KR20080107385A

KR20080107385A - 변형된 활성화 특성을 갖는 응고 인자 ｘ 폴리펩타이드

Info

Publication number: KR20080107385A
Application number: KR1020087020484A
Authority: KR
Inventors: 슈테판 슐트; 한스-페터 하우저; 우베 칼리나; 토마스 바이머
Original assignee: 체에스엘 베링 게엠베하
Priority date: 2006-02-21
Filing date: 2007-02-19
Publication date: 2008-12-10
Anticipated expiration: 2027-02-19
Also published as: US20090175828A1; DK1991255T3; JP2009527234A; AU2007218266B2; EP1991255B1; US9347051B2; KR101492824B1; EP1820508A1; WO2007096116A1; ES2546862T3; JP5292107B2; AU2007218266A1; EP1991255A1; CA2642910A1; CA2642910C

Abstract

본 발명은 활성화를 위한 인자 VIIIa/FIXa 또는 인자 VIIa/TF의 필요성을 우회할 수 있는 인자 X 폴리펩타이드, 특히 사람 인자 X 및 이의 유도체를 암호화하는 변형된 cDNA 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 변형된 cDNA 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터, 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포, 변형되지 않은 야생형 단백질의 생물학적 활성을 갖지만 변화된 활성화 특성을 갖는 재조합 폴리펩타이드 및 유도체, 및 이러한 재조합 단백질 및 이의 유도체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 변형된 DNA 서열을 포함하는, 사람의 유전자 치료법에서 사용하기 위한 전달 벡터에 관한 것이다.

응고 인자 X 폴리펩타이드, 인자 VIIIa/FIXa, 인자 VIIa/TF

Description

변형된 활성화 특성을 갖는 응고 인자 Ｘ 폴리펩타이드{Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties}

비타민 K 의존적 단백질은 특정 유형의 혈우병을 치료하는데 사용된다. 전형적 혈우병 또는 A형 혈우병은 유전성 출혈 질환이다. 이는 혈액 응고 인자 VIII의 염색체 X-연관된 결함으로 인한 것이며, 10,000명당 한 명 내지 두 명의 발생률로 거의 전적으로 남성에게서 일어난다. X-염색체 결함은 그 자신은 혈우병 환자 가 아닌 여성 보인자에 의해 유전된다. A형 혈우병의 임상 증상은 출혈 경향의 증가이다. 인자 VIII 농축물을 사용한 치료가 도입되기 전에, 중증 혈우병에 걸린 사람의 평균 수명은 20년 미만이었다. 혈장 유래의 인자 VIII의 농축물 및 이후의 인자 VIII의 재조합 형태의 농축물의 사용은 혈우병 환자의 평균 수명을 길게 연장시키고 이들 대부분에게 다소간의 정상 생활을 영위할 가능성을 주어, 혈우병 환자의 상황을 크게 개선시켰다. A형 혈우병보다 5배 덜 만연한 B형 혈우병은 비기능성 인자 IX 또는 인자 IX의 결여로 인해 유발되며 혈장 유래의 인자 IX 농축물 또는 인자 IX의 재조합 형태로 치료된다. A형 혈우병 및 B형 혈우병 둘다에서, 질환 치료에서의 가장 심각한 의학적 문제는 대체 인자에 대한 알로항체의 발생이다. 모든 A형 혈우병 환자의 최대 30%에서 인자 VIII에 대한 항체가 발생한다. FIX에 대한 항체는 보다 덜한 정도로 발생하지만, 이들 항체가 면역 내성 유도 치료법에 대해 덜 감수성이기 때문에 보다 심각한 결과를 초래한다.

응고에 대한 현재 모델은 응고의 생리학적 유발인자가, 정상적으로는 맥관계 외부에 위치해 있고 손상이 일어나야지만 접근할 수 있는 조직 인자(TF) 발현 세포의 표면상에 TF와 인자 VIIa(FVIIa) 간에 복합체를 형성시킴을 보여준다. 인자 VIIa/TF의 복합체는 인자 IX 및 인자 X를 활성화시켜 최종적으로 일부 트롬빈을 생성시킨다. 양성 피드백 루프에서, 트롬빈은 인자 VIII 및 인자 IX를 활성화시키고, 이들은 이어서 혈액 응고 캐스케이드(blood coagulation cascade)의 소위 "내인성" 팔(arm)인 인자 X를 활성시킴으로써 완전한 트롬빈 반응의 발생을 위해 필수적인 인자 Xa의 생성을 증폭시켜 완전한 지혈을 달성한다. 생리학적 농도를 초과 하는 농도의 FVIIa를 투여함으로써 인자 VIIIa 및 인자 IXa의 필요가 우회되는 것으로 나타났다. 인자 VII에 대한 cDNA의 클로닝[참조: 미국 특허 제4,784,950]은 혈장 유래의 응고 인자의 재조합 대체물을 개발할 수 있게 하였다. 이러한 인자 VIIa는 1988년에 FVIII에 대한 고 역가의 억제성 항체를 갖는 환자에게 최초로 성공적으로 투여되었다. 그 이후로 줄곧, 인자 VIIa가 범용 지혈제일 수 있다는 가능성을 보여주는 인자 VIIa의 증거의 수가 꾸준하게 늘어났다[참조: Erhardtsen, 2002]. 불행하게도, 인자 VIIa는 2시간을 조금 넘는 혈장 반감기를 가지며 따라서 빈번하게 재투여해야만 해서 이러한 치료법은 침습적이고 비용이 매우 많이 들게 된다.

따라서, 특히 지혈성 우회 제제(haemostatic bypassing agent)인 개선된 응고 인자가 계속 요구되어 왔다. 지혈성 우회 제제는 특정 응고 인자가 결여되었거나 비기능적이거나 억제성 항체에 의해 차단된 환자에게 투여되는 경우에 응고를 일으킬 수 있는 물질이다. 응고 캐스케이드에서의 차단을 우회하는 이러한 화합물의 활성(지혈성 우회 활성)은 당업계에 공지된 응고 검정을 사용하여 측정할 수 있다. 필수적으로, 지혈성 우회 제제는, 결여되었거나 비기능적이거나 차단된 응고 인자의 기질 또는 이러한 결여되었거나 비기능적이거나 차단된 응고 인자의 "하류"에 있는 응고 캐스케이드의 기타 기질을 직접적으로 활성화시키는 능력을 갖고, 이에 따라서 이러한 결여되었거나 비기능적이거나 차단된 응고 인자가 효과적 트롬빈 생성을 위해 더이상 필요하지 않게 한다.

인자 X도 집중적 조사 대상이였다.

인자 X에 대한 cDNA는 특성 규명되었다[참조: Leytus et al. 1984, PNAS, 82: 3699- 3702]. 응고 인자 X는 자이모겐으로서 간 세포로부터 혈장으로 분비되는 분자량 58.5 kDa의 비타민-K 의존적 당단백질이다. 초기에 인자 X는 총 488개의 아미노산으로 이루어진 시그날 펩타이드를 갖는 프리프로펩타이드로서 생산된다. 소포체로 수송되는 동안에 시그날 펩티다제에 의해 시그날 펩타이드가 절단되고, 감마 카복실화가 성숙한 N-말단 쇄의 N-말단에 있는 처음 11개 글루탐산 잔기에서 일어난 후에 프로펩타이드 서열이 절단된다. Arg182와 Ser183 사이의 절단에 의해 추가 프로세싱 단계가 일어난다. 이러한 프로세싱 단계는 또한 부수적으로 트리펩타이드 Arg180-Lys181-Arg182의 결실을 야기한다. 생성된 분비성 인자 X 자이모겐은 Cys172와 Cys342 사이의 디설파이드 브릿지를 통해 공유 결합된, 139개 아미노산의 N-말단 경쇄(M_r 16,200)와 306개 아미노산의 C-말단 중쇄(M_r 42,000)로 이루어져 있다. 추가의 해독후 프로세싱 단계는 Asp103의 β-하이드록실화와 N-형 및 O-형 당화.

인자 VIIIa/인자 IXa 또는 인자 VIIa/TF는 둘다, Arg234에 대한 카복시-말단을 절단하여 Ser183부터 Arg234까지의 52개 아미노산의 이른바 활성화 펩타이드를 방출시킴으로써 활성화된 혈소판상의 인자 X를 활성화시킬 수 있는 생리학적 조건하에 있다.

자가촉매 절단에서, 활성화된 인자 X(인자 Xa)는 Arg464에 대한 카복시 말단에서 이의 중쇄의 C-말단의 작은 단편을 절단하여 인자 Xaβ를 유도한다. 그러나, 인자 Xa의 두 형태 모두가 유사한 촉매 활성을 갖기 때문에 이러한 절단의 생리학적 관련성은 명확하지 않다.

다음과 같이 인자 X를 변형시키고자 하는 몇가지 시도가 있었다:

울프(Wolf) 등(1991)(JBC. 266. no. 21. PP. 13726-13730)은 인자 X의 활성화 펩타이드를 인자 X의 활성화 펩타이드 영역 내로 2개의 신규 푸린(furin) 절단 컨센서스 부위의 도입을 유도하는 디펩타이드 Arg-Lys로 치환시킴으로써, 인자 X의 활성화 펩타이드를 결실시켰다. 이러한 인자 X 변이체는 세포내 프로세싱 동안 이미 활성화되어 활성화된 인자 X의 분비를 유도한다.

울프 등(1995)(Blood. 86. pp 4153-4157)은 혈장으로 주사된 후에 천천히 탈아실화되어 시간 경과에 따라서 활성화된 인자 X를 생성시키는 인자 Xa의 아실화 불활성 변이체를 제조하였다.

루돌프(Rudolph) 등(1997)(Prot. Express and Puri.. 10: 373-378)은 프로펩타이드 절단 부위의 영역 내에서 인자 X를 변형시켰고, Thr39의 Arg로의 치환이 세포 배양물 내에서 프로펩타이드 프로세싱의 효율을 상당히 개선시켰음을 확인하였다.

카미레(Camire) 등(2000)(Biochemistry. 39 pp.14322-14329)은 인자 X의 프리프로펩타이드를 트롬빈의 프리프로펩타이드로 치환시켜 세포 배양물 중에서 보다 높은 감마 카복실화 정도를 달성하였다. 그러나, 감마 카복실화 속도가 증가되었지만 인자 X의 10 내지 30%는 여전히 카복실화되지 않았다.

루돌프 등(2002)(Thromb Haemost., 88:756-62)은 활성화 펩타이드가 결실된 인자 X 변이체를 제조하였다. 이러한 인자 X 변이체는 보조인자 독립적 방식으로 자가활성화된 것으로 나타났으며, 본 논문은 활성화 펩타이드의 1차적 기능은 FX의 거짓(spurious) 활성화를 방지하는 것이라고 결론짓고 있다.

티에스(Thiec) 등(2003)(JBC. 12. pp 10393-10399)은 인자 X의 GIa 도메인 및 제1 EGF 도메인을 FIX의 상응하는 도메인으로 치환시켜, 이러한 키메라가 TF/FVIIa 복합체와 생산적으로 상호작용하는 능력을 조사하였다.

WO 98/38317 (우선일: 1997년 2월 27일)은 Gly228와 Ile235 사이의 천연 활성화 절단 부위에 변형을 가져서, 천연적으로는 인자 X를 활성화시키지 않는 프로테아제에 의해 절단되고 활성화될 수 있는 인자 X 유사체를 청구한다.

WO 98/38318 (우선일: 1997년 2월 27일)에는 Arg180부터 Arg234까지의 아미노산이 결실되고 Gly173부터 Arg179까지의 아미노산이 변형되어, 천연적으로는 FX를 활성화시키지 않는 프로테아제가 변형된 서열을 절단하여 당해 인자 X 유사체를 활성화시킬 수 있는 인자 X 유사체가 교시되어 있다.

WO 01/10896 (우선일: 1999년 8월 10일)에는 Glu226과 Ile235 사이의 아미노산중 하나 이상이 치환된 인자 X 유사체가 기재되어 있다. 상기 공보의 실시예에는 인자 X 변이체를 FXI에 의해 절단될 수 있도록 만드는 FIX 유래의 활성화 절단 부위의 도입이 제시되어 있다.

WO 03/035861 (우선일: 2001년 10월 19일)은 활성화 펩타이드가 제거되어 피브리노펩타이드 A의 아미노산 P₁₀ 내지 P₁에 의해 치환됨으로써 당해 인자 X 변이 체가 트롬빈에 의해 활성화될 수 있게 만드는 키메라 트롬빈 절단 부위를 생성시키는 인자 X의 변이체를 청구한다.

WO 2004/005347 (우선일: 2002년 7월 3일)에는 야생형 인자 X 내에서 Leu-Thr-Arg-Ile-Val-Gly 내지 X-Pro-Arg-Ala-Y-Z인 잔기 P₃-P₂-P₁-P₁'-P₂'-P₃'을 변형시켜 트롬빈에 의해 활성화될 수 있는 인자 X의 변이체가 교시되어 있다.

볼켈(Volkel) 등(2005)[참조: Mol. Biotechnol.. 29 (1):19-30]은 전립선 특이적 항원이 FX 변이체를 특이적으로 활성화시키도록 하는 FX 활성화 펩타이드 내로의 신규 프로테아제 절단 부위의 도입을 교시한다.

몇몇 저자들이 활성화된 인자 X (FXa)가 지혈성 우회 제제로서 사용될 수 있다고 제시하였지만[참조: Ni et al., 1992 (Thromb. Haemost. 67:264-271); Himmelspach et al., 2002 (Thromb. Haemost. 88:1003-1011)], 이러한 약제학적 제제가 혈전발생성이고 파종성 혈관내 응고(DIC)를 초래할 수 있다는 몇가지 우려가 여전히 남아있다.

비-활성화된 자이모겐 인자 X의 치료학적 용도는 훨씬 안전한 접근법인 것으로 보인다. 미국 특허 제4,501,731호(우선일 1983년 6월 27일)는 지혈성 우회 제제로서의 인자 X의 용도만을 제시한다. WO 03/006054 (우선일: 2001년 7월 10일)에서는, 약제학적 조성물 중의 인자 X가 FVIIa와 함께, FVIIa의 지혈 효능을 상승작용에 의해 증진시킬 수 있다는 것이 제시되었다.

그러나, 내인성 응고 경로를 통한 인자 X의 활성화의 효율은 억제제 환자에 서 심각하게 약화되는 반면에 외인성 응고 경로는 (조직 인자의 제한된 유용성으로 인해) 응고의 초기 단계로 제한되는 것으로 보이기 때문에, 응고가 요구되고 제한된 유용성 및/또는 활성의 보조인자의 필요성을 우회하는 상황에서 인자 X의 활성화를 촉진시키도록 인자 X를 변형시키는 것이 유리하다. 변이체 인자 X 자이모겐은, 이것이 생산되어 활성화 없이 투여될 수 있지만 응고 활성(예를 들면, 트롬빈 생성)이 요구되는 경우에는 응고의 내인성 및 외인성 경로의 천연 활성화인자의 필요 없이 활성화가 보다 높은 속도로 일어날 수 있도록 안정해야만 한다.

몇몇 저자들은 천연적으로는 FX를 절단 및 활성화시키지 않는 프로테아제에 의해 활성화될 수 있는 인자 X 유사체를 제조하고자 시도했었다는 것이 기재되어 있다. 이들 인자 X 유사체는 활성화 펩타이드의 결실 또는 Arg234의 절단 부위앞에서 일어나는 활성화 펩타이드의 서열의 변형을 갖는다. 그러나 이들 인자 X 유사체는 불충분한 지혈성 우회 활성을 나타낸다.

본 발명에서 제기된 한가지 과제는 지혈성 우회 제제를 동정하는 것이다. 특히, 고 역가의 인자 VIII 억제제를 갖는, 환자를 치료하는데 사용될 수 있는 지혈성 우회 제제가 요구된다.

본 발명에서 놀랍게도 지혈성 우회 활성을 갖는 생물학적 활성 인자 X 변이체(도 1)가 (i) 인자 X의 활성화 펩타이드를 변형시켜 야생형 인자 X의 활성화 펩타이드내에 존재하지 않는 프로테아제 절단 부위를 생성시키는 단계 및 (ii) 활성화 펩타이드 및/또는 경쇄의 C-말단 영역내에 아미노산의 수를 감소시키는 단계에 의해 수득될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

본 발명에서 활성화 펩타이드는 인자 X내 프로테아제 절단 부위를 포함하는 Arg179 및 Arg234 사이의 인자 X내의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미하고 이때, 당해 프로테아제 절단 부위가 프로테아제에 의해 절단되는 경우 인자 X는 인자 Xa로 활성화된다.

본 발명의 한가지 측면은 야생형 인자 X의 Arg179 내지 Arg234의 아미노산 서열내에 존재하지 않는 프로테아제 프로세싱 부위를 활성화 펩타이드내에 생성시키는 변형을 갖고, 이때 Arg179 및 Ile235에 상응하는 잔기 사이의 아미노산 수가 야생형 인자 X와 비교하여 1 내지 52개의 아미노산까지 감소되는 생물학적 활성 인자 X 변이체이다 .

본 발명의 또 다른 측면은 야생형 인자 X의 Arg179 내지 Arg234의 아미노산 서열내에 존재하지 않는 프로테아제 프로세싱 부위를 활성화 펩타이드내에 생성시키는 변형을 갖고, 이때 변형된 활성화 펩타이드가 야생형 인자 X의 활성화 펩타이드보다 단축된, 생물학적 활성 인자 X 변이체이다. 본 발명의 또 다른 측면은 야생형 인자 X의 Ser183 내지 Arg234의 아미노산 서열내에 존재하지 않는 프로테아제 프로세싱 부위를 생성시키고 변형된 활성화 펩타이드가 야생형 인자 X의 활성화 펩타이드 보다 단축되도록 활성화 펩타이드가 변형된 생물학적 인자 X 변이체이다.

본 발명은 추가로 야생형 인자 X의 Ser183 내지 Arg234의 아미노산 서열내에 존재하지 않고 푸린 프로세싱 부위가 아닌 프로테아제 프로세싱 부위를 생성시키는 변형을 활성화 펩타이드에 갖고, 이때 야생형 인자 X의 활성화 펩타이드 보다 단축되도록 활성화 펩타이드가 변형된 생물학적 활성 인자 X 변이체에 관한 것이 다.

야생형 인자 X 및 야생형 인자 X의 아미노산 서열을 암호화하는 cDNA 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2로 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같은 인자 X 서열내 아미노산의 번호매김은 서열번호 2에 나타낸 야생형 서열의 아미노산 번호매김을 언급한다.

본 발명에 따른 인자 X 변이체는 새롭게 도입된 프로테아제 프로세싱 부위가 당해 프로테아제 프로세싱 부위를 절단할 수 있는 프로테아제에 의해 절단되는 즉시 활성화된다. 일반적으로, 본 발명의 인자 X 변이체는 푸린과 같은 세포내 프로테아제에 의해 활성화될 수 없다. 따라서, 본 발명의 인자 X 변이체는 일반적으로 울프 등[문헌참조: 1991 (JBC, 266, no. 21, pp. 13726-13730)]에 의해 기재된 변이체와는 반대로 숙주 세포에서 이의 발현 동안에 인자 Xa로 프로세싱되지 않는다. 일반적으로, 본 발명의 인자 X 변이체는 환자에게 비활성화된 형태로 투여되어야만 하고 인자 Xa로의 활성화는 단지 환자의 체내에 투여후에만 일어난다.

본 발명의 변이체는 야생형 인자 X의 아미노산 서열과 비교하여 활성화 펩타이드 서열 및/또는 경쇄의 C-말단 영역에서 감소된 수의 아미노산을 갖는다. 당해 변이체는 Arg179 및 Ile235에 상응하는 잔기사이에 감소된 수의 아미노산 또는 Arg180 및 Ile235에 상응하는 잔기 사이에 감소된 수의 아미노산, 또는 Lys181 및 Ile235에 상응하는 잔기 사이에 감소된 수의 아미노산, 또는 Arg182 및 Ile235에 상응하는 잔기 사이의 감소된 수의 아미노산을 가질 수 있고; 이때, 아미노산 수의 감소는 야생형 인자 X의 아미노산 서열에 상대적인 것이다.

바람직하게, 본 발명의 변이체는 야생형 인자 X의 아미노산 서열과 비교하여 이의 활성화 펩타이드 서열에 감소된 수의 아미노산을 갖는다. 예를 들어, 당해 변이체는 야생형 인자 X의 아미노산 서열과 비교하여 Arg182와 Ile235에 상응하는 아미노산 잔기 사이에 감소된 수의 아미노산을 가질 수 있다.

야생형 인자 X와 비교하여 상기 정의된 바와 같은 아미노산의 수는 1 내지 52개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 49개의 아미노산, 보다 바람직하게는 10개 내지 48개의 아미노산, 보다 바람직하게는 20 내지 47개의 아미노산, 여전히 보다 바람직하게는 30개 내지 47개의 아미노산, 가장 바람직하게는 38개 내지 47개의 아미노산 (예를 들어. 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개 또는 46개 아미노산)까지 감소한다.

아미노산 수의 감소는 인자 X 서열의 활성화 펩타이드 및/또는 경쇄 기원의 하나 이상의 아미노산의 결실로 인한 것일 수 있다. 야생형 인자 X의 아미노산 서열과 비교하여 치환 및 삽입을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가의 돌연변이가 있을 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로테아제 프로세싱 부위 "는 프로테아제에 의해 인지되고 절단될 수 있는 아미노산 서열을 언급한다. 궁극적으로 프로테아제에 의해 절단되는 화학적 결합은 내부적으로 프로세싱 부위내 또는 프로세싱 부위에 대한 C-말단내에 위치할 수 있다. 예를 들어, 프로세싱 부위가 TQSFNDFTR (서열번호 3)인 경우, 실질적인 절단은 당해 서열내 아르기닌에 대한 C 말단에서 일어날 수 있다. 바람직하게, 새로운 프로세싱 부위는 변형된 활성화 펩타이드의 C-말 단 영역, 예를 들어, 야생형 인자 X의 활성화 프로세싱 부위가 위치한 영역에 위치한다.

프로테아제 프로세싱 부위에 대한 당해 프로테아제의 절단은 인자 X 변이체를 활성화시킨다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 인자 X 변이체에서 천연 인자 X 활성화 펩타이드는 천연적으로 인자 X를 활성화시키는 프로테아제가 당해 인자 X 변이체를 더 이상 절단하여 활성화시킬 수 없도록 변형된다. 이것은 인자 X의 활성화 펩타이드 서열내로 돌연변이를 도입시켜 성취될 수 있다. 돌연변이는 삽입, 결실 및 치환을 포함한다. 바람직하게는 천연적으로 인자 X를 활성화시키는 프로테아제가 당해 인자 X 변이체를 더 이상 절단하여 활성화시킬 수 없도록, 단지 활성화가 새로운 프로테아제 프로세싱 부위를 통해 발생하도록, 활성화 펩타이드 서열이 결실되고/되거나 치환되는 것이다. 가장 바람직하게는, 야생형 인자 X의 활성화 펩타이드에 존재하는 프로테아제 프로세싱 부위를, 천연적으로 야생형 인자 X를 절단하여 활성화시키지 못하는 프로테아제에 대한 프로테아제 프로세싱 부위로 대체하는 것이다.

본 발명의 바람직한 양태에 따라, 변형된 X 변이체의 활성화 펩타이드에서 새로운 프로테아제 프로세싱 부위는 세린 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 보다 바람직하게, 세린 프로테아제는 인자 IIa, 인자 IXa, 인자 Xa, 인자 XIa, 인자 XIIa, 활성화된 단백질 C, 엘라스타제 또는 칼리크레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 본 발명의 인자 X 변이체에서 변형된 활성화 펩타이드는 하기의 식으로 나타낸다:

-R¹-P-R²-,

상기식에서,

P는 절단 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열, 즉 절단 프로테아제에 의해 인지되어 절단될 수 있는 아미노산 서열(또한 "프로세싱 부위"로서 지정됨)을 나타내고,

R¹은 화학적 결합 또는 하나 이상의 아미노산 (예를 들어, 1개 내지 48개의 아미노산)을 나타내고,

R²는 화학적 결합 또는 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1개 내지 5개의 아미노산)을 나타낸다.

본 발명에 따른 인자 X 변이체내 변형된 활성화 펩타이드는 바람직하게 야생형 인자 X 의 활성화 펩타이드 보다 짧다. 따라서, -R¹-P-R²-의 최대 길이는 일반적으로 51개의 아미노산이다. -R¹-P-R²-의 총 길이의 범위는 바람직하게 3개 내지 40개 아미노산, 보다 바람직하게는 4개 내지 40개, 여전히 보다 바람직하게는 5개 내지 30개 아미노산, 보다 더 바람직하게는 6개 내지 20개의 아미노산, 가장 바람직하게는 7개 내지 15개 아미노산, 예를 들어, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산이다.

R¹은 48개 이하의 아미노산 길이를 가질 수 있다. 그러나 바람직하게, R¹은 화학적 결합이거나 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 아미노산)으로 이루어진다. R¹은 야생형 인자 X의 활성화 펩타이드의 부분 서열일 수 있다. 52개 아미노산으로 이루어진 야생형 인자 X의 활성화 펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 4로 나타낸다. 예를 들어, R¹은 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 45번 내의 N 말단 또는 내부 단편을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. R¹의 예는 하기의 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:

서열번호 4의 아미노산 1번 (즉, 아미노산 1번=Ser);

서열번호 4의 아미노산 1번 및 2번 (즉, Ser-Val);

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 3번 (즉, Ser-Val-Ala);

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 4번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 5번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 6번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 7번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 8번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 9번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 10번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 11번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 12번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 13번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 14번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 15번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 16번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 17번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 18번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 19번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 20번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 21번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 22번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 23번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 24번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 25번 ;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 26번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 27번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 28번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 29번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 30번; 서열번호 4의 1번 내지 31번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 32번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 33번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 34번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 35번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 36번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 37번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 38번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 39번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 40번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 41번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 42번; 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 43번;

서열번호 4의 아미노산 1번 내지 44번; 및 서열번호 4의 아미노산 1번 내지 45번.

추가로, R²가 화학적 결합이거나 1 또는 2개의 아미노산으로 이루어진 것이 바람직하다. 가장 바람직하게 R²는 화학적 결합이다.

일반적으로, 새롭게 도입된 프로테아제 절단 부위가 절단되는 경우 절단되는 화학적 결합에 대한 아미노산 C-말단은 바람직하게 이소류신 또는 발린이다. 당해 아미노산에 이어서 바람직하게는 발린이 위치한다. 새롭게 도입된 프로테아제 절단 부위가 절단되는 경우 절단되는 화학적 결합에 대한 다른 바람직한 아미노산 C-말단은 알라닌, 세린 또는 트레오닌이다.

R²가 화학적 결합인 경우, 새롭게 도입되는 프로테아제 절단 부위가 절단되는 경우의 화학적 결합에 대한 아미노산 C-말단은 인자 X 변이체 중쇄의 N-말단 아미노산이고 Ile235에 상응한다. 당해 아미노산은 Ile, Val, Ala, Ser 또는 Thr일 수 있다. 바람직하게, Ile235에 상응하는 아미노산은 Ile 또는 Val이다. Val236에 상응하는 아미노산은 바람직하게 Val이다.

또 다른 양태에서, R²는 Ile, Val, Ala, Ser, Thr, Ile-Val, 또는 Val-Val일 수 있다.

P는 3개 이상의 아미노산 길이, 바람직하게는 30개 이하의 아미노산 길이를 갖는다. 바람직하게, P는 4개 내지 15개의 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 4 내 지 10개의 아미노산 길이를 갖는다. 프로테아제에 의한 절단은 일반적으로 P에 대한 C 말단에서 일어난다. P는 절단 프로테아제에 의해 절단되는 단백질의 부분 아미노산 서열일 수 있다. 또한, P는 절단 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 비천연 또는 인공 아미노산 서열일 수 있다.

적합한 프로테아제에 의해 절단되고 적합한 프로테아제 프로세싱 부위를 포함하는 단백질은 응고 인자, 및 인자 VII, 인자 IX, 안티트롬빈 III, 인자 II, 인자 VIII, 인자 XI, 인자 XII, 또는 프레칼리크레인과 같은 세르핀을 포함하고 이들의 아미노산 서열은 당업자에게 공지되어 있다 (하기 참조). 따라서, P는 당해 단백질의 임의의 하나의 부분 서열 또는 단편일 수 있고, 여기서, 당해 부분 서열 또는 단편은 프로테아제 프로세싱 부위를 포함한다. 당해 프로세싱 부위의 변이체가 여전히 절단 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 한 당해 변이체는 또한 본 발명에 포함된다. 당해 변이체는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 이의 조합을 포함한다.

세린 프로테아제에 의해 인지되고 절단될 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 적합한 아미노산 서열 P는 하기의 항목(i) 내지 (iv)에 지적된다:

(i) FVII로부터 기원하고 예를 들어, 인자 Xa에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열은 아미노산 서열 LEKRNASKPQGR (서열번호 5)이다. FVII로부터 기원하고 예를 들어, 인자 Xa에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열의 추가의 예는 서열번호 5의 아미노산 2번 내지 12번,

서열번호 5의 아미노산 3번 내지 12번;

서열번호 5의 아미노산 4번 내지 12번;

서열번호 5의 아미노산 5번 내지 12번;

서열번호 5의 아미노산 6번 내지 12번;

서열번호 5의 아미노산 7번 내지 12번; 또는

서열번호 5의 아미노산 8번 내지 12번으로 이루어진 아미노산 서열이다.

(ii) FIX로부터 기원하고 예를 들어, FXIa에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열은 아미노산 서열 AETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTR (서열번호 6)이다. FVII로부터 기원하고 예를 들어, FXIa에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열의 추가의 예는 서열번호 6의 아미노산 2번 내지 35번; 서열번호 6의 아미노산 3번 내지 35번;

서열번호 6의 아미노산 4번 내지 35번; 서열번호 6의 아미노산 5번 내지 35번;

서열번호 6의 아미노산 6번 내지 35번; 서열번호 6의 아미노산 7번 내지 35번;

서열번호 6의 아미노산 8번 내지 35번; 서열번호 6의 아미노산 9번 내지 35번;

서열번호 6의 아미노산 10번 내지 35번; 서열번호 6의 아미노산 11번 내지 35번;

서열번호 6의 아미노산 12번 내지 35번; 서열번호 6의 아미노산 13번 내지 35번;

서열번호 6의 아미노산 14번 내지 35번; 서열번호 6의 아미노산 15번 내지 35번;

서열번호 6의 아미노산 16번 내지 35번; 서열번호 6의 아미노산 17번 내지 35번;

서열번호 6의 아미노산 18번 내지 35번; 서열번호 6의 아미노산 19번 내지 35번;

서열번호 6의 아미노산 20번 내지 35번; 서열번호 6의 아미노산 21번 내지 35번;

서열번호 6의 아미노산 22번 내지 35번; 서열번호 6의 아미노산 23번 내지 35번;

서열번호 6의 아미노산 24번 내지 35번; 서열번호 6의 아미노산 25번 내지 35번;

서열번호 6의 아미노산 26번 내지 35번; 서열번호 6의 아미노산 27번 내지 35번;

서열번호 6의 아미노산 28번 내지 35번; 서열번호 6의 아미노산 29번 내지 35번;

서열번호 6의 30번 내지 35번; 또는 서열번호 6의 아미노산 31번 내지 35번으로 이루어진 아미노산 서열이다.

(iii) 안티트롬빈 III로부터 기원하고 예를 들어, 인자 IIa에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열은 아미노산 서열 GSEAAASTAVVIAGRS (서열번호 7)이다. 안티트롬빈 III로부터 기원하고 예를 들어, 인자 IIa에 의해 절단될 수 있는 아미노 산 서열의 추가의 예는 안티트롬빈 III를 절단할 수 있는 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 서열번호 7의 단편이다.

(iv) 추가로 프로테아제 절단 부위의 비제한적인 예는 인자 IIa, 인자 IXa, 인자 Xa, 인자 XIIa, 활성화된 단백질 C, 엘라스타제 또는 칼리크레인에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열이다. 당해 세린 프로테아제에 의해 인지되고 절단되는 아미노산 서열은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌: "Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice", Fourth Edition, Colman et al. 2001 factor IIa: p34-35, p176, factorIXa: p40-41, factor Xa: p34-35, factor XIa p128129, factor XIIa: p194, aPC: p34-35, p159, kallikrein: p103-104 or elastase (O'Reilly et al., 1999; Antiangiogenic activity of the cleaved conformation of the serpin antithrombin: Science, 285,1926-1928에 기재된 바와 같음). 당해 아미노산 서열은 본원에 참조로서 인용된다.

프로테아제 절단 부위의 단편은 또한 당해 단편화된 프로테아제 절단 부위를 포함하는 FX 변이체가 여전히 절단에 민감하고 당해 FX 변이체가 여전히 생물학적 활성을 갖는 한 발명에 포함된다.

구조 -R¹-P-R²-내에 프로세싱 부위 P는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 및 당해 항목 (i), (ii), (iii) 및 (iv)에서 기재된 바와 같은 절단 가능한 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 바람직하다.

또한, 인자 X 서열의 천연 경쇄의 C 말단에서 하나 이상의 아미노산이 결실될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 인자 X 변이체는 변형된 활성화 펩타이드 R¹-P-R²에 인접한 하기의 구조를 포함할 수 있다:

LC- R¹-P-R²-HC1-HC2-,

상기식에서,

R¹, P 및 R² 의 의미는 상기 정의된 바와 같고,

LC는 인자 X 서열에서 경쇄의 C 말단 아미노산 서열이고, HC1은 인자 X 서열에서 중쇄의 N-말단 아미노산이고 HC2는 인자 X 서열에서 중쇄의 2번째 아미노산이다. HC1은 야생형 서열에서 Ile235에 상응한다. HC1은 Ile, Val, Ala, Ser 또는 Thr일 수 있다. 바람직하게, HC1은 Ile 또는 Val이다. HC2는 야생형 서열에서 Val236에 상응한다. HC2는 Ile, Val, Ala, Ser 또는 Thr일 수 있다. 바람직하게, HC2 는 Ile 또는 Val이고 가장 바람직하게, HC2는 Val이다.

LC는 Arg179에서 Arg182의 임의의 하나 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. LC는 바람직하게 Arg182, Lys181, Arg180 및 Arg179로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

보다 특히, 본 발명의 인자 X 변이체는 하기의 구조를 포함할 수 있다:

-Arg182-R¹-P-R²-HC1-HC2-; 바람직하게는 -Lys181-Arg182-R¹-P-R²-HC1-HC2-; 보다 바람직하게는 -Arg180-Lys181-Arg182-R¹-P-R²-HC1-HC2-,

여기서, R¹, P 및 R², HC1 및 HC2은 상기 정의된 바와 같다.

또 다른 양태에서, 또한 Arg182에 상응하는 아미노산은 결실되었다. 따라서, 본 발명의 인자 X 변이체는 하기의 구조를 포함할 수 있다:

-Lys181-R¹-P-R²-HC1-HC2-; 바람직하게는 -Arg180-Lys181-R¹-P-R²-HC1-HC2-;

여기서, R¹, P 및 R², HC1 및 HC2 는 상기 정의된 바와 같다.

여전히 또 다른 양태에서, 또한 Lys181 및 Arg182에 상응하는 아미노산 서열이 결실되었다. 따라서, 본 발명의 인자 X 변이체는 하기의 구조를 포함할 수 있다:

-Arg180-R¹-P-R²-HC1-HC2-;

여기서, R¹, P 및 R², HC1 및 HC2은 상기 정의된 바와 같다.

여전히 또 다른 양태에서, 또한 Arg180, Lys181 및 Arg182에 상응하는 아미노산이 결실되었다. 따라서, 본 발명의 인자 X 변이체는 하기의 구조를 포함할 수 있다:

-Arg179-R¹-P-R²-HC1-HC2-;

여기서, R¹, P 및 R², HC1 및 HC2는 상기 정의된 바와 같다.

특정 측면에서, LC1은 Pro171 내지 Arg182의 아미노산 잔기중 임의의 하나일 수 있고 (서열번호 2 참조) 이때 P는 인자 IX 아미노산 서열로부터 유래하는 7개 이상의 연속 아미노산 서열을 갖는 인자 IX의 부분 아미노산 서열이다. 본 발명의 당해 측면에 따라, P는 서열번호 6의 아미노산 1번 내지 35번, 서열번호 6의 아미노산 2번 내지 35번,

서열번호 6의 아미노산 3번 내지 35번, 서열번호 6의 아미노산 4번 내지 35번,

서열번호 6의 아미노산 5번 내지 35번, 서열번호 6의 아미노산 6번 내지 35번,

서열번호 6의 아미노산 7번 내지 35번, 서열번호 6의 아미노산 8번 내지 35번,

서열번호 6의 아미노산 9번 내지 35번, 서열번호 6의 아미노산 10번 내지 35번,

서열번호 6의 아미노산 11번 내지 35번, 서열번호 6의 아미노산 12번 내지 35번,

서열번호 6의 아미노산 13번 내지 35번, 서열번호 6의 아미노산 14번 내지 35번,

서열번호 6의 아미노산 15번 내지 35번, 서열번호 6의 아미노산 16번 내지 35번,

서열번호 6의 아미노산 17번 내지 35번, 서열번호 6의 아미노산 18번 내지 35번,

서열번호 6의 아미노산 19번 내지 35번, 서열번호 6의 아미노산 20번 내지 35번,

서열번호 6의 아미노산 21번 내지 35번, 서열번호 6의 아미노산 22번 내지 35번,

서열번호 6의 아미노산 23번 내지 35번, 서열번호 6의 아미노산 24번 내지 35번,

서열번호 6의 25번 내지 35번, 서열번호 6의 아미노산 26번 내지 35번,

서열번호 6의 아미노산 27번 내지 35번, 서열번호 6의 아미노산 28번 내지 35번, 및 서열번호 6의 아미노산 29번 내지 35번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게, P는 서열번호 3으로 이루어진다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 Ser183 내지 Arg234가 -R¹-P-R²-(여기서, R¹, P 및 R²는 상기 정의된 바와 같다)로 대체된 인자 X 아미노산 서열을 포함하는 인자 X 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 서열번호 2의 아미노산 Arg182 내지 Arg234가 -R¹-P-R²-(여기서, R¹, P 및 R²는 상기 정의된 바와 같다)로 대체된 인자 X 아미노산 서열을 포함하는 인자 X 변이체에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 서열번호 2의 아미노산 Lys181 내지 Arg234가 -R¹-P-R²-(여기서, R¹, P 및 R²는 상기 정의된 바와 같다)로 대체된 인자 X 아미노산 서열을 포함하는 인자 X 변이체에 관한 것이다. 여전히 또 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 Arg180 내지 Arg234가 -R¹-P-R²-(여기서, R¹, P 및 R²는 상기 정의된 바와 같다)로 대체된 인자 X 아미노산 서열을 포함하는 인자 X 변이체에 관한 것이다.

바람직한 측면에서, 본 발명의 인자 X 변이체는 서열번호 2의 아미노산 Ser183 내지 Arg234가 서열번호 5 내지 7의 아미노산 서열중 임의의 하나 또는 항목 (i), (ii) 및 (iii)중 임의의 하나로 상기된 바와 같은 단편으로 대체된 인자 X 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 2의 아미노산 Ser183 내지 Arg234이 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열로 대체된 인자 X 아미노산 서열을 포함하는 인자 X 변이체가 가장 바람직하다. 가장 바람직한 인자 X 변이체의 완전한 아미노산 서열은 서열번호 8 및 서열번호 9에 나타낸다.

또한 본 발명에 의해 포함되는 것은, 상기된 바와 같은 새로운 프로테아제 프로세싱 부위가 인자 X 분자의 중쇄에 도입된 양태이다. 중쇄에 도입된 프로테아제 프로세싱 부위는 변형된 활성화 펩타이드에 존재하는 프로테아제 프로세싱 부위를 비롯한 추가의 프로세싱 부위일 수 있거나 변형된 활성화 펩타이드내에서 프로테아제 프로세싱 부위 대신에 존재할 수 있다. 중쇄로의 삽입은 바람직하게 Ile 235 또는 상응하는 잔기(예를 들어, Val)에 대한 C 말단에 수행된다. 인자 X의 중쇄로의 삽입은 문헌[European Patent application No. 05011773.8 filed on June 1^st, 2005]에 상세히 기재되어 있고, 이의 내용은 본원에 참조로서 인용된다. 본 원에 기재된 양태는 당해 문헌에 기재된 양태와 조합될 수 있다.

예를 들어, 본 발명은 하기식을 특징으로 하는 인자 X 변이체를 포함한다:

-LC-R¹-HC1-R¹-P-R²-HC2-

여기서, LC, R¹, P, R², HC1 및 HC2는 상기 정의된 바와 같다. 당해 경우에, R²는 바람직하게 Ile, Val, Ala, Ser 및 Thr중 하나이고, 가장 바람직하게는 R²는 Ile 또는 Val이다.

당해 양태의 또 다른 예는 하기식의 변이체이다:

-LC-R¹-HC1-HC2-R¹-P-R²-HC3-

여기서, LC, R¹, P, R², HC1 및 HC2는 상기 정의된 바와 같고 HC3는 인자 X의 중쇄의 3번째 아미노산이다. 당해 양태에서, R²는 바람직하게 Ile-Val 또는 Val-Val이다.

본 발명의 인자 X 변이체는 인자 X 서열내의 다른 위치에서 추가의 변형을 가질 수 있다. 따라서, 인자 X의 활성화 펩타이드에서 변형 및 부분 결실은 서열번호 2로 나타낸 바와 같은 야생형 서열과 비교되는 아미노산 서열에 대한 여러 변형중 하나 일 수 있다. 39번 위치에서 트레오닌이 아르기닌으로 대체되는 것이 바람직하다.

하나의 특이적 양태에서, 본 발명의 인자 X 변이체는 Gly173과 Arg179 사이의 인자 X 아미노산 서열에서 어떠한 변형을 갖지 않는다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 인자 X 변이체는 Gly173과 Arg179 사이의 인자 X 아미노산 서열에서 하나의 변형을 갖지만 Gly173과 Arg179 사이의 인자 X 아미노산 서열에서 당해 변형은 서열번호 2의 Gly173과 Arg179 사이를 천연적으로 절단하지 않는 프로테아제에 대한 프로세싱 부위를 유도하지 않는다. Gly173과 Arg179 사이의 인자 X 아미노산 서열에서 변형은 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3개)의 아미노산 서열의 결실, 치환 및/또는 삽입일 수 있다.

다른 특정 양태에서, 야생형 인자 X 서열의 활성화 펩타이드(즉, Ser183 내지 Arg234의 아미노산) 는 서열 RKR로 대체되지 않거나 상기 정의된 바와 같은 구조 -R¹-P-R²- 는 RKR가 아니거나; 인자 X 변이체는 서열 -Arg182-Arg-Lys-Arg-[Ile235]-을 갖지 않는다.

또 다른 양태에서, 야생형 인자 X의 Ser183 내지 Arg234의 아미노산 서열내에 존재하지 않는 프로테아제 프로세싱 부위는 RKRRK이 아니다.

본 발명의 인자 X 변이체는 생물학적 활성을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "생물학적 활성"은 인자 X 활성을 언급한다. 인자 X 활성을 갖는 단백질은 이의 자이모겐 형태의 단백질이 프로테아제에 의한 절단을 통해 활성화될 수 있고 이의 활성화된 형태로 인자 Xa 활성을 가짐을 의미한다. 인자 X 활성은 시험관내 응고 분석으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 인자 X 활성은 실시예 4에 기재 된 바와 같은 외인성 응고 경로의 활성을 측정하는 프로트롬빈 시간(PT) 분석으로 측정할 수 있다. 샘플중에 응고 활성으로서 표현되는 인자 X 활성은 mU/ml 또는 U/ml로 나타낸다.

상기 측정된 인자 X 활성은 샘플중에 존재하는 인자 X 항원의 양으로 언급될 수 있고 따라서 변이체의 "비활성(specific activity)"을 나타내고 예를 들어 U/mg 또는 mU/g 단백질로 표현된다. 본 발명의 변이체의 비활성은 서열번호 2로 나타낸 바와 같은 야생형 서열을 갖는 재조합 인자 X 분자의 인자 X 활성에 대해 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상이다.

본 발명의 인자 X 변이체는 추가로 지혈성 우회 활성을 갖는다. 당해 활성은 FVIII- 또는 FIX-고갈 혈장을 사용하여 응고 활성(aPPT)을 측정함에 의해 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정할 수 있다. 당해 분석에서 응고 활성은 바람직하게 야생형 서열을 갖는 재조합 인자 X의 활성 보다 바람직하게는 70배 이상, 보다 바람직하게는 100배 이상, 가장 바람직하게는 500배 이상 증가된다. FVIII-고갈된 혈장을 사용한 응고 활성은 야생형 서열을 갖는 재조합 인자 X 의 활성 보다 바람직하게는 200배 이상, 보다 바람직하게는 300배 이상, 보다 바람직하게는 500배 이상, 가장 바람직하게는 1000배 이상 또는 보다 더 바람직하게는 1500배 이상 증가된다. FIX 고갈된 혈장을 사용한 응고 활성은 야생형 서열을 갖는 재조합 인자 X의 활성 보다 바람직하게는 100배 이상, 보다 바람직하게는 200배 이상, 가장 바람직하게는 500배 이상 또는 1000배 이상 증가된다.

인자 X 변이체는 인자 VIII 억제제의 존재하에 개선된 우회 활성을 갖는다. 이러한 활성은 하기 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정할 수 있다. 본 발명의 인자 X 변이체의 FVIII 억제제를 함유하는 혈장에서 응고 시간(예를 들어, 실시예 4에 따라 측정되는 바와 같이)은 동일 인자 X 활성으로 조정되는 경우 야생형 서열을 갖는 재조합 인자 X의 응고 시간에 비해 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상으로 감소한다.

본 발명에 따른 바람직한 인자 X 변이체는 선행기술분야에 기재된 인자 X 변이체에 비해 증진된 지혈성 우회 활성을 갖는 인자 X 변이체이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 인자 X 변이체는 일반적으로 서열번호 2의 아미노산 번호매김을 기준으로 서열 Glu226-Gln227-Ser228-Phe229-Asn230-Asp231-Phe232-Thr233-Arg234 (EQSFNDFTR=서열번호 10)을 함유하는 비교용 인자 X 변이체(비교용 변이체의 활성화 펩타이드의 길이는 52개 아미노산이고 즉, 활성화 펩타이드의 길이에는 어떠한 결실된 부분이 없다)에 비해 상당히 증진된 지혈성 우회 활성을 갖는다. FVIII- 또는 FIX 고갈된 혈장에서 지혈성 우회 활성은 당해 비교용 변이체에 비해 1.5 이상, 바람직하게는 2 이상, 보다 바람직하게는 5 이상, 가장 바람직하게는 10 이상의 인자로 증가한다. 본 발명의 인자 X 변이체의 FVIII 억제제를 함유하는 혈장에서 응고 시간(예를 들어, 실시예 4에 따라 측정되는 바와 같이)은 동일 인자 X 활성으로 조정되는 경우 당해 비교용 변이체의 응고 시간에 비해 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상 감소한다.

또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 인자 X 변이체는 서열번호 2의 아미노산 226번 내지 234번이 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열로 대체된 인자 X 아미노산 서열을 포함하는 비교용 인자 X 변이체와 비교하여 상당히 증진된 지혈성 후회 활성을 갖고 이때, 당해 비교용 인자 X 변이체에서 활성화 펩타이드의 길이는 52개 아미노산이다. 당해 비교용 변이체는 실시예에 기재된 작제물 "535"에 상응한다. FVIII- 또는 FIX- 고갈된 혈장에서 지혈성 우회 활성은 당해 비교용 변이체와 비교하여 1.5이상, 바람직하게는 2 이상, 보다 바람직하게는 5 이상, 가장 바람직하게는 10이상의 인자로 증가한다. 본 발명의 인자 X 변이체의 FVIII 억제제를 함유하는 혈장에서 응고 시간(예를 들어, 실시예 4에 따라 측정되는 바와 같이) 은 동일 인자 X 활성으로 조정되는 경우 당해 비교용 변이체의 응고시간에 비해 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상 감소한다.

본 발명의 또 다른 측면은 인자 X 서열의 활성화 펩타이드를 변형시켜 변형된 활성화 펩타이드가 야생형 인자 X의 Arg179 내지 Arg234의 아미노산 서열내에 존재하지 않는 프로테아제 프로세싱 부위를 포함하도록 하고 야생형 인자 X에 비해, Arg179 및 Ile235에 상응하는 잔기 사이의 아미노산 수를 1 내지 52개로 감소시킴을 포함하는, 지혈성 우회 제제를 제조하는 방법이다.

본 발명의 또 다른 측면은 인자 X 서열의 활성화 펩타이드를 변형시켜 변형된 활성화 펩타이드가 야생형 인자 X의 Arg179 내지 Arg234의 아미노산 서열내에 존재하지 않는 프로테아제 프로세싱 부위를 포함하도록 하고 부분적으로 활성화 펩타이드를 결실시켜 변형된 활성화 펩타이드가 야생형 인자 X의 활성화 펩타이드 보다 단축되도록 함을 포함하는, 지혈성 우회 제제를 제조하는 방법이다.

바람직하게, 새로운 절단 부위는 변형된 활성화 펩타이드의 C-말단 영역에 있다. 본 발명의 방법의 바람직한 양태는 본원에 기재된 인자 X 변이체의 바람직한 양태에 상응한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 변형된 사람 인자 X를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 용어 "폴리뉴클레오타이드(들)"은 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 언급한다. 당해 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄 또는 이본쇄 DNA, 일본쇄 또는 이본쇄 RNA일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드(들)"은 또한 이노신과 같이 하나 이상의 변형된 염기 및/또는 독특한 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 다양한 변형이 DNA 및 RNA에 가해질 수 있고 이것은 당업자에게 공지된 많은 유용한 목적에 사용될 수 있는 것으로 평가된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오타이드(들)"는 바이러스 및 예를 들어, 단순 세포 및 복잡한 세포를 포함하는 세포에 특징적인 화학적 형태의 DNA 및 RNA 뿐만 아니라 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

당업자는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 소정의 폴리펩타이드가 상이한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있음을 이해할 것이다. 이들 "변이체"가 본 발명에 포함된다.

바람직하게, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 분리된 폴리뉴클레오타이드이다. 용어 "분리된" 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 이에 제한되지 않지만 다른 염색체 및 염색체 외부 DNA 및 RNA와 같은 실질적으로 다른 핵산 서열이 없는 폴리 뉴클레오타이드를 언급한다. 분리된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 당업자에게 공지된 통상적인 핵산 정제 방법을 사용하여 분리된 폴리뉴클레오타이드를 수득할 수 있다. 당해 용어는 또한 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

그러나, 본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 또는 벡터이다. 바람직하게, 플라스미드 또는 벡터는 발현 벡터이다. 특정 양태에서, 당해 벡터는 사람 유전자 치료에 사용하기 위한 전달 벡터이다.

본 발명의 여전히 또 다른 측면은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.

본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 일부인 사람 인자 X의 변이체를 제조하는 방법에 사용될 수 있다. 당해 방법은:

a) 본 발명의 숙주 세포를 인자 X 변이체가 발현되는 조건하에서 배양하는 단계; 및

b) 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 사람 인자 X의 변이체를 임의로 회수하는 단계

를 포함한다.

당화 또는 기타 해독 후 변형 정도 및 위치는 선택된 숙주 세포 및 숙주 세포 환경의 특성에 따라 다양할 수 있다. 특정 아미노산 서열을 언급하는 경우, 당해 서열의 해독후 변형이 본원에 포함된다.

본원에 사용되는 바와 같은 "인자 X"는 비활성화된 형태로 이루어진 생성물(인자 X)을 의미한다. 상기 정의 범위에서 "인자 X"는 천연 사람 인자 X의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 이것은 또한 단백질이 실질적으로 인자 Xa의 활성을 보유하고 있는 한, 약간 변형된 아미노산 서열, 예를 들어, N-말단 아미노산 결실 또는 부가를 포함하는 변형된 N-말단을 갖는 단백질을 포함한다. 상기 정의 범위내에서 "인자 X"는 또한 개체별로 존재하거나 실재할 수 있는 천연 대립형질 변이체를 포함한다. 상기 정의 범위내에서 "인자 X"는 또한 인자 X의 변이체를 포함한다. 당해 변이체는 야생형 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이하다. 당해 차이의 예는 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들어, 1개 내지 10개의 아미노산 잔기)에 의한 N-말단 및/또는 C-말단의 절단 또는 N말단 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 추가 잔기의 부가, 예를 들어, N-말단에서 메티오닌 잔기의 부가, 및 보존성 아미노산 치환, 즉, 유사한 특성을 갖는 아미노산 그룹, 예를 들어 (1) 소형 아미노산, (2) 산성 아미노산, (3) 극성 아미노산, (4) 염기성 아미노산, (5) 소수성 아미노산, (6) 방향족 아미노산 그룹으로 수행되는 치환을 포함할 수 있다. 당해 보존성 치환의 예는 하기의 표에 나타낸다.

용어 "재조합 "은 예를 들어, 변이체가 숙주 유기체에서 유전자 조작 기술에 의해 제조된 것임을 의미한다. 본 발명의 인자 X 변이체는 일반적으로 재조합 인자 X 변이체이다.

제안된 변이체의 발현:

적합한 숙주 세포에서 고수준으로 재조합 단백질의 제조는 당업자에게 공지된 법에 따라 다양한 발현 시스템에서 증폭될 수 있는 재조합 발현 벡터에서 적합한 조절 요소들과 함께 효율적인 전사 유니트로 상기된 변형된 cDNA를 어셈블리할 필요가 있다. 효율적인 전사 조절 요소들은 본래의 숙주가 동물 세포인 바이러스 또는 동물 세포의 염색체 DNA로부터 유래할 수 있다. 바람직하게, 시미안 바이러스 40, 아데노바이러스, BK 폴리오마 바이러스, 사람 사이토메갈로바이러스 또는 긴 말단 복체의 라우스 사르코마 바이러스로부터 유래된 프로모터-인핸서 조합체, 또는 베타 액틴 또는 GRP78 처럼 동물 세포에서 강하게 항상성으로 전사되는 유전자를 포함하는 프로모터-인핸서 조합체가 사용될 수 있다. cDNA로부터 전사되는 안정한 고수준의 mRNA를 성취하기 위해, 전사 유니트는 이의 3' 인접 부분에 전사 종결-폴리아데닐화 서열을 암호화하는 DNA 영역을 포함해야만 한다. 바람직하게, 당해 서열은 시미안 바이러스 40 어얼리 전사 영역, 래빗 베타-글로빈 유전자 또는 사람 조직 플라스미노겐 활성화인자 유전자로부터 유래한다.

이어서, cDNA는 인자 X 변이체의 발현용으로 적합한 숙주 세포주의 게놈으로 통합된다. 바람직하게 당해 세포주는 올바른 폴딩, Gla-도메인 합성, 디설파이드 결합 형성, 아스파라긴-연결된 당화, O-연결된 당화 및 기타 해독후 변형 및 배양 배지로의 분비를 보장하기 위해 척추동물 기원의 동물 세포주이어야만 한다. 다른 해독후 변형의 예는 초기 폴리펩타이드 쇄의 하이드록실화 및 단백질 분해 프로세싱이다. 사용될 수 있는 세포주의 예는 몽키 COS-세포, 마우스 L-세포, 마우스 C127-세포, 햄스터 BHK-21 세포, 사람 배아 신장 293 세포 및 햄스터 CHO-세포이다.

상응하는 cDNA를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 여러 상이한 방식으로 동물 세포주에 도입될 수 있다. 예를 들어, 재조합 발현 벡터는 상이한 동물 바이러스를 기초로 하는 벡터로부터 작제될 수 있다. 이들의 예는 바쿨로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 바람직하게 소 파필로마 바이러스를 기초로 하는 벡터이다.

상응하는 DNA를 암호화하는 전사 유니트는 또한 당해 세포에서 재조합 DNA가 이의 게놈으로 통합된 특정 세포 클론의 분리를 용이하게 하기 위해 당해 세포에서 우성 선택가능 마커로서 작용할 수 있는 또 다른 재조합 유전자와 함께 동물 세포에 도입될 수 있다. 당해 유형의 우성 선택가능 마커 유전자의 예는 제네티신(G418)에 대해 내성을 부여하는 Tn5 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 히그로마이신에 대해 내성을 부여하는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 및 푸로마이신에 대해 내성을 부여하는 푸로마이신 아세틸 트랜스퍼라제이다. 당해 선택가능 마커를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 목적하는 단백질의 cDNA를 암호화하는 것과 동일한 벡터상에 존재할 수 있거나, 동시에 도입되고 숙주 세포의 게놈으로 통합되어 흔히, 상이한 전사 유니트 사이에서 엄격한 물리적 연결을 형성하는 별도의 벡터상에 암호화될 수 있다.

목적하는 단백질의 cDNA와 함께 사용될 수 있는 다른 유형의 선별가능 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr)를 암호화하는 다양한 전사 유니트를 기초로 한다. 당해 유형의 유전자가 내인성 dhfr-활성이 결여된 세포, 바람직하게 CHO-세포(DUKX-B11, DG-44)로 도입되면, 이것은 당해 세포가 뉴클레오사이드 결여 배지에서 성장할 수 있도록 한다. 당해 배지의 예는 하이포산틴, 티미딘 및 글라이신 부재의 Ham's F12이다. 이들 dhfr-유전자는 응고 인자 cDNA 전사 유니트와 함께 동일한 벡터 또는 상이한 벡터상에 연결되어 상기 유형의 CHO 세포로 도입될 수 있고 따라서 재조합 단백질을 생산하는 dhfr 양성 세포주가 생성될 수 있다.

상기 세포주가 세포독성 dhfr-억제제 메토트렉세이트의 존재하에 성장하는 경우, 메토트렉세이트에 내성인 새로운 세포주가 출현할 것이다. 이들 세포주는 증폭된 수의 연결된 dhfr 및 목적하는 단백질의 전사 유니트로 인해 증가된 비율로 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 증가하는 농도의 메토트렉세이트(1 - 10000nM)에서 당해 세포주를 증식시키는 경우, 매우 높은 비율로 목적하는 단백질을 생산하는 새로운 세포주가 수득될 수 있다.

목적하는 단백질을 생산하는 상기 세포주는 현탁 배양 또는 다양한 고형 지지체상에서 대규모로 성장할 수 있다. 당해 지지체의 예는 덱스트란 또는 콜라겐 매트릭스, 또는 중공 섬유 또는 다양한 세라믹 재료 형태의 고형 지지체를 기초로 하는 마이크로 담체이다. 세포 현탁 배양에서 또는 마이크로 담체상에서 성장하는 경우, 상기 세포주의 배양은 회분 배양 또는 장기간동안 조건화된 배지를 연속적으로 발생시키는 관류 배양으로서 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라, 상기 세포주는 목적하는 재조합 단백질의 생산을 위한 산업 공정의 개발에 매우 적합하다.

상기 유형의 분비 세포 배지에 축적하는 재조합 단백질은 다양한 생화학적 및 크로마토그래피 방법에 의해 농축되고 정제될 수 있고 당해 방법은 세포 배양 배지에서 목적하는 단백질과 다른 물질간의 크기, 전하, 소수성, 용해도, 특이적 친화성 등의 차이를 사용하는 방법을 포함한다.

당해 정제의 예는 재조합 단백질을 고형 지지체상에 고정화된 모노클로날 항체에 흡착시키는 것이다. 탈착시킨 후, 단백질은 또한 상기 성질을 기초로 하는 다양한 크로마토그래피 기술에 의해 정제될 수 있다.

본 발명의 변형된 생물학적 활성 인자 X 변이체를 80% 이상의 순도, 보다 바람직하게는 95% 이상의 순도로 정제하는 것이 바람직하고 오염 거대분자, 특히 다른 단백질 및 핵산에 대해 99.9% 초과로 순수하고 감염성 제제 및 화농성 제제가 없는 약제학적으로 순수한 상태가 특히 바람직하다. 바람직하게, 본 발명의 분리되거나 정제된 변형된 생물학적 활성 인자 X 변이체는 실질적으로 기타 폴리펩타이드가 부재이다.

본 발명에 기재된 재조합 단백질은 치료학적 용도의 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 정제된 단백질은 임의로 약제학적 부형제가 부가될 수 있는 생리학적으로 적합한 통상적인 완충 수용액에 용해시켜 약제학적 제제를 수득할 수 있다.

적합한 약제학적 제형 뿐만 아니라 당해 약제학적 담체 및 부형제는 당업계에 널리 공지되어 있다 (문헌참조 "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) or "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3^rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)). 특히, 본 발명의 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 약제학적 조성물은 동결건조된 또는 안정한 가용성 형태로 제형화될 수 있다. 폴리펩타이드 변이체는 당업계에 공지된 다양한 과정에 의해 동결건조될 수 있다. 동결건조된 제형은 사용전에 주사용 멸균수 또는 멸균 생리학적 식염 용액과 같은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제를 첨가하여 재구성된다.

당해 조성물의 제형은 약제학적으로 적합한 투여 수단에 의해 개체에 전달된다. 다양한 전달 시스템이 공지되어 있고 임의의 통상적인 경로에 의해 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 우선적으로 본 발명의 조성물은 전신 투여된다. 전신 용도를 위해, 본 발명의 인자 X 변이체는 통상적인 방법에 따라 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 뇌내, 폐내, 비강내 또는 피내) 또는 경장 (예를 들어, 경구, 질내 또는 직장내) 전달용으로 제형화된다. 가장 선호되는 투여 경로는 정맥내 투여이다. 당해 제형은 주입 또는 일시 주사에 의해 연속적으로 투여될 수 있다. 당해 제형은 서방성 시스템을 포함한다.

본 발명의 당해 변형된 생물학적 활성 인자 X 변이체는 치료학적 유효량으로 환자에게 투여되고 당해 유효량은 목적하는 효과를 생성하기에 충분한 양, 또는 상당한 부작용을 나타내는 양에 이르지 않고 치료되는 상태 또는 증상의 중증도 또는 확장을 예방하거나 경감시키는 양을 의미한다. 정확한 양은 예를 들어, 징후, 제형, 투여 방식과 같은 많은 인자에 의존하고 당해 각각의 징후에 대해 임상전 및 임상 시험에서 측정되어야만 한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 연계하여 투여될 수 있다. 당해 제제는 동일 약제의 일부로서 혼입될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기재된 바와 같은 사람 인자 X의 변형된 동족체, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 변형된 동족체, 본 발명의 플라스미드 또는 벡터의 변형된 동족체 또는 본 발명의 숙주 세포의 변형된 동족체를 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하는 것이다. 혈액 응고 장애는 A형 혈우병, B형 혈우병 또는 FVII/FVIIa 결핍증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 이들 질환은 각각의 응고 인자에 대한 자가면역 항체에 의해 악화되는 후천성 또는 선천성 형태이다. 특정 양태에서, 치료될 환자는 인자 VIII에 대한 억제제 항체를 갖는다. 바람직하게, 당해 치료는 사람 유전자 치료를 포함한다.

본 발명은 또한 A형 혈우병, B형 혈우병 또는 FVII/FVIIa 결핍증과 같은 혈액 응고 장애를 앓는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이고 바람직하게 당해 질환은 각각의 응고 인자에 대한 자가면역 항체에 의해 악화되는 후천성 또는 선천성 형태이다. 당해 방법은 당해 개체에 본원에 기재된 바와 같은 유효량의 사람 인자 X의 변형된 동족체를 당해 개체에 투여함을 포함한다. 또 다른 양태에서, 당해 방법은 당해 개체에 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 플라스미드 또는 벡터를 당해 개체에 투여함을 포함한다. 또한, 당해 방법은 당해 개체에 본원에 기재된 바와 같은 유효량의 본 발명의 숙주 세포를 투여함을 포함할 수 있다.

표 및 도면 설명:

도 1:

새롭게 도입된 프로테아제 절단 부위를 갖는 FX 야생형 및 FX 변이체의 개요. 숫자는 서열번호 2의 아미노산 번호매김을 언급하고 활성화 펩타이드는 Numbers Ser183에서 Arg234까지의 아미노산 서열로서 정의된다. 인자 IX로부터 유래하는 외래 활성화 서열은 굵은 문자로 강조된다. 밑줄친 아미노산은 각각 테나제 복합체 및 인자 VIIa/조직 인자에 의해 각각의 인자 X 분자를 비활성화시킬 수 있는 점 돌연변이를 나타낸다. 작제물 "532"는 인자 X 야생형 서열에 상응한다.

도 2:

야생형 인자 X의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열

도 3:

인자 IX 기원의 프로테아제 프로세싱 부위를 함유하는 인자 X가 인자 XI에 의해 직접적으로 활성화되어 응고 인자 IX 및 VIII에 대한 필요성을 어떻게 우회할 수 있는지를 보여주는 응고 캐스케이드의 도식이다.

실시예 1: 발현 플라스미드의 작제

인자 X 암호화 서열은 프라이머 We1292 및 We1293 (서열번호 11 및 12)를 사용하는 PCR에 의해 사람 간 cDNA 라이브러리(Ambion)로부터 증폭시켰다. 프라이머 We1354 및 We1355 (서열번호 13 및 14)를 사용하는 제2회 PCR에서, 제한 엔도뉴클레아제 NheI에 대한 절단 부위는 5' 말단에 도입하고 제한 엔도뉴클레아제 NotI에 대한 절단 부위는 단편의 3' 말단에 도입하였다. 이어서 PCR 단편은 pIRESpuro3(BD Biosciences)의 NheI / NotI 부위에 삽입하였다. 수득한 플라스미드는 pFX-445로 지정하였다.

프로펩타이드의 프로세싱을 개선시키기 위해, 절단 부위는 39번 위치(서열번 호 2)에서 아미노산 트레오닌을 아르기닌으로 대체하여 개선시켰다 (Rudolph et al., 1997 (Protein Expression and Purification 10:373-378)). 이를 위해, pFX-445는 표준 방법에 따라 올리고뉴클레오타이드 We1482 및 We1483 (서열번호 15 및 16)를 사용하는 부위 지시된 돌연변이 유발에 적용하였다 (QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene). 수득한 플라스미드는 pFX-532로 지정하였다.

하기에 기재된 모든 돌연변이는 시판되는 돌연변이 유발 키트를 사용하여 수행하였다 (QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene).

pFX-532를 기초로, 인자 XIa 절단 부위를 갖는 작제물을 작제하였다. 올리고뉴클레오타이드 We1444 및 We1445 (서열번호 17 및 18)을 사용하는 대체 돌연변이 유발에 의해 인자 X 활성화 영역의 8개 아미노산(서열번호 2의 아미노산 225번 내지 233번)이 FIX의 활성화 영역 기원의 8개 아미노산으로 대체된 플라스미드 pFX-535를 수득하였다.

pFX-532에 대해 올리고뉴클레오타이드 We1567 및 We1568 (서열번호 19 및 20)을 사용한 부위 지시된 돌연변이 유발을 사용하여 플라스미드 pFX-641를 작제하였다. 이것은 인자 X 활성화 펩타이드내에 2개의 돌연변이 Leu232Asp 및 Thr233Asp를 포함했고 이에 따라 활성화될 수 없는 인자 X 분자가 생성되었다.

올리고뉴클레오타이드 We1976 및 We1977 (서열번호 21 및 22)을 사용한 결실 돌연변이 유발에 의해 FX 활성화 펩타이드 서열이 결실되었지만 삽입된 FIX 활성화 서열을 유지하고 있는 플라스미드 pFX-915를 수득하였다(도 3 참조).

올리고뉴클레오타이드 We2357 및 We2358 (서열번호 23 및 24)을 사용하는 pFX-915에 대한 부위 지시된 돌연변이 유발에 의해 Ile235가 Val로 대체되었고 이에 의해 FX 중쇄의 아미노 말단 아미노산이 FIX의 상응하는 아미노산으로 변화된 플라스미드 pFX-1066을 수득하였다.

실시예 2: 변형된 인자 X 분자의 형질감염 및 발현

플라스미드는 이 콜리 TOP10 (Invitrogen)에서 증폭시키고 표준 프로토콜(Qiagen)을 사용하여 정제하였다. 리펙타민 2000 시약(Invitrogen)을 사용하여 HEK 293 세포를 형질감염시키고 50 ng/ml의 비타민 K 및 4 ug/ml 푸로마이신의 존재하에 무혈청 배지(Invitrogen 293 Express)에서 증폭시켰다. 형질감염 약 4주 후에 생화학적 특성 분석을 위해 상등액을 수거하였다.

실시예 3: 재조합 인자 X 변이체의 특성 분석

인자 X 변이체의 발현은 인자 X에 대한 모노클로날 항체를 사용하는 정량적 ELISA에 의해 조절하였다. 이어서 재조합 단백질의 실체는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 샘플은 환원 및 비환원 조건하에 분석하였다. 혈장 인자 X는 고유 분자량 대조군으로서 사용하였다. 인자 Xa를 사용하여 자가 활성화의 경우에 임의로 활성화된 재조합 인자 X 변이체를 검출하고 비교하였다. 웨스턴 블롯에서 가시화된 바와 같이, 모든 재조합 인자 X 변이체는 약 58kDa의 올바른 분자량으로 발현하였고 혈장 인자 X와 상응하는 위치로 이동하였다. 환원된 경우, 재조 합 인자 X 변이체는 약 40kDa의 중쇄(HC)와 약 20kDa의 경쇄(LC)로 붕괴하였다. 58 kDa 밴드는 비처리된 단일쇄(OC) 인자 X를 나타냈다. 웨스턴 블롯에서 인자 Xa 또는 인자 X의 어떠한 응집체도 검출되지 않았다. 본 발명의 인자 X 변이체는 분자량이 약 49kDa인 비처리된 단일쇄 분자로서 웨스턴 블롯에서 가시화되었다. 이는 비환원된 형태 및 환원된 형태에서 사실임을 입증한다.

실시예 4: 사람 인자 VIII 억제제 혈장에서 뿐만 아니라 사람 인자 X-, 인자 VIII- 및 인자 IX 결핍 혈장에서 재조합 인자 X 변이체의 시험관내 활성에 대한 조사

인자 X 활성은 외인성 응고 경로의 활성을 측정하는 프로트롬빈 시간(PT) 분석에서 측정하였다. 100 ul의 인자 X 결핍 혈장은 100 ul의 인자 X 변이체 세포 배양 상등액 또는 정제된 단백질과 혼합하였다. 37℃에서 60초동안 항온처리 한 후, 사람 혈장 유래 트롬보플라스틴, CaCl₂ 및 인지질을 함유하는 200 ul 의 트롬보렐 (Dade Behring)을 당해 혼합물에 첨가하고 Schnittger & Gross 응고 타이머를 사용함에 의해 초단위로 응고 시간을 측정하였다. 인자 X 활성의 측정을 위해, 혈장 인자 X 표준물을 사용하여 당해 분석을 보정하였다. 돌연변이된 인자 X pFX641의 세포 배양 상등액은 당해 분석에 대한 네가티브 대조군으로서 사용할 수 있다. 당해 돌연변이체는 야생형 인자 X 활성화 펩타이드내에서 손상된 절단 부위를 함유한다. 예상되는 바와 같이, 돌연변이체가 216.4 U/ml의 인자 X와 동등한 항원 수준 에서 시험되는 경우, 응고 활성은 단지 0.5 mU/ml에 도달하였다.

pFX532로부터 유래하는 재조합 야생형 인자 X 및 pFX535, pFX915 및 pFX1066으로부터 유래하는 인자 X 변이체를 정제하였다. 인자 X 항원에 특이적인 항체를 사용한 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 항원 농도는 1.1 내지 4.2 U/ml이었다. 인자 Xa에 의한 인자 X의 측정 장애를 배척하기 위해, 인자 Xa는 색소형성 분석에 의해 측정하였다. 모든 정제된 인자 X 변이체는 단지 0.023-0.103 mU/ml의 인자 Xa 수준을 포함했고(표 2) 이는 인자 X 측정을 실질적으로 방해하지 않는다.

서로간에 발현된 인자 X 변이체를 비교하기 위해, 인자 X 응고 활성을 측정하고 약 1.5U/ml로 조정하였다. 시험된 모든 변이체는 기능적으로 활성이고 응고 활성은 1.10 내지 1.72 U/ml 이다(표 2).

FVIII- 및 FIX 결핍 혈장에서 재조합 인자 X 변이체의 기능은 내인성 응고 캐스케이드의 활성을 측정하는 활성화된 부분 프로트롬빈 시간(aPPT)으로 시험하였다. 100 ul의 FVIII- 또는 FIX- 고갈된 혈장은 100 ul의 인자 X 변이체 세포 배양 상등액 또는 정제된 단백질과 혼합하였다. 37℃에서 6분동안 항온처리한 후 SiO₂, 인지질 및 40mM의 NaCl을 함유하는 100 ul의 파트롬프틴 (Dade Behring) 및 100ul의 25mM CaCl₂를 첨가하여 응고 반응을 개시하였다. 초 단위의 응고 시간은 Schnittger & Gross 응고 타이머를 사용하여 측정하였다. 활성은 표준 사람 혈장과 비교되는 바와 같이 각각의 응고 FX 관련 사항으로 나타내었다.

재조합 야생형 인자 X는 예상된 바와 같이, 인자 VIII 고갈 혈장에서 단지 6.6mU/ml의 응고 활성 및 FIX 고갈 혈장에서 단지 5.8mU/ml의 응고 활성에 도달하였다. 반대로, 본 발명의 인자 X 변이체는 인자 VIII 고갈 혈장에서 12952.0 내지 26428.0 mU/ml 범위의 매우 높은 응고 활성 및 FIX 고갈 혈장에서 6327.0 mIU/ml 내지 15515.0 mIU/ml 범위의 매우 높은 응고 활성에 도달하였다 (표 2).

pFX535로부터 유래하는 인자 X 변이체는 Ile235에 대해 야생형 FX 활성화 펩타이드 N-말단의 영역내에 삽입된 새로운 인자 IX 활성화 서열을 갖는 WO 01/10896에 기재된 인자 X 변이체에 상응하지만 활성화 펩타이드 길이에서는 어떠한 결실을 갖지 않는다. 놀랍게도, 인자 X 야생형 활성화 펩타이드가 결실되었고 pFX915 및 pFX1066에 의해 암호화된 새로운 프로테아제 절단 부위로 대체된 본 발명의 인자 X변이체는 FIX 고갈된 혈장에서 각각 6327.0 및 15515.0 mU/ml 또는 FVIII 고갈 혈장에서 각각 12952.0 및 26428.0 mU/ml의 매우 강한 응고 활성을 나타내었다 (표 2).

기능 활성의 측정은 또한 A형 혈우병 환자 기원의 혈장을 함유하는 FVIII-억제제를 사용하여 수행하였다. 환자 혈장은 ml당 약 300 베테스다 유니트의 FVIII 억제제를 함유하였다. 응고는 상기된 바와 같은 인자 X 응고로 조정된 aPPT 및 샘플에서 측정하였다.

표준 및 시험 샘플의 희석을 위해 사용되는 샘플 완충 대조군은 156.5초의 응고 시간에 도달하는 반면, 재조합 야생형 인자 X는 111.4 초의 응고 시간에 도달하였다. FVIII 또는 FIX 고갈된 혈장을 기초로하는 FVIII 또는 FIX 응고 분석에서 놀라운 결과를 확인해 볼 때, pFX915 및 pFX1066에 의해 암호화된 본 발명의 인자 X 변이체는 FVIII 억제 항체를 함유하는 혈장을 기초로 하는 FEIBA 분석에서 각각 21.4 및 21.1 초의 응고시간을 유도하였고 이는 pFX535에 의해 암호화된 인자 X 변이체가 사용되는 경우에 수득된 응고 시간 보다 훨씬 단축되었다 (표 2).

이와 함께 이것은 인자 X 변이체가 지혈성 우회 제제로서 기능적으로 활성이고 이들 인자 X 변이체가 인자 VIII에 대한 억제제를 함유하는 A형 혈우병 환자 혈장에서 응고 활성을 보여주는 것으로 나타났다. 놀랍게도, pFX915 및 pFX1066에 의해 암호화된 인자 X 변이체는 동일한 인자 X 응고 관련 사항으로 조정되는 경우 pFX535에 의해 암호화된 인자 X 변이체와 비교되는 바와 같이 인자 VIII- 및 인자 IX 고갈된 혈장에서 보다 강한 응고 활성을 나타내었다.

실시예 5: 모노클로날 항체 친화성 크로마토그래피에 의한 재조합 인자 X 변이체의 정제

재조합 인자 X 변이체는 하기의 프로토콜에 따라 정제하였다. 인자 X에 특이적인 모노클로날 항체 FX-13 (ZLB Behring)은 CNBr-활성화된 세파로스와 커플링시켰다. 수득한 친화성 수지는 Pharmacia XK 16 크로마토그래피 칼럼으로 흡수시켜 직경 1.6cm, 높이 1.8cm의 친화성 매트릭스를 형성하고 3.6ml의 겔을 수득한다. 친화성 매트릭스는 2.5M NaCl, 10mM의 인산수소이나트륨중에 저장시켰다. 사용 전에, 겔은 pH 7.0-HCl에서 10 겔 용적의 20mM의 삼나트륨 시트레이트로 평형화시켰다.

100mIU/ml 이상의 인자 X-항원을 함유하는 세포 배양 상등액은 밤새 4 내지 8℃에서 2 내지 4ℓ의 평형 완충액에서 VISKING 튜빙 형 32/36을 사용하여 투석하였다.

1ml/분의 유속으로 70ml의 투석된 상등액과 함께 친화성 겔을 로딩하였다. 겔은 10배 용적의 평형 완충액으로 세척하고 이어서 0.1M 글라이신, pH 2.5-HCl에 의해 용출시켰다. 용출된 물질은 NaOH로 중화시키고 1.0M NaCl 및 0.1mg/ml 나트륨 카프릴레이트로 안정화시켰다.

인자 X 변이체의 세포 배양 상등액 기원의 샘플, 분획을 통한 통류물 및 용출된 물질로부터의 샘플은 SDS-PAGE로 분석하고 이어서 은 염색하였다. 58kDa 의 단백질 밴드는 상기된 방법으로 정제하였다. 58kDa 밴드는 항-인자 X 항체에 의해 탐침된 웨스턴 블롯에 의한 인자 X 변이체로서 동정되었다.

<110> CSL Behring GmbH <120> Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties <130> 2006.M002-A113-EP <150> EP 06003475.8 <151> 2006-02-21 <150> US 60/780,066 <151> 2006-03-08 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1467 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggggcgcc cactgcacct cgtcctgctc agtgcctccc tggctggcct cctgctgctc 60 ggggaaagtc tgttcatccg cagggagcag gccaacaaca tcctggcgag ggtcacgagg 120 gccaattcct ttcttgaaga gatgaagaaa ggacacctcg aaagagagtg catggaagag 180 acctgctcat acgaagaggc ccgcgaggtc tttgaggaca gcgacaagac gaatgaattc 240 tggaataaat acaaagatgg cgaccagtgt gagaccagtc cttgccagaa ccagggcaaa 300 tgtaaagacg gcctcgggga atacacctgc acctgtttag aaggattcga aggcaaaaac 360 tgtgaattat tcacacggaa gctctgcagc ctggacaacg gggactgtga ccagttctgc 420 cacgaggaac agaactctgt ggtgtgctcc tgcgcccgcg ggtacaccct ggctgacaac 480 ggcaaggcct gcattcccac agggccctac ccctgtggga aacagaccct ggaacgcagg 540 aagaggtcag tggcccaggc caccagcagc agcggggagg cccctgacag catcacatgg 600 aagccatatg atgcagccga cctggacccc accgagaacc ccttcgacct gcttgacttc 660 aaccagacgc agcctgagag gggcgacaac aacctcacca ggatcgtggg aggccaggaa 720 tgcaaggacg gggagtgtcc ctggcaggcc ctgctcatca atgaggaaaa cgagggtttc 780 tgtggtggaa ccattctgag cgagttctac atcctaacgg cagcccactg tctctaccaa 840 gccaagagat tcaaggtgag ggtaggggac cggaacacgg agcaggagga gggcggtgag 900 gcggtgcacg aggtggaggt ggtcatcaag cacaaccggt tcacaaagga gacctatgac 960 ttcgacatcg ccgtgctccg gctcaagacc cccatcacct tccgcatgaa cgtggcgcct 1020 gcctgcctcc ccgagcgtga ctgggccgag tccacgctga tgacgcagaa gacggggatt 1080 gtgagcggct tcgggcgcac ccacgagaag ggccggcagt ccaccaggct caagatgctg 1140 gaggtgccct acgtggaccg caacagctgc aagctgtcca gcagcttcat catcacccag 1200 aacatgttct gtgccggcta cgacaccaag caggaggatg cctgccaggg ggacagcggg 1260 ggcccgcacg tcacccgctt caaggacacc tacttcgtga caggcatcgt cagctgggga 1320 gagggctgtg cccgtaaggg gaagtacggg atctacacca aggtcaccgc cttcctcaag 1380 tggatcgaca ggtccatgaa aaccaggggc ttgcccaagg ccaagagcca tgccccggag 1440 gtcataacgt cctctccatt 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Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu 195 200 205 Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln 210 215 220 Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu 225 230 235 240 Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu 245 250 255 Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu 260 265 270 Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val 275 280 285 Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu 290 295 300 Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp 305 310 315 320 Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met 325 330 335 Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr 340 345 350 Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His 355 360 365 Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr 370 375 380 Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln 385 390 395 400 Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln 405 410 415 Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe 420 425 430 Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys 435 440 445 Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg 450 455 460 Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu 465 470 475 480 Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 485 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg 1 5 <210> 4 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Val Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly Glu Ala Pro Asp Ser Ile 1 5 10 15 Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu Asp Pro Thr Glu Asn Pro 20 25 30 Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln Pro Glu Arg Gly Asp Asn 35 40 45 Asn Leu Thr Arg 50 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala 1 5 10 15 Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp 20 25 30 Phe Thr Arg 35 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ser Thr Ala Val Val Ile Ala Gly Arg Ser 1 5 10 15 <210> 8 <211> 445 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PROPEP <222> (1)..(40) <220> <221> MUTAGEN <222> (39)..(39) <223> T39R <400> 8 Met Gly Arg Pro Leu His Leu Val Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gln Ala Asn 20 25 30 Asn Ile Leu Ala Arg Val Arg Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met 35 40 45 Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr 50 55 60 Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe 65 70 75 80 Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln 85 90 95 Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys 100 105 110 Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu 115 120 125 Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln 130 135 140 Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn 145 150 155 160 Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr 165 170 175 Leu Glu Arg Arg Lys Arg Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Ile 180 185 190 Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu 195 200 205 Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser 210 215 220 Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg 225 230 235 240 Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly 245 250 255 Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr 260 265 270 Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro 275 280 285 Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp 290 295 300 Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly 305 310 315 320 Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met 325 330 335 Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser 340 345 350 Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln 355 360 365 Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe 370 375 380 Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys 385 390 395 400 Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu 405 410 415 Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys 420 425 430 Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 435 440 445 <210> 9 <211> 445 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PROPEP <222> (1)..(40) <220> <221> MUTAGEN <222> (39)..(39) <223> T39R <400> 9 Met Gly Arg Pro Leu His Leu Val Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gln Ala Asn 20 25 30 Asn Ile Leu Ala Arg Val Arg Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met 35 40 45 Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr 50 55 60 Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe 65 70 75 80 Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln 85 90 95 Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys 100 105 110 Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu 115 120 125 Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln 130 135 140 Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn 145 150 155 160 Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr 165 170 175 Leu Glu Arg Arg Lys Arg Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val 180 185 190 Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu 195 200 205 Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser 210 215 220 Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg 225 230 235 240 Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly 245 250 255 Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr 260 265 270 Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro 275 280 285 Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp 290 295 300 Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly 305 310 315 320 Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met 325 330 335 Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser 340 345 350 Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln 355 360 365 Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe 370 375 380 Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys 385 390 395 400 Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu 405 410 415 Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys 420 425 430 Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 435 440 445 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg 1 5 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We1292 <400> 11 cagggacaca gtactcggcc 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We1293 <400> 12 gagtgggatc tcactttaat gg 22 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We1354 <400> 13 gcggctagca tggggcgccc actgcacc 28 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We1355 <400> 14 gcggcggccg ctcactttaa tggagaggac gttatg 36 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We1482 <400> 15 cctggcgagg gtcaggaggg ccaattc 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We1483 <400> 16 gaattggccc tcctgaccct cgccagg 27 <210> 17 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We1444 <400> 17 cagacgcagc ctacccaatc atttaatgac ttcactcgga tcgtgggagg 50 <210> 18 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We1445 <400> 18 cctcccacga tccgagtgaa gtcattaaat gattgggtag gctgcgtctg 50 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We1567 <400> 19 ggcgacaaca acgacgacag gatcgtgg 28 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We1568 <400> 20 ccacgatcct gtcgtcgttg ttgtcgcc 28 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We1976 <400> 21 gcaggaagag gacccaatca tttaatgact tc 32 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We1977 <400> 22 gaagtcatta aatgattggg tcctcttcct gc 32 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We2357 <400> 23 cgacttcacc cgcgtcgtgg gaggc 25 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We2358 <400> 24 gcctcccacg acgcgggtga agtcg 25

Claims

야생형 인자 X의 Arg179 내지 Arg234의 아미노산 서열내에 존재하지 않는 프로테아제 프로세싱 부위를 활성화 펩타이드내에 생성시키는 변형을 갖고, 이때 Arg179 및 Ile235에 상응하는 잔기 사이의 아미노산 수가 야생형 인자 X에 비해 1개 내지 52개 아미노산까지 감소된, 생물학적 활성 인자 X 변이체.
야생형 인자 X의 Arg179 내지 Arg234의 아미노산 서열내에 존재하지 않는 프로테아제 프로세싱 부위를 활성화 펩타이드내에 생성시키는 변형을 갖고, 이때 변형된 활성화 펩타이드가 야생형 인자 X의 활성화 펩타이드 보다 단축된, 생물학적 활성 인자 X 변이체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 프로테아제 프로세싱 부위를 절단할 수 있는 프로테아제에 의한 당해 프로테아제 프로세싱 부위의 절단이 인자 X 변이체를 활성화시키는 인자 X 변이체.
제3항에 있어서, 프로테아제가 야생형 인자 X를 천연적으로 절단하지 못하는 인자 X 변이체.
제3항 또는 제4항에 있어서, 프로테아제가 야생형 인자 X를 천연적으로 활성 화시키지 못하는 인자 X 변이체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 프로세싱 부위가 세린 프로테아제에 의한 인자 X 변이체의 활성화를 허용하는 인자 X 변이체.
제6항에 있어서, 프로테아제 프로세싱 부위가 인자 Ila, 인자 IXa, 인자 Xa, 인자 Xla, 인자 Xlla, 활성화된 단백질 C, 엘라스타제 또는 칼리크레인에 의한 인자 X 변이체의 활성화를 허용하는 인자 X 변이체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 활성화 펩타이드가 4개 내지 15개의 아미노산으로 이루어진 인자 X 변이체.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 226번 내지 234번이 서열번호 3으로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열로 대체된 인자 X 아미노산 서열을 포함하고 활성화 펩타이드의 길이가 52개의 아미노산인 비교용 인자 X 변이체에 비해 증진된 지혈성 우회 활성을 갖는 인자 X 변이체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 번호매김을 기준으로 서열 Glu226-Gln227-Ser228-Phe229-Asn230-Asp231-Phe232-Thr233-Arg234을 포함하는 비교용 인자 X 변이체에 비해 증진된 지혈성 우회 활성을 갖는 인자 X 변이체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약제 재료로서 사용하기 위한 인자 X 변이체.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 인자 X 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
제12항에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 또는 벡터.
제13항에 있어서, 발현 벡터인 플라스미드 또는 벡터.
제13항에 있어서, 사람 유전자 치료에 사용하기 위한 전달 벡터인 플라스미드 또는 벡터.
제12항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제16항에 따른 숙주 세포를 인자 X 변이체가 발현되도록 하는 조건하에서 배양하는 단계 및 임의로, 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 인자 X 변이체를 회수하 는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 인자 X 변이체를 제조하는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 인자 X 변이체, 제12항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
혈액 응고 장애의 치료 또는 예방용 약물을 제조하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 인자 X 변이체, 제12항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터 또는 제17항에 따른 숙주 세포의 용도.
제19항에 있어서, 혈액 응고 장애가 A형 혈우병인 용도.
제20항에 있어서, A형 혈우병이 FVIII에 대한 자가 항체에 의해 발병되거나 악화되는 용도.
제20항에 있어서, 혈액 응고 장애가 B형 혈우병인 용도.
제22항에 있어서, B형 혈우병이 FIX에 대한 자가항체에 의해 유발되거나 악 화되는 용도.
제19항에 있어서, 혈액 응고 장애가 FVII 및/또는 FVIIa 결핍인 용도.
제24항에 있어서, FVII 및/또는 FVlla 결핍이 FVII 및/또는 FVIIa에 대한 자가 항체에 의해 유발되거나 악화되는 용도.
제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 사람 유전자 치료를 포함하는 용도.
응고 촉진 성질을 갖는 약물을 제조하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 인자 X 변이체, 제12항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터 또는 제16항에 따른 숙주 세포의 용도.