KR20080046135A

KR20080046135A - 자가면역 질환 대상체로부터의 생물학적 샘플의 예비처리

Info

Publication number: KR20080046135A
Application number: KR1020077029603A
Authority: KR
Inventors: 크리스타 맥커천; 안 송
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2005-05-20
Filing date: 2006-05-19
Publication date: 2008-05-26
Also published as: WO2006127517A2; CA2608835A1; US20060263349A1; BRPI0613259A2; DE602006012839D1; CN101223448A; EP1902320B1; ATE460672T1; ES2341484T3; US20100015055A1; ZA200709956B; AU2006251647A1; WO2006127517A3; EP1902320A2; IL187083A0; RU2007147426A; CN101223448B; WO2006127517A9; US7601335B2; MX2007014497A

Abstract

본 출원은 간섭을 회피하기 위한 자가면역 질환 대상체로부터의 생물학적 샘플의 예비처리 방법을 기재하며, 특히 여기서 샘플은 세포-기반 생물학적 활성 분석, 예컨대 중화 항체 분석에 적용된다.

자가면역 질환, 생물학적 샘플, 간섭, 예비처리, 세포-기반 생물학적 분석, 중화 항체 분석, 탈지질화, 친화도 정제

Description

자가면역 질환 대상체로부터의 생물학적 샘플의 예비처리 {PRETREATMENT OF A BIOLOGICAL SAMPLE FROM AN AUTOIMMUNE DISEASE SUBJECT}

본 출원은 2005년 5월 20일자로 출원된 가출원 제60/682,990호 (그의 전문은 본원에 참고로 도입됨)에 대해 35 USC§119 하의 우선권을 주장하는 비-가출원이다.

본 발명은 간섭을 회피하기 위한 자가면역 질환 대상체로부터의 생물학적 샘플의 예비처리 방법에 관한 것이며, 특히 여기서 샘플은 세포-기반 생물학적 활성 분석, 예컨대 중화 항체 분석에 적용된다.

림프구는 조혈 과정 동안 골수에서 생성되는 많은 유형의 백혈구 세포 중 하나이다. 림프구에는 2가지 주요한 집단, 즉 B 림프구 (B 세포)와 T 림프구 (T 세포)가 있다. 본원에서 특히 대상이 되는 림프구는 B 세포이다.

B 세포는 골수 내에서 성숙하며, 골수에서 나와서 항원-결합 항체를 그의 세포 표면 상에 발현한다. 막-결합된 항체에 대해 특이적인 항원을 천연 B 세포가 최초로 마주칠 때, 세포는 급속하게 분열하기 시작하며, 그의 자손은 기억 B 세포 및 "형질 세포"로 지칭되는 효과기 세포로 분화된다. 기억 B 세포는 보다 긴 수명 을 가지며, 원래 모 세포와 동일한 특이성을 갖는 막-결합된 항체를 계속하여 발현한다. 형질 세포는 막-결합된 항체를 생성하지 않지만, 대신에 분비될 수 있는 형태의 항체를 생성한다. 분비된 항체는 체액성 면역의 주요한 효과기 분자이다.

CD20 항원 (인간 B-림프구-제한된 분화 항원, Bp35로도 지칭됨)은 프리(pre)-B 및 성숙 B 림프구 상에 위치된, 분자량이 대략 35 kD인 소수성 막횡단 단백질이다 (문헌 [Valentine et al., J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)]; 및 [Einfeld et al., EMBO J. 7(3):711-717 (1988)]). 항원은 또한 90％ 초과의 B-세포 비-호지킨(non-Hodgkin) 림프종 (NHL)에서도 발현되지만 (문헌 [Anderson et al. Blood 63(6):1424-1433 (1984)]), 조혈 줄기 세포, 프로(pro)-B 세포, 정상적인 형질 세포 또는 기타 정상적인 조직에서는 발견되지 않는다 (문헌 [Tedder et al. J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)]). CD20은 세포-주기 개시 및 분화에 대한 활성화 프로세스에 있어서 초기 단계(들)를 조절하며 ([Tedder et al.], 상기 문헌), 가능하게는 칼슘 이온 채널로서 기능한다 (문헌 [Tedder et al. J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990)]).

B 세포 림프종에서 CD20이 발현되면, 상기 항원은 이러한 림프종의 "표적화"를 위한 후보로서 기능할 수 있다. 본질적으로, 이러한 표적화는 하기와 같이 일반화될 수 있다: B 세포의 CD20 표면 항원에 특이적인 항체를 환자에게 투여한다. 상기 항-CD20 항체는 (표면상으로는) 정상적인 B 세포 및 악성 B 세포 둘다의 CD20 항원에 특이적으로 결합하며, CD20 표면 항원에 결합된 항체는 신생물 B 세포의 파괴 및 고갈을 초래할 수 있다. 또한, 종양을 파괴하는 잠재성을 갖는 화학적 작용 제 또는 방사성 표지는 항-CD20 항체에 접합되어, 작용제가 신생물 B 세포에 특이적으로 "전달되도록" 할 수 있다. 접근법의 유형에 관계없이, 일차적인 목표는 종양을 파괴하는 것이며, 구체적인 접근법은 이용되는 특정 항-CD20 항체에 의해 결정될 수 있고, 따라서 CD20 항원을 표적화하는데 이용가능한 접근법은 상당히 다양할 수 있다.

리툭시마브 (리툭산(RITUXAN)(등록상표))는 인간 CD20 항원에 대한 유전학적으로 조작된 키메라 뮤린/인간 모노클로날 항체이다. 리툭시마브는 1998년 4월 7일자로 허여된 미국 특허 제5,736,137호 (Anderson et al.)에서 "C2B8"로 지칭된 항체이다. 리툭시마브는 재발성 또는 난치성 저-등급 또는 소포성, CD20-양성, B-세포 비-호지킨 림프종을 갖는 환자의 치료에 대해 설명되었다. 시험관내에서, 리툭시마브는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 및 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하며 아폽토시스를 유도하는 것으로 입증되었다 (문헌 [Reff et al., Blood 83(2):435-445 (1994)]; [Maloney et al., Blood 88:637a (1996)]; [Manches et al., Blood 101:949-954 (2003)]). 리툭시마브와 화학요법 및 독소 사이의 상승작용은 또한 실험적으로 관찰되었다. 특히, 리툭시마브는 약물-저항성 인간 B-세포 림프종 세포주를 독소루비신, CDDP, VP-16, 디프테리아 독소, 및 리신의 세포독성 효과에 대해 감작화시킨다 (문헌 [Demidem et al., Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3):177-186 (1997)]). 생체내 전임상 연구는 리툭시마브가 시노몰구스 원숭이의 말초 혈액, 림프절, 및 골수로부터의 B 세포를 고갈시킴을 밝혀내었다 (문헌 [Reff et al., Blood 83:435-445 (1994)]).

리툭시마브는 또한 B 세포 및 자가항체가 질환 병태생리에서 역할을 하는 것으로 보이는 다양한 비-악성 자가면역 장애에서 연구되었다 (문헌 [Edwards et al., Biochem Soc. Trans. 30:824-828 (2002)]). 리툭시마브는 예를 들어 류마티스성 관절염 (RA) ([Leandro et al., Ann. Rheum. Dis. 61:883-888 (2002)]; [Edwards et al., Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9):S46 (2002)]; [Stahl et al., Ann. Rheum. Dis., 62 (Suppl. 1):OP004 (2003)]; [Emery et al., Arthritis Rheum. 48(9):S439 (2003)]), 루푸스 ([Eisenberg, Arthritis. Res. Ther. 5:157-159 (2003)]; [Leandro et al. Arthritis Rheum. 46:2673-2677 (2002)]; [Gorman et al., Lupus, 13:312-316 (2004)]), 면역 혈소판감소 자반증 ([D'Arena et al., Leuk. Lymphoma 44:561-562 (2003)]; [Stasi et al., Blood, 98:952-957 (2001)]; [Saleh et al., Semin. Oncol., 27 (Supp 12):99-103 (2000)]; [Zaia et al., Haematolgica, 87:189-195 (2002)]; [Ratanatharathorn et al., Ann. Int. Med., 133:275-279 (2000)]), 진정 적혈구계 무형성증 ([Auner et al., Br. J. Haematol., 116:725-728 (2002)]); 자가면역 빈혈 ([Zaja et al., Haematologica 87:189-195 (2002)] (정오표는 [Haematologica 87:336 (2002)]에 나타남), 저온 응집병 ([Layios et al., Leukemia, 15:187-8 (2001)]; [Berentsen et al., Blood, 103:2925-2928 (2004)]; [Berentsen et al., Br. J. Haematol., 115:79-83 (2001)]; [Bauduer, Br. J. Haematol., 112:1083-1090 (2001)]; [Damiani et al., Br. J. Haematol., 114:229-234 (2001)]), 중증 인슐린 저항성의 B형 증후군 ([Coll et al., N. Engl. J. Med., 350:310-311 (2004)]), 혼합 한랭글로불린혈증 ([DeVita et al., Arthritis Rheum. 46 Suppl. 9:S206/S469 (2002)]), 중증 근무력증 ([Zaja et al., Neurology, 55:1062-63 (2000)]; [Wylam et al., J. Pediatr., 143:674-677 (2003)]), 베게너 육아종증 ([Specks et al., Arthritis & Rheumatism 44:2836-2840 (2001)]), 난치성 심상성 천포창 ([Dupuy et al., Arch Dermatol., 140:91-96 (2004)]), 피부근육염 ([Levine, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9):S1299 (2002)]), 쇼그렌 증후군 ([Somer et al., Arthritis & Rheumatism, 49:394-398 (2003)]), 활동성 II형 혼합 한랭글로불린혈증 ([Zaja et al., Blood, 101:3827-3834 (2003)]), 심상성 천포창 ([Dupay et al., Arch. Dermatol., 140:91-95 (2004)]), 자가면역 신경병증 ([Pestronk et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74:485-489 (2003)]), 부신생물 안구진탕-근경련 증후군 ([Pranzatelli et al. Neurology 60(Suppl. 1) PO5.128:A395 (2003)]) 및 재발-진정 다발성 경화증 (RRMS) ([Cross et al. (abstract) "Preliminary results from a phase II trial of Rituximab in MS" Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis, 20-21 (2003)])의 징후 및 증상을 잠재적으로 완화시키는 것으로 보고되었다.

리툭시마브의 안전성 및 효능에 대한 48-주 추적 데이타를 제공하는 II상 연구 (WA16291)가 류마티스성 관절염 (RA)을 갖는 환자에서 수행되었다 (문헌 [Emery et al., Arthritis Rheum 48(9):S439 (2003)]; [Szczepanski et al. Arthritis Rheum 48(9):S121 (2003)]; [Edwards et al., "Efficacy of B-cell-targeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis" N Engl. J. Med. 350:2572-82 (2004)]). 총 161명의 환자는 4가지 처치군으로 고르게 무작위화되었다: 메토트렉세이트, 리툭시마브 단독, 리툭시마브 ＋ 메토트렉세이트, 및 리툭시마브 ＋ 시클로포스파미드 (CTX). 리툭시마브의 처치 처방은 제1일 및 제15일에 정맥내로 1 g 투여였다. RA를 갖는 대부분의 환자에서 리툭시마브의 주입은 대부분의 환자에 의해 우수하게 허용되었으며, 환자의 36％는 그의 제1 주입 동안 하나 이상의 부작용을 경험하였다 (위약을 투여받은 환자의 30％에 비해). 전체적으로, 대다수의 부작용은 중증도에 있어서 온건 내지 중간정도로 간주되었으며, 모든 처리군에 걸쳐 우수하게 균형을 이루었다. 48주에 걸쳐 4개의 군을 통해 총 19건의 중증 부작용이 있었으며, 리툭시마브/CTX 군에서 약간 더 빈번했다. 감염의 발생은 모든 군에 걸쳐 우수하게 균형을 이루었다. 상기 RA 환자 집단에서 중증 감염의 평균 비율은 4.66/100 환자-년이었으며, 이는 공동체-기반 역학 연구에서 보고된 RA 환자에서 입원을 요하는 감염의 비율 (9.57/100 환자-년)보다 낮은 것이다 (문헌 [Doran et al., Arthritis Rheum. 46:2287-2293 (2002)]).

자가면역 신경병증 ([Pestronk et al.], 상기 문헌), 안구진탕-근경련 증후군 ([Pranzatelli et al.], 상기 문헌), 및 RRMS ([Cross et al.], 상기 문헌)를 비롯한 신경계 장애를 갖는 소수의 환자에서 리툭시마브의 보고된 안전성 프로파일은 종양학 또는 RA에서 보고된 것과 유사하였다. RRMS를 갖는 환자에서 인터페론-β (IFN-β) 또는 글라티라머 아세테이트와 조합된 리툭시마브의 계속된 연구자-지원 시험 (IST)에서 ([Cross et al], 상기 문헌), 치료된 환자 10명 중 1명은 리툭시마브의 제1 주입 후 중간정도의 발열 및 경직을 경험한 후 밤새 관찰을 위해 입 원조치된 반면, 다른 9명의 환자는 임의의 보고된 부작용 없이 4회-주입 처방을 완료하였다.

CD20 항체 및 CD20 결합 분자에 관한 특허 및 특허 공보로는 미국 특허 제5,776,456호, 제5,736,137호, 제5,843,439호, 제6,399,061호 및 제6,682,734호, 뿐만 아니라 US 2002/0197255, US 2003/0021781, US 2003/0082172, US 2003/0095963, US 2003/0147885 (Anderson et al.); 미국 특허 제6,455,043호 및 WO 2000/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO 2000/27428 (Grillo-Lopez and White); WO 2000/27433 및 US 2004/0213784 (Grillo-Lopez and Leonard); WO 2000/44788 (Braslawsky et al.); WO 2001/10462 (Rastetter, W.); WO 2001/10461 (Rastetter and White); WO 2001/10460 (White and Grillo-Lopez); US 2001/0018041, US 2003/0180292, WO 2001/34194 (Hanna and Hariharan); US 2002/0006404 및 WO 2002/04021 (Hanna and Hariharan); US 2002/0012665 및 WO 2001/74388 (Hanna, N.); US 2002/0058029 (Hanna, N.); US 2003/0103971 (Hariharan and Hanna); US 2002/0009444 및 WO 2001/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO 2001/97858 (White, C.); US 2002/0128488 및 WO 2002/34790 (Reff, M.); WO 2002/060955 (Braslawsky et al.); WO 2002/096948 (Braslawsky et al.); WO 2002/079255 (Reff and Davies); 미국 특허 제6,171,586호 및 WO 1998/56418 (Lam et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); WO 1999/22764 (Raju, S.); WO 1999/51642, 미국 특허 제6,194,551호, 미국 특허 제6,242,195호, 미국 특허 제6,528,624호 및 미국 특허 제6,538,124호 (Idusogie et al.); WO 2000/42072 (Presta, L.); WO 2000/67796 (Curd et al.); WO 2001/03734 (Grillo- Lopez et al.); US 2002/0004587 및 WO 2001/77342 (Miller and Presta); US 2002/0197256 (Grewal, L.); US 2003/0157108 (Presta, L.); WO 04/056312 (Lowman et al.); US 2004/0202658 및 WO 2004/091657 (Benyunes, K.); 미국 특허 제6,565,827호, 제6,090,365호, 제6,287,537호, 제6,015,542호, 제5,843,398호 및 제5,595,721호 (Kaminski et al.); 미국 특허 제5,500,362호, 제5,677,180호, 제5,721,108호, 제6,120,767호, 제6,652,852호 (Robinson et al.); 미국 특허 제6,410,391호 (Raubitschek et al.); 미국 특허 제6,224,866호 및 WO 00/20864 (Barbera-Guillem, E.); WO 2001/13945 (Barbera-Guillem, E.); US 2005/0079174 A1 (Barbera-Guillem et al.); WO 2000/67795 (Goldenberg); US 2003/0133930 및 WO 2000/74718 (Goldenberg and Hansen); US 2003/0219433 및 WO 2003/68821 (Hansen et al.); WO 2004/058298 (Goldenberg and Hansen); WO 2000/76542 (Golay et al.); WO 2001/72333 (Wolin and Rosenblatt); 미국 특허 제6,368,596호 (Ghetie et al.); 미국 특허 제6,306,393호 및 US 2002/0041847 (Goldenberg, D.); US 2003/0026801 (Weiner and Hartmann); WO 2002/102312 (Engleman, E.); 2003/0068664 (Albitar et al.); WO 2003/002607 (Leung, S.); WO 2003/049694, US 2002/0009427 및 US 2003/0185796 (Wolin et al.); WO 2003/061694 (Sing and Siegall); US 2003/0219818 (Bohen et al.); US 2003/0219433 및 WO 2003/068821 (Hansen et al.); US 2003/0219818 (Bohen et al.); US 2002/0136719 (Shenoy et al.); WO 2004/032828 (Wahl et al.) 및 WO 2002/56910 (Hayden-Ledbetter)를 들 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,849,898호 및 EP 330,191 (Seed et al.); EP 332,865 A2 (Meyer and Weiss); 미국 특허 제4,861,579호 (Meyer et al.); US 2001/0056066 (Bugelski et al.); WO 1995/03770 (Bhat et al.); US 2003/0219433 A1 (Hansen et al.); WO 2004/035607 (Teeling et al.); US 2004/0093621 (Shitara et al.); WO 2004/103404 (Watkins et al.); WO 2005/000901 (Tedder et al.); US 2005/0025764 (Watkins et al.); WO 2005/016969 및 US 2005/0069545 A1 (Carr et al.); WO 2005/014618 (Chang et al.)을 참조한다.

리툭시마브를 사용한 요법에 관한 간행물로는 하기를 들 수 있다: [Perotta and Abuel, "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab" Abstract # 3360 Blood 10(1)(part 1-2): p. 88B (1998)]; [Perotta et al., "Rituxan in the treatment of chronic idiopathic thrombocytopaenic purpura (ITP)", Blood, 94:49 (abstract) (1999)]; [Matthews, R., "Medical Heretics" New Scientist (7 April, 2001)]; [Leandro et al., "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response" Arthritis and Rheumatism 44(9):S370 (2001)]; [Leandro et al., "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus", Arthritis and Rheumatism, 46:2673-2677 (2002)] (여기서, 2-주 기간 동안, 각각의 환자는 리툭시마브의 2회 500-mg 주입, 시클로포스파미드의 2회 750-mg 주입, 및 고-투여량 경구 코르티코스테로이드를 투여받았으며, 처치된 환자 중 2명은 각각 7개월 및 8개월에 재발하여, 상이한 프로토콜로 재처치됨); [Weide et al., "Successful long-term treatment of systemic lupus erythematosus with rituximab maintenance therapy" Lupus, 12:779-782 (2003)] (여기서, 환자는 리툭시마브 (375 mg/m² x 4, 매주 간격으로 반복됨)로 처치되고, 추가의 리툭시마브 적용은 매 5 내지 6개월마다 전달되었으며, 그 후, 유지 요법으로 매 3개월마다 리툭시마브 375 mg/m²를 투여하였고, 난치성 SLE를 갖는 제2 환자는 리툭시마브로 성공적으로 치료되었고, 유지 요법을 매 3개월마다 받고 있으며, 환자 모두는 리툭시마브 요법에 잘 반응하였음); [Edwards and Cambridge, "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rheumatology 40:205-211 (2001)]; [Cambridge et al., "B lymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritis: serial studies of immunological parameters" Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9):S1350 (2002)]; [Edwards et al., "Efficacy and safety of rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9):S197 (2002)]; [Levine and Pestronk, "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using rituximab" Neurology 52:1701-1704 (1999)]; [DeVita et al., "Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheum 46:2029-2033 (2002)]; [Hidashida et al. "Treatment of DMARD-refractory rheumatoid arthritis with rituximab." Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002]; [Tuscano, J. "Successful treatment of infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab" Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002]; ["Pathogenic roles of B cells in human autoimmunity; insights from the clinic" Martin and Chan, Immunity 20:517-527 (2004)]; [Silverman and Weisman, "Rituximab Therapy and Autoimmune Disorders, Prospects for Anti-B Cell Therapy", Arthritis and Rheumatism, 48:1484-1492 (2003)]; [Kazkaz and Isenberg, "Anti B Cell therapy (rituximab) in the treatment of autoimmune diseases", Current opinion in pharmacology, 4:398-402 (2004)]; [Virgolini and Vanda, "Rituximab in autoimmune diseases", Biomedicine & pharmacotherapy, 58:299-309(2004)]; [Klemmer et al., "Treatment of antibody mediated autoimmune disorders with a AntiCD20 monoclonal antibody Rituximab", Arthritis And Rheumatism, 48:(9): S624-S624(2003)]; [Kneitz et al., "Effective B cell depletion with rituximab in the treatment of autoimmune diseases", Immunobiology, 206:519-527 (2002)]; [Arzoo et al., "Treatment of refractory antibody mediated autoimmune disorders with an anti-CD20 monoclonal antibody (rituximab)" Annals of the Rheumatic Diseases, 61 (10), p922-4 (2002) Comment in Ann Rheum Dis. 61:863-866 (2002)]; ["Future Strategies in Immunotherapy" by Lake and Dionne, in Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (2003 by John Wiley & Sons, Inc.) 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미국 특허 출원 제2003/0068664호 (Albitar et al.)에는 리툭시마브에 대한 인간 항-키메라 항체 (HACA)를 측정하는 ELISA 분석이 기재되어 있다.

미국 특허 출원 제US 2005/0032130 A1호 (Beresini and Song)에는 치료용 항체, 예컨대 CD20 항체에 대한 중화 항체의 검출 방법이 개시되어 있다.

문헌 [Mire-Sluis et al. J. Immunol. Methods 289:1-16 (2004)]은 생명공학 생성물에 대한 숙주 항체의 검출에 사용되는 면역분석의 검출 및 최적화에 대한 권고사항을 제공한다.

홍(Hong) 등은 세포 표면 단백질 CD20에 대한 인간화 항체에 대한 간단한 정량적 간세포 및 항-개별특이형 항체 기반 ELISA를 기재한다 (문헌 [Hong et al. J Immunol Methods. 294:189-197 (2004)]).

문헌 [Wei et al, J Immunol Methods. 293:115-26 (2004)]에는 임상 연구에서 재조합 인간 에리트로포이에틴에 대한 중화 항체의 검출을 위한 세포-기반 생분석이 기재되어 있다.

레옹(Leon) 등은 비둘기 사육자에서의 항조류 항체의 검출에서 류미티스성 인자 활성에 의한 간섭을 기재한다 (문헌 [Leon et al. Clin Exp Med. 2(2):59-67 (2002); erratum in: Leon et al. Clin Exp Med. 2(3):157 (2002)]). 문헌 [Stahl et al. Vox Sang. 74(4):253-255 (1998)]은 고-역가 IgM 냉각 어글루틴으로 환자에서 IgG 동종항체를 검출하기 위한 혈청 친화도 크로마토그래피를 언급한다. 문헌 [Koper et al. Clin Cliem Lab Med. 36(1):23-28 (1998)]은 친화도 크로마토그래피를 사용한 CA125 측정에서 IgG 및 IgM 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 간섭을 정량화하였다. 크라울리 및 월터스(Crowley and Walters)는 고-성능 친화도 크로마토그래피에 의한 혈액 혈청에서의 이뮤노글로불린의 측정을 언급한다 (문헌 [Crowley and Walters J Chromatogr. 266:157-162 (1983)]).

또한, 문헌 [Maeda et al., Intl. J. Hematology 74(1):70-75 (2001)]; [Gordon et al., Blood 98(11 Part 2):228b (2001)]; [Kaminski et al., Blood 96(11 Part 1):734a (2000)]; [Shan et al., Cancer Immunology Immunotherapy 48(12):673-683 (2000)]; [Idusogie et al., Journal of Immunology 166(4):2571-2575 (2001)]; [Reff et al., Blood 83(2):435-445 (1994)]; 및 [Zaya et al., Blood 98(11 Part 2):41b (2001)]을 참조한다.

발명의 요약

본 발명은 적어도 부분적으로는 자가면역 질환, 예컨대 RA 또는 SLE를 갖는 대상체로부터의 혈청이 세포-기반 생물학적 활성 분석, 예컨대 중화 항체 분석의 성능을 간섭하는 물질(들)을 함유한다는 발견에 관한 것이다. 간섭의 문제를 다룬 다양한 방법을 시도하였고, 이뮤노글로불린 친화도 정제가 간섭을 제거하는 바람직한 방법으로서 확인되었으며, 보다 신뢰성 있는 결과가 생검에서 달성될 수 있었다.

따라서, 일 측면에서, 본 발명은

(a) 샘플을 탈지질화시키는 단계;

(b) 샘플 중의 이뮤노글로불린을 친화도 정제하는 단계;

(c) 정제된 이뮤노글로불린을 농축시키는 단계; 및

(d) 농축된 이뮤노글로불린을 세포-기반 생물학적 활성 분석에 적용하는 단계

를 포함하는, 자가면역 질환 대상체로부터의 생물학적 샘플의 처리 방법을 제공한다.

본 발명은 또한

(a) 치료용 항체 또는 면역어드헤신을 자가면역 질환을 치료할 대상체에게 투여하는 단계;

(b) 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;

(c) 생물학적 샘플 중의 이뮤노글로불린을 친화도 정제하는 단계; 및

(d) 정제된 이뮤노글로불린을 중화 항체 분석에 적용하는 단계

를 포함하는, 자가면역 질환을 갖는 대상체의 치료 방법을 제공한다.

상기 방법에 사용하기 위해, 본 발명은 또한

(a) 탈지질화 시약;

(b) 이뮤노글로불린의 친화도 정제용 완충제; 및

(c) 진단 키트의 사용자에게 상기 방법 중 하나 또는 둘다의 실시를 설명하는 취급 설명서

를 포함하는 진단 키트를 제공한다.

도 1A는 각각의 뮤린 2H7 (서열 1), 인간화 2H7.v16 변이체 (서열 2), 및 인간 카파 경쇄 아군 I (서열 3)의 가변 경쇄 도메인 (V_L)의 아미노산 서열을 비교하는 서열 정렬이다. 2H7 및 hu2H7.v16의 V_L의 CDR은 하기와 같다: CDR1 (서열 4), CDR2 (서열 5), 및 CDR3 (서열 6).

도 1B는 각각의 뮤린 2H7 (서열 7), 인간화 2H7.v16 변이체 (서열 8), 및 중쇄 아군 III의 인간 컨센서스 서열 (서열 9)의 가변 중쇄 도메인 (V_H)의 아미노산 서열을 비교하는 서열 정렬이다. 2H7 및 hu2H7.v16의 V_H의 CDR은 하기와 같다: CDR1 (서열 10), CDR2 (서열 11), 및 CDR3 (서열 12).

도 1A 및 도 1B에서, 각각의 쇄에서 CDR1, CDR2 및 CDR3은 괄호 안에 둘러싸여 있으며, 지시된 바와 같이 프레임워크 영역, 즉 FR1 내지 FR4에 플랭킹된다. 2H7은 뮤린 2H7 항체를 지칭한다. 서열의 2개의 열 사이에 있는 별표는 2개의 서열 사이에 상이한 위치를 나타낸다. 잔기 넘버링은 문헌 [Kabat et al. Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 따르며, 삽입구는 a, b, c, d 및 e로서 나타내어진다.

도 2는 카바트(Kabat) 가변 도메인 잔기 넘버링 및 유(Eu) 불변 도메인 잔기 넘버링으로 성숙 2H7.v16 및 2H7.v511 경쇄 (각각 서열 13 및 15)의 정렬을 나타낸다.

도 3은 카바트 가변 도메인 잔기 넘버링 및 Eu 불변 도메인 잔기 넘버링으로 성숙 2H7.v16 및 2H7.v511 중쇄 (각각 서열 14 및 16)의 정렬을 나타낸다.

도 4는 리툭시마브에 대한 중화 항체 (NAb) 분석으로서 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 설명한다.

도 5는 하기 샘플에 대한 NAb 분석으로서 CDC를 나타낸다: 대조군, 염소 항-리툭시마브 CDR 항체, 및 염소 항-인간 Fc 항체.

도 6은 정상적인 인간 대상체로부터의 혈청 (좌측), 및 류마티스성 관절염 (RA) 대상체로부터의 혈청 (우측)으로부터의 결과를 비교하는, CDC NAb 분석에서의 혈청 내성을 나타낸다.

도 7은 셀타이터-글로(CELLTITER-GLO)(등록상표) 발광 세포 생존력 분석, 칼세인, 락토스 데히드로게나제 (LDH), 및 알라마르 블루(ALAMAR BLUE)(상표명) (레사주린)에 대한 CDC NAb 분석으로부터의 분석 판독을 나타낸다.

도 8은 분석 판독에 대한 알라마르 블루(상표명) (레사주린) (좌측) 또는 셀타이터-글로(등록상표) (우측)를 포함하는 RA 혈청 간섭을 비교한다.

도 9는 본원에서 혈청 예비-처리에 대한 바람직한 절차를 설명한다.

도 10은 혈청 예비처리하지 않은 RA 혈청 (좌측) 및 혈청 예비처리한 RA 혈청 (우측)으로부터의 판독에 대한 혈청 예비-처리의 효과를 나타낸다.

도 11은 NAb 분석에 사용되는 세포 수 다양화의 효과를 나타낸다.

도 12는 리툭시마브 투여량 선택, NAb에 대한 감수성을 나타낸다.

도 13은 0:1 (좌측) 또는 5:1 (우측)의 NAb:리툭산 비율을 갖는 NAb 분석에서의 약물 간섭을 나타낸다.

I. 정의

달리 정의되지 않는다면, 본원에서 "생물학적 샘플"은 인간 대상체로부터 수득된 샘플을 의미한다. 대상체는 바람직하게는 자가면역 질환 대상체이다. 샘플은 환자가 치료되었을 수 있는 항체 또는 약물, 예컨대 인간 항-뮤린 항체 (HAMA), 인간 항-키메라 항체 (HACA) 또는 인간 항-인간 항체 (HAHA)에 결합하는 대상체로부터의 이뮤노글로불린을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 예를 들어 혈청, 혈장, 세포 용해물, 유액, 타액, 초자체액, 윤활액, 복막강액, 눈물, 조직 균등질을 포함할 수 있지만, 바람직하게는 혈청이다. 샘플은 약물로 치료된 대상체로부터의 것일 수 있거나 (이 경우, 샘플은 약물, 예컨대 치료용 항체 또는 면역어드헤신을 추가로 포함할 수 있음), 또는 비치료되거나 약물 비투약 대상체로부터의 것일 수 있다.

본원에서 "자가면역 질환"은 개체 자신의 조직 또는 그의 공동-격리물로부터 야기되고 그에 대해 지정된 질환 또는 장애 또는 그의 증상 또는 그로부터 결과되는 상태이다. 일 실시양태에서, 이는 정상적인 신체 조직 및 항원과 반응성인 항체의 B 세포의 생성에 의해 초래되거나, 그에 의해 악화되는 상태를 지칭한다. 다른 실시양태에서, 자가면역 질환은 자가 항원 (예를 들어, 핵 항원)으로부터의 에피토프에 대해 특이적인 자가항체의 분비에 관련된 것이다. 자가면역 질환 또는 장애의 예로는 관절염 (류마티스성 관절염, 예를 들어 급성 관절염, 만성 류마티스성 관절염, 통풍성 관절염, 급성 통풍성 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 제II형 콜라겐-유도된 관절염, 감염성 관절염, 라임(Lyme) 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 스틸(Still)병, 척추 관절염, 및 소아-발병 류마티스성 관절염, 골관절염, 만성 진행성 관절염, 변형 관절염, 원발성 만성 다발관절염, 반응성 관절염 및 강직성 척추염), 염증성 과다증식성 피부 질환, 건선, 예를 들어 플라크 건선, 물방울 건선, 농포 건선, 및 손톱의 건선, 아토피성 질환을 비롯한 아토피, 예를 들어 고초열 및 잡(Job) 증후군, 피부염, 예를 들어 접촉 피부염, 만성 접촉 피부염, 탈락 피부염, 알레르기성 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 포진상 피부염, 화폐상 피부염, 지루성 피부염, 비-특이성 피부염, 원발성 자극성 접촉 피부염, 및 아토피성 피부염, x-연관 과다 IgM 증후군, 알레르기성 안내 염증성 질환, 두드러기, 예를 들어 만성 알레르기성 두드러기 및 만성 특발성 두드러기, 예를 들어 만성 자가면역 두드러기, 근육염, 다발근육염/피부근육염, 소아 피부근육염, 독성 표피 괴사, 공피증 (전신성 공피증 포함), 경화증, 예를 들어 전신성 경화증, 다발성 경화증 (MS), 예를 들어 가시눈 MS, 원발성 진행성 MS (PPMS) 및 재발 진정 MS (RRMS), 진행성 전신성 경화증, 죽상경화증, 동맥경화증, 파종성 경화증, 실조성 경화증, 시각 신경척수염 (NMO), 염증성 장 질환 (IBD) (예를 들어, 크론(Crohn)병, 자가면역-매개된 위장관 질환, 결장염, 예를 들어 궤양성 결장염 (colitis ulcerosa), 현미경적 결장염, 아교섬유성 결장염, 폴립성 결장염, 괴사성 소장결장염 및 전층 결장염, 및 자가면역 염증성 장 질환), 장 염증, 괴저 농피증, 결절성 홍반, 원발성 경화성 담관염, 상공막염), 호흡 곤란 증후군, 예를 들어 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 수막염, 포도막 전부 또는 일부의 염증, 홍채염, 맥락막염, 자가면역 혈액학적 장애, 류마티스성 척추염, 류마티스성 윤활막염, 유전성 혈관부종, 수막염에서의 뇌신경 손상, 임신성 헤르페스, 임신성 유사천포창, 음낭 가려움증, 자가면역 미성숙 난소 기능부전, 자가면역 상태에 기인한 돌발성 난청, IgE-매개된 질환, 예를 들어 아나필락시스 및 알레르기성 및 아토피성 비염, 뇌염, 예를 들어 라스무센(Rasmussen) 뇌염 및 변연엽 및/또는 뇌간 뇌염, 포도막염, 예를 들어 전포도막염, 급성 전포도막염, 육아종성 포도막염, 비육아종성 포도막염, 수정체성 포도막염, 후포도막염, 또는 자가면역 포도막염, 신증후군이 있거나 없는 사구체신염 (GN), 예를 들어 만성 또는 급성 사구체신염, 예를 들어 원발성 GN, 면역-매개된 GN, 막 GN (막 신장병증), 특발성 막 GN 또는 특발성 막 신장병증, 막- 또는 막 증식성 GN (MPGN), 예를 들어 I형 및 II형 및 급속 진행성 GN, 증식성 신장염, 자가면역 다분비선 내분비 기능부전, 귀두염, 예를 들어 국한성 형질세포 귀두염, 귀두포피염, 중심원심성 윤상홍반, 지속성 피부이색성 홍반, 다형 홍반, 환상 육아종, 광택 태선, 층판성 비늘증, 표피박리성 과각화증, 전악성 각화증, 괴저 농피증, 알레르기 상태 및 반응, 알레르기 반응, 습진, 예를 들어 알레르기성 또는 아토피성 습진, 건조 습진, 발한장애성 습진, 및 수포성 손발바닥 습진, 천식, 예를 들어 기관지 천식 (bronchial asthma) 및 자가면역 천식, T 세포의 침윤과 관련된 상태 및 만성 염증성 반응, 외래 항원에 대한 면역 반응, 예를 들어 임신 동안의 태아 A-B-O 혈액형, 만성 폐 염증성 질환, 자가면역 심근육염, 백혈구 부착 결핍증, 루푸스, 예를 들어 루푸스 신장염, 루푸스 뇌염, 소아 루푸스, 비-신장 루푸스, 신장외 루푸스, 원반상 루푸스 및 원반상 홍반성 루푸스, 탈모성 루푸스, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) (systemic lupus erythematodes), 예를 들어 피부 SLE, 아급성 피부 SLE, 신생아 루푸스 증후군 (NLE), 및 파종상 홍반성 루푸스, 소아 발병 (I형) 당뇨병, 예를 들어 소아 인슐린-의존성 당뇨병 (IDDM), 성인 발병 당뇨병 (II형 당뇨병), 자가면역 당뇨병, 특발성 요붕증, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신장병증, 당뇨병성 대혈관 장애, 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연된 과민성과 관련된 면역 반응, 결핵, 사르코이드증, 육아종증, 예를 들어 림프종양 육아종증, 베게너 육아종증, 무과립구증, 혈관염증, 예를 들어 혈관염, 대혈관 혈관염 (예를 들어, 류마티스성 다발근육통 및 거대 세포 (다까야스(Takayasu) 동맥염), 중혈관 혈관염 (예를 들어, 가와사끼(Kawasaki)병 및 결절성 다발동맥염/결절성 동맥주위염), 현미경적 다발동맥염, 면역혈관염, CNS 혈관염, 피부혈관염, 과민성 혈관염, 괴사성 혈관염, 예를 들어 전신성 괴사성 혈관염, 및 ANCA-관련된 혈관염, 예를 들어 처크-스트라우스(Churg-Strauss) 혈관염 또는 증후군 (CSS) 및 ANCA-관련된 소혈관 혈관염, 측두 동맥염, 재생불량성 빈혈, 자가면역 재생불량성 빈혈, 쿰브스(Coombs) 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙판(Diamond Blackfan) 빈혈, 용혈성 빈혈 또는 면역 용혈성 빈혈, 예를 들어 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA), 악성 빈혈 (anemia perniciosa), 애디슨(Addison)병, 진정 적혈구계 빈혈 또는 무형성증 (PRCA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역 호중성구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 혈구누출과 관련된 질환, CNS 염증성 장애, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 기관 손상 증후군, 예를 들어 패혈증, 외상 또는 출혈에 이차적인 것들, 항원-항체 복합체-매개된 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트(Behcet)병/증후군, 캐슬맨(Castleman) 증후군, 굿패스쳐(Goodpasture) 증후군, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨(Stevens-Johnson) 증후군, 유천포창, 예를 들어 수포성 유천포창 및 피부 유천포창, 천포창 (예를 들어, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 천포창 점막 유천포창 및 홍반성 천포창), 자가면역 다발내분비병증, 라이터(Reiter)병 또는 증후군, 열 손상, 전자간증, 면역 복합 장애, 예를 들어 면역 복합 신장염, 항체-매개된 신장염, 시신경 척수염 (NMO; 데빅(Devic) 증후군으로도 공지됨), 다발신경병증, 만성 신경병증, 예를 들어 IgM 다발신경병증 또는 IgM-매개된 신경병증, 저혈소판증 (예를 들어, 심근 경색 환자에 의해 발달된 바와 같음), 예를 들어 혈전성 혈소판감소 자반증 (TTP), 수혈후 자반증 (PTP), 헤파린-유도된 저혈소판증, 및 자가면역 또는 면역-매개된 저혈소판증, 예를 들어 특발성 혈소판감소 자반증 (ITP), 예를 들어 만성 또는 급성 ITP, 공막염, 예를 들어 특발성 하공막염, 상공막염, 고환 및 난소의 자가면역 질환, 예를 들어 자가면역 고환염 및 난소염, 원발성 갑상선기능저하증, 부갑상선기능저하증, 자가면역 내분비선 질환, 예를 들어 갑상선염, 예를 들어 자가면역 갑상선염, 하지모또(Hashimoto)병, 만성 갑상선염 (하지모또 갑상선염), 또는 아급성 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 특발성 갑상선기능저하증, 그레이브(Grave)병, 다분비선 증후군, 예를 들어 자가면역 다분비선 증후군 (또는 다분비선 내분비병증 증후군), 부신생물 증후군, 예를 들어 신경계 부신생물 증후군, 예를 들어 램버트-이튼(Lambert-Eaton) 근무력증 증후군 또는 이튼-램버트(Eaton-Lambert) 증후군, 경직인 (stiff-man 또는 stiff-person) 증후군, 뇌척수염, 예를 들어 알레르기성 뇌척수염 (encephalomyelitis allergica) 및 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE), 중증 근무력증, 예를 들어 흉선종-관련된 중증 근무력증, 소뇌 변성증, 신경근육긴장증, 안구진탕 또는 안구진탕 근경련 증후군 (OMS), 및 감각 신경병증, 다초점성 운동 신경병증, 시한(Sheehan) 증후군, 자가면역 간염, 만성 간염, 루푸스양 간염, 거대-세포 간염, 만성 활동 간염 또는 자가면역 만성 활동 간염, 림프양 간질성 폐렴 (LIP), 폐쇄성 세기관지염 (비-이식) 대 NSIP, 길랑-바르(Guillain-Barre) 증후군, 버거(Berger)병 (IgA 신장병증), 특발성 IgA 신장병증, 선형 IgA 피부병, 급성 유열 호중구성 피부병, 각질하 농포성 피부병, 일과성 극세포해리 피부병, 경화증, 예를 들어 원발성 담즙성 간경화증 및 폐경화증, 자가면역 장병증 증후군, 소아지방변증, 복강 질환, 비열대 스프루 (글루텐 장병증), 난치성 스프루, 특발성 스프루, 한랭글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS; 루게릭(Lou Gehrig)병), 심장 동맥 질환, 자가면역 귀 질환, 예를 들어 자가면역 내이 질환 (AIED), 자가면역 난청, 다발연골염, 예를 들어 난치성 또는 재발성 다발연골염, 폐포 단백증, 코간(Cogan) 증후군/비매독성 사이질 각막염, 아밀로이드증, 비-암성 림프구증가증, 원발성 림프구증가증, 예를 들어 모노클로날 B 세포 림프구증가증 (예를 들어, 양성 모노클로날 감마글로불린병증 및 미확인된 중요성을 갖는 모노클로날 감마글로불린병증, MGUS), 말초 신경병증, 부신생물 증후군, 채널병증, 예를 들어 간질, 편두통, 부정맥, 근육 장애, 청력상실, 실명, 주기성 마비, 및 CNS의 채널병증, 자폐증, 염증성 근육병증, 국소성 또는 분절성 사구체경화증 (FSGS), 내분비선 안병증, 포도막망막염, 맥락망막염, 자가면역 간(hepatological) 장애, 섬유근육통, 다발성 내분비선 부전증, 슈미츠(Schmidt) 증후군, 부신염, 위선 위축, 초로성 치매, 탈수초성 질환, 예를 들어 자가면역 탈수초성 질환 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 드레슬러(Dressler) 증후군, 원형 탈모증, 전두 탈모증, CREST 증후군 (석회증, 레이노 현상, 식도 운동장애, 손발가락 경화증 및 모세혈관확장증), 남성 및 여성 자가면역 불임증 (예를 들어, 항-정자 항체에 기인함), 혼합 결합 조직 질환, 샤가스(Chagas)병, 류마티스성 열병, 재발성 유산, 농부폐, 다형 홍반, 심장절개술후 증후군, 쿠싱(Cushing) 증후군, 조류사육자폐, 알레르기성 육아종성 맥관염, 양성 림프구 맥관염, 알포트(Alport) 증후군, 폐포염, 예를 들어 알레르기성 폐포염 및 섬유화 폐포염, 간질(間質) 폐 질환, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 기생충 질환, 예를 들어 리슈만편모충증, 키파노소미아시스(kypanosomiasis), 주혈흡충증, 회충증, 아스페르길루스증, 샘프터(Sampter) 증후군, 카플랜(Caplan) 증후군, 뎅기, 심내막염, 심내막심근 섬유증, 확산 간질 폐 섬유증, 간질 폐 섬유증, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭성 섬유증, 안내염, 지속 융기 홍반, 태아 적모구증, 호산구성 근막염, 슐만(Shulman) 증후군, 펠티(Felty) 증후군, 사상충증, 섬모체염, 예를 들어 만성 섬모체염, 이시성 섬모체염, 홍채섬모체염 (급성 또는 만성), 또는 푸흐(Fuch) 섬모체염, 헤노흐-숀라인(Henoch-Schonlein) 자반증, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염, SCID, 후천성 면역 결핍증 (AIDS), 에코바이러스 감염, 패혈증, 내독혈증, 췌장염, 갑상선중독증, 파르보바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 백신화후 증후군, 선천성 풍진 감염, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 감염, 볼거리, 에반(Evan) 증후군, 자가면역 생식선 부전증, 시데남(Sydenham) 무도병, 연쇄구균후 신장염, 유비테리안(ubiterans) 혈전혈관염, 갑상선항진증, 척수 매독, 맥락막염, 거대-세포 다발근육통, 만성 과민성 폐렴, 건성 각결막염, 유행성 각막결막염, 특발성 신장염 증후군, 최소 변화 신장병증, 양성 가족성 및 허혈-재관류 손상, 장기 이식 재관류, 망막 자가면역, 관절 염증, 기관지염, 만성 폐쇄성 기도/폐 질환, 규폐증, 아프타, 아프타성 구내염, 동맥경화 장애, 무정액증(aspermiogenese), 자가면역 용혈, 뵈크(Boeck)병, 한랭글로불린혈증, 두피트랑(Dupuytren) 구축, 수정체과민 안내염, 알레르기성 장염, 나병 결절 홍반, 특발성 안면 마비, 만성 피로 증후군, 류마티스성 열병, 하만-리히(Hamman-Rich)병, 감각신경성 난청, 발작성 혈색소뇨증, 생식선기능저하증, 항문부 회장염, 백혈구감소증, 전염성 단핵구증, 횡단 척수염, 원발성 특발성 점액부종, 신장증, 교감신경 안염, 육아종성 고환염, 췌장염, 급성 다발신경근염, 괴저 농피증, 퀘르뱅(Quervain) 갑상선염, 후천성 척추 위축증, 비-악성종양 흉선종, 백반증, 독성-쇼크 증후군, 식중독, T 세포의 침윤과 관련된 상태, 백혈구-부착 결핍증, 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연된 과민성과 관련된 면역 반응, 백혈구 혈구누출과 관련된 질환, 다발성 기관 손상 증후군, 항원-항체 복합체-매개된 질환, 항사구체 기저막 질환, 알레르기성 신경염, 자가면역 다발내분비병증, 난소염, 원발성 점액부종, 자가면역 위축성 위염, 교감성 안염, 류마티스성 질환, 혼합 결합 조직 질환, 신증후군, 췌도염, 다발내분비 부전증, 자가면역 다분비선 증후군 I형, 성인-발병 특발성 부갑성선기능저하증 (AOIH), 심근병증, 예를 들어 확장 심근병증, 전두 탈모증, 확장 심근병증, 후천성 수포성 표피박리증 (EBA), 혈색소증, 심근염, 신증후군, 원발성 경화성 담관염, 화농 또는 비화농 부비동염, 급성 또는 만성 부비동염, 벌집뼈, 이마, 상악, 또는 나비뼈 부비동염, 호산구-관련된 장애, 예를 들어 호산구증가증, 폐 침윤 호산구증가증, 호산구증가-근육통 증후군, 로플러(Loffler) 증후군, 만성 호산구성 폐렴, 열대성 호산구성 폐렴, 기관지폐 아스페르길루스증, 아스페르길루스종, 또는 호산구 함유 육아종, 아나필락시스, 혈청반응음성 척추관절염증, 다발내분비 자가면역 질환, 경화성 담관염, 공막, 상공막, 만성 점막피부 칸디다증, 브루톤(Bruton) 증후군, 유아기의 일시적 저감마글로불린혈증, 위스코트-알드리히(Wiskott-Aldrich) 증후군, 모세혈관확장성 운동실조증, 콜라겐 질환과 관련된 자가면역 장애, 류마티즘, 신경계 질환, 림프절염, 혈압 반응의 감소, 혈관 기능이상, 조직 손상, 심혈관 허혈, 통각과민, 신장 허혈, 뇌 허혈, 및 혈관신생 합병증, 알레르기성 과민성 장애, 사구체신염증, 재관류 손상, 허혈성 재관류 장애, 심근 또는 다른 조직의 재관류 손상, 림프종성 기관지염, 염증성 피부병, 급성 염증성 성분을 갖는 피부병, 다발성 장기 기능부전, 수포성 질환, 신장 피질 괴사, 급성 화농성 수막염 또는 기타 중추 신경계 염증성 장애, 안구 및 안와 염증성 장애, 과립구 수혈-관련된 증후군, 사이토킨-유도된 독성, 기면증, 급성 중증 염증, 만성 난치성 염증, 신우염, 말단동맥 증식증, 소화 궤양, 판막염 및 자궁내막증을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에서 "대상체"는 인간 대상체이다.

본원에서 "자가면역 질환 대상체"는 자가면역 질환을 갖거나 자가면역 질환으로 발달할 위험이 있는 대상체이다.

본원에서 "탈지질화"는 혈청과 같은 생물학적 샘플로부터 지질을 제거하는 것으로 의도된다. 탈지질화는 샘플에 존재할 수 있고 정제 컬럼을 차단하거나 막을 수 있는 지질을 제거하기 위해 요망된다. 탈지질화는 흡수제 (예컨대, 리포소르브(LIPOSORB)(등록상표)); 소르비탄 에스테르/폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르)의 사용, 유기 추출, 여과, 원심분리 등을 비롯한 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다.

"친화도 정제"는 정제될 화합물 또는 조성물 (예를 들어, Fc 영역-함유 폴리펩티드)에 선택적으로 또는 선호적으로 결합하는, 바람직하게는 고정된 흡수제의 사용으로 의도된다. 그 예로는 단백질 A + G 정제; IgG 친화도 정제 (예를 들어, 멜론 겔(MELON GEL)(상표명) (피어스(Pierce) 제품)을 사용); 항이뮤노글로불린 항체 (단독으로, 또는 하나 이상의 동종형에 대한 특이성과 조합으로 사용됨; 예를 들어, 각각의 동종형의 특이적 친화도 정제에 대해 결합된, 항-인간 IgG, IgA, IgM 및 IgE의 조합물); 이뮤노글로불린 결합 특성을 갖는 임의의 다른 흡수제 (예를 들어, 피어스 T-겔(PIERCE T-GEL)(상표명))를 들 수 있다. 본원에서 바람직한 친화도 정제 방법은 단백질 A + G 친화도 정제 (하기 정의 참조)를 사용하여 생물학적 샘플의 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체 동종형을 정제하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 본원에서 친화도 정제는 본질적으로 모든 동종형의 Fc 영역-함유 폴리펩티드를 정제한다.

본원에서 "Fc 영역-함유 폴리펩티드"는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드의 예로는 치료용 항체, 면역어드헤신, 및 대상체로부터의 이뮤노글로불린 (대상체의 항-약물 이뮤노글로불린 포함)을 들 수 있다.

본원에서 "흡착제"는 임의의 공유 결합 없이 다른 물질을 그의 표면에 부착시킬 수 있는 물질 또는 조성물이다. 바람직하게는, 흡착제는 고정된다.

"고정된" 흡착제는 고체상에 부착된 것이다.

"고체상"은 흡착제가 부착될 수 있는 비-수성 매트릭스를 의미한다. 본원에서 대상의 고체상은 일반적으로 유리, 실리카, 아가로스 또는 폴리스티렌 표면을 포함하는 것이다. 고체상은 예를 들어 정제 컬럼 또는 별개의 입자의 비연속상을 포함할 수 있다.

본원에서 "단백질 A + G 친화도 정제"는 바람직하게는 고체상에 고정된 그의 단편 및/또는 융합물을 포함하는 단백질 A 및 단백질 G를 사용하여 샘플로부터 이뮤노글로불린 또는 Fc 영역-함유 폴리펩티드를 제거하는 것을 지칭한다. 이러한 정제는 본질적으로 동시성 단백질 A 및 단백질 G 정제, 뿐만 아니라 임의의 순서의 순차적 정제 (즉, 단백질 A 후에 단백질 G, 및 그의 역)를 포함한다.

본원에서 "농축"은 대상의 화합물 또는 조성물의 농도를 증가시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 샘플 중의 이뮤노글로불린의 농도는 농축기 (예컨대, 피어스 아이콘(Pierce ICON)(등록상표) 단백질 농축기, 또는 센트리콘(CENTRICON)-30(상표명)), 원심분리, 여과 등을 이용하여 증가될 수 있다.

"생물학적 활성"이라는 표현은 작용제, 예컨대 본원에서 치료용 항체 또는 면역어드헤신의 측정가능한 기능을 지칭한다. 다양한 활성이 고려되며, 보체-의존성 세포독성 (CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 아폽토시스, 이온 채널 조절, 세포 (예를 들어, 치료용 항체 또는 면역어드헤신이 결합할 수 있는 항원을 발현하는 세포)의 성장 억제 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

"생물학적 활성 분석"은 작용제 또는 조성물, 예컨대 치료용 항체 또는 면역어드헤신의 생물학적 활성을 평가하는 분석을 지칭한다.

본원에서, "세포-기반" 분석은 세포주를 비롯한 세포를 이용하여 작용제 또는 조성물, 예컨대 치료용 항체 또는 면역어드헤신의 생물학적 활성을 평가하는 생분석이다. 바람직하게는, 분석에 사용되는 세포 또는 세포주는 치료용 항체 또는 면역어드헤신이 결합하는 항원을 발현한다.

생물학적 샘플 (예비처리된 샘플 또는 정제된 이뮤노글로불린 제제 포함)이 길항제 또는 항체의 생물학적 활성을 "차단하는" 능력은 상기 활성의 부분적 차단 또는 완전한 차단 둘다를 지칭한다.

본원에서 "중화 항체"는 대상의 항원에 결합하는 항체 (예를 들어, 치료용 항체 또는 면역어드헤신) 뿐만 아니라 상기 항원의 생물학적 활성을 일정 정도로 억제하는 항체를 지칭한다.

본원에서, "중화 항체 분석"은 샘플 중의 중화 항체의 존재를 평가하는 분석이다.

본원에서 "간섭"은 세포-기반 생물학적 활성 분석, 예컨대 중화 항체 분석의 재현성을 간섭하는 화합물(들) 또는 조성물(들)의 존재를 지칭한다. 샘플 중의 산섭의 존재는 예를 들어 생분석이 수행되어야 할 표적 집단으로부터의 약물 비투약 자가면역 대상체로부터의 혈청을 분석함으로써 수행될 수 있다. 분석이 상기 개체 사이에 매우 다양한 세포 반응을 입증할 경우, 혈청 간섭이 하나 이상의 샘플에 존재한다고 결론내릴 수 있다. 바람직하게는, 간섭은 류마티스성 인자 (RF), 이뮤노글로불린, 또는 대상체를 치료하는 약물이 아니다.

"B-세포"는 골수 내에서 성숙하는 림프구이며, 천연 B 세포, 기억 B 세포, 또는 효과기 B 세포 (형질 세포)를 들 수 있다. 본원에서 B 세포는 정상적인 또는 비-악성 B 세포일 수 있다.

본원에서 "B-세포 표면 마커" 또는 "B-세포 표면 항원"은 그에 결합하는 길항제 또는 항체로 표적화될 수 있는 B 세포의 표면 상에 발현되는 항원이다. 예시적인 B-세포 표면 마커로는 CD1O, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 및 CD86 림프구 표면 마커 (설명에 대해서는, 문헌 [The Leukocyte Antigen Facts Book, 2^nd Edition. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co., New York] 참조)를 들 수 있다. 다른 B-세포 표면 마커로는 RP105, FcRH2, B-세포 CR2, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRH1, IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCMA, 및 239287을 들 수 있다. 특정한 대상의 B-세포 표면 마커는 대상체의 다른 비-B 세포 조직에 비해 B 세포 상에 선호적으로 발현되며, 전구체 B 세포 및 성숙 B 세포 둘다 상에 발현될 수 있다. 본원의 목적에 바람직한 B-세포 표면 마커는 CD20, CD22, 및 BR3이다.

"CD20" 항원, 또는 "CD20"은 말초 혈액 또는 림프양 기관으로부터의 B 세포의 90％ 초과의 표면 상에서 발견되는 약 35-kDa의 비-글리코실화된 인단백질이다. CD20은 정상적인 B 세포 뿐만 아니라 악성 B 세포 둘다에 존재하지만, 줄기 세포 상에서는 발현되지 않는다. 문헌상 CD20에 대한 다른 명칭으로는 "B-림프구-제한된 항원" 및 "Bp35"를 들 수 있다. CD20 항원은 예를 들어 문헌 [Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:1766 (1985)]에 기재되어 있다.

"B-세포 표면 마커 길항제"는 B 세포 상의 B-세포 표면 마커에 결합시 대상체에서 B 세포를 파괴하거나 고갈시키고/거나, 예를 들어 B 세포에 의해 발휘되는 체액성 반응을 감소시키거나 방지함으로써 하나 이상의 B 세포 기능을 간섭하는 분자이다. 길항제는 바람직하게는 그것으로 치료되는 대상체에서 B 세포를 고갈 (즉, 순환 B 세포 수준을 감소)시킬 수 있다. 이러한 고갈은 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC), B 세포 증식의 억제 및/또는 B 세포 사멸의 유도 (예를 들어, 아폽토시스를 통해)와 같은 다양한 메카니즘을 통해 달성될 수 있다. 본 발명의 범위 내에 포함되는 길항제는 임의로 세포독성제와 접합되거나 그에 융합되는, 항체, 합성 또는 천연-서열 펩티드, 면역어드헤신, 및 B-세포 표면 마커에 결합하는 소-분자 길항제, 예컨대 CD20를 포함한다. 바람직한 길항제는 항체를 포함한다.

본원에서 "CD20 항체 길항제"는 B 세포 상의 CD20에 결합시 대상체에서 B 세포를 파괴하거나 고갈시키고/거나, 예를 들어 B 세포에 의해 발휘되는 체액성 반응을 감소시키거나 방지함으로써 하나 이상의 B 세포 기능을 간섭하는 항체이다. 항체 길항제는 바람직하게는 그것으로 치료되는 대상체에서 B 세포를 고갈 (즉, 순환 B-세포 수준을 감소)시킬 수 있다. 이러한 고갈은 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC), B 세포 증식의 억제 및/또는 B 세포 사멸의 유도 (예를 들어, 아폽토시스를 통해)와 같은 다양한 메카니즘을 통해 달성될 수 있다.

본원에서 "B 세포 고갈"은 처치 전의 수준에 비해 일반적으로 약물 또는 항체 처치 후에 동물 또는 인간에서의 B 세포 수준의 감소를 지칭한다. B 세포 고갈은 부분적이거나 완전할 수 있다. B 세포 수준은 널리 공지된 기술, 예컨대 문헌 [Reff et al., Blood 83:435-445 (1994)] 또는 미국 특허 제5,736,137호 (Anderson et al.)에 기재된 것들을 이용하여 측정가능하다. 예로서, 포유통물 (예를 들어, 통상적인 영장류)는 항체 또는 면역어드헤신의 다양한 투여량으로 처치될 수 있으며, 말초 B-세포 농도는 예를 들어 B 세포를 계수하는 FACS 방법에 의해 측정될 수 있다.

CD20 항체의 예로는 현재 "리툭시마브" ("리툭산(등록상표)")으로 지칭되는 "C2B8" (미국 특허 제5,736,137호); "Y2B8" 또는 아이덱 파마슈티칼스, 인크.(IDEC Pharmaceuticals, Inc.)에서 시판되는 "이브리투모마브 티욱세탄(Ibritumomab Tiuxetan)" (제발린(ZEVALIN)(등록상표))으로 지칭되는 이트륨-[90]-표지된 2B8 뮤린 항체 (미국 특허 제5,736,137호); 1993년 6월 22일자로 ATCC에 수탁 번호 HB11388로 기탁된 2B8; 코릭사(Corixa)에서 시판되는 임의로 ¹³¹I로 표지되어 "131I-B1" 또는 "요오드 I131 토시투모마브" 항체 (벡사르(BEXXAR)(상표명))를 생성하는, "토시투모마브(Tositumomab)"로도 지칭되는 뮤린 IgG2a "B1" (또한 미국 특허 제5,595,721호 참조); 뮤린 모노클로날 항체 "1F5" ([Press et al. Blood 69(2):584-591 (1987)] 및 "프레임워크 패치된" 또는 인간화 1F5를 비롯한 그의 변이체 (WO 2003/002607, Leung, S.; ATCC 기탁 HB-96450); 뮤린 2H7 및 키메라 2H7 항체 (미국 특허 제5,677,180호); 인간화 2H7 (WO 2004/056312, Lowman et al.) 및 하기 설명된 바와 같음); 휴맥스-CD20(상표명) 완전 인간 항체 (젠맵(Genmab), 덴마크; 예를 들어, [Glennie and van de Winkel, Drug Discovery Today 8:503-510 (2003)] 및 [Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003)] 참조); WO 2004/035607 (Teeling et al.)에 설명된 인간 모노클로날 항체; US 2004/0093621 (Shitara et al.)에 기재된, Fc 영역에 결합된 복합 N-글리코시드-연결된 당 쇄를 갖는 항체; WO 2004/103404 (Watkins et al., 어플라이드 몰리큘라 에볼루션)에 설명된 바와 같은, 항체의 AME 계열과 같은 CD20 결합 분자, 예를 들어 AME-133(TM) 항체; A20 항체 또는 키메라 또는 인간화 A20 항체와 같은 그의 변이체 (각각 cA20, hA20) (US 2003/0219433, 이뮤노메딕스(Immunomedics)); 및 인터내셔날 류코사이트 타이핑 워크샵(International Leukocyte Typing Workshop)에서 이용가능한 모노클로날 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2 ([Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)]); 1H4 (문헌 [Haisma et al. Blood 92:184 (1998)]); 항-CD20 아우리스타틴 E 접합체 (시애틀 제네틱스(Seattle Genetics)); 항-CD20-IL2 (EMD/바이오베이션(Biovation)/호프 오브 시티); 항-CD20 MAb 요법 (에피사이트(EpiCyte)); 항-CD20 항체 TRU 015 (트루비온(Trubion))를 들 수 있다. 본원에서 바람직한 CD20 항체는 키메라, 인간화, 또는 인간 CD20 항체, 보다 바람직하게는 리툭시마브, 인간화 2H7, 2F2 (Humax-CD20) 인간 CD20 항체 (젠맵), 및 인간화 A20 또는 이뮨(IMMUN)-106 항체 (이뮤노메딕스)이다.

본원에서 용어 "리툭시마브" 또는 "리툭산(등록상표)"은 미국 특허 제5,736,137호에서 "C2B8"로 지칭된, CD20 항원에 대한 유전학적으로 조작된 키메라 뮤린/인간 모노클로날 항체, 및 CD20에 결합하는 능력을 보유하는 그의 단편을 지칭한다.

순수하게 본원의 목적상, 그리고 달리 지시되지 않는다면, "인간화 2H7" 항체는 뮤린 2H7 항체의 인간화 변이체이며, 항체는 생체내에서 순환 B 세포를 감소시키는데 효과적이다.

일 실시양태에서, 인간화 2H7 항체는 하기 CDR 서열 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함한다:

CDR L1 서열 RASSSVSYXH (여기서, X는 M 또는 L (서열 21), 예를 들어 서열 4 (도 1A)임),

서열 5 (도 1A)의 CDR L2 서열,

CDR L3 서열 QQWXFNPPT (여기서, X는 S 또는 A (서열 22), 예를 들어 서열 6 (도 1A)임),

서열 10 (도 1B)의 CDR H1 서열,

CDR H2 서열 AIYPGNGXTSYNQKFKG (여기서, X는 D 또는 A (서열 23), 예를 들어 서열 11 (도 1B)임), 및

CDR H3 서열 VVYYSXXYWYFDV (여기서, 위치 6에서의 X는 N, A, Y, W 또는 D이고, 위치 7에서의 X는 S 또는 R (서열 24), 예를 들어 서열 12 (도 1B)임).

상기 CDR 서열은 일반적으로 인간 가변 경쇄 및 가변 중쇄 프레임워크 서열, 예컨대 실질적으로 인간 경쇄 카파 아군 I (V_LκI)의 인간 컨센서스 FR 잔기, 및 실질적으로 인간 중쇄 아군 III (V_HIII)의 인간 컨센서스 FR 잔기 내에 존재한다. 또한, WO 2004/056312 (Lowman et al.)를 참조한다.

가변 중쇄 영역은 인간 IgG 쇄 불변 영역에 결합될 수 있으며, 여기서 영역은 예를 들어 천연 서열 및 변이체 불변 영역을 포함하는 IgG1 또는 IgG3일 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 이러한 항체는 임의로 가변 경쇄 도메인 서열 (v16, 도 1A에 나타난 바와 같음)을 포함하는, 서열 8의 가변 중쇄 도메인 서열 (v16, 도 1B에 나타난 바와 같음)을 포함하며, 임의로 가변 중쇄 도메인에서 위치 56, 100, 및/또는 100a에서의 하나 이상의 아미노산 치환(들), 예를 들어 D56A, N1OOA 또는 N1OOY, 및/또는 S1OOaR, 가변 경쇄 도메인에서 위치 32 및/또는 92에서의 하나 이상의 아미노산 치환(들), 예를 들어 M32L 및/또는 S92A를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 서열 13 또는 15의 경쇄 아미노산 서열, 및 서열 14, 16, 17 또는 20의 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 무손상 항체이다.

바람직한 인간화 2H7 항체는 오크렐리주마브 (제넨테크)이다.

본원에서 항체는 ADCC 활성을 개선시키는 Fc 영역 내의 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대 중쇄 잔기의 EU 넘버링을 이용하여 아미노산 치환이 위치 298, 333, 및 334, 바람직하게는 S298A, E333A, 및 K334A에 있는 것을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 미국 특허 제6,737,056B1호 (Presta)를 참조한다.

임의의 상기 항체는 FcRn 결합 또는 혈청 반감기를 개선시키는 Fc 영역 내의 하나 이상의 치환, 예를 들어 중쇄 위치 434에서의 치환, 예컨대 N434W를 포함할 수 있다. 또한, 미국 특허 제6,737,056B1호 (Presta)를 참조한다.

임의의 상기 항체는 적어도 위치 326에서의 치환을 포함하는, CDC 활성을 증가시키는 Fc 영역 내의 하나 이상의 아미노산 치환, 바람직하게는 K326A 또는 K326W를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 미국 특허 제6,528,624B1호 (Idusogie et al.)를 참조한다.

일부 바람직한 인간화 2H7 변이체는 (존재할 경우) Fc 영역 내의 치환이 있거나 없는 것들을 비롯한 서열 2의 가변 경쇄 도메인 및 서열 8의 가변 중쇄 도메인을 포함하는 것들, 및 서열 8에 변경 N1OOA; 또는 D56A 및 N1OOA; 또는 D56A, N1OOY, 및 S1OOaR을 갖는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 2에 변경 M32L; 또는 S92A; 또는 M32L 및 S92A를 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하는 것들이다.

2H7.v16의 가변 중쇄에서 M34는 항체 안정성의 잠재적 원천으로 확인되었으며, 치환을 위한 또다른 잠재적인 후보이다.

본 발명의 일부 다양한 바람직한 실시양태의 요약에서, 2H7.v16에 기반한 변이체의 가변 영역은 하기 표 1에 지시된 아미노산 치환의 위치를 제외하고 v16의 아미노산 서열을 포함한다. 달리 지시되지 않는다면, 2H7 변이체는 v16과 동일한 경쇄를 가질 것이다.

한 가지 바람직한 인간화 2H7은 2H7.v16 가변 경쇄 도메인 서열:

및 2H7.v16 가변 중쇄 도메인 서열:

을 포함한다.

인간화 2H7.v16 항체가 무손상 항체일 경우, 이는 경쇄 아미노산 서열:

및 서열 14 또는

의 중쇄 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또다른 바람직한 인간화 2H7 항체는 2H7.v511 가변 경쇄 도메인 서열:

및 2H7.v511 가변 중쇄 도메인 서열:

을 포함한다.

인간화 2H7.v511 항체가 무손상 항체일 경우, 이는 경쇄 아미노산 서열:

및 서열 16 또는

의 중쇄 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본원의 목적상, "면역요법"은 항체로 포유통물 (바람직하게는, 인간 환자)를 치료하는 방법을 지칭할 것이며, 여기서 항체는 비접합되거나 "네이키드" 항체일 수 있거나, 항체는 이종 분자(들) 또는 작용제(들), 예컨대 하나 이상의 세포독성제(들)과 접합되거나 융합되어 "면역접합체"를 생성할 수 있다.

본원에 사용된 "치료용 항체"는 질환 또는 장애를 갖거나 그에 걸리기 쉬운 포유통물에서 질환 또는 장애 (바람직하게는, 자가면역 질환)를 치료하는데 효과적인 항체이다. 예시적인 치료용 항체로는 HER2 항체, 예컨대 트라스투주마브 (헤르셉틴(HERCEPTIN)(등록상표) (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992)], 미국 특허 제5,725,856호) 및 페르투주마브 (옴니타르그(OMNITARG)(상표명) (WO 01/00245); CD20 항체 (하기 참조); IL-8 항체 (문헌 [St John et al., Chest, 103:932 (1993)], 및 국제 공개 WO 95/23865); VEGF 또는 VEGF 수용체 항체, 예컨대 인간화 및/또는 친화도 성숙된 VEGF 인간화 항체, 예컨대 인간화 VEGF 항체 huA4.6.1 베바시주마브 (아바스틴(AVASTIN)(등록상표) 및 라니비주마브 (루센티스(LUCENTIS)(등록상표) (문헌 [Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992)], 국제 공개 WO 96/30046, 및 WO 98/45331, 1998년 10월 15일자로 공개됨); PSCA 항체 (WO 01/40309); CD1 Ia 항체, 예컨대 에팔리주마브 (랍티바(RAPTIVA)(등록상표) (미국 특허 제5,622,700호 WO 98/23761, 문헌 [Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991)], 및 [Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)]); IgE에 결합하는 항체, 예컨대 오말리주마브 (졸레어(XOLAIR)(등록상표) (문헌 [Presta et al., J. Immunol 151:2623-2632 (1993)], 및 국제 공개 WO 95/19181;미국 특허 제5,714,338호, 1998년 2월 3일자로 허여됨, 또는 미국 특허 제5,091,313호, 1992년 2월 25일자로 허여됨, WO 93/04173, 1993년 3월 4일자로 공개됨, 또는 국제 출원 PCT/US98/13410, 1998년 6월 30일자로 출원됨, 미국 특허 제5,714,338호); CD18 항체 (미국 특허 제5,622,700호, 1997년 4월 22일자로 허여됨, 또는 WO 97/26912, 1997년 7월 31일자로 공개됨); Apo-2 수용체 항체 항체 (WO 98/51793, 1998년 11월 19일자로 공개됨); 조직 인자 (TF) 항체 (유럽 특허 제0420 937 B1호, 1994년 11월 9일자로 허여됨); α₄-α₇ 인테그린 항체 (WO 98/06248, 1998년 2월 19일자로 공개됨); EGFR 항체 (예를 들어, 키메라 또는 인간화 225 항체, 세툭시마브, 에르부틱스(ERBUTIX)(등록상표), WO 96/40210, 1996년 12월 19일자로 공개됨); CD3 항체, 예컨대 OKT3 (미국 특허 제4,515,893호, 1985년 7월 5일자로 허여됨); CD25 또는 Tac 항체, 예컨대 CHI-621 (시물렉트(SIMULECT)(등록상표) 및 제나팍스(ZENAPAX)(등록상표) (미국 특허 제5,693,762호, 1997년 12월 2일자로 허여됨); CD4 항체, 예컨대 cM-7412 항체 (문헌 [Choy et al. Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)]); CD52 항체, 예컨대 캄패스-1H (엘렉스(ELEX)/베를렉스(Berlex)) (문헌 [Riechmann et al. Nature 332:323-337 (1988)]); Fc 수용체 항체, 예컨대 FcγRI에 대한 M22 항체 (문헌 [Graziano et al. J. Immunol 155(10):4996-5002 (1995)]); 암종배아 항원 (CEA) 항체, 예컨대 hMN-14 (문헌 [Sharkey et al. Cancer Res. 55(23Suppl):5935s-5945s (1995)]); 유방 내피 세포에 대한 항체 (huBrE-3, hu-Mc 3 및 CHL6 (문헌 [Ceriani et al. Cancer Res. 55(23):5852s-5856s (1995)]; 및 [Richman et al. Cancer Res. 55(23 Supp):5916s-5920s (1995)]) 포함); 결장 암종 세포에 결합하는 항체, 예컨대 C242 (문헌 [Litton et al. Eur J. Immunol. 26(1):1-9 (1996)]); CD38 항체, 예컨대 AT 13/5 (문헌 [Ellis et al. J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)]); CD33 항체, 예컨대 Hu M195 (문헌 [Jurcic et al. Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995)]) 및 CMA-676 또는 CDP771; EpCAM 항체, 예컨대 17-1A (파노렉스(PANOREX)(등록상표)); GpIIb/IIIa 항체, 예컨대 아브식시마브 또는 c7E3 Fab (레오프로(REOPRO)(등록상표)); RSV 항체, 예컨대 MEDI-493 (시나지스(SYNAGIS)(등록상표)); CMV 항체, 예컨대 프로토비어(PROTOVIR)(등록상표); HIV 항체, 예컨대 PRO542; 간염 항체, 예컨대 Hep B 항체 오스타비어(OSTAVIR)(등록상표); CA 125 항체 오바렉스(OvaRex); 개별특이형 GD3 에피토프 항체 BEC2; αvβ3 항체 (예를 들어, 비탁신(VITAXIN)(등록상표); 메드이뮨(Medimmune)); 인간 신장 세포 암종 항체, 예컨대 ch-G250; ING-I; 항-인간 17-1A 항체 (3622W94); 항-인간 결장직장 종양 항체 (A33); GD3 갱글리오시드에 대한 항-인간 흑색종 항체 R24; 항-인간 편평-세포 암종 (SF-25); 인간 백혈구 항원 (HLA) 항체, 예컨대 Smart ID1O 및 항-HLA DR 항체 온코라임 (Lym-1); CD37 항체, 예컨대 TRU 016 (트루비온(Trubion)); IL-21 항체 (지모제네틱스(Zymogenetics)/노보 노르디스트(Novo Nordisk)); 항-B 세포 항체 (임페론(Impheron)); B 세포 표적화 MAb (이뮤노젠(Immunogen)/아벤티스(Aventis)); 1D09C3 (모르포시스(Morphosys)/GPC); 림포래드(LymphoRad) 131 (HGS); Lym-1 항체, 예컨대 Lym-1Y-90 (USC) 또는 항-Lym-1 온코라임 (USC/페레그린(Peregrine)); LIF 226 (인핸스드 라이프사이언스(Enhanced Lifesci.)); BAFF 항체 (예를 들어, WO 03/33658); BAFF 수용체 항체 (예를 들어, WO 02/24909); BR3 항체; Blys 항체, 예컨대 벨리무마브; 림포스타트(LYMPHOSTAT)-B(상표명); ISF 154 (UCSD/로슈(Roche)/트라겐(Tragen)); 고밀릭시마 (아이덱(Idec) 152; 바이오젠 아이덱(Biogen Idec)); IL-6 수용체 항체, 예컨대 아틀리주마브 (악템라(ACTEMRA)(상표명); 추가이(Chugai)/로슈); IL-15 항체, 예컨대 HuMax-Il-15 (젠맵/암젠(Amgen)); 케모카인 수용체 항체, 예컨대 CCR2 항체 (예를 들어, MLN1202; 밀레니엄(Millieneum)); 항-보체 항체, 예를 들어 C5 항체 (예를 들어, 에쿨리주마브, 5G1.1; 알렉시온(Alexion)); 인간 이뮤노글로불린의 경구 제제 (예를 들어, IgPO; 프로테인 테라퓨틱스(Protein Therapeutics)); IL-12 항체, 예컨대 ABT-874 (CAT/애보트(Abbott)); 테넬릭시마브 (BMS-224818; BMS); CD40 항체, 예컨대 S2C6 및 그의 인간화 변이체 (WO00/75348) 및 TNX 100 (키론(Chiron)/타녹스(Tanox)); TNF-α 항체, 예컨대 cA2 또는 인플릭시마브 (레미케이드(REMICADE)(등록상표)), CDP571, MAK-195, 아달리무마브 (후미라(HUMIRA)(상표명)), 페길화 TNF-α 항체 단편, 예컨대 CDP-870 (셀테크(Celltech)), D2E7 (놀(Knoll)), 항-TNF-α 폴리클로날 항체 (예를 들어, PassTNF; 베리겐(Verigen)); CD22 항체, 예컨대 LL2 또는 에프라투주마브 (림포시드(LYMPHOCIDE)(등록상표); 이뮤노메딕스), 예컨대 에프라투주마브 Y-90 및 에프라트주마브 1-131, 아비오겐의 CD22 항체 (아비오겐, 이탈리아), CMC 544 (와이어스(Wyeth)/셀테크), 콤보톡스 (UT 사우트웨스턴(Soutwestern)), BL22 (NIH), 및 림포스캔(LympoScan) Tc99 (이뮤노메딕스)를 들 수 있다. 바람직하게는, 본원에서 치료용 항체는 자가면역 질환, 예컨대 RA 및/또는 SLE의 치료에 유용한 네이키드, 무손상 항체이다.

본원에 사용된 용어 "면역어드헤신"은 이종 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성과 이뮤노글로불린 불변 도메인의 효과기 기능을 조합한 분자를 지칭한다. 구조적으로, 면역어드헤신은 아미노산 서열이 항체의 항원 인식 및 결합 부위 이외의 것인 (즉, "이종"인) 목적하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열, 및 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열 (예를 들어, IgG의 CH2 및/또는 CH3 서열)의 융합을 포함한다. 예시적인 어드헤신 서열은 대상의 단백질에 결합하는 수용체 (본원에서 "리간드 결합 도메인") 또는 리간드 (본원에서 "수용체 결합 도메인")의 일부분을 포함하는 연속적인 아미노산 서열을 포함한다. 어드헤신 서열은 또한 대상의 단백질에 결합하지만 수용체 또는 리간드 서열은 아닌 서열 (예를 들어, 펩티바디에서의 어드헤신 서열)을 포함한다. 이러한 폴리펩티드 서열은 다양한 방법에 의해 선택되거나 확인될 수 있으며, 파지 제시 기술 및 고처리량 분류 방법을 들 수 있다.

본원에 사용된 "리간드 결합 도메인"은 임의의 천연 세포-표면 수용체 또는 상응하는 천연 수용체의 적어도 정성적인 리간드 결합 능력을 보유하는 그의 임의의 영역 또는 유도체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 수용체는 이뮤노글로불린 상유전자과의 구성원과 동종인 세포외 도메인을 갖는 세포-표면 폴리펩티드로부터의 것이다. 이뮤노글로불린 상유전자과의 구성원이 아니지만 그럼에도 불구하고 상기 정의에 의해 구체적으로 포괄되는 다른 수용체는 사이토킨에 대한 수용체, 특히 티로신 키나제 활성을 갖는 수용체 (수용체 티로신 키나제), 헤마토포이에틴 및 신경 성장 인자 수용체 상과의 구성원, 및 세포 부착 분자, 예를 들어 (E-, L- 및 P-) 셀렉틴이다.

용어 "수용체 결합 도메인"은 세포 부착 분자를 비롯한, 수용체에 대한 임의의 천연 리간드, 또는 상응하는 천연 리간드의 적어도 정성적인 수용체 결합 능력을 보유하는 이러한 천연 리간드의 임의의 영역 또는 유도체를 지칭하는데 사용된다. 상기 정의는 다른 것들 중에서도 특히 상기 언급된 수용체에 대한 리간드로부터의 결합 서열을 포함한다.

"항체-면역어드헤신 키메라"는 하나 이상의 항체 결합 도메인 (본원에서 정의된 바와 같음)과 하나 이상의 면역어드헤신 (본 출원에서 정의된 바와 같음)를 조합한 분자를 포함한다. 예시적인 항체-면역어드헤신 키메라는 문헌 [Berg et al., PNAS (USA) 88:4723-4727 (1991)] 및 [Chamow et al., J. Immunol. 153:4268 (1994)]에 기재된 이중특이적 CD4-IgG 키메라이다.

본원에서 대상체의 "치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 수단 둘다를 지칭한다. 치료가 필요한 것은 이미 질환을 갖는 것 뿐만 아니라 질환이 예방되어야 할 것도 포함한다. 따라서, 대상체는 질환을 갖는 것으로 진단되었을 수 있거나, 질환에 걸리기 쉽거나 감수성일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는 방지적 (예를 들어, 예방적), 고식적 및 치료적 처치를 포함한다.

"유효량"이라는 표현은 질환의 예방, 경감 또는 치료에 효과적인 약물 (예컨대, 항체 또는 면역어드헤신)의 양을 지칭한다. 이러한 유효량은 일반적으로 질환의 징후 또는 증상의 개선을 초래할 것이다.

부가 요법을 위해 본원에 사용된 용어 "면역억제제"는 본원에서 치료되는 대상체의 면역계를 억제하거나 방해하는 작용을 하는 물질을 지칭한다. 이는 사이토킨 생성을 억제하거나, 자가-항원 발현을 하향-조절 또는 억제하거나, MHC 항원을 방해하는 물질을 포함할 것이다. 이러한 작용제의 예로는 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘 (미국 특허 제4,665,077호 참조); 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID); 간시클로비어, 타크롤리무스, 글루코코르티코이드, 예컨대 코르티솔 또는 알도스테론, 항염증제, 예컨대 시클로옥시게나제 억제제, 5-리폭시게나제 억제제, 또는 류코트린 수용체 길항제; 퓨린 길항제, 예컨대 아자티오프린 또는 미코페놀레이트 모페틸 (MMF); 알킬화제, 예컨대 시클로포스파미드; 브로모크립틴; 다나졸; 답손; 글루타르알데히드 (MHC 항원을 방해함, 미국 특허 제4,120,649호에 기재된 바와 같음); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-개별특이형 항체; 시클로스포린; 6 머캅토퓨린; 스테로이드, 예컨대 코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코이드 유사체, 예를 들어 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 예컨대 솔루-메드롤(SOLU-MEDROL)(등록상표) 메틸프레드니솔론 나트륨 숙시네이트, 및 덱사메타손; 디히드로폴레이트 리덕타제 억제제, 예컨대 메토트렉세이트 (경구 또는 피하); 항-말라리아제, 예컨대 클로로퀸 및 히드록시클로로퀸; 술파살라진; 레플루노미드; 사이토킨 또는 사이토킨 수용체 항체 또는 길항제, 예컨대 항-인터페론-알파, -베타 또는 -감마 항체, 항-종양 괴사 인자(TNF)-알파 항체 (인플릭시마브 (레미케이드(등록상표)) 또는 아달리무마브), 항-TNF-알파 면역어드헤신 (에타너셉트), 항-TNF-베타 항체, 항-인터루킨-2 (IL-2) 항체 및 항-IL-2 수용체 항체, 및 항-인터루킨-6 (IL-6) 수용체 항체 및 길항제; 항-LFA-1 항체, 예컨대 항-CD11a 및 항-CD18 항체; 항-L3T4 항체; 이종 항-림프구 글로불린; pan-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 함유하는 가용성 펩티드 (WO 90/08187, 1990년 7월 26일자로 공개됨); 스트렙토키나제; 전환 성장 인자-베타 (TGF-베타); 스트렙토도르나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 클로람부실; 데옥시스페르구알린; 라파미신; T-세포 수용체 (Cohen et al., 미국 특허 제5,114,721호); T-세포 수용체 단편 (문헌 [Offner et al., Science, 251:430-432 (1991)]; WO 90/11294; [Ianeway, Nature, 341:482 (1989)]; 및 WO 91/01133); BAFF 길항제, 예컨대 BAFF 또는 BR3 항체 또는 면역어드헤신 및 zTNF4 길항제 (검토를 위해, 문헌 [Mackay and Mackay, Trends Immunol, 23:113-5 (2002)] 참조, 또한 하기 정의 참조); T 세포 헬퍼 신호를 간섭하는 생물학적 작용제, 예컨대 항-CD40 수용체 또는 항-CD40 리간드 (CD154), 예컨대 CD40-CD40 리간드에 대한 차단 항체 (예를 들어, 문헌 [Durie et al., Science, 261:1328-30 (1993)]; [Mohan et al., J. Immunol, 154:1470-80 (1995)]) 및 CTLA4-Ig (문헌 [Finck et al., Science, 265:1225-7 (1994)]); 및 T-세포 수용체 항체 (EP 340,109), 예컨대 T10B9를 들 수 있다.

본원에 사용된 "BAFF 길항제"는 일반적으로 BAFF의 생물학적 활성을 직접적으로 억제하는 임의의 화합물을 지칭한다. 분자는 BAFF 폴리펩티드, BAFF 유전자, BAFF 전사체, 또는 BAFF 수용체와 상호작용함으로써 BAFF의 생물학적 활성을 직접적으로 억제한다. BAFF 길항제는 예를 들어 BAFF에 결합하고 그의 활성을 중화시키거나; BAFF 발현 수준을 감소시키거나; BAFF의 안정성에 영향을 주거나; BAFF의 막 결합된 형태를 가용성 형태로 단백질분해성 절단하는데 영향을 줄 수 있거나, 또는 이는 하나 이상의 BAFF 수용체의 세포내 신호전달을 간섭할 수 있다. BAFF 길항제는 단백질성 분자 (예를 들어, 항체, 수용체 융합 단백질, 펩티드, 펩티바디, 우성 음성 BAFF 돌연변이체) 또는 비단백질성 분자 (예를 들어, 유기 소분자 (약 500 Da 미만)), 예컨대 siRNA 및 압타머 등일 수 있다. BAFF 길항제의 생물학적 활성을 중화시키는 방법으로는 당업계에 기재된 공지된 것들을 들 수 있다. BAFF 길항제의 예로는 BAFF 수용체의 BAFF-결합 부분 또는 그의 BAFF-결합 변이체를 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, WO 01/12812, WO 02/24909, WO 00/40716, WO 03/024991), 항-BAFF 항체 (예를 들어, WO 03/33658), BAFF-결합 펩티바디 (예를 들어, WO 02/092620), 항-BAFF-R 항체 (예를 들어, WO 02/24909) 및 BAFF-결합 펩티드 (예를 들어, WO 02/16412)를 들 수 있다. 일 실시양태에 따르면, BAFF 길항제는 BCMA-Fc (예를 들어, WO 01/12812), BAFF-R-Fc (예를 들어, WO 02/24909), TACI-Ig (예를 들어, WO 00/40716), 항-BAFF 항체 (예를 들어, WO 03/33658), 항-BAFF-R 항체 (예를 들어, WO 02/24909), BAFF-결합 펩티바디 (예를 들어, WO 02/092620), 우성 음성 BAFF (예를 들어, WO 04/081043)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 실시양태에 따르면, 항-BAFF 항체 및 항-BAFF 수용체 항체는 인간, 인간화, 키메라이거나, 또는 다르게는 인간에서의 치료에 대해 증진된다.

본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고/하거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 나타낸다. 이러한 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제; 및 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소-분자 독소 또는 효소 활성 독소, 또는 그의 단편을 포함하는 것으로 의도된다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드 시톡산 (CYTOXAN)(등록상표); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라닌 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민 포함); 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); δ-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀 (MARINOL)(등록상표)); β-라파콘; 라파콜; 콜치신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (히캄틴(HYCAMTIN)(등록상표), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)(등록상표)), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르미신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함)); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로르암부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스핀, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대 엔디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 γII 및 칼리케아미신 ωII) (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 다이네미신, 예컨대 다이네미신 A; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 엔디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)(등록상표)), 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 독소루비신 HCl 리포좀 주사 (독실(DOXIL)(등록상표)), 리포좀성 독소루비신 TLC D-99 (미오세트(MYOCET)(등록상표))), 페길화 리포좀성 독소루비신 (카엘릭스(CAELYX)(등록상표)), 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)(등록상표)), 테가푸르 (우프토랄(UFTORAL)(등록상표)), 카페시타빈 (젤로다(XELODA)(등록상표)), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 항-부신 물질, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 에포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK(등록상표) 다당류 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products; 미국 오리곤주 유진 소재)); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 네투아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 필데신(FILDESIN)(등록상표)); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 탁솔(TAXOL)(등록상표), 파클리탁셀의 크레모포르-무함유 알부민-가공된 나노입자 제제 아브락산(ABRAXANE)(상표명), 및 도세탁셀 탁소테레(TAXOTERE)(등록상표); 클로란부실; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴; 미세관 형성으로부터 튜불린 중합을 방지하는 빈카, 예를 들어 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)(등록상표)), 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)(등록상표)), 빈데신 (엘디신(ELDISINE)(등록상표), 필데신(FILDESIN)(등록상표)), 및 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)(등록상표)); 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 류코보빈; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산, 예를 들어 벡사로텐 (타르그레틴(TARGRETIN)(등록상표)); 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)(등록상표) 또는 오스타크(OSTAC)(등록상표)), 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)(등록상표)), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (악토넬(ACTONEL)(등록상표)); 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적 세포 증식에 관여하는 신호전달 경로에서 유전자 발현을 억제하는 것들, 예를 드어 PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 상피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예를 들어 테라토프(THERATOPE)(등록상표) 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)(등록상표) 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)(등록상표) 백신, 및 백시드(VAXID)(등록상표) 백신; 토포이소메라제 1 억제제 (예를 들어, 루르토테칸(LURTOTECAN)(등록상표)); rmRH (예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)(등록상표)); BAY439006 (소라페니브; 바이엘(Bayer)); SU-11248 (화이자); 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테오좀 억제제 (예를 들어, PS341); 보르테조미브 (벨카드(VELCADE)(등록상표)); CCI-779; 티피파르니브 (R11577); 오라페니브, ABT510; Bal-2 억제제, 예를 들어 오블리메르센 나트륨 (게나센스(GENASENSE)(등록상표)); 픽산트론; 및 이들 중 어느 하나의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 이들 중 둘 이상의 조합, 예컨대 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법의 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보빈과 함께 옥살리플라틴 (엘록산틴(ELOXATIN)(상표명))을 사용하는 치료 처방의 약어)가 있다.

본원에서, 화학요법제는 암의 성장을 촉진시킬 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항-호르몬제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 이들은 호르몬 자체일 수도 있다. 그 예로는 혼합된 작동제/길항제 프로파일을 갖는 항-에스트로겐, 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)(등록상표)), 4-히드록시타목시펜, 토레미펜 (파레스톤(FARESTON)(등록상표)), 이독시펜, 드롤록시펜, 랄록시펜 (에비스타(EVISTA)(등록상표)), 트리옥시펜, 케옥시펜, 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM), 예를 들어 SERM3; 효능제 특성이 없는 순수한 항-에스트로겐, 예를 들어 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)(등록상표)), 및 EM800 (예를 들어, 에스트로겐 수용체 (ER) 이량체화를 차단하고/거나, DNA 결합을 억제하고/거나, ER 전환을 증가시키고/거나, ER 수준을 억제하는 작용제); 아로마타제 억제제, 예를 들어 스테로이드성 아로마타제 억제제, 예를 들어 포르메스탄 및 엑세메스탄 (아로마신(AROMASIN)(등록상표)), 및 비스테로이드성 아로마타제 억제제, 예를 들어 아나스트라졸 (아리미덱스(ARIMIDEX)(등록상표)), 레트로졸 (페마라(FEMARA)(등록상표)) 및 아미노글루테티미드, 및 기타 아로마타제 억제제, 예를 들어 보로졸 (리비소르(RIVISOR)(등록상표)), 메게스트롤 아세테이트 (메가스(MEGASE)(등록상표)), 파드로졸, 및 4(5)-이미다졸; 황체형성 호르몬-방출 호르몬 효능제, 예를 들어 류프롤리드 (루프론(LUPRON)(등록상표) 및 엘리가르드(ELIGARD)(등록상표)), 고세렐린, 부세렐린, 및 트립테렐린; 성 스테로이드, 예를 들어 프로게스틴, 예를 들어 메게스토롤 아세테이트 및 메드록시프로게스테론 아세테이트, 에스트로겐, 예를 들어 디에틸스틸베스트롤 및 프레마린, 및 안드로겐/레티노이드, 예를 들어 플루옥시메스테론, 모든 트랜스레티노산 및 펜레티니드; 오나프리스톤; 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 항-안드로겐, 예를 들어 플루마티드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 이들 중 어느 하나의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 상기 중 2가지 이상의 조합이 있다.

본원에 사용된 용어 "EGFR 억제제"는 EGFR에 결합하거나 다르게는 EGFR과 직접적으로 상호작용하고, 그의 신호전달 활성을 방지하거나 감소시키는 화합물을 지칭하며, 대안적으로 "EGFR 길항제"로 지칭된다. 이러한 작용제의 예로는 EGFR에 결합하는 항체 및 소분자를 들 수 있다. EGFR에 결합하는 항체의 예로는 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (미국 특허 제4,943, 533호, Mendelsohn et al. 참조) 및 그의 변이체, 예컨대 키메라 225 (C225 또는 세툭시마브; 에르부틱스(ERBUTIX)(등록상표)) 및 재성형된 인간 225 (H225) (WO 96/40210, 임클론 시스템스 인크.(Imclone Systems Inc.) 참조); IMC-11F8, 완전 인간, EGFR-표적화된 항체 (임클론); 제II형 돌연변이체 EGFR에 결합하는 항체 (미국 특허 제5,212,290호); 미국 특허 제5,891,996호에 기재된 바와 같은 EGFR에 결합하는 인간화 및 키메라 항체; 및 EGFR에 결합하는 인간 항체, 예컨대 ABX-EGF 또는 파니투무마브 (WO 98/50433, 압제닉스(Abgenix)/암젠); EMD 55900 (문헌 [Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)]); EGFR 결합에 대해 EGF 및 TGF-알파 둘다와 경쟁하는 EGFR에 대한 EMD7200 (마투주마브) 인간화 EGFR 항체 (EMD/머크(Merck)); 인간 EGFR 항체, HuMax-EGFR (젠맵); E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 및 E7.6.3으로 공지되고 미국 특허 제6,235,883호에 기재된 완전 인간 항체; MDX-447 (메다렉스 인크(Medarex Inc)); 및 mAb 806 또는 인간화 mAb 806 (문헌 [Johns et al, J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)])을 들 수 있다. 항-EGFR 항체는 세포독성제와 접합될 수 있으므로 면역접합체를 형성할 수 있다 (예를 들어, EP659,439A2, 머크 페이턴트 게엠베하(Merck Patent GmbH) 참조). EGFR 길항제는 미국 특허 제5,616,582호, 제5,457,105호, 제5,475,001호, 제5,654,307호, 제5,679,683호, 제6,084,095호, 제6,265,410호, 제6,455,534호, 제6,521,620호, 제6,596,726호, 제6,713,484호, 제5,770,599호, 제6,140,332호, 제5,866,572호, 제6,399,602호, 제6,344,459호, 제6,602,863호, 제6,391,874호, 제6,344,455호, 제5,760,041호, 제6,002,008호, 및 제5,747,498호, 뿐만 아니라 하기 PCT 공개: WO 98/14451, WO 98/50038, WO 99/09016, 및 WO 99/24037에 기재된 화합물과 같은 소분자를 포함한다. 특정 소분자 EGFR 길항제로는 OSI-774 (CP-358774, 에를로티니브, 타르세바(TARCEVA)(등록상표) 제넨테크/OSI 파마슈티칼스(OSI Pharmaceuticals)); PD 183805 (CI 1033, 2-프로펜아미드, N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-6-퀴나졸리닐]-디히드로클로라이드, 화이자 인크.(Pfizer Inc.)); ZD1839, 게티니티브 (이레사(IRESSA)(상표명)) 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린, 아스트라제네카(AstraZeneca)); ZM 105180 ((6-아미노-4-(3-메틸페닐-아미노)-퀴나졸린, 제네카(Zeneca)); BIBX-1382 (N8-(3-클로로-4-플루오로-페닐)-N2-(1-메틸-피페리딘-4-일)-피리미도[5,4-d]피리미딘-2,8-디아민, 뵈링거 잉겔하임(Boehringer Ingelheim)); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-페닐에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀); (R)-6-(4-히드록시페닐)-4-[(1-페닐에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘); CL-387785 (N-[4-[(3-브로모페닐)아미노]-6-퀴나졸리닐]-2-부틴아미드); EKB-569 (N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-3-시아노-7-에톡시-6-퀴놀리닐]-4-(디메틸아미노)-2-부텐아미드) (와이어스); AG1478 (서젠(Sugen)); AG1571 (SU 5271; 서젠); 이중 EGFR/HER2 티로신 키나제 억제제, 예컨대 라파티니브 (GW 572016 또는 N-[3-클로로-4-[(3-플루오로페닐)메톡시]페닐]6[5[[[2메틸술포닐)에틸]아미노]메틸]-2-푸라닐]-4-퀴나졸린아민; 글락소-스미스클라인(Glaxo-SmithKline))을 들 수 있다.

"티로신 키나제 억제제"는 HER 수용체와 같은 티로신 키나제의 티로신 키나제 활성을 억제하는 분자이다. 이러한 억제제의 예로는 선행 문단에 언급된 EGFR-표적화된 약물; 소분자 HER2 티로신 키나제 억제제, 예컨대 다께다(Takeda)에서 시판되는 TAK165; ErbB2 수용체 티로신 키나제의 경구 선택적 억제제인 CP-724,714 (화이자 및 OSI); 이중-HER 억제제, 예컨대 EGFR에 선호적으로 결합하지만 HER2 및 EGFR-과발현 세포 둘다를 억제하는 EKB-569 (와이어스에서 시판됨); 라파티니브 (GW572016; 글락소-스미스클라인에서 시판됨) 경구 HER2 및 EGFR 티로신 키나제 억제제; PKI-166 (노파르티스(Novartis)에서 시판됨); pan-HER 억제제, 예컨대 카네르티니브 (CI-1033; 파마시아(Pharmacia)); Raf-1 억제제, 예컨대 Raf-1 신호전달을 억제하는, ISIS 파마슈티칼스(ISIS Pharmaceuticals)에서 시판되는 안티센스제 ISIS-5132; 비-HER 표적화된 TK 억제제, 예컨대 이마티니브 메실레이트 (글락소에서 시판되는 글리백(GLEEVAC)(상표명)); MAPK 세포외 조절된 키나제 I 억제제 CI-1040 (파마시아에서 시판됨); 퀴나졸린, 예컨대 PD 153035, 4-(3-클로로아닐리노)퀴나졸린; 피리도피리미딘; 피리미도피리미딘; 피롤로피리미딘, 예컨대 CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706; 피라졸로피리미딘, 4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘; 쿠르쿠민 (디페룰로일 메탄, 4,5-비스(4-플루오로아닐리노)프탈이미드); 니트로티오펜 잔기 함유 티르포스틴; PD-0183805 (워너-램버트(Warner-Lambert)); 안티센스 분자 (예를 들어, HER-코딩 핵산에 결합하는 것들); 퀴녹살린 (미국 특허 제5,804,396호); 트리포스틴 (미국 특허 제5,804,396호); ZD6474 (아스트라제네카); PTK-787 (노파르티스/쉐링 아게(Schering AG)); pan-HER 억제제, 예컨대 CI-1033 (화이자); 아피니타크(Affinitac) (ISIS 3521; 아이시스(Isis)/릴리(Lilly)); 이마티니브 메실레이트 (글리백; 노파르티스); PKI 166 (노파르티스); GW2016 (글락소 스미스클라인); CI-1033 (화이자); EKB-569 (와이어스); 세막시니브 (서젠); ZD6474 (아스트라제네카); PTK-787 (노파르티스/쉐링 아게); INC-1C11 (임클론); 또는 하기 특허 공개 중 하나에 기재된 것: 미국 특허 제5,804,396호; WO 99/09016 (아메리칸 시아나미드(American Cyanamid)); WO 98/43960 (아메리칸 시아나미드); WO 97/38983 (워너 램버트); WO 99/06378 (워너 램버트); WO 99/06396 (워너 램버트); WO 96/30347 (화이자 인크.); WO 96/33978 (제네카); WO 96/3397 (제네카); 및 WO 96/33980 (제네카)을 들 수 있다.

"항-혈관신생제"는 혈관의 발달을 일정 정도로 차단하거나 간섭하는 화합물을 지칭한다. 항-혈관신생 인자는 예를 들어 혈관신생을 촉진하는데 관여하는 성장 인자 또는 성장 인자 수용체에 결합하는 소분자 또는 항체일 수 있다. 본원에서 바람직한 항-혈관신생 인자는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 또는 그의 수용체에 결합하는 항체, 예컨대 베바시주마브 (아바스틴(AVASTIN)(등록상표)) 또는 라니비주마브 (루센티스(등록상표)), 또는 αvβ3 항체, 예컨대 비탁신(VITAXIN)(상표명) (메드이뮨)이다.

용어 "사이토킨"은 세포내 매개자로서 또다른 세포에 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반적인 용어이다. 이러한 사이토킨의 예는 림포킨, 모노킨; 인터루킨 (IL), 예컨대 IL-I, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, 예컨대 프로루킨(PROLEUKIN)(등록상표) rIL-2 및 인간 IL-4 및 인간 IL-4의 돌연변이체, 예컨대 IL-2 감마에의 결합에 관여하는 IL-4의 영역에서의 돌연변이를 함유하는 돌연변이체, 예를 들어, Arg 21은 Glu 잔기로 변화됨; 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β; 및 다른 폴리펩티드 인자, 예컨대 LDF 및 키트 리간드 (KL)이다. 본원에 사용된 용어 사이토킨은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연-서열 사이토킨의 생물학적 활성 등가물, 예컨대 합성적으로 생성된 소-분자 실체 및 그의 제약상 허용되는 유도체 및 염을 포함한다.

용어 "호르몬"은 일반적으로 도관을 갖는 관상 기관에 의해 분비되는 폴리펩티드 호르몬을 지칭한다. 호르몬에 포함되는 것으로는 예를 들어 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 에스트라디올; 호르몬-대체 요법; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 또는 테스토락톤; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예컨대 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 및 황체형성 호르몬 (LH); 프로락틴, 태반 락토겐, 마우스 생식선자극호르몬-관련된 펩티드, 생식선자극호르몬-방출 호르몬; 인히빈; 악티빈; 뮬러리안-억제 물질; 및 트롬보포이에틴이 있다. 본원에 사용된 용어 호르몬은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연-서열 호르몬의 생물학적 활성 등가물, 예컨대 합성적으로 생성된 소-분자 실체 및 그의 제약상 허용되는 유도체 및 염을 포함한다.

용어 "성장 인자"는 성장을 촉진하는 단백질을 지칭하며, 예를 들어 간세포 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 혈관 내피 성장 인자; 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-유래된 성장 인자; 전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β, 및 -γ; 및 콜로니 자극 인자 (CSF), 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF)를 들 수 있다. 본원에 사용된 용어 성장 인자는 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연-서열 성장 인자의 생물학적 활성 등가물, 예컨대 합성적으로 생성된 소-분자 실체 및 그의 제약상 허용되는 유도체 및 염을 포함한다.

용어 "인테그린"은 세포가 세포외 매트릭스에 결합하게 하고 그에 반응하게 하는 수용체 단백질을 지칭하며, 다양한 세포 기능, 예컨대 상처 치유, 세포 분화, 종양 세포의 귀환 및 아폽토시스에 관여한다. 이는 세포-세포외 매트릭스 및 세포-세포 상호작용에 관여하는 세포 부착 수용체의 큰 과의 일부이다. 기능적 인테그린은 비-공유 결합된 알파 및 베타로 지칭되는 2가지 막횡단 당단백질 서브유닛으로 이루어진다. 알파 서브유닛은 모두 서로에 대해 일부의 상동성을 공유하며, 베타 서브유닛도 그러하다. 수용체는 항상 하나의 알파 쇄 및 하나의 베타 쇄를 함유한다. 그 예로는 알파6베타1, 알파3베타1, 알파7베타1, LFA-1 등을 들 수 있다. 본원에 사용된 용어 "인테그린"은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연-서열 인테그린의 생물학적 활성 등가물, 예컨대 합성적으로 생성된 소-분자 실체 및 그의 제약상 허용되는 유도체 및 염을 포함한다.

본원의 목적상, "종양 괴사 인자 알파 (TNF-알파)"는 문헌 [Pennica et al., Nature, 312:721 (1984)] 또는 [Aggarwal et al., JBC, 260:2345 (1985)]에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 인간 TNF-알파 분자를 지칭한다.

본원에서 "TNF-알파 억제제"는 일반적으로 TNF-알파에 결합하고 그의 활성을 중화시키는 것을 통해 TNF-알파의 생물학적 기능을 일정 정도로 억제하는 작용제이다. 본원에서 구체적으로 고려되는 TNF 억제제의 예는 에타너셉트 (엔브렐(등록상표)), 인플릭시마브 (레미케이드(등록상표)), 아달리무마브 (후미라(상표명)), 페길화 가용성 TNF-R 페그수네르셉트 (sTNF-R1; 암젠); 페길화 항-TNF 항체 단편, CDP-870 (셀테크)이다.

"질환-조절 항-류마티스 약물" 또는 "DMARD"의 예로는 히드록시클로로퀸, 술파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 에타너셉트, 인플릭시마브 (플러스 경구 및 피하 메토트렉세이트), 아자티오프린, D-페니실라민, 금 염 (경구), 금 염 (근육내), 미노시클린, 시클로스포린, 예컨대 시클로스포린 A 및 국소 시클로스포린, 스타필로코쿠스 단백질 A (문헌 [Goodyear and Silverman, J. Exp. Med., 197, (9), p1125-39 (2003)]), 및 그의 염 및 유도체 등을 들 수 있다.

"비-스테로이드성 항-염증 약물" 또는 "NSAID"의 예로는 아스피린, 아세틸살리실산, 이부프로펜, 나프록센, 인도이네타신, 술린닥, 톨메틴, COX-2 억제제, 예컨대 셀레콕시브 (셀레브렉스(CELEBREX)(등록상표); 4-(5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)벤젠술폰아미드 및 발데콕시브 (벡스트라(BEXTRA)(등록상표)), 및 멜록시캄 (모빅(MOBIC)(등록상표)), 및 그의 염 및 유도체 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 이는 아스피린, 나프록센, 이부프로펜, 인도메타신 또는 톨메틴이다.

본원에서 "인테그린 길항제 또는 항체"의 예로는 CD11a 또는 LFA-1 항체, 에컨대 제넨테크에서 시판되는 에팔리주마브 (랍비타(RAPTIVA)(등록상표)), 또는 알파 4 인테그린 항체, 예컨대 바이오젠 아이덱/엘란(Elan)에서 시판되는 나탈리주마브 (안테그렌(ANTEGREN)(등록상표)), 또는 디아자시클로 페닐알라닌 유도체 (WO 2003/89410), 페닐알라닌 유도체 (WO 2003/70709, WO 2002/28830, WO 2002/16329 및 WO 2003/53926), 페닐프로피온산 유도체 (WO 2003/10135), 에나민 유도체 (WO 2001/79173), 프로판산 유도체 (WO 2000/37444), 알칸산 유도체 (WO 2000/32575), 치환된 페닐 유도체 (미국 특허 제6,677,339호 및 제6,348,463호), 방향족 아민 유도체 (미국 특허 제6,369,229호), ADAM 디스인테그린 도메인 폴리펩티드 (US 2002/0042368), 알파v베타3 인테그린에 대한 항체 (EP 633945), 아자-브릿지된 비시클로 아미노산 유도체 (WO 2002/02556), 및 683699 (타나베(Tanabe)) 등을 들 수 있다.

"코르티코스테로이드"는 천연 발생 코르티코스테로이드의 효과를 모방하거나 증강시키는 스테로이드의 일반적 화학 구조를 갖는 몇몇 합성 또는 천연 발생 물질 중 임의의 하나를 지칭한다. 합성 코르티코스테로이드의 예로는 프레드니손, 프레드니솔론 (메틸프레드니솔론, 예컨대 솔루-메드롤(등록상표) 메틸프레드니솔론 나트륨 숙시네이트 포함), 덱사메타손 또는 덱사메타손 트리암시놀론, 히드로코르티손, 및 베타메타손을 들 수 있다. 본원에서 바람직한 코르티코스테로이드는 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 히드로코르티손, 또는 덱사메타손이다.

본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 2개 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다.

"항체 단편"은 바람직하게는 그의 항원 결합 영역을 포함하는, 무손상 항체의 일부분을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 들 수 있다.

본원에서 "무손상 항체"는 2개의 항원 결합 영역, 및 Fc 영역을 포함하는 것이다. 임의로, 무손상 항체는 기능적 Fc 영역을 갖는다.

"성장 억제성" 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 방지하거나 감소시키는 것이다. 예를 들어, 항체는 시험관내 및/또는 생체내에서 B 세포의 증식을 방지하거나 감소시킬 수 있다.

"아폽토시스를 유도하는" 항체는 표준 아폽토시스 분석, 예컨대 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편화, 및/또는 막 소포의 형성 (아폽토시스 바디로 지칭됨)에 의해 측정된 바와 같은, 예를 들어 B 세포의 프로그램된 세포 사멸을 유도하는 것이다. "천연 항체"는 통상적으로 2개의 동일한 경 (L) 쇄 및 2개의 동일한 중 (H) 쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 결합되는 반면, 디술피드 결합의 수는 상이한 이뮤노글로불린 동종형의 중쇄 사이에서 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄내 디술피드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에 다수의 불변 도메인에 이어진 가변 도메인 (V_H)을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (V_L) 및 그의 다른 말단에 불변 도메인을 가지며, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 함께 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 함께 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 믿어진다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 사이에서 서열에 있어서 상당히 상이하다는 것을 지칭하며, 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 하지만, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘다에서 초가변 영역으로 지칭되는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 높게 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR을 포함하며, β-쉬트 구조를 연결하고, 일부의 경우 그의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3개의 초가변 영역에 연결된 β-쉬트 형태를 크게 채택한다. 각각의 쇄에서 초가변 영역은 다른 쇄로부터의 초가변 영역을 갖는, FR에 의해 매우 가깝게 함께 잡혀 있으며, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데 직접적으로 관여하지 않지만, 다양한 효과기 기능, 예컨대 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에서 항체의 참여를 나타낸다.

항체의 파파인 소화는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편으로 지칭되는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 그의 명칭이 용이하게 결정화되는 그의 능력을 반영하는 잔여 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')₂ 단편을 생성한다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 상기 영역은 단단한 비-공유 결합의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 각각의 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 한정하는 것은 이러한 형태이다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 대한 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 전체 결합 부위보다 낮은 친화도이기는 하지만, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 그에 결합하는 능력을 갖는다.

Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 소수의 잔기가 첨가된 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 하나 이상의 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 본원의 지칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 원래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.

임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 2가지 명백히 구별되는 형태 중 하나로 분류될 수 있다.

그의 "중쇄"의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, (존재할 경우) 항체는 여러가지 부류로 할당될 수 있다. 무손상 항체에는 5가지 주요한 부류, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 하위부류 (동종형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 여러가지 항체의 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지칭된다. 여러가지 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형태는 널리 공지되어 있다.

달리 지시되지 않는다면, 본원에서 이뮤노글로불린 중쇄에서 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] (본원에 명백히 참고로 도입됨)에서와 같은 EU 색인의 것이다. "카바트에서의 EU 색인"은 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.

본원에서 "Fc 영역"이라는 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 비롯한 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 Cys226의 아미노산 잔기, 또는 Pro230으로부터 그의 카르복실-말단까지 연장되는 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따라 잔기 447)은 예를 들어 항체의 생성 또는 정제 동안, 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합적 유전자조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 비손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 있거나 없는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.

"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능"을 갖는다. 예시적인 "효과기 기능"으로는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 들 수 있다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 결합될 것을 요구하며, 예를 들어 본원에 논의된 바와 같은 다양한 분석을 이용하여 평가될 수 있다.

"천연 서열 Fc 영역"은 천연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역으로는 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역, 뿐만 아니라 그의 천연 발생 변이체를 들 수 있다.

"변이체 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환(들)에 의해 천연 서열 Fc 영역의 그것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에 비해 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 약 80％ 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 약 90％ 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 약 95％ 이상의 상동성을 가질 것이다.

"항체-의존성 세포-매개된 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 중성구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 이어서 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개된 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 대상의 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 효과기 세포의 예로는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 들 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 대상의 분자의 ADCC 활성은 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수 있다.

"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하며 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 중성구를 들 수 있으며; PBMC 및 NK 세포가 바람직하다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"이라는 용어는 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재하는데 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이며, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체, 및 상기 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 들 수 있다. FcγRII 수용체로는 그의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는, FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 들 수 있다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (검토를 위해 문헌 [M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)]을 참조한다). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토되었다. 장래에 확인될 것들을 비롯한 다른 FcR은 본원에서 "FcR"이라는 용어에 포함된다. 상기 용어는 또한 모체 IgG를 태아에 전달하는 것을 담당하며 이뮤노글로불린의 항상성을 조절하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]).

"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에서 표적을 용해시키는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템 (C1q)의 제1 성분의 동족체 항원과 복합체화된 분자 (예를 들어, 항체)에의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다.

"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 상기 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성하도록 하는 V_H과 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해서는 문헌 [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.

"디아바디"라는 용어는 동일한 폴리펩티드 쇄 (V_H - V_L) 내의 가변 경쇄 도메인 (V_L)에 연결된 가변 중쇄 도메인 (V_H)을 포함하는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭한다. 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 이룰 수 없는 링커를 사용함으로써, 도메인은 또다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 이루며, 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 충분히 기재되어 있다.

본원에 사용된 "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터의 항체를 지칭하며, 즉 집단에 포함되는 개별 항체는 모노클로날 항체의 생성 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체를 제외하고는 (이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재함) 동일하고/거나 동일한 에피토프(들)에 결합한다. 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 표적-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터의 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 과정에 의해 수득되었다. 예를 들어, 선별 과정은 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀과 같은 다수의 클론으로부터 고유한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 선별된 표적 결합 서열은 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키고, 표적 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양물에서의 그의 생성을 개선시키고, 생체내에서 그의 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 생성하는 등을 위해 추가로 변경될 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체는 또한 본 발명의 모노클로날 항체이다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제조물과 반대로, 모노클로날 항체 제조물의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대한 것이다. 그의 특이성 이외에, 모노클로날 항체 제조물은 이들이 전형적으로 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 변형어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 동종인 집단으로부터 수득된 항체의 특징을 나타내며, 항체의 생성이 임의의 특정 방법에 의할 것을 요구하는 것으로 간주되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N. Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조), 파지 제시 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Nat. Acad, Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)] 참조), 및 인간 이뮤노글로불린 좌위 또는 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서의 인간 또는 인간-유사 항체의 제조 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,591,669호 (모두 젠팜(GenPharm)); 제5,545,807호; WO 1997/17852; 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호; [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature, 368:856-859 (1994)]; [Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)] 참조)을 비롯한 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.

본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 쇄(들)의 나머지는 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린), 및 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]). 본원에서 당해 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구세계 원숭이, 예컨대 개코원숭이, 붉은털원숭이 또는 시노몰구스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다 (미국 특허 제5,693,780호).

비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분, 인간화 항체는 수여자의 초가변 영역으로부터의 잔기가, 목적하는 특이성, 친화도 및 수용력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수여자 항체)이다. 일부의 예에서, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변형이 이루어져 항체 성능을 추가로 개량한다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프가 비-인간 이뮤노글로불린의 그것과 상응하는, 실질적으로 모든 하나 이상의, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 그것이다. 인간화 항체는 또한 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 그것을 포함할 것이다. 추가의 상세사항에 대해서는 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.

본원에 사용될 경우 "초가변 영역"이라는 용어는 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24 내지 34 (L1), 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3), 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 31 내지 35 (H1), 50 내지 65 (H2) 및 95 내지 102 (H3); 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 상기 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26 내지 32 (L1), 50 내지 52 (L2) 및 91 내지 96 (L3), 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 26 내지 32 (H1), 53 내지 55 (H2) 및 96 내지 101 (H3); 문헌 [Chothia and Lesk. J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

"네이키드(naked) 항체"는 세포독성 잔기 또는 방사성표지와 같은 이종 분자와 접합되지 않은 항체이다.

"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리되고/거나 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단 또는 치료 용도를 간섭할 물질이며, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 들 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정된 바와 같이 항체 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과까지, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 15 잔기 이상의 N-말단 또는 내부 아미노산 서열을 수득하는데 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시(Coomassie) 블루, 또는 바람직하게는 실버 염료를 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 동질성으로 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 동일계내에서 재조합 세포 내의 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"친화도 성숙된" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도의 개선을 초래하는 하나 이상의 그의 초가변 영역 내에 하나 이상의 변경을 갖는 것이다. 바람직한 친화도 성숙된 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙된 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 제조된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화도 성숙이 기재되어 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌 [Barbas et al. Proc. Nat. Acad. Sci., USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al. Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.

"항체 노출"은 약 1 내지 20일의 기간에 걸쳐 투여된 하나 이상의 투여량으로 본원의 항체에 접촉 또는 노출시키는 것을 지칭한다. 투여량은 상기 노출 기간에 걸쳐 1회로 또는 고정되거나 불규칙한 시간 간격으로 주어질 수 있다. 초기 및 후기 (예를 들어, 제2 또는 제3) 항체 노출은 본원에 상세히 기재된 바와 같이 서로로부터 시간상 분리된다.

"포장 삽입물"은 시판되는 치료용 제품의 상업적 포장에 포함되는 설명서를 지칭하며, 이는 증상에 대한 정보, 용법, 투여량, 투여법, 금기사항, 포장된 제품과 조합되는 다른 치료용 제품, 및/또는 이러한 치료용 제품의 사용에 관한 주의사항 등을 함유한다.

II. 샘플 예비처리

자가면역 질환, 예컨대 RA 또는 SLE를 갖는 대상체로부터의 혈청은 세포-기반 생분석, 예컨대 중화 항체 분석의 재현성을 간섭하는 물질(들)을 함유한다는 것이 하기 실시예에서 밝혀졌다. 간섭은 류마티스성 인자 (RE) 또는 이뮤노글로불린이 아니었다.

다양한 방법이 이러한 문제를 다루기 위해 평가되었지만, 회복 또는 특이적 항체, 또는 분석 간섭을 제거하는데 있어서 특히 충분하지 않았다. 샘플 희석 최소화된 간섭을 증가시키면서, 분석의 감응성은 크게 절충되었다. 간섭의 문제를 다룬 다른 방법이 평가되었다. 예를 들어, 분석 판독 또는 세포-기반 결합 분석의 변화는 문제를 고정시키지 않았으며, 탈염화, 탈지질화, 사이토킨 상관관계, 또는 포화 황산암모늄 침전에 의해 샘플을 예비-처리하지 않았다.

이뮤노글로불린 친화도 정제는 궁극적으로 간섭을 제거하는 바람직한 방법으로 확인되었다. 상기 단계는 대상체의 이뮤노글로불린을 간섭으로부터 회수하여, 정제된 이뮤노글로불린이 세포-기반 생분석에 보다 신뢰성있게 되도록 할 수 있었다.

따라서, 본 발명은

(a) 샘플을 탈지질화시키는 단계;

(b) 샘플 중의 이뮤노글로불린을 친화도 정제하는 단계;

(c) 정제된 이뮤노글로불린을 농축시키는 단계; 및

(d) 농축된 이뮤노글로불린을 세포-기반 생물학적 활성 분석 (바람직하게는, 중화 항체 분석)에 적용하는 단계

를 포함하는, 자가면역 질환 대상체로부터의 생물학적 샘플의 처리 방법에 관한 것이다.

단계 (a), (b) 및 (c)는 임의의 순서로 수행될 수 있지만, 바람직하게는 단계 (a), 후 단계 (b), 후 단계 (c)로 수행된다.

본원에서 생물학적 샘플은 혈청, 혈장, 세포 용해물, 유액, 타액, 초자체액, 및 다른 분비물, 윤활액, 복막강액, 눈물, 및 조직 균등질을 비롯한 다양한 샘플을 들 수 있지만, 바람직하게는 혈청 샘플을 포함한다. 더욱이, 샘플은 액체, 동결, 냉각, 동결건조 등을 비롯한 다양한 형태일 수 있다. 샘플은 본원에서 친화도 정제 단계 전 및/또는 후의 추가의 정제 또는 처리 단계에 적용될 수 있다.

생물학적 샘플은 환자가 치료된 항체 또는 면역어드헤신에 결합하는 대상체로부터의 이뮤노글로불린, 에컨대 인간 항-뮤린 항체 (HAMA), 인간 항-키메라 항체 (HACA) 또는 인간 항-인간 항체 (HAHA)를 포함할 수 있다. HAHA는 인간화 또는 인간 치료용 항체에 대한 것일 수 있다. 일 실시양태에서, 샘플은 이러한 항체를 함유하는지 측정된 것이다. 예를 들어, 환자로부터의 혈청은 ELISA 분석, 예컨대 미국 특허 출원 제2005/0032130A1호 (Beresini and Song) 또는 미국 특허 출원 제2003/0068664호 (Albitar et al.)에 기재된 ELISA 분석을 통해 당해 약물에 대한 항체를 포함하는 것으로 발견될 수 있다.

샘플은 상기 열거된 것들과 같은 자가면역 질환, 바람직하게는 류마티스성 관절염 (RA), 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 또는 쇼그렌병, 가장 바람직하게는 RA를 갖는 대상체로부터의 것이다.

더욱이, 샘플이 수득되는 대상체는 치료용 항체, 면역어드헤신, 또는 다른 생물학적 약물, 예컨대 페길화 가용성 TNF-R (sTNF-R1 페그수네르셉트 포함, 암젠), IL-1 수용체 길항제 (IL-IRa), 예컨대 아나키라 (키너트(KINERET)(등록상표)), DN-BAFF (젠코어(Xencor)), 또는 백신, 예컨대 B 세포 림프종 백신 (CRV/아트로스(ATROS), 인트라셀(Intracel), 라지 스케일 바이올로지(Large Scale Biology), 파브릴(Favrille), NCI, 제니토프(Genitope) 등에서 시판되는 것들 포함) 또는 류코백스(LeukoVAX) (인플라마틱스(Inflammatics))로 치료되거나 치료되었을 수 있다.

대상체가 치료용 항체로 치료되었을 경우, 항체는 B-세포 표면 마커, 예컨대 CD20 항체, 예컨대 리툭시마브, 인간화 2H7, 2F2 (HuMax-CD20) 인간 CD20 항체 (젠맵), 인간화 A20 항체 또는 IMMU-106 (이뮤노메딕스), TRU 015 (트루비온) 등을 비롯한 항체에 결합할 수 있다. 본원에서 바람직한 CD20 항체는 리툭시마브 또는 인간화 2H7이다.

대상의 다른 치료용 항체로는 종양 괴사 인자 (TNF)-α 항체 (예컨대, 인플릭시마브 (레미케이드)(등록상표)), CDP571, MAK-195, 아달리무마브 (후미라(상표명)), 페길화 TNF-α 항체 단편, 예컨대 CDP-870, 항-TNF-α 폴리클로날 항체, 예컨대, PassTNF); 인테그린 항체 (예컨대, 에팔리주마브 또는 나탈리주마브); BAFF 항체 (예를 들어, WO 03/33658); BR3 항체; BAFF 수용체 항체 (예를 들어, WO 02/24909); Blys 항체 (예컨대, 림포스타트(LYMPHOSTAT)-B(상표명), 벨리무마브; HGS/CAT); CD37 항체 (예컨대, TRU 016; 트루비온); CD22 항체, 예컨대 LL2 또는 에프라투주마브 (림포시드(LYMPHOCIDE)(등록상표); 이뮤노메딕스), 아비오겐의 CD22 항체, CMC 544 (와이어스/셀테크), 콤보톡스 (UT Soutwestern), BL22 (NIH), LIF 226 (인핸스드 라이프사이언스); VEGF 또는 VEGF 수용체 항체, 예컨대 베바시주마브 (아바스틴(등록상표)) 및 라니비주마브 (루센티스(등록상표)); 항-HER 항체, 예컨대 트라스투주마브 (헤르셉틴(등록상표)), 페르투주마브 (옴니타르그(상표명)), 및 세툭시마브 (에르부틱스)(등록상표)); 항-IgE 항체, 예컨대 오말리주마브 (졸레어(등록상표)); IL-21 항체 (지모제네틱스/노보 노르디스크); 항-B 세포 항체 (임페론); B 세포 표적화 MAb (이뮤노젠/아벤티스); 1D09C3 (모르포시스/GPC); Lym-1 항체, 예컨대 항-Lym-1 온코라임 (USC/페레그린(Peregrine)); ISF 154 (UCSD/로슈/트라겐); 고밀릭시마 (아이덱 152; 바이오젠 아이덱); IL-6 수용체 항체, 예컨대 아틀리주마브 (악템라)(상표명); 추가이/로슈); IL-15 항체, 예컨대 HuMax-Il-15 (젠맵/암젠); 케모카인 수용체 항체, 예컨대 CCR2 항체 (예를 들어 MLN1202; 밀레니엄); 항-상보체 항체, 예컨대 C5 항체 (예를 들어, 에쿨리주마브, 5G1.1; 알렉시온(Alexion)); 인간 이뮤노글로불린의 경구 제제 (예를 들어, IgPO; 프로테인 테라퓨틱스); IL-12 항체, 예컨대 ABT-874 (CAT/애보트); 테넬릭시마브 (BMS-224818; BMS); CD40 항체, 예컨대 S2C6 및 그의 인간화 변이체 (WO 00/75348) 및 TNX 100 (키론(Chiron)/타녹스(Tanox)); CD52 항체 (예를 들어, 캄패스); αvβ3 항체 (비탁신)(등록상표); 메드이뮨) 등을 들 수 있다.

자가면역 질환 대상체가 면역어드헤신으로 치료되었을 경우, 면역어드헤신은 BR3-Ig; TNF-α 면역어드헤신 (예를 들어, 에타너셉트); 항-BAFF 펩티바디 (예를 들어, WO 02/092620; 암젠); TACI-Ig (지모제네틱스) (예를 들어, WO 00/40716); BCMA-Ig (지모제네틱스) (예를 들어, WO 01/12812); CTLA4-Ig, B7 및 CD28 공동자극 차단제, 예컨대 아바타셉트 (BMS); BAFF-R-Fc (예를 들어, WO 02/24909) 등일 수 있다.

생물학적 샘플은 일반적으로 환자가 약물, 항체 또는 면역어드헤신으로 치료되기 전 및/또는 후에 환자로부터 수득된다. 통상적으로, 생물학적 샘플은 일련의 시점에서 환자로부터, 예를 들어 치료 사이클(들) 전반에 걸쳐 에비처리로부터 수득된다. 약물이 분석의 성능을 간섭하는 것을 회피하기 위해, 생물학적 샘플은 약물 세척이 일어날 때 통상적으로 취해질 것이다. 예를 들어, 기준선, 및 3개월, 6개월 및 9개월에서의 샘플이 시험될 수 있다. 환자가 차후에 재치료될 경우, 기준선 및 3개월 또는 6개월로부터의 샘플은 예비처리된 후 중화 항체로 시험될 수 있다.

친화도 정제 전의 탈지질화 단계는 친화도 정제 단계 동안 응고를 감소시키는 것이 요망된다. 탈지질화를 위한 흡수제 (예컨대, 리포소르브(등록상표); 소르비탄 에스테르/폴리에틸렌 소르비탄 에스테르)를 사용할 수 있지만, 다른 방법, 예컨대 유기 추출, 여과, 원심분리 등은 샘플을 탈지질화시키는데 이용가능하다.

친화도 정제 단계는 바람직하게는 실질적으로 모든 이뮤노글로불린 동종형 (즉, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, 및 IgE, 선택된 흡착제의 친화도가 상이한 동종형에 대해 상이하다 하더라도)을 정제하는 것을 포함한다. 친화도 정제는 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 단백질 A + G 크로마토그래피 (예를 들어, 예시된 바와 같은 단백질 A/G 크로마토그래피, 또는 단백질 A 및 단백질 G 수지의 혼합물 등), IgG 친화도 정제 (예를 들어, 피어스 제품인 멜론 겔(상표명)), 항-이뮤노글로불린 항체 친화도 정제 (항이뮤노글로불린 항체가 단독으로 또는 하나 또는 모든 동종형에 대한 특이성과 조합으로; 예를 들어, 각각의 동종형의 특이적 친화도 정제에 대해 결합된, 항-인간 IgG, IgA, IgM 및 IgE의 조합), 이뮤노글로불린 결합 특성을 갖는 다른 흡착제 (예를 들어, 피어스 T-겔(상표명)) 등에 의해 달성될 수 있다. 바람직하게는, 친화도 정제는 단백질 A + G 친화도 정제를 포함한다.

친화도 정제 (예를 들어, 단백질 A + G 친화도 정제)는 바람직하게는 2회, 3회, 또는 그보다 많은 회수로, 가장 바람직하게는 3회 반복된다. 친화도 컬럼을 로딩한 후, 고체상을 바람직하게는 세척하여 비-특이적 결합을 제거하고, 이뮤노글로불린을 다양한 용리 완충액을 이용하여 용리할 수 있다. 바람직한 용리 완충액은 후속의 세포-기반 중화 항체 분석과 융화된다. 예를 들어, 용리 완충액은 낮은 pH에서일 수 있고/거나, 염산염 (HCl), 글리신, 트리플루오로아세트산 (TFA), 아세트산 등을 함유할 수 있다. 용리 완충액은 임의로 염기성 완충액으로 중화되고/거나, 인산염 완충 염수 (PBS)가 중화 항체 분석을 수행하기 전에 첨가될 수 있다.

일 실시양태에서, 정화된 이뮤노글로불린은 추가의 정제, 농축 단계의 처리에 적용된다. 예를 들어, 이뮤노글로불린은 예를 들어 농축기를 이용하여 농축되거나, 침전 및 재현탁되거나, 동결건조되거나 등일 수 있다.

농축된 또는 정제된 이뮤노글로불린을 포함하는 샘플은 그 후 중화 항체 분석, 예컨대 하기 섹션에 기재된 것에 적용될 수 있다. 샘플은 정제된 Fc-함유 폴리펩티드, 예컨대 대상체의 이뮤노글로불린 (자가항체, 및 항약물 항체 포함), 치료용 항체 및 면역어드헤신, 및 류마티스성 인자 (RF)를 포함할 수 있다.

중화 항체 분석이 본원에서 바람직한 세포-기반 생분석이지만, 예비처리된 샘플은 다른 세포-기반 생물학적 분석, 예컨대 세포 상에서 환자 혈청 내의 약물의 기능적 활성을 측정할 수 있는 약물동력학적 (PD) 생물마커 분석 등에 적용될 수 있다.

III. 중화 항체 분석

본원에서 샘플 예비처리 방법은 바람직하게는 치료용 항체, 면역어드헤신 또는 다른 생물학 제제와 같은 약물에 대한, 또는 B 세포 표면 마커에 결합하는 길항제 또는 항체 (예를 들어, CD20에 결합하는 항체)에 대한 중화 항체를 검출하는 분석과 함께 사용된다. 분석은 치료용 항체, 면역어드헤신 또는 다른 약물로 치료된 환자로부터의 생물학적 샘플이 약물의 생물학적 활성을 차단하는 능력을 측정하며, 여기서 차단 활성은 약물의 감소된 효능을 지시할 수 있다.

중화 항체는 주입된 약물의 예상되는 약리학적 수준을 감소시킴으로써, 효능을 감소시키거나 반응의 가능성을 보다 다양하게 할 수 있다. 중화 항체는 재치료시 혈청 질병 또는 면역 복합체 질환과 관련될 수 있다. 예로서, 중화 항체 반응이 나타날 경우, 치료는 중단되거나 연기될 수 있거나, 투여량이 증가될 수 있거나, 환자는 약물의 효능을 개선시키고/거나 그에 대한 임의의 면역 반응을 감소시키는 추가의 작용제를 투여받을 수 있다. 중화 항체 반응이 관찰될 경우 면역 반응을 감소시키는 치료와 조합될 수 있는 다양한 면역억제제가 공지되어 있으며, 예시적인 이러한 약물은 본원에 구체적으로 언급되어 있다.

환자 치료에서 임상의에 의한 분석 결과의 사용법 이외에, HAMA, HACA, 또는 HAHA 데이타와 함께 항-약물 항체의 중화 특성은 면역원성, 또는 면역원성의 경향, 뿐만 아니라, 약물의 면역원성의 성질을 입증한다. 상기 정보는 약물 안전성의 평가 및 요법에 대한 환자의 잠재적인 면역 반응의 예측에 유용하다.

CD20 항체, 또는 B 세포 표면 마커에 결합하는 다른 길항제의 내용에서, 분석은 이를 사용한 치료가 부분적인 B 세포 고갈만을 초래할 경우, B 세포 과다활성화가 일어날 경우 (예를 들어, SLE에서와 같이), 또는 저항성 질환 증상이 해마다 존재할 경우 (예를 들어, SLE 및 RA에서와 같이) 특히 유용한 것으로 여겨진다.

자가면역 질환을 치료하기 위해 약물로 치료되고 있는 환자에 대해 분석을 사용하는 것은 특이 바람직하다. 다양한 자가면역 질환이 본원에 기재되어 있지만, 예시적인 것으로는 류마티스성 관절염 (RA), 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 베게너병, 염증성 장 질환 (IBD), 특발성 또는 면역 혈소판감소 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소 자반증 (TTP), 자가면역 저혈소판증, 다발성 경화증 (MS), 건선, IgA 신장병증, IgM 다발신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, 당뇨병, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 사구체신염, 자가면역 용혈성 빈혈 등을 들 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 생물학적 활성 분석은 세포-기반 생물학적 분석, 예컨대 보체-의존성 세포독성 (CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 아폽토시스, 이온 채널 조절, 또는 세포 성장의 억제를 측정하는 분석을 포함한다.

바람직하게는, 분석은 CDC 활성을 연구한다. 본 발명의 상기 실시양태에 따르면, 치료용 항체 또는 면역어드헤신이 결합하는 항원 (예를 들어, B 세포 표면 마커, 예컨대 CD20)을 발현하는 세포는 약물의 존재 (또는 부재) 하에서 보체 (바람직하게는, 인간 보체) 뿐만 아니라 약물로 치료되는 환자로부터의 생물학적 샘플에 노출될 수 있다. 본 출원은 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 4가지 성분 (세포, 보체, 약물 및 생물학적 샘플)을 노출시키는 것을 고려하며, 이러한 모든 가능성은 본원에 포함된다. 하지만, 본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈청)은 약물의 활성을 중화시키도록 약물과 조합된 후, 세포 및 보체가 상기 혼합물에 첨가된다.

리툭시마브 중화 항체 분석으로서 보체-의존성 세포독성 (CDC)은 도 4에 나타나 있다. 리툭시마브의 Fab 도메인은 B 림프구 상의 세포 표면 항원인 CD20에 결합한다. 일단 결합되면, 리툭시마브의 Fc 도메인은 보체를 동원하고, 세포 용해를 매개할 것이다. 생체내에서, 리툭시마브는 정상적인 인간 혈청 보체와 함께 WIL2-S 세포에 첨가된다. 세포 용해물은 알라마르 블루(상표명) 또는 셀타이터 글로(등록상표)을 이용하여 간 세포의 미토콘드리아 대사 활성에 비례하는 것으로 측정된다 (상부 패널). 상기 CDC 분석을 환자 혈청에서 리툭시마브 중화 항체를 평가하는데 이용할 경우, 리툭시마브를 환자 혈청과 함께 예비-인큐베이션한 후, 보체 및 세포를 도입한다 (하부 패널). 중화 항체는 리툭시마브의 효능을 감소시켜, 보다 많은 수의 대사적으로 활성인 간 세포를 초래할 것이다. 환자의 혈청에서 중화 활성의 양은 음성 대조군에 비해 알라마르 블루(상표명) 또는 셀타이터 글로(등록상표) 신호전달의 증가에 비례하는 것으로 측정된다.

노출 단계에 이이서, CDC 활성이 바람직하게는 세포 생존력을 측정함으로써 (즉, 간 세포를 정량함으로써) 측정된다. 프로피듐 요오다이드 (PI), 트리판 블루 (문헌 [Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)] 참조), 아넥신 V, 또는 비처리된 세포에 비해 7AAD, 미국 특허 출원 제2005/0032130A1호 (Beresini and Song)에서와 같은 알라마르 블루(상표명) (레사주린) 분석, 또는 하기 기재된 바와 같은 분석 판독을 위한 셀타이터-글로(등록상표) 발광 세포 생존력 분석을 이용한 변형된 분석 등을 비롯한 세포 생존력을 측정하는 다양한 방법이 이용가능하다. 항체 또는 면역어드헤신이 CDC를 매개하는 능력의 감소는 중화 항체가 생물학적 샘플에 존재함을 지시할 수 있다.

세포-기반 분석을 위해, 일반적으로 항체 또는 면역어드헤신이 결합하는 항원을 발현하는 세포주가 이용될 것이다. CD20 항원의 경우, WIL2-S 세포 (ATCC CRL 8885, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)) 또는 WIL2-NS (ATCC CRL-8155), SU-DHL-4 (DSMZ No. ACC495, 독일 미생물 및 배양물 콜렉션(Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zelkulturen)), 또는 CD20 발현 림프모세포oid B-세포주를 비롯한 다양한 세포가 이용가능하다. CD20 양성 세포를 이용한 CDC 분석은 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000)]; [Idusogie et al., J. Immunol. 166:2571-2575 (2001)]; [Rett et al. Blood 83(2):435-445 (1994)]; 미국 특허 제6,194,551 B1호 (Idusogie et al.); 및 미국 특허 제5,736,137호 (Anderson et al.)에 기재되었다.

분석이 ADCC를 평가할 경우, 항체 또는 면역어드헤신은 자연-킬러 세포 (NK 세포) 및/또는 치료용 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포의 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 용해물을 매개하는 그의 능력에 대해 평가될 수 있다. CD20 항원의 경우, WIL2-S 세포가 이용될 수 있으며, 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)] 및 WO 00/42072 (Presta, L.)는 이러한 세포를 이용한 예시적인 ADCC 분석을 기재한다. 또한, 문헌 [Clynes et al. Nature Medicine 6:443-6 (2000)]을 참조한다. 미국 특허 제5,736,137호 (Anderson et al.)는 또한 CD20 양성 세포를 이용한 ADCC 분석을 기재한다.

아폽토시스는 예를 들어 B 세포의 프로그램된 세포 사멸을 지칭하며, 다양한 여러가지 분석, 예컨대 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편화, 및/또는 막 소포 (아폽토시스 바디로 지칭됨)의 형성에 의해 측정될 수 있다. 항체 (예를 들어, 리툭시마브)가 아폽토시스를 유도하는 능력을 측정하는 분석은 예를 들어 문헌 [Shan et al. Cancer Immunol Immunther 48:673-83 (2000)]; [Pedersen et al. Blood 99:1314-9 (2002)]; [Demidem et al. Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3):177-186 (1997)]에 기재되었다.

항체 또는 면역어드헤신이 세포, 예를 들어 길항제 또는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 암성 B 세포의 성장을 억제하는 능력은 다양한 여러가지 분석에 의해 평가될 수 있다. 문헌 [Taji et al. Jpn J. Cancer Res 89:748-56 (1998)]은 CD20 항체에 의한 CD20-양성 B 림프종 세포주의 성장 억제 측정 방법을 기재한다.

본원의 중화 항체 분석을 이용하여, 약물 (예를 들어, CD20에 결합하는 것)의 효능을 약물로 치료되는 환자로부터의 생물학적 샘플이 그의 생물학적 활성을 차단하는 능력을 측정함으로써 측정할 수 있으며, 여기서 대조군 샘플에 비해 생물학적 활성의 감소는 환자가 당해 약물에 대한 항체를 발생시키고 있는지 및/또는 이러한 항체가 적어도 일정 정도로 그의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는지를 지시한다. 유의한 반응은 중화 항체 발달로부터 안전성 관련 문제 및/또는 약물의 변경된 청소율에 반응하여 주요한 약물의 투여량을 변경하는 요건을 초래하는 것일 수 있다. 예를 들어, 동일한 양의 예비-처리 상대물 (예를 들어, HAMA, HACA, 및 HAHA 음성)에 비해, 주어진 농도에서 약물의 약 20％ 이상의 활성을 중화시키는 샘플 (예를 들어, 약 20％ 내지 약 100％ 범위로)은 약물에 대한 중화 항체에 대해 양성인 것으로 간주될 수 있다.

본원에서 바람직한 중화 항체 분석은 2005년 2월 10일자로 공개된 US 2005/0032130 A1 (Beresini and Song)에 개시된 것이지만, 하기 실시예 1에 보다 상세히 기재된 바와 같이 다양한 관점에서 변형된다. 특히, 생물학적 샘플 (즉, 혈청)은 이제 예비-처리된 혈청이며, 셀타이터-글로(등록상표) 발광 세포 생존력 분석은 이제 알라마르 블루(상표명) (레사주린) 대신의 분석 판독이며, 사용된 대조군 항체는 염소 항-리툭시마브가 아닌 시노몰구스 원숭이 단백질 A 정제된 (HER2 흡착된) 제제이며, 완충액, 부피, 보체, 대조군, 혈청 매트릭스 효과, 데이타 분석 및 해석은 실시예 1에 기재된 바와 같이 변화되었다.

IV. 항체의 제조

본원에서 대상의 약물은 치료용 항체, 예를 들어 B-세포 표면 마커에 결합하는 것, 특히 CD20에 결합하는 것일 수 있다. 따라서, 항체 제조 방법이 여기서 기재될 것이다.

항체의 제조, 또는 스크리닝에 사용되는 항원은 예를 들어 목적하는 에피토프를 함유하는 항원 또는 그의 일부분의 가용성 형태일 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 그의 세포 표면에서 항원을 발현하는 세포는 항체를 생성하거나 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 항체 제조에 유용한 항원의 다른 형태는 당업자에게 명백할 것이다.

본 발명에 따라 사용되는 항체 제조를 위한 예시적인 기술에 대한 기재가 이어진다.

(i) 폴리클로날 항체

폴리클로날 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 아주반트의 다중 피하 (sc) 또는 복막내 (ip) 주사에 의해 동물에서 발생된다. 이는 면역화되어야 할 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 이관능성 또는 유도체화제를 이용한 대두 트립신 억제제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합) , N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂, 또는 R¹N=C=NR (여기서, R 및 R¹은 상이한 알킬기임)에 관련 항원을 접합하는데 유용할 수 있다.

동물을 예를 들어 프로인트 완전 아주반트 3 부피를 갖는 단백질 또는 접합체 (토끼 또는 마우스에 대해 각각) 100 ㎍ 또는 5 ㎍ 를 배합하고, 용액을 다중 부위에 진피내 주사함으로써 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후, 동물을 다중 부위에 피하 주사에 의해 프로인트 완전 아주반트 중 펩티드 또는 접합체의 원래 양을 1/5 내지 1/10으로 추가주사한다. 7 내지 14일 후, 동물을 채혈하고, 혈청을 항체 역가에 대해 분석한다. 동물을 역가가 안정수준에 달할 때까지 추가주사한다. 바람직하게는, 동물을 동일한 항원의 접합체로 추가주사하지만, 상이한 단백질 및/또는 상이한 가교결합 시약을 통해 접합하기도 한다. 접합체는 또한 단백질 융합물로서 재조합 세포 배양물로 제조될 수 있다. 또한, 백반과 같은 응집제가 면역 반응을 증진시키는데 적합하게 사용된다.

(ii) 모노클로날 항체

모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득되며, 즉 집단에 포함되는 개별 항체가 일반적으로 소량으로 존재하는 변이체와 같은 모노클로날 항체의 생성 동안 발생하는 가능한 변이체를 제외하고는 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합한다. 따라서, 변형어 "모노클로날"은 별개의 또는 폴리클로날 항체의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 나타낸다.

예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조될 수 있다.

하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 햄스터와 같은 다른 적절한 숙주 생물을 상기 기재된 바와 같이 면역화시켜 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 그 후, 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합화제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]).

이렇게 제조된 하이브리도마 세포를 씨딩하고, 바람직하게는 비융합된 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 없을 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이들의 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.

바람직한 골수종 세포는 효과적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고-수준 생산을 뒷받침하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 것들이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 미국 캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 살크 인스티튜트 세포 분화 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)에서 이용가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것들, 및 미국 메릴랜드주 로크빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에서 이용가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포와 같은 뮤린 골수종 세포주이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 또한 인간 모노클로날 항체의 제조를 위해 기재되었다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).

하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 항원에 대한 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법에 의해, 또는 방사성면역분석 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석에 의해 측정된다.

모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐챠드(Scatchard) 분석에 의해 측정될 수 있다.

목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석 절차에 의해 클론을 서브클로닝하고 표준 방법에 의해 성장시킨다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]). 상기 목적에 적합한 배양 배지로는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 들 수 있다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물에서의 복수 종양으로서 생체내에서 성장시킬 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체를 적합하게는 예를 들어 단백질 A-세파로스, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 통상적인 항체 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수액, 또는 혈청으로부터 분리한다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고, 시퀀싱된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 기능한다. 일단 단리하면, DNA를 발현 벡터 내에 놓은 후, 이. 콜라이(E. Coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 다르게는 항체 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포 내의 모노클로날 항체의 합성을 얻는다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 검토 논문으로는 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)] 및 [Plueckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)]을 들 수 있다.

추가의 실시양태에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여, 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에는 각각 파지 라이브러리를 이용한 뮤린 및 인간 항체의 단리가 기재되어 있다. 후속 간행물에는 사슬 셔플링에 의한 고 친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생산 (문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]), 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합적 감염 및 생체내 재조합이 기재되어 있다 (문헌 [Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)]). 따라서, 상기 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.

DNA는 또한 예를 들어 동종 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 대체함으로써 (미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형될 수 있다.

전형적으로, 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드로 항체의 불변 도메인을 치환하거나, 이들로 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인을 치환하여, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 이가 항체를 생성한다.

(iii) 인간화 항체

비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 기재되었다. 바람직하게는, 인간화 항체는 인간이 아닌 공급원으로부터 그의 내로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 상기 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "도입(import)" 잔기로 지칭되며, 이는 전형적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법에 따라, 초가변 영역 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써 수행된다 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]). 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 덜 비손상인 인간 가변 도메인이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 제4,816,567호). 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 뮤린 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

인간화 항체의 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄 둘다의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "최적(best-fit)" 방법에 따르면, 뮤린 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 그 후, 뮤린의 것과 가장 가까운 인간 서열을 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로서 수용한다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 영역을 이용한다. 동일한 프레임워크는 몇몇 여러가지 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)]).

항체가 항원에 대한 고 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것은 또한 중요하다. 상기 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따르면, 인간화 항체를 모 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 개념적인 인간화 생성물의 분석의 방법에 의해 제조한다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하며, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 형태적 구조를 예시 및 제시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 상기 디스플레이의 점검은 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린의 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기를 선택하고, 수여자 및 도입 서열로부터 결합하여 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도와 같은 목적하는 항체 특징이 달성되도록 할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 주는 것에 관여한다.

(iv) 인간 항체

인간화에 대한 대안적으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화시 내인성 이뮤노글로불린 생성의 부재하에서 인간 항체의 완전 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)를 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식 계열 돌연변이체 내의 항체 중쇄 결합 영역 (J_H)의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 초래한다고 기재되었다. 이러한 생식 계열 돌연변이체 마우스 내의 인간 생식 계열 이뮤노글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 접종시 인간 항체의 생산을 초래할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 및 미국 특허 제5,591,669호, 제5,589,369호 및 제5,545,807호를 참조한다.

대안적으로, 파지 제시 기술 (문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)])을 이용하여 인간 항체 및 항체 단편을 비면역화된 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자로부터 시험관내에서 생산할 수 있다. 상기 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 프레임 내에서 M13 또는 fd와 같은 필라멘트성 박테리오파지의 주요 또는 부 코팅 단백질 유전자 내로 클로닝하고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 제시한다. 필라멘트성 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 기재로 하는 선별은 또한 상기 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선별을 초래한다. 따라서, 파지는 B-세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 제시는 다양한 형태로 수행될 수 있으며, 그의 검토를 위해서는 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조한다. V-유전자 절편의 몇몇 공급원은 파지 제시에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 비면역화된 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리를 구축할 수 있으며, 항원의 다양한 어레이에 대한 항체 (자가-항원 포함)은 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라 본질적으로 단리할 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호를 참조한다.

상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관내에서 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다 (미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조).

(v) 항체 단편

항체 단편의 제조를 위한 다양한 기술이 발달되었다. 전통적으로, 상기 단편은 비손상 항체의 단백질분해성 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 상기 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편을 이. 콜라이로부터 직접적으로 회수하고, 화학적으로 커플링시켜 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또다른 접근법에 따르면, F(ab')₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 항체 단편을 제조하는 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택의 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호를 참조한다. 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

(vi) 이중특이적 항체

이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 B 세포 표면 마커의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 이러한 항체는 B 세포 표면 마커에 결합하고, 추가로 제2의 B-세포 표면 마커에 결합할 수 있다. 대안적으로, B-세포 표면 마커 결합 팔(arm)은 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2 또는 CD3)와 같은 백혈구, 또는 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)와 같은 Fc 수용체 상의 촉발 분자에 결합하는 팔과 결합되어 B 세포에 대한 세포 방어 메카니즘에 집중할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 세포독성제를 B 세포를 발현하는 세포에 위치화시키는데 사용될 수 있다. 상기 항체는 B 세포-결합팔, 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)을 결합시키는 팔을 갖는다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')₂ 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.

이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 제조는 2개의 쇄가 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현을 기초로 한다 (문헌 [Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위적 구분 때문에, 상기 하이브리도마 (콰드로마)는 단지 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산한다. 통상적으로 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거로우며, 생성물 수율은 낮다. 유사한 절차는 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.

상이한 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)는 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 이는 하나 이상의 융합물에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합물, 및 필요할 경우 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 별개의 발현 벡터 내로 삽입되며, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염된다. 이는 구축에 사용되는 3개의 폴리펩티드 쇄의 비동일한 비율이 최적 수율을 제공하는 실시예에서, 3개의 폴리펩티드의 상호 비율을 조정하는 큰 융통성을 제공한다. 그러나, 2개 이상의 폴리펩티드 쇄의 동일한 비율의 발현이 높은 수율을 초래할 경우 또는 비율이 특정 유의성이 없는 경우, 하나의 발현 벡터 내의 2개 또는 모든 3개의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.

상기 접근법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 하나의 팔에 제1 결합 특이성을 갖는 혼성 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른 팔에 혼성 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 이루어진다. 상기 비대칭 구조는, 이중특이적 분자의 단지 절반 내의 이뮤노글로불린 경쇄의 존재가 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에, 목적하는 이중특이적 화합물의 원하지 않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터의 분리를 용이하게 한다. 상기 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 보다 상세한 내용에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.

미국 특허 제5,731,168호에 기재된 또다른 접근법에 따르면, 항체 분자의 쌍 사이의 계면을 유전자조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수된 이종이량체의 퍼센트를 최대화할 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 적어도 일부의 C_H3 도메인을 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)으로 대체된다. 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보충적 "공동"은, 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원하지 않는 최종 생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.

이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 것은 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염의 치료를 위한 것으로 제안된다 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089). 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 다수의 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 또한 문헌에 기재되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학 결합을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]에는 비손상 항체를 단백질분해적으로 절단하여 F(ab')₂ 단편을 생성하는 절차가 기재되어 있다. 상기 단편을 티올 착물화제 나트륨 아르세나이트의 존재하에서 환원시켜 근접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 그 후, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민을 사용한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고, 다른 Fab'-TNB 유도체의 동몰량과 혼합하여 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용될 수 있다.

재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하는 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 제조될 수 있다 (문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성한 후, 재산화시켜 항체 이종이량체를 형성하였다. 상기 방법은 또한 항체 동종이량체의 제조에 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하는 별법의 메카니즘을 제공하였다. 단편은, 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 이룰 수 없는 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 V_H 및 V_L 도메인은 또다른 단편의 상보적 V_L 및 V_H 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하는 또다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.

2 이상의 결합가(valence)를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다 (문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991)]).

V. 면역어드헤신의 제조

본원에서 약물은 또다른 실시양태에서 면역어드헤신, 예를 들어 BR3-Ig 또는 TNF-α 면역어드헤신일 수 있다. 면역어드헤신을 제조하는 예시적인 방법은 하기에 보다 상세히 기재되어 있다.

가장 단순하고 가장 직접적인 면역어드헤신 설계는 어드헤신의 결합 도메인(들) (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인 (ECD))과 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역을 조합한다. 통상적으로, 본 발명의 면역어드헤신의 제조시, 어드헤신의 결합 도메인을 코딩하는 핵산은 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 N-말단을 코딩하는 핵산에 C-말단적으로 융합될 것이지만, N-말단 융합도 가능하다.

전형적으로, 이러한 융합에서, 코딩된 키메라 폴리펩티드는 적어도 기능적으로 활성인 힌지, 이뮤노글로불린 중쇄의 불변 영역의 C_H2 및 C_H3 도메인을 보유할 것이다. 융합은 또한 불변 도메인의 Fc 부분의 C-말단, 또는 중쇄의 C_H1에 대한 바로 N-말단 또는 경쇄의 상응하는 영역에 대해 이루어진다. 융합이 이루어지는 정확한 부위는 중요하지 않으며, 특정 부위는 널리 공지되어 있고, 면역어드헤신의 생물학적 활성, 분비, 또는 결합 특징을 최적화하기 위해 선택될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 어드헤신 서열은 이뮤노글로불린 G₁ (IgG₁)의 Fc 영역의 N-말단에 융합된다. 전체 중쇄 불변 영역을 어드헤신 서열에 융합시키는 것이 가능하다. 하지만, 보다 바람직하게는, IgG Fc를 화학적으로 한정하는 파파인 절단 부위의 상류의 힌지에서 시작하는 서열 (즉, 잔기 216, 중쇄 불변 영역의 제1 잔기를 114로 할 때), 또는 다른 이뮤노글로불린의 유사한 부위가 융합에 사용된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 어드헤신 아미노산 서열은 IgG 중쇄의 (a) 힌지 영역 및 C_H2 및 C_H3 또는 (b) C_H1, 힌지, C_H2 및 C_H3 도메인에 융합된다.

이중특이적 면역어드헤신에 대해, 면역어드헤신은 밀리리터로, 특히 이종이량체 또는 이종사량체로 집합된다. 일반적으로, 이러한 집합된 이뮤노글로불린은 공지된 단위 구조를 가질 것이다. 기본적인 4가지 쇄 구조적 단위는 IgG, IgD, 및 IgE가 존재하는 형태이다. 4가지 쇄 단위는 보다 높은 분자량 이뮤노글로불린에서 반복되며, IgM은 일반적으로 디술피드 결합에 의해 함께 잡혀진 4가지 기본적인 단위의 오량체로서 존재한다. IgA 글로불린, 및 때때로 IgG 글로불린은 또한 혈청에서 다량체 형태로 존재한다. 다량체의 경우, 4가지 단위 각각은 동일하거나 상이할 수 있다.

본원의 범위 내에서의 다양한 예시적인 집합된 면역어드헤신은 하기에 개략적으로 도해되어 있다.

(a) AC_L-AC_L;

(b) AC_H-(AC_H, AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H, 또는 V_LC_L-AC_H);

(C) AC_L-AC_H-(AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H, V_LC_L-AC_H, 또는 V_LC_L-V_HC_H);

(d) AC_L-V_HC_H-(AC_H, 또는 AC_L-V_HC_H, 또는 V_LC_L-AC_H);

(e) V_LC_L-AC_H-(AC_L-V_HC_H, 또는 V_LC_L-AC_H); 및

(f) (A-Y)_n-(V_LC_L-V_HC_H)₂,

상기 식들에서, 각각의 A는 동일하거나 상이한 어드헤신 아미노산 서열을 나타내고;

V_L은 이뮤노글로불린 경쇄 가변 도메인이고;

V_H는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 도메인이고;

C_L은 이뮤노글로불린 경쇄 불변 도메인이고;

C_H는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인이고;

n은 1 초과의 정수이고;

Y는 공유 가교결합제의 잔기를 나타낸다.

간결함을 위하여, 상기 구조는 단지 중요한 특징으로만 나타낸다; 이는 결합 (J) 또는 이뮤노글로불린의 다른 도메인을 나타내지 않으며, 도시된 디술피드 결합도 아니다. 하지만, 이러한 도메인이 결합 활성에 필요할 경우, 이는 이들이 이뮤노글로불린 분자에서 점령하는 통상적인 위치에 존재하는 것으로 간주될 것이다.

대안적으로, 어드헤신 서열은 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 서열 사이에 삽입되어, 키메라 중쇄를 포함하는 이뮤노글로불린이 수득되도록 할 수 있다. 상기 실시양태에서, 어드헤신 서열은 힌지 및 C_H2 도메인 사이, 또는 C_H2 및 C_H3 도메인 사이에서 이뮤노글로불린의 각각의 팔 내의 이뮤노글로불린 중쇄의 3' 말단에 융합된다. 유사한 구조는 문헌 [Hoogenboom, et al., Mol. Immunol. 28:1027-1037 (1991)]에 의해 보고되었다.

이뮤노글로불린 경쇄의 존재가 본 발명의 면역어드헤신에 요구되는 것은 아니지만, 이뮤노글로불린 경쇄는 어드헤신-이뮤노글로불린 중쇄 융합 폴리펩티드에 공유 결합되거나, 어드헤신에 직접 융합될 수 있다. 전자의 경우, 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 전형적으로 어드헤신-이뮤노글로불린 중쇄 융합 단백질과 공동발현된다. 분비시, 혼성 중쇄 및 경쇄는 공유 결합되어 2개의 디술피드-결합된 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 이뮤노글로불린-유사 구조를 제공할 것이다. 이러한 구조의 제조에 적합한 방법은 예를 들어 1989년 3월 28일자로 허여된 미국 특허 제4,816,567호에 개시되어 있다.

면역어드헤신은 프레임내 어드헤신 부분을 코딩하는 cDNA 서열 이뮤노글로불린 cDNA 서열에 융합시킴으로써 가장 편리하게 작제된다. 하지만, 게놈 이뮤노글로불린 단편에의 융합이 또한 이용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Aruffo et al., Cell 61:1303-1313 (1990)]; 및 [Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144 (1991)] 참조). 후자의 융합 유형은 발현을 위해 Ig 조절 서열의 존재를 필요로 한다. IgG 중쇄 불변 영역을 코딩하는 cDNA는 혼성화 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술에 의해, 비장 또는 말초 혈액 림프구로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터 공개된 서열을 기초로 단리될 수 있다. "어드헤신" 및 면역어드헤신의 이뮤노글로불린 부분을 코딩하는 cDNA는 선택된 숙주 세포에서 효과적인 발현을 지정하는 플라스미드 벡터 내로 탠덤하게 삽입될 수 있다.

본원에서 면역어드헤신은 예를 들어 WO 02/092620에 기재된 바와 같이 제조될 수 있는 폴리펩티드를 포함한다.

대상의 면역어드헤신을 기재하고 있는 다른 공보로는 BCMA-Fc를 기재하고 있는 WO 01/12812; BAFF-R-Fc에 관한 WO 02/24909; TACI-Ig에 관한 WO 00/40716 등을 들 수 있다.

VI. 항체 또는 면역어드헤신의 접합체 및 다른 변형

본원에서 항체 또는 면역어드헤신은 임의로 또다른 작용제, 예컨대 세포독성제 또는 사이토킨 (예를 들어, IL2; 예를 들어, WO2005/016969 참조)에 접합된다.

접합은 통상적으로 공유 결합을 통해 달성되며, 그의 정확한 성질은 표적화 분자 및 CD20 길항제 또는 항체 폴리펩티드 상의 결합 부위에 의해 결정될 것이다. 전형적으로, 비-펩티드성 작용제는 그의 아미노산 측쇄, 탄수화물 쇄, 또는 화학적 개질에 의해 항체 또는 면역어드헤신 상에 도입된 반응성 기를 통해 항체 또는 면역어드헤신에 접합되도록 하는 링커의 첨가에 의해 개질된다. 예를 들어, 약물은 리신 잔기의 ε-아미노기를 통해, 유리 α-아미노기를 통해, 시스테인 잔기에 대한 디술피드 교환에 의해, 또는 과요오드산으로 탄수화물 쇄의 1,2-디올을 산화시킴으로써 부착되어 쉬프-염기 결합을 통해 다양한 친핵체를 함유하는 약물을 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,256,833호를 참조한다. 단백질 개질제로는 아민-반응성 시약 (예를 들어, 반응성 에스테르, 이소티오시아네이트, 알데히드, 및 술포닐 할라이드), 티올-반응성 시약 (예를 들어, 할로아세틸 유도체 및 말레이미드), 및 카르복실산- 및 알데히드-반응성 시약을 들 수 있다. CD20 길항제 또는 항체 폴리펩티드는 이관능성 가교결합 시약의 사용을 통해 펩티드성 작용제에 공유 결합될 수 있다. 헤테로이관능성 시약은 보다 통상적으로 사용되며 2개의 상이한 반응성 잔기 (예를 들어, 아민-반응성 플러스 티올, 요오도아세트아미드, 또는 말레이미드)의 사용을 통해 2개의 상이한 단백질의 제어된 커플링을 가능하게 한다. 이러한 결합제의 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,671,958호를 참조한다. 펩티드성 링커는 또한 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 면역어드헤신은 융합 폴리펩티드의 제조를 통해 펩티드성 잔기에 결합될 수 있다.

추가의 이관능성 단백질 커플링제의 예로는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미노에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 들 수 있다.

대안적으로, 항체/면역어드헤신 및 작용제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다.

항체 또는 면역어드헤신의 다른 변형은 본원에서 고려된다. 예를 들어, 항체 면역어드헤신은 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 결합될 수 있다.

본원에 개시된 항체 또는 면역어드헤신은 또한 리포좀으로 제제화될 수 있다. 길항제 또는 항체를 함유하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 에컨대 문헌 [Epstein et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)]; [Hwang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)]; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 1997년 10월 23일자로 공개된 WO 97/38731에 기재된 방법에 의해 제조된다. 증대된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀을 한정된 공극 크기의 필터를 통해 압출하여 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 문헌 [Martin et al. J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 디술피드 상호교환 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 화학요법제는 임의로 리포좀 내에 함유된다. 문헌 [Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989)]를 참조한다.

항체 또는 이뮤노글로불린의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체 또는 이뮤노글로불린의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산 내로 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및/또는 잔기 내로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구조물이 목적하는 특징을 갖는다면, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어져 최종 구조물에 도달한다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같이 항체의 번역후 과정을 변화시킬 수 있다.

돌연변이유발에 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발법"이라 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 기 (예를 들어, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기)를 확인하고, 이를 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 준다. 그 후, 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 상기 아미노산 위치를 치환 부위에서, 또는 그에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개량한다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 예정되는 반면, 돌연변이의 성질 그 자체는 예정될 필요가 없다. 예를 들어, 돌연변이의 성능을 주어진 부위에서 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고, 발현된 항체 변이체를 목적하는 활성에 대해 스크리닝한다.

아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기 내지 100 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드의 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 들 수 있다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소, 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.

또다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 상기 변이체는 상이한 잔기로 대체된 항체 분자 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이유발법에 가장 큰 관심 부위로는 초가변 영역 또는 CDR을 들 수 있지만, FR 또는 Fc 영역 변경도 고려된다. 보존적 치환은 표 2에 "바람직한 치환"이라는 표제하에 나타나 있다. 이러한 치환이 생물학적 활성에 변화를 초래할 경우, 표 2의 "예시적인 치환"으로 명명된, 또는 아미노산 부류에 대해 하기에 추가로 기재된 바와 같은 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물이 스크리닝될 수 있다.

항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 쉬트 또는 나선 형태로서의 치환의 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 크기를 유지하는 그의 효과에 있어서 상당히 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 아미노산은 그의 측쇄의 특성에 있어서의 유사성에 따라 분류된다 (문헌 [A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]):

(1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) 비하전된 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) 산성: Asp (D), Glu (E)

(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H)

대안적으로, 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 기재한 기로 나누어질 수 있다.

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 상기 부류 중 하나의 구성원으로 또다른 구성원을 교환하는 것을 수반할 것이다.

또한, 일반적으로 항체의 완전한 형태를 유지하는데 관련되지 않는 임의의 시스테인 잔기를 세린으로 치환하여 분자의 산화 안정성을 개선시키고 비정상적 가교결합을 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)을 항체에 첨가하여 그의 안정성을 개선시킬 수 있다 (특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편일 경우).

특히 바람직한 유형의 치환 변이체는 모 항체 (예를 들어, 인간화 항체 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 이들이 생성되는 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 제시를 사용한 친화도 성숙을 포함한다. 간략히, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6 내지 7 부위)를 돌연변이시켜 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성할 수 있다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각각의 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에의 융합으로서 필라멘트성 파지 입자로부터의 일가 형태로 제시된다. 그 후, 파지-제시된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 그의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발법을 수행하여 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 확인하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 본원에 설명된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가의 개발을 위해 선택할 수 있다.

항체의 또다른 유형의 아미노산 변이체는 항체 또는 면역어드헤신의 원래 글리코실화 패턴을 변경한다. 이러한 변경은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 부분을 결실시키고/거나 항체 또는 면역어드헤신에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 첨가하는 것을 의미한다.

폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 부분이 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 부분의 아스파라긴 측쇄에의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내에 상기 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 당, 즉 N-아세일갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록실리신도 사용될 수 있다.

글리코실화 부위의 항체에의 첨가는 편리하게는 이것이 하나 이상의 상기 기재된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위에 대해). 변경은 또한 원래 단백질의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 그것으로의 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위에 대해).

항체가 Fc 영역을 포함할 경우, 그에 부착된 임의의 올리고당류 구조는 변경될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스가 없는 성숙한 탄수화물 구조를 갖는 항체는 미국 특허 출원 제US 2003/0157108 A1 (Presta. L.)에 기재되어 있다. 또한, US 2004/0093621 A1 (교와 하꼬 고교 가부시끼가이샤(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))를 참조한다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고당류 구조 내에 이등분 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 갖는 항체는 WO 03/011878 (Jean-Mairet et al.) 및 미국 특허 제6,602,684호 (Umana et al.)에 기재되어 있다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고당류 구조 내에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체는 WO 97/30087 (Patel et al.)에 보고되어 있다. 또한, 그의 Fc 영역에 부착된 변경된 탄수화물을 갖는 항체에 관한 WO 98/58964 (Raju, S.) 및 WO 99/22764 (Raju, S.)를 참조한다.

본원에서 바람직한 글리코실화 변이체는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조는 푸코스가 결여되어 있다. 이러한 변이체는 개선된 ADCC 기능을 갖는다. 임의로, Fc 영역은 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334에서의 치환을 추가로 포함한다 (잔기의 Eu 넘버링). "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체에 관한 공보의 예로는 미국 특허 출원 제US 2003/0157108 A1호 (Presta, L); WO 00/61739 A1; WO 01/29246A1; US 2003/0115614 A1; US2002/0164328A1; US 2004/0093621 A1; US 2004/0132140 A1; US 2004/0110704 A1; US 2004/0110282 A1; US 2004/0109865 A1; WO 03/085119 A1; WO 03/084570 A1; WO 2005/035778; WO 2005/035586 (푸코실화의 RNA 억제 (RNAi)를 기재); 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]을 들 수 있다. 탈푸코실화된 항체를 생성하는 세포주의 예로는 단백질 푸코실화에 결함이 있는 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 제US 2003/0157108 A1호 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al, 특히 실시예 11), 및 넉아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포 (문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)])를 들 수 있다.

아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 상기 방법으로는 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 초기에 제조된 변이체 또는 비-변이체 형태의 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

예를 들어 항체의 항원-의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 증진시키기 위해, 본 발명의 항체를 효과기 기능에 대해 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 항체의 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입하여 상기 영역에서 쇄간 디술피드 결합을 형성할수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체성 항체는 개선된 내부화 능력 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 사멸 및 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)]을 참조한다. 증진된 항종양 활성을 갖는 동종이량체성 항체는 또한 문헌 [Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 이종이관능성 가교결합제를 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 항체는 이중 Fc 영역을 갖고 그에 의해 증진된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가지도록 유전자조작될 수 있다. 문헌 [Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)]을 참조한다.

WO 00/42072 (Presta, L.)에는 그의 Fc 영역 내에 아미노산 치환을 포함하는, 인간 효과기 세포의 존재하에서 개선된 ADCC 기능을 갖는 항체가 기재되어 있다. 바람직하게는, 개선된 ADCC를 갖는 항체는 Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334에 치환을 포함한다 (잔기의 Eu 넘버링). 바람직하게는, 변경된 Fc 영역은 상기 위치의 1개, 2개 또는 3개에 치환을 포함하거나 이로 이루어지는 인간 IgG1 Fc 영역이다. 이러한 치환은 C1q 결합 및/또는 CDC가 증가된 치환(들)과 임의로 조합된다.

변경된 C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖는 항체는 WO 99/51642, 미국 특허 제6,194,551 B1호, 미국 특허 제6,242,195 B1호, 미국 특허 제6,528,624 B1호 및 미국 특허 제6,538,124호 (Idusogie et al.)에 기재되어 있다. 항체는 그의 Fc 영역의 하나 이상의 아미노산 위치 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 및/또는 334에 아미노산 치환을 포함한다 (잔기의 Eu 넘버링). 위치 326, 327, 333 및/또는 334에서의 하나 이상의 잔기의 치환은 C1q 결합 및/또는 CDC 기능을 개선시킬 수 있다.

항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이 구조(salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체 (특히 항체 단편) 내로 혼입할 수 있다. 본원에 사용된 "구조 수용체 결합 에피토프"라는 용어는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기의 증가를 담당하는 IgG 분자 (예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.

신생아 Fc 수용체 (FcRn)에의 결합이 개선되고 증가된 반감기를 갖는 항체는 WO 00/42072 (Presta, L.) 및 US 2005/0014934 A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 상기 항체는 Fc 영역의 FcRn에의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 예를 들어, Fc 영역은 위치 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 또는 434 (잔기의 Eu 넘버링) 중 하나 이상에 치환을 가질 수 있다. FcRn 결합이 개선된 바람직한 Fc 영역-포함 항체 변이체는 그의 Fc 영역의 위치 307, 380 및 434 중 1, 2 또는 3개에 아미노산 치환을 포함한다.

3개 이상의 (바람직하게는 4개) 관능성 항원 결합 부위를 갖는 유전자조작된 항체가 또한 고려된다 (미국 특허 출원 제US 2002/0004587 A1호, Miller et al.).

VII. 제약 제제

본 발명에 따라 사용되는 항체 또는 면역어드헤신의 조성물의 치료 제제는 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체를 혼합함으로써 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]), 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 저장용으로 제조될 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이며, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로펠 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류; 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터-이온; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 트윈(TWEEN)(상표명), 플루로닉스(PLURONICS)(상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 들 수 있다.

예시적인 항-CD20 항체 제제는 WO 98/56418에 기재되어 있다. 상기 공보는 40 mg/mL 리툭시마브, 25 mM 아세테이트, 150 mM 트레할로스, 0.9％ 벤질 알코올, 0.02％ 폴리소르베이트 20 (pH 5.0) (2 내지 8℃에서 2년의 저장의 최소 저장 수명을 가짐)을 포함하는 액체 다회투여량 제제를 기재한다. 또다른 대상의 항-CD20 제제는 9.0 mg/mL 염화나트륨, 7.35 mg/mL 나트륨 시트레이트 디히드레이트, 0.7 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 주사용 멸균수 (pH 6.5) 중 1O mg/mL 리툭시마브를 포함한다.

피하 투여에 적합한 동결건조된 제제는 미국 특허 제6,267,958호 (Andya et al.)에 기재되어 있다. 이러한 동결건조된 제제는 적합한 희석제로 고 단백질 농도로 재구성될 수 있으며, 재구성된 제제는 본원에서 치료되는 포유통물에게 피하 투여될 수 있다.

항체 또는 면역어드헤신의 결정화된 형태는 또한 고려된다. 예를 들어, US 2002/0136719 A1 (Shenoy et al.)을 참조한다.

본원의 제제는 또한 치료될 특정 증상에 필요한 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 보충적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 하기 치료 섹션에 개시된 것과 같은 제2 의약을 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 다른 작용제의 유형 및 유효량은 예를 들어 제제에 존재하는 항체의 양, 치료될 자가면역 질환의 유형, 및 대상체의 임상적 파라미터에 의존한다. 이는 일반적으로 상기 사용된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로 또는 상기 사용된 투여량의 약 1 내지 99％로 사용된다.

활성 성분은 또한 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에서, 또는 매크로에멀젼에서, 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의해, 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 매트릭스가 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태인 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 루프론 데포(LUPRON DEPOT)(상표명) (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 미소구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 들 수 있다.

생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성된다.

VII. 자가면역 질환 대상체의 치료

본원에서 본 발명은 대상체에게 치료용 항체, 면역어드헤신, 또는 다른 생물학적 약물을 대상체에게 투여하여 자가면역 질환을 치료하는 단계; 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플로부터 이뮤노글로불린을 친화도 정제하는 단계; 및 정제된 이뮤노글로불린을 중화 항체 분석에 적용하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환을 갖는 대상체의 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 생물학적 샘플은 혈청이며, 중화 항체 분석의 성능을 간섭하는 간섭을 함유하는 것으로 밝혀졌을 수 있다.

본원에서 치료될 수 있는 다양한 자가면역 질환은 상기 정의 섹션에 기재되어 있다. 예시적인 바람직한 자가면역 질환으로는 자가면역 류마티스성 장애 (예컨대, 류마티스성 관절염 (RA), 쇼그렌 증후군, 공피증, 루푸스, 예컨대 SLE 및 루푸스 신장염, 다발근육염/피부근육염, 한랭글로불린혈증, 항-인지질 항체 증후군, 건선성 관절염), 자가면역 위장관 및 간 장애 (예컨대, 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 결장염 및 크론병), 자가면역 위염 및 악성 빈혈, 자가면역 간염, 원발성 담관성 간경화증, 원발성 경화성 담관염, 만성소화장애증), 혈관염 (ANCA-관련된 혈관염, 처크-스트라우스 혈관염, 베게너 육아종증, 및 다발동맥염), 자가면역 신경계 장애 (예컨대, 다발성 경화증, 안구진탕 근경련 증후군, 중증 근무력증, 시신경 척수염, 파킨슨병, 알츠하이머병, 자가면역 다발신경병증), 신장 장애 (사구체신염, 굿패스쳐 증후군, 베게너병), 자가면역 피부 질환 (건선, 두드러기, 심상성 천포창, 수포성 유천포창, 피부 홍반성 루푸스), 혈액 장애 (혈소판감소 자반증, 혈전성 혈소판감소 자반증, 수혈후 자반증, 자가면역 용혈성 빈혈), 죽상경화증, 포도막염, 자가면역 청력 질환, 예컨대 내이 질환 및 난청, 베체트병, 레이노 증후군, 장기 이식, 및 자가면역 내분비 장애 (당뇨병-관련된 자가면역 질환, 애디슨병, 자가면역 갑상선 질환 (그레이브스병, 갑상선염)을 들 수 있다. 보다 바람직한 자가면역 증상으로는 류마티스성 관절염 (RA), SLE, 궤양성 결장염, ANCA-관련된 혈관염, 루푸스, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 그레이브스병, IDDM, 악성 빈혈, 갑상선염, 및 사구체신염을 들 수 있으며, RA 및 SLE가 본원의 목적상 가장 바람직하다.

본원에서 바람직한 치료용 항체는 B-세포 표면 마커에 결합하는 항체, 가장 바람직하게는 CD20 항체, 가장 바람직하게는 키메라, 인간화, 또는 인간 CD20 항체, 보다 바람직하게는 리툭시마브, 인간화 2H7, 2F2 (HuMax-CD20) 인간 CD20 항체 (젠맵), 인간화 A20 항체 (이뮤노메딕스), 항-CD20 아우리스타틴 E 접합체 (시애틀 제네틱스), 항-CD20-IL2 (EMD/바이오베이션/시티 오브 호프), 항-CD20 MAb 요법 (에피사이트), 또는 항-CD20 항체 TRU 015 (트루비온) 등이다. 보다 더 바람직한 것은 리툭시마브 또는 인간화 2H7이다.

본원에서 대상의 다른 치료용 항체 또는 면역어드헤신으로는 리툭시마브, 인간화 2H7, 2F2 (HuMax-CD20) 인간 CD20 항체, 인간화 A20 항체 또는 IMMU-106, TRU 015, 종양 괴사 인자 (TNF)-α 항체, 인플릭시마브, CDP571, MAK-195, 아달리무마브, 페길화 TNF-α 항체 단편, CDP-870, 항-TNF-α 폴리클로날 항체, PassTNF, 인테그린 항체, 에팔리주마브, 나탈리주마브, BAFF 항체, BR3 항체, BAFF 수용체 항체, Blys 항체, 벨리무마브, CD37 항체, TRU 016, CD22 항체, 에프라투주마브, 아비오겐 CD22 항체, CMC 544, 콤보톡스, BL22, LIF 226, VEGF 항체, VEGF 수용체 항체, 베바시주마브, 항-HER 항체, 트라스투주마브, 페르투주마브, 세툭시마브, 항-IgE 항체, 오말리주마브, IL-21 항체, 임페론 항-B 세포 항체, 1D09C3, Lym-1 항체, 온코라임, ISF 154, 고밀릭시마, BL-6 수용체 항체, 아틀리주마브, IL-15 항체, HuMax-Il-15, 케모카인 수용체 항체, CCR2 항체, MLN1202, 항-보체 항체, C5 항체, 에쿨리주마, 인간 이뮤노글로불린의 경구 제제, IgPO, IL-12 항체, ABT-874, 테넬릭시마브, CD40 항체, 인간화 S2C6, TNX 100, CD52 항체, 캄패스-1H, 및 αvβ3 항체를 들 수 있다.

항체가 CD20 항체, 예컨대 리툭시마브 또는 인간화 2H7일 경우, 항체는 1 gm x 2, 375 mg/m² x 4 등으로서 투여량화될 수 있다. 바람직하게는, 2회 이상의 항체 노출이 대략 매 6개월마다, 또는 대략 매 12개월마다 주어진다.

항체는 비경구, 국소, 피하, 복막내, 폐내, 비내, 및/또는 병변내 투여를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내 또는 피하 투여를 들 수 있다. 경막내 투여가 또한 고려된다 (예를 들어, 미국 특허 출원 제2002/0009444호, Grillo-Lopez, A, CD20 항체의 경막내 전달에 관한 것). 바람직하게는, 투여량은 정맥내 또는 피하로 주어진다.

치료용 항체, 면역어드헤신 또는 다른 생물학적 작용제는 자가면역 질환을 투여하기 위해 단일-작용제로서 투여될 수 있는 반면, 일반적으로 치료용 항체 또는 면역어드헤신은 1종 이상의 제2 의약(들)과 조합될 것이다. 예를 들어, RA 및 다른 자가면역 질환에 대해, 항체, 면역어드헤신 또는 다른 생물학적 약물은 바람직하게는 상기 정의 섹션에 열거된 면역억제제, 화학요법제, BAFF 길항제, 인테그린 길항제 또는 항체, 및/또는 사이토킨 중 임의의 1종 이상; 1종 이상의 질환-조절 항류마티스 약물 (DMARD), 예컨대 히드록시클로로퀸, 술파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 아자티오프린, D-페니실아민, 금 (경구), 금 (근육내), 미노시클린, 시클로스포린; 스타필로코쿠스 단백질 A 면역흡착; 정맥내 이뮤노글로불린 (IVIG); 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID); 글루코코르티코이드 (예를 들어, 관절 주사를 통해); 코르티코스테로이드 (예를 들어, 메틸프레드니솔론 및/또는 프레드니손); 엽산; 항-종양 괴사 인자 (TNF) 길항제, 예를 들어 에타너셉트/엔브렐(상표명), 인플릭시마브/레미케이드(상표명), D2E7 (놀) 또는 CDP-870 (셀테크); IL-IR 길항제 (예를 들어, 키너트); IL-10 길항제 (예를 들어, 일로데카킨); 혈액 응고 조절제 (예를 들어, 윈로(WinRho)); IL-6 길항제/항-TNF (CBP 1011); CD40 길항제 (예를 들어, IDEC 131); Ig-Fc 수용체 길항제 (MDX33); 면역조절제 (예를 들어, 탈리도미드 또는 ImmuDyn); 항-CD5 항체 (예를 들어, H5g1.1); 대식세포 억제제 (예를 들어, MDX 33); 공동자극성 차단제 (예를 들어, BMS 188667 또는 톨레리마브); 보체 억제제 (예를 들어, h5G1.1, 3E10 또는 항-분해 촉진 인자 (DAF) 항체); IL-2 길항제 (zxSMART); EGFR 억제제 (상기 정의 참조); 티로신 키나제 억제제 (상기 정의 참조); 항-혈관신생제 (예를 들어, VEGF 항체, 예컨대 베바시주마브); CD22 항체, 예컨대 LL2 또는 에프라투주마브 (림포시드(등록상표); 이뮤노메딕스), 예컨대 에프라투주마브 Y-90 (문헌 [Juweid et al. Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995)]), 아비오겐의 CD22 항체 (아비오겐, 이탈리아), CMC 544 (와이어스/셀테크), 콤보톡스 (UT 사우트웨스턴), BL22 (NIH), 및 림포스캔 Tc99 (이뮤노메딕스); EpCAM 항체, 예컨대 17-1A (파노렉스(등록상표)); αvβ3 항체 (예를 들어 비탁신(등록상표); 메드이뮨); CD37 항체, 예컨대 TRU 016 (트루비온); IL-21 항체 (지모제네틱스/노보 노르디스크); 항-B 세포 항체 (임페론); B 세포 표적화 MAb (이뮤노젠/아벤티스); 1D09C3 (모르포시스/GPC); 림포래드 131 (HGS); Lym-1 항체 Y-90 (USC); LIF 226 (인핸스드 라이프사이언스); BAFF 항체 (예를 들어, WO 03/33658); BAFF 수용체 항체 (예를 들어, WO 02/24909); BR3 항체; Blys 항체, 예컨대 벨리무마브; 림포스타트-B(상표명); 항-Lym-1 온코라임 (USC/페레그린); ISF 154 (UCSD/로슈/트라겐); 고밀릭시마 (아이덱 152; 바이오젠 아이덱); IL-6 수용체 항체, 예컨대 아틀리주마브 (악템라(상표명); 추가이/로슈); IL-15 항체, 예컨대 HuMax-Il-15 (젠맵/암젠); 케모카인 수용체 항체, 예컨대 CCR2 항체 (예를 들어 MLN1202; 밀레니엄); 항-보체 항체, 예컨대 C5 항체 (예를 들어, 에쿨리주마브, 5G1.1; 알렉시온); 인간 이뮤노글로불린의 경구 제제 (예를 들어, IgPO; 프로테인 테라퓨틱스); IL-12 항체, 예컨대 ABT-874 (CAT/애보트); 테넬릭시마브 (BMS-224818); B 세포 백신; DN-BAFF (젠코어); CRx-119 (콤비네이토Rx); 암젠의 BAFF 길항제; 펜토스타틴 (화이자); IC-485 (ICOS); 케모카인 길항제, 예컨대 T-487 (툴라리크) 또는 레티쿨로스 (AVR-118); SCO-323 (SCIOS); 인테그린 길항제 683699, 타나베, NGD-2001-1 (뉴로젠); SCIO-469 (SCIOS); BIRB-796 (뵈링거 잉겔하임); VX702, VX850 (베르텍스); 류코트리엔 B-4 길항제 (예컨대, 아멜루번트, BIIL-284; BI); 미소관 조절제 (팍시드; 안지오테크); 프로테아제 억제제 (MBS561392; BMS); AGIX-4207 (아테로제닉스); ISIS-104838 (ISIS/엘란); MFG-IRAP (피츠버그 대학교); IL-I Trap (RGN-303; 레제네론(Regeneron)/노파르티스); 오프렐베킨 (와이어스); 에베롤리무스 (세르티칸; 노파르티스); 아메비브(Amevive) (바이오젠 아이덱); ORG-39141 (오르가논(Organon)); FK-506 (후지사와); IL-2 길항제 (타크롤리무스; 후지사와) 등과 조합된다.

제2 의약은 치료용 항체 또는 면역어드헤신의 초기 노출 및/또는 후기 노출과 함께 투여될 수 있으며, 이러한 조합된 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 이용한 공동-투여, 및 임의의 순서의 연속 투여를 포함하며, 여기서 바람직하게는 활성제 둘다 (또는 전부)가 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 시기가 있다.

항체 또는 면역어드헤신을 대상체에게 직접적으로 투여하는 것 이외에, 본 발명은 유전자 요법에 의한 항체 또는 면역어드헤신의 투여를 고려한다. 이러한 항체를 코딩하는 핵산의 투여는 "유효량"의 항체를 투여한다는 표현에 포함된다. 예를 들어, 세포내 항체를 생성하는 유전자 요법의 사용에 관한 1996년 3월 14일자로 공개된 WO 96/07321을 참조한다.

핵산 (임의로, 벡터에 함유됨)을 대상체의 세포 내로 주입하는, 생체내 및 생체외의 2가지 주요한 접근법이 있다. 생체내 전달을 위해, 핵산을 통상적으로 항체가 요구되는 부위에서 대상체에게 직접적으로 투여한다. 생체외 치료를 위해, 대상체의 세포를 제거하고, 핵산을 상기 단리된 세포 내로 도입하고, 변형된 세포를 직접적으로 대상체에게 투여하거나, 또는 예를 들어 대상체에게 이식된 다공성 막 내로 캡슐화시킨다 (예를 들어 미국 특허 제4,892,538호 및 제5,283,187호 참조). 핵산을 생존가능한 세포 내로 도입하는데 이용가능한 다양한 기술이 있다. 기술은 핵산이 의도되는 숙주 세포에서 시험관내에서 또는 생체내에서 배양된 세포 내로 전달되는지 여부에 따라 다양하다. 핵산의 포유통물 내로의 시험관내 전달에 적합한 기술로는 리포좀의 사용, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등을 들 수 있다. 유전자의 생체외 전달에 통상적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.

현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술로는 바이러스 벡터 (예컨대, 아데노바이러스, 단순 헤르페스 I 바이러스, 또는 아데노-관련된 바이러스)를 사용한 형질감염 및 지질-기반 시스템 (유전자의 지질-매개된 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Choi임)을 들 수 있다. 일부 상황에서, 표적 세포를 표적화하는 작용제, 특히 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용될 경우, 세포내이입에 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질, 예를 들어 특정 세포 유형에 친화성인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 사이클링에서 내재화를 겪는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 위치화를 표적화하고 세포내 반감기를 증대시키는 단백질은 표적화 및/또는 흡수를 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 수용체-매개된 세포내이입의 기술은 예를 들어 문헌 [Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)]; 및 [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)]에 기재되어 있다. 현재 공지된 유전자 마킹 및 유전자 요법 프로토콜의 검토를 위해, 문헌 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)]을 참조한다. 또한, WO 93/25673 및 그에 인용된 참고문헌을 참조한다.

IX. 진단 키트

본 발명은 또한 본원의 예비처리 방법과 함께 사용하기 위한 진단 키트, 또는 제품을 제공한다. 진단 키트는 하기 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다: 길항제/항체/약물 참조 물질 (예를 들어, 리툭시마브 참조 물질); 양성 대조군 중화 항체 (바람직하게는, 시노몰구스 원숭이의 염소); 단백질 A + G 컬럼 (예를 들어, 단백질 A/G 컬럼); 탈지질화 시약; 이뮤노글로불린 친화도 정제 완충제(들) (예를 들어, 결합, 용리 및 중화 완충제); 보체 혈청; 세포용 분석 희석제; 취급 설명서 또는 문헌; 동결된 세포 (예를 들어, WIL2 세포)의 바이알; 세포 표지 시약 (예컨대, 셀타이터 글로(등록상표)) 등.

예를 들어, 진단 키트는 (a) 탈지질화 시약; (b) 이뮤노글로불린의 친화도 정제를 위한 완충제 (예를 들어, 결합 및 용리 완충제); 및 (c) (예를 들어, 혈청 간섭의 문제를 회피하기 위한) 샘플 상에서 세포 기반 생분석 (예컨대, 중화 항체 분석)을 수행하기 전 자가면역 질환 대상체로부터의 생물학적 샘플을 예비-처리하기 위한 키트의 사용을 진단 키트의 사용자에게 설명하는 취급 설명서를 포함할 수 있다. 임의로, 생물학적 샘플은 약물, 예컨대 치료용 항체 또는 면역어드헤신으로 치료되었다.

진단 키트는 임의로 약물 참조 물질, 양성 대조군 중화 항체, 보체 혈청, 세포용 분석 희석제, 및 세포 표지 시약 등 중 임의의 하나 이상을 포함한다.

본 발명의 추가의 상세사항은 하기 비-제한적 실시예에 의해 설명된다. 본 본 명세서의 모든 인용문의 개시사항은 본원에 참고로 도입된다.

실시예 1

혈청 예비처리를 한 중화 항체 분석

본 실시예는 자가면역 증상에서의 CD20 항체, 리툭시마브에 대한 중화 항체 분석의 개발에 관한 것이다. 리툭시마브는 B-세포 상의 인간 CD20 분자를 인식하며, 항체 효과기 기능을 통해 B-세포를 고갈시키는 인간-마우스 키메라 모노클로날 항체이다. 리툭시마브는 미국 및 유럽에서 무통성 재발성 비-호지킨 림프종 (NHL)에 대해 승인되어 있으며, 다른 것들 중에서도 류마티스성 관절염 (RA) 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 비롯한 자가면역 증상에 대해 개발중이다.

리툭시마브에 대한 혈청반응-양성 중화 항체 (NAb) 활성의 평가는 효능 분석인 보체-의존성 세포 세포독성 (CDC) 분석을 기초로 개발되었다. 상기 분석에서, 리툭시마브를 인간 혈청 보제의 표준화된 공급원 및 표적 B 림프구 세포주인 WIL2-S와 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간 후, 리툭시마브-CDC에 의해 사멸된 세포의 양을 잔류하는 살아있는 세포의 양에 비례하여 측정하였다.

시약

탈지질화 시약: PHM-L 리포소르브(등록상표) 흡수제, 칼바이오켐(Calbiochem), cat524371

이뮤노퓨어(IMMUNOPURE)(상표명) 고정된 단백질 A/G: 피어스, cat 20422

5 mL 폴리프로필렌 컬럼: 피어스, cat 29922

용리 완충액: 멸균 ddH₂0 중 HCl, pH 2.1

중화 완충액: 2OX PBS, A410, (Ca⁴⁺Mg⁺⁺이 없음), pH 6.5, 하이클론(HyClone) cat SH3A648.01

차단 완충액: PBS 중 1％ BSA

BSA: 7.5％ BSA, 프랙션(Fraction) V, 시험된 세포 배양물, 시그마(Sigma) cat A8412

PBS: GNE B5 메디아 프렙(Media Prep), 코드 A0829

센트리콘-30(등록상표) 농축기: 2 mL 크기, 아미콘 cat 4209

탈지질화를 위한 원심분리기: 에펜도르프(EPPENDORF)(등록상표) 원심분리기 5415C

세포 및 농축을 위한 원심분리기: 베크맨(Beckman) GS-6R

WIL2-S 세포 (ATCC CRL-8885)

성장 배지: RPMI 1640, 2 mM L-글루타민, 10％ FBS, 겐타미신

분석 희석제 (AD): RPMI 1640, 20 mM HEPES, 0.1％ BSA, 25 ug/mL 겐타미신.

스타베이션 배지: AD 중 10％ 성장 배지

보체: 인간 보체 혈청, 퀴델(Quidel) 파트 A112, lot 3MO174

리툭시마브 표준: 참조 물질 C2B81298-2, 9.8 mg/mL.

리툭시마브 NAb 표준: 시노(Cyno) 항-리툭산 pAb (lot 44082-81), 0.5 mg/mL

리툭시마브 NAb 대조군: NHS_pool 함유 NAb (저 및 고 역가, lot 44083-48)

셀타이터-글로(등록상표): 프로메가, cat G7571 (10 x 1O mL 바이알)

구아바(GUAVA)(등록상표) 비아카운트(VIACOUNT)(상표명): 구아바(등록상표) 인크. 4000-0040

96-웰 백색 TC 플레이트, 투명 바닥에 뚜껑 있음: 코닝 코스타(Corning costar) 3610

몰리큘라 디바이스 소프트맥스(SOFTMAX)(등록상표) Pro Lmax 판독기

피어스 iCON(상표명) 농축기, 7 mL 크기, cat-89886 (센트리콘-30(등록상표)에 대한 대안)

피어스 이뮤노퓨어(등록상표) 단백질 A 플러스 (cat 22811) (단백질 A/G에 대한 대안)

피어스 이뮤노퓨어(등록상표) 고정된 단백질 G 플러스 (cat 22851) (단백질 A/G에 대한 대안)

샘플 예비-처리 절차:

1. 혈청을 탈지질화시켰다. 200 ㎕ 리포소르브(등록상표) (PBS에 재구성됨, 제조사의 지시에 따름) 용액을 규소화된 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브 중의 혈청 0.25 mL에 첨가하였다. 45초 동안 볼텍싱하고, 4500 rpm (1600 x g)에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 규소화된 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브 중의 PBS 1 mL로 희석하였다 (일부 리포소르브(등록상표)가 샘플 내로 운반되는지가 허용가능하며, 컬럼을 막지 않는다).

2. 각각의 환자 샘플 및 대조군에 대해 단백질 A/G 컬럼 분리물 0.5 mL을 제조하였다. 단백질 A/G 슬러리 1 mL을 컬럼 5 mL에 첨가하고, 층의 높이를 측정하여 층 부피가 0.5 mL이 되도록 하였다.

3. 겔이 이전에 사용되었을 경우, 컬럼을 통해 용리 완충액 5 mL을 구동시켜 컬럼 비드를 청소하였다. 컬럼이 재사용될 수 있는 회수를 측정하지 않았다.

4. 컬럼을 PBS 2 x 5 mL을 사용하여 평형화시켰다.

5. 희석된 컬럼 1.25 mL을 컬럼에 적용하였다. 규소화된 1.5 mL 폴리프로필 렌 튜브에서 유통물을 수집하고, 2회 재적용하였다.

6. 3 x 5 mL PBS를 이용하여 컬럼을 세척하였다.

7. 항체를 용리 완충액 4 mL로 중화 완충액 0.2 mL을 함유하는 15 mL 팔콘(FALCON)(등록상표) 튜브 내로 용리하였다.

8. 차단 완충액 0.5 mL을 첨가함으로써 2 mL 센트리콘-30(등록상표) 농축기를 차단하고, 농축기를 3000 rpm (1000 x g)에서 10분 동안 원심분리하였다. 농축기의 상부 또는 하부에 잔류하는 임의의 차단 완충액을 따라내었다.

9. 중화된 용리액을 최종 부피 0.25 mL이 될 때까지 농축시켰다. 샘플이 과다-농축될 경우, 센트리콘-30(등록상표) 유통물을 이용하여 0.25 mL로 희석하였다. 규소화된 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브를 이용하여 최종 부피 0.25 mL 마크를 측정하였다.

10. 중화 CDC 분석에서 시험할 준비가 될 때까지 농축물을 -70℃에서 저장하였다.

중화 분석 절차:

본원에서 중화 항체 분석은 2005년 2월 10일자로 공개된 US 2005/0032130 A1 (Beresini and Song)에 개시된 것에 기초하였다. 하지만, 분석은 하기 관점에서 변형되었다: 생물학적 샘플 (즉, 혈청)은 이제 예비-처리된 혈청이며, 셀타이터-글로(등록상표) 발광 세포 생존력 분석은 이제 알라마르 블루(상표명) (레사주린) 대신의 분석 판독이며, 사용된 대조군 항체는 염소 항-리툭시마브가 아닌 시노몰구스 원숭이 단백질 A 정제된 (HER2 흡착된) 제제이며, 완충액, 부피, 보체, 대조군, 혈 청 매트릭스 효과, 데이타 분석 및 해석은 하기에 기재된 바와 같이 변화되었다.

1. 분석 전날, 스타베이션 배지 20 mL 중 8 x 10⁶개 세포를 씨딩하였다 (0.4 x 10⁶개 세포/mL).

2. 100 (CDC_max), 0.4 (CDC_NAb) 및 0 (CDC_zero) ㎍/mL 리툭시마브를 제조하였다.

100 ㎍/mL: 10.2 ㎕ 리툭시마브 표준 (1 mL AD 중)

20㎍/mL: 150 ㎕ 100 ㎍/mL 리툭시마브 (600 ㎕ AD 중)

0.4 ㎍/mL: lOO㎕ 20 ㎍/mL 리툭시마브 (4.9 mL AD 중)

0 ㎍/mL: AD 단독

3. 하기 나타난 바와 같이 25 ㎕를 분석 웰에 첨가하였다 (표 3).

4. 도 4에 나타난 바와 같이 음성 대조군, 저 대조군, 및 샘플을 2벌로 각각 25 ㎕ 첨가하였다. 현재 플레이트 구획은 24개 샘플에 대한 공간을 갖는다. 보다 많은 플레이트가 사용될 수 있지만, 이는 시험되지 않았다.

5. 실온에서 2시간 이상 동안 부드럽게 교반하면서 인큐베이션하여 혈청 정제된 항체가 리툭시마브에 결합하고 이를 중화하도록 하였다.

6. 보체 혈청을 실온 (RT)에서 해동한 후, 얼음 상에 놓았다.

7. WIL2-S 세포를 플라스크로부터 제거하고, 플라스크의 측면을 50 mL 팔콘 튜브 내로 세척하였다. 세포 현탁액 10 ㎕을 제거하고, 비아카운트(등록상표) 190 ㎕를 첨가하였다. 2분 후, 세포를 계수하고, 수/mL (20 X 희석) 및 ％ 생존력을 기록하였다. 대안적으로, 세포를 혈구계를 이용하여 계수할 수 있다.

8. 세포를 1200 rpm (150 x g)에서 8분 동안 스피닝하였다. 배지를 경사분리하고, 세포를 1 mL AD에서 재현탁하였다. AD 중 WIL2-S 세포 10 내지 20 mL을 0.25 x 10⁶개/mL에서 분석을 위해 제조하였다.

9. 보체 50 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다.

10. 단계 9에서 제조된 0.25 x 10⁶개/mL WIL2-S 세포 50 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다.

11. 플레이트를 실온에서 1분 동안 교반하여 혼합하였다. 37℃/5％ CO₂에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막 10분에, 플레이트를 실온으로 하였다.

12. 셀타이터-글로(등록상표) 시약을 실온으로 하였다. 각각의 웰에 100 ㎕를 첨가하였다. 셀타이터-글로(등록상표) 완충액 및 기질을 -20℃에서 저장하였다. 2가지 성분을 4 내지 8℃에서 밤새 해동하고, 분석 당일, 혼합하고, 벤치탑 상에 30 내지 45분 동안 방치하였다. 여분의 혼합된 시약은 -20℃에서 1개월 이상 저장할 수 있다.

13. 플레이트를 실온에서 10분 동안 교반하여 혼합하였다.

14. 발광을 1초의 통합 시간을 이용한 몰리큘라 디바이스 LMAX(등록상표) 판독기 상에서 판독하였으며, 공백 삭감은 없었다.

데이타 분석

1. 분석 레플리케이트로부터 모든 샘플 및 대조군에 대해 평균값을 계산하였다. 평균의 ％ CV가 25％를 초과할 경우 값을 이용하지 않았다.

2. 컷포인트를 하기와 같이 계산하였다.

(0.4 ㎍/mL 리툭시마브에서의 평균 음성 대조군 셀타이터-글로(등록상표) 값) x 1.03

분석의 컷포인트는 샘플이 양성으로 정의되는 초과 및 샘플이 음성으로 정의되는 미만의 분석의 반응 수준으로 정의된다. 컷포인트는 문헌 [Mire-Sluis et al. Journal of Immunological Methods 289:1-16 (2004)]에 기재된 바와 같이 분석에서 비-특이적 배경의 수준으로부터 통계적으로 측정된다. 상기 분석에서, 1.03의 컷포인트 인자를 10명의 RA 개체 천연 혈청을 3일에 걸쳐 분석함으로써 측정하였으며, 분석내 음성 대조군 반응을 넘는 3％ 증가를 나타낸다. 10명의 RA 개체 혈청을 100명의 개체의 집단으로부터 선택하여 완전한 범위의 혈청 간섭 및 비-특이적 효과를 반영하였다. 혈청 예비-처리 절차를 각각의 분석의 일부로서 수행하고, 샘플 반응을 정규화하고, 1.03의 저 컷오프 인자를 적용할 수 있다. 1.03의 컷포인트를 이용하여, 모든 리툭시마브 천연 RA 혈청은 음성으로 정의될 것인 반면, 1 ㎍/mL 시노몰구스 원숭이 항-리툭시마브 pAb, 또는 0.25 ㎍/mL 염소 항-리툭시마브 pAb는 양성으로 정의될 것이다.

3. 하기 범주에 따라 샘플 평균값을 조사하고, 보고하였다.

샘플 평균값이 컷포인트 이하일 경우, 샘플을 음성으로 보고한다.

샘플 평균값이 컷포인트 초과일 경우, 샘플을 양성으로 보고한다.

4. 저 대조군의 비율이 컷오프 초과일 경우, 및 0 ㎍/mL 및 100 ㎍/mL 리툭시마브 분석 반응 사이에 신호의 10배 하강이 있을 경우, 분석은 유효하다.

5. 여기에서, 샘플은 분석내 컷포인트를 기초로 양성 또는 음성으로 보고된다. 장래에, 샘플의 역가값을 계산하는 것이 바람직할 수 있다. "역가"는 방법에서 양성으로 시험된 샘플의 최고 희석의 역수이다. 역가는 방법에서 양성으로 시험된 샘플의 최고 희석의 상용 로그로서 표현하는 것이 통상적인 관행이다 (문헌 [Mire-Sluis et al. Journal of Immunological Methods 289:1-16 (2004)]). 이를 수행한 경우, 고 역가 대조군이 또한 포함될 것이다.

역가의 내삽

샘플의 역가는 분석에서 컷오프와 동등한 분석 반응을 초래한 샘플의 희석 인자의 log10으로 정의된다. 따라서, 샘플의 1/100 희석이 컷포인트와 동등한 분석에서 신호를 초래할 경우, 역가는 log₁₀100 또는 2.00일 것이다. 컷포인트 반응이 샘플의 2가지 희석 반응 사이에 있을 경우 (일반적으로 그러함), 역가는 공식을 이용하여 계산하여 x-Y 축 상의 직선 상의 미지의 점에 대해 해결하며, 모든 Y는 기지의 것 ("신호 단위")이고, 2개의 X 점은 기지의 것 ("희석 단위")이다.

하기 식이 이용된다.

a = 컷포인트 초과의 양성 샘플 또는 대조군의 신호로 둔다.

b = 컷포인트 미만의 양성 샘플 또는 대조군의 신호로 둔다.

c = 컷포인트의 신호로 둔다.

d = 컷포인트 초과의 양성 샘플 또는 대조군의 희석으로 둔다.

e = 컷포인트 미만의 양성 샘플 또는 대조군의 희석으로 둔다.

역가의 계산:

역가 = log (a-c) × (e-d) + d (a-b)

6. 저 대조군의 비율이 1.03 초과이고, 고 대조군 역가가 2.0 초과일 경우, 분석은 유효하다.

7. 샘플을 중화 활성화 역가 값으로 보고하였다. 0 ㎍/mL 리툭시마브에서의 샘플 반응은 분석 간섭을 나타내며, 데이타는 "간섭 물질 때문에 측정되지 않음"으로 보고하였다.

WIL2-S 세포 통과

1. 리툭시마브-CDC 중화 분석은 표적 세포로서 불멸 WIL2-S, B 림프모세포를 이용한다. 상기 세포주는 1 내지 2 x 10⁶개 세포/mL의 밀도에 도달한 후 최적으로 통과된다. 세포를 유지하기 위해, 새로운 씨딩 밀도는 성장 배지 중 0.04 내지 0.3 x 10⁶개 세포/mL를 표적화해야 한다. CDC 분석을 준비하기 위해, 세포를 10％ 성장 배지를 함유하는 분석 희석액에서 0.4 x 10⁶개 세포/mL의 빌도로 씨딩한다. 세포는 적어도 P31까지 통과될 수 있다. 이상적으로는, 세포는 0.25 내지 2.5 x 10⁶개 세포/mL의 세포 밀도로 유지되어야 한다.

결과 및 토의

리툭시마브 CDC 중화 항체 분석은 도 4에 개략적으로 도시되어 있다. 도 5는 리툭시마브 보체-의존성 세포독성 (CDC)이 Fab 및 Fc 도메인 둘다에서 중화될 수 있음을 나타낸다. 리툭시마브는 5 ㎍/mL의 농도로 발생하는 최대 세포 용해 (○으로 나타내어진 대조군 데이타)로 투여량-의존성 방식으로 CDC를 매개한다. 상기 분석이 중화 항체를 검출하는 능력을 시험하기 위해, 리툭시마브를 염소 항-인간 Fcγ (◇로 나타내어진 데이타) 또는 염소 항-리툭시마브 (CDR-특이적; □로 나타내어진 데이타) 폴리클로날 항체와 함께 예비-인큐베이션하였다. 2시간 후, 정상적인 인간 혈청 보체 및 12,500개 세포를 첨가하였다. 2시간 후, 살아있는 세포의 수를 셀타이터 글로(등록상표)를 이용하여 측정하였다. 항-CDR 또는 Fc 항체의 존재하에서, 리툭시마브-CDC 활성의 효능은 감소하였으며, 이는 투여량-반응 곡선이 우측으로 이동한 것으로 나타내어진다. 예를 들어, 화살표에 의해 나타내어진 바와 같이, 1 ㎍/mL 리툭시마브에서 잔류하는 살아있는 세포의 퍼센트는 대조군에 비해 (40％), (염소 항-CDR와 함께 예비-인큐베이션된 샘플에서 최고이며 (100％), 그 다음은 염소 항-Fcγ와 함께 예비-인큐베이션된 샘플이다 (70％).

효능으로부터 중화 분석 포맷으로 변화시키는 첫번째 단계는 분석이 비처리된 약물-천연 혈청을 허용하는 능력을 시험하는 것이다. 정상적인 인간 혈청의 존재하에서 리툭시마브-CDC의 초기 시험은 20명의 남성 및 여성 개체 사이에 동등한 투여량-의존성 성능을 나타내었다. 하지만, NAb 분석 표적 집단, 류마티스성 관절염 (RA) 환자 중에서, 분석은 신뢰성이 없었으며, 이는 개체 사이에 매우 가변적인 리툭시마브-CDC 세포 반응을 입증한다. 일부의 개체에서, 천연 혈청의 분석에의 첨가는 리툭시마브가 CDC를 매개하는 능력을 완전히 억제하였다.

도 6은 리툭시마브-CDC 분석에서의 혈청 내성을 나타낸다. 리툭시마브-CDC 분석은 비처리된 약물-천연 혈청을 허용하는 능력에 대해 시험되었다. 정상적인 인간 혈청의 존재하에서 분석의 초기 시험은 10명의 남성 및 여성 개체 사이에 동등한 투여량-의존성 성능을 나타내었다 (좌측 플롯). 하지만, NAb 분석 표적 집단, 류마티스성 관절염 (RA) 환자 중에서, 분석은 신뢰성이 없었으며, 이는 개체 사이에 매우 가변적인 리툭산-CDC 세포 반응을 입증한다 (우측 플롯). 일부의 개체에서, 천연 혈청의 분석에의 첨가는 리툭산이 CDC를 매개하는 능력을 완전히 억제하였다 (예를 들어, ◇로 나타내어진 개체의 데이타).

RA 혈청의 존재하에서 리툭시마브 효능의 분석 특이성 및 가변성, 소위 "혈청 간섭"의 부재는 리툭시마브 CDC 분석에 샘플을 적용하기 전에 샘플을 "청소하는" 혈청 예비-처리 단계의 추가를 초래한다.

혈청 예비-처리에 대해 시험된 방법은 증가하는 배수의 수준으로 발달되었다.

먼저, 간섭은 최소 샘플 희석을 증가시킴으로써 (1/80 이상까지) 최소화될 수 있지만, 분석의 감수성은 매우 높게 절충되었다 (5 ㎍/mL 초과 항-리툭시마브 항체).

두번째로, 몇몇 대안적인 분석 판독을 비교하였다. 상기 분석에서, 리툭시마브에 의해 유발된 CDC의 양은 잔류하는 살아있는 세포의 수 또는 사멸된 세포의 수에 의해 측정될 수 있다. 살아있는 세포는 전형적으로 대사 판독, 예컨대 산화환원 지시제 알라마르 블루(상표명) 또는 ATP 지시제 셀타이터 글로(상표명)에 의해 측정된다. 사멸된 세포는 세포질 내용물, 즉 내인성 (예를 들어, 락토스 데히드로게나제), 또는 예비-로딩된 염료 (예를 들어, 칼세인)의 방출에 의해 측정될 수 있다. 개념적으로, 시약이 16시간에 비해 (예를 들어, 알라마르 블루(상표명)) 10분 후 분석 판독을 나타낸다면 (예를 들어, 셀타이터 글로(상표명)), 혈청이 세포 대사를 비-특이적으로 간섭하는 시간이 적을 것이다. 또는, 시약이 외인성으로 첨가되고, 따라서 세포 대사가 연결되지 않을 경우 (예를 들어, 칼세인), 적은 간섭이 있을 수 있다.

도 7은 리툭시마브-CDC 분석에 대한 대안적인 분석 판독을 나타낸다. 리툭시마브-CDC에 의해 유발된 세포 용해물의 양은 잔류하는 세포의 수 또는 사멸된 세포의 수에 의해 측정될 수 있다. 살아있는 세포는 전형적으로 대사 판독, 예컨대 산화환원 지시제 알라마르 블루(상표명) 또는 ATP 지시제 셀타이터 글로(상표명)에 의해 측정된다. 사멸된 세포는 세포질 내용물, 즉 내인성 (예를 들어, 락토스 데히드로게나제), 또는 예비-로딩된 염료 (예를 들어, 칼세인)의 방출에 의해 측정될 수 있다. 알라마르 블루(상표명) (x 축에 나타내어진 데이타) 및 셀타이터 글로(상표명) (○으로 나타내어진 데이타)는 유사한 리툭시마브-CDC 프로파일을 입증하며, 셀타이터 글로(등록상표)에 대해 명백히 동력학적 범위가 개선되었다. 칼세인 (□로 나타내어진 데이타)은 또한 적은 감수성 및 보다 적은 동력학적 범위이긴 하지만 리툭시마브-CDC를 측정할 수 있다.

도 8은 상이한 판독을 이용할 경우의 리툭시마브-CDC 분석에서 RA 혈청 간섭의 비교이다. 리툭시마브-CDC 분석에서 류마티스성 관절염 혈청 간섭을 감소시키려는 노력에서, 5명의 개체의 RA 혈청에 대한 3가지 상이한 CDC 분석 판독의 내성 (도 7 참조)을 시험하였다. 혈청 간섭은 모든 3가지 검출 시약, 즉 셀타이터 글로(등록상표), 알라마르 블루(상표명) (중간 플롯), 및 칼세인에서 관찰되었다. 셀타이터 글로(등록상표)는 가장 적은 혈청 간섭, 가장 우수한 동력학적 범위, 및 가장 균일하게 감수성인 리툭시마브 EC₅₀을 나타내었기 때문에, 장래의 분석 개발에 대한 판독으로서 선택되었다.

도 7 및 8에 나타난 바와 같이, 상기 분석에서, 대안적인 판독은 RA 혈청 간섭을 해결하지 않았으며, 이는 간섭이 분석에서 세포가 리툭시마브 및 표준화된 보체 혈청과 함께 인큐베이션된 2시간 동안의 초기에 발생함을 시사한다. 불행하게도, 리툭시마브에 대한 대안적인 적합한 기능적 MOA 분석, 또는 CDC 측정에 대한 대안적인 경로는 이용가능하지 않다.

세번째 계열의 접근법은 간섭 물질을 제거하기 위한 것이었다. 초기에 시험된 2가지 매우 적당한 방법으로는 소분자를 제거하는 탈염 컬럼 (NAP-5(상표명) 컬럼, 파마시아 바이오텍(Pharmacia Biotech)); 및 혈청 지질을 제거하는 탈지질화 절차 (PHM-L 리포소르브(상표명) 칼바이오켐)를 들 수 있다. 어떤 방법도 간섭 물질을 제거할 수 없었다. 제3의 가능성은 간섭 사이토킨에 대한 억제성 항체를 첨가하거나, 열-불활성화시킬 것이다. 하지만, 환자 RA 혈청의 사이토킨 프로파일이 정상적이지 않지만, 이는 특정 사이토킨 수준 및 분석 간섭 사이의 상관관계를 입증하지 않았다. 전체 이뮤노글로불린을 선호적으로 침전시키는 가공되지 않은 방법은 포화 황산암모늄 (SAS)를 최종 부피 33％로 첨가함으로써 "염제거"하는 것이다. 샘플 간섭은 여전히 SAS 절차 후에 문제가 되었다. 마지막으로, 리툭시마브-CDC 분석에서 샘플을 분석하기 전에 혈청 이뮤노글로불린을 특이적으로 정제하는 것이 필요할 것이라고 믿어졌다.

혈청 이뮤노글로불린의 특이적 정제는 (a) 항-리툭시마브 항체를 특이적으로 정제하거나, (b) 전체 이뮤노글로불린을 특이적으로 정제함으로써 수행될 수 있다.

항-리툭시마브 항체의 정제는 가장 직접적인 접근법인 것으로 나타났으며, 모든 항-약물 동종형의 포획 및 환자 샘플에서 잔류하는 치료용 약물에 의해 유발된 리툭시마브 간섭의 제거의 이점이 첨가되었다. 몇몇 리툭시마브-친화도 정제 전략, 예컨대 리툭시마브-GLY-CPG(상표명) (컨트롤드 포어 글래스 프로덕츠 인크.(Controlled Pore Glass Products Inc.)), 리툭시마브-바이오맥(등록상표) (뱅스 래버러토리스, 인크.(Bangs Laboratories, Inc.)) 및 리툭시마브-엠포어(상표명) (3M 바이오애널리티컬 테크놀로지스(3M Bioanalytical Technologies))이 시험되었다. 커플링, 차단, 결합 및 용리 파라미터의 심도있는 최적화 후, 상기 방법은 특히 1 ㎍/ mL 미만의 혈청 특이적 항체 농도에서 낮은 회수율 (25％ 미만의 회수율) 때문에 계속되지 않았다.

전체 이뮤노글로불린의 정제를 위한 전통적인 방법은 미생물 기원의 재조합 단백질인 단백질 A 및 단백질 G의 사용이다. 단백질 G는 모든 4개의 IgG 아형 (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)에 강하게 결합하는 반면, 단백질 A는 IgG1, IgG2 및 IgG4에는 강하게 결합하고, IgG3, IgM, IgA에는 약하게, 그리고 IgE에는 중간정도로 결합한다. 단백질 A 및 단백질 G 특성의 조합은 IgG1 24 아형에 대해서는 편향되긴 하지만, 모든 항-약물 항체 동종형을 포획할 것이다. 상기 접근법을 이용하여, 리툭시마브에 대한 항체의 중화 활성은 CDC 분석에서 정상적인 인간 혈청 및 에비-처리된 정상적인 인간 혈청에서 동등하였다. 중요하게도, 리툭시마브-CDC 활성의 투여량-반응성은 RA 개체 (비처리된 혈청에서 극도의 CDC 분석 생존력을 입증하는 개체)의 예비-처리된 혈청에서 동등하게 되었다. 중화 활성의 낮은 감수성은 염소 및 시노몰구스 원숭이 항-리툭시마브 항체에서 각각 0.25 ㎍/ mL 및 1 ㎍/ mL (순 혈청 농도)인 것으로 측정되었다. 마지막으로, 세포-기반 리툭시마브-CDC 분석에서 혈청반응양성 항-리툭시마브 항체 샘플을 분석하기 전 단백질 A+G 정제를 이용하는 절차를 개발하고, 최적화하고, 정성화하였다. 분석 성능 특징은 허가된 임상 항체 특성화 분석에 허용되는 것으로 밝혀졌다.

도 9는 혈청 샘플로부터의 전체 이뮤노글로불린을 정제하는데 사용되는 혈청 예비-처리 절차를 나타낸다. 전체 혈청 이뮤노글로불린의 정제를 위한 상기 방법은 리툭시마브-CDC 분석에서 혈청 간섭을 제거하기 위해 개발되었다. 절차를 요약하는 흐름도는 상기 도면에 나타나 있다.

혈청 예비-처리 절차는 간섭의 문제를 극복하였다. 도 10은 혈청 예비-처리 절차 전 및 후의 리툭시마브-CDC 분석의 성능을 나타낸다. NAb 분석 표적 집단, 류마티스성 관절염 (RA) 환자 중에서, 분석은 신뢰성이 없었으며, 이는 개체 사이에 매우 가변적인 리툭산-CDC 세포 반응을 입증한다 (좌측 플롯). 10명의 개체 RA 혈청을 혈청 예비-처리 절차를 수행하기 전 (좌측 플롯) 및 후 (우측 플롯)에 분석에서 시험하였다. 혈청 예비-처리는 간섭 매트릭스 성분을 제거하였고, RA 개체 사이에서 리툭산-CDC 활성의 투여량-반응성을 정규화시켰다.

혈청 예비-처리 절차 이외에, 중화 항체 분석에 다양한 추가의 개선이 또한 개발되었다.

상이한 세포 수를 이용한 분석의 감수성을 평가하였다. 도 11은 보다 적은 세포 수에서 중화에 대한 리툭시마브-CDC 분석의 감수성이 보다 높음을 나타낸다. 물질 로트 방출에 사용된 리툭시마브-CDC 효능 분석은 중화 분석으로서 적응되었다. 중화 분석 최적화 동안, 개선된 감수성은 효능 분석 (좌측 플롯)에 사용된 것보다 4배 낮은 세포 수 (우측 플롯)를 이용하여 관찰되었으며, 분석 강도는 유지되었다. 증가하는 염소 항-리툭시마브 CDR 폴리클로날 항체의 농도, 0.125 내지 2 ㎍/mL을 분석의 전체 투여량-반응 범위에 걸쳐 리툭시마브와 함께 예비-인큐베이션하였다. 투여량-반응 곡선의 우측 이동은 리툭시마브에 대한 pAb의 농도에 정비례하는 방식으로 증가하였다 (좌측 및 우측 플롯). 우측 이동은 보다 적은 세포 수에서 보다 컸다 (우측 플롯). 또한, 모든 중화 항체 농도에서 대조군에 비해 이동은 비-선형인 것으로 관찰되었으며, 보다 낮은 농도의 리툭시마브에서 보다 큰 정도로 이동하였다 (좌측 및 우측 플롯의 상부 섹션).

리툭시마브 투여량 선택은 또한 중화 항체 분석의 감수성을 개선시키는 추가의 수단으로서 평가되었다. 도 12는 중화 활성을 평가하는데 사용되는 리툭시마브 농도의 선택을 반영한다. 환자 샘플의 평가에서, 컷포인트에 비해 리툭시마브의 단일의 선택된 농도에서 중화 활성을 보고하는 것이 바람직하다. 보다 낮은 리툭시마브 농도에서 중화에 대한 리툭시마브 투여량-반응 곡선의 개선된 감수성을 기초로 (도 12), 리툭시마브 농도를 증가하는 양의 염소 항-리툭시마브 CDR pAb (0.1 내지 1 ㎍/mL)로 0.2, 0.4 및 0.6 ㎍/mL에서 시험하였다. 0.2 ㎍/mL의 리툭시마브 농도에서, CDC 활성은 약물의 부재하에서 최저로만 배경 세포 용해물을 초과하며, 중화는 통계적 유의성 미만이다. 0.4 ㎍/mL의 리툭시마브 농도에서, CDC 활성은 약물의 부재하에서 배경 세포 용해물을 25 내지 30％를 초과하며, 중화는 통계적으로 유의하고, 중화 항체 농도에 비례한다. 리툭시마브 농도의 추가의 증가는 중화 항체의 보다 낮은 수준을 검출하는 분석의 감수성을 절충하였다. 예를 들어, 위의 별표에 의해 나타내어진 바와 같이, 0.1 ㎍/mL의 염소 항-리툭시마브 CDR pAb는 0.4 ㎍/mL 리툭시마브 뿐만 아니라 0.6 ㎍/mL을 중화시키지 않는다.

도 13은 중화 리툭시마브-CDC 분석에 대한 약물 간섭의 효과를 나타낸다. 중화 리툭시마브-CDC 분석에서 시험하기 위한 환자 혈청은 잔류의 치료용 리툭시마브를 함유할 수 있다. 중화 항체의 수준이 생물학적으로 불활성인 순환 치료에 불충분할 경우, 샘플은 분석에 대한 활성 리툭시마브에 기여할 수 있으며, 이는 비정상적으로 높은 CDC 활성을 초래한다. 분석에서 중화 활성은 분석내 음성 및 저 양성 대조군에 대해 평가하였다. 비정상적으로, 샘플에서 높은 CDC 활성은 가 음성 판독을 초래할 것이다. 좌측의 플롯은 1 ㎍/mL 리툭시마브 (□)를 정상적인 분석 리툭시마브 투여량-반응 곡선 (○)에 첨가하는 것의 효과를 나타낸다. 기준선 독성은 더 높으며, EC50은 보다 낮은 명백한 농도로 이동한다. 하지만, 우측의 플롯에 나타내어진 바와 같이, 동일한 1 ㎍/mL 리툭시마브 농도가 5배 몰 과량 (5 ㎍/mL)의 염소 항-리툭시마브 CDR 폴리클로날 항체와 함께 첨가될 경우 (□), 기준선 독성은 정상으로 돌아가며, 여전히 분석에 양성으로 측정되는 리툭시마브가 과량으로 충분한 중화 항체가 있다 (투여량-반응 곡선에서 유의한 우측 이동에 의해 나타남).

<110> GENENTECH, INC. MCCUTCHEON, KRISTA SONG, AN <120> PRETREATMENT OF A BIOLOGICAL SAMPLE FROM AN AUTOIMMUNE DISEASE SUBJECT <130> P2233R1 PCT <140> PCT/US2006/019576 <141> 2006-05-19 <150> US 60/682,990 <151> 2005-05-20 <160> 24 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro 1 5 10 15 Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30 Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro 35 40 45 Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 65 70 75 Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 80 85 90 Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 95 100 105 Lys Arg <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30 Tyr 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sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr 50 55 60 Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg 95 100 105 Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 125 130 135 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 140 145 150 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 155 160 165 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 170 175 180 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 185 190 195 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 410 415 420 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 425 430 435 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 440 445 450 Gly Lys <210> 17 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 50 55 60 Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser 95 100 105 Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 125 130 135 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 140 145 150 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 155 160 165 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 170 175 180 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 185 190 195 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 200 205 210 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 215 220 225 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 320 325 330 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 335 340 345 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 350 355 360 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 365 370 375 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 380 385 390 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 395 400 405 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 410 415 420 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 425 430 435 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 440 445 450 Gly <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro 35 40 45 Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 80 85 90 Ala Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 95 100 105 Lys Arg <210> 19 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr 50 55 60 Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg 95 100 105 Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120 Ser Ser <210> 20 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 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Claims

(a) 샘플을 탈지질화시키는 단계;

(b) 샘플 중의 이뮤노글로불린을 친화도 정제하는 단계;

(c) 정제된 이뮤노글로불린을 농축시키는 단계; 및

(d) 농축된 이뮤노글로불린을 세포-기반 생물학적 활성 분석에 적용하는 단계

를 포함하는, 자가면역 질환 대상체로부터의 생물학적 샘플의 처리 방법.
제1항에 있어서, (d)에서의 분석이 중화 항체 분석인 방법.
제1항에 있어서, (a)에서의 샘플이 혈청 샘플인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 류마티스성 관절염을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 본질적으로 모든 이 뮤노글로불린 동종형을 정제하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 단백질 A + G 친화도 정제를 포함하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 단백질 A + G 친화도 정제가 2회 이상 반복되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 단백질 A + G 친화도 정제가 3회 반복되는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서의 샘플이 간섭을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 자가면역 질환 대상체가 치료용 항체 또는 면역어드헤신으로 치료되었던 것인 방법.
제11항에 있어서, 자가면역 질환 대상체가 치료용 항체로 치료되었던 것인 방법.
제12항에 있어서, 치료용 항체가 CD20 항체인 방법.
제13항에 있어서, 치료용 항체가 리툭시마브 또는 인간화 2H7인 방법.
제12항에 있어서, 치료용 항체가 리툭시마브, 인간화 2H7, 2F2 (HuMax-CD20) 인간 CD20 항체, 인간화 A20 항체 또는 IMMU-106, TRU 015, 종양 괴사 인자 (TNF)-α 항체, 인플릭시마브, CDP571, MAK-195, 아달리무마브, 페길화 TNF-α 항체 단편, CDP-870, 항-TNF-α 폴리클로날 항체, PassTNF, 인테그린 항체, 에팔리주마브, 나탈리주마브, BAFF 항체, BR3 항체, BAFF 수용체 항체, Blys 항체, 벨리무마브, CD37 항체, TRU 016, CD22 항체, 에프라투주마브, 아비오겐(Abiogen) CD22 항체, CMC 544, 콤보톡스, BL22, LIF 226, VEGF 항체, VEGF 수용체 항체, 베바시주마브, 라니비주마브, 항-HER 항체, 트라스투주마브, 페르투주마브, 세툭시마브, 항-IgE 항체, 오말리주마브, IL-21 항체, 임페론 항-B 세포 항체, 1D09C3, Lym-1 항체, 온코라임, ISF 154, 고밀릭시마브, IL-6 수용체 항체, 아틀리주마브, IL-15 항체, HuMax-Il-15, 케모카인 수용체 항체, CCR2 항체, MLN1202, 항-보체 항체, C5 항체, 에쿨리주마브, 인간 이뮤노글로불린의 경구 제제, IgPO, IL-12 항체, ABT-874, 테넬릭시마브, CD40 항체, 인간화 S2C6, TNX 100, CD52 항체, 캄패스-1H, 및 αvβ3 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제12항에 있어서, 치료용 항체가 인테그린 항체인 방법.
제16항에 있어서, 인테그린 항체가 에팔리주마브 또는 나탈리주마브인 방법.
제11항에 있어서, 자가면역 질환 대상체가 면역어드헤신으로 치료되었던 것인 방법.
제18항에 있어서, 면역어드헤신이 BR3-Ig, TNF-α 면역어드헤신, 에타너셉트, 항-BAFF 펩티바디, TACI-Ig, BCMA-Ig, CTLA4-Ig, 아바타셉트, 및 BAFF-R-Ig로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제11항에 있어서, 자가면역 질환 대상체가 종양 괴사 인자 (TNF)-α 항체 또는 TNF-α 면역어드헤신으로 치료되었던 것인 방법.
제20항에 있어서, 자가면역 질환 대상체가 인플릭시마브, 아달리무마브, 에타너셉트, CDP-870 또는 D2E7로 치료되었던 것인 방법.
제1항에 있어서, 자가면역 질환 대상체가 페길화 가용성 TNF-R, 페그수네르셉트, IL-1 수용체 길항제 (IL-1Ra), 아나키라, DN-BAFF, 및 백신으로 이루어진 군으로부터 선택된 약물로 치료되었던 것인 방법.
(a) 치료용 항체 또는 면역어드헤신을 자가면역 질환을 치료할 대상체에게 투여하는 단계;

(b) 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;

(c) 생물학적 샘플 중의 이뮤노글로불린을 친화도 정제하는 단계; 및

(d) 정제된 이뮤노글로불린을 중화 항체 분석에 적용하는 단계

를 포함하는, 자가면역 질환을 갖는 대상체의 치료 방법.
제23항에 있어서, 단계 (b)에서의 샘플이 인간 혈청을 포함하는 것인 방법.
제23항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 쇼그렌병인 방법.
제23항에 있어서, 단계 (b)에서의 샘플이 간섭을 포함하는 것인 방법.
(a) 탈지질화 시약;

(b) 이뮤노글로불린의 친화도 정제용 완충제; 및

(c) 진단 키트의 사용자에게 제1항의 방법의 실시를 설명하는 취급 설명서

를 포함하는 진단 키트.
제27항에 있어서, 약물 참조 물질, 양성 대조군 중화 항체, 보체 혈청, 세포용 분석 희석제, 및 세포 표지 시약 중 임의의 1종 이상을 추가로 포함하는 진단 키트.