KR20070119614A

KR20070119614A - 노시셉틴/오파닌 에프큐 수용체의 고강력 완전 및 부분작동물질 및 길항물질

Info

Publication number: KR20070119614A
Application number: KR1020077018487A
Authority: KR
Inventors: 레모 구에리니; 세베로 살바도리; 지롤라모 칼로'; 도메니코 레골리
Original assignee: 메나리니 인터내셔날 오퍼레이션즈 룩셈부르크 에스.아.
Priority date: 2005-02-15
Filing date: 2006-02-15
Publication date: 2007-12-20
Also published as: HUE025000T2; WO2006087340A2; ZA200707714B; CU23823A3; RS54095B1; CA2598121C; US20100273710A1; MA29288B1; HRP20150731T1; CN101128482A; BRPI0606998B8; BRPI0606998A2; EA200701732A1; CR9379A; WO2006087340A3; PL1851241T3; EA011325B1; NO20074702L; BRPI0606998B1; IL185235A0

Abstract

노시셉틴/오파닌 FQ의 펩타이드 유사체, 이의 조성물 및 이들이 NOP 수용체의 활성화 또는 차단과 관련 있는 장애 및 기능장애의 치료에 사용되는 용도가 기술되어 있다.

노시셉틴, 오파닌 FQ, 펩타이드 유사체, NOP 수용체

Description

노시셉틴/오파닌 에프큐 수용체의 고강력 완전 및 부분 작동물질 및 길항물질{Highly potent full and partial agonists and antagonists of the nociceptin/orphanin FQ receptor}

본 발명은 노시셉틴/오파닌(nociceptin/orphanin) FQ (N/OFQ) 펩타이드 수용체(NOP 수용체)의 활성을 조정할 수 있는 N/OFQ 펩타이드 유사체, 이러한 펩타이드 유사체를 함유하는 약학 조성물 및 이들을 상기 수용체를 수반하는 기능장애, 병리학적 이상 또는 병리학적 상태를 치료하는데 사용하는 용도에 관한 것이다.

아편유사 수용체와 구조적으로 유사한 ORL1이라는 신규 수용체는 1994년에 클로닝되었다; 최근 IUPHAR 권고에 따르면, 이 수용체의 가장 적당한 명칭은 NOP이다. 이의 내인성 리간드(N/OFQ)는 1995년 말에 동정되었고, 일부 아편유사 펩타이드(예, 다이노르핀 A)와 유사하지만 고전적 아편유사 수용체의 뮤(MOP), 델타(DOP) 또는 카파(KOP) 형태에 결합하지 않는 헵타데카펩타이드이다. NOP 수용체에 의해 매개되는 세포 효과는 고전적인 아편유사 수용체에 의해 유발되는 것과 유사하다. 구조적 관점 및 시그널 변환의 관점에서 N/OFQ-NOP 펩타이드/수용체 시스템은 아편유사 패밀리에 속하지만, 약리학적으로는 다른 분지를 이룬다. 1996년과 1998년 사이에 실시된 몇 가지 연구에 따르면, N/OFQ가 중추신경계(통증, 불안, 학습, 기억, 약물 남용, 식욕) 및 말초 수준(혈압, 심장 리듬, 신장, 위장, 비뇨생식 및 호흡 기능)에서의 몇 가지 기능을 조정할 수 있음이 밝혀져 있다(더 세부 사항은 Massi et al., Peptides 21, 2000 참조).

본 발명자들은 1996년부터 N/OFQ-NOP 시스템에 대한 연구를 수행했고, 그 결과 특정 NOP 수용체 리간드, 예컨대 i) N/OFQ 천연 리간드와 동일한 활성을 보유하는 최소 기능성 단편을 나타내는 N/OFQ(1-13)-NH₂ (Calo et al., Eur J Pharmacol 311, R3-5, 1996), ii) N/OFQ에 비해 더욱 강력하고 장기적인 효과를, 특히 생체 내에서 생산하는 N/OFQ-NH₂ (Rizzi et al., Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 363, 161-165, 2001), iii) NOP 및 고전적 아편유사 수용체에 작용하는 혼합 작동물질인 [Tyr¹]N/OFQ(1-13)-NH₂ (Calo et al., Can J Physiol Pharmacol 75, 713-8, 1997; Varani et al., Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 360, 270-7, 1999), iv) 연구 중인 제조/분석에 따라 순수 길항물질, 부분 작동물질 또는 심지어 완전한 작동물질로서 작용하는 선택적 NOP 수용체 리간드인 [Phe¹Ψ(CH₂-NH)Gly²]N/OFQ(1-13)-NH₂ - 이 화합물은 칼로 등(Peptides 21, 935-47, 2000)에 의해 보고된 [Phe¹Ψ(CH₂-NH)Gly²]N/OFQ(1-13)-NH₂ 의 약리적 작용의 상세한 분석을 기초로 할 때, 사실상 부분 NOP 작동물질인 것으로 판명되었다, v) NOP 수용체의 최 초의 순수한 경쟁적 길항물질인 [Nphe¹]N/OFQ(1-13)-NH₂ (Calo et al., Br J Pharmacol 129, 1183-93, 2000; Guerrini et al., J Med Chem 15, 2805, 13, 2000)를 동정했다. 이 리간드들의 작용은 시험관내 및 생체내의 여러 분석들을 통해 특성이 밝혀져 있다(Calo et al., Br J Pharmacol 129, 1261-83, 2000). 더 최근에는 Phe⁴ 잔기를 (pF)Phe 또는 (pNO₂)Phe로 교체함으로써 강력한 선택적 NOP 작동물질이 수득되었다(Guerrini et al., J Med Chem 44, 3956-64, 2001). 다른 재미있는 화합물인 [Arg¹⁴,Lys¹⁵]N/OFQ는 매우 강력한 작동물질(N/OFQ보다 17배 더 강력한)로서, HEK293 세포에서 발현되는 사람 재조합 NOP 수용체 선택성인 것으로 확인되었다(Okada et al., Biochem Biophys Res Commun 278, 493-8, 2000). 이 리간드의 작용은 N/OFQ에 민감한 분리 조직을 이용하는 시험관내에서, 그리고 마우스 생체내에서 더 상세히 분석되었다(Rizzi et al., J Pharmacol Exp Ther 300, 57-63, 2002). 더욱이, 짱 등(Zhang et al., J. Med. Chem., 45, 5280-5286, 2002)은 Ala 잔기 대신에 교체되어 리간드 친화성 및 효능을 증가시키는 7번 및/또는 11번 위치의 2-아미노-2-메틸-프로피온산(Aib) 잔기를 특징으로 하는 N/OFQ 유사체를 제시했다. N/OFQ 유사체는 WO 99/07212, WO 97/07208, WO 99/03491, WO 99/03880 및 EP 1422240에 기술되어 있다. 이 리간드의 유용성은 통각과민, 신경내분비 기능, 스트레스, 운동 활동 및 불안과 관련 있는 질환의 치료/예방에서 보고되었다. 이하, N/OFQ 펩타이드의 참조 서열은 다음과 같다: H-Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg- Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Ala-Asn-Gln-OH

도 1 : 꼬리 움츠림 분석에서 N/OFQ(10nmol/마우스) 및 UFP-112(0.1nmol/마우스)를 뇌실내(i.c.v., 상단 패널) 또는 경막내(i.t., 하단 패널) 투여한 효과(ref. Calo et al. Br J Pharmacol. 125, 375-378, 1998). 대조용 동물에게는 식염수(2㎕/마우스)를 i.c.v.로 1회 주사했다. 각 점은 적어도 4회 실험한 결과의 평균 ±s.e.m.을 나타낸다.

도 2 : 마우스의 자발적 운동 활동에 미치는 뇌실내 투여(i.c.v.)된 N/OFQ (10nmol/마우스) 및 UFP-112(0.1nmol/마우스) 효과의 지속 기간(ref. Rizzi et al., Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 363, 161-165, 2001). 대조용 동물에게는 식염수(2㎕/마우스)를 i.c.v.로 1회 주사했다. 각 점은 적어도 4회 실험한 결과의 평균±s.e.m.을 나타낸다.

도 3 : 전기 자극 후 마우스의 수정관에서 동등 효과 농도의 N/OFQ 및 UFP-112가 나타내는 효과의 작용 동역학 및 가역성. 전기 자극에 의해 유도된 수정관 수축은 UFP-112 또는 N/OFQ의 존재 하에서 억제된다.

본 명세서에서 사용된 용어들은 다음과 같이 문헌[IUPHAR on Receptor Nomenclature and Drug Classification, Pharm. Rev. (2003) Vol 55, No. 4, p.597]에 보고되었듯이, 당업계에 공지된 의미인 것이다:

효능(efficacy) - 동일한 비율의 수용체를 차지하고 있는 경우에도 다른 작동물질이 다양한 반응을 생산하는 정도를 나타낸다는 개념.

역가(potency) - 일정 효과를 생산하는데 필요한 농도 또는 함량으로 정의되는 화합물 활성의 표현. 이러한 역가는 작동물질의 경우에는 pEC₅₀으로, 길항물질의 경우에는 pA₂ 로 측정한다.

본 발명의 목적은 하기 식 (I)로 표시되는 N/OFQ 펩타이드 유사체를 제공하는 것이다:

Xaa ¹ -Ψ-Gly²-Gly³-Xbb ⁴ -Thr⁵-Gly⁶-Xcc ⁷ -Arg⁸-Lys⁹-Ser¹⁰-Xdd ¹¹ -Arg¹²-Lys¹³-Xee ¹⁴ -Xff ¹⁵ -R (I)

여기서,

Xaa ¹ 은 Phe 또는 N-벤질-글리신(Nphe)이고; Ψ은 처음 두 아미노산 잔기 사이의 결합을 나타내는 것으로서, CO-NH, CH₂-NH, CH₂-O 중에서 선택되는 것이며; Xbb ⁴ 는 Phe 또는 (pX)Phe로서, 여기서 "X"는 H, Cl, Br, I, F, NO₂, CN을 나타내고, "p"는 Phe의 페닐 고리의 파라 위치를 나타내며, Xcc ⁷ 및 Xdd ¹¹ 은 Ala; 2-아미노-2-메틸-프로피온산(Aib); 2-아미노-2-메틸-부티르산(Iva); 2-아미노-2-에틸-부티르산(Deg); 2-아미노-2-프로필-펜탄산(Dpg); (C_aCH₃)Leu; (C_aCH₃)Val; 1-아미노-사이클로프로판-카르복시산(Ac₃c); 1-아미노-사이클로펜탄-카르복시산(Ac₅c) 및 1-아미노-사이클로헥산-카르복시산(Ac₆c) 중에서 선택되는 것이며; Xee ¹⁴ 및 Xff ¹⁵ 는 Arg, Lys, Orn, omoArg, 디아미노부티르산, 디아미노프로피온산 또는 Trp 중에서 선택되는 것이고; R은 디펩타이드 Asn-Gln-NH₂ 또는 Asn-Gln-OH, 또는 아미드(-NH₂) 또는 카르복시(-OH) 말단기를 보유하거나 아미노(-NH₂) 또는 하이드록시(-OH) 말단기를 보유한 아미노산 Asn을 나타낸다.

더욱이, 본 발명은 이러한 화합물 (I)의 약학적 허용성 염, 특히 유기 및 무기산 염, 예컨대 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염, 아세트산염, 숙신산염, 아스코르브산염, 타르타르산염, 글루콘산염, 벤조산염, 말레산염, 푸마르산염 및 스테아르산염을 포함한다.

상기 식 (I)에 속하는 본 발명에 따른 화합물은 당업계에 공지된 펩타이드 리간드보다 100배도 넘는 약리 활성이 입증되었다. 따라서, 식 (I)에 의거하여, 위치 1, 4, 7, 11, 14 및 15와 처음 두 아미노산 잔기 사이의 결합에 대한 과돌연변이(permutation)의 상승작용적 효과의 가설을 세우는 것이 가능하다. 식 (I)로 표시되는 화합물 및 특히 바람직한 화합물, 바람직하게는 작동물질, 더욱 바람직하게는 [(pF)Phe⁴,Aib⁷,Arg¹⁴,Lys¹⁵]N/OFQ-NH₂의 높은 활성은 친화성, 역가, 프로테아제 내성, 작용의 시험관내 동역학, 특히 생체내 작용 지속 시간에 관해서 증명되었다.

바람직한 화합물은 식 (I)의 화합물에서 Ψ가 CO-NH 또는 CH₂-NH 또는 CH₂-O이고, Xaa ¹ 이 Phe 또는 Nphe이며, Xbb ⁴ 가 Phe 또는 (pX)Phe(여기서 "(pX)"는 상기에 정의된 바와 같다)이고, Xcc ⁷ 및 Xdd ¹¹ 은 상기에 정의된 바와 같으며, Xee ¹⁴ 및 Xff ¹⁵ 는 Arg, Lys, Orn, omoArg 또는 Trp이고; R은 -NH₂ 또는 -OH 또는 Asn-NH₂ 또는 Asn-OH 또는 Asn-Gln-NH₂ 또는 Asn-Gln-OH인 화합물이다.

더욱 바람직하게는, Ψ가 CO-NH 또는 CH₂-NH 또는 CH₂-O이고, Xaa ¹ 이 Phe 또는 Nphe이며, Xbb ⁴ 가 Phe 또는 (pF)Phe 또는 (pNO₂)Phe이고, Xcc ⁷ 및 Xdd ¹¹ 는 Ala; 2-아미노-2-메틸-프로피온산(Aib); 2-아미노-2-메틸-부티르산(Iva); 2-아미노-2-에틸-부티르산(Deg); 2-아미노-2-프로필-펜탄산(Dpg); (CaCH₃)Leu; (C_aCH₃)Val; 1-아미노-사이클로프로판-카르복시산(Ac₃c); 1-아미노-사이클로펜탄-카르복시산(Ac₅c) 또는 1-아미노-사이클로헥산-카르복시산(Ac₆c)이며, Xee ¹⁴ 및 Xff ¹⁵ 는 Arg 또는 Lys이고, R은 Asn-Gln-NH₂ 또는 -NH₂인 식 (I)의 화합물이다.

더욱 더 바람직하게는, 가변 잔기가 다음 표에 제시된 의미를 갖는 식 (I)의 펩타이드 유사체이다:

이 중에서, 더욱 더 바람직한 것은, Ψ 가 CO-NH 또는 CH₂-NH 또는 CH₂-O이고; Xaa ¹ 이 Phe 또는 Nphe이며; Xbb ⁴ 가 Phe 또는 (pF)Phe 또는 (pNO₂)Phe이며; Xcc ⁷ 및 Xdd ¹¹ 이 Ala; 2-아미노-2-메틸-프로피온산(Aib); 2-아미노-2-메틸-부티르산(Iva)이고; Xee ¹⁴ 가 Arg이고; Xff ¹⁵ 가 Lys이며; R이 Asn-Gln-NH₂ 또는 -NH₂인 화합물로서, 다음과 같은 식으로 표시된다:

a) H-Nphe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

b) H-Phe-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

c) H-Phe-Ψ(CH₂-NH)-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

d) H-Phe-Ψ(CH₂-O)-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

e) H-Phe-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys- Asn-Gln-NH₂

f) H-Phe-Ψ(CH₂-NH)-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg- Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

g) H-Phe-Ψ(CH₂-O)-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg- Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

h) H-Nphe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂

i) H-Phe-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂

l) H-Phe-Ψ(CH₂-NH)-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg- Lys-Arg-Lys-NH₂

m) H-Phe-Ψ(CH₂-O)-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂

n) H-Phe-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys- NH₂

o) H-Phe-Ψ(CH₂-NH)-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg- Lys-NH₂

p) H-Phe-Ψ(CH₂-O)-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg- Lys-Arg- Lys-NH₂

aa) H-Nphe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

bb) H-Phe-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg- Lys-Asn-Gln-NH₂

cc) H-Phe-Ψ(CH₂-NH)-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg- Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

dd) H-Phe-Ψ(CH₂-O)-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

ee) H-Phe-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys- Asn-Gln-NH₂

ff) H-Phe-Ψ(CH₂-NH)-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg- Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

gg) H-Phe-Ψ(CH₂-O)-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg- Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

hh) H-Nphe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂

ii) H-Phe-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys- NH₂

ll) H-Phe-Ψ(CH₂-NH)-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg- Lys-Arg-Lys-NH₂

mm) H-Phe-Ψ(CH₂-O)-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg- Lys-Arg-Lys-NH₂

nn) H-Phe-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂

oo) H-Phe-Ψ(CH₂-NH)-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂

pp) H-Phe-Ψ(CH₂-O)-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Aib-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂

aaa) H-Nphe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Iva-Arg-Lys-Arg-Lys- Asn-Gln-NH₂

bbb) H-Phe-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Iva-Arg-Lys-Arg-Lys- Asn-Gln-NH₂

ccc) H-Phe-Ψ(CH₂-NH)-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Iva-Arg- Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

ddd) H-Phe-Ψ(CH2-O)-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Iva-Arg- Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

eee) H-Phe-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Iva-Arg-Lys-Arg- Lys- Asn-Gln-NH₂

fff) H-Phe-Ψ(CH₂-NH)-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Iva-Arg- Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

ggg) H-Phe-Ψ(CH₂-O)-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Iva-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH₂

hhh) H-Nphe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Iva-Arg-Lys-Arg-Lys- NH₂

iii) H-Phe-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Iva-Arg-Lys-Arg- LyS-NH2

lll) H-Phe-Ψ(CH₂-NH)-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Iva-Arg- Lys-Arg-Lys-NH₂

mmm) H-Phe-Ψ(CH₂-O)-Gly-Gly-(pF)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Iva-Arg- Lys-Arg-Lys-NH₂

nnn) H-Phe-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Iva-Arg-Lys-Arg- Lys-NH₂

ooo) H-Phe-Ψ(CH₂-NH)-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Iva- Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂

ppp) H-Phe-Ψ(CH₂-O)-Gly-Gly-(pNO₂)Phe-Thr-Gly-Aib-Arg-Lys-Ser-Iva-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂

본 발명에 따른 펩타이드 유사체는 문헌에 공지된 여러 기술로 합성할 수 있다: 예컨대, Schroeder et al. "The Peptides" vol 1 , Academic Press, 1965; Bodanszky et al. "Peptide Synthesis" lnterscience Publisher, 1966; Barany & Merrifield, "The peptides; Analysis, Synthesis, Biology", 2, Academic Press, 1980; E. Atheron e R. C. Sheppard, "Solid Phase Peptide Synthesis" IRL Press at Oxford University Press 1989; J. Jones, "The Chemical Synthesis of Peptides", Claredon Press, Oxford 1994. 이러한 기술에는 고상 펩타이드 합성법 또는 용액상 펩타이드 합성법, 유기 화학의 합성 방법들 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다. 합성 방식의 선택은 물론 주어진 펩타이드의 조성에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 낮은 생산비를, 특히 대량 생산 시 수반하는 고상 기술과 고전적인 용액상 방법의 적당한 조합을 기초로 한 합성 방법을 이용하는 것이 좋다.상세하게는, 이러한 방법은 다음과 같은 방법을 포함한다:

i) N-보호된 아미노산을 적당하게는 활성화된 상태에서, 아미노산 또는 C-보호된 펩타이드 사슬에 순차 커플링하고, 중간체를 분리하고, 이어서 단편의 N-말단 및 C-말단 단부를 선택적 탈보호화하며, 이러한 커플링을 원하는 펩타이드가 수득될 때까지 반복하는, 펩타이드 사슬 단편의 용액 중의 합성법. 필요한 경우에는 측쇄도 탈보호화한다.

ii) 불용성 중합체 지지체 위에서 C-말단 단부에서부터 N-말단 단부쪽으로 수행하는 펩타이드 사슬의 고상 합성법. 여기서, 펩타이드는 무수 플루오르화물 산(fluoridric acid) 또는 트리플루오로아세트산에 의한 가수분해, 및 이와 동시에 측쇄의 탈보호화에 의해 수지로부터 분리된다.

합성 완료 시, 펩타이드는 적당한 용매로 처리하고 크로마토그래피 기술, 예컨대 HPLC를 이용하여 정제 및 분리할 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드 유사체는 i) 구조식이 [Phe¹Ψ[CO-NH)Gly²]인 경우, 완전한 작동물질로서, ii) 구조식이 [Phe¹Ψ(CH₂-NH)Gly²] 또는 [Phe¹Ψ(CH₂-O)Gly²]인 경우, 부분 작동물질로서, 그리고 구조식이 [Nphe¹Ψ(CO-NH)Gly²]인 경우 순수 길항물질로서 NOP 수용체에 작용한다.

또한, 본 발명은 전술한 펩타이드 유사체를 함유하고, 가능하다면 약학적 허용성 매개제 및 부형제와 혼합된 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 주사용 제제, 캡슐, 정제, 과립제, 용액제, 현탁제, 시럽, 좌약, 비측 분무제, 크림, 연고, 젤, 조절 방출형 제제 등으로서, 경구 또는 비경구 경로를 통해, 또는 호흡기, 직장, 척수, 경막내, 방광내 또는 국소 경로를 통해 투여될 수 있다. 약학 조성물의 제조 원리와 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18°Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa, 1990]에 기술되어 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 일반적으로 0.001 내지 100mg 범위, 바람직하게는 0.01 내지 10mg 범위의 펩타이드(또는 이의 유도체)의 유효량을 함유한다. 1일 용량은 병리학/기능장애, 연령, 성별 및 환자의 체중, 일반적인 건강 상태 및 기타 증례 기준에 의거하여 증례에서 평가되어야 하는 다른 변수들에 따라 달라진다.

생물학적 검사에서 본 발명의 펩타이드에 의해 관찰되는 활성 프로필을 고려할 때, 상기 펩타이드를 함유하는 약학 조성물은 기능장애, 이상 또는 병리적 상태, 예컨대 신경 및 감각신경의 기능장애의 치료에 사용할 수 있다. 바람직하게는, 불안, 식욕부진, 고혈압, 빈맥, 수분저류 장애, 저나트륨혈증, 울혈성심부전, 위장관, 호흡기관 및 비뇨생식기관의 평활근 운동 기능장애(특히 신경성 방광 후 요실금), 염증 상태 또는 말초 또는 척수 무통각증의 치료, 특히 만성 통증 치료, 더욱 더 기침 저지를 위해 강력하고 지속적인 NOP 수용체 활성화를 수득하는 것이 좋다. 더욱이, 기억, 기분, 운동 활성(예, 파킨슨씨병), 섭식 장애(예, 병적과식)의 치료, 또는 더욱 일반적으로 비만 환자의 치료를 위해 상기 길항물질을 사용하는 것이 가능할 것이다. 이러한 화합물의 고분자량 및 이 화합물 내에 생리적 pH에서 양하전을 띨 수 있는 잔기의 존재는 혈액-뇌 장벽을 통해 화합물이 통과할 수 없게 한다. 상기 화합물들은 주로 말초 분포를 보이기는 하지만, 국소 투여 후 중추 효과를 발휘할 수도 있다. 예를 들어, 작동물질 화합물은 경막내 투여 또는 척수 투여 후, 중추 신경계 수준에서 진통 효과를 유도할 수 있다.

실험

1. 펩타이드 합성

1.1 합성 개요

본 발명의 펩타이드는 수지 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸페녹시아세트아미도-노르류실-수지(Rink-Amide MBHA 수지)를 이용하여 고상 합성법으로 제조했다. Fmoc 아미노산(플루오레밀메톡시카르보닐)은 카르복시 기능의 활성화 시약으로서 [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄엑사플루오로포스페이트](HATU)를 이용하여 축합시켰다. Fmoc 기는 DMF(디메틸포름아미드) 중의 20% 피페리딘을 이용하여 제거했고, 보호된 펩타이드에 결합된 수지는 K 시약으로 처리하여 미정제 펩타이드를 수득했다. 처음 2개의 아미노산 잔기 사이에 변형된 펩타 이드 결합을 함유하는 화합물 [Phe¹Ψ(CH₂-NH)Gly²] 또는 [Phe¹Ψ(CH₂-O)Gly²]은 최종 합성 단계 동안에 수지에 결합된 보호된 펩타이드(2-17) 또는 (2-16) 또는 (2-15)에 Boc-Phe-CHO를 축합시켜, 중간체 "이미노" 유도체를 NaBH₃CN으로 동일계 내에서 환원시키거나, 또는 최종 합성 단계 동안에 수지에 결합된 보호된 펩타이드(3-17) 또는 (3-16) 또는 (3-15)에 단편 Boc-[Phe¹Ψ(CH₂-O)Gly²]-OH(문헌, Balboni et al., J.Chem.Soc.Perkin Trans I, 1998, pg 1645-1651 에 보고된 방법에 따라 수득)을 축합제로서 HATU를 이용하여 축합시켜 수득했다.

미가공 산물 및 최종 산물의 분석 조절은 Alltech C-18 컬럼(150 x 4.6mm, 5㎛)을 이용하는 Beckmann System Gold 168에서 분석용 HPLC로 수행했다. 화합물은 프로그램되는 구배가 분석될 화합물의 이화학적 성질에 따라 이루어지는 용매 A: 35mM NaH₂PO₄(pH 2.1)와 용매 B: 59mM NaH₂PO₄(pH 2.1)-아세토니트릴(60:40 v/v)로 구성된 2중 용출 시스템을 이용하여 1ml/min의 유속과 220nm의 파장에서 분석했다. 미가공 펩타이드의 정제는, 워터(Water) 방사상 충진 컬럼 델타-LC 40mm(30 x 40cm, C18, 300 A, 15㎛)를 이용하는 Water 정제용 HPLC Delta Prep 4000 시스템으로, 상기 분석용 HPLC에서 사용했던 동일한 이동상으로 미가공 반응 산물의 분석 프로필에 따라 프로그램된 구배로 용출시켜 수행했다. 최종 화합물의 분자량은 마이크로매스 ZMD2000을 이용하는 전기방사 질량분광분석법으로 수득했다.

일부 펩타이드의 중간체에 대한 분광학적 1HNMR 분석은 Bruker 200MHz 기구 를 이용하여 수행했다.

1.2 절차

전술한 펩타이드 유사체 b), c) 및 d)는 이하에 기술되는 절차에 따라 제조했다.

수지 Rink-Amide MBHA(0.65mmol/g, 0.2g)는 DMF 중의 피페리딘(20%)으로 처리하고, HATU로 카르복시 기를 활성화시킨 Fmoc-Gln(Trt)-OH와 축합시켰다. 다음과 같은 Fmoc 아미노산을 순차적으로 신장성 펩타이드 사슬에 커플링시켰다: Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-(pF)Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Phe-OH. Fmoc 아미노산(4 당량)은 모두 DMF 중의 HATU(4 당량)와 디이소프로필에틸아민(4 당량)을 이용하여 신장성 펩타이드 사슬에 커플링시켰다; 이러한 커플링 반응은 1시간 동안 수행했다. 합성 수율을 최적화하고 화합물의 정제를 더 용이하게 하기 위해서는 Aib 잔기에 아실화 시간 1시간이 추가된 2배 커플링 시간이 필요했다. 각 단계마다 Fmoc 기를 제거하기 위해 DMF 중의 피페리딘(20%)을 사용했다. N^a-Fmoc 기의 탈보호화 후, 펩타이드 수지는 메탄올로 세척하고 진공 건조하여 [(pF)Phe⁴, Aib⁷, Arg¹⁴, Lys¹⁵]-N/OFQ(1-17)-Rink-Amide MBHA-보호된 수지를 수득했다. 이와 같이 보호된 펩타이드 수지는 실온에서 1시간 동안 K 시약(TFA/H₂O/페놀/에탄디티올/티오아니솔 82.5:5:5:2.5:5; v/v: 10ml/0.2g 수지)으로 처리했다. 소모된 수지는 여과한 후, 용매를 진공 농축시키고, 잔류물은 에테르로 분말화했다. 미가공 펩타이드는 정제용 역상 HPLC로 정제하고, 동결건조 후 백색 분말을 수득했다.

[Phe¹Ψ(CH₂-NH)Gly²,(pF)Phe⁴,Aib⁷,Arg¹⁴,Lys¹⁵]-N/OFQ-NH₂(펩타이드 c)의 합성은 전술한 바와 같이 합성된 중간체 [(pF)Phe⁴,Aib⁷Arg¹⁴,Lys¹⁵]- N/OFQ-(2-17)-수지를 원료로 하여 제조했다. 이 중간체(0.2g, 0.65mmol/g, 0.13mmol)는 1% (V/V) 아세트산(2ml)을 함유하는 메탄올에 재현탁시켜 팽윤시켰다. 20분 후, Boc-Phe-CHO(0.065g, 0.26mmol) 및 NaBH3CN(0.033g, 0.52mmol)을 메탄올(0.8ml)에 용해시킨 용액을 첨가하고, 이 반응 혼합물을 1.5시간 동안 교반했다. 이 수지를 그 다음 메탄올로 세척하고, 전술한 바와 같은 시약 K로 처리했다. [Phe¹Ψ(CH₂-O)Gly²,(pF)Phe⁴,Aib⁷,Arg¹⁴,Lys¹⁵]N/OFQ-NH₂(펩타이드 d)의 합성은 전술한 바와 같이 합성된 중간체 [(pF)Phe⁴,Aib⁷Arg¹⁴,Lys¹⁵]-N/OFQ(3-17)-수지를 원료로 하여 수행했다. 상기 중간체(0.2g, 0.65mmol/g, 0.13mmol)를, 일반적인 아실화 단계에서 설명된 바와 같은 조건 하에 HATU로 카르복시 기를 활성화시킨 Boc-Phe[Ψ(CH₂-O)]Gly-OH(4당량, 0.16g, 0.52mmol)로 최종 단계에서 아실화시켰다. 그 다음, 수지를 메탄올로 세척하고 전술한 바와 같은 시약 K로 처리했다.

2. 약리 검사

2.1 재료 및 방법

화합물의 시험관내 검사는 사람 재조합 NOP 수용체를 발현하는 햄스터 난모세포 막(CHO_hNOP)(수용체 결합 실험 및 GTPуS 결합 자극 실험) 및 전기 자극 후의 마우스 수정관에 대해 수행했다. 생물검정 실험(마우스 수정관)에서 화합물의 효과를 연구하는데 사용된 조건은 문헌[Bigoni et al. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 359, 160-7, 1999]에 기술되어 있는 반면, CHO_hNOP 세포에서의 효과를 연구하는데 사용된 조건은 문헌[Mc Donald et al. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 367, 183-187, 2003]에 기술되어 있다. 각각의 일련의 실험에서, 신규 화합물의 활성은 천연의 N/OFQ 펩타이드의 활성과 비교했다.

2.2 결과

수용체 결합 실험에 따르면, 검사된 화합물 모두가 사람 재조합 NOP 수용체로부터 삼중수소화된 N/OFQ를 완전히 치환시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 화합물들은 각각의 화학적 변형에 따라 매우 다른 수용체 친화도(pK_i)를 나타냈다. 일반적으로, [Phe¹Ψ(CO-NH)Gly²] 구조를 가진 화합물은 [Phe¹Ψ(CH₂-NH)Gly²] 구조를 가진 화합물보다 높은 친화도를 보였고, [Nphe¹Ψ(CO-NH)Gly²] 구조를 가진 화합물보다 극히 높은 친화도를 보였다. 또한, 복합 변형을 보유한 화합물 [(pF)Phe⁴,Aib⁷,Arg¹⁴,Lys¹⁵]은 단일 변형을 보유한 화합물보다 더 큰 친화도를 보였 다. GTPуS 결합 자극에 관계하는 기능 검사 및 마우스 수정관의 전기 자극에 의해 유도된 경련의 억제에 관계하는 검사에 따르면, [Phe¹Ψ(CO-NH)Gly²] 구조를 보유한 화합물의 효과는 N/OFQ의 효과와 닮았고, 특히 유사한 최대 효과를 유도하여 완전한 작동물질로서 작용했지만, [Phe¹Ψ(CH₂-NH)Gly²] 구조를 가진 화합물은 최대 효과가 N/OFQ보다 낮은 바, 부분 작동물질로서 작용했다. 마지막으로, [Nphe¹Ψ(CO-NH)Gly²] 구조를 보유한 화합물은 그 자체가 어떠한 효과를 나타내지는 않았지만, N/OFQ의 경쟁적 길항물질로서 작용했다. 간단하게 나타내기 위해, 표 1에 화합물 [(pF)Phe⁴,Aib⁷Arg¹⁴,Lys¹⁵]N/OFQ-NH₂(UFP-112), [Phe¹Ψ(CH₂-NH)Gly²,(pF)Phe⁴,Aib⁷Arg¹⁴,Lys¹⁵]N/OFQ-NH₂ (UFP-113), [Nphe¹,Aib⁷Arg¹⁴,Lys¹⁵]N/OFQ-NH₂(UFP-111), 및 참조 펩타이드 N/OFQ에 의해 수득되는 결과를 정리했다.

표 1

[(pF)Phe⁴,Aib⁷,Arg¹⁴,Lys¹⁵]N/OFQ-NH₂(UFP-112), [Phe¹Ψ(CH₂-NH)Gly²,(pF)Phe⁴,Aib⁷,Arg¹⁴,Lys¹⁵]N/OFQ-NH₂(UFP-113), [Nphe¹,Aib⁷,Arg¹⁴,Lys¹⁵]N/OFQ-NH₂(UFP-111), 및 참조 펩타이드 N/OFQ의 생물학적 활 성.

	CHO_hNOP 세포의 막				마우스 수정관
	수용체 결합	GTPуS 결합 시 자극			전기 자극에 의해 유도된 경련 억제
		작동물질		길항물질	작동물질		길항물질
	PK_i	pEC₅₀	E_max	pA₂	pEC₅₀	E_max	pA₂
N/OFQ	9.50	9.04	100±9%	ND	7.39	-84±3%	ND
UFP-112	10.55	10.55	118±9%	ND	9.48	-85±2%	ND
UFP-113	10.26	9.72	79±3%	ND	가변성 작동물질 효과		9.28
UFP-111	9.75	불활성		8.68	불활성		7.46

상기 결과들은 4 내지 6회 측정값의 평균(중앙값)이다. ND : 화합물의 작동물질 효과로 인해 측정할 수 없음을 나타낸다.

표 1에서 강조되는 바와 같이, 화합물 UFP-113은 부분적인 NOP 수용체 작동물질로서 작용하여, GTPуS 분석은 물론 마우스 수정관의 전기 자극에 의해 유도된 수축의 억제 분석에서 모두 N/OFQ보다 낮은 최대 효과를 일으킨다. 쉴드(Schild) 분석(GTPуS 실험 및 마우스 수정관 시스템에서 모두 실시됨)에서는 상기 화합물이 역가 값이 각각 8.68 및 7.46(pA₂로서 표현)인 NOP 수용체의 경쟁적 길항물질로서 작용하는 것으로 나타난다(표 1 참조).

2.3 UFP-112 화합물의 선택성

UFP-112 효과는 이 펩타이드의 마우스 수정관에서의 작용이 날록손(고전적 아편유사 수용체의 비선택적 길항물질, 하지만 NOP 수용체의 길항물질은 아니다)의 존재 하에서 변경되지 않지만, 선택적 NOP 수용체 길항물질인 UFP-101([Nphe1,Arg14,Lys15]N/OFQ-NH₂, Calo et al., Br J Pharmacol 136, 303-311, 2002)이 효과적 길항작용성인 것으로 판명된 사실로 확인되듯이 NOP 수용체 활성화 에 의해 매개된다. UFP-112와 경쟁적으로 사용된 UFP-101은 내인성 작동물질 N/OFQ와 경쟁적으로 사용될 때 수득되는 역가와 유사한 역가 값(pA₂ 6.81)을 나타냈다. 이것은 3 분자(N/OFQ, UFP-112 및 UFP-101)가 동일한 수용체, 즉 NOP 수용체와 상호작용한다는 것을 나타낸다. 이것은 NOP 수용체 유전자에 대한 녹아웃 마우스(참조, Nishi, M. et al., Unrestrained nociceptive response and disregulation of hearing ability in mice lacking the nociceptin/orphanin FQ receptor. Embo J 16 (8): 1858-64, 1997) (NOP^-/-)유래의 조직에서 수득되는 결과에 의해 추가 입증된다(표 2 참조).

표 2 - 야생형(NOP^+/+) 및 NOP 수용체 녹아웃 마우스(NOP^-/-)의 수정관에서의 작동물질 N/OFQ 및 UFP112와 작동물질 DOP, D-Pen2,D-Pen5엔케팔린(DPDPE)의 효과

	NOP^+/+		NOP^-/-
화합물	pEC₅₀	E_max	pEC₅₀	E_max
N/OFQ	7.47	84±4%	<6	-
UFP-112	8.94	93±3%	<6	-
DPDPE	8.40	93±3%	8.20	91±5%

UFP-112에 의해 일어나는, 전기 자극에 의해 유도된 수축에 대한 억제 효과(N/OFQ에 의해 발견되는 것과 유사)는 NOP^-/- 마우스에서 분리된 수정관에서는 사라졌고, 이것은 UFP-112의 생물학적 작용이 오로지 NOP 수용체와의 상호작용에 의한 것임을 확인시켜준다.

선택적 DOP 작동물질인 화합물 [D-Pen²,D-Pen⁵]-엔케팔린, DPDPE(참조, Life Sci. 1983; 33 Suppl 1: 447-50)는 양성 대조군으로 사용했다. 이 대조군은 NOP 수 용체를 사용하지 않는 억제 자극에 대해서는 정상적으로 반응하는 NOP 수용체 녹아웃 마우스에서 유래된 조직임을 보여준다.

2.4 본 발명에 따른 화합물의 선택성에 미치는 약리 검사

화합물 검사는 맥도날드 등(Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 367, 183-187, 2003)의 문헌에 따라서, 상기 문단 2.1에서와 같이 사람 재조합 NOP 수용체(CHO_hNOP)를 발현하는 햄스터 난모세포의 막에서 시험관내 검사로 수행했다.

이 화합물들의 NOP 수용체에 대한 선택성 연구는 CHO_hNOP에서와 같은 방법을 이용하여 뮤(MOP), 델타(DOP) 및 카파(KOP) 형의 사람 재조합 난모세포 수용체로 형질감염된 CHO 세포의 막에 대한 수용체 결합 연구로 수행했다. 선택성 연구는 맥도날드 등(Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 367, 183-187, 2003)에 기술된 방법에 따라 경쟁 실험으로 수행했다. N/OFQ에 대한 pK_i를 측정하기 위해, 삼중수소화된 N/OFQ를 방사능리간드로서 사용했고, 고전적 아편유사 수용체에 대해서는 [³H]-디프레노르핀을 사용했다. 새로운 화합물의 활성은 천연 펩타이드 N/OFQ의 활성과 비교했다.

형질감염된 CHO 세포의 막에 대해 수행된 수용체 결합 실험에서, UFP-111, UFP-112 및 UFP-113은 MOP, KOP 및 DOP 수용체보다 NOP 수용체에 대해 더 높은 선택성(>100배)을 보여주었다(표 3).

표 3. CHO 세포에 형질감염된 NOP, MOP, DOP 및 KOP 수용체에 대한 UFP-112, UFP- 113 및 UFP-111의 친화성(pK_i)[참조, Mc Donald et al.(Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 367, 183-187, 2003)].

	pK_i
수용체(수용체당 사용된 표준 리간드)	NOP(N/OFQ)¹	MOP(DAMGO)^2,3	DOP(날트린돌)³	KOP(Nor-BNI)³
표준 리간드	9.50	8.43	9.97	9.90
UFP-112	10.55	7.13	6.37	8.36
UFP-113	10.26	6.45	5.69	7.55
UFP-111	7.75	<5.0	<5.0	6.17

데이터는 4회 실험의 평균값이다.

·주 1 - 사용된 삼중수소화된 리간드는 [³H]N/OFQ이다.

·주 2 - DAMGO는 [D-Ala(2),N-MePhe(4),Gly-ol(5)]엔케팔린을 의미한다.

·주 3 - 사용된 삼중수소화된 리간드는 [³H]-디프레노르핀이다.

3. 완전한 작동물질 화합물 UFP-112의 효능에 미치는 생체내 연구

완전한 작동물질인 화합물 UFP-112는 다음과 같은 여러 가지 분석법으로 마우스의 생체내에서 검사했다:

1) Calo et al.(Br J Pharmacol 125, 373-378, 1998) 및 Rizzi et al.(Clin Pharmacol 18, 56, 2004)에 의해 개시된 실험 프로토콜에 따른 꼬리 움츠림 분석:

2) 문헌[Rizzi et al. (National Congress of the Italian Society of Neuroscience and joint Italian-Swedish Neuroscience Meetings, lschia (Napoli) 1-4 October 2005)]에 개시된 바와 같은 급식 동물의 음식 섭취량 측정;

3) 문헌[Rizzi et al., Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 363, 161-165, 2001]에 기술된 바와 같은 자발적 운동 활동의 측정 분석.

각 분석법마다 UFP-112와 N/OFQ 활성은 동등한 유효 용량으로 측정했다. UFP-112가 약 100배 높은 역가를 나타내는 바, 펩타이드 UFP-112는 0.001 내지 0.1nmol 사이의 용량으로 사용했고, N/OFQ는 0.1 내지 10nmol 사이의 용량으로 사용했다.

마우스의 진통분석적 꼬리 움츠림 검사에서, UFP-112는 동등 유효 용량에서 천연 리간드 N/OFQ와 닮은 효과를 나타냈지만, 그 작용은 더 길었다(>120분).

0.001 내지 0.1nmol 사이의 용량 범위의 UFP-112는 뇌실내(i.c.v.) 경로를 통해 주사한 경우, 전구통각수용(pronociceptive) 효과를 유도한 반면, 경막내(i.t.) 경로를 통해 투여했을 때에는 통각수용억제(antinociceptive) 효과를 일으켰다(도 1 참조). 이러한 효과(N/OFQ에서 발견되는 것과 유사)는 NOP^-/- 마우스에서는 존재하지 않기 때문에 NOP 수용체 활성화에 의해 매개되는 것이다.

동등 유효 용량의 N/OFQ와 UFP-112는 급식 마우스의 음식 섭취량 검사로 조사했다. 두 화합물은 음식 섭취량의 유의적 증가를 유도했으며, UFP-112는 이 분석에서도 N/OFQ보다 100배 이상 강력한 것으로 입증되었다. 이 검사에서, N/OFQ와 NFP-112의 식욕항진 효과는 NOP^+/+ 마우스에서는 나타나지만 NOP^-/- 마우스에서는 나타나지 않는 바, 이러한 효과는 오로지 NOP 수용체 활성화 때문이다.

UFP-112 작용의 생체내 지속 기간을 조사하기 위해, 자발적 운동 활동에 대하여 둘 다 i.c.v. 투여한 동등 유효 용량의 N/OFQ(10nmol)와 UFP-112(0.1nmol)가 미치는 효과의 지속 기간(오후 5:30에서부터 오전7:30까지)을 비교하는 실험을 마우스에서 수행했다. 두 펩타이드는 모두 운동 활동을 억제했지만, N/OFQ의 효과는 i.c.v. 주사 후 60분 후에 중단되었지만, UFP-112에 의해 유도된 효과는 약 6h 후에 중단되었다(도 2 참조).

4. 뇌 균질물 및 혈장에서의 N/OFQ 및 신규 유도체 UFP-111, UFP-112 및 UFP-113의 대사 안정성

혈장 및 뇌 조직 시료는 스위스 마우스 수컷(Morini, Reggio Emilia, Italy, 25-30g)에서 수득했다. 에테르 마취로 살처분한 동물에게 좌심실에 장치한 주사바늘을 통해 생리적 헤파린 용액을 주입하여 관류시켰다. 그 다음, 혈액을 취하고, 실온에서 14000xg 하에 2분 동안 원심분리했다. 펠릿으로부터 분리 후, 혈장은 분취하여 -80℃에 보관했다. 혈액 채취 후, 동물에게 다시 생리적 용액을 2분 동안 관류시킨 다음 뇌를 분리했다. 뇌 조직은 Tris/HCl(50mM, pH 7.4, 0℃) 5vol.(w/v) 중에서 ultra-Turrax(Janke Junkel, Staufen, FRG)로 각각 15초씩 3회 균질화했다. 원심분리(3000xg, 15분, 4℃)하여 수득한 상청액은 따라 내어 -80℃에 보관햇다.

제조물의 단백질 함량은 문헌[Anal. Biochem., 72, 248-254, 1976]에 기술된 바와 같은 브래드포드 방법으로 측정한 결과, 뇌 균질액에서는 약 8㎍/㎕이고, 혈장에서는 17㎍/㎕이었다.

각 펩타이드(3mg/500㎕ Tris)의 100㎕ 용액 분취량을 Tris/HCl 50mM pH 7.4 완충액을 함유하는 총 부피 1ml의 뇌 균질액 또는 혈장(450㎕)과 항온배양했다(최종 농도 6㎍/㎕). 분취량의 항온배양은 240min 이하의 다양한 기간 동안 37℃에서 수행했다. 여러 항온배양 시간에서, 용액의 분취량(100㎕)을 취해, 4.5% TFA 용액(200㎕)을 첨가해 분해를 차단시켰다. 원심분리(3000rpm, 15분) 후, 상청액의 분취량(100㎕)을 RP-HPLC에 주입했다. HPLC 분석은 가변성 파장 UV 검출기가 장착된 Beckman System Gold 크로마토그래피 시스템을 이용하여 Kromasil 100-5C18 컬럼(4.6x250mm)에서 수행했다. 용출의 분석 조건에는 각각 0.1% TFA를 함유하는 물(용매 A)과 아세토니트릴(용매 B)을 0.7ml/min의 유속으로 이용한 구배 분석이 포함되었다. 구배 분석에는 피분석물의 이화학적 특징에 기초하여 선택되는 다음과 같은 프로토콜을 이용했다: 20분 후까지 B 5%에서 40%까지의 선형 구배; 5분 후까지 B 40%에서 60%까지의 선형 구베; 5분 후까지 B 60%에서 5%까지의 선형 구배. 용출물은 220nm에서 모니터했다. 반감기(T_1/2)는 최소제곱법을 사용한 선형 회귀 분석으로 수득했고, 각 분석마다 최소 5개의 점을 이용하여 각 유도체의 피크 면적을 항온배양 시간의 함수로서 도표로 나타냈다.

데이터는 표 3에 평균 ± 표준편차로서 제시했고, 최소 3회의 실험에서 수득했다.

표 3. 마우스 혈장 및 뇌 조직에서 N/OFQ 및 유도체의 T½(min)

	혈장	뇌
N/OFQ	64±1	3.2±1.8
UFP-111	137±4	11.0±1.9
UFP-112	167±9	11.3±1.4
UFP-113	110±10	12.3±0.8

N/OFQ의 반감기는 혈장에서 약 1시간이었고, 이와 달리 뇌 균질에서 수득되는 반감기는 약 3분이었다. 본 발명에 따라 조사된 모든 펩타이드는 천연 펩타이드 에 비해 반감기가 유의적으로 길었다. 특히, UFP-111 및 UFP-113의 혈장 T½은 뇌 조직에서 N/OFQ에 의해 나타나는 값(3분)보다 3배 넘게 길었다.

이러한 데이터는 UFP-111, 112 및 113 서열의 화학적 변경이 N/OFQ에 비해 작동물질 또는 길항물질로서의 역가를 증가시킨다는 것을 보여주며, 이러한 변경은 혈장 및 뇌 조직에 모두 존재하는 펩티다제에 의한 분해 민감성의 중대한 감소를 결정한다. 이러한 중대한 특징은 섹션 3에 정리된 일련의 실험(생체내 연구)에서 UFP-112에 대해 분명하게 기록된 바와 같이, 이러한 분자의 생체내 작용을 연장시키는데 결정적인 것임이 확실하다.

5. 마우스 수정관에서 UFP-112의 억제 효과의 동역학

전기 자극을 받은 마우스 수정관에서, UFP-112 작용의 동역학 및 세척 후 효과의 가역성은 모두 N/OFQ보다 훨씬 느렸다(도 3 참조). 이것은 전기 자극에 의해 유도되는 수정관 수축에 대한 억제 효과를 통해 확인되었다. 대사 안정성 데이터와 함께, 이것은 내인성 리간드 N/OFQ에 비해 UFP-112의 더 긴 생체내 작용을 설명할 수 있을 것이다.

6. 전기 자극 후 마우스 수정관에서 식 I로 표시되는 일부 화합물의 생물학적 활성

표 4는 작동물질 모델 N/OFQ-NH₂의 위치 7과 11에서 다른 화학적 변경을 보유하는 식 I로 표시되는 일련의 화합물의 존재 하에, 전기 자극 후 마우스 수정관에서 수득된 결과를 정리한 것이다. 이 데이터는 다른 아미노산 치환이 모두 완전 한 작동물질로서 작용하는 화합물의 효능을 변화시키지는 않지만, 일부 경우(예컨대, [Ac₅c¹¹]N/OFQ-NH₂ 및 [D/L-Iva¹¹]N/OFQ-NH₂)에는 참조 서열에 비해 역가를 증가시킨다는 것을 보여준다. 이러한 각각의 변경의 결과로서 수득되는 역가의 증가(참조 서열에 비해 2배)는 다른 위치에서 복합 변경의 결과로서 수득되는 역가의 증가, 예컨대 100배가 넘는 역가 증가를 나타내는 UFP-112(표 1)의 경우보다 낮은 증가라는 것을 간과해서는 아니 된다.

표 4: 위치 7과 11에서 다양한 화학적 변경에 의해 수득되는 식 I로 표시되는 일련의 화합물을 가지고 마우스의 전기 자극된 수정관에서 측정한 역가

화합물	pEC₅₀ (CL 95%)	E_max
N/OFQ-NH₂	7.80(7.74-7.86)	93±2%
[Ac₃c⁷]N/OFQ-NH₂	7.08(6.82-7.34)	98±1%
[Ac₅c⁷]N/OFQ-NH₂	7.60(7.40-7.80)	98±1%
[Ac₆c⁷]N/OFQ-NH₂	7.20(6.86-7.54)	87±1%
[(aMe)D/L-Val⁷]N/OFQ-NH₂ (부분입체이성질체 1)	7.26(7.00-7.52)	88±1%
[(aMe)D/L-Val⁷]N/OFQ-NH₂ (부분입체이성질체 2)	7.56(7.34-7.78)	95±1%
[(aMe)D/L-Leu⁷]N/OFQ-NH₂ (부분입체이성질체 1)	7.33(7.04-7.62)	84±1%
[(aMe)D/L-Leu⁷]N/OFQ-NH₂ (부분입체이성질체 2)	7.12(7.02-7.22)	95±2%
[Iva⁷]N/OFQ-NH₂ (부분입체이성질체 1)	7.83(7.74-7.92)	91±4%
[Iva⁷]N/OFQ-NH₂ (부분입체이성질체 2)	7.62(7.32-7.92)	88±3%
[Deg⁷]N/OFQ-NH₂	7.91(7.53-8.27)	89±2%
[Dpg⁷]N/OFQ-NH₂	7.90(7.71-8.11)	91±4%
[Ac₃c¹¹]N/OFQ-NH₂	7.78(7.62-7.94)	91±4%
[Ac₅c¹¹]N/OFQ-NH₂	8.08(7.93-8.23)	89±4%
[Ac₆c¹¹]N/OFQ-NH₂	7.79(7.53-8.05)	89±4%
[(aMe)D/L-Val¹¹]N/OFQ-NH₂ (부분입체이성질체 1)	7.71(7.37-8.05)	93±2%
[(aMe)D/L-Val¹¹]N/OFQ-NH₂ (부분입체이성질체 2)	7.83(7.67-7.99)	86±4%
[(aMe)D/L-Leu¹¹]N/OFQ-NH₂	7.87(7.67-8.07)	91±4%
[D/L-Iva¹¹]N/OFQ-NH₂	8.12(7.78-8.46)	90±4%
[Deg¹¹]N/OFQ-NH₂	7.75(7.43-7.89)	87±4%
[Dpg¹¹]N/OFQ-NH₂	7.53(7.17-8.04)	86±3%

서열목록제출서에 첨부하여 제출

Claims

하기 식 (I)로 표시되는 펩타이드 및 이의 약학적 허용성 염:

Xaa ¹ - Ψ -Gly²-Gly³-Xbb ⁴ -Thr⁵-Gly⁶-Xcc ⁷ -Arg⁸-Lys⁹-Ser¹⁰-Xdd ¹¹ -Arg¹²-Lys¹³-Xee ¹⁴ -Xff ¹⁵ -R (I)

여기서,

Xaa ¹ 은 Phe 또는 N-벤질-글리신(Nphe)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;

Ψ 은 처음 두 아미노산 잔기 사이의 결합을 나타내는 것으로서, CO-NH, CH₂-NH 및 CH₂-O로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이며;

Xbb ⁴ 는 Phe 또는 pXPhe로서, 여기서 "X"는 H, Cl, Br, I, F, NO₂ 및 CN으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, "p"는 Phe의 페닐 고리의 파라 위치를 나타내며;

Xcc ⁷ 및 Xdd ¹¹ 은 Ala; 2-아미노-2-메틸-프로피온산(Aib); 2-아미노-2-메틸-부티르산(Iva); 2-아미노-2-에틸-부티르산(Deg); 2-아미노-2-프로필-펜탄산(Dpg); (C_aCH₃)Leu; (C_aCH₃)Val; 1-아미노-사이클로프로판-카르복시산(Ac₃c); 1-아미노-사이클로펜탄-카르복시산(Ac₅c) 및 1-아미노-사이클로헥산-카르복시산(Ac₆c)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이며;

Xee ¹⁴ 및 Xff ¹⁵ 는 Arg, Lys, Orn, omoArg, 디아미노부티르산, 디아미노프로피온산 또는 Trp로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이고;

R은 디펩타이드 Asn-Gln-NH₂ 또는 Asn-Gln-OH, 또는 아미드(-NH₂) 또는 카르복시(-OH) 말단기를 보유하거나 아미노(-NH₂) 또는 하이드록시(-OH) 말단기를 보유한 아미노산 Asn을 나타낸다.
제1항에 있어서, Xcc ⁷ 이 2-아미노-2-메틸-프로피온산(Aib); 2-아미노-2-메틸-부티르산(Iva); 2-아미노-2-에틸-부티르산(Deg); 2-아미노-2-프로필-펜탄산(Dpg); (CaCH₃)Leu; (CaCH₃)Val; 1-아미노-사이클로프로판-카르복시산(Ac₃c); 1-아미노-사이클로펜탄-카르복시산(Ac₅c) 및 1-아미노-사이클로헥산-카르복시산(Ac₆c)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 펩타이드 및 이의 약학적 허용성 염.
제2항에 있어서, 다음 화합물을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 펩타이드 및 이의 약학적 허용성 염:
제2항에 있어서,

Xaa ¹ 이 Phe이고;

Xbb ⁴ 가 (pX)Phe 이며, 여기서 "X"는 H, F, NO₂로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, "p"는 Phe의 페닐 고리에서 파라 위치인 것을 나타내며;

Xcc ⁷ 이 2-아미노-2-메틸-프로피온산(Aib); 1-아미노-사이클로펜탄-카르복시산(Ac₅c) 및 2-아미노-2-메틸-부티르산(Iva)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;

Xdd ¹¹ 이 Ala; 2-아미노-2-메틸-프로피온산(Aib); 1-아미노-사이클로펜탄-카르복시산(Ac₅c) 및 2-아미노-2-메틸-부티르산(Iva)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며;

Xee ¹⁴ 가 Arg이고;

Xff ¹⁵ 가 Lys이며;

R이 디펩타이드 Asn-Gln-NH₂, Asn-NH₂ 또는 아미노(-NH₂) 기를 나타내는 펩타이드 및 이의 약학적 허용성 염.
제4항에 있어서, Ψ 가 CO-NH; "X"가 F; Xcc ⁷ 이 2-아미노-2-메틸-프로피온산(Aib)이고 Xdd ¹¹ 가 Ala이고 R은 디펩타이드 Asn-Gln-NH₂를 나타내는 펩타이드 및 이의 약학적 허용성 염.
제4항에 있어서, Ψ 가 CH₂-NH; "X"가 F; Xcc ⁷ 이 2-아미노-2-메틸-프로피온 산(Aib)이고 Xdd ¹¹ 가 Ala이고 R은 디펩타이드 Asn-Gln-NH₂를 나타내는 펩타이드 및 이의 약학적 허용성 염.
제3항에 있어서,

Xaa ¹ 이 N-벤질-글리신(Nphe)이고;

Ψ 가 CO-NH이며;

Xbb ⁴ 가 Phe 이며;

Xcc ⁷ 이 2-아미노-2-메틸-프로피온산(Aib) 및 2-아미노-2-메틸-부티르(Iva)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;

Xdd ¹¹ 이 Ala; 2-아미노-2-메틸-프로피온산(Aib); 및 2-아미노-2-메틸-부티르산(Iva)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며;

R이 디펩타이드 Asn-Gln-NH₂ 또는 아미노(-NH₂) 기를 나타내는 펩타이드 및 이의 약학적 허용성 염.
제7항에 있어서, Xcc ⁷ 이 2-아미노-2-메틸-프로피온산(Aib)이고; Xdd ¹¹ 은 Ala이며, R은 디펩타이드 Asn-Gln-NH₂ 인 펩타이드 및 이의 약학적 허용성 염.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드를 함유하는 조성물.
약학적 허용성 매개제 및/또는 부형제와 배합된 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드를 활성 주성분으로서 함유하는 약학 조성물.
제10항에 있어서, 경구, 국소, 호흡기, 직장, 척수내, 경막내, 방광내 또는 비경구 경로를 통해 투여되는 약학 조성물.
제11항에 있어서, 투여가 경막내 및 비경구 경로를 통해 수행되는 약학 조성물.
신경학적 및 감각신경 기능장애의 치료 또는 예방에 사용될 약물의 제조에 사용되는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드의 용도.
고혈압, 빈맥, 수분저류 장애, 저나트륨혈증, 심부전, 위장관, 호흡기관 및 비뇨생식기관의 평활근 운동 기능장애, 염증 상태 또는 말초 또는 척수 무통각증의 치료 또는 예방, 만성 통증 치료 및 기침 저지를 위한 약물의 제조에 사용되는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드의 용도.
제14항에 있어서, 치료가 신경성 요실금 또는 비뇨 방광 과다활성을 비롯한 생식비뇨계 질환, 호흡기 기능장애 또는 만성 통증 치료용인, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드의 용도.
제13항에 있어서, 신경안정제 또는 식욕부진의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에 사용되는 펩타이드의 용도.
기억 및 기분 기능장애, 운동 활동 및 섭식 장애의 치료, 또는 비만 환자의 치료용 약물의 제조에 사용되는 제7항 또는 제8항에 기재된 펩타이드의 용도.