KR20070035483A - 태반 및 뇌하수체 아형 유래의 키메라 인간 성장 호르몬 및상기 키메라의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 성장 호르몬을 코딩하는 서열번호 3을 갖는 신규한 hGH-NV cDNA 키메라에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유전자 특이적 프라이머를 이용한 역전사에 의해 상기 cDNA 아형을 증폭하는 단계; 상기 증폭된 cDNA 아형을 클로닝하는 단계; 상기 클로닝된 cDNA 아형을 특정한 제한효소 부위에서 소화시키는 단계; 및 소화된 cDNA 아형내의 hGH-V 절편 특이적 영역을 hGH-N 절편으로 교체하여 hGH-NV cDNA 키메라를 얻는 단계를 포함하는, 인간 태반 및 뇌하수체 RNA의 cDNA 아형으로부터 신규한 hGH-NV cDNA 키메라를 제조하는 방법에 관한 것이다. 아울러, 상기 신규한 hGH-NV cDNA 키메라는 성숙한 인간 성장 호르몬을 생산하기 위하여 서열번호 5를 갖는 절편을 포함하는 발현가능한 구조체를 얻기 위한 주형으로 사용된다.

Description

태반 및 뇌하수체 아형 유래의 키메라 인간 성장 호르몬 및 상기 키메라의 제조 방법{CHIMERIC HUMAN GROWTH HORMONE DERIVED FROM THE PLACENTA AND PITUITARY ISOFORM AND PROCESSES FOR OBTAINING SAID CHIMERA}

본 발명은 1차적으로 인간 성장 호르몬(hGH)을 코딩하는 서열번호 3으로 기재되는 신규한 hGH-NV cDNA 키메라 및 상기 신규한 키메라의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 성숙한 인간 성장 호르몬을 제조하기 위해 발현가능한 구조체(construct)를 얻기 위한 hGH-NV cDNA 키메라의 용도에 관한 것이다.

DNA 아형( isoform ) 및 유전자 클러스터( cluster )

성장 호르몬(GH, 소마토트로핀)에 대한 포유동물의 게놈 위치(locus)는 진화 과정에서 매우 최근에(아마도, 1,000만년 전쯤)(유인원 및 인간에서처럼) 5개의 매고도의 서열-보존적인 유전자로 된 클러스터로 확장되었다. 반면, 설치류(rodent) 및 유제류(ungulate)에서는 상기 상동성 위치에서 해당 소마토트로핀에 대한 유전자만 단독으로 포함하고 있으며, 인간의 경우 상기 위치는 4개의 유전자를 추가로 포함하고 있다(Fiddes 등, 1979; Seeburg, 1982). 상기 인간 성장 호르몬 유전자 클러스터의 구조는 78 kb 이상의 DNA 영역인 것으로 밝혀졌다. 전체 유전자 클러스터는 인간 염색체 17번 q22∼q24 밴드상의 긴 암(arm)에 위치하고 있다(George 등, 1981). 본 명세서에서 개시한 66,495 bp의 DNA 서열(각각 5개의 엑손(exon)과 4개의 인트론(intron)을 포함하는 5개의 유전자 서열을 포함함)은 인간 염색체 17번 전체의 약 0.1%에 해당한다. 이것은 2개의 중첩하는 재조합 코즈미즈(cosmids) 상에서 분리되었으며(Barsh 등, 1983), 그 위치 및 전사 방향 뿐만 아니라 제한효소 분석에 의해 특정되고 있다.

3개의 융모성(chorionic) 소마토맘모트로핀(somatomammotropin) 유전자에 2개의 성장 호르몬 유전자가 산재되어 있으며, 모두 동일한 전사 방향을 갖는다. 상기 성장 호르몬 수퍼패밀리의 유전자 클러스터(5' to 3' : hGH-N, hCS-L, hCS-A, hGH-V, hCS-B)는 동일한 전사 방향을 보이며, 48개의 산재된 Alu 형 중앙 반복 서열 인자를 포함하는 6 내지 13 kb 길이의 유전자간 영역(intergenic region)에 의해 떨어져 있다(Chen 등, 1989; Seeburg, 1982). 이들 중 3개는 절단된 형태이다. 상기 성장 호르몬 수퍼패밀리의 유전자 클러스터 지도는 일렬로 되어 있으며, 유전자들(5' to 3' : hGH-N, hCS-L, hCS-A, hGH-V, hCS-B)은 동일한 전사 방향으로 배열되어 있고, 48개의 산재된 중앙 반복 서열 인자를 포함하는 6 내지 13 kb 길이의 유전자간 영역에 의해 떨어져 있다. hGH 및 hCS 유전자는 염색체 17번상의 q22∼q24 밴드에 함께 클러스터 되어 있으나, 프롤락틴(prolactin) 유전자는 염색체 6번에 위치하고 있다. 상기 5개 유전자는 이들 사이의 인접 영역을 포함해서 모두 시퀀싱(sequencing) 되어 있고, 전체적으로 보존되어 있다(91∼99%).

상기 인간 염색체상의 성장 호르몬 위치는 대략 66.5 kb에 걸쳐 있으며, 전체가 시퀀싱되어 그 생물학 및 진화 분석을 위한 기초를 제공하고 있다(Chen 등, 1989; Seeburg 등, 1982, Lewis 등, 1980; Hirt 등, 1987). hGH-N 유전자는 배타적으로 뇌하수체에서만 전사되는 반면, 다른 4개의 유전자(hCS-L, hCS-A, hGH-V, hCS-B)는 태반 조직에서만 발현되며, 각 유전자에 특징적인 농도로 발현된다(Hennen 등, 1985; Macleod 등, 1991; Frankenne 등, 1990). 광범위한 구조적 정보에 의해 단일 조상의 성장 호르몬-유사 원종(progenitor) 유전자로부터 현재 염색체 17번 상의 5개 유전자 배열까지 hGH 위치의 분자 진화상 주요한 단계들을 재구성하는 것이 가능해졌다.

구별적인 아형의 발현

상기 유전자 서열의 분석 및 상기 5개 유전자 클러스터에 산재되어 있는 3개 이상의 상이한 복제 단위 클래스의 동정으로부터, 상기 클러스터는 매우 최근에 진화되었고, 유전자 복제 메카니즘은 Alu 패밀리 중앙 반복 인자간의 상동성(homologous) 비동등(unequal) 교환 과정을 수반한다는 것을 추정할 수 있다.

이들 유전자군은 5' 인접 및 코딩 서열에 대해서는 매우 상동적이지만 3' 인접 영역에서는 다양하게 나타나는데, 이로부터 구조 및 인접 서열이 매우 유사한 유전자들이 어떻게 그토록 구별되게 조절될 수 있는가 하는 역설(paradox)이 일어난다. 높은 서열 유사성에도 불구하고, 상기 유전자들은 구별되는 호르몬의 조절하에서 2가지 다른 조직에서 선별적으로 발현된다(Parks 등, 1989). 상기 hGH-N 유전자는 뇌하수체에서 활성형 크로마틴(chromatin) 형태로 있고 뇌하수체 전엽의 소마토트로핀 세포에서만 전사되는 반면, 융모성 소마토맘모트로핀 유전자들 중 1개 이상은 태반의 트로포블라스트(tropoblast)에 있다.

RNA 스플라이싱(splicing) 과정의 첫 번째 단계는 3' 스플라이싱 부위를 선별하는 것이며, 인트론상의 분지점 부위에 연합된 인자(들)를 수반하는 그 폴리피리미딘 트랙은 주로 상기 3' 스플라이싱 정션(junction)과의 거리에 의해 결정된다. 따라서, 상기 스플라이싱 부위를 선택하는 것이 일반적인 스플라이싱 메카니즘에서나 선택적인(alternative) 특별한 프로세싱(processing)의 경우 모두에서 중요한 요소인 것이 분명하다고 생각된다. 이것은 선택적 RNA 프로세싱이 선택적 공여 부위를 사용하는 것보다 선택적 수용 부위(hGH mRNA의 경우 일어남)를 사용하는 것과 더 자주 관련된다는 관찰 결과와도 일치한다. 세포형에 의존적인 스플라이싱 변이체 및 그 안정성이 상기 전사체의 위치를 정한다.

GH/PL 유전자의 전사는 인간 개체발생 과정에서 기관-특이적인 양상으로 조절된다: GH-V, PL-A, PL-B 및 PL-L 유전자는 태반에서 전사적으로 활성형이며(Seeburg 등, 1982), 반면 출생 이후에는 뇌하수체 유래의 hGH-N이 주된 내분비-활성형 GH가 된다(Selby 등, 1984). hGH-N과는 대조적으로, 태반 hGH-V는 인간 일생중 임신 첫번째 달 동안에 합포체 영양아세포(syncytiotrophoblast)에서 합성되며, 성장, 발달 및 대사에 있어서의 역할은 명확하지 않다(Hennen 등, 1985; Cooke 등, 1988). 태반에서 분비되는 상기 임신성(gestational) 폴리펩티드 호르몬, hGH-V 및 태반 락토젠(lactogen) 중에서 hGH-V의 분비만이 포도당에 의해 조절되는데, 이는 임신기간중에 상기 호르몬이 대사적으로 중요한 역할을 한다는 것을 시사 한다(Seeburg, 1982; Patel 등, 1995). 총 태반 GH/PL mRNA의 주된 부분은 PL-A 및 PL-B 유전자로부터 유래되며(95∼99%), 1∼4.2% 만이 GH-V 유전자 생성물을 코딩한다(Chen 등, 1989; MacLeod 등, 1991; Lytras 등, 1994).

GH-V 유전자의 인트론 D가 생략 또는 포함된 선택적으로 프로세싱된 2가지 mRNA (Untergasser, G 등, 1998)가 합포체 영양아세포에서 발현되어 분비 단백질(22k, 191 아미노산)이 되거나, 추정하기로는 막-관련 단백질(26K, 230 아미노산)이 된다(Cooke 등, 1988). 태반 hGH라고도 불리는 분비된 hGH-V인 소마타젠(somatagen)은 임신한 여성의 혈청에서 검출되며, 임신 중 3번째 3개월(trimester)까지 우세한 혈청 hGH가 된다(Hennen 등, 1985; Cooke 등, 1988). 이러한 정보는 본 발명자들이 한 아형(hGH-V)에서 다른 아형(hGH-N)으로 신규한 cDNA 연구를 하게 도와주었다. 이들 둘 사이의 cDNA 서열 유사성 및 제한효소 지도 패턴을 본 신규한 발명의 기반으로 삼았다.

뇌하수체 및 태반 유래의 성장 호르몬 모두 임의의 분비 신호 서열을 포함하거나 포함하지 않은 프로세싱된 성숙한 GH 단백질의 형태로 제조되며, 각각 대장균에서는 페리플라즘(periplasm) 또는 가용성 분획으로 축적된다(Hsiung 등, 1986; Chang 등, 1987; Martial 등, 1979; Gray 등, 1988 및 Joly 등, 1998). hGH-V cDNA는 20,000 달톤의 분자량을 갖는 단백질을 코딩하지만(Ucida 등, 1997; Honjo 등, 1996; Igout 등, 1988 및 1993; Frankenne 등, 1990), 상기 성장 호르몬은 191개의 아미노산으로 이루어져 있고, 21,500 달톤의 분자량을 가지며, 뇌하수체 소인증(dwarfism), 소아의 만성 신부전증의 치료에 사용된다(Mukhija 등, 1995; Grandi, 1991). hGH는 최근 성장 촉진 활성뿐만 아니라 면역 증진 활성 또는 지방분해 촉진 활성과 같은 현저한 활성을 갖고 있는 것으로 나타났다. 장차 더 넓은 분야에 적용될 것으로 기대되고 있다.

1차 hGH-N 유전자 전사체 생성물의 선택적 스플라이싱은 각각 hGH (22 kD 형태)와 hGH-N 유전자 전사체의 엑손 Ⅲ에서 15개 코돈이 결실된 소마토트로핀 변이체(20 kD 형태)를 코딩하는 2가지 mRNA 종을 생성한다(Denoto 등, 1981; Singh 등, 1974; Lewis 등, 1978). hCS 유전자 RNA에 대해서는 이러한 선택적 스플라이싱이 보고된 바 없다. 엑손 Ⅲ의 구조가 다른 hCS-L 유전자 mRNA를 제외하고는 모든 mRNA에서 완벽한 코돈의 공선성(colinearity)이 존재한다.

모든 5가지 mRNA는 약 200개 아미노산 길이의 폴리펩티드를 특정하며, 이중 N-말단의 26개 잔기가 신호 서열 기능을 한다. hCS-A 및 -B 유전자 사이에 위치하는 hGH-V 유전자는 hGH-N과 비교할 때 GH와 13군데 위치가 다른 폴리펩티드를 코딩하며(Seeburg, 1982), 반면 hGH는 hCS와 28개 잔기가 다르다. hCS-L DNA의 서열은 2번째 인트론의 5' 보존적 스플라이싱 공여 부위에서 점 돌연변이가 있음을 보여주고 있는데(Hirt 등, 1987), 이는 상기 위치에서 스플라이싱이 일어나지 않을 수 있음을 의미한다. 따라서, hCS-L 유전자는 안정한 RNA 또는 단백질 생성물을 생산하지 않을 수도 있다. 이론적으로 hCS-L 단백질은 매우 연관된 hCS보다 18개 아미노산 잔기가 짧고, 다른 폴리펩티드와 상동성이 없는 6개 잔기의 스트레치(stretch)를 포함하며, hGH와 단지 75%만 서열 상동성이 있다. 상기 5가지 유전자 전사체의 공간적인 분포는 전사 수준에서 조절되거나, 또는 hGH 위치의 크로마틴 구조에서 반영되는 양쪽 위치에 기초하여 조절될 수 있으며, 각 유전자 주위의 서열-특이적 조절 인자들이 관찰되는 유전자 발현의 조직-특이적 패턴에 관여할 수 있다.

진핵성 코돈 이용성 대 분화

상기 유전자 DNA는 구조적으로 격리되어 있는 몇 개의 영역, 즉 조절 영역 및 전체길이의 단백질을 코딩하는 열린번역틀(open reading frame)을 포함하고 있다. "RNA 폴리머라제" 효소가 활성화되어 조절 영역('프로모터'라 불림)에 결합하고, 몇 가지 다른 기능적 부속물(accessory)들의 도움을 받아 상기 구조 유전자를 따라 미끄러지듯이 코딩되는 정보를 전사하여 스플라이싱된 프리-메신저 리보핵산(pre-mRNA)의 초기 전구체(rough draft)를 생성하고, 이후 최종적으로 프로세싱된 mRNA가 만들어진다. 상기 mRNA의 정보는 이후 각 번역가능한 아미노산에 대해 트리플렛(triplet) 코드의 형태로 리보좀(ribosome)에서 번역되며, 단백질의 번역은 개시 신호(가장 일반적으로 ATG)에서 시작하여 종결 신호(일반적으로 TAA, TAG, TGA)에 도달할 때까지 진행한다.

상기에서 언급한 바와 같이, DNA 내의 유전자 코드는 아미노산에 의해 정의되고, 상기 아미노산은 트리플렛 또는 "코돈"(A,T,G,C로부터 3개의 인접한 뉴클레오티드)에 의해 특정되며, 임의의 단백질에서 각 아미노산의 3번째 뉴클레오티드는 다양할 수 있다. 유전자 코드에 따라 특정한 아미노산의 3번째 뉴클레오티드를 이용하는 선호도(preference)는 원핵생물 및 진행생물에 따라 다양하며, 이는 다양한 생명체 사이의 코돈 이용성의 "디제너러시(degeneracy)"를 정의한다(표 1). 코돈 이용성의 백분율 및 그 발현 빈도는 Ausubel 등의 문헌에 명확하게 개시되어 있 다(Ausubel F.M. 등, 1987). 본 명세서에서, 본 발명자들은 생명체 간의 아미노산 이용성에 있어서의 다양성 및 그 발현 빈도를 표 1에 개시하였다(Ausubel F.M. 등, 1987). 이러한 지식은 재조합 기술을 이용하여 이형(heterologous) 시스템에서 원하는 단백질을 발현하는데 있어서 매우 큰 도움을 주는데, DNA 수준에서 트리플렛 내의 뉴클레오티드를 변경시켜 임의의 외래 단백질의 발현 효율을 향상시킬 수 있다. 키메라 hGH에 대한 분석에서, 본 발명자들은 잠재적으로 빈약한 이형 발현으로 이어질 수 있는 서열 영역을 동정하였다. 본 발명자들은 hGH-N 서열의 차이점과 그 알렐(allele)의 코돈 이용성을 이용하여 적절하게 코돈 이용성을 변경함으로써, 대장균, 효모, 곤충, CHO 등과 같은 다양한 생명체 내에서 인간 성장 호르몬의 발현을 크게 도울 수 있는 발현 클론(clone)을 제시한다.

인간 성장 호르몬(hGH) 유전자의 완전한 서열 및 상기 서열내 hGH mRNA의 성숙한 5' 말단의 위치는 DeNoto 등에 의해 결정되었다(Denoto F.M. 등, 1981). 상기 서열을 클로닝된 hGH cDNA와 비교한 결과, 상기 유전자는 4개의 사이(intervening) 서열에 의해 간섭되어 있는 것으로 나타났다. S1 맵핑(mapping)으로부터, 이들 사이 서열 중 하나가 2개의 다른 3' 스플라이싱 부위를 갖는 것으로 나타났다. 상기 선택적 스플라이싱 경로는 정상의 뇌하수체에서 발견되는 서로 다른 크기의 hGH 펩티드를 생성한다. hGH mRNA의 5' 말단 서열을 인간 당단백질 호르몬의 알파 서브유닛(subunit)의 유사한 영역과 비교한 결과, 연관되지 않은 이들 펩티드 호르몬 간에 예기치 않은 동질성 영역이 존재하는 것으로 나타났다.

선택적 RNA 스플라이싱 메카니즘은 통상 단백질 다양성의 생성과 연관된다. 사이 서열 B의 정상 3' 위치로부터 45 bp 하류에 위치하는 한 선택적 3' 부위에서의 스플라이싱은 정상 뇌하수체에서 낮은 농도로 발견되는 더 작은 hGH 펩티드 mRNA를 생성할 수 있다. 성숙한 mRNA의 5' 말단의 위치가 S1 맵핑을 이용하여 결정되어 있다. S1 뉴클레아제 분석은 다중 RNA의 존재에 대한 증거를 제공한다. hGH 유전자는 RNA 스플라이싱의 정확도와 선택적 경로에서 스플라이싱 부위 선택의 조절에 대한 미해결된 의문점들에 접근하기 위한 좋은 시스템이 될 수 있다. 전사의 개시와 연관되어 있다고 생각되는 TATAAA 신호 서열은 성숙한 mRNA의 5' 말단으로부터 대략 25 bp 상류에서 발견된다. 또한, 보존된 서열은 유전자에서 mRNA에 폴리 A가 첨가되는 서열 근처에서 발견된다. 놀랍게도, hGH mRNA의 5' 비번역 영역과, 연관되지 않은 인간 당단백질 호르몬 알파 서브유닛 간에 동질성 영역이 존재한다. 본 발명은 또한 키메라 hGH mRNA 2차 구조상에 더 우수한 발현을 위해 미세한(suttle) 차이점을 유발하는 것을 목표로 하고 있다. Sononick은 RNA 2차 구조가 스플라이싱 부위의 선택에 영향을 미친다고 제안하였다(Sononick, 1985). 그는 빈번하게 이용되는 스플라이싱 부위가 헤어핀 루프(hairpin loop)에 의해 격리될 때 임의적이 된다는 것을 보였다. 이들의 관찰 결과에 따르면, hGH 전구체 mRNA의 선택적 스플라이싱 부위 영역에는 국소적인 2차 구조로서 22K 및 20K 수용 부위 모두를 트랩(trap)하는 큰 헤어핀 구조와 상기 스플라이싱 부위의 분지점 서열이 존재한다. 상기 22K 및 20K 스플라이싱 부위를 풀어주고 특정한 스플라이싱 부위로 이끄는 올가미(lariat)의 형성을 방해함으로써, 상기 안정한 구조는 선택적 수용 부위로 점프 슬라이스하기 쉽다.

컴퓨터 검색을 하면, 많은 인트론에서 3' 스플라이싱 절단 부위로부터 -60 내지 -21에 동격자들(coordinates) 간의 매우 보존된 영역이 있음을 보여준다. 이 박스는 수용 스플라이싱 부위의 인식 및 올가미 형성에 영향을 미치는 추가 인자를 갖는다(Leocomte 등, 1987). 인간 뇌하수체 RNA의 S1 맵핑 분석은 1차 전사체의 2번째 인트론의 선택적 수용 부위로부터 유래되는 4개 이상의 상이한 hGH mRNA가 존재한다는 것을 확인시켜 준다. 단지 이 부위에서만 일어나는 고빈도의 선택적 스플라이싱을 설명하기 위해 hGH 유전자 서열에 대한 분석을 수행하였다. hGH 유전자의 4가지 인트론 중에서, 3가지는 수용 스플라이싱 부위의 상류 영역에 "CTTG" 박스를 포함한다(인트론 A, B 및 D). 그러나, 상기 "CTTG" 박스는 인트론 C와 20K 선택적 전사 부위의 상류에서는 발견되지 않았다. 많은 인트론의 경우, "CTTG" 박스를 포함하는 영역과 U2 snRNA 첫 번째 루프의 5' 말단 간의 양호한 상보성이 RNA-RNA 염기 대합(base pairing)에 의해 특정한 스플라이싱 부위의 분지점 선택에서 역할을 할 수 있다고 보고되고 있다. hGH에서 다양한 단백질이 생성되는 것은 RNA 2차 구조 및 코돈 이용성의 차이에 기인하며, 선호하는 숙주에서 다른 발현 수준을 갖는다는 것을 나타낼 수 있다.

키메라의 구축 및 산업상 원리( rationale )

클로닝에 사용되는 재조합 벡터의 구축은 원하는 성숙한 단백질, 예컨대 성숙한 hGH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 그 5' 말단에 융합 태그 펩티드 서열 및 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 서열이 융합된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 교잡(hybrid) 플라스미드를 구축하는 것을 포함한다. 따라서, 상기 교잡 플라스미드 는 가까운 미래에 실험실 규모뿐만 아니라 큰 규모에서도 잠재적인 이용성이 있는 키메라 DNA 구조체를 만듦으로써 이형적으로 만들어진다. 재조합 기술에서 원하는 유전자를 이용한 키메라를 구축하는 개념은 발현 수율 및 정제 단계를 촉진시킨다. 양 측면에서의 성공률은 선별된 융합 단백질의 선택에 의존한다.

재조합 단백질의 정제를 위해 가장 널리 사용되는 기술은 고정 금속 이온 친화 크로마토그래피(IMAC)이다. 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단에 His-태그(tag)를 붙이면 상기 재조합 단백질을 Ni^{2 +}, Co^{2 +}, Zn^{2 +}, Cu^{2 +} 및 Fe^{2 +}와 같은 고정 금속에 선별적으로 흡착시킬 수 있다. 상기 기술은 표적 단백질을 선별적으로 정제하도록 한다(Mukhija 등, 1995; Shin 등, 1998; WO9115589). 히스티딘 또는 라이신 또는 아르기닌을 포함하는 염기성 아미노 잔기를 사용하는 것은 본 발명이 더욱 효율적이 되도록 한다.

종합적으로, 키메라 구조체를 만듦에 있어서 선별 및 적용은 파일럿(pilot) 규모뿐만 아니라 산업적인 배경이 있는 큰 규모에서 생성물의 수율을 높이는데 도움을 준다. 상기 친화 태그(His-태그 또는 GST-태그) 바로 뒤에 프로테아제 절단 부위(예를들면, 엔테로키나제와 같은 트롬빈, 인자 V, 인자 Xa, 세린 프로테아제 부위)를 두는 것이 키메라 구조체에서 통상적으로 사용되며, 이 부위에서 발현된 이형 단백질이 칼럼상에서 또는 칼럼밖에서 태그로부터 용이하게 절단되어 자연 발생적 hGH 서열을 갖는 원하는 단백질이 분리된다. 친화 크로마토그래피 기술을 선택하는 것은 정제시 더 적은 단계로 산업적인 목적으로 임의의 큰 배치 정제(batch purification)를 취급하는데 도움을 주고, 원하는 최종 생성물의 손실을 감소시켜 전체 공정 비용을 효율적으로 만든다.

hGH 클로닝의 역사

인간 성장 호르몬(hGH)은 인간 뇌하수체에서 분비된다. 성숙한 형태의 경우 191개의 아미노산으로 이루어져 있고, 약 21,500의 분자량을 가지며, 따라서 인슐린보다 3배 이상 크다. 재조합 DNA 기술이 출현하기 전까지, hGH는 제한된 공급원, 즉 인간 시체의 뇌하수체 샘으로부터 노동집약적인 추출을 통해서만 얻어질 수 있었다. 화상, 상처 치유, 영양실조, 뼈의 유착(knitting), 확산형 장출혈 및 위관절(pseudarthrosis)의 치료에 효과적이라는 것이 알려져 있었지만, 결과적으로 물질의 부족으로 인해 그 적용이 저뇌하수체 소인증의 치료에 제한되었다. 사실, 조직으로부터 가용한 hGH의 양은 저뇌하수체 소인증 환자의 약 50% 정도만 감당할 수 있는 정도인 것으로 추정된다. 따라서, hGH를 다른 용도로 사용할 수 없었다. 따라서, hGH를 클로닝하기 위한 재조합 DNA 기술을 이용하여 대장균에서 이를 특이적으로 생산할 필요가 있다. 복잡한 이형 폴리펩티드를 위한 미생물 숙주로 대장균을 사용하는 것은 지금은 미생물 숙주에서 잘 확립되어 있다. 먼저, hGH는 재조합 숙주 세포, 특히 대장균에서 저뇌하수체 소인증 및 hGH가 효과를 보이는 다른 질환들을 치료하기에 충분한 정도의 양호한 함량으로 생산될 수 있음이 알려져 있다(예를 들면, US4,342,832). US4,342,832의 방법에 의해 발현된 hGH는 치료 분야에 사용될 수 있는 생성물을 만든다. 이후, 대장균(또한, 바실러스 및 슈도모나스)에서 hGH 발현용 벡터 구조체를 제조하기 위한 다양한 변형이 수행되었다. 지 금까지, 대장균에서 제조된 재조합 hGH는 환자에게 잘 받아들여지고 있으며, 어떠한 면역반응도 보이지 않는다. hGH는 당단백질이 아니기 때문에, hGH의 발현에는 대장균이 가장 적합한 숙주이다.

대장균 숙주 시스템에서 발현 부위 및 발현 수율뿐만 아니라 클로닝 단계 과정에서 발현된 단백질의 2차 구조 형성 정도를 조절하기 위한 특정한 조절 인자를 갖는 벡터 구조체를 만들기 위한 시도가 수행되고 있다(Tokunaga 등, 1985). hGH가 발현되는 방법은, 예컨대 봉입체(inclusion body)로 세포내에서 발현되거나, 페리플라즘 공간 또는 분비 단백질로 세포 밖에서 발현되는 3가지 방법이 있다(US4,755,465).

대장균의 페리플라즘으로 22 kD hGH를 분비하는 것이 보고되어 있다(Gray 등, 1985, 247∼254; US5,279,947). 상기 페리플라즘은 대장균을 포함하는 그람-음성 세균의 내부막과 외부막 사이의 공간을 가리킨다. 그람-음성 세균에서, 막 투과를 위해서는 신호 서열을 포함하는 전구체 단백질이 필요하며, 내부막을 통과하면 상기 신호 서열은 절단되어 버린다. 이후, 상기 단백질은 분비 신호를 잃어버림으로써 성숙한 단백질로 프로세싱된다. 지금까지 공개된 클로닝 관련 특허들이 다수 있으며(리스트는 아래에 기재됨), 이들은 본 발명자들의 실험실에 특이한 hGH 클로닝 전략을 수립하는데 도움을 주고 있다.

최근, 재조합 DNA 기술을 이용하여 인간 성장 호르몬을 세포내, 세포외 또는 페리플라즘에서 생산하는 것이 가능하게 되었으며, hGH 유전자는 숙주인 미생물에서 발현된다(US5,047,333, US4,755,465, US4,604,359 및 US4,601,980).

다양한 효소, 예컨대 인자(Factor) Xa, 엔테로키나제, 레닌(Renin), 또는 CNBr과 같은 특정한 화합물을 이용한 인 시투(in situ) 번역후 변형은 또 다른 관심 영역으로서, 키메라 단백질 부분 또는 연장된 N-말단 부분으로부터 성숙한 hGH가 분리된다. 적절한 크로마토그래피 기술을 이용함으로써, 이것은 나머지 숙주 단백질로부터 총 단백질을 용이하게 분리 및 정제할 수 있게 한다. 정제된 hGH의 불순물 프로필은 인 시투 번역후 변형의 선택에 직접적으로 의존할 수 있다.

본 명세서에 기재된 발명은 최근까지 종래 기술이 없다. 어느 정도 관련이 있는 특허의 종래 기술 내용은 아래에 요약되어 있다.

US3,853,832 특허에서는 합성 인간 성장 촉진 물질의 제조 방법을 개시하고 있으며, 본 발명과는 진보성 측면에서 관련이 없다. 상기 특허는 188개 아미노산의 폴리펩티드를 다루고 있는 반면, 인간 hGH는 191개의 아미노산을 갖는다. 이 발명은 셀프하이드릴기 도입, 산화에 대해 교시하고 있으며, 그 위치에 대해 언급하고 있다. 본 발명은 cDNA 클로닝에 의한 hGH의 생산이라는 신규한 접근 방법에 관한 것이다. US5,955,346은 인간 프롤락틴의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 다루고 있다. 유일한 유사점은 모두 단백질을 다루고 있다는 것이다.

US4,446,235는 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 얻는 방법에 대해 개시하고 있으며, 게놈 부위(section)를 얻기 위해 클로닝된 게놈 DNA를 탐침하는 것을 포함하고, COS 세포 벡터를 사용한다. 따라서, 상기 특허는 본 발명에서 개시된 내용을 개시하고 있지 않다.

US4,665,160은 본 발명에서와 같이 hGH-V의 아미노산 서열을 개시하고 있으 나, cDNA의 클로닝, 또는 아형-유래 키메라의 사용, 또는 본 발명의 신규한 작업에 대해서는 개시하고 있지 않다. 본 발명은 hGH-HV로부터 hGH를 생산하는 것에 관한 것이다.

US4,670,393은 삽입된 DNA 서열을 포함하는 복제가능한 클론 비히클(vehicle)을 개시하고 있고, 그 아미노산 서열을 나열하고 있으나, 본 발명은 키메라라는 개념을 처음으로 도입한 신규한 기술에 의한 hGH의 생산에 관한 것이다. US5,849,535는 hGH의 변이체에 관해 개시하고 있으며, 따라서 상기 문헌은 본 발명의 내용과 관련이 없다. 또한, US5,597,709는 야생형 hGH로부터 재조합 DNA 기술에 의해 인간 성장 호르몬 변이체를 생산하는 방법에 대해 개시하고 있는데, 본 발명과는 달리 뇌하수체 유래 hGH-N이 아닌 주로 hGH-V에 대해 초점을 맞추고 있다. GB2055382A는 hGH의 합성에 뇌하수체 호르몬 절편을 사용하는 것에 대해 개시하고 있다. 상기 문헌은 세균 발현 시스템을 이용하여 hGH를 얻기 위해 자연 발생적 부분과 합성된 부분을 결합하고 있다. 이는 본 발명에서 개시하고 있는 2가지 아형 키메라의 클로닝과는 고전적으로 다르다. 상기 문헌은 클로닝 비히클 및 클로닝 벡터에 대해 개시하고 있는데, 이들은 다르다.

US5,496,713은 페리플라즘 공간에서 hGH를 생산하기 위한 방법에 대해 개시하고 있으며, 분비 생산 방법에 해당한다. 본 발명은 세포벽 훨씬 내부의 세포내에서 생산하는 방법에 대해 다루고 있으므로, 따라서 근본적으로 다르다. 또한, US5,047,333은 바실러스 세포에서 자연 발생적 hGH를 생산하는 방법에 관해 개시하고 있으며, 따라서 본 발명과는 다르다. 본 발명에서 사용된 기술은 신규하고, 사 용된 숙주 세포는 바실러스가 아니며, 발명의 개념이 US5,047,333과는 다르다.

US4,859,600은 그 아미노산 서열이 자연 발생적 hGH의 아미노산 서열로 이루어져 있는 hGH를 포함하는 재조합 원핵생물 숙주 세포를 만드는 방법에 대해 개시하고 있는데, 자연 환경에서 함께 관련되어 있는 다른 단백질들이 없고, 추가로 N-말단 메티오닌을 갖는 성숙한 hGH가 없으며, 상기 재조합 원핵생물 숙주에 의해 생산된다. US5,618,697은 hGH의 생산 방법에 대해 개시하고 있는데, 추후의 공정 과정을 더욱 용이하게 하기 위하여 그 구조체는 아미노 말단에 연장된 음전하 아미노산 서열을 포함하고 있다.

US4,601,980은 주로 생산된 폴리펩티드를 얻기 위한 하류 공정에 대해 개시하고 있으며, 따라서 본 발명의 대상이 아닌 발효 및 정제 측면에 대해 다루고 있다.

US4,755,465 및 몇 개의 다른 특허에서는 N 말단 메티오닌의 존재와 그 이점의 측면에 대해 개시 및 교시하고 있으며, 본 발명의 내용은 개시하고 있지 않다. US5,633,352는 뇌하수체 유래의 hGH로부터 hGH의 생합성에 관련되는 단계들을 보여주고 있다. 일단의 아미노산을 치환함으로써 변경된 결합 특성을 갖는 자연형 인간 성장 호르몬의 변이체가 US5,688,666에 개시되어 있다.

US5,635,604는 실질적으로 정제된 아미노 말단이 연장된 hGH에 대해 개시하고 있는데, 여기서 X는 2개 이상의 아미노산을 갖는 전하를 띈 아미노산 서열이고, X의 N-말단 아미노산은 Lys 및 Arg 이외의 음전하 아미노산이다.

US6,436,674/EP0974654는 대장균 및 살모넬라에서의 효율적인 클로닝 방법에 대해 개시하고 있으며, 인간 성장 호르몬은 분비 신호 펩티드를 이용하여 페리플라즘 공간으로 보내진다. 상기 발명의 경우, 바람직한 방법은 분비하는 것인데, 그 이유는 그 발명자에 의해 언급된 바대로 페리플라즘에서는 불순물 단백질의 농도가 낮기 때문에 분리 및 정제가 용이하기 때문이다.

EP0587427호에서는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 유래의 신규한 중성 프로테아제를 이용한 20K hGH의 생산 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 분비성으로서, hGH가 세균의 페리플라즘으로 분비된다. 다른 특허인 JP61224988은 20K hGH cDNA를 증폭하기 위한 대장균의 재조합 플라스미드에 대해 개시하고 있다. 대조적으로, JP61202689는 인간 뇌하수체 조직으로부터 성장 호르몬을 추출하는 방법 및 그 이후의 방법에 대해 개시하고 있다.

EP0489711은 자연 발생적 hGH의 아미노산 서열을 갖는 hGH의 생산 방법에 대해 개시하고 있다. 상기 방법은 생산된 첫 번째 폴리펩티드의 N-말단에 Met가 존재하는 것에 의해 특정된다.

상기에서 언급된 인용문헌들은 분비 과정 또는 메티오닌 특정된 더 큰 폴리펩티드 또는 hGH를 생산하기 위한 인간 뇌하수체 및 인간 태반 cDNA 아형의 용도에 대해 다루고 있다. 그러나, 이들 문헌 중 어느 것도 hGH-NV cDNA 키메라를 유도하고, 또한 hGH-N(야생형)보다 더 나은 전사체 2차 스트레치를 갖고 뇌하수체 hGH와 아미노산 서열이 동일한 22K hGH를 생산하기 위해 이중으로 비 GC 풍부(rich) 서열의 스트레치와 연관되어 있는 키메라 유래의 서열번호 5의 발현가능한 구조체를 얻기 위해 인간 태반 및 뇌하수체 hGH cDNA 아형을 사용하는 기술에 대해서는 개시하 고 있지 않다. 성숙한 hGH의 독특한 구조체 및 더 나은 발현이 본 발명의 독창적인 단계이다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 인간 성장 호르몬을 코딩하는 서열번호 3으로 기재되는 신규한 hGH-NV cDNA 키메라를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 hGH-NV cDNA 키메라를 포함하는 플라스미드 벡터 pGEHNV를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 플라스미드 벡터를 포함하는 재조합 대장균 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 이중으로 비 GC 풍부 서열의 스트레치와 연관되어 있는 키메라 유래의 서열번호 5의 발현가능한 구조체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 플라스미드 발현 벡터 pABGH2를 포함하는 재조합 대장균 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 hGH-NV cDNA 키메라의 제조 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 1차적으로 뇌하수체 및 태반 RNA로부터 획득한 2가지 구별되는 cDNA 아형 유래의 인간 성장 호르몬을 코딩하는 서열번호 3으로 기재되는 신규한 hGH-NV cDNA 키메라에 관한 것이며, 또한 유전자 특이적 프라이머를 이용한 역전사에 의해 증폭하는 단계; 증폭된 cDNA 아형을 클로닝하는 단계; 클로닝된 cDNA 아형을 특정한 제한효소 부위에서 소화하는 단계; 및 소화된 cDNA 아형내의 hGH-V 절편 특이적 영역을 hGH-N 절편으로 교체하여 hGH-NV cDNA 키메라를 얻는 단계를 포함하는 상기 신규한 키메라를 얻는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 성숙한 인간 성장 호르몬을 생산하기 위해 발현가능한 구조체를 얻기 위한 hGH-NV cDNA 키메라의 용도에 관한 것이다.

발명의 바람직한 구현예

따라서, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 신규한 hGH-NV cDNA 키메라에 관한 것이다.

본 발명의 구현예에서는 서열번호 3을 포함하는 플라스미드 벡터 pGEHNV를 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에서는 서열번호 3을 포함하는 플라스미드 벡터 pGEHNV를 포함하는 재조합 대장균 세포를 제공한다.

본 발명의 구현예는 인간 성장 호르몬을 코딩하는 신규한 hGH-NV cDNA 키메라를 얻기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은

(a) 인간 태반 및 뇌하수체로부터 총 RNA를 분리하는 단계;

(b) 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로부터 선택된 유전자 특이적 프라이머를 이용한 역전사에 의해 단계 (a)의 해당 cDNA 아형인 인간 태반 RNA 유래의 hGH-V 및 뇌하수체 RNA 유래의 hGH-N을 증폭하는 단계;

(c) 단계 (b)의 증폭된 cDNA 아형 hGH-V 및 hGH-N을 클로닝하는 단계;

(d) 틀내(inframe) 번역된 ORF 서열에 따라 단계 (c)의 클로닝된 cDNA 아형 양자의 제한효소 지도를 비교하는 단계;

(e) 단계 (c)의 클로닝된 cDNA 아형을 특정한 제한효소 부위에서 소화시키는 단계;

(f) 단계 (e)의 소화된 cDNA 아형내의 hGH-V 절편 특이적 영역을 단계 (e)에서 기재된 특정한 제한효소 부위에서 hGH-N 절편으로 접합(ligation)에 의해 교체하여 원하는 특정한 조합의 hGH-NV cDNA 키메라를 얻는 단계; 및

(g) 서열번호 3으로 기재되는 hGH-NV cDNA 키메라를 클로닝하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에서는 상기 아형의 일부가 특정하게 조합되어 더 나은 코돈 이용성을 갖는 hGH cDNA 절편의 주형(template)을 개발한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서는 원하는 특정한 조합의 hGH-NV cDNA 키메라가 서열번호 3에서 표시된 바와 같은 1∼62 bp, 63∼587 bp 및 588∼728 bp인 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서는 제한효소가 BseMI, AatⅡ, EcoNI, PleI, BstXI, EheI, SmlI 및 SmaI로부터 선택되는 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서는 신규한 hGH-NV cDNA 키메라로부터 서열번호 5에서 표시된 바와 같은 성숙한 hGH cDNA를 생성한다.

본 발명의 구현예에서는 유전자 특이적 프라이머를 이용한 cDNA 증폭에 의해 생성된 서열번호 5를 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에서는 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22로부터 선택되는 유전자 특이적 프라이머의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서는 키메라-유래의 서열번호 5의 발현가능한 구조체가 비 GC 풍부 서열의 스트레치와 연관되어 있는 것을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서는 비 GC 풍부 서열의 스트레치와 연관된 키메라-유래의 서열번호 5의 서열이 이중(duplicate)인 것을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서는 서열번호 5에서 표시된 바와 같은 키메라 유래의 성숙한 cDNA 서열을 포함하는 플라스미드 발현 벡터 pABGH2를 제공한다.

본 발명의 또 따른 구현예에서는 성숙한 인간 성장 호르몬을 생산을 위하여 상기 플라스미드 pABGH2를 포함하는 재조합 대장균 세포를 제공한다.

클로닝 방법의 중요성 및 어려움:

A. 태반 mRNA 및 조직 가용성

놀랍게도, 본 발명자들은 그람(Gram)-음성 세균내에서 프리(pre)-hGH를 제공하기 위해 계속 발현되는 hGH 유전자(즉, 191개 아미노산의 성숙한 단백질 및 26개 아미노산의 그 신호 펩티드를 코딩하는 유전자)가, 대응하는 태반의 프리-hGH와 비슷한 길이인 것을 발견하였다.

상기 성장 호르몬은 전구체의 형태로 합성되고, 이후 개인의 일생을 통해 뇌하수체의 전엽에서 생산되며, 미성년 기간동안 더 많은 양이 생산되고, 프로세싱된 후 세포로부터 분비된다.

몇 년 전까지 상기 호르몬의 유일한 공급원은 시체의 뇌하수체였으며, 이로부터 복잡하고 비용이 많이 드는 방법을 통해 낮은 수율로 추출되었다.

따라서, 본 발명은 뇌하수체 mRNA 뿐만 아니라 태반 mRNA가 hGH-N 유사체인 hGH-NV의 클로닝 방법의 출발점이라는 점에서 특히 매우 유용하다. 5가지 hGH-V cDNA는 매우 동질적인 인간 성장 호르몬 및 인간 융모성 소마토맘모트로핀 유전자 전사체의 경우와 유사한 방식으로 mRNA가 스플라이싱된 후 프로세싱된다는 것을 보여준다(Cooke 등, 1988). 아울러, 단리 과정의 태반 mRNA의 안정성도 중요하다. 클로닝 방법은 최종 구조체에서의 코돈 이용성에 있어서 어느 정도의 자유를 부여한다. hGH-NV 내에서의 hGH-V 부분은 hGH-N보다 더 나은 mRNA 2차 구조를 제공하기 위한 목적이다.

B. 태반 cDNA 구조체의 클로닝

이들 두 유전자가 선택적인 호르몬 조절하에 2가지 다른 조직에서 선별적으로 발현된다는 사실에도 불구하고(Parks 등, 1989), 본 발명자들은 처음으로 hGH-V cDNA의 클로닝을 통해 hGH-N 유사체 아형의 클로닝을 시도하였다. 상기 hGH-N 유전자는 뇌하수체 전엽의 소마토트로핀 세포에서만 전사되고, hCS-A 및 -B 유전자는 태반의 트로포블라스트에서만 전사된다. 1차 hGH-N 유전자 전사 생성물의 선택적 스플라이싱(DeNoto 등, 1981)으로부터 2가지 mRNA 종이 생성되며, 각각 인간 GH (22K 형태) 및 hGH로부터 아미노산 잔기가 결실된 소마토트로핀 변이체(20K 형태)를 코딩한다(Singh 등, 1974).

C. 기초( basic ) 동질성

본 발명은 1차적으로 동일한 염색체 위치에서 인간 성장 호르몬의 변이체가 존재한다는데 기초하고 있으며, 특히 대표적인 유전자는 hGH 변이체 단백질을 코딩하고 4∼5개의 사이 유전자들을 포함한다. 본 발명자들은 hGH 아형, 예를 들면 hGH-V, hCS의 클로닝을 통해 cDNA를 클로닝하는 독특한 선택을 했다.

클로닝을 위한 출발 물질로 mRNA의 아형을 사용하는 것과 순수한 형태를 얻기 위한 해당 효소 일치(match) 부위와 고수율을 얻기 위한 적절한 ORF의 조작(manipulation)하는 방법을 제공한다.

클로닝 및 표적 cDNA 내에서 특정한 아미노산의 워블(wobble) 서열에 변화를 도입하기 위해 2가지 아형의 전체길이 cDNA 간에 뒤섞는(shuffle) 전략은 본 발명의 신규한 점이다.

고수율의 정제된 생성물을 얻기 위해 발현가능한 플라스미드 내에서 코딩 영역의 직렬 카세트(tandem cassette)를 클로닝하는 재조합 방법 또한 공개되어 있다(US5,955,323; US5,279,947; US4,859,765)

합성 cDNA 의 구축

본 발명의 목적은 hGH-NV 키메라의 모든 선택 가능한 조합으로부터 26개의 아미노산 신호 서열을 갖는 전체길이 키메라(hGH-V 아형 유래의 hGH-N 유사체, 도 5)를 더 나은 프로모터-조절성 대장균 발현 시스템에 적용하는 것이었다. 상기 클론은 전체길이 키메라 ORF로부터 진정한(authentic) 제한효소 부위가 도입된 2개 아미노산의 워블 서열상의 독특한 변화를 갖는 합성형의 성숙한 ORF로 바꾸기 위한 주형으로 사용되었다.

세균에서, 유도가능한 프로모터-리보솜 결합 부위(rbs) 발현 인자가 높은 수준의 이형 유전자 발현을 위해 일반적으로 사용된다. 상기 프로모터-rbs 발현 인자를 운반하고 이형 단백질을 높은 수준으로 직접 발현하기 위한 유전 정보를 코딩하는 플라스미드에서, 원하는 유전자의 ORF는 상기에서 언급된 조절 인자의 조절하에서 구축될 수 있다. 아울러, 발현 벡터 시스템은 상기 재조합 미생물에 의해 세균에서 생산된 이형 단백질을 바람직하고 보다 용이하게 정제하기 위하여, 친화 태그 및 성숙한 cDNA 서열 바로 다음의 특이적 절단 부위를 포함한다.

cDNA 삽입체의 발현은 유도가능한 ara C 프로모터의 조절하에 있으며, 벡터의 NcoI 부위의 ATG 코돈에서 개시하고 엔테로키나제 특이적 절단 부위를 갖는 융합 단백질에서 절단된다(도 5a 및 도 5b). 상기 재조합 플라스미드는 대장균 TOP10을 형실전환시키기 위해 사용되며, 암피실린 저항성 콜로니(ampicillin resistant colony)로 선별된다. 단백질의 유도는 세균의 로그상(log phase) 성장기에 L-아라비노즈를 배지에 첨가함으로써 수행되며, 6시간동안 지속된다. 검출가능한 융합 단백질은 상기 특이적 효소 절단 부위에서 절단되며, 자연적인 생물학적 활성과 정확한 분자량을 갖는 것으로 나타났다. 미생물 게놈에서 우선시되는 대다수의 코돈인 인간 소마토스타틴, 프리프로인슐린, 프로인슐린, 인슐린 A 사슬, 인슐린 B 사슬 또는 소 또는 인간 성장 호르몬, LH, ACTH 및 췌장 폴리펩티드를 코딩하는 DNA가 미생물에서의 발현을 위한 플라스미드 내로 삽입되었다.

인간 태반 mRNA 의 분리

총 RNA를 표준 절차(Ausuble 등, 1987)에 따라 구아니디움 티오시아네이트 방법을 사용하여 인간 태반으로부터 분리하였다. 폴리(A+) RNA를 올리고(dT) 셀룰로즈 상에서 친화 크로마토그래피로 정제하였다. mRNA를 프로메가(Promega)사의 총 RNA 분리 시스템 프로토콜(protocol)(Cat. # Z51110)에 기재된 방법에 따라 균질화시킨 총 RNA로부터 올리고(dT) 셀룰로즈 친화 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 결과물인 상기 mRNA를 이후 AMV 트랜스크립타제를 사용하는 표준화된 방법에 의해 제1-사슬을 생성하기 위하여 사용하였다. 사슬들 간의 비-특이적 상호작용은 RNase H 및 RNase A를 사용함으로써 감소시켰으며, 이후 페놀/클로로포름/이소아밀알콜 및 70% 에탄올 세척을 사용하여 상기 제1-사슬 DNA를 정제하였다(20 ng/㎕).

총 RNA는 "총 RNA 분리 시스템용 RNAgent"(프로메가, Cat. # Z51110)를 사용하여 인간 태반으로부터 분리하였다. 매번 약 2 gm의 조직을 처리하였다. 총 RNA 펠렛(pellet)을 1 ㎖의 뉴클레아제-제거 수에 재현탁시킨 후 -70℃에서 보관하였다. 총 RNA의 농도는 대략 4 ㎍/㎕ 였다. 올리고(dT)_{8 -12} 및 올리고(dT)₁₀ 비드(bead)를 이용하여 총 RNA로부터 폴리아데닐화 RNA를 모았다. 각 반응마다 1 ㎍의 총 RNA를 사용하였다. 폴리아데닐화 RNA는 AMV 역전사효소를 이용하여 42℃에서 1시간동안 단일사슬의 제1-사슬 상보적 DNA로 역전사시켰다. 제1-사슬 cDNA의 최적 농도는 20 ng/㎕ 범위였다.

cDNA 의 합성 및 클로닝

표준 RT-PCR 기술에 따라 제1-사슬 cDNA를 생성하기 위하여, 역전사에 사용되는 안정한 폴리(A+) RNA(메신저 RNA)를 선별 및 정제하기 위해 올리고(dT)_{12 -18} 비드를 사용하였다(도 1, 도 2 및 도 5a).

역전사 및 제1-사슬의 합성

전사 반응을 확립(set up)하기 위하여, 1.0 ㎍의 RNA/mRNA, 0.5 ㎍의 프라이머(올리고 dT), 뉴클레아제-제거 수를 70℃에서 5분간 가열하고, 이후 5분간 얼음위에서 냉각시켰다. 3초간 마이크로퓨지(microfuge)하여 재료를 정치해 놓았다. 다음으로, 뉴클레아제-제거 수, RT 버퍼(5X), dNTP 혼합물(12.5 mM), 리보뉴클레아제 억제제(40 U/㎕의 1:2 희석액) 및 나트륨 파이로포스페이트(40 mM, 4 mM 최종 농도)를 순차적으로 첨가하고, 부드럽게 혼합시킨 후, 이 혼합물을 42℃에서 2분간 전보온(prewarm)하고 AMV 역전사효소(RT)(10 U/㎕)를 첨가하였다. 부드럽게 잘 혼합한 후 42℃에서 1시간동안 방치한(RT 반응) 다음 75℃에서 10분간 가열하였다(RT의 불활성화). 튜브당 1.0 유닛의 RNase A를 첨가하고, 25℃에서 30분간 배양한 후, 각 반응 튜브에 0.5 유닛의 RNase H를 첨가하고 37℃에서 30분간 배양하였다.

다음으로, 제1 사슬 cDNA를 세척하기 위해 Tris-Cl/1.0 mM EDTA(pH 5∼7.5)를 첨가하였다. 이후, 버퍼화된 페놀(pH 5∼8.0)-클로로포름-이소아밀 알콜을 첨가하고, 볼텍스(vortex)한 후 미세원심분리기 내에서 ∼14,000 rpm으로 회전시켰다. 액체상(aqueous phase)을 새로운 튜브로 옮긴 후, 3 M의 나트륨 아세테이트(pH 3∼7)를 첨가하고 잘 혼합하였다. 이후, 차가운 100% EtOH를 첨가하고, -70℃에 방치한 후, ∼14,000 rpm으로 5분간 회전시켰다. 4℃에서 ∼14,000 rpm으로 5분간 회전시킴으로써 펠렛을 EtOH로 세척하였다. 이후, 뉴클레아제-제거 수에서 재현탁시켰다.

Taq 폴리머라제를 이용하여 표준 PCR 증폭을 수행하여 적절한 선택 벡터내로 원하는 유전자를 클로닝하기에 앞서 이중-사슬 cDNA를 만들었다. 먼저, 모든 성분들, 예를 들면, 버퍼, 프라이머, 제1-사슬 cDNA, 2 mM dNTP, 효소를 혼합한 후, 변성(denaturation)을 위해 열 순환기(cycler) 내에서 94℃에서 1분간 가열하였다. 상기 프라이머의 Tm 보다 2∼4℃ 아래에서 어닐(anneal)한 후, 72℃에서 연장(extension)시켰다. 총 45사이클 증폭을 진행시켰다. 이후, 0.8%∼2% 아가로즈 젤 상에서 요구되는 대로 PCR 반응을 수행하였다.

이중-사슬 cDNA는 Taq 폴리머라제를 이용한 표준 PCR 증폭 기술에 따라 합성하였다. 이후, 상기 원하는 절편을 pUC-18 기반의 TA-클로닝 벡터내로 직접 클로닝시켰다. 이후의 작업을 위한 형질전환체를 제조하기 위해 세균 균주 JM109를 선별하였다.

클로닝 기술

PCR Taq 폴리머라제에 의해 증폭되고 양측 모두에 아데닌을 갖는 이중 사슬 절편의 클로닝 및 구축이 TA-클로닝 벡터내로 직접 수행되었다(도 2 및 도 5). hGH-V용 폴리아데닐화 mRNA는 태반 및 뇌하수체 조직으로부터 준비하였다. 5 ㎍의 상기 총 RNA로부터 총 100 ng의 제1-사슬 cDNA가 제조되었다. 694 bP의 hGH-V 절편(서열번호 1) 및 723 bp의 hGH-N 절편(서열번호 2)을 증폭하기 위하여, 20 ng의 제1-사슬이 유전자-특이적 프라이머, 즉 프라이머 A(서열번호 6); 프라이머 B(서열번호 7); 프라이머 C(서열번호 8); 프라이머 D(서열번호 9)를 어닐링하기 위한 주형으로 사용되었다. 5'- 및 3'-말단 모두에 A-테일(tail)을 갖는 이들 이중-사슬 절편은 pGEHV 및 pGEHN 구조체를 획득하기 위하여 대장균 T4 DNA 리가제(ligase)의 존재하에 pUC-18 기반의 클로닝 벡터내로 직접 클로닝되었다. 이들 클론을 NcoI/NotI, NcoI/PstI로 이중 소화시킴으로써 각각 추가 점검하였다. 아울러, NcoI/RsaI, BstXI, EcoRI/SmlI, SmaI, EcoRI/Bgl Ⅱ, HgaI을 이용하여 제한효소 지도 분석을 수행하였으며, 이로부터 cDNA PCR 절편의 정확성(fidelity)을 결정하였다.

hGH -V 플라스미드 구조체로부터 hGH -N 플라스미드 구조체로의 이동( walking ) 및 적절한 주형 키메라 cDNA 구조체의 제조

hGH-키메라 구조체를 제조함에 있어서, hGH-V(서열번호 1) 및 hGH-N(서열번호 2)은 각각 태반 및 태아 뇌하수체로부터 분리하여 클로닝 벡터내로 클로닝하였다. 이후 hGH-V 절편의 특정한 영역을 몇 가지 제한효소를 이용하여 대장균화된(E. coli-able) hGH-N으로 교체하여 합성 hGH-NV(서열번호 3)을 제조하였다(도 1, 도 4 및 도 5a).

양쪽 cDNA를 특정한 제한효소를 이용하여 철저하게 제한효소 분석하였다. 두 클론의 제한효소 지도를 비교하였고(도 4), 제한효소 소화를 이용하여 hGH-V를 특정한 영역에서 hGH-N으로 치환하기 위한 독특한 방법을 선별하기 위해 분석하였다. hGH-NV의 키메라를 제조함에 있어서, NcoI, NotI, AatⅡ 및 SmlI이 hGH-NV 키메라를 제조하기 위해 사용된 효소들이었다. 돌연변이를 피하기 위하여 프라이머 및 PCR 증폭은 수행하지 않았다. AatⅡ 및 SmlI hGH-V 525 bp cDNA 절편 부분을 hGH-N cDNA로 교체하기 위하여 hGH-N 및 hGH-V 절편 모두에 대해 제한효소 소화만을 수행하였다. 728 bp의 최종 hGH-NV 키메라 구조체(서열번호 3)는 NcoI/NotI 효소 부위를 갖는 pUC-18 기반의 벡터에서 제조되었다.

hGH-V cDNA를 이용하여 변형된 형태로 hGH-N을 클로닝하는 것은 대장균에서의 더 나은 발현을 위해서였다. 상기 목적을 위하여, 태반 유래의 hGH-V(서열번호 1) 및 태아 뇌하수체 유래의 hGH-N(서열번호 2)이 미리 pUC-18 TA-클로닝 벡터내로 클로닝하였고, 이후 상기 키메라(서열번호 3)를 주형으로 성숙한 hGH-NV cDNA가 아라비노즈 유도성 대장균 발현 벡터내로 엔테로키나제 절단 부위 바로 다음에 서브클로닝하였다(도 5a, 도 5b).

26개 아미노산 서열이 제거된 hGH-NV 키메라의 성숙한 펩티드 부분(728 bp, 서열번호 3)에 대해 591 bp의 원하는 PCR 생성물(서열번호 4)을 제공하는 유전자 특이적 프라이머를 이용한 PCR 증폭을 함으로써 성숙한 hGH-NV 절편을 pBAD-HisA 발현 벡터내로 클로닝을 수행하였다.

591 bp의 성숙한 hGH-NV 절편을 증폭하기 위하여, 프라이머 E(서열번호 12) 및 프라이머 F(서열번호 13)가 PCR 증폭에 사용되었다. 도 5에 나타나 있는 유전자 특이적 프라이머 쌍(프라이머 E 및 F)은 591 bp의 성숙한 hGH-NV 절편을 증폭하기 위한 것으로, 프라이머 E(서열번호 12) 및 프라이머 F(서열번호 13)이다. 상기 벡터 부분이 프라이머 Q(서열번호 15) 및 프라이머 R(서열번호 16) 프라이머 쌍에 의해 플라스미드로부터 증폭되어 357 bp의 절편을 만든다.

hGH-V가 hGH-N과 다른 아미노산을 갖는 것(총 13개)의 장점이 고려되었으며, 이때 상기 변화는 이들 아미노산들이 hGH-NV cDNA 스트레치로 교체되는 방식으로 hGH-V 클론 상에서 일어난다. 결과적으로, 이들 변화는 또한 그 발현 효율을 유지하면서 대장균화된 변형된 hGH cDNA 생성물을 제조하였다. hGH-NV 절편의 선별은 코돈 이용성과 RNA 2차 구조 원리에 기반하고 있다. 최종 hGH-NV 키메라 구조체(728 bp, 서열번호 3)에 있어서, 26개 아미노산의 신호 펩티드 중 처음 8개 아미노산은 hGH-V cDNA 유래이며, 3번째 아미노산인 알라닌은 hGH-N의 3번째 아미노산과 다르다. 9∼192 아미노산은 hGH-N cDNA로부터 유래하며, 193∼218 아미노산은 또한 hGH-V cDNA로부터 유래된 것이다.

본 명세서에서, 본 발명자들은 서열번호 1의 전체길이 cDNA 클론을 포함하는 이전의 pGEHV와 서열번호 2의 전체길이 cDNA 클론을 포함하는 pGEHN을 취하여 각각 독특한 제한효소로 소화시켜 hGH-V 절편의 특정한 영역을 대장균화된 hGH-N 부분으로 교체하였다. 이후, 최종 hGH-NV 키메라를 다시 pUC-18 기반의 TA-클로닝 벡터의 NcoI/NotI 제한효소 부위 사이에 클로닝하여 pGEHNV를 제조하였다. pUC 기반의 TA-클로닝 벡터내에 접합된 hGH-NV 키메라를 확인하기 위하여 제한효소 분석을 수행하였다.

추가 변형을 위하여, 나머지 서열은 뇌하수체 형태의 hGH (pABGH1)와 유사하게 유지하면서 유사한 아미노산으로 변형된 워블 서열을 갖고 독특한 RE 부위(BsrGI)가 첨가된 cDNA를 제조하기 위한 주형으로 hGH-NV 키메라 구조체(pGEHNV)를 사용하였다. 마지막으로, 579 bp(서열번호 5) 길이의 변형된 형태의 성숙한 hGH ORF(독특한 제한효소 부위인 BsrGI이 도입됨)는 프라이머 E(서열번호 12) 및 프라이머 F(서열번호 13)를 사용하여 아라비노즈 유도성 대장균 발현 벡터내로 EK 절단 부위 바로 다음에 클로닝되어 hGH 클론 #1(pABGH1)이 되었다(도 5b). 기원이 되는 뇌하수체 cDNA의 발현과 비교하기 위하여, 태아 뇌하수체 유래의 총 RNA를 사용하여 PCR 생성물을 증폭하고, EK 절단 부위 바로 다음에 아라비노즈 유도성 벡터내로 클로닝하였으며, hGH는 579 bp의 합성체(서열번호 5, 도 8)와 비교할 때 낮은 단백질 발현 수준을 나타내었다. hGH-NV 키메라 유래의 상기 cDNA 서열을 디제너러시에 따른 코돈 이용성을 선택하기 위해 취하였고, 발현 효율을 증가시키기 위해 대장균에서 유지하였다. 결과적으로, 본 발명자들은 예를 들면 hGH-V(서열번호 1)에서 hGH-N(서열번호 2)으로, 최종적으로 hGH-NV 키메라(서열번호 3)의 순으로 그 차이가 크지는 않았지만(도 8) 양쪽 클론 모두에서 hGH 발현 정도를 확인하였다. 소수의 대장균화된 코돈을 도입하였으며, 클로닝 단계(도 5b)에서 서열번호 17 내지 서열번호 22로 기재되는 프라이머 J 내지 O를 이용하여 제한 부위(BsrG1)를 도입하는 것은 아미노산의 3번째 코돈(서열번호 5) 또한 변화시켰다.

hGH - NV 키메라 구조체 제조의 상세한 설명

총 RNA를 추출하기 위한 기원이 되는 조직 공급원은 hGH-N cDNA 합성의 경우에는 인간 태아 뇌하수체 조직으로부터 취하였고, hGH-V cDNA 합성의 경우에는 인간 태반으로부터 취하였다. hGH-N (723 bp, 서열번호 2) 및 hGH-V (694 bp, 서열번호 1) cDNA의 예측되는 RT-PCR 증폭 cDNA 생성물이 pUC-18 기반의 벡터 내에서 TA-접합되었다(도 5a). 독특한 제한효소를 이용하여 양쪽 cDNA에 대한 철저한 제한효소 분석을 수행하였다(도 4).

단계 Ⅰ. 키메라 형태의 hGH-NV cDNA를 제조함에 있어서, pUC-18 기반 벡터의 독특한 부위로서 hGH-V의 694 bp 절편(서열번호 1)에는 없는 NcoI/NotI으로 pUC-18 기반의 hGH-V 클론(#6 및 #25)을 이중 소화하였다. NcoI/NotI 소화된 720 bp 절편(서열번호 3에서 확인)이 젤에서 정제되어 5'-말단(55 bp) 및 3'-말단(139 bp)을 분리하였다. 상기 NcoI/NotI 소화된 열린 pUC-18 기반의 벡터(pGEHNV, 2,941 bp) 또한 이후의 클로닝을 위해 정제하였다(도 5a, 도 5b).

단계 Ⅱ. NcoI/NotI 이중 소화된 720 bp의 젤-정제 절편을 다시 Aat Ⅱ/SmlI으로 소화시켜 525 bp의 중앙 Aat Ⅱ/SmlI 절편으로부터 55 bp의 5'-말단 및 139 bp의 3'-말단 절편을 분리하였다. 상기 525 bp의 hGH-V cDNA 절편은 Aat Ⅱ/SmlI 525 bp hGH-N 절편으로 교체하였으며, 이로부터 인간 태반 hGH-V는 인간 뇌하수체 유래 hGH-N과 비교할 때 13개 아미노산이 차이가 있었다. HGH-V는 26개 아미노산 중에서 2개 아미노산(3번째 및 19번째)이 hGH-N 신호 서열과 다르며, hGH-NV 신호 서열의 경우에는 3번째 아미노산은 hGH-V와 일치하고 19번째 아미노산은 hGH-N과 일치한다. 165개 아미노산 중에서 성숙한 펩티드를 포함하는 hGH-NV의 140개 아미노산은 hGH-N 서열과 일치하며, 이 부분의 hGH-N은 대부분 hGH-V와 다르다. 나머지 25개 아미노산은 다시 hGH-V 서열과 일치한다. 이 단계에서, T4 DNA 리가제를 이용하여 4℃에서 밤새 접합 반응을 수행하여 점착성(sticky) 말단을 갖는 대응하는 제한효소 부위(도 4)에서 55 bp 및 139 bp 절편을 접합시켰다.

양쪽 클론의 제한효소 지도를 비교하면 제한효소(NcoI, NcoTI, Aat Ⅱ 및 SmlI) 소화를 이용하여 특정한 영역에서 hGH-V를 hGH-NV로 교체하기 위한 독특한 방법이 선택되며, 전체길이 728 bp의 접합된 hGH-NV cDNA 절편을 보여준다(서열번호 3).

성숙한 펩티드 부분의 hGH-NV cDNA를 유전자 특이적 프라이머 쌍으로 PCR 증폭하면 591 bp의 예측되는 PCR 생성물을 생성하였다(서열번호 4, 도 5b). 유전자 특이적 프라이머 쌍(프라이머 E 및 프라이머 F)은 도 5에 나타나 있으며, 프라이머 E(서열번호 12) 및 프라이머 F(서열번호 13)이고, 591 bp의 성숙한 hGH-NV 절편의 증폭에 사용된다. 상기 벡터 부분을 프라이머 Q(서열번호 15) 및 프라이머 R(서열번호 16) 프라이머 쌍에 의해 플라스미드(pBAD-HisA)로부터 증폭시켜 357 bp 절편을 생성하였다. 프라이머 E는 성숙한 hGH를 개시하는 첫 번째 아미노산인 페닐알라닌(TTC)으로부터 TC(서열번호 3 내의 119에서 프라이머 E)가 첫 번째 뉴클레오티드로 선택되는 방식으로 선택되었다. 프라이머 F는 서열번호 3 내의 681∼694에서 선택되었고, 나머지 뉴클레오티드는 클로닝을 위해 XhoI 제한효소 부위를 포함하는 아라비노즈 유도성 벡터에 근거하여 선택되었다. 591 bp 서열이 아래에 나타나 있으며, 프라이머 부분은 박스로 표시되어 있다.

또한, pBAD/HisA의 hGH-NV 성숙 클론을 제한효소 NcoI/Eco24I, NheI/EheI, NcoI/XhoI, BshTI/XhoI/BstXI, BshTI/XhoI, NcoI/EcoRI 으로 소화하면 올바른 크기의 절편을 생성하였다. 상기 클론 및 NcoI/EcoRI 소화된 젤 정제 절편에 대해 NcoI/Bsh1236I, NcoI/PleI, NcoI/PstI, NcoI/BstXI, NcoI/EheI, NcoI/Bgl Ⅱ, NcoI/Eco57I, PleI/XhoI, NcoI/PstI/EheI, Bsh1236I/Bgl Ⅱ 로 추가 분석하였다.

아라비노즈 유도성 hGH 클론의 독특한 구조체의 제조

대장균에서의 hGH 단백질의 발현을 최적화하기 위하여, 프로모터-삽입체-종결 서열을 포함하는 전체 카세트의 다중화(multimerization)를 시도하여 유사한 발현 벡터내로 클로닝하였다. 이러한 변형을 얻기 위하여, 총 대장균 발현의 5%를 보이는 hGH 클론 #1, pABGH1 (hGH-NV 유래의 합성 단일 hGH 삽입체, 도 5a)을 주형 플라스미드로 사용하였다.

hGH 클론 #1 (pABGH1)을 BshTI/EcoRI (각각 74 및 977에 독특한 부위)으로 소화시키고, 각각 3,717 bp (절편 1) 및 903 bp (절편 2)인 소화된 절편 모두를 정제한다. AccI (350, 1447, 3412 부위) 및 EcoRI (977 부위)으로 소화된 pABGH1 DNA는 627 bp, 470 bp, 1,558 bp 및 1,965 bp를 생성한다. 이후, 470 bp 절편(절편 3)을 정제한다. pABGH1 DNA를 AccI (부위는 위에 기재) 및 BshTI (74 부위)으로 소화시켜 279 bp, 1,097 bp, 1,282 bp 및 1,965 bp를 생성한다. 이후, 상기 1,282 bp 절편(절편 4)을 정제한다. 모든 접합 반응은 실온에서 1시간동안 배양한 후 4℃에서 밤새 배양하였다.

절편 2와 절편 3을 접합시켜 1,373 bp (절편 5)를 얻는다. 이후, 상기 절편 5를 절편 1과 접합시켜 5,090 bp (절편 6)를 얻는다. 이후, 절편 4와 절편 2를 개별적으로 접합시켜 2,185 bp (절편 7)를 얻는다. 마지막으로, 절편 6과 절편 7을 접합시켜 hGH 클론 #1(pABGH1, 4,620 bp)을 hGH 클론 #2(pABGH2, 7,275 bp)로 변형시키는 것을 완성하게 된다. 양성 클론은 DNA 추출, 및 예컨대 EcoRI, BshTI과 같은 이중 제한효소 부위뿐만 아니라 7,275 bp 절편의 선형화된 pABGH2를 얻기 위하여 예컨대 PvuI과 같은 독특한 부위를 갖는 제한효소 분석에 의해 분석하였다. 삽입체의 정확한 길이는 2,655 bp였으며, 이중으로 복제되어 아라비노즈 유도성 발현 벡터 내에서 직렬 카세트 형태로 EK 절단 부위 바로 다음에 삽입되었다. 상기 카세트를 추가로 확인하기 위하여, 2,655 bp 및 4,620 bp의 2가지 절편을 NcoI 또는 BshTI으로 소화한 후 서열 분석을 수행하였다. pABGH2 클론을 제조하기 위한 상기 시도로부터 hGH 발현 수준이 거의 2배 증가되었음을 확인하였다(도 8).

더 높은 수준으로 hGH를 발현하기 위하여, 아라비노즈 유도성 벡터 내에서 카세트의 수를 증가시키기 위한 시도를 수행하였다. pABGH2 구조체를 제조한 후, 추가로 카세트를 첨가하면 플라스미드를 안정하게 제조할 수 없었다. 동일한 배양물을 2 계대배양 후, pABGH3의 3번째 발현 카세트가 결실되었음을 서열분석으로 확인하였다. pABGH2가 2년후에도 안정한 유일한 플라스미드였으며, 발효기에서 배양할 때에도 또한 안정한 것으로 나타났다.

배양기에서 자란 세포 배양물로부터 성숙한 hGH 의 정제

배양기로부터 유도된 세포 배양물이 용해 물질 공급원으로 사용되었으며, 재조합 hGH는 가용성 대장균 단백질들과 함께 얻어졌다.

(pABGH1 및 pABGH2 발현 클론 유래의) 재조합 hGH의 정제는 도 6 및 도 8에서 해당 웨스턴 블롯에 의해 나타난 몇 가지 독특한 단계를 통해 수행되었다. 정제된 hGH는 생물학적 활성에 대해 검사하였으며, 시판되는 노바젠(Novagen)사의 노르디트로핀(Norditropin) 표준물에 필적하는 높은 효능을 보였다(도 7).

성장 호르몬의 생활성 ( bioactivity ):

정제된 hGH를 시판되는 hGH(노바젠사의 노르디트로핀)와 함께 생활성을 확인하기 위해 검사하였다. GH 생활성은 혈청내에서 비교 표준물과 자극 또는 억제 원리가 동일하다는 가정하에 공지된 표준물에 의해 유도되는 것에 상당하는 표적 조직의 반응이다. 림포마(lymphoma) 세포는 락토젠성 활성이 알려져 있는 인간 성장 호르몬(hGH)을 포함하는 락토젠성(lactogenic) 호르몬에 특이적으로 반응한다는 것이 오랫동안 알려져 왔다. hGH 생분석(bioassay)에서 사용된 방법은 타나카의 방법(Tanaka 등, 1980; Ealey 등, 1995)에 약간의 변형을 가한 것이었다. 선물로 제공받은 래트(rat) 림포마 세포주인 Nb-2를 hGH의 생물학적 활성을 확인하기 위해 사용하였다. 상기 Nb-2 세포는 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 10% 말 혈청(HS)을 함유하는 RPMI에서 지속적으로 유지시켰다. 생분석 24시간 전에, 1% FBS 및 10% 말 혈청을 함유하는 RPMI 1640 무활동(quiescent) 배지에서 세포를 유지하였다. 분석시에는 세포를 세척하고 계수한 후, 세포 밀도를 10% 말 혈청을 함유하는 RPMI 플레이팅 배지를 이용하여 1×10⁵ 세포/㎖로 조정하였다. 상기 플레이팅 세포의 밀도는 24 웰 플레이트의 경우 1×10⁵ 세포/㎖/웰 이었다. 다른 농도의 표준물 및 본 발명의 신규한 방법에 의해 생산된 hGH를 세포에 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24, 48 및 72시간 동안 배양하였다. 매 24, 48 및 72시간에 혈구측정기(hemocytometer)를 이용하여 세포를 계수하였다.

표 2 및 도 8의 그래프로부터, 시간이 경과함에 따라 세포 수가 투여량(dose) 의존적으로 증가한다는 것이 분명하였다. 최대 세포 증식은 72시간 후에 얻어졌다. 본 발명의 신규한 방법에 의해 생산된 성장 호르몬의 생활성은 성장 호르몬 표준물의 참고 표준물에 필적하였고 재생가능하였다. 표 2의 데이터는 4차례 이상의 실험 결과를 보여주고 있다.

본 발명의 목적 및 이점이 얻어질 수 있는 방식은 상세한 설명 및 이에 수반되는 도면에 의해 보다 충분하게 개시될 것이며, 그 내용은 다음과 같다.

도 1은 hGH 아형인 hGH-V 및 hGH-N의 cDNA 서열을 hGH-NV 키메라 구조체와 비교한 것이다.

도 2는 hGH-V (서열번호 10), hGH-N (서열번호 11) 및 hGH-NV (서열번호 14)의 아미노산 서열을 비교한 것이다.

도 3은 hGH-N 및 hGH-NV 서열에 기초하여 접혀진(folded) RNA 2차 구조를 비교한 것이다. 비록, 양쪽의 최소(min) 에너지(hGH-N 및 hGH-NV ORF 서열)는 유사하지만, 이들의 RNA 2차 구조는 서열의 차이로 인해 매우 다르다.

도 4는 키메라 hGH-NV를 생산하기 위한 hGH-N 및 hGH-V의 제한효소 부위를 개략적으로 보여주는 것이다.

도 5a는 hGH-NV 키메라(서열번호 3)의 제조와 pGEHNV 플라스미드를 얻기 위 한 클로닝에 관여하는 단계들을 순차적으로 보여주는 개략도이다.

도 5b는 플라스미드 클론 pABGH1을 구축하기 위하여 키메라 hGH를 아라비노즈(ara)-유도성 벡터내로 클로닝하는 방법을 보여주는 흐름도이다.

도 6은 His-태그 hGH 및 항-hGH 항체를 이용한 웨스턴 블롯(Western blot)을 이용하여 발효기에서 자란 용해물(lysate)로부터 정제된 형태의 hGH를 얻는데 관여하는 단계를 보여주는 것이다.

도 7은 재조합 hGH의 생활성도 수준을 시판되는 노르디트로핀(Norditropin)과 비교한 것을 보여준다.

도 8은 쿠마시(Coomassie) 염색된 젤에서 아라비노즈-유도성 발현에 의해 hGH#1 (pABGH1) 및 hGH#2 (pABGH2) 클론간의 hGH 발현 정도의 차이를 보여주는 것이다. 비유도성 클론이 대조군으로 사용되었다.

본 도면에서, pABGH1'은 뇌하수체 cDNA에서 유도된 hGH 클론(Chen 등, 1989, 레인 5 및 6)이고, pABGH1(레인 7 및 8)은 키메라 hGH-NV에서 유도된 합성 hGH 클론이며, pABGH2(레인 3 및 4)는 나중에 이중으로 삽입된 것을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 돌연변이 유발을 통한 원하는 cDNA 로의 클로닝

유전자 특이적 프라이머(들)를 합성하는 동안에 독특한 제한효소 부위 또는 ORF 영역에서의 코돈 수준에서의 변화를 도입하였다. 예컨대, cDNA 상의 이러한 변경, 돌연변이 자체는 hGH-V 및 hGH-N의 공개된 cDNA 서열을 주형으로 사용하여 상기 인간 성장 호르몬상에서 도입되었다. hGH-V의 cDNA 서열은 한 예로써 아래에 나타내었으며, 박스 영역은 694 bp의 hGH-V 절편(서열번호 1)을 PCR 증폭하기 위한 선별 부위인 상부 PCR 프라이머(프라이머 A, 서열번호 6) 및 하부 PCR 프라이머(프라이머 B, 서열번호 7)를 나타낸다. 이때, 상기 프라이머 쌍의 위치는 태반 제1 사슬 유래의 694 bp hGH-V 절편(서열번호 1)을 증폭하는 것을 보여준다. 개시 코돈인 ATG와 종결 코돈인 TAG는 동일한 서열 영역 내에 다른 색깔(굵은 글씨)로 강조되어 있다.

예상되는 694 bp 길이의 생성물(서열번호 1)

PCR 증폭 과정에서, cDNA의 5'- 및 3'-말단 상의 적절한 부위 내에 제한효소 부위를 도입하는 것이 가능하였다. 이러한 변화는 이후 특정한 발현 벡터내로 클로닝하기 위해 사용되었다. 전체길이 cDNA 내에서의 이러한 돌연변이는 코돈 영역에 영향을 미치지는 않으며, 예컨대 잠재적인 hGH-V cDNA는 상기 유전자 특이적 프라이머 쌍(프라이머 C&D; 서열번호 8&9, 표 3)을 이용하여 다른 것들 중에서 증폭되었다.

hGH -V 증폭을 위한 프라이머들

프라이머 서열 (5'→3')	특성	길이	Tm	야생형 서열상의 뉴클레오티드 위치(Chen, 등, 1989)
4CTGTGGACAGCTCAGGTACCGGCAATGG(프라이머 C) (서열번호 8)	KpnI 부위 포함	28 bp	60.7℃	39∼66
4GATGGGATCCGAGCAGCTAGAAGCCACAG(프라이머 D) (서열번호 9)	BamHI 부위 포함	29 bp	60.7℃	571∼600

실시예 2: 위치( locus )상의 제한효소 분석에 의한 잠재적 클론의 검증

약 723 bp (hGH-N, 서열번호 2) 또는 694 bp (hGH-V, 서열번호 1)의 DNA 절편은 총 20 ㎕의 반응액에서 pUC-18 기반의 클론을 제한효소 SalI 및 XhoI을 이용하여 이중 소화시킴으로써 얻었다. 상기 반응 샘플은 MBI, 젤 추출 키트(Cat. # K0513)를 이용하여 1% 아가로즈 젤상에서 러닝(running)시켜 원하는 밴드를 정제하였다. 이후, 결과물인 2∼3 ㎕의 정제된 절편을 예를 들면, NcoI/NotI, KpnI/BamHI, BsrDI/SpeI, Bgl Ⅱ/BamHI, NcoI/HgaI, NcoI / RsaI 및 EcoRI/Bgl Ⅱ와 같은 단일형 또는 조합형으로 6 내지 7가지 독특한 절단체(효소의 농도는 통상 10 U/ ㎕ 였음)로 소화시킴으로써 그 제한효소 맵에 대해 분석하였다. 소화된 샘플을 러닝한 후 아가로즈 젤을 분석하기 전에 상기 제한효소 소화물로부터 대략적인 절편의 크기를 산정하였다. 또한 제한효소 소화물을 원하는 삽입체를 포함하는 세균 클론의 유효성을 검증하기 위해 체크하였다. 이때, 상기 제한효소 소화물은 상기 벡터 효소 부위로부터의 삽입체의 거리가 맵핑되고, 5'에서 3' 방향으로의 삽입체의 방향이 알려져 있는 방식으로, 예를 들면 PvuI , SalI / EcoRI , Cfr10I , ApaLI , BshTI, AvaI , SspI , AccI 등으로 선별하였다.

실시예 3: 제1 사슬의 제조 및 코돈 이용성

본 발명에서, 본 발명자들의 관심은 태반 유래의 hGH-V 및 뇌하수체 유래의 hGH-N을 올리고-dT RT-PCR을 통해 대장균 TA-클로닝 벡터내로 클로닝하는데 있다. hGH-V를 클로닝하기 위하여, 총 RNA를 인간 태반으로부터 추출하였다. 유전자 특이적 상류 및 하류 프라이머들은 hGH-V cDNA 서열에 따라 디자인하였다(Chen 등, 1989). RT-PCR은 mRNA 생성용 올리고-dT₍₈₊₁₂₎ 프라이머들을 이용한 올리고 dT₍₈₊₁₂₎ 및 올리고 dT₁₀ 정제된 mRNA로 수행하였고, 순차적으로 제1 사슬 cDNA를 합성하였다. 모아진 mRNA는 AMV 트랜스크립타제(transcriptase)의 도움으로 RT 반응에 의해 제1 사슬 cDNA를 합성하기 위해 사용되었다. 제1 사슬의 양은 예를 들면 β-액틴 유전자와 같은 표준 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 증폭에 의해 확인되었다. PCR 증폭된 694 bp의 잠재적 hGH-V 절편(서열번호 1)은 TA-클로닝에 의해 pUC-18 기반의 벡터내로 직접 클로닝되었다. 모든 양성 클론들은 제한효소 분석(Aat Ⅱ, BstXI, NcoI, NotI, PstI을 사용)을 수행하여 절편의 유효성 검증뿐만 아니라 벡터 내에서의 절편의 방향도 점검하였다. 그 결과, 상기 694 bp 절편(서열번호 1)이 hGH-V cDNA임을 확인하였다.

또한, hGH-N cDNA 절편은 상기에서 기재된 동일한 방법에 따라 태아 뇌하수체 mRNA를 이용하여 제조하였다. 4개의 독립적인 RT-PCR 증폭된 잠재적 723 bp hGH-N 절편(서열번호 2)이 TA-클로닝에 의해 pUC-18 기반의 벡터내로 직접 클로닝되었다(pGEHN). 인간 hGH-N cDNA 맵으로부터 8가지 독특한 제한효소를 사용하여 클로닝된 절편의 유효성을 점검하였으며, 태아 뇌하수체 및 뇌 유래의 상기 723 bp RT-PCR 생성물(서열번호 2)이 모두 잠재적인 hGH-N cDNA임을 확인하였다.

대장균의 코돈 디제너러시에 따라 코돈 최적화를 위해 hGH-N을 분석하였는데, 대부분의 영역에서 코돈 이용성이 유사하였다(Gray 등, 1988; US4,604,359). 바람직한 구현예에서는 성숙한 ORF 내의 2개 아미노산만이 그 워블 서열에 따라 조작되었고, 독특한 제한효소 부위를 생성하였다.

실시예 4: 서열에 의한 분석

상기 구조체는 보통의 시퀀싱 크로토콜을 실험실에서 변형한 방법을 이용하여 시퀀싱하였다. 시퀀싱할 DNA인 PCR 생성물 또는 플라스미드 구조체는 칼럼을 통하거나, 또는 Kraft 등(1988)에 의해 개시된 PEG 침전법을 통해 정제하였다. 정제 후, 샘플 DNA를 시퀀싱을 위해 50 ng 내지 500 ng 범위로 준비하였다. 순환 시 퀀싱 반응은 10 ㎕ 또는 20 ㎕의 최종 부피에서 수행되었다. 각각의 반응에서, 4 ㎕ 또는 8 ㎕의 종결제 즉시 반응 혼합물(ready reaction mix)을 DNA 주형에 첨가하였다. 상기 즉시 반응 혼합물은 미리 혼합된 dNTP, 염료 종결제, 증폭 Taq DNA 폴리머라제, MgCl₂ 및 버퍼를 포함한다. 1 ㎕의 프라이머(5 pmole/㎕)를 첨가한 튜브를 열 순환기에서 순환 시퀀싱하였다(94℃에서 10초, 50℃에서 5초 및 60℃에서 4분을 25회 반복).

상기 PCR 생성물은 2.7 M 나트륨 아세테이트(pH 4.6) 및 에탄올로 침전시키고, 70% 에탄올로 2차례 세척한 다음, 최종 DNA 펠렛(pellet)은 포름아미드(formamide)로 재부유시켰다. 이후, 샘플을 자동 서열분석기(ABI 테크놀로지사의 310 유전자 분석기)에서 분석하였다.

실시예 5: 키메라 cDNA 의 구축

본 발명자들의 전략에서, hGH-V와 hGH-N 간의 아미노산(총 13개)의 차이점을 고려하여 상기 아미노산들이 hGH-N cDNA 스트레치로 변경되는 방식으로 hGH-V 클론상에서 변형을 수행하였으며, 그 결과 대장균화된 변형된 hGH cDNA 생성물을 제조하였다. 본 발명자들은 pUC-18 기반의 벡터내에 미리 클로닝된 hGH-V 및 hGH-N cDNA를 사용하였다. 상기 클론들(pGEHV 및 pGEHN)을 독특한 제한효소를 이용하여 각각 소화시켜 hGH-V 절편의 특정한 영역을 대장균화된 hGH-N 부분 또는 합성 구조체로 교체하였다. 이후, 최종 hGH-NV 키메라를 제한효소를 이용하여 클로닝하였 고, 소화된 절편들을 서로 접합시켜 TA-클로닝 벡터내로 NcoI/NotI 부위 사이에 다시 접합시켰다. 제한효소 분석을 수행하여 상기 접합된 hGH-NV 키메라가 동일한 pUC-18 기반의 TA-클로닝 벡터(Yanisch-Perron 등, 1985)내에 있음을 확인하였다.

hGH-NV cDNA 키메라의 클로닝은 pUC-18 기반의 클로닝 벡터 pGEHNV 상의 NcoI/NotI 부위(도 5a)에서 수행하였고, 또한 pBAD 프로모터(또는 유사한 프로모터)(pBAD/HisA)에 의해 조절되는 대장균 발현 벡터에서 수행하였으며, 이를 이용하여 TOP10 대장균 균주를 형질전환시켰다. 접합 반응은 상기 반응 혼합물을 4℃∼14℃에서 16시간동안 밤새 배양함으로써 수행하였다. 형질전환체의 수를 증가시키기 위해서는 상기 접합 반응 혼합물을 이러한 방식으로 배양하는 것이 필요하였다. 형질전환을 위해 통상의 프로토콜이 수행되었으며, 이때 배양 후 100 ㎕∼200 ㎕의 형질전환 혼합물을 50 ㎍/㎕의 암피실린을 포함하는 2XYT 아가 플레이트에 도말하였다. 플레이트당 50∼70개 이상의 콜로니가 존재하였다; 대조군 플레이트는 선형화된 벡터를 이용하여 준비하였다. DNA 추출을 상기에서 언급한 알칼리 용해 방법을 이용하여 이후의 미니프렙(miniprep) DNA 추출에 따라 수행하였다. 잠재적인 양성 클론을 확보한 후 철저한 제한효소 분석을 수행하였으며, 삽입체의 제한효소 지도를 점검하기 위해 NcoI/Eco24I, NheI/EheI, NcoI/XhoI, BshTI/XhoI/BstXI, BshTI/XhoI, NcoI/EcoRI을 사용하였다.

대장균에서의 hGH-NV 발현을 체크하기 위하여, 본 발명자들은 상기 키메라 cDNA를 pBAD/HisA 발현 벡터내로 클로닝하였다. 본 발명자들은 분비 신호 펩티드인 26개 아미노산이 제거된 성숙한 펩티드 영역을 코딩하는 cDNA의 영역만을 클로 닝하는 것에 관심이 있다. 이를 위하여, 유전자 특이적 프라이머 쌍을 성숙한 펩티드 영역의 개시(프라이머 E, 서열번호 12) 및 종결(프라이머 F, 서열번호 13) 부위에서 제조하였다. 상기 벡터 내의 인자 Ⅷa 및/또는 EK 절단 부위 바로 뒤에 성숙한 hGH-NV를 동시에 클로닝하기 위하여, 상기 벡터 절편의 프라이머 쌍(프라이머 Q&R; 서열번호 17 및 18)이 상기 hGH-NV cDNA가 T-A 클로닝 방법에 의해 상기 벡터 절편 영역 내에 고정되는 방식으로 디자인하였다. 이러한 독특한 전략을 사용함으로써, 본 발명자들은 pBAD/HisA 발현 벡터(또는 유사한 벡터)를 갖는 7개의 양성 hGH-NV 클론을 획득하였다.

TOP 10 대장균 발현 균주(또는 유사 균주) 유래의 6개의 성숙한 키메라 클론 중 2개를 광범위하게 제한효소 분석한 결과, 상기 클론들이 T-A 접합에 의해 상기 벡터상에 올바른 방향으로 접합된 잠재적인 hGH-NV 성숙 cDNA 클론임을 확인하였다. hGH-NV 서열(서열번호 3)은 코돈 이용성, 1개의 추가 제한효소 부위 및 mRNA 2차 구조(도 3 및 도 4)에서 hGH-N 서열과 다르며, 상기 합성 hGH-NV는 소마토트로핀과 동일한 단백질 서열을 제공한다(도 2).

실시예 6: 다중 카세트의 제조

상기 조절 영역을 포함하는 코딩 도메인(domain)의 다중 카세트를 직렬 방식으로 삽입시키기 위하여 독특한 전략을 수립하였다. 이는 대장균 내에서 재조합 hGH-NV 유래의 인간 성장 호르몬의 발현 수준을 증가시키도록 하며, 그 발현 수준에서 명확하게 구별되는 차이를 보인다(도 8). 이때, 상기 다중 카세트를 총 7,275 bp의 아라비노즈 유도성(또는 유사한 유도 시스템) 발현 벡터(pABGH2)내로 클로닝하였다.

상기 시도에서, 본 발명자들의 관심은 대장균내에서 고-레벨로 발현하기 위하여 유도가능한 발현 벡터 내에서 hGH 성숙 cDNA를 이중 카세트의 형태로 클로닝하는 데 있다. 발현된 단백질에 대해 철저한 분석을 수행한 결과, 올바른 분자량을 갖는 단백질이 SDS-PAGE 상의 밴드에서 나타났으며, 이후 웨스턴 블롯, N-말단 아미노산 시퀀싱 및 프로테아제 절단 맵핑을 통해 추가로 확인되었다(데이터 미공개). 종래의 클론은 총 대장균 단백질 발현의 단 5%만을 보였으므로, 본 발명자들은 hGH 클론 #1 (pABGH1)을 변형시키는데 초점을 맞추었다. 본 발명자들은 접합 및 클로닝 전략을 적용함으로써 8개 이상의 상기 양성 클론들을 확보하였다. 상기 독특한 클론은 다중 카피(copy)된 프로모터-hGH 삽입체-터미네이터 카세트로 구성되어 있다. 양성 클론의 확인은 제한효소 분석을 몇 가지 조합함으로써 수행되었다. 빠른 유도 실험 및 이후의 SDS-PAGE 분석 결과, 발현 수준이 종래 hGH 클론 #1 (pABGH1)보다 더 높다는 것을 보여주었다. 훨씬 더 높은 수준의 발현을 획득하기 위하여, 다양한 유도제(inducer)를 포함하는 최적 배지 내에서 발현이 유도되었다.

양성 클론에 대해 철저한 제한효소 분석을 수행하였다. 미니프렙 DNA에 대한 PvuI 소화가 양성 클론을 선별하기 위한 스크리닝 방법으로 선택되었다.

hGH 클론 #1 (pABGH1) 유래의 맥시프렙(maxiprep) DNA를 AccI/BshTI, BshTI/EcoRI 및 AccI/EcoRI으로 소화시켜 1,965 bp, 1,282 bp, 903 bp, 3,717 bp 및 470 bp의 DNA 절편을 각각 얻었다. 37℃에서 2시간동안 소화시킨 후, 소화된 샘플을 1.2% 아가로즈 젤에서 러닝하고, 상기 언급된 밴드를 접합시키기 위해 정제하였다.

제한효소 소화된(pABGH1) 맥시프렙 DNA는 원하는 젤-정제 절편을 보여준다. AccI/BshTI으로 이중 소화된 pABGH1 클론은 1,965 bp 및 1,282 bp의 원하는 DNA 절편을 보여주었고, BshT Ⅱ/EcoRI으로 이중 소화된 pABGH1은 정제된 903 bp의 소화된 절편을 보여주었으며, pABGH1 클론은 AccI/ecoRI으로 이중 소화되었다. 470 bp 및 1,965 bp의 정제된 원하는 밴드는 접합될 것이다.

상기 3가지 DNA 절편들을 차례로 접합하였으며, 이들은 조절부위, hGH cDNA 삽입체 및 3'-하류 종결 영역을 포함한다. 상기 총 2,655 bp의 카세트는 최종적으로 상기 1,965 bp 절편과 접합시킴으로써 원형화된다. 플라스미드 구조체의 총 길이는 7,275 bp (서열번호 18, 도 5b)가 되며, 상기 삽입체의 크기는 2,655 bp로서 직렬로 배열된 이중 카세트 내에 삽입되어 있다. 모든 서열번호들은 표 3에 적절하게 표로 만들어져 있다.

실험실 규모의 생산

다중 카세트의 hGH-NV를 아라비노즈 유도성 발현 벡터내로 클로닝하는 것은 이후 단계에서의 생산을 위해 발현 수준을 증가시키기 위한 의도이다. 이러한 의도는 적어도 1 ℓ 규모에서는 성공적이었으며, 4∼5 g/ℓ(또는 그 이상)의 수율로 적절한 발효 조건 하에서 생산되었다. 단일 합성 hGH, 이중 카세트 내에서의 단백질 발현 정도를 비교한 것을 도 8에 나타내었다.

참고문헌

특허문헌

기타 문헌

본 발명의 주된 이점들:

1. 2가지 아형, 즉 hGH-V 및 hGH-N으로부터 제조되며, 원핵생물 세포에서 더 나은 코돈 이용성을 갖는 신규한 키메라.

2. hGH-NV cDNA 키메라가 위치-유도(site-directed) 돌연변이법을 사용하지 않고 획득됨.

3. 헬퍼 벡터를 사용하지 않고, 또한 단백질 서열을 변경하지 않으면서, 코돈 이용성을 변형하는 것에 의한 더 나은 hGH의 발현.

4. 상기 벡터 유래의 조절 인자와 함께 hGH-NV cDNA 키메라 유래의 발현가능한 구조체를 이중으로 함으로써 향상된 수준의 hGH 발현이 가능함.

Ausubel, F.M. 등(1987)으로부터 취함

아미노산	코돈	포유동물 빈도	%	기타 빈도	척추동물 %	효모 빈도	%	그람 빈도	음성 %	G. 빈도	양성 %
Gly	GGG	16.6	22.8	14.8	20.7	5.2	9.0	9.4	12.3	9.2	13.7
Gly	GGA	18.5	25.5	20.9	29.2	8.5	15.0	7.0	9.2	20.5	30.5
Gly	GGU	12.8	17.6	15.2	21.3	34.9	61.0	25.1	32.9	18.2	27.2
Gly	GGC	24.7	34.1	20.7	28.9	8.9	15.0	34.9	45.6	19.1	28.5
Pro	CCG	6.8	11.2	6.0	11.0	4.1	9.0	23.7	54.4	10.8	30.3
Pro	CCA	16.5	27.3	16.7	30.4	21.9	49.0	7.4	17.1	10.3	28.9
Pro	CCU	17.4	28.8	15.7	28.6	12.7	29.0	6.6	15.2	11.9	33.2
Pro	CCC	19.7	32.7	16.4	30.0	5.7	13.0	5.8	13.3	2.7	7.6
중지	UAA	1.0	23.2	1.4	28.0	1.0	49.0	1.8	57.2	2.1	65.6
중지	UAG	0.7	17.2	0.7	13.8	0.4	17.0	0.3	9.7	0.5	15.6
중지	UGA	2.6	59.6	2.9	58.1	0.7	34.0	1.0	33.2	0.6	18.9
Phe	UUU	15.3	40.7	14.6	44.2	22.7	53.0	17.1	47.5	27.3	68.0
Phe	UUC	22.3	59.3	18.4	55.8	20.0	47.0	18.9	52.5	12.8	32.0

	24 시간	48 시간	72 시간
대조군	1.25×105±0.11	1.72×105±0.27	2.05×105±0.11
0.1 ng Novo Nordisk	1.72×105±0.18	5.07×105±0.55	5.30×105±0.92
1 ng Novo Nordisk	1.73×105±0.06	6.05×105±0.45	10.12×105±0.27
10 ng Novo Nordisk	1.79×105±0.27	8.37×105±0.73	16.35×105±1.15
본 발명의 신규한 방법에 따라 생산된 0.1 ng의 GH	1.49×105±0.11	2.53×105±0.29	5.20×105±0.66
본 발명의 신규한 방법에 따라 생산된 1 ng의 GH	2.04×105±0.22	5.90×105±0.42	11.8×105±0.74
본 발명의 신규한 방법에 따라 생산된 10 ng의 GH	1.95×105±0.22	9.1×105±0.44	19.05×105±1.73

서열번호	서열명	서열의 길이 (뉴클레오티드/펩티드)	위치
1	hGH-V(cDNA)	694	1∼694
2	hGH-N(cDNA)	723	1∼723
3	hGH-NV(키메라)	728	1∼728
4	591-NV	591	119∼695 + TAA 추가
5	579-NV	579	120∼695
6	프라이머 A	29	1∼29 전방 프라이머, 5'-비번역 영역에서 개시
7	프라이머 B	29	인간 태반으로부터 694 bp의 hGH-V cDNA를 증폭하기 위한 후방 프라이머
8	프라이머 C	29	1∼28 전방 프라이머, 5'-비번역 영역에서 개시
9	프라이머 D	27	인간 태아 뇌하수체로부터 723 bp의 hGH-N cDNA를 증폭하기 위한 후방 프라이머
10	펩티드 V	217	26개 아미노산의 신호 펩티드를 포함
11	펩티드 N	217	"
12	프라이머 E	24	서열번호 3의 120∼144 위치
13	프라이머 F	30	서열번호 3의 681∼695 위치
14	펩티드 NV	217	26개 아미노산의 신호 펩티드를 포함
15	프라이머 Q	17	pBAD 벡터의 상류 서열에 결합
16	프라이머 R	18	pBAD 벡터의 EK 절단 부위 서열 영역에 결합
17	프라이머 J	31	서열번호 3의 298∼328 위치
18	프라이머 K	31	서열번호 3의 388∼418 위치
19	프라이머 L	31	서열번호 3의 934∼963 위치
20	프라이머 M	27	서열번호 3의 744∼714 위치
21	프라이머 N	30	서열번호 3의 927∼953 위치
22	프라이머 O	32	서열번호 3의 1,304∼1,335 위치

<110> USV Limited <120> CHIMERIC HUMAN GROWTH HORMONE DERIVED FROM THE PLACENTA AND PITUITARY ISOFORM AND PROCESSES FOR OBTAINING SAID CHIMERA <130> 2006-fpa-1944 <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 694 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctgtggacag ctcaggtacc ggcaatggct gcaggctccc ggacgtccct gctcctggct 60 tttggcctgc tctgcctgtc ctggcttcaa gagggcagtg ccttcccaac cattccctta 120 tccaggcttt ttgacaacgc tatgctccgc gcccgtcgcc tgtaccagct ggcatatgac 180 acctatcagg agtttgaaga agcctatatc ctgaaggagc agaagtattc attcctgcag 240 aacccccaga cctccctctg cttctcagag tctattccaa caccttccaa cagggtgaaa 300 acgcagcaga aatctaacct agagctgctc cgcatctccc tgctgctcat ccagtcatgg 360 ctggagcccg tgcagctcct caggagcgtc ttcgccaaca gcctggtgta tggcgcctcg 420 gacagcaacg tctatcgcca cctgaaggac ctagaggaag gcatccaaac gctgatgtgg 480 aggctggaag atggcagccc ccggactggg cagatcttca atcagtccta cagcaagttt 540 gacacaaaat cgcacaacga tgacgcactg ctcaagaact acgggctgct ctactgcttc 600 aggaaggaca tggacaaggt cgagacattc ctgcgcatcg tgcagtgccg ctctgtggag 660 ggcagctgtg gcttctagct gcacggatcc catc 694 <210> 2 <211> 723 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac agctcaccta gcggcaatgg 60 ctacaggctc ccggacgtcc ctgctcctgg cttttggcct gctctgcctg ccctggcttc 120 aagagggcag tgccttccca accattccct tatccaggct ttttgacaac gctatgctcc 180 gcgcccatcg tctgcaccag ctggcctttg acacctacca ggagtttgaa gaagcctata 240 tcccaaagga acagaagtat tcattcctgc agaaccccca gacctccctc tgtttctcag 300 agtctattcc gacaccctcc aacagggagg aaacacaaca gaaatccaac ctagagctgc 360 tccgcatctc cctgctgctc atccagtcgt ggctggagcc cgtgcagttc ctcaggagtg 420 tcttcgccaa cagcctggtg tacggcgcct ctgacagcaa cgtctatgac ctcctaaagg 480 acctagagga aggcatccaa acgctgatgg ggaggctgga agatggcagc ccccggactg 540 ggcagatctt caagcagacc tacagcaagt tcgacacaaa ctcacacaac gatgacgcac 600 tactcaagaa ctacgggctg ctctactgct tcaggaagga catggacaag gtcgagacat 660 tcctgcgcat cgtgcagtgc cgctctgtgg agggcagctg tggcttctag ctgcccgggt 720 ggc 723 <210> 3 <211> 728 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 3 gccatggccg cgggattctg tggacagctc aggtaccgca atggctgcag gctcccggac 60 gtccctgctc ctggcttttg gcctgctctg cctgccctgg cttcaagagg gcagtgcctt 120 cccaaccatt cccttatcca ggctttttga caacgctatg ctccgcgccc atcgtctgca 180 ccagctggcc tttgacacct accaggagtt tgaagaagcc tatatcccaa aggaacagaa 240 gtattcattc ctgcagaacc cccagacctc cctctgtttc tcagagtcta ttccgacacc 300 ctccaacagg gaggaaacac aacagaaatc caacctagag ctgctccgca tctccctgct 360 gctcatccag tcgtggctgg agcccgtgca gttcctcagg agtgtcttcg ccaacagcct 420 ggtgtacggc gcctctgaca gcaacgtcta tgacctccta aaggacctag aggaaggcat 480 ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg cagcccccgg actgggcaga tcttcaagca 540 gacctacagc aagttcgaca caaactcaca caacgatgac gcactactca agaactacgg 600 gctgctctac tgcttcagga aggacatgga caaggtcgag acattcctgc gcatcgtgca 660 gtgccgctct gtggagggca gctgtggctt ctagctgcac ggatcccatc aatcactagt 720 gcggccgc 728 <210> 4 <211> 591 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 4 tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat gctccgcgcc catcgtctgc 60 accagctggc ctttgacacc taccaggagt ttgaagaagc ctatatccca aaggaacaga 120 agtattcatt cctgcagaac ccccagacct ccctctgttt ctcagagtct attccgacac 180 cctccaacag ggaggaaaca caacagaaat ccaacctaga gctgctccgc atctccctgc 240 tgctcatcca gtcgtggctg gagcccgtgc agttcctcag gagtgtcttc gccaacagcc 300 tggtgtacgg cgcctctgac agcaacgtct atgacctcct aaaggaccta gaggaaggca 360 tccaaacgct gatggggagg ctggaagatg gcagcccccg gactgggcag atcttcaagc 420 agacctacag caagttcgac acaaactcac acaacgatga cgcactactc aagaactacg 480 ggctgctcta ctgcttcagg aaggacatgg acaaggtcga gacattcctg cgcatcgtgc 540 agtgccgctc tgtggagggc agctgtggct tctagtaact cgagtggccg c 591 <210> 5 <211> 579 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric sequence <400> 5 ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta tgctccgcgc ccatcgtctg 60 caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaag cctatatccc aaaggaacag 120 aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagagtc tattccgaca 180 ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccaacctag agctgctccg catctccctg 240 ctgctcatcc agtcgtggct ggagcccgtg cagttcctca ggagtgtctt cgccaacagc 300 ctggtgtacg gcgcctctga cagcaacgtc tatgacctcc taaaggacct agaggaaggc 360 atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaag 420 cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac 480 gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg 540 cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttctagtaa 579 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 6 cctgtggaca gctcacctag cggcaatgg 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 7 gatgggatcc gagcagctag aagccacag 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 ccaaggccca actccccgaa ccactcagg 29 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 9 gccacccggg cagctagaag ccacagc 27 <210> 10 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 10 Met Ala Ala Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu 20 25 30 Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala Arg Arg Leu Tyr Gln 35 40 45 Leu Ala Tyr Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Leu Lys 50 55 60 Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 65 70 75 80 Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Val Lys Thr Gln Gln Lys 85 90 95 Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp 100 105 110 Leu Glu Pro Val Gln Leu Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val 115 120 125 Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Arg His Leu Lys Asp Leu Glu 130 135 140 Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Trp Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 145 150 155 160 Thr Gly Gln Ile Phe Asn Gln Ser Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Lys Ser 165 170 175 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe 180 185 190 Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys 195 200 205 Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 210 215 <210> 11 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu 20 25 30 Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln 35 40 45 Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys 50 55 60 Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 65 70 75 80 Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys 85 90 95 Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp 100 105 110 Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val 115 120 125 Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu 130 135 140 Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 145 150 155 160 Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 165 170 175 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe 180 185 190 Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys 195 200 205 Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 210 215 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 tcccaaccat tcccttatcc aggc 24 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 gcggccactc gagttactag aagccacagc 30 <210> 14 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 14 Met Ala Ala Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu 20 25 30 Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln 35 40 45 Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys 50 55 60 Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 65 70 75 80 Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys 85 90 95 Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp 100 105 110 Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val 115 120 125 Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu 130 135 140 Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 145 150 155 160 Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 165 170 175 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe 180 185 190 Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys 195 200 205 Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 210 215 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 15 gctcttctcg ctaacca 17 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 16 cttatcgtca tcgtcgta 18 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 17 gagtatgccg gcagcagggg atcattttgc g 31 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 18 ccccaacgga atttgtcgtc gtcgtcgtcg a 31 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 19 gatctgtacg acgatgaaat tcccaaccat t 31 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 20 ggcactgtac aatgcgcagg aatgtct 27 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 21 cctgcgcatt gtacagtgcc gctctgtgga 30 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 22 ttcagatcgg ctcccggcgg atttgtccta ct 32

Claims (18)

1. 서열번호 3으로 기재되는 hGH-NV cDNA 키메라.
2. hGH-NV cDNA 키메라에 의해 코딩되는 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열.
3. 서열번호 3으로 기재되는 키메라 cDNA 서열을 포함하는 플라스미드 벡터.
4. 서열번호 5로 기재되는 성숙한 cDNA 서열 유래의 키메라를 포함하는 플라스미드 발현 벡터 pABGH2.
5. (a) 인간 태반 및 뇌하수체로부터 총 RNA를 분리하는 단계;

   (b) 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로부터 선택된 유전자 특이적 프라이머를 이용한 역전사에 의해 해당 cDNA 아형인 상기 (a) 단계의 인간 태반 RNA 유래의 hGH-V 및 상기 (a) 단계의 뇌하수체 RNA 유래의 hGH-N을 증폭하는 단계;

   (c) 단계 (b)의 증폭된 cDNA 아형 hGH-V 및 hGH-N을 클로닝하는 단계;

   (d) 틀내(inframe) 번역된 ORF 서열에 따라 단계 (c)의 클로닝된 cDNA 아형 양자의 제한효소 지도를 비교하는 단계;

   (e) 단계 (c)의 클로닝된 cDNA 아형을 특정한 제한효소 부위에서 소화시키는 단계;

   (f) 단계 (e)의 소화된 cDNA 아형내의 hGH-V 절편 특이적 영역을 특정한 제한효소 부위에서 hGH-N 절편으로 접합(ligation)에 의해 교체하여 원하는 특정한 조합의 hGH-NV cDNA 키메라를 얻는 단계; 및

   (g) 서열번호 3으로 기재되는 hGH-NV cDNA 키메라를 적합한 플라스미드 벡터 내로 클로닝하는 단계를 포함하는, 인간 성장 호르몬(hGH)을 코딩하는 서열번호 3으로 기재되는 신규한 hGH-NV cDNA 키메라를 제조하는 방법.
6. 제5항에 있어서,

   상기 원하는 특정한 조합의 hGH-NV cDNA 키메라는 서열번호 3에서 표시된 1∼62 bp, 63∼587 bp 및 588∼728 bp인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제5항에 있어서,

   단계 (e)의 특정한 제한효소는 BseMI, AatⅡ, EcoNI, PleI, BstXI, EheI, SmlI 및 SmaI로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제5항에 있어서,

   상기 신규한 hGH-NV cDNA 키메라는 서열번호 5로 기재되는 성숙한 hGH cDNA를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8항에 있어서,

   상기 서열번호 5는 유전자 특이적 프라이머를 사용한 cDNA 증폭에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9항에 있어서,

    상기 유전자 특이적 프라이머는 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제8항에 있어서,

    키메라 유래의 서열번호 5의 발현가능한 구조체는 비 GC 풍부 서열의 스트레치와 연관되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제11항에 있어서,

    비 GC 풍부 서열의 스트레치와 연관된 상기 키메라-유래의 서열번호 5의 서열이 이중(duplicate)인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제4항의 플라스미드 발현 벡터 pABGH2를 포함하는 대장균 유래의 재조합 세포.
14. 제1항의 서열번호 3으로 기재되는 키메라 cDNA 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 포함하는 대장균 유래의 재조합 세포.
15. (a) 제4항의 플라스미드 발현 벡터 pABGH2를 포함하는 재조합 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및

    (b) 상기 재조합 세포의 배양 배지로부터 공지된 방법에 의해 상기 합성 인간 성장 호르몬을 회수하는 단계를 포함하는 합성 인간 성장 호르몬의 생산 방법.
16. 제15항에 있어서,

    상기 재조합 세포는 대장균, 효모, CHO로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 대장균인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제15항에 있어서,

    상기 플라스미드 발현 벡터 pABGH2는 키메라 유래의 서열번호 5를 두 카피 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제15항에 있어서,

    상기 키메라 유래의 서열번호 5를 포함하는 플라스미드 발현 벡터 pABGH2는 비 GC 풍부 서열의 스트레치와 연관되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.

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