KR20080101344A - 탄닌 함유 해동피 추출물을 유효성분으로 하는 소염 진통제조성물 - Google Patents
탄닌 함유 해동피 추출물을 유효성분으로 하는 소염 진통제조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 활성물질로서 10.0 ~ 25.0중량%의 탄닌(Tannin)을 함유하는 해동피(Kalopanacis Cortex) 추출물의 제조방법 및 이를 유효성분으로 하는 소염 진통제 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 알코올 수용액을 추출용매로 여과 및 감압농축 등의 방법을 이용하여 일정 함량의 탄닌이 함유되도록 제조된 해동피 추출물을 유효성분으로 하는 소염 진통제 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 일정 함량의 탄닌을 함유하는 해동피 추출물은 천연물 유래의 물질로서 독성 및 부작용이 없으며, 염증매개전구물질 NF-κB 인산화 억제작용, 염증매개물질인 NO와 TNF-α 생산 억제작용, 소염 진통작용, 급성부종 억제작용, 급성관절염 억제작용 등의 탁월한 항염증 효과를 가지므로, 이를 함유하는 조성물은 관절염, 부종, 통증 등과 같은 염증성 질환의 치료 및 예방에 효과적이고 안전한 의약품으로 유용하게 이용될 수 있다.
해동피 추출물, 탄닌(Tannin), NF-κB, NO, TNF-α, 소염작용, 진통작용, 관절염
Description
도 1은 본 발명에 따른 탄닌 함유 해동피 추출물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물의 유도성 질소산화물 합성효소(iNOS)의 농도 의존성 생성 억제 효과를 나타낸 것이다 (a: 면역블럿팅 결과, b: a 데이터의 광농도 측정 분석결과).
도 3은 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물의 질소산화물(nitric oxide; NO)의 농도 의존성 생성 억제효과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물의 종양괴사인자-알파(TNF-α)의 유전자 mRNA 발현억제에 대한 농도 의존성 효과를 나타낸 것이다 (a: 역전사-역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)의 결과, b: a 데이터의 광농도 측정 분석 결과).
도 5는 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물의 TNF-α의 생성 억제에 대한 농도 의존성 효과를 나타낸 것이다 (a: 면역 블럿팅의 결과, b: a 데이터의 광농도 측정 분석 결과).
도 6은 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물의 NF-κB 인산화 억제에 대한 농도 의존성 효과를 나타낸 것이다 (a: 면역 블럿팅의 결과, b: a 데이터의 광농도 측정 분석 결과).
도 7은 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물이 실험동물의 비장세포에 미치는 독성을 농도에 따른 생존율 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물이 실험동물의 간 조직에 미치는 독성(GOT, GPT)을 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물이 실험동물의 신장 조직에 미치는 독성(CRE, BUN)을 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물이 미성숙 실험동물의 성장에 미치는 영향을 체중 변화로 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물이 성숙 실험동물의 성장에 미치는 영향을 체중 변화로 나타낸 것이다.
본 발명은 활성물질로서 10.0 ~ 25.0중량%의 탄닌(Tannin)을 함유하는 해동피(Kalopanacis Cortex) 추출물의 제조방법 및 이를 유효성분으로 하는 소염 진통제 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 알코올 수용액을 추출용매로 여과 및 감압농축 등의 방법을 이용하여 일정 함량의 탄닌이 함유되도록 제조된 해동피 추출물을 유효성분으로 하는 소염 진통제 조성물에 관한 것이다.
염증이란 외부 세균의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 뜻하며, 염증반응은 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 재생하기 위한 생체 방법 반응과정으로, 조직(세포)의 손상이나 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질 등과 같은 외부감염원에 감염되었을 때 국소 혈관과 체약 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종 발명 통증 등과 같은 외적 증상을 나타낸다.
정상인 경우 염증반응은, 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 질환의 주요 병리현상(과민성 질환, 만성염증)이 되며, 수혈, 약물 투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.
이러한 염증반응에 관여하는 염증성 인자인 질소산화물(nitric oxide; NO)은 NO 합성효소(nitric oxide synthase; NOS)에 의해 L-알지닌(L-arginine)으로부터 중간 대사물인 히드록시알지닌(hydroxyarginie)을 거쳐 NO와 시트룰린(citrulline)이 만들어진다. NO는 생물학적 활성을 지닌 것으로 매우 작은 분자량을 갖고 있으며, 생체 내에서 혈관계에 작용하여 혈관확장, 혈소판 부착 및 응집, 신경전달, 소화기관 운동 등에 관여하는 매개물질이며, 여러 가지 대사 조절 작용 및 생리 작 용(신경전달, 혈액응고, 혈압조절, 암세포에 대한 면역 등)을 담당하는 것으로 밝혀져 있고, 염증세포 뿐만 아니라 비면역세포에서도 생성되어 미생물 감염에 대한 방어 작용을 한다. 일반적으로 NO는 대기 상태에서 가스의 형태로 존재하며, 자유라디칼 구조이기 때문에 매우 유독할뿐더러 반감기가 6 ~ 10초로 매우 불안정하여, 안정화된 최종 산물인 NO3(nitrate)와 NO2(nitrite)로 신속히 변화되는 것으로 알려져 있다(Snyder, S. H. et al., Scientific American, May, pp28-35, 1992).
한편, NO 생성에 관여하는 NOS는 칼슘 (Ca2+)이나 칼모듈린 (camodulin) 의존성 여부에 따라 크게 2가지 즉, cNOS (constitutive NOS)와 iNOS (inducible NOS)로 분류되는데, cNOS는 칼슘이나 칼모듈린 의존성이고 주로 뇌, 상피세포, 호중구, 위장 점막 세포에 존재하며, iNOS는 칼슘이나 칼모듈린 비의존성으로 iNOS는 대식세포, 간세포, 암세포 등에 존재하며, IL-1β (interlukin-1β), IFN-γ (interferon-γ), TNF-α(tumor necrosis factor-α) 등과 같은 사이토카인류 (cytokines)와 내독소인 세균성 LPS (lipopolysaccharide) 등에 의해 유도된다 (Dinerman, J. L., et al., Circ. Res., 73, pp217-222, 1993). 이러한 자극에 의하여 COX-2(cyclooxygenase-2)도 함께 활성화되어 염증매개물질인 PGs(prostaglandines)가 생성되기 때문에 iNOS 발현과 COX-2의 발현은 매우 밀접한 관련이 있으며, 생성된 NO는 COX-2 발현에 영향을 주기도 한다 (Robert C., et al ., J. Immunol. 165, pp1582-1587, 2000; Daniela S., et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, pp7240-7244, 1993).
따라서, iNOS에 의한 NO의 생성을 억제하는 물질을 확보하고 이를 의약품으로 개발하려는 노력이 다양하게 진행되고 있다.
이러한 염증반응에 의해 발생하는 염증성 질환에는 동맥경화 외에 위염, 대장염, 관절염, 신장염, 간염, 암 또는 퇴행성 질환 (Gobert A. P. et al., J. Immunol. 168(12), pp6002-6006, 2002; Dijkstra G. et al., Scand. J. Gastroenterol. 37(5), pp546-554, 2002; Sakac V. and Sakac M. Med. Pregl. 53, pp463-474, 2000; Albrecht E. W. et al., Am. J. Transplant, 29(5), 448-453, 2002; Ramachandran A. et al., Free Radical Biol. Med. 33(11), pp1465-1474, 2002; Sartor L. et al., Biochemical Pharmacol. 64, pp229-237, 2002; Sadowska-Krowicka H. et al., Proc. Soc. Exp. biol. Med. 217(3), pp351-357, 1998; Lo A-H. et al., Carcinogenesis, 23(6), pp983-991, 2002) 등이 포함된다.
상기와 같은 염증억제 효과검사는 세포적인 측면에서는 염증매개물질인 질소산화물(Nitric oxide; NO), 종양괴사인자-알파(TNF-α), IL-1β 등의 생산을 억제하는 지를 확인하고, 동물실험 측면에서는 모세혈관 투과도 억제효과와 귀부종 및 족부종 억제효과 등을 검사하는 것이다. 그리고 진통효과 검사를 위한 동물실험에서는 일반적으로 아세트산 유도 스트레칭 억제 테스트를 이용해 진통효과를 검사한다(이은 등, 생약학회지, 26(2):122-129, 1995년; Choi J et al., J Ethnopharmacol. 79(2): 199-204, 2002년 2월; Kim YK et al., Arch Pharm Res. 26(12):1061-1066, 2003년 12월; Kim IT et al., J Ethnopharmacol. 94(1):165-173, 2004년 9월; 이지은 등, 대한치주과학회지, 35(1):9-17, 2005년; Lao CJ et al., Am J Chin Med. 33(3):425-438, 2005년; Lee YC et al., Int Immunopharmacol. 6(4):703-713, 2006년 4월).
해동피(海桐皮)는, 엄나무(학명: Kalopanax pictus Nakai)의 껍질로서 생약명은 KALOPANACIS CORTEX이다. 엄나무는 낙엽교목으로 키가 25 m까지 자라며, 가지에는 가시가 있다. 잎은 오갈피나무과의 공통된 특징인 손바닥 모양을 하고 있으며, 보통 5~9 갈래로 갈라져 있다. 과실은 핵과로 되어 있고, 구형인데 10월에 흑색으로 익으며, 그 안에 1~2개의 종자가 들어있다. 맛은 쓰고, 평(平)하며, 한국 전역, 일본, 중국 만주 우수리, 사할린 등 깊은 산의 숲 속에서 잘 자란다.
약효 또는 용도로는 거풍(祛風), 제습(除濕), 활혈(活血), 살충(殺蟲)에 효과가 있다고 전해져 오고 있다.
해동피는 예로부터 동의보감, 향약집성방 및 광제비급 등의 기성 한약서나 관련 문헌에서 단방 생약으로서 처방하고 있으나, 이러한 처방은 해동피의 외형상의 형태감별 방법 및 한방의학적 약효와 탕액의 제조방법에 관한 간단한 언급에 불과하며, 해동피 성분 중 약효를 발현하는 유효활성 성분들에 대한 기술된 바는 없다.
한편, 최근 국내에서는 메탄올로 추출한 해동피 추출물 Liriodendrin의 부종 억제 효과와 진통효과에 대해 개시된 바가 있으며(이은 등, 생약학회지, 26(2):122-129, 1995년), 해동피 에탄올 추출물의 항염작용과 진통작용이 발표되었다(Kim IT et al., J Ethnopharmacol. 94(1):165-173, 2004년 9월).
또한, 한국특허 등록 제10-0547554호에서는 항염증 활성을 갖는 해동피, 갈화, 옻나무 추출물을 함유하는 조성물에 관해 개시하고 있고, 한국특허 등록 제10-0547560호에서는 항염증 활성을 갖는 해동피, 갈화, 옻나무 추출물을 함유하는 약학조성물에 관해 개시하고 있으며, 한국특허 출원 제10-2001-0011226호(등록포기)에서는 엄나무 추출물, 이의 제조방법 및 용도에 대해 개시하고 있고, 한국특허 제10-0555660호에서는 해동피의 에틸아세테이트 가용 추출물로부터 분리된 칼로파낙스 사포닌 에이 유도체를 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물에 관해 개시하고 있다.
또한, 해동피 추출물이 말라리아에 독성효과가 있는 것이 알려져 있으며(Park H et al., Biol Pharm Bull. 26(11):1623-1624, 2003년 11월), 해동피 성분 중 해동피 사포닌의 항염증 효과에 대해서도 발표되었다(Li DW, Biol Pharm Bull. 26(4):429-433, 2003년 4월).
특히, 특정질병효과에 있어서는 해동피 메탄올 추출물이 관절염 완화 효과가 있음이 발표된 바 있다(Choi J et al., J Ethnopharmacol.79(2):199-204, 2002년 2월).
그러나, 현재까지 공지된 내용에 따르면 해동피 사포닌을 제외하고는 해동피의 어떠한 성분에 의해 염증에 관련된 매개물질 및 세포들이 억제되는지에 대해서는 개시된 바 없다.
이에 본 발명자들은 해동피 추출물 중 사포닌을 제외한 현저한 항염증 효과를 갖는 특정 활성성분 및 이의 함량에 따른 해동피 추출물의 항염증 효과를 규명하기 위하여 예의 노력한 결과, 활성물질로서 탄닌(Tannin)이 10.0 ~ 25.0중량% 함유된 해동피 추출물이 우수한 항염증 효과를 가짐을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 활성물질로 10.0 ~ 25.0중량%의 탄닌을 함유하는 해동피 추출물을 유효성분으로 하는 소염 진통제 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 우수한 항염증 효과를 갖는 활성물질로 10.0 ~ 25.0중량%의 탄닌을 함유하는 해동피 추출물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 활성물질로 5.0 ~ 30.0중량%의 탄닌(Tannin)을 함유하는 해동피(Kalopanacis Cortex) 추출물을 유효성분으로 하는 소염 진통제 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 탄닌은 10.0 ~ 25.0중량%인 것을 특징으로 할 수 있으며, 염증 및 염증반응에 의해 발생하는 관절염, 중이염, 통증, 부종 또는 퇴행성 질환에 대해 탁원할 소염진통 효과를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 해동피를 5 ~ 8배량의 물, 알코올 또는 알코올 수용액으로 추출, 냉각 및 여과하여 여액을 수득하는 단계; b) 상기 여액을 알코올 수용액으로 층분리한 다음, 60 ~ 80℃로 감압 농축하여 농축물을 수득하는 단계; 및 c) 상기 농축물에 알코올을 가한 후 500 ~ 1,000 rpm으로 원심분리한 다음 여액을 감압농축, 진공건조, 분쇄 및 멸균하여 해동피 추출물을 수득하는 단계;를 포함하는 탄닌을 함유하는 해동피 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 탄닌은 10.0 ~ 25.0중량%인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 해동피 추출물은 분말인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등과 같은 탄소수 1 ~ 6의 저급 알코올인 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 일정 함량의 탄닌(Tannin)을 활성물질로서 함유하는 해동피(Kalopanacis Cortex) 추출물의 제조방법 및 이를 유효성분으로 하는 소염 진통제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 소염 진통제 조성물은 해동피 추출물을 유효성분으로 함유하며, 상기 해동피 추출물은 지표물질 및 활성물질로서 탄닌(Tannin)을 5.0 ~ 30.0중량% 함유하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10.0 ~ 25.0중량% 함유할 수 있다.
이는 원 생약에 함유된 유효 생리 활성물질의 함량이 산지, 채취시기, 보관기간 및 보관상태 등에 따라 크게 달라질 수 있으므로 각 생약조성물의 조성을 한정함에 있어 사용 성분의 중량비의 한정보다는 특정 활성물질의 함량을 한정하는 것이 보다 바람직하다.
따라서, 본 발명에서는 목적하는 항염증 효과의 발현을 극대화하는 해동피 추출물을 얻기 위해 지표물질 및 활성물질로서 탄닌을 선정한 것이다.
본 발명의 염증성 질환의 치료에 사용되는 해동피 추출물은 해동피로부터 추출한 추출물 자체(생약 엑기스) 또는 상기 해동피 추출물로부터 특정 활성물질인 탄닌을 추출하여 선택 사용할 수 있다. 이때의 배합비율은 해동피의 원래 함량과는 관계없이 지표물질이자 활성물질인 탄닌의 함량으로 결정되며, 바람직하게는 해동피 추출물 중 5.0 ~ 30.0중량%의 탄닌을 함유하고, 더욱 바람직하게는 10.0 ~ 25.0중량%의 탄닌을 함유하도록 한다.
본 발명에 있어서, 상기 탄닌의 함량이 10.0중량% 미만인 경우에는 관절염 등의 치료에 상대적으로 저조한 결과를 나타내므로, 탄닌의 함량은 10.0중량% 이상이 함유되도록 하는 것이 좋다. 또한, 본 발명에서는 상기 탄닌 함량의 상한 범위에 대해 특별한 제한은 두지 않으나, 다만 일정수준 이상을 초과하여 함유되면 효과가 더 이상 증가하지 않을 뿐만 아니라 제조하기에도 기술적, 경제적 측면에서 바람직하지 않으므로 30.0중량% 이하고, 더욱 바람직하게는 25.0중량% 정도 함유되도록 하는 것이 좋다.
본 발명에서 상기 지표물질이자 활성물질인 탄닌이 10.0 ~ 25.0중량%로 함유되어 있을 경우, 목적하는 약효의 상승효과를 발현하여 보다 탁월한 해동피 추출물의 항염증 효과를 나타낼 수 있으나, 본 발명에서는 해동피 추출물 중 상기 탄닌 이외의 기타 다른 성분의 작용을 배제할 수는 없다.
본 발명에 따른 현저한 항염증 효과를 갖는 10.0 ~ 25.0중량%의 탄닌을 함유 하는 해동피 추출물의 제조방법은,
a) 해동피를 5 ~ 8 배량의 물, 알코올 또는 알코올 수용액으로 추출, 냉각 및 여과하여 여액을 수득하는 단계;
b) 상기 여액을 알코올 수용액으로 층분리한 다음, 60 ~ 80℃로 감압농축하여 농축물을 수득하는 단계; 및
c) 상기 농축물에 알코올을 가한 후 500 ~ 1,000 rpm으로 원심분리한 다음 여액을 감압농축, 진공건조, 분쇄 및 멸균하여 해동피 추출물을 수득하는 단계;를 포함하여 이루어진다.
상기 제조방법을 더욱 상세히 설명하면, 해동피 원 생약에 물, 알코올 또는 알코올 수용액을 가하고 2 ~ 3 시간, 2 ~ 5회 반복하여 추출한 다음, 상온에서 서서히 냉각시킨 후 원심분리 등의 방법으로 여과하여 잔사와 분리한다. 상기 잔사에 상기 혼합 생약 중량의 5 ~ 8 배량의 물, 알코올, 또는 알코올 수용액을 가하고 가온하여 재추출한 후 여과한 다음, 이전의 여액과 혼합하여 여과한다.
본 발명에서는 상기와 같이 잔사에 물 또는 알코올 수용액을 가하여 재추출 및 여과함으로써 추출 효율을 높일 수 있으며, 이때 추출에 사용되는 물, 알코올 또는 알코올 수용액의 사용량이 5 배량 미만일 경우에는 추출물의 용해도가 나빠져서 추출효율이 떨어지며, 사용량이 8 배량을 초과할 경우에는 층분리에 사용하는 알코올 수용액의 사용량이 증가하고, 감압 농축 시간이 오래 걸리는 등의 경제적이지 못하거나 취급상의 문제가 생길 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 알코올은 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 지방 족, 방향족 알코올이 모두 사용 가능하며, 바람직하게는 지방족 알코올, 보다 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등과 같은 탄소수 1 ~ 6의 저급 알코올을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 1차 추출 후 다시 재추출하는 방법을 채택하였는데, 생약추출물을 대량 생산하는 경우 효과적으로 여과를 한다 하더라도 생약 자체의 수분 함량이 높기 때문에 손실이 발생하게 되어 1차 추출만으로는 추출효율이 떨어지므로 이를 방지하기 위함이다. 또한, 각 단계별 추출효율을 검증한 결과 2차 추출에 의해 전체 추출량의 80 ~ 90% 정도가 추출되는 것으로 밝혀졌고, 3차 이상의 다단계 추출은 경제성이 없는 것으로 여겨진다.
상기와 같이 1, 2차에 걸쳐 물, 알코올 또는 알코올 수용액으로 추출하여 얻은 추출액은 여과 및 농축한 다음, 여액 중에 함유된 불필요한 단백질, 다당류 및 지방산 등의 불순물을 정제하는데, 본 발명에서는 여액과 동량의 알코올 수용액을 용매로 사용량 2 ~ 5회 층분리를 실시하여 용매 분획을 얻음으로써 불순물을 정제할 수 있다.
상기 층분리에 사용되는 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등과 같은 탄소수 1 ~ 6의 저급 알코올이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30% 에탄올 수용액을 사용할 수 있다. 또한, 상기 층분리에 있어서, 저급 알코올 수용액의 사용량이 여액에 비하여 적을 경우에는 지방산 등의 불필요한 성분들에 의한 미립자가 형성되어 층 분리가 원활하지 못할 뿐만 아니라 유효활성물질의 추출 함량이 낮아지게 되므로 효율적이지 못하다.
상기 층분리한 추출액은 60 ~ 80℃에서 감압 농축하여 잔존하는 용매를 제거하며, 이렇게 얻어진 농축물에 상기 감압 농축 시 회수된 알코올을 가한 후 500 ~ 1,000 rpm으로 원심분리한 여액을 가하여 농축물을 혼탁시킨 다음 재차 감압 농축시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 감압 농축 온도가 60℃ 미만일 경우에는 용매를 100% 제거하기 어렵고, 80℃를 초과하는 경우에는 농축물의 안정성에 문제점이 발생할 수 있으며, 상기 rpm이 500 미만일 경우에는 농축물과 알코올의 분리가 어려우며, 1,000 이상일 경우에는 농축물의 안정성에 문제점이 발생할 수 있다.
상기 농축물을 60 ~ 80℃에서 0.08 ~ 0.3 pa로 진공건조 시킨 후 30 ~ 80 메쉬로 분쇄 및 멸균하여, 활성물질로 10.0 ~ 25.0중량%의 탄닌을 함유하는 분말상의 해동피 추출물을 수득할 수 있다.
상기와 같이 수득된 일정 함량의 탄닌을 함유하는 해동피 추출물에 대해 내독소인 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide; 이하 "LPS"라고 약칭함)의 잔류량으로 오염 유무를 검사한 결과, 리포폴리사카라이드의 잔류량은 17 엔도톡신 유닛 (endotoxin units; EU)/㎖ 인 것으로 조사되었다. 이는 유럽 국가에 있어서의 상기 실험 시약에 대한 LPS 잔류량의 기준 허용 범위인 350 EU/㎖ 와 비교해 볼 때 (Scheer, Arzenimittelforschung, 43(7): 975 ~ 800, 1993년 7월), 내독소 LPS 잔류량이 잔유량 허용범위의 1/20 이하인 것으로 확인되었다.
본 발명은 일차 면역반응 세포이면서 대표적인 염증반응 세포인 대식세포를 사용하여 해동피 추출물의 염증 억제효과를 조사하였으며, ICR 마우스, 수컷 SD계 레트, Balb/c 마우스 (한국, 대전 화학연구소 제공)를 사용하여 탄닌 함유 해동피 추출물의 부종 억제검사 및 통각 억제검사, 관절염 치료 효과검사 및 비장세포, 간, 신장 및 성장에 미치는 독성을 검사하였다.
그 결과, 본 발명의 해동피 추출물이 염증매개물질인 NO와 TNF-α의 생성을 현저히 억제하고, 염증매개전구물질인 NF-κB 인산화 억제작용, 소염 진통작용, 급성부종 억제작용, 급성관절염 억제작용 등의 탁월한 항염증 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 해동피 추출물은 비장세포, 간 및 신장 모두에서 유해한 독성을 나타내지 않았으며, 미성숙 쥐와 성숙 쥐 모두에서도 신체발육에 유해한 독성을 미치지 않음을 확인할 수 있었다.
그러므로, 본 발명의 해동피 추출물은 탁월한 항염증 효과를 가지면서도 독성이 없는 안전한 물질임을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 활성물질로 10.0 ~ 25.0중량%의 탄닌을 함유하는 해동피 추출물은 염증성 질환의 치료 및 예방을 위한 의약품, 건강보조식품 등에 유용하게 이용될 수 있으며, 이에 의해 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물이 의약품으로 이용될 경우에는 생약 추출물 그 자체만으로 포함할 수 있지만, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 제형, 예를 들면, 분말, 정제, 과립, 캅셀 또는 주사제 등의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 담체 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드, 파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물류가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체 및 부형제는 모두 사용 가능하다. 또한 항산화 조성물을 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 해동피 추출물을 통상적인 방법에 의해 정제로 제형화할 경우, 기제로 사용되는 락토오스, 미세결정 셀룰로오스, 스테아린산 마그네슘 등을 합한 것과 상기 해동피 추출물을 1 : 1의 비율로 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 해동피 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없으며, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 해동피 추출물은 체중 1 ㎏당 1일 0.001 ~ 50 ㎎으로, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 ㎎으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 해동피 추출물은 쥐, 생쥐, 가축 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 실시 예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 탄닌 함유 해동피 추출물의 제조
물로 세척하고 잘 건조시킨 해동피 (Actinidia polygama) 를 30% 에탄올 수용액에 가한 후 교반하여 주면서 2시간 단위로 2회 열탕추출하였다. 상기 열탕 추출물을 상온으로 서서히 냉각시킨 다음 원심여과하여 잔사를 제거하고 여액을 병합하여 60 ~ 80℃에서 감압 농축 하였다. 상기 에탄올 분획을 통하여 회수된 에탄올을 상기 농축물에 가하여 현탁시킨 후 1,000 rpm으로 원심여과하고 감압농축 한 다음, 60℃, 0.08 pa 조건으로 진공건조 시킨 후 80 메쉬로 분쇄 및 멸균하여 해동피 추출물을 수득하였다.
상기한 방법으로 추출, 정제한 해동피 추출물 중 탄닌(Tannin)의 함량은 10.0 ~ 25.0중량% 이었다. 또한, 상기한 방법으로 얻어진 탄닌 함유 해동피 추출물을 다음과 같은 조건으로 HPLC 분석하였으며 그 결과를 도 1에 나타내었다 (도 1 참조).
1) 전개용매(Eluent) : 메탄올 50%
2) 컬럼 : C-18 COSMOSIL PACKED, 10 ㎛, 4.6 * 250 ㎜
3) 유속 : 0.8 ㎖/분
4) 컬럼온도 : 20℃
5) 검출기 : UV 280 ㎚
실험예 1: 대식세포로부터 염증 매개물질인 iNOS 생산에 있어 탄닌 함유 해동피 추출물의 억제 효과 검사
본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물이 염증매개물질인 NO의 전구물질인 iNOS의 생산을 어느 정도 억제하는 지를 조사하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.
1-1. 마우스 복강으로부터 대식세포의 분리
마우스의 복강으로부터 대식세포를 추출하기 위하여 사육된 6 ~ 10 주령의 Balb/c 마우스에 2 개월 이상 배양된 티오글리콜레이트 배지 (thioglycollate medium; 미국 Gibco사 제품)을 투여한 다음, 투여 4 일 후 마우스를 경추 탈골시켜 희생시켰다. 희생시킨 마우스의 복강에 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 불완전 RPMI-1640 배지 (미국 Gibco사 제품)를 주입하여 복강 내에 있던 대식세포를 추출하고 원심분리한 후, 6웰 플레이트에 3 × 106 세포/웰 농도로 분주하였다. 이것을 약 1 시간가량 CO2 항온기에서 배양한 후, 플레이트에 부착하지 않은 세 포와 다른 부유물들을 불완전 RPMI-1640 배지를 사용하여 2 회 세척한 다음 1.5 ㎖/웰 양의 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신과 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum)이 첨가된 완전 RPMI-1640 배지를 주입하고 3 일간 CO2 항온기 (100% 습도, 37℃, 5% CO2)에서 배양하였다.
대식세포의 순수도 측정은 부착된 세포들을 분리한 후, 사이토스핀-Ⅲ(Cytospin-Ⅲ, 500 rpm, 5분)을 이용해 슬라이드 글라스 (slide glass)에 부착시켜 라이트 김자 (Wright and Giemsa) 염색법으로 염색하여 측정하였으며, 이 때 순수도는 95% 이상 이었다 (data not shown).
1-2. 탄닌 함유 해동피 추출물로 대식세포를 전처리한 후 염증유발물질 LPS로 자극
상기 1-1의 마우스 대식세포 분리과정에서 얻은 대식세포를 6 웰 플레이트 (미국 Falcon사 제품)에 3 × 106 세포/웰로 도말하고 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신과 10% 우태아 혈청이 첨가된 완전 RPMI-1640 배지 (미국 Gibco사 제품)를 사용해 3일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양 배지를 제거하고 새로운 불완전 RPMI-1640 배지 조건하에서 대식세포들을 탄닌 함유 해동피 추출물을 농도별로 2시간 동안 자극시켰다. 그리고 난 후 염증 유도물질인 리포폴리사카라이드 (10 ㎍/㎖; 미국 Sigma사 제품)로 대식세포를 6시간 동안 더 자극시켰다.
자극을 위한 배양이 모두 끝난 즉시 세포를 차가운 PBS 완충용액으로 3 회 세척한 후 각종 프로테아제 억제제 (protease inhibitor)가 함유된 용출 완충용액 (lysis buffer)을 사용해 세포를 용해시켰다. 세포 용해 후 용해 시료를 다음과 같이 면역 블럿팅 기법을 사용하여 세포 내에 존재하는 iNOS 량을 조사하였다.
1-3. 면역 블럿팅기법을 이용하여 탄닌을 함유하는 해동피 추출물에 의한 iNOS 생산 억제효과 분석
0.1% SDS 폴리아크릴아미드 전기영동 상의 분리 겔과 상단 겔은 각각 16% 및 3%를 사용하였고, 전기영동 시 전류는 55 mA (Powersupply; 스웨덴 Pharmacia사 제품), 온도는 쿨링 시스템 (cooling system; 스웨덴 LKB사 제품)을 사용하여 4℃를 유지하면서 약 4 ~ 5 시간 동안 런닝 (running)하였다. 여기에 사용된 전기영동 시스템은 Hoefer SE 600 (미국 Hoefer-Pharmacia사 제품)이었으며, 각각의 시료는 동일한 총 단백질 량을 겔에 로딩 (loading)하여 전기 영동하였다.
상기 전기영동이 끝난 겔은 트랜스퍼 완충용액 (transfer buffer; 39 mM 글리신, 2.9 g, 48 mM 트리스-염기, 5.8 g, 0.037% SDS, 20% 메탄올; pH 8.3)에 미리 적신 니트로셀룰로스 멤브레인 (nitrocellulose membrane, NC)을 올려놓은 후 파이버 패드 (fiber pad)에 넣고 조립하였다. 그리고 나서 면역블럿팅 트랜스퍼 카세트 (immunoblotting transfer cassette)를 NC 멤브레인이 양극 (positive charge) 방향으로, 겔이 음극 (음성 charge) 방향으로 오도록 맞추어 트랜스퍼 쳄버에 넣어 두었다. 전류는 1 A로 공급하고, 온도는 쿨링 시스템을 사용하여 4℃를 유지하면서 1 시간 30 분간 트랜스퍼시켰다. 상기 NC 페이퍼는 블로킹 완충용액 (blocking buffer; 5% 비지방 분유(nonfat dry milk))을 녹인 TBS-T 완충용액 (20 mM 트리스-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈-20) 약 200 ㎖에 1시간 동안 Red-Rocker (미국 Hoefer사 제품)로 로킹하여 항체 (antibody)의 비특이적 결합(non-specific binding)을 블로킹한 다음, 다시 TBS-T 완충용액으로 15 분간 1 회, 10 분간 2 회 세척하였다. 그 후, 3 ㎖ TBS-T 완충용액을 실리콘 용기 (siliconized bottle)에 분주하고 여기에 토끼 항-생쥐 iNOS 다클론 일차 항체 (rabbit anti-murine iNOS polyclonal primary antibody; 500 ㎍/1.5 ㎖ 농도로 PBS 완충용액에 녹임) 30 ㎕ (1 : 300 희석)를 첨가한 후, NC 페이퍼를 실리콘 용기에 넣어 4℃ 하이브리디제이션 항온기 (hybridization incubator; 미국 Robbins사 제품)에서 10 rpm 으로 12 시간 동안 반응시켰다. 배양 후, 70 ㎖ TBS-T 완충용액으로 20 분간 각각 3 번 하이브리디제이션 항온기 (hybridization incubator)에서 12 rpm 속도로 세척한 후, 이차 항체(secondary antibody), 즉 염소 항-토끼 IgG 호스래디쉬 퍼옥시다제 결합을 이용하여 친화 분리된 항체 (goat anti-rabbit IgG horseradish peroxidase conjugated affinity purified antibody; PBS 완충용액에 0.02 ㎎/4㎖ 농도로 녹인 스톡 용액)를 3 ㎖ TBS-T 완충용액에 30 ㎕ (1 : 20,000 희석)을 첨가하여 4℃, 하이브리디제이션 항온기에서 3 시간 동안 배양하였고, 70 ㎖ TBS-T 완충용액으로 20 분간 각각 4 번 씻어내었다. 씻은 후, NC 페이퍼를 얇고 투명한 비닐에 넣고 ECL (peroxidase substrate) 반응액 1 및 2 를 50%씩 혼합한 3 ㎖ 을 NC 페이퍼에 분주한 다음 5 분간 배양하였다. 그 후, 암실 (10 W safety lamp; 미국 Kodak사 제품)에서 NC 가 들어있는 카세트에 X-ray 필름을 넣고 5 분 또는 10 분 이상 감광 시킨 후 X-ray 필름을 현상용 박스 내의 현상 용액 (develop solution)에 넣어 약 3 분간 반응시켰다. 상기 과정이 끝난 후, 이 X-ray 필름을 다시 물에서 2 분간 세척한 후, 고정 용액 (fixing solution)에서 3 분간 반응시키고 다시 2 분간 물로 세척하여 나타나는 밴드 (band)를 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물 1 ㎍/㎖ 농도에서 LPS에 의한 iNOS 단백질의 생산이 억제되기 시작하다가 100 ㎍/㎖ 농도에서 LPS에 의한 iNOS 생산이 최대로 억제됨을 보여 주었다 (도 2 참조; (a)는 면역블럿팅의 결과이며, (b)는 상기 (a)데이터의 광농도 측정 분석결과를 나타냄).
상기한 바와 같이, 탄닌 함유 해동피 추출물은 염증유발물질인 LPS에 자극된 대식세포로부터 iNOS 생산을 농도 의존적으로 현저히 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 염증매개물질인 질소산화물 (NO) 생산을 억제하는 탄닌 함유 해동피 추출물의 효과 검사
본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물의 염증매개물질인 NO 생산 억제 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.
2-1.
해동피
추출물인
탄닌으로
대식세포를 전처리한 후 염증유발물질
LPS
로 자극
상기 실험예 1-1의 대식세포를 6 웰 플레이트 (미국 Falcon사 제품)에 3 × 106 세포/웰 농도로 도말하여 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신과 10% 우태아 혈청이 첨가된 완전 RPMI-1640 배지(미국 Gibco사 제품)를 사용하여 3 일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양 배지를 제거하고 새로운 불완전 RPMI-1640 배지 조건하에서 상기 대식세포들을 탄닌 함유 해동피 추출물을 농도별로 처리하여 2시간 동안 자극시켰다. 그리고 난 후 염증 유도물질인 리포폴리사카라이드 (10 ㎍/㎖; 미국 Sigma사 제품)로 대식세포를 6시간 동안 더 자극하였다.
자극을 위한 배양이 끝난 즉시 각 세포 배양액을 채취한 후 원심분리(1000 g, 4℃, 5 분)하여 배양 상등액을 수거하고 다음과 같이 생산된 NO 량을 측정하였다.
2-2. 질소산화물 (NO)의 정량 분석
활성화된 대식세포로부터 생산된 질소산화물 NO는 곧바로 산소와 반응하여 아질산염(nitrite)으로 변환되므로, 배양액에 있는 아질산염을 측정하여 NO 생산을 검사하였다. 아질산염은 그리스 반응액(Griess reagent, Green LC 등, 1982, Anal Biochem., 126(1), 131~138)을 사용하여 하기와 같이 측정하였다. 반응은 100 ㎕ 배양 상등액과 100 ㎕ 그리스 반응액을 함께 혼합한 후 10분 동안 항온에서 배양하고, 배양이 끝난 후 엘리사 판독기 (ELISA reader)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 이 때 표준곡선을 위한 시약은 나트륨 질산염 (sodium nitrite, 미국 Sigma사 제품)을 사용하였다.
그 결과, 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물 1 ㎍/㎖ 농도에서 염증유발물질인 LPS에 의한 NO 생산 억제 효과를 보이기 시작하다가 100 ㎍/㎖ 농도에서는 최고의 NO 생산억제 효과를 나타내었다 (도 3 참조).
상기한 바와 같이, 탄닌 함유 해동피 추출물은 염증지표인 NO의 생산을 농도 의존적으로 현저하게 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 3: TNF-α 유전자 (TNF-αmRNA) 발현에 있어 탄닌 함유 해동피 추출물의 발현억제 효능 검사
본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물의 TNF-α(종양괴사인자-알파, tumor necrosis factor-α)의 유전자 발현억제 효과를 검사하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.
3-1. 탄닌 함유 해동피 추출물로 대식세포를 전처리한 후 염증유발물질 LPS로 자극 및 전체 RNA 의 분리
상기 실험예 1-1의 대식세포를 6-웰 플레이트 (미국 Falcon사 제품)에 3 × 106 세포/웰 농도로 도말하고 100 U/㎖ 의 페니실린-스트렙토마이신과 10% 우태아 혈청이 첨가된 완전 RPMI-1640 배지 (미국 Gibco사 제품)를 사용하여 3일 동안 배양하였다. 세포 배양이 끝난 다음 배양 배지를 세척한 후 새로운 100 U/㎖ 의 페니실린-스트렙토마이신만이 첨가된 불완전 RPMI-1640 배지(미국 Gibco사 제품)를 주입하여 적당한 배지 조건 하에서 탄닌 함유 해동피 추출물을 농도별로 처리하여 2시간 동안 자극시켰다. 그리고 난 후 염증 유도물질인 리포폴리사카라이드 (10 ㎍/ ㎖; 미국 Sigma사 제품)로 대식세포를 6시간 동안 더 자극시켰다.
세포 자극이 끝난 다음, 차가운 PBS 완충용액으로 배양 세포를 2회 세척한 다음 PBS 완충용액을 제거한 각 웰에 1 ㎖의 트리졸 (Trisol)을 투여하여 5분 동안 항온에서 배양하였다. 배양이 끝난 다음, 트리졸에 녹인 세포 용액을 3 회 피펫팅하여 E-튜브에 담고 0.2 ㎖ 의 클로로포름을 첨가한 다음 10 초 정도 볼텍스 (vortex)하여 세포를 잘 혼합하고 다시 원심분리 (속도 12,000 rpm, 60 분, 4℃)하였다. 그 다음 전체 RNA 층인 상층액만을 E-튜브에 옮기고, 차가운 100% 이소프로판올을 넣어 적어도 하루 동안 침전시켰다. 다시 동일한 조건에서 20 분 정도 원심분리하여 상층액을 따라 버리고 이 과정을 반복하여 순수한 전체 RNA를 분리하였다. 그 다음 75% 에탄올을 첨가하여 손으로 잘 저어 혼합하고 원심분리 하였으며, 원심분리가 끝나면 상층액을 버리고 0.1% DEPC-H2O 를 넣어 65℃에서 10 분 동안 가열한 후 -20℃에서 사용할 때까지 저장하였다.
3-2. 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)
역전사-중합효소 연쇄반응을 수행하기 위하여 하기에 기술한 모든 프라이머는 주식회사 바이오니아 (청원, 충북)에 의뢰하여 주문 합성하였다. 구체적으로 TNF-α의 정방향 프라이머 (forward primer; 5'-GGCAGGTCTTTGGAGTCATTGC-3') 및 역방향 프라이머 (reverse primer; 5'-CATTCGAGGCTCCAGTGAATTCCAG-3'), 그리고 베타-액틴의 정방향 프라이머 (β-actin forward primer; 5'- CAAAGAAAATGGACGCCGCCGAACTTGG-3') 및 역방향 프라이머 (β-actin reverse primer; 5'-CCTGCTTGCTTGCTGATCCACATCTGCTGG-3')를 사용하였다.
중합효소 연쇄반응으로 cDNA 를 합성하기 위하여, 5× 역전사효소 완충용액, 2.5 mM dNTP, 500 ng 프라이머/㎕, 200 U/㎕ MMLV 역전사효소 (reverse trancriptase; 일본 Takara사 제품), 전체 RNA, 0.1% DEPC-처리된 이차 증류수 (DDW)를 첨가하여 반응 혼합액을 준비하였다. 이 때 사용한 프라이머는 역방향 프라이머였다. 그러고 나서 42℃에서 30 분 동안 배양, 75℃에서 30 분 동안 배양을 실시하여 cDNA 를 얻었다. 그 다음 상기 역전사 반응 과정에서 얻은 cDNA 가 포함된 RT 혼합액, 10× Taq 폴리머라제 완충용액, 2.5 mM dNTP, 정방향 프라이머(25 pmol/㎕), 역방향 프라이머(25 pmol/㎕), Taq 폴리머라제 (2.5 units/㎕; 일본 Takara사 제품), 이차 증류수를 잘 혼합하여 반응 조건 95℃에서 30 초, 55℃에서 1 분, 72℃에서 30 초를 30 회로 반복하여 cDNA 를 증폭한 다음 상기 cDNA 를 전기영동하고 TNF-α 유전자의 mRNA 발현 상의 차이를 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물은 30 ㎍/㎖ 농도에서 TNF-α 유전자의 발현억제를 보이기 시작하다가 300 ㎍/㎖ 농도에서는 최고조로 TNF-α유전자의 발현억제를 나타내었다 (도 4 참조; (a)는 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)의 결과이며, (b)는 상기 (a)의 광농도 측정 분석 (densitometric analysis) 결과를 나타냄).
상기한 바와 같이, 탄닌 함유 해동피 추출물(Tannin)이 염증 지표인 TNF-α유전자 발현을 농도 의존적으로 현저히 억제시킴을 확인할 수 있었다.
실험예
4: 대식세포에서
TNF
-α의 분비를 억제하는
탄닌
함유
해동피
추출물의 억제효능 검사
상기 실험예 3에서 살펴본 바와 같이, 탄닌 함유 해동피 추출물이 염증반응에 주로 관여하는 대식세포에서 염증 해당 지표인 TNF-α 유전자발현 억제능을 가지지만, 이러한 TNF-α 유전자 발현억제가 TNF-α 단백질의 생산 및 분비억제로도 이어지는지 여부를 조사하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.
4-1.
탄닌
함유
해동피
추출물로 대식세포를 전처리한 후 염증유발물질
LPS
로 자극
상기 실험예 1-1의 대식세포를 6-웰 플레이트 (미국 Falcon사 제품)에 3 × 106 세포/웰 농도로 접종하고 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신과 10% 우태아 혈청이 첨가된 완전 RPMI-1640배지 (미국 Gibco사 제품)를 사용하여 3일 동안 배양하였다. 세포 배양이 끝난 다음 배양 배지를 세척하고 새로운 불완전 RPMI-1640 배지로 적당한 배지 조건 하에서 대식세포들을 탄닌 함유 해동피 추출물을 농도별로 처리하여 2시간 동안 자극시켰다. 그리고 난 후 염증 유도물질인 리포폴리사카라이드 (10 ㎍/㎖; 미국 Sigma사 제품)로 대식세포를 6시간 동안 더 자극시켰다.
세포 자극을 위한 배양이 끝난 다음 즉시 각 배양액을 채취하여 원심분리(1000 g, 4℃, 5 분)하고 배양 상층액을 수거하여 하기와 같이 배양 상등액에 존재하는 TNF-α단백질의 양을 측정하였다.
4-2. 면역
블럿팅을
이용한
TNF
-α 단백질의 정량적 분석
0.1% SDS 폴리아크릴아미드 전기영동 상의 분리 겔과 상단 겔은 각각 16% 및 3%를 사용하였고, 전기영동 시 전류는 55 mA (Powersupply; 스웨덴 Pharmacia사 제품)로 공급하고, 온도는 쿨링 시스템 (cooling system; 스웨덴 LKB사 제품)을 사용하여 4℃를 유지하며 약 4 ~ 5시간 동안 런닝하였다. 또한, 전기영동 시스템은 Hoefer SE 600 (미국 Hoefer-Pharmacia사 제품)을 사용하였다. 상기 전기영동이 끝난 다음 얻은 겔은 트랜스퍼 완충용액 (transfer buffer; 39 mM 글리신 2.9 g, 48 mM 트리스 베이스 5.8 g, 0.037% SDS, 20% 메탄올, pH 8.3)에 미리 적신 니트로셀룰로스 멤브레인 (nitrocellulose membrane; NC)을 위에 올려놓고 파이버 패드 (fiber pad)에 넣어 조립시켰다. 그러고 나서 면역블럿팅 트랜스퍼 카세트 (immunoblotting transfer cassette)를 니트로셀룰로스 멤브레인이 양극 (positive charge) 방향으로 오고, 겔이 음극 (음성 charge) 방향으로 오도록 맞추어 트랜스퍼 챔버에 넣어두었다. 전류는 1 A 로 공급하고, 온도는 쿨링 시스템을 사용하여 4℃를 유지하면서 1 시간 30 분 동안 트랜스퍼시켰다. 상기 니트로셀룰로스 멤브레인은 블로킹 완충용액 (blocking buffer; 5% 비지방 분유 (nonfat dry milk)를 녹인 TBS-T 완충용액 (20 mM 트리스-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈-20)) 약 200 ㎖ 에 1 시간 동안 Red-Rocker (Hoefer; CA, USA)를 사용하여 로킹하고 항체 (antibody)의 비특이적 결합(non-specific binding)을 블로킹한 다음, 다시 TBS-T 완충용액으로 15 분 동안 1 회, 10 분 동안 2 회 세척하였다.
그 다음 TBS-T 완충용액 3 ㎖를 실리콘 용기 (siliconized bottle)에 분주하고 여기에 토끼 항-생쥐 TNF-α 다클론 일차 항체 (rabbit anti-murine TNF-α polyclonal primary antibody; PBS 완충용액에 500 ㎍/1.5 ㎖ 농도) 30 ㎕(1 : 300 희석 비율)를 각각 첨가하여 니트로셀룰로스 멤브레인을 실리콘 용기 (siliconized bottle)에 넣은 후 4℃로 맞춘 하이브리디제이션 반응기 (hybridization incubator; 미국 Robbins사 제품)에서 10 rpm 속도로 12 시간 동안 반응시켰다. 그리고 나서 TBS-T 완충용액 70 ㎖ 을 사용하여 20 분 동안 각각 3 번 하이브리디제이션 반응기에서 12 rpm 속도로 씻어내고 이차 항체로서 염소 항-토끼 IgG 퍼옥시다제 결합 항체 (goat anti-rabbit IgG horseradish peroxidase conjugated affinity purified antibody; 스톡 용액은 PBS 완충용액에 0.02 ㎎/4 ㎖ 농도)를 친화성 분리하여 3 ㎖ TBS-T 완충용액에 30 ㎕ (1 : 20,000 희석 비율)을 첨가한 다음 4℃로 맞춘 하이브리디제이션 반응기에서 3 시간 동안 배양하고 다시 70 ㎖ TBS-T 완충용액을 사용하여 20 분 동안 각각 4회 세척하였다. 그 다음 니트로셀룰로스 멤브레인을 얇고 투명한 비닐에 넣고 퍼옥시다제 기질 (ECL; peroxidase substrate) 반응용액 1 및 반응용액 2를 50% 씩 혼합한 반응용액 3 ㎖ 을 이 위에 분주하고 5분 동안 배양하였다. 반응이 끝난 다음 암실 (10 W 안전 램프; 미국 Kodak사 제품)에서 NC 가 들어있는 카세트에 X-선 필름을 끼우고 5 분 또는 10 분 이상 감광시킨 후 X-선 필름 현상용 박스 안의 현상 용액 (develop solution)에 약 3 분 동안 넣어 반응시킨 후, 이 X-선 필름을 다시 2 분 동안 물로 씻은 다음 고정 용액 (fixing solution)에서 3 분 동안 반응시키고 다시 2 분 동안 물로 씻어 나타 나는 밴드를 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물 1 ㎍/㎖ 농도에서 TNF-α단백질의 분비억제를 보이기 시작하다가 100 ㎍/㎖ 농도에서는 최고조의 TNF-α의 분비억제를 보였다 (도 5 참조; (a)는 면역블럿팅의 결과이며, (b)는 (a) 데이터의 광농도 측정 분석결과를 나타냄).
상기한 바와 같이, 탄닌 함유 해동피 추출물이 염증 지표인 TNF-α 단백질 생산 및 분비를 농도 의존적으로 탁월하게 저해함을 확인할 수 있었다.
실험예
5: 대식세포에서
NF
-κB 인산화 (p-
NF
-κB)를 억제하는
탄닌
함유
해동피
추출물의 억제 효능 검사
염증 해당지표인 NO 와 TNF-α의 생산은 전사인자인 NF-κB를 통해 생산되므로, 이러한 염증 해당지표인 NO와 TNF-α 생산억제가 NF-κB 활성화 즉 인산화의 억제에 의해 일어났는지 여부를 조사하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.
5-1.
탄닌
함유
해동피
추출물로 대식세포를 전처리한 후 염증유발물질
LPS
로 자극
상기 실험예 1-1의 대식세포를 6-웰 플레이트 (미국 Falcon사 제품)에 3 × 106 세포/웰로 도말하고 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신과 10% 우태아 혈청이 첨가된 완전 RPMI-1640 배지 (미국 Gibco사 제품)를 사용해 3일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양 배지를 제거하고 새로운 불완전 RPMI-1640 배지 조건하에서 대식 세포들을 탄닌 함유 해동피 추출물을 농도별로 처리하여 2시간 동안 자극시켰다. 그리고 난 후 염증 유도물질인 리포폴리사카라이드 (10 ㎍/㎖; 미국 Sigma사 제품)로 대식세포를 6시간 동안 더 자극시켰다.
자극을 위한 배양이 모두 끝난 즉시 세포를 차가운 PBS 완충용액으로 3 회 세척한 후 각종 프로테아제 억제제 (protease inhibitor)가 함유된 용출 완충용액 (lysis buffer)을 사용해 세포를 용해시켰다. 세포 용해 후 용해 시료를 다음과 같이 면역블럿팅 기법을 사용하여 세포 내에 존재하는 NF-κB 인산화 (p-NF-κB) 량을 조사하였다.
5-2. 면역 블럿팅기법을 이용하여 탄닌 함유 해동피 추출물에 의한 NF-κB 인산화(p-NF-κB) 억제정도 분석
0.1% SDS 폴리아크릴아미드 전기영동 상의 분리 겔과 상단 겔은 각각 16% 및 3%를 사용하였고, 전기영동 시 전류는 55 mA (Powersupply; 스웨덴 Pharmacia사 제품), 온도는 쿨링 시스템 (cooling system; 스웨덴 LKB사 제품)을 사용하여 4℃를 유지하면서 약 4 ~ 5 시간 동안 런닝 (running)하였다. 여기에 사용된 전기영동 시스템은 Hoefer SE 600 (미국 Hoefer-Pharmacia사 제품)을 사용하였다. 각각의 시료는 동일한 총 단백질 량을 겔에 로딩 (loading)하여 전기 영동하였다.
상기 전기영동이 끝난 겔은 트랜스퍼 완충용액 (transfer buffer; 39 mM 글리신, 2.9 g, 48 mM 트리스-염기, 5.8 g, 0.037% SDS, 20% 메탄올; pH 8.3)에 미리 적신 니트로셀룰로스 멤브레인 (nitrocellulose membrane, NC)을 올려놓은 후 파이 버 패드 (fiber pad)에 넣고 조립하였다. 그리고 나서 면역 블럿팅 트랜스퍼 카세트 (immunoblotting transfer cassette)를 NC 멤브레인이 양극 (positive charge) 방향으로, 겔이 음극 (음성 charge) 방향으로 오도록 맞추어 트랜스퍼 쳄버에 넣어 두었다. 전류는 1 A로 공급하고, 온도는 쿨링 시스템을 사용하여 4℃를 유지하면서 1 시간 30 분간 트랜스퍼시켰다. 상기 NC 페이퍼는 블로킹 완충용액 (blocking buffer; 5% 비지방 분유 (nonfat dry milk))를 녹인 TBS-T 완충용액 (20 mM 트리스-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈-20) 약 200 ㎖에 1시간 동안 Red-Rocker (미국 Hoefer사 제품)로 로킹하여 항체 (antibody)의 비특이적 결합(non-specific binding)을 블로킹한 다음, 다시 TBS-T 완충용액으로 15 분간 1 회, 10 분간 2 회 세척하였다. 그 후, 3 ㎖ TBS-T 완충용액을 실리콘 용기 (siliconized bottle)에 분주하고 여기에 토끼 항-생쥐 phospho-NF-κB 다클론 일차 항체 (rabbit anti-murine phospho-polyclonal primary antibody; 500 ㎍/1.5 ㎖ 농도로 PBS 완충용액에 녹임) 30 ㎕ (1 : 300 의석)를 첨가한 후, NC 페이퍼를 실리콘 용기에 넣어 4℃ 하이브리디제이션 항온기 (hybridization incubator; 미국 Robbins사 제품)에서 10 rpm 으로 12 시간 동안 반응시켰다. 배양한 후, 70 ㎖ TBS-T 완충용액으로 20 분간 각각 3 번 하이브리디제이션 항온기 (hybridization incubator)에서 12 rpm 속도로 씻어낸 후, 이차 항체(secondary antibody), 즉 염소 항-토끼 IgG 호스래디쉬 퍼옥시다제 결합을 이용하여 친화 분리된 항체 (goat anti-rabbit IgG horseradish peroxidase conjugated affinity purified antibody; PBS 완충용액에 0.02 ㎎/4㎖ 농도로 녹인 스톡 용액)를 3 ㎖ TBS-T 완충용액에 30 ㎕ (1 : 20,000 희석)을 첨가 하여 4℃, 하이브리디제이션 항온기에서 3 시간 동안 배양하였고, 70 ㎖ TBS-T 완충용액으로 20 분간 각각 4 번 씻어내었다. 씻은 후, NC 페이퍼를 얇고 투명한 비닐에 넣고 ECL (peroxidase substrate) 반응액 1 및 2 를 50%씩 혼합한 3 ㎖ 을 NC 페이퍼에 분주한 다음 5 분간 배양하였다. 그 후, 암실 (10 W safety lamp; 미국 Kodak사 제품)에서 NC 가 들어있는 카세트에 X-ray 필름을 넣고 5 분 또는 10 분 이상 감광 시킨 후 X-ray 필름을 현상용 박스 내의 현상 용액 (develop solution)에 넣어 약 3 분간 반응시킨 다음, 이 X-ray 필름을 다시 물에서 2 분간 세척한 후, 고정 용액 (fixing solution)에서 3 분간 반응시키고 다시 2 분간 물로 세척하여 나타나는 밴드 (band)를 분석하였다.
그 결과, 탄닌 함유 해동피 추출물 1 ㎍/㎖ 농도에서 LPS에 의한 NF-κB의 인산화를 억제되기 시작하다가 100 ㎍/㎖ 농도에서 LPS에 의한 NF-κB의 인산화를 최대로 억제됨을 보여 주었다 (도 6 참조; (a)는 면역블럿팅의 결과이며, (b)는 상기 (a) 데이터의 광농도 측정 분석결과를 나타냄).
상기한 바와 같이, 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물은 대식세포로부터 LPS에 의한 NF-κB의 인산화를 농도 의존적으로 현저하게 역제함을 확인할 수 있었다.
실험예
6:
탄닌
함유
해동피
추출물에 의한
기염제
12-O-tetradecanoylphorbol 13-
acetate
(
TPA
) 유도
귀부종
억제 테스트
본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물이 소염 효과가 동물실험에서도 적용 되 는 지 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
7 주령 된 ICR 마우스를 각 실험구별로 분리한 후 해동피 추출물 20, 100, 200, 400 ㎎/㎏ 을 경구 투여 후 1 시간 뒤 아세톤에 녹인 TPA(2.5 ㎍/20 ㎕)를 사용하여 쥐의 귀에 부종을 유발하였다. 이 때 비교를 위한 기존 소염제는 SK-JOINS 제품(400 ㎎/㎏)을 사용하였다. 부종 유발 후 4 시간 뒤 각 실험구 별로 귀 부종을 측정하였으며, 측정 시에는 경추 탈골법을 이용하여 실험체 마우스를 도태 시킨 후 정확한 측정을 유도하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
| 처리 | 귀의 두께 | 염증 억제율(%) |
| 대조군 | 0.67±0.02 | - |
| 음성 대조군 | 0.23±0.06 | 65 |
| 대조시약(SK-JOINS 400 ㎎/㎏) | 0.44±0.07 | 34 |
| 해동피(400 ㎎/㎏-탄닌함량 15.0중량%) | 0.43±0.03 | 36 |
| 해동피(200 ㎎/㎏-탄닌함량 15.0중량%) | 0.50±0.07 | 31 |
| 해동피(100 ㎎/㎏-탄닌함량 15.0중량%) | 0.59±0.01 | 25 |
| 해동피(20 ㎎/㎏-탄닌함량 15.0중량%) | 0.61±0.02 | 9 |
| 1. Data represent the mean of difference in ear thickness(㎜)±S.E.M (n=12) 2. 대조군: 부종을 유발하지 않은 실험 구 3. 음성 대조군: 부종유발 후 약제 무처리 실험 구 | ||
상기 표 1 에서 보는 바와 같이, 탄닌 함유 해동피 추출물 400 ㎎/㎏ 농도일 경우 염증 억제율이 39%로 가장 높았으며, 이는 기존 소염제인 SK-JOINS와 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않은 것으로, 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물은 농도 의존적으로 TPA 유도 귀부종을 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 7: 탄닌 함유 해동피 추출물에 의한 기염제 아라키돈산(arachidonic acid) 유도 귀 부종억제 테스트
본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물의 아라키돈산 유도 귀 부종 억제 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.
7주령 된 ICR 마우스를 각 실험구별로 분리한 후 SK-JOINS을 400 ㎎/㎏ (비교약물로 사용), 해동피 추출물 20, 100, 200, 400 ㎎/㎏ 을 경구 투여 후 1 시간 뒤 아세톤에 녹인 아라키돈산(2 ㎍/20 ㎕)을 사용하여 귀에 부종을 유발하였다. 부종 유발 후 1 시간 뒤 각 실험구 별로 귀 부종을 측정하였으며, 측정 시에는 경추 탈골법을 이용하여 실험체 마우스를 도태 시킨 후 정확한 측정을 유도하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
| 처리 | 귀의 두께 | 염증 억제율(%) |
| 대조군 | 0.55±0.01 | - |
| 음성 대조군 | 0.21±0.021 | 62 |
| SK-JOINS 400 ㎎/㎏ | 0.30±0.02 | 45 |
| 해동피(400 ㎎/㎏-탄닌함량 15.0중량%) | 0.25±0.05 | 55 |
| 해동피(200 ㎎/㎏-탄닌함량 15.0중량%) | 0.31±0.05 | 44 |
| 해동피(100 ㎎/㎏-탄닌함량 15.0중량%) | 0.47±0.08 | 15 |
| 해동피(20 ㎎/㎏-탄닌함량 15.0중량%) | 0.53±0.01 | 4 |
| 1. Data represent the mean of difference in ear thickness(㎜)±S.E.M (n=12) 2. 대조군: 부종을 유발하지 않은 실험 구 3. 음성 대조군: 부종유발 후 약제 무 처리 실험 구 | ||
상기 표 2 에서 보는 바와 같이, 탄닌 함유 해동피 추출물 400 ㎎/㎏ 농도일 경우 아라키돈산 유도 귀부종 염증 억제율이 가장 높음을 알 수 있었으며, 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물은 아라키돈산 유도 귀 부종을 농도 의존적으로 현저하게 억제함을 확인할 수 있었다.
실험예 8: 탄닌 함유 해동피 추출물에 의한 아세트산 유도 스트레칭 억제 테스트
본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물이 귀 부종뿐만 아니라 통각의 완화 및 억제에도 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 종래의 아세트산 유도 스트레칭 억제 테스트의 실험방법 (Hermendez-Perez M, Rabanal RM, J. Ethnopharmacol. 81:43-47, 2002년)을 참조하여 하기와 같이 실험하였다.
7주령 된 ICR 마우스를 각 생약 후보별로 분리한 후 SK-JOINS을 400 ㎎/㎏ (비교 약물로 사용), 해동피 추출물 20, 100, 200, 400 ㎎/㎏을 경구 투여 1시간 후 아세트산(0.7%)의 복강 내 투여(0.1 ㎖/10 g)로 장기의 염증을 유발하였다. 10분후 10 분 동안 마우스의 스트레칭(stretching)을 관찰하였는데, 그 이유는 부종 시 가려움증을 유발하기 때문이며 이러한 현상을 통해서 통각 지표로 사용 할 수 있다.
| 처리 | 비틀림 횟수 (Writhing number) | 통증 억제율(%) |
| 대조군 | 30.60±1.6 | - |
| SK-JOINS(400 ㎎/㎏) | 19.5±1.9 | 36 |
| 해동피(400 ㎎/㎏-탄닌함량 20.0 중량%) | 15.2±1.4 | 50 |
| 해동피(200 ㎎/㎏-탄닌함량 20.0 중량%) | 20.1±1.1 | 34 |
| 해동피(100 ㎎/㎏-탄닌함량 20.0 중량%) | 24.3±1.3 | 21 |
| 해동피(20 ㎎/㎏-탄닌함량 20.0 중량%) | 26.2±0.8 | 13 |
| 1. 대조군: 스트레칭 유발 후 약제 무처리 실험 구 | ||
상기 표 3 에서 보는 바와 같이 탄닌 함유 해동피 추출물 400 ㎎/㎏ 농도일 경우 아세트산 유도 스트레칭 억제 효과가 높은 것을 알 수 있었으며, 이는 비교 소염제인 SK-JOINS보다 더 통각 억제율을 나타내는 것으로, 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물이 농도 의존적으로 아세트산 유도 스트레칭 억제효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다.
실험예
9:
탄닌
함유
해동피
추출물에 의한 급성 관절염 치료효과 검정
본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물의 급성 관절염 치료효과를 검정하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.
수컷 SD계 레트(200 g 내외)에 미리 조제한 SK-JOINS을 400 ㎎/㎏ (비교 약물로 사용)과, 해동피 추출물 20, 100, 200, 400 ㎎/㎏을 1 ㎖ 경구 투여하고 1% 카라기닌 생리식염수 100 ㎕를 좌측 족저부에 주사하여 급성 족부 부종을 유도하였다. 부종은 플레티스모메터(plethysmometer, LE 7500)를 이용하여 3시간 후의 발 용적을 측정하였으며 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
| 처리 | 염증유발정도(%) |
| 대조군 | 0 |
| 양성 대조군 | 84 |
| SK-JOINS(400 ㎎/㎏) | 51 |
| 해동피(400 ㎎/㎏-탄닌함량 15.0중량%) | 53 |
| 해동피(200 ㎎/㎏-탄닌함량 15.0중량%) | 60 |
| 해동피(100 ㎎/㎏-탄닌함량 15.0중량%) | 72 |
| 해동피(20 ㎎/㎏-탄닌함량 15.0중량%) | 79 |
| 1. 대조군: 부종을 유발하지 않은 실험 구 2. 양성 대조군: 부종유발 후 약제 무처리 실험 구 | |
상기 표 4 에서 보는 바와 같이, 탄닌 함유 해동피 추출물 400 ㎎/㎏ 농도일 경우 급성 관절염 치료효과가 가장 높음을 알 수 있으며, 이는 비교 소염제인 SK-JOINS 보다 더 좋은 효과를 나타낸 것으로, 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물이 농도 의존적으로 현저한 급성 관절염 치료 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.
실험예 10: 탄닌 함유 해동피 추출물의 세포 독성 유무 검사
본 발명의 탄닌 함유 탄닌 함유 해동피 추출물의 세포 독성에 대한 안정성을 조사하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.
10-1.
비장세포
추출 및 배양
7 주령의 Balb/c 마우스 (한국, 대전 화학연구소)를 경추 탈골해서 희생시키고 비장을 무균 상태에서 회수한 다음 100 U/㎖의 페니실린-스트렙토마이신만이 첨가된 차가운 불완전 RPMI-1640 배지(미국 Gibco사 제품)로 2회 세척한 후, 다시 차가운 불완전 RPMI-1640 배지를 주입하여 Daunce 세포균질기(미국 Wheaton사 제품)를 사용하여 각각 하나의 세포를 만들고 얼음물에서 10분 동안 배양하였다. 배양이 끝난 다음 세포 상층액만을 수집하여 원심분리 (1,000 g, 5 분, 4℃)하고 다시 상층액을 따라버리고 세포를 얻었다. 비장세포는 96-웰 플레이트에 1.5 × 105 세포/웰 농도로 분주하여 100 U/㎖ 의 페니실린-스트렙토마이신과 10% 우태아 혈청이 첨가된 완전 RPMI-1640 배지(미국 Gibco사 제품)로 배양하였다. 그 다음 각 웰에 탄닌 함유 해동피 추출물을 농도별로 첨가하고 2일 동안 배양하여 MTT 분석을 수행하였다.
10-2. 화학적 세포독성 검사를 위한
MTT
분석
MTT 분석은 프랑소아와 리타 (Francois D and Lita L., J. Immunological methods, 89, 271-277, 1986년)의 방법에 준하여 다음과 같이 실시하였다. 비장세포의 배양이 완료되면 MTT 반응액 (HBSS 완충용액에서 농도 1 ㎎/㎖)을 각 웰 당 50 ㎕씩 첨가하고 37℃ 에서 4 시간 동안 다시 배양하였다. 이후 배양 상등액은 모두 제거하고 침전된 불용성 포르마잔 (formazan)을 녹이기 위하여 디메틸설포옥사이드 (dimethylsulfoxide; DMSO)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하여 15 분 동안 저어주고 (stirring), 엘리사 판독기 (ELISA reader; 미국 Pharmacia사 제품)를 사용하여 540 ㎚ 파장에서의 흡광도(O. D.)를 측정하여 다음과 같은 공식에 따라 % 세포 독성(cytotoxicity)을 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7은 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물이 실험동물의 비장세포에 미치는 독성을 생존율 그래프로 나타낸 것으로서, 이 때 해동피 추출물인 탄닌의 농도는 1 ~ 100 ㎍/㎖ 범위이고 자극시간은 2 일이며, NS (non-stimulation)는 해동피 추출물 대신 식염수로 자극하였다.
도 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물은 높은 농도인 100 ㎍/㎖ 에서도 비장세포에 독성 효과를 미치지 않았으며 오히려 대조군과 비교하여 미미하나마 더 높은 생존율을 보여주었다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물은 세포 독성이 없으며 소염제로서 안전성이 있는 것임을 확인할 수 있었다.
실험예 11: 탄닌 함유 해동피 추출물의 장기 독성 검사
본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물이 생체의 신진대사와 독성에 민감한 주요 장기인 간과 신장에 미치는 효과를 검사하기 위하여 하기와 같이 실험하였다. 신장 기능은 혈액 크레아틴 (blood creatin, CRE)과 혈액 우레아 질소 (blood urea nitrogen, BUN)의 혈중 농도를 측정하여 검사하고, 간 기능은 간세포가 함유하는 GOT (glutamic-oxalacetate transaminase)와 GPT (glutamic pyruvic transaminase)의 두 효소의 혈중 농도를 측정하여 검사하였다.
7 주령의 마우스 (Balb/c; 한국, 대전 화학연구소)를 사용하여 실험군에는 탄닌 함유 해동피 추출물 10 ㎍ 및 100 ㎍ 을 0.01 M PBS 완충용액 2 ㎖ 에 용해시켜 정맥에 매일 1 회 2 ㎖씩 투여하고, 정상군에는 PBS 완충용액 2 ㎖만을 매일 1 회 투여하여 동일한 과정으로 실험하였다. 정맥 주사 후 1, 5 및 10 일이 경과하면 마우스의 눈으로부터 채혈하여 얻은 혈청 10 ㎕를 다층 필름 (multilayer film) 상에 놓고 후지 드라이 켐 시스템 (Fugi Dry Chem System; 일본 Fugi Photo Film 사 제품)을 이용하여 각각 CRE, BUN, GOT 및 GPT 값을 측정하였으며, 그 결과를 도 8 및 9에 나타내었다.
도 8 및 도 9는 각각 탄닌 함유 해동피 추출물의 간과 신장 독성 영향을 나타낸 그래프로, 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물 30 ㎍과 300 ㎍을 각각 마우스에 매일 투여하고 1 일, 5 일, 10 일에 채혈해서 간과 신장 조직에 미치는 독성을 검사(GOT, GPT 및 CRE, BUN) 하였으며, 대조군(NS)은 해동피 추출물 대신 식염수로 자극하였다.
도 8 및 9 에서 보는 바와 같이, 탄닌 함유 해동피 추출물 30 ㎍를 투여한 실험군에서는 GOT, GPT, CRE 및 BUN 의 혈중 농도가 정상군과 거의 동일하였으며, 100 ㎍ 투여한 실험군에서는 정상군보다는 조금 높지만 유의한 차이는 없었다 (도 8 및 도 9).
상기한 바와 같이, 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물은 간 및 신장 모두에서 유해한 독성을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 12: 탄닌 함유 해동피 추출물에 의한 실험동물의 체중 변화 검사
본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물의 안전성을 확인하기 위하여, 미성숙 또는 성숙한 쥐의 신체 발육에 미치는 영향을 체중 증감 변화로 조사하였다.
탄닌 함유 해동피 추출물을 10 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖ 농도가 되도록 0.01 M PBS 완충용액에 녹이고 생후 1 일째의 미성숙 마우스에는 매일 피하 주사하고, 생후 7 주령된 성숙 마우스에는 매일 복강 내 주사하였으며, 대조군(NS)에는 0.01 M PBS 완충용액을 피하주사하거나 복강 내 주사하였다. 그 결과를 도 10 (미성숙 쥐의 경우) 및 11 (성숙 쥐의 경우)에 나타내었다.
도 10 및 11에서 보는 바와 같이, 미성숙 마우스와 성숙 마우스 모두에서 탄닌 함유 해동피 추출물의 10 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖ 농도가 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않음을 알 수 있었다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물은 강력한 소염효과 및 진통효과가 있을 뿐만 아니라, 쥐를 사용한 동물 실험에서는 세포, 조직 및 신체 발육에 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.
하기에 상기 약학 조성물의 제제예를 설명하나 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제조예 1: 정제의 제조
본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물을 이용하여 하기의 조성으로 경구투여용 정제를 습식과립법 및 건식과립법을 이용하여 제조한다.
[조성]
탄닌 함유 해동피 추출물 .....................200 ㎎
경질 무수규산 ...............................10 ㎎
스테아린산 마그네슘.......................... 2 ㎎
미세결정 셀룰로오즈 .........................50 ㎎
전분 글리콜산 나트륨 ........................25 ㎎
유당 ....................................... 101㎎
포비돈 ......................................12 ㎎
무수에탄올................................... 적량
제조예 2: 연고제의 제조
본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물을 이용하여 하기의 조성으로 연고제를 제조한다.
[조성]
탄닌 함유 해동피 추출물....................... 5 g
세틸팔미테이트 ...............................20 g
세탄올 .......................................40 g
스테아릴알코올............................... 40 g
미리스탄이소프로필 ...........................80 g
모노스테아린산 소르비탄 ......................20 g
폴리솔베이트 .................................60 g
파라옥시안식향산 프로필....................... 1 g
파라옥시안식향산 메틸......................... 1 g
인산 및 정제수................................ 적량
제조예 3: 주사제의 제조
본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물을 이용하여 하기의 조성으로 주사제를 제조한다.
[조성]
탄닌 함유 해동피 추출물...................... 100 ㎎
만니톨 .......................................180 ㎎
인산일수소나트륨 ..............................25 ㎎
주사용 정제수 ............................. 2,974 ㎎
제조예 4: 경피제의 제조
본 발명의 탄닌 함유 해동피 추출물을 이용하여 하기의 조성으로 경피제를 제조한다.
[조성]
탄닌 함유 해동피 추출물....................... 0.4 g
폴리아크릴산 나트륨 ...........................1.3 g
글리세린 ......................................3.6 g
수산화알루미늄 ..............................0.004 g
메틸 파라벤 ...................................0.2 g
아크릴계 점착용액 .............................14 ㎖
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의한 일정 함량의 탄닌을 함유하는 해동피 추출물은 천연물 유래의 물질로써 독성 및 부작용이 없으며, 염증매개물질인 NO와 TNF-α의 생성을 현저히 억제하고, 염증매개전구물질인 NF-κB 인산화 억제작용, 소염 진통작용, 급성부종 억제작용, 급성관절염 억제작용 등의 탁월한 항염증 효과를 가지므로, 이를 함유하는 조성물은 염증 및 염증반응에 의해 발생하는 관절염, 중이염, 통증, 부종 또는 퇴행성 질환 등과 같은 염증성 질환의 치료 및 예방에 효과적이고 안전한 의약품으로 유용하게 이용될 수 있다.
<110> Konkuk University Industrial Coopertaion Corp.
<120> Composition for the anti-inflammatory and alagesia comprising
tannin-contained Kalopanacis Cortex extract
<130> P07-E208
<160> 4
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
ggcaggtctt tggagtcatt gc 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
cattcgaggc tccagtgaat tccag 25
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
caaagaaaat ggacgccgcc gaacttgg 28
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
cctgcttgct tgctgatcca catctgctgg 30
Claims (7)
- 활성물질로 5.0 ∼ 30.0중량%의 탄닌(Tannin)을 함유하는 해동피 (Actinidia polygama) 추출물을 유효성분으로 하는 소염 진통제 조성물.
- 제1항에 있어서, 탄닌은 10.0 ~ 25.0중량%인 것을 특징으로 하는 소염 진통제 조성물.
- 제1항에 있어서, 염증 및 염증반응에 의해 발생하는 관절염, 중이염, 부종, 통증 또는 퇴행성 질환에 대해 소염진통 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 소염 진통제 조성물.
- 1) 해동피를 5 ~ 8 배량의 물, 알코올 또는 알코올 수용액으로 추출, 냉각 및 여과하는 단계;2) 상기 여액을 알코올 수용액으로 층분리한 다음 60 ~ 80℃ 로 감압 농축하는 단계; 및3) 상기 농축물에 알코올을 가한 후 500 ~ 1,000 rpm으로 원심분리한 다음 여액을 감압 농축, 진공건조, 분쇄 및 멸균하여 해동피 추출물을 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 탄닌을 함유하는 해동피 추출물의 제조방법.
- 제4항에 있어서, 알코올은 30% 에탄올 수용액인 것을 특징으로 하는 탄닌을 함유하는 해동피 추출물의 제조방법.
- 제4항에 있어서, 해동피 추출물은 분말인 것을 특징으로 하는 탄닌을 함유하는 해동피 추출물의 제조방법.
- 제4항에 있어서, 탄닌은 10.0 ~ 25.0중량%인 것을 특징으로 하는 탄닌을 함유하는 해동피 추출물의 제조방법.
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011019153A3 (ko) * | 2009-08-12 | 2011-03-31 | (주) 와이디생명과학 | 오미자, 황금 및 해동피의 혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR101248378B1 (ko) * | 2012-09-26 | 2013-04-02 | 대한약품공업 주식회사 | 관절염 치료 및 예방용 약학조성물 |
| KR20200033685A (ko) * | 2018-09-20 | 2020-03-30 | 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 | 해동피 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역력 증진용 조성물 |
-
2007
- 2007-05-17 KR KR1020070047976A patent/KR20080101344A/ko not_active Ceased
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| KR101248378B1 (ko) * | 2012-09-26 | 2013-04-02 | 대한약품공업 주식회사 | 관절염 치료 및 예방용 약학조성물 |
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