KR20080019902A

KR20080019902A - 이소플라본 제조방법과 제니스틴 제조방법 및 이를 이용한모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인을 갖는 홍국균 배양방법과 이를 이용한 분말, 겔, 쌀 제조방법

Info

Publication number: KR20080019902A
Application number: KR1020060082415A
Authority: KR
Inventors: 김용훈; 윤은경
Original assignee: (주)엔앤비
Priority date: 2006-08-29
Filing date: 2006-08-29
Publication date: 2008-03-05
Anticipated expiration: 2026-08-29
Also published as: KR100858280B1

Abstract

본 발명은 이소플라본 제조방법과 제니스틴 제조방법 및 이를 이용한 모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인을 갖는 홍국균 배양 방법에 관한 것으로,

콩 혹은 비지로부터 고 함량의 이소플라본에서 고순도의 제니스틴을 용해도를 이용하여 분리함으로써, 고가의 제니스틴을 획득함으로써 경제적 가치를 극대화하고자 한다.

또한, 추출에 의해 얻어진 비배당체인 제니스틴을 홍국균(Monascus sp.)의 배양을 통하여 배당체인 제니스테인과 모나콜린 케이가 함축된 GCM(Genistein Combined Monacolin K)이 홍국균에 함유되어 콜레스테롤 생성 억제뿐만 아니라, 고지혈증 개선에 뛰어난 효과를 갖도록 하는 데 있다.

제니스틴, 제니스테인, 모나콜린 케이, 홍국, 콩, 비지

Description

이소플라본 제조방법과 제니스틴 제조방법 및 이를 이용한 모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인을 갖는 홍국균 배양 방법과 이를 이용한 분말, 겔, 쌀 제조방법{Manufacturing method of Isoflavone, Genistin and Monascus sp., powder, gel, rice with Genistein Combined Monacolin K}

도 1은 본 발명에 따른 GCM의 제조공정을 나타내는 도면

도 2는 GCM함량에 의한 혈청 콜레스테롤 함량을 나타내는 그래프

도 3은 GCM함량에 의한 LDL-콜레스테롤 함량을 나타내는 그래프

도 4는 GCM함량에 의한 HDL-콜레스테롤 함량을 나타내는 그래프

본 발명은 이소플라본 제조방법과 제니스틴 제조방법 및 이를 이용한 홍국균 배양방법과 모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콩분말 혹은 비지로부터 이소플라본을 제조하고, 이를 이용하여 얻어진 제니스틴을 홍국(Monascus sp.) 발효 과정에 투입하여, 모나콜린 케이(Monacolin K)를 함유한 제니스테인(이하, GCM이라 함, Genistein Combined Monacolin K)을 갖는 홍국균 배양 방법에 관한 것이다.

현대인의 식생활은 과도한 콜레스테롤의 생성 및 섭취에 따른 동맥경화증, 협심증 등의 혈관질환 질병과 여러 성인병이 문제가 되고 있으며, 화학합성을 통한 의약품 등의 부작용이 따라 안전한 천연소재를 이용한 콜레스테롤 생성억제 및 고지혈증 치료제의 개발이 절박한 실정이다.

이에 대한 해결책으로 콩의 생리활성물질에 대한 관심이 높아지고 있는데, 콩에는 이소플라본, 단백질 분해효소 억제제, 엽산, 식이성 섬유, 사포닌, 식물성 스테롤 및 페놀성 물질 등이 존재하며, 이 중에서도 이소플라본은 에스트로겐과 유사한 구조로서 피토에스트로겐(Phytoestrogen)과 같은 생리적 기능이 있음이 밝혀져 있다. 이소플라본은 C 15 H10 O2의 분자식을 가진 화합물군으로 제니스테인(Genistein),다이드제인(Daidzein), 글리시테인, 글루코스 배당체 등 합계 12종류가 천연의 상태로 존재하고 있는 이성체로서 주로 배당체의 형태로 존재하는 물질인데, 이들 이성체 중에서 제니스테인과 다이드제인이 대부분이다.

이중 이소플라본의 비배당체인 제니스틴은 독성이 거의 없으면서도, 단백질 효소 중 PTK(Protein Tyrosine Kinase)의 선택적 억제제, Topoisomerase II 억제제, 에스트로겐 역할 및 신생혈관작용억제제 등의 다양한 생리적 활성을 가지며, HMG-CoA 환원효소(reductase) 및 저밀도 지질 단백질(LDL) 수용체의 유전자를 적절히 조절하여 고지혈증에 유익한 효과를 가지는 것으로 밝혀지고 있어 의약분야에도 상당한 관심을 끌고 있다.

그런데, 제니스틴은 식품 중에서 유일하게 콩에만 존재하기 때문에, 콩 중에 함유된 성분을 추출하는 다양한 방법들이 개발되고 있는데, 이 중 한국공개특허 2001-0060419호에서는 콩 배아 및 콩 배아와 두부순물의 혼합액을 사용하여 열수 추출로서 피에이치를 조절한 뒤 데칸타를 통해 분리 추출된 액을 흡착공정 및 제반공정을 사용하여 분리하는 방법 등을 제시하고 있으나, 여전히 효율성 및 경제성 문제 등이 남아 있다.

한편, 1979년 일본 동경대의 엔도 아끼라 교수는 콜레스테롤 수치를 저하시키는 천연물질 모나스커스 에스피피(Monascus SPP)를 개발하였는데, 일명 홍국 발효 산물인 모나콜린 케이(Monacolin K)는 체내에서 생산되는 콜레스테롤 생합성 경로의 속도 결정 단계인 HMG-CoA 환원효소를 특이적으로 억제함으로써 저밀도 지질 단백질(LDL)과 결합된 콜레스테롤 농도를 저하시켜 혈중 콜레스테롤 수치를 낮춰주며 몸에 이로운 고밀도 지질 단백질(HDL)-콜레스테롤 수치를 증가시키는 것으로 알려져 있다.

상기한 다양한 종래 기술들을 바탕으로 하여, 본 발명의 목적은 두부 생산공정에서 부산물로 발생하는 비지에서 고 함량의 이소플라본을 분리정제하여 고순도의 제니스틴을 용해도를 이용하여 분리함으로써, 원가절감에 따른 저비용으로 고가의 제니스틴을 효율적으로 획득하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 획득된 제니스틴을 홍국(Monascus sp.)발효 과정에 투입하여, 홍국균에 모나콜린 케이(Monacolin K)를 함유한 제니스테인(이하, GCM이라 함, Genistein Combined Monacolin K)을 함유하도록 하는 배양 방법을 제공하는 데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징은 콩분말 1kg에 대하여 1-3L의 핵산을 2-4회 반복해서 가하여 10시간 교반 한 후, 필터링하여 탈지된 콩 분말을 제조하는 탈지과정과, 탈지된 콩 분말 700g에 대하여 상온에서 0.5-2L의 80% 에탄올 수용액을 2-5회 반복하여 가하여 4-6시간 교반하여 10% 내외의 이소플라본을 얻는 10% 이소플라본 추출 과정과, 상기한 10% 내외의 이소플라본 10g에 95% 에탄올 수용액(aq. ethanol) 100-150mL를 첨가한 후 70-90℃에서 30분에서 1-3시간 교반한 후 여과한 다음 용매를 감압여과하여 제거함으로써 50% 이상의 이소플라본을 얻는 50% 이상의 이소플라본 추출과정으로 구성되는 이소플라본 제조방법과, 완전히 건조된 비지를 사용하여 상기한 탈지과정을 거치지 않고 10% 이소플라본 추출 과정과 50% 이상의 이소플라본 추출과정으로 구성되는 이소플라본 제조방법에 있다.

그리고 추출된 이소플라본 1g에 대하여 60-90% 에탄올 수용액 80-120mL를 추가하여 70-90℃에서 10-30분간 환류 추출한 다음 필터링하고 5-15℃로 급속냉각한 후 12-36시간 경과시켜 제니스틴을 얻는 제니스틴 제조방법에 있다.

그리고 다른 특징은 제니스틴을 50-85% 에탄올에 0.1 내지 1% 용해하여 pH는 5-7로 조정된 배지에 0.01-0.2%첨가하여 홍국균을 배양하되, 상기한 제니스틴은 액상으로 첨가되는 홍국균이 모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인 제조방법이다.

또한, 본 발명은 생산된 홍국균체와 배양액을 균질화 한 후 60-90% 에탄올로 추출한 후 환류 냉각하고 필터로 여과하여 모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인을 얻는 방법과, 상기한 모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인 1g에 대하여 레시틴 1.5-3g을 클로로포름: 메탄올이 2:1로 혼합된 용매에 녹인 후 용매를 제거하고, 생성된 물질의 중량에 대하여 물 50-60mL를 넣은 후 50-70분간 고속 교반하여 균질화된 현탁액을 제조하고, 크산탄 검 1-5g을 물 40-60mL에 완전히 녹여 겔상으로 만든 후, 상기 균질화된 현탁액과 겔상의 크산탄 검을 교반하면서 섞어서 겔형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인 제조방법에 특징이 있다.

이하 본 발명의 실시예를 보다 상세하게 살펴본다.

우선 본 발명에 따른 GCM의 제조 방법을 살펴보면, 콩과 비지로부터 50% 이상의 이소플라본을 추출한 후, 분리 정제 과정을 통하여 제니스틴을 얻고, 상기한 제니스틴을 홍국균과 함께 배양하여 모나콜린 케이가 함유된 제니스테인을 얻는다.

부가적으로, 상기한 GCM을 겔형으로 형성한다.

1. 제니스틴 ( Genistin ) 추출

(1) 이소플라본의 추출

3L의 둥근 플라스크에 콩 분말 1kg을 넣은 후 2L의 핵산(hexane)(2회 반복)을 가하여 10시간 교반 한 후, 필터링하여 탈지된 콩 분말 700g을 얻는 탈지 콩 분말을 제조하고, 700g의 탈지 콩 분말에 상온에서 1L의 80% 에탄올 수용액(aq, ethanol)(3회 반복)을 가하여 5시간 교반하여 10% 내외의 이소플라본 9g을 얻은 후, 여기에 95% 에탄올 수용액(aq. ethanol) 100mL를 첨가한 후 80℃에서 1시간 교 반한 후 글라스 필터(glass filter)로 여과한 다음 용매를 제거하여 50% 이상의 이소플라본 1.7g 을 얻는다.

그리고 상기한 콩 분말을 이용한 이소플라본 추출 외에 비지를 사용할 경우에는 두부공정에서 나온 비지를 건조 오븐(dry oven)에서 100-150℃에서 수분함량 10%이하가 되도록 완전히 건조한 후, 700g의 건조 비지에 상온에서 1L의 80% 에탄올 수용액(aq, ethanol)(3회 반복)을 가하여 5시간 교반하여 10% 내외의 이소플라본 9g을 얻은 후, 여기에 95% 에탄올 수용액(aq. ethanol) 100mL를 첨가한 후 80℃에서 1시간 교반한 후 글라스 필터(glass filter)로 여과한 다음 용매를 제거하여 50% 이상의 이소플라본 1.7g 을 얻는다.

상기한 이소플라본 추출과정에서 비지에 비하여 탈지 콩 분말이 이소플라본 추출 수율이 우수함을 알 수 있다.

(2) 고농도 이소플라본으로부터 제니스틴의 분리 및 재결정화

상기한 이소플라본 제조과정에서 얻어진 50% 글리코사이드 이소플라본 2g을 60, 70, 80 및 90% 에탄올 수용액(aquous ethanol) 200mL에 넣어서 60, 70, 80 및 90℃에서 20분간 환류(reflux)한 다음, 세라믹 필터를 이용하여 재빨리 거른 후, 급속으로 10℃ 부근으로 냉각시키면, 순수한 엷은 노란색의 제니스테인이 생성되기 시작한다. 다음날 필터링하여 제니스틴을 얻고, 이를 다시 80% 에탄올 수용액에 재결정하여 순수한 제니스틴을 얻는다.

제니스틴 추출 과정에서 에탄올 수용액의 농도에 따른 제니스틴의 수율의 변화는 표 1과 같이 80-90% 농도에서 비슷한 경향을 보이며, 최대의 조건은 80% 함량에서 최대의 수율을 거두었다.

aquous ethanol 함량	Genistin 수율
90%	0.64
80%	0.68
70%	0.56
60%	0.46

표 1은 80℃에서 에탄올 수용액 농도에 따른 제니스틴의 수율 변화를 나타낸다.

그리고 80% 에탄올 수용액에서 추출 온도 변화에 따른 수율 변화는 표 2와 같이 80-90℃에서 최대 수율을 보였으며, 온도가 80℃ 이하로 내려감에 따라 수율의 감소를 나타내었다.

추출온도	Genistin 수율
90℃	0.68
80℃	0.68
70℃	0.6
60℃	0.5

표 2는 80% 에탄올 수용액에서 추출 온도에 따른 제니스틴의 수율 변화를 나타낸다.

2. GCM 배양

(1) 재료 및 균주

실험용 재료는 이소플라본에서 분리, 재결정화 한 제니스틴을 사용하였으며, 균주는 한국종균협회에서 분양받은 홍국균인 Monascus pilosus KCCM 60084를 사용하였다.

(2) 홍국균 배양 배지 선택

배지

홍국균의 생성에 유효한 배지의 종류를 검토하여 본 균주에 가장 적합한 배지를 선발하였다. 배지의 조건은 아래 표 3과 같으며 pH는 모두 6.0으로 조정하였다.

표 3은 배지의 종류와 조성을 나타낸다.

종배양 및 본배양

종 배양용 배지는 Mizutani 배지에 초순수(d-water) 100mL를 첨가하여 사용하였으며, 보존 중인 균주는 동일 배지를 사용하여 30℃ 인큐베이터에서 150rpm으로 7일간 계대 배양하여 활성화한 후 동일 배지 7mL씩을 넣은 캡시험관을 사용하여 같은 조건으로 7일간 배양하였다.

본 배양은 250mL의 삼각플라스크에 배지 100mL를 넣어 121℃에서 15분간 멸균한 후 종 배양액을 넣어 30℃의 인큐베이터에서 10일간 배양하였다.

균의 증식도 및 색소함량

균의 증식도는 배지에 번식한 균체를 핀셋으로 꺼내어 습기를 제거한 후 생체중량을 측정하였으며, 배지 100mL 당 성장한 균체 g수로 나타내었다. 색소함량은 배양액과 균체를 균질기로 12,000rpm에서 5분간 파쇄한 후 10mL를 취하고 95% 에탄올 50mL를 가하여 15분 동안 색소를 출출하였으며, 여과 후 흡광도를 500nm에서 측정하였다.

상기한 홍국균주의 증식도 조사 결과, 홍국균의 경우 30℃에서 10일간 배양한 균체의 무게는 MM에서 26.9g/100mL로 가장 높았으며, LM, GY 는 각각 15.5-17.2g/100mL를 나타내었다. 또 YM, TM은 8.2-10.3g/100mL으로 상대적으로 낮은 균체 생성량을 보였다. 이에 본 배양실험에서는 MM배지를 이용하여 실험을 수행하였다.

(3) 최적의 제니스틴 형태 선택

GCM 최적화에 미치는 제니스틴의 형태를 알아보기 위하여 분말과 70% 에탄올에 0.5% 용해한 용액을, 0-1.0%의 구간으로 배지에 첨가하고, 홍국균 1-5g을 100ml배지에 첨가하여 30℃ 인큐베이터에 7-14일(본 발명의 실시예에서는 10일)간 배양하였다. 그 결과 표 4에 나타내는 바와 같이 분말로 첨가한 것은 쉽게 용해되기 어려워 배양 후 아랫부분에 일정량 제니스틴이 그대로 남아있는 반면, 70% 에탄올에 용해하여 첨가한 경우 배지에 그대로 용해되어 홍국 배양에 바로 이용되어 높은 색소와 향을 생성하였다. 이에 제니스틴의 형태는 액상이 우수한 것으로 나타났다.

Fungi	첨가형태	결과
Fungi	첨가형태	용해정도	균체 생성	색소생성	향
Monascus pilosus 60084	control	-	+	+	+
Monascus pilosus 60084	분말	-	++	+	++
Monascus pilosus 60084	액상	+	++	++	++

표 4는 제니스틴의 첨가형태에 따른 홍국 배양 결과를 나타낸다.

(4) 제니스틴 첨가 조건 선택

0.1% 제니스틴의 70% 에탄올 첨가조건을 검토하기 위하여 0-1.0%의 구간으로 첨가하였다. 에탄올의 순도가 높아질수록 제니스틴의 용해도 쉬웠으나, 70% 에탄올로 용해한 경우까지 균체와 색소가 생성된 반면 95% 첨가구간에서는 배양이 일어나지 않았다. 이에 용해된 에탄올의 첨가량 최적조건을 균의 증식도와 색소함량으로 측정하였다.

70% ethanol 용해 genistin 첨가량(mL)	균체 증식량(g/100mL)	색소함량
0	5	+
0.05	10	+
0.1	12	++
0.5	20	+++
1	-	-

표 5는 제니스테인 첨가량에 따른 증식도와 색소함량을 나타낸다.

그 결과, 제니스틴은 70% 에탄올에 용해하여 0.5mL를 첨가한 구간에서 가장 우수한 배양이 이루어짐을 알 수 있었다.

3. GCM 제조 방법

홍국균체와 배양액을 균질화 한 후 60-90% 에탄올로 추출한 후 환류 냉각하고 필터로 여과하여 GCM을 얻는다.

4. GCM 효능에 대한 실험

(1) 식이 첨가에 대한 영향

GCM이 랫드의 고지혈증에 미치는 영향을 조사하기 위해 암수 랫드에 1% 콜레스테롤과 GCM 0.3%, 0.6% 그리고 3%를 특수 사료와 함께 섭취시켰다. 약 1개월 동안 자유식이 후 혈액을 채취하여 혈청의 총콜레스테롤, HDL, LDL 그리고 중성지방 (TG)을 측정하였으며 체중증감과 식이 효율 (Food efficiency ratio: FER)에 따른 GCM의 효과를 확인하였다.

실험동물 및 식이

SD(Sprague-Dawley)계통의 특정병원균 부재(SPF) 랫드는 (주)오리엔트에서 암수 각 7주령을 구입하여 사용하였다. 7주령의 SD를 1주일간 적응시킨 후 각 군당 5마리씩으로 나누고, 식이는 AIN-76 diet를 이용하였다. 시험물질은 1% cholesterol과 0.3%, 0.6% 그리고 3% GCM을 사료와 혼합하여 투여하였다. 시험군의 구성은 1% cholesterol 투여군 (HC), 1% cholesterol + 0.3% GCM 투여군 (0.3% GCM), 1% cholesterol + 0.6% GCM 투여군 (0.6% GCM), 1% cholesterol + 3% GCM (3% GCM)으로 나누었다.

혈청 지질분석

채혈 전 1시간 절식시킨 후 ether로 마취시켜 복부대동맥에서 채혈하였으며, 실온에서 30분간 방치 후 4℃, 3,000rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 혈청의 total cholesterol, HDL-cholesterol 및 triglyceride 는 효소법에 의한 kit(아산제약, 한국)를 사용하여 흡광도를 측정[Perkinelmer, VICTO3 family) 하였으며, LDL-cholesterol은 Friedewald식Total cholesterol-(HDL-cholesterol+TG/5)]에 의해 계산하였다.

식이 효율측정

식이 섭취량은 1주일에 2번씩 측정하였으며, 체중은 1주당 1번씩 측정하였다. 식이효율(food efficiency ratio: FER)은 3주간의 사육기간 동안의 체중증가량을 같은 기간 동안 섭취한 식이 섭취량으로 나누어 산출하였다.

통계학적 방법

SAS를 이용하여 ANOVA를 통해 유의성을 검증한 후 Duncan‘s multiple range test를 실행하였다.

상기한 실험결과는 아래와 같다.

사망률과 임상적 관찰

시험기간 동안 GCM 섭취에 의한 동물의 사망이나 육안적으로 특이한 임상적 증상은 없었다.

혈청 콜레스테롤

총 콜레스테롤 (Total cholesterol: TC)의 함량은 표 6에 나타내는 바와 같이 3% GCM군이 유의적으로 가장 낮았고, LDL-콜레스테롤의 함량 역시 3% GCM군이 가장 낮았다.

그리고 중성지방 (Triglyceride / TG)의 함량은 HC군이 가장 높고 나머지 각 군간 유의적인 차이는 없었으며, HDL-콜레스테롤의 함량은 HC군에 비하여 첨가량이 증가할수록 유의적으로 높아짐을 알 수 있다.

	TC		LDL		TG		HDL
	mean	SD	mean	SD	mean	SD	mean	SD
HC	233.76^a1 ⁾²⁾	28.28	193.50^a	10.35	63.68^NS3 ⁾	9.98	19.88^b	2.15
0.3% GCM	182.03^b	28.03	149.85^b	12.08	50.79	9.10	26.50^a	3.70
0.6% GCM	148.27^c	11.73	117.86^c	16.36	49.82	4.14	31.18^a	5.09
3% GCM	134.20^c	7.81	101.88^c	12.08	49.73	10.98	30.34^a	3.21

상기 표 6에서 단위는 mg/dl이고, NS는 no significance를 의미한다.

체중변화

체중의 증가량 변화는 표 7에 나타내는 바와 같이 군간의 유의적인 차이는 없었다.

표 7에서 단위는 g이다.

식이 효율 (Food efficiency ratio: FER )

표 8에서 나타내는 바와 같이 HC군과 3% GCM 투여군은 유의적인 차이가 없었으나 0.3% GCM군, 0.6% GCM군은 HC군보다 유의적으로 감소하였다.

Group	FER¹ ⁾
HC	0.247±0.016
0.3% GCM	0.197±0.019
0.6% GCM	0.225±0.015
3% GCM	0.247±0.022

표 8에서 FER은 weight gain/diet intake이다.

(2) 경구투여에 대한 영향

실험동물 및 식이

SD (Sprague-Dawley) 계통의 특정병원균 부재 (SPF) 랫드는 (주)오리엔트에서 암수 각 7주령을 구입하여 사용하였다. 7주령의 SD를 1주일간 적응시킨 후 각 군당 5마리씩으로 나누고, 식이는 AIN-76 diet를 이용하였다. 시험물질은 1% cholesterol을 사료와 혼합하여 투여하였다. 시험군의 구성은 음성대조군 (NC), 1% cholesterol 투여군 (HC), 1% cholesterol+0.165g GCM/kg (HC1×GCM), 1% cholesterol+0.330g GCM/kg (HC2×GCM), 1% cholesterol+0.825 GCM/kg (HC5×GCM) 투여군으로 구성된다.

혈청 지질분석

채혈 전 1시간 절식시킨 후 ether로 마취시켜 복부대동맥에서 채혈하였으며, 실온에서 30분간 방치 후 4℃, 3,000rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 혈청의 total cholesterol, HDL-cholesterol 및 triglyceride 는 효소법에 의한 kit (아산제약, 한국)를 사용하여 흡광도를 측정 [Perkinelmer, VICTO3 family) 하였으며, LDL-cholesterol은 Friedewald식 Total cholesterol-(HDL-cholesterol+TG/5)]에 의해 계산하였다.

식이 효율측정

식이 섭취량과 체중 시험기간 동안 매일 측정하였으며 식이 효율 (food efficiency ratio: FER)은 시험기간 동안의 체중증가량을 같은 기간 동안 섭취한 식이 섭취량으로 나누어 산출하였다.

통계학적 방법

SPSS 12.0K를 이용하여 일원 배치분산분석 (ANOVA test)를 통하여 연구의 모든 자료를 분석하였다.

이상의 실험 결과를 하기에서 살펴본다.

사망률과 임상적 관찰

혈청 콜레스테롤 (total cholesterol : TC )

도 1에 나타내는 바와 같이 총 콜레스테롤 함량은 음성대조군 (NC)과 1% 콜레스테롤 처리한 HC군은 각각 72.83±7.59mg/dl, 231.33±53.17mg/dl으로 콜레스테롤 식이에 의해 약 3배 정도 증가하였다. HC1×GCM, HC2×GCM, HC5×GCM의 시험군인 경우 각각 181.41±14.68mg/dl, 135.33±11.07mg/dl, 114.40±6.51mg/dl으로 HC1×GCM을 제외한 나머지 두 고농도 투여군은 HC군과 유의한 차이가 있다. 특히 시험물질의 농도가 높을수록 혈청 콜레스테롤 함량이 유의하게 감소하는 경향을 보이고 있다.

중성지방 ( Triglyceride : TG)

중성지방 함량은 음성대조군 (NC)과 1% 콜레스테롤 처리한 HC군은 각각 72.43±24.67 mg/dl, 45.95±9.65mg/dl로 콜레스테롤 식이에 의해 다소 감소되는 경향은 있으나 두 군간의 유의한 차이는 없다. HC1×GCM, HC2×GCM, HC5×GCM의 시험군인 경우 각각 54.59±22.01mg/dl, 28.41±9.70mg/dl, 26.20±5.45mg/dl로 HC1×GCM을 제외한 나머지 두 고농도 투여군은 HC군과 유의하게 중성지방 함량이 감소하였다.

LDL-cholesterol 함량

LDL-cholesterol 함량은 도 2에 나타내는 바와 같이 음성대조군 (NC)과 1% 콜레스테롤 처리한 HC군은 각각 20.59±6.25mg/dl 으로 콜레스테롤 식이에 의해 약 5배 정도 증가하였다. HC1×GCM, HC2×GCM, HC5×GCM의 시험군인 경우 각각 144.82±14.03mg/dl, 99.76±8.46mg/dl, 77.49±13.64mg/dl로 HC1×GCM을 제외한 나머지 두 고농도 투여군은 HC군과 유의한 차이가 있다.

HDL-cholesterol 함량

HDL-cholesterol 함량은 도 3에 나타내는 바와 같이 음성대조군 (NC)과 1% 콜레스테롤 처리한 HC군은 각각 37.75±4.32mg/이, 27.06±8.61 mg/dl으로 콜레스테롤 식이에 의해 다소 감소되는 경향은 있으나 두 군간 유의한 차이는 없다. HC1×GCM, HC2×GCM, HC5×GCM 의 시험군인 경우 각각 25.67±7.34mg/dl, 31.68±8.24mg/dl으로 HC군과 유의한 차이가 없다.

체중변화

실험기간 동안 체중증가는 표 9에 나타내는 바와 같이 유의한 차이가 없다 (P>0.05).

표 9에서 단위는 g이다.

식이 효율 (Food efficiency ratio: FER )

식이 효율 역시 표 10에 나타내는 바와 같이 유의적인 차이가 없다.(P>0.05).

5. liposomal GCM 의 제조

250mL 둥근 플라스크 용기에 얻어진 GCM 1g과 레시틴(lecithin) 2g을 클로로포름(chloroform):메탄올(methanol)이 2:1(v/v) 용매에 잘 녹인 후 evaporator로 용매를 제거한다. 여기에 물 47mL를 넣은 후 균질기(homogenizer)로 60분간 고속으로 교반하여 균질된 현탁액(homogenized suspension)을 만든다. 다른 250mL 비커에 크산탄 검(xanthane gum 2g을 물 48mL에 완전히 녹여 겔상으로 만든다. 위의 두 물질을 교반하면서 섞어 1%의 겔형 GCM을 완성한다.

이와 같이 생성된 겔형 GCM은 기능성화장품, 골다공증 치료제 등에 다양하게 사용가능하다.

또한, 배양된 홍국균과 배지는 오븐에서 110℃로 수분함량 10% 이하가 되도록 건조하여 분말로 제조하여 사용할 수도 있다.

그리고, 상기한 바와 같이 제조된 GCM을 갖는 홍국균과 배양액을 이용하여 쌀을 가공하는데, 그 과정을 살펴보면, 백미를 물에 충분히 잠기도록 수침시켜 8-12시간 경과시켜 수분함량 45% 이상이 되도록 한 후, 100-140℃에서 10-20분 증자한 후, 여기에 GCM을 갖는 홍국균과 배양액을 증자한 쌀중량에 대하여 5-10% 첨가하여 20-40℃ 인큐베이터에서 10-14일간 배양하여 쌀에 GCM성분이 함유되도록 한 것이다.

상기한 바와 같이 구성된 본 발명에 의하면 분리 및 용해도에 의한 저비용의 배당체 제니스테인의 분리기술 확립으로 경제적인 이익의 극대화가 가능하고, 홍국균을 이용한 비배당체 이소플라본과 모나콜린 케이(Monacolin K)를 동시에 가지는 GCM의 획득을 통하여 보다 효율적인 고지혈증 건강기능식품의 생산기술을 확보할 수 있게 된다.

그리고 대두와 더불어 두부생산 공정에서 발생하는 부산물인 비지에서 콩의 주요 기능성 성분인 이소플라본을 분리할 수 있어서 원자재의 원가절감효과와 더불어 폐자원의 활용이라는 점에서 중요한 가치를 가진다.

또한, 생성된 GCM은 콜레스테롤 억제를 통한 고지혈증 및 심장질환 개선제로 이용이 가능하며, 모나콜린 케이의 골세포 촉진작용과 제니스테인의 파골세포 억제 등을 통한 골다공증 치료에 효과가 있다.

또한, 본 발명의 제니스틴 추출 과정은 종래의 콩과 식물에서 이소플라본을 분리하는 방법으로 주로 사용되는 칼럼 크로마토그래피(column chromatography)를 이용하여 글리코사이드 이소플라본(glycoside isoflavone)을 분리한 다음, 산이나 효소를 이용하여 아글루콘 이소플라본(aglucone isoflavone)을 얻는 방법에 비하여, 고농도의 글리코사이드 이소플라본인 제니스틴을 에탄올 수용액의 용해도 차이를 이용하여 보다 효과적으로 분리할 수 있다.

Claims

콩 분말 1kg에 대하여 1-3L의 핵산을 2-4회 반복해서 가하여 10시간 교반한 후, 필터링하여 탈지된 콩 분말을 제조하는 탈지과정과,

탈지된 콩 분말 700g에 대하여 상온에서 0.5-2L의 80% 에탄올 수용액을 2-5회 반복하여 가하여 4-6시간 교반하여 10% 내외의 이소플라본을 얻는 10% 이소플라본 추출 과정과,

상기한 10% 내외의 이소플라본 10g에 95% 에탄올 수용액(aq. ethanol) 100-150mL를 첨가한 후 70-90℃에서 30분에서 1-3시간 교반한 후 여과한 다음 용매를 감압여과하여 제거함으로써 50% 이상의 이소플라본을 얻는 과정인 것을 특징으로 하는 이소플라본 제조 방법.
비지를 건조 오븐에서 100-150℃에서 수분함량 10%이하가 되도록 완전히 건조하는 건조과정과,

건조된 콩비지분말 700g에 대하여 상온에서 0.5-2L의 80% 에탄올 수용액을 2-5회 반복하여 가하여 4-6시간 교반하여 10% 내외의 이소플라본을 얻는 10% 이소플라본 추출 과정과,

상기한 10% 내외의 이소플라본 10g에 95% 에탄올 수용액(aq. ethanol) 100-150mL를 첨가한 후 70-90℃에서 30분에서 1-3시간 교반한 후 여과한 다음 용매를 감압여과하여 제거함으로써 50% 이상의 이소플라본을 얻는 과정인 것을 특징으로 하는 이소플라본 제조 방법.
콩 혹은 콩비지로부터 추출된 이소플라본 1g에 대하여 60-90% 에탄올 수용액 80-120mL를 추가하여 70-90℃에서 10-30분간 환류 추출한 다음 필터링하고 5-15℃로 급속냉각한 후 12-36시간 경과시켜 제니스틴을 얻는 것을 특징으로 하는 제니스틴 제조 방법.
제니스틴을 50-85% 에탄올에 0.1 내지 1중량% 용해하여 pH는 5-7로 조정된 배지에 0.01-0.2중량% 첨가하여 홍국균을 배양하여 홍국균이 모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인을 갖도록 하는 것을 특징으로 하는 모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인을 갖는 홍국균 배양 방법.
제 4항에 있어서, 상기한 제니스틴은 액상으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인을 갖는 홍국균 배양 방법.
모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인을 갖는 홍국균과 배지를 오븐에서 110℃로 수분함량 10% 이하가 되도록 건조하는 것을 특징으로 하는 모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인을 갖는 분말 제조 방법.
청구항 6에서 얻어진 모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인을 갖는 홍국분말 1g에 대하여 레시틴 1.5-3g을 클로로포름:메탄올이 2:1의 부피비로 혼합된 용매에 녹인 후 용매를 이베퍼레이터를 사용하여 제거하고,

생성된 물질의 중량에 대하여 물 50-60mL를 넣은 후 50-70분간 고속 교반하여 균질화된 현탁액을 제조하며,

크산탄 검 1-5g을 물 40-60mL에 완전히 녹여 겔상으로 만든 후,

상기 균질화된 현탁액과 겔상의 크산탄 검을 교반하면서 섞어서 겔형으로 제조하는 것을 특징으로 하는 모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인을 갖는 겔 제조 방법.
백미를 물에 충분히 잠기도록 수침시켜 8-12시간 경과시켜 수분함량 45% 이상이 되도록 한 후, 100-140℃에서 10-20분 증자하고, 여기에 모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인을 갖는 홍국균과 배지를 증자한 쌀중량에 대하여 5-10% 첨가하여 20-40℃ 인큐베이터에서 10-14일간 배양한 것을 특징으로 하는 모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인을 갖는 쌀 제조 방법.