KR20070102608A - 항체 변이체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 B 세포 악성 종양 및 자가면역 질환의 치료를 위한 개선된 인간화 CD20 결합 항체를 제공한다.

인간화 CD20 결합 항체, B 세포 악성 종양, 자가면역 질환, 인간 CD20, 암

Description

항체 변이체 및 그의 용도 {ANTIBODY VARIANTS AND USES THEREOF}

본 출원은 전문을 본원에 참고로 포함시킨 미국 가출원 60/651,111 (2005년 2월 7일 출원), 60/689,404 (2005년 6월 10일 출원) 및 60/702,571 (2005년 7월 25일 출원)을 기초로 한 우선권을 주장한다.

본 발명은 항-CD20 항체 및 B-세포 관련 질병 치료시의 그의 용도에 관한 것이다.

림프구는 몇몇 백혈구 집단의 하나이고; 이들은 외래 항원을 특이적으로 인식하고 반응한다. 림프구의 3개의 주요 집단은 B 림프구 (B세포), T 림프구 (T 세포) 및 천연 킬러 (NK) 세포이다. B 림프구는 항체 생산을 책임지는 세포로서, 체액성 면역을 제공한다. B 세포는 골수 내에서 성숙하고 골수를 떠나 그들 세포 표면에 항원-결합 항체를 발현한다. 미반응 (naive) B 세포가 처음으로 그의 막-결합 항체에 특이적인 항원을 만나면, 세포는 신속하게 분열하기 시작하고 그의 자손체는 기억 B 세포와 "형질 세포"로 불리는 효과기 세포로 분화한다. 기억 B 세포는 더 긴 수명을 갖고 원래의 모세포와 동일한 특이성을 갖는 막-결합 항체를 계속해서 발현한다. 형질 세포는 막-결합 항체를 생산하지 않지만 그 대신 분비될 수 있는 형태로 항체를 생산한다. 분비된 항체는 체액성 면역의 주요 효과기 분자이다.

CD20 항원 (인간 B-림프구-제한된 분화 항원, Bp35로도 불림)은 프리-B 및 성숙 B 림프구 상에 위치하는 대략 35 kD의 분자량을 갖는 소수성 막횡단 단백질이다 (Valentine et al., J. Biol. Chem. 264(19): 11282-11287(1989); 및 Einfeld et al., EMBO J. 7(3): 711-717(1988)). 이 항원은 또한 90％ 초과의 B 세포 비-호지킨 림프종 (NHL)에서 발현되지만 (Anderson et al., Blood 63(6): 1424-1433(1984)), 조혈 줄기 세포, 프로-B 세포, 정상 형질 세포나 기타 정상 조직에서는 발견되지 않는다 (Tedder et al., J. Immunol. 135(2): 973-979(1985)). CD20은 세포 주기 개시와 분화를 위한 활성화 과정에서의 초기 단계(들)를 조절하고 (상기 Tedder 등), 가능하게는 칼슘 이온 채널로서 기능한다 (Tedder et al., J. Cell. Biochem. 14D: 195(1990)).

B 세포 림프종에서 CD20의 발현을 가정하면, 이 항원은 상기 림프종의 치료를 위한 유용한 치료 표적이었다. 미국에 B-세포 NHL 환자가 30만명이 존재하고, 매년 56,000명의 새로운 환자가 진단되고 있다. 예를 들어, 인간 CD20 항원에 대해 작용하는 유전공학에 의해 처리된 키메라 쥐/인간 모노클로날 항체 (제넨테크, 인크. (Genentech, Inc., 미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코)로부터 입수가능)인 리툭시맙 (RITUXAN(등록상표)) 항체는 재발 또는 불응성 저급 또는 여포, CD20-양성, B 세포 비-호지킨 림프종에 걸린 환자의 치료를 위해 사용된다. 리툭시맙은 1998년 4월 7일 등록된 미국 특허 5,736,137 (Anderson et al.) 및 미국 특 허 5,776,456에서 "C2B8"로 언급되는 항체이다. 시험관 내 작용기작 연구는 Rituxan(등록상표)이 인간 보체에 결합하고 보체-의존성 세포독성(CDC, Complement-Dependent Cytotoxicity)을 통해 림프성 B 세포주를 용해함을 증명하였다 (Reff et al., Blood 83(2): 435-445 (1994)). 부가적으로, 그것은 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC, Antibody-Dependnet Cellular Cytotoxicity)에 대한 분석에서 유의한 활성을 갖는다. 생체 내 전임상 연구는 Rituxan(등록상표)이 아마도 보체 및 세포 매개 과정을 통해, 사이노몰거스 원숭이의 말초 혈액, 림프절 및 골수로부터 B 세포를 고갈시킴을 보여주었다 (Reff et al., Blood 83(2): 435-445(1994)). NHL 치료를 적응증으로 하는 다른 항-CD20 항체는 방사성 동위원소 이트륨-90에 연결된 쥐 항체 Zevalin™ (아이디이씨 파마슈티칼스 (IDEC Pharmaceuticals), 미국 캘리포니아주 샌 디에고), I-131에 접합된 다른 전장 쥐 항체인 Bexxar™ (코릭사 (Corixa), 미국 워싱턴주)를 포함한다.

CD20은 또한 자가면역 질환의 치료를 위한 유용한 표적 항원이다. 리툭시맙은 또한 B 세포 및 자가항체가 질병 병리생리학에서 기능하는 것으로 보이는 다양한 비악성 자가면역 질환에서 연구되었다 [Edwards et al., Biochem Soc. Trans. 30:824-828 (2002)]. 리툭시맙은 예를 들어 류마티스 관절염 (RA) (Leandro et al., Ann. Rheum. Dis. 61:883-888 (2002): Edwards et al., Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S46 (2002); Stahl et al., Ann. Rheum. Dis., 62 (Suppl. 1): OP004 (2003); Emery et al., Arthritis Rheum. 48(9): S439 (2003)), 루푸스 (Eisenberg, Arthritis. Res. Ther. 5:157-159 (2003); Leandro et al., Arthritis Rheum. 46: 2673-2677 (2002); Gorman et al., Lupus, 13: 312-316 (2004)), 면역 혈소판 감소 자색반 (D'Arena et al., Leuk. Lymphoma 44:561-562 (2003); Stasi et al., Blood, 98: 952-957 (2001); Saleh et al., Semin. Oncol, 27 (Supp 12):99-103 (2000); Zaia et al., Haematolgica, 87: 189-195 (2002); Ratanatharathorn et al., Ann. Int. Med., 133: 275-279 (2000)), 진정 적혈구계 빈혈 (Auner et al., Br. J. Haematol, 116: 725-728 (2002)); 자가면역 빈혈 (Zaja et al., Haematologica 87:189-195 (2002) (오탈자가 Haematologica 87:336 (2002)에 보인다), 저온응집병 (Layios et al., Leukemia, 15: 187-8 (2001); Berentsen et al., Blood, 103: 2925-2928 (2004); Berentsen et al., Br. J. Haematol, 115: 79-83 (2001); Bauduer, Br. J. Haematol., 112: 1083-1090 (2001); Damiani etal, Br. J. Haematol, 114: 229-234 (2001)), 심한 인슐린 저항의 B형 증후군 (Coll et al., N. Engl. J. Med., 350: 310-311 (2004)), 혼합 한랭 글로불린혈증 (De Vita et al., Arthritis Rheum. 46 Suppl. 9:S206/S469 (2002)), 중증 근무력증 (Zaja et al., Neurology, 55: 1062-63 (2000); Wylam et al., J. Pediatr., 143: 674-677 (2003)), 베게너 육아종증 (Specks et al., Arthritis ＆ Rheumatism 44: 2836-2840 (2001)), 불응성 심상성 천포창 (Dupuy et al., Arch Dermatol, 140:91-96 (2004)), 피부근염 (Levine, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9):S1299 (2002)), 쇼그렌 증후군 (Somer et al., Arthritis ＆ Rheumatism, 49: 394-398 (2003)), 활성 타입-II 혼합 한랭 글로불린혈증 (Zaja et al., Blood, 101: 3827-3834 (2003)), 심상성 천포창 (Dupay et al., Arch. Dermatol, 140: 91- 95 (2004)), 자가면역 신경병증 (Pestronk et al., J. Neurol Neurosurg. Psychiatry 74:485-489 (2003)), 부신생물 안진전-간대성근경련 (Pranzatelli et al., Neurology 60(Suppl. 1) PO5.128:A395 (2003)), 및 재발-이장성 다발성 경화증 (RRMS) (Cross et al., (abstract) "Preliminary results from a phase II trial of Rituximab in MS" Eighth Annual Meeting of the Americas CO mMittees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis, 20-21 (2003))의 징후 및 증상을 효능있게 제거하는 것으로 보고되었다.

류마티스 관절염 (RA) 환자에서 II상 임상 시험이 실시되어 리툭시맙의 안전성 및 효능에 대한 48주 동안의 데이타가 제공된 바 있다 [Emery et al., Arthritis Rheum 48(9):S439 (2003); Szczepanski et al., Arthritis Rheum 48(9):S121 (2003)]. 환자는 4개의 처리군, 즉 메토트렉세이트, 리툭시맙 단독, 리툭시맙 + 메토트렉세이트, 및 리툭시맙 + 시클로포스파미드 (CTX)으로 균등하게 무작위로 분류하였다. 리툭시맙의 처리 요법은 1일 및 15일에 1 g을 정맥내 투여하는 것이었다.

리툭시맙을 사용한 요법에 관한 간행물은 다음을 포함한다: Perotta and Abuel, "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab" Abstract # 3360 Blood 1O(1)(part 1-2): p. 88B (1998); Perotta et al., "Rituxan in the treatment of chronic idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP)", Blood, 94: 49 (abstract) (1999); Matthews, R., "Medical Heretics" New Scientist (J April, 2001); Leandro et al., "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis, 상기 문헌; Leandro et al., "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response" Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001); Leandro et al., "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus", Arthritis and Rheumatism, 46:2673-2677 (2002) (여기서, 2주 동안 각각의 환자에게 리툭시맙의 2회의 500-mg 주입, 시클로포스파미드의 2회의 750-mg 주입 및 고투여량 경구 코르티코스테로이드를 투여하였고, 처리된 2명의 환자가 각각 7개월 및 8개월에 재발하였고, 상이한 프로토콜에 따라 재치료하였다); "Successful long-term treatment of systemic lupus erythematosus with rituximab maintenance therapy" Weide et al., Lupus, 12: 779-782 (2003) (여기서, 환자는 리툭시맙으로 처리하고 (375 mg/m² x 4, 1주 간격으로 반복), 추가의 리툭시맙을 5-6개월마다 전달하고, 유지 요법제를 3개월마다 리툭시맙 375 mg/m²와 함께 투여하고, 제2의 불응성 SLE 환자를 리툭시맙으로 성공적으로 치료하고, 유지 요법제를 3개월마다 투여하였고, 두 환자 모두 리툭시맙 치료에 우수하게 반응함); Edwards and Cambridge, "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rheumatology 40:205-211 (2001); Cambridge et al., "B lymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritis: serial studies of immunological parameters" Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S1350 (2002); Edwards et al., "B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" supra; Edwards et al., "Efficacy and safety of rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002); Levine and Pestronk, "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using rituximab" Neurology 52: 1701-1704 (1999); De Vita et al., "Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis ＆ Rheum 46:2029-2033 (2002); Hidashida et al., "Treatment of DMARD-refractory rheumatoid arthritis with rituximab." Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002; Tuscano, J. "Successful treatment of infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab" Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002; "Pathogenic roles of B cells in human autoimmunity; insights from the clinic" Martin and Chan, Immunity 20:517-527 (2004); Silverman and Weisman, "Rituximab Therapy and Autoimmune Disorders, Prospects for Anti-B Cell Therapy", Arthritis and Rheumatism, 48: 1484-1492 (2003); Kazkaz and Isenberg, "Anti B cell therapy (rituximab) in the treatment of autoimmune diseases", Current opinion in pharmacology, 4: 398-402 (2004); Virgolini and Vanda, "Rituximab in autoimmune diseases", Biomedicine ＆ pharmacotherapy, 58: 299-309(2004); Klemmer et al., "Treatment of antibody mediated autoimmune disorders with a AntiCD20 monoclonal antibody Rituximab", Arthritis And Rheumatism, 48: (9) 9,S (SEP), page: S624-S624( 2003); Kneitz etal, "Effective B cell depletion with rituximab in the treatment of autoimmune diseases", hnmunobiology, 206: 519-527 (2002); Arzoo et al., "Treatment of refractory antibody mediated autoimmune disorders with 항-CD20 monoclonal antibody (rituximab) "annals of the Rheumatic Diseases, 61 (10), p922-4 (2002) CO mMent in Ann Rheum Dis. 61: 863-866 (2002); "Future Strategies in Immunotherapy" by Lake and Dionne, in Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (2003 by John Wiley ＆ Sons, Inc.)Article Online Posting Date: January 15, 2003 (Chapter 2 " Antibody-Directed Immunotherapy"); Liang and Tedder, Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine, Section: CD20 as an Immunotherapy Target, article online posting date: 15 January, 2002 entitled "CD20"; Appendix 4A entitled "Monoclonal Antibodies to Human Cell Surface Antigens" by Stockinger et al., eds: Coligan et al., in Current Protocols in Immunology (2003 John Wiley ＆ Sons, Inc) Online Posting Date: May, 2003; Print Publication Date: February, 2003; Penichet and Morrison, "CD Antibodies/molecules: Definition; Antibody Engineering" in Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine Section: Chimeric, Humanized and Human Antibodies; posted online 15 January, 2002; Specks et al., "Response of Wegener's granulomatosis to anti-CD20 chimeric monoclonal antibody therapy" Arthritis ＆ Rheumatism 44:2836-2840 (2001); online abstract submission and invitation Koegh et al., "Rituximab for Remission Induction in Severe ANCA-Associated Vasculitis: Report of a Prospective Open-Label Pilot Trial in 10 Patients", American College of Rheumatology, Session Number: 28-100, Session Title: Vasculitis, Session Type: ACR Concurrent Session, Primary Category: 28 Vasculitis, Session 10/18/2004 (http://www.abstractsonline.com/viewer/SearchResults.asp); Eriksson, "Short-term outcome and safety in 5 patients with ANCA-양성 vasculitis treated with rituximab", Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294 (2003); Jayne et al., "B-cell depletion with rituximab for refractory vasculitis" Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294 (2003); Jayne, poster 88 (11^th International Vasculitis and ANCA workshop), 2003 American Society of Nephrology; Stone and Specks, "Rituximab Therapy for the Induction of Remission and Tolerance in ANCA-associated Vasculitis", in the Clinical Trial Research Summary of the 2002-2003 Immune Tolerance Network, http://www.immunetolerance.org/research/autoimmune/trials/stone.html., 및 Leandro et at, "B cell repopulation occurs mainly from naive B cells in patient with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus" Arthritis Rheum., 48 (Suppl 9): S1160 (2003).

인간 치료시에 쥐 항체 사용의 주요한 제한 사항은 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 반응이다 (예를 들어, Miller, R.A. et al., "Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma" Blood, 62:988-995, 1983; and Schroff, R.W., et al., "Human anti-murine immunoglobulin response in patients receiving monoclonal antibody therapy" Cancer Res., 45:879-885, 1985 참조). 설치류 항체의 가변 (V) 도메인이 인간 불변 (C) 영역에 융합된 키메라 분자도 계속해서 유의한 면역 반응을 유도할 수 있다 (HACA, 인간 항-키메라 항체) (Neuberger et al., Nature (Lond.), 314:268-270, 1985). 모노클로날 항체의 임상 사용에 대한 상기 제한을 극복하기 위한 강력한 방법은 쥐 항체 또는 비-인간종으로부터의 항체의 "인간화"이다 (Jones et al., Nature (Lond), 321:522-525, 1986; Riechman et al., Nature (Lond), 332:323-327, 1988). 상기 항체는 특히 만성 질환 치료를 위해 환자에게 투여될 때 최소의 항원성을 생성시키거나 전혀 생성시키지 않을 것으로 예상된다. 인간화 항-CD20 항체는 WO 03/068821A2 (Hansen et al.), WO2004103404 (Watkins), 및 WO 04/056312 (Adams)에 기재되어 있다. 인간 항-CD20 항체는 WO 2004/035607 (Teeling et al.)에 기재되어 있다.

최소 항원성을 가질 뿐만 아니라 개선된 생물학적 특성 및 임상 효능을 갖는 치료 활성의 CD20 결합 항체를 제공하는 것이 유리할 것이다. 본 발명은 상기 필요성 및 다른 필요성을 충족시킨다. 본 발명은 현재 사용되는 치료 조성물의 제한 사항을 극복하고 본원의 상세한 설명에서 분명해지는 추가의 잇점을 제공하는 항- CD20 항체를 제공한다.

CD20 항체에 관한 특허 및 특허 공개는 미국 특허 5,776,456, 5,736,137, 5,843,439, 6,399,061, 및 6,682,734, 및 미국 특허 출원 US 2002/0197255 A1, US 2003/0021781A1, US 2003/0082172 A1, US 2003/0095963 A1, US 2003/0147885 A1 (Anderson et al.); 미국 특허 6,455,043B1 및 WO00/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO00/27428 (Grillo-Lopez and White); WO00/27433 (Grillo-Lopez and Leonard); WO00/44788 (Braslawsky et al.); WO01/10462 (Rastetter, W.); WO01/10461 (Rastetter and White); WO01/10460 (White and Grillo-Lopez); US2001/0018041A1, US2003/0180292A1, WO01/34194 (Hanna and Hariharan); 미국 특허 출원 US2002/0006404 및 WO02/04021 (Hanna and Hariharan); 미국 특허 출원 US2002/0012665 A1 및 WO01/74388 (Hanna, N.); 미국 특허 출원 US 2002/0058029 A1 (Hanna, N.); 미국 특허 출원 US 2003/0103971 A1 (Hariharan and Hanna); 미국 특허 출원 US2002/0009444A1, 및 WO01/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO01/97858 (White, C.); 미국 특허 출원 US2002/0128488A1 및 WO02/34790 (Reff, M.); WO02/060955 (Braslawsky et al.); WO2/096948 (Braslawsky et al.); WO02/079255 (Reff and Davies); 미국 특허 6,171,586B1, 및 WO98/56418 (Lam et al.); WO98/58964 (Raju, S.); WO99/22764 (Raju, S.); WO99/51642, 미국 특허 6,194,551B1, 미국 특허 6,242,195B1, 미국 특허 6,528,624B1 및 미국 특허 6,538,124 (Idusogie et al.); WO00/42072 (Presta, L.); WO00/67796 (Curd et al.); WO01/03734 (Grillo-Lopez et al.); 미국 특허 출원 US 2002/0004587 A1 및 WO01/77342 (Miller and Presta); 미국 특허 출원 US2002/0197256 (Grewal, L); 미국 특허 출원 US 2003/0157108 A1 (Presta, L.); 미국 특허 6,565,827B1, 6,090,365Bl, 6,287,537B1, 6,015,542, 5,843,398, 및 5,595,721, (Kaminski et al.); 미국 특허 5,500,362, 5,677,180, 5,721,108, 6,120,767, 6,652,852B1 (Robinson et al.); 미국 특허 6,410,391B1 (Raubitschek et al.); 미국 특허 6,224,866B1 및 WO00/20864 (Barbera-Guillem, E.); WO01/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO00/67795 (Goldenberg); US 특허 출원 US 2003/0133930 A1 및 WO00/74718 (Goldenberg and Hansen); WO00/76542 (Golay et); WO01/72333 (Wolin and Rosenblatt); 미국 특허 6,368,596Bl (Ghetie et al.); 미국 특허 6,306,393 및 미국 특허 출원 US2002/0041847 A1, (Goldenberg, D.); 미국 특허 출원 US2003/0026801A1 (Weiner and Hartmann); WO02/102312 (Engleman, E.); 미국 특허 출원 2003/0068664 (Albitar et al.); WO03/002607 (Leung, S.); WO 03/049694, US2002/0009427A1, 및 US 2003/0185796 A1 (Wolin et al.); WO03/061694 (Sing and Siegall); US 2003/0219818 A1 (Bohen et al.); US 2003/0219433 A1 및 WO 03/068821 (Hansen et al.); US2002/0136719A1 (Shenoy et al.); WO2004/032828 (Wahl et al.); WO2004/035607 (Teeling et al.); US2004/0093621 (Shitara et al.) 및 미국 특허 5,849,898 및 EP 특허 출원 330,191 (Seed et al.); 미국 특허 4,861,579 및 EP332.865A2 (Meyer and Weiss); WO95/03770 (Bhat et al.), US 2001/0056066 (Bugelski et al.); WO 2004/035607 (Teeling et al.); WO 2004/056312 (Lowman et al.); US 2004/0093621 (Shitara et al.); 및 WO 2004/103404 (Watkins et al.)를 포함한다. CD20 항체에 관한 간행물은 다음을 포함한다: Teeling, J. et al., "Characterization of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin's lymphomas" Blood, Jun 2004; 10.1182.

<발명의 개요>

본 발명은 생체 내에서 인간 CD20에 결합하고 영장류 B 세포를 고갈시키는, 표 13 및 14에 나열된 인간화 2H7 변이체 항체를 제공한다. 특정 실시태양에서, hu2H7 항체는 버전 472, 473, 511, 523 및 516이다. 본 발명의 조성물, 방법, 제조품, 제제의 바람직한 실시태양에서, 인간화 2H7 항체는 hu2H7.v511 또는 hu2H7.v114이다.

본 발명은 생체 내에서 영장류 B 세포를 고갈시키는데 효과적이고, 서열 25의 L쇄 가변 영역 (V_L) 서열 및 서열 8의 H쇄 가변 영역 (V_H) 서열을 포함하지만, VH-CDR2 내에서 D56A의 아미노산 치환을 갖고, VH-CDR3 내의 N100은 Y 또는 W로 치환된, 인간 CD20에 결합하는 인간화 2H7 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 한 실시태양에서, 상기 항체는 VH-CDR3 내에서 치환 S100aR을 추가로 포함한다. 상기 항체의 추가의 실시태양에서, 항체는 ADCC 및/또는 CDC 활성을 개선시키는, Fc 영역 내에 적어도 하나의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. ADCC 및/또는 CDC 효과기 기능을 개선시키기 위해, 한 실시태양에서, 상기 항체는 아미노산 치환 S298A, E333A, K334A 및 K326A 또는 K326W를 포함하는 IgG1 Fc를 추가로 포함할 것 이다. 한 실시태양에서, 상기 실시태양의 항체는 2H7.v16보다 적어도 20배 더 큰 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 나타내고, 2H7.v16보다 적어도 25배 더 큰 보체 세포독성을 나타낸다.

별법으로, 치환 S100aR를 포함하는 항체는 ADCC를 개선시키지만 CDC 활성을 감소시키는 적어도 하나의 아미노산 변형 또는 치환을 Fc에 가질 수 있다. 이러한 측면에서, 항체는 Fc에 적어도 아미노산 치환 K322A를 포함할 수 있고, 아미노산 치환 S298A, E333A, K334A를 추가로 포함할 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 개선된 ADCC 및 CDC 활성을 갖는 항체는 또한 각각 서열 13 및 14의 L쇄 및 H쇄 서열을 갖는 항체 2H7.v16에 비해 적어도 3배, 바람직하게는 적어도 6배 증가된 친화도로 인간 CD20에 결합한다.

본 발명은 인간 CD20에 결합하는 인간화 2H7 항체를 제공하고, 여기서 항체는 서열 26의 경쇄 서열 및 서열 34의 중쇄 서열로 이루어진다.

또한, 본 발명은 세포 독성제에 접합된 임의의 선행 실시태양의 항체를 제공한다. 한 실시태양에서, 세포 독성제는 방사성 동위원소 또는 독소이다.

한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 CHO 세포에서 생산된다.

본 발명은 발현 벡터를 포함하는, 상기 실시태양의 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 추가로 제공한다. 또한, 항체를 생산하는, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 실시태양에서, 숙주 세포는 항체 2H7.v511을 생산하는 것이다.

상기 숙주 세포를 배양하고, 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 것을 포함하는, 임의의 상기 항체를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 2H7 항체 및 담체를 포함하는 조성물을 또한 제공한다. 한 실시태양에서, 담체는 제약상 허용되는 담체이다.

다른 실시태양은 hu2H7.v511을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물 내의 항체의 약 80-100％에는 푸코스가 결여되어 있다.

다른 측면은 용기 및 그에 담긴 조성물을 포함하는 제조품이고, 상기 조성물은 임의의 선행 실시태양의 항체를 포함한다. 조성물의 요구되는 특정 치료에 따라, 제조품은 조성물이 비-호지킨 림프종을 치료하기 위해 사용되는지 또는 조성물이 류마티스 관절염을 치료하기 위해 사용되는지 나타내는 포장 삽입물 (package insert)을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 선행 실시태양의 인간화 2H7 항체를 사용하여 생체 내에서 B 세포를 고갈시키는 방법이다.

본 발명은 또한 CD20-양성 암의 환자에게 치료 유효량의 선행 실시태양의 인간화 2H7 항체를 투여하는 것을 포함하는, CD20-양성 암을 치료하는 방법을 제공한다. CD20-양성 암은 바람직하게는 B 세포 림프종 또는 백혈병이다. 특정 실시태양에서, hCD20에 결합하는 인간화 2H7 항체 및 그의 기능적 단편은 비-호지킨 림프종 (NHL), 림프구 우세형 호지킨병 (LPHD), 소림프구성 림프종 (SLL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 치료에 사용된다. 특정 실시태양에서, 인간화 CD20 결합 항체 또는 그의 기능적 단편, 특히 v511 및 v114는 재발된 무통성 NHL 및 리툭시맙-불응성 무통성 NHL을 포함하여 무통성 NHL을 치료하기 위해 사용된다.

상기 암의 치료를 위해, 한 실시태양에서, 항체는 정맥내 주입을 통해 투여 된다. 주입을 통해 투여되는 투여량은 투여당 약 12.5 mg/m² 내지 800 mg/m², 일반적으로 총 1, 2, 3 또는 4회 투여를 위한 1주당 1회 투여이다.

또한, 본 발명은 자가면역 질환 환자에게 치료 유효량의 임의의 선행 실시태양의 인간화 2H7 항체를 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 완화시키는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 정맥내 또는 피하 투여된다. 항체는 투여당 10 mg 내지 500 mg의 투여량으로 정맥내 투여되고, 특정 실시태양에서, 투여량은 100 mg/투여이다.

특정 실시태양에서, 자가면역 질환은 류마티스 관절염 및 연소성 류마티스 관절염, 루푸스 신염을 포함하여 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 베게너병, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발신경병증, 중증 근무력증, ANCA 관련 맥관염, 진성 당뇨병, 레이나우드 증후군, 쇼그렌 증후군, 시신경 척수염 (NMO) 및 사구체신염으로 구성된 군에서 선택된다.

hu2H7.v511 및 hu2H7.v114 항체는 제2 치료제와 함께 동시에, 순차적으로 또는 교대 요법으로 자가면역 질환 또는 B 세포 신생물의 치료 또는 완화 방법에 유용하다. 한 실시태양에서, 제2 치료제는 BAFF 길항제이다. 특정 실시태양에서, BAFF 길항제는 인간 BR3 또는 BR3-Fc 융합 단백질에 결합하는 항체이다.

상기 질병의 치료 방법의 바람직한 실시태양에서, 질병으로 고통받는 대상 또는 환자는 영장류, 바람직하게는 인간이다.

또한, 인간화 2H7.v511 항체 약 20 mg/ml, 20 mM 아세트산나트륨, 4％ 트레할로스 이수화물, 0.02％ 폴리소르베이트 20 (pH 5.5)을 포함하는, 정맥내 투여를 위한 액체 제제가 제공된다. 2O mM 아세트산나트륨, 24O mM (8％) 트레할로스 이수화물 (pH 5.3), 0.02％ 폴리소르베이트 20 중의 인간화 2H7.v114 항체 약 20 mg/ml를 포함하는 액체 제제도 제공된다. 2H7.v16에 대해 사용될 수 있는 다른 액체 제제는 2O mM 아세트산나트륨 (pH 5.3), 4％ 트레할로스 이수화물, 0.02％ 폴리소르베이트 20 (Tween 20™) 중의 약 30 mg/ml의 항체이다.

도 1A는 쥐 2H7 (서열 1), 인간화 2H7.v16 변이체 (서열 2), 및 인간 카파 경쇄 하위군 I (서열 3) 각각의 경쇄 가변 도메인 (V_L)의 아미노산 서열을 비교하는 서열 정렬을 보여준다. 2H7 및 hu2H7.v16의 VL의 CDR은 다음과 같다: CDR1 (서열 4), CDR2 (서열 5) 및 CDR3 (서열 6).

도 1B는 쥐 2H7 (서열 7), 인간화 2H7.v16 변이체 (서열 8)의 V_H 서열, 및 중쇄 하위군 III (서열 9)의 인간 컨센서스 서열을 비교하는 서열 정렬을 보여준다. 2H7 및 hu2H7.v16의 V_H의 CDR은 다음과 같다: CDR1 (서열 10), CDR2 (서열 11), 및 CDR3 (서열 12).

도 1A 및 도 1B에서, 각 쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 중괄호로 표시하고, 나타낸 바와 같이 프레임워크 영역 FR1-FR4가 인접한다. 2H7는 쥐 2H7 항체를 의미한다. 서열의 두 줄 사이의 별표는 두 서열 사이에 상이한 위치를 나타낸다. 잔 기 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 따랐고, 삽입은 a, b, c, d 및 e로 표시하였다.

도 2A는 인간화 2H7.V16 대 v511의 경쇄의 단백질 서열 정렬을 보여준다.

도 2B는 인간화 2H7.V16 대 v511의 중쇄의 단백질 서열 정렬을 보여준다.

도 3은 가용화된 CD20 ELISA에서 2H7 변이체의 상대 결합을 보여준다. 항체 2H7.v16 (원), 2H7.v511 (정사각형), 및 2H7.v588 (삼각형)을 비교하였다 (실시예 12 참조).

도 4는 WIL2-S 세포 및 정제된 인간 NK 세포를 사용한 ADCC 활성을 보여준다. 항체 2H7.v16 (원), 2H7.v511 (정사각형), 및 2H7.v588 (삼각형)을 시험관 내에서 ADCC를 매개하는 능력에 대해 비교하였다 (실시예 13 참조).

도 5는 WIL2-S 세포 및 인간 보체를 사용한 CDC 활성을 보여준다. 항체 2H7.v16 (원), 2H7.v511 (정사각형), 및 2H7.v588 (삼각형)을 시험관 내에서 CDC를 매개하는 능력에 대해 비교하였다 (실시예 14 참조).

도 6은 항체 주사 2일 후에 생체 내에서 2H7 변이체 v16 및 v511에 의한 혈액 (좌측) 및 복강 (우측)에서의 B-세포 고갈을 보여준다 (실시예 15 참조).

도 7은 항체 주사 2일 후에 2H7 변이체 v16 및 v511에 의한 비장에서의 B-세포 고갈을 보여준다: 비장 B-세포(좌측), 변연대 B-세포 (중앙), 및 여포 B-세포 (우측) (실시예 15 참조).

도 8은 인간 CD20 및 인간 CD16을 발현하는 hCD20 Tg+/+/ mCD16-/-/ hCD16 Tg+/- 트랜스제닉 마우스에서 2H7.v16 및 .v511에 의한 생체 내 B 세포 고갈을 비교한 것이다 (실시예 15 참조).

도 9는 CHO 세포에서 2H7.v16의 발현을 위한 벡터를 보여준다.

도 10은 WIL2-S 세포에 대해 분석시에 2H7.v511의 보체 (CDC) 활성을 다른 2H7 변이체 v16, v31, v114, v138, 및 v488과 비교한 것이다 (실시예 14 참조).

도 11은 실시예 13 및 도 4에 제시된 바와 같이 WDL2-S 세포 및 정제된 인간 NK 세포를 사용하여 항체 변이체 2H7.v511, v16, v31, v114, v138, 및 v488의 ADCC 활성을 비교한 것이다.

도 12는 인간 CD20 및 인간 CD16을 발현하는 hCD20 Tg+/+ /mCD16-/- / hCD16 Tg+/- 트랜스제닉 마우스에서 2H7.v511 및 리툭시맙 (Rituxan(등록상표))의 생체 내 B 세포 고갈 분석을 도시한 것으로, 두 항체의 활성을 표에 요약하였다 (실시예 15 참조).

도 13은 주사 2일 후에 생체 내에서 2H7.v511 및 리툭시맙에 의한 혈액 (좌측) 및 복강 (우측)에서의 B-세포 고갈을 보여준다 (실시예 15 참조).

도 14는 항체 주사 2일 후에 2H7.v511 및 리툭시맙에 의한 비장에서의 B-세포 고갈을 보여준다: 비장 B-세포(좌측), 변연대 B-세포 (중앙), 및 여포 B-세포 (우측) (실시예 15 참조).

도 15A, 15B, 및 15C는 PBMC가 2H7.v114 또는 Rituxan™, 및 인간 혈청 보체로 처리된 3명의 CLL 환자로부터 정제된 PBMC의 시험관 내 CDC 활성을 비교한 것이다.

도 16A, 16B, 및 16C는 PBMC가 2H7.v511 또는 Rituxan™, 및 인간 혈청 보체로 처리된 3명의 CLL 환자(도 15와 동일한 환자)로부터 정제된 PBMC의 시험관 내 CDC 활성을 비교한 것이다.

"CD20" 항원은 말초혈액이나 림프 기관으로부터의 B 세포의 90％ 초과의 표면 상에서 발견되는 약 35 kD의 비-글리코실화된 막횡단 인단백질이다. CD20은 초기 프리-B 세포 발생 동안 발현되고 혈장 세포 분화까지 남아있고, 인간 줄기 세포, 림프양 전구세포 또는 정상 형질 세포에서 발견되지 않는다. CD20은 정상 B 세포와 악성 B 세포 모두에 존재한다. 문헌에서 CD20에 대한 다른 이름은 "B-림프구-제한된 분화 항원" 및 "Bp35"를 포함한다. CD20 항원은 예를 들어 문헌 [Clark and Ledbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989) 및 Valentine et al., J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)]에 기재되어 있다.

용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 요구되는 생물학적 활성 또는 기능을 보이는 항체 단편을 포함한다.

본 발명의 인간화 CD20 결합 항체의 생물학적 활성은 항체의 인간 CD20, 보다 바람직하게는 인간 및 다른 영장류 CD20 (사이노몰거스 원숭이, 붉은털 원숭이, 침팬지 포함)에 대한 결합을 적어도 포함할 것이다. 항체는 1 x 10^-8 이하의 K_d 값, 바람직하게는 1 x 10^-9 이하의 K_d 값으로 CD20에 결합하고, 바람직하게는 상기 항체로 처리되지 않은 적합한 음성 대조군에 비해 적어도 20％까지 생체 내에서 B 세포를 사멸 또는 고갈시킬 수 있을 것이다. B 세포 고갈은 하나 이상의 ADCC, CDC, 세포자멸, 또는 다른 메카니즘의 결과일 수 있다. 본원에서 질병 치료의 일부 실시태양에서, 특정 효과기 기능 또는 메카니즘이 다른 것보다 요구될 수 있고, 인간화 2H7의 특정 변이체는 생물학적 기능, 예를 들어 ADCC를 달성하기 위해 바람직하다.

"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 전장 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편, 디아바디 (diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 긴밀하게 비공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 상기 2개의 도메인의 폴딩으로부터 아미노산 잔기의 항원 결합에 기여하고 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프 (H 및 L쇄로부터 각각 3개의 루프)가 유도된다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이지만 항원을 인식하여 결합할 능력을 갖는다.

본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는, 모노클로날 항체 생산 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체를 제외하고는 동일하고 및/또는 동일한 에피토프(들)에 결합한다. 상기 모노클로날 항체는 일반적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 표적 결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터 하나의 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 과정에 의해 얻었다. 예를 들어, 선택 과정은 다수의 클론, 예를 들어 하이브리도마 클론, 파지 클론, 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 특유한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키고 표적 결합 서열을 인간화시키고 세포 배양에서 그의 생산을 개선시키고 그의 생체 내 면역원성을 감소시키고 다중특이적 항체를 생성시키기 위해서와 같은 목적으로 추가로 변경시킬 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 모노클로날 항체임을 이해하여야 한다. 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 일반적으로 포함하는 통상적인 폴리클로날 항체 제제에 비해, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 그의 특이성에 추가하여, 모노클로날 항체 제제는 다른 면역글로불린에 의해 일반적으로 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 변경 표현 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로서 생각하지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 다양한 기술, 예를 들어 하이브리도마 방법 [예를 들어, Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N. Y., 1981)], 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004) 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 로커스 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간 유사 항체를 제조하는 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); 미국 특허 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (모두 겐팜 (GenPharm) 소유); 5,545,807; WO 1997/17852; 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, H: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995) 참조)]에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 CD20 결합 항체의 "기능성 단편"은 본원에서 설명되는 바와 같은 시험관 내 또는 생체 내 분석에 의해 측정시에 그로부터 단편이 유도되는 무손상 전장 분자와 실질적으로 동일한 친화도로 CD20에 결합하고 B 세포 고갈을 포함하는 생물학적 활성을 보이는 단편이다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 중의 서열에서 크게 상이하다는 사실을 설명하기 위해 사용된다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 규정한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 110개 아미노산 전체에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 그 대신, V 영역은 각각 9-12개 아미노산 길이의 "초가변 영역"으로 불리는 가변성이 매우 큰 보다 짧은 영역에 의해 분리된 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 비교적 비가변성의 작은 스트레치로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결되는, 주로 β-시트 형태를 취하는 4개의 FR을 각각 포함한다. 각 쇄 내의 초가변 영역은 FR 영역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합에 직접 관여하지 않지만, 상이한 효과기 기능, 예를 들어 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)에서 항체의 참여를 보인다.

본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 필요한 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, VL1의 대략 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 VH의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어, VL의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 VH의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))를 포함한다.

본원에서 사용되는 "컨센서스 서열" 또는 컨센서스 V 도메인 서열은 공지의 인간 면역글로불린 가변 영역 서열의 아미노산 서열의 비교를 통해 유도된 인공 서열이다. 상기 비교를 기초로 하여, 인간 κ 및 인간 H쇄 하위군 III V 도메인으로부터 유도된 서열의 컨센서스인 V 도메인 아미노산을 코딩하는 재조합 핵산 서열을 제조하였다. 컨센서스 V 서열은 임의의 공지의 항체 결합 특이성 또는 친화도를 갖지 않는다.

"키메라" 항체 (면역글로불린)는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이고 쇄(들)의 나머지는 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 항체, 및 요구되는 생물학적 활성을 보이는 상기 항체의 단편을 의미한다 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 및 Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 참조). 본원에서 사용되는 인간화 항체는 키메라 항체의 하위세트이다.

비-인간 (예를 들어 쥐) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 특정 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수여자의 초가변 영역 잔기가 비인간종 (공여 항체), 예를 들어 요구되는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수여 또는 수용 항체)를 포함한다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 구역 (FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체나 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변형은 항체 성능, 예를 들어 결합 친화도를 보다 개량하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나의, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 것에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이지만, FR 영역은 결합 친화도를 개선시키는 하나 이상 아미노산 치환을 포함할 수 있다. FR에서 상기 아미노산 치환의 수는 일반적으로 H쇄에서 6개 이하, L쇄에서 3개 이하이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참고한다.

항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 의한 생물학적 활성을 의미하고, 항체 이소형에 따라 상이하다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합; 보체-의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절 및 B 세포 활성화를 포함한다.

"항체-의존성 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비된 Ig이 상기 세포 독성 효과기 세포가 항원 함유 표적 세포에 특이적으로 결합한 후, 세포독소를 사용하여 표적 세포를 사멸시키도록 하는 세포독성 형태를 의미한다. 항체는 세포독성 세포를 싸울 준비를 하고, 상기 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하고, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337 또는 미국 특허 6,737,056 (Presta)에 기재된 바와 같은 시험관 내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석에 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 별법으로, 또는 추가로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 CD20 결합 항체일 경우, ADCC 활성은 아래에서 설명되는 바와 같이 인간 CD20 + CD16 (hCD20+/hCD16+ Tg 마우스)를 발현하는 트랜스제닉 마우스에서 시험될 수 있다.

"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈 단핵세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하고, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리될 수 있다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하고, 상기 수용체의 대립 유전자 변이체 및 교대 스플라이싱된 형태를 포함하여 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다 (Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997) 참고). FcR에 대해서는 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)]을 참고한다. 미래에 확인되는 것을 포함하여 다른 FcR가 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 또한, 이 용어는 모체 IgG의 태아로의 전달에 작용하고 (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)) 면역글로불린의 항상성을 조절하는 신생아의 수용체 FcRn를 포함한다.

WO00/42072 (Presta)에는 FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 상기 특허 출원 공개의 내용은 본원에 참고로 포함된다 [또한, Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 참고].

FcRn에 대한 결합 친화도의 경우, 한 실시태양에서, 항체의 EC50 또는 겉보기 Kd (pH 6.0에서)는 ≤100 nM, 보다 바람직하게는 ≤10 nM이다. FcγRIII에 대한 증가된 결합 친화도 (F158; 즉, 저-친화도 이소형)의 경우, 한 실시태양에서 EC50 또는 겉보기 Kd는 ≤10 nM이고, FcγRIII (V158; 고-친화도)의 경우 EC50 또는 겉보기 Kd는 ≤3 nM이다. FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있고 (예를 들어, Ghetie 1997, Hinton 2004 참조), 아래에서 설명된다. 인간 FcRn 고 친화도 결합 폴리펩티드의 생체 내에서 인간 FcRn에 대한 결합 및 혈청 반감기는 예를 들어 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 Fc 변이체 폴리펩티드가 투여된 영장류에서 분석할 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 인간화 2H7 항체는 IgG Fc에 아미노산 변형을 추가로 포함하고, 야생형 IgG Fc를 갖는 항체보다 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 보다 바람직하게는 적어도 100배, 바람직하게는 적어도 125배, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 150배 내지 약 170배 증가된 인간 FcRn에 대한 결합 친화도를 보인다.

"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적 세포의 용해를 의미한다. 전통적인 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 그의 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 서브클래스의)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 CDC 분석을 수행할 수 있다.

변경된 Fc 영역 아미노산 서열 및 증가 또는 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩티드 변이체는 미국 특허 6,194,551B1 및 WO99/51642에 기재되어 있다. 상기 특허 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함된다. 또한, 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 참고한다.

본원 명세서 및 청구의 범위 전반에 걸쳐, 달리 나타내지 않으면, 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인의 잔기 넘버링은 본원에 참고로 포함된 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 기재된 바와 같은 EU 인덱스이다. "카바트 (Kabat)에 기재된 바와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 의미한다. V 영역의 잔기는 순차적인 또는 다른 넘버링 시스템이 구체적으로 표시되지 않으면 카바트 넘버링으로 번호를 매긴다.

CD20 항체는 현재 "리툭시맙" ("RITUXAN(등록상표)")으로 불리는 "C2B8" (미국 특허 5,736,137); "Y2B8" 또는 아이디이씨 파마슈티칼스, 인크.로부터 상업적으로 입수가능한 "이브리투모맙 티욱세탄" (ZEV ALIN(등록상표))으로 명명된 이트륨-[90]-표지된 2B8 쥐 항체 (미국 특허 5,736,137; 1993년 6월 22일에 기탁 번호 HB11388 하에 ATCC에 기탁된 2B8); "131I-B1" 또는 "요오드 I131 토시투모맙" 항체 (BEXXAR™, 글락소스미스클라인 (GlaxoSmithKline), 또한, 미국 특허 5,595,721 참조)를 생성시키기 위해 ¹³¹I로 임의로 표지된 "토시투모맙"으로도 불리는 쥐 IgG2a "B1"; 쥐 모노클로날 항체 "1F5" (Press et al., Blood 69(2):584-591 (1987)) 및 "프레임워크 패치된 (patched)" 또는 인간화 1F5를 포함하는 그의 변이체 (WO 2003/002607, Leung, S.; ATCC 기탁 HB-96450); 쥐 2H7 및 키메라 2H7 항체 (미국 특허 5,677,180); 인간화 2H7 (WO 2004/056312 (Lowman et al.) 및 아래 제시된); HuMAX-CD20™ 전체 인간 항체 (겐맙 (Genmab), 덴마크; 예를 들어, Glennie and van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) 및 Cragg et al., Blood 101: 1045-1052 (2003) 참조); WO 2004/035607 (Teeling et al.)에 제시된 인간 모노클로날 항체; US 2004/0093621 (Shitara et al.)에 기재된 Fc 영역에 결합된 복합 N-글리코시드-연결 당쇄를 갖는 항체; CD20 결합 분자, 예를 들어 WO 2004/103404 (Watkins et al., Applied Molecular Evolution)에 제시된 바와 같은 항체의 AME 시리즈, 예를 들어 AME-133™ 항체; A20 항체 또는 그의 변이체, 예를 들어 키메라 또는 인간화 A20 항체 (각각 cA20, IMMU-106 (hA20로도 알려짐) (US 2003/0219433, US 2005/0025764; 이뮤노메딕스 (Immunomedics)); 및 International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987))으로부터 입수가능한 모노클로날 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2를 포함한다. 본원에서 바람직한 CD20 항체는 인간화, 키메라, 또는 인간 CD20 항체, 보다 바람직하게는 인간화 2H7 항체, 리툭시맙, 키메라 또는 인간화 A20 항체 (이뮤노메딕스), 및 HuMAX-CD20™ 인간 CD20 항체 (겐맙)이다.

본원에서 사용되는 "B 세포 고갈"은 처리 전의 수준에 비해 약물 또는 항체 처리 후에 동물 또는 인간에서 B 세포 수준의 감소를 의미한다. B 세포 수준은 공지된 분석을 사용하여, 예를 들어 전혈 카운트 획득에 의해, 공지의 B 세포 마커에 대한 FACS 분석 염색에 의해, 및 실시예에 기재된 바와 같은 방법에 의해 측정할 수 있다. B 세포 고갈은 부분적이거나 완전할 수 있다. 한 실시태양에서, B 세포를 발현하는 CD20의 고갈은 적어도 25％이다. B 세포 고갈 약물을 투여한 환자에서, B 세포는 일반적으로 약물이 환자의 신체에서 순환되는 기간 및 B 세포의 회복을 위한 시간 동안 고갈된다.

"종양 괴사 인자 알파 (TNFα)"는 문헌 [Pennica et al., Nature, 312:721 (1984) 또는 Aggarwal et al., JBC, 260:2345 (1985)]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간 TNFα 분자를 의미한다. 본원에서 "TNFα 억제제"는 일반적으로 TNFα에 결합하여 그의 활성을 중화시킴으로써 TNFα의 생물학적 기능을 어느 정도 억제하는 물질이다. 본원에서 특히 고려되는 TNF 억제제의 예는 에타네르셉트 (ENBREL(등록상표)), 인플릭시맙 (REMICADE(등록상표)) 및 아달리무맙 (HUMIRA™)이다.

용어 "TNFα-억제제에 대한 부적합 반응"은 독성 및/또는 부적합 효능 때문에 TNFα-억제제를 사용한 기존 또는 현재 치료에 대한 부적합 반응을 의미한다. 부적합 반응은 문제되는 질병 치료시에 숙련의에 의해 평가될 수 있다. "부적합 효능"을 경험하는 포유동물은 TNFα-억제제를 사용한 기존 또는 현재 치료 후에 활동성 질병으로 계속 고통받는다. 예를 들어, 환자는 TNFα-억제제를 사용한 치료 3개월 후에 활동성 질병 활성을 보일 수 있다.

본원에서 사용될 때 용어 "BAFF", "BAFF 폴리펩티드", "TALL-1" 또는 "TALL-1 폴리펩티드", "BLys", "THANK"는 "천연 서열 BAFF 폴리펩티드" 및 "BAFF 변이체"를 포함한다. "BAFF"는 하기 아미노산 서열 중의 임의의 하나에 의해 코딩되는 폴리펩티드 및 천연 서열 BAFF의 생물학적 활성을 갖는 그의 상동체 및 단편 및 변이체에 대해 붙여진 명칭이다.

BAFF의 생물학적 활성은 B 세포 생존 촉진, B 세포 성숙 및 BR3에 대한 결합으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 용어 "BAFF"는 문헌 [Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); GenBank 기탁 번호 AF136293; WO98/18921 (1998년 5월 7일 공개); EP 869,180 (1998년 10월 7일 공개); WO98/27114 (1998년 6월 25일 공개); WO99/12964 (1999년 3월 18일 공개); WO99/33980 (1999년 7월 8일 공개); Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)]에 기재된 폴리펩티드를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "BAFF 길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, (1) 천연 서열 BAFF 폴리펩티드에 결합하거나 또는 천연 서열 BR3 폴리펩티드에 결합하여 BAFF 폴리펩티드와 BR3 상호작용을 부분적으로 또는 완전히 차단하고, (2) 천연 서열 BAFF 신호전달을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 임의의 분자를 포함한다. 천연 서열 BAFF 폴리펩티드 신호전달은 무엇보다도 B 세포 생존 및 B 세포 성숙을 촉진시킨다. BAFF 신호전달의 차단, 억제 또는 중화는 특히 B 세포 수를 감소시킨다. 본 발명에 따른 BAFF 길항제는 BAFF 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 시험관 내 또는 생체 내에서 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시킬 것이다. 한 실시태양에서, 생물학적으로 활성을 갖는 BAFF는 시험관 내 또는 생체 내에서 다음 사건의 임의의 하나 조합을 가능하게 한다: B 세포의 생존율 증가, IgG 및/또는 IgM의 수준 증가, 형질 세포수의 증가, 및 비장 B 세포에서 NF-κb2/100의 p52 NF-κb로의 프로세싱 [예를 들어, Batten, M et al., (2000) J. Exp. Med. 192:1453-1465; Moore, et al., (1999) Science 285:260-263; Kayagaki, et al., (2002) 10:515-524].

본원에서 사용될 때 용어 "BR3", "BR3 폴리펩티드" 또는 "BR3 수용체"는 "천연 서열 BR3 폴리펩티드" 및 "BR3 변이체" (본원에서 추가로 규정됨)를 포함한다. "BR3"은 하기 폴리펩티드 서열 중의 임의의 하나를 포함하는 폴리펩티드 및 그의 상동체에 대해 붙여진 명칭이다.

몇몇 실시태양에서, 본 발명에 따른 BAFF 길항제는 항-BAFF 항체, BAFF-결합 폴리펩티드 (면역어드헤신 및 펩티드 포함), 및 BAFF-결합 소분자를 포함한다. BAFF 길항제는 WO 02/02641에 기재된 BAFF 결합 항체 (예를 들어, 표 1의 서열 1-46, 321-329, 834-872, 1563-1595, 1881-1905 중의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 항체)를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 면역어드헤신은 BAFF 수용체의 BAFF 결합 영역 (예를 들어, BR3, BCMA 또는 TACI의 세포외 도메인)을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 면역어드헤신은 BR3-Fc이다. BAFF 결합 Fc 단백질의 다른 예는 WO 02/66516, WO 00/40716, WO 01/87979, WO 03/024991, WO 02/16412, WO 02/38766, WO 02/092620, WO 01/12812에 기재되어 있다. BAFF 길항제의 제조 방법은 US 2005/0095243 A1 및 US 2005/0163775에 기재되어 있다.

"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시에 항체의 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과 수준까지, (2) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 (in situ) 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"단리된" 핵산 분자는 항체 핵산의 천연 공급원에 통상 회합하는 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 세팅과 상이하다. 단리된 핵산 분자는 따라서 천연 세포에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는 예를 들어 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하는 경우에 통상 항체를 발현하는 세포에 포함된 핵산 분자를 포함한다.

표현 "조절 서열"은 특정 숙주 유기체 내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 예를 들어, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 예비 서열 또는 분비 리더용 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질 (preprotein)로서 발현될 경우 폴리펩티드용 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 줄 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 위치할 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접함을 의미하고, 분비 리더의 경우 인접하고 리딩 페이즈 (reading phase)로 존재한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 상기 부위가 존재하지 않을 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상의 용례에 따라 사용된다.

"벡터"는 셔틀 및 발현 벡터를 포함한다. 일반적으로, 플라스미드 구성체는 또한 세균에서 플라스미드의 복제 및 선택을 위해 복제 기점 (예를 들어, ColE1 복제 기점) 및 선택가능한 마커 (예를 들어, 암피실린 또는 테트라사이클린 내성)를 포함할 것이다. "발현 벡터"는 세균 또는 진핵 세포에서 본 발명의 항체 단편을 포함하는 항체의 발현을 위해 필요한 조절 서열 또는 조절 성분을 포함하는 벡터를 의미한다. 적합한 벡터는 아래에서 개시된다.

본 발명의 인간화 CD20 결합 항체, 예를 들어 인간화 2H7 항체를 생산하는 세포는 그 내부로 항체 코딩 핵산이 도입된 세균 및 진핵 숙주 세포를 포함할 것이다. 적합한 숙주 세포는 아래에서 개시된다.

본원에서 사용될 때 용어 "표지"는 직접 또는 간접적으로 항체에 접합된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.

본 발명의 조성물 및 방법

본 발명은 2H7.v16의 변이체인 인간화 2H7 항체를 제공한다. 특정 실시태양에서, 변이체는 hu2H7.v511이다.

전장 항체에서, 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체는 인간 면역글로불린의 C 도메인에 연결된 인간화 V 도메인을 포함할 것이다. 바람직한 실시태양에서, H쇄 C 영역은 인간 IgG, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG3으로부터 유래한 것이다. L쇄 C 도메인은 바람직하게는 인간 κ 쇄로부터 유래한 것이다.

본 발명의 목적을 위해, "인간화 2H7"는 하기 가변 경쇄 (V_L) 서열 (서열 2) 및 가변 중쇄 (V_H) 서열 (서열 8)을 포함하는 무손상 항체 또는 항체 단편을 의미한다.

인간화 2H7 항체가 무손상 항체인 경우에는, 바람직하게는 상기 항체는 하기 v16 경쇄 아미노산 서열 (서열 13) 및 중쇄 아미노산 서열 (서열 14)를 포함한다.

상기 선행 인간화 2H7 mAb의 변이체는 서열 13과 동일한 L쇄 서열을 갖고 H쇄 아미노산 서열은 하기 서열인 2H7v.31이다.

또다른 변이체는 서열 26의 H쇄 아미노산 서열을 갖는 2H7.v138이다.

상기 인간화 2H7 항체의 또다른 변이체는 2H7.v511의 서열 25의 V_L 및 서열 33의 V_H를 포함하는 것이다 [표 2 참조].

hu2H7.v511은 전장 IgG1이다. 한 실시태양에서, 항체는 2H7.v511 경쇄 (서열 26) 및 2H7.v511 중쇄 (서열 34)를 포함한다.

버전 16에 기초한 모든 다른 변이체의 V 영역은 하기 표 1에 나타낸 아미노산 치환 위치를 제외하고 v16의 아미노산 서열을 가질 것이다. 달리 나타내지 않으면, 2H7 변이체는 v16과 동일한 L쇄를 가질 것이다. 또한, 인간화 항체 2H7v.16은 rhuMAb2H7, PRO70769, 또는 오크렐리주맙으로도 언급된다.

잔기 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 따르고, 삽입은 a, b, c, d, 및 e로 표시하고, 갭은 서열에 대쉬로 표시한다. Fc 영역을 포함하는 CD20 결합 항체에서, Fc 영역의의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 Ab의 정제 또는 항체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 재조합 처리에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명의 인간화 2H7 항체 조성물은 K447을 갖는 항체, 모든 K447이 제거된 항체, 또는 K447 잔기가 존재하거나 존재하지 않는 항체의 혼합물을 포함할 수 있다.

IgG 내의 N-글리코실화 부위는 CH2 도메인의 Asn297이다. 본 발명의 인간화 2H7 항체 조성물은 Fc 영역을 갖는 상기 임의의 인간화 2H7 항체의 조성물을 포함하고, 여기서 조성물 내의 약 80-100％ (바람직하게는 약 90-99％)의 항체는 당단백질의 Fc 영역에 부착된, 푸코스가 결여된 성숙 코어 탄수화물 구조를 포함한다. 상기 조성물은 인간 IgG과 상호작용시에 FcγRIIIA (V158)만큼 효과적이지 않은 FcγRIIIA(F158)에 대한 결합의 놀라울 정도의 개선을 보이는 것으로 본 발명에서 입증되었다. FcγRIIIA (F158)은 정상의 건강한 아프리카계 미국인 및 백인에서 FcγRIIIA (V158)보다 흔하게 존재한다 (Lehrnbecher et al., Blood 94:4220 (1999) 참조). 역사적으로, 가장 통상적으로 사용되는 산업용 숙주 세포인 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)에서 생산된 항체는 비푸코실화된 집단을 약 2 내지 6％ 포함한다. 그러나, YB2/0 및 Lec13은 78 내지 98％의 비푸코실화된 항체를 갖는 항체를 생산할 수 있다. 문헌 [Shinkawa et al., J Bio. Chem. 278 (5), 3466-347 (2003)]은 FUT8 활성이 보다 작은, YB 2/0 및 Lec13 세포에서 생산된 항체가 시험관 내에서 유의하게 증가된 ADCC 활성을 보였다고 보고하였다. 또한, 푸코스 함량이 감소된 항체의 생산도 문헌에 기재되어 있다 [예를 들어, Li et al., (GlycoFi) "Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris" in Nature Biology online publication 22 Jan. 2006; Niwa R. et al., Cancer Res. 64(6):2127-2133 (2004); US 2003/0157108 (Presta); US 6,602,684 및 US 2003/0175884 (Glycart Biotechnology); US 2004/0093621, US 2004/0110704, US 2004/0132140 (모두 Kyowa Hakko Kogyo)].

이중특이적 인간화 2H7 항체는 항체의 한 아암이 본 발명의 인간화 2H7 항체의 H 및/또는 L쇄의 적어도 항원 결합 영역을 갖고, 다른 아암은 제2 항원에 대한 V 영역 결합 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 특정 실시태양에서, 제2 항원은 CD3, CD64, CD32A, CD16, NKG2D 또는 다른 NK 활성화 리간드로 구성된 군에서 선택된다.

특정 실시태양에서, 본 발명의 인간화 2H7 항체는 IgG Fc에 아미노산 변형을 추가로 포함하고, 야생형 IgG Fc를 갖는 항체보다 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 보다 바람직하게는 적어도 100배, 바람직하게는 적어도 125배, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 150배 내지 약 170배 더 증가된 인간 FcRn에 대한 결합 친화도를 보인다.

항체 생산

모노클로날 항체

모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조하거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 4,816,567)에 의해 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적합한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터를 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 상기와 같이 면역화시킨다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화시킬 수 있다. 면역화 후에, 림프구를 단리한 후, 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 콜산을 사용하여 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

이와 같이 제조된 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합된 모 골수종 세포 (융합 파트너라고도 부름)의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적합한 배양 배지에 씨딩하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 히포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우, 하이브리도마용 선택 배양 배지는 일반적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제하는 물질인 히포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이다.

바람직한 융합 파트너 골수종 세포는 효율적으로 융합하여 선택된 항체 생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준의 생산을 지지하고 비융합된 모 세포에 대항하여 선택하는 선택 배지에 감수성인 세포이다. 바람직한 골수종 세포주는 쥐 골수종 라인, 예를 들어 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center)) 및 SP-2 및 유도체, 예를 들어 X63-Ag8-653 세포 (미국 메릴랜드주 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection))에서 유도된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체 생성을 위해 설명된 바 있다 (Kozbor, 1984, J. Immunol., 133: 3001; Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker,Inc., New York)).

하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대해 작용하는 모노클로날 항체의 생성에 대해 분석된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사성 면역 분석 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정한다.

모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기재된 스캐챠드 (Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다.

목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론은 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]으로 성장시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 예를 들어 마우스 내로 세포의 주사에 의해 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다.

서브클론에서 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 과정, 예를 들어 친화도 크로마토그래피 (예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스를 사용) 또는 이온 교환 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고, 통상적인 방법을 사용하여 (예를 들어 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 서열을 결정한다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리된 DNA는 발현 벡터에 삽입되고, 이 벡터는 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성하기 위해 본래 항체 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염된다. 항체를 코딩하는 DNA의 세균 내에서의 재조합 발현에 대해서는 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) 및 Plueckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)].

추가의 실시태양에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에서는 파지 라이브러리를 사용하여 각각 쥐 및 인간 항체의 단리를 설명하고 있다. 후속 문헌은 쇄 셔플링에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생성 (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), 및 매우 큰 파지 라이브러리 제조를 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)을 설명하고 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술의 실행가능한 대안이다.

항체를 코딩하는 DNA는 예를 들어 상동성 쥐 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 (C_H 및 C_L) 서열로 치환시키거나 (미국 특허 4,816,567; 및 Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), 비-면역글로불린 폴리펩티드 (이종 폴리펩티드)의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합시킴으로써 변형시킬 수 있다. 비-면역글로불린 폴리펩티드 서열은 항체의 불변 도메인을 대체하거나, 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인을 대체하여 한 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.

인간화 항체

비-인간 항체를 인간화하기 위한 방법은 당업계에 설명되어 있다. 바람직하게는, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그 내부로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 "도입 (import)" 잔기로서 종종 언급되고, 일반적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 대응하는 서열을 초가변 영역 서열로 대체함으로써 윈터 (Winter) 등의 방법 (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 1988, 239:1534-1536)을 따라 수행할 수 있다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비-인간종의 대응하는 서열로 대체된 키메라 항체 (미국 특허 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체이다.

인간화 항체 제조에 사용되는 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 모두)의 선택은 항체가 인간 치료를 의도할 경우 항원성 및 HAMA 반응 (인간 항-마우스 항체) 감소에 매우 중요하다. 소위 "최적 맞춤 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열은 공지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류와 가장 근접한 인간 V 도메인 서열이 확인되고, 인간화 항체의 인간 프레임워크 구역 (FR)으로서 허용된다 (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위 군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래한 특정 프레임워크 영역을 이용한다. 동일한 프레임워크가 복수개의 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

항체가 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이를 달성하기 위해서, 바람직한 방법에 따르면, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모서열 및 상이한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상 입수가능하고, 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 그려 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 상기 디스플레이의 조사를 통해 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 끼치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접적으로 가장 실질적으로 관련된다.

인간화 항체는 면역접합체를 생성시키기 위해 하나 이상의 세포 독성제(들)과 임의로 접합된 항체 단편, 예를 들어 Fab일 수 있다. 별법으로, 인간화 항체는 전장 항체, 예를 들어 전장 IgG1 항체일 수 있다.

인간 항체 및 파지 디스플레이 방법

인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역처리시에 내생 면역글로불린 생성의 부재시에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 (transgenic) 동물 (예, 마우스)을 현재 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포 돌연변이체 마우스의 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자의 동종 접합성 결실이 내생 항체 생성을 완전히 억제한다고 설명되었다. 상기 생식세포 돌연변이체 마우스에서 인간 생식세포 면역글로불린 유전자 어레이의 전이는 항원 시험시에 인간 항체의 생성을 야기할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993)] 및 미국 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (모두 겐팜); 5,545,807; 및 WO 97/17852 참조).

별법으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990))을 사용하여 비면역처리된 공여자로부터 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생성시킬 수 있다. 이 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 필라멘트성 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 fd의 주요 또는 마이너 코트 단백질 유전자 내로 인 프레임으로 클로닝되어 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로 디스플레이된다. 필라멘트성 입자는 파지 게놈의 단일쇄 DNA 카피를 포함하기 때문에, 항체의 기능성 특성에 기초한 선별을 통해 또한 상기 특성을 보이는 항체를 코딩하는 유전자의 선택이 가능하다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993)] 참조). V-유전자 세그먼트의 복수의 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에서는 면역처리된 마우스의 췌장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 랜덤 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 비면역처리된 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 제조할 수 있고, 다양한 항원 어레이 (자가항원 포함)에 대한 항체는 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라 단리될 수 있다. 또한 미국 특허 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다.

상기 논의한 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관 내에서 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다 (미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조).

항체 단편

특정 환경에서, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 보다 작은 크기는 신속한 소실을 허용하여 고형 종양에 대한 접근성이 개선될 수 있다.

항체 단편의 생산을 위해 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백분해성 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되고 분비되어 다량의 상기 단편을 쉽게 생산할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). 다른 방법에 따라, F(ab')₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 생체 내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')₂ 단편은 미국 특허 5,869,046에 기재되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 숙련된 실무자에게 명백할 것이다. 다른 실시태양에서, 선택되는 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (WO93/16185; 미국 특허 5,571,894; 및 미국 특허 5,587,458 참조). Fv 및 sFv는 단지 불변 영역이 결여된 무손상 결합 부위를 갖는 단편이기 때문에, 생체 내에서 사용 동안 비특이적 결합을 감소시키기에 적합하다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에서 효과기 단백질의 융합을 야기하도록 구성될 수 있다 (Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌 참조). 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체 단편은 일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

이중특이적 항체

이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 CD20 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 상기 항체는 CD20 결합 부위를 다른 단백질의 결합 부위와 조합할 수 있다. 별법으로, 항-CD20 아암은 세포 방어 메카니즘을 CD20-발현 세포에 집중하고 편재시키기 위해 백혈구 상의 촉발 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자 (예를 들어 CD3), 또는 IgG의 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16), 또는 NKG2D 또는 다른 NK 세포 활성화 리간드에 결합하는 아암과 조합될 수 있다. 또한, 이중특이적 항체는 세포 독성제를 CD20을 발현하는 세포에 편재시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 항체는 CD20-결합 아암 및 세포 독성제 (예를 들어 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 아암을 갖는다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어 F(ab')₂ 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.

WO 96/16673에서는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRIII 항체를 설명하고, 미국 특허 5,837,234에서는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRI 항체를 설명한다. 이중특이적 항-ErbB2/Fcα 항체는 WO 98/02463에 나타나 있다. 미국 특허 5,821,337에서는 이중특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체를 교시한다.

이중특이적 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하고, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마 (quadroma))는 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산한다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고, 생산 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO 10, 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.

상이한 방식에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합은 바람직하게는 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 융합체의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 필요한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시형질감염시킨다. 이는 제작에 사용된 3개의 폴리펩티드 쇄의 불균등한 비율이 요구되는 이중특이적 항체의 최적 수율을 제공하는 실시태양에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 큰 탄력성을 제공한다. 그러나, 균등한 비율의 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율을 나타낼 때 또는 상기 비가 요구되는 쇄 조합의 생성에 유의한 영향을 갖지 않을 때 하나의 발현 벡터 내에 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 쇄의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.

상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍 (제2 결합 특이성을 제공하는)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 반쪽에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 손쉬운 분리 방법을 제공하므로, 상기 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 쇄 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 방법은 PCT 공개 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 추가의 상세한 내용에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121, 210 (1986)]을 참조한다.

미국 특허 5,731,168에 기재된 다른 방법에 따라, 한쌍의 항체 분자들 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화하도록 처리될 수 있다. 바람직한 계면은 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예, 티로신 또는 트립토판)으로 교체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예, 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체함으로써 큰 측쇄(들)에 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "캐비티 (cavity)"가 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물, 예를 들어 동종이량체 (homodimer)에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다.

이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 그러한 항체는 예를 들어, 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안되었다. 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 잘 알려져 있고, 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 4,676,980에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술은 또한 문헌에서 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 결합을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에서는 무손상 항체가 단백분해적으로 절단되어 F(ab')₂ 단편을 생성하는 절차를 기술하고 있다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제인 아비소산나트륨의 존재 하에 환원된다. 이어서 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 약제로서 사용될 수 있다.

최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]에서는 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')₂ 분자의 생산을 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비되었고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관 내에서 화학 커플링되었다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발시킬 수 있었다.

이중특이적 항체 단편을 재조합 세포 배양물로부터 직접 제조하고 단리시키기 위한 다양한 기술이 또한 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼 (zipper)를 사용하여 생산되었다 (Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 다음, 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 본 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편 제조를 위한 다른 메카니즘을 제공하였다. 이 단편은 동일 쇄 상의 두개의 도메인 사이에 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 V_L에 연결된 V_H를 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H 및 V_L 도메인은 다른 단편의 상보성 V_L 및 V_H 도메인과 페어링하고, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용한 이중특이적 항체 단편의 다른 제조 전략도 보고된 바 있다 (Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994) 참조).

3가 이상의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 (Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)).

다가 항체

다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 빠르게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 항원 결합 부위가 3개 이상인 (예를 들어 4가 항체) 다가 항체 (IgM 클래스가 아닌)일 수 있고, 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이로 이루어진다). 상기 시나리오에서, 항체는 Fc 영역 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VD1-(X1)_n-VD2-(X2)_n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원에서 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에서 다가 항체는 예를 들어 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.

다른 아미노산 서열 변형

본원에서 설명되는 CD20 결합 항체의 아미노산 서열 변형(들)도 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항-CD20 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변경을 항-CD20 항체 핵산에 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조된다. 상기 변형은 예를 들어 항-CD20 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 요구되는 특징을 갖는 최종 구성체를 얻도록 수행된다. 아미노산 변화는 또한 항-CD20 항체의 번역후 프로세싱를 변경시킬 수 있고, 예를 들어 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변경시킬 수 있다.

돌연변이유발의 바람직한 위치인 항-CD20 항체의 특정 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells in Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 (scanning) 돌연변이유발"이다. 여기서, 표적 잔기 또는 잔기의 집단이 확인되고 (예를 들어, 대전된 잔기, 예를 들어 arg, asp, his, lys, 및 glu), 아미노산과 CD20 항원의 상호작용에 영향을 주기 위해 중성 또는 음대전 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환된다. 이어서, 치환에 대한 기능적 감수성을 보이는 아미노산 위치는 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정할 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해서 ala 스캐닝 또는 랜덤 돌연변이유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고, 발현된 항-CD20 항체 변이체를 요구되는 활성에 대해 스크리닝한다.

아미노산 서열 삽입은 길이가 하나의 잔기 내지 100 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합체 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항-CD20 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항-CD20 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어 ADEPT를 위한) 또는 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항-CD20 항체의 N- 또는 C-말단, 또는 항체의 융합을 포함한다.

다른 종류의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 항-CD20 항체 분자의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 상이한 잔기로 치환된다. 치환 돌연변이를 위한 가장 흥미로운 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변이도 포함된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 표에 나타낸다. 상기 치환이 생물학적 활성을 변경시키면, 하기 표 1에 "예시적인 치환"으로 명명된 또는 아미노산 종류에 대해 아래에서 상세히 설명하는 보다 큰 변화가 도입되고, 생성물을 스크리닝할 수 있다.

아미노산 치환의 표

본래 서열	예시적인 치환	바람직한 치환
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gln; asn	lys
Asn (N)	gln; his; asp, lys; arg	gln
Asp (D)	glu; asn	glu
Cys (C)	ser; ala	ser
Gln (Q)	asn; glu	asn
Glu (E)	asp; gln	asp
Gly (G)	ala	ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; 노르류신	leu
Leu (L)	노르류신; ile; val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	tyr
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; 노르류신	leu

항체의 생물학적 특성에서 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 형태로서의 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 것에 대한 그의 효과가 크게 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 천연 발생 잔기는 통상적인 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 군으로 분류된다.

(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비보존성 치환은 상기 종류의 하나의 멤버를 다른 종류와 교환하는 것을 수반한다.

인간화 또는 변이체 항-CD20 항체의 적절한 형태를 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 또한 분자의 산화 안정성을 개선시키고 비정상적 가교결합을 방지하기 위해 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 반대로, 그의 안정성을 개선시키기 위해 시스테인 결합(들)이 항체에 첨가될 수 있다 (특히 항체가 항체 단편, 예를 들어 Fv 단편인 경우).

특히 바람직한 종류의 치환 변이체는 모 항체 (예를 들어 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 생성되는 변이체(들)은 이들이 생성되는 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 그러한 치환 변이체를 생성하기 위한 간편한 방법은 파지 디스플레이를 사용하는 친화도 성숙을 수반한다. 간단히, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어 6-7개의 부위)가 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성하도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 산물에서 유전자에 대한 융합체로서 필라멘트상 파지 입자로부터 1가 양식으로 디스플레이된다. 이어서 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 그들의 생물학적 활성 (예를 들어 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인하도록 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 항체와 인간 CD20 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 상기 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 본원에서 설명된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 그러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝시키고, 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가 개발을 위해 선택할 수 있다.

항체의 다른 종류의 아미노산 변이체는 항체의 본래의 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 변경은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실, 및/또는 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다.

항체의 글리코실화는 일반적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 잔기의 부착을 의미한다. 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 잔기의 효소에 의한 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내의 상기 트리펩티드 서열의 존재는 효능있는 글리코실화 부위를 생성시킨다. O-연결 글리코실화는 당 N-아세일갈락토사민, 갈락토스, 또는 크실로스의 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌 중의 하나의 부착을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신도 사용될 수 있다.

항체에 대한 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 트리펩티드 서열 (N-연결 글리코실화 부위에 대해)을 포함하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다. 또한, 변형은 본래 항체의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 추가 또는 치환에 의해 수행될 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위에 대해).

항-CD20 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조된다. 상기 방법은 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 항-CD20 항체의 초기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위 지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

예를 들어 항체의 항원 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 향상시키기 위해 효과기 기능에 관하여 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)이 Fc 영역 내에 도입되어, 상기 영역 내에서의 쇄내 디술피드 결합을 형성할 수 있다. 이와 같이 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체 매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 보일 수 있다 (Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992) 참조). 향상된 항-종양 활성을 갖는 동종이량체 항체도 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같은 이종이관능성 가교결합제를 사용하여 제조할 수 있다. 별법으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체가 공학처리되어 향상된 보체 매개 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다 (Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989) 참조).

항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 5,739,277에 기재된 바와 같이 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체 (특히, 항체 단편) 내로 포함시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체 내 혈청 반감기를 증가시키는 IgG 분자 (예, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 나타낸다.

다른 항체 변형

다른 항체 변형이 본원에서 고려된다. 예를 들어, 항체는 다양한 비단백성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 연결될 수 있다. 항체는 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐)에, 각각 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

요구되는 특성을 갖는 항체의 스크리닝

특정 생물학적 특징을 갖는 항체는 실험 실시예에 설명된 바와 같이 선택될 수 있다.

본 발명의 항-CD20 항체의 성장 억제 효과는 예를 들어 CD20을 내인성으로 발현하거나 CD20 유전자의 형질감염 후에 발현하는 세포를 사용하여 당업계에 공지된 방법에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어, 종양 세포주 및 CD20-형질감염된 세포는 수일 (예를 들어, 2-7일) 동안 다양한 농도에서 본 발명의 항-CD20 모노클로날 항체로 처리하고 크리스탈 바이올렛 (crystal violet) 또는 MTT로 염색하거나 또는 다른 비색 분석으로 평가할 수 있다. 증식을 측정하는 다른 방법은 본 발명의 항-CD20 항체의 존재 또는 부재 하에 처리된 세포에 의한 ³H-티미딘 흡수를 비교하는 것이다. 항체 처리 후에, 세포를 수확하고, DNA에 포함된 방사성의 양을 신틸레이션 (scintillation) 계수기로 정량하였다. 적합한 양성 대조군은 세포주 성장을 억제하는 것으로 알려진 성장 억제 항체로 선택된 세포주의 처리를 포함한다.

세포 사멸을 유도하는 항체를 선택하기 위해서, 예를 들어 요오드화프로피듐 (PI), 트리판 블루 또는 7AAD 흡수에 의해 표시되는 막 통합성의 상실을 대조군과 비교하여 평가하였다. PI 흡수 분석은 보체 및 면역 효과기 세포의 부재 하에 수행할 수 있다. CD20-발현 종양 세포는 배지 단독 또는 예를 들어 약 1O ㎍/ml의 적합한 모노클로날 항체를 포함하는 배지와 함께 인큐베이션한다. 세포를 3일 동안 인큐베이션한다. 각각의 처리 이후, 세포를 세척하고, 세포 덩어리의 제거를 위해 35 mm 스트레이너 (strainer) 뚜겅이 달린 12 x 75 튜브 (튜브당 1 ml, 처리군 당 3개의 튜브) 내로 분취한다. 이어서, 튜브에 PI (10 ㎍/ml)을 넣는다. 샘플은 FACSCAN™ 유세포 측정기 (flow cytometer) 및 FACSCONVERT™ CellQuest 소프트웨어 (벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson))를 사용하여 분석할 수 있다. PI 흡수에 의해 측정시에 통계학적으로 유의한 수준의 세포 사멸을 유도하는 항체를 세포 사멸 유도 항체로서 선택할 수 있다.

목적하는 항체에 의해 결합된 CD20 상의 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 통상적인 교차차단 분석, 예를 들어 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 설명된 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석은 시험 항체가 본 발명의 항-CD20 항체와 동일한 부위 또는 에피토프에 결합하는 지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 에피토프 맵핑을 당업계에 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체 서열은 접촉 잔기를 확인하기 위해 예를 들어 알라닌 스캐닝에 의해 돌연변이시킬 수 있다. 돌연변이체 항체는 적절한 폴딩을 보장하기 위해 폴리클로날 항체와의 결합에 대해 초기에 시험된다. 상이한 방법에서, CD20의 상이한 영역에 대응하는 펩티드는 시험 항체와 함께 또는 시험 항체 및 특성화되거나 알려진 에피토프를 갖는 항체와 함께 경쟁 분석에 사용될 수 있다.

벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법

본 발명은 또한 인간화 2H7 변이체 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포 및 항체의 생산을 위한 재조합 기술을 제공한다.

항체의 재조합 생산을 위해, 항체 코딩 핵산은 단리되어 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능 벡터 내로 삽입된다. 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고, 통상적인 과정 (예를 들어 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여)에 의해 서열결정된다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 시그날 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열 중의 하나 이상을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

(i) 시그날 서열 성분

본 발명의 인간화 2H7 항체는 직접 및 바람직하게는 시그날 서열인 이종 폴리펩티드 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 다른 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합 방법으로 제조할 수 있다. 선택되는 이종성 시그날 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식 및 프로세싱 (즉, 시그날 펩티다제에 의한 분해)되는 것이다. 천연 CD20 결합 항체 시그날 서열을 인식하여 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 시그날 서열은 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열안정성 장독소 II 리더의 군으로부터 선택되는 원핵 시그날 서열에 의해 치환된다. 효모 분비를 위해, 천연 시그날 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, 알파 팩터 리더 (사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 알파-팩터 리더), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더, WO 90/13646에 기재된 시그날에 의해 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 시그날 서열 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 시그날이 이용가능하다.

상기 전구체 영역을 위한 DNA는 인간화 2H7 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프레임 (reading frame)으로 라이게이션된다.

(ii) 복제 기점

발현 및 클로닝 벡터는 모두 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터가 복제하도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 일반적으로, 벡터 클로닝시에 상기 서열은 숙주 염색체 DNA에 무관하게 벡터가 복제하도록 하는 것이고, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 상기 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)는 포유동물 세포에 벡터를 클로닝하는데 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다 (SV40 기점은 단지 초기 프로모터를 포함하기 때문에 일반적으로 사용될 수 있다).

(iii) 선택 유전자 성분

발현 및 클로닝 벡터는 선택가능 마커로도 언급되는 선택 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양분을 공급하는 단백질, 예를 들어 바실러스의 D-알라닌 라세마제를 코딩한다.

선택 방식의 일례는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고, 따라서 선택법에서 생존할 수 있다. 상기 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 이용한다.

포유동물 세포에 적합한 선택가능 마커의 다른 예는 인간화 2H7 항체를 코딩하는 핵산을 섭취하는 능력을 갖는 세포의 확인을 가능하게 하는 것, 예를 들어 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이다.

예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 메토트렉세이트 (Mtx), DHFR의 경쟁적 길항제를 포함하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인한다. 야생형 DHFR을 사용할 때 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주(예를 들어, ATCC CRL-9096)이다.

별법으로, 인간화 2H7 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또다른 선택가능 마커, 예를 들어 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환된 또는 동시-형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 포함하는 야생형 숙주)는 선택가능 마커에 대한 선택제, 예를 들어 아미노글리코사이드계 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418를 포함하는 배지에서 세포의 성장에 의해 선택될 수 있다 (미국 특허 4,965,199를 참조).

효모에 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 내의 trp1 병변의 존재는 트립토판 부재시의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결여 효모 균주 (ATCC 기탁 번호 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 포함하는 공지의 플라스미드에 의해 보완된다.

또한, 1.6 ㎛ 환상 플라스미드 pKD1에서 유래한 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 별법으로, 케이. 락티스 (K. lactis)에 대한 재조합 송아지 키모신의 대량 생산용 발현 시스템이 문헌 [Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]에 보고되었다. 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 클루이베로마이세스의 산업적 균주에 의한 분비를 위한 안정한 다중 카피 발현 벡터도 개시되어 있다 (Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)).

(iv) 프로모터 성분

발현 및 클로닝 벡터는 대체로 숙주 유기체에 의해 인식되고 인간화 2H7 항체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 특정 프로모터를 포함한다. 원핵 숙주에 사용하기 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼린 포스파타제 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지의 세균 프로모터도 적합하다. 또한 세균 시스템에 사용하기 위한 프로모터도 CD20 결합 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno; S.D.) 서열을 포함할 것이다.

프로모터 서열이 진핵세포에 대해 공지되어 있다. 실질적으로 모든 당단백질 유전자는 전사가 개시되는 부위의 약 25 내지 30 염기 상류에 위치하는 AT 풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시점으로부터 70 내지 80 염기 상류에 존재하는 또다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일의 부가를 위한 시그날일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 당단백질 유전자의 3' 말단에 존재한다. 상기 모든 서열은 진핵 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.

효모 숙주에 사용하기 위해 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제용 프로모터를 포함한다.

성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가의 잇점을 갖는 유도가능 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관여하는 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소용 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기 위해 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 또한, 효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.

포유동물 숙주 세포 내의 벡터로부터의 인간화 2H7 항체 전사는 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성일 경우 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 얻은 프로모터에 의해 조절된다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 기점을 포함하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 인간 사이토메갈로바이러스의 최조기 (immediate early) 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 소 파필로마 바이러스를 벡터로서 사용하는 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 4,419,446에 기재되어 있다. 이 시스템의 변형은 미국 특허 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스로부터 티미딘 키나제 프로모터의 조절 하에 마우스 세포에서 인간 베타-인터페론 cDNA의 발현에 대해서는 또한 문헌 [Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982)]을 참조한다. 별법으로, 라우스 (rous) 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.

(v) 인핸서 엘리먼트 성분

보다 고등한 진핵세포에 의한 본 발명의 인간화 2H7 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 일반적으로 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 하류 쪽의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 엘리먼트는 문헌 [Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 위치 5' 또는 3'에서 CD20 결합 항체 코딩 서열까지 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.

(vi) 전사 종결 성분

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 (nucleated) 세포)에 사용되는 발현 벡터도 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 상기 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 통상 얻을 수 있다. 이들 영역은 CD20 결합 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분 내의 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. 한 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. W094/11026 및 본원에 개시된 발현 벡터를 참조한다.

(vii) 숙주 세포의 선택 및 형질전환

본원에서 벡터 내에 DNA를 클로닝하거나 발현시키기 위한 적합한 숙주 세포는 상기한 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 본 목적에 적합한 원핵생물은 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아새 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아 (Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실리 (Bacilli), 예를 들어 비. 섭틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 애루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 하나의 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예를 들어 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)가 적합하다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다.

전장 항체, 항체 단편, 및 항체 융합 단백질은 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않을 때, 예를 들어 치료 항체가 세포 독성제 (예를 들어, 독소)에 접합되고 면역접합체 자체가 종양 세포 파괴 효과를 보일 때 세균에서 생산될 수 있다. 전장 항체는 혈류에서 보다 긴 반감기를 갖는다. 이. 콜라이에서의 생산이 보다 신속하고 비용 효과적이다. 세균에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는 예를 들어 발현 및 분비 최적화를 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 시그날 서열을 설명하고 있는, 본원에 참고로 포함된 U.S. 5,648,237 (Carter et. al.), U.S. 5,789,199 (Joly et al.), 및 U.S. 5,840,523 (Simmons et al.)을 참고한다. 발현 후, 항체는 가용성 분획 내의 이. 콜라이 세포 페이스트로부터 단리되고, 예를 들어 이소형에 따라 단백질 A 또는 G 칼럼을 통해 정제될 수 있다. 최종 정제는 예를 들어 CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하기 위한 방법과 유사하게 수행할 수 있다.

원핵생물 외에, 진핵 미생물, 예를 들어 필라멘트성 진균 또는 효모가 CD20 결합 항체-코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 보통의 제빵용 효모가 저등 진핵 숙주 미생물 사이에 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 예를 들어 쉬조사카로마이세스폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스 (K. lactis), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스 ((K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia (EP 244,234)); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬바니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스 ( occidentalis); 및 필라멘트성 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (nidulans) 및 에이. 니거 (niger)가 일반적으로 이용가능하고 본원에서 유용하다.

글리코실화 인간화 2H7 항체 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포성 유기체로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 숙주, 예를 들어 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda; 쐐기벌레), 아에데스 아에깁티 (Aedes aegypti, 모기), 아에데스 알보픽투스 (albopictus, 모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster, 과일파리), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터의 대응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 이용가능하고, 상기 바이러스는 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로서 이용할 수 있다.

면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 감자의 식물 세포 배양액도 숙주로서 이용할 수 있다.

그러나, 척추동물 세포가 가장 관심의 대상이 되어 왔고, 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 방법이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인 (현탁 배양으로 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포들 (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1997)); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980) 또는 CHO-DP-12 라인; 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL 1587); 인간 경부 암세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암세포주 (Hep G2)이다.

숙주 세포는 CD20 결합 항체 생산을 위한 상기한 발현 또는 클로닝 벡터를 사용하여 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양한다.

(viii) 숙주 세포 배양

본 발명의 CD20 결합 항체를 생산하기 위해 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어 햄 (Ham's) F10 (시그마 (Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 (Dulbecco's) 개질 이글 (Eagle's) 배지 (DMEM, 시그마)가 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:225 (1980)], 미국 특허 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 설명된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 외피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 버퍼 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, GENTAMYCIN (등록상표) 약물), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 동등 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물이 또한 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

(ix) 항체 정제

재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포내, 주변 세포질 공간에 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되면, 제1 단계로서, 입자형 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌 [Carter et al. Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변 세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하기 위한 절차가 설명되어 있다. 간단히 설명하면, 세포 페이스트는 아세트산 나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동된다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 상기 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 단백분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.

세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어, 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고, 친화도 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존한다. 단백질 A가 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 한 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (Lindmark et al. J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 추천된다 (Guss et al. EMBO J. 5: 15671575 (1986)). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 종종 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠이 아가로스를 사용하여 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유동 속도와 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX (등록상표) 수지 (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스 (등록상표) 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전도 회수되는 항체에 따라 사용될 수 있다.

임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 목적하는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 pH 약 2.5-4.5에서, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다.

항체 접합체

항체는 세포 독성제, 예를 들어 독소 또는 방사성 동위원소에 접합될 수 있다. 특정 실시태양에서, 독소는 칼리케아마이신, 마이탄시노이드, 돌라스타틴, 오리스타틴 E 및 이들의 유사체 또는 유도체이다.

바람직한 약물/독소는 DNA 손상제, 미세관 중합 또는 탈중합 억제제 및 ㅎ를 항대사물질을 포함한다. 바람직한 종류의 세포 독성제는 예를 들어 효소 억제제, 예를 들어 디히드로폴레이트 리덕타제 억제제, 및 티미딜레이트 신타제 억제제, DNA 인터컬레이터 (intercalator), DNA 절단제, 토포이소머라제 억제제, 안트라사이클린 패밀리 약물, 빈카 약물, 미토마이신, 블레오마이신, 세포독성 뉴클레오시드, 프테리딘 패밀리 약물, 디이넨, 포도필로독소 및 분화 유도제를 포함한다. 상기 클래스의 특히 유용한 멤버는 예를 들어 메토트렉세이트, 메토프테린, 디클로로메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 6-머캅토퓨린, 시토신 아라비노시드, 멜팔란, 류로신, 류로시데인, 액티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, N-(5,5-디아세톡시펜틸)독소루비신, 모르폴리노-독소루비신, 1-(2-클로로에틸)-1,2-디메탄술포닐 히드라지드, N⁸-아세틸 스페르미딘, 아미노프테린 메토프테린, 에스페라미신, 미토마이신 C, 미토마이신 A, 액티노마이신, 블레오마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 탈리소마이신, 포도필로독소 및 포도필로독소 유도체, 예를 들어 에토포시드 또는 에토포시드 포스페이트, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 탁솔, 탁소테레, 레티노산, 부티르산, N⁸-아세틸 스페르미딘, 캄프토테신, 칼리케아마이신, 브리오스타틴, 세팔로스타틴, 안사미토신, 악토신, 마이탄시노이드, 예를 들어 DM-I, 마이탄신, 마이탄시놀, N-데스메틸-4,5-데스에폭시마이탄시놀, C-19-데클로로마이탄시놀, C-20-히드록시마이탄시놀, C-20-데메톡시마이탄시놀, C-9-SH 마이탄시놀, C-14-알콕시메틸마이탄시놀, C-14-히드록시 또는 아세틸옥시메틸마이탄시놀, C-15-히드록시/아세틸옥시마이탄시놀, C-15-메톡시마이탄시놀, C-18-N-데메틸마이탄시놀 및 4,5-데옥시마이탄시놀, 오리스타틴, 예를 들어 오리스타틴 E, M, PHE 및 PE; 돌로스타틴, 예를 들어 돌로스타틴 A, 돌로스타틴 B, 돌로스타틴 C, 돌로스타틴 D, 돌로스타틴 E (20-에피 및 11-에피), 돌로스타틴 G, 돌로스타틴 H, 돌로스타틴 I, 돌로스타틴 1, 돌로스타틴 2, 돌로스타틴 3, 돌로스타틴 4, 돌로스타틴 5, 돌로스타틴 6, 돌로스타틴 7, 돌로스타틴 8, 돌로스타틴 9, 돌로스타틴 10, 데오-돌로스타틴 10, 돌로스타틴 11, 돌로스타틴 12, 돌로스타틴 13, 돌로스타틴 14, 돌로스타틴 15, 돌로스타틴 16, 돌로스타틴 17 및 돌로스타틴 18; 세팔로스타틴, 예를 들어 세팔로스타틴 1, 세팔로스타틴 2, 세팔로스타틴 3, 세팔로스타틴 4, 세팔로스타틴 5, 세팔로스타틴 6, 세팔로스타틴 7, 25'-에피-세팔로스타틴 7, 20-에피-세팔로스타틴 7, 세팔로스타틴 8, 세팔로스타틴 9, 세팔로스타틴 10, 세팔로스타틴 11, 세팔로스타틴 12, 세팔로스타틴 13, 세팔로스타틴 14, 세팔로스타틴 15, 세팔로스타틴 16, 세팔로스타틴 17, 세팔로스타틴 18 및 세팔로스타틴 19를 포함한다.

마이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 마이탄신이 이스트 아프리칸 쉬러브 마이테누스 세라타 (east African shrub Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 (미국 특허 3,896,111). 후속적으로, 특정 미생물이 또한 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄시놀 및 C-3 마이탄시놀 에스테르를 생산하는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 4,151,042). 합성 마이탄시놀 및 그의 유도체 및 유사체는 예를 들어 본원에 참고로 포함된 미국 특허 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533에 개시되어 있다.

마이탄신 및 마이탄시노이드는 종양 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체에 접합되었다. 마이탄시노이드를 포함하는 면역접합체 및 그들의 치료 용도는 예를 들어 그 개시 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0425 235 B1에 개시되어 있다. 문헌 [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에는 인간 결직장암에 대해 작용하는 모노클로날 항체 C242에 연결된 DM1로 명명된 마이탄시노이드를 포함하는 면역접합체가 기재되어 있다. 접합체는 배양된 결장암 세포에 대한 높은 세포독성을 보이는 것으로 밝혀졌고, 생체 내 종양 성장 분석에서 항종양 활성을 보였다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에는 마이탄시노이드가 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 쥐 항체 A7에, 또는 HER-2/neu 발암유전자에 결합하는 다른 쥐 모노클로날 항체 TA.1에 디술피드 링커를 통해 접합된 면역접합체가 기재되어 있다.

예를 들어, 미국 특허 5,208,020 또는 EP 특허 0425 235 B1, 및 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)]에 개시된 것을 포함하여 항체-마이탄시노이드 접합체를 제조하기 위한, 당업계에 공지된 많은 연결기가 존재한다. 연결기는 상기 특허에 개시된 바와 같은 디술피드 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광 불안정성 기, 펩티다제 불안정성 기, 또는 에스테라제 불안정성 기를 포함하고, 디술피드 및 티오에테르 기가 바람직하다.

항체와 마이탄시노이드의 접합체는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 특히 바람직한 커플링제는 디술피드 연결을 제공하기 위한 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)를 포함한다.

링커는 연결의 종류에 따라 상이한 위치에서 마이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결기는 통상적인 커플링 기술을 이용하여 히드록실기과의 반응에 의해 형성할 수 있다. 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 개질된 C-14 위치, 히드록실기로 개질된 C-15 위치, 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치에서 발생할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 연결은 마이탄시놀 또는 마이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.

목적하는 다른 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아마이신 분자에 접합된 CD20 결합 항체를 포함한다. 칼리케아마이신 패밀리의 항생제는 피코몰 미만 농도에서 이중쇄 DNA 파열을 생성시킬 수 있다. 칼리케아마이신 패밀리의 접합체의 제조에 대해서는, 미국 특허 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (모두 아메리칸 시아나미드 컴퍼니 (American Cyanamid Company))를 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아마이신의 구조적 유사체는 γ₁ ^I, α₂ ^I, α₃ ^I, N-아세틸-γ₁ ^I, PSAG 및 θ^I ₁을 포함하고, 이로 제한되지 않는다 (Hinman et al., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) 및 아메리칸 시아나미드의 상기 특허). 항체가 접합될 수 있는 다른 항-종양 약물은 항엽산제인 QFA이다. 칼리케아마이신과 QFA는 모두 액틴의 세포내 부위를 갖고, 쉽게 형질막을 통과하지 못한다. 따라서, 항체 매개 내재화를 통한 상기 물질의 세포 흡수는 그의 세포독성 효과를 크게 향상시킨다.

방사성 동위원소

종양의 선택적 파괴를 위해, 항체는 방사성이 높은 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성 접합된 항-CD20 항체의 생산에 이용될 수 있다. 그 예는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 접합체가 진단을 위해 사용될 때, 접합체는 섬광조영술 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc^99m 또는 I¹²³, 또는 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화 (mri)으로도 공지됨)를 위한 스핀 표지, 예를 들어 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.

방사성- 또는 다른 표지는 공지된 방식으로 포함될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성되거나 예를 들어 수소 대신에 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용한 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. 표지, 예를 들어 tc99m 또는 I¹²³, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸ 및 In¹¹¹은 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODOGEN 방법 (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)을 사용하여 요오드-123을 포함시킬 수 있다. 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에 다른 방법이 상세히 기재되어 있다.

항체와 세포 독성제의 접합체는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성 뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이팅제이다 (WO94/11026 참조). 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광 불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992); 미국 특허 5,208,020)가 사용될 수 있다.

치료 용도

본 발명의 인간화 2H7 CD20 결합 항체는 많은 악성 및 비악성 질병, 예를 들어 CD20-양성 암, 예를 들어 B 세포 림프종 및 백혈병, 및 자가면역 질환의 치료에 유용하다. 골수 내의 줄기 세포 (B-세포 전구세포)에는 CD20 항원이 결여되어, 건강한 B-세포가 치료 후에 재생되어 수개월 내에 정상 수준으로 회복된다. hu2H7.v511이 본 발명의 치료 방법에 사용되는 바람직한 항체이다.

CD20-양성 암은 세포 표면 상에 CD20을 발현하는 세포의 비정상적 증식을 포함하는 것이다. CD20-양성 B 세포 신생물은 CD20-양성 호지킨병, 예를 들어 림프구 우세형 호지킨병 (LPHD); 비-호지킨 림프종 (NHL); 여포 중심 세포 (FCC) 림프종; 급성 림프구성 백혈병 (ALL); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 유모세포 백혈병을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "비-호지킨 림프종" 또는 "NHL"은 호지킨 림프종 이외의 림프계의 암을 의미한다. 호지킨 림프종은 일반적으로 호지킨 림프종에 Reed-Sternberg 세포가 존재하고 비-호지킨 림프종에 상기 세포가 존재하지 않는다는 사실에 의해 비-호지킨 림프종과 구별될 수 있다. 본원에서 사용되는 상기 용어에 포함되는 비-호지킨 림프종의 예는 당업계에 공지된 분류 방식, 예를 들어 문헌 [Color Atlas of Clinical Hematology (3rd edition), A. Victor Hoffbrand and John E. Pettit (eds.) (Harcourt Publishers Ltd., 2000)]에 기재된 Revised European-American Lymphoma (REAL) 방식에 따라 당업자 (예를 들어, 종양의 또는 병리학자)에 의해 확인되는 임의의 림프종을 포함한다. 특히, 도 11.57, 11.58 및 11.59에서 목록을 참조한다. 보다 구체적인 예는 재발된 또는 불응성 NHL, 전선 (front line) 저등급 NHL, 단계 III/IV NHL, 화학요법 내성 NHL, 전구체 B 림프모구 백혈병 및/또는 림프종, 소림프구성 림프종, B 세포 만성 림프구성 백혈병 및/또는 전림프구성 백혈병 및/또는 소림프구성 림프종, B-세포 전림프구성 림프종, 면역종 및/또는 림프형질 세포성 림프종, 림프형질 세포성 림프종, 변연대 B 세포 림프종, 비장 변연대 림프종, 림프절외 변연대 - MALT 림프종, 림프절 변연대 림프종, 유모세포 백혈병, 형질 세포종 및/또는 형질 세포 골수종, 저등급/여포성 림프종, 중등급/여포성 NHL, 외투세포 림프종, 여포 중심 림프종 (여포성), 중등급 미만성 NHL, 미만성 대 B-세포 림프종, 침습성 NHL (침습성 전선 NHL 및 침습성 재발된 NHL), 자가 줄기세포 이식 후에 재발된 또는 이식에 불응성인 NHL, 원발성 종격 대 B-세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 고등급 림프모세포성 NHL, 고등급 림프모구 NHL, 고등급 비분해 소세포 (small non-cleaved cell) NHL, 벌키한 (bulky) 질병 NHL, 버킷트 (Burkitt) 림프종, 전구체 (말초) 대과립 림프구성 백혈병, 균상식육종 및/또는 세자리 (Sezary) 증후군, 피부 (cutaneous) 림프종, 큰세포 역형성 림프종, 혈관중심성 림프종을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

특정 실시태양에서, 인간화 CD20 결합 항체 및 그의 기능적 단편은 비-호지킨 림프종 (NHL), 림프구 우세형 호지킨병 (LPHD), 소림프구성 림프종 (SLL), 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 및 상기 질환의 재발의 치료에 사용된다.

무통성 림프종은 환자가 평균적으로 오랜 기간의 완화 및 재발 후에 6년 내지 10년 생존하는 서서히 진행되는 난치성 질병이다. 한 실시태양에서, 인간화 CD20 결합 항체 또는 그의 기능적 단편은 재발된 무통성 NHL 및 리툭시맙-불응성 무통성 NHL을 포함하는 무통성 NHL의 치료에 사용된다. 재발된 무통성 NHL 환자는 리툭시맙을 이전에 1회 투여받고 6개월을 초과하여 반응을 보인 리툭시맙 반응자일 수 있다.

본 발명의 인간화 2H7 항체 또는 그의 기능적 단편은 예를 들어 재발된 또는 불응성 저등급 또는 여포성, CD20-양성, B-세포 NHL에 대한 단제 처리 (단제요법)로서 유용하거나, 또는 다중 약물 요법에서 다른 약물과 함께 환자에 투여될 수 있다.

본 발명의 인간화 2H7 항체 또는 기능적 단편은 일차 요법 (front-line therapy)으로서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 리툭시맙 (제넨테크); 오크렐리주맙 (제넨테크, 인크.); 이브리투모맙 티욱세탄 (Zevalin™, 바이오겐 아이디 (Biogen Idee)); 토시투모맙 (Bexxar™, 글락소스미스클라인); HuMAX-CD20™ (겐맙); IMMU-106 (hA20 또는 90Y-hLL2로도 알려진 인간화 항-CD20, 이뮤노메딕스); AME-133 (어플라이드 몰레큘라 이벌루션 (Applied Molecular Evolution)/일라이 릴리 (Eli Lilly)); 겐투주맙 오조가마이신 (Mylotarg™, 인간화 항-CD33 항체, 와이어쓰 (Wyeth)/PDL); 알렘투주맙 (Campath™, 항-CD52 항체, 쉐링 플로 (Schering Plough)/겐자임 (Genzyme)); 에프라투주맙 (IMMU-103™, 인간화 항-CD22 항체, 이뮤노메딕스) 중의 임의의 하나의 약물을 사용한 치료에 비반응성이거나 부적합한 반응을 보이거나 상기 약물을 사용한 치료 후에 재발되는 CD20-양성 B 세포 신생물 환자를 치료하기 위한 상기 항체의 용도를 포함한다.

본 발명은 추가로 플루다라빈 요법으로 실패한 환자를 포함하여 CLL 환자를 본 발명의 인간화 2H7 항체로, 특정 실시태양에서 2H7.v511 및 2H7.v114로 치료하는 방법을 제공한다.

본원에서 사용되는 "자가면역 질환"은 개체의 자기 자신의 조직 또는 동시 분리계 (co-segregate)로부터 자기 조직에 대해 발생하는 비악성 질병 또는 질환 또는 그의 증상 또는 그로부터 발생하는 병태이다. 자가면역 질환 또는 질환의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 관절염 (류마티스 관절염, 예를 들어 급성 관절염, 만성 류마티스 관절염, 통풍 관절염, 급성 통풍 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 감염성 관절염, 라임 (Lyme) 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 척추 관절염, 및 연소성 발병 류마티스 관절염, 골관절염, 만성 프로그레디엔테 (chronica progrediente) 관절염, 변형 관절염, 만성 원발성 (chronica primaria) 다발관절염, 반응성 관절염, 및 강직 척추염), 염증성 과다증식성 피부병, 건선, 예를 들어 반상 건선, 물방울 모양 (gutatte) 건선, 농포성 건선, 및 손톱 건선, 아토피, 예를 들어 아토피성 질병, 예를 들어 고초열 및 욥 (Job) 증후군, 피부염, 예를 들어 접촉 피부염, 만성 접촉 피부염, 알레르기 피부염, 알레르기 접촉 피부염, 포진피부염, 및 아토피 피부염, x-연결 과다 IgM 증후군, 두드러기, 예를 들어 만성 알레르기 두드러기 및 만성 특발성 두드러기, 예를 들어 만성 자가면역 두드러기, 다발근육염/피부근염, 연소성 피부근염, 독성 표피괴사, 공피증 (전신성 공피증 포함), 경화증, 예를 들어 전신성 경화증, 다발성 경화증 (MS), 예를 들어 척수-눈 (spino-optical) MS, 원발성 진행성 MS (PPMS), 및 재발 완화형 MS (RRMS), 진행성 전신성 경화증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 범발성 경화증, 및 실조성 경화증, 염증성 장 질환 (IBD) (예를 들어, 크론병, 자가면역-매개 위장관 질환, 대장염, 예를 들어 궤양성 대장염, 궤양성 대장염, 현미경적 대장염, 교원질성 대장염, 용종 대장염, 괴사소장대장염, 및 경벽성 대장염, 및 자가면역 염증성 장 질환), 괴저농피증, 결절홍반, 원발성 경화쓸개관염, 상공막염), 호흡 곤란 증후군, 예를 들어 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 수막염, 포도막의 전부 또는 일부의 염증, 홍채염, 맥락막염, 자가면역 혈액학적 질환, 류마티스 척추염, 급성 난청, IgE-매개 질환, 예를 들어 과민증 및 알레르기 및 아토피 비염, 뇌염, 예를 들어 랏무센 (Rasmussen) 뇌염 및 변연 및/또는 뇌간 뇌염, 포도막염, 예를 들어 앞포도막염, 급성 앞포도막염, 육아종성 포도막염, 비육아종성 포도막염, 수정체항원성 (phacoantigenic) 포도막염, 뒤포도막염, 또는 자가면역 포도막염, 신 증후군이 있거나 없는 사구체신염 (GN), 예를 들어 만성 또는 급성 사구체신염, 예를 들어 원발성 GN, 면역 매개 GN, 막 GN (막 신병증), 특발성 막 GN 또는 특발성 막 신병증, 막- 또는 막 증식성 GN (MPGN), 예를 들어 타입 I 및 타입 II, 및 급속 진행성 GN, 알레르기 질환 및 반응, 알레르기 반응, 습진, 예를 들어 알레르기 또는 아토피 습진, 천식, 예를 들어 기관지성 천식 (asthma bronchiale), 기관지 천식, 및 자가면역 천석, T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응, 외래 항원, 예를 들어 임신 동안 태아 A-B-O 혈액형에 대한 면역 반응을 수반하는 질환, 만성 폐 염증성 질환, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍, 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 전신 홍반성 에리테마토데스 (erythematodes), 예를 들어 피부 SLE, 아급성 피부 홍반 루푸스, 신생아 루푸스 증후군 (NLE), 파종상 홍반성 루푸스, 루푸스 (예를 들어 신장염, 뇌염, 소아, 비-신장, 신장외, 원반상 탈모증), 연소성 발병 (타입 I) 진성 당뇨병, 예를 들어 소아 인슐린-의존형 진성 당뇨병 (IDDM), 성인 발병 진성 당뇨병 (타입 II 당뇨병), 자가면역 당뇨병, 특발성 요붕증, 시토킨 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 관련된 면역 반응, 결핵, 사코이드증, 육아종증, 예를 들어 림프종모양 육아종증, 베게너 육아종증, 무과립구증, 혈관염, 예를 들어 맥관염 (예를 들어 대혈관 맥관염 (예를 들어 류마티스성 다발성 근육통 및 거대세포 (Takayasu's) 동맥염), 중형 혈관 맥관염 (예를 들어 가와사키 (Kawasaki) 병 및 다발성 결절 동맥염/결절동맥주위염), 현미경적 다발성 동맥염, CNS 맥관염, 괴사, 피부, 또는 과민성 맥관염, 전신성 괴사 맥관염, 및 ANCA-관련 맥관염, 예를 들어 처크-스트라우스 (Churg-Strauss) 맥관염 또는 증후군 (CSS)), 일시적 동맥염, 재생불량 빈혈, 자가면역 재생불량 빈혈, 쿰즈 (Coombs) 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 (Diamond Blackfan) 빈혈, 용혈 빈혈 또는 면역 용혈 빈혈 예를 들어 자가면역 용혈 빈혈 (AIHA), 악성 빈혈 (anemia perniciosa), 애디슨 (Addison)병, 진정 적혈구계 빈혈 또는 무형성 (PRCA), 팩터 VIII 결핍증, A형 혈우병, 자가면역 호중구 감소증, 범혈구감소증, 백혈구 감소증, 백혈구 혈구 누출을 수분하는 질병, CNS 염증성 질환, 다발성 장기 손상 증후군, 예를 들어 패혈증, 외상 또는 출혈에 2차적인 질환, 항원-항체 복합체 매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기 신경염, 베체트 (Bechet) 또는 베게트 (Behcet) 병, 캐슬만 (Castleman) 증후군, 굿파스쳐 (Goodpasture) 증후군, 레이나우드 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 (Stevens-Johnson) 증후군, 천포창, 예를 들어 낙엽상 천포창 및 피부 유천포창, 천포창 (심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 점막 유천포창 및 홍반 천포창 포함), 자가면역 다발성 내분비 장애, 라이터 (Reiter) 병 또는 증후군, 면역 복합체 신장염, 항체-매개 신장염, 시신경 척수염, 다발신경병증, 만성 신경병증, 예를 들어 IgM 다발신경병증 또는 IgM-매개 신경병증, 혈소판감소증 (예를 들어 심근경색 환자에 의해 발생), 예를 들어 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 수혈후 자반증 (PTP), 헤파린-유발 혈소판감소증, 및 자가면역 또는 면역-매개 혈소판감소증, 예를 들어 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 예를 들어 만성 또는 급성 ITP, 정소 및 난소의 자가면역 질환, 예를 들어 자가면역 고환염 및 난소염, 원발성 갑상선 기능 저하증, 부갑상선 기능 저하증, 자가면역 내분비 질환, 예를 들어 갑상선염 예를 들어 자가면역 갑상선염, 하시모토 (Hashimoto) 병, 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염), 또는 아급성 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 특발성 갑상선 기능 저하증, 그레이브 (Grave) 병, 다분비선 증후군, 예를 들어 자가면역 다분비선 증후군 (또는 다분비선 내분비병증 증후군), 부신생물 증후군, 예를 들어 신경학적 부신생물 증후군, 예를 들어 램버트-이튼 (Lambert-Eaton) 근무력증 증후군 또는 이튼-램버트 증후군, 근강직 증후군, 뇌척수염, 예를 들어 알레르기 뇌척수염 (encephalomyelitis allergica) 및 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE), 중증 근무력증, 예를 들어 흉선종-관련 중증 근무력증, 소뇌변성, 신경근강직증, 안진전 또는 안진전 근경련 증후군 (OMS), 및 감각 신경병증, 다소성 운동 신경병증, 쉬한 (Sheehan) 증후군, 자가면역 간염, 만성 간염, 루푸스양 간염, 거대세포 간염, 만성 활성 간염 또는 자가면역 만성 활성 간염, 림프양 간질 폐렴 (LIP), 폐쇄세기관지염 (비-이식) 대 NSIP, 길랑-바레 (Guillain-Barre) 증후군, 버거 (Berger) 병 (IgA 신장병증), 특발성 IgA 신장병증, 선상 IgA 피부병, 원발성 담관 경화증, 폐경화, 자가면역 장병증 증후군, 만성 소화장애증, 복강 질환, 비열대스프루 (글루텐 장병증), 불응성 스프루, 특발성 스프루, 한랭글로불린혈증, 근위축 측삭 경화증 (ALS; 루게릭 (Lou Gehrig) 병), 관상동맥 질환, 자가면역 귀 질환, 예를 들어 자가면역 내이 질환 (AIED), 자가면역 청력 상실, 안진전 근경련 증후군 (OMS), 다발연골염, 예를 들어 불응성 또는 재발된 다발연골염, 폐포단백증, 아밀로이드증, 공막염, 비-암성 림프구증가증, 모노클로날 B 세포 림프구증가증 (예를 들어, 양성 모노클로날 감마글로불린병증 및 유의성 비결정 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS))을 포함하는 원발성 림프구증가증, 말초 신경병증, 부신생물 증후군, 채널병증, 예를 들어 간질, 편두통, 부정맥, 근육 질환, 난청, 실명, 주기적 마비, 및 CNS의 채널병증, 자폐증, 염증성 근염, 국소 분절 사구체 경화증 (FSGS), 내분비 눈병증, 포도망막염, 맥락망막염, 자가면역 간질환, 섬유근육통, 다발성 내분비 부전, 슈미트 (Schmidt) 증후군, 부신염, 위 위축, 초로 치매, 탈수초성 질환, 예를 들어 자가면역 탈수초성 질환 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 당뇨성 신병증, 드레슬러 (Dressler) 증후군, 원형탈모증, CREST 증후군 (석회증, 레이나우드 (Raynaud) 현상, 식도 운동이상, 손발가락경화증, 및 모세혈관확장증), 남성 및 여성 자가면역 불임, 혼합결합조직병, 샤가스 (Chagas) 병, 류마티스열, 습관성 유산, 농부폐, 다형 홍반, 심장절개술후 증후군, 쿠싱 (Cushing) 증후군, 새 사육가 폐, 알레르기 육아종 혈관염, 양성 림프구 혈관염, 알포트 (Alport) 증후군, 폐포염, 예를 들어 알레르기 폐포염 및 섬유화 폐포염, 간질 폐 질환, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 리슈만편모충증, 키파노소미아시스 (kypanosomiasis), 주혈흡충증, 회충증, 아스페르길루스증, 샘퍼 (Sampter) 증후군, 카플란 (Caplan) 증후군, 뎅기, 심내막염, 심내막 심근섬유증, 미만성 간질성 폐섬유증, 간질 폐 섬유증, 폐섬유증, 특발성 폐섬유증, 낭성 섬유증, 안구내염, 장기 융기성 홍반, 태아적모구증, 호산구성 근막염, 슐만 (Shulman) 증후군, 펠티 (Felty) 증후군, 플라리아시스 (flariasis), 섬모체염, 예를 들어 만성 섬모체염, 이시성 섬모체염, 홍채섬모체염 (급성 또는 만성), 또는 푸크 (Fuch) 섬모체염, 헤노호-쉔라인 (Henoch-Schonlein) 자색반, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염, 에코바이러스 감염, 심근병증, 알츠하이머병, 파보바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 백신처리후 증후군, 선천 풍진 감염, 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스 감염, 볼거리, 에반 (Evan) 증후군, 자가면역 생식선 부전, 시덴함 무도병, 연쇄상구균 감염후 신장염, 폐쇄성 혈전혈관염 (thromboangitis ubiterans), 갑상선 기능 항진증, 척수매독, 맥락막염, 거대세포 다발근육통증, 내분비 눈병증, 만성 과민성 폐렴, 건조 각막결막염, 유행성 각막결막염, 특발성 신장염 증후군, 미소 병변 신병증, 양성 가족성 및 허혈-재관류 손상, 망막 자가면역, 관절 염증, 기관지염, 만성 폐쇄성 기도 질환, 규폐증, 아프타, 아프타 구내염, 동맥경화성 질환, 아스퍼미오게네스 (aspermiogenese), 자가면역 용혈, 뵈크 (Boeck) 병, 한랭글로불린혈증, 뒤피트렌 (Dupuytren) 구축, 수정체 과민 안내염 (endophthalmia phacoanaphylactica), 알레르기성 장염, 나병결절홍반, 특발성 안면마비, 만성 피로 증후군, 류마티스성 열, 함만-리치 (Hamman-Rich) 병, 감각신경성 난청, 발작성 혈색소뇨증, 성선 기능저하증, 국한성 회장염, 백혈구 감소증, 전염 단핵구증, 횡단척수염, 원발성 특발성 점액부종, 신장증, 교감성 안염, 육아종성 고환염, 췌장염, 급성 다발 신경근염, 괴저농피증, 쿼베인 (Quervain) 갑상선염, 후천성 비장 위축, 항정자 항체에 의한 불임, 비-악성 흉선종, 백반증, SCID 및 엡스타인-바 바이러스-연관 질환, 후천적 면역 결핍 증후군 (AIDS), 기생충 질환, 예를 들어 리슈만편모충, 독성 쇼크 증후군, 식중독, T 세포 침윤, 백혈구-부착 결핍, 시토킨 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 관련된 면역 반응을 수반하는 병태, 백혈구 혈구 누출을 수반하는 질병, 다발성 장기 손상 증후군, 항원-항체 복합체 매개 질환, 항사구체 기저막 질환, 알레르기 신경염, 자가면역 다발성 내분비 장애, 난소염, 원발성 점액부종, 자가면역 위축 위염, 교감성 안염, 류마티스병, 혼합결합조직 질병, 신 증후군, 췌도염, 다발성 내분비 부전, 말초 신경병증, 자가면역 다분비선 증후군 타입 I, 성인 발병 특발성 부갑상선 기능 저하증 (AOIH), 전체탈모증, 확장 심근병증, 후천적 수포성 표피박리증 (EBA), 혈색소침착증, 심근염, 신 증후군, 원발성 경화쓸개관염, 화농성 또는 비화농성 동염, 급성 또는 만성 동염, 사골, 전두, 상악, 또는 접형 동염, 호산구-관련 질환, 예를 들어 호산구 증가증, 폐 침윤 호산구 증가증, 호산구 증가증-근육통 증후군, 로플러 (Loffler) 증후군, 만성 호산구성 폐렴, 열대성 폐 호산구 증가증, 기관지폐렴성 아스페르길루스증, 아스페르길루스종, 또는 호산구를 포함하는 육아종, 과민증, 음성혈청 척추관절염, 다발성 내분비 자가면역 질환, 경화쓸개관염, 공막, 상공막, 만성 점막 피부 칸디다증, 브루톤 (Bruton) 증후군, 유아의 일과성 감마글로불린저혈증, 위스코트-올드리히 (Wiskott-Aldrich) 증후군, 운동실조 모세혈관확장증, 교원병과 연관된 자가면역 질환, 류마티스, 신경학적 질환, 림프절염, 허혈 재관류 질환, 혈압 반응의 감소, 혈관 기능이상, 혈관확장증, 조직 손상, 심혈관 허혈, 통각과민, 뇌 허혈 및 혈관신생을 수반하는 질환, 알레르기 과민성 질환, 사구체신염, 재관류 손상, 심근 또는 다른 조직의 재관류 손상, 급성 염증성 성분을 갖는 피부병, 급성 화농성 수막염 또는 다른 중추신경계 염증성 질환, 안 및 안와 염증성 질환, 과립구 수혈-연관 증후군, 시토킨 유발 독성, 급성 중증 염증, 만성 난치성 염증, 신우염, 폐경화, 당뇨 망막병증, 당뇨성 대동맥 질환, 말단동맥 과다증식 (endarterial hyperplasia), 소화 궤양, 판막염 및 자궁내막증.

특정 실시태양에서, 인간화 2H7 항체 및 그의 기능적 단편은 류마티스 관절염 및 연소성 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 예를 들어 루푸스 신염, 베게너병, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 예를 들어 재발 완화형 MS, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발신경병증, 중증 근무력증, ANCA 관련 맥관염, 진성 당뇨병, 레이나우드 증후군, 쇼그렌 증후군, 시신경 척수염 (NMO) 및 사구체신염의 치료에 사용된다.

"치료하는" 또는 "치료" 또는 "완화"는 목적하는 병리학적 상태 또는 질환을 치료하지 않거나 상태의 재발을 억제하지 않으면 대상이 무기력해지는 (약해지는) 치료적 처리를 의미한다. 대상은 본 발명의 방법에 따라 치료량의 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체를 투여한 후에 대상이 특정 질환의 하나 이상의 징후 및 증상의 관찰가능한 및/또는 측정가능한 감소 또는 부재, 예를 들어 암세포 수의 유의한 감소 또는 부재; 종양 크기의 감소; 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 느린, 바람직하게는 정지된); 종양 성장의 일정 수준의 억제; 완화 기간의 증가 및/또는 특정 암과 연관된 하나 이상의 증상의 일정 정도의 구제; 이환율 및 치사율의 감소 및 삶의 질의 개선을 보이면, 자가면역 질환 또는 CD20-양성 B 세포 악성종양에 대해 성공적으로 "치료된" 것이다. 또한, 질병의 징후 또는 증상의 감소는 환자가 느낄 수도 있다. 치료는 암의 모든 징후의 소멸로 규정되는 완전 반응, 또는 종양의 크기가 바람직하게는 50％ 초과로, 보다 바람직하게는 75％까지 감소되는 부분 반응을 달성할 수 있다. 환자는 또한 환자가 안정한 질병을 경험할 경우 치료된 것으로 간주된다. 한 기준에서, 본 발명의 h2H7 항체는 95％ 초과의 말초혈 B 세포 고갈 및 기저선의 25％까지의 B 세포 회복을 달성한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체를 사용한 치료는 치료 4개월 후, 바람직하게는 6개월 후, 보다 바람직하게는 1년 후, 훨씬 더 바람직하게는 2년 이상 후에 암 환자가 암 진행이 발생하지 않을 정도로 효과적이다. 질병의 성공적인 치료 및 개선을 평가하기 위한 상기 파라미터는 당업계의 숙련의에게 잘 알려진 통상적인 과정에 의해 쉽게 측정할 수 있다.

"치료 유효량"은 대상에서 질병 또는 질환의 "치료"에 효과적인 항체 또는 약물의 양을 나타낸다. 암의 경우, 치료 유효량의 약물은 암 세포수의 감소; 종양 크기의 감소; 주변 장기로의 암 세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도의 감소, 바람직하게는 중지); 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도의 감소, 바람직하게는 중지); 어느 정도 종양 성장의 억제 및/또는 암과 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도의 경감의 효과를 달성할 수 있다. "치료"의 상기 정의를 참조한다. 자가면역 질환의 경우에, 치료 유효량의 항체 또는 다른 약물은 질병의 징후 및 증상의 경감에 효과적이다.

신생물 치료 효능 또는 성공도를 평가하기 위한 파라미터는 적합한 질병의 숙련의에게 공지되어 있을 것이다. 일반적으로, 숙련의는 특정 질병의 징후 및 증상의 감소를 조사할 것이다. 파라미터는 질병 진행 개시까지 걸린 정중 시간 (median time), 완화 시간, 안정한 질병을 포함한다.

다음 참고문헌은 림프종 및 CLL, 그의 진단, 치료 및 치료 효능을 평가하기 위한 표준 의학 절차를 설명하고 있다 (Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1998; van Besien K and Cabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Chap. 70, pp 1293-1338, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al., (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000; 및 Rai, K and Patel, D:Chronic Lymphocytic Leukemia, Chap. 72, pp 1350-1362, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al., (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000).

자가면역 또는 자가면역 관련 질병 치료의 효능 또는 성공도를 평가하기 위한 파라미터는 적합한 질병의 숙련의에게 공지되어 있을 것이다. 일반적으로, 숙련의는 특정 질병의 징후 및 증상의 감소를 조사할 것이다. 다음은 예로서 제시된다.

한 실시태양에서, 인간화 2H7 항체 및 구체적으로 hu2H7.v511 및 그의 기능적 단편이 류마티스 관절염을 치료하기 위해 사용된다.

RA는 2백만명 이상의 미국인이 이환되는, 환자를 약하게 만드는 자가면역 질환이고, 환자의 일상적인 활동을 방해한다. RA는 신체 자체의 면역계가 관절 조직을 부적절하게 공격하여 건강한 조직을 파괴하는 만성 염증 및 관절 내의 손상을 야기할 때 발생한다. 증상은 관절 염증, 붓기, 경직 및 통증을 포함한다. 추가로, RA는 전신성 질환이기 때문에, 다른 조직, 예를 들어 폐, 눈 및 골수에 영향을 줄 수 있다. 현재 치료법은 알려져 있지 않은 상태이다. 환자에 대한 치료는 다양한 스테로이드성 및 비-스테로이드성 소염약, 면역억제제, 질환 변형성 항-류마티스 약물 (DMARD) 및 생물학제를 포함한다. 그러나, 많은 환자가 치료에 대한 부적합 반응을 계속 보인다.

항체는 초기 RA 환자에서 제1선 요법으로서 (즉, 메토트렉세이트 (MTX) 미투여 (naive)) 및 단제요법으로, 또는 예를 들어 MTX 또는 시클로포스파미드와 조합하거나 이들 투여 후에 사용될 수 있다. 또는, 항체는 DMARD 및/또는 MTX 불응성인 환자에 대한 제2선 치료로서 및 단제요법으로서 또는 예를 들어 MTX와 조합하여 사용될 수 있다. 인간화 CD20 결합 항체는 RA에서 관절 손상을 방지 및 억제하고 구조적 손상을 지연시키고 염증 관련 통증을 감소시키고 중등도 내지 중증 RA에서 일반적으로 징후 및 증상을 감소시키는데 유용하다. RA 환자는 RA 치료시에 사용된 다른 약물을 사용한 치료 전, 치료 후 또는 치료와 함께 인간화 CD20 항체로 치료될 수 있다 (하기 조합 요법 참조). 한 실시태양에서, 이전에 질환 변형성 항류마티스 약물 치료가 실패하고/하거나 및/또는 메토트렉세이트 단독에 대해 부적합 반응을 보인 ㅎ호환자가 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체로 치료된다. 상기 치료의 한 실시태양에서, 환자는 인간화 CD20 결합 항체 단독 (제1일 및 제15일에 Ig i.v. 주입); CD20 결합 항체 + 시클로포스파미드 (제3일 및 제17일에 750 mg i.v. 주입); 또는 CD20 결합 항체 + 메토트렉세이트를 투여하는 17일 치료 요법으로 치료된다.

신체는 RA 동안 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)를 생성시키기 때문에, TNFα 억제제가 상기 질병 치료를 위해 사용되어 왔다. 그러나, TNFα 억제제, 예를 들어 에타네르셉트 (ENBREL(등록상표)), 인플릭시맙 (REMICADE(등록상표)) 및 아달리무맙 (HUMIRA™)은 유해한 부작용, 예를 들어 감염, 심장 부전 및 탈수초화를 야기할 수 있다. 따라서, 한 실시태양에서, 인간화 CD20 결합 항체 또는 그의 생물학적 기능적 단편은, TNFα 억제제 약물에 의한 상기 유해한 부작용의 위험을 감소시키기 위해 RA 환자를 치료하거나, 독성, 예를 들어 심장 독성을 경험하기 쉬운 것으로 간주되는 환자를 치료하기 위한, 예를 들어 제1선 치료로서 유용하다. 인간화 CD20 결합 항체 또는 그의 생물학적 기능적 단편은 또한 TNFα-억제제로 처리하였지만 TNFα-억제제에 비반응성이거나 부적합 반응을 보이거나 (TNF-IR 환자), 또는 일정 시간의 반응 후에 질병이 재발하거나 TNFα-억제제를 사용한 치료에 대해 반응하지 않을 것으로 결정된 RA에 걸린 대상을 치료하는 방법에서 유용하다. 한 실시태양에서, TNF-IR은 TNFα 억제제로 처리하기 전에 저 용량, 예를 들어 100 mg 미만으로 치료된다.

RA에서 치료 효능을 평가하는 하나의 방법은 무엇보다도 압통이 있고 부은 관절의 개선 비율을 측정하는 American College of Rheumatology (ACR) 기준을 기초로 한다. RA 환자는 예를 들어 항체 비처리시 (예를 들어, 처리 전의 기저선) 또는 위약 처리와 비교하여 ACR 20 (20％ 개선)에 대해 점수를 매길 수 있다. 항체 치료의 효능을 평가하기 위한 다른 방식은 X-선 스코어링 (scoring), 예를 들어 구조적 손상, 예를 들어 골 침식 및 관절강 협착을 스코어링하기 위해 사용되는 Sharp X-선 스코어를 포함한다. 환자를 또한 처리 동안의 시점에 또는 처리 후에 Health Assessment Questionnaire [HAQ] 스코어, AIMS 스코어, SF-36을 기초로 하여 장애의 예방 또는 개선에 대해 평가할 수 있다. ACR 20 기준은 압통 (통증이 있는) 관절 카운트 (count) 및 부은 관절 카운트 모두의 20％ 개선 + 다음 5개의 추가의 측정 중 적어도 3개에서 20％ 개선을 포함할 수 있다:

1. 시각 상사 척도 (VAS)에 의한 환자의 통증 평가,

2. 질병 활성 (VAS)에 대한 환자의 전반적인 평가,

3. 질병 활성 (VAS)에 대한 의사의 전반적인 평가,

4. Health Assessment Questionnaire에 의해 평가된 환자의 장애에 대한 자가평가, 및

5. 급성상 반응물, CRP 또는 ESR.

ACR 50 및 70은 유사하게 정의된다. 바람직하게는, 환자에게 적어도 ACR 20, 바람직하게는 적어도 ACR 30, 보다 바람직하게는 적어도 ACR 50, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 ACR 70, 가장 바람직하게는 적어도 ACR 75 이상의 스코어를 달성하기에 효과적인 양의 본 발명의 CD20 결합 항체가 투여된다.

건선성 관절염은 독특하고 구별되는 방사선 촬영 특징을 갖는다. 건선성 관절염에 대해, 관절 침식 및 관절강 협착을 Sharp 스코어에 의해 또한 평가할 수 있다. 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체는 관절 손상을 억제하고 질환의 징후 및 증상을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 질환에 걸린 대상에게 치료 유효량의 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체를 투여함으로써 SLE 또는 루푸스 신염을 치료하는 방법이다. SLEDAI 스코어는 질병 활성의 수치 계량화를 제공한다. SLEDAI는 질병 활성과 관련이 있는 것으로 알려진 24개의 임상 및 실험 파라미터의 가중 지수로서, 그 수치 범위는 0-103이다 (Bryan Gescuk ＆ John Davis, "Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus" in Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521 참조). 다른 스코어링 방법은 BILAG 스코어링을 포함한다. 이중쇄 DNA에 대한 항체는 신장 발적 및 루푸스의 다른 증상을 야기하는 것으로 생각된다. 항체 치료를 받는 환자를 혈청 크레아티닌, 뇨 단백질 또는 소변 중의 혈액의 유의한 재현가능한 증가로서 규정되는 신장 발적까지 소요되는 시간에 대해 모니터링할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 환자는 항핵 항체 및 이중쇄 DNA에 대한 항체의 수준에 대해 모니터링할 수 있다. SLE에 대한 치료는 고용량 코르티코스테로이드 및/또는 시클로포스파미드 (HDCC)를 포함한다. 본원에서, 루푸스의 성공적인 치료는 발적을 감소시킬 것이다. 즉, 심도 및/또는 다음 발적시까지 걸리는 시간을 감소시킬 것이다.

척추관절병증은 일군의 관절 질환, 예를 들어 강직 척추염, 건선성 관절염 및 크론병이다. 치료 성공은 환자 및 의사의 전반적인 평가를 측정하는 인증된 수단에 이해 측정할 수 있다.

맥관염에 관련하여, 약 75％의 전신성 혈관염 환자가 항-호중구 세포질 항체를 갖고, 소/중 크기의 혈관에 영향을 주는 3개의 병태, 즉 베게너 육아종증 (WG), 현미경적 다발성 혈관염 (MPA) 및 집합적으로 ANCA 관련 맥관염 (AAV)으로 공지된 처크 스트라우스 (Churg Strauss) 증후군 (CSS)으로 분류된다.

건선에 대한 치료 효능은 의사의 전반적인 평가 (PGA) 변화 및 건선 영역 및 심도 지수 (PASI) 스코어, 건선 증상 평가 (PSA)를 포함하여 기저선 상태와 비교시 질병의 임상 징후 및 증상의 변화를 모니터링함으로써 평가된다. 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체, 예를 들어 hu2H7.v511로 치료된 건선 환자는 특정 시점에서 경험한 가려움 정도를 나타내기 위해 사용되는 시각 상사 척도로 치료 전반에 걸쳐 주기적으로 측정할 수 있다.

환자는 치료 항체의 제1 주입시에 주입 반응 또는 주입-관련 증상을 경험할 수 있다. 이러한 증상은 심도가 상이하고, 일반적으로 의료적 처치로 회복될 수 있다. 이들 증상은 감기와 유사한 열, 오한/경직, 메스꺼움, 두드러기, 두통, 기관지 연축, 혈관부종을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 질병 치료 방법은 주입 반응을 최소화하는 것이 바람직할 것이다. 상기 불리한 사건을 완화시키거나 최소화하기 위해, 환자에게 항체의 초기 조건화 또는 관용화 용량(들), 이어서 치료 유효 용량을 투여할 수 있다. 조건화 용량(들)은 환자가 보다 고 투여량에 관용성이 되도록 조건화하기 위해 치료 유효 용량보다 더 낮을 것이다.

투약

해당 분야의 숙련의가 잘 알고 있는 치료할 적응증 및 투약에 관련된 요인에 따라, 본 발명의 항체는 독성 및 부작용을 최소화하면서 상기 적응증의 치료에 효과적인 투여량으로 투여될 것이다. 요구되는 투여량은 질병 및 질병의 심도, 질병의 단계, 요구되는 B 세포 조절 수준, 및 당업계의 숙련의가 잘 알고 있는 다른 요인에 따라 결정될 수 있다.

자가면역 질환의 치료를 위해, 인간화 2H7 항체의 투여량을 조정함으로써 질병 및/또는 개별 환자의 병태의 심도에 따라 B 세포 고갈 정도를 조절하는 것이 바람직할 수 있다. B 세포 고갈은 완전할 수 있지만, 완전할 필요는 없다. 또는, 총 B 세포 고갈이 초기 치료에서 바람직할 수 있지만, 후속적인 치료에서, 투여량은 부분적 고갈만을 달성하도록 조정될 수 있다. 한 실시태양에서, B 세포 고갈은 적어도 20％이고, 즉, 처리 전의 기저선 수준에 비해 80％ 이하의 CD20-양성 B 세포가 남아있다. 다른 실시태양에서, B 세포 고갈은 25％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％ 또는 그 이상이다. 바람직하게는, B 세포 고갈은 질병의 진행 정지, 보다 바람직하게는 치료 시에 특정 질환의 징후 및 증상의 완화, 훨씬 더 바람직하게는 질병 치유를 위해 충분한 수준이다.

제넨테크 및 바이오겐 아이디 임상 조사는 10 mg의 낮은 용량으로부터 1 g까지의 용량을 사용하여 자가면역 질환의 치료의 치료 효과를 평가하였다 (리툭시맙 연구에 대한 배경 섹션; 및 WO 04/056312, 실시예 16 참조). 일반적으로, 항체는 상기 임상 조사에서 약 2주의 시간 간격으로 2회의 용량으로 투여되었다. 임상 조사에서 연구된 요법의 예는 류마티스 관절염에서 인간화 CD20 항체 2H7.v16에 대해 2 x 10 mg (투여당 1O mg의 2 용량을 의미함; 70 kg, 67 인치의 키가 큰 환자에 대한 총 투여량 ~10.1 mg/m²), 2 x 50 mg (70 kg, 67 인치의 키가 큰 환자에 대한 총 투여량 55 mg/m²), 2 x 200 mg (70 kg, 67 인치의 키가 큰 환자에 대한 총 투여량 220 mg/m²), 2 x 500 mg (70 kg, 67 인치의 키가 큰 환자에 대한 총 투여량 ~550 mg/m²) 및 2 x 1000 mg (70 kg, 67 인치의 키가 큰 환자에 대한 총 투여량 ~1100 mg/m²); Rituxan에 대해 2 x 500 mg (70 kg, 67 인치의 키가 큰 환자에 대한 총 투여량 ~550 mg/m²), 2 x 1000 mg (70 kg, 67 인치의 키가 큰 환자에 대한 총 투여량 ~1100 mg/m²)을 포함한다. 각각의 상기 용량에서, 제1 용량의 항체 투여 후에 순환 B-림프구의 실질적인 고갈이 관찰되었다. 현재, 단일 또는 이중 정맥내 주입으로서 1O mg 내지 2000 mg의 용량이 조사되었다.

자가면역 질환 환자에서 자가면역 질환의 치료 및 B 세포 고갈을 위한 본 발명의 방법에서, 한 실시태양에서, 환자에게 O.1 mg 내지 1000 mg의 균일 용량의 인간화 2H7.v511 항체가 투여된다. 본 발명자들은 300 mg 미만, 심지어 10 mg의 균일 용량에서, 실질적인 B 세포 고갈이 달성됨을 밝혀내었다. 따라서, 상기 B 세포 고갈 및 상이한 실시태양에서의 치료 방법에서, hu2H7.v511 항체는 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 또는 250 mg의 투여량으로 투여된다. 부분 또는 단기 B 세포 고갈이 목적일 경우에는, 보다 낮은 투여량, 예를 들어 20 mg, 10 mg 또는 그 미만이 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 상기 투여량 및 투약 요법이 류마티스 관절염 (RA) 치료에 사용된다.

CD20-양성 암 치료를 위해, 본 발명의 항-CD20 항체의 표적인 B 세포의 고갈을 최대화하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, CD20-양성 B 세포 신생물의 치료를 위해, B 세포 고갈은 예를 들어 종양 성장 (크기), 암성 세포 종류의 증식, 전이, 특정 암의 다른 징후 및 증상을 모니터링함으로써 당업계의 숙련에 의해 평가될 수 있는 질병의 진행을 적어도 억제할 정도로 충분한 것이 바람직하다. 바람직하게는, B 세포 고갈은 질병의 진행을 적어도 2개월, 보다 바람직하게는 3개월, 훨씬 더 바람직하게는 4개월, 보다 바람직하게는 5개월, 훨씬 더 바람직하게는 6개월 이상 억제할 정도이면 충분하다. 훨씬 더 바람직한 실시태양에서, B 세포 고갈은 완화 시간을 적어도 6개월, 보다 바람직하게는 9개월, 보다 바람직하게는 1년, 보다 바람직하게는 2년, 보다 바람직하게는 3년, 훨씬 더 바람직하게는 5년 이상으로 증가시키면 충분하다. 가장 바람직한 실시태양에서, B 세포 고갈은 질병을 치유할 정도이면 충분하다. 바람직한 실시태양에서, 암 환자에서 B 세포 고갈은 처리 전의 기저선 수준의 적어도 약 75％ , 보다 바람직하게는 80％, 85％, 90％, 95％, 99％ 및 심지어 100％이다.

NHL의 치료에서 임상 시험을 위한, v16 및 v511을 포함하는 hu2H7 항체의 투약 요법 및 투여량의 예는 하기 실험 실시예 18-20에서 설명된다.

50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350 mg/투여의 투여량도 B 세포 악성 종양, 예를 들어 NHL에 대한 유지 요법에 사용될 수 있다.

투약 빈도는 몇몇 인자에 따라 변할 수 있다. 일반적으로, 환자에게 일반적으로 적어도 2회 용량의 인간화 2H7 CD20 결합 항체가 투여될 것이고, 상이한 실시태양에서 2-4회, 2-8회, 2-10회 용량이 투여될 수 있다. 일반적으로, 2회 용량은 1개월 내에, 일반적으로 1, 2 또는 3주 간격으로 투여된다. 종양에 대한 한 치료 요법에서, 투여량 200 mg/m² 내지 750 mg/m²의 8회의 i.v. 주입이 고려된다. RA에 대한 한 투약 요법에서, 환자에게 6개월마다 500 mg의 인간화 항체, 예를 들어 v16, v114 또는 v511이 2회 투여된다. RA에 대한 다른 투약 요법은 9개월마다 1000 mg의 2회 투여이다. RA에 대한 v16, v114 또는 v511을 사용한 제3의 투약 요법은 6개월마다 10 mg의 2회 투여이다. 질병 또는 재발의 개선 수준에 따라, 추가의 투여량이 질병 진행에 걸쳐 또는 질병 유지 요법으로서 투여될 수 있다.

하나 이상의 현존하는 요법이 무효하거나, 관용성이 불량하거나, 금지된 자가면역 질환 또는 B 세포 악성종양 환자는 임의의 본 발명의 투약 요법을 이용하여 치료될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 종양 괴사 인자 (TNF) 억제제 요법 또는 질환 변형성 항-류마티스약 (DMARD) 요법에 대해 부적합 반응을 보인 RA 환자에 대한 본 발명의 치료 방법의 적용을 고려한다.

"만성" 투여는 급성 방식과 달리 연장된 기간 동안 초기 치료 효과 (활성)를 유지하기 위해 연속적인 방식으로 물질(들)을 투여하는 것을 의미한다. "간헐적" 투여는 중단없이 연속적으로 행해지지 않지만 특성상 주기적인 치료이다.

투여 경로

인간화 2H7 항체는 공지의 방법에 따라, 예를 들어 정맥내 투여, 예를 들어 볼러스로서 또는 일정 시간에 걸친 연속 주입, 피하, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 관절내, 윤활막내, 경막내, 또는 흡입 경로, 일반적으로 정맥내 또는 피하 투여에 의해 인간 환자에게 투여된다.

일반적으로, 종양학 적응증을 위해, 인간화 2H7 항체 제제는 정맥내 경로에 의해, 예를 들어 주입에 의해 투여된다. 한 실시태양에서, 인간화 2H7 항체는 주입 비히클로서 0.9％ 염화나트륨 용액을 사용하여 정맥내 주입에 의해 투여된다. 항체 제제는 류마티스 관절염의 I/II상 임상 시험에서 정맥내 주입을 통해 투여된다 (실시예 20 참조).

다른 실시태양에서, 인간화 2H7 항체는 특히 피하 주사로 투여된다.

조합 요법

상기한 B 세포 신생물 치료시에, 환자는 다중약물 요법에서 하나 이상의 치료제, 예를 들어 화학요법제와 함께 본 발명의 인간화 2H7 항체로 치료될 수 있다. 인간화 2H7 항체는 화학요법제와 동시에, 순차적으로 또는 교대로, 또는 다른 요법에 대한 비반응 후에 투여될 수 있다. 림프종 치료를 위한 표준 화학요법제는 시클로포스파미드, 시타라빈, 멜팔란 및 미토잔트론 + 멜팔란을 포함할 수 있다. CHOP는 비-호지킨 림프종 치료를 위한 가장 통상적인 화학요법 요법제이다. 다음은 CHOP 요법에 사용되는 약물이다: 시클로포스파미드 (브랜드명 시톡산, 네오사르); 아드리아마이신 (독소루비신/히드록시독소루비신); 빈크리스틴 (Oncovin); 및 프레드니솔론 (때때로 델타손 또는 오라손으로 불림). 특정 실시태양에서, CD20 결합 항체는 그를 필요로 하는 환자에게 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니솔론 중의 하나 이상의 화학요법제와 함께 투여된다. 특정 실시태양에서, 림프종 (예를 들어, 비-호지킨 림프종) 환자는 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손) 요법제와 함께 본 발명의 인간화 2H7 항체로 치료된다. 다른 실시태양에서, 암 환자는 CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴, 및 프레드니손) 화학요법제와 함께 본 발명의 인간화 2H7 CD20 결합 항체로 치료된다. 특정 실시태양에서, CD20-양성 NHL 환자에게 인간화 2H7.v511 또는 v114를 CVP와 함께, 예를 들어 8 사이클 동안 3주마다 투여한다. CLL 치료를 위한 특정 실시태양에서, hu2H7.v511 항체는 플루다라빈 및 시톡산 중의 하나 또는 둘 모두와 함께 투여된다.

"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 CYTOXAN(등록상표) (시클로스포스파미드); 알킬 술포네이트, 예를 들어 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민; TLK 286 (TELCYTA™); 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, MARINOL(등록상표)); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프포테신 (합성 유사체 토포테칸 (HYCAMTIN(등록상표) 포함); CPT-11 (이리노테칸, CAMPTOSAR(등록상표)), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도제레신, 카르제레신 및 비제레신 합성 유사체 포함); 포도필로독소; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타이인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레틸아민 옥시드 염산염, 멜파란, 노벤비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트; 항생제, 예를 들어 에네디와인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가1I (예를 들어, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994) 참조) 및 안트라사이클린, 예를 들어 안나마이신, AD 32, 알카루비신, 다우노루비신, 덱스라족산, DX-52-1, 에피루비신, GPX-100, 이다루비신, KRN5500, 메노가릴; 다이네미신, 예를 들어 다이네미신 A; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 흡광단 (chromophore) 및 관련 크로모단백질 에네디와인 항생제 흡광단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우쓰라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN(등록상표) 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 리포좀성 독소루비신, 및 데옥시독소루비신 포함), 에소루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴 및 조루비신, 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 프테로프테린, 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플로스우리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄 및 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테치미드, 미토탄 및 트리로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 폴린산 (류코보린); 아세글라톤; 항-폴레이트 항-신생물제, 예를 들어 ALIMTA(등록상표), LY231514 페메트렉세드, 디히드로폴레이트 리덕타제 억제제, 예를 들어 메토트렉세이트, 항대사물질, 예를 들어 5-플루오로우라실 (5-FU) 및 그의 전구약물, 예를 들어 UFT, S-1 및 카페시타빈, 및 티미딜레이트 신타제 억제제 및 글리시나미드 리보뉴클레오티드 포르밀트랜스퍼라제 억제제, 예를 들어 랄티트렉세드 (TOMUDEX(등록상표), TDX); 디히드로피리미딘 데히드로게나제 억제제, 예를 들어 에닐우라실; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토잔트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소잔트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK(등록상표) 다당류 복합체 (제이에이치에스 내쳐럴 프로덕츠 (JHS Natural Products, 미국 오레곤주 유진)); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE(등록상표), FILDESIN(등록상표)); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드 및 탁산, 예를 들어 TAXOL(등록상표) (파클리탁셀, 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지 (Bristol-Myers Squibb Oncology, 미국 뉴저지주 프린스톤)), ABRAXANE™ (파클리탁셀의 크로모포르 부재 알부민-처리된 나노입자 제제 (아메리칸 파마슈티칼 파트너즈, 미국 일리노이주 샤움버그)) 및 TAXOTERE(등록상표) (독세탁셀, 롱-쁘랑 로러 (Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니)); 클로람부실; 겜시타빈 (GEMZAR(등록상표)); 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금; 백금 유사체 또는 백금계 유사체, 예를 들어 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN(등록상표)); 에토포사이드 (VP-16); 이포스파미드; 미토잔트론; 빈크리스틴 (ONCOVIN(등록상표)); 빈카 알칼로이드; 비노렐빈 (NAVELBINE(등록상표)); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노산; 및 상기 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 상기 물질의 2 이상의 조합물, 예를 들어 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법의 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (ELOXATIN™)을 사용한 치료 요법의 약어인 FOLFOX를 포함한다.

또한, 상기 정의에는 종양에 대해 작용하는 호르몬을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들어 항에스트로겐, 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (NOLVADEX(등록상표) 타목시펜 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 FARESTON(등록상표) 토레미펜; 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소인 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE(등록상표) 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN(등록상표) 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, RIVISOR(등록상표) 보로졸, FEMARA(등록상표) 레트로졸, 및 ARIMIDEX(등록상표) 아나스트로졸; 및 항안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 관련되는 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예를 들어 유전자 치료 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN(등록상표) 백신, LEUVECTIN(등록상표) 백신, 및 VAXID(등록상표) 백신; PROLEUKIN(등록상표) rIL-2; LURTOTECAN(등록상표) 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX(등록상표) rmRH; 및 상기 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

추가로, hu2H7 항체 및 그의 기능적 단편은 항-종양 혈관신생제, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 길항제와 함께 CD20 발현 B 세포 신생물 (예를 들어, NHL) 치료에 사용될 수 있다. "항-혈관신생제" 또는 "혈관신생 억제제"는 혈관신생, 혈관형성, 또는 바람직하지 않은 혈관 투과성을 직접 또는 간접적으로 억제하는 소분자량 물질, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 그의 접합체 또는 융합 단백질을 의미한다. 예를 들어, 항-혈관신생제는 상기 정의된 바와 같은 혈관신생제에 대한 항체 또는 다른 길항제, 예를 들어 VEGF에 대한 항체, VEGF 수용체에 대한 항체, VEGF 수용체 신호전달을 차단하는 소분자이다 (예를 들어, PTK787/ZK2284, SU6668). "VEGF 길항제"는 하나 이상의 VEGF 수용체에 대한 그의 결합을 포함하여 VEGF 활성을 중화, 차단, 억제, 제거, 감소 또는 방해할 수 있는 분자를 의미한다. 한 실시태양에서, 상기 B 세포 신생물로 고통받는 환자는 Avastin(등록상표) (베바치주맙; 제넨테크)과 함께 2H7.v511 또는 2H7.v114로 치료된다. 항-VEGF 항체 "베바치주맙 (BV)" (또한 "rhuMAb VEGF" 또는 "Avastin(등록상표)"로서 공지된)는 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체이다.

hu2H7 항체 및 그의 기능적 단편, 및 특정 실시태양에서, 2H7.v511 및 2H7.v114는 시토킨의 TNF 패밀리 멤버, 예를 들어 TRAIL로도 언급되는 Apo-2 리간드 (Apo2L)와 함께 CD20 발현 B 세포 신생물을 치료하는 방법에서 또한 유용하다. 전장 천연 서열 인간 Apo-2 리간드는 281개 아미노산의 길이이고, 시토킨의 종양 괴사 인자 패밀리의 타입 II 막횡단 단백질이다. 예를 들어 세포외 도메인 (ECD) 또는 그의 일부를 포함하는 Apo-2 리간드의 가용성 형태는 포유동물 암 세포에서 세포자멸 활성을 포함하여 상이한 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. Apo2L/TRAIL (WO 97/01633 및 WO 97/25428에 기재됨)은 전장 Apo-2L 단백질의 아미노산 114-281을 포함하는, ECD의 단편인 가용성 인간 단백질이다.

자가면역 질환 또는 상기 설명된 자가면역 관련 병태를 치료하는데 있어서, 환자는 예를 들어 다중 약물 요법에서 제2 치료제, 예를 들어 면역억제제와 함께 하나 이상의 hu2H7 항체, 예를 들어 hu2H7.v511로 치료될 수 있다. hu2H7 항체는 면역억제제와 동시에, 순차적으로 또는 교대로 또는 다른 요법에 대해 비반응성일 때 투여될 수 있다. 면역억제제는 당업계에 제시된 것과 동일하거나 더 작은 투여량으로 투여될 수 있다. 바람직한 보조 면역억제제는 치료되는 질환의 종류 및 환자의 병력을 포함하는 많은 인자에 따라 결정될 것이다.

보조 요법을 위해 본원에서 사용되는 "면역억제제"는 환자의 면역계를 억제하거나 차단하는 작용을 하는 물질을 의미한다. 상기 억제제는 시토킨 생산을 억제하거나, 자가항원 발현을 하향조절하거나 또는 MHC 항원을 억제하거나 차단하는 물질을 포함할 것이다. 상기 약제의 예는 스테로이드, 예를 들어 글루코코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 및 덱사메타손; 2-아미노-6-아릴-5-치환 피리미딘 (미국 특허 4,665,077 참조), 아자티오프린 (또는 아자티오프린에 대한 이상 반응이 있는 경우, 시클로포스파미드); 브로모크립틴; 글루타르알데히드 (MHC 항원을 차단, 미국 특허 4,120,649에 기재됨); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-개별특이형 항체; 시클로스포린 A; 시토킨 또는 시토킨 수용체 길항제, 예를 들어 항-인터페론-γ, -β, 또는 -α 항체; 항-종양 괴사 인자-α 항체; 항-종양 괴사 인자-β 항체; 항-인터루킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체; 항-L3T4 항체; 이종 항-림프구 글로불린; 범용(pan)-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 포함하는 가용성 펩티드 (WO 90/08187, 1990년 7월 26일 공개); 스트렙토키나제; TGF-β; 스트렙토도르나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T-세포 수용체 (미국 특허 5,114,721); T-세포 수용체 단편 (Offner et al., Science 251:430-432 (1991); WO 90/11294; 및 WO 91/01133); 및 T 세포 수용체 항체 (EP 340,109), 예를 들어 T10B9를 포함한다.

류마티스 관절염 치료를 위해, 환자는 CD20 결합 항체 (예를 들어 리툭시맙 또는 오크렐리주맙 또는 그의 변이체)를 하나 이상의 임의의 다음 약물과 조합하여 치료할 수 있다: DMARDS (질환 변형성 항-류마티스약 (예를 들어, 메토트렉세이트), NSAI 또는 NSAID (비-스테로이드성 소염약), 면역억제제 (예를 들어, 아자티오프린; 마이코페놀산 모페틸 (CellCept(등록상표); 로슈 (Roche, 스위스))), 진통제, 글루코코르티코스테로이드, 시클로포스파미드, HUMIRA™ (아달리무맙; 애보트 래보래토리즈 (Abbott Laboratories)), ARAVA(등록상표) (레플루노마이드), REMICADE(등록상표) (인플릭시맙; 센토코르 인크. (Centocor Inc., 미국 펜실배니아주 맬번)), ENBREL (에타네르셉트; 이뮤넥스 (Immunex, 미국 워싱턴), ACTEMRA (토실리주맙; 로슈), COX-2 억제제. RA에 통상적으로 사용되는 DMARD는 히드록시클로로퀸, 술파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 에타네르셉트, 인플릭시맙, 아자티오프린, D-페니실라민, 금 (경구), 금 (근내), 미노사이클린, 시클로스포린, 스타필로코커스 단백질 A 면역흡착제이다.

아달리무맙은 TNFα에 결합하는 인간 모노클로날 항체이다. 인플릭시맙은 TNFα에 결합하는 키메라 마우스-인간 모노클로날 항체이다. 이는 RA 및 크론병 치료를 위해 처방되는 면역-억제약이다. 인플릭시맙은 치명적인 반응, 예를 들어 심부전증 및 감염, 예를 들어 결핵 및 MS를 야기하는 탈수초화에 연관되었다. Actemra (토실리주맙)은 인간화 항-인간 인터루킨-6 (IL-6) 수용체이다.

에타네르셉트는 인간 IgG1의 Fc 부분에 연결된 인간 75 kD (p75) 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)의 세포외 리간드 결합 부분으로 이루어진 "면역어드헤신" 융합 단백질이다. 에타네르셉트 (ENBREL(등록상표))는 활성 RA의 치료제로서 미국에서 승인된 주사가능 약물이다. 에타네르셉트는 TNFα에 결합하고, 관절 및 혈액으로부터 대부분의 TNFα를 제거하여 TNFα가 염증 및 류마티스 관절염의 다른 증상을 촉진하는 것을 방지하는 기능을 수행한다. 상기 약물은 유해한 부작용, 예를 들어 중증 감염 및 패혈증, 신경계 질환, 예를 들어 다발성 경화증 (MS)과 연관되었다 (예를 들어, www.remicade-infliximab.com/pages/enbrel_embrel.html 참조).

RA의 통상적인 치료에 대해서는, 예를 들어, 문헌 ["Guidelines for the management of rheumatoid arthritis" Arthritis ＆ Rheumatism 46(2): 328-346 (February, 2002)]을 참조한다. 특정 실시태양에서, RA 환자는 메토트렉세이트 (MTX)와 함께 본 발명의 hu2H7 CD20 항체로 치료된다. MTX의 예시적인 투여량은 약 7.5-25 mg/kg/wk이다. MTX는 경구 및 피하 투여될 수 있다.

한 예에서, 또한 CD20 항체 주입 30분 전의 메틸프레드니솔론 100 mg i.v. 및 제2-7일의 프레드니손 60 mg p.o., 8-14일의 30 mg p.o., 16일에 기저선 용량으로의 회복으로 이루어지는 코르티코스테로이드 요법과 함께 MTX (경구 (p.o.) 또는 비경구로 10-25 mg/주)를 환자에게 투여한다. 또한, 환자에게 폴레이트 (5 mg/주)를 단일 용량으로서 또는 분할 일일 용량으로서 투여할 수 있다. 환자에게 치료 기간 내내 임의로 임의의 배경 코르티코스테로이드 (10 mg/d 프레드니손 또는 동등물)를 계속 투여한다.

강직 척추염, 건선성 관절염 및 크론병의 치료를 위해, 환자는 본 발명의 CD20 결합 항체를, 예를 들어 Remicade(등록상표) (인플릭시맙; 센토코르 인크.), ENBREL (에타네르셉트; 이뮤넥스)와 조합하여 치료될 수 있다.

SLE 치료는 CD20 항체와 고용량 코르티코스테로이드 및/또는 시클로포스파미드 (HDCC)의 조합 투여를 포함한다. SLE, AAV 및 NMO 환자는 본 발명의 2H7 항체를 코르티코스테로이드, NSAID, 진통제, COX-2 억제제, 글루코코르티코스테로이드, 통상적인 DMARD (예를 들어, 메토트렉세이트, 술파살라진, 히드록시클로로퀸, 레플루노미드), 생물학적 DMARD, 예를 들어 항-Blys (예를 들어, 벨리무맙), 항-IL6R, 예를 들어 토실리주맙; CTLA4-Ig (아바타셉트), (항-CD22, 예를 들어 에프라투주맙), 면역억제제 (예를 들어, 아자티오프린; 마이코페놀산 모페틸 (CellCept(등록상표); 로슈)), 및 세포 독성제 (예를 들어, 시클로포스파미드) 중의 임의의 물질과 조합하여 치료할 수 있다.

건선 치료를 위해, 환자에게 국소 치료제, 예를 들어 국소 스테로이드, 안트랄린, 칼시포트리엔, 클로베타솔 및 타자로텐, 또는 메토트렉세이트, 레티노이드, 시클로스포린, PUVA 및 UVB 요법제와 함께 인간화 2H7 항체를 투여한다. 한 실시태양에서, 건선 환자는 시클로스포린과 함께 인간화 2H7 항체로 순차적으로 또는 동시에 치료된다.

본 발명의 hu2H7 항체, 특히 hu2H7.v511 및 hu2H7.v114는 BAFF 길항제와 함께 동시에, 순차적으로 또는 교대 요법으로 자가면역 질환 또는 B 세포 신생물의 치료에 유용하다. BAFF 및 BAFF 길항제는 상기 정의한 바와 같다. 한 실시태양에서, BAFF 길항제는 인간 BR3에 결합하는 항체이고, 상기 항체는 바람직하게는 인간화, 인간 또는 키메라 항체이다. 다른 실시태양에서, BAFF 길항제는 BR3-Fc 융합 단백질이다. B 세포 고갈시에 항-CD20 항체와 BAFF 길항제의 상승 효과가 보고된 바 있다 (예를 들어, WO 05/000351 상기 문헌; Gong et al., (2005), J. Immunol. 174: 817-826 참조).

독성을 최소화하기 위해, 전통적인 전신 요법제는 본 발명에 제시된 투여량의 hu2H7 CD20 결합 항체 조성물과 함께 교대, 순차적, 조합 또는 간헐 치료 요법으로, 또는 보다 낮은 투여량 조합 요법으로 투여될 수 있다.

제약 제제

본 발명에 따라 사용되는 hu2H7 CD20-결합 항체의 치료 제제는 요구되는 정도의 순도를 갖는 항체를 선택적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 보관을 위해 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 투여 대상에게 비독성이고, 버퍼, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레졸시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀 및 m-크레졸); 낮은 분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.

예시적인 hu2H7 항체 제제는 본원에 참고로 포함된 WO98/56418에 기재되어 있다. 다른 제제는 hu2H7 항체 40 mg/mL, 25 mM 아세테이트, 150 mM 트레할로스, 0.9％ 벤질 알콜, 0.02％ 폴리소르베이트 20 (pH 5.0)을 포함하고 최소 저장 수명이 2-8℃에서 2년인 액체 다용량 제제이다. 목적하는 다른 항-CD20 항체 제제는 9.0 mg/mL 염화나트륨, 7.35 mg/mL 시트르산나트륨 이수화물, 0.7 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 주사용 멸균수 (pH 6.5) 중의 10 mg/mL 항체를 포함한다. 또다른 수성 제약 제제는 약 pH 4.8 내지 약 pH 5.5, 바람직하게는 pH5.5의 10-30 mM 아세트산나트륨, 계면활성제로서의 약 0.01-0.1％ v/v의 폴리소르베이트, 약 2-10％ w/v의 트레할로스, 및 보존제로서 벤질 알콜을 포함한다 (U.S. 6,171,586). 피하 투여를 위한 동결건조 제제는 WO97/04801에 기재되어 있다. 상기 동결건조 제제는 적합한 희석제를 사용하여 높은 단백질 농도로 재구성될 수 있고, 재구성된 제제는 본원에서 치료되는 포유동물에 피하 투여될 수 있다.

특정 실시태양에서, 인간화 2H7.v16의 한 IV 제제는 2O mM 아세트산나트륨, 4％ 트레할로스 이수화물, 0.02％ 폴리소르베이트 20 (Tween 20™) (pH 5.3) 중의 30 mg/ml 항체이다. 상기 IV 제제는 종양 적응증, 예를 들어 NHL, 및 류마티스 관절염에 대해 투여될 수 있다. 인간화 2H7.v511 변이체의 한 제제는 1O mM 히스티딘 술페이트, 60 mg/ml 슈크로스 (6％), 0.2 mg/ml 폴리소르베이트 20 (0.02％), 및 주사용 멸균수 (pH 5.8) 중의 15-30 mg/ml 항체, 바람직하게는 20 mg/mL 항체이다. 또다른 실시태양에서, 2H7 변이체, 특히 2H7.v511의 제제는 정맥내 투여를 위한 20 mg/ml 2H7, 20 mM 아세트산나트륨, 4％ 트레할로스 이수화물, 0.02％ 폴리소르베이트 20 (pH 5.5)이다. 상기 제제는 단일 i.v. 주입을 위해 사용될 수 있다. 2H7.v114를 위한 하나의 제제는 2O mM 아세트산나트륨, 24O mM (8％) 트레할로스 이수화물, 0.02％ 폴리소르베이트 20 (pH 5.3) 중의 항체 15-25 mg/ml, 바람직하게는 20 mg/ml이다.

본원에서 제제는 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않는 상보 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 독성제, 화학요법제, 시토킨 또는 면역억제제 (예를 들어 T 세포에 대해 작용하는 물질, 예를 들어 시클로스포린 또는 T 세포에 결합하는 항체, 예를 들어 LFA-1에 결합하는 항체)를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 유효량의 상기 다른 물질은 제제에 존재하는 항체의 양, 질병 또는 치료의 종류, 및 상기 논의한 다른 요인에 따라 결정된다. 상기 물질은 일반적으로 본원에서 사용되는 투여량과 동일한 투여량으로 본원에 설명된 투여 경로로 또는 본원에서 사용되는 투여량의 약 1 내지 99％로 사용된다.

활성 성분은 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐)에, 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

지효성 제제를 제조할 수 있다. 지효성 제제의 적합한 예는 길항제를 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지효성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미세구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.

생체 내 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

제조품 및 키트

본 발명의 다른 실시태양은 자가면역 질환 및 관련 병태 및 CD20-양성 암, 예를 들어 비-호지킨 림프종의 치료에 유용한 물질을 포함하는 제조품이다. 제조품은 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알 (vial), 시린지 (syringe) 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 병태 치료에 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개가 있는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 hu2H7 항체, 예를 들어 hu2H7.v511이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 특정 병태 치료에 사용됨을 나타낸다. 라벨 또는 포장 삽입물은 항체 조성물을 환자에게 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함할 것이다.

포장 삽입물은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용도, 투여량, 투여, 금기 및/또는 경고 사항에 대한 정보를 포함하는, 치료 제품의 상업적 포장에 통상적으로 포함되는 설명서를 의미한다. 한 실시태양에서, 포장 삽입물은 조성물이 비-호지킨 림프종을 치료하기 위해 사용되는 것을 나타낸다.

추가로, 제조품은 제약상 허용되는 버퍼, 예를 들어 주사용 정균수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품은 상업적인 관점 및 사용자 입장에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.

다양한 목적, 예를 들어 세포자멸 분석을 위한 양성 대조군으로서 B-세포 사멸 분석, 세포로부터 CD20의 정제 또는 면역침전을 위해 유용한 키트가 또한 제공된다. CD20의 단리 및 정제를 위해, 키트는 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 hu2H7.v511 항체를 함유할 수 있다. 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블로트에서 시험관 내에서 CD20의 검출 및 정량을 위해 항체를 포함하는 키트가 제공될 수 있다. 제조품에서와 같이, 키트는 용기 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 용기는 적어도 하나의 본 발명의 항-CD20 항체를 포함하는 조성물을 보유한다. 예를 들어, 희석제 및 버퍼, 대조 항체를 포함하는 추가의 용기가 포함될 수 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물에 대한 설명, 및 의도된 시험관 내 또는 진단 용도를 위한 설명서를 제공할 수 있다.

실험 실시예

재료

마우스: 인간 CD20 (hCD20)⁺ 마우스의 생성은 hCD20 로커스 (locus)를 포함 하는 세균 인공 염색체 (BAC)의 사용을 통해 달성하였다. 양성 BAC 클론을 FVB 마우스로부터 유래된 배반포 (blastocyte) 내로 주입하여 hCD20을 발현하는 트랜스제닉 (Tg) 파운더 (founder) 주를 생성하였다. hCD20 Tg⁺ 마우스의 생성 및 특성화에 대한 상세한 설명은 문헌 [Gong et al., (2005) J. Immunol. 174:817-826]을 참조한다. HCD20 Tg⁺ 마우스를 후속적으로 hCD16Tg⁺mCD16^-/-와 함께 번식시켜 hCD20Tg⁺mCD16^-/-hCD16Tg⁺ 마우스를 생성하고, 이를 하기 설명된 연구에서 사용하였다.

항체: FACS 분석에서 사용된 모든 항체는 비디 파밍엔 (BD PharMingen)으로부터 구입하였다.

기기/소프트웨어: FACS 분석은 FACScan 또는 FACSCalibur 기계를 사용하고, 벡톤 디킨슨으로부터 구입한 CellQuest 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

일반적인 방법

단일 세포 현탁액의 제조: 50 ㎕의 마우스 혈액을 EDTA-함유 튜브를 사용하여 회전식으로 수집한 후, ACK 용해 버퍼 (바이오소스 (Biosource)로부터 구입함)를 사용하여 적혈구 용해시켰다. 그들의 제거 후, 마우스 비장을 불투명 유리 슬라이드를 사용하여 단일 세포 현탁액 내로 과립화하였다. 이어서, 세포 펠렛을 세척하고, 재현탁시키고 여과하였다. 5 ml의 냉 PBS를 사용하여 각각의 마우스의 복강을 세척하였다. 세척액을 5-ml 시린지를 사용하여 회수한 후, 원심분리하였다. 이어서, 마우스 혈액, 비장 및 복막으로부터의 백혈구를 세척하고, FACS 분석을 위 한 염색에 앞서 계수하였다.

FACS 염색: 약 1x1O⁶개를 각종 세포 표면 마커 (FACS 분석에서 정의 참조)에 대해 100 ㎕의 포스페이트 완충 염수 + 1％ 알부민 (시그마) 내에서 염색하였다. 이어서, 얼음 상에서 30분 인큐베이션 후, 염색된 세포를 세척하고 재현탁시킨 후 FACS 분석을 하였다.

FACS 분석: FACS 분석은 CellQuest 소프트웨어를 이용하는 FACScan 또는 FACSCalibur를 사용하여 수행하였다. 혈액 중의 B 세포는 CD21⁺CD23⁺로서 정의하고; 복막 B 세포는 CD19⁺로서 정의하고; 비장 B 세포는 B220⁺로서 정의하고; MZ (변연대) B 세포는 CD21^highCD23^low로서 정의하고; FO (여포) B 세포는 CD21⁺CD23^high로서 정의하였다.

통계학: 데이타를 평균±표준 오차로서 표현하였다 (n=5). 통계학적 분석은 투-테일 (two-tail) 언페어드 (unpaired) T 시험을 이용하여 수행하였다.

실시예 1

2 H7 항- CD20 쥐 모노클로날 항체의 인간화

쥐 항-인간 CD20 항체, 2H7 (또한 본원에서 m2H7으로서 칭함, 쥐에 대해 m)의 인간화는 일련의 부위 지정 돌연변이유발 단계로 수행하였다. 쥐 2H7 항체 가변 영역 서열, 및 마우스 V와 인간 C를 갖는 키메라 2H7은 설명되었다 (예를 들어, 미국 특허 5,846,818 및 6,204,023 참조). 2H7의 CDR 잔기는 쥐 2H7 가변 도메인 의 아미노산 서열 (미국 특허 5,846,818에 개시된)을 공지의 항체의 서열과 비교함으로써 확인되었다 (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, Ed. 5. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). 경쇄 및 중쇄에 대한 CDR 영역을 서열 과변이 (hypervariability)를 기초로 하여 정의하고 (Kabat et al., 상기 문헌), 각각 도 1A 및 도 1B에 나타낸다. 합성 올리고뉴클레오티드 (표 1)을 사용하여, 부위 지정 돌연변이유발 (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488-492 (1985))을 이용하여 모두 6개의 쥐 2H7 CDR 영역을 플라스미드 pVX4 상에 포함된 컨센서스 서열 V_κI,V_HIII (V_L 카파 하위군 I, V_H 하위군 III)에 상응하는 완전 인간 Fab 프레임워크 내로 도입하였다 (PCT 공개가 전체가 본원에 포함되는 WO 04/056342에서 도 2 참조).

파지미드 pVX4를 돌연변이유발을 위해 및 이. 콜라이 내에서 F(ab)의 발현을 위해 사용하였다. 파지미드 pbO72O에 기초하여, pB0475의 유도체 (Cunningham et al., Science 243: 1330-1336 (1989))인 pVX4는 인간화 컨센서스 κ-하위군 I 경쇄 (V_LκI-C_L) 및 인간화 컨센서스 하위군 III 중쇄 (V_HIII-C_H1) 항-IFN-α (인터페론 α) 항체를 코딩하는 DNA 단편을 함유한다. pVX4는 또한 둘 모두 이전에 설명된 다른 pUC119-기재 플라스미드, pAK2 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992))로부터 유도된 알칼리성 포스파타제 프로모터 및 샤인-달가노 서열을 갖는다. 독특한 SpeI 제한 부위를 F(ab) 경쇄 및 중쇄에 대해 코딩하는 DNA 사이에 도입하였다. 항-IFN-α 중쇄 및 경쇄 내의 처음 23 아미노산은 StII 분비 시그날 서열이다 (Chang et al., Gene 55: 189-196 (1987)).

2H7의 CDR-교환 (swap) 버전 (2H7.v2)을 구성하기 위해, 부위 지정 돌연변이유발을 pVX4의 데옥시우리딘-함유 주형 상에서 수행하였고; 항-IFN-α의 모든 6개의 CDR을 쥐 2H7 CDR로 교환하였다. 생성되는 분자를 인간화 2H7 버전 2 (2H7.v2), 또는 2H7의 "CDR-교환 버전"으로 칭하고; 이는 도 1A 및 1B에 도시된 컨센서스 인간 FR 잔기를 갖는 m2H7 CDR 잔기를 갖는다. 인간화 2H7.v2를 추가의 인간화를 위해 사용하였다.

표 3은 H 및 L쇄 내에 각각의 쥐 2H7 (m2H7) CDR을 생성시키기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 서열을 보여준다. 예를 들어, CDR-H1 올리고뉴클레오티드를 사용하여 m2H7 H쇄 CDR1을 재구성하였다. CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3은 각각 H쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 나타내고; 유사하게, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3은 각각의 L쇄 CDR을 나타낸다. CDR-H2에서 치환은 2개의 올리고뉴클레오티드, CDR-H2A 및 CDR-H2B를 사용하여 2 단계로 이루어졌다.

(각각의 올리고뉴클레오티드에 의해 변화된 잔기는 밑줄로 표시함.)

인간화 구성체와 비교하기 위해, 쥐 프레임워크 잔기를 2H7.v2 내로 도입하기 위해 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 부위 지정 돌연변이유발 (Kunkel, 상기 문헌)에 의해 키메라 2H7 Fab (쥐 V_L 및 V_H 도메인과 인간 C_L 및 C_H1 도메인을 포함)을 발현하는 플라스미드를 구성하였다. 2H7.v6.8로 알려진 키메라 Fab의 발현을 위한 생성되는 플라스미드 구성체는 WO 04/056342에서 도 3에 나타나 있다. Fab의 각각의 코딩된 쇄는 상기 pVX4에 대해 설명된 바와 같이 23 아미노산 StII 분비 시그날 서열을 갖는다.

쥐 2H7 프레임워크 잔기와 인간 V_κI,V_HIII 컨센서스 프레임워크 (도 1A 및 1B) 및 이전에 인간화된 항체 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992))와의 서열 비교에 기초하여, 몇몇 프레임워크 돌연변이를 부위 지정 돌연변이유발에 의해 2H7.v2 Fab 구성체 내로 도입하였다. 상기 돌연변이는 특정 인간 컨센서스 프레임워크 잔기를 CDR 형태 또는 항원 접촉에 영향을 미칠 수 있는 부위에서 쥐 2H7 프레임워크 내에 발견된 것으로 변화시킨다. 버전 3은 V_H(R71V,N73K)을 포함하고, 버전 4은 V_H(R71V)를 포함하고, 버전 5는 V_H(R71V,N73K) 및 V_L(L46P)를 포함하고, 버전 6은 V_H(R71V,N73K) 및 V_L(L46P,L47W)를 포함하였다.

m2H7 항체의 인간화 및 키메라 Fab 버전을 이. 콜라이 내에서 발현시키고 다음과 같이 정제하였다. 플라스미드를 이중쇄 및 단일쇄 DNA의 제조를 위해 이. 콜라이 균주 XL-1 Blue (스트라타젠 (Stratagene, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)) 내로 형질전환시켰다. 각각의 변이체에 대해, 경쇄 및 중쇄 모두를 디데옥시뉴클레오티드 방법 (Sequenase, 유.에스. 바이오케미컬 코퍼레이션 (U.S. Biochemical Corp.))을 이용하여 완전히 서열분석하였다. 플라스미드를 이. 콜라이 균주 16C9 (MM294의 유도체) 내로 형질전환시키고, 5 ㎍/ml 카르베니실린을 함유하는 LB 플레이트 상으로 플레이팅하고, 단백질 발현을 위해 단일 콜로니를 선택하였다. 단일 콜로니를 5 ml LB-100 ㎍/ml 카르베니실린 내에서 5-8 h 동안 37℃에서 성장시켰다. 5 ml 배양액을 500 ml AP5-100 ㎍/ml 카르베니실린에 첨가하고, 16 h 동안 4 L의 배플(baffle)이 달린 진탕 플라스크 내에서 37℃에서 성장시켰다. AP5 배지는 1.5 g 글루코스, 11.0 Hycase SF, 0.6 g 효모 추출액 (보증품), 0.19 g 무수 MgSO₄, 1.07 g NH₄Cl, 3.73 g KCl, 1.2 g NaCl, 120 ml 1 M 트리에탄올아민 (pH 7.4), 총부피가 1 L가 되도록 하는 물로 이루어지고, 이어서 0.1 ㎛ Sealkeen 필터를 통해 멸균 여과하였다.

세포를 1 L 원심분리병 (날젠 (Nalgene)) 내에서 3000xg에서 원심분리에 의해 수확하고, 상등액을 제거하였다. 1 h 동안 동결시킨 후, 펠렛을 25 ml의 냉 10 mM MES-10 mM EDTA, pH 5.0 (버퍼 A) 내에 재현탁시켰다. 단백분해를 억제하기 위해 250 ㎕의 0.1 M PMSF (시그마)를 첨가하고, 세균 세포벽의 용해를 돕기 위해 3.5 ml의 원액 10 mg/ml 계란 난백 라이소자임 (시그마)을 첨가하였다. 얼음 상에서 1 h 동안 부드럽게 진탕한 후, 샘플을 40,000xg에서 15분 동안 원심분리하였다. 상등액을 버퍼 A로 50 ml로 하고, 버퍼 A로 평형화시킨 2 ml DEAE 칼럼 상으로 로딩하였다. 이어서, 유통액 (flow-through)을 버퍼 A로 평형화시킨 단백질 G-세파로스 CL-4B (파마시아 (Pharmacia)) 칼럼 (0.5 ml 층 부피)에 적용하였다. 칼럼을 10 ml 버퍼 A로 세척하고, 3 ml의 0.3 M 글라이신, pH 3.0으로 1.25 ml의 1 M Tris, pH 8.0 내로 용출하였다. 이어서, F(ab)를 Centricon-30 (아미콘 (Amicon))을 사용하여 PBS 내로 버퍼 교환하고, 최종 부피 0.5 ml로 농축시켰다. 순도를 확정하기 위해 모든 F(ab)의 SDS-PAGE 겔을 실행하고, 각각의 변이체의 분자량을 전기분무 질량 분광분석법에 의해 입증하였다.

세포-기재 ELISA 결합 분석 (아래 설명됨)에서, 키메라 2H7 Fab를 포함한 Fab의 CD20에 대한 결합은 검출하기 어려웠다. 따라서, 2H7 Fab 버전을 분석 및 추가의 돌연변이유발을 위한 전장 IgG1 항체로서 재포맷팅하였다.

전장 IgG의 발현을 위한 플라스미드는 키메라 2H7 (v6.8) Fab 뿐만 아니라 인간화 Fab 버전 2 내지 6의 V_L 및 V_H 도메인을 포유동물 세포 발현을 위한 앞서 설명된 pRK 벡터 (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)) 내로 서브클로닝함으로써 구성하였다. 간략히, 각각의 Fab 구성체를 EcoRV 및 BlpI로 소화시켜 V_L 단편을 삭제하고, 이를 완전 경쇄 (V_L-C_L 도메인)의 발현을 위해 플라스미드 pDR1의 EcoRV/BlpI 부위 (WO 04/056312의 도 4) 내로 클로닝하였다. 추가로, 각각의 Fab 구성체를 PvuII 및 ApaI로 소화시켜 V_H 단편을 삭제하고, 이를 완전 중쇄 (V_H-CH₁-힌지-CH₂-CH₃ 도메인)의 발현을 위해 플라스미드 pDR2의 PvuII/ApaI 부위 (WO 04/056312의 도 5) 내로 클로닝하였다. 각각의 IgG 변이체에 대해, 경쇄 발현 플라스미드 및 중쇄 발현 플라스미드를 아데노바이러스-형질전환된 인간 배아 신장 세포주, 293 (Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59-74, (1977)) 내로 동시형질감염시킴으로써 일과적 형질감염을 수행하였다. 간략히, 293 세포를 형질감염 전날에 분할시키고, 혈청-함유 배지에 플레이팅하였다. 다음날에, 인산칼슘 침전물로서 제조된 이중쇄 DNA에 이어, pAdVAntage™ DNA (프로메가 (Promega, 미국 위스콘신주 매디슨))를 첨가하고, 세포를 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 4일 후 수확하였다. 항체를 단백질 A-세파로스 CL-4B를 사용하여 배양 상등액으로부터 정제한 후, 10 mM 숙신산나트륨, 140 mM NaCl (pH 6.0) 내로 버퍼 교환하고, Centricon-10 (아미콘)을 사용하여 농축시켰다. 단백질 농도는 정량적 아미노산 분석에 의해 결정하였다.

CD20 항원에 대한 상대 결합 친화도를 측정하기 위해, 세포-기재 ELISA 분석을 개발하였다. 인간 B-림프모구 (lymphoblastoid) WIL2-S 세포 (ATCC CRL 8885, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션)를 가습 5％ CO₂ 인큐베이터 내에서 2 mM L-글루타민, 20 mM HEPES (pH 7.2) 및 10％ 열-불활성화 태 송아지 혈청을 보충한 RPMI 1640 내에서 성장시켰다. 세포를 1％ FBS를 함유하는 PBS (분석 버퍼)로 세척하고, 250-300,000 세포/웰로 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (넌크 (Nunc, 덴마크 로스킬데))에 접종하였다. 분석 버퍼 중에 2배 계열 희석된 표준품 (15.6-1000 ng/ml의 2H7.v6.8 키메라 IgG) 및 3배 계열 희석된 샘플 (2.7-2000 ng/ml)을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 얼음에 묻고, 45분 동안 인큐베이션하였다. 비결합 항체를 제거하기 위해, 0.1 mL 분석 버퍼를 웰에 첨가하였다. 플레이트를 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 세포를 0.2 mL 분석 버퍼로 2회 더 세척하였다. 플레이트에 결합된 항체는 퍼옥시다제 접합된 염소 항-인간 Fc 항체 (잭슨 이뮤노리서치 (Jackson ImmunoResearch, 미국 펜실배니아주 웨스트 그로브))를 플레이트에 첨가하여 검출하였다. 45분 인큐베이션 후, 세포를 상기한 바와 같이 세척하였다. TMB 기질 (3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘; 키르케가아드 앤 페리 래보래토리스 (Kirkegaard ＆ Perry Laboratories, 미국 메릴랜드주 게이터스버그))을 플레이트에 첨가하였다. 1 M 인산을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 적정 곡선은 4-변수 비선형 회귀 곡선-피팅 프로그램 (KaleidaGraph, 시너지 소프트웨어 (Synergy software, 미국 펜실배니아주 리딩))으로 피팅하였다. 적정 곡선의 중간점에서 흡광도 (mid-OD) 및 표준품의 그의 상응하는 농도를 결정하였다. 이어서, 상기 mid-OD에서 각각의 변이체의 농도를 결정하고, 표준품의 농도를 각각의 변이체의 농도로 나누었다. 따라서, 그 값은 표준품에 비해 각각의 변이체의 결합의 비율이다. 상대 친화도에서 표준 편차 (동등 농도)는 일반적으로 실험 사이에 +/- 10％이었다.

표 4에 나타낸 바와 같이, CDR-교환 변이체 (v.2)의 CD20 결합은 키메라 2H7 (v.6.8)에 비해 극도로 감소되었다. 그러나, 버전 3 내지 6은 개선된 결합을 보였다. 결합 친화도를 키메라 2H7의 값으로 복구하기 위해 요구될 수 있는 최소수의 돌연변이를 결정하기 위해, 추가의 돌연변이 및 돌연변이의 조합을 부위 지정 돌연변이유발에 의해 구성하여, 표 5에 나타낸 바와 같이 변이체 7 내지 17을 제조하였다. 특히, 이들은 V_H 돌연변이 A49G, F67A, I69L, N73K, 및 L78A; 및 V_L 돌연변이 M4L, M33I, 및 F71Y를 포함하였다. 버전 16 및 17은 키메라 버전의 값의 2배 내에 있는 최상의 상대 결합 친화도를 보였고, 둘 사이에 유의한 차이는 없었다 (s.d.= +/- 10％). 돌연변이의 수를 최소화하기 위해, 따라서 인간 프레임워크 잔기의 쥐 프레임워크 잔기로의 단지 4개의 돌연변이 (표 5)를 갖는 버전 16을 추가의 특성화를 위한 인간화 형태로서 선택하였다.

(상대 결합은 동등한 결합에 요구되는 변이체의 농도를 초과하는 키메라 2H7의 농도로서 표현됨. 따라서, 비율 <1은 변이체에 대한 보다 약한 친화도를 나타냄. 상대 친화도 결정에서의 표준 편차는 평균 +/- 10％이었음. 가변 도메인에서의 프레임워크 치환은 Kabat의 넘버링 시스템 (Kabat et al., 상기 문헌)에 따라 CDR-교환 버전에 상대적임.)

(밑줄친 코돈은 나타낸 아미노산 치환을 코딩함. V_H(R71V, N73K) 및 V_L(L46P)의 경우에 올리고는 Fab 주형 상에서의 돌연변이유발에 사용되었기 때문에 센스 스트랜드로서 나타낸 반면, V_H(A49G)의 경우에는 올리고가 pRK (IgG 중쇄) 주형과 함께 사용되었기 때문에 안티센스 스트랜드로서 나타냄. 버전 16의 단백질 서열은 조성물 하에 상기 제공됨.)

실시예 2

2 H7 CDR 영역 내에서 추가의 돌연변이

Ala-스캐닝에 의해 중요한 것으로 확인된 CDR 위치에서 추가의 잔기의 치환 및 치환의 조합을 또한 시험하였다. 몇몇 조합 변이체, 특히 v.96이 v.16보다 더 단단히 결합하는 것으로 나타났다.

(CD20에 대한 상대 결합은 동등한 결합에 요구되는 변이체의 농도를 초과하는 2H7.v16 모체의 농도로서 표현되기 때문에, 비율 <1은 변이체에 대해 더 약한 친화도를 나타내고, 비율 >1은 변이체에 대해 더 큰 친화도를 나타냄. 상대 친화도 결정에서의 표준 편차는 평균 +/- 10％이었음. 가변 도메인에서의 프레임워크 치환은 Kabat의 넘버링 시스템 (Kabat et al., 상기 문헌)에 따라 2H7.v16에 상대적임.)

실시예 3

향상된 효과기 기능을 갖는 인간화 2 H7 변이체

2H7은 보체-의존성 세포독성 (CDC) 및 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 모두를 통해 B-세포의 용해를 매개할 수 있기 때문에, 개선된 CDC 및 ADCC 활성을 갖는 인간화 2H7.v16의 변이체를 생산하고자 하였다. 다른 항체의 Fc 영역 내에서 특정 잔기의 돌연변이가 보체 성분 C1q에 대한 향상된 결합을 통해 CDC를 개선하기 위해 설명되었다 (Idusogie et al., J. Immunol. 166:2571-2575 (2001)). 돌연변이는 또한 활성화 Fcγ 수용체에 대한 향상된 IgG 결합 및 억제성 Fcγ 수용체에 대한 감소된 IgG 결합을 통해 ADCC를 개선하기 위해 설명되었다 (Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Presta et al., Biochem. Soc. Trans. 30:487-490 (2002)). 특히, 설명된 바와 같이 (Idusogie et al., 상기 문헌 (2001); Shields et al., 상기 문헌), CDC 및 ADCC 활성을 개선하기 위한 3개의 돌연변이가 확인되었다: S298A/E333A/K334A (또한 본원에서 삼중 Ala 돌연변이체 또는 변이체로서 칭함; Fc 영역에서 넘버링은 EU 넘버링 시스템에 따른다; Kabat et al., 상기 문헌).

2H7의 CDC 및 ADCC 활성을 향상시키기 위해서, 2H7 Fc의 삼중 Ala 돌연변이체를 구성하였다. 항-HER2 항체 4d5의 인간화 변이체가 돌연변이 S298A/E333A/K334A를 사용하여 생산되었고, 4D5Fc110으로서 공지되어 있다 (즉, 항-p¹⁸⁵HER2 IgG1 (S298A/E333A/K334A); Shields et al., 상기 문헌). 항체 4D5Fc110을 코딩하는 플라스미드, p4D5Fc110 (Shields et al., 상기 문헌)을 ApaI 및 HindIII로 소화시키고, Fc-단편 (돌연변이 S298A/E333A/K334A를 함유하는)을 2H7 중쇄 벡터 pDR2-v16의 ApaI/HindIII 부위에 라이게이션시켜 pDR2-v31을 제조하였다. 버전 31 완전 H쇄의 아미노산 서열은 상기 조성물 하에 제공된다. L쇄는 v16의 것과 동일하다.

IgG1 항체의 Fc 영역의 불변 도메인은 주어진 종 내에서 비교적 보존되지만, 대립유전자 변이가 존재한다 (Lefranc and Lefranc, in The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function, and regulation, pp. 43-78, F. Shakib (ed.), Pergammon Press, Oxford (1990)).

CD20 결합에 대한, Fc 영역에서의 치환 효과

2H7 버전	Fc 치환*	상대 결합
6.8	-	-1-
16	-	0.65
31	S298A,E333A,K334A	0.62

(CD20에 대한 상대 결합을 프레임워크 치환의 세포-기재 (WIL2-S) 분석으로 측정하였음. Fc 돌연변이 (^*)는 EU 넘버링 (Kabat, 상기 문헌)으로 나타내었고, 2H7.v16 모체에 상대적임. v.31의 Fc 영역에서 3개의 Ala 변화의 조합은 "Fc110"으로 기재함. IgG 변이체는 2H7.v16 배경에 관하여 돌연변이를 갖는 것으로 나타남. 상대 결합은 동등한 결합에 요구되는 변이체의 농도를 초과하는 2H7.v6.8 키메라의 농도로서 표현되기 때문에, 비율 <1은 변이체에 대한 더 약한 친화도를 나타냄. 상대 친화도 결정에서의 표준 편차는 평균 +/- 10％이었음.)

실시예 4

향상된 안정성을 갖는 인간화 2 H7 변이체

치료 단백질로서 개발하기 위해, 적합한 제제 버퍼 중에서 산화, 탈아미드화, 또는 제품 품질에 해를 끼칠 수 있는 다른 과정에 관하여 안정하게 남아있는 변이체를 선택하는 것이 바람직하다. 2H7.v16에서, 몇몇 잔기가 불안정성의 가능한 원인으로서 확인되었다: VL (M32) 및 VH (M34,N100). 따라서, v16과 비교하기 위해 돌연변이를 상기 부위에서 도입하였다.

(IgG 변이체는 2H7.v16 배경에 관하여 돌연변이를 갖는 것으로 나타남. 상대 결합은 동등한 결합에 요구되는 변이체의 농도를 초과하는 2H7.v6.8 키메라의 농도로서 표현되기 때문에, 비율 <1은 변이체에 대한 더 약한 친화도를 나타냄. 상대 친화도 결정에서의 표준 편차는 평균 +/- 10％이었음. 가변 도메인에서의 프레임워크 치환은 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 2H7.V16에 상대적이고, Fc 돌연변이 (^*)는 EU 넘버링 (Kabat et al., 상기 문헌)으로 나타냄. (^**) 2H7.v16을 표준 비교기로서 사용하여 측정된 변이체; 상대 값은 키메라의 것으로 표준화함.

이전에 보고된 돌연변이 (Idusogie et al., (2000); Idusogie et al., (2001); Shields et al., (2001))에 기초하여 효과기 기능을 변경하거나 향상시키기 위해 추가의 Fc 돌연변이를 안정성 또는 친화도-향상 돌연변이와 결합시킴. 상기 변화는 상기 설명한 바와 같은 S298, E333A, K334A; CDC 활성을 감소시키기 위한 K322A; ADCC 활성을 감소시키기 위한 D265A; CDC 활성을 향상시키기 위한 K326A 또는 K326W; 및 Fc 영역에서 대립유전자형 변화의 효과를 시험하기 위한 E356D/M358L을 포함함 상기 돌연변이는 어느 것도 CD20 결합 친화도에 있어서 유의한 차이를 유발시키지 않았음.)

단백질 분해 속도에 대한 안전성 돌연변이의 효과를 시험하기 위해, 2H7.v16 및 2H7.v73을 10 mM 히스티딘, 6％ 슈크로스, 0.02％ 폴리소르베이트 20, pH 5.8 중에 12-14 mg/mL로 제제화하고, 40℃에서 16일 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 인큐베이션한 샘플을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 전하 변이체에서, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 응집 및 단편화에서, 및 세포-기재 (WIL2-S) 분석으로 시험함으로써 상대 결합에서 변화에 대해 분석하였다.

결과는 2H7 v.73이 가속된 안정성 조건 하에 이온 교환 크로마토그래피에 의해 주요 피크의 분획에서 손실에 관하여 2H7 v.16에 비해 더 큰 안정성을 가짐을 보여주었다. 응집, 단편화, 또는 결합 친화도에 관하여 유의한 차이가 보이지 않았다.

실시예 5

보체 -의존성 세포독성 ( CDC ) 분석

2H7 IgG 변이체를 WIL2-S 세포 (CD20 발현 림프모구 B-세포주)의 보체-의존성 용해를 매개하는 그들의 능력에 대해 본질적으로 설명된 바와 같이 분석하였다 (Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000); Idusogie et al., J. Immunol. 166:2571-2575 (2001)). 항체를 0.1 mg/mL 원액으로부터 1:3 계열 희석하였다. 각각의 희석액의 0.05 mL 분취액을 0.05 mL의 정상 인간 보체의 용액 (퀴델 (Quidel, 미국 캘리포니아주 샌 디에고))을 함유하는 96-웰 조직 배양 플레이트에 첨가하였다. 상기 혼합물에, 50,000 WIL2-S 세포를 0.05 mL 부피로 첨가하였다. 2h 동안 37℃에서 인큐베이션 후, 0.05 mL의 Alamar blue 용액 (어큐메드 인터내셔널 (Accumed International, 미국 오하이오주 웨스트레이크))을 첨가하고, 추가로 18h 동안 37℃에서 계속 인큐베이션하였다. 이어서, 커버를 플레이트로부터 제거하고, 15분 동안 실온에서 회전식 진탕기 상에서 진탕하였다. 상대 형광 단위 (RFU)는 530 nm 여기 필터 및 590 nm 방사 필터를 사용하여 판독하였다. EC₅₀은 KaleidaGraph 소프트웨어를 이용하여 RFU를 각각의 항체에 대해 농도의 함수로서 피팅함으로써 계산하였다.

결과 (표 9)는 인간화 2H7 항체에 의한 CDC에서 놀라운 개선을 보여주고, 상대 효력 (potency)은 v.73에 대해 Rituxan(등록상표)과 유사하고, v.75에 대해 Rituxan(등록상표)보다 3배 더 강력하고, v.16에 대해 Rituxan(등록상표)보다 3배 더 약하다.

(수치 >1은 Rituxan(등록상표)보다 덜 강력한 CDC 활성을 나타내고, 수치 <1은 Rituxan(등록상표)보다 더 강력한 활성을 나타냄. 항체는 안정한 CHO 주로부터 제조하되, 단 (^*)로 표시한 것은 일시적으로 제조하였음.)

실시예 6

항체-의존성 세포 매개 세포독성 ( ADCC ) 분석

2H7 IgG 변이체를 WIL2-S 세포 (CD20 발현 림프모구 B-세포주)의 천연 킬러 세포 (NK 세포) 용해를 매개하는 그들의 능력에 대해 락테이트 데히드로게나제데 (LDH) 판독 (readout)을 이용하여 본질적으로 설명된 바와 같이 분석하였다 (Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)). NK 세포는 FcγRIII (CD16으로서서도 공지된)에 대해 동형화된 정상 인간 공여자로부터 얻은, 100 mL의 PBS (포스페이트 완충 염수)로 희석된 100 mL의 헤파린처리된 혈액으로부터 제조하였다 (Koene et al., Blood 90:1109-1114 (1997)). 본 실험에서, NK 세포는 CD16 (F158/V158)에 대해 이종접합성인 인간 공여자의 것이었다. 희석시킨 혈액을 15 mL의 림프구 분리 배지 (아이씨엔 바이오케미칼 (ICN Biochemical, 미국 오하이오주 오로라)) 상에 적층시키고, 20분 동안 2000 RPM에서 원심분리하였다. 층들 사이의 계면에서 백혈구를 15％ 태 송아지 혈청을 함유하는 RPMI 배지로 채워진 4개의 깨끗한 50-mL 튜브에 분배하였다. 튜브를 5분 동안 1400 RPM에서 원심분리하고, 상등액을 폐기하였다. 펠렛을 MACS 버퍼 (0.5％ BSA, 2mM EDTA) 내에 재현탁시키고, NK 세포를 제조사의 프로토콜 (밀테나이이 바이오테크 (Miltenyi Biotech))에 따라 비드 (NK Cell Isolation Kit, 130-046-502)를 사용하여 정제하였다. NK 세포를 MACS 버퍼 내에 2x10⁶ 세포/mL로 희석하였다.

분석 배지 (글라이신을 갖지 않는 F12/DMEM 50:50, 1 mM HEPES 버퍼 pH 7.2, 페니실린/스트렙토마이신 (100 유니트/mL; 깁코 (Gibco)), 글루타민, 및 1％ 열 불활성화 태 송아지 혈청) 중의 항체의 계열 희석액 (0.05 mL)을 96-웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에 첨가하였다. WIL2-S 세포를 분석 버퍼 내에 4 x 10⁵/mL의 농도로 희석하였다. WIL2-S 세포 (웰 당 0.05 mL)를 96-웰 플레이트에서 희석된 항체와 혼합하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션하여 항체를 CD20에 결합시켰다 (옵소닌화 (opsonization)).

ADCC 반응은 0.1 mL의 NK 세포를 각각의 웰에 첨가함으로써 개시되었다. 대조 웰에서는, 2％ Triton X-100을 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 4h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. LDH의 수준은 제조사의 지시에 따라 세포독성 (LDH) 검출 키트 (Kit#1644793, 로슈 다이아그노스틱스 (Roche Diagnostics, 미국 인디애나주 인디애나폴리스))를 사용하여 측정하였다. 0.1 mL의 LDH 현상제를 각각의 웰에 첨가한 후, 10s 동안 혼합하였다. 이어서, 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고, 암소에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 490 nm에서 광학 밀도를 판독하고, 이를 대조 웰에서 측정된 총 LDH로 나누어 ％ 용해를 계산하였다. 용해를 항체 농도의 함수로서 플로팅하고, 4-변수 곡선 피트 (KaleidaGraph)를 사용하여 EC₅₀ 농도를 결정하였다.

결과는 인간화 2H7 항체가 ADCC에서 활성이고, 상대 효력은 v.31 및 v.75에 대해 Rituxan(등록상표)보다 20배 더 높고, v.16에 대해 Rituxan(등록상표)보다 5배 더 강력하고, v.73에 대해 Rituxan(등록상표)보다 거의 4배 더 높은 것을 보여주었다.

(값 >1은 2H7.v16보다 더 낮은 효력을 나타내고, 값 <1은 더 큰 효력을 나타냄)

2H7의 조합-변이체를 Rituxan(등록상표)과 비교하기 위해 추가의 ADCC 분석을 수행하였다. 상기 분석의 결과는 2H7.v114 및 2H7.v115가 Rituxan(등록상표)에 비해 >10배 개선된 ADCC 효력을 갖는 것을 나타냈다 (표 11).

(값 >1은 Rituxan(등록상표)보다 더 낮은 효력을 나타내고, 값 <1은 더 큰 효력을 나타냄.)

실시예 7

FcRn 결합에 대한 분석

Fc에서 아미노산 변형을 갖는 가용성 Fc 변이체 (예를 들어, N434W, N434Y, N434F, N434A N434H, N434A+E380A+T307A)를 발현시키고, 정제하고, 인간, 사이노몰거스 원숭이, 래트, 및 쥐 FcRn에 대한 그들의 친화도에 대해 BIAcore 결합 분석으로 분석하였다. Fc 변이체를 또한 그들의 응집 경향을 결정하기 위해 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다.

변이체 Fc 단편은 34B8 이. 콜라이 세포를 돌연변이체 pW0437 파지미드로 형질전환시키고, 24시간 동안 30℃에서 포스페이트-비함유 배지 내에서 성장시켜 Fc 유전자의 발현을 유도하고, 세포를 수확함으로써 발현시켰다. 세포 페이스트를 밤새 동결시키고, 10 mM Tris, 1 mM EDTA 내에서 삼투 쇼크에 의해 용해시켰다. 용해물을 원심분리에 의해 청정화하고, 단백질 A 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 PBS로 세척하고, 단백질 A 시트레이트 용출 버퍼 (0.1 M 시트레이트, pH 3.0)로 가용성 Fc 용출시키고, Tris pH 7.5로 중화시켰다. 가용성 Fc는 Amicon Centriprep에서 농축시켰다.

인간, 사이노몰거스 원숭이, 래트, 또는 마우스로부터의 FcRn을 NHS 화학에 의해 Biacore CM5 칩 상에 다양한 밀도 (100-3000 RU)로 고정화시켰다. Fc 변이체를 PBS 중에 pH 6.0에서 10 ㎛ 내지 1 nM로 계열 희석하고, 결합을 시간에 걸쳐 모니터링하였다. 힌지가 없는 모 Fc (즉, 야생형)에 대해, 평형 결합은 huFcRn에 대해 거의 즉시 도달되었고, 이는 매우 빠른 온률 (on-rate) 및 오프율 (off-rate)을 갖고, 평형 분석에 의해 결정될 때 근사 Kd가 700 nM임을 나타낸다. N434W 변이체에 대해, 온률은 현저하게 더 느리고, 오프율은 극히 느리다. N434W를 보다 느린 유동 속도로 보다 장기간 동안 주입함으로써, 평형 분석이 가능하였고, Kd는 약 4 nM이다. 변이체 N434W, N434F, N434A, 및 삼중 돌연변이체 N434A+E380A+T307A은 야생형 Fc에 비해 친화도가 pH 6.0에서 각각 ~170배, ~9배, ~2.7배, 및 ~14배로 명백하게 증가하였다. 반대로, pH 7.4에서, huFcRn에 대한 N434 변이체의 친화도는 상기 분석으로 효과적으로 측정되기에는 너무 낮다. 야생형에 상대적인 N434W의 개선은 사이노몰거스 FcRn에 대한 결합에서만큼 유의하지 않고, 래트 FcRn에 대한 결합에 대해서만 약 10배 더 우수하고, FcRn에 대한 결합에 대해 WT와 사실상 동일하다. 따라서, 상기 돌연변이에 의해 달성된 개선은 인간 FcRn에 대해 특이적이다.

2H7.v138의 인간 IgG1 변이체를 인간 FcRn에 대한 pH-의존 결합에 대해 비오티닐화 FcRn을 사용하는 ELISA에서 분석하였다. MaxiSorp 96-웰 마이크로웰 플레이트 (넌크)를 2㎍/ml NeutrAvidin (피어스 (Pierce, 미국 일리노이주 록포드))으로 50 mM 카르보네이트 버퍼, pH 9.6 중의 100 ㎕/웰로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 0.05％ 폴리소르베이트를 함유하는 PBS (세척 버퍼), pH 7.4로 세척하고, 0.5％ BSA를 함유하는 PBS, pH 7.4로 150 ㎕/웰로 차단하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션 후, 플레이트를 세척 버퍼, pH 7.4로 세척하였다. 인간 FcRn은 비오틴-X-NHS (리서치 오가닉스 (Research Organics, 미국 오하이오주 클리블랜드))를 사용하여 비오티닐화하였다. 비오티닐화 FcRn을 플레이트에 2 ㎍/ml에서 0.5％ BSA, 0.05％ 폴리소르베이트 20을 함유하는 PBS (샘플 버퍼), pH 7.4 중에 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하고 세척 버퍼, pH 6.0로 세척하였다. 샘플 버퍼, pH 6.0 중의 7개의 IgG 항체의 2배 계열 희석액 (3.1-200 ng/ml)을 플레이트에 첨가하였다. 2시간 인큐베이션 후, 플레이트를 세척 버퍼, pH 6.0로 세척하였다. 결합된 IgG는 퍼옥시다제 표지된 염소 F(ab')₂ 항-인간 IgG F(ab')₂ (잭슨 이뮤노리서치)를 샘플 버퍼, pH 6.0 중의 100 ㎕/웰로 첨가하여 검출하였다. 1시간 인큐베이션 후, 플레이트를 세척 버퍼, pH 6.0로 세척하고, 기질 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB) (키르케가아드 앤 페리 래보래토리스)를 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 반응은 1 M 인산을 100 ㎕/웰로 첨가하여 중지시켰다. 흡광도는 450 nm에서 멀티스캔 Ascent 판독기 (써모 랩시스템즈 (Thermo Labsystems, 핀란드 헬싱키)) 상에서 판독하였다. 표준 곡선의 중간점에서 흡광도 (mid-OD)를 계산하였다. 상기 mid-OD에서 표준품 및 샘플의 상응하는 농도를 적정 곡선으로부터 4-변수 비선형 회귀 곡선-피팅 프로그램 (KaleidaGraph, 시너지 소프트웨어)를 사용하는 결정하였다. 상대 활성은 표준품의 mid-OD 농도를 샘플의 것으로 나누어 계산하였다.

pH 6.0 또는 pH 7.4에서 FcRn으로부터 결합된 IgG의 해리를 평가하기 위해, 분석을 유사하게 수행하되, 단, 샘플 인큐베이션 단계 후 및 플레이트를 세척할 때, pH 6.0 또는 7.4에서 샘플 버퍼를 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 45분 동안 인큐베이션하고 세척하였다. 이어서, 상기 설명한 바와 같이 계속 분석하였다.

실시예 8

FcRn 돌연변이를 갖는 인간화 항- CD20 IgG1 변이체의 특성화

인간 Fc의 파지 디스플레이에 의해 확인된 돌연변이를 또한 무손상 항체, 2H7.v138의 배경에서 그들의 효과에 대해 시험하였다. 2H7.V138은 Fc가 증가된 ADCC 및 CDC 활성을 위해 돌연변이 S298A, K326A, E333A, K334A를 통해 변형된 인간화 항-CD20 항체이다. 위치 N434에서의 돌연변이를 상기 배경 내로 도입하였고, IgG (표 12)를 앞서 설명된 바와 같이 293 세포의 일과적 형질감염에 의해 제조하였다. 각각의 경우에, 정제된 IgG 변이체는 상기 설명한 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피에 의해 낮은 수준의 단백질 응집을 갖는 것으로 나타났다.

인간화 항-CD20 항체 2H7.v138의 변이체

2H7 변이체	FcRn 돌연변이
138	-
364	N434A
477	N434W
478	N434F
479	N434Y

2H7.v138의 인간 IgG1 변이체를 인간 FcRn에 대한 pH-의존 결합에 대해 비오티닐화 FcRn을 사용하는 ELISA에서 분석하였다. MaxiSorp 96-웰 마이크로웰 플레이트 (넌크)를 2㎍/ml NeutrAvidin (피어스)으로 50 mM 카르보네이트 버퍼, pH 9.6 중의 100 ㎕/웰로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 0.05％ 폴리소르베이트를 함유하는 PBS (세척 버퍼), pH 7.4로 세척하고, 0.5％ BSA를 함유하는 PBS, pH 7.4로 150 ㎕/웰로 차단하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션 후, 플레이트를 세척 버퍼, pH 7.4로 세척하였다. 인간 FcRn은 비오틴-X-NHS (리서치 오가닉스)를 사용하여 비오티닐화하였다. 비오티닐화 FcRn을 플레이트에 2 ㎍/ml에서 0.5％ BSA, 0.05％ 폴리소르베이트 20을 함유하는 PBS (샘플 버퍼), pH 7.4 중에 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하고 세척 버퍼, pH 6.0로 세척하였다. 샘플 버퍼, pH 6.0 중의 7개의 IgG 항체의 2배 계열 희석액 (3.1-200 ng/ml)을 플레이트에 첨가하였다. 2시간 인큐베이션 후, 플레이트를 세척 버퍼, pH 6.0로 세척하였다. 결합된 IgG는 퍼옥시다제 표지된 염소 F(ab')₂ 항-인간 IgG F(ab')₂ (잭슨 이뮤노리서치)를 샘플 버퍼, pH 6.0 중의 100 ㎕/웰로 첨가하여 검출하였다. 1시간 인큐베이션 후, 플레이트를 세척 버퍼, pH 6.0로 세척하고, 기질 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB) (키르케가아드 앤 페리 래보래토리스)를 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 반응은 1 M 인산을 100 ㎕/웰로 첨가하여 중지시켰다. 흡광도는 450 nm에서 멀티스캔 Ascent 판독기 (써모 랩시스템즈) 상에서 판독하였다. 표준 곡선의 중간점에서 흡광도 (mid-OD)를 계산하였다. 상기 mid-OD에서 표준품 및 샘플의 상응하는 농도를 적정 곡선으로부터 4-변수 비선형 회귀 곡선-피팅 프로그램 (KaleidaGraph, 시너지 소프트웨어)를 사용하는 결정하였다. 상대 활성은 표준품의 mid-OD 농도를 샘플의 것으로 나누어 계산하였다.

pH 6.0 또는 pH 7.4에서 FcRn으로부터 결합된 IgG의 해리를 평가하기 위해, 분석을 유사하게 수행하되, 단, 샘플 인큐베이션 단계 후 및 플레이트를 세척할 때, pH 6.0 또는 7.4에서 샘플 버퍼를 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 45분 동안 인큐베이션하고 세척하였다. 이어서, 상기 설명한 바와 같이 계속 분석하였다.

결과는 Fc 변이체에 대해 관찰된 것과 유사한 상대 결합 친화도를 나타냈다. pH 6.0에서, 상대 결합 친화도는 v477 > v478 = v479 > v364 > v138이다. pH 7.4에서, 상대 결합 친화도는 pH 6.0에서보다 일관되게 더 약하여, 동일한 상대 결합: v477 > v478 = v479 > v364 > v138을 갖는다.

상기 Fc 돌연변이는 인간 IgG 항체에 폭넓게 적용가능하다.

실시예 9

사이노몰거스 원숭이에서 파일럿 연구에서 2 H7 변이체의 생체 내 효과

CHO 세포의 일과적 형질감염에 의해 생산된 2H7 변이체를 정상 수컷 사이노몰거스 (Macaca fascicularis) 원숭이에서 그들의 생체 내 활성을 평가하기 위해 시험하였다. 다른 항-CD20 항체, 예를 들어 C2B8 (Rituxan(등록상표))는 정상 영장류에서 B-세포를 고갈시키는 능력을 나타냈다 (Reff et al., Blood 83:435-445 (1994)).

한 연구에서, 인간화 2H7 변이체를 비교하였다. 평행 연구에서, Rituxan(등록상표)을 또한 사이노몰거스 원숭이에서 시험하였다. 4마리의 원숭이를 각각의 5가지 용량군에서 사용하였다: (1) 비히클, (2) 0.05 mg/kg hu2H7.v16, (3) 10 mg/kg hu2H7.v16, (4) 0.05 mg/kg hu2H7.v31, 및 (5) 10 mg/kg hu2H7.v31. 항체를 0, 0.2, 또는 20 mg/mL의 농도로 연구의 1일에 1회, 및 8일에 다른 1회로 총 2회 용량으로 정맥내 투여하였다. 투약의 1일은 1일로 지정하고, 전일은 -1일로 지정하고; 회수 1일 (각각의 군에서 2마리 동물에 대해)은 11일로 지정한다. 혈액 샘플은 -19일, -12일, 1일 (투약 전), 및 제1 용량 후 6h, 24h, 및 72h에서 수집하였다. 추가의 샘플은 8일 (투약 전), 10일 (2 동물/군의 희생 전), 및 36일 및 67일 (회수 동물에 대해)에서 취했다.

말초 B-세포 농도는 CD3-/CD40+ 세포를 카운팅한 FACS 방법에 의해 결정하였다. 원숭이 샘플에서 총 림프구의 CD3-CD40+ B 세포는 다음 게이팅 (gating) 방법에 의해 얻었다. 림프구 집단을 전방 스캐터 (scatter)/측면 스캐터 스캐터그램 상에서 표지하여 영역 1 (R1)을 규정하였다. R1에서 이벤트를 이용하여, 형광 강도 점 플롯을 CD40 및 CD3 마커에 대해 표시하였다. 형광 표지된 이소형 대조군을 사용하여, CD40 및 CD3 양성에 대한 각각의 컷오프 (cutoff) 지점을 결정하였다.

결과는 2H7.v16 및 2H7.v31이 모두 10 mg/kg 용량에서 완전 말초 B-세포 고갈 및 0.05 mg/kg 용량에서 부분 말초 B-세포 고갈을 일으킬 수 있음을 나타냈다. 투약의 처음 72h 동안 측정된 B-세포 고갈의 정도 및 시간 경과는 2개의 항체에 대해 유사하였다. 회수 동물을 후속적으로 분석하면 2H7.v31로 치료된 동물이 2H7.v16으로 투약한 것에 비해 B-세포의 장기적인 고갈을 보였음을 나타냈다. 특히, 10 mg/kg 2H7.v16으로 치료한 회수 동물에서, B-세포는 10일 내지 36일에서의 샘플링 사이의 어ㄴ느 시점에 실질적인 B-세포 회수를 보였다. 그러나, 10 mg/kg 2H7.v31로 치료한 회수 동물에 대해, B-세포는 36일 내지 67일 사이의 어느 시점까지 회수를 보이지 않았다. 이는 완전 고갈의 지속시간이 2H7.v16에 비해 2H7.v31이 약 1개월 더 긴 것을 제시한다.

독성은 원숭이 연구에서 저용량 또는 고용량에서 관찰되지 않았고, 육안 병리소견은 정상이었다. 다른 연구에서, v16은 상기 원숭이에서 2주 간격으로 제공된 2회 용량의 i.v. 투여에 따른 평가된 최고 용량 (100 mg/kgx2 = 1200 mg/m²x2)까지 잘 관용되었다.

2H7.v16 대 Rituxan(등록상표)을 사용한 사이노몰거스 원숭이에서 데이타는 CDC 활성에서 5배 감소가 효력에 불리한 영향을 미치지 않음을 제시한다. 강력한 ADCC 활성을 갖지만 감소된 CDC 활성을 갖는 항체는 제1 주입 반응에 관하여 보다 큰 CDC 활성을 갖는 것보다 더 유리한 안정성 프로파일을 가질 수 있다.

실시예 10

종양 성장의 생체 내 억제

Raji 인간 B-세포, 림프종 세포주 (ATCC CCL 86)의 성장을 억제하는 rhuMAb 2H7.v16의 능력을 Balb/c 누드 (비흉선) 마우스에서 평가하였다. Raji 세포는 CD20을 발현하고, 누드 마우스에서 성장하여 전이성 질병을 발생시키는 것으로 보고되었고; 종양 성장은 Rituxan(등록상표)에 의해 억제된다 (Clynes et al., Nature Medicine 6, 443-446 (2000)). 56마리의 8-10주령의 Balb/c 누드 마우스를 7개의 군 (A-G)으로 나누었고, 각각의 군은 8마리 마우스로 이루어진다. 0일에, 각각의 마우스에게 옆구리에 5 x 10⁶ Raji B-림프종 세포를 피하 주사하였다. 0일에서 시작하여, 각각의 마우스에게 100 ㎕의 음성-대조 용액 (PBS; 포스페이트-완충 염수), Rituxan(등록상표) 또는 2H7.v16을 투여하였다. 용량은 체중에 의존적이고, 약물 전달은 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 수행하였다. A군 마우스에는 PBS를 투여하였다. B-D군에는 Rituxan(등록상표)을 각각 5.0 mg/kg, 0.5 mg/kg, 및 0.05 mg/kg로 투여하였다. E-G군 마우스에는 2H7 v.16를 각각 5.0 mg/kg, 0.5 mg/kg, 및 0.05 mg/kg로 투여하였다. 주사는 6주 동안 매주 반복하였다. 치료 동안 매주 간격으로, 각각의 마우스를 주사 부위에서 촉진가능한 종양의 존재에 대해 검사하였고, 존재하는 경우 종양의 부피를 측정하고 기록하였다. 최종 검사는 8주 (치료하지 않은 2주 간격 후)에 이루어졌다.

본 연구의 결과는 rhuMAb 2H7.v16 및 Rituxan(등록상표) 모두가 누드 마우스에서 피하 Raji-세포 종양 성장을 억제하는데 있어서 효과적임을 보여주었다. 종양 성장은 PBS 대조군에서 4주에서 시작하여 관찰되었다. 그러나, 종양 성장은 Rituxan(등록상표) 또는 2H7.v16으로 5 mg/kg 또는 0.5 mg/kg에서 치료한 군에서 8주의 연구 지속기간 동안 관찰되지 않았다. 저용량 0.05 mg/kg 처리군에서, 종양은 2H7군에서 한 마리 및 Rituxan(등록상표)군에서 한 마리의 동물에서 관찰되었다.

실시예 11

중등도 내지 중증 류마티스 관절염에서 rhuMAb 2 H7 (2 H7 . v16 )의 I/II상 연구

목적

본 연구의 주목적은 중등도 내지 중증 류마티스 관절염 (RA)의 대상에서 증가하는 정맥내 (IV) 용량의 rhuMAb 2H7의 안정성 및 관용성을 평가하기 위한 것이다.

연구 설계

본 연구는 중등도 내지 중증 RA의 대상에서 MTX와 조합한 증가하는 용량의 rhuMAb 2H7 (PRO70769)의 안정성의 랜덤화된 위약-제어된 다기관 맹검 I/II상, 조사자- 및 대상-맹검 연구이었다. 연구는 다수의 대상이 참여한, 용량 증가상 및 제2상으로 이루어졌다. 스폰서 (Sponsor)는 치료 할당을 위해 비맹검으로 남을 것이다.

현재 MTX를 사용하는 치료에 대해 불만족스러운 임상 반응을 갖는, 1 내지 5가지 질환 변형성 항-류마티스약 또는 생물학제에 실패한 중등도 내지 중증 RA의 대상을 참여시켰다.

대상은 MTX를 연구 도입 전에 적어도 12주 동안 매주 10-25 mg 범위로 투여받고, 그들의 초기 용량의 연구 약물 (PRO70769 또는 위약)을 투여받기 전에 적어도 4주 동안 안정한 용량으로 있는 것이 요구되었다. 대상은 또한 안정한 용량의 경구 코르티코스테로이드 (매일 10 mg 이하 또는 프레드니손 동등물) 및 안정한 용량의 비스테로이드성 소염약 (NSAID)을 투여받을 수 있다. 대상은 PRO70769 또는 위약 동등물의 2회 IV 주입을 지시된 용량에서 1일 및 15일에 다음 용량 증가 계획에 따라 투여받았다.

용량 증가는 특수한 기준에 따라, 내부 안정성 데이타 검토 위원회에 의한 안정성 데이타의 검토 및 각각의 코호트 (cohort)에서 치료된 마지막 대상에서 제2 주입 72시간 후 급성 독성의 평가 후 일어났다. 용량 증가상 후, 용량 수준이 용량 증가상 동안 관용가능한 것으로 증명되면 추가의 40 대상 (32 활성 및 8 위약)이 다음 용량 수준의 각각에 랜덤화될 것이다: 2x50 mg, 2x200 mg, 2x500 mg 및 2x1000 mg. 약 205 대상이 연구에 참여할 것이다.

B-세포 카운트를 얻고 기록할 것이다. B-세포 카운트는 6개월 효능 평가를 넘어 48주 추적 기간에 유세포 측정기를 사용하여 평가될 것이다. B-세포 고갈은 용량-제한 독성 (DLC)으로 간주되지 않을 것이고, 대신 PRO70769 치료의 예상된 약역학적 성과로 간주될 것이다.

하위연구에서, 혈청 및 RNA 분석을 위한 혈액과 소변 샘플을 대상으로부터 다양한 시점에 얻을 것이다. 상기 샘플을 사용하여 중등도 내지 중증 RA의 대상에서 PRO70769 치료에 대한 반응의 예측이 될 수 있는 생체마커를 확인할 수 있다.

연구 치료

대상의 코호트는 PRO70769 또는 위약 동등물의 2회 IV 주입을 지시된 용량에서 1일 및 15일에 다음 증가 계획에 따라 투여받았다:

- 10 mg PRO70769 또는 위약 동등물: 4 대상 활성 약물, 1 대조군

- 50 mg PRO70769 또는 위약 동등물: 8 대상 활성 약물, 2 대조군

- 200 mg PRO70769 또는 위약 동등물: 8 대상 활성 약물, 2 대조군

- 500 mg PRO70769 또는 위약 동등물: 8 대상 활성 약물, 2 대조군

- 1000 mg PRO70769 또는 위약 동등물: 8 대상 활성 약물, 2 대조군

효능

PRO70769의 효능은 ACR 반응에 의해 측정될 것이다. ACR20, ACR50, 및 ACR70 반응을 달성한 대상의 비율이 처리군에 의해 요약될 것이고, 각각의 군에 대해 95％ 신뢰 간격이 생성될 것이다. 상기 반응의 성분 및 기저선으로부터 그들의 변화가 치료 및 방문에 의해 요약될 것이다.

실시예 12

알라닌 스캐닝 데이타와 결합된 2H7.v16의 결정 구조의 검사로부터, N100 (V_H) 및 이웃 잔기를 포함하는 CDR-H3의 영역이 항원 결합에 참여할 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명자들은 2H7.v16 배경에서 많은 아미노산 치환을 만드는 N100 (V_H)에 주목하였다. 결과 (표 13)은 Tyr 또는 Trp 치환이 v16에 비해 결합을 개선시켰음을 나타냈다.

(IgG 변이체는 2H7.v16 배경에 관하여 돌연변이 (Kabat 넘버링)로 표시됨. 상대 결합은 동등한 결합에 요구되는 변이체의 농도를 초과하는 2H7.v16의 농도로서 표현되기 때문에, 비율 >1은 버전 16에 비해 CD20에 대한 변이체의 개선된 결합 친화도를 나타냄.)

추가의 친화도 개선이 S100a (VH)에서 치환에 의해 얻어질 수 있는지 결정하기 위해, 본 경우에 상기 위치에서 많은 돌연변이를 2H7.v472의 배경에서 만들었다 (표 13). 세포-기재 결합 비교의 결과 (표 14)는 2H7.v511이 세포 상에서 CD20에 대한 결합을 >3배 개선시켰음을 나타냈다.

2H7.v511 중쇄에 대한 유전자는 2H7.v138의 중쇄를 코딩하는 플라스미드의 ssDNA를 주형으로서, 및 CA1568으로 지정된 5'-포스포릴화 데옥시올리고뉴클레오티드: 5'-CCA GAC GTC GAA GTA CCA GTA GCG GTA GCT ATA GTA TAC GAC GCG-3' (서열 45)를 사용하여 부위 지정 돌연변이유발에 의해 구성하였다. 밑줄친 뉴클레오티드는 CDR-H3 변화 N100Y, S100aR을 코딩하는 안티센스 DNA 스트랜드의 코돈에 대응한다. 2H7.v511의 경쇄는 2H7.v138의 것과 동일하고, 동일한 플라스미드가 경쇄의 발현을 위해 사용되었다.

Hu2H7 변이체, 예를 들어 v138 및 v511은 2H7.v16의 발현을 위해 사용된 도 9에 나타낸 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 발현될 수 있다.

(IgG 변이체는 2H7.v16 배경에 비교될 때 CDR 부위에서 돌연변이 (Kabat 넘버링)로 표시됨. 또한, 모든 변이체는 2H7.v16에 비교할 때 Fc 변화 S298A, K326A, E333A 및 K334A (EU 넘버링)을 포함함. 상대 결합은 동등한 결합에 요구되는 변이체의 농도를 초과하는 2H7.v16의 농도로서 표현되기 때문에, 비율 >1은 버전 16에 비교한 CD20에 대한 변이체의 개선된 결합 친화도를 나타냄.)

상기 변이체는 또한 Fc 변화를 포함하기 때문에, 겉보기 평형 해리 상수 (K_d)를 결정하기 위해 경쟁적 스캐챠드 분석으로 결합을 추가로 측정하였다.

평형 해리 상수 (K_d)는 방사성표지된 항체 2H7.v511 및 2H7.v138 IgG를 사용하여 WIL2s-S 세포에 대한 인간화 항-CD20 모노클로날 항체 결합에 대해 결정되었다. 항-CD20 모노클로날 항체는 CHO 세포에서 생산하였다. 모든 희석은 결합 분석 버퍼 (0.5％ 소 혈청 알부민, 25 mM HEPES pH 7.2, 및 0.01％ 나트륨 아지드를 함유하는 DMEM 배지) 내에서 수행하였다. 0.1 nM의 농도에서 ¹²⁵I-2H7.v511 및 ¹²⁵I-2H7.v138 (락토퍼옥시다제를 사용하여 요오드화된)의 분취액 (0.05 mL)을 V-바닥 96-웰 마이크로분석 플레이트의 웰에 분배하였다. 비표지된 항체의 계열 희석액 (0.05 mL)을 첨가하고 혼합하였다. 0.05 mL의 부피에서 30,000 WIL2-S 세포를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 24h 동안 인큐베이션한 후, 15분 동안 2,500 RPM으로 원심분리하였다. 이어서, 상등액을 흡인하고, 세포 펠렛을 세척하고 원심분리하였다. 상등액을 다시 흡인하고, 펠렛을 1N NaOH에 용해시키고, 감마 카운팅을 위해 튜브에 옮겼다. 데이타를 프로그램 Ligand (McPherson, Comput. Programs Biomed. 17: 107-114 (1983))를 사용하는 스캐챠드 분석 (Munson and Rodbard, Anal. Biochem. 107:220-239 (1980))을 위해 사용하였다. 하기 표 15에 나타낸 결과는 항-CD20 모노클로날 항체 2H7.v511 및 2H7.V138이 WIL2-S 세포 상에서 발현된 CD20에 높은 친화도로 결합하고, 2H7.v511은 2H7.v16보다 2.2배 내지 7.3배 더 높은 친화도로 결합하는 것을 나타낸다. 표지된 ¹²⁵I-2H7.v511 및 ¹²⁵I-2H7.v138을 사용하여 얻은 값에서의 차이는 2H7.v511의 CDR-H3에서 새로운 Tyr의 요오드화로 인한 항원 결합의 교란을 반영할 수 있다. 따라서, ¹²⁵I-2H7.v138 결과는 상대 결합 친화도를 보다 정확하게 반영하는 것으로 보인다.

2H7 변이체의 결합 활성의 추가의 비교로서, 가용화 CD20을 사용하여 ELISA를 수행하였다. 비교를 위해, 2H7.v16에 동일한 CDR 영역 및 2H7.v511에 동일한 Fc 영역을 갖는 다른 변이체, 2H7.v588을 구성하였다.

NUNC Maxisorp™ 플레이트를 2.5 ㎍/ml의 가용성 CD20 (제넨테크; 앞서 설명된 바와 같이 제조된)로 PBS 중에서 밤새 4℃에서 코팅한 후, 0.5％ BSA로 실온에서 1 h 동안 차단하였다. 0.5％ BSA 중 샘플의 계열 희석액을 플레이트 상에서 2 h 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 결합된 항체는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (키르케가아드 앤 페리 래보래토리스)을 기질로서 사용하여 HRP-접합된 항-인간 Fab 항체 (염소 항-인간 Ig, Fab'2-HRP 접합체, (NB))로 검출하였다. 흡광도는 450 nm에서 판독하였다. 적정 곡선은 4-변수 비선형 회귀 곡선-피팅 프로그램 (KaleidaGraph; 시너지 소프트웨어)으로 피팅하였다. 표준품의 적정 곡선의 중간점 흡광도에 상응하는 항체 변이체의 농도를 계산하였다. 결과 (도 3)는 2H7.v588 및 2H7.v16에 대한 것과 유사한 결합 친화도를 보였지만; 2H7.v511은 상기 분석에서 가용성 CD20에 대한 약 90배 향상된 결합을 갖는 것으로 나타났다.

실시예 13

ADCC 활성

ADCC 활성을 WIL2-S 세포 및 정상 인간 공여자로부터의 정제된 NK 세포를 사용하여 도 4에 대해 약 4의 효과기:표적 비율 및 도 11 분석에 대해 5:1의 비율로 이전에 설명된 바와 같이 평가하였다. 도 4 및 도 11에 나타낸 결과는 2H7.v16 및 다른 2H7 변이체에 비교할 때 2H7.V511에 대해 증가된 ADCC 효력 및 최대 활성을 나타냈다. 2H7.v588은 2H7.v511에 대해 유사한 효력 및 최대 활성을 보였고 (도 4), 이는 추가의 CD20 친화도 개선이 ADCC 활성을 유의하게 향상시킬 수 없음을 나타낸다.

실시예 14

CDC 활성

CDC 활성을 또한 WIL2-S 세포 및 인간 보체를 사용하여 상기 설명한 바와 같이 평가하였다. 도 5에 나타낸 결과는 2H7.v588에 비교할 때 2H7.v511에 대한 증가된 CDC 효력, 및 2H7.v16에 비해 크게 증가된 효력을 나타냈다. 앞서 설명된 변이체를 사용하여 관찰된 바와 같이, 향상된 CD20 친화도는 시험관 내 CDC 활성을 향상시키는 것으로 보인다. 2H7.v511을 다른 2H7 변이체와 비교하는 별도의 CDC 분석에서, v511은 또한 도 10에 나타낸 바와 같이 v31, v488 및 v114에 비해 증가된 CDC 활성을 나타냈다. 도 10에서 CDC 분석은 96 마이크로웰 플레이트 포맷에서 본질적으로 상기 설명한 바와 같이 수행하되, 다음과 같이 변형하였다. 50 ㎕의 계열 희석된 2H7.v511 (및 실시예 15에서 도 12에 요약된 실험에서 Rituxan) (300-1000 nM에서 시작함)을 50 ㎕의 정상 인간 혈청 보체 (퀴델)의 1:4 희석액과 함께, 50 ㎕의 정상 B 세포 (1x10⁶/ml, 웰 당 50,000 세포) 또는 50 ㎕의 WIL2-S 세포 (30,000)와 함께 인큐베이션하였다. 정상 B 세포는 헤파린 내에 채혈한 전혈로부터 네가티브 선택 (Rosettesep, 스템셀 테크놀로지스 (StemCell Technologies)), 및 Ficoll-Paque Plus (아머샴 바이오사이언시즈 (Amersham Biosciences)) 구배 분리를 이용하여 단리하였다. 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 50 ㎕의 Alamar Blue (바이오소스 인터내셔널 (Biosource International))을 첨가하고, 추가로 18시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 15분 동안 간단히 진탕한 후, 형광 플레이트 판독기 (Ext. 535, Emt 595) 상에서 판독하여 상대 형광 단위 (RFU)를 결정하였다. 관찰된 RFU 값을 KaleidaGraph로 mAb의 농도에 대해 플로팅하고, 4 변수 피트를 이용하여 곡선을 그렸다.

실시예 15

생체 내 B 세포 고갈

B-세포 고갈의 트랜스제닉 마우스 모델에서 2H7.v511의 생체 내 활성을 2H7.v16과 비교하였다. 트랜스제닉 마우스 (hCD20 Tg^+/+ mCD16^-/- hCD16 Tg^+/-) (n=5/군)에게 마우스 당 125 ㎍ 또는 12.5 ㎍ (5 및 0.5 mg/kg에 동등함)의 항체를 정맥내 주사하였다. 각각의 도 6, 7, 13, 및 14에서 hIgG1 (빈 막대)은 이소형 대조 항체이다. 2일에, 혈액 및 선택된 조직 컴파트먼트 내의 B-세포의 수를 FACS 분석으로 계수하였다. 결과 (도 6)는 2H7.v511이 저용량 및 고용량 모두에서 2H7.v16보다 혈액 및 복강 내의 B-세포를 더 효과적으로 고갈시켰음을 보여주었다. 비장에서 (도 7), 2H7.v511은 저용량에서 약간 내지 유의하게 더 큰 고갈을 보였지만, 상기 차이는 고용량에서 보이지 않았다. 도 8은 실험의 개략도이고, v16 및 v511 사이의 CD20 결합 및 Fc 기능의 수준을 요약한 것이다.

2H7.v511 B 세포 고갈을 또한 마우스 모델에서 리툭시맙 (Rituxan(등록상표))과 비교하였고; 실험은 도 12에 개략적으로 나타낸다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 2H7.v511은 저용량 및 고용량 모두에서 혈액 및 복강에서 리툭시맙보다 더 큰 B-세포 고갈을 보였다. 도 14는 비장에서 B 세포 고갈을 보여준다. 0.5 mg/kg (도면에서 12.5 ㎍)의 저용량에서, 총 및 여포 비장 B-세포 고갈은 v511을 사용할 때가 리툭시맙을 사용할 때보다 더 효과적이었지만; v511은 변연대 B-세포 고갈을 매개하는데 있어서 리툭시맙과 유사하거나 그보다 약간 덜 효과적인 것으로 나타났다.

2H7.v511의 생체 내 효과를 또한 사이노몰거스 원숭이에서 본질적으로 상기 실시예 9에 설명된 바와 같이 연구한다.

실시예 16

종양 성장의 생체 내 억제

Raji 인간 B-세포, 림프종 세포주 (ATCC CCL 86)의 성장을 억제하는 2H7.v511의 능력을 Balb/c 누드 (비흉선) 마우스에서 상기 실시예 10에 설명된 바와 같은 절차에 따라 평가한다.

실시예 17

약동학에 대한 FcRn 결합 효과의 생체 내 연구

상기 Fc 변이체 항체의 생체 내 약동학에 대한 개선된 FcRn 결합의 효과를 결정하기 위해, 사이노몰거스 (Macaca fascicularis) 원숭이 또는 다른 영장류 종에게 각각의 항체 변이체를 정맥내 주사하고, 항체의 청소율을 모니터링하기 위해 혈액 샘플을 시간에 걸쳐 수집하였다. 몇몇 동물에게 1회 이상의 용량 수준을 주사한다. 한 실험에서, 1-20 mg/kg의 단일 i.v. 용량을 1일에 시간 0에서 주사한다. 혈액 (혈청) 샘플은 각각의 동물로부터 투약 전 및 투약 후 6h, 24h, 및 72h에서 수집한다. 추가의 샘플은 8일, 10일, 30일 및 60일에 수집한다. 혈청 샘플 내의 항체의 농도는 ELISA를 이용하여 결정된다. 혈청 내의 항체 농도에서 시간-의존적 감소는 표준 약물학 기술을 이용하여 모델링한다 (Shargel and Yu, Applied Pharmaceutics and Pharmacokinetics, Fourth edition, pp. 67-98, Appleton and Lange, Stamford, CT (1999)). 조직으로의 항체의 초기 분포 (알파상)에 이어 종말 또는 제거상 (베타상)을 밝히기 위해 2-컴파트먼트 모델을 사용한다. FcRn이 혈류에서 IgG를 유지하는 기능을 하기 때문에 이렇게 계산된 제거 반감기 (t_{1 /2} ^β)는 개선된 FcRn 결합의 효과를 보여준다.

실시예 18

CLL 환자로부터의 세포를 사용한 ADCC , CDC 활성

본 연구에서, CLL 환자로부터의 B 세포에 대한 항체 2H7.v511 및 v114의 보체 활성을 시험하였다. PBMC를 3명의 CD20-양성, CLL 환자 (CLL 환자에서, PBMC 분획에서 발견된 대부분의 세포는 B 세포임)로부터 단리하였다. 96웰 마이크로웰 포맷에서, 각각의 환자로부터의 50,000 PBMC를 50 ㎕의 적정된 mAb (v114, v511, 또는 Rituxan™)과 1000 nM에서 시작하여 항체의 1:3배 계열 희석액으로 혼합하였다. 각각의 웰에 1:4로 희석된 50 ㎕의 정상 인간 혈청 보체를 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 50 ㎕의 대사적 염료 표시제인 Alamar Blue (용해 표시제)을 첨가하고, 37℃에서 밤새 (~16시간) 계속 인큐베이션하였다. 96-웰 플레이트를 실온에서 1분 동안 진탕하고, 형광 플레이트 상에서 535 nm/590 nm에서 판독하였다. 상대 형광 단위 대 항체 농도를 플로팅하여 EC50을 얻었다. CDC 활성에서 v114 및 Rituxan을 비교하는 도 15, 및 v511 및 Rituxan을 비교하는 도 16에 나타낸 결과로부터, 모든 3명의 환자에 대해 v511 및 v114는 모두 효력이 거의 동등하였지만, Rituxan 및 v.16보다 유의하게 더 양호하였다.

별도의 연구에서, MEC1 B-CLL 세포주 (Stacchini, A et al., (1999) Leukemia Res. 23, 127-136) 및 B-CLL 환자로부터의 B 세포 (B 세포 관련 CLL)를 사용하는 2H7v.511 및 Rituxan의 ADCC 효력을 시험관 내 분석으로 비교하였다. 실험을 다음과 같이 수행하였다. NK 세포를 제조사 (RosetteSep, 스템셀 테크놀로지스)의 권장 프로토콜에 따라 네가티브 선택을 이용하여 100 mL의 정상 인간 전혈로부터 단리하였다. 전혈 공여자는 NK 세포 상에서 CD16의 표현형 발현에서 변화한다. 대립유전자 차이는 위치 158에서 일어나고, 발린-발린, 발린-페닐알라닌, 및 페닐알라닌-페닐알라닌 표현형을 포함한다. 일반적으로, 분석은 발린-페닐알라닌 표현형을 사용하여 수행하였다. 분석은 둥근 바닥 96 마이크로웰 플레이트에서 다음과 같이 이루어졌다. 50 ㎕의 계열 희석된 양의 mAb (10-100 nm에서 시작하여)을 50 ㎕의 표적 세포와 함께 인큐베이션하였다. 표적 세포는 B-CLL MEC1 세포주 (50 ㎕ 당 10,000 및 또한 B-CLL 환자로부터의 PBMC (50 ㎕ 당 30,000)를 포함한다. PBMC는 표준 Ficoll-Paque Plus 구배 분리를 이용하여 CLL 공여자의 전혈로부터 단리하였다. 계열 희석된 항체와 함께 30분 실온 인큐베이션 후, 50 ㎕의 NK 세포 (50,000)를 첨가하고, 추가로 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 1500 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 100 ㎕의 세포 배지를 제거하였다. 세포 용해 수준은 용해된 세포로부터 방출된 락테이트 데히드로게나제의 양을 측정함으로써 (LDH 키트, 로슈) 결정하였다. mAb 농도에 대한 용해 ％를 결정하고 KaleidaGraph에서 4-변수 곡선 피트를 이용하여 플로팅하였다. IC₅₀ 값은 MEC1 세포주에 대해 기록하였다. 포인트 대 포인트 선 그래프를 사용하여 CLL PBMC 데이타를 플로팅하고, 30, 5, 및 0.8 nM에서 사멸 ％를 기록하였다.

결과는 2H7V.511의 ADCC 활성이 모든 3명의 환자 샘플에서 Rituxan보다 더 높음을 보여주었다. 30 nM, 5 nM 및 0.8 nM의 항체에서, Rituxan보다 우월한 2H7v.511의 개선은 각각 2.8배, 6.2배 및 5.4배이었다. NK 세포는 VF 표현형의 것이었다.

2H7v.511의 ADCC 활성은 또한 MEC1 세포의 세포 용해를 매개하는 데 있어서 Rituxan보다 더 높았다. 2H7v.511은 13배 더 높은 활성을 가졌고, 2H7v.511의 IC₅₀은 0.95 pM이고 Rituxan은 0.012 nM이었다. NK 세포는 VV 표현형의 것이었다.

결론

요약하면, 2H7.v511 및 v114는 2H7.v16에 비해 증가된 CD20 결합 친화도, 증가된 CDC 활성, 증가된 ADCC 활성, 및 생체 내 B-세포 고갈에 대한 증가된 생체 내 효력을 보인다.

실시예 19

연구는 사이노몰거스 원숭이에서 2H7.v511 및 v114를 사용하여 안전성, 영장류에서 PK, 및 생체 내 정상 B 세포 고갈을 평가하기 위해 하기 표에 나타낸 연구 설계에 따라 수행하였다. 동물에게 각각의 용량 수준에서 1주 1회씩 4회 투여하였다. 2.5 또는 50 mg/kg x 4 투약에서의 동물의 분석은 v511 및 v114를 사용할 때 말초 B 세포 고갈을 보였다. 50 mg/kg에서 v511을 사용하는 파일럿 연구에서, 말초 B 세포는 신속하고 완전히 고갈되었다. 부검 소견에 기초하여, 조직 B 세포는 또한 상기 용량에서 유의하게 고갈되었다.

군	수컷/암컷의 수	용량 수준 (mg/kg)	안락사 수
			29일	254일
1	4/4	0 (대조군)	2/2	2/2
2	4/4	2.5	2/2	2/2
3	4/4	5	2/2	2/2
4	4/4	10	2/2	2/2
5	4/4	25	2/2	2/2
6	4/4	50	2/2	2/2

실시예 20

NHL 에 대한 I/ II 상 임상 연구

하기 표는 하나의 연구에서 항체 hu2H7.v16 및 평행 연구에서 hu2H7.v511를 사용하여 비-호지킨 림프종 (NHL)을 치료하기 위한 하나의 I/II상 임상 연구 설계를 보여준다. 항체는 정맥내 주입을 통해 투여된다. 상기 투약 요법은 또한 상기한 본 발명의 다른 hu2H7 변이체에서 사용될 수 있다.

비-호지킨 림프종에 대한 2H7 I/II상 연구 - 용량/주입 속도

코호트	1주	2주	3주	4주	총 용량
A	100 mg/m2 Rituxan-유사 주입	100 mg/m2 Rituxan-유사 주입	100 mg/m2 Rituxan-유사 주입	100 mg/m2 Rituxan-유사 주입	400 mg/m2
B	250 mg/m2 Rituxan-유사 주입	250 mg/m2 Rituxan-유사 주입	250 mg/m2 Rituxan-유사 주입	250 mg/m2 Rituxan-유사 주입	1000 mg/m2
C	375 mg/m2 Rituxan-유사 주입	375 mg/m2 Rituxan-유사 주입	375 mg/m2 Rituxan-유사 주입	375 mg/m2 Rituxan-유사 주입	1500 mg/m2
D	375 mg/m2 Rituxan-유사 주입	375 mg/m2 가속 주입	375 mg/m2 가속 주입	375 mg/m2 가속 주입	1500 mg/m2
E	100 또는 250 mg/m2 Rituxan-유사 주입	375 mg/m2 가속 주입	375 mg/m2 가속 주입	375 mg/m2 가속 주입	1225 또는 1375 mg/m2

실시예 21

NHL 에 대한 I상 임상 연구 2

하기 표는 하나의 연구에서 항체 hu2H7.v16 및 평행 연구에서 hu2H7.v511을 사용하여 비-호지킨 림프종 (NHL)을 치료하기 위한 또다른 I상 임상 연구 설계를 보여준다. 항체는 정맥내 주입을 통해 투여된다. 상기 투여 요법은 또한 상기한 본 발명의 다른 hu2H7 변이체와 함께 사용될 수 있다. 각각의 용량은 3주 간격으로 총 8회 용량 제공된다.

3 코호트 (10 환자/코호트) q3wksx8

코호트 (총 용량) mg/m2	용량 1 (mg/m2)	용량 2	용량 3	용량 3	용량 4	용량 5	용량 6	용량 7	용량 8
A 1600	200	200	200	200	200	200	200	200	200
B 3000	375	375	375	375	375	375	375	375	375
C 5625	375	750	750	750	750	750	750	750	750

실시예 22

NHL 에 대한 I/ II 상 용량 증가 코호트

하기 표는 항체 hu2H7.v511을 사용하여 비-호지킨 림프종 (NHL)을 치료하기 위한 I/II상 임상 연구 설계를 보여준다. 환자는 매주 x 4주 투약되었다. 효능은 예를 들어, CT 스캔에 의한 종양 감소량에 의해 측정한다.

(코호트 당 3-6 환자)

	1주	2주	3주	4주	총 용량
A	12.5 mg/m2	12.5 mg/m2	12.5 mg/m2	12.5 mg/m2	50 mg/m2
B	25 mg/m2	25 mg/m2	25 mg/m2	25 mg/m2	100 mg/m2
C	50 mg/m2	50 mg/m2	50 mg/m2	50 mg/m2	200 mg/m2
D	100 mg/m2	100 mg/m2	100 mg/m2	100 mg/m2	400 mg/m2
E	200 mg/m2	200 mg/m2	200 mg/m2	200 mg/m2	800 mg/m2
F	400 mg/m2	400 mg/m2	400 mg/m2	400 mg/m2	1600 mg/m2
G	800 mg/m2	800 mg/m2	800 mg/m2	800 mg/m2	3200 mg/m2

실시예 23

NHL 에 대한 I/ II 상 용량 증가 코호트

하기 표는 항체 hu2H7.v511을 사용하여 비-호지킨 림프종 (NHL)을 치료하기 위한 또다른 I/II상 임상 연구 설계를 보여준다. 환자는 매주 x 4주 투약되었다. 효능은 예를 들어 CT 스캔에 의한 종양 감소량에 의해 측정한다.

	1주	2주	3주	4주	총 용량
A	25 mg/m2	25 mg/m2	25 mg/m2	25 mg/m2	100 mg/m2
B	25 mg/m2	50 mg/m2	50 mg/m2	50 mg/m2	175 mg/m2
C	50 mg/m2	100 mg/m2	100 mg/m2	100 mg/m2	350 mg/m2
D	100 mg/m2	200 mg/m2	200 mg/m2	200 mg/m2	700 mg/m2
E	200 mg/m2	400 mg/m2	400 mg/m2	400 mg/m2	1,400 mg/m2
F	400 mg/m2	800 mg/m2	800 mg/m2	800 mg/m2	2,800 mg/m2

실시예 24

중등도 내지 중증 류마티스 관절염에서 2 H7 . v511 의 I/ II 상 연구

연구 치료의 설계

대상의 코호트는 hu2H7.v511 또는 위약 동등물의 2회 IV 주입을 지시된 용량에서 1일 및 15일에 다음 증가 계획에 따라 투여받았다:

- 10 mg hu2H7.v511 또는 위약 동등물: 8 대상 활성 약물, 2 대조군

- 50 mg hu2H7.v511 또는 위약 동등물: 8 대상 활성 약물, 2 대조군

- 100 mg hu2H7.v511 또는 위약 동등물: 8 대상 활성 약물, 2 대조군

- 200 mg hu2H7.v511 또는 위약 동등물: 8 대상 활성 약물, 2 대조군

- 300 mg hu2H7.v511 또는 위약 동등물: 8 대상 활성 약물, 2 대조군

- 500 mg hu2H7.v511 또는 위약 동등물: 8 대상 활성 약물, 2 대조군

효능

2H7.v511의 효능은 ACR 반응에 의해 측정할 것이다. ACR20, ACR50, 및 ACR70 반응을 달성한 대상의 백분율은 처리군에 의해 요약될 것이고, 각각의 군에 대해 95％ 신뢰 간격이 생성될 것이다.

참고문헌

특허, 공개된 출원 및 다른 간행물을 포함하여 본원에서 인용된 참고 문헌은 본원에 참고로 포함된다.

본 발명은 달리 나타내지 않으면 당업계에 알려져 있는 통상적인 분자생물학 기술 등을 사용할 것이다. 상기 기술은 문헌에 상세히 설명되어 있다 [예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al., eds., 1987 updated); Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukarvotic Genes (A. Bothwell et al., eds., Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu et al., eds., Academic Press 1995); PCR: A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller ＆ M. Calos eds., 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler ed., 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard et al., eds., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2^nd Ed. (R. Freshney et al. eds., Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed et al., eds., Wiley-Liss 1990); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Wirth M. and Hauser H. (1993); Immunochemistrv in Practice, 3rd edition, A. Johnstone ＆ R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock ＆ P. Petrusz eds., Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir ＆ C. Blackwell, eds.); Current Protocols in Immunology (J. Coligan et al., eds. 1991); Immunoassay (E. P. Diamandis ＆ T.K. Christopoulos, eds., Academic Press, Inc., 1996); Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New York; Ed Harlow and David Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Antibody Engineering, 2^nd edition (C. Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995); and the series Annual Review of Immunology; the series Advances in Immunology 참조].

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Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 125 130 135 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 140 145 150 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 155 160 165 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 170 175 180 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 185 190 195 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 200 205 210 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 215 220 225 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 320 325 330 Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys 335 340 345 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 350 355 360 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 365 370 375 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 380 385 390 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 395 400 405 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 410 415 420 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 425 430 435 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 440 445 450 Gly Lys <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 35 ctacaccttc acgagctata acatgcactg ggtccg 36 <210> 36 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 36 gattaatcct gacaacggcg acacgagcta taaccagaag ttcaagggcc 50 g 51 <210> 37 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 37 gaatgggttg cagcgatcta tcctggcaac ggcgacac 38 <210> 38 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 38 attattgtgc tcgagtggtc tactatagca acagctactg gtacttcgac 50 gtctggggtc aagga 65 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 39 ctgcacagcc agctcttctg tcagctatat gcattg 36 <210> 40 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 40 aactactgat ttacgctcca tcgaacctcg cgtctggagt cc 42 <210> 41 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 41 tattactgtc aacagtggag cttcaatccg cccacatttg gacag 45 <210> 42 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 42 gtttcactat aagtgtcgac aagtccaaaa acacatt 37 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 43 gccaggatag atggcgccaa cccattccag gcc 33 <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 44 aagctccgaa accactgatt tacgct 26 <210> 45 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 45 ccagacgtcg aagtaccagt agcggtagct atagtatacg acgcg 45 <210> 46 <211> 285 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys 1 5 10 15 Leu Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile 20 25 30 Leu Pro Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly 35 40 45 Lys Leu Leu Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys 50 55 60 Leu Thr Val Val Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp 65 70 75 Leu Ala Ser Leu Arg Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys 80 85 90 Leu Pro Ala Gly Ala Gly Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala 95 100 105 Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro 110 115 120 Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val 125 130 135 Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile 140 145 150 Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Thr Phe 155 160 165 Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu 170 175 180 Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile 185 190 195 Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His 200 205 210 Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser 215 220 225 Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu 230 235 240 Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu 245 250 255 Gly Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile 260 265 270 Ser Leu Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu 275 280 285 <210> 47 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala 1 5 10 15 Pro Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg 20 25 30 His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro 35 40 45 Ala Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln 50 55 60 Glu Ser Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro 65 70 75 Gly Leu Leu Phe Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val 80 85 90 Leu Ala Leu Val Leu Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln 95 100 105 Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp 110 115 120 Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro 125 130 135 Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu 140 145 150 Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His Ser Val Pro Val Pro Ala 155 160 165 Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr Lys Thr Ala Gly 170 175 180 Pro Glu Gln Gln <210> 48 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala 1 5 10 15 Pro Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg 20 25 30 His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro 35 40 45 Ala Gly Ala Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro 50 55 60 Gln Glu Ser Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu 65 70 75 Pro Gly Leu Leu Phe Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu 80 85 90 Val Leu Ala Leu Val Leu Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg 95 100 105 Gln Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly 110 115 120 Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp Lys Val Ile Ile Leu Ser 125 130 135 Pro Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala Trp Pro Pro Pro Gly 140 145 150 Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His Ser Val Pro Val Pro 155 160 165 Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr Lys Thr Ala 170 175 180 Gly Pro Glu Gln Gln 185

Claims (56)

1. 서열 25의 L쇄 가변 영역 (V_L) 서열 및 서열 8의 H쇄 가변 영역 (V_H) 서열을 포함하지만 VH-CDR2 내에 D56A의 아미노산 치환을 갖고 VH-CDR3 내의 N100이 Y 또는 W로 치환된, 인간 CD20에 결합하는 인간화 2H7 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
2. 제1항에 있어서, N100이 Y로 치환된 것인 항체.
3. 제1항에 있어서, N100이 W로 치환된 것인 항체.
4. 제1항에 있어서, VH-CDR3 내에 치환 S100aR을 추가로 포함하는 항체.
5. 제4항에 있어서, IgG Fc 영역에 ADCC (항체-의존성 세포 매개 세포독성, Antibody-Dependnet Cellular Cytotoxicity) 활성 및/또는 CDC (보체-의존성 세포독성, Complement-Dependent Cytotoxicity) 활성을 개선시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 항체.
6. 제5항에 있어서, 아미노산 치환 S298A, E333A, K334A, K326A를 포함하는 IgG1 Fc를 포함하는 항체.
7. 제4항에 있어서, Fc 영역 내에 ADCC 활성은 개선시키지만 CDC 활성은 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 항체.
8. 제7항에 있어서, 적어도 아미노산 치환 K322A를 포함하는 항체.
9. 제8항에 있어서, 아미노산 치환 S298A, E333A, K334A를 추가로 포함하는 항체.
10. 제6항에 있어서, 서열 26의 경쇄 서열 및 서열 34의 중쇄 서열을 포함하는 항체.
11. 제4항에 있어서, 항체 2H7.v16에 비해 3배 이상 증가된 친화도로 인간 CD20에 결합하는 항체.
12. 제4항에 있어서, 항체 2H7.v16에 비해 6배 이상 증가된 친화도로 인간 CD20에 결합하는 항체.
13. 제6항에 있어서, 2H7.v16보다 20배 이상 더 큰 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 나타내는 항체.
14. 제6항에 있어서, 2H7.v16보다 25배 이상 더 큰 보체 세포독성을 나타내는 항체.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 독성제에 접합된 항체.
16. 제15항에 있어서, 세포 독성제가 방사성 동위원소 또는 독소인 항체.
17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, CHO 세포 (Chinese Hamster Ovary cell, 차이니즈 햄스터 난소 세포)에서 생산된 것인 항체.
18. 제1항의 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
19. 제1항 또는 제10항의 항체를 코딩하는 발현 벡터.
20. 제18항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
21. 제20항에 있어서, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는 숙주 세포.
22. 제20항에 있어서, 서열 26의 경쇄 서열 및 서열 34의 중쇄 서열을 포함하는 항체를 생산하는 숙주 세포.
23. 제22항에 있어서, CHO 세포인 숙주 세포.
24. 제21항의 숙주 세포를 배양하고, 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체의 생산 방법.
25. 제1항의 항체 및 담체를 포함하는 조성물.
26. 제25항에 있어서, 제10항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
27. 용기, 및

    상기 용기에 함유된, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 조성물

    을 포함하는 제조품.
28. 제27항에 있어서, 조성물이 비-호지킨 림프종 치료용임을 나타내는 포장 삽입물(package insert)을 추가로 포함하고, 항체는 서열 26의 경쇄 서열 및 서열 34 의 중쇄 서열을 포함하는 것인 제조품.
29. 제27항에 있어서, 조성물이 류마티스 관절염 치료용임을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함하는 제조품.
30. CD20-양성 암 환자에게 치료 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 인간화 2H7 항체를 투여하는 것을 포함하는, CD20-양성 암의 치료 방법.
31. 제30항에 있어서, CD20-양성 암이 B 세포 림프종 또는 백혈병인 방법.
32. 제31항에 있어서, CD20-양성 암이 비-호지킨 림프종 (NHL, Non-Hodgkin's Lymphoma)인 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 암이 만성 림프구성 백혈병 (CLL, Chronic Lymphocytic Leukemia) 또는 소림프구성 림프종 (SLL, Small Lymphocytic Lymphoma)인 방법.
34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 항체가 서열 26의 경쇄 아미노산 서열 및 서열 34의 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
35. 제31항에 있어서, 항체가 정맥내 주입을 통해 투여되는 것인 방법.
36. 제35항에 있어서, 항체가 1회 투여 당 약 100 mg/m² 내지 375 mg/m² 범위의 투여량으로 투여되는 것인 방법.
37. 제36항에 있어서, 항체가 4회 이상의 투여 동안 1회 투여 당 375 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것인 방법.
38. 제30항에 있어서, 환자에게 1종 이상의 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
39. 제38항에 있어서, 암이 비-호지킨 림프종 (NHL)이고, 화학요법제가 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니솔론으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
40. 자가면역 질환 환자에게 치료 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 인간화 2H7 항체를 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환의 완화 방법.
41. 제40항에 있어서, 항체가 서열 26의 경쇄 아미노산 서열 및 서열 34의 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
42. 제41항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스 관절염 및 연소성 류마티스 관절염, 루푸스 신염을 비롯한 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 베게너병, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발신경병증, 중증 근무력증, ANCA 관련 맥관염, 진성 당뇨병, 레이나우드 증후군, 쇼그렌 증후군, 시신경 척수염 (NMO) 및 사구체신염으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
43. 제42항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스 관절염인 방법.
44. 제43항에 있어서, 환자에게 제2 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
45. 제44항에 있어서, 제2 치료제가 면역억제제인 방법.
46. 제45항에 있어서, 면역억제제가 메토트렉세이트인 방법.
47. 제43항에 있어서, 항체가 정맥내 투여되거나 피하 투여되는 것인 방법.
48. 제43항에 있어서, 항체가 1회 투여 당 10 mg 내지 500 mg 범위의 투여량으로 정맥내 투여되는 것인 방법.
49. 제48항에 있어서, 항체가 1회 투여 당 100 mg의 투여량으로 투여되는 것인 방법.
50. 제40항에 있어서, 환자에게 제2 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
51. 제50항에 있어서, 제2 치료제가 BAFF 길항제인 방법.
52. 제51항에 있어서, BAFF 길항제가 항-BR3 항체 또는 BR3-Fc 융합 단백질인 방법.
53. 제30항에 있어서, 환자에게 VEGF 길항제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
54. 20 mM 아세트산나트륨 (pH 5.5), 4％ 트레할로스 이수화물, 0.02％ 폴리소르베이트 20 (Polysorbate 20) 중의 인간화 2H7.v511 항체 약 20 mg/ml를 포함하는, 정맥내 투여용 액체 제제.
55. 20 mM 아세트산나트륨 (pH 5.3), 240 mM (8％) 트레할로스 이수화물, 0.02％ 폴리소르베이트 20 중의 인간화 2H7.v114 항체 약 20 mg/ml를 포함하는 액체 제제.
56. 20 mM 아세트산나트륨 (pH 5.3), 4％ 트레할로스 이수화물, 0.02％ 폴리소르베이트 20 중의 인간화 2H7.v16 항체 약 30 mg/ml를 포함하는, 정맥내 투여용 액체 제제.

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