에서는, RAGE 폴리펩티드가 RAGE 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다.

RAGE 단백질 또는 폴리펩티드는 전장 인간 RAGE (예를 들면, 서열 1), 또는 인간 RAGE의 단편을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 어떠한 신호 서열 잔기도 포함하지 않는다. RAGE의 신호 서열은 전장 RAGE (서열 1)의 잔기 1 내지 22 또는 잔기 1 내지 23을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, RAGE 폴리펩티드는 인간 RAGE 또는 그의 단편과 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96%, 97％, 98％ 또는 99％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 한 실시양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 인간 RAGE 또는 그의 단편을 포함할 수 있으며, 제1 잔기로서 메티오닌이 아닌 글리신을 갖는다 (예를 들어, [Neeper et al, (1992)] 참조). 또는, 인간 RAGE는 신호 서열이 제거된 전장 RAGE (예를 들어, 서열 2 또는 서열 3) (도 1A 및 1B) 또는 이러한 아미노산 서열의 일부를 포함할 수 있다. 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 또한, sRAGE (예를 들면, 서열 4), sRAGE와 90％ 이상 동일한 폴리펩티드, 또는 sRAGE의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 인간 sRAGE 또는 그의 단편을 포함할 수 있으며, 제1 잔기로서 메티오닌이 아닌 글리신을 갖는다 (예를 들어, [Neeper et al, (1992)] 참조). 또는, 인간 RAGE는 신호 서열이 제거된 sRAGE (예를 들어, 도 1C의 서열 5, 서열 6, 서열 45 참조) 또는 이러한 아미노산 서열의 일부를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, RAGE 단백질은 V 도메인 (예를 들면, 도 1의 서열 7, 서열 8, 서열 46)을 포함할 수 있다. 또는, V 도메인 또는 그의 단편과 90％ 이상 동일한 서열을 사용할 수도 있다. 또는, RAGE 단백질은 V 도메인의 일부를 포함하는 RAGE의 단편 (예 를 들면, 도 1의 서열 9, 서열 10, 또는 서열 47 참조)을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 서열 47 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, RAGE 단편이 합성 펩티드이다.

한 실시양태에서는, 핵산 서열이 인간 RAGE의 아미노산 1 내지 118 또는 그의 단편을 코딩하기 위한 서열 25를 포함한다. 예를 들어, 서열 25의 뉴클레오티드 1 내지 348을 포함하는 서열을 사용하여 인간 RAGE의 아미노산 1 내지 116을 코딩할 수 있다. 또는, 핵산은 인간 RAGE의 아미노산 1 내지 123을 코딩하기 위한 서열 26을 포함할 수 있다. 또는, 핵산은 인간 RAGE의 아미노산 1 내지 136을 코딩하기 위한 서열 27을 포함할 수 있다. 또는, 핵산은 인간 RAGE의 아미노산 1 내지 230을 코딩하기 위한 서열 28을 포함할 수 있다. 또는, 핵산은 인간 RAGE의 아미노산 1 내지 251을 코딩하기 위한 서열 29를 포함할 수 있다. 또는, 이들 핵산 서열의 단편을 사용하여 RAGE 폴리펩티드 단편을 코딩할 수 있다.

RAGE 융합 단백질에는 RAGE 또는 그의 단편으로부터 유래되지 않은 몇 가지 유형의 펩티드가 포함될 수 있다. RAGE 융합 단백질의 제2 폴리펩티드는 이뮤노글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 이소형 중 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε) 또는 IgA (α). 또한, 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 아형 중 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG1 (γ1), IgG2 (γ 2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2), 또는 생물학적 활성을 변경시키는 이들 이소형 또는 아형의 돌연변이물. 제2 폴리펩티드는 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인, 또는 이들 도메인 중의 어느 하나, 또는 둘 다의 일부를 포함할 수 있다. 예시 실시양태로서, 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다. 이뮤노글로불린 펩티드는 서열 39 또는 서열 41의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 다른 실시양태에서, 서열 38 또는 서열 40의 이뮤노글로불린 서열은 또한 각각 서열 52 또는 서열 53에 의해 코딩될 수 있다.

이뮤노글로불린 쇄의 Fc 부분의 힌지 영역은 생체 내에서 전염증성일 수 있다. 따라서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 이뮤노글로불린으로부터 유래된 도메인간 힌지 폴리펩티드가 아닌 RAGE로부터 유래된 도메인간 링커를 포함할 수 있다.

따라서 한 실시양태에서, 본 발명은 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 RAGE 폴리펩티드를 공유결합으로 연결시키는 단계를 포함하는, RAGE 융합 단백질을 제조하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서는, RAGE 융합 단백질이 RAGE 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 이러한 RAGE 리간드 결합 부위는 RAGE의 V 도메인, 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, RAGE 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 서열 47 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, RAGE 융합 단백질은 재조합 DNA 구축물에 의해 코딩될 수 있다. 상기 방법은 DNA 구축물을 발현 벡터 내로 혼입하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 발현 벡터를 숙주 세포 내로 형질감염시키는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시양태는 또한 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자를 코딩하는 발현 벡터를 포함한다. 특정 실시양태에서, DNA 분자는 서열 56 또는 서열 57로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 RAGE 융합 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 서열 56 또는 서열 57과 90% 이상 동일한 서열은 C-말단 리신을 수반하지 않은 서열 56 또는 서열 57의 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 또한 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자를 코딩하는 발현 벡터로 형질감염시킨 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, DNA 분자는 서열 56 또는 서열 57로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 RAGE 융합 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 서열 56 또는 서열 57과 90% 이상 동일한 서열은 C-말단 리신을 수반하지 않은 서열 56 또는 서열 57의 서열을 포함한다.

예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명은 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인, 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 한 실시양태에서, C_H2 도메인, 또는 그의 단편은 서열 42를 포함한다. 한 실시양태에서, 서열 42의 단편은 처음 10개의 아미노산을 제거한 서열 42를 포함한다. 제2 폴리펩티드는 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태로, 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 서열 38 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 이뮤노글로불린 펩티드는 서열 39 또는 서열 41의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 서열 38 또는 서열 40 중 이뮤노글로불린 서열은 또한 서열 52 또는 서열 53에 의해 코딩될 수 있는데, 여기서 상기 서열의 C-말단에서 프롤린 (CCG 내지 CCC) 및 글리신 (GGT 내지 GGG)를 코딩하는 코돈에 대한 사일런트 염기 변화가 종결 코돈 부위의 크립틱 RNA 스플라이스 부위를 제거한다 (즉, 서열 39의 뉴클레오티드 622 내지 627은 서열 52를 생성하기 위해 변형되거나 또는 서열 41의 뉴클레오티드 652-657은 서열 53을 생성하기 위해 변형됨).

한 실시양태에서, RAGE 폴리펩티드는 RAGE 이뮤노글로불린 도메인과 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함하여 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인, 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N- 말단 아미노산에 직접적으로 연결될 수 있다. 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인 또는 상기 도메인 중 하나 또는 둘 모두의 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태로, 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 일부는 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 일부는 서열 38 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 C-말단 리신 (K)이 제거된 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다.

본 발명의 RAGE 융합 단백질은 RAGE로부터의 단일 또는 다중 도메인을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 이뮤노글로불린 도메인에 연결된 도메인간 링커를 포함하는 RAGE 폴리펩티드는 전장 RAGE 단백질의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, RAGE 융합 단백질은 RAGE 단백질로부터 유래된 2개의 이뮤노글로불린 도메인 및 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 이뮤노글로불린 도메인을 포함할 수 있다. RAGE 융합 단백질은 제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C- 말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 C_H2 이뮤노글로불린 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제1 RAGE 도메인간 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 V-도메인, C1 도메인, 상기 2개의 도메인을 연결하는 도메인간 링커, 및 C1의 하류의 제2 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23-251 (서열 19) 또는 그와 90% 이상 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24-251 (서열 20) 또는 그와 90% 이상 동일한 서열, 또는 Q24를 고리화하여 pE를 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24-251 (서열 51) 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 서열 30 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 구조물은 네개의 도메인 RAGE 융합 단백질 (도 2A)을 코딩할 수 있다. 다른 실시양태에서, 서열 54 (도 2B)를 포함하는 핵산 구조물은 네개의 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩할 수 있는데, 여기서 상기 서열의 C-말단에서 프롤린 (CCG 내지 CCC) 및 글리신 (GGT 내지 GGG)를 코딩하는 코돈에 대한 사일런트 염기 변화가 종결 코돈 부위의 크립틱 RNA 스플라이스 부위를 제거한다 (즉, 서열 30의 뉴클레오티드 1375-1380이 변형되어 서열 54를 생성함).

다르게는, 3개 도메인 RAGE 융합 단백질은 RAGE로부터 유래된 1개의 이뮤노글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 이뮤노글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 융합 단백질은 RAGE 도메인간 링커를 통하 여 C_H2 이뮤노글로불린 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 연결된 단일 RAGE 이뮤노글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인 및 하류 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 136 (서열 15) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 136 (서열 16) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 Q24가 고리화되어 pE를 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 136 (서열 49) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다 (도 1). 한 실시양태에서는, 서열 31 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 구축물이 3개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩할 수 있다 (도 3A). 다른 실시양태에서, 서열 55를 포함하는 핵산 구축물은 3개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩할 수 있으며, 여기서 상기 서열의 C-말단에서 프롤린 (CCG 내지 CCC) 및 글리신 (GGT 내지 GGG)를 코딩하는 코돈에 대한 사일런트 염기 변화가 종결 코돈 부위의 크립틱 RNA 스플라이스 부위를 제거한다 (즉, 서열 31의 뉴클레오티드 1030-1035은 변형되어 서열 55를 생성함) (도 3B).

RAGE 도메인간 링커 단편은 본래 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 하류에 위치하므로, RAGE 이뮤노글로불린 도메인에 연결되는 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE V 도메인의 경우에는 도메인간 링커가 이러한 V 도메인으로부터 본래 하류에 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 상기 링커가 전장 RAGE의 아미노산 117 내지 123에 상응하는 서열 21을 포함할 수 있다. 또는, 상기 링커는 천연 RAGE 서열의 부가 부분을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 21의 상류 및 하류에 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산)을 포함하는 도메인간 링커를 사용할 수도 있다. 따라서, 한 실시양태에서는 도메인간 링커가 전장 RAGE의 아미노산 117 내지 136을 포함하는 서열 23을 포함한다. 또는, 상기 링커의 어느 한 말단으로부터, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산을 결실시킨 서열 21의 단편을 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 상기 링커가 서열 21 또는 서열 23과 70％, 80％ 또는 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 링커는 서열 21 또는 서열 23과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다.

RAGE C1 도메인의 경우에는, 상기 링커가 본래 C1 도메인의 하류에 있는 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 상기 링커가 전장 RAGE의 아미노산 222 내지 251에 상응하는 서열 22를 포함할 수 있다. 또는, 상기 링커는 천연 RAGE 서열의 부가 부분을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 22의 상류 및 하류에 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산)을 포함하는 링커를 사용할 수도 있다. 또는, 상기 링커의 어느 한 말단으로부터, 예를 들어 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산을 결실시킨 서열 22의 단편을 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는 RAGE 도메인간 링커가 아미노산 222 내지 226에 상응하는 서열 24를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 링커는 서열 22 또는 서열 24과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다.

또는, 도메인간 링커는 RAGE 아미노산 318-342에 상응하는 서열 44를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 서열 44와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다.

상기 방법은 DNA 구축물을 발현 벡터 내로 혼입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 따라서 한 실시양태에서, 본 발명은 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 RAGE 융합 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서는, RAGE 폴리펩티드가, RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록 RAGE 이뮤노글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 갖는 본원에 기재된 바와 같은 구축물을 포함한다. 예를 들어, 세포를 형질감염시키는데 사용되는 발현 벡터는 핵산 서열인 서열 30 또는 그의 단편, 서열 54 또는 그의 단편, 서열 31 또는 그의 단편, 또는 서열 55 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.

상기 방법은 세포를 본 발명의 발현 벡터로 형질감염시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 따라서 한 실시양태에서, 본 발명은 상기 세포가 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 RAGE 융합 단백질을 발현하도록, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터를 이용하여 형질감염시킨 세포를 포함한다. 한 실시양태에서는, RAGE 폴리펩티드가, RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록 RAGE 이뮤노글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 갖는 본원에 기재된 바와 같은 구축물을 포함한다. 예를 들어, 상기 발현 벡터는 핵산 서열인 서열 30 또는 그의 단편, 서열 54 또는 그의 단편, 서열 31 또는 그의 단편, 또는 서열 55 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.

예를 들어, 상이한 길이의 인간 RAGE의 5' cDNA 서열을 인간 IgG1 (γ1)의 3' cDNA 서열과 융합시킴으로써 RAGE-IgG 융합 단백질을 발현하는 혈장을 구축할 수 있다. 표준 재조합 기술을 사용하여 발현 카세트 서열을 발현 벡터, 예를 들어 pcDNA3.1 발현 벡터 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주) 내로 삽입할 수 있다.

또한, 상기 방법은 발현 벡터를 숙주 세포 내로 형질감염시키는 것을 포함할 수 있다. RAGE 융합 단백질은 발현 구축물을 레트로바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 바이러스를 사용하여 포유동물 세포에 도입시키는 시스템을 비롯하여, 포유동물 발현 시스템에서 발현시킬 수 있다. 발현에 숙주로 이용가능한 포유동물 세포주는 당업계에 공지되어 있으며, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection (ATCC))으로부터 입수가능한 다수의 영구화된 세포주를 포함할 수 있다. 이들은 특히 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0, SP2 세포, HeLa 세포, 갓 태어난 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), A549 세포, 및 다수의 다른 세포주를 포함한다. 세포주는 어떤 세포주가 RAGE 융합 단백질의 높은 발현 수준을 갖는지 결정하여 선택될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주, 예컨대 Sf9 세포이다. 식물 숙주 세포는, 예를 들어 니코티아나(Nicotiana), 아라비돕시스(Arabidopsis), 개구리밥, 옥수수, 밀, 감자 등을 포함한다. 박테리아 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종을 포함한다. 효모 숙주 세포는 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다. RAGE 융합 단백질 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입된 경우, RAGE 융합 단백질은 숙주 세포에서 RAGE 융합 단백질을 발현시키거나 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지에 RAGE 융합 단백질을 분비하도록 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양하여 생성된다. RAGE 융합 단백질은 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.

RAGE 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자 및 이들 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터는 적합한 동물, 식물, 박테리아 또는 효모 숙주 세포에 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 형질변환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입시키는 임의의 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포에 도 입시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 덱스트란-매개된 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌-매개된 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 폴리뉴클레오티드(들)을 리포솜에 피막 형성시키는 방법, 및 DNA를 핵에 직접 미세주사하는 방법을 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포에 도입될 수 있다. 식물 세포를 형질변환시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질변환, 바이오리스틱(biolistic) 형질변환, 직접 주사, 전기천공 및 바이러스 형질변환 방법을 포함한다. 박테리아 또는 효모 세포를 형질변환시키는 방법도 당업계에 공지되어 있다.

발현 벡터는 또한 혈장가 미시적 입자 (바람직하게는, 금색) 상에 침전되고, 이 입자가 추진력에 의해 표적 세포 또는 발현 시스템에 진입하는, DNA 바이오리스틱을 이용하는 발현 시스템으로 전달될 수 있다. DNA 바이오리스틱 기술은 공지의 기술 및 장치이며, 예를 들면 "유전자 총(gene gun)"이 미세입자를 세포에 전달하고 (예를 들면, 헬리오스 유전자 총(Helios Gene Gun), 바이오-라드 랩스(Bio-Rad Labs.), 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재), 피부에 전달하는데 (PMED 장치, 파워메드사(PowderMed Ltd.), 영국 옥스포드 소재) 상업적으로 이용될 수 있다.

생산 세포주로부터 RAGE 융합 단백질을 발현시키는 것은 다수의 공지의 기술을 이용하여 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 글루타민 신테타제 유전자 발현 시스템 (GS 시스템) 및 혈장-코딩된 네오마이신 내성 시스템이 특정 조건하에서 발현을 향상시키기 위한 통상적인 접근법이다.

상이한 세포주에 의해 발현된 RAGE 융합 단백질은 서로 상이한 글리코실화 패턴을 나타낼 수 있다. 그러나, 본원에 제공된 핵산 분자의 의해 코딩되거나 또는 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 RAGE 융합 단백질은 RAGE 융합 단백질의 글리코실화에 관계없이 본 발명의 일부이다.

한 실시양태에서는, 재조합 발현 벡터를 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 내로 형질감염시키고, 발현을 최적화시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 상기 세포가 0.1 내지 20 그램/리터, 또는 0.5 내지 10 그램/리터, 또는 약 1 내지 2 그램/리터로 생성될 수 있다.

당업계에 공지된 바와 같이, 이러한 핵산 구축물은, 예를 들어 관심있는 돌연변이를 포함하는 프라이머를 사용하여 핵산 주형을 PCR 증폭시킴으로써 돌연변이에 의해 변형시킬 수 있다. 이러한 방식으로, RAGE 리간드에 대한 다양한 친화도를 나타내는 폴리펩티드를 고안할 수 있다. 한 실시양태에서는, 이와 같이 돌연변이시킨 서열이 출발 DNA와 90％ 이상 동일할 수 있다. 따라서, 변이체는 엄격한 조건 하에 (즉, 1몰 염 중의 DNA 이중체의 융점 (TM) 보다 약 20 내지 27℃ 아래 온도 등가 조건) 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

발현 벡터를 적당한 숙주 내로 형질감염시킴으로써 코딩 서열을 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 재조합 벡터가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 내로 안정적으로 형질감염될 수 있고, RAGE 융합 단백질을 발현하는 세포를 선별하여 클로닝한다. 한 실시양태에서, 재조합 구축물을 발현하는 세포를 대상으로 하여, 항생제 G418을 적용함으로써 혈장-코딩된 네오마이신 내성에 대해 선별한다. 개개 클론을 선별할 수 있고, 세포 상층액을 웨스턴 블롯 (Western Blot) 분석에 의해 검출된 바와 같이 높은 수준의 재조합 단백질을 발현하는 클론을 확장시킬 수 있으며, 단백질 A 칼럼을 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 유전자 생성물을 정제한다.

본 발명의 RAGE 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산의 샘플 실시양태가 도 2 및 3에 도시되어 있다. 예를 들어, 상기에서 언급한 바와 같이, 재조합 DNA 구축물에 의해 생성된 RAGE 융합 단백질은 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함할 수 있다. RAGE 융합 단백질은 RAGE 단백질로부터 유래된 2개의 도메인과, 이뮤노글로불린으로부터 유래된 2개의 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 구조를 갖는 RAGE 융합 단백질 TTP-4000 (TT4)을 코딩하는 핵산 구축물의 한 예가 도 2 (서열 30 및 서열 54)에 도시되어 있다. 서열 30 및 서열 54에 도시된 바와 같이, 코딩 서열 1 내지 753 (진하게 강조함)은 RAGE N-말단 단백질 서열을 코딩하는 반면, 서열 754 내지 1386은 IgG 단백질 서열을 코딩한다.

서열 30 또는 서열 54, 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열로부터 유래된 경우, RAGE 융합 단백질은 서열 32의 4개 도메인 아미노산 서열, 또는 신호 서열을 제거시킨 폴리펩티드 (예를 들면, 도 4의 서열 33 또는 서열 34, 또는 서열 56 참조)를 포함할 수 있다. 서열 32, 서열 33, 서열 34 또는 서열 56에서는, RAGE 아미노산 서열이 진하게 강조되었다. 이뮤노글로불린 서열은 힌지 영역이 없는 IgG의 C_H2 및 C_H3 이뮤노글로불린 도메인이다.

도 6은 RAGE 및 IgG (도 6A)에서 발견된 폴리펩티드 도메인과 RAGE 융합 단백질 TTP-3000 및 TTP-4000의 도메인 구조물의 비교를 보여준다. 도 6B에 도시된 바와 같이, 전장 TTP-4000 RAGE 융합 단백질의 처음 251개 아미노산은 RAGE 폴리펩티드 서열로서, 아미노산 1 내지 22/23을 포함하는 신호 서열, 아미노산 23/24 내지 116을 포함하는 V 이뮤노글로불린 도메인 (리간드 결합 부위 포함), 아미노산 117 내지 123을 포함하는 도메인간 링커, 아미노산 124 내지 221을 포함하는 제2 이뮤노글로불린 도메인 (C1), 및 아미노산 222 내지 251을 포함하는 하류 도메인간 링커를 함유한다.

한 실시양태에서는, RAGE 융합 단백질이 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인을 반드시 포함하지 않을 수 있다. 예를 들어, RAGE 융합 단백질은 RAGE로부터 유래된 1개의 이뮤노글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 이뮤노글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 RAGE 융합 단백질을 코딩하는 핵산 구축물의 한 예가 도 3 (서열 31 및 서열 55)에 도시되어 있다. 서열 31 및 서열 55에 도시된 바와 같이, 뉴클레오티드 1 내지 408의 코딩 서열 (진하게 강조함)은 RAGE N-말단 단백질 서열을 코딩하는 반면, 서열 409 내지 1041은 인간 IgG1 Fc(γ1) 단백질 서열을 코딩한다.

서열 31 또는 서열 55, 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열로부터 유래된 경우, RAGE 융합 단백질은 서열 35의 3개 도메인 아미노산 서열, 또는 신호 서열을 제거시킨 폴리펩티드 (예를 들면, 도 5의 서열 36 또는 서열 37, 또는 서열 57 참조)를 포함할 수 있다. 도 5의 서열 36, 서열 37 또는 서열 57에서는, RAGE 아미노산 서열이 진하게 강조되었다. 도 6B에 도시된 바와 같이, 전장 TTP-3000 RAGE 융합 단백질의 처음 136개 아미노산은 RAGE 폴리펩티드로서, 아미노산 1 내지 22/23을 포함하는 신호 서열, 아미노산 23/24 내지 116을 포함하는 V 이뮤노글로불린 도메인 (리간드 결합 부위 포함) 및 아미노산 117 내지 136을 포함하는 도메인간 링커를 함유한다. 서열 137 내지 346에는 힌지 영역을 수반하지 않은 IgG의 C_H2 및 C_H3 이뮤노글로불린 도메인이 포함된다.

본 발명의 RAGE 융합 단백질은 제2의 폴리펩티드를 포함하지 않는 RAGE 폴리펩티드에 비해 개선된 생체내 안정성을 나타낼 수 있다. RAGE 융합 단백질을 추가로 변형시켜 안정성, 효능, 효력 및 생물학적 이용가능성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 번역 후 과정 또는 화학적 변형에 의해 변형시킬 수 있다. 예를 들어, RAGE 융합 단백질은 L-, D-, 또는 천연이 아닌 아미노산, 알파-이치환된 아미노산, 또는 N-알킬 아미노산을 포함하도록 합성적으로 제조할 수 있다. 부가적으로, 단백질을 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 포스파티딜이노시톨 등의 지질 부착, 디술피드 결합 형성 등에 의해 변형시킬 수 있다. 또한, 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하여 RAGE 융합 단백질의 생물학적 안정성을 증가시킬 수 있다.

RAGE 융합 단백질에 대한 RAGE 길항제의 결합

본 발명의 RAGE 융합 단백질은 수많은 적용 분야를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 RAGE 리간드, 예를 들어 RAGE 효능제, 길항제 또는 조절제를 확인하기 위한 결합 검정에 사용될 수 있다.

예를 들어 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 연 결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 RAGE 융합 단백질을 제공하는 단계 (여기서, RAGE 폴리펩티드는 리간드 결합 부위를 포함한다); (b) RAGE에 대한 공지된 결합 친화도를 갖는 리간드 및 관심있는 화합물과 RAGE 융합 단백질을 혼합하는 단계; 및 (c) 상기 관심있는 화합물의 존재 하에 RAGE 융합 단백질에 대한 공지된 RAGE 리간드의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, RAGE 조절제를 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서는, 리간드 결합 부위가 RAGE 융합 단백질의 가장 N-말단 도메인을 포함한다.

RAGE 융합 단백질은 또한, RAGE 조절제를 검출하기 위한 키트를 제공할 수도 있다. 예를 들어 한 실시양태에서는, 본 발명의 키트가 (a) 양성 대조군으로서, RAGE에 대한 공지된 결합 친화도를 지닌 화합물; (b) 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 RAGE 융합 단백질 (여기서, RAGE 폴리펩티드는 RAGE 리간드 결합 부위를 포함한다); 및 (c) 사용에 관한 지시사항을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 리간드 결합 부위가 RAGE 융합 단백질의 가장 N-말단 도메인을 포함한다.

예를 들어, RAGE 융합 단백질은 효능있는 RAGE 리간드를 확인하기 위한 결합 검정에 사용될 수 있다. 이러한 결합 검정의 한 가지 예시 실시양태에서는, 공지된 RAGE 리간드를 웰당 약 5 마이크로그램의 농도로 (이 때 각 웰은 총 약 100 마이크로리터 (㎕) 부피를 함유함) 고형 기판 (예를 들어, 맥시소르브 (Maxisorb) 플레이트) 상으로 피복시킬 수 있다. 상기 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 상기 리간드가 기판에 흡착 또는 결합되게 할 수 있다. 다르게는, 보다 높은 온도 (예를 들면, 실온)에서 보다 짧은 기간 동안의 인큐베이션을 사용할 수도 있다. 리간드가 상기 기판에 결합할 수 있는 시간이 경과한 후, 검정 웰을 흡인시키고, 차단용 완충액 (예를 들어, 50 mM 이미다졸 완충액 중 1％ BSA, pH 7.2)을 첨가하여 비-특이적 결합을 차단시킬 수 있다. 예를 들어, 차단용 완충액을 상기 플레이트에 실온에서 1시간 동안 첨가할 수 있다. 이어서, 상기 플레이트를 흡인시키고/흡인시키거나 세척 완충액으로 세척할 수 있다. 한 실시양태에서는, 20 mM 이미디졸, 150 mM NaCl, 0.05％ 트윈 (Tween)-20, 5 mM CaCl₂ 및 5 mM MgCl₂, pH 7.2를 포함하는 완충액을 세척 완충액으로서 사용할 수 있다. 이어서, RAGE 융합 단백질을 희석률을 증가시키면서 상기 검정 웰에 첨가할 수 있다. 이어서, RAGE 융합 단백질을 상기 검정 웰에서 고정된 리간드와 함께 인큐베이션하여, 결합이 평형을 획득할 수 있도록 할 수 있다. 한 실시양태에서는, RAGE 융합 단백질을 37℃에서 약 1시간 동안 고정된 리간드와 함께 인큐베이션한다. 또 다른 실시양태에서는, 보다 낮은 온도에서 보다 길게 인큐베이션할 수도 있다. RAGE 융합 단백질과 고정된 리간드를 인큐베이션한 후, 상기 플레이트를 세척하여 결합되지 않은 모든 RAGE 융합 단백질을 제거할 수 있다. 고정된 리간드에 결합된 RAGE 융합 단백질을 다양한 방식으로 검출할 수 있다. 한 실시양태에서는, ELISA를 이용하여 검출한다. 따라서, 한 실시양태에서는 모노클로날 마우스 항-인간 IgG1, 바이오티닐화 염소 항-마우스 IgG, 및 아비딘 연결된 알칼리성 포스파타제를 함유하는 면역검출 복합체를, 상기 검정 웰에서 고정된 RAGE 융합 단백질에 첨가할 수 있다. 이러한 면역검출 복합체가 고정된 RAGE 융합 단백질에 결합할 수 있도록 하여, RAGE 융합 단백질과 면역검출 복합체 간의 결합이 평형을 달성하도록 한다. 예를 들어, 상기 복합체를 실온에서 1시간 동안 RAGE 융합 단백질에 결합될 수 있도록 한다. 이때, 검정 웰을 세척 완충액으로 세척함으로써, 결합되지 않은 모든 복합체를 제거할 수 있다. 결합된 복합체는 알칼리성 포스파타제 기질인 파라-니트로페닐포스페이트 (PNPP)를 첨가한 다음, 405 nm 에서의 흡광도 증가로서 PNPP가 파라-니트로페놀 (PNP)로 전환되는 양을 측정함으로써 검출할 수 있다.

한 실시양태에서는, RAGE 리간드가 RAGE 융합 단백질과 나노몰 (nM) 또는 마이크로몰 (μM) 친화도로 결합한다. RAGE 리간드가 본 발명의 RAGE 융합 단백질과 결합하는 것을 예시하는 실험이 도 7에 도시되어 있다. 초기 농도가 각각 1.082 mg/ml 및 370 ㎍/ml인 TTP-3000 (TT3) 및 TTP-4000 (TT4)의 용액을 준비하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 다양한 희석률에서 RAGE 융합 단백질 TTP-3000 및 TTP-4000은 고정된 RAGE 리간드 아밀로이드-베타 (A베타) [아밀로이드 베타 (1-40); 바이오소스(Biosource)], S100b (S100), 및 암포테린 (Ampho)과 결합하여, 흡광도를 증가시킬 수 있다. 리간드의 부재 하에서는 (즉, BSA로만 피복시킴) 흡광도 증가가 전혀 없었다.

본 발명의 결합 검정을 사용하여 RAGE에 대한 리간드 결합을 정량화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, RAGE 리간드가 본 발명의 RAGE 융합 단백질과 0.1 내지 1000 나노몰 (nM), 1 내지 500 nM, 또는 10 내지 80 nM 범위의 결합 친화도로 결합할 수 있다.

본 발명의 RAGE 융합 단백질을 또한 사용하여, RAGE와 결합할 수 있는 능력을 지닌 화합물을 확인할 수 있다. 도 8 및 9에 각각 도시된 바와 같이, RAGE 리간드를 대상으로 하여, TTP-4000 (TT4) 또는 TTP-3000 (TT3) RAGE 융합 단백질에 대한 결합을 놓고 고정된 아밀로이드 베타와 경쟁할 수 있는 능력에 대해 검정할 수 있다. 따라서, 10 μM의 최종 검정 농도 (FAC)에서 RAGE 리간드는 초기 TTP-4000 용액 (도 8) 또는 TTP-3000 (도 9)의 1:3, 1:10, 1:30 및 1:100 농도에서 아밀로이드-베타에 대한 RAGE 융합 단백질의 결합을 대체시킬 수 있는 것으로 관찰될 수 있다.

세포 효과기의 조절

본 발명의 RAGE 융합 단백질의 실시양태들을 사용하여 RAGE에 의해 매개된 생물학적 반응을 조절할 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현에서 RAGE-유도된 증가를 조절하도록 RAGE 융합 단백질을 고안할 수 있다. 따라서 한 실시양태에서는, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 생물학적 효소의 기능을 조절할 수 있다. 예를 들어, RAGE와 그의 리간드 간의 상호작용은 산화적 스트레스와, NF-κB, 및 NF-κB 조절된 유전자, 예를 들어 사이토킨 IL-1β, TNF-α 등의 활성화를 유발시킬 수 있다. 또한, 몇 가지 다른 조절성 경로, 예를 들어 p21ras, MAP 키나제, ERK1 및 ERK2가 관여하는 경로가 RAGE에 대한 AGE 및 다른 리간드의 결합에 의해 활성화되는 것으로 밝혀졌다.

세포 효과기 TNF-α의 발현을 조절하기 위해 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하는 것이 도 10에 도시되어 있다. THP-1 골수성 세포를, 10％ FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하고, RAGE를 S100b로 자극함으로써 TNF-α를 분비하도록 유도시킬 수 있다. 이러한 자극이 RAGE 융합 단백질의 존재 하에 일어나게 되면, RAGE에 대한 S100b의 결합으로 인한 TNF-α 유도가 억제될 수 있다. 따라서, 도 10에 도시된 바와 같이, 10 ㎍의 TTP-3000 (TT3) 또는 TTP-4000 (TT4) RAGE 융합 단백질을 첨가하면, S100b에 의한 TNF-α 유도가 약 50％ 내지 75％ 정도 저하된다. RAGE 융합 단백질 TTP-4000은 S100b에 의한 TNF-α 유도를 차단시키는데 있어서 적어도 sRAGE 만큼 효과적일 수 있다 (도 10). TTP-4000 및 TTP-3000의 RAGE 서열에 대한 억제 특이성은, IgG만을 S100b 자극된 세포에 첨가하는 실험에서 밝혀졌다. IgG와 S100b를 본 검정에 첨가한 결과, S100b만을 첨가한 경우와 동일한 수준의 TNF-α가 나타났다.

세포를 기초로 하는 다른 분석에서, RAGE 리간드 HMGB1이 RAGE 및 다른 MGB1 수용체와 상호작용하는 것을 막는 TTP-4000의 능력이 측정되었다. RAGE에 결합하는 항-RAGE 항체와 달리 그리고 RAGE 리간드와 RAGE의 상호작용을 막기 위해서, TTP-4000은 RAGE 리간드에의 결합에 의한 RAGE 리간드의 RAGE와의 상호작용을 차단할 수 있다. HMGB1은 RAGE 및 톨-유사 수용체 (Toll-Like Receptor) 2 및 4에 대한 리간드로 보고되었다 (문헌 [Park et al., J Biol Chem., 2004; 279(9):7370-7]). 모든 3개의 상기 수용체 (RAGE, 톨-유사 수용체 2, 및 톨-유사 수용체 4)는 THP-1 세포 상에 발현된다 (문헌 [Parker, et al., J Immunol, 2004,172(8):4977-86]).

상기 실험에서, THP-1 세포를 자극하여 TTP4000 또는 항-RAGE 항체의 존재 또는 부재 하에 HMGB 1 (50 mg/mL)에 의해 TNF-α를 생성한다. 이 분석에서 사용된 조건하에서, HMGB1은 TNF-α의 유일한 유도인자이어야만 한다. 도 11의 결과는 항-RAGE 항체 및 RAGE 융합 단백질 TTP-4000은 HMGB1이 THP-1 세포에서 발현된 RAGE와 상호작용하는 것을 막고, TTP-4000이 항-RAGE 항체보다 더 큰 정도로 HMGB1-유도된 TNF-α 생성을 억제하는 것을 보여준다. 따라서, 데이터는 TTP-4000은 HMGB1이 톨-유사 수용체 2 및 4 뿐만 아니라 THP-1 세포에 존재하는 RAGE와 상호작용하는 것을 억제하여 항-RAGE 항체보다 더 큰 정도로 HMGB1 활성을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.

RAGE 융합 단백질의 생리적 특징

sRAGE가 RAGE-매개성 질환을 조절하는데 있어서 치료 이점을 지닐 수 있긴 하지만, 인간 sRAGE는 혈장 내에서의 반감기가 비교적 짧기 때문에 그 자체 만으로는 치료제로 사용하기에 한계가 있을 수 있다. 예를 들어, 설치류 sRAGE는 정상 및 당뇨병 래트에서 대략 20시간의 반감기를 갖는 반면, 인간 sRAGE는 면역반응성 sRAGE 잔류에 의해 평가하였을 때에는 2시간 미만의 반감기를 갖고 있었다 (문헌 [Renard et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 290:1458-1466 (1999)]).

sRAGE와 유사한 결합 특징을 지니고 있긴 하지만, 보다 안정한 약동학적 프로파일을 지닌 RAGE 치료제를 생성하기 위해, 하나 이상의 인간 이뮤노글로불린 도메인에 연결된 RAGE 리간드 결합 부위를 포함하는 RAGE 융합 단백질을 사용할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이뮤노글로불린 도메인에는 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 부분이 포함될 수 있다.

이러한 이뮤노글로불린 Fc 부분은 융합 단백질에 몇 가지 특징을 제공할 수 있다. 예를 들어, Fc 융합 단백질은 이러한 융합 단백질의 혈청 반감기를 몇 시간에서부터 며칠까지도 증가시킬 수 있다. 약동학적 안정성의 증가는 일반적으로, Fc 단편의 C_H2 영역과 C_H3 영역 간의 링커와 FcRn 수용체의 상호작용에 따른 결과이다 (문헌 [Wines et al., J. Immunol., 164:5313-5318 (2000)]).

이뮤노글로불린 Fc 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이 안정성 증가의 이점을 제공할 수 있긴 하지만, 이뮤노글로불린 융합 단백질은 숙주 내로 도입되는 경우에 염증성 반응을 유발시킬 수 있다. 이러한 염증성 반응은 대부분이, 융합 단백질의 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 기인할 수 있다. 전염증성 반응은 제거시킬 필요가 있는 병든 세포 유형 (예를 들면, 암 세포, 및/또는 자가면역 질환을 유발시키는 림프구 집단) 상에서 표적이 발현되는 경우에 바람직한 특징일 수 있다. 전염증성 반응은 표적이 가용성 단백질인 경우에는 분명치 않은 특징일 수 있는데, 이는 대부분의 가용성 단백질이 이뮤노글로불린을 활성화시키지 못하기 때문이다. 그러나, 전염증성 반응은 파괴로 인해 바람직하지 못한 부작용이 유발될 수도 있는 세포 유형에서 표적이 발현되는 경우에는, 부정적인 특징이 될 수도 있다. 또한, 전염증성 반응은 조직 표적에 대한 융합 단백질 결합 부위에 염증성 케스케이드가 수립되는 경우에도 부정적인 특징이 될 수 있는데, 이는 많은 염증 매개인자가 주변 조직에 해로울 수 있고/있거나 전신 효과를 유발시킬 수 있기 때문이다.

이뮤노글로불린 Fc 단편 상의 주요 전염증성 부위는 C_H1과 C_H2 사이의 힌지 영역 상에 체류한다. 이러한 힌지 영역은 다양한 백혈구 상의 FcR1-3과 상호작용하고 이들 세포가 표적을 공격하도록 촉발시킨다 (문헌 [Wines et al., J. Immunol., 164:5313-5318 (2000)]).

RAGE-매개성 질환에 대한 치료제로서, RAGE 융합 단백질은 염증성 반응 발생을 요구하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질에 관한 실시양태는 이뮤노글로불린 도메인(들)에 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 RAGE 융합 단백질 (여기서는, 이뮤노글로불린으로부터의 Fc 힌지 영역이 제거되고 RAGE 폴리펩티드로 대체됨)을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 염증 세포 상에서 RAGE 융합 단백질과 Fc 수용체 간의 상호작용을 최소화할 수 있다. 그러나, RAGE 융합 단백질의 다양한 이뮤노글로불린 도메인들 간의 적절한 적층과 다른 3차원적 구조적 상호작용을 유지시키는 것이 중요할 수 있다. 따라서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질에 관한 실시양태는 이뮤노글로불린 중쇄의 정상적인 힌지 영역 대신, RAGE의 V 도메인과 C1 도메인을 격리시키는, 생물학적으로 불활성이지만 구조적으로 유사한 RAGE 도메인간 링커, 또는 RAGE의 C1 도메인과 C2 도메인을 격리시키는 링커로 치환할 수 있다. 따라서, RAGE 융합 단백질의 RAGE 폴리펩티드는 RAGE 이뮤노글로불린 도메인/링커 단편을 형성하기 위해 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 하류에서 본래 발견되는 도메인간 링커 서열을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, RAGE 또는 이뮤노글로불린에 의해 기여된 이뮤노글로불린 도메인들 간의 3차원적 상호작용을 유지시킬 수 있다.

한 실시양태에서는, 본 발명의 RAGE 융합 단백질이 sRAGE와 비교해서 약동학 적 안정성을 상당히 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 도 12는 RAGE 융합 단백질 TTP-4000이 일단 그의 리간드를 포화시키면, 300 시간 초과의 반감기를 보유할 수 있음을 보여준다. 이는 인간 혈장에서의 sRAGE의 반감기가 단지 수 시간에 불과한 것과는 대조적일 수 있다.

따라서, 한 실시양태에서는 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여, 허용되지 않은 양의 염증을 발생시키지 않으면서 RAGE-매개성 질환을 치료하기 위한 수단으로서 RAGE에 대한 생리적 리간드의 결합을 길항시킬 수 있다. 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 IgG와 비교해서 전염증성 반응 발생을 상당히 저하시킬 수 있다. 예를 들어, 도 13에 도시된 바와 같이 RAGE 융합 단백질 TTP-4000은 인간 IgG 자극에 의한 TNF-α 방출이 검출되는 조건 하에서도 세포로부터 TNF-α 방출을 자극하지 않는다.

RAGE 융합 단백질을 이용한 질환 치료

본 발명은 또한, 인간 대상체에게서 RAGE-매개성 질병을 치료하는 방법을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 상기 방법이 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 연결된 RAGE 리간드 결합 부위를 포함하는 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 RAGE 융합 단백질을 특정 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, RAGE 제제는 동결건조된 RAGE 융합 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 RAGE 융합 단백질, 동결건조 보호제, 및 완충액를 포함하는 치료상 유효량의 재구성된 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 RAGE-매개성 질병을 치유하는 방법을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 RAGE 융합 단백질의 임의의 실시양태는 본 발명의 치료 조성물 및 제제로 질환을 치료하는데 사용할 수 있다. 따라서, RAGE 융합 단백질은 이뮤노글로불린 폴리펩티드에 연결된 RAGE 리간드 결합 부위로부터 유도된 서열을 포함할 수 있다. RAGE 융합 단백질의 실시양태는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, RAGE 폴리펩티드는, RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, RAGE 이뮤노글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질의 특정 실시양태는 제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 C_H2 이뮤노글로불린 도메인 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 일부의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제1 RAGE 도메인간 링커를 포함할 수 있다.

상기 다중-도메인 융합 단백질의 또 다른 실시양태에서, RAGE 폴리펩티드는 서열 10으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열, 또는 서열 47로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, RAGE 융합 단백질은 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57 중 하나 이상으로 나타낸 아미노 서열, 또는 그와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37, 또는 57과 90% 이상 동이한 서열은 C-말단 리신을 수반하지 않은 서열 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37, 또는 57의 폴리펩티드를 포함한다. 또는, 본원에 제기된 다른 실시양태는 본 발명의 제제에 사용된 RAGE 융합 단백질을 구성할 수 있다.

다양한 동결건조 보호제가 동결건조된 RAGE 융합 단백질 제제에 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 동결건조 보호제는 비환원성 당을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비환원성 당은 수크로즈, 만니톨, 또는 트레할로스를 포함할 수 있다. 또한, 다양한 완충액은 동결건조된 RAGE 융합 단백질 제제에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충액은 히스티딘을 포함할 수 있다.

상기 동결건조된 RAGE 융합 단백질은 부가 성분을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, RAGE 융합 단백질 제제는 부가적으로 계면 활성제, 킬레이트제 또는 증량제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는 서열 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37, 또는 57로 나타낸 서열을 포함하는 약 40 내지 100 mg/mL의 RAGE 융합 단백질; 약 2 mM 내지 약 50 mM의 히스티딘; 약 60 mM 내지 약 65 mM의 수크로즈; 약 0.001% 내지 약 0.05%의 트윈 80; 및 약 6.0 내지 6.5의 pH를 포함한다. 예를 들어, 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는, 특정 실시양태에서, 서열 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37, 또는 57로 나타낸 서열을 포함하는 약 40 내지 50 mg/mL의 RAGE 융합 단백질; 약 10 mM의 히스티딘, 약 65 mM의 수크로즈, 약 0.01 %의 트윈 80, 및 약 pH of 약 6.0의 pH를 포함할 수 있다. 또는, RAGE 융합 단백질의 다른 농축액은 요구되는 바와 같이 RAGE-매개성 질병의 치료를 위한 제제로서 사용될 수 있다.

RAGE 융합 단백질 제제는 임상용으로 또는 조제용 약으로서 사용하도록 제제화된 안정적인 치료제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, RAGE 융합 단백질 제제는 40℃에서 1주일 후에 10% 미만, 또는 5% 미만, 또는 3% 미만의 분해를 나타낼 수 있다.

또한, RAGE 융합 단백질 제제는 희석제 중에서 재구성될 때 안정적일 수 있다. 특정 실시양태에서, 약 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 RAGE 융합 단백질은 RAGE 융합 단백질 제제 중에서 응집물로 존재한다. 상기 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는 다양한 경로로의 투여 및 요구되는 바와 같이 관심사인 RAGE-매개성 질병의 치료에 있어서 적합할 수 있다. 본 발명의 RAGE 융합 단백질의 투여는 복강내 (DP) 주사를 사용할 수 있다. 다르게는, RAGE 융합 단백질은 경구, 흉골내, 또는 에어로졸로 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 투여는 정맥내 (IV) 투여이다. RAGE 융합 단백질은 또한 피하 투여일 수 있다. 다른 실시양태에서, RAGE 융합 단백질의 투여는 동맥내 투여이다. 다른 실시양태에서, 투여는 설하 투여이다. 또한, 투여는 서방형 캡슐을 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 투여는 좌제 등에 의한 경직장 투여일 수 있다. 예를 들어, 자가 투여가 요망되는 경우에 만성 질환을 치료하는데 피하투여가 유용할 수 있다.

본원에 더욱 상세히 기술된 바와 같이, RAGE가 다양한 질환 상태의 병인에 관여하고, 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 상기 질환의 상태를 개선하는데 효율적이라는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질 제제는 다양한 RAGE-매개성 질병을 치유하는데 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는 당뇨병 또는 당뇨병 말기 합병증 증상을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 당뇨병 또는 당뇨병 말기 합병증 증상에는 당뇨병성 신병증, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 족부 궤양, 당뇨병의 심혈관 합병증, 또는 당뇨병성 신경병증 중 하나 이상이 포함될 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는 아밀로이드증, 알츠하이머병, 암, 신부전증, 또는 자가면역, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 건선, 다발성 경화증, 저산소증, 졸중, 심장 마비, 출혈성 쇼크, 패혈증, 기관 이식, 또는 상처 치유 부전과 연관된 염증 중 하나 이상을 치료하는데 사용될 수 있다.

또는, 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는 골다공증을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질 제제의 투여는 대상체의 골 밀도를 증가시키거나 또는 대상체의 골 밀도 감소율을 저하시킨다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질 제제를 사용하여 치료한 자가면역은 피부 세포, 췌장 세포, 신경계 세포, 근육 세포, 내피 세포, 심장 세포, 간 세포, 신장 세포, 심장, 골수 세포, 뼈, 혈액 세포, 동맥 세포, 정맥 세포, 연골 세포, 갑상선 세포, 또는 줄기 세포 중 하나 이상의 거부반응을 포함할 수 있다. 또는, 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는 신부전증을 치료하는데 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제를 사용하여 기관, 조직 또는 다수의 세포들 중 하나 이상의 제1 부위로부터 제2 부위로의 이식과 연관된 염증 및/또는 거부 반응을 치료할 수 있다. 제1 및 제2 부위는 상이한 대상체에 있을 수도 있고, 동일한 대상체에 있을 수도 있다. 다수의 상이한 세포 유형의 이식은 본 발명의 RAGE 융합 단백질 제제를 사용하여 향상될 수 있다. 예를 들어, 이식된 세포, 조직, 또는 기관은 췌장, 피부, 간, 신장, 심장, 골수, 혈액, 뼈, 근육, 정맥, 동맥, 연골, 갑상선, 신경계, 또는 줄기 세포의 세포, 조직 또는 기관을 포함할 수 있다.

상기 질환 및 질병의 치료에 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하는 예가 본원에 기재되어 있다.

예를 들어, 다양한 동물 모델을 사용하여, RAGE를 조절하는 치료제로서의 화합물의 용도를 검증하였다. 이들 모델의 예는 다음과 같다:

a) sRAGE는 RAGE를 통한 내피, 평활근 및 대식 세포 활성화를 억제함으로써 당뇨병 래트와 정상 래트 모두에서 동맥 손상에 따른 재발 협착증 래트 모델에서 신생내막 형성을 억제하였다 (문헌 [Zhou et al., Circulation 107:2238-2243 (2003)]).

b) sRAGE 또는 항-RAGE 항체를 사용하여 RAGE/리간드 상호작용을 억제시키면, 전신성 아밀로이드증 마우스 모델에서 아밀로이드 반점 형성이 저하되었다 (문헌 [Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)]). 아밀로이드 반점 저하에 수반하여, 치료받은 동물에게서 NF-κB의 활성화가 저하될 뿐만 아니라 염증성 사이토킨, 인터루킨-6 (IL-6) 및 대식 세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF)가 감소되었다.

c) RAGE 트랜스제닉 (transgenic) 마우스 (RAGE 과발현자 및 RAGE 우세 음성 발현자)는 AD 마우스 모델에서 인지력 결핍과 반점 형성을 나타낸다 (문헌 [Arancio et al., EMBO J., 23:4096-4105 (2004)]).

d) 당뇨병 래트를 sRAGE로 처리하면, 혈관 투과성이 저하되었다 (문헌 [Bonnardel-Phu et al., Diabetes, 48:2052-2058 (1999)]).

e) sRAGE로 처리하면, 당뇨병성 아포지단백질 E-기능없는 (null) 마우스에서 아테롬성 동맥경화증 병변이 감소되었고, db/db 마우스에서 당뇨병성 신병증의 기능적 및 형태학적 징후가 예방되었다 (문헌 [Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)]).

f) sRAGE는 콜라겐-유도된 관절염 마우스 모델 (문헌 [Hofmann et al., Genes Immunol., 3: 123-135 (2002)]), 실험적 알레르기성 뇌척수염 마우스 모델 (문헌 [Yan et al., Nat. Med. 9:28-293 (2003)]) 및 염증성 장 질환 마우스 모델 (문헌 [Hofmann et al., Cell, 97:889-901 (1999)])에서 중증의 염증을 약화시켰 다.

따라서, 한 실시양태에서는 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 당뇨병 증상 및/또는 RAGE에 의해 매개된 당뇨병으로부터 비롯된 합병증을 치료할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 당뇨병 또는 당뇨병 말기 합병증 증상에는 당뇨병성 신병증, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 족부 궤양, 당뇨병의 심혈관 합병증, 또는 당뇨병성 신경병증이 포함될 수 있다.

RAGE는 그의 발현이 당뇨병 병리 상태와 연관이 있는 분자에 대한 수용체로서 최초로 확인되었기 때문에, RAGE 그 자체가 당뇨병 합병증의 병리생리학에 있어 필수적이다. RAGE와 그의 리간드(들) 간의 상호작용을 생체 내에서 억제시키는 것이, 당뇨병 합병증과 염증이 있는 다중 모델에서 치료적인 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)]). 예를 들어, 항-RAGE 항체를 이용하여 2개월간 치료하면, 당뇨병 마우스에서 신장 기능이 정상화되었고 비정상적인 신장 조직병리 상태가 저하되었다 (문헌 [Flyvbjerg et al., Diabetes 53:166-172 (2004)]). 또한, RAGE 리간드와 결합하고 RAGE/리간드 상호작용을 억제하는 가용성 형태의 RAGE (sRAGE)를 이용하여 치료하면, 당뇨병성 아포지단백질 E-기능없는 마우스에서 아테롬성 동맥경화증 병변이 저하되었고 db/db 마우스에서 당뇨병성 신병증의 기능적 및 형태학적 병리 상태가 약화되었다 (문헌 [Bucciarelli et al., Circulation 106:2827-2835 (2002)]).

또한, 궁극적으로 최종당화산물 (AGE)을 형성시켜 주는 거대 분자의 비효소적 당산화 반응이 염증 부위에서, 신부전증에서, 고혈당증 및 전신성 또는 국소 산 화제 스트레스와 연관된 다른 질환의 존재 하에서 향상되는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Dyer et al., J. Clin. Invest., 91:2463-2469 (1993)]; [Reddy et al., Biochem., 34:10872-10878 (1995)]; [Dyer et al., J. Biol. Chem., 266:11654-11660 (1991)]; [Degenhardt et al., Cell Mol. Biol., 44:1139-1145 (1998)]). AGE가 혈관계에 축적되는 것은, 투석과 관계된 아밀로이드증 환자에게서 발견된 AGE-β₂-마이크로글로불린으로 구성된 관절 아밀로이드에서와 같이 병소적으로 일어날 수 있거나 (문헌 [Miyata et al., J. Clin. Invest., 92:1243-1252 (1993)]; [Miyata et al., J. Clin. Invest., 98:1088-1094 (1996)]), 또는 당뇨병 환자의 혈관계 및 조직에 의해 예시된 바와 같이 전신적으로 일어날 수 있다 (문헌 [Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004 (1995)]). AGE가 당뇨병 환자에게서 시간 경과에 따라 점진적으로 축적된다는 것은, 내인성 제거 메카니즘이 AGE 침착 부위에서 효과적으로 기능할 수 없다는 것을 제안하고 있다. 이와 같이 축적된 AGE는 수많은 메카니즘에 의해 세포 특성을 변경시킬 수 있는 능력을 지니고 있다. RAGE가 수용체의 리간드가 축적되는 환경 하에서, 정상 조직과 혈관계에서는 낮은 수준으로 발현되긴 하지만, RAGE는 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Li et al., J. Biol Chem., 272:16498-16506 (1997)]; [Li et al., J. Biol. Chem., 273:30870-30878 (1998)]; [Tanaka et al., J. Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)]). RAGE 발현은 당뇨병 혈관계에서, 내피, 평활근 세포 및 침윤성 단핵 포식세포에서 증가된다. 또한, 세포 배양물에서의 연구 결과, AGE-RAGE 상호작용이 혈관 항상성에 있어 중요한 세포 특성의 변화를 유발시키는 것으로 입증되었다.

당뇨병과 관계된 병리 상태를 치료하는데 있어 RAGE 융합 단백질을 사용하는 것이 도 14에 예시되어 있다. RAGE 융합 단백질 TTP-4000은, 혈관 손상에 따른 내막 팽창과 평활근 증식을 측정함으로써, 당뇨병성 재발 협착증 래트 모델에서 평가하였다. 도 14에 예시된 바와 같이, TTP-4000 처치는 당뇨병 관련 재발 협착증에서 혈관 내막/중막 (LM) 비 (도 14A; 표 1)를 투여량-반응성 방식으로 상당히 감소시킬 수 있다. 또한, TTP-4000 처치는 재발 협착증-관련 혈관 평활근 세포 증식을 투여량-반응성 방식으로 상당히 저하시킬 수 있다.

다른 실시양태에서는, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 아밀로이드증과 알츠하이머병을 치료 또는 역전시킬 수도 있다. RAGE는 아밀로이드 베타 (Aβ) 뿐만 아니라 SAA 및 아밀린을 포함한 다른 아밀로이드생성 단백질에 대한 수용체이다 (문헌 [Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996)]; [Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:5296-5301 (1997)]; [Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)]; [Sousa et al., Lab Invest., 80:1101-1110 (2000)]). 또한, AGE, S100b 및 Aβ 단백질을 포함한 RAGE 리간드는 남성에게서의 노인성 반점 주변 조직에서 발견된다 (문헌 [Luth et al., Cereb. Cortex 15:211-220 (2005)]; [Petzold et al., Neurosci. Lett., 336:167-170 (2003)]; [Sasaki et al., Brain Res., 12:256-262 (2001)]; [Yan et al., Restor. Neurol Neruosci., 12:167-173 (1998)]). RAGE는 소단위체 (아밀로이드-β 펩티드, 아밀린, 혈청 아밀로이드 A, 프리온-유래 펩티드)의 조성에 상관없이 β-시트 섬유상 물질과 결합하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996)]; [Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)]). 또한, 아밀로이드 침착으로 인해 RAGE의 발현이 향상되는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 알츠하이머병 (AD) 환자의 뇌에서는 RAGE 발현이 뉴런과 신경교에서 증가된다 (문헌 [Yan et al., Nature 382:685-691 (1996)]). RAGE 리간드의 발현과 동시에, RAGE는 AD 환자의 해마 내의 미세신경교 세포와 성상 세포에서 상향 조절되지만, AD가 없는 개인에게서는 상향 조절되지 않는다 (문헌 [Lue et al., Exp. Neurol., 171:29-45 (2001)]). 이러한 발견들은 RAGE를 발현하는 세포가 노인성 반점 근처에서 RAGE/RAGE 리간드 상호작용을 통하여 활성화된다는 것을 제안하고 있다. 또한, 시험관 내에서 Aβ에 의해 매개된 미세신경교 세포의 활성화는, RAGE의 리간드-결합 도메인에 대항하여 유도된 항체를 사용하여 차단시킬 수 있다 (문헌 [Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:5296-5301 (1997)]). 또한, RAGE는 피브릴 어셈블리에 대한 병소 지점으로 제공될 수 있는 것으로 입증되었다 (문헌 [Deane et al., Nat. Med. 9:907-913 (2003)]).

또한, sRAGE 또는 항-RAGE 항체를 사용하여 RAGE/리간드 상호작용을 생체내 억제시키면, 전신성 아밀로이드증 마우스 모델에서 아밀로이드 반점 형성이 저하될 수 있다 (문헌 [Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)]). 뉴런에서 스웨덴인 및 런던인 돌연변이를 수반한 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) (돌연변이 hAPP)와 인간 RAGE를 과발현하는 이중 트랜스제닉 마우스에게서, 그들의 단일 돌연변이 hAPP 트랜스제닉 상대보다 더 일찍 신경병리학적 이상과 학습력 결핍이 발생한다. 이와는 달리, 동일한 돌연변이 hAPP 백그라운드 상에서 우세 음성 형태의 RAGE를 발현하는 뉴런으로 인해 Aβ 신호 전달 능력이 저하된 이중 트랜스제닉 마우스에게서는, 그들의 단일 APP 트랜스제닉 상대에 비해 신경병리학적 이상과 학습 이상의 발병이 더 느리게 나타났다 (문헌 [Arancio et al., EMBO J., 23:4096-4105 (2004)]).

또한, RAGE-아밀로이드 상호작용을 억제하면, 세포 RAGE와 세포 스트레스 마커의 발현이 저하되고 (NF-κB 활성화도 저하됨), 아밀로이드 침착이 감소되는 것으로 밝혀졌는데 (문헌 [Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)]), 이는 RAGE-아밀로이드 상호작용이 아밀로이드 축적에서 뿐만 아니라 아밀로이드가 풍부한 환경 하에서 (심지어 초기 단계에서도) 세포 특성의 교란에 있어 소정의 역할을 수행한다는 것을 제안하고 있다.

따라서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 아밀로이드증을 치료할 수 있고, 알츠하이머병 (AD)과 연관된 인지 기능장애와 아밀로이드 반점을 저하시킬 수도 있다. 상기 언급된 바와 같이, sRAGE는 AD 동물 모델에서 뇌에서의 아밀로이드 반점 형성과 후속 염증성 마커 증가 둘 다를 저하시키는 것으로 밝혀졌다. 도 15A 및 15B는 AD가 있고, TTP-4000 또는 마우스 sRAGE를 이용하여 3개월간 처치한 마우스는, 비히클 또는 인간 IgG 음성 대조군 (IgG1)을 투여한 동물 보다 더 적은 수의 아밀로이드 베타 (Aβ) 반점과 덜한 인지 기능장애를 나타내었다는 것을 도시하고 있다. sRAGE와 마찬가지로, TTP-4000 또한 AD와 연관된 염증성 사이토킨 IL-1 및 TNF-α를 저하시킬 수 있다 (데이터는 제시되지 않음).

또한, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 아테롬성 동맥경화증 및 다른 심혈관 질병을 치료할 수 있다. 따라서, 허혈성 심장 질환은 당뇨병 환자에게서 특히 잘 발병하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Robertson, et al., Lab Invest., 18:538-551 (1968)]; [Kannel et al., J. Am. Med. Assoc., 241:2035-2038 (1979)]; [Kannel et al., Diab. Care, 2:120-126 (1979)]). 또한, 연구 결과, 아테롬성 동맥경화증은 당뇨병을 앓고 있지 않은 환자에서 보다도 당뇨병 환자에게서 보다 더 광범위하게 나타나고 진행이 가속화되는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 문헌 [Waller et al., Am. J. Med., 69:498-506 (1980)]; [Crall et al., Am. J. Med. 64:221-230 (1978)]; [Hamby et al., Chest, 2:251-257 (1976)]; 및 [Pyorala et al., Diab. Metab. Rev., 3:463-524 (1978)] 참조). 당뇨병 환자에게서 아테롬성 동맥경화증이 가속화되는 이유에는 여러 가지가 있긴 하지만, AGE 감소가 반점 형성을 저하시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.

예를 들어, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 또한 사용하여 졸중을 치료할 수 있다. 질환과 관련된 졸중 동물 모델에서 TTP-4000를 sRAGE와 비교한 경우에는, TTP-4000가 경색 용적을 상당히 더 많이 감소시켜 주는 것으로 밝혀졌다. 이러한 모델에서는, 마우스의 중앙 경동맥을 결찰한 다음, 재관류하여 경색을 형성시킨다. 졸중을 치료 또는 예방하는 RAGE 융합 단백질의 효능을 평가하기 위해, 재관류하기 직전에 마우스를 sRAGE 또는 TTP-4000, 또는 대조군 이뮤노글로불린으로 처치하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, TTP-4000은 상기 동물에게서 경색 면적을 제한한다는 점에서 sRAGE 보다 더 효능이 있었는데, 이는 TTP-4000가 그의 혈장 내에서의 반감기가 더 우수하기 때문에 sRAGE 보다 더 큰 보호를 유지할 수 있었다는 것을 제안하고 있다.

다른 실시양태에서는, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 암을 치료할 수 있다. 한 실시양태에서는, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 치료되는 암이 RAGE를 발현하는 암 세포를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 이용하여 치료할 수 있는 암에는 몇몇 폐암, 몇몇 신경교종, 몇몇 유두종 등이 포함된다. 암포테린은 RAGE와 상호작용하는 것으로 밝혀진, 고이동성 I군 비-히스톤 염색체 DNA 결합 단백질이다 (문헌 [Rauvala et al., J. Biol. Chem., 262: 16625-16635 (1987)]; [Parkikinen et al., J. Biol Chem. 268:19726-19738 (1993)]). 암포테린은 (세포 이동성에 기여하는 것으로 공지되기도 한) 섬유소용해 시스템에서 프로테아제 복합체 어셈블리에 대한 표면으로서 제공될 뿐만 아니라 신경돌기 증식을 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, RAGE를 차단시키는 국소 종양 성장 억제 효과가 원발성 종양 모델 (C6 신경교종), 루이스 (Lewis) 폐 전이 모델 (문헌 [Taguchi et al., Nature 405:354-360 (2000)]), 및 v-Ha-ras 트랜스유전자 (transgene)를 발현하는 마우스에서 자발적으로 발생한 유두종 (문헌 [Leder et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9178-9182 (1990)])에서 관찰되었다.

또 다른 실시양태에서는, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 염증을 치료할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 염증성 장 질환과 연관된 염증, 류마티스성 관절염과 연관된 염증, 건선과 연관된 염증, 다발성 경화증과 연관된 염증, 저산소증과 연관된 염증, 졸중과 연관된 염증, 심장 마비와 연관된 염증, 출혈성 쇼크와 연관된 염증, 패혈증과 연관된 염증, 기관 이식과 연관된 염증, 상처 치유 부전과 연관된 염증, 또는 자가 (예를 들면, 자가면역) 또는 비-자가 (예를 들면, 이식된) 세포, 조직 또는 기관의 거부반응과 연관된 염증을 치료할 수 있다.

예를 들어, 혈전용해 치료 후, 과립구와 같은 염증 세포가 허혈성 조직 내로 침윤되어 산소 라디칼을 생성시키는데, 이는 저산소증에 의해 사멸되는 세포 보다 더 많은 세포를 파괴시킬 수 있다. 항체 또는 다른 단백질 길항제를 사용하여 상기 조직을 침윤시킬 수 있는 호중구에 대해 책임이 있는 호중구 상의 수용체를 억제시키는 것이 상기 반응을 완화시키는 것으로 밝혀졌다. RAGE는 이러한 호중구 수용체에 대한 리간드이기 때문에, RAGE의 단편을 함유하는 RAGE 융합 단백질이 미끼로서 작용할 수 있고, 호중구가 재관류된 부위로 트래픽킹 (trafficking)되지 못하도록 함으로써 추가의 조직 파괴를 예방할 수 있다. 염증을 예방하는데 있어서의 RAGE의 역할은, sRAGE가 당뇨병 래트와 정상적인 래트 둘 다에서 동맥 손상에 따른 재발 협착증 래트 모델에서, 아마도 RAGE를 통한 내피, 평활근 세포 증식과 대식 세포 활성화를 억제함으로써 신생내막 팽창을 억제하였다는 것을 보여주는 연구 결과에 의해 확인될 수 있다 (문헌 [Zhou et al., Circulation, 107:2238-2243 (2003)]). 또한, sRAGE는 지연형 과민증, 실험적 자가면역성 뇌염 및 염증성 장 질환을 포함한 염증 모델을 억제하였다 (문헌 [Hofman et al., Cell, 97:889-901 (1999)]).

한 실시양태에서는 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 자가면역에 기초한 질병을 치료할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 신부전증을 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 전신성 루푸스 신염 또는 염증성 루푸스 신염을 치료할 수 있다. 예를 들어, S100/칼그라눌린은 연결 펩티드에 의해 연결된 2개의 EF-핸드 (hand) 영역을 특징으로 하는, 밀접하게 관련된 칼슘-결합 폴리펩티드 부류를 포함하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Schafer et al., TIBS, 21:134-140 (1996)]; [Zimmer et al., Brain Res. Bull., 37:417-429 (1995)]; [Rammes et al., J. Biol. Chem., 272:9496-9502 (1997)]; [Lugering et al., Eur. J. Clin. Invest., 25:659-664 (1995)]). 이들에 신호 펩티드가 결여되긴 하지만, S100/칼그라눌린은 낭성 섬유증 및 류마티스성 관절염에서와 같이, 특히 만성 면역/염증 반응 부위에서 세포외 공간에 접근하는 것으로 오랫 동안 공지되어 왔다. RAGE는 S100/칼그라눌린 부류의 수많은 구성원들에 대한 수용체이므로, 림프구 및 단핵 포식세포와 같은 세포에 대한 그들의 전염증성 효과를 매개한다. 또한, 지연형 과민증 반응, IL-10 기능없는 마우스에서의 결장염, 콜라겐-유도된 관절염, 및 실험적 자가면역성 뇌염 모델에 대한 연구 결과는, RAGE-리간드 상호작용 (S100/칼그라눌린과의 상호작용인 것으로 추정됨)이 상기 염증성 케스케이드에 있어 근위적 역할을 한다는 것을 제안한다.

제I형 당뇨병은 본 발명의 RAGE 융합 단백질로 처치하여 예방 또는 개선될 수 있는 자가면역 질병이다. 예를 들면, sRAGE가 비-비만성 당뇨병 (NOD) 마우스로부터 중증의 복합 면역결핍증을 앓고 있는 NOD-마우스 (NOD-scid 마우스)로 비장 세포를 전달할 수 있는 것으로 밝혀졌다. NOD-scid 마우스는 자발적으로 당뇨병을 나타내지는 않았으나, 랑게르한스 섬 세포를 파괴할 수 있는 면역 세포의 존재가 필요할 수 있으며, 이로부터 나중에 당뇨병이 유도된다. sRAGE로 처치된 NOD-SCID 수혜자는 sRAGE로 처치되지 않은 NOD-scid 수혜자에 비해 당뇨병 (NOD) 마우스로부터 전달된 비장 세포에 의해 유도된 당뇨병 발병을 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 공개공보 2002/0122799). 상기 US2002/0122799 언급된 바와 같이, 상기 모델에서 sRAGE를 사용한 실험 결과는 장래 면역 요법 및 랑게르한스 섬 이식을 가능하게 할 수 있는 임상적 환경과 같은 인간 질환에 적절하다.

따라서, 한 실시양태에서는, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 기관, 조직 또는 다수의 세포들 중 하나 이상의 제1 부위로부터 제2 부위로의 이식과 연관된 염증을 치료할 수 있다. 제1 및 제2 부위는 상이한 대상체에 있을 수 있거나 동일한 대상체에 있을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이식되는 세포, 조직 또는 기관은 췌장, 간, 신장, 심장, 폐, 골수, 혈액, 뼈, 근육, 내피 세포, 동맥, 정맥, 연골, 갑상선, 신경계의 세포, 또는 줄기 세포를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 RAGE 융합 단백질 투여를 사용하여 제1 비-당뇨병 대상체로부터 제2 당뇨병 대상체로의 랑게르한스 섬 세포의 이식을 용이하게 할 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료상 유효량의 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 대상체에게 투여하여 골다공증을 치료하는 방법을 제공할 수 있다 (문헌 [Zhou et al, J. Exp. Med., 203:1067-1080 (2006)]). 한 실시양태에서, 골다공증 치료 방법은 또한 대상체의 골 밀도를 증가시키거나 또는 대상체의 골 밀도 감소율을 저하시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

따라서, 다양하게 선택된 실시양태에서 본 발명은 치료상 유효량의 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 대상체에게 투여함으로써, 이러한 대상체에서 AGE와 RAGE의 상호작용을 억제하는 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 치료받는 대상체는 동물일 수 있다. 한 실시양태에서는, 이러한 대상체가 인간이다. 이 대상체는 AGE-관련 질환, 예를 들어 당뇨병, 당뇨병 합병증, 예를 들어 신병증, 신경병증, 망막병증, 족부 궤양, 아밀로이드증, 또는 신부전증, 및 염증으로 고통받을 수 있다. 또는, 대상체는 알츠하이머병에 걸린 개인일 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 대상체가 암 환자일 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 대상체가 전신성 홍반성 루푸스 또는 염증성 루푸스 신염으로 고통받을 수 있다. 다른 질환이 RAGE에 의해 매개될 수 있으므로, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명의 부가의 또 다른 실시양태에서는, RAGE 융합 단백질을 사용하여 인간 또는 동물 대상체에게서 크론병 (Crohn's disease), 관절염, 혈관염, 신병증, 망막병증 및 신경병증을 치료할 수 있다. 다른 실시양태에서, 자가면역 반응 (예를 들면, 자가 거부반응) 및 비-자가면역 반응 (예를 들면, 비-자가 거부반응) 둘 모두와 연관된 염증은 RAGE에 의해 매개될 수 있으므로, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 치료할 수 있다.

치료상 유효량은 특정 대상체에게서 RAGE와 AGE 또는 내인성 RAGE 리간드의 다른 유형과의 상호작용을 예방할 수 있는 양을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 양은 치료받는 대상체에 따라서 달라질 것이다. 화합물 투여는 매시간, 매일, 매주, 매월, 매년, 또는 단일 사건으로서 이루어질 수 있다. 각종의 또 다른 실시양태에서는, RAGE 융합 단백질의 유효량 범위가 약 1 ng/kg(체중) 내지 약 100 mg/kg(체중), 또는 약 10 ㎍/kg(체중) 내지 약 50 mg/kg(체중), 또는 약 100 ㎍/kg(체중) 내지 약 20 mg/kg(체중)일 수 있다. 실제 유효량은 당업계에서 표준인 방법을 사용하여 투여량/반응 검정에 의해 확립할 수 있다 (문헌 [Johnson et al., Diabetes. 42: 1179, (1993)]). 따라서, 당업계에 공지된 바와 같이 유효량은 해당 화합물의 생물학적 이용가능성, 생물학적 활성, 및 생분해성에 좌우될 수 있다.

조성물

본 발명은 제약상 허용되는 담체와 혼합된 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. RAGE 융합 단백질은 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, RAGE 융합 단백질이 RAGE 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 리간드 결합 부위가 RAGE 융합 단백질의 가장 N-말단 도메인을 포함한다. 이러한 RAGE 리간드 결합 부위는 RAGE의 V 도메인, 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, RAGE 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 서열 47 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, RAGE 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 도메인 또는 이뮤노글로불린 도메인의 일부 (예를 들면, 그의 단편)을 포함하는 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 한 실시양태에서는, 이뮤노글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 인간 IgG의 C_H2 도메인 또는 C_H3 도메인 중의 하나 이상의 일부를 포함한다.

RAGE 단백질 또는 폴리펩티드는 전장 인간 RAGE (예를 들어, 서열 1), 또는 인간 RAGE의 단편을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 어떠한 신호 서열 잔기도 포함하지 않는다. RAGE의 신호 서열은 전장 RAGE (서열 1)의 잔기 1 내지 22 또는 잔기 1 내지 23을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, RAGE 폴리펩티드는 인간 RAGE 또는 그의 단편과 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96%, 97％, 98％ 또는 99％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 한 실시양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 인간 RAGE 또는 그의 단편을 포함할 수 있으며, 제1 잔기로서 메티오닌이 아닌 글리신을 갖는다 (예를 들어, 문헌 [Neeper et al, (1992)]). 또는, 인간 RAGE는 신호 서열이 제거된 전장 RAGE (예를 들어, 서열 2 또는 서열 3) (도 1A 및 1B) 또는 이러한 아미노산 서열의 일부를 포함할 수 있다.

본 발명의 RAGE 융합 단백질은 또한, sRAGE (예를 들면, 서열 4), sRAGE와 90％ 이상 동일한 폴리펩티드, 또는 sRAGE의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 인간 sRAGE 또는 그의 단편을 포함할 수 있으며, 제1 잔기로서 메티오닌이 아닌 글리신을 갖는다 (예를 들어, 문헌 [Neeper et al, (1992)]). 또는, 인간 RAGE는 신호 서열이 제거된 인간 sRAGE (예를 들어, 도 1의 서열 5, 서열 6, 또는 서열 45) 또는 이러한 아미노산 서열의 일부를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, RAGE 단백질은 V 도메인 (예를 들어, 도 1의 서열 7, 서열 8, 또는 서열 46)을 포함할 수 있다. 또는, V 도메인 또는 그의 단편과 90％ 이상 동일한 서열을 사용할 수도 있다. 또는, RAGE 단백질은 V 도메인의 일부를 포함하는 RAGE의 단편 (예를 들면, 도 1의 서열 9, 서열 10, 또는 서열 47)을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 서열 47 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, RAGE 단편이 합성 펩티드이다.

예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 116 (서열 7) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 116 (서열 8) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 Q24가 고리화되어 pE를 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 116 (서열 46) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또는, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 C1 도메인에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 124 내지 221 (서열 11) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 RAGE의 C2 도메인에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 227 내지 317 (서열 12) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또는, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인 및 하류 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 123 (서열 13) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 123 (서열 14) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또는, RAGE 폴리펩티드는 Q24가 고리화되어 pE를 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 123 (서열 48) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또는, RAGE 폴리펩티드는 V 도메인, C1 도메인 및 이들 두 도메인을 연결시켜 주는 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 226 (서열 17) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 226 (서열 18) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또는, RAGE 폴리펩티드는 Q24가 고리화되어 pE를 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 226 (서열 50) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또는, RAGE 폴리펩티드는 sRAGE (즉, V, C1 및 C2 도메인, 및 도메인간 링커를 코딩함)에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 339 (서열 5) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 339 (서열 6) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또는, RAGE 폴리펩티드는 Q24가 고리화되어 pE를 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 339 (서열 45) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또는, 이들 서열 각각의 단편을 사용할 수도 있다.

다른 실시양태에서, 리간드 결합 부위는 서열 1의 아미노산 22 내지 51을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 리간드 결합 부위는 서열 1의 아미노산 23 내지 51을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 리간드 결합 부위는 서열 1의 아미노산 31 내지 51을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 리간드 결합 부위는 서열 1의 아미노산 31 내지 116을 포함할 수 있다. 예를 들어, 리간드 결합 부위는 RAGE 리간드 결합 도메인 (예를 들어, 서열 1의 아미노산 1 내지 118, 23 내지 118, 24 내지 118, 31 내지 118, 1 내지 116, 23 내지 116, 24 내지 116, 31 내지 116, 1 내지 54, 23 내지 54, 24 내지 54, 31 내지 54, 1 내지 53, 23 내지 53, 24 내지 53, 또는 31 내지 53, 또는 그의 단편)과 같은 RAGE V 도메인 또는 그의 일부를 포함할 수 있다 (도 1). 또는, RAGE 리간드에 기능적으로 결합된 폴리펩티드의 단편이 사용될 수 있다. 또는, RAGE V 도메인 또는 그의 단편 (예를 들어, 상기에 기술된 바와 같음)과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열이 사용될 수 있다. 추가로, 당업계에 공지된 바와 같이, 융합 단백질의 N-말단이 글루타민인 실시양태에서, 예를 들어 서열 1의 잔기 1 내지 23을 포함하는 신호 서열을 제거할 때 (예를 들어, 폴리펩티드를 위한 Q24는 서열 1의 아미노산 24 내지 118을 포함함), 글루타민은 고리화되어 피로글루탐산 (pE)을 형성한다.

RAGE 융합 단백질에는 RAGE 또는 그의 단편으로부터 유래되지 않은 몇 가지 유형의 펩티드가 포함될 수 있다. RAGE 융합 단백질의 제2 폴리펩티드는 이뮤노글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 이소형 중 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε) 또는 IgA (α). 또한, 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 아형 중 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2), 또는 생물학적 활성을 변경시키는 이들 이소형 또는 아형의 돌연변이물. 제2 폴리펩티드는 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인, 또는 이들 도메인 중의 어느 하나, 또는 둘 다의 일부를 포함할 수 있다. 예시 실시양태로서, 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 서열 40 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 서열 38, 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 일부는 리신 (K)이 제거된 말단을 갖는 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다. 이뮤노글로불린 펩티드는 서열 39 또는 서열 41의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 서열 38 또는 서열 40의 이뮤노글로불린 서열은 또한 각각 서열 52 또는 서열 53에 의해 코딩될 수 있다.

이뮤노글로불린 쇄의 Fc 부분은 생체 내에서 전염증성일 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 이뮤노글로불린로부터 유래된 도메인간 힌지 폴리펩티드가 아니라, RAGE로부터 유래된 도메인간 링커를 포함한다.

따라서, 한 실시양태에서는, RAGE 융합 단백질이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인, 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, C_H2 도메인 또는 그의 단편이 서열 42를 포함한다. 한 실시양태에서는, 서열 42의 단편이 처음 10개의 아미노산이 제거된 서열 42를 포함한다.

한 실시양태에서, RAGE 폴리펩티드는, RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록 RAGE 이뮤노글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함한다. 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인, 또는 이들 도메인 중 어느 하나 또는 둘 모두의 일부를 포함할 수 있다. 예시 실시양태로서, 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 일부는 서열 40 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 일부는 서열 38 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG1의 C_H2 및 C_H3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 일부는 리신 (K)이 제거된 말단을 갖는 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다.

본 발명의 RAGE 융합 단백질은 RAGE로부터의 단일 또는 다중 도메인을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 이뮤노글로불린 도메인에 연결된 도메인간 링커를 포함하는 RAGE 폴리펩티드는 전장 RAGE 단백질의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어 한 실시양태에서는, RAGE 융합 단백질이 RAGE 단백질로부터 유래된 2개의 이뮤노글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 이뮤노글로불린 도메인을 포함할 수 있다. RAGE 융합 단백질은 제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 C_H2 이뮤노글로불린 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제1 도메인간 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 V 도메인, C1 도메인, 이들 두 도메인을 연결시켜 주는 도메인간 링커, 및 C1의 하류 제2 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 251 (서열 19) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 251 (서열 20) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 Q24가 고리화되어 pE를 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 251 (서열 51) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 서열 30 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 구축물이 4개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩할 수 있다. 다른 실시양태에서, 서열 54를 포함하는 핵산 구축물은 4개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩할 수 있으며, 여기서 상기 서열의 C-말단에서 프롤린 (CCG 내지 CCC) 및 글리신 (GGT 내지 GGG)를 코딩하는 코돈에 대한 사일런트 염기 변화가 도입되어 종결 코돈 부위의 크립틱 RNA 스플라이스 부위를 제거한다 (즉, 서열 30의 뉴클레오티드 1375-1380은 변형되어 서열 54를 생성함).

다르게는, 3개 도메인 RAGE 융합 단백질은 RAGE로부터 유래된 1개의 이뮤노글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 이뮤노글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 융합 단백질은 RAGE 도메인간 링커를 통하여 C_H2 이뮤노글로불린 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 연결된 단일 RAGE 이뮤노글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인 및 하류 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 136 (서열 15) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 136 (서열 16) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열, 또는 Q24가 고리화되어 pE를 형성하는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 136 (서열 49) 또는 이와 90％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 서열 31 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 구축물이 3개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩할 수 있다. 다른 실시양태에서, 서열 55를 포함하는 핵산 구축물은 3개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩할 수 있으며, 여기서 상기 서열의 C-말단에서 프롤린 (CCG 내지 CCC) 및 글리신 (GGT 내지 GGG)를 코딩하는 코돈에 대한 사일런트 염기 변화가 도입되어 종결 코돈 부위의 크립틱 RNA 스플라이스 부위를 제거한다 (즉, 서열 31의 뉴클레오티드 1030-1035는 변형되어 서열 55를 생성함).

RAGE 도메인간 링커 단편은 본래 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 하류에 위치하여 RAGE 이뮤노글로불린 도메인에 연결되는 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE V 도메인의 경우에는 도메인간 링커가 본래 이러한 V 도메인으로부터 하류에 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 상기 링커가 전장 RAGE의 아미노산 117 내지 123에 상응하는 서열 21을 포함할 수 있다. 또는, 상기 링커는 천연 RAGE 서열의 부가 부분을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 21의 상류 및 하류에 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산)을 포함하는 도메인간 링커를 사용할 수도 있다. 따라서, 한 실시양태에서는 도메인간 링커가 전장 RAGE의 아미노산 117 내지 136을 포함하는 서열 23을 포함한다. 또는, 상기 링커의 어느 한 말단으로부터, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산을 결실시킨 서열 21의 단편을 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 상기 링커가 서열 21 또는 서열 23과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다.

RAGE C1 도메인의 경우에는, 상기 링커가 본래 C1 도메인의 하류에 있는 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서는, 상기 링커가 전장 RAGE의 아미노산 222 내지 251에 상응하는 서열 22를 포함할 수 있다. 또는, 상기 링커는 천연 RAGE 서열의 부가 부분을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 22의 상류 및 하류에 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산)을 포함하는 링커를 사용할 수도 있다. 또는, 상기 링커의 어느 한 말단으로부터, 예를 들어 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산을 결실시킨 서열 22의 단편을 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는 RAGE 도메인간 링커가 아미노산 222 내지 226에 상응하는 서열 24를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 상기 링커가 서열 22 또는 서열 24와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다.

또는, 도메인간 링커는 RAGE 아미노산 318 내지 342와 상응하는 서열 44를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 상기 링커가 서열 44와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다.

제약상 허용되는 담체에는 당업계에 공지된 모든 표준 제약상 허용된 담체가 포함될 수 있다. 한 실시양태에서는, 제약 담체가 액상일 수 있고, RAGE 융합 단백질 또는 핵산 구축물이 용액 형태일 수 있다. 다른 실시양태에서는, 제약상 허용되는 담체가 분말, 동결건조된 분말 또는 정제 형태의 고형물일 수 있다. 또는, 제약 담체는 겔, 좌제 또는 크림일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 담체는 리포솜, 미소캡슐, 중합체 피막 형성된 세포, 또는 바이러스를 포함할 수 있다. 따라서, 용어 제약상 허용되는 담체에는 모든 표준 제약상 허용된 담체, 예를 들어 물, 알코올, 인산염 완충 식염수, 당 (예를 들면, 수크로즈 또는 만니톨), 오일 또는 에멀젼, 예를 들어 오일/수 에멀젼 또는 트리글리세라이드 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 정제, 제피정 및 캅셀제가 포괄되지만, 이들로 한정되지는 않는다.

특정 실시양태에서, RAGE 융합 단백질은 중성 형태로 (쯔비터 이온 형태(zwitter ionic forms)를 포함) 또는 양전하 또는 음전하 종으로 존재할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, RAGE 융합 단백질은 반대이온과 복합체화되어, 제약상 허용가능한 염을 형성할 수 있다.

용어 "제약상 허용가능한 염"은 하나 이상의 RAGE 융합 단백질 및 하나 이상의 반대이온을 포함하는 복합체를 의미하는데, 여기서 반대이온은 제약상 허용가능한 무기 및 유기산 및 염기로부터 유도된다.

제약상 허용가능한 무기 염기는 금속성 이온을 포함한다. 더욱 바람직한 금속성 이온은 적합한 알칼리 금속염, 알칼리 토금속 염 및 다른 생리적으로 허용가능한 금속 이온을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 무기 염기로부터 유도된 염은 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 코발트, 니켈, 몰리브데늄, 바나듐, 망간, 크로뮴, 셀레늄, 주석, 구리, 철(II), 철(III), 리튬, 마그네슘, 망간염, 망간(I), 칼륨, 루비듐, 나트륨, 및 아연, 및 일반적인 원자가의 그들을 포함한다.

본 발명의 RAGE 융합 단백질의 제약상 허용가능한 산 부가 염은 포름산, 아세트산, 아세트아미도벤조산, 아디프산, 아스코르브산, 붕산, 프로피온산, 벤조산, 캄포르산, 탄산, 시클람산, 디히드로콜산, 말론산, 에데트산, 에틸황산, 펜디조산, 메타포스포르산, 숙신산, 글리콜산, 글루콘산, 락트산, 말산, 타르타르산, 탄닌산, 시트르산, 질산, 아스코르브산, 글루쿠론산, 말레산, 엽산, 푸마르산, 프로피온산, 피루브산, 아스파르트산, 글루탐산, 벤조산, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 리신산, 이소시트르산, 트리플루오로 아세트산, 파모산, 프로피온산, 안트라닐산, 메실산, 오로트산, 옥살산, 옥살아세트산, 올레산, 스테아르산, 살리실산, 아미노살리실산, 실리케이트산, p-히드록시벤조산, 니코틴산, 페닐아세트산, 만델산, 엠본산, 술폰산, 메탄술폰산, 인산, 포스폰산, 에탄술폰산, 에탄디술폰산, 암모늄산, 벤젠술폰산, 판토텐산, 나프탈렌술폰산, 톨루엔술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 술파닐산, 황산, 질산, 아질산, 황산 모노메틸 에스테르산, 시클로헥실아미노술폰산, β-히드록시부티르산, 글리신산, 글리실글리신산, 글루탐산, 카코딜산, 디아미노헥산산, 캄포르술폰산, 글루콘산, 티오시안산, 옥소글루타르산, 피리독살 5-포스페이트, 클로로페녹시아세트산, 운데칸산, N-아세틸-L-아스파르트산, 갈락타르산 및 갈락투론산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 산으로부터 제조될 수 있다.

제약상 허용가능한 유기 염기는 트리메틸아민, 디에틸아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디벤질아민, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메글루민 (N-메틸글루카민), 프로카인, 시클릭 아민, 4차 암모늄 양이온, 아르기닌, 베타인, 카페인, 클레미졸, 2-에틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄디아민, 부틸아민, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-에틸모르폴린, N-에틸피페리딘, 에틸글루카민, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 히드라바민, 이미다졸, 이소프로필아민, 메틸글루카민, 모르폴린, 피페라진, 피리딘, 피리독신, 네오디뮴, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 푸린, 테오브로민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, 메틸아민, 타우린, 콜레이트, 6-아미노-2-메틸-2-헵탄올, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올, 지방족 모노- 및 디-카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족산, 지방족 및 방향족 술폰산, 스트론튬, 트리신, 히드라진, 페닐시클로헥실아민, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산, 비스(2-히드록시에틸)아미노-트리스(히드록시메틸)메탄, N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산, 1,4-피페라진디에탄술폰산, 3-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산, 1,3-비스[트리스(히드록시메틸)메틸아미노]프로판, 4-모르폴린프로판술폰산, 4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-에탄술폰산, 2-[(2-히드록시-1,1-비스(히드록시메틸)에틸)아미노]에탄술폰산, N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산, 4-(N-모르폴리노)부탄술폰산, 3-(N,N-비스[2-히드록시에틸]아미노)-2-히드록시프로판술폰산, 2-히드록시-3-[트리스(히드록시메틸)메틸아미노]-1-프로판술폰산, 4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-(2-히드록시프로판술폰산), 피페라진-1,4-비스(2-히드록시프로판술폰산)디히드레이트, 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진프로판술폰산, N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신, N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄술폰산), N-[트리스(히드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판술폰산, N-트리스(히드록시메틸)메틸-4-아미노부탄술폰산, N-(1,1-디메틸-2-히드록시에틸)-3-아미노-2-히드록시프로판술폰산, 2-(시클로헥실아미노)에탄술폰산, 3-(시클로헥실아미노)-2-히드록시-1-프로판술폰산, 3-(시클로헥실아미노)-1-프로판술폰산, N-(2-아세트아미도)이미노디아세트산, 4-(시클로헥실아미노)-1-부탄술폰산, N-[트리스(히드록시메틸)메틸]글리신, 2-아미노-2-(히드록시메틸)-1,3-프로판디올, 및 트로메타몰을 포함한다.

본 발명의 RAGE 융합 단백질은 다양한 경로로 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질의 투여는 복강내 (IP) 주사를 이용할 수 있다. 다르게는, RAGE 융합 단백질은 경구, 비내 또는 에어로졸로서 투여할 수 있다. 다른 실시양태에서는, 정맥내 (IV) 투여한다. RAGE 융합 단백질은 피하 주사할 수도 있다. 다른 실시양태에서는, RAGE 융합 단백질을 동맥내 투여한다. 다른 실시양태에서는, 설하 투여한다. 또한, 투여는 서방형 캡슐을 이용할 수도 있다. 예를 들어, 자가 투여가 요망되는 경우에 만성 질환을 치료하는데 있어서는 피하 투여가 유용할 수 있다.

본 발명의 추가 국면에서는, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 보조 치료적 처치 또는 다른 공지된 치료제와의 병용 치료적 처치에 활용할 수 있다. 다음은 본 발명의 RAGE 융합 단백질 조절제와 병용해서 활용될 수 있는 부가의 치료제 및 보조제를 비-제한적으로 열거한 것이다:

항암제의 약리학적 분류:

1. 알킬화제: 시클로포스파미드, 니트로소우레아, 카르보플라틴, 시스플라틴, 프로카르바진

2. 항생제: 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신

3. 항대사물질: 메토트렉세이트, 시타라빈, 플루오로우라실, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 및 세포독성 암 화학요법제

4. 식물 알카로이드: 빈블라스틴, 빈크리스틴, 에토포시드, 파클리탁셀

5. 호르몬: 타목시펜, 옥트레오티드 아세테이트, 피나스테라이드, 플루타미드

6. 생체 반응 조절물질: 인터페론, 인터루킨

류마티스성 관절염 치료제에 대한 약리학적 분류:

1. 진통제: 아스피린

2. NSAID (비스테로이드계 소염 약물): 이부프로펜, 나프록센, 디클로페낙

3. DMARD (질환 완화 항류마티스약): 메토트렉세이트, 금 제제, 히드록시클로로퀸, 술파살라진

4. 생체 반응 조절물질, DMARD: 에타네르셉트, 인플릭시맵, 글루코코르티코이드, 예를 들어 베클로메타손, 메틸프레드니솔론, 베타메타손, 프레드니손, 덱사메타손 및 히드로코르티손

진성 당뇨병 치료제에 대한 약리학적 분류:

1. 술포닐우레아: 톨부타미드, 톨라자미드, 글리부리드, 글리피지드

2. 비구아니드: 메트포르민

3. 다양한 경구제: 아카르보스, 트로글리타존

4. 인슐린

알츠하이머병 치료제에 대한 약리학적 분류:

1. 콜린에스테라제 억제제: 타크린, 도네페질

2. 항정신병제: 할로페리돌, 티오리다진

3. 항우울제: 데시프라민, 플루옥세틴, 트라조돈, 파록세틴

4. 항경련제: 카르바마제핀, 발프로산.

한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 치료상 유효량의 RAGE 융합 단백질을 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 포함할 수 있다. 상기 기재된 제제 이외에도, 다음과 같은 치료제가 본 발명의 RAGE 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다: 면역억제제, 예컨대 시플로스포린, 타크롤리무스, 라파마이신 및 다른 FK-506 유형의 면역억제제.

한 실시양태에서, 본 발명은 RAGE 매개성 질환의 치료가 필요한 대상체에게 치료상 유효량의 RAGE 융합 단백질을, 알킬화제, 항대사물질, 식물 알카로이드, 항생제, 호르몬, 생체 반응 조절물질, 진통제, NSAID, DMARD, 생체 반응 조절물질 (예를 들어, 글루코코르티코이드), 술포닐우레아, 비구아니드, 인슐린, 콜린에스테라제 억제제, 항정신병제, 항우울제, 항경련제, 및 면역억제제, 예컨대 시플로스포린, 타크롤리무스, 라파마이신 및 다른 FK-506 유형의 면역억제제로 이루어진 군 중에서 선택된 치료제와 함께 투여하는 것을 포함하는, RAGE 매개성 질환을 치료하는 방법을 제공할 수 있다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 알킬화제, 항대사물질, 식물 알카로이드, 항생제, 호르몬, 생체 반응 조절물질, 진통제, NSAID, DMARD, 생체 반응 조절물질 (예를 들어, 글루코코르티코이드), 술포닐우레아, 비구아니드, 인슐린, 콜린에스테라제 억제제, 항정신병제, 항우울제, 항경련제, 및 면역억제제, 예컨대 시플로스포린, 타크롤리무스, 라파마이신 및 다른 FK-506 유형의 면역억제제로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 치료제를 추가로 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물을 제공한다.

동결건조된 제제

다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 RAGE 융합 단백질을 포함하는 제제를 제공한다. 제제의 실시양태는 동결건조 보호제, RAGE 융합 단백질, 및 완충액의 동결건조된 혼합물을 포함할 수 있다. 다양한 동결건조 보호제가 본 발명의 동결건조된 RAGE 융합 단백질 제제 중에 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 동결건조 보호제는 비환원성 당을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 비환원성 당은 수크로즈, 만니톨, 또는 트레할로스를 포함할 수 있다. 또한, 다양한 완충액은 동결건조된 RAGE 융합 단백질 제제에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충액은 히스티딘을 포함할 수 있다.

동결건조된 RAGE 융합 단백질은 부가적인 성분을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, RAGE 융합 단백질 제제는 추가적으로 계면 활성제, 킬레이트제 또는 증량제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는 서열 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37, 또는 57로 나타낸 서열을 포함하는 약 40 내지 100 mg/mL의 RAGE 융합 단백질; 약 2 mM 내지 약 50 mM의 히스티딘; 약 60 mM 내지 약 65 mM의 수크로즈; 약 0.001% 내지 약 0.05%의 트윈 80; 및 약 6.0 내지 6.5의 pH를 포함한다. 예를 들어, 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는, 특정 실시양태에서, 서열 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37, 또는 57로 나타낸 서열을 포함하는 약 40 내지 50 mg/mL RAGE 융합 단백질; 약 10 mM의 히스티딘; 약 65 mM의 수크로즈; 약 0.01 %의 트윈 80; 및 약 6.0의 pH을 포함할 수 있다. 또는, 본원에 추가로 기술된 바와 같이 RAGE 융합 단백질은 다른 농도로 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 희석제 중에서 재구성한 동결건조된 RAGE 융합 단백질을 포함하는 재구성된 제제를 포함하는데, 여기서 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 400 mg/mL 범위 내이다. 또는, 본원에 추가로 기술된 바와 같이 RAGE 융합 단백질은 다른 농도로 사용될 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 RAGE 융합 단백질의 안정적인 재구성된 제제를 제조하는 방법을 포함할 수 있다. 재구성된 제제는 직접 사용하기에 (예를 들어, 대상체에게 직접 투여) 적합하거나 또는 추가적으로 희석되고/되거나 전달제와 혼합될 수 있는 농도를 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 상기 방법은 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도가 약 1 mg/mL 내지 약 400 mg/mL의 범위 내에 있도록, 희석제 중에 RAGE 융합 단백질 및 동결건조 보호제의 동결건조된 혼합물을 재구성하는 것을 포함할 수 있다. 또는, 본원에 추가로 기술된 바와 같이 다른 농도로 사용될 수 있다.

다양한 동결건조 보호제는 본 발명의 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제 중에 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 동결건조 보호제는 비환원성 당을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비환원성 당은 수크로즈, 만니톨, 또는 트레할로스를 포함할 수 있다. 또한, 다양한 완충액이 동결건조된 RAGE 융합 단백질 제제 중에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충액은 히스티딘을 포함할 수 있다.

재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는 부가적인 성분을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, RAGE 융합 단백질 제제는 추가적으로 계면 활성제, 킬레이트제 또는 증량제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는 서열 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37, 또는 57로 나타낸 서열을 포함하는 약 40 내지 100 mg/mL의 RAGE 융합 단백질; 약 2 mM 내지 약 50 mM의 히스티딘; 약 60 mM 내지 약 65 mM의 수크로즈; 약 0.001% 내지 약 0.05%의 트윈 80; 및 약 6.0 내지 6.5의 pH를 포함한다. 예를 들어, 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는, 특정 실시양태에서, 서열 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37, 또는 57로 나타낸 서열을 포함하는 약 40 내지 50 mg/mL RAGE 융합 단백질; 약 10 mM의 히스티딘; 약 65 mM의 수크로즈; 약 0.01 %의 트윈 80; 및 약 6.0의 pH을 포함할 수 있다.

약품에 적합한 다양한 희석제가 동결건조된 RAGE 융합 단백질을 재구성하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 동결건조된 RAGE 융합 단백질을 멸균시켰다. 또한 한 실시양태에서, 희석제를 멸균시켰다. 한 실시양태에서, 희석제는 주사용수 (WFI)를 포함할 수 있다. 또한, 특정 실시양태에서, 첨가된 희석제의 양은 치료상 용량 및 RAGE 융합 단백질의 약동학적 프로파일 뿐만 아니라 투여하는 제제 및 담체의 생체적합성에 기초한다. 한 실시양태에서, 재구성된 제제는 등장성이다.

RAGE 융합 단백질 제제는 임상용 또는 조제용 약물로 사용하도록 제제화된 안정적인 치료제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는 40℃에서 1주일 후 10% 미만, 또는 5 % 미만, 또는 3% 미만의 분해를 나타낼 수 있다.

또한, RAGE 융합 단백질 제제는 희석제 중에서 재구성할 때 안정적일 수 있다. 특정 실시양태에서, 약 10%, 또는 약 5%, 또는 약 4%, 또는 약 3%, 또는 약 2%, 또는 약 1% 미만의 RAGE 융합 단백질은 RAGE 융합 단백질 제제 중에 응집물로 존재한다.

재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는 다양한 경로에 의한 투여 및 요구되는 바와 같이 관심사인 RAGE-매개성 질병의 치료를 위해 적합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는 대상체에게 제제를 정맥내, 복강내, 또는 피하 투여 중 하나 이상으로 투여하는데 적합할 수 있다.

예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 발명은 10 mg/mL 이상, 또는 20 mg/mL 이상, 또는 50 mg/mL 이상의 농도로 RAGE 융합 단백질 및 희석제를 포함하는 안정적인 재구성된 제제를 포함할 수 있는데, 여기서 재구성된 제제는 RAGE 융합 단백질 및 동결건조 보호제의 동결건조된 혼합물으로부터 제조된다. 또 다른 실시양태에서, 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도는 100 mg/mL 이상, 또는 200 mg/mL 이상, 또는 400 mg/mL 이상일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도는 약 0.5 mg/mL 내지 약 400 mg/mL, 또는 약 1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 또는 약 40 mg/mL 내지 약 400 mg/mL, 약 40 내지 100 mg/mL, 또는 약 40 내지 약 50 mg/mL의 범위 내의 농도이다. 제제는 또한 완충액을 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 RAGE 융합 단백질을 포함하는 제조 약품을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제조 약품은 동결건조된 RAGE 융합 단백질을 담는 용기, 및 희석제로 동결건조된 제제를 재구성하는 지시사항을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제조 약품은 동결건조 보호제, RAGE 융합 단백질, 및 완충액의 동결건조된 혼합물을 포함하는 제제를 담는 용기를 포함할 수 있다. 제조 약품은 또한 희석제로 동결건조된 제제를 재구성하는 지시사항을 포함할 수 있다. 다양한 동결건조 보호제는 본 발명의 제조 약품 중에 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 동결건조 보호제는 비-환원성 당을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비환원성 당은 수크로즈, 만니톨, 또는 트레할로스를 포함할 수 있다. 또한, 다양한 완충액은 동결건조된 RAGE 융합 단백질 제제에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충액은 히스티딘을 포함할 수 있다.

본 발명의 제조 약품의 RAGE 융합 단백질 제제는 부가적인 성분을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 동결건조된 RAGE 융합 단백질 제제는 추가적으로 계면 활성제, 킬레이트제 또는 증량제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 제조 약품의 한 실시양태에서, 제공된 지시사항에 따른 재구성을 할 때, RAGE 융합 단백질 제제는 서열 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37, 또는 57로 나타낸 서열을 포함하는 약 40 내지 100 mg/mL의 RAGE 융합 단백질; 약 2 mM 내지 약 50 mM의 히스티딘; 약 60 mM 내지 약 65 mM의 수크로즈; 약 0.001% 내지 약 0.05% 트윈 80; 및 약 6.0 내지 6.5의 pH를 포함한다. 예를 들어, 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는, 특정 실시양태에서, 서열 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37, 또는 57로 나타낸 서열을 포함하는 약 40 내지 50 mg/mL의 RAGE 융합 단백질; 약 10 mM의 히스티딘; 약 65 mM의 수크로즈; 약 0.01 %의 트윈 80; 및 약 6.0의 pH를 포함할 수 있다. 또는, 본원에 기재된 바와 같이 RAGE 융합 단백질을 다른 농도로 사용할 수 있다.

약품에 적합한 다양한 희석제가 동결건조된 RAGE 융합 단백질을 재구성하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 동결건조된 제제를 멸균시켰다. 다르게는 또는 부가적으로, 희석제를 멸균시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 희석제는 주사용수 (WFI)를 포함할 수 있다. 따라서, 제조 약품은 동결건조된 제제를 재구성하는 희석제를 담는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있는데, 여기서 희석제는 주사용수 (WFI)이다. 한 실시양태에서, 재구성된 제제는 등장성이다.

또한, 특정 실시양태에서, 첨가된 희석제의 양은 치료상 용량 및 RAGE 융합 단백질의 약동학적 프로파일 뿐만 아니라 투여하는 제제 및 담체의 생체적합성에 기초한다. 또 다른 실시양태에서, 지시사항은 동결건조된 제제를 재구성을 위한 것인데, 이에 따라 본원에 기재된 농도를 갖도록 한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 지시사항은 동결건조된 제제를 재구성을 위한 것인데, 이에 따라 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도는 약 40 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 범위 내이다.

제조 약품으로 제공된 RAGE 융합 단백질 제제는 임상용 또는 조제용 약물의 용도로 제조된 안정적인 치료제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제공된 지시사항에 따라 재구성될 때, RAGE 융합 단백질은 40℃에서 1주일 동안 10% 미만, 또는 5 % 미만, 또는 3% 미만의 분해를 나타낼 수 있다. 또한, RAGE 융합 단백질 제제는 희석제 중에서 재구성할 때 안정적일 수 있다. 특정 실시양태에서, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만, 또는 약 4% 미만, 또는 약 3% 미만, 또는 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만의 RAGE 융합 단백질이 RAGE 융합 단백질 제제 중 응집물로 존재한다.

또한, 특정 실시양태에서, 제공된 지시사항에 따라 재구성할 때, 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는 다양한 경로에 의한 투여 및 요구되는 바와 같이 관심사인 RAGE-매개성 질병의 치료를 위해 적합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제는 대상체에게 제제를 정맥내, 복강내, 또는 피하 투여 중 하나 이상으로 투여하는데 적합할 수 있다.

제제, 제조 약품, 및 RAGE 융합 단백질을 포함하는 제제의 제조 방법의 특정 실시양태에서, 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도는 10 mg/mL 이상, 또는 20 mg/mL 이상, 또는 50 mg/mL 이상일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도는 100 mg/mL 이상, 또는 200 mg/mL 이상, 또는 400 mg/mL 이상일 수 있다. 예를 들어, 또 다른 실시양태에서, 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도는 약 0.5 내지 400 mg/mL 이상, 또는 약 1 내지 200 mg/mL 이상, 40 내지 400 mg/mL, 50 내지 400 mg/mL, 40 내지 100 mg/mL, 50 내지 100 mg/mL, 또는 약 40 내지 50 mg/mL일 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시양태에서, RAGE 융합 단백질은 약 5.0 내지 약 6.5 범위의 pH를 갖고, 약 1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 RAGE 융합 단백질, 약 1 밀리몰 내지 약 100 밀리몰의 히스티딘 완충액, 약 0.01 mg/mL 내지 약 10 mg/mL의 폴리소르베이트 80, 약 100 밀리몰 내지 약 400 밀리몰의 트레할로스 및 약 0.01 밀리몰 내지 약 1.0 밀리몰의 EDTA 이나트륨(2수화물)을 포함하는 멸균 수용액으로 제제 중에 투여한다.

본원에 기재된 임의의 실시양태는 본 발명의 제제 중 RAGE 융합 단백질로 사용될 수 있다. 따라서, 각각의 동결건조된 제제, 재구성된 동결건조된 제제, 또는 동결건조된 제제 또는 재구성된 동결건조된 제제의 제조 방법, 또는 본 발명의 동결건조된 제제 또는 재구성된 동결건조된 제제을 포함하는 제조 약품에 대해, RAGE 융합 단백질은 이뮤노글로불린 폴리펩티드에 연결된 RAGE 리간드 결합 부위 유래된 서열을 포함할 수 있다.

따라서, RAGE 융합 단백질의 실시양태는 본원에 기재된 바와 같이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, RAGE 폴리펩티드는 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미 노산에 연결되도록, RAGE 이뮤노글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질의 특정 실시양태는 제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 C_H2 이뮤노글로불린 도메인 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 일부의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제1 RAGE 도메인간 링커를 포함할 수 있다.

예를 들어, RAGE 융합 단백질의 또 다른 실시양태에서, RAGE 폴리펩티드는 서열 10으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열, 또는 서열 47로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, RAGE 융합 단백질은 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57 중 하나 이상으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37, 또는 57과 90% 이상 동일한 서열은 C-말단 리신을 수반하지 않은 서열 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37, 또는 57의 폴리펩티드를 포함한다.

동결건조된 제제의 제조

다른 실시양태에서, 본 발명은 예비-동결건조된 제제, 동결건조된 제제, 재구성된 제제, 및 그의 제조 방법을 제공한다. 상기에 기재된 바와 같이 관심사인 RAGE 융합 단백질을 제조한 후, "예비-동결건조된 제제"는 제조될 수 있다. 예비-동결건조된 제제 중에 존재하는 RAGE 융합 단백질의 양은 원하는 투여 용적, 투여 방식 등을 고려하여 측정할 수 있다. 한 실시양태에서, 예비-동결건조된 제제 중 융합 단백질의 양은 1 mg/mL 초과일 수 있다. 또한, 특정 실시양태에서, 예비-동결건조된 제제 중 융합 단백질의 양은 약 5 mg/mL, 10 mg/mL, 50 mg/mL, 100 mg/mL, 또는 200 mg/mL 미만일 수 있다.

추가적인 실시양태에서, 예비-동결건조된 제제는 약 4 내지 8의 pH의 pH-완충액일 수 있다. 다른 실시양태에서, 예비-동결건조된 제제는 약 5 내지 7의 pH의 pH-완충액일 수 있다. 다른 실시양태에서, 예비-동결건조된 제제는 6.7 미만의 pH의 pH-완충액일 수 있다. 다른 실시양태에서, 예비-동결건조된 제제는 약 6.0의 pH의 pH-완충액일 수 있다. 예시적인 완충액은 히스티딘, 포스페이트, 트리스, 시트레이트, 숙시네이트 및 본원에 기재된 다른 유기산을 포함한다. 완충액 농도는, 완충액 및 원하는 등장성의 제제 (예를 들면 재구성된 제제)에 따라, 약 1 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 50 mM 미만, 또는 약 2 mM 내지 약 50 mM, 또는 약 15 mM 미만, 또는 약 3 mM 내지 약 15 mM일 수 있다. 한 실시양태에서, 완충액은 히스티딘이다.

동결건조 보호제는 예비-동결건조된 제제에 첨가될 수 있다. 한 실시양태에서, 동결건조 보호제는 당을 포함한다. 다른 실시양태에서, 동결건조 보호제는 비환원성 당을 포함한다. 다른 실시양태에서, 동결건조 보호제는 비환원성 당인 수크로즈를 포함한다. 또는, 비환원성 당은 만니톨을 포함할 수 있다. 또는, 비환원성 당은 트레할로스를 포함할 수 있다. 예비-동결건조된 제제 중 동결건조 보호제의 양은 일반적으로 재구성할 때 생성된 제제가 등장성이 되는 양이다. 그러나, 재구성된 고장성(hypertonic)의 제제가 또한 적합할 수 있고, 예를 들어 말초 비경구 투여에 대한 제제 중에 또한 적합할 수 있다. 또한, 동결건조 보호제의 양은 허용될 수 없는 단백질의 분해 및/또는 응집된 양은 동결건조 시에 일어나도록 상당히 낮지 않아야만 한다. 또 다른 실시양태에서, 허용될 수 없는 응집량은 RAGE 융합 단백질의 20%, 또는 10%, 또는 5% 이상이 제제 중에 응집물로 존재하는 경우일 수 있다. 예비-동결건조된 제제 중 예시적인 범위의 동결건조 보호제 농도는 약 400 mM 미만일 수 있다. 다른 실시양태에서, 예비-동결건조된 제제 중 동결건조 보호제 농도의 범위는 약 100 mM 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 따라서 예비-동결건조된 제제 중 동결건조 보호제 농도의 범위는 약 0.5 mM 내지 400 mM, 또는 약 2 mM 내지 200 mM, 또는 약 30 mM 내지 약 150 mM, 또는 약 60-65 mM의 범위 내일 수 있다. 또한, 몇몇 실시양태에서, 동결건조 보호제는 재구성된 제제에 등장성을 부여하는 양으로 첨가된다.

예비-동결건조된 제제 중 RAGE 융합 단백질의 동결건조 보호제에 대한 비율은 각 RAGE 융합 단백질 및 동결건조 보호제의 조합을 위해 선택된다. 높은 RAGE 융합 단백질 농도 (예를 들어, 약 50 mg/mL 이상)를 갖는 등장성 재구성된 제제의 한 실시양태에서, RAGE 융합 단백질에 대한 동결건조 보호제의 몰비는 1 몰의 RAGE 융합 단백질에 대해 약 50 내지 약 1500 몰의 동결건조 보호제일 수 있다. 다른 실시양태에서, RAGE 융합 단백질에 대한 동결건조 보호제의 몰비는 1 몰의 RAGE 융합 단백질에 대해 약 150 내지 약 1000 몰의 동결건조 보호제일 수 있다. 다른 실시양태에서, RAGE 융합 단백질에 대한 동결건조 보호제의 몰비는 1 몰의 RAGE 융합 단백질에 대해 약 150 내지 약 300 몰의 동결건조 보호제일 수 있다. 예를 들어, 이들 범위는 동결건조 보호제가 비환원성 당, 예를 들어 수크로즈, 트레할로스 또는 만니톨인 경우에 적절할 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 계면 활성제는 예비-동결건조된 제제에 첨가될 수 있다. 다르게는, 또는 부가적으로, 계면 활성제는 동결건조된 제제 및/또는 재구성된 제제에 첨가될 수 있다. 예시적인 계면 활성제는 비이온성 계면 활성제 예를 들면 폴리소르베이트 (예를 들면 폴리소르베이트 20 또는 80) (트윈 20^TM 또는 트윈 80^TM; 폴록사머 (예를 들면 폴록사머 188)를 포함한다. 첨가된 계면 활성제의 양은 재구성된 단백질의 응집을 감소시키고, 재구성 후 미립자가 형성되는 것을 최소화하는 양이다. 예를 들어, 계면 활성제는 예비-동결건조된 제제 중에 약 0.001% 내지 0.5%의 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 계면 활성제는 폴리소르베이트 80이고, 계면 활성제는 예비-동결건조된 제제 중에 약 0.005% 내지 0.05%, 또는 약 0.008% 내지 0.012%, 또는 약 0.01%의 양으로 존재할 수 있다. 다르게는, 계면 활성제는 제제 중에 0.001 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 또는 약 0.01 mg/mL 내지 약 10 mg/mL의 범위의 최종 농도를 포함하도록 존재할 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 동결건조 보호제 (예를 들면 수크로즈 또는 히스티딘) 및 증량제 (예를 들면 만니톨 또는 글리신)의 혼합물은 예비-동결건조 제제의 제조 중에 사용될 수 있다. 증량제는 과량의 포켓을 함유하지 않는 균일한 동결건조된 케이크의 제조를 가능하게 할 수 있다.

제제의 원하는 특징에 부정적인 영향을 주지 않는다는 조건으로, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기술된 것과 같은 기타 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제가 예비-동결건조된 제제 (및/또는 동결건조된 제제 및/또는 재구성된 제제) 중에 포함될 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 용량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이고, 부가적인 완충제; 방부제; 공용매; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; EDTA 같은 킬레이트제; 금속 복합체 (예를 들면 Zn-단백질 복합체); 생물분해성이 있는 중합체, 예를 들어 폴리에스테르; 및/또는 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨을 포함한다.

본 발명의 RAGE 융합 단백질 제제는 또한 치료할 특정 용도를 위해 필요한 부가적인 단백질을 함유할 수 있다. 부가적인 단백질은 각 단백질이 서로 또는 RAGE 융합 단백질에 부정적인 영향을 주지 않는 상보적인 활성을 갖도록 선택될 수 있다. 상기 단백질은 의도하는 목적을 위해 효율적인 양으로 적합하게 조합하여 존재한다.

본 발명의 RAGE 융합 단백질 제제는 생체 투여에 있어서 멸균될 수 있다. 이것은 멸균 여과막을 통해, 동결건조 및 재구성 전후에 여과하여 달성할 수 있다.

RAGE 융합 단백질, 동결건조 보호제 및 다른 임의의 성분이 함께 혼합된 후, 상기 제제는 동결건조될 수 있다. 상기 목적으로 위해 다수의 상이한 동결-건조기, 예를 들면 훌(Hull)50^TM(훌, 미국 소재) 또는 GT20^TM(레이볼트-헤라우스(Leybold-Heraeus), 독일 소재) 동결-건조기가 이용가능하다. 동결-건조는 제제를 동결시키고, 이어서 1차 건조를 위해 적합한 온도에서 동결 함유물로부터 얼음을 승화시켜 달성된다. 상기 조건하에서, 생성 온도는 제제의 공융점 또는 붕괴 온도 미만이다. 전형적으로, 1차 건조를 위한 선반 온도는, 적절한 압력, 전형적으로 약 50 내지 250 mTorr의 범위에서, 약 -50 내지 25℃의 범위 내일 것이다 (1차 건조에서 생성물이 동결된 채로 유지된다는 조건). 한 실시양태에서, 압력은 약 100 mTorr이고, 샘플은 약 -30 내지 25℃에서 동결건조될 수 있다. 제제, 샘플을 담는 용기 (예를 들어, 유리 바이알)의 크기 및 유형 및 액체의 용적은 건조를 위해 필요한 시간 (수시간 내지 수일의 범위일 수 있음 (예를 들어, 40 내지 60시간))을 알려줄 수 있다. 동결-건조 조건은 제제 및 바이알의 크기에 따라 다양할 수 있다.

몇몇 예에서, 전이 단계를 막기 위해 단백질의 재구성을 수행하는 용기 내에서 단백질 제제를 동결건조하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 예에서, 용기는, 예를 들어, 2, 3, 5, 10, 20, 50, 100, 또는 250 cc의 바이알일 수 있다. 한 실시양태에서, 용기는 100 mL 이하의 용적을 갖는 재구성된 제제를 제조하는데 적합한 임의의 용기이다.

일반적인 조건에서, 동결건조로 수분 함량이 약 5% 미만인 동결건조된 제제를 얻을 것이다. 한 실시양태에서, 동결건조된 제제의 수분 함량은 약 3% 미만이다. 다른 실시양태에서, 동결건조된 제제의 수분 함량은 약 1% 미만이다.

동결건조된 제제의 재구성

원하는 단계에서, 전형적으로는 환자 또는 대상체에게 RAGE 융합 단백질을 투여할 때, 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도가 약 10 mg/mL 초과, 또는 20 mg/ml 초과, 또는 50 mg/mL 초과, 또는 약 30 내지 50 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL이도록 동결건조된 제제를 희석제로 재구성할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도는 100 mg/mL, 또는 200 mg/mL, 또는 400 mg/mL 이상일 수 있다. 예를 들어, 또 다른 실시양태에서, 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 600 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 500 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 400 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 400 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 40 mg/mL 내지 약 400 mg/mL, 약 40 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 약 400 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL 범위 내일 수 있다. 다른 실시양태에서, 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도는 약 40 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 또는 약 40 mg/mL 내지 약 50 mg/mL이다. 상기 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도는 재구성된 제제의 피하 전달을 목적으로 할 때 특히 유용한 것으로 생각된다. 그러나, 다른 경로의 투여, 예를 들면 정맥내 투여를 위해서는, 재구성된 제제 중 단백질의 농도를 더 낮추는 것이 바람직할 수 있다 (예를 들어 재구성된 제제 중 약 5 내지 50 mg/mL, 약 10 내지 40 mg/mL의 RAGE 융합 단백질). 따라서, 몇몇 실시양태에서, 재구성된 제제 중 융합 단백질의 농도는 예비-동결건조된 제제 중 융합 단백질의 농도와 동일하거나 2배 미만일 수 있다.

특정 실시양태에서, 재구성된 제제 중 융합 단백질 농도는 유의적으로 예비-동결건조된 제제 중의 융합 단백질의 농도보다 높다. 예를 들어, 재구성된 제제 중 융합 단백질 농도는, 특정 실시양태에서, 예비-동결건조된 제제의 약 2 내지 40, 또는 2 내지 10, 또는 3 내지 8배일 수 있다. 한 실시양태에서, 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도는 예비-동결건조된 제제 중 RAGE 융합 단백질의 농도보다 약 3 내지 6배일 수 있다. 다른 실시양태에서, 예비-동결건조된 제제 중 RAGE 융합 단백질의 농도가 약 15 mg/mL이고, 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질의 농도는 약 50 mg/mL 이상이다 (예를 들어, 3배 이상 또는 4배 이상더 크다).

용적 제한 (1.5 mL 이하) 및 용량 조건 (100 mg 이상) 때문에, 높은 단백질 농도의 전달은 종종 유리하거나 피하 투여에 필요하다. 그러나, 고농도에서 단백질은 공정 도중에 응집하는 경향을 가질 수 있으며, 조정하기 어려워지기 때문에 (예를 들면, 펌프 및 멸균 여과기), 단백질 농도 (50 mg/mL 이상)는 제조 공정에서 달성하기 어려울 수 있다. 다르게는, 동결건조 공정은 단백질의 농축물을 가능하게 하는 방법을 제공할 수 있다. 예를 들어, RAGE 융합 단백질은 용적 (Vf)으로 바이알을 채운 후, 동결건조될 수 있다. 동결건조된 RAGE 융합 단백질은 그다음 본래 용적보다 더 적은 용적 (Vr)의 (예를 들면, Vr=0.25 Vf) 물 또는 방부제 (예를 들면, BWFI)로 재구성하여 재구성된 용액 중 더 높은 RAGE 융합 단백질 농축물을 얻는다. 이 공정은 또한 완충액 및 부형제의 농축물을 얻는다. 피하 투여에 있어서, 용액은 바람직하게는 등장성이다.

경우에 따라, 다른 온도가 사용될 수 있지만, 재구성은 일반적으로 약 25℃의 온도에서 이루어져 수화의 완결을 보장한다. 재구성을 위해 필요한 시간은, 예를 들어, 희석제의 유형, 부형제(들)의 양 및 단백질에 따라 달라질 수 있다. 희석제의 예는 멸균수, 정균성 주사용수 (BWFI), pH 완충액 (예를 들어 인산-완충액 염수), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 한 실시양태에서, 희석제는 주사에 적합한 재구성된 제제를 제공한다. 다른 실시양태에서, 희석제가 주사에 적합한 재구성된 제제를 제공하고, 희석제가 주사용수 (WFI)를 포함한다. 임의로 상기 희석제는 방부제를 함유한다. 사용한 방부제의 양은 단백질과의 양립가능성을 위한 상이한 방부제 농도의 분석 및 방부제 효율성 시험에 의해 결정될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 재구성된 제제는 50 mL 용기 당 크기가 10㎛ 이상인 8,000 미만, 또는 6,000 미만, 또는 4,000 미만, 또는 2,000 미만, 또는 1,000 미만, 또는 600 미만, 또는 400 미만, 또는 200 미만 또는 100 미만, 또는 50 미만 개의 입자를 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 재구성된 제제는 50 mL 용기 당 크기가 25㎛ 이상인 8,000 미만, 또는 6,000 미만, 또는 4,000 미만, 또는 2,000 미만, 또는 1,000 미만, 또는 600 미만, 또는 400 미만, 또는 200 미만 또는 100 미만, 또는 50 미만 개의 입자를 가질 수 있다.

재구성된 제제의 투여

재구성된 제제는 RAGE 융합 단백질로 포유류, 예를 들어 인간을 치료하기 위해 공지된 방법, 예를 들어 정맥내 (예를 들어 볼루스 또는 일정 시간 지속 주입), 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액낭내, 초내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해 투여될 수 있다.

실시양태에서, 상기 재구성된 제제는 피하 (즉, 피부 아래) 투여에 의해 포유류에게 투여될 수 있다. 상기 목적을 위해, 재구성된 제제는 주사기를 사용하여 투여될 수 있다. 그러나, 재구성된 제제의 투여를 위한 다른 기구를 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면 주사기 (예를 들면 인젝트-이즈(Inject-ease^TM)및 젠젝트(Genject^TM) 기구); 인젝터 펜 (예를 들면, 젠펜(GenPen)^TM); 바늘이 없는 기구 (예를 들면 메디젝터(MediJector)^TM및 바이오젝터(BioJector)^TM); 및 피하 패치 전달계가 있다.

RAGE 융합 단백질의 적절한 용량 또는 치료상 유효량은, 예를 들어, 치료의 조건, 상태의 심각성 및 경과, RAGE 융합 단백질이 예방의 목적을 위해 투여하는지 또는 치료의 목적을 위해 투여하는지 여부, 과거 치료 기록, 환자의 의료 기록 및 RAGE 융합 단백질에의 반응, 및 주치의의 소견에 따라 달라질 것이다. RAGE 융합 단백질은 대상체 (예를 들어, 환자)에게 한번 또는 수차례의 치료에서 투여되거나 또는 환자에게 진단시부터 계속해서 임의의 시기에 수차례 투여될 수 있다. RAGE 융합 단백질은 단독 치료로 투여되거나 또는 문제가 되는 상태를 치료하는데 유용한 다른 약물 또는 치료와 병행하여 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 1회 이상의 개별 투여에 의한 경우, 대상체에게 투여하기 위한 초기 후보 용량은 약 0.1 내지 20 mg/kg이다. 상기에 기술된 바와 같이, 다른 용량 용법이 유용할 수 있다.

제조 약품

본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명의 동결건조된 제제를 함유하고, 그의 재구성 및/또는 용도에 대한 지시사항을 제공하는 제조 약품을 제공한다. 제조 약품은 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알 (예를 들어 듀얼 챔버 바이알), 주사기 (예를 들어 듀얼 챔버 주사기) 및 테스트 튜브를 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 동결건조된 제제를 담아둘 수 있다. 특정 실시양태에서, 용기에 부착된 또는 용기와 관련된 라벨이 있을 수 있다. 라벨은 재구성 및/또는 용도에 대한 지시사항을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 라벨은 동결건조된 제제가 상기에 기술된 바와 같은 단백질 농도로 재구성되었음을 나타낼 수 있다. 상기 라벨은 추가적으로 제제가 피하 투여용이거나 피하 투여에 유용함을 나타낸다.

제제를 담는 용기는 재구성된 제제의 반복 투여 (예를 들어, 2 내지 6, 또는 2 내지 10, 또는 2 내지 50 투여)를 가능하게 하는 다용도의 바이알일 수 있다. 제조 약품은 추가적으로 적합한 희석제 (예를 들어, WFI)를 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 희석제 및 동결건조된 제제를 혼합할 때, 재구성된 제제 중 최종 RAGE 융합 단백질 농도는 일반적으로 10 mg/mL 이상일 것이다. 한 실시양태에서, 재구성된 제제 중 최종 RAGE 융합 단백질 농도는 약 20 mg/mL 이상이다. 다른 실시양태에서, 재구성된 제제 중 최종 RAGE 융합 단백질 농도는 약 50 mg/mL 이상이다. 또 다른 실시양태에서, 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도는 100 mg/mL 이상, 또는 200 mg/mL 이상, 또는 400 mg/mL 이상일 수 있다. 다른 실시양태에서, 재구성된 제제 중 최종 RAGE 융합 단백질 농도는 약 1 내지 400 mg/mL, 또는 1 내지 200 mg/mL, 또는 1 내지 100 mg/mL, 또는 10 내지 400 mg/mL, 또는 10 내지 200 mg/mL, 또는 10 내지 100 mg/mL, 또는 40 내지 400 mg/mL, 또는 40 내지 200 mg/mL, 또는 40 내지 100 mg/mL, 또는 50 내지 400 mg/mL, 또는 50 내지 200 mg/mL, 또는 50 내지 100 mg/mL, 또는 40 mg/mL 내지 50 mg/mL이다. 제조 약품은 추가적으로 기타 완충액, 희석제, 여과기, 바늘, 주사기, 및 사용에 대한 지시사항을 넣은 사용설명서를 포함하는, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 포함할 수 있다.

본 발명에 포괄되는 본 발명의 특징과 이점이 다음 실시예에 추가로 예시되 어 있다.

실시예 1A: RAGE 융합 단백질의 생성

RAGE-IgG 융합 단백질을 발현하는 두 혈장을 구축하였다. 인간 RAGE로부터의 상이한 길이의 5' cDNA 서열을 인간 IgG Fc (γ1)로부터의 동일한 3' cDNA 서열과 연결시킴으로써 두 혈장을 모두 구축하였다. 이어서, 이들 발현 서열 (즉, 연결 생성물)을 pcDNA3.1 발현 벡터 (인비트로젠(Invitrogen), CA)에 삽입하였다. 상기 RAGE 융합 단백질 코딩 영역을 코딩하는 핵산 서열이 도 2 및 3에 도시되었다. TTP-4000 RAGE 융합 단백질의 경우, 핵산 서열 1 내지 753 (진하게 강조)은 RAGE N-말단 단백질 서열을 코딩하는 반면, 핵산 서열 754 내지 1386은 힌지 없는 IgG Fc 단백질 서열을 코딩하였다 (도 2). TTP-3000의 경우, 핵산 서열 1 내지 408 (진하게 강조)은 RAGE N-말단 단백질 서열을 코딩하는 반면, 핵산 서열 409 내지 1041은 힌지 없는 IgG Fc 단백질 서열을 코딩하였다 (도 3).

RAGE 융합 단백질을 생성시키기 위해, 서열 30 또는 서열 31의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 CHO 세포 내로 안정적으로 형질감염시켰다. 양성 형질전환체를 혈장에 의해 부여된 네오마이신 내성에 대해 선별하고, 이를 클로닝하였다. 상층액을 웨스턴 블롯 분석함으로써 검출된 바와 같이 고 수준으로 생산하는 클론을 확장시켰으며, 단백질 A 칼럼을 사용하여 친화 크로마토그래피를 수행함으로써 유전자 생성물을 정제하였다. 세포가 재조합 TTP-4000을 약 1.3 그램/리터 수준으로 생성시키도록 발현을 최적화하였다.

실시예 1B: 4개 도메인 RAGE 융합 단백질의 대체적 생성

RAGE-IgG 융합 단백질을 발현하는 혈장을 구축하였다. 인간 RAGE로부터의 5' cDNA 서열을 Fc 힌지 영역이 없는 인간 IgG Fc(γ1)로부터의 3' cDNA 서열과 연결시킴으로써 혈장을 구축하였다. PCR을 사용하여 cDNA를 증폭시켰다. 또한, 5' 말단 상에서, PCR 프라이머는 클로닝으로부터의 EcoRI 제한 효소 부위 및 Kozak 공통 번역 개시 서열을 첨가하였다. 3' 말단 상에서, PCR 프라이머는 종결 코돈 바로 뒤에 Xho I 제한 효소 부위를 첨가하였다. 3' 말단 상에서, PCR 프라이머는 또한 종결 코돈 부근의 이뮤노글로불린 부분에서 크립틱 RNA 스플라이스 부위를 제거한 두 사일런트 염기 변화를 포함하였다. 프롤린 (서열 32의 단백질 서열의 번호지정에 기초하여 잔기 459)을 코딩하는 코돈을 CCG에서 CCC로 변화시키고, 글리신 (서열 32의 단백질 서열의 번호지정에 기초하여 잔기 460)을 코딩하는 코돈을 GGT에서 GGG로 변화시켰다. PCR 단편을 Eco RI 및 Xho I으로 분해한 후에, Mfe I (Eco RI과 상용성 말단을 형성하기 위함)로 분해한 레트로벡터 혈장 (pCNS-newMCS-WPRE (new ori), 갈라, 인크.(Gala, Inc.)로부터 입수가능함)에 삽입하고, Xho I으로 분해하였다. 클로닝된 혈장의 삽입된 부분 및 클로닝 연결부를 서열분석하여 클로닝 동안 돌연변이가 일어나지 않도록 하였다.

RAGE-IgG 융합 단백질을 생성하기 위해, 서열 54의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 CHO 세포에 안정하게 형질감염시켰다.

형질감염된 세포에 의해 발현되어 단리된 RAGE 융합 단백질 TTP-4000의 서열은 서열 34 또는 서열 56, 또는 서열 34 및 서열 56 둘 모두로 다양한 특성화 연구에 의해 확인하였다. 따라서, 서열 32의 처음 23개 아미노산에 의해 코딩되는 신 호 서열을 절단하였으며, N-말단 잔기는 글루타민 (Q) 또는 피로글루탐산 (pE), 또는 이들의 혼합물이었다. 특성화 연구는 또한 N2 및 N288 (서열 34 또는 서열 56의 번호지정에 기초함)에서 글리코실화 부위를 보여주고, RAGE 융합 단백질의 C_H3 영역이 이 재조합 시스템에서 발현될 때 번역후 변형을 통해 분리된 그의 C-말단 잔기를 가질 수 있음을 보여준다.

실시예 1C: 3개 도메인 RAGE 융합 단백질의 대체적 생성

TTP-4000에 대해 상기에서 기술한 방식으로 TTP-3000과 같은 3개의 도메인 RAGE-IgG 융합 단백질 (예를 들어, 1개의 RAGE 도메인 및 2개의 IgG 도메인)을 발현하기 위해 혈장을 구축할 수 있다. 인간 RAGE로부터의 5' cDNA 서열을 Fc 힌지 영역이 없는 인간 IgG Fc(γ1)로부터의 3' cDNA 서열과 연결시킴으로써 혈장을 구축하였다. PCR을 사용하여 cDNA를 증폭시켰다. 5' 말단 상에서, PCR 프라이머는 클로닝으로부터의 EcoRI 제한 효소 부위 및 Kozak 공통 번역 개시 서열을 첨가할 수 있었다. 3' 말단 상에서, PCR 프라이머는 종결 코돈 바로 뒤에 제한 효소 부위(예를 들어, Xho I 제한 효소 부위)를 또한 첨가할 수 있었다. PCR 프라이머는 또한 실시예 1B에 기술된 바와 같은 이뮤노글로불린 C_H2 도메인의 3' 말단 상에 위치한 크립틱 RNA 스플라이스 부위와 같은 임의의 크립틱 RNA 스플라이스 부위를 제거하는데 필요할 수 있는 사일런트 염기 변화를 포함할 수 있었다. 이들 크립틱 스플라이스 부위를 제거하기 위해, 서열 35의 프롤린 344 (서열 31의 단백질 서열의 번호지정에 기초하여 잔기 1030-1032)를 코딩하는 코돈을 CCG에서 CCC로 변화시 키고, 서열 35의 글리신 345 (서열 31의 단백질 서열의 번호지정에 기초하여 잔기 1033-1035)을 코딩하는 코돈을 GGT에서 GGG로 변화시킬 수 있었다. PCR 단편을 적절한 제한 효소 (예를 들어, Eco RI 및 Xho I)로 분해한 후에, 레트로벡터 혈장 pCNS-newMCS-WPRE ((new ori), 갈라, 인크.(Gala, Inc.)로부터 입수가능함)에 삽입할 수 있었다. 벡터는 Mfe I (Eco RI과 상용성 말단을 형성하기 위함)로 분해하고 또한 Xho I으로 분해할 수 있었다. 클로닝된 혈장 및 클로닝 연결부의 삽입된 부위는 클로닝 도중 발생하는 돌연변이가 없도록 서열화될 수 있다.

RAGE-IgG 융합 단백질을 생성하기 위해, 실시예 1A 및 1B에 기재된 바와 같이 서열 55의 핵산 서열을 포함 (즉, 크립틱 스플라이스 부위(cryptic splice sites)를 제거하기 위해 DNA 서열을 변화하는 것을 포함)하는 발현 벡터를 CHO 세포에 안정하게 형질감염시켰다.

형질감염된 세포에 의해 발현된 단리된 RAGE 융합 단백질 TTP-3000의 서열은 서열 36, 서열 37 또는 서열 57, 또는 서열 36, 서열 37 및/또는 서열 57의 조합이다. 따라서, 서열 35의 처음 22 및/또는 23개 아미노산에 의해 코딩되는 신호 서열을 절단할 수 있으며, N-말단 잔기는 글루타민 (Q) 또는 피로글루탐산 (pE), 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 글리코실화는 N2 및 N174 (서열 37 또는 서열 57의 번호지정에 기초함)의 부위 및/또는 존재할 수 있는 다른 글리코실화 부위에서 일어날 수 있다. RAGE 융합 단백질의 C_H3 영역이 이 재조합 시스템에서 발현될 때 번역후 변형을 통해 분리된 그의 C-말단 잔기를 가질 수 있다.

실시예 2: RAGE-IgG1 융합 단백질의 활성을 시험하는 방법

A. 시험관내 리간드 결합:

공지의 RAGE 리간드를 웰당 5 마이크로그램의 농도로 맥시소르브 플레이트 표면 상에 피복시켰다. 플레이트를 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 리간드를 인큐베이션한 후에, 플레이트를 흡인시키고, 50 mM 이미다졸 완충액 (pH 7.2) 중 1％ BSA의 차단 완충액을 실온에서 1시간 동안 상기 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 상기 플레이트를 흡인시키고/시키거나 세척 완충액 (20 mM 이미디졸, 150 mM NaCl, 0.05％ 트윈-20, 5 mM CaCl₂ 및 5 mM MgCl₂, pH 7.2)으로 세척하였다. 초기 농도가 1.082 mg/ml인 TTP-3000 (TT3)의 용액과 초기 농도가 370 ㎍/ml인 TTP-4000 (TT4)의 용액을 제조하였다. RAGE 융합 단백질을 초기 샘플의 희석률을 증가시키면서 첨가하였다. RAGE 융합 단백질을 37℃에서 1시간 동안 고정된 리간드와 함께 인큐베이션한 다음, 플레이트를 세척하고, RAGE 융합 단백질의 결합을 알아보기 위해 검정하였다. 결합은 21 ng/100 ㎕의 최종 검정 농도 (FAC)가 되도록 1:11,000으로 희석시킨 모노클로날 마우스 항-인간 IgG1, 500 ng/㎕의 FAC가 되도록 1:500으로 희석시킨 바이오티닐화 염소 항-마우스 IgG, 및 아비딘-연결된 알칼리성 포스파타제를 함유하는 면역검출 복합체를 부가함으로써 검출하였다. 이 복합체를 실온에서 1시간 동안 고정된 RAGE 융합 단백질과 함께 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척하고, 알칼리성 포스파타제 기질 파라-니트로페닐포스페이트 (PNPP)를 첨가하였다. 고정된 RAGE 융합 단백질에 대한 상기 복합체의 결합은, PNPP가 파라-니트 로페놀 (PNP)로 전환되는 양을 측정함으로써 정량화하였다 (이는 405 nm에서 분광광도계로 측정하였다).

도 7에 예시된 바와 같이, RAGE 융합 단백질 TTP-4000 (TT4) 및 TTP-3000 (TT3)은 공지된 RAGE 리간드 아밀로이드-베타 (A베타), S100b (S100), 및 암포테린 (Ampho)과 특이적으로 상호작용하였다. 리간드의 부재 하에서는, 즉 BSA 피복재 단독 (BSA 또는 BSA + 세척액) 하에서는, 면역검출 복합체의 비-특이적 결합에 기인한 수준 전반에 걸쳐 흡광도 증가가 전혀 나타나지 않았다. 아밀로이드 베타를 표지된 리간드로서 사용하는 경우에는, 검정하기 전에 아밀로이드 베타를 예비-인큐베이션하는 것이 필요할 수도 있다. 예비-인큐베이션은 아밀로이드 베타가 주름진 시트 형태로 자가-응집할 수 있게 해주는데, 이는 아밀로이드 베타가 주름진 시트 형태로 RAGE에 우선적으로 결합할 수 있기 때문이다.

RAGE 융합 단백질 TTP-4000 및 TTP-3000과 RAGE 리간드 간에 특이적 상호작용이 존재한다는 명백한 부가의 증거는, RAGE 리간드가 RAGE 융합 단백질에 대한 결합을 놓고 공지된 RAGE 리간드와 효과적으로 경쟁할 수 있다는 것을 보여주는 연구에서 예시되었다. 이들 연구에서는, 아밀로이드-베타 (A-베타)를 맥시소르브 플레이트에 고정시키고, RAGE 융합 단백질을 상기 언급된 바와 같이 첨가하였다. 또한, RAGE 리간드를 RAGE 융합 단백질과 동시에 몇몇 웰에 첨가하였다.

TTP-4000이 123 ㎍/ml로 존재하는 경우에는 (1:3 희석률, 도 8), RAGE 리간드가 TTP-4000 (TT4)의 결합을 약 25％ 내지 30％ 정도 차단시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. TTP-4000의 초기 용액을 10 또는 30 배 희석시킨 경우에는 (1:10 또는 1:30), 고정된 리간드에 대한 RAGE 융합 단백질의 결합이 RAGE 리간드에 의해 완전히 억제되었다. 이와 유사하게, TTP-3000이 360 ㎍/ml로 존재하는 경우에는 (1:3 희석률, 도 9), RAGE 리간드가 TTP-3000 (TT3)의 결합을 약 50％ 정도 차단시켰다. TTP-3000의 초기 용액을 10 배 희석시킨 경우에는 (1:10), 고정된 리간드에 대한 RAGE 융합 단백질의 결합이 RAGE 리간드에 의해 완전히 억제되었다. 따라서, RAGE 리간드에 대한 RAGE 융합 단백질의 결합 특이성은 투여량 의존적이었다. 또한, 도 8 및 9에 도시된 바와 같이, RAGE 융합 단백질의 부재 하에서는, 즉 면역검출 복합체 만을 사용해서는 ("복합체 단독") 본질적으로 결합이 전혀 검출되지 않았다.

B. 세포 기초 검정에서 RAGE 융합 단백질의 효과

기존의 연구 결과는, 골수성 THP-1 세포가 RAGE 리간드에 반응하여 TNF-α를 분비할 수 있음을 보여주었다. 이러한 검정에서는, THP-1 세포를 ATCC에 의해 제공된 프로토콜을 사용하여 10％ FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. RAGE 융합 단백질 TTP-3000 (TT3) 또는 TTP-4000 (TT4) (10 ㎍), sRAGE (10 ㎍), 및 인간 IgG (10 ㎍) (즉, 음성 대조군으로서)의 부재 및 존재 하에 RAGE를 0.1 mg/ml S100b로 자극함으로써 TNF-α를 분비하도록 상기 세포를 유도시켰다. THP-1 세포에 의해 분비된 TNF-α의 양은, TNF-α에 대한 시판용 ELISA 키트 (알앤드디 시스템즈(R＆D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 사용하여 상기 단백질을 세포 배양물에 첨가하고 24시간 후에 측정하였다. 도 10의 결과는 RAGE 융합 단백질이 이들 세포에서 S100b/RAGE-유도된 TNF-α 생성을 억제하였음을 입증한다. 도 10에 도시된 바와 같이, 10 ㎍ TTP-3000 또는 TTP-4000 RAGE 융합 단백질 을 첨가하면, S100b (0.1 mg/ml FAC)에 의한 TNF-α 유도가 각각 약 45％ 내지 70％ 정도 저하되었다. 융합 단백질 TTP-4000은 S100b에 의한 TNF-α 유도를 차단시키는데 있어서 적어도 sRAGE 만큼 효과적일 수 있다 (도 10). TTP-4000 및 TTP-3000의 RAGE 서열에 대한 억제 특이성은, IgG를 단독으로 S100b 자극된 세포에 첨가하는 실험에 의해 밝혀졌다. IgG와 S100b를 본 검정에 첨가한 결과, S100b만을 첨가한 경우와 동일한 수준의 TNF-α가 나타났다. RAGE 융합 단백질의 RAGE 서열에 대한 TTP-4000 및 TTP-3000에 의한 TNF-α 유도 억제 특이성은, IgG를 단독으로 S100b 자극된 세포에 첨가한 실험에 의해 밝혀졌다. IgG, 즉 RAGE 서열을 수반하지 않은 인간 IgG (10 ㎍/웰로 첨가된 시그마 인간 IgG)와 S100b를 본 검정에 첨가한 결과, S100b 단독과 동일한 수준의 TNF-α가 나타났다는 것을 알 수 있다.

세포를 기초로 하는 다른 분석에서, RAGE 리간드 HMGB1이 RAGE 및 다른 HMGB1 수용체와 상호작용하는 것을 막는 TTP-4000의 능력이 측정되었다. RAGE에 결합하는 항-RAGE 항체와 달리 그리고 RAGE 리간드와 RAGE의 상호작용을 막기 위해서, TTP-4000은 RAGE 리간드에의 결합에 의한 RAGE 리간드의 RAGE와의 상호작용을 차단할 수 있다. HMGB1은 RAGE 및 톨-유사 수용체 2 및 4에 대한 리간드로 보고되었다 (문헌 [Park et al., J Biol Chem., 2004; 279(9):7370-7]). 모든 3개의 상기 수용체 (RAGE, 톨-유사 수용체 2, 및 톨-유사 수용체 4)는 THP-1 세포 상에 발현된다 (문헌 [Parker, et al., J Immunol, 2004,172(8):4977-86]).

상기 실험에서, THP-1 세포를 자극하여 TTP4000 또는 항-RAGE 항체의 존재 또는 부재 하에 HMGB 1 (50 mg/mL)에 의해 TNF-α를 생성한다. 이 분석에서 사용 된 조건하에서, HMGB1은 TNF-α의 유일한 유도인자이어야만 한다. THP-1 세포에 의해 분비된 TNF-α의 양은 TNF-α(알앤드디 시스템즈, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)에 대해 시판된 ELISA 키트를 사용한 세포 배양에 단백질을 첨가하고 24시간 후에 측정하였다. 도 11의 결과는 항-RAGE 항체 및 RAGE 융합 단백질 TTP-4000은 HMGB1이 THP-1 세포에서 발현된 RAGE와 상호작용하는 것을 막고, TTP-4000이 항-RAGE 항체보다 더 큰 정도로 HMGB1-유도된 TNF-α 생성을 억제하는 것을 보여준다. 따라서, 데이터는 TTP-4000은 HMGB1이 톨-유사 수용체 2 및 4 뿐만 아니라 THP-1 세포에 존재하는 RAGE와 상호작용하는 것을 억제하여 항-RAGE 항체보다 더 큰 정도로 HMGB1 활성을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 3: TTP-4000의 약동학적 프로파일

TTP-4000이 인간 sRAGE와 비교해서 탁월한 약동학적 프로파일을 지니고 있는지를 결정하기 위해, 래트 및 비-인간 영장류에게 TTP-4000 (5 mg/kg)을 정맥내 (IV) 주사한 다음, TTP-4000가 존재하는지를 알아보기 위해 혈장을 평가하였다. 이들 실험에서는, 타고난 본래의 2마리 수컷 원숭이의 말초 정맥에 단일 정맥내 볼루스 투여량의 TTP-4000 (5 mg/ml/kg)을 투여한 다음, 대략 1.0 밀리리터 (mL) 식염수 세정액을 투여하였다. 혈액 샘플 (대략 1.0 mL)을, 투여하기 전 (즉, TTP-4000을 주사하기 이전), 또는 리튬 헤파린을 함유하는 튜브 내로 투여한지 0.083, 0.25, 0.5, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 288, 및 336시간 후에 수집하였다. 수집 후, 상기 튜브를 냉동 (2 내지 8℃) 하에 15분 동안 1500×g로 원심분리시킬 때까지 습윤 얼음 위에 놓아두었다 (최대 30분). 이어서, 수거된 각 혈장 샘플을, 실시예 6에 기재된 바와 같이 주사 후 다양한 시점에서 ELISA를 사용하여 RAGE 폴리펩티드에 대해 검정할 때까지 동결시켜 (-70℃±10℃) 보관하였다.

도 12에 도시된 역학적 프로파일은, 2마리 동물에서 알파 상의 꽤 가파른 기울기로써 입증된 바와 같이 TTP-4000이 일단 그의 리간드를 포화시키면, 이는 300시간 초과의 말단 반감기를 보유한다는 것을 나타내었다. 이러한 반감기는 인간 sRAGE의 혈장 중에서의 반감기 (일반적으로 약 2시간) 보다 상당히 더 크고, 급성 및 반-만성 적응증에 대해 1회 주사 투여할 수 있는 기회를 제공해준다. 도 12에서는, 각 곡선이 동일한 실험 조건 하의 상이한 동물을 나타낸다.

실시예 4: TTP-4000 Fc 활성화

인간 IgG와 비교해서 RAGE 융합 단백질 TTP-4000에 의한 Fc 수용체의 활성화를 측정하기 위한 실험을 수행하였다. Fc 수용체 활성화는 이러한 Fc 수용체를 발현하는 THP-1 세포로부터의 TNF-α 분비를 측정함으로써 측정하였다. 이들 실험에서는, 96 웰 플레이트를 10 ㎍/웰 TTP-4000 또는 인간 IgG로 피복시켰다. Fc 자극으로 인해, TNF-α가 분비되었다. TNF-α의 양은 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 측정하였다.

따라서, 본 검정에서는 골수성 세포주 THP-1 (ATTC #TIB-202)를 ATCC 지시에 따라서 10％ 태아 소 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지에서 유지시켰다. 전형적으로, 웰을 10 ㎍/웰의 열 응집된 (63℃에서 30분 동안) TTP-4000 또는 인간 IgG1로 예비피복시킴으로써 Fc 수용체 자극을 통하여 TNF-알파를 분비하도록, 웰당 40,000 내지 80,000개 세포를 유도시켰다. THP-1 세포에 의해 분비된 TNF-알파의 양은 시판 용 TNF ELISA 키트 (알앤드디 시스템즈 (미국 미네소타주 미네아폴리스 소재) #DTA00C)를 지시사항에 따라서 사용하여 처리한 웰에서 24시간 세포 배양물로부터 수집한 상층액 중에서 측정하였다. 그 결과를 도 13에 도시하였으며, 이로부터 TTP-4000이 웰당 2 ng 미만의 TNF를 생성하고, IgG가 웰당 40 ng을 초과하여 생성하였음을 알 수 있다.

실시예 5: TTP-4000의 생체내 활성

TTP-4000의 활성을 몇 가지 인간 질환 생체내 모델에서 sRAGE와 비교하였다.

A. 재발 협착증 동물 모델에서의 TTP-4000

RAGE 융합 단백질 TTP-4000은, 혈관 손상 21일 후 내막 팽창과 평활근 증식을 측정함으로써, 당뇨병성 재발 협착증 래트 모델에서 평가하였다. 이들 실험에서는, 좌측 총경동맥의 벌룬(balloon) 손상을, 표준 과정을 사용하여 주커 (Zucker) 당뇨병성 래트와 비당뇨병성 래트에서 수행하였다. IgG, TTP-4000 또는 인산염 완충 식염수 (PBS)의 로딩 투여량 (래트 1 마리당 3 mg)을 손상시키기 하루 전에 복강내 (IP) 투여하였다. 손상시킨지 7일 후까지는 유지 투여량을 격일로 투여하였다 (즉, 손상시킨 후 1일, 3일, 5일 및 7일 째에 투여함). 이러한 유지 투여량은 한 무리에 대해서는 동물당 1 mg 정도로 높거나, 또는 또 다른 제2 무리에 대해서는 0.3 mg 정도로 낮다. 혈관 평활근 세포 (VSMC) 증식을 측정하기 위해, 손상시킨 후 4일 및 21일 째에 동물을 희생시켰다.

세포 증식을 측정하기 위해, 4일째 동물에게 안락사시키기 18, 12 및 2시간 전에 브로모데옥시우리딘 (BrDdU) 50 mg/kg을 복강내 주사하였다. 희생시킨 후, 전체 좌측 및 우측 경동맥을 수거하였다. 표본을 포매시키기 전 적어도 24시간 동안 히스토초이스 (Histochoice)에 보관하였다. 마우스 항-BrdU 모노클로날 항체를 사용하여, VSMC 증식에 관한 평가를 수행하였다. 형광 표지된 염소 항-마우스 이차 항체를 적용하였다. 이러한 치료 처방 내용을 전혀 알지 못하는 2명의 관찰자가 박편당 BrdU-양성 핵의 개수를 계수하였다.

나머지 래트는 형태계측적 분석을 위해 21일 째에 희생시켰다. 형태계측적 분석은 연속적 박편들, 반 기에손 (Van Gieson) 염색에 의해 염색시킨 (5 mm 간격) 경동맥들 상에서 컴퓨터 디지털 현미경 면적측정 소프트웨어 이미지-프로 플러스 (Image-Pro Plus)를 사용하여, 연구군에 대한 내용을 전혀 알지 못하는 관찰자가 수행하였다. 모든 데이터는 평균±SD로서 표현하였다. SPSS 소프트웨어를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 쌍을 이루지 않은 t 검정을 사용하여 연속되는 변수를 비교하였다. P ≤ 0.05 값이 통계상 유의적인 것으로 간주되었다.

도 14A 및 14B에 도시된 바와 같이, TTP-4000 처치는 혈관 내막/중막 비와 혈관 평활근 세포 증식을 투여량-반응성 방식으로 유의하게 저하시켰다. 도 14B에서는, y-축이 BrdU 증식성 세포 수를 나타낸다.

B. AD 동물 모델에서의 TTP-4000

TTP-4000이 AD 마우스 모델에서 아밀로이드 형성과 인지 기능질병에 영향을 미칠 수 있는지를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 이 실험은 PDGF-B 연쇄 프로모터의 제어 하에 인간 스웨덴인 돌연변이 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 활용하였다. 시간이 지남에 따라, 이들 마우스는 높은 수준의 RAGE 리간드 아밀로이드 베타 (Aβ)를 생성하였다. 기존에는, sRAGE로 3개월 동안 처치하면, 뇌에서의 아밀로이드 반점 형성과, 이러한 모델에서의 관련된 염증성 마커 증가가 저하되는 것으로 밝혀졌다.

본 실험에 사용된 APP 마우스 (수컷)는 인간 APP 유전자 (스웨덴인 및 런던인 돌연변이를 수반함)를 혈소판-유래된 성장 인자 B (PDGF-B) 연쇄 유전자 프로모터의 제어 하에 마우스 난자 내로 미세주사함으로써 고안하였다. 이 마우스는 C57BL/6 백그라운드 상에서 생성되었고, 몰레큘라 테라퓨틱스 인크.(Molecular Therapeutics Inc.)에 의해 개발되었다. 동물에게 사료를 임의로 공급하고, 형제 자매 교배에 의해 유지시켰다. 이러한 구축물로부터 발생한 마우스에게서, 생후 6개월 째부터 아밀로이드 침착물이 발생하였다. 동물을 6개월 동안 노화시킨 다음 90일 동안 유지시키고, 아밀로이드 정량화를 위해 희생시켰다.

APP 트랜스제닉 마우스에게 비히클 또는 TTP4000을 생후 6개월부터 시작하여 90일 동안 격일[qod] 투여하였다 (복강내). 실험 종결 시점에, 동물을 희생시키고 뇌에 존재하는 Aβ 반점의 양 (즉, 반점의 개수)을 검사하였다. 생후 6개월 대조군 APP군은 아밀로이드 침착물의 기준선을 결정하기 위해 사용하였다. 또한, 연구가 종결 시점에, 상기 동물을 대상으로 하여 행위적 [모리스 수 미로(Morris water maze)] 분석을 수행하였다. 이에 참여한 연구 조사자들은 연구 화합물에 관한 내용을 전혀 알지 못하였다. 샘플을 마우스 1마리당 0.25 ml씩 격일로 마우스에게 투여하였다. 또한, 마우스 한 무리에게는 인간 sRAGE를 하루에 200 ㎍씩 투여하였다.

1. 아밀로이드 베타 침착

조직학적으로 조사하기 위해, 해당 동물에게 나트륨 펜토바르비탈 (50 mg/kg)을 복강내 주사 (IP)하여 이를 마취시켰다. 이 동물에게 4℃ 인산염 완충 식염수 (PBS)에 이어, 4％ 파라포름알데히드를 경심장적으로 관류시켰다. 뇌를 꺼내어 4％ 파라포름알데히드에 밤새 놓아두었다. 이 뇌를 파라핀으로 처리하고 포매시켰다. 뇌내의 연속적 30-㎛ 두께 박편 10개를 수득하였다. 상기 트랜스제닉 동물 뇌에서의 아밀로이드 침착물을 검출하기 위해, 이들 박편에 일차 항체 (Aβ 펩티드 항체)를 4℃에서 밤새 적용하였다 (문헌 [Guo et al., J. Neurosci., 22:5900-5909 (2002)]). 박편을 트리스 완충 식염수 (TBS)에서 세척하고, 이차 항체를 가한 다음, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 박편을 벡터 ABC 엘라이트 키트 (벡터 레보러토리즈(Vector Laboratories))에서 지시된 바와 같이 인큐베이션하고 디아미노벤조산 (DAB)으로 염색하였다. 반응을 물에서 중단시키고, 크실렌으로 처리한 후에 커버 슬립으로 덮었다. 순간 포착 프레임 그래버 카드가 장착된 파워 매킨토시(Power Macintosh) 컴퓨터, 올림푸스 (Olympus) 현미경 위에 설치된 히타치 (Hitachi) CCD 카메라 및 카메라 스탠드로 구성된, 컴퓨터를 이용한 영상 분석 시스템을 사용하여, 각 박편 내의 아밀로이드 면적을 결정하였다. NIH 영상 분석용 소프트웨어 v. 1.55를 사용하였다. 영상을 포착하고 10개 박편 전반에 걸친 아밀로이드 총 면적을 결정하였다. 처리 상태를 전혀 알지 못하는 단독 조작원이 모든 측정 과정을 수행하였다. 박편의 아밀로이드 용적을 합하고, 이를 총 박편 수로 나눔으로써 아밀로이드 용적을 계산하였다.

정량적으로 분석하기 위해, 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하여 APP 트랜스제닉 마우스 (바이오소스 인터내셔널(Biosource International), 미국 캘리포니아주 카마릴로 소재) 뇌내의 인간 총 Aβ, Aβ_총 및 Aβ_1-42 수준을 측정하였다. Aβ_총 및 Aβ_1-42는 구아니딘 히드로클로라이드에 의해 마우스 뇌로부터 추출하고, 제조업자가 기재한 바와 같이 정량화하였다. 이러한 검정으로, 뇌로부터 총 Aβ 펩티드 (가용성 및 응집형)를 추출하였다.

2. 인지 기능

모리스 수 미로 시험을 다음과 같이 수행하였다: 실험 종결 시점에 모든 마우스를 모리스 수 미로 시험으로 1회 시험하였다. 마우스를 1.2 m의 개방 영역의 수 미로에서 훈련시켰다. 풀을 물로 30 cm 깊이가 되도록 채운 다음 25℃로 유지시켰다. 탈출용 플랫폼 (10 평방 cm)을 수 표면 1 cm 아래에 놓아두었다. 이와 같이 시도하는 동안, 상기 플랫폼을 풀로부터 제거하였다. 이러한 자극을 가하는 시험은 흰색 커튼이 쳐진 풀에서 수행하여 미로 외의 어떠한 자극도 감추었다. 모든 동물을 대상으로 하여 비-공간적 사전 훈련 (NSP)을 3일 연속해서 진행시켰다. 이러한 시도는 동물에게 플랫폼을 찾을 수 있는 기억력이 남아있는지를 결정하기 위한 최종 행위 시험을 하기 위한 것이다. 이러한 시도는 기록하지 않았는데, 단지 훈련하기 위한 것일 뿐이다. 훈련 및 학습 연구의 경우에는, 커튼을 치우고 별도의 미로 자극을 첨가하였다 (이로써, 수영 질병가 있는 동물을 확인할 수 있었다). 1일 째에는, 마우스를 감춰진 플랫폼 상에 20초 동안 놓아 두고 (시도 1), 시도 2 내지 3에서는 동물을 자극시킨 플랫폼 또는 감춰진 플랫폼으로부터 10 cm 떨어진 거리에서 물에 풀어 놓고 (시도 4), 플랫폼까지 수영하도록 하였다. 시도 이틀 째에는, 감춰진 플랫폼을 풀 중앙이나 각 4 분원 중앙 사이에 무작위로 이동시켰다. 동물을 벽 쪽을 향하도록 무작위로 풀에 풀어 놓았는데, 플랫폼에 도달하는데 60초가 소요되도록 하였다 (3번 시도). 세번째 시도에서는, 동물이 3번 시도하게 하였는데, 2번은 감춰진 플랫폼을 이용하였고, 1번은 자극 플랫폼을 이용하였다. NSP를 수행하고 2일 후에, 동물을 대상으로 하여 최종 행위 시도 (모리스 수 미로 시험)를 수행하였다. 이들 시도 (동물당 3번)를 위해, 플랫폼을 풀의 1개 4분원 중앙에 놓아두고, 동물을 벽 쪽을 향하도록 무작위로 풀에 풀어 놓았다. 동물이 플랫폼을 발견하거나 수영하는데 60초 (이는 플랫폼을 발견하는데 소요되는 잠복 기간이다)가 소요되도록 하였다. 모든 동물은 투약한지 4 내지 6시간 내에 시험하였고, 동물을 무작위로 선별하여 시험군에 관한 내용을 전혀 알지 못하는 조작원이 시험하였다.

그 결과를 평균±표준 편차 (SD)로서 표현하였다. 아밀로이드 및 행위적 연구에 있어서의 유의적 차이는 t-검정을 이용하여 분석하였다. 6개월생 APP 대조군과 TTP-4000 처리 동물 간을 비교하였을 뿐만 아니라 9개월생 APP 비히클 처리군과 TTP-4000 처리 동물 간도 비교하였다. 0.05 미만 차이가 유의적인 것으로 간주되었다. 아밀로이드 및 행동 상의 변화율 (％)은 각 군의 데이터를 종합하고, 이를 상기 비교 수치로 나눔으로써 결정하였다 (즉, 1, 복강내/6개월생 대조군 = ％ 변화).

도 15A 및 15B는 TTP-4000 또는 마우스 sRAGE를 이용하여 3개월간 처치한 마우스는 비히클 및 음성 대조군 인간 IgG1 (IgG1)로 처치한 동물보다도 Aβ 반점 수가 더 적었고 인지 기능 질병가 덜하였다는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 TTP-4000이 트랜스제닉 마우스 모델에서 AD 병리 상태를 저하시키는데 유효하다는 것을 나타낸다. 또한, sRAGE과 마찬가지로 TTP-4000가 염증성 사이토킨 IL-1 및 TNF-α를 감소시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다 (데이터는 제시되지 않음).

C. 졸중 동물 모델에서 TTP-4000의 효능

TTP-4000은 또한, 질환과 관련된 졸중 동물 모델에서 sRAGE와 비교하였다. 이러한 모델에서는, 마우스의 중간 경동맥을 1시간 동안 결찰시킨 다음, 23시간 동안 재관류하였는데, 이때 마우스를 희생시키고 뇌 경색 면적을 평가하였다. 재관류시키기 직전에 마우스를 sRAGE 또는 TTP-4000 또는 대조군 이뮤노글로불린으로 처치하였다.

이들 실험에서는, 수컷 C57BL/6에게 마우스 1마리당 비히클 250 ㎕ 또는 TTP 시험 제품 (마우스 1마리당 TTP-3000, TTP-4000 250 ㎕)을 주사하였다. 허혈증이 발생한지 1시간 후에 마우스에게 복강내 주사하였다. 마우스를 대상으로 하여 1시간 동안 뇌 허혈증을 발생시킨 다음 24시간 재관류하였다. 허혈증을 유도하기 위해, 각 마우스를 마취시키고, 외부적으로 가온시킴으로써 체온을 36 내지 37℃로 유지시켰다. 경부 (목) 중심선을 절개하여 좌측 총경동맥 (CCA)을 노출시켰다. 내부 경동맥 (ICA) 기점 주변에 미세수술용 클립을 놓아두었다. ECA의 원위 말단을 견사로 결찰시키고 가로로 절개하였다. 6-0 견사로 ECA 스텀프 (stump) 주변을 느슨하게 묶었다. 불을 이용하여 끝을 처리시킨 나일론 봉합사를 ECA 스텀프 내로 조심스럽게 삽입하였다. 6-0 결사 루프를 상기 스텀프 주변에 단단히 고정시키고, 나일론 봉합사가 전방 뇌동맥에 잔류할 때까지 이 봉합사를 내부 경동맥 (ICA) 내로 나아가게 함으로써, 이와 같이 전달되는 전방 뇌동맥과 중간 뇌동맥을 폐쇄시켰다. 나일론 봉합사를 1시간 동안 원 위치에 놓아둔 후, 동물을 다시 마취시키고, 직장 온도를 기록한 다음, 봉합사를 꺼내고 절개 부위를 닫았다.

해당 동물에게 나트륨 펜토바르비탈 (50 mg/kg)을 복강내 주사함으로써 마취시킨 다음 뇌를 꺼냄으로써, 경색 용적을 측정하였다. 이어서, 뇌를 절단하여, 경색된 영역 내의 2-mm 박편 4개를 수득하고, 이를 2％ 트리페닐테트라졸륨 클로라이드 (TTC)에 30분 동안 놓아 두었다. 그 후, 상기 박편을 4％ 파라포름알데히드에 밤새 놓아두었다. 순간 포착 프레임 그래버 카드가 장착된 파워 매킨토시 컴퓨터 및 카메라 스탠드 위에 설치된 히타치 CCD 카메라로 구성된, 컴퓨터를 이용한 영상 분석 시스템을 사용하여, 각 박편 내의 경색 면적을 결정하였다. NIH 영상 분석용 소프트웨어 v. 1.55를 사용하였다. 영상을 포착하고 박편 전반에 걸친 경색 총 면적을 결정하였다. 처리 상태를 전혀 알지 못하는 단독 조작원이 모든 측정 과정을 수행하였다. 박편의 경색 용적을 합하여 총 경색 용적을 계산하였다. 그 결과를 평균±표준 편차 (SD)로서 표현하였다. 경색 용적 데이터에 있어서의 유의적 차이는 t-시험을 이용하여 분석하였다.

표 2의 데이터로써 예시된 바와 같이, TTP-4000은 상기 동물에게서 경색 면적을 제한한다는 점에서 sRAGE 보다 더 효능이 있었는데, 이는 TTP-4000가 그의 혈 장 내에서의 반감기가 더 우수하기 때문에 이들 마우스에서 sRAGE 보다 더 큰 보호를 유지할 수 있었다는 것을 제안하고 있다.

실시예 6: ELISA에 의한 RAGE 융합 단백질의 검출

처음에는, 1X PBS pH 7.3 중의 10 ㎍/ml 농도의 RAGE 특이적 모노클로날 항체 1HB1011 50 ㎕를 밤새 인큐베이션함으로써 플레이트에 피복시켰다. 사용하기 직전에, 플레이트를 300 ㎕의 1X 이미다졸-트윈 세척 완충액으로 3회 세척한 다음, 1％ BSA로 차단시켰다. 공지된 TTP-4000 희석률의 샘플 (희석됨) 및 표준 희석물을 100 ㎕ 최종 용적으로 첨가하였다. 샘플을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상기 판을 3회 세척하였다. 1％ BSA를 수반한 1X PBS 중의 염소 항-인간 IgG1 1 (시그마 A3312) AP 접합체를 가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 판을 3회 세척하였다. 파라니트로페닐포스페이트를 사용하여 색상을 밝혀내었다.

실시예 7: RAGE 융합 단백질에 결합하는 RAGE 리간드의 정량화

도 16은 공지된 다양한 고정된 RAGE 리간드에 대한 TTP-4000을 이용한 경우의 포화-결합 곡선을 도시한 것이다. 상기 리간드를 미세역가 플레이트에 고정시키고, 0에서부터 360 nM까지 농도를 증가시킨 RAGE 융합 단백질의 존재 하에 인큐베이션하였다. 융합 키메라의 IgG 부분에 대해 특이적인 알칼리성 포스파타제와 접합시킨 폴리클로날 항체를 사용하여, RAGE 융합 단백질-리간드 상호작용을 검출하였다. 그래프파드 프리즘 (Graphpad Prizm) 소프트웨어를 사용하여 상대적 Kd를 계산하였는데, 이는 당해 분야의 문헌에 확립된 RAGE-RAGE 리간드 값과 부합되었 다. HMG1B = 암포테린, CML = 카르복시메틸 리신, A 베타 = 아밀로이드 베타 1-40.

실시예 8: 동종이계 이식 거부반응을 예방하기 위한 RAGE 융합 단백질의 용도

RAGE 차단은 동종이계 이식 거부반응을 차단할 것으로 예상할 수 있다. 이들 실험은 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하는 리간드-RAGE 상호작용 차단이 이식받은 동물의 혈중 글루코스 수준이 목적하는 농도 아래로 유지되는 기간에 의해 측정된 바와 같이 건강한 공여자로부터 당뇨병 동물에게 이식된 랑게르한스 섬 세포의 거부반응을 약화시키는지 여부를 조사하였다. 본원에 논의된 바와 같이, RAGE 융합 단백질 (예를 들면, TTP-4000)을 랑게르한스 섬 세포를 이식받은 당뇨병 동물에게 투여하면 고혈당증의 재발을 유의하게 지연시키고, 이에 따라 두 가지 (동종이계 및 동계) 동물 이식 모델에서 이식된 랑게르한스 섬 세포의 거부반응이 유의하게 지연되는 것으로 밝혀졌다.

A. 마우스에서의 동종이계 랑게스한스 섬 이식

첫번째 실험 세트는 RAGE 융합 단백질 (TTP-4000)의 투여가 당뇨병 C57BL/6J (B6) 마우스 모델에서 이식된 랑게르한스 섬 세포의 동종이계 거부반응 및 당뇨병의 재발을 조절하는지 여부를 시험하였다.

당뇨병의 동물 모델

C57BL/6J (6 내지 8 주령) (B6) 마우스에게 스트렙토조토신 (STZ) (시그마 케미컬사(Sigma Chemical Co.), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)을 200 mg/kg으 로 1회 정맥내 주사하여 당뇨병에 걸리게 하였다. BALB/cJ (6 내지 8주령) (BALB) 마우스를 랑게르한스 섬 이식의 공여자로 사용하였으며, 이에 따라 랑게르한스 섬 이식에 대해 동종-미스매치가 발생하였다.

랑게르한스 섬 단리

마우스 (BALB/c)를 케타민 HCl/크실라진 HCl 용액 (시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)으로 마취시켰다. 1.5 mg/ml의 콜라게나제 P (로쉐 디아그노스틱스(Roche Diagnostics), 미국 뉴저지주 브랜치버그 소재)를 함유하는 차가운 행크 밸런스 염 용액 (Hank's balanced salt solution) (HBSS, 깁코(Gibco), 미국 뉴욕주 그랜스 아일랜드 소재) 3 ml를 관내 주사한 후에, 췌장을 수술에 의해 수득하여 37 ℃에서 20 분 동안 소화시켰다. 랑게르한스 섬을 HBSS로 세척하고, 4 가지 상이한 농도 (26％, 23％, 20％ 및 11％)를 갖는 폴리수크로즈 400 (셀그로(Cellgro), 미국 버지니아주 헌돈 소재)를 사용하여 비연속성 구배 원심분리에 의해 정제하였다. 20％ 및 23％ 층의 경계에서 조직 단편을 수집하고, HBSS로 세척하여 재현탁시켰다. 각각의 랑게르한스 섬 (부착된 포상 세포가 없음), 혈관 및 관 조직을 도립 현미경 하에서 손으로 분리하여, 이식에 사용되는 고도로 정제된 랑게르한스 섬을 수득하였다.

랑게르한스 섬 이식

스트렙토조토신-유도된 당뇨병 C57BL/6 (B6) 마우스에게 당뇨병 진단후 2일 이내에 랑게르한스 섬 이식편을 이식하였다. BALB/cJ (6 내지 8주령) (BALB) 마우스를 동종이계 랑게르한스 섬 이식에 공여자로 사용하였다. 이식을 위해, 공여자 마우스로부터 신선하게 단리된 500-600 랑게르한스 섬 (즉, 대략 550 랑게르한스 섬 등가물)을 주입 세트로 수확하고, 수혜자의 오른쪽 신장의 낭하(subcapular) 공간에 이식하였다.

시험 화합물로의 처치

시험 화합물을 랑게르한스 섬을 이식하자마자 투여하였으며, 대조군 동물이 어떻게 생활하는지에 따라 약 60일 동안 계속 투여하였다. 아래 처방에 따라 마우스에게 인산염 완충 염수 (PBS), PBS 중 TTP-4000 또는 PBS 중 IgG를 25 ml 주사하였다 (표 3).

랑게르한스 섬 이식편 기능 모니터링

랑게르한스 섬 이식편 기능을 랑게르한스 섬 이식후 처음 2 주일 동안에는 매일, 그 이후부터는 격일로 연속적 혈중 글루코스 측정에 의해 모니터링하였다. 당뇨병의 회복은 2회 연속 측정시 글루코스 수준이 200 mg/dl 미만인 혈액으로 정의한다. 2회 연속 측정시 혈중 글루코스가 250 mg/dl를 초과하는 경우에 이식편이 손실된 것으로 측정된다. 결과를 표 4에 나타내었다.

B6 마우스에서의 BALB/c 랑게르한스 섬에 대한 동종이식 거부반응에 미치는 TTP-4000 투여 효과를 도 17에 캐플란-마이어 누적 생존률 플롯(Kaplan-Meier Cumulative Survival Plot)으로 나타내었다. 전혀 처치되지 않은 동물 (대조군) 또는 비히클 (PBS) 또는 (인간 IgG1)로 처치된 동물과 달리 TTP-4000으로 처치된 동물 (제1군 및 제3군)에서 이식 실패가 검출되기 이전 시간이 증가함을 알 수 있다. 다양한 통계학적 분석 (만텔-콕스 로그랭크(Mantel-Cox Logrank), 브레슬로우-게한-윌콕슨(Breslow-Gehan-Wilcoxon); 타론-웨어(Tarone-Ware), 페토-페토-윌콕슨(Peto-Peto-Wilcoxin); 및 해링톤-플레밍(Harrington-Fleming))을 이용한 결과, 대조군 및 TTP-4000 (제1군 및 제3군) 사이의 차이가 유의한 수준이었다 (표 5).

B. 자가면역 질환 모델로서의 NOD-마우스에서의 랑게르한스 섬 이식

두번째 실험 세트는 동계 NOD 이식 모델을 사용하여 RAGE 융합 단백질 (즉, TTP-4000 또는 TTP-3000)의 투여가 NOD 마우스에서 당뇨병 재발 과정을 조절하는지 여부를 시험하였다.

당뇨병의 동물 모델

특발성 자가면역 비-비만 당뇨병 마우스 (NOD/LtJ) (12 내지 25주령)를 랑게르한스 섬 세포에 대한 수혜자로 사용하는 한편, 어린 당뇨병 이전 NOD/LtJ 마우스 (6 내지 7주령)를 동계 랑게르한스 섬 이식에서 공여자로 사용하였다. 이식에 사용되는 랑게르한스 섬을 상기 섹션 A (동종이계 랑게르한스 섬 이식)에 기재된 바와 같이 단리하였다.

랑게르한스 섬 이식:

당뇨병 NOD/LtJ 마우스에게 당뇨병 진단후 2일 이내에 랑게르한스 섬 이식편을 이식하였다. 공여자 마우스로부터 신선하게 단리된 500-600 랑게르한스 섬 (대략 550 랑게르한스 섬 등가물)을 주입 세트로 수확하고, 오른쪽 신장의 낭하 공간에 이식하였다.

시험 화합물로의 처치

시험 화합물을 랑게르한스 섬을 이식하자마자 투여하였으며, 대략 8 주 동안 계속 투여하였다. 아래 처방에 따라 마우스에게 PBS, PBS 중 TTP-4000 또는 PBS 중 TTP-3000을 0.25 ml 주사하였다 (표 6).

랑게르한스 섬 이식편 기능 모니터링

랑게르한스 섬 이식편 기능을 랑게르한스 섬 이식후 처음 2 주일 동안에는 매일, 그 이후부터는 격일로 연속적 혈중 글루코스 측정에 의해 모니터링하였다. 당뇨병의 회복은 2회 연속 측정시 글루코스 수준이 200 mg/dl 미만인 혈액으로 정의한다. 이식편 손실률은 2회 연속 측정시 혈중 글루코스가 250 mg/dl를 초과하는 경우에 결정하였다. 결과를 표 7에 나타내었다.

당뇨병 NOD 마우스에서의 동계 이식된 랑게르한스 섬의 거부반응에 대한 TTP-4000 투여 효과를 도 18에 캐플란-마이어 누적 생존률 플롯으로 나타내었다. 표 7의 데이터에 나타낸 바와 같이, 전혀 처치되지 않은 동물 (대조군)과 달리 TTP-4000 (제1군) 및 TTP-3000 (제2군)으로 처치된 동물에서 이식 실패가 검출되기 이전 시간이 증가하였다. 도 18은 TTP-4000으로 처치된 동물 (제1군) 및 전혀 처치되지 않은 동물에서 이식 실패가 검출되기 이전 시간이 증가하였음을 보여준다. 다양한 통계학적 분석 (만텔-콕스 로그랭크, 브레슬로우-게한-윌콕슨; 타론-웨어, 페토-페토-윌콕슨; 및 해링톤-플레밍)을 이용한 결과, 대조군 및 TTP-4000 (제1군) 사이의 차이 및 대조군 및 TTP-3000 (제2군) 사이의 차이가 유의한 수준이었다 (표 8).

실시예 9 -RAGE 융합 단백질 동결건조된 제제

RAGE 융합 단백질 TTP-4000을 사용한 동결건조된 제제의 개발에 있어서, 동결건조 보호제 및 완충액을 동결건조 및 재구성한 후 단백질의 안정성을 측정하여 초기 스크리닝하였다. 또한 각 제제 중 동결건조된 단백질에 가속화된 안정성 연구를 하여 그의 선반-수명을 넘어서는 단백질의 잠재적 안정성을 측정하였다.

초기 스크리닝 연구에 있어서, 실험은 동결된 벌크로 제조된 TTP-4000의 적절한 용해도 및 안정성을 제공하고, 약 50 mg/mL 이상의 RAGE 융합 단백질의 농도를 갖는 재구성된 제제를 제공할 수 있는 제제 조건을 평가하도록 고안되었다. 아세트산나트륨, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 숙신산나트륨, 히스티딘, 및 염화나트륨을 함유한 제제를 수크로즈 및 만니톨과 함께 시험하였다. 5.5 내지 7.0의 가변 pH를 또한 평가하였다.

TTP-4000의 생물물리적 및 화학적 안정성을 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography (SEC)), SDS-Page, 푸리에-변환 적외선 분광법(Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FTIR)), 원편광 이색성 분광법(circular dichroism (CD)), 펩티드 맵핑(peptide mapping), 및 자외선-가시광선 흡수 분광법(UV-Vis)을 사용하여 평가하였다.

7.0 이하의 pH에서 시트르산나트륨, 히스티딘, 수크로즈, 만니톨, 및 트윈 80 중 하나 이상을 함유하는 제제 중 RAGE 융합 단백질의 용해도에 기초하여, 완충액, 동결건조 보호제, 또는 계면 활성제 중 하나 이상을 함유하는 제제들을 추가적인 연구를 위해 선택하였다.

실시예 10 - RAGE 융합 단백질 동결건조된 제제

실시예 9에서 얻어진 정보에 기초하여, 부가적인 TTP-4000의 제제를 연구하였다. 연구는 동결-건조 공정을 통과한 안정적인 제품을 유지하고 재구성시 고농도(즉, 약 또는 50 mg/mL 초과)의 TTP-4000을 달성하는 것을 가능하게 하기에 유용한 완충액 및/또는 동결건조 보호제의 확인에 초점을 두었다. 2주 동안의 가속화한 안정성 연구에서 6개의 제제를 연구하였다. 상기 제제를 표 9에 요약하였다. 아래에 기술된 바와 같이 연구는 더 큰 용량의 TTP-4000 (250 mg)을 위한 동결-건조 순환을 개발하는데 또한 초점을 두었다.

동결-건조 후, 상기 제제 개발 샘플 바이알을 권축하고 2주 동안 40℃의 챔버에 두었다. 스케일-업(scale-up)한 개발 샘플을 시험이 수행될 때까지 2-8℃에서 저장하였다.

샘플 분석 방법:

샘플 중 TTP-4000의 농도를 자외선-가시광선 분광광도법으로 측정하였다. 애질런트(Aglient) UV-Vis가 단백질 스펙트럼 뿐만 아니라 완충액 블랭크 스펙트럼을 얻기위해 사용하였다. 일단 얻어지면, 임의의 단백질 응집의 결과 발생할 수 있는 임의의 광산란에 대해 흡광치를 수정하였다.

잔여 수분을 칼 피셔(Karl Fisher) 적정법을 사용하여 분석하였다. 동결-건조 제제 개발 샘플을 적절한 양의 WFI로 재구성시켰다. 재구성을 위한 시간은 물을 첨가한 때로부터 가시적인 고형물이 없을 때까지의 시간을 의미한다. 재구성 후, 각 샘플의 pH를 적절하게 교정한 세미-마이크로 프로브를 사용하여 측정하였다.

TSKgel Super SW2000 칼럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 수행하여, 가속화한 조건에서 동결-건조 및 저장 동안 TTP-4000의 물리적 안정성(분해 및 가용성 응집물 형성)을 분석하거나 모니터링하였다. 애질런트 1100 시리즈 LC로 주입된 샘플을 2개의 TSKgel Super SW2000, 4.6 x 300 mm, 4 ㎛ 칼럼 (토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience), 18674)에 피팅시켰다.

입자수를 측정하기 위해, 1 mL 샘플을 20 mL에서 20-배 희석시켰다. 샘플을 약 30초 동안 초음파로 탈기시키고, 거품이 생기지 않도록 손으로 부드럽게 교반하였다. 각각 용적이 5 mL인 세 분취액을 광 차단 카운터 센서 (light obscuration counter sensor)로 회수하였다. 누적 모드로 설정한 기구로, 10 ㎛ 이상 및 25 ㎛ 이상으로 설정하여 입자를 수집하였다.

결과:

실시예 9에서의 예비 제제 연구에 기초하여, 2개의 완충액 (시트르산나트륨 및 L-히스티딘)을 우선 연구하였다. 원심력농축기를 사용하여 농축 제제 1-6 (표 9)을 제조하였다. 표 9의 제제 1-6에서의 단백질 최종 농도는 약 4 내지 15 mg/mL의 범위 내에 있다.

표 9의 제제 1-6을 사용하여, 0.7 mL의 용적을 채우는 바이알 (2 mL)을 사용하였다. 바이알 상부의 공간은 공기로 채워졌다. 건조 전에 샘플을 -50℃ 내지 -20℃의 선반 온도에서 대략 12시간 동안 동결하였다. 샘플을 대략 36시간 동안 -20℃ 내지 -10℃의 선반 온도에서 100 mTorr의 감압하에서 건조시킨 후, 20℃의 선반 온도에서 대략 12시간 동안 건조시켰다. 동결건조 후, 바이알을 마개로 막고, 상부를 권축하였다. 울퉁불퉁한 케이크를 각 제제 1-6으로부터 생성하였다.

제제의 화학적 안정성을 얻기 위해 동결-건조된 생성물을 가속화된 안정성 연구하였다. 동결-건조된 생성물을 40℃에서 75 %의 상대습도에서 2주 동안 저장고에 두었다.

동결-건조된 생성물을 0.206 mL WFI로 재구성하였다. 모든 동결-건조된 생성물을 20초 이하 내에 재구성하였다. 2주의 저장기간에 걸쳐 모든 재구성된 제제에서 pH를 일정하게 유지하였다. 동결-건조된 생성물에 대해 0 및 2주에 측정된 잔여 수분값은 3.0% 내지 0.8%이고, 동결-건조 순환이 예비-동결건조된 제제를 충분하게 건조시키는 것이 가능하다는 것을 보여주었다. 모든 재구성된 제제의 몰삼투압농도는 바람직한 등장성 범위인 250 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg 내이다 (표 10 참조). 각 재구성된 제제의 점도는 3.7 cP (센티포이즈) 미만이다.

SEC 분석을 동결-건조 공정의 다양한 단계에서 얻어진 표 10의 제제 5의 샘플에서 수행하고, 응집물 및 파괴종이 적은 양으로 일정하다는 것에 기초하여 상기 제제 중 TTP-4000이 동결-건조 공정의 임의의 단계에 특히 민감하지 않다는 것을 나타내었다.

SEC 분석은 또한 동결-건조전 예비-동결건조된 제제에서 뿐만 아니라 0주 및 2주의 가속화된 안정성 연구 후에 재구성된 제제에서 수행하였다. 불순물 (응집물 또는 파괴된 생성물)의 양은 계속해서 낮다 (즉, 4% 미만) (표 11).

펩티드 맵핑은 가속화된 조건하에서 동결-건조 및 저장 때문에 TTP-4000이 산화 또는 탈아미드화 되지 않음을 나타내었다.

SDS-PAGE를 제제 1, 3, 4, 및 6에서 행하고, 상기 제제 중에서 TTP-4000이 동결-건조 및 저장 공정 전반에서 물리적 안정성을 유지한다는 것을 보여주었다.

50 mL의 동결건조 바이알 및 TTP-4000을 250 mg의 용량으로 사용하기 위해 동결-건조 공정을 스케일-업하기 위해, 한외 여과를 사용하여 용액을 15 mg/mL의 TTP-4000으로 농축한 다음 pH 6.0에서 10 mM 히스티딘 및 65 mM 수크로즈에 대한 용액을 정용여과 하여 샘플을 제조하였다. 트윈 80을 0.01% (vol/vol)의 최종양으로 첨가하였다.

예비-동결건조된 제제 (16.67 mL)를 각 50 mL 바이알에 첨가하였다. 5℃ 내지 -5℃의 선반 온도에서 30분 동안 냉각시킨 후, -50℃의 선반 온도에서 대략 3시간 동안 냉각시키는 동결-건조 순환에 샘플을 노출시켰다. 샘플을 -20℃ 내지 -10℃의 선반 온도에서 100 mTorr의 감압에서 대략 34시간 동안 건조시킨 후, 5℃ 내지 20℃의 선반 온도에서 대략 11시간 동안 건조시켰다. 동결건조 후, 바이알의 마개를 닫고, 상부를 권축하였다. 제약상 우수한(elegant), 백색 케이크를 제조하였다. 케이크는 울퉁불퉁한 것으로 보이고, 취급 및 저장 동안 그 구조를 상실하지 않았다.

280 nm에서의 흡광도에 의해 측정된 재구성된 샘플의 농도는 40.5 mg/mL의 TTP-4000이었다. 유사한 조건하에서의 부가적인 연구에서, 재구성된 샘플 중 TTP-4000의 농도는 일정하게 약 50 mg/mL이다.

재구성된 샘플을 실온에서 저장하고 0, 2, 및 6시간 후에 미립자의 함량을 측정하였다. 표 12에서의 결과는 재구성된 샘플이 낮은 미립자 함량을 갖는 것을 보인다.

요약하면, TTP-4000을 수크로즈, 만니톨, 및 트윈 80 중 하나 이상을 함유하는 시트레이트 및 히스티딘 완충액 중에서 제조하였다. 시험은 시트르산나트륨 또는 히스티딘을 함유하는 제제가 유사한 수행 특징을 갖고, TTP-4000은 히스티딘을 함유하는 제제 중 더욱 가용성일 수 있다는 것을 보였다.

히스티딘을 함유하는 제제는 추가적인 스케일-업 연구에 초점을 두었다. 동결-건조 순환 후, TTP-4000의 화학적 및 물리적 안정성을 평가하였는데, 히스티딘 제제들 사이의 유의적 차이가 확인되지 않았다. 또한, 만니톨을 제제로부터 제거하였다. 약 pH 6.0에서 10 mM 히스티딘, 60 mM 수크로즈, 및 0.01% 트윈 80을 함유하는 제제의 개발 연구로부터 최종 제제를 선택하였다. 이 제제는 TTP-4000을 동결-건조 및 저장 동안 안정적으로 유지하는 우수한 능력을 보이고, 또한 연구 동안 TTP-4000의 최고 농도를 제공하였다. 스케일-업 연구에서, 수크로즈 양을 65 mM로 높여 제제의 몰삼투압농도를 등장성에 접근하도록 조정하였다. 스케일-업 연구동안, 또한 TTP-4000 예비-동결건조된 제제 및 재구성된 제제의 pH를 약 pH 6.0 및 6.7 미만에서 유지하는 것이 단백질 침전 또는 응집을 감소시키는 pH로 유용하다는 것이 밝혀졌다.

전술된 내용은 본 발명의 요지를 단지 예시하는 것으로 간주해야 한다. 당업자는 수많은 변형과 변화를 용이하게 인지할 것이기 때문에, 본 발명이 본원에 제시되고 기재된 바로 그 실시양태들로만 제한되지 않으며, 첨부된 청구의 범위 내에 속하는 적합한 모든 변형물과 등가물 역시 본 발명의 개념에 속하는 것으로 간주된다.

SEQUENCE LISTING <110> TransTech Pharma, Inc. <120> RAGE Fusion Proteins, Formulations, and Methods of Use Thereof <130> 57739-367597 <140> To Be Assigned <141> 2007-04-25 <150> US 60/798,455 <151> 2006-05-05 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 404 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu 1 5 10 15 Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu 20 25 30 Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg 35 40 45 Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu 50 55 60 Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro 65 70 75 80 Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile 85 90 95 Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn 100 105 110 Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp 115 120 125 Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys 130 135 140 Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro 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Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60 Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn 65 70 75 80 Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln 85 90 95 Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110 Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro 115 120 125 Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn 130 135 140 Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr 145 150 155 160 Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly 165 170 175 Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro 180 185 190 Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln 195 200 <210> 51 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = pyroglutamic acid <400> 51 Xaa Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 1 5 10 15 Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30 Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60 Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn 65 70 75 80 Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln 85 90 95 Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110 Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro 115 120 125 Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn 130 135 140 Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr 145 150 155 160 Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly 165 170 175 Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro 180 185 190 Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu 195 200 205 Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly 210 215 220 Ala Val Ala Pro 225 <210> 52 <211> 633 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA construct <400> 52 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 60 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 120 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 180 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 240 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 300 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 360 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 420 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 480 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 540 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 600 cagaagagcc tctccctgtc tcccgggaaa tga 633 <210> 53 <211> 663 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA construct <400> 53 ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 60 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 120 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 180 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 240 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 300 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 360 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 420 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 480 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 540 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 600 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tcccgggaaa 660 tga 663 <210> 54 <211> 1386 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA construct <400> 54 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag 420 gtggggacat gtgtgtcaga ggggagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat 480 gggaagcccc tggtgcctaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggagacac 540 cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga 600 gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgaca ccgggccttg 660 cgcacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg gagcctgtgc ctctggagga ggtccaattg 720 gtggtggagc cagaaggtgg agcagtagct cctccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 840 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 960 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1080 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1140 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg 1380 aaatga 1386 <210> 55 <211> 1041 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA construct <400> 55 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtcc gtcagtcttc 420 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 480 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 540 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 600 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 660 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 720 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 780 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 840 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 900 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 960 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1020 tccctgtctc ccgggaaatg a 1041 <210> 56 <211> 438 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = pyroglutamic acid <400> 56 Xaa Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 1 5 10 15 Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30 Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60 Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn 65 70 75 80 Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln 85 90 95 Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110 Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro 115 120 125 Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn 130 135 140 Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr 145 150 155 160 Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly 165 170 175 Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro 180 185 190 Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu 195 200 205 Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly 210 215 220 Ala Val Ala Pro Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 225 230 235 240 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 245 250 255 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 260 265 270 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 275 280 285 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 290 295 300 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 305 310 315 320 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 325 330 335 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 340 345 350 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 355 360 365 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 370 375 380 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 385 390 395 400 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 405 410 415 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 420 425 430 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 <210> 57 <211> 323 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = pyroglutamic acid <400> 57 Xaa Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 1 5 10 15 Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30 Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60 Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn 65 70 75 80 Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln 85 90 95 Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 115 120 125 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 130 135 140 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 145 150 155 160 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 165 170 175 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 180 185 190 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 195 200 205 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 210 215 220 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 225 230 235 240 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 245 250 255 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 260 265 270 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 275 280 285 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 290 295 300 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 305 310 315 320 Pro Gly Lys

Claims

서열 56 또는 서열 57로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 RAGE 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 서열 56 또는 서열 57과 90% 이상 동일한 서열이 C-말단 리신을 수반하지 않은 서열 56 또는 서열 57의 서열을 포함하는 RAGE 융합 단백질.
제1항의 RAGE 융합 단백질을 코딩하는 단리된 DNA 분자.
제3항에 있어서, 상기 DNA가 서열 54 또는 서열 55로 나타낸 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자.
제1항의 RAGE 융합 단백질을 코딩하는 발현 벡터.
세포가 서열 56 또는 서열 57로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 RAGE 융합 단백질을 발현하도록 제5항의 발현 벡터로 형질감염시킨 세포.
제6항에 있어서, 상기 서열 56 또는 서열 57과 90% 이상 동일한 서열이 C-말단 리신을 수반하지 않은 서열 56 또는 서열 57의 서열을 포함하는 세포.
동결건조 보호제, RAGE 융합 단백질, 및 완충액의 동결건조된 혼합물을 포함하는 제제.
제8항에 있어서, 상기 동결건조 보호제가 비환원성 당을 포함하는 제제.
제9항에 있어서, 상기 비환원성 당이 수크로즈, 만니톨, 또는 트레할로스 중 하나 이상을 포함하는 제제.
제8항에 있어서, 상기 완충액이 히스티딘을 포함하는 제제.
제8항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 제제.
제12항에 있어서, 상기 RAGE 폴리펩티드가, RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, RAGE 이뮤노글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함하는 제제.
제12항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질이, 제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 C_H2 이뮤노글로불린 도메인 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 일부의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제1 RAGE 도메인간 링커를 포함하는 제제.
제12항에 있어서, 상기 RAGE 폴리펩티드가 서열 10으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열, 또는 서열 47로 나타낸 아미노산 서열 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 RAGE 리간드 결합 부위를 포함하는 제제.
제8항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질이 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57 중 하나 이상으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 제제.
제16항에 있어서, 상기 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57과 90% 이상 동일한 서열이 C-말단 리신을 수반하지 않은 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 또는 57의 폴리펩티드를 포함하는 제제.
제8항에 있어서, 계면 활성제, 킬레이트제, 또는 증량제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 제제.
재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도가 약 1 mg/mL 내지 약 400 mg/mL의 범위 내에 있는, 희석제 중에서 재구성된 동결건조된 RAGE 융합 단백질을 포함하는 재구성된 제제.
제19항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 재구성된 제제.
제20항에 있어서, 상기 RAGE 폴리펩티드가, RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, RAGE 이뮤노글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함하는 재구성된 제제.
제20항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질이, 제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 C_H2 이뮤노글로불린 도메인 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 일부의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제1 RAGE 도메인간 링커를 포함하는 재구성된 제제.
제20항에 있어서, 상기 RAGE 폴리펩티드가 서열 10으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열, 또는 서열 47로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 RAGE 리간드 결합 부위를 포함하는 재구성된 제제.
제19항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질이 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 재구성된 제제.
제24항에 있어서, 상기 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57과 90% 이상 동일한 서열이 C-말단 리신을 수반하지 않은 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 또는 57의 폴리펩티드를 포함하는 재구성된 제제.
제19항에 있어서, 상기 희석제가 주사용수 (WFI)를 포함하는 재구성된 제제.
제19항에 있어서, 상기 재구성된 제제가 피하 또는 근육내 투여에 적합한 재구성된 제제.
제19항에 있어서, 상기 재구성된 제제가 등장성인 재구성된 제제.
제19항에 있어서, 상기 제제가 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57로 나타낸 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 약 1 내지 400 mg/mL RAGE 융합 단백질; 약 1 mM 내지 약 100 mM 히스티딘 완충액; 약 60 mM 내지 약 65 mM 수크로즈; 약 0.001% 내지 약 0.05 % 트윈 80; 및 약 6.0 내지 6.5의 pH를 포함 하는 재구성된 제제.
제19항에 있어서, 상기 제제가 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57로 나타낸 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 약 40 내지 50 mg/mL RAGE 융합 단백질; 약 10 mM 히스티딘; 약 65 mM 수크로즈; 약 0.01% 트윈 80; 및 약 6.0의 pH를 포함하는 재구성된 제제.
제19항에 있어서, 상기 제제가 40℃에서 1주일 후에 5% 미만의 분해를 나타내는 재구성된 제제.
제19항에 있어서, 약 10% 미만의 RAGE 융합 단백질이 재구성시에 제제 중에 응집물로 존재하는 재구성된 제제.
제19항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질의 동결건조된 제제가 동결건조 보호제를 포함하는 재구성된 제제.
제33항에 있어서, 상기 동결건조 보호제가 비환원성 당을 포함하는 재구성된 제제.
제34항에 있어서, 상기 비환원성 당이 수크로즈, 만니톨, 또는 트레할로스 중 하나 이상을 포함하는 재구성된 제제.
제19항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질의 동결건조된 제제가 완충액, 계면 활성제, 킬레이트제 또는 증량제 중 하나 이상을 포함하는 재구성된 제제.
동결건조된 RAGE 융합 단백질, 및 동결건조된 제제를 희석제로 재구성하는 지시사항을 담는 용기를 포함하는 제조 약품.
제37항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 제조 약품.
제38항에 있어서, 상기 RAGE 폴리펩티드가, RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, RAGE 이뮤노글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함하는 제조 약품.
제38항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질이, 제1 도메인간 링커의 N-말단 아 미노산이 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 C_H2 이뮤노글로불린 도메인 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 일부의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제1 RAGE 도메인간 링커를 포함하는 제조 약품.
제38항에 있어서, 상기 RAGE 폴리펩티드가 서열 10으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열, 또는 서열 47로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 RAGE 리간드 결합 부위를 포함하는 제조 약품.
제37항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질이 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57 중 하나 이상으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 제조 약품.
제42항에 있어서, 상기 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57과 90% 이 상 동일한 서열이 C-말단 리신을 수반하지 않은 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 또는 57의 폴리펩티드를 포함하는 제조 약품.
제37항에 있어서, 상기 희석제가 주사용수 (WFI)를 포함하는 제조 약품.
제37항에 있어서, 상기 재구성된 제제가 피하 또는 근육내 투여에 적합한 제조 약품.
제37항에 있어서, 상기 재구성된 제제가 등장성인 제조 약품.
제37항에 있어서, 상기 지시사항에 따른 재구성시, 제제가 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57로 나타낸 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 약 1 내지 400 mg/mL RAGE 융합 단백질; 약 1 mM 내지 약 100 mM 히스티딘 완충액; 약 60 mM 내지 약 65 mM 수크로즈; 약 0.001% 내지 약 0.05 % 트윈 80; 및 약 6.0 내지 6.5의 pH를 포함하는 제조 약품.
제37항에 있어서, 재구성시 상기 제제가 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57로 나타낸 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 약 40 내지 50 mg/mL RAGE 융합 단백질; 약 10 mM 히스티딘; 약 65 mM 수크로즈; 약 0.01% 트윈 80; 및 약 6.0의 pH를 포함하는 제조 약품.
제37항에 있어서, 상기 지시사항이 재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도가 약 40 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 범위 내에 있도록 동결건조된 제제를 재구성하기 위한 것인 제조 약품.
제37항에 있어서, 상기 동결건조된 제제가 멸균된 것인 제조 약품.
제37항에 있어서, 동결건조된 제제를 재구성하는 희석제를 담는 제2 용기를 추가로 포함하며, 여기서 상기 희석제가 주사용수 (WFI)인 제조 약품.
제37항에 있어서, 상기 지시사항에 따라 재구성할 때, 제제가 40℃에서 1주일 후에 5% 미만의 분해를 나타내는 제조 약품.
제37항에 있어서, 약 10% 미만의 RAGE 융합 단백질이 재구성시에 제제 중에 응집물로 존재하는 제조 약품.
제37항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질이 동결건조 보호제를 포함하는 제조 약품.
제54항에 있어서, 상기 동결건조 보호제가 비환원성 당을 포함하는 제조 약 품.
제54항에 있어서, 상기 비환원성 당이 수크로즈, 만니톨, 또는 트레할로스 중 하나 이상을 포함하는 제조 약품.
제37항에 있어서, 상기 동결건조된 RAGE 융합 단백질이 완충액, 계면 활성제, 킬레이트제 또는 증량제 중 하나 이상을 포함하는 제조 약품.
재구성된 제제 중 RAGE 융합 단백질 농도가 약 1 mg/mL 내지 약 400 mg/mL의 범위 내에 있도록, 희석제 중에서 RAGE 융합 단백질 및 동결건조 보호제의 동결건조된 혼합물 재구성하는 것을 포함하는 RAGE 융합 단백질의 안정적인 재구성된 제제의 제조 방법.
제58항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 방법.
제58항에 있어서, 상기 동결건조 보호제가 비환원성 당을 포함하는 방법.
제58항에 있어서, 상기 동결건조 보호제가 수크로즈, 만니톨, 또는 트레할로스 중 하나 이상을 포함하는 방법.
제58항에 있어서, 상기 동결건조된 혼합물이 완충액, 계면 활성제, 킬레이트제 또는 증량제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 방법.
제58항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질이 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57 중 하나 이상으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 방법.
제63항에 있어서, 상기 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57과 90% 이상 동일한 서열이 C-말단 리신을 수반하지 않은 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 또는 57의 폴리펩티드를 포함하는 방법.
제58항에 있어서, 상기 재구성된 제제가 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57로 나타낸 서열을 포함하는 약 40 내지 100 mg/mL RAGE 융합 단백질; 약 2 mM 내지 약 60 mM 히스티딘; 약 60 mM 내지 약 65 mM 수크로즈; 약 0.001% 내지 약 0.05 % 트윈 80; 및 약 6.0 내지 6.5의 pH를 포함하는 방법.
제58항에 있어서, RAGE 융합 단백질 및 동결건조 보호량의 동결건조 보호제 를 포함하는 혼합물을 동결건조하여 동결건조된 RAGE 융합 단백질을 제조하는 것을 추가로 포함하는 방법.
RAGE 융합 단백질, 동결건조 보호제, 및 완충액을 포함하는 재구성된 제제의 치료상 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체 중 RAGE-매개성 질병의 치료 방법.
제67항에 있어서, 상기 동결건조 보호제가 비환원성 당을 포함하는 방법.
제68항에 있어서, 상기 비환원성 당이 수크로즈, 만니톨, 또는 트레할로스를 포함하는 방법.
제67항에 있어서, 상기 완충액이 히스티딘을 포함하는 방법.
제67항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 방법.
제71항에 있어서, 상기 RAGE 폴리펩티드가, RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, RAGE 이뮤노글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함하는 방법.
제71항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질이, 제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 C_H2 이뮤노글로불린 도메인 또는 이뮤노글로불린의 C_H2 도메인의 일부의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, 제2 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 이뮤노글로불린 도메인 및 제1 RAGE 도메인간 링커를 포함하는 방법.
제71항에 있어서, 상기 RAGE 폴리펩티드가 서열 10으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열, 또는 서열 47로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 방법.
제67항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질이 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57 중 하나 이상으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 방법.
제75항에 있어서, 상기 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57과 90% 이상 동일한 서열이 C-말단 리신을 수반하지 않은 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 또는 57의 폴리펩티드를 포함하는 방법.
제67항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질 제제가 계면 활성제, 킬레이트제 또는 증량제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 방법.
제67항에 있어서, 상기 RAGE 융합 단백질 제제가 40℃에서 1주일 후에 5% 미만의 분해를 나타내는 방법.
제67항에 있어서, 약 10% 미만의 RAGE 융합 단백질이 RAGE 융합 단백질 제제 중에 응집물로 존재하는 방법.
제67항에 있어서, 대상체에게 RAGE 융합 단백질 제제를 정맥내, 복강내, 또는 피하 중 하나 이상으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
제67항에 있어서, 상기 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제가 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57로 나타낸 서열을 포함하는 약 40 내지 100 mg/mL RAGE 융합 단백질; 약 2 mM 내지 약 50 mM 히스티딘; 약 60 mM 내지 약 65 mM 수크로즈; 약 0.001% 내지 약 0.05 % 트윈 80; 및 약 6.0 내지 6.5의 pH를 포함하는 방법.
제67항에 있어서, 상기 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제가 서열 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56, 또는 57로 나타낸 서열을 포함하는 약 40 내지 50 mg/mL RAGE 융합 단백질; 약 10 mM 히스티딘; 약 65 mM 수크로즈; 약 0.01% 트윈 80; 및 약 6.0의 pH를 포함하는 방법.
제67항에 있어서, 상기 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제가 당뇨병 또는 당뇨병 말기 합병증 증상을 치료하는데 사용되는 방법.
제83항에 있어서, 상기 당뇨병 또는 당뇨병 말기 합병증 증상이 당뇨병성 신병증, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 족부 궤양, 당뇨병의 심혈관 합병증, 또는 당뇨병성 신경병증 중 하나 이상을 포함하는 방법.
제67항에 있어서, 상기 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제를 아밀로이드증, 알츠하이머병, 암, 신부전증, 또는 자가면역, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 건선, 다발성 경화증, 저산소증, 졸중, 심장 마비, 출혈성 쇼크, 패혈증, 기관 이 식, 또는 상처 치유 부전과 연관된 염증 중 하나 이상을 치료하는데 사용하는 방법.
제67항에 있어서, 상기 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제를 골다공증을 치료하는데 사용하는 방법.
제86항에 있어서, 상기 방법이 대상체의 골 밀도를 증가시키거나 또는 대상체의 골 밀도 감소율을 저하시키는 것을 포함하는 방법.
제85항에 있어서, 상기 자가면역이 피부 세포, 췌장 세포, 신경계 세포, 근육 세포, 내피 세포, 심장 세포, 간 세포, 신장 세포, 심장, 골수 세포, 뼈, 혈액 세포, 동맥 세포, 정맥 세포, 연골 세포, 갑상선 세포, 또는 줄기 세포 중 하나 이상의 거부반응을 포함하는 방법.
제67항에 있어서, 상기 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제를 신부전증을 치료하는데 사용하는 방법.
제67항에 있어서, 상기 재구성된 RAGE 융합 단백질 제제를 기관, 조직 또는 다수의 세포들 중 하나 이상의 제1 부위로부터 제2 부위로의 이식과 연관된 염증 및/또는 거부 반응을 치료하는데 사용하는 방법.
제90항에 있어서, 상기 제1 부위 및 제2 부위가 상이한 대상체 내에 있는 방법.
제90항에 있어서, 상기 제1 부위 및 제2 부위가 동일한 대상체 내에 있는 방법.
제90항에 있어서, 상기 이식되는 세포, 조직 또는 기관이 췌장, 피부, 간, 신장, 심장, 골수, 혈액, 뼈, 근육, 동맥, 정맥, 연골, 갑상선, 신경계, 또는 줄기 세포의 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 방법.