KR20070011558A - 일배체형 마커 및 치료에 대한 반응을 측정하기 위해 이를이용하는 방법 - Google Patents
일배체형 마커 및 치료에 대한 반응을 측정하기 위해 이를이용하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 일배체형 마커 내의 하나 이상의 다형성 자리에서 뉴클레오티드의 존재를 측정함으로써, Alefacept와 같은 치료에 대한 반응성을 진단 또는 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 Alefacept에 대한 반응과 연관된 복수 일배체형을 확인한다. 본 발명에 의해 확인된 일배체형 마커 및 본 발명의 방법은 건선과 같은 피부 질환에 대한 감수성을 진단 또는 예측하는데 특히 유용할 수 있다.
Description
관련 출원
본 출원은 전체가 본원에 원용에 의해 포함된, 미국 가출원 제60/568,371호(2004.5.4 출원)의 우선권을 주장한다.
DNA에서 변이 또는 돌연변이는 거의 모든 인간 표현형 특성 및 질병과 관련된다. DNA 변이의 가장 흔한 유형은 게놈 상의 단일 위치에서 1개의 염기쌍 치환인 단일염기다형성(SNP)이다. SNP는 인간 사이의 DNA 서열 차이의 대부분을 설명한다고 평가되었다 (Patil, N. et al., Science, 294:1719 (2001)). 게놈에서 물리적으로 매우 근접한 상기 SNP의 블록은 종종 유전적으로 연결되어 있으며, 이는 집단 내의 감소된 유전적 변이성을 초래하며, 제한된 수의 "SNP 일배체형"을 한정하며, 이의 각각은 단일의 오래된 염색체 유래의 혈통을 반영한다 (Stephens, J. C. , Molec. Diag. 4(4):309-317; Fullerton, S. M., et al., Am. J. Hum. Genet. 67: 881 (2000)).
SNP, 일배체형 또는 기타 유형의 변이에 의해 정의되는 인간 DNA 서열 변이 패턴은 표현형 특징 및 유전자 좌위 사이의 관련을 확인하데 중요한 의미를 가진다. 예를 들면, 목적하는 특정 게놈 영역은 SNP 또는 일배체형을 표현형 특징-예를 들면, 질병 감수성 또는 내성, 유전자 질환에 대한 소인, 또는 약물 반응과 연관시키기 위해 추가로 분석될 수 있다. 상기 정보는 상기 특징에 대한 생물학적 기초를 이해할 뿐만 아니라 치료제 및 진단제의 개발에 유용한 후보 유전자를 확인하는데 매우 중요할 수 있다.
건선은 세계 인구의 1-2% 까지 영향을 주는 가장 흔한 피부 질환(또한 본원에서 피부 질환으로서 언급함) 중의 하나이다. 이는 홍반성의 예리하게 분리되는 구진 및 은 운모비늘에 의해 덮이는 둥근 플라그의 임상 특징이 있는 만성 염증성 피부 질환이다. 외상 영역은 종종 건선 병터를 발생한다 (쾨브너 또는 동형현상). 부가적으로, 기타 외부 인자는 감염을 포함하는 건선, 스트레스 및 투약을 악화시킬 수 있다. 건선 환자의 약 5-10%는 관련된 관절 호소를 가지며, 이는 손톱 병발을 갖는 환자에서 가장 종종 발견된다. 일부는 고전적인 류마트스 관절염의 동시 발생을 가지지만, 많은 사람은 관절 질환을 가진다.
건선의 병인은 여전히 잘 이해되지 않는다. 건선에 대한 명확한 유전적 요소가 있다. 건선 환자의 50% 이상이 양성 가족력을 보고하며, 일란성 쌍둥이 중의 65-72% 일치가 쌍둥이 연구에서 보고되었다. 건선은 HLA-Cw6 및 더 적은 정도로 HLA-DR7과 연결되어 있다. 건선의 병태생리학에서 T 세포의 역할을 나타내는 증거가 명백히 축적되고 있다. IL-2와 같은 시토카인을 이용한 면역 기능의 촉진은 기존의 건선의 급격한 악화와 연관되었으며, 골수 이식은 질환의 제거를 초래하였다.
건선 병터는 활성화된 기억 T 세포 및 표피에서 우세한 CD8+ 세포를 이용한 피부의 침윤의 특징이 있다. 활성화된 T 세포 기능을 저해하는 물질은 종종 심한 건선의 치료에 효과적이다.
건선의 치료는 질환의 유형, 위치, 및 정도에 의존한다. 국부화된 플라크 유형 건선을 갖는 대부분의 환자는 이의 장기간 이용이 종종 효능의 손실을 동반하지만, 중간 효능의 국부적인 글루코코르티코이드로 다룰 수 있다.
미정제 콜타르(연고 기재로 1-5%)는 자외선 치료와 함께 오래되었으나 유용한 치료 방법이다. 국부적인 비타민 D 유사체(칼시피트리올)는 또한 건선의 치료에 효과가 있다. 메토트렉세이트는 특히 관련된 건선 관절염을 갖는 환자에서 효과적인 물질이다. 장기간 사용으로 인한 간 독성은 보편적인 질환을 가지나 덜 공격적인 증상에 반응성이지 않은 환자에 대한 이의 이용을 제한한다. 합성 레티노이드인 아세트레틴은 심한 건선을 갖는 일부 환자에서 효과적인 것으로 밝혀졌으나, 잠재적인 기형유발물질이므로, 가임능을 갖는 여성에서 이의 이용을 제한한다.
건선에 유용한 많은 치료에도 불구하고, 현재 건선과 같은 피부 질환에 대한 치료에 대한 대상의 반응을 예상하는 믿을만한 방법은 없다. 그리하여, 건선과 같은 피부 질환의 치료에 대한 대상의 반응성을 예상하는 믿을만하고, 비공격적인 방법에 대한 필요성이 당업계에 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 적어도 부분적으로 T-세포 활성화 및 저해에 관련된 유전자, 예를 들면, T 세포 제거 물질, 예를 들면, AmeviveTM(또한 "Alefacept"로서 알려짐)을 이용한 치료와 같은 치료에 대한 개인의 반응과 관련된 CD8B1, HCR, SPR1, 및 TCF19을 포함하는 유전자를 선택할 때 유전자 다형성의 발견에 기초한다.
따라서, 본 발명은 Alefacept를 이용한 치료와 같은 치료에 대한 대상의 반응성을 측정하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 대상 유래의 시료에서 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형 내의 하나 이상의 다형성 자리에 존재하는 뉴클레오티드를 측정하는 것을 포함한다. 기타 구현예에서, 상기 방법은 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형에 대한 대상의 카피수를 측정하기 위해 상기 대상 유래의 시료를 분석하는 것을 포함한다. T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 예를 들면, 표 1에 기재된 임의의 유전자에서 일배체형, 예를 들면, CD8B1, SPR1,TCF19, 또는 HCR 유전자에서 일배체형일 수 있다.
본 발명은 또한 대상 유래의 시료에서 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형 내의 하나 이상의 염색체 상의 하나 이상의 다형성 자리에 존재하는 뉴클레오티드와 같은 유전형을 측정함으로써 치료에 대한 대상의 반응성을 측정하는 방법을 제공한다. 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 치료에 대한 대상의 반응성에 대한 일배체형의 연관에 대한 p-값이 높은 수준의 유의성을 나타내는 것일 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 CD8B1 유전자에서 일배체형이며, 일배체형 및 치료에 대한 반응성 사이의 연관에 대한 p-값은 약 0.005 이하이다. 또 다른 구현예에서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 SPR1 유전자에서 일배체형이며, 일배체형 및 치료에 대한 반응성 사이의 연관에 대한 p-값은 약 0.005 이하이다. 여전히 또 다른 구현예에서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 TCF19 유전자에서 일배체형이며, 일배체형 및 치료에 대한 반응성 사이의 연관에 대한 p-값은 약 0.010 이하이다. 추가의 구현예에서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 HCR 유전자에서 일배체형이며, 일배체형 및 치료에 대한 반응성 사이의 연관에 대한 p-값은 약 0.007 이하이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 일배체형에서 하나 이상의 다형성 자리에서 측정된 대상의 유전형을 이용하여 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형의 카피수를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 CD8B1, HCR, SPR1, 및 TCF19 유전자에서 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형의 SNP를 유전형 결정(genotyping)하는데 적합한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트를 제공하는데, T 세포 활성화 또는 저해 일배체형의 카피수는 T 세포 관련 질환, 예를 들면 건선으로 고생하는 대상 그룹이 Alefacept와 같은 T 세포 제거 물질에 대해 반응할 것인지 또는 반응하지 않을 것인지에 대한 통계학적 유의한 관련을 제공한다. 하나의 양태에서, 대상의 반응 및 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형 사이의 연관은 초기 p-값, 예를 들면, CD8B1 유전자에 대한 약 0.005 이하의 초기 p-값; HCR 유전자 유전자에 대한 약 0.007 이하의 초기 p-값; SPR1 유전자에 대한 약 0.005 이하의 초기 p-값; 및 TCF19 유전자에 대한 약 0.010 이하의 초기 p-값에 의해 측정된다.
여전히 또 다른 양태에서, 본 발명은 Alefacept와 같은 T-세포 제거 물질에 대한 반응 또는 무반응과 관련된 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형의 존재를 검출하기 위한 키트를 제공하는데, 상기 키트는 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형이 CD8Bl, HCR, SPR1, 및 TCF19로 이루어진 군에서 선택된 유전자에서 일배체형인, T 세포 활성화 또는 저해 일배체형 내의 다형성 자리를 유전형 결정하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오티드 세트를 포함한다. 그리하여, 상기 일배체형은 예를 들면, 표 1에서 일배체형 마커 1-5 또는 표 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에서 일배체형; 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에서 일배체형 중의 임의의 하나에 연관된 일배체형 마커; 또는 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B,12, 16A 또는 16B에서 일배체형 중의 임의의 하나에 대한 치환(substitute) 일배체형 마커일 수 있다.
여전히 또 다른 양태에서, 본 발명은 치료 섭생(regime)에 대한 질환으로 고생하는 대상의 반응을 진단하기 위한 CD8B1, HCR, SPR1, 및 TCF19 유전자에서 SNP를 유전형 결정하는데 적합한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 SNP는 예를 들면 하기 위치의 다형성으로부터 선택될 수 있다: CD8B1 유전자에서 위치 -685, -255, 25, 8632, 15080, 19501, 28589, 28663 및 28739, HCR 유전자에서 위치 2173, 2175, 2360, 5782,5787, 6174, 6666, 8277, 8440, 8476, 11565, 11941, 12152, 13553, 13892, 14287, SPR1 유전자에서 위치 -119, -845, -455, -384, -228, 161, 627, 739, 913 및 1171, 및 TCF19 유전자에서 -303, -210, 316, 2059, 2365, 2456 및 3340. 또한, 상기 키트는 추가로 사용 지시서를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 SNP에 검출가능하게 혼성화할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 CD8B1, HCR, SPR1, 또는 TCF19 유전자에서 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형에서 SNP를 유전형 결정하는데 적합한 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 상기 SNP는 예를 들면 하기 위치의 다형성으로부터 선택될 수 있다: CD8B1 유전자에서 위치 -685, -255, 25, 8632, 15080, 19501, 28589, 28663 및 28739, HCR 유전자에서 위치 2173, 2175, 2360, 5782, 5787, 6174, 6666, 8277, 8440, 8476, 11565, 11941, 12152, 13553, 13892, 14287, SPR1 유전자에서 위치 -119, -845, -455, -384, -228, 161, 627, 739, 913 및 1171, 및 TCF19 유전자에서 위치 -303, -210, 316, 2059, 2365, 2456 및 3340.
또 다른 양태에서, 본 발명은 T 세포 제거 물질에 대한 대상의 반응성을 측정하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 대상 유래의 시료에서 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형 내의 하나 이상의 다형성 자리에서 유전형을 측정하는 것을 포함한다. 기타 구현예에서, 상기 방법은 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형의 대상에서의 존재 또는 부재를 측정하기 위해 또는 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형에 대한 대상의 카피수를 측정하기 위해 대상 유래의 시료를 분석하는 것을 포함한다. 상기 일배체형은 예를 들면 표 1에서 일배체형 마커 1-5 또는 표 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에서 일배체형; 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에서 일배체형 중의 임의의 하나에 연관된 일배체형 마커; 또는 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B,12, 16A 또는 16B에서 일배체형 중의 임의의 하나에 대한 치환 일배체형 마커일 수 있다. 상기 T 세포 제거 물질은 예를 들면 LFA-3 관련 분자, 또는 CD2 수용체 블록킹 물질, 예를 들면, Alefacept일 수 있다.
예를 들면, 본 발명에 따라, 위치 -255에서 시토신, 위치 25에서 티민 및 위치 28589에서 구아닌을 포함하는 CD8B1 일배체형의 대상에서의 존재는 Alefacept에 대한 대상에 의한 무반응성을 나타낸다. 마찬가지로, 위치 2175에서 시토신, 위치 5787에서 티민 및 위치 11565에서 구아닌을 포함하는 HCR 일배체형 또는 위치 5782에서 구아닌, 위치 11565에서 구아닌, 및 위치 14287에서 시토신을 포함하는 HCR 일배체형의 2 카피의 대상에서의 존재는 Alefacept에 대한 대상에 의한 무반응성을 나타낸다. 위치 -845에서 구아닌, 위치 -455에서 구아닌 및 위치 1171에서 아데닌을 포함하는 SPR1 일배체형의 대상에서의 존재는 Alefacept에 대한 대상에 의한 무반응성을 나타낸다. 더욱이, 위치 2365에서 구아닌 및 위치 3340에서 구아닌을 포함하는 TCF19 일배체형의 대상에서의 존재는 Alefacept에 대한 대상에 의한 무반응성을 나타낸다.
하나의 양태에서, 시료에서 뉴클레오티드의 존재를 측정하는 것은 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화, 서열결정, 프라이머 특이적 연장, 또는 단백질 검출에 의해 달성될 수 있다.
또 다른 양태에서, 연관된 일배체형 마커 및 일배체형 마커 사이의 연관불균형은 0.75 이상, 0.80 이상, 0.85 이상, 0.90 이상, 0.95 이상, 및 1.0으로 이루어진 군으로부터 선택된 △2를 가진다.
여전히 또 다른 양태에서, 본 발명은 질환으로 고생하는 대상에 대해 적당한 치료 섭생, 예를 들면 Alefacept와 같은 약제의 투여를 선택하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상 유래의 시료에서 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에서 일배체형 마커, 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에서 일배체형 중의 임의의 하나에 연관된 일배체형 마커, 또는 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에서 일배체형 중의 임의의 하나에 대한 치환 일배체형 마커를 포함하는 일배체형 내의 하나 이상의 다형성 자리에서 대상의 유전형을 결정하는 것; 및 상기 일배체형 내의 하나 이상의 다형성 자리에서 대상의 유전형에 기초하여 대상에 대한 적당한 치료 섭생을 선택하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 대상에 존재하는 일배체형의 카피수는 상기 일배체형 내의 하나 이상의 다형성 자리에서 대상의 유전형으로부터 측정된다. 정말로, 본원에 기재된 방법은 T 세포 활성화 또는 저해와 관련된 질환, 해로운 T 세포 반응과 관련된 질환, 염증 질환, 피부 질환, 예를 들면, 건선 또는 습진과 같은 질환에 대한 치료 섭생을 선택하는데 이용될 수 있다.
질환으로 고생하는 대상에 대한 적당한 치료 섭생의 선택은 대상으로부터 시료를 수집하는 것; 대상 유래의 시료에서, 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에서 일배체형 마커; 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에서 일배체형 중의 하나에 연관된 일배체형 마커; 또는 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에서 일배체형 중의 하나에 대한 치환 일배체형 마커 중의 하나와 같은, 일배체형 내의 하나 이상의 다형성 자리에서 뉴클레오티드의 존재를 측정하는 것; 및 상기 일배체형 내의 하나 이상의 다형성 자리에서 대상의 유전형에 기초하여 대상에 대한 적당한 치료 섭생을 선택하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 대상 유래의 시료에서 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에서 일배체형, 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에서 일배체형 중의 하나에 연관된 일배체형 마커, 또는 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에서 일배체형 중의 하나에 대한 치환 일배체형 마커와 같은 일배체형 내의 하나 이상의 다형성 자리에서 유전형을 결정함으로써 치료 섭생에 대한 질환으로 고생하는 대상의 반응성을 측정하는 방법의 특징이 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 질환은 건선이며, 상기 치료 섭생은 Alefacept의 투여를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 질환으로 고생하는 대상을 치료하는 방법의 특징이 있다. 상기 방법은 대상 유래의 시료에서 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에서 일배체형, 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에서 일배체형 중의 하나에 연관된 일배체형 마커, 또는 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에서 일배체형 중의 하나에 대한 치환 일배체형 마커와 같은 일배체형 내의 하나 이상의 다형성 자리에서 대상의 유전형을 결정하는 것; 상기 일배체형 내의 하나 이상의 다형성 자리에서 대상의 유전형에 기초하여 대상에 대한 적당한 치료 섭생을 선택하는 것; 및 상기 대상에 치료 섭생을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 질환은 건선이며, 상기 치료 섭생은 Alefacept의 투여를 포함한다.
본 발명은 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형에 대한 대상의 카피수를 측정하기 위해 상기 대상 유래의 시료를 분석하는 것을 포함하는, T-세포 제거 물질에 대한 반응 또는 무반응과 관련된 일배체형의 존재에 대해 개인을 시험하는 방법을 제공한다. 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 표 3A 및 3B에 제시된 CD8B1 일배체형, 표 7A 및 7B에 제시된 HCR 일배체형, 표 12에 제시된 SPR1 일배체형 및 표 16A 및 B에 제시된 TCF19 일배체형 중의 임의의 하나, 표 3A 및 3B에 제시된 CD8B1 일배체형, 표 7A 및 7B에 제시된 HCR 일배체형, 표 12에 제시된 SPR1 일배체형 및 표 16A 및 B에 제시된 TCF19 일배체형 중의 임의의 하나에 연관된 일배체형, 또는 표 3A 및 3B에 제시된 CD8B1 일배체형, 표 7A 및 7B에 제시된 HCR 일배체형, 표 12에 제시된 SPR1 일배체형 및 표 16A 및 B에 제시된 TCF19 일배체형 중의 임의의 하나에 대한 치환 일배체형일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상 유래의 시료에서 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형에 대한 대상의 카피수를 측정함으로써 Alefacept를 이용한 치료에 무반응성 또는 반응성일 것 같은 대상을 확인하는 방법의 특징이 있다. 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 표 3A 및 3B에 제시된 CD8B1 일배체형, 표 7A 및 7B에 제시된 HCR 일배체형, 표 12에 제시된 SPR1 일배체형 및 표 16A 및 B에 제시된 TCF19 일배체형 중의 임의의 하나; 표 3A 및 3B에 제시된 CD8B1 일배체형, 표 7A 및 7B에 제시된 HCR 일배체형, 표 12에 제시된 SPR1 일배체형 및 표 16A 및 B에 제시된 TCF19 일배체형 중의 임의의 하나에 연관된 일배체형; 또는 표 3A 및 3B에 제시된 CD8B1 일배체형, 표 7A 및 7B에 제시된 HCR 일배체형, 표 12에 제시된 SPR1 일배체형 및 표 16A 및 B에 제시된 TCF19 일배체형 중의 임의의 하나에 대한 치환 일배체형일 수 있다.
본 발명의 기타 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
본 발명이 더욱 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 특정 용어가 먼저 정의된다.
본 명세서에 이용된, "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미한다. 단어 "포함하는"과 함께 이용될 때, 청구범위(들)에 이용된, "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미한다.
본원에 이용된, "또 다른"은 적어도 두번째 또는 그 이상을 의미한다.
"유전자"는 RNA 또는 폴리펩티드를 코딩하는 ORF (개방형해독틀), 인트론 영역, 및 아마도 양 방향으로 코딩 영역 밖의 약 10 kb까지 확장될 수 있는 인접한 5' 및 3' 비코딩 뉴클레오티드 서열을 의미할 의도이다. 상기 인접한 인트론 서열은 코딩된 RNA 또는 폴리펩티드의 발현의 조절에 관련될 수 있다.
본원에 이용된 "동유전자(isogene)"는 집단에서 발견되는 유전자의 이성질형태 중의 하나를 말한다. 동유전자는 유전자의 특정 이성질형태에 존재하는 다형성의 모두를 포함한다.
본원에 이용된 "교차비" 또는 "OR"은 특정 유전자 HAP 마커의 특정 카피수의 존재 또는 부재가 제시될 때, Alefacept와 같은 T 세포 제거 물질에 대한 응답자 또는 무응답자일 확률을 비교하는 방식이다. 상기 OR은 유전자 HAP 마커의 카피수 및 T 세포 제거 물질에 대한 강한 또는 약한 반응 사이의 관련 정도의 측정으로서 해석될 수 있다. 상기 OR은 로지스틱 회귀 분석을 이용하여 유전자 HAP 마커와 T 세포 제거 물질에 대한 강한 반응 또는 약한 반응의 이원(binary) 결과 사이의 관련 평가로부터 유도된다. 예를 들면, CD8B1 유전자의 일배체형 마커 1에 대해, 약물 Alefacept에 대한 OR은 5.2이다. 상기 비율은 일배체형 마커의 1 또는 2 카피를 가질 수 있는 개인과 대비할 때, 일배체형 마커 1의 0 카피를 갖는 개인을 비교함으로써 유도된다. 그 결과, 상기 OR은 Alefacept에 응답하는 교차는 상기 일배체형 마커의 1 또는 2 카피를 가질 수 있는 대상과 대비할 때, CB8B1 유전자에서 일배체형 마커 1의 0 카피를 갖는 대상에서 5.2배 더 가능성이 있다는 것을 나타낸다.
본원에 이용된, "p-값"은 통계 시험에서 수득된 제시된 결과가 가정된 관계 때문에보다 오히려 우연히 일어날 수 있다는 확률을 말한다. 예를 들면, 상관계수가 p < .05를 가진다면, 관찰된 상관이 무작위로 일어날 것 같지 않다는 것을 추리할 수 있는데, 이는 p-값이 특정 상관이 100 중에서 5배 더 적게 우연히 수득될 수 있다는 것을 제시한다. 상기 마커에 대한 "초기 p-값"은 로지스틱 회귀에서 그러나 복수의 비교에 대한 것이 아닌 공변량에 대해 조정된, 일배체형 마커 및 종점(endpoint) 사이의 연관의 p-값을 말한다. 실시예에 기재한 바와 같이, "순열 조정된 p-값"은 순열 시험을 이용하여 복수의 비교를 위한 초기 p-값을 조정한다. 0.05 유의 수준이 당업계에 통상적으로 이용된다는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, p < 0.05이면, 결과는 매우 유의하다(Rosner B, 1990. Fundamentals of Biostatistics, 3rd Edition. PWS-Kent Publishing Company. Boston, Mass).
"다형성"은 집단에서 단일 유전자 좌위에서 유전자 변이, 또는 2 이상의 유전적으로 결정된 대안적인 서열 또는 대립유전자의 발생을 말한다.
다형성은 마이너(minor) 대립유전자가 선택된 집단의 1% 이상의 빈도, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 빈도로 발생하는 2개의 대립유전자를 가질 수 있다. 선택된 집단에서 가장 빈번히 발생하는 대립유전자 형태는 종종 "야생형" 형태로 언급된다. 이배체 생물체는 대립유전자 형태에 대해 동종접합 또는 이형접합일 수 있다. 복대립유전자 다형성은 2가지 형태를 가진다. 삼대립유전자 다형성은 3가지 형태를 가진다.
다형성의 예는 제한효소 단편 길이 다형성 (RFLP), 다양한 길이의 일렬로 된 반복단위 (VNTR), 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP), 디뉴클레오티드 반복, 트리뉴클레오티드 반복, 테트라뉴클레오티드 반복, 단순서열 반복, 및 Alu과 같은 삽입 원소를 포함한다. "다형성 자리"는 다형성이 일어나는 핵산 서열에서 위치를 말한다. 다형성 자리는 1 bp만큼 작을 수 있다.
"SNP" 또는 "단일 뉴클레오티드 다형성"은 단일 뉴클레오티드에 의해 차지되는 다형성 자리에서 일어나는 다형성이다. SNP의 자리는 통상적으로 매우 보존된 서열(예를 들면, 집단의 {분획(1/100)} 또는 {분획(1/1000)} 멤버보다 적게 변하는 서열)에 앞서거나 뒤따른다. 본원에 이용된, "SNP"는 SNP의 복수이다. SNP는 대부분 자주 복대립유전자이다. SNP에 대한 가장 통상적인 대립유전자는 "주(major) 대립유전자"라 불리며, 상기 SNP의 대안적인 대립유전자는 "마이너 대립유전자"라 불린다. SNP는 통상적으로 다형성 자리에서 하나의 뉴클레오티드의 또 다른 것으로의 치환으로 인해 일어난다. 전이(transition)는 또 다른 퓨린에 의한 하나의 퓨린의 치환 또는 또 다른 피리미딘에 의한 하나의 피리미딘의 치환이다. 전위(transversion)는 피리미딘에 의한 퓨린의 치환 또는 그 역의 경우이다.
SNP는 또한 기준 대립유전에 대해 뉴클레오티드의 결실 또는 뉴클레오티드의 삽입으로부터 일어날 수 있다. "SNP 위치" 또는 "SNP 좌위"는 SNP가 일어나는 다형성 자리이다.
"일배체형 마커", "HAP 마커", 또는 "일배체형"은 목적 핵산 서열에서 다형성의 세트에서 대립유전자의 조합을 말한다. 특히, 본 발명은 적어도 부분적으로 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 및 16B에 기재된 일배체형 마커를 제공한다. 본 발명의 일배체형 마커는 +1 위치에 대한 기준으로서 유전자에 대해 본원에 이용된 기준 mRNA의 개시 코돈(ATG)를 이용하여 유전자에서 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)에 기여하는 위치에 기초하여 표지된다. 이용된 표시법은 각 위치에서 대립유전자에 의해 따르는 SNP(5'에서 3')에 대한 ATG 시초(offset)를 제공한다. 예를 들면, 또한 CD8B1 유전자에서 일배체형 마커 1으로서 본원에 언급된 일배체형 마커(-255, 25, 28589/CTG)에서, 각각 상기 유전자에서 C는 -225에서 프로모터 SNP에서 대립유전자이며, T 및 G는 위치 25 및 28589에서 엑손 SNP에서 대립유전자이다. 표 1에서 일배체형 마커 2-5는 유사하게 정의된다.
"치환 일배체형"은 표 1에 제시된 일배체형 마커 1-5 또는 표 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 및 16B에서 일배체형 중의 임의의 하나에 유사하나, 상기 일배체형 마커에서 구체적으로 확인된 다형성 자리의 하나 이상에서 대립유전자가 구체적으로 확인된 다형성 자리에서 대립유전자와 높은 연관불균형에서 다형성 자리에서 대립유전자로 치환된 다형성 서열을 포함한다. 치환 일배체형은 하기에 추가로 기재된다.
"연관된 일배체형"은 표 1에 제시된 일배체형 마커 1-5 또는 표 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 및 16B에서 일배체형 중의 임의의 하나와 높은 연관불균형인 일배체형을 포함한다. 연관된 일배체형은 indel을 포함하는 기타 유형의 변이를 포함할 수 있다. 연관된 일배체형은 하기에 추가로 기재된다.
본원에 이용된, 용어 "T 세포 활성화 또는 저해 일배체형"은 T 세포 활성화 또는 T 세포 저해와 연관된 임의의 일배체형을 포함할 의도이다. T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 T 세포 활성화 또는 T 세포 저해를 초래하는 세포 경로의 일부인 단백질을 코딩하는 유전자에서 일배체형일 수 있다. 예를 들면, T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 T 세포 수용체 유전자, 보조수용체 유전자, 인테그린 유전자 또는 자연살해(NK) 세포에 의한 T 세포 인식과 연관된 유전자에서 일배체형이다. 바람직한 구현예에서, T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 CD8B1, HCR, SPR1, 또는 TCF19 유전자에서 일배체형이다 (예를 들면, 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에 기재된 일배체형 중의 하나).
본원에 이용된, 용어 "T 세포 제거 물질"은 대상에서 T 림프구, 예를 들면, CD4+, CD8+ 또는 CD2+ T 림프구 수준을 감소시킬 수 있는 임의의 물질을 포함할 의도이다. 본 발명에 의해 포함되는 상기 T 세포 제거 물질은 LFA-3/CD2 상호작용을 저해함으로써 T 림프구 수준을 감소시킬 수 있다.예를 들면, T 세포 제거 물질은 CD2에 결합하고, 항원제시세포 상의 LFA-3 및 T 림프구 상의 CD2 사이의 상호작용을 저해함으로써 T 림프구 수준을 감소시킬 수 있다. 바람직한 구현예에서, T 세포 제거 물질은 CD2 결합 분자, 예를 들면, LFA-3 분자의 CD2 결합 부분을 포함하는 분자이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 T 세포 제거 물질은 Alefacept이다.
"연관" 또는 "연관된"은 동일한 염색체 상에서 이의 위치의 근접성 결과로서 세대에서 세대로 함께 유전되는 유전자, 대립유전자, 좌위 또는 유전자 마커의 경향을 기재하거나 또는 경향에 관한 것으로서; 예를 들면, 작위적으로 유전되는 유전자 좌위이다.
"연관불균형" 또는 "대립유전자 연관"은 집단에서 임의의 특정 대립유전자 빈도에 대해 우연히 예상되는 것보다 더욱 빈번히 근처의 염색체 위치에서 특정 대립유전자 또는 유전자 마커와 특정 대립유전자 또는 유전자 마커의 우선적인 연관을 포함한다. 예를 들면, 좌위 X가 동일한 빈도로 일어나는 대립유전자 A 및 B를 가지며, 연관된 좌위 Y가 동일한 빈도로 일어나는 대립유전자 c 및 d를 가진다면, 조합 ac가 0.25의 빈도로 일어날 것이라는 것을 예상할 수 있다. ac가 더욱 빈빈히 일어난다면, 대립유전자 및 a 및 c는 연관불균형이다. 연관불균형은 대립유전자의 특정 조합의 자연 선택으로 인해 생성될 수 있거나 또는 대립유전자가 연관된 대립유전자와 평형화되도록 너무 최근에 집단 내로 도입되었기 때문에 생성될 수 있다. 질환(또는 기타 표현형)에 대한 또 다른 원인 마커와 함께 연관불균형에서 마커는 마커가 질환을 야기하지 않음에도 불구하고, 질환(또는 기타 표현형)에 대한 감수성을 검출하는데 유용할 수 있다. 예를 들면, 그 자체로 질환의 원인 성분은 아니나, 표현형의 원인 성분인 유전자의 이성질형태(조절 서열 포함)(Y)와 연관불균형인 마커 (X)는 유전자 Y가 확인될 수 없거나 또는 용이하게 검출될 수 없는 환경에서 질환에 대한 감수성을 나타내기 위해 이용될 수 있다.
"핵산"은 DNA, RNA, 단일- 또는 이중 가닥, 게놈, 클로닝된, 자연적으로 발생하는 또는 합성 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 폴리뉴클레오티드, 앰플리콘, RNA 전사체, 단백질 핵산, 핵산 모방체 등일 수 있다.
"올리고뉴클레오티드"는 당업계에 주지되어 있으며, 통상적으로 길이가 5-100 인접 염기, 종종 길이가 5-10, 5-20, 10-20, 10-50, 15-50; 15-100, 20-50, 또는 20-100 인접 염기인 핵산을 포함한다. 약 20 인접 염기보다 긴 올리고뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드로서 언급될 수 있다. 다형성 자리 (다형성)은 올리고뉴클레오티드 내의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 다형성 자리 (다형성)의 임의의 대립유전자 형태를 포함할 수 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 기타 올리고뉴클레오티드는 다형성 자리에 인접한 1-약 10 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 5 뉴클레오티드 이하에 위치한 표적 영역에 혼성화한다. 다형성 자리에 인접한 1 내지 수 개의 뉴클레오티드에서 종료하는 상기 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 다형성 중의 하나를 검출하기 위한 중합효소 매개 프라이머 연장 방법에 유용하므로, 상기 올리고뉴클레오티드는 본원에 "프라이머-연장 올리고뉴클레오티드"로서 언급된다. 바람직한 구현예에서, 프라이머-연장 올리고뉴클레오티드의 3'-말단은 상기 다형성 자리에 바로 인접하여 위치한 뉴클레오티드에 상보적인 데옥시뉴클레오티드이다.
"혼성화 프로브" 또는 "프로브"는 핵산의 부분적으로 또는 완전히 상보적인 가닥에 염기 특이적인 방식으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 상기 프로브는 [Nielsen et al., Science 254: 1497-1500 (1991)]에 기재된 펩티드 핵산뿐만 아니라, 모든 기타 유형의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
"총괄 평가 점수"는 내과의사의 평가 시기에 건선의 심각도를 측정하기 위해 이용된 7점 스케일을 말한다: 심각함: 매우 현저한 플라크 상승, 스케일링 및/또는 홍반; 적당 내지 심각함: 현저한 플라크 상승, 스케일링 및/또는 홍반; 부드러움 내지 적당함: 적당함 및 부드러움 중간; 부드러움: 약간 플라크 상승, 스케일링 및/또는 홍반 거의 제거: 부드러움 및 제거 중간; 제거: 건선 징후 없음(염증 후 색소침착저하증 또는 과다색소침착이 존재할 수 있다).
혼성화는 스트린전트 조건하에 통상적으로 수행된다. 스트린전트 조건은 서열 의존적이며 환경에 의존하여 변할 수 있다. 일반적으로, 스트린전트 조건은 지정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮도록 선택된다. 상기 Tm은 표적 서열에 상보적인 프로브의 50%가 평형 상태의 표적 서열에 혼성화하는 온도 (지정된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도 하의)이다. Tm에서 표적 서열이 일반적으로 과량으로 존재할 때, 프로브의 50%는 평형에서 차지된다. 전형적으로, 스트린전트 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 적어도 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 기타 염)의 염 농도를 포함하며, 온도는 짧은 프로브 (예를 들면, 10 내지 50 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 25℃이다. 스트린전트 조건은 또한 포름아미드와 같은 불안정화제의 첨가로 달성될 수 있다. 예를 들면, 5xSSPE (750 mM NaCl, 50 mM NaPhosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25-30℃의 조건이 대립유전자 특이적 프로브 혼성화에 적합하다.
부가적인 스트린전트 조건은 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), chapters 7, 9, 및 11]에 기재된다. 스트린전트 혼성화 조건의 바람직한 비제한적인 예는 4X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC), 약 65-70℃에서 혼성화 (또는 대안적으로 약 42-50℃에서 4X SSC + 50% 포름아미드에서 혼성화)에 이은 1X SSC, 약 65-70℃에서 1회 이상의 세정을 포함한다. 매우 스트린전트 혼성화 조건의 바람직한 비제한적인 예는 1X SSC, 약 65-70℃에서 혼성화(또는 대안적으로 약 42-50℃에서 1X SSC + 50% 포름아미드에서 혼성화)에 이은 0.3X SSC, 약 65-70℃에서 1회 이상의 세정을 포함한다. 감소된 스트린전시 혼성화 조건의 바람직한 비제한적인 예는 4X SSC, 약 50-60℃에서 혼성화(또는 대안적으로 약 40-45℃에서 6X SSC + 50% 포름아미드에서 혼성화)에 이은 2X SSC, 약 50-60℃에서 1회 이상의 세정을 포함한다. 상기 인용된 값에 대한 중간 범위, 예를 들면, 65-70℃ 또는 42-50℃가 또한 본 발명에 포함될 의도이다. SSPE (lxSSPE는 0.15M NaCl, lOmM NaH2P04, 및 1.25mM EDTA, pH 7.4)는 혼성화 및 세정 버퍼에서 SSC (1X SSC는 0.15M NaCl 및 15mM 시트르산나트륨이다)로 대체될 수 있으며; 세정은 혼성화 종료 후에 매번 15분 동안 수행된다. 길이가 50 bp 보다 적을 것으로 예상되는 혼성체에 대한 혼성화 온도는 혼성체의 융점(Tm)보다 5-10℃ 낮아야 하며, Tm은 하기 식에 따라 결정된다. 길이가 18bp보다 작은 혼성체에 대해, Tm(℃) = 2(A + T 염기 수) + 4(G + C 염기 수). 길이가 18 내지 49bp의 혼성체에 대해, Tm(℃) = 81.5 +16.6(log10[Na+]) + 0.41(%G+C) - (600/N)(식 중, N은 혼성체에서 염기 수이며, [Na+]는 혼성화 버퍼 중의 나트륨 이온의 농도(1X SSC에 대해 [Na+] = 0.165 M)이다). 블록킹 물질 (예를 들면, BSA 또는 연어 또는 청어 정자 운반체 DNA), 세제 (예를 들면, SDS), 킬레이트제 (예를 들면, EDTA), 피콜, PVP 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 부가적인 시약이 니트로셀룰로오스 또는 나일론막과 같은 막에 핵산 분자의 비특이적 혼성화를 감소시키기 위해 혼성화 및/또는 세정 버퍼에 첨가될 수 있다는 것을 당업자는 인식할 것이다. 나일론막을 이용할 때, 특히, 스트린전트 혼성화 조건의 부가적인 바람직한 비제한적인 예는 약 65℃에서 0.25-0.5M NaH2P04, 7% SDS에서 혼성화에 이은 65℃에서 0.02M NaH2PO4, 1% SDS 또는 대안적으로 0.2X SSC, 1% SDS에서 1회 이상의 세정이다 (예를 들면, Church and Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995 참고).
"건선 영역 심각도 지수"(PASI) 스코어는 건선의 심각도의 측정을 말한다 (예를 들면, Fleischer et al. (1999), J. Dermatol. 26: 210-215 및 Tanew et al. (1999), Arch Dermatol. 135:519-524 참고). 상기 PASI 스코어는 신체의 건선 병터에서 피부 스케일링의 위치, 크기 및 정도의 측정이다. 상기 PASI는 건선 치료에 대한 임상 시도에서 흔히 이용되는 대책이다. 전형적으로, 상기 PASI는 건선이 치료에 얼마나 잘 반응하는지를 측정하기 위해 치료 기간 전, 동안 및 후에 계산된다 (예를 들면, 더 낮은 PASI는 더 적은 건선을 의미한다). 상기 PASI에 대해, 신체는 전형적으로 4개의 섹션으로 구분되며, 각 영역은 그 자체로 스코어링된 후, 4개의 스코어는 최종 PASI로 합쳐진다. 각 피부 섹션에 대해, 관련 피부 양을 상기 신체 섹션에서 피부의 백분율로 측정한다. 심각도, 예를 들면, 가려움, 홍반(적화), 스케일링 및 두께는 또한 각 피부 섹션에 대해 측정된다.
"강한 응답자"는 임의의 시간에 기준선으로부터 PASI의 50% 이상의 감소의 환자의 반응을 말한다. 용어 "부분적인 응답자"는 임의의 시간에 기준선으로부터 PASI의 25%-50%의 감소의 환자의 반응을 말한다. 용어 "무응답자"는 임의의 시간에 기준선으로부터 PASI의 25% 미만의 감소의 환자의 반응을 말한다.
본원에 이용된, 용어 "대상"은 온혈동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 대상은 영장류이다. 더 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 영장류는 인간이다.
본원에 이용된, 용어 "치료학적 유효량"은 질환의 하나 이상의 증상의 개선을 초래하는데 충분한 치료제의 양을 말한다. 건선의 치료에 대해, 치료학적 유효량은 바람직하게는 적어도 20%, 적어도 35%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85%에 의해 대상(예를 들면, 인간)의 PASI 스코어를 감소시키는 치료제의 양을 말한다.
대안적으로, 건선의 치료에 대해, 치료학적 유효량은 바람직하게는 적어도 25%, 적어도 35%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%에 의해 대상(예를 들면, 인간)의 총괄 평가 점수를 개선하는 치료제의 양을 말한다. 치료학적 유효량은 원하는 결과를 달성하기에 필요한, 예를 들면, 피부 질환과 같은 염증 질환과 같은 질환 또는 질병으로 고생하는 대상을 치료하기에 충분한 기간 동안 및 투여량으로 효과적인 양을 포함한다. 본원에 정의된 T 세포 제거 물질, 예를 들면, Alefacept와 같은 화합물의 치료학적 유효량은 대상의 질환 상태, 나이 및 체중과 같은 인자, 및 대상에서 원하는 반응을 유도할 화합물의 능력에 따라 변할 것이다. 투여 계획은 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 T 세포 제거 물질, 예를 들면, Alefacept의 임의의 독성 또는 유해 효과(예를 들면, 부작용)가 치료학적으로 유리한 효과에 의해 압도되는 것이다.
"예방학적 유효량"은 질환에 대해 질병소질인 대상에서, 염증 질환, 예를 들면, 건선과 같은 피부 질환을 예방 또는 저해하는 것과 같은 원하는 예방학적 결과를 달성하기에 필요한 기간 및 투여량으로 효과적인 양을 말한다. 예방학적 유효량은 치료학적 유효량에 대해 전술한 바와 같이 결정될 수 있다. 전형저그로, 예방학적 투여량은 염증 질환의 초기 단계 또는 초기 단계 전에 대상에 이용되므로, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
II. 일반론
본 발명은 치료에 대한 반응성과 연관된 복수 일배체형의 확인에 기초하여, 치료 섭생, 예를 들면, Alefacept와 같은 T 세포 제거 물질을 이용한 치료에 대한 대상의 반응성을 측정하는 신규 방법을 제공한다.
본 발명은 치료 섭생에 대한 대상의 반응을 진단하는 수단으로서, 또는 대상에 특이적으로 맞추어진 효과적인 치료 계획을 진단하는 수단으로서, 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 또는 16B에 기재된 것뿐만 아니라 다형성, 대립유전자, 또는 상기 마커와 연관불균형인 마커를 포함하는, 본 발명의 임의의 일배체형 마커의 용도를 포함한다. 본 발명은 특히 건선 및 습진과 같은 피부 질환의 치료에 유용하다.
본 발명의 다형성 및 일배체형은 표 1, 3A,3B, 7A, 7B, 12, 16A 및 16B에 기재되며, 본원에 기재된 바와 같이 확인된다.
| 일배체형 마커 번호 | 유전자 기호 | 일배체형 마커* | 서열 확인 번호 |
| 1 | CD8B1 | (-255,25,28589/CTG) | 1 |
| 2 | HCR | (2175,5787,11565/CTG) | 2 |
| 3 | SPR1 | (-845,-455,1171/GGA) | 3 |
| 4 | TCF19 | (2365,3340/GG) | 4 |
| 5 | HCR | (5782,11565,14287/GGC) | 2 |
| * 일배체형 마커는 +1 위치에 대한 기준으로서 개시 코돈 (ATG)를 이용하여 유전자에서 SNP에 기여하는 위치에 기초하여 표지된다. 이용된 표기법은 각 위치에서 SNP (5'에서 3')에 대한 ATG 출발에 이은 대립유전자를 제공한다. 예를 들면, 본원에 CD8B1 유전자에서 일배체형 마커 1로서 언급된 일배체형 마커 (-255,25,28589/CTG)에서, C는 -255에서 프로모터 SNP에서 대립유전자이며, T 및 G는 상기 유전자에서 각각 위치 25 및 28589에서 엑손 SNP에서 대립유전자이다. | |||
CD8B1
유전자
CD8 항원, 베타 폴리펩티드 1(CD8B1) 유전자는 CD8 단백질의 β 서브유닛을 코딩한다. 상기 CD8β 사슬은 4개의 별개의 기능성 도메인인 Ig 유사 엑토도메인, 막 근위 줄기(힌지) 영역, 막횡단 도메인, 및 세포질 도메인으로 이루어지는 34 kDa 단백질이다.
인간 CD8은 세포독성 T 세포에서 발현되며, T 세포 항원 수용체 (TCR)와 함께 보조수용체로서 기능하는 세포 표면 당단백질이다. 성숙한 말초 클래스 I MHC 제한된 T-세포 상에서, CD8 분자는 알파 및 베타 사슬의 디설피드 연관된 이질이합체로서 존재한다. 그러나, CD8β 분자는 CD8α 사슬 없이 세포 표면 상에서 발현된다. 상기 세포외 도메인은 TCR/CD3 복합체와 효율적으로 상호작용할 수 있으며, 또한 CD8α의 부재하에 MHC 클래스 I/β2 미크로글로불린 이합체와 독립적인 상호작용을 할 수 있다. 상기 세포질 도메인은 효과적인 신호 전달에 필요한 세포내 신호전달 분자, 예를 들면, 림프구 특이적 단백질 티로신 키나아제(LCK) 및 T-세포의 활성화 링커(LAT)와의 연관을 증진 및 조절한다.
CD8B1의 게놈 서열은 서열번호 1로서 본원에 기재되며, contig의 순서를 결정하기 위해 기준 mRNA X13445.1을 이용하여 초안 게놈 서열 등록 번호 AC111200.3 (GI: 18873971) 및 AC112696.1 (GI: 18860769)의 조합으로부터 유래되었다.
HCR
유전자
α-나선 코일드-코일(coiled-coil) 막대기 동족체(HCR) 유전자는 염색체 6번 상의 PSORS1 좌위의 일부인 유전자이다. HCR에 대한 게놈 조직은 등록 번호 AB029343.1 (GI No.: 5360900)의 주석에 제공되며, 서열번호 2로서 본원에 기재된다.
HCR의 기능적 역할이 아직 해명되지 않았지만, 상기 유전자는 정상 및 건선 피부에 차별적인 발현을 보여준다. HCR 유전자에서 2개의 SNP인 C2175 및 T5787은 상기 단백질의 2차 구조의 현저한 변경을 야기하는 아미노산 변화를 초래한다.
SPR1
유전자
작은 프롤린 풍부 단백질 1(SPR1)은 건선에 대한 감수성과 연관된 것으로 확인된 HLA-C 유전자 주위의 PSORS1라 불리는 300kb 영역의 일부인 유전자이다. 상기 SPRI 유전자는 HCR 유전자에 대해 약 3 kb 말단 부위에 위치한다. 데이타는 2 유전자 사이의 강한 연관불균형을 나타낸다. SPR1의 게놈 서열은 서열번호 3으로서 기재되며, 게놈 DNA로서 기준 mRNA인 NM_014069.1 (GI No.: 7662664) 및 Genbank 등록 번호 AP000510.2 (GI No.: 7380878)를 이용하여 유도되었다.
TCF19
유전자
전사인자 19 유전자(TCF19)는 보통 건선의 병태생리학에 연관된 영역인 HLA-C 및 S 유전자 상의 염색체 6번 상에 위치한다. TCF19 유전자는 상이한 조직에서 풍부하게 발현된다. 상기 단백질의 8개의 이성질형태를 생성하는 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 생성된 적어도 10개의 상이한 전사체가 존재한다. 상기 TCF19 단백질은 DNA 복구, 신호 전달, 및 단백질 분해와 같은 많은 상이한 세포 과정에 참여하는 키나아제, 포스파타아제, 전사인자 및 효소와 같은 많은 조절 단백질에서 발견되는 포크헤드 관련(FHA) 모티프를 가진다.
TCF19의 게놈 서열은 기준 mRNA Genbank 등록 번호 NM007109.1 (GI No.:6005891) 및 DNA 등록 번호 AC004195.1를 이용하여 유도되었으며, 서열번호 4로서 본원에 기재된다.
연관불균형에서
부가적인 다형성
표 1 또는 표 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 및 16B에서 각각의 일배체형 마커 1 내지 5에 대해, 본 발명은 또한 일배체형 마커를 포함하는 하나 이상의 다형성과 높은 연관불균형 (LD)인 상기 유전자의 염색체 상의 상기 유전자 또는 다른 곳에서 기타 다형성을 포함한다. 상이한 다형성 자리에서 2개의 특정 뉴클레오티드 대립유전자는 상기 자리 중의 하나에서 대립유전자 중의 하나의 존재가 동일한 염ㅅ핵체 상의 다른 자리에서 다른 대립유전자의 존재를 예상하는 경향이 있다면 LD인 것으로 일컬어진다 (Stevens, JC, Mol. Diag. 4: 309-17, 1999). 연관불균형의 가장 흔히 이용되는 측정 중의 하나는 △2이며, 이는 Devlin, B. 및 Risch, N.(1995, Genomics, 29(2):311-22)에 기재된 식을 이용하여 계산된다. 기본적으로, △2는 첫번째 다형성 자리에서 대립유전자 X가 동일한 염색체 상의 두번째 다형성 자리에서 대립유전자 Y의 존재를 얼마나 잘 예상하는지를 측정한다. 상기 측정은 단지 예상이 완벽할 때 1에 도달한다 (예를 들면, X이면 오로지 Y인 경우).
그리하여, 당업자는 본원에 기재된 본 발명의 모든 구현예가 자주 본원에 개시된 일배체형 마커에서 구체적으로 확인된 다형성 자리의 임의(또는 모두)에서 대립유전자를 구체적으로 확인된 다형성 자리에서 대립유전자와 높은 LD인 또 다른 다형성 자리에서 대립유전자로 치환함으로써 수행될 수 있다는 것을 예상할 수 있다. 상기 "다형성 자리의 치환"은 현재로 공지되었거나 이후에 개발된 것일 수 있으며, 치환된 다형성 자리와 동일한 유전자에서 다형성 자리 또는 치환된 다형성 자리와 동일한 염색체 상의 다른 자리에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 상기 치환 다형성 자리는 상기 다형성 자리로부터 약 100kbp 내의 게놈 영역에 존재한다.
또한, 표 1 또는 표 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 및 16B에 제시된 임의의 특정 일배체형에 대해, 본 발명은 임상 표현형(즉, Alefacept를 이용한 치료와 같은 치료에 대한 반응성, 또는 염증성 또는 피부 질환의 개시 나이)을 또한 예상할 수 있는 일배체형 마커를 포함하는 하나 이상의 다형성과 높은 LD인 상기 유전자와 동일한 염색체 상의 유전자 또는 기타 위치에서 기타 일배체형일 수 있다는 것을 고려한다. 바람직하게는, 상기 연관된 일배체형은 상기 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는(spanning) 약 100kbp의 게놈 영역에 존재한다. 개시된 일배체형 마커 및 연관된 일배체형 사이의 연관불균형은 또한 △2를 이용하여 측정될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 임의의 개시된 일배체형 마커의 다형성 자리에서 대립유전자 및 이를 치환할 수 있는 치환 다형성 자리에서의 대립유전자 사이 또는 임의의 개시된 일배체형 마커 및 연관된 일배체형 사이의 연관불균형은 0.75 이상, 더욱 바람직하게는 0.80 이상, 더 더욱 바람직하게는 0.85 이상 또는 0.90 이상, 여전히 더욱 바람직하게는 0.95 이상, 가장 바람직하게는 1.0의 적당한 기준 집단에서 측정된 △2 값을 가진다. 상기 △2 측정에 대한 적당한 기준 집단은 바람직하게는 이의 구성원의 민족 배경이 치료 섭생, 예를 들면, Alefacept를 이용하여 치료되는 환자의 집단의 것을 반영하는 집단으로부터 선택된다. 기준 집단은 일반적인 집단, T 세포 제거 물질, 예를 들면, Alefacept를 이용한 집단; 염증성 질환 또는 건선과 같은 피부 질환으로 고생하는 집단; 또는 염증성 또는 피부 질환을 발생하는 위험 인자를 갖는 집단일 수 있다.
게놈 영역에서 LD 패턴은 임의의 2개의 대립유전자(상이한 다형성 자리 또는 2개의 일배체형에서)가 연관불균형인지를 결정하기 위해 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 적당하게 선택된 시료에서 용이하게 측정된다 (Weir B. S. 1996 Genetic Data Analysis II, Sinauer Associates, Inc. Publishers, Sunderland, MA). 당업자는 LD를 측정하는 어떤 방법이 특정 시료 크기 및 게놈 영역에 가장 적합한지를 용이하게 선택할 수 있다. 유사하게, T 세포 제거 물질, 예를 들면, Alefacept에 대한 임상 반응을 예상하는 하나 이상의 치환 다형성 자리에서 대립유전자를 포함하는 치환 일배체형, 또는 표 1, 3A, 3B, 7A, 7B, 12, 16A 및 16B에서 하나 이상의 일배체형 마커와 높은 LD인 연관된 일배체형의 능력은 당업자에 의해 또한 용이하게 시험될 수 있다.
그리하여, T 세포 활성화 또는 저해 일배체형에 대한 본원의 기준은 T 세포 제거 물질, 예를 들면, Alefacept에 대한 대상의 임상 반응을 예상하는 면에서 개시된 일배체형 마커와 유사하게 행동하는 임의의 개시된 일배체형에 대한 연관된 일배체형 및 임의의 개시된 일배체형에 대한 치환 일배체형을 포함할 의도이다.
III. 본 발명의 다형성을 포함하는 핵산 분자
본 발명은 CD8B1, HCR, SPR1, 및 TCF19 유전자 (서열번호 1-4)에서 다형성 및 일배체형 마커의 발견에 부분적으로 기초한다. 그리하여, 하나의 양태에서, 본 발명은 표 1에 열거된 하나 이상의 단일염기다형성을 포함하는 상기 유전자(서열번호 1-4)의 단편을 제공한다.
본 발명의 다형성 변이체 뉴클레오티드 서열 (SNP)을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 코딩된 변이체 단백질을 복제 및 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터에서 하나 이상의 발현 조절 원소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 재조합 발현 벡터 내에, "작동가능하게 연결된"은 목적 뉴클레오티드 서열이 (예를 들면, 시험관 내 전사/번역 시스템에서 또는 상기 벡터가 숙주 세포 내로 도입되는 숙주 세포에서) 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열(들)에 연결되는 것을 의미할 의도이다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 원소 (예를 들면, 폴리아데닐화 신호)를 포함할 의도이다. 상기 조절 서열은 예를 들면, [Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재된다. 조절 서열은 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 지속적 발현을 이끄는 것 및 단지 특정 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열(예를 들면, 조직 특이적 조절 서열)의 발현을 이끄는 것을 포함한다. 상기 발현 벡터의 디자인은 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것을 당업자는 인식할 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어 본원에 기재된 핵산에 의해 코딩되는 변이체 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포에서 단백질의 발현을 위해 디자인될 수 있다. 예를 들면, 단백질은 대장균과 같은 박테리아 세포, 곤충 세포(배큘로바이러스 발현 벡터 이용), 효모 세포 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 적당한 숙주 세포는 또한 [Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 논의된다.
대안적으로, 상기 재조합 발현 벡터는 예를 들면, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 이용하여 시험관 내에서 전사 및 번역될 수 있다.
IV. 이용 방법
본 발명의 방법은 생물학적 시료에서 다형성 및 일배체형 패턴을 확인하는데 유용성을 가진다. 상기 정보는 이어서 건선과 같은 질환으로 고생하는 대상에 대한 치료 섭생의 선택; 치료 효능 및/또는 안전성 시도; 표현형 특징(예를 들면, 질병 내성 또는 감수성 및 예를 들면, 효능 및 부작용을 포함하는 약물 반응)의 유전자 맵핑; 진단학; 후보 약물 표적의 확인; 단백질, 소분자, 안티센스, 항체, 또는 기타 치료제의 개발; 표현형 특징에 대한 생물학적 기초를 밝히는 것; 연관 연구; 법의학; 및 부친검사를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 수많은 방식에 이용될 수 있다.
A. 표적 핵산 분자에서 본 발명의
일배체형
마커의
검출
본 발명의 다형성 및 일배체형 마커는 스크리닝되는 대상, 예를 들면, 질환에 대한 치료를 경험하는 대상 또는 질환(예를 들면, 건선)에 대한 치료를 요하는 대상 유래의 핵산 시료에서 검출될 수 있다. 핵산 시료는 실제로 임의의 생물학적 시료로부터 수득될 수 있다. 예를 들면, 편리한 시료는 전혈, 혈청, 정액, 타액, 눈물, 대변물, 소변, 땀, 볼 물질, 피부 및 모발을 포함한다. cDNA 또는 mRNA의 분석을 위해, 조직은 표적 핵산이 발현되는 기관으로부터 수득되어야 한다.
진단 절차는 또한 핵산 정제가 필요하지 않도록, 생검 또는 재절단으로부터 수득된 환자 조직의 조직 절단(고정 및/또는 동결)시 인 시투로 직접 수행될 수 있다. 핵산 시약은 상기 인 시투 절차에 대해 프로브 및/또는 프라이머로서 이용될 수 있다 (예를 들면, Nuovo, G. J. , 1992, PCR in situ hybridization: protocols and applications, Raven Press, N.Y. 참고).
핵산 시료는 당업자에게 공지된 임의의 기술을 이용하여 분석을 위해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 상기 기술은 핵산 분자에서 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 대립유전자의 존재 또는 부재를 결정하는데 충분히 순수한 핵산 분자의 생산을 초래한다. 상기 기술은 예를 들면, 본원에 원용에 의해 포함된 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York) (2001)]에서 발견될 수 있다.
핵산에서 하나 이상의 대립유전자의 존재 또는 부재를 측정하기 전에 목적하는 하나 이상의 핵산을 증폭 및/또는 표지하는 것이 바람직할 수 있다. 중합효소 연쇄반응(PCR) 기술을 포함하나, 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 임의의 증폭 기술이 본 발명과 함께 이용될 수 있다.
PCR은 당업자에게 공지된 재료 및 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (일반적으로 PCR Technology: Principals and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N. Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif. , 1990); Matilla et al., Nucleic acid Res. 19: 4967 (1991); Eckert et al., PCR Methods and Applications 1: 17 (1991); PCR (eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford); 및 미국특허 제4,683,202호 참고, 각각의 전체 내용이 본원에 원용에 의해 포함됨). 기타 적당한 증폭 방법은 리가제 연쇄반응(LCR) (Wu and Wallace, Genomics 4: 560(1989) 및 Landegren et al., Science 241: 1077 (1988) 참고), 전사 증폭 (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173 (1989)), 자가 유지(self-sustained) 서열 복제 (Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990)) 및 핵산 기재 서열 증폭 (NASBA)을 포함한다.
핵산에서 하나 이상의 대립유전자의 존재 또는 부재의 측정은 당업자에게 공지된 임의의 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 변이의 정확한 측정을 허용하는 임의의 기술이 이용될 수 있다. 바람직한 기술은 최소한의 시료 취급과 함께 복수의 변이의 신속하고 정확한 측정을 허용한다. 적당한 기술의 일부 예는 직접적인 DNA 서열결정, 모세관 전기영동, 예를 들면, 대립유전자-특이적 프로브 또는 프라이머를 이용한 혼성화, 단일 가닥 형태 다형성 분석, 핵산 어레이, 프라이머 특이적 연장, 단백질 검출, 및 당업계에 공지된 기타 기술을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. DNA 서열결정에 대한 몇 가지 방법이 주지되어 있으며, 일반적으로 당업계에 유용하며, 제시된 개인에 존재하는 대립유전자를 측정하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 원용에 의해 포함된 Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York) (2001), 및 Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, New York) (1997) 참고. 예를 들면, SNP의 검출을 위한 핵산 어레이 (DNA 칩)의 이용에 관한 상세한 것에 대해, 모두 본원에 원용에 의해 포함된 미국특허 제6,300,063호(Lipshultz, et al.에게 허여) 및 미국특허 제5,837,832호(Chee, et al.에게 허여), HuSNP Mapping Assay, reagent kit and user manual, Affymetrix Part No. 90094 (Affymetrix, Santa Clara, Calif. ) 참고.
본 발명의 검출 방법은 시험관 내뿐만 아니라 생체 내에서 생물학적 시료 중의 폴리펩티드 또는 핵산에서 하나 이상의 대립유전자의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 목적 핵산 분자의 검출을 위한 시험관 내 기술은 노던 혼성화, 서던 혼성화 및 인 시투 혼성화를 포함한다. 목적 폴리펩티드의 검출을 위한 시험관 내 기술은 효소면역측정법(ELISA), 웨스턴 블롯, 면역침전법 및 면역형광법을 포함한다.
대안적으로, 상기 폴리펩티드는 대상에 표지된 항체를 도입함으로써 대상에서 생체 내에서 검출될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체는 대상에서 이의 존재 및 위치가 표준 이미징 기술에 의해 검출될 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다.
서던 또는 노던 분석, 점 블롯(dot blot), 또는 기타 막 기재 기술, 딥스틱 분석, 및 환자 유래의 유체 또는 조직 추출액을 이용하는 마이크로어레이가 본원에 기재된 다형성을 검출하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열, 및 그로부터 유도된 더 긴 또는 더 짧은 서열은 또한 마이크로어레이, 또는 기타 유전형 결정 시스템에서 표적으로서 이용될 수 있다. 상기 시스템은 특정 대립유전자의 존재 또는 부재를 검출하거나 또는 수많은 유전자 산물의 발현을 동시에 모니터링하기 위해 이용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 핵산 시료에서 일배체형 구조를 결정하기 위해 다형성의 유전형을 측정하기 위해 대립유전자-특이적 프로브를 이용하는 것이 가능하다. 다형성을 분석하기 위한 대립유전자-특이적 프로브의 디자인 및 용도는 예를 들면, 미국특허 제6,361,947호(Dong, et al에게 허여)에 기재된다. 2명의 개인 유래의 각각의 절편에서 상이한 다형성 형태(대립유전자)의 존재로 인해, 하나의 개인 유래의 표적 핵산 시료, 예를 들면, DNA 또는 RNA의 절편에 혼성화하나, 또 다른 개인 유래의 해당하는 절편에는 혼성화하지 않는 대립유전자-특이적 프로브가 디자인될 수 있다. 혼성화 조건은 대립유전자 사이의 혼성화 강도의 현저한 차이, 바람직하게는 본질적으로 이원(binary) 반응이 존재하여, 프로브가 대립유전자 중의 단지 하나에 혼성화하도록 충분히 스트린전트해야 한다. 일부 프로브가 다형성 자리가 프로브의 중앙 위치(예를 들면, 7번째 위치에서 15-머; 13번째 위치에서 25-머)와 정렬되도록 표적 핵산 분자의 절편에 혼성화하기 위해 디자인된다. 프로브의 상기 디자인은 상이한 대립유전자 형태 사이의 혼성화의 양호한 구별을 달성한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 핵산은 표적 핵산에서 다형성을 검출하는 수단으로서 표적 핵산에 특이적으로 혼성화된다. 상기 대립유전자-특이적 프로브는 또한 핵산 어레이 상에 고정화될 수 있다. 핵산 어레이에 대한 혼성화의 예는 DNA 칩 (올리고뉴클레오티드 어레이), 예를 들면, Affymetrix, Inc. Santa Clara, Calif 사에서 시판하는 것의 이용을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 핵산 어레이는 표적 DNA 시료에서 본 발명의 일배체형 마커를 검출하기 위해 이용된다.
기타 구현예에서, DNA/DNA 또는 RNA/DNA 이중쇄가 히드록실아민 또는 오스뮴 테르록시드 및 피페리딘으로 처리되어 미스매치된 영역을 절단할 수 있다. 미스매치된 영역의 절단 후에, 생성된 물질은 이어서 다형성의 자리를 측정하기 위해 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에 크기에 의해 분리된다. 예를 들면, Cotton et al (1988) Proc. Natl Acad Sci USA 85: 4397; 및 Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217: 286-295 참고. 바람직한 구현예에서, 조절 DNA 또는 RNA가 검출을 위해 표지될 수 있다.
여전히 또 다른 구현예에서, 미스매치 절단 반응은 이중 가닥 DNA에서 미스매치된 염기쌍을 인식하는 하나 이상의 단백질을 이용한다 (소위 "DNA 미스매치 복구" 효소). 예를 들면, 대장균의 mutY 효소는 G/A 미스매치에서 A를 절단하며, HeLa 세포 유래의 티미딘 DNA 글리코실라아제는 G/T 미스매치에서 T를 절단한다 (Hsu et al. (1994) Carcinogeneis 15: 1657-1662). 전형적인 구현예에 따라, 본 발명의 일배체형 마커의 대립유전자에 기초한 프로브는 시험 세포(들) 유래의 cDNA 또는 기타 DNA 산물에 혼성화한다. 이중쇄는 DNA 미스매치 복구 효소로 처리되며, 있다면 절단 산물은 전기영동 프로토콜 등으로부터 검출될 수 있다 (예를 들면, 미국특허 제5,459,039호 참고).
여전히 또 다른 구현예에서, 변성제의 구배를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔에서 대립유전자의 이동은 변성 구배 겔 전기영동(DGGE)를 이용하여 분석된다 (Myers et al. (1985) Nature 313:495). DGGE가 분석 방법으로서 이용되는 경우에, DNA는 예를 들면, PCR에 의해 고융점 GC 풍부 DNA의 대략 40bp의 GC 클램프를 첨가함으로써 완전히 변성되지 않는 것을 보장하도록 변형될 것이다. 추가의 구현예에서, 온도 구배가 변성제 구배 대신에 이용되어 대조군 및 시료 DNA의 이동성에서 차이를 확인한다 (Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753).
단백질 번역의 조기 종결을 생성하는 다형성에 대해, 단백질 절단 분석(PTT)은 효율적이 진단 접근법을 제공한다 (Roest, et al., (1993) Hum. Mol Genet. 2: 1719-21; van der Luijt, et al., (1994) Genomics 20: 1-4). PTT에 대해, RNA는 초기에 유용한 조직으로부터 분리되며, 역전사되며, 목적 절편이 PCR에 의해 증폭된다. 역전사 PCR의 산물은 이어서 RNA 중합효소 프로모터 및 진핵세포 번역을 개시하기 위한 서열을 포함하는 프라이머를 이용한 네스티드(nested) PCR 증폭에 대한 주형으로서 이용된다. 목적 영역의 증폭 후에, 상기 프라이머 내로 혼입된 독특한 모티프는 PCR 산물의 연속적인 시험관 내 전사 및 번역을 허용한다.
본 발명의 다형성 및 일배체형 마커는 또한 이의 일부 예가 WO 95/11995에 기재된 핵산 어레이에 대한 혼성화에 의해 분석될 수 있다. WO 95/11995는 또한 미리 규명된 다형성의 변이체 형태의 검출에 대해 최적화된 서브어레이를 기재한다. 상기 서브어레이는 첫번째 기준 서열의 대립유전자 변이체인 두번째 기준 서열에 상보적이도록 디자인된 프로브를 포함한다. 프로브의 두번째 그룹은 상기 프로브가 두번째 기준 서열에 상보성을 나타내는 것을 제외하고, 동일한 원리에 의해 디자인된다. 두번째 그룹(또는 추가의 그룹)의 포함은 복수의 돌연변이가 프로브이 길이에 상당하는 짧은 거리 내에 예상되는 (예를 들면, 9 내지 21 염기 내에 2 이상의 돌연변이) 일차 기준 서열의 짧은 하부서열을 분석하는데 특히 유용할 수 있다.
상기 중합효소 연쇄반응을 이용하여 생성된 증폭 산물은 변성 구배 겔 전기영동의 이용에 의해 분석될 수 있다. 상이한 대립유전자는 용액 내의 DNA의 상이한 서열 의존성 용융 특성 및 전기영동 이동에 기초하여 확인될 수 있다 (Erlich, ed., PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, W. H. Freeman and Co, New York, 1992, Chapter 7).
표적 서열의 대립유전자는 [Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766-2770 (1989)]에 기재된 바와 같이, 단일 가닥 PCR 산물의 전기영동 이동의 변경에 의해 염기 차이를 확인하는 단일 가닥 입체형태 다형성 분석을 이용하여 구별될 수 있다. 증폭된 PCR 산물은 전술한 바와 같이 생성될 수 있으며, 단일 가닥 증폭 산물을 형성하기 위해 가열 또는 그렇지 않으면 변성될 수 있다. 단일 가닥 핵산은 리폴딩되거나 또는 염기 서열에 부분적으로 의존하는 이차 구조를 형성할 수 있다. 단일 가닥 증폭 산물의 상이한 전기영동 이동은 표적 서열의 대립유전자 사이의 염기-서열 차이와 관련될 수 있다.
다형성을 확인 및 분석하는 대안적인 방법은 첨가된 염기의 표지 및 프라이머의 표지 사이의 형광공명에너지전달(FRET)와 커플링된 형광으로 표지된 프라이머의 단일-염기 연장 (SBE)에 기초한다. 전형적으로, Chen 등 (Proc. Nat. Acad. Sci. 94: 10756-61(1997))에 기재된 것과 같은 상기 방법은 5-카르복시플루오레신 (FAM)을 이용하여 5' 말단에 표지된 좌위-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한다. 상기 표지된 프라이머는 3' 말단이 목적 다형성 자리에 바로 인접하도록 디자인된다. 상기 표지된 프라이머는 상기 좌위에 혼성화되며, 상기 표지된 프라이머의 단일 염기 연장은 어떠한 데옥시리보뉴클레오티드도 존재하지 않는 것을 제외하고는, 염료-터미네이터 서열결정 방식으로 형광으로 표지된 디데옥시리보뉴클레오티드 (ddNTP)를 이용하여 수행된다. 표지된 프라이머의 파장에서 여기(excitation)에 대한 반응에서 첨가된 ddNTP의 형광의 증가는 첨가된 뉴클레오티드의 실체를 추리하기 위해 이용된다.
일배체형 마커 X의 개인에서의 존재는 하기 논의된 것을 포함하는, 개인의 게놈의 하나 또는 양자 카피에서 다형성 자리의 세트에 대한 일배체형 또는 일배체형 쌍을 측정하는 당업계에 주지된 다양한 간접적 또는 직접 방법에 의해 측정될 수 있다. 개인에서 다형성 자리에 대한 유전형은 당업계에 공지된 방법 또는 하기 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다.
제로 또는 적어도 하나의 카피의 일배체형이 개인에 존재하는지를 측정하기 위한 하나의 간접적 방법은 상기 일배체형을 포함하는 하나 이상의 다형성 자리 (PS)에서 측정된 개인의 유전형에 기초하며, 개인에 존재하는 일배체형을 측정하기 위해 각 자리에서 측정된 유전형을 이용하는 예측에 의한 것이다. 목적하는 제로, 하나 또는 두 카피의 일배체형의 존재는 상기 일배체형을 포함하는 PS에서 대립유전자의 육안 검사에 의해 측정될 수 있다. 상기 일배체형 쌍은 개인의 유전형과 일반적인 집단 또는 특정 집단 그룹에 존재하는 것으로 알려진 일배체형 쌍 또는 각 PS에서 가능한 대안적인 대립유전자에 기초한 이론적으로 가능한 일배체형 쌍에 해당하는 동일한 세트의 PS에서 유전형을 비교하고, 어느 일배체형 쌍이 개인에 가장 존재할 것 같은지를 결정함으로써 할당된다.
관련된 간접 일배체형 결정 방법에서, 제로 카피 또는 적어도 1 카피의 일배체형의 개인에서의 존재는 기준 집단에 존재하는 것으로 알려진 일배체형 쌍에 대한 정보를 이용하여 선택된 일배체형을 포함하는 세트의 PS에 대한 개인의 유전형으로부터 예측된다. 하나의 양태에서, 상기 일배체형 쌍 예측 방법은 선택된 일배체형을 포함하는 다형성 자리의 세트에서 개인에 대한 유전형을 확인하는 단계, 선택된 일배체형의 다형성 자리를 포함하는 다형성 자리의 세트에 대한 기준 집단에서 확인된 일배체형 쌍을 포함하는 데이타에 접근하는 단계, 및 개인의 유전형과 일치하는 개인의 일배체형 쌍에 할당하는 단계를 포함한다. 개인이 일배체형 마커 X를 가지는지는 할당된 일배체형 쌍에 기초하여 측정될 수 있다. 상기 일배체형 쌍은 개인의 유전형과 일반적인 집단 또는 특정 집단 그룹에 존재하는 것으로 알려진 일배체형 쌍에 해당하는 유전형을 비교하고, 어느 일배체형 쌍이 개인의 유전형과 일치할지를 결정함으로써 할당된다. 특정 구현예에서, 상기 비교 단계는 육안 검사에 의해 수행될 수 있다. 개인의 유전형이 하나 이상의 일배체형 쌍과 일치할 때, 빈도 데이타가 상기 일배체형 쌍의 어느 것이 개인에서 가장 존재할 것인지를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 개인의 유전형과 일치하는 특정 일배체형 쌍이 상기 유전형과 일치하는 기타보다 기준 집단에서 더욱 빈번하다면, 가장 높은 빈도를 갖는 일배체형 쌍이 개인에 가장 존재할 것 같다.
상기 측정은 또한 육안 검사에 의해 일부 구현예에서 수행될 수 있다. 기타 구현예에서, 상기 비교는 개인의 유전형 및 컴퓨터 해독가능한 포멧으로 저장된 기준 일배체형 데이타를 이용하여 컴퓨터 수행된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, WO01/80156에 기재된 바와 같이, 상기 비교를 수행하는 하나의 컴퓨터 수행된 알고리즘은 상기 유전형과 일치하는 모든 가능한 일배체형 쌍을 열거하는 것, 개인이 가능한 일배체형 쌍을 가지는 확률을 결정하기 위해 기준 집단에서 측정된 일배체형 쌍 빈도 데이타를 포함하는 데이타를 접근하는 것, 및 개인에 일배체형 쌍을 할당하기 위해 측정된 확률을 분석하는 것을 필요로 한다.
전형적으로, 상기 기준 집단은 세계의 주요 민족지리학적(ethnogeographic) 그룹을 대표하는 무작위로 선발된 개인으로 이루어진다. 본 발명의 방법에 이용하기 위한 바람직한 기준 집단은 코카서스인 개인으로 이루어지면, 이의 수는 얼마나 희귀한 일배체형을 검사하기를 원하는가에 기초하여 선택된다. 예를 들면, 기준 집단에서 발생하는 p% 빈도로 집단에서 존재하는 일배체형을 누락하지 않는 q% 가능성을 갖기를 원한다면, 샘플링되어야 하는 개인의 수(n)는 2n=log(l-q)/log(l-p)(식 중, p 및 q는 분수로서 표시된다)에 의해 제공된다. 특히 바람직한 기준 집단은 일배체형 결정 절차의 질을 검사하기 위한 대조군으로서 이용하는 3-세대 코카서스인 패밀리를 포함한다.
상기 기준 집단이 하나 이상의 민족지리학적 그룹을 포함한다면, 각 그룹에 대한 상기 빈도 데이타는 Hardy-Weinberg 평형과 일치하는지를 결정하기 위해 조사된다. Hardy-Weinberg 평형 (D. L. Hartl et al., Principles of Population Genomics, Sinauer Associates (Sunderland, MA), 3rd Ed. , 1997)은 일배체형 쌍 H1/H2를 발견하는 빈도가 H1≠H2 라면 PH-W(H1/H2) = 2p(H1)p(H2)이며, H1=H2 라면 PH-W(H1/H2) = p(H1)p(H2)와 같다는 것을 가정한다. 관찰 및 예상된 일배체형 빈도 사이의 통계학적으로 유의한 차이는 집단 그룹 내의 현저한 동계교배, 유전자에 대한 강한 선택적 압력, 샘플링 편차, 및/또는 유전형 결정 과정의 오차를 포함하는 하나 이상의 인자에 기인할 수 있었다. Hardy-Weinberg 평형으로부터 큰 편차가 민족지리학적 그룹에서 관찰되면, 상기 그룹에서 개인의 수는 상기 편차가 샘플링 편차에 기인하는지를 조사하기 위해 증가될 수 있다. 더 큰 시료 크기가 관찰 및 예상된 일배체형 쌍 빈도 사이의 차이를 줄이지 못한다면, 직접적 일배체형 결정 방법, 예를 들면, CLASPER SystemTM 기술 (미국특허 제5,866,404호), 단일 분자 희석, 또는 대립유전자-특이적 긴 범위(long-range) PCR (Michalotos-Beloin et al., Nucleic Acids Res. 24:4841-4843, 1996)을 이용하여 개인의 일배체형 결정을 고려하는 것을 원할 수 있다.
개인에 대한 일배체형 쌍을 예측하는 상기 방법의 일 구현예에서, 할당 단계는 하기 분석을 수행하는 것을 포함한다. 먼저, 가능한 일배체형 쌍의 각각은 기준 집단에서 일배체형 쌍과 비교된다. 일반적으로, 기준 집단에서 일배체형 쌍의 단지 하나가 가능한 일배체형 쌍과 부합하며, 상기 쌍은 개인에 할당된다. 종종, 기준 일배체형 쌍에서 대표적인 단지 하나의 일배체형은 개인에 대한 가능한 일배체형 쌍과 일치하며, 상기 경우에 상기 개인은 상기 공지된 일배체형 및 가능한 일배체형 쌍으로부터 공지된 일배체형을 뺌으로써 유도된 신규 일배체형을 포함하는 일배체형 쌍으로 할당된다. 대안적으로, 개인에서 일배체형 쌍은 보고된 방법(예를 들면, Clark et al. 1990, Mol Bio Evol 7:111-22 또는 WO 01/80156)을 이용하거나 또는 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. (New Haven, CT)에 의해 제공되는 것과 같은 시판되는 일배체형 결정 서비스를 통해 상기 유전자에 대한 개인의 유전형으로부터 예측될 수 있다. 드문 경우에, 기준 집단에서 어느 일배체형도 가능한 일배체형 쌍과 일치하지 않거나, 또는 대안적으로, 복수의 기준 일배체형 쌍이 가능한 일배체형 쌍과 일치된다. 상기 경우에, 상기 개인은 바람직하게는 직접적인 일배체형 결정 방법, 예를 들면, CLASPER SystemTM 기술 (미국특허 제5,866,404호), SMD, 또는 대립유전자-특이적 긴 범위 PCR (Michalotos-Beloin et al., 이하 동일)를 이용하여 일배체형이 결정된다.
유전형으로부터 개인에 존재하는 일배체형의 수의 측정은 2개의 다형성 자리인 PSA 및 PSB를 포함하는 일배체형에 대해 본원에 예시된다. 하기 표는 개인으로부터 2개의 염색체 카피를 이용하여 PSA 및 PSB에서 검출될 수 있는 9 (3n, n=2 2 대립유전자 다형성 자리의 각각은 존재하는 3개의 상이한 유전형 중의 하나를 가질 수 있다) 유전형을 보여준다. 2 자리에 대한 9개의 가능한 유전형 중 8개는 개인에 존재하는 일배체형의 카피 수의 명백한 측정을 가능하게 하므로, 개인이 일배체형 마커 X를 가질지의 명백한 측정을 허용할 수 있다. 그러나, C/G A/C 유전형을 갖는 개인은 하기 일배체형 쌍 CA/GC 또는 CC/GA 중의 하나를 가질 수 있으므로, 일배체형 마커 X에 해당하는 일배체형 (CC/GA 일배체형 쌍)의 1 카피 또는 일배체형 마커 X에 해당하는 일배체형의 0 카피(CA/GC 일배체형 쌍)를 가질 수 있다. 결정된 유전형 C/G A/C에 기초하는 일배체형 쌍에서 애매함이 존재하는 경우에 대해, 빈도 정보가 가장 가능한 일배체형 쌍, 그러므로 개인에서 일배체형의 가장 가능성 있는 카피 수를 측정하기 위해 이용될 수 있다. 개인의 유전형과 일치하는 특정 일배체형 쌍이 상기 유전형과 일치하는 기타보다 기준 집단에서 가장 빈번하다면, 가장 높은 빈도를 갖는 상기 일배체형 쌍은 개인에서 존재할 확률이 가장 크다. 상기 일배체형 쌍에서 목적 일배체형의 카피수는 이어서 상기 쌍에서 각 일배체형에 대한 반응 마커를 포함하는 PS에서 대립유전자의 육안 검사에 의해 측정될 수 있다.
대안적으로, 애매한 이중 이형접합체에 대해, 상기 유전자 또는 염색체 좌위에서 하나 이상의 부가적인 자리의 유전형 결정은 PSA 및 PSB에서 유전형에 기초한 상기 일배체형 쌍을 디컨벌루팅(deconvoluting)시 애매함을 제거하기 위해 수행될 수 있다. 당업자는 상기 하나 이상의 부가적인 자리가 일배체형 쌍의 명백한 할당을 허용하는 상기 쌍에서 가능한 일배체형의 적어도 하나에서 대립유전자와 충분한 연관을 가질 필요가 있다는 것을 인식할 것이다. 상기 예시가 개인에 존재하는 상기 일배체형의 수를 측정하는 특정 경우에 대한 것이지만, 상기 방법은 일배체형 마커 X를 포함하는 임의의 연관된 또는 치환 일배체형에 대해 유사할 수 있다.
<PSA 및 PSB에서 유전형에 기초한 가상적인
일배체형
(GA)의 가능한
카피수
>
PS의 원하는 세트에 대한 개인의 유전형은 당업계에 주지된 다양한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 상기 방법은 전형적으로 개인으로부터 목적 유전자 또는 좌위의 2 카피를 포함하는 게놈 DNA 시료를 분리하는 단계, 상기 시료로부터 유전형이 결정될 다형성 자리를 포함하는 하나 이상의 표적 영역을 증폭하는 단계, 및 증폭된 표적 영역(들)에서 목적하는 각각의 PS에 존재하는 뉴클레오티드 쌍을 검출하는 단계를 포함한다.
게다가, 본원에 기재된 임의의 다형성 자리에서 대립유전자(들)의 실체는 목적하는 다형성 자리와 연관불균형인 또 다른 다형성 자리의 일배체형 결정 또는 유전형 결정에 의해 간접적으로 측정될 수 있다. 지금 개시된 다형성 자리와 연균불균형인 다형성 자리는 본원에 조사되지 않은 유전자 영역 또는 기타 게놈 영역에 위치할 수 있다. 본원에 기재된 신규 다형성 자리와 연관불균형인 다형성 자리에 존재하는 대립유전자(들)의 검출은 다형성 자리에서 대립유전자의 실체를 검출하기 위한 임의의 전술한 방법에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
대안적으로, 일배체형 마커 X를 포함하는 PS 세트에 대해 일배체형 또는 일배체형 쌍의 개인에서의 존재는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 목적하는 개인의 게놈 영역, 또는 이의 적당한 단편의 카피 중의 하나를 직접 일배체형 결정함으로써 측정될 수 있다. 상기 직접적인 일배체형 결정 방법은 전형적으로 당업자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 동일한 대립유전자 또는 상이한 대립유전자일 수 있는 개인의 게놈 영역의 2 "카피" 중의 하나를 가지는 반접합체 DNA 시료를 생산하는 방식으로 개인으로부터 분리된 게놈 핵산 시료를 처리하는 단계, 상기 시료로부터 유전형을 결정할 다형성 자리를 포함하는 하나 이상의 표적 영역을 증폭하는 단계, 및 증폭된 표적 영역(들)에서 목적하는 각 PS에 존재하는 뉴클레오티드를 검출하는 단계를 포함한다. 핵산 시료는 하기를 포함하는 반접합체 DNA 시료를 제조하는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 수득될 수 있다: WO 98/01573, 미국특허 제5,866,404호, 및 미국특허 제5,972,614호에 기재된 효모에서 표적화된 생체 내 클로닝 (TIVC); 미국특허 제5,972,614호에 기재된 프라이머 연장 및 엑소뉴클레아제 분해와 조합된 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드를 이용한 반접합체 DNA 표적을 생성하는 것; Ruano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6296-6300, 1990에 기재된 단일 분자 희석 (SMD); 및 대립유전자 특이적 PCR(Ruafio et al., 1989, 이하 동일; Ruano et al., 1991, 이하 동일; Michalatos-Beloin et al., 이하 동일).
당업자에 의해 용이하게 인식될 수 있는 바와 같이, 임의의 개인 클론은 전형적으로 단지 개인에 존재하는 2개의 게놈 카피 중 하나에 대한 일배체형 정보를 제공할 것이다. 일배체형 정보가 개인의 다른 카피에 대해 원한다면, 부가적인 클론이 통상적으로 조사될 필요가 있을 것이다. 전형적으로, 적어도 5개의 클론이 개인에서 게놈 좌위의 2개의 카피를 일배체형 결정하는 90% 이상의 확률을 가지기 위해 조사되어야 한다. 특정 경우에, 그러나, 하나의 게놈 대립유전자에 대한 일배체형이 직접 결정되면, 다른 대립유전자에 대한 일배체형은 개인이 목적하는 다형성 자리에 대한 공지의 유전형을 가지는지 또는 개인의 집단 그룹에 대한 일배체형 빈도 또는 일배체형 쌍 빈도가 공지되는지를 추리할 수 있다.
상기 유전자의 2 카피의 직접적인 일배체형 결정에서, 상기 분석은 바람직하게는 별개의 용기에 위치한 유전자의 각 카피에 대해 수행되는 반면, 또한 2 카피가 상이한 태그로 표지되거나, 또는 그렇지 않으면 별도로 구별가능하거나 또는 확인가능하다면, 특정 경우에 동일한 용기에서 일배체형 결정을 수행하는 것이 가능할 수 있다는 것을 생각할 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자의 첫번째 및 두번째 카피가 상이한 첫번째 및 두번째 형광 염료로 각각 표지되고, 세번째 상이한 형광 염료로 표지된 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드가 상기 다형성 자리(들)을 분석하기 위해 이용된다면, 첫번째 및 세번째 염료의 조합을 검출하는 것은 첫번째 유전자 카피에서 다형성을 확인할 수 있는 반면, 두번째 및 세번째 염료의 조합을 검출하는 것은 두번째 유전자 카피에서 다형성을 확인할 수 있다.
상기 간접 및 직접 일배체형 결정 방법에 이용된 핵산 시료는 전형적으로 개인으로부터 채취한 생물학적 시료, 예를 들면, 혈액 시료 또는 조직 시료로부터 분리될 수 있다. 적당한 조직 시료는 전혈, 타액, 눈물, 소변, 피부 및 모발을 포함한다.
B. 약물유전체학
단독으로 또는 특정 질환 또는 상태에 기여하는 기타 유전 결함에 관한 정보와 함께, 특정 치료 섭생에 대한 반응과 연관된 특정 대립유전자의 지식은 대상의 유전 프로필에 따라 예방 또는 치료 섭생의 맞춤을 허용한다. 본 발명은 특히, 약물유전체학의 분야, 즉, 환자의 유전자가 약물에 대한 그 또는 그녀의 반응(예를 들면, 환자의 "약물 반응 표현형" 또는 "약물 반응 유전형")을 어떻게 결정하는지의 연구에 관한 것이다. 그리하여, 본 발명의 또 다른 양태는 대상의 약물 반응 유전형에 따라 치료 섭생(예를 들면, Alefacept의 투여)을 이용한 대상의 치료 또는 예방을 맞추는 방법을 제공한다. 본 발명의 약물유전체학 방법은 임상의사 또는 내과의사가 치료로부터 가장 유리할 환자에 대한 예방 또는 치료를 표적화하고, 치료에 무반응이고/이거나 독성 약물 관련 부작용을 경험할 수 있는 환자의 치료를 피하도록 한다.
대상으로 유래된 시료에서 본원에 기재된 하나 이상의 다형성의 검출에 기초하여, 치료 섭생에 대한 대상의 반응은 예상될 수 있다. 예를 들면, 전술한 바와 같이, 대상으로부터 유래된 시료에서 (a) 일배체형 마커 1의 적어도 1 카피의 존재; (b) 일배체형 마커 2의 2 카피의 존재; (c) 일배체형 마커 4의 적어도 1 카피의 존재; 또는 (d) 일배체형 마커 3의 부재는 상기 대상이 Alefacept를 이용한 치료에 무반응성일 것 같다는 것을 나타낼 수 있다. 그리하여, 상기 대상은 또 다른 치료 계획을 이용하여 치료될 수 있다. 대조적으로, 대상으로부터 유래된 시료에서 (a) 일배체형 마커 1의 부재; (b) 일배체형 마커 2의 부재 또는 일배체형 마커 2의 1 카피의 존재; (c) 일배체형 마커 3의 적어도 1 카피의 존재; 또는 (d) 일배체형 마커 4의 부재의 검출은 상기 대상이 Alefacept를 이용한 치료에 반응성일 것 같다는 것을 나타낼 수 있다. 그리하여, 상기 대상을 치료하는 내과의사는 상기 치료를 진행할지를 선택할 수 있다.
본원에서 확인된 임의의 다형성 또는 일배체형의 조합의 검출을 이용하는 예측 방법은 또한 본 발명에 포함된다. 예를 들면, 본 발명은 대상으로부터 유래된 시료에서 (a) 일배체형 마커 1 및 일배체형 마커 2의 존재 또는 (b) 일배체형 마커 1 및 일배체형 마커 3의 존재를 측정함으로써 Alefacept를 이용한 치료에 무반응성일 것 같은 대상을 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 대상으로부터 유래된 시료에서 (a) 일배체형 마커 1 및 일배체형 마커 2의 부재 또는 (b) 일배체형 마커 1 및 일배체형 마커 3의 부재를 측정함으로써 Alefacept를 이용한 치료에 반응성일 것 같은 대상을 확인하는 방법을 제공한다.
게다가, 본 발명의 일배체형 마커 연관은 환자 집단의 계층화를 허용함으로써 건선과 같은 피부 질환 및 기타 장애 또는 질환에 대한 신규 치료에 대한 임상 시도를 개발하기 위해 이용될 수 있다.
C.
키트
본 발명은 또한 생물학적 시료에서 본 발명의 일배체형 마커의 존재를 검출하기 위한 키트, 예를 들면, 치료 섭생에 대한 대상의 반응을 진단하는데 적합한 키트를 포함한다. 상기 키트는 환자로부터 수득된 시료에서 본 발명의 일배체형 마커의 존재 또는 부재를 검출하는 수단을 포함한다. 임의로, 상기 키트는 추가로 상기 질환, 질환 감수성, 또는 치료 반응과 일배체형 마커의 연관의 데이타 세트를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 연관의 데이타 세트는 컴퓨터 해독가능한 매체이다.
본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 핵산, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 본 발명의 다형성 또는 일배체형 마커를 검출하기 위해 이용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브를 포함하는 키트를 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 키트는 하나 이상의 대립유전자의 5' 및 3'에 혼성화하는 5' 및 3' 올리고뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. PCR 증폭 올리고뉴클레오티드는 이은 분석에 대한 편리한 크기의 PCR 산물을 생산하기 위해, 25 내지 2500 염기쌍 사이를 두고, 바람직하게는 약 100 내지 약 500 염기 사이를 두고 혼성화해야 한다.
종종, 상기 키트는 본 발명의 하나 이상의 일배체형 마커의 부분을 포함하거나 또는 하나 이상의 일배체형 마커인 표적의 하나 이상의 영역의 증폭을 허용하기 위해 표적 핵산에 혼성화하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 증폭 산물은 상기 표적 핵산 내에 포함되는 다형성 및/또는 일배체형 마커의 유전형을 결정하기 위해 분석될 수 있다. 특정 키트에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 기판 상에 고정화된 채로 제공된다. 바람직한 구현예에서, 기판 상에 고정화된 올리고뉴클레오티드 프로브는 본 발명의 제시된 다형성의 특정 대립유전자에 혼성화한다.
키트에 이용하기 위해, 올리고뉴클레오티드는 합성 올리고뉴클레오티드, 제한효소 단편, cDNA, 합성 펩티드 핵산 (PNA) 등과 같은 임의의 다양한 천연 및/또는 합성 조성물일 수 있다. 상기 분석 키트 및 방법은 또한 분석에서 확인의 용이함을 허용하기 위해 표지된 올리고뉴클레오티드를 이용할 수 있다. 이용될 수 있는 표지의 예는 방사성 표지, 효소, 형광 화합물, 스트렙트아비딘, 아비딘, 바이오틴, 자성 모이어티, 금속결합 모이어티, 항원 또는 항체 모이어티 등을 포함한다.
상기 키트는 임의로 또한 DNA 샘플링 수단을 포함할 수 있다. DNA 샘플링 수단은 당업자에게 주지되어 있으며, 여과지 등과 같은 기질(예를 들면, AmpliCardTM (University of Sheffield, Sheffield, England S10 2JF; Tarlow, J W, et al., J. of Invest. Dermatol. 103: 387-389 (1994)); DNA 정제 시약, 예를 들면, NucleonTM 키트, 용해 버퍼, 프로테이나아제 용액 등; PCR 시약, 예를 들면, 10× 반응 버퍼, 열안정성 중합효소, dNTPs 등; 및 대립유전자 검출 수단, 예를 들면, HinfI 제한효소, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드, 건조 혈액 유래의 네스티드 PCR을 위한 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 통상적으로, 상기 키트는 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지시서를 포함한다.
상기 키트는 치료 섭생에 대해 긍정적으로 또는 부정적으로 반응할 것 같은 대상; 건선과 같은 염증성 질환을 발생할 위험이 있는 대상, 건선 증상을 악화시키는 약물에 민감한 대상, 및 본 발명의 다형성 및 일배체형 마커와 연관불균형인 기타 표현형 특징을 갖는 대상의 확인을 용이하게 하며, 또한 유전 상담에 유용할 수 있었다.
도면뿐만 아니라 본 출원을 통해 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개 특허출원의 내용은 본원에 원용에 의해 포함된다.
본 발명은 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되는, 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다.
도 1-7은 특정 유전자에서 본 발명의 일배체형 마커와 Alefacept 반응 사이의 연관을 나타내는 교차비 (OR) 플롯을 도시한다. 각 도면에 대한 설명은 하기와 같다. 상단 패널: Alefacept 처리된 그룹; 하단 패널: 플라시보 처리된 그룹. OR 값은 Y-축 상에 나타낸다. X-축은 마커의 카피수를 나타내며, 괄호 안의 숫자는 각 그룹에서 대상의 수이다. 제목에서 숫자는 게놈 서열에서 개시자 ATG에 대한 SNP의 위치를 나타낸다. 괄호 안의 SNP 번호는 기준으로서 개시 코돈 (ATG)을 이용하여 게놈 구조 상의 SNP의 위치를 나타낸다. p-값을 (1) 우성 또는 열성 모델 또는 (2) 0, 1, 또는 2 카피의 마커를 비교하는 모델에 기초하여 계산하였다. 포인트는 x-축 상에 나타낸 기준 그룹을 이용한 각 그룹의 OR이다. 라인은 OR의 95% 신뢰 간격이다. 각 라인 상의 숫자는 OR이다.
도 1은 Alefacept 반응에 대한 CD8B1 유전자에서 일배체형 마커 1(-255,25,28589/CTG)의 연관을 나타내는 OR 플롯을 도시한다.
도 2는 유전의 우성 모델을 이용하여 CD8B1 현저한 마커의 OR 플롯을 도시한다.
도 3은 Alefacept 반응에 대한 HCR 유전자에서 일배체형 마커 2 (2175,5787,11565/CTG)의 연관을 나타내는 OR 플롯을 도시한다.
도 4는 유전의 열성 모델을 이용하여 HCR 현저한 마커의 OR 플롯을 도시한다.
도 5는 Alefacept 반응에 대한 SPR1 유전자에서 일배체형 마커 3 (-845,-455,1171/GGA)의 연관을 나타내는 OR 플롯을 도시한다.
도 6은 유전의 우성 모델을 이용하여 SPR1 현저한 마커의 OR 플롯을 도시한다.
도 7은 Alefacept 반응에 대한 TCF19 유전자에서 일배체형 마커 4 (2365,3340/GG)의 연관을 나타내는 OR 플롯을 도시한다.
하기 방법을 본원에 기재된 실시예에 이용하였다.
A. 연구 대상
첫번째 연구에서, 충분한 DNA를 갖는 환자(N=205)를 4가지 연구로부터 선발하였으며, 이 중 3가지는 플라시보 조절된 연구이며, 이 중 1가지는 개방 표지 연구이었다. 전체 중에서, 145명 환자는 Alefacept로 처리되었으며, 60명 환자는 플라시보로 처리되었다. 145명 활동 환자 중에서, 119명 강한 응답자 및 26명 무응답자가 있었다. 60명 플라시보 환자 중에서, 30명 강한 응답자 및 30명 무응답자 가 있었다.
두번째 연구에서, 임상 코호트는 Alefacept에 대한 반응에서 PASI75를 달성한 활동 환자 세트로부터 무작위로 선발된 68명 강한 응답자, 및 첫번째 연구로부터의 26명 무응답자로 이루어진다.
B. 시료 취득 및 가공
본원에 기재된 임상 표현형의 정의에 기초하여, 단지 강한 응답자 및 무응답자가 분석 집단에 포함되었다. 낮은 DNA 양을 가진 대상은 분석 세트로부터 배제되었다. 임상 표현형 정의에서 원하지 않는 노이즈를 최소화하기 위해, 제한된 효능 방문(visit) 및/또는 금지된 동반 투약의 용법으로 인해 치료 과정 동안 임의의 시간에 PASI25를 달성하지 못한 무응답자는 최종 분석 세트로부터 배제되었다.
C. 분석된 표현형
기준선에서 건선 영역 심각도 지수 (PASI)의 % 감소는 첫번째 및 두번째 연구에서 평가된 표현형이었다. 상기 반응 카테고리는 하기와 같이 정의되었다: (a) 강한 응답자은 임의의 시간에 기준선으로부터 PASI의 50% 이상 감소의 반응을 갖는 환자를 말하며; (b) 부분적인 응답자는 임의의 시간에 기준선으로부터 PASI의 25% 이상-50% 이하 감소의 반응을 갖는 환자를 말하며; 또는 (c) 무응답자는 임의의 시간에 기준선으로부터 PASI의 25% 미만 감소의 반응을 갖는 환자를 말한다.
D. 후보 유전자
첫번째 연구에서, 유전형 결정을 위한 후보 유전자 세트를 T 세포 활성화 및 저해에 관련된 유전자(T-세포 수용체, 보조수용체, 인테그린), 상기 약물에 의해 표적화된 수용체(Fc 감마 수용체), 및 건선에 연관된 것으로 알려진 유전자에 집중하여 선발하였다. 두번째 연구에서, 유전형 결정을 위한 부가적인 39개 후보 유전자 세트를 선발하였다.
유전형 결정 분석에 대한 후보 유전자는 치료를 위해 의도한 질환인 건선과 연관된 유전자, 및 Amevive와 직접 상호작용하며, 이의 표적 수용체에 대한 Amevive 결합에 이차적으로 활성화된 단백질을 코딩하는 유전자에 집중하였다. 건선관 연관된 유전자는 염색체 6번 상의 PSORS1 좌위 유전자들, 즉, HCR, SPR1, STG, SEEK1, TCF 19 및 HLA-C를 포함하였다. Amevive의 작용 방식에 기초하여 선발된 유전자는 Amevive에 대한 인지 수용체인 CD2 및 Amevive의 막 결합 형태를 코딩하는 LFA3 유전자인 CD58을 포함하였다. 게다가, T 림프구 활성화 및 동시 촉진에 관련된 세포 표면 수용체 단백질을 코딩하는 유전자, 예를 들면, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD8A, CD8B1, CTLA4, CCR6, ICAM 및 ICOS, 및 하류 신호 단백질을 코딩하는 유전자, 예를 들면, NFKB1, NFKB2, LCK, TNF, IL-20, CD2BP, IKBKAP, ZAP70, ITGAL, ITGAM를 연구하였다. 효과기 기능 (제안된 임상 작용 방식 중의 하나)을 매개하는 Fc 감마 수용체를 관련시키는 Amevive 분자의 C-말단의 능력에 기초하여, Fc 감마 수용체 I (A,B), II (A,B) and III (A,B)를 코딩하는 유전자뿐만 아니라, 하류 신호 및 Fc 수용체 매개된 효과기 기능을 매개하는 단백질을 코딩하는 유전자, 예를 들면 MAPK1, NFATC1, NFATC2, GNLY (granulolysin), GZMB (granzyme-B)를 연구하였다.
E. SNP 발견 및
일배체형
마커
생성
임상 코호트의 SNP 발견 및 유전형 결정을 코호트에서 대상으로부터 게놈 DNA의 서열을 결정함으로써 수행하였다. 서열결정에 대해 표적화된 영역(ATG의 500 bp 상류; 각 엑손 + 엑손의 각 말단 상의 플랭킹 서열의 100 bp; 및 종결 코돈의 100 bp 하류)을 게놈 DNA로부터 증폭하였다. 꼬리를 가진(tailed) PCR 프라이머를 후보 유전자의 각각의 서열을 이용하여 디자인하였다. 증폭된 PCR 산물을 Applied Biosystems Big Dye Terminator 화학을 이용하여 서열 결정하고, ABI Prism 3700 DNA 분석기 상에서 분석하였다. 수득된 서열을 PolyPhred 프로그램을 이용하여 다형성의 존재에 대해 조사하였다. 이어서, 서열 데이타를 시료 제조를 위해 수동으로 스캔하고, PolyPhred 출력 파일에 잘못 확인된 서열결정 변칙 및 SNP를 버렸다. SNP를 일단 수용하면, 임상 코호트에서 각 개인의 유전형을 수동으로 입증하고 저장하였다.
일배체형을 WO01/80156에 기재된 방법을 이용하여 임상 코호트의 SNP 유전형으로부터 유도하였다. 대상에 일배체형 쌍의 각 할당을 위해, 신뢰 점수는 할당의 정확성의 가능성을 정량하였다. 낮은 빈도를 갖는 SNP를 일배체형을 제조하는데 이용하지 않았다.
F. 통계학적 분석
각 유전자에 대해, 모든 다형성 자리를 이용하여 좌위에 대해 상기에서 유도된 일배체형의 유전적 다양성의 95% 이상을 생성하는 다형성 자리의 감소된 세트 (Judson, R. et al. Pharmacogenomics, 3(3):379-91(2002))를 임상 종점(endpoint)을 이용한 통계학적 분석을 위해 선발하였다. 감소된 세트로부터 최대 4가지 다형 성을 포함하는 각 유전자의 모든 가능한 일배체형을 열거하였다. 다형성의 수에 대한 상한이 이용되었는데, 이는 제시된 유전자에 대해, 4 또는 5 다형성 자리 이상을 포함하는 일배체형이 좀처럼 가장 강력한 일배체형이 아니며, 덜 중요한 다형성이 이의 효과를 희석시키면서 이미 강력한 일배체형에 종종 첨가되기 때문이다. 분석 코호트에서 각 개인은 0, 1, 또는 2 카피의 일배체형을 갖는 것으로서 분류되었다. 5% 이상의 빈도를 갖는 각각의 독특한 일배체형을 이어서 임상 종점과의 연관에 대해 시험하였다.
하나의 주요한 결과 변수는 무응답자 및 강한 응답자를 포함하는, PASI 스코어 (섹션 C. 분석된 표현형 참고)의 이분되는 버전이었다. 이의 반응이 상기 2가지 범위 사이에 해당하는 환자는 상기 분석에 포함하지 않았다.
로지스틱 회귀를 이용하여 일배체형 및 강한 반응 또는 무반응의 이원 결과 사이의 연관을 평가하였다. 일배체형 및 임상 표현형 사이의 연관을 분석하기 위한 로지스틱 회귀에 이용된 모델은 일반적인 연관 모델 (0 카피 대 1 카피 대 2 카피), 우성 연관 모델 (0 카피 대 1 또는 2 카피), 및 열성 연관 모델 (0 또는 1 카피 대 2 카피)이었다. 모든 모델에 대해, 일배체형 카피수에 대한 유전자 마커 용어를 포함하였다. 성 및 기준선 PASI를 공변량으로서 이용하였다. 많은 통계학적 시험이 수행되었으므로, 순열 시험 (Good, P, 2000. Permutation Tests: A Practical Guide to Resampling Methods for Testing Hypotheses, 2nd edition. Springer Series in Statistics, New York)을 상기 유전자에서 일배체형의 비독립성을 적당하게 설명하면서, 복수 비교에 대해 조정하기 위해 수행하였다. 상기 절 차에서, 결과 및 공변량을 일정하게 유지하였으며, 생성된 일배체형의 세트를 무작위로 1,000배 치환하였다. 많은 일배체형 사이의 최소 p-값을 1,000 순열의 각각에 대해 기록하였다. 이어서, 상기 분포에서 관찰된 p-값의 분위수(quantile)를 조정된 p-값으로서 이용하였다. 예를 들면, 상기 순열로부터의 최소 p-값의 4.5%가 일배체형의 초기 p-값보다 적다면, 상기 일배체형의 순열 조정된 p-값은 0.045 일 것이다. 임상 표현형과 연관을 가지는 것으로 발견된 일배체형은 +1 위치에 대한 기준으로서 상기 유전자에 대한 기준 mRNA에 대한 개시 코돈 (ATG)을 이용하여 각 유전자에서 SNP에 기여하는 위치에 기초하여 본원에 표지된다. 이용된 표기법은 SNP (5'에서 3')에 대한 ATG 시초(offset)에 이은 각 위치에서 대립유전자를 제공한다. 예를 들면, CD8B1 유전자에서 일배체형 마커 1 (-255,25,28589/CTG)에서, C는 -255에서 프로모터 SNP에서 대립유전자이며, T 및 G는 상기 유전자에서 각각 위치 25 및 28589에서 SNP에서 대립유전자이다.
하기 실시예는 CD8B1, HCR, SPR1, 및 TCF19 유전자에서 확인된 다형성 자리의 요약을 포함하는 표를 제공한다. 특히, 각 유전자에 대해, 표는 다형성 자리 번호("다형성 자리 번호"), SNP의 첫번째 위치의 ATG 시초("ATG 시초"), 서열 내의 SNP의 첫번째 위치의 뉴클레오티드 위치 ("뉴클레오티드 위치"), ATG 시초 및 뉴클레오티드 위치에 존재하는 대립유전자 ("기준 대립유전자"), 및 기준 대립유전자 대신에 치환되는 대립유전자 ("변이체 대립유전자")로 제공된다.
본 발명의 분석에서, CD8B1, HCR 및 SPR1 및 TCF19 유전자는 PASI 스코어와 통계학적으로 유의한 관련을 나타내는 것으로 발견되었다.
실시예
I:
CD8B1
유전자에서
일배체형
마커
1의 확인 및 분석
본 실시예는 Alefacept에 대한 반응에 관한 연관에 대해 CD8B1 유전자에서 일배체형의 분석 및 상기 일배체형의 카피수가 무응답자로부터 Alefacept에 대한 강한 응답자를 구분할 수 있는 확인을 기재한다. 표 1의 일배체형 마커 1인 3-SNP 일배체형이 가장 상세히 분석된다.
A.
CD8B1
유전자에서 확인된 다형성 자리
표 2는 CD8B1 유전자에서 확인된 다형성 자리를 나타낸다. 상기 기재된 바와 같이, 표 2는 다형성 자리 번호("다형성 자리 번호"), SNP의 첫번째 위치의 ATG 시초("ATG 시초"), 서열번호 1 내의 SNP의 첫번째 위치의 뉴클레오티드 위치 ("뉴클레오티드 위치"), ATG 시초 및 뉴클레오티드 위치에 존재하는 대립유전자 ("기준 대립유전자"), 및 기준 대립유전자 대신에 치환되는 대립유전자 ("변이체 대립유전자")를 제공한다.
표 3A 및 3B는 각각 우성 및 열성 유전자 카피수 모델을 이용하여 PASI에 대한 가장 현저한 관련을 보여주는 CD8B1 일배체형을 제공한다. 특히, 표 3A 및 3B의 칼럼에 기재된 "CD8B1 유전자의 다형성 자리"는 표 2에 확인된 CD8B1 유전자의 다형성 자리와 일치한다. 표 3A 및 3B의 각각의 열은 일배체형 마커를 나타낸다. 게다가, "미조정된 p-값" 및 "O.R."은 각각 CD8B1 유전자 내의 각각의 일배체형 마커에 대한 초기 p-값 및 교차비에 해당한다. 표 3A 및 3B에서 별표는 상기 자리에서 대립유전자가 측정되지 않았으며, 대립유전자 중의 하나, 즉, 표 2에 확인된 기준 대립유전자 또는 변이체 대립유전자 중의 하나일 수 있다는 것을 나타낸다. "O.R.의 하단 CI" 및 "O.R.의 상단 CI"는 상기 교차비의 95% 신뢰한계를 나타낸다.
B.
CD8B1
유전자에서
일배체형
마커
1
CD8B1 유전자에서 "일배체형 마커 1,"로서 언급된 3-SNP 일배체형 (-255,25,28589/CTG)는 5.2의 O.R.을 갖는 무응답자로부터 Alefacept에 대한 강한 응답자를 구분한다.
일배체형 마커 1과 Alefacept 반응 사이의 연관은 1 또는 2 카피를 갖는 대상이 더욱 무응답자일 것 같으며, 0 카피를 갖는 대상이 더욱 강한 응답자일 것은 유전 패턴을 가진다. 일배체형 마커 1 연관의 요약은 표 4에 제공된다.
| 일배체형 마커 1 (-255,25,28589/CTG) | |
| 대상 수(카피수) | 96(0) 49(1,2) |
| OR (0 대 1,2) | 5.2 |
| 95% 신뢰 간격 | 1.97,13.8 |
| 미조정 p-값 | 0.0009 |
| 순열 조정 p-값 | 0.021 |
| 무반응과 연관된 일배체형 마커의 카피수 | 1 또는 2 카피 |
| Alefacept 처리된 코호트에서 일배체형 마커의 0 카피의 빈도 | 66.2% |
| 1 또는 2 카피를 갖는 무응답자의 퍼센트 | 61.5% |
| 1 또는 2 카피를 갖는 강한 응답자의 퍼센트 | 27.7% |
C. 약물 반응을 이용하여
일배체형
마커
1의 연관 분석
도 1은 일반적인 모델(마커의 0, 1, 및 2 카피 비교)에서 약물 반응을 이용하여 일배체형 마커 1의 연관 분석 결과를 OR 플롯으로서 나타낸다.
도 2는 유전의 우성 모델을 이용하여 일배체형 마커 1의 연관의 OR 플롯을 보여준다. 상기 연관은 일배체형(일반적인 모델)의 0, 1 또는 2 카피가 Alefacept 처리된 환자 그룹에서 반응에 대해 시험될 경우에 0.0021의 초기 p-값을 가진다. 상기 일배체형 마커의 카피수는 플라시보 반응에 효과가 없었으며, 플라시보에 대한 반응에 대한 p-값은 유의하지 않았다 (p=0.523) (하단 패널, 도 1).
상기 연관은 복수 비교에 대한 원래 p 값을 보정한 후에 통계학적으로 유의하였다 (순열 조정된 p= 0.021). 우성 모델에서 분석될 때, 마커의 제로 카피를 갖는 사람들은 마커의 1 또는 2 카피를 갖는 대상과 비교하여 Alefacept에 5.2배 더 반응할 것 같다. 성 불균형이 환자 코호트에서 존재하였으므로, 남성, 더 큰 성 그룹의 서브세트 분석을 수행하였으며, 마커 주요 효과는 일배체형 마커의 1 또는 2 카피에 대해 제로 카피를 갖는 대상에 대해 6.1의 OR을 가지면서, 유의하였다 (p = 0.0044).
Alefacept에 대한 강한 및 무응답자 사이의 마커 분포는 표 5에 요약된다. CD8B1 마커 (CTG의 1 또는 2 카피)는 5.2의 OR과 함께 62%의 무응답자 및 28%의 강한 응답자를 확인한다. 상기 시험 특성을 반응 시도의 분포(23% 무응답자 및 55% 강한 응답자)에 적용함으로써, CD8B1 일배체형 마커 1은 Alefacept에 대한 무반응에 대한 81.6%의 양성 예측값(PPV) (즉, 강한 반응 카피수를 가진다면, 강하게 반응하는 확률) 및 48.3%의 음성 예측값(NPV) (즉, 무반응 카피수를 가진다면, 반응하지 않는 확률)을 가지는 것으로 예측된다.
| 카피수 | 무응답자 | 강한 응답자 |
| 0 | 10 | 86 |
| 1 또는 2 | 16 | 33 |
| 대상의 총 수 | 26 | 119 |
실시예
II:
HCR
유전자에서
일배체형
마커
2 및
일배체형
마커
5의 확인 및 분석
본 실시예는 Alefacept를 이용한 치료에 대한 반응과 연관된 HCR에서 일배체형의 확인 및 분석을 기재한다. 일배체형 마커 2 및 5인 3-SNP 일배체형을 가장 상세히 분석하였다.
A.
HCR
유전자에서 확인된 다형성 자리
표 6은 HCR 유전자에서 확인된 다형성 자리를 나타낸다. 전술한 바와 같이, 표 6은 다형성 자리 번호, SNP의 첫번째 위치의 ATG 시초, 서열번호 2 내의 SNP의 첫번째 위치의 뉴클레오티드 위치, ATG 시초 및 뉴클레오티드 위치에 존재하는 대립유전자, 및 기준 대립유전자 대신에 치환되는 대립유전자를 제공한다.
표 7A 및 7B는 각각 우성 및 열성 유전자 카피수 모델을 이용하여 PASI에 대한 가장 현저한 연관을 보여주는 HCR 일배체형을 제공한다. 전술한 바와 같이, 표 7A 및 7B의 칼럼에 기재된 "HCR 유전자의 다형성 자리"는 표 6에서 확인된 HCR 유전자의 다형성 자리와 일치한다. 표 7A 및 7B의 각 열은 일배체형 마커를 나타낸다. 게다가, "미조정된 p-값" 및 "O.R."은 각각 HCR 유전자 내의 각각의 일배체형 마커에 대한 초기 p-값 및 교차비 데이타에 해당한다. 표 7A 및 7B에서 별표는 상기 자리에서 대립유전자가 측정되지 않았으며, 대립유전자 중의 하나, 즉, 표 6에 확인된 기준 대립유전자 또는 변이체 대립유전자 중의 하나일 수 있다는 것을 나타낸다. "O.R.의 하단 CI" 및 "O.R.의 상단 CI"는 상기 교차비의 95% 신뢰한계를 나타낸다.
B.
HCR
유전자에서
일배체형
마커
2
"일배체형 마커 2,"로서 언급된 마커 (2175,5787,11565/CTG)의 요약은 표 8에 제공된다. 일배체형 마커 2는 2 카피를 갖는 대상이 더욱 무응답자일 것 같은 열성 패턴을 가진다. 마커 (2175,5787,11565/CTG)와 유사한 분포 및 반응에 대한 효과를 갖는, "일배체형 마커 5,"로서 언급된 두번째 마커 (5782,11565,14287/GGC)는 또한 표 9에 요약된다.
| 일배체형 마커 2 (2175,5787,11565/CTG) | |
| 대상 수(카피수) | 105(0,1) 40(2) |
| OR (0,1 대 2) | 5.7 |
| 95% 신뢰 간격 | 2.2,15 |
| 미조정 p-값 | 0.0003 |
| 순열 조정 p-값 | 0.031 |
| 무반응과 연관된 일배체형 마커의 카피수 | 2 카피 |
| Alefacept 처리된 코호트에서 마커의 0 또는 1 카피의 빈도 | 72.4% |
| 2 카피를 갖는 무응답자의 퍼센트 | 57.7% |
| 2 카피를 갖는 강한 응답자의 퍼센트 | 21.0% |
| 일배체형 마커 5 (5782,11565,14287/GGC) | |
| 대상 수(카피수) | 109(0,1) 36(2) |
| OR (0,1 대 2) | 5.7 |
| 95% 신뢰 간격 | 2.2,15.1 |
| 미조정 p-값 | 0.0004 |
| 순열 조정 p-값 | 0.033 |
| 무반응과 연관된 일배체형 마커의 카피수 | 2 카피 |
| Alefacept 처리된 코호트에서 마커의 0 또는 1 카피의 빈도 | 75.2% |
| 2 카피를 갖는 무응답자의 퍼센트 | 53.8% |
| 2 카피를 갖는 강한 응답자의 퍼센트 | 18.5% |
C. 약물 반응을 이용하여
일배체형
마커
2의 연관 분석
도 3은 약물 반응을 이용하여 일배체형 마커 2의 연관 분석 결과를 OR 플롯으로서 나타낸다. 상기 마커의 2 카피를 갖는 환자의 집단에 대한 Alefacept에 대한 반응의 OR은 0 또는 1 카피를 갖는 환자와 비교하여 5.5이다. 선택된 일배체형은 일배체형 마커의 0, 1 또는 2 카피가 Alefacept 처리된 환자 그룹에서 반응에 대해 시험될 경우에 0.0016의 초기 p-값을 가진다. 상기 일배체형 마커의 카피수는 플라시보 반응에 효과가 없었으며, 플라시보에 대한 반응에 대한 p-값은 유의하지 않았다 (p=0.371) (하단 패널, 도 3). 상기 연관은 복수 비교에 대한 초기 p 값을 보정한 후에 통계학적으로 유의하였다 (순열 조정된 p= 0.031).
일배체형 마커의 0 또는 1 카피를 갖는 대상은 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 반응의 유사한 가능성으로 인해 1 그룹으로 붕괴될 수 있다. 이는 일배체형 마커의 0 또는 1 카피를 갖는 대상이 일배체형 마커의 2 카피를 갖는 대상과 비교하여 Alefacept에 대해 5.7배 더욱 반응할 것 같은 유전의 열성 모델을 의미한다(도 4). Alefacept에 대한 강한 및 무응답자 사이의 마커 분포는 표 10에 요약된다. HCR 마커 (CTG의 2 카피)는 5.7의 OR과 함께 58%의 무응답자 및 21%의 강한 응답자를 확인한다. 상기 시험 특성을 Alefacept 시도의 반응 분포(23% 무응답자 및 55% 강한 응답자)에 적용한다면, HCR 일배체형 마커 2는 Alefacept에 대한 무반응에 대한 81.1%의 PPV 및 52%의 NPV을 가지는 것으로 예측된다.
| 카피수 | 무응답자 | 강한 응답자 |
| 0 또는 1 | 11 | 94 |
| 2 | 15 | 25 |
| 대상의 총 수 | 26 | 119 |
실시예
III:
SPR1
유전자에서
일배체형
마커
3의 확인 및 분석
본 실시예는 Alefacept를 이용한 치료에 대한 반응과 강하게 연관된 SPR1에서 일배체형의 확인 및 분석을 기재한다. 일배체형 마커 3인 3-SNP 일배체형을 가장 상세히 분석하였다.
A.
SPR1
유전자에서 확인된 다형성 자리
표 11은 SPR1 유전자에서 확인된 다형성 자리를 나타낸다. 전술한 바와 같이, 표 11은 다형성 자리 번호, SNP의 첫번째 위치의 ATG 시초, 서열번호 3 내의 SNP의 첫번째 위치의 뉴클레오티드 위치, ATG 시초 및 뉴클레오티드 위치에 존재하는 대립유전자, 및 기준 대립유전자 대신에 치환되는 대립유전자를 제공한다.
표 12는 우성 유전자 카피수 모델을 이용하여 PASI에 대한 가장 현저한 연관을 보여주는 SPR1 일배체형을 제공한다. 특히, 표 12의 칼럼에 기재된 "SPR1 유전자의 다형성 자리"는 표 11에서 확인된 SPR1 유전자의 다형성 자리와 일치한다. 표 12의 각 열은 일배체형 마커를 나타낸다. 게다가, "미조정된 p-값" 및 "O.R."은 각각 SPR1 유전자 내의 각각의 일배체형 마커에 대한 초기 p-값 및 교차비 데이타에 해당한다. 표 12에서 별표는 상기 자리에서 대립유전자가 측정되지 않았으며, 대립유전자 중의 하나, 즉, 표 11에 확인된 기준 대립유전자 또는 변이체 대립유전자 중의 하나일 수 있다는 것을 나타낸다. "O.R.의 하단 CI" 및 "O.R.의 상단 CI"는 상기 교차비의 95% 신뢰한계를 나타낸다.
B.
SPR1
유전자에서
일배체형
마커
3
"일배체형 마커 3,"으로서 언급된 3-SNP 일배체형 마커 (-845,-455,1171/GGA)는 상세한 분석을 위해 선발되었다. 일배체형 마커 3은 0 카피를 갖는 대상이 더욱 무응답자일 것 같은 우성 패턴을 가진다. 일배체형 마커 3의 요약은 표 13에 제공된다.
| 일배체형 마커 3 (-845,-455,1171/GGA) | |
| 대상 수(카피수) | 28(0) 117(1,2) |
| OR (1,2 대 0) | 7.1 |
| 95% 신뢰 간격 | 2.5,20 |
| 미조정 p-값 | 0.0002 |
| 조정 p-값 | 0.028 |
| 무반응과 연관된 일배체형 마커의 카피수 | 0 카피 |
| Alefacept 처리된 코호트에서 일배체형 마커의 1 또는 2 카피의 빈도 | 80.7% |
| 0 카피를 갖는 무응답자의 퍼센트 | 46.2% |
| 0 카피를 갖는 강한 응답자의 퍼센트 | 13.4% |
C. 약물 반응을 이용하여
일배체형
마커
3의 연관 분석
도 5는 약물 반응을 이용하여 일배체형 마커 3의 연관 분석 결과를 OR 플롯으로서 나타낸다. 선택된 일배체형은 마커의 0, 1 또는 2 카피가 Alefacept 처리된 환자 그룹에서 반응에 대해 시험될 경우에 0.0009의 초기 p-값을 가진다. 상기 마커의 카피수는 플라시보 반응에 효과가 없었으며, 플라시보에 대한 반응에 대한 p-값은 유의하지 않았다 (p=0.2839) (하단 패널, 도 5). 상기 연관은 순열 시험을 이용한 복수 비교에 대한 초기 p 값을 보정한 후에 통계학적으로 유의하였다 (순열 조정된 p= 0.028).
일배체형 마커의 1 또는 2 카피를 갖는 대상은 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 반응의 유사한 가능성으로 인해 1 그룹으로 붕괴되었다. 이는 1 또는 2 카피를 갖는 대상이 일배체형 마커의 0 카피를 갖는 대상과 비교하여 Alefacept에 대해 7배 더욱 반응할 것 같은 유전의 우성 모델을 나타낸다(도 6).
Alefacept에 대한 강한 및 무응답자 사이의 마커 분포는 표 14에 요약된다. SPR1 마커 (GGA의 0 카피)는 7.1의 OR과 함께 46%의 무응답자 및 13%의 강한 응답자를 확인한다. 상기 시험 특성을 Alefacept 시도에서 보여준 반응 분포(23% 무응답자 및 55% 강한 응답자)에 적용한다면, SPR1 일배체형 마커 3은 Alefacept에 대한 무반응에 대한 80%의 PPV 및 61%의 NPV을 가지는 것으로 예측된다.
| 카피수 | 무응답자 | 강한 응답자 |
| 0 | 14 | 103 |
| 1 또는 2 | 12 | 16 |
| 대상의 총 수 | 26 | 119 |
실시예
IV:
TCF19
유전자에서
일배체형
마커
4의 확인 및 분석
본 실시예는 Alefacept를 이용한 치료에 대한 반응과 강하게 연관된 TCF19에서 일배체형의 확인 및 분석을 기재한다. 일배체형 마커 4를 가장 상세히 분석하였다.
A.
TCF19
유전자에서 확인된 다형성 자리
표 15는 TCF19 유전자에서 확인된 다형성 자리를 나타낸다. 특히, 표 15는 다형성 자리 번호, SNP의 첫번째 위치의 ATG 시초, 서열번호 4 내의 SNP의 첫번째 위치의 뉴클레오티드 위치, ATG 시초 및 뉴클레오티드 위치에 존재하는 대립유전자, 및 기준 대립유전자 대신에 치환되는 대립유전자를 제공한다.
표 16A 및 16B는 각각 우성 및 열성 유전자 카피수 모델을 이용하여 PASI에 대한 가장 현저한 연관을 보여주는 TCF19 일배체형을 제공한다. 특히, 표 16A 및 16B의 칼럼에 기재된 "TCF19 유전자의 다형성 자리"는 표 15에서 확인된 TCF19 유전자의 다형성 자리와 일치한다. 표 16A 및 16B의 각 열은 일배체형 마커를 나타낸다. 게다가, "미조정된 p-값" 및 "O.R."은 각각 TCF19 유전자 내의 각각의 일배체형 마커에 대한 초기 p-값 및 교차비 데이타에 해당한다. 표 16에서 별표는 상기 자리에서 대립유전자가 측정되지 않았으며, 대립유전자 중의 하나, 즉, 표 15에 확인된 기준 대립유전자 또는 변이체 대립유전자 중의 하나일 수 있다는 것을 나타낸다. "O.R.의 하단 CI" 및 "O.R.의 상단 CI"는 상기 교차비의 95% 신뢰한계를 나타낸다.
B.
TCF19
유전자에서
일배체형
마커
4
TCF19 유전자 마커 및 PASI 스코어의 연관 분석으로 Alefacept에 대한 반응에 대한 통계학적으로 유의한 연관과 함께, "일배체형 마커 4,"로서 언급된 TCF19의 일배체형 마커 (2365,3340/GG)를 확인하였다. 일배체형 마커 4의 요약은 표 17에 제공된다.
| 일배체형 마커 4 (2365,3340/GG) | |
| 카피 카테고리 | 0 대 1,2 |
| 대상 수(카피수) | 51(0), 43(1,2) |
| OR (0 대 1,2) | 6.3 |
| OR에 대한 95% 신뢰 간격 | 2.0,20 |
| 미조정 p-값 | 0.0015 |
| 순열 조정 p-값 | 0.01 |
| 무반응과 연관된 일배체형 마커의 카피수 | 1,2 카피 |
| Alefacept 처리된 코호트에서 일배체형 마커의 1 또는 2 카피의 빈도 | 38% |
| 1 또는 2 카피를 갖는 무응답자의 퍼센트 | 73.1% |
| 1 또는 2 카피를 갖는 강한 응답자의 퍼센트 | 35.3% |
C. 약물 반응을 이용하여
일배체형
마커
4의 연관 분석
Alefacept 반응에 대한 일배체형 마커 4의 연관 분석 결과를 또한 도 7에서 우성 모델에 대한 OR 플롯에서 나타낸다. 이는 상기 마커의 0 카피를 갖는 사람이 상기 마커의 1 또는 2 카피를 갖는 사람보다 Alefacept 처리에 대한 반응의 6.3배 더 높은 교차를 가진다. 일배체형 마커 4는 0.0015의 초기 p-값 및 0.001의 순열 조정된 p-값을 가진다. 일배체형 마커 4 분포의 요약은 표 18에 제공된다.
| 카피수 | 무응답자 | 강한 응답자 |
| 0 | 7 | 44 |
| 1 또는 2 | 19 | 24 |
| 대상의 총 수 | 26 | 68 |
일배체형 마커 4는 상기 시간의 무응답자 71%를 올바르게 확인한다. 상기 시험 특성을 Alefacept 시도에서 보여준 반응 분포(23% 무응답자 및 55% 강한 응답자)에 적용한다면, 상기 일배체형 마커는 Alefacept에 대한 무반응의 86%의 PPV 및 53%의 NPV을 가지는 것으로 예측된다.
실시예
V: 복수유전자 분석
본 실시예는 Alefacept에 대한 반응에 대한 현저한 연관을 갖는 HCR, SPR1, CD8B1 및 TCF19 유전자에서 일배체형 마커의 복수유전자 분석을 기재한다. HCR, SPR1, CD8B1 및 TCF19 유전자에서 Alefacept에 대한 반응에 대한 현저한 연관을 갖는 일배체형 마커를 표 19에 요약하며, 2-유전자 모델에 포함하기 위해 고려된다.
| 일배체형 마커 | 유전자 모델 | 무응답자 그룹에 대한 카피수 | 미조정된 p-값 | 순열 조정된 p-값 |
| 일배체형 마커 2 | 열성 | 2 | 0.0003 | 0.031 |
| 일배체형 마커 5 | 열성 | 2 | 0.0004 | 0.033 |
| 일배체형 마커 3 | 우성 | 0 | 0.0002 | 0.028 |
| 일배체형 마커 1 | 우성 | 1 또는 2 | 0.0009 | 0.021 |
| 일배체형 마커 4 | 우성 | 1 또는 2 | 0.0015 | 0.01 |
HCR 및 SPR1이 PSORS1 좌위 상에 매우 연관되므로, 각 유전자 유래의 마커는 동일한 환자에서 발견되는 경향이 있다. 그리하여, 상기 유전자 쌍은 2-유전자 모델에서 분석되지 않았다.
2-유전자 모델링에서, 각 유전자에 대한 카피수 및 일배체형 마커의 조합(이미 최상의 단일 유전자 통계학적 결과를 제공하는 열성 또는 우성 모델을 반영하기 위해 붕괴됨)을 평가하였다. 초기에 일배체형 마커 쌍에 대한 카피수의 모든 4가지 가능한 조합을 고려하면서, 로지스틱 회귀를 수행하였다. 이어서, 4 카피수 그룹을 2 그룹으로 붕괴시켰다(최악 그룹 대 나머지 3 그룹 또는 최상 그룹 대 나머지 3 그룹). 수행된 모델 중에서, 어느 것도 유의한 상호작용 p-값을 가지지 않았다. 그러나, 모든 모델에서, 두번째 마커의 주요 효과의 첨가에 대한 2-자유도 시험 및 첫번째 마커와의 상호작용 효과는 마커가 첨가된 순서와 무관하게 현저하였다. 표 20은 주요 효과, 상호작용, 및 2 자유도 시험에 대한 p-값을 제공한다.
강한 응답자 및 무응답자 사이의 마커 분포는 하기 표에 요약된다.
표 21에 나타낸 바와 같이, 1 또는 2 카피의 일배체형 마커 1 및 2 카피의 일배체형 마커 2로 이루어진 CD8B1/HCR-CTG 복수유전자 마커는 38%의 무응답자를 올바르게 확인하며, 단지 5%의 강한 응답자를 12의 OR을 갖는 무응답자로서 잘못 할당한다. 그리하여, 상기 복수유전자 마커에 대해 음성으로 시험한 대상은 양성으로 시험한 대상보다 Alefacept 치료에 12배 더 반응할 것 같다. 상기 시험 특성을 Alefacept 시도에서 보여준 반응 분포(23% 무응답자 및 55% 강한 응답자)에 적용한다면, 상기 마커는 Alefacept에 대한 무반응에 대한 78.8%의 양성 예측값 (PPV) 및 75%의 음성 예측값 (NPV)을 가지는 것으로 예측된다.
| 카피수 (CD8B1/HCR) | 무응답자 | 강한 응답자 |
| 모든 기타 조합 | 16 | 113 |
| 1 또는 2/2 | 10 | 6 |
| 대상의 총 수 | 26 | 119 |
표 22에 나타낸 바와 같이, 1 또는 2 카피의 일배체형 마커 1 및 0 카피의 일배체형 마커 3으로 이루어진 CD8B1/SPRl 복수유전자 마커는 31%의 무응답자를 올바르게 확인하며, 단지 3%의 강한 응답자를 11의 OR을 갖는 무응답자로서 잘못 할당한다. 그리하여, 상기 복수유전자 마커에 대해 음성으로 시험한 대상은 양성으로 시험한 대상보다 Alefacept 치료에 11배 더 반응할 것 같다. 상기 시험 특성을 Alefacept 시도에서 보여준 반응 분포(23% 무응답자 및 55% 강한 응답자)에 적용한다면, 상기 마커는 Alefacept에 대한 무반응에 대한 76.8%의 PPV 및 77.8%의 NPV을 가지는 것으로 예측된다.
| 카피수 (CD8B1/SPRl) | 무응답자 | 강한 응답자 |
| 모든 기타 조합 | 18 | 115 |
| 1 또는 2/0 | 8 | 4 |
| 대상의 총 수 | 26 | 119 |
표 23에 나타낸 바와 같이, 1 또는 2 카피의 일배체형 마커 4 및 1 또는 2 카피의 일배체형 마커 1로 이루어진 TCF19/CD8B1 복수유전자 마커는 91%의 응답자를 올바르게 확인하며, 50%의 무응답자를 13.1의 OR을 갖는 강한 응답자로서 잘못 확인한다. 그리하여, 상기 복수유전자 마커에 대해 양성으로 시험한 대상은 음성으로 시험한 대상보다 Alefacept 치료에 13배 더 반응할 것 같다. 상기 시험 특성을 Alefacept 시도에서 보여준 반응 분포(23% 무응답자 및 55% 강한 응답자)에 적용한다면, 상기 마커는 Alefacept에 대한 무반응에 대한 80.6%의 PPV 및 70.6%의 NPV을 가지는 것으로 예측된다.
| 카피수 (TCF19/CD8B1) | 무응답자 | 강한 응답자 |
| 모든 기타 조합 | 13 | 6 |
| 1 또는 2/1 또는 2 | 13 | 62 |
| 대상의 총 수 | 26 | 68 |
표 24에 나타낸 바와 같이, 1 또는 2 카피의 일배체형 마커 4 및 2 카피의 일배체형 마커 2로 이루어진 TCF19/HCR 복수유전자 마커는 90%의 응답자를 올바르게 확인하며, 58%의 무응답자를 6.9의 OR을 갖는 강한 응답자로서 잘못 확인한다. 그리하여, 상기 복수유전자 마커에 대해 양성으로 시험한 대상은 음성으로 시험한 대상보다 Alefacept 치료에 거의 7배 더 반응할 것 같다. 상기 시험 특성을 Alefacept 시도에서 보여준 반응 분포(23% 무응답자 및 55% 강한 응답자)에 적용한다면, 상기 마커는 Alefacept에 대한 무반응에 대한 79.4%의 PPV 및 62.5%의 NPV을 가지는 것으로 예측된다.
| 카피수 (TCF19/HCR) | 무응답자 | 강한 응답자 |
| 모든 기타 조합 | 11 | 7 |
| 1 또는 2/2 | 15 | 61 |
| 대상의 총 수 | 26 | 68 |
표 25에 나타낸 바와 같이, 1 또는 2 카피의 일배체형 마커 4 및 0 카피의 일배체형 마커 3으로 이루어진 TCF19/SPRl 복수유전자 마커는 91%의 응답자를 올바르게 확인하며, 65%의 무응답자를 7.5의 OR을 갖는 강한 응답자로서 잘못 확인한다. 그리하여, 상기 복수유전자 마커에 대해 양성으로 시험한 대상은 음성으로 시험한 대상보다 Alefacept 치료에 거의 8배 더 반응할 것 같다. 상기 시험 특성을 Alefacept 시도에서 보여준 반응 분포(23% 무응답자 및 55% 강한 응답자)에 적용한다면, 상기 마커는 Alefacept에 대한 무반응에 대한 76.9%의 PPV 및 61.5%의 NPV을 가지는 것으로 예측된다.
| 카피수 (TCF19/SPRl) | 무응답자 | 강한 응답자 |
| 모든 기타 조합 | 9 | 6 |
| 1 또는 2/0 | 17 | 62 |
| 대상의 총 수 | 26 | 68 |
표 26은 Alefacept 치료에 대한 스크리닝 시험으로서 상기 유전자 마커를 이용한 효과의 모의 실험을 나타낸다. 100명 환자 (Alefacept의 시도에서 보여준 반응 속도를 반영함)의 시료에서, 23명 무응답자, 22명 부분적인 응답자, 및 55명 강한 응답자가 있었다. 각각의 단일 또는 복수유전자 마커에 대해, "In" 그룹은 시험 결과에 기초하여 치료될 수 있는 환자로 이루어진다. "Out" 그룹은 치료될 수 없는 환자로 이루어진다. 부분적인 응답자가 통계학적 분석에 포함되지 않았지만, 이의 일배체형은 알려져 있으므로, 상기 표에 포함될 수 있다. 예를 들면, CD8B1/SPR1 마커를 이용하여, 91명 환자가 치료될 수 있으며, 이들에 대한 반응 분포는 각각 17.6%, 24.2% 및 58.2% 무응답자, 부분적인 응답자 및 강한 응답자일 수 있으며; 9명 환자는 거부된 치료일 수 있으며, 이 중에서 77.8%, 0% 및 22.2%는 무응답자, 부분적인 응답자 및 강한 응답자일 수 있다.
<110> Beena Koshy
Bradley J. Dain
Madan Kumar Anant
Ping Zhan
<120> Haplotype Markers and Methods of Using the Same to Determine Response
to Treatment
<130> BGN-025-1
<141> 04-05-2004
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 26419
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> allele
<222> (1272)..(1272)
<223> PS2: polymorphic base adenine or guanine
<220>
<221> allele
<222> (1702)..(1702)
<223> PS6: polymorphic base cytosine or thymine
<220>
<221> allele
<222> (1981)..(1981)
<223> PS11: polymorphic base cytosine or thymine
<220>
<221> unsure
<222> (3055)..(3155)
<223> N's represent unknown nucleotides
<220>
<221> allele
<222> (9682)..(9682)
<223> PS13: polymorphic base guanine or adenine
<220>
<221> unsure
<222> (10786)..(10886)
<223> N's represent unknown nucleotides
<220>
<221> allele
<222> (12027)..(12027)
<223> PS15: polymorphic base guanine or adenine
<220>
<221> allele
<222> (16448)..(16448)
<223> PS21: polymorphic base guanine or adenine
<220>
<221> unsure
<222> (17114)..(17214)
<223> N's represent unknown nucleotides
<220>
<221> allele
<222> (25065)..(25065)
<223> PS26: polymorphic base adenine or guanine
<220>
<221> allele
<222> (25139)..(25139)
<223> PS27: polymorphic base cytosine or thymine
<220>
<221> allele
<222> (25215)..(25215)
<223> PS28: polymorphic base cytosine or thymine
<400> 1
cactaatatt tagaggttaa tttatcacag acgcaagagt ttccataact aatgcatcca 60
ggggttccct gtctatgatt ttagacaata cctgacaaag cagtgagtaa cttttaatca 120
tttactgaga aagttgttcc ttttgcaatg ctgtggcgcc catgagagag tggatagaaa 180
gaggtagctt gtgttttcta aacaacaaat actttgaata cacatacaaa gaagaaatac 240
aaatggccaa caagcacatg aattgatgct taacatcatt tctcattcag gaagtacaaa 300
tccaaaccac aatgagatat cacttcacac ccactaggat ggaacaaaac aaaaacagaa 360
aataacaagt gttggcgatg atgtggggaa attggaaccc tttcattgtt ggcagaaatg 420
taaatggtca cagctgctat ggaaatcagt tggttagtcc ctcaaaaagt taaacataga 480
attattgtat gacccagcaa ttgcactgcc tgagtacata cctgaaagaa ttgaaaacag 540
gcacccaaac atatatttgt acaagaatgt tcacagtagc attactcaca aaagtcaaaa 600
agtagatata gtagcccact caaatgtcca tcattagatg aacagataaa gaaaatgtgg 660
tatatacagg tacatacaca aaatattact caacaataag aagaaatggt gctataatgg 720
ggatgaacct gaaaaacatt gcgctgagtc aaagaagcca ttcgctaaag accacacatt 780
gtatgggagc caaggcagta tccagcgaga ctctggcctc tggctgggct gagtgacttc 840
ttttccccca gtgcctttga actctctgca cccaactcag ccatgagcaa tgctgtcacc 900
agcaatgggc agaggggctg gggcaagagt gggatggaaa gaatactgga tgtggagacc 960
aaatgtgaca gtgtccttgc ccggctgcct gctttagatc tcaggggaca cgccatttcc 1020
tctccgataa actctaagct cttagggtaa cccatggacc tgcctggctg ggtctttgtt 1080
gacatttaca aggagcctct cccgcagccc tccaaggggt ccctctcccc tgcaggctgc 1140
atgcccagtt ctccctggac ctccccaacc ccctctctac taacccccgt ttgaacagga 1200
agacacagcc tgagccaggt ctcccctcac aaatctcccc accagggctg gatcgcgcaa 1260
caaatagagc crgccccagg gcactcgccg gcagggcgca gccggtgatc gtcacagtcc 1320
ttcgaaattc ttaagatcta ggtcttgctg cacccccaca acctacaaac agcgtcgggg 1380
ccttctctgc acctccagtt cccagctcac ctccctcagt gtcacagccg gttacctttc 1440
cttcctccct ggcaagggag ggcaagactt ggggcttgct gactccaggc ccagcccagc 1500
ccggggcacc caggagcccc tcaattgcta ctcaaacaag acaagaagcg gcccgagtta 1560
gtggccagct ccaccatgca ctacacatcc tgacctctct gagcctctac tgtcactcgg 1620
ggtcacaacc ctttcctgag cacctcccgg ggcagggggc gatgacacac atgcagctgc 1680
ctgggggagg ccggcggtgt cycctccttt ctggaaagcg gagggtcctg gtgggctctg 1740
gaaacgcagc ccagaccttt gcaatgctag gaggatgagg gcggagacct cgcggtcccc 1800
aacaccagac tcccgccgcc accgcgcccg gtcccgccct ccccactgcc cccccagctc 1860
cccgacccag gcgccccgcc cggccagctc ctcacccacc ccagccgcga ctgtctccgc 1920
cgagcccccg gggccaggtg tcccgggcgc gccacgatgc ggccgcggct gtggctcctc 1980
ytggccgcgc agctgacagg taaggcggcg gcgcgcgggc tacccaaggg tctgcgctcc 2040
cggggcctga gcggggaggt gataagtggc tgtcctggcc ctggtcctgg cagggtgcag 2100
cgtcgagccc gcggtggcgg ggcgcccggg aggcagcttg gcaggcacgg tccctaaggg 2160
tggaaataaa atacccccat atcgcattac cccgggggac cggagagccc ctggactgag 2220
gccacctccc ctcaaaagcc tggacgcagg agaaggggag gcagtgaaaa ggggagcgag 2280
tgagggaagg aaagagaggg tcgctggagg tcaccagggg aaggaaacag gtccctgccc 2340
agggtccccg caggatgtgc tcggaggaag gttggccagg ccatgggtcc tgtggacaca 2400
tttttattac ttccggggaa gtgtttgtag tacaatcaga caaacatcgg gcgttctcag 2460
ttctcggagg gctagggcag ggtgatccct ctggctcccg ttctccctga tgtcgctggt 2520
gttgggtgtc atgggtagcg tggctcccta ggaagcagcc tggaggttgg gttgttggag 2580
ttggatgggg catctggatt gtccttctga ataagcccag ccagactgcc ttttggaaga 2640
agcctccaca cacccggaaa actacccaaa ctggtcgatt tgctctcgtg cccaaaaagc 2700
ccaaagctgg tcatcttgcc agggggtgac aaggcctgcc cgccgggggt tctggcccag 2760
tgagtgcaac atcataaata gaaacagccc aggccgttca gagcactaaa gtcattactg 2820
atggatctag aaacatcagg tccctctgag aatggaattc ctgggttacc gaggggaaca 2880
tgcagtgagg cctggctcca tgtccagcac acagcagggc cttggccaca gcccggagta 2940
ttcagttcct aggggacaaa aagcaagtgg gccccgggaa gagccggggt gtgtctcagc 3000
caggagagga aatgcacact cacagcccag gccttgctct tacaggagtc gcttgnnnnn 3060
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3120
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngttct gatccttctc cttgagattt 3180
aatttacctc cagtaacaac cctgtgatat gagacacagg gacagtattt acctgtgtac 3240
atggccatac agtttacagt gtgctttttt ggacagcatt tcatttattt ccaaccctca 3300
gaggcaggca ggacaacagc cccaagctgt cctccgttca taagaagaca gaggctcggt 3360
gactggcctg aggtctcaca gctggcacgg ccagaggctg ggttcagggc caggtctgtg 3420
agtcctgctc tagctcctca tgaataagcc cctgcttgcc gggtgcttct cgtcagagtc 3480
taagatgaac tcccagccct gcttctgtgg tgtctgtcct tccactgggg aatagggatc 3540
cagtgaccca tcagttgctg ggctcggggg tcatgggctg taattgtacc taccagggtc 3600
tgtccagcaa cggacagacc agccacatgc tctgctgtga ttctgggctc ctctcccagc 3660
ctgtcctggg tctccttcgg cagtttggag cctaccgaag ggctgtacat ccagtggcag 3720
ccaggggagg tgaaaggcaa ccagctttgg cttcagactt caaatccttg agtttgactc 3780
ctaggccact tacatactgt aagtgggact ttgaacaagt aacttcatgc ctcagtttcc 3840
tcatctgtgt aatgaggatt aaaaatcctg gatctatcct tttgtggtgg tacatgccta 3900
tactctcagc tacttgggag gctgaggtgg gaagatagat tgagcccagg aggtcaaggc 3960
tgaagtgtac tatgatagtg cctgtgagta gccactccac tccaacctgg gcaacataac 4020
aagaccccat gtcttttaaa aaattccaaa gccagtttga ggcttgattg agttccttta 4080
tgcaagggcc aggcatataa gtacacaata aacaaatggc agctctctcc cctgtacctt 4140
tgtaaagctg aacttagcaa acacctccct tccagatgat ctcctgggag gtggggtatg 4200
tgaactctga gtccaggagc caacagctgc gctcaacaca ctccctggac ccagtaactg 4260
ggcaggtcct tccatggctt ttcctttgac acttgactca gtgtgactgc aaggtcccac 4320
agctgtggct aggaaaatgt gtgatgtctc tgttcttggc ttttcctagt tctccatggc 4380
aactcagtcc tccagcagac ccctgcatac ataaaggtgc aaaccaacaa gatggtgatg 4440
ctgtcctgcg aggctaaaat ctccctcagt aacatgcgca tctactggct gagacagcgc 4500
caggcaccga gcagtgacag tcaccacgag ttcctggccc tctgggattc cgcaaaaggg 4560
actatccacg gtgaagaggt ggaacaggag aagatagctg tgtttcggga tgcaagccgg 4620
ttcattctca atctcacaag cgtgaagccg gaagacagtg gcatctactt ctgcatgatc 4680
gtcgggagcc ccgagctgac cttcgggaag ggaactcagc tgagtgtggg taagaagcag 4740
gctcaatgct atcagtgagc accgattgtg tgccaggcac gtgccaggca ctgggaccac 4800
caggcttcag tgtgccccac tctgcagccg tgactaatgg cactgctgct aatagtaaca 4860
gaaagaacat gtggagactt acccaggcca agcccctcca agtgtttaca tagttagctt 4920
gcttaatgct gccaaccacc ctgaaggtag gtctattacc taaccacttt aggtgggaat 4980
aagatgaaac tagaagagac gggccagagt cagagatgag cattgtgctt ctctttttta 5040
tttatttatt attattattt tttttgagac agagcctcac tgtgttgccc aggctggggt 5100
gcagtggtgc gatcttggct cactgcagcc tctgcttccc gggttcaagt gattctcctg 5160
cctcagcttc ccgagtagct gggattacag gcatgagcca ccacacctgg ctaatttttt 5220
gtatttttag tggagacgag atttcaccat gttggccagg tgggtcttga actcctgacc 5280
tcaagtgatc cacccacctt agcctcccaa agcgctagga ttacaggcgt gagccaccat 5340
gcctggccag gcattattct tcttatgggg acagggcagt gctgtccttc aggccacatc 5400
agggacattc aaagctacgg ctggattggg ctgagcccct tggccttata gtggtgttag 5460
aaatccccag agtgtgcaca cagggaaagg aggccctcac tgccctgata tacccagtga 5520
gggcatttct aggggcaggt gcccttatgt tctctgtgag ggcctacagc tcgaattcat 5580
acctgagtcg aagttagtaa ggagactgag ccaggcccag ctctgcttgc aaacttgcca 5640
tgctttctcc cctgggcctc agtgttctct tctgtgtcac acgggggtgc tgatggcctc 5700
catgacccac ttaatcccag agaagctgca gacctctgac ttaagtcagc aagtccagca 5760
gacgcacatt tcaagccaca gatgaaattc taaattttta aagtcttgtt taaaaaagca 5820
aaaagaagca agtaaaatta atttaaataa tgttatattt aactcaattt attaactata 5880
ttttcatctc aacatgtaat caatataaaa agtattgctg aaatatttta cattcatttt 5940
tcatactaag tgttcgatga gcattttaca taaaacatat ggctcatctc gattcagact 6000
ggccacattt catgtgctca gcagcacctg tggcatattg gacagaaggc atttagttat 6060
gggtggtaac tctcacagcc tggctctggc tctagcccca cctccagctt ggcccaaggc 6120
tggagccaac cccctccagg gctcccactg ccctgcttcc tgctcacttg agggcactaa 6180
aagccacaag gggacccaga aattagacca ctcagcgtga ggaagtgcag gggcagctgg 6240
ggacagcagc acaattagga agacacaaac caaagtgatg ccccgccacc tcttgctagc 6300
ctgggagggt gtattgcagg caagaagctg aggcatccct tcacgtgggg gtccactgat 6360
tttcgtattg aaaaatggac tttgggagtt tggggtttgg ggtttggggt ttggntttag 6420
cttattgttt ttgtctctgt aagccccaca cctttccact catgagattt cagagtctga 6480
gaaggtggag ggtacaataa acacagctag tttccagagc ttcccaccgc ctccatccca 6540
accgcactca ctcctgactt ccgtgtttcc aaaccccaaa cccctcccag cactatagga 6600
atgtcaatgc ctctctccag ctctggcttg cagccaaacc tgcttctccc cagggcttgc 6660
aaccagacct tcttcggagc cgaaccccac cttctcaccc aagaaaggcc ttttagagga 6720
caaagctggg atggttgaga aagtgtttgg ggaaagacag ggcctttttc aggcccttaa 6780
gtatatcatg ggctcgaagt tttattcctt ttaagaacag agagggagag attaaactgg 6840
gtgctcagga ggaatccagg gggacctggc tctaggcaag aagaatttaa aacagaacag 6900
tcccccaacc tgagtctccc actagaccca ggcggcggtg cccagccaag gcactgaggg 6960
cccaaagagt tggctcccct ctgggctcac cactgaccat ctgaaagacg tccctgcttc 7020
ctcgggtaga aaataagtca aacagaacta cttctagggc catgaggatt gaaggaggca 7080
acactcccag gagagggcca ggctcgttgc acgctctccg accctgctga tgacagtttc 7140
ctcttacaat agttgccctc agcactatga tgacccaggg ccttgggtgg acctaaagtg 7200
ttcaactttt gtcagaaaat ctttgcacgt gaggtagtgt ggcagaacga gaagcacagg 7260
ttctagaatc aaggtctttt ggtgcagata ctggctctgc agccagtggc tgtctaactt 7320
tggacacatt atttcagctc tctgagccta ggcttcctcc tggataaaat ggggacaaca 7380
gtgcctgccc caaaagttgt tgtgtccagt aaacttatgc tgaaaggctc agcactgctc 7440
cccacacatg gttggagctt agtgcacttt catcctagtt gcttcttccc atcaatgtct 7500
tgaagcagac aaacagatcg tgttctctcc gctttccaga ggaggctcag agaggtgagg 7560
ggttaaaatg tctactttta tatagaagat gccagcccaa aaatgactga tctgtgggct 7620
tcccctgcct gttccccctt acaacccccc aaaacctttt ttttttttga gacggagtca 7680
ctgtcaccca ggctggagtt tagtggcagg atcttggctg actgcaacct ctgcctcaca 7740
ggttcaaacg actctgctgc ctcagcctcc tgagtagctg ggattacagg cacgtgccac 7800
cacgcccaac taatttttgt atttttagta ggcacagggt tttgccatgt tggccaggct 7860
ggtcttggac tcctgacctc aggtgatctg cctgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt 7920
acaggcgtga gtcaccgcgc ccagccttaa tatttctttt cttttctttt ttttttttct 7980
gtccccctga ctctagagtt taggttcatg gtgtctcctt actccctctc ctaccatttt 8040
ggagaaaatc agtgcagaga gatctgtttc cttaacccac aaaggcaagg gttggactct 8100
gtggccagca gtgccccctt catccccagt aggcatcaga gccacagctg tcttcctttg 8160
ctctgggtgc tggcccactg cccctcccaa cacttcagca ggggtcactg ggtaaaaatg 8220
aaggagaggg gtgacccatc caggagtcag gacaggggtt tggggtccca acacagcact 8280
caccacttgg ggctgcaggg gccagctccc ctcatctctg gcgttcacct ttgaaattaa 8340
agtttgagac tgaacttccc ttagctctgg tattatatat atattttagg gccatctgag 8400
aaggaaaacc aatccccaaa tatgacacct gtgtggtact ctacatgcag aaaagggcac 8460
cccctccttc catgagcttc ctccatgtgc ttagggaatg ccgagttggg cggaggggct 8520
cgttgtgcca aaggctgggc gatccagccc tggggctcaa ggtcttcagc caggtggagc 8580
cacatctact gaaacttttt ttggacacac tgtccctttc attctcagat aatcccaaga 8640
aggaggtggc agttatcatt atttcagcag ataaggaaat caaggcacag aaaaatgcta 8700
tgacttgtcc caagtcacac agcggttaat caggggtgta ggtcggccgg gtgcggtggc 8760
tcgtacctgt aatactagca cttttggagg ccgaggtgag tggattacct gagatcagga 8820
gttcaagacc agcctggcca acatggtgaa accccgtctc tactaaaaat acaaaaaatt 8880
agacgaatgc agtggcacga cgaatgcagt ggcacgacga atgcagtggt acgtgcctgt 8940
aatcccagct actctggagg ctgaggcagg ataattgctt gaacctggga ggcaaaggtt 9000
gcagtgagcc gagatcgtgc cactgccctc cagcctgggc tacagagcga gactttgtct 9060
caaaaaataa ataaataaat aaataaataa aaataaataa atcagaggtg taggctctgc 9120
tcagttctgt gtggctccag agccttcctc tctccaggac accaagctga accccatctc 9180
taggccctca cccctttccc aacatctgag aattcagaaa gcagatcaaa cattctattg 9240
ctctgtgacc ttcaagccct gtagcagcct ggggaacagt cataaggact tcagtacttg 9300
gatgtaagac aaattttgtt catttgttca tttatttgct cttgagacag ggtcttgctc 9360
tgccgtccag gccagagtgc agttgcatga tcatggctca cttcagcctt gacttcccaa 9420
gctcaggtga tcctctcacc tcaccctcct gggtagctgg gacggtaggc atatgccacc 9480
acgcctggct aactttttat ttttgtagag agggggtttc accatgttgc ccaggctggt 9540
ctcaacctcc tgagctcaaa tgatctcctg ccttggcctc cggaagtgtt gggattccag 9600
gcatgagcca ccgcacccgc cataagacaa agttttgtct ttgagtccac gtggtgttca 9660
cttggctaag atatgtgtct trctttcttt ctgtagttga tttccttccc accactgccc 9720
agcccaccaa gaagtccacc ctcaagaaga gagtgtgccg gttacccagg ccagagaccc 9780
agaagggtga gttccctatc cctctgcacc ctcagaaaca aggcagacat ccccttgccc 9840
tccctccctc ccctccttcc ttccccaggc actttccaag tgtcaactct agagcctatc 9900
tccccggcct aagctagggt cagaaaggat gctgagtgtg ccagcaactc acagtctcgt 9960
gggagacaga ctcataaatt gttactggac aaagcttaat ggaggagatc tccacccaca 10020
cccctgcaca caaatgtcca tagcttcatt attcatacta gccaaaagca gaaactaccc 10080
aaacatccac cagctaatga gctgattaac aaaatgtggc ttatttatta tcgtggaata 10140
ttgtttggcc ataataaaga ataaaatgaa aggagccagt cacaaaaatc catatactat 10200
atgattccat gattatggaa tatccagcat atgatcctct gtagagacag aatgtagatt 10260
ggttgctgcc taaggctggg ggcttgggaa agaaatgggg agtgattcct aatgggtata 10320
aggtttcttt ttaggggaat ttaaatgttc tgaaattaca ttatgataat ggttgcacaa 10380
ctccatgaat acactaaaaa ccatgacatt gtacacttta aacaagggga ctttatacgt 10440
aaattataac tcaataaagc tgttaacaaa caaaaaatcc actcaaagga ccagcacttt 10500
aaacttttcc agttttggcc agatgtggtg gctcacacct gtaatcccag cactttggga 10560
ggcccagatg ggtggatcgc cttgagctca ggagttagag accagcctgg gcaacacggt 10620
gaaactctgt ctctacgaaa atgtaaaaaa attagctggg cgtggtggca catgcctgta 10680
gtcccagcta ctcaggaggc tgaggtggat gccttgagcc tgggaggtgg agattgaagt 10740
gagctgagat cctgccactg cactccagcc tgggtgatag agccagnnnn nnnnnnnnnn 10800
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10860
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnttaa ggccagttgc ggtagctcac acctgtaatc 10920
ccagcacttt gggaggctga ggcgggtgga tcacttgagg ccaggagatt gagaccatcc 10980
tggccaacgt ggtgaaaccc cgtctctact aaaaatacaa aaattagcca ggcatgacgg 11040
cggacgcctg taatcccagc tacttgagag gctgaggcag gagaatcgct tgaacccaga 11100
aggcggaggt tgcagtgagc caagattgcg ccactgcact ccagcctggg cgacagagcg 11160
agactgtgtg tgacagagcg agactctgtg tcaaaacaaa caaacaaacg aacaaaccct 11220
atatgtatat ataaaaatta cataggcatg gaaagagaaa gttactaaat tatcagtggt 11280
gattaattct gtgaaggagc aaagatgtca gggagcactc taatcctata tttaaatgtc 11340
ttacaatgaa aatatattca gctatttctt gtgaaattaa aagttttaaa aataaatagt 11400
aaaagactca ttaccaggca tgaaaattgt ctacttctta aaaatttgaa tgtgggacat 11460
gaaattttat aataaaatga tttcaataat gtttaaagtg cttacaaaga ctagacgatg 11520
gccggacatg gtggctcagg cctgtaatcc cagcactttg ggaggccaag gtgggcggat 11580
tgcttgaggc caggagtttg agaccagcct ggccaacatg ataaaaccct ctctctacta 11640
aagatacaaa aattagccag gcatggtggc acatgcctgt agtcccagct actcgggagg 11700
ctaagaacga gaatcccttg aacccaggag gcggaagttg cagtaagctg agaatgcacc 11760
actgcactcc ggcctgggtg acagagcaag actctgtctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 11820
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ctacaggcac atgccaccac acatggttaa tttttgtatt tttagtagag acggggtttc 25800
accatgtttg gccaggttgg tctcgaaccc ttgacctcag gtgattcaac cacctcggcc 25860
tcccaaagtg ctggaattac aggcatgaac cacccaggcc cggcctactt ttaatttatt 25920
ttttattttt gagacaaggt ctcactctgt cacccaggct ggagtgcagt ggtgcaatca 25980
cggctcactc tagcgttgac ctcccaggct caggcaattc ttccacctca gcctcctggg 26040
tagctgagac tacaggtgca caccaccaca cctggcaaat ttttgtattt attgtagaca 26100
cggggtctcc ttatgttgcc caggctggcc ttgagctcct gggctcaagc aacctgcctg 26160
cctcagcctc ccaaaatgtt gggattatag gcatgagcac catgcccagc cctttttttt 26220
tttttttttt tttgaaatgg agtctcactg tgttgcccag gctggagtgc agtggcgtga 26280
tctcagctca ttgcaacctc cgcctcccag gttcaagtga ttctcctgcc tcagcctcca 26340
gagtagctgg gattacaggt gcccaccacc acgcttggct aatttttata tttttagtag 26400
aggcagggtt tcaccatgt 26419
<210> 2
<211> 14483
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> allele
<222> (2195)..(2195)
<223> PS5: polymorphic base guanine or adenine
<220>
<221> allele
<222> (2197)..(2197)
<223> PS6: polymorphic base cytosine or thymine
<220>
<221> allele
<222> (2382)..(2382)
<223> PS10: polymorphic base guanine or cytosine
<220>
<221> allele
<222> (5804)..(5804)
<223> PS13: polymorphic base guanine or adenine
<220>
<221> allele
<222> (5809)..(5809)
<223> PS14: polymorphic base thymine or adenine
<220>
<221> allele
<222> (6196)..(6196)
<223> PS16: polymorphic base cytosine or adenine
<220>
<221> allele
<222> (6688)..(6688)
<223> PS17: polymorphic base adenine or guanine
<220>
<221> allele
<222> (8299)..(8299)
<223> PS18: polymorphic base cytosine or thymine
<220>
<221> allele
<222> (8462)..(8462)
<223> PS19: polymorphic base cytosine or thymine
<220>
<221> allele
<222> (8498)..(8498)
<223> PS22: polymorphic base cytosine or thymine
<220>
<221> allele
<222> (11587)..(11587)
<223> PS32: polymorphic base thymine or guanine
<220>
<221> allele
<222> (11963)..(11963)
<223> PS38: polymorphic base guanine or thymine
<220>
<221> allele
<222> (12174)..(12174)
<223> PS40: polymorphic base guanine or adenine
<220>
<221> allele
<222> (13575)..(13575)
<223> PS43: polymorphic base cytosine or thymine
<220>
<221> allele
<222> (13914)..(13914)
<223> PS47: polymorphic base adenine or thymine
<220>
<221> allele
<222> (14309)..(14309)
<223> PS50: polymorphic base cytosine or guanine
<400> 2
cgccctttca actctgccaa gaatggctcc cacctggctc tcagacattc ccctggtcca 60
acccccaggc catcaagatg tctcagagag gcggctagac acccagagac ctcaagtgac 120
catgtgggaa cgggatgttt ccagtgacag gcaggagcca gggcggagag gcaggtaggg 180
atccatccac gccgttttct caggcttgct tgctagtgac ccttcctcac tggaataaac 240
tccttaccct atttcggccc tagtttccag aacgtactca tttttatgta agcaattagt 300
tcctacagtg cataaataat aaagcagtgt gctaagtgct agggatgagg ataacaatag 360
tgaataagac aaatcctgac ttaaatttgt aattaataag gaatctaaaa tcctaagagg 420
ggagatagat tgaccaccag ctgatggtaa agcatggtat gaggcaagat gaagaagtgc 480
aaactagagg tagagaccca gcactgtggc agtgtgggtt cattctgatg gaagaaagcc 540
tttacagagg acatgctgtg ggagctggcc atgctgtcgt attatctgta aacattctta 600
ttcttgtttc atgtgtcttt tcccagatgt actgggatat cattctgcca ttttgctcca 660
gaataggatt acattagaag aagcagcatg atgaagaagg aatactagac tgggtgtcag 720
gagacagaga ctctatttct agtttggcta ccagctagag gacatttggc aagtcactta 780
atttccctag cctacagatc gctgctacta aagaaaagaa agaaagagcg agccagatat 840
ggcggctcac acctataatc ctagcacttt gggagctgag gcaggaggat cacttgagcc 900
caggagttca tgaccagcgt gggcaacaaa gcgagactcc gtctccacag aaaataatta 960
gctggctgtg gtggcatgca tttgtagtcc tagctactca ggaggctaag gtggtaggac 1020
cccttgagct cagaagttga agactgcagt gacctatgat ccagccactg cattgaggcc 1080
tgggtgacac agtgataccc tgtctctaaa aacgacaaca acaacaatct cttatagtcc 1140
tgggtctcag agagctgcct caggagccat gttccaagct ggattaaact tcacgtgaca 1200
ttggtagacg atttctctaa aggctggcac tgtgttattt atgtactgtt ctctcagact 1260
cctcataaag tatacctaac actcaataaa tgcctttttt tttttttttt ttttttgaga 1320
tggagtctca ctctgtcgcc caggctggag tgcactgggg agatcttggc tcactgcaag 1380
ctccgcctcc caggttgacg ccattctcct gcctcagcct cccaagcagc tgggactaca 1440
ggcacctgcc accacgccca gctagttttt tatattttta gtagagatgg ggtttcaccg 1500
tgttaaccag gatgatctcg atctcctgac ctcgtgatcc gcccgcctcg gcctcccaaa 1560
gtgctgggat tacaggcatg agccaccgcg cccagccaat aaatgccttt taactagcac 1620
ctggcctcac catattgata ctggaagctt acgacctctc tatgcccatt cctccctcaa 1680
acttcttgcc cttaaattag aattgagaag tccctgtgtg ttcttccaac ctttccactt 1740
aaaatgtgtg gcctaaaaat aaaaaaataa ataagacaaa aaaaccacca aaaaacaaaa 1800
agaatgtgtg gcctaatgat atacacattt gatgttgaat cctcctgtat gtagctctct 1860
ctagggagat catgttccac gatctcagcc agactttagg tcctgtgagt ccaggcactg 1920
gactcaacat gctcaatagg gctttgatga atgatgatga tgtcaatgca gacatcccca 1980
taccccagct tcagcacccc cttcacctcc ccacacggaa gcagaggggt cctcttttcc 2040
ttctcctggc tatgtttatg ccctcaacta tccttccagc actggagaca agtctcacct 2100
gcactaacct gtctttgaag gtcctggggg ctggaggggt cacaggccct gagccagcag 2160
gctgaggtga tcgttcggca gctgcaagag ctgcrgyggc tggaggagga ggtccggctc 2220
ctgcgggaga cctcgctgca gcagaagatg aggctagagg cccaggccat ggagctagag 2280
gctctggcac gggcggagaa ggccggccga gctgaggctg agggcctgcg tgctgctttg 2340
gctggggctg aggttgtccg gaagaacttg gaagagggga gscagcggga gctggaagag 2400
gttcagaggc tgcaccaaga gcaggtgaat gcaggggtag aaaggattca aattcataac 2460
ggagagctgg gcagtagctt ccaagcaaag aacaggtatt gcagaaaaga ccctccatga 2520
gtagtgagta gtagagtgat gagacctttg gtgaaaataa acacacatgg gctagaaaga 2580
tggagaattt gggtactttt atcttaattc aggttgcact tttcccccaa gactcaggtg 2640
gcctcccacc acttgaagcc ctgcttccct ttctagtagg aaatagtttg cctccctact 2700
ttactccagg taccaattca tcaggggtat tgtggagggc agtgaggaag gtgggtataa 2760
gggggctatg gtggactggg agagagagat tattcagtcc tcaaactcag tacttactct 2820
gccatctcta agactcagtg accaaattag cctgagtcct gccttcgtgg atggaactga 2880
cagcctcgtg ggggatatac acatccacat ttaatttaat cataattaat tgcaatcagg 2940
aggaatgcct tgaaggagaa ggactagaaa gcactaactt agtctggggt tcagggaagg 3000
ccactgtaac cagttgacat gtcaaggaaa gaaaccatag ccctgggcgc agtggctcac 3060
gcctgtaatc ccagcatttt gggaggccga agcaggcaga tcacaaggtc aggagttcaa 3120
gaccagcctg gccaacatgg cgaaaccctg tctctactaa aaataaaaaa attcaccagg 3180
catggtggtg cgcacctgta atcccagcta cttgggaggc cgaggcagga gaatcacttg 3240
aacctgggca gtggaggttg cagtgagccg agactgtgcc attgcactcc agcctgggcg 3300
acagagcaag actctgtctc aaaaaataaa ataaaaaagg aactgggaga aaacaaggga 3360
gaattccttt ataaccttgt agtgggcaag gcctttctac ctgtgagtca aaatccaaaa 3420
tctagaagcc ataaaggaaa aaattgatcc attgacttta taacatgaac attaggaata 3480
gccaaaaaga aaaaaaaaag ctatatttat agctcagatc acaagaaaag ggtaatatcc 3540
ctaatataaa atgtgtgcct agaaattggt aagggaaaga ccagcaatcc aatcagaaaa 3600
tggacaaagg agatttatga aagaaactta gaaacaagaa gctaggccag gcacagtggc 3660
tcatgcctgt aatcccagca ctttgggagg ccgaggtggg cggatcactt gaggccagga 3720
gttaaagacc aacctggcca acatgaagaa ctctacaaaa aaatacaaaa attagccggg 3780
tatagtcgtg ggcgcctgta atcccccagc ttcttgggag gctgaggcag gagaattgct 3840
tgaacctggg agacagaggt tacagtgagc tgacatcaca ctccagcctg ggcagcagag 3900
cgagactaaa aaaacaacaa gctaccgttt gtgctgaata ggagttggcc agtgaagagg 3960
cgtgtgaagt ccagtggtag ctggaagaca cttggtggga caacaggtga aggcggggac 4020
aggaggccag aaggctgggg cacagagatg aggggcactg agtgtgctgc agagcccagg 4080
acccagggca caaggctttg gccacttcag aacttgctac tttcccataa gagcaatgag 4140
caggctgggc acagtggctc atacctgtaa tcctagcact ttgggaggcc aaggtggaag 4200
gatcatttga gcccaggagt ttgagaccag cctgggcaac aaagcgagac ccccatctct 4260
attttatgga agaaattagg gctgggcatg gttgctcaca tgtgtaatcc tagcactttg 4320
ggaagctgag gcgggtggat cacttgaggt caggagttcg agaccagcct ggccaacatg 4380
gtaaaacctc atctctacta aaaatacaaa aattagctgg gcgtggtggc tcatgcctgt 4440
aatctcagct actcgggagg gtgaggcggg agggtgaggc aggagaatcg cttgaacctg 4500
ggaggcagcg tttgcagtga gctgagatcg tgccattgca ctccagtcta ggcaacaaag 4560
tgaaactcca tctccaaaaa aacaaacaaa aaaaaattgt tttttcaagt aataagcaac 4620
cgttgaaagg ttgttttttt ttttttttga gatggagtct cgctctgtcg cccaggctgg 4680
agtgcagtgg cgcgatcttg gctcactgca agctccgcct cccgggttca tgtcattctt 4740
ccgagtagct gggactacag gcgcccgcca ccacgcccag ctaatttttt gtattttaat 4800
agagacgggg tttcaccgtg ttagccagga tgatctcaat ctcctgacct tgtgatccac 4860
ccacctcggc ctcccaaagt gctggaatta caggaatgag ccactgcgcc cggcctgttg 4920
aaaggtttta agcagggaaa taacatgatt agatttgtat tttatgtcta aaaaattttg 4980
tcatttatgt cccccaaatt aattttattg ttgtatggag acagggctag aggaggcaga 5040
ccaggaagca gggtgggcac tttgccctcc tttccagtcc atcccatgac tcttggtggc 5100
tctgacaccc ctgcaacact ttgaggtgcc atgagcaaaa gacacaaaat tcctcctttc 5160
ctggagcttt ccttccagtg tggtccgaca gatagtaaca catacacata agcaagatat 5220
ggtcagtgct aagtgctcag gaggacgtga acagctgatg gggcagagta gggtggggag 5280
ggacagtatt agagggccca gtgaagccac cctgaggagg ggctatcgcc tggggtctgt 5340
ggagcaagga ggggccgctg tctggttctc agcagactcc ccgtggccgg agcggggagc 5400
agtgggagag cctccagggt gagctcagga ggtaggcaga ggccgggtcc cctggcctgc 5460
aggtgtggag agacacctgg gttttgttgt gaatgctgtg agaagccact gagggtttgt 5520
aaagactagt taggagatgg tcgctgttgc ccaggcaaaa gatgagggtt ggtggcagtg 5580
gagacggaga cagagaggtg aagatatgtt ttgggggaga tcggacaaga actcctgatg 5640
ggttgtgggg cagctgcgga gagtgagttg ccagctctcc atttgctgtg cacagttggc 5700
tgattggttg ggtcattctc taaggtcaca gaaagtggga gtgaagggaa caaggaaggc 5760
ctccatgtgg ggtcgagcct ctgctgagcc ccctcttctt tccrcagcwg tcctctttga 5820
cacaggctca cgaggaggct ctttccagtt tgaccagcaa ggctgagggc ttggagaagt 5880
ctctgagtag tctggaaacc agaagagcag gggaagccaa ggagctggcc gaggctcaga 5940
gggaggccga gctgcttcgg aagcagctga ggtaggtggg cggacgccga cgggagccca 6000
gcaattagtg atgtggtgga tctgcagggc gccccactga tggctgtccc attcccaccc 6060
caaccctagc aagacccagg aagacttgga ggctcaggtg accctggttg agaatctaag 6120
aaaatatgtt ggggaacaag tcccttctga ggtccacagc cagacatggg aactggagcg 6180
acagaagctt ctggamacca tgcaggtgag ggtgcaggaa tgtatctgtg tgcagactta 6240
gggatcaggt tgggaggcaa gcgtggccct tggaggagcg tgtagagcac agcctccggg 6300
agagaaggtg gtacctaagg cggcatggag gccctacaga ggggctgctt tcctctgccc 6360
gcagcacttg caggaggacc gggacagcct gcatgccacc gcggagctgc tgcaggtgcg 6420
ggtgcagagc ctcacacaca tcctcgccct gcaggaggag gagctgacca ggaaggtaca 6480
gcccaacccc cagacccctc accctcagcc gcatcctgca tctactgtcc cctgcctccc 6540
tccctgtggg caggaggggt caatgtgccc cagaacctgc ttagatctcc ttcctgtgaa 6600
ctcctcttgc tgtagctcat gttgcccagg caggacagag gagaaacaaa gatgccacct 6660
ccttcctctc ctcccccagg agcccacrct tttctcccac tccttctccc tcaggttcaa 6720
ccttcagatt ccctggagcc tgagtttacc aggaagtgcc agtccctgct gaaccgctgg 6780
cgggagaagg tgtttgccct catggtgcag ctaaaggccc aggagctgga acacagtgac 6840
tctgttaagc agctgaaggg acaggtcact gcactctctt ttctcccggt attccctccc 6900
agcaccttgc tccttccatg aaggtggcat ccattcaacc agtgtttatt gagtggttgc 6960
cacatgctgg gcacacagcc ctgaacaaaa ctaaaatgtg gagcttgcat tctagaacag 7020
agacacagaa cacgcaagta aacagataat gttgggtaat tatatgtgcg atagaaagat 7080
tgaagccggg tgcagtggct cacacctata atgcgatcac tttggtctcc aactcctgac 7140
ctcaggtgat tcacctgcct cagcctccca aagtgatggg attacaggtg tgagccaccg 7200
tgcccagtca agtaatgcca acagtttggg agaccgaggc aggtggatca ctggaggtca 7260
ggagttcgag accagcctgg gcaacatgtg aaatcccgtc tctactaaaa atacaaaaaa 7320
ttagccgggc atagtggctc attcctgtag tcccagctac tctggaggat gaggtgggag 7380
gatcacctga ggctgggagg tcgaggcgag gccacagtga actgtgatcc catcactgca 7440
ctctagcctg ggtgacaaag cgagatcttt tctcaaaaaa aaagaaagta gtaagaaaaa 7500
ttcaaaagat aatgtgacgg agagactgtg gggtgagtca gcctcaggta ggatgctcag 7560
agacagcctc tctgaggagg tgacagcatc tgaggagagt ggcatggtca gttggtgggt 7620
cttgtggggt gtgtcaaggg ctattcccat cttcgagtgg gcacatggaa tgtggaacat 7680
ggaacactgg gctcagattc catcctcaga acctaagctt ctgtctccct gcgtggcatt 7740
cattcttttt cttttctttt cttttttttt ttttttttga gaaggagtct tgttcttgtc 7800
acccaggctg gagtgcagtg gcctgatctc agctcactgc aacctccgcc tcccaggttc 7860
aagtgattct cctgcctcag cctcccgagt agctgggatt acaggcacat gccatcacgc 7920
tcagctaatt tttgtatttt tagtagagac aggctttcac catgttggcc aggctgatct 7980
tgaacccctg acctcaagtg atccatctgc ctcggcctcc caaagtgctg ggattacagg 8040
tgtgagccac cgtgctgcga cccacccccg tcgcccgccc tccctccccc cagcccctgc 8100
atggcattct tacagagatc tctgcacctg ccactttgct tccagtgccc ccctcatctt 8160
ttagctctag agggccctgc ccagctctct ctcctccccc aggtggcctc actccaggaa 8220
aaagtgacat cccagagcca ggagcaggcc atcctgcagc gatccctgca ggacaaagcc 8280
gcagaggtgg aggtggagyg tatgggtgcc aaggttggtg tcagcctact agagactcgg 8340
ggagggcaag ggagcccctg ttccggggct gcagccagga cttagggagg gaccctgtcc 8400
tttgctgcat cctccccagg gcctgcagtt ggagctgagc cgtgctcagg aggccaggcg 8460
tyggtggcag cagcagacag cctcagccga ggagcagytg aggcttgtgg tcaatgctgt 8520
cagcaggtat cagggatgga ggggtgggtg gagtagtgtt tctgccacct caggttcctg 8580
ggcaccttgt tgctgaggat cctcaggcaa gaggggctgg aaagtggcca ctggaggcta 8640
cagggctggg cagatttagc tctatcaatg ttcctgtgtt cgtttctttt cctggggaag 8700
ccccttctgc attcatacct gattgcttgt tatgaatttc ccgttgcatg tttggctgga 8760
ggtgaggcct tgcttcctcc tgcagttcag tctagtaatg gcttgagcta aatagagcac 8820
ccgggaggat cttcacttgc agtattgttc aaggatggag agtgtagaca cttcatcttc 8880
cttttttttt ctaaaatttt acgggcaatc cgtttcactg gagaaaaatt tagtctattt 8940
atttatttat tttgagacaa agtctcgctc tgtcacccag gctggagtgc aatggcacaa 9000
tcttggctca ctgcaacctc acctccctgg ttcaagtgat tctcctgcct cagcctcccg 9060
agtagctgga ttacaggcat cctccaccag tgtcctccac tacgcccggc taatttttgc 9120
atttttagta gggacggggt ttcaccatgt tggccaggct ggtcttgaac tcctgacctc 9180
aggtgatcca cccacctcag cctcccaaag tgctggaatt ataggtgtga gccactgcac 9240
ctggcctagt ctatttattt aaagctgtat acttacttgc ttattatata cttaacttgc 9300
ttactattcc atctaaaatg taagccagtt agtttccttc taaatcaatt gccagccttt 9360
gtctctccta ccaacttcct agttgtttca ttacctacaa ttgttgtatg accttcagaa 9420
aaacctctaa gaaaacagca aagcttcttt gtgctggtga tgacttcccc tcagccttag 9480
acactgaggt acccaaggca agtagttctt tttttttttt tttgagacag agtctcgcac 9540
tgtcacccag gctggagtgc aatggcacga tctcagctca ctgcaacctc tgcctcccgg 9600
gttcacacga ttttcctgcc tcagcctcct gagtagctgg gattacaggt gcacaccacc 9660
acacccggct acttttttgt atttttagta gagacagggt ttcactgtgt tggccaggct 9720
ggtctcaaac ttctgacctc gtgatccgcc cgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattac 9780
aggcttgagc caccgtgccc ggccggcagg tagttcttag cacagtctct ggcttgtaaa 9840
tgtttattgt tatcgtgagg ctcttcttga tgggttaatt tagataaaga taatttttgg 9900
tttagcgaaa ttaagatgca ggatgagtcc ttgcccacca cttccttctc ttgggtttgt 9960
accttaggga ctaatttagc tttaaaaatt atgaaaaatt tcaaacttgc acggaattaa 10020
actagttata atgacctacc acccaggttc aatccatcgc gggtgccccc tacctccagg 10080
agaacagaaa gatgcactgt ggacagggtt tgactttggt accaggtgat cacagaaatg 10140
gtctgtgtaa tgatgcattt gccgaaagtc ctccaggctt aaagcagtcc aaactctgat 10200
tgttgctggg tttattagat tgtctctagg taattggaga ctttaataag agctgtggta 10260
ggtgttggaa gcatctactg gaacaatttc cagatcaaag tgaactttgc tgtgctgctg 10320
gggatgcagc tgcaagcctt catcatcatg tgtttttctg tgggtgcaga cctggactct 10380
cctgaggaaa ccccagcccg gccccagaca ctccttggcc tcctcctggg gcctgtttaa 10440
gctgctcagt tttcatgagc caggttggtc ctacttctgg cacagccagc tggtaaagca 10500
tgtggacctg cccgtcattg gtgctagatc gacactcctg ggcttggaga ggataacttt 10560
gttttctttt gtttttttga gatggagtct cgctctgtca cccagtcttg agggcagggg 10620
tgcgatcttg gctcactgga acctccacct cctaggttca agtgattctc gtgcctcagc 10680
ctctggagta gctgggatta caggcatgag ccaccatgcc cggctaattt ttgtgttttt 10740
aagtagagag agtttcacca tgttggccag gctagtctcc aattcctgac ttcaggtgat 10800
ccgcccgcct cggcctccca aagtgctggg attacaggca ggagccactg cccctgacca 10860
gagaggataa ctttactctt tgatacacga tagtgagcaa aacacagttg tgagaaataa 10920
gcttaacagg ttgcttaaaa agatagtcat ttaatgcatt cttggggcaa gggtccttta 10980
gataattgac ggaagctgtg cgttctgtac ttgtataatg ggacaggatt agagggagtt 11040
gtctatacaa ggcacagcaa gtcctttggg aatgagggga ggcatggagg atcagtgact 11100
tgtgccctct ccagctctca gatctggctc gagaccacca tggctaaggt ggaaggggct 11160
gccgcccagc ttcccagcct caacaaccga ctcagctatg ctgtccgcaa ggtccacacc 11220
attcggggtg cgtaggacaa ctgcgagcca cgtcctgccc ccaccccacc agctcggact 11280
ttcttcttcc tgacccagct ctctctgatc ccacatccat tcaccttcct cctttcacca 11340
gtccttgcat ctctttttcc cttactccct gtccccactt tctcccatgc aaacttcatc 11400
tctttttctc cctgcttttt cccctccagg cctgattgct cgaaagcttg cccttgctca 11460
gctgcgccag gagaggtgaa gtttgtgcac tttgaggtgg atggggcttt agggcattgg 11520
ctgctgggac ccccaaaacc atgaggactg aggtgggatg ggggctttgg gatcaggcag 11580
ctgggtkatt tctcctgact ctttctcttc cccgtcccag ctgtccccta ccaccaccgg 11640
tcacagatgt gagccttgag ttgcagcagc tgcgggaaga acggaaccgc ctggatgcag 11700
aactgcagct gagtgcccgc ctcatccagc aggaggtggg ccgggctcgg gagcaaggta 11760
cacctggttg ccagagggtg gagaggatga ggaaaaaccc agtgtctagg gtgctgggag 11820
aggcctgacc cagcaccccc tccttttagg ggaggcagag cggcagcagc tgagcaaggt 11880
ggcccagcag ctggagcagg agctgcagca gacccaggag tccctggcta gcttggggct 11940
gcagctggag gtagcacgcc agkgccagca ggagagcaca gaggaggctg ccagtctgcg 12000
gcaggagctg acccagcagc aggaactcta cgggcaaggt gtcgagaggg aaatgggtgc 12060
ttcccttgga gggtggggtg ggaactgcga atcaaagctc ctgctgatat gccccgtctg 12120
cactttcacc ccagccctgc aagaaaaggt ggctgaagtg gaaactcggc tgcrggagca 12180
actctcagac acagagagga ggctgaacga ggctcggagg gagcatgcca aggccggtga 12240
gccttgccag ggtggatagg gccttccagg aagaaggaag tgttaagaca taaggttatt 12300
attttcccct caaagtgtgt tcaaagcttc attacaggaa gtaatgaagg tatccaggag 12360
tagcacagat gaattatcac atcgtgaaca cacccatgta gccagcacca gattaagaaa 12420
cagcatatgg ccggtcgcgg tggcttatgc ctgtaatcca agcactttgg gaggccgagg 12480
tgggtgtatc acctgaggtc aggagtttga ggccagcctg gacaacatgg cgaaaccctg 12540
tctcgactaa aaatacaaaa attagctagg cctggtggtg ggcacctgta ccccaagctt 12600
acttgtgagg ctgatgtggg aagactacat gaacccggga ggtcgaggct gcagtgagcc 12660
aagattgtgc cactgcactc aagcctgggt gatagagaaa gaccatgtgt caaaaaaaga 12720
attgtgtaat gaatgtatct tctctaacta aatatagcag ttaacatttg ccacatttgg 12780
tctcttatct atatacacac atatttgtac atcttttgaa tcactttaag ttgtaatcat 12840
ttaatgtttt gttgttgttg ttgtttgaga cagagtcttc ctctgtcacc agctggagtg 12900
cagtggcatg atcttggctc actgtgacct ctgcctcccg ggttcaagcc attctcctgg 12960
ctcagcctcc caagtagctg ggattacagg cgcccaccac catgcccagc tagtttttgt 13020
atttgcagta gagacgggat tacaccatgt tggccaggat ggtctcgagc tcctgacctc 13080
gtgatccgcc cgctttggca tcccaaagtg ctgggattat aggcgtgagc caccacgcct 13140
aagtaagttg taaacataag ttgttcagcc gcatctccca aagccagtaa attctcctat 13200
atagctgcaa tcatcacact ttaagacagt gaacactaat tgcacaaaat ctaacccagt 13260
tcatgttcag atttcccctg aggaactcca ggatggttca gggatgagga agatacttag 13320
gttcagattc ccaggctcct agagcatcag cccacccctc caactgtaca gaagagacag 13380
atccacagag cagaacagcc tccccaagcc acagagttgg tgacccagcg tttgttcctg 13440
tcttcatggt gcctggctgc ctctggcctg actcacacct gcctcctctg tgccttggcc 13500
tctctgtagt ggtctccttg cgccagattc agcgcagagc cgcccaggaa aaggagcgga 13560
gccaggaact caggygtctg caggaggagg cccggaagga ggaggggcag cgactggccc 13620
ggcgcttgca ggagctagag agggataaga acctcatgct ggtaggagac aggagggcag 13680
acaggcagac actagggccc atcctgggct ggttcctggg ctagaggtgt ggaaagagga 13740
tggtgaggga ggctctatcc gggctaggtt taaccctctc cttcccaggc caccttgcag 13800
caggaaggtc tcctctcccg ttacaagcag cagcgactgt tgacagttct tccttcccta 13860
ctggataaga agaaatctgt ggtgtccagc cccaggcctc cagagtgttc agcwtctgca 13920
cctgtagcag cagcagtgcc caccagggag tccataaaag gtcttgggcc aagcacaaag 13980
ggacaaggga caaatgcgcg cacttcagga atctcctctt cagactctgg catgatgagt 14040
gttgttctct gcggtccttc gaggccctta gcctctttta gcgatgccca gcttggacca 14100
aagagcctcc tctctcccat tcctcatttc ctgtgccagc cctgtttcct ctgtaaccac 14160
gagcaccttc ccttgtctgg tgctcatctg ctgtcttcct tcccagggtc cctctctgtc 14220
ctgctcgatg acctgcagga cctgagtgaa gccatttcca aagaggaagc tgtttgtcaa 14280
ggagacaacc ttgacagatg ctccagctsc aatccccaga tgagcagcta agcagctgac 14340
agttggaggg aaagccagcc tgggggctgg gaggatcctg gagaagtggg tggggacaga 14400
ccagcccttc cccatcctgg ggttgccctg ggggatacca gctgagtctg aattctgctc 14460
taaataaaga cgactacaga agg 14483
<210> 3
<211> 4416
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> allele
<222> (1128)..(1128)
<223> PS2: polymorphic base guanine or adenine
<220>
<221> allele
<222> (1402)..(1402)
<223> PS6: polymorphic base guanine or adenine
<220>
<221> allele
<222> (1792)..(1792)
<223> PS7: polymorphic base guanine or adenine
<220>
<221> allele
<222> (1863)..(1863)
<223> PS12: polymorphic base thymine or cytosine
<220>
<221> allele
<222> (2019)..(2019)
<223> PS16: polymorphic base adenine or guanine
<220>
<221> allele
<222> (2407)..(2407)
<223> PS20: polymorphic base cytosine or thymine
<220>
<221> allele
<222> (2873)..(2873)
<223> PS21: polymorphic base guanine or adenine
<220>
<221> allele
<222> (2985)..(2985)
<223> PS22: polymorphic base guanine or adenine
<220>
<221> allele
<222> (3159)..(3159)
<223> PS24: polymorphic base cytosine or thymine
<220>
<221> allele
<222> (3417)..(3417)
<223> PS27: polymorphic base adenine or guanine
<400> 3
gtttgagacc agccaacata gggagactcc atctatataa aaaataaaaa taaaaaacat 60
tggagggcat ggtggcgtgc acccatggtc ctagttactc cagaggctga gttgggagga 120
ttgtttgagc ccaagaggtt gaggctgcaa tgagctgtga tcgcaccact gcaccccagc 180
ctaagagagc gagaacctgt cctcactccc caaacaaagg gaagacgcaa catgatttgg 240
tgtacatttt ttttcctgag ggacttactg gatggtccct tccagagtga ggtacacata 300
tccacgcact gtggtcagcg attgctcccg gcacccagcg cagcagatgg gtgggtctaa 360
ccaggtcact tccccaggag ggcataattg agcagtttcc gcatcaggtc cacgtgggcc 420
agcagcatgc ggcaggcagc ggctgtggtg cttcaggccc agggcgtccc catcagcgta 480
cttggactgc agcagcccca ggtaggcctc ccacgtgttg cccacagtct tgctgcaggt 540
gaagcagcgc acacaactcc tgagctcaag tggtcctcct gtgtcagctt cccaaagtgc 600
tggcatgagc cactacgcct ggcctgatat atatatatat gttttttttt tttttgagac 660
ggaatttcac tcgttgccca ggctggagtg caatggtgtg atctcagctc accacaacct 720
ctgcctcctg ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctct tgagtagctg ggattacagg 780
catgtgccac catgtccggc taatattttt gtatttttag tagagacggg gtttctccat 840
gttggtcagg ctggtcttga actcccgacc tcaggtgatc tgcccgcttc ggcctcccaa 900
agtgctggga ttacaggcgc gagccaccac accaggcccg cgtgatgtat attttaagac 960
ctcttttgct ggtggaggac aggctttgtg tgagggggag ggataaacag tgggagcaag 1020
ggggccaatt agaagggtgt tggggaggct caggggagat ggtggctcag gatgatgggc 1080
tgggtttgga cagggtgtgg aggggcttgc aggtggatgg tggaggartg taacgaaggt 1140
ttctgcgtga gccctggagg gaacagatga gatcacgcca ttgcataata aggtgttcct 1200
tactgtgggg tagcggacca ggcagggaac aacctgggag gaatcaaatt ttattttgga 1260
catgttactt ctgaaaggct aacagacttc caggcagaaa ggtccttgag ggaaacattc 1320
taggggtctc tctgggaggc ttagatcaag gagctgagac caaaaggaga atgggaggga 1380
ggagacgagt acaatagagt trgagccaag gtcctagagg cggataggtg gattcctgag 1440
ggaggaggaa ggggctgagg ttgctggagc ctggcagctt cttccggagc cattggcagg 1500
actgatgcaa acagctctgg gtgggaagag ggaaccagga tatcctcctg tgtccttcct 1560
tttctgcagt catcctgggt ggctgccaga tggaattcct tggatatcat tgcttggagg 1620
tcccctgcat gcctgaagaa ggacatggtg gagagcagga tgcctggatc ccatggggga 1680
agggaagtgc ccaggaaagc acgaagcccc agggggagct ttcagtgcgg gggtgagtgg 1740
ggaggctggg gtagtagctg acactgtccc agctgcatcc caggtttgaa argcacctcc 1800
tcccccagcg caggcatcct gcctcccaac cctgtaatta cggtgcttcc caacgcccat 1860
cgygtggttt gctcccattc tttggcttcc aatagttgca agggatgaag gtggacatct 1920
ctgtgattac ggagatgcca agtgggtatt gactgctcca ggatgtggat ggagggtgtg 1980
aaaaccaggg tggggtgacg caggctctgg gtcatgatrg ggagagcagg cagctgggtc 2040
ctgggctgga ggactaaaat aagggacgcc accttcaggg gtgacacatc agcccaggcc 2100
ctccctacgg gtttgaccag tcctgttctg acggtattcc tgcgccactg ggctggtccc 2160
tcctccactc ctcccctata aagcctcctg gggtccccag gcacccagac tcagcccacc 2220
ccagctttgg gggccagtac gcagccatga tcctcaactg gaagctcctg gggatcctgg 2280
tcctttgcct gcacaccaga ggtgaggtgg gaacagaggc agggactgca gtttggggtg 2340
atgagggata ctcaagatgg cggaggtgaa ctggacgcat ggggttgggg acaggaattc 2400
aggggaygca gaaggtgcat ctggctcacc agaaatggct ttctggacac attgggtggg 2460
ggacatggtg cagaaggtgc atttggctct caccagaaat ggtttgctgg ctccatgtgg 2520
caaagtcggt caggattaac gtggggggga cgagtttcct tggagctggg atctgtgtta 2580
aggagctggg gtccttgtaa agctggggtc tgtgtgcctg ggggccaagg tgtaacccac 2640
cttgggttgc aggttggcct gaggacaaag ctagtggggt accccaacca ggggtggatg 2700
gagcttattt ggagaagtct ggtcagttta aagtgggtca agtgaacggt tcagatccat 2760
cgggggtagg ggttcatgac attttaccat cagttaagta tttacaaacc taccgagagc 2820
tctttgagag tgactttttt ggtctgtttg tgggtcagtt caggctgcgt ccrtccagac 2880
aggctcctcc tcctggggct ggggctgggt ggggctgggg agagaagccc tcaccacctc 2940
ttacctttct ccttcctcct ttacaggcat ctcaggcagc gaggrccacc cctctcaccc 3000
acccgcagag gaccgagagg aggcaggctc cccaacattg cctcagggcc ccccagtccc 3060
cggtgaccct tggccagggg caccccctct ctttgaagat cctccgccta cccgccccag 3120
tcgtccctgg agagacctgc ctgaaactgg agtctggcyc cctgaaccgc ctagaacgga 3180
tcctcctcaa cctccccggc ctgacgaccc ttggccggca ggaccccagc ccccagaaaa 3240
cccctggcct cctgcccctg aggtggacaa ccgacctcag gaggagccag acctagaccc 3300
accccgggaa gagtacagat aatggagtcc cctcagccgt tctgttccca ggcatctcca 3360
ggcacccacg ccctctccac cctctgattc cccgtgaatt cttcccaatt tagcctrtct 3420
ccttaaacct cttcctcatt ccctcggttt tattctgaac ccgtaaggtg gtgttctcaa 3480
tatttcctgt cccctcctga gatccatact tagtcctcac atcgcccgtt ttttcctctg 3540
acagcctaag cctactctcc tacctcgcct ccaggcctcg gccccaccta cctcccaccc 3600
ggtcttcctg cccgcgcgat cgctggggca gggctacggt actgtgttcc cttctgccac 3660
ctggtggccg gcggcaggaa ctatcagtag acagctgctg cttccatgaa acggaaaaat 3720
aaaaatcatg ttttcttaac tctgaatcta ggctgctgct ttaactaaca cttagggtct 3780
ttttcattta tttttattta tttgtttttt tctttttttg agacgaagtc tcgctctgtc 3840
gcccaggctg gagtacagtg gcacgatctc ggctcactgc aagctccgcc tcccgggttc 3900
acgctattct gcctcagcct cccgagtagc tgggactaca ggcgcccgcc accacgccag 3960
gctaattttt tgtatttttt agtagaggcg gggtttcacc gtgttagcca gagtggtctc 4020
gatctcctga cctcgtgatc tgcccgcctg ggcctcccaa agtgctggga ttacacgcgt 4080
gagccacagc gcccggcttc tttcttcttt ttctttcttt tttttttaga tggagtctca 4140
ctctatgccc aggctggagt gcaatggcac gatctcggct cactgcaacc tccggctccc 4200
gggttcaagc cattctcctg cctcagcctt ctgagtagct gggattacag gtgcgcacca 4260
ccatgcccgg ctaatttttg tattttagta gagatggggt ttcaccatgt tggccaggct 4320
ggtctcgaac tcctgacatc gtgatctccc cgcctcggcc tcccaaaggg ctgggattac 4380
aggcgtgagc caccgtgccc ggccaacact tatgtt 4416
<210> 4
<211> 6209
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> allele
<222> (1568)..(1568)
<223> PS3: polymorphic base thymine or cytosine
<220>
<221> allele
<222> (1661)..(1661)
<223> PS5: polymorphic base cytosine or thymine
<220>
<221> allele
<222> (2186)..(2186)
<223> PS6: polymorphic base thymine or cytosine
<220>
<221> allele
<222> (3929)..(3929)
<223> PS7: polymorphic base cytosine or thymine
<220>
<221> allele
<222> (4235)..(4235)
<223> PS9: polymorphic base guanine or adenine
<220>
<221> allele
<222> (4326)..(4326)
<223> PS11: polymorphic base cytosine or thymine
<220>
<221> allele
<222> (5210)..(5210)
<223> PS13: polymorphic base adenine or guanine
<400> 4
tgcagggcta gaccctcccc aagaccttgg gaatccaggc cgcctagatc cccaggcaga 60
aaagccagcg tcctgacatc ttattcaaat ctttcctgcg gctgttctct cagcttctct 120
ctactatccc cttagcttcc atgcctgctg cccgcctcct ctttctcgag tcctaacaca 180
tagtgggcac ttgaagatct tcctcccacc ctcccaccct cattaatcta ttttttaccc 240
gaatctggga tccctactcc cgtccctttt tacaacctaa tctacctttt tctgaaggaa 300
ttattctggt cctgaccctc acccccatgt ctcaatagcc tgccctcgcc ccctgtacgc 360
tagccggctc tactctccca ccactgctcc cctagatacc agaggcttca cccagttagc 420
ccgtgagctc taaggctgtt ctgatctctt catctgtccc ttcacctggc ccctgtaccc 480
ccttcccctt tggacccctt gaaccctccc aggacccccg ctcagcccct tcccgccccc 540
aaccgactct tcccgaacgt cccttaccaa ccgcgagagc cccctactgc gctttggcca 600
caccccctac gcctcgctcc cggccccgcc tctgcccctg accgcgcctg cgcaaggcgg 660
gcgccctaaa gtcctatttc actctgttgg gaggaggggg aaaggtgtac gcaggcgcag 720
tggcgtctaa atttgggccc actaaatgcg tcggagcatc tccgcgccca ggcggctcct 780
cctcactgcg gcaacccggg aaaacttgtg aactaatcag aaaaagtgga aggcgggaga 840
tcttggggcg ctgtccaatg gcgcggaaga gaacaaatga gctggccaat cgggaacggc 900
acgggggcgg gctcgctcgg cgcgaagttc gggcccggga attccgaagg aggggtaggc 960
gctgcccgcg cgcagaggcc gcgcccctcc tggccccggc ttcttggctg tcaaacagat 1020
gcagcaacgt cggctcctgc cgaggagccc aaggggtccc gggatccgcc gcacaggctg 1080
gcactgcttg aagaggaggc tactcggaga ctgcgccgcg cgggtagatc cgaaacgggg 1140
ctggggcgga gtgggaaaag gccgggtatg ccttgcatga tcgcggggag ctccttcctg 1200
tttttatccc acctagagaa gccgggaagt aggggtttag gtccaatttg ttggagtact 1260
taaggactcg tttgcacttt cttttggggg atgacagtgg attcattgcc ctcggaggtt 1320
caaccagtta tgagtgaggg attggccaga agatcggggc gcaggcaagc aggagtgctc 1380
tattaggata agcaagtttg acaggaagaa gctgctcttc tccgaattac acagaggtga 1440
tgtgttcgta ttgcacgtag acgtgtgtat aacaggacct ccttccccgc gccccgccac 1500
cccgacacac acaggagctg cctaaagtat ccttgccttg cagattggag gctccccaaa 1560
tattttgyga tctgaggatc cagctcaagt gaggtgccat aggacgtgtt cctgagtttg 1620
cattgcacgg agaccttcct ggaatttttc atttgcaagt yggcttaacc aattttgcat 1680
tgagtcctag gctgcttgca ctctgaattt gggctattca ggtagtgtgc tcaaagttga 1740
aaccgcatac agcacaactc aagtttgcat cagactggga agcgaactta agccagcggt 1800
gcgtggccca ggagtgggaa aggaaatgga tgcctgaagt ggaagaggtg gtgcagaggg 1860
ggcaccgccc atgctgccct gcttccaact gctgcgcata gggggcggca ggggcggtga 1920
tctctacacc ttccaccccc ccgccggggt tggctgcacc tatcgcttgg gccacagggc 1980
cgacctgtgt gatgtggccc tgcggcccca gcaggagcct ggcctcatct ctgggatcca 2040
cgccgaactg catgccgagc cccggggtga tgactggagg gtcagcctgg aagaccacag 2100
cagccaaggt gagcattaag cagggcagct ttgcccctgg gtggttgaag cgccaggctg 2160
gaatgagtaa ggtctccaca agaccytgct gcctgcctcc catactccca tcagattgga 2220
tggatagtcg tggtccagac cttcatcttc ccaccagaag tgtgcacagt cagaagctct 2280
ctgccagact gacccttttt ggtcccgttt agctcataca ggacctggga tatcatcaga 2340
aagatatcac agtggggatg ttctgaggcc actagaggcc aagtttagac ttgattcagt 2400
ttccagcttt gctgaggcac tctgttcctg ggttagggca gttctatgtt gaataatgtt 2460
tttaataatc tgggcatgtc tttctccgtg acttgaggca gttagcctca gaaagcctag 2520
attcacattt gagttttgcc actgcctctt ggtaaagtca gctgtaggag tgttatggtt 2580
attagactat agtagccaac attcatctag tgcttactgt tatgagccag gccctatttt 2640
aagtgtattg aatgtaggtg gtactaatat tatcctcatt tacagtaaag gaaaatgagg 2700
cacaaagagg ttaaggaact tgtccagggc tgggcatggt ggtttacacc tataatccag 2760
cactttggga ggctaaggca gggtggatca cttgagctca ggagttcgag accagcctgg 2820
gcaacatggt gaaaacctgt ctctaccaaa aaattaatta attttttaaa aaaagcctgg 2880
gcgcggtggc tcacgcctgt aatcccagca ctttgggagg ccgagatggg cagatcacga 2940
ggtcaggagt tcgagaccat cctgaccaac atgttgaaac cccatctgtg ctgaaaaaaa 3000
aatacaaaaa ttagccaggt gtggtggcgt gcacctgtaa ccccagctac tcaggaggct 3060
gaagcagcag aatcacttga acccgggagg cggaggttgc agtgagctga gatcgcacca 3120
ctgcactcca gcttgggcga cagagcgaga ctccatctca aacaaacaaa caaaccaaaa 3180
gcttgcccag ggtcacataa ctggtaagtg gtagagctag gatctgaacg agctggagct 3240
gggggagagt gagcatgttt gaaaactgga ccttagggcg gggcacggtg gctcacgcct 3300
gtaatcccag cactttggga ggctgaggcg ggcagatcag gaggtcagga gtatgagacc 3360
agcctggcca acatggtaaa accctgtctc tgctaaaaat aaaaaaatta gccagacgtg 3420
gtggcacatg cctgtaatcc cagctactca ggaggctgag gcaggagaat tgcttgaacc 3480
tgggaggcgg agtgcagtga gctgagattg cactactgca ctccagcttg ggcaatagag 3540
caaaactcca tctcaaaaaa aaaaaaaaga aagaaaaaaa aagaagaaag aaagaaaatt 3600
ggaccttagg acagtgaggg cagggatcct ttgtaggaaa gcacaagaaa cacagacttg 3660
ttcctagctg acaaggagtg tactgcctgg tacctgtcac ctgctgaggg gcttaggatg 3720
tgagggagaa tctgactaca gtttcatatt cttccccaga aatcatacag atttctccac 3780
tcctgactct ggtcatttct gtttttgtcc tccatatttg cctggtgccc caccatcaac 3840
aggtactttg gtcaataatg tccgactccc aagaggtcac aggctggaat tgagtgatgg 3900
agacctcctg acctttggcc ctgaagggyc cccaggaacc agcccctcgg agttctactt 3960
catgttccaa caagtacgag tcaagcctca ggactttgct gccattacca tcccacggtc 4020
taggggagaa gcccgggttg gggctggttt ccggcctatg ctgccctccc agggggctcc 4080
acagcggcct ctcagcacct tctcccctgc ccccaaggcc acactgatcc taaactccat 4140
aggcagcctc agcaagctcc ggccccagcc cctcaccttc tcccctagtt ggggtggacc 4200
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ccaacgcaat cggaggaaat ctgttcaccg agtgttggcg gaactggatg atgagagtga 4320
gcctcytgag aacccgccac cggtccttat ggagcccagg aagaaactcc gtgtagacaa 4380
agccccactg actcccactg ggtaagtgga gtcctcactt ggccctctca gtgttttact 4440
gcttttcgat tccttgtatc cctaggctgt gaggaggtcc ccctgcctgg ggggatgggc 4500
acgggaggtg gaatagatgg aatggcaaga cctgggttag ctctgatagg aaaagaaaaa 4560
tatgtgcagg agaacatgag aggtggggtg gggcagtgct tataaaacaa ccggagtgag 4620
catgtcctgc tttttacatt catatggctt taaccccatt cttctagtgc ctaaggatgg 4680
ggaactttca ggctcacact agaggttttt aggcccaccc tatgtgtttt taaggacaga 4740
gtccaggctc accttagttc tcagaccact gtgcctctgt ggcctcaccc tatgaccagc 4800
catagggtgg caaggtctag gccttctcct acaggtttcc ggtgaccctt gtgtctgtgt 4860
cacttccttc agaaatcgac gtggccgtcc tcggaagtac ccagtgagcg ctcccatggc 4920
tccccctgca gttggggcgg ggagccctgt gcagctcctt gttgctgcct gccccaggaa 4980
gagacagtgg cctgggttca gtgtgatggc tgtgacgtct ggttccatgt ggcctgtgtt 5040
ggctgcagca tccaggctgc cagggaggcc gacttccgat gcccagggtg ccgggctggc 5100
attcagccta aggtccaccg ccaaggcacc atcggacaca cctgcccatg agtagacaca 5160
gcagcgagca aataggtctg ataaataccc cccttccctt ccctccccar gagggaatga 5220
ctacagggaa gaaggatgga ttgatgtgga ctcattcagg gcctggagca gaccctggtg 5280
gccaagacag aagagatggt ttcctgccaa agatattgcc acctccagga aattgccagt 5340
gagctggaag ttcccactat tacaagccat aaggccatgt tgccatggac accagaatat 5400
ctgtagtcag agcacctatc agttgcaaaa gccatgcctg caaccgatgg aaaatgtaag 5460
agggagttct taaggttctt ggtggcatca cccaaggcat tctgggaaaa cctagggcct 5520
ggccccaaaa cttccctact ctgtggctag tcctgctgcc aacaaaatcg tagcgacctg 5580
gcttttcaca gctttgcttt tatttccaag tcaaggacaa gccgcttcat tcactcctgg 5640
gcatttactc ttcttgtggg tctgtgatat tccttgcttt ccagggagaa tgtgcttggc 5700
aaggtctgga gaactaattc agaatcttag gggaagggga gagatggaaa tacaaacctg 5760
cttactggaa aggtgcaaat atatgggttg agctggaggt aggaatacag gtaattaagg 5820
tttctagttt aagggaaaac agatctattg ccatttaaat aaggtaactg ggatttggtt 5880
aagttcacaa agatagcaga agatttattt acaggcttca cctgtactgt cagggcaaga 5940
gaaagcctgg taaaccagct acagcagttt accagtgtga tggctgtgac acagctccac 6000
tccacgggtg gacacagcag agggcaactg ggctggcctg gttcagtgtg aatcaaaccg 6060
cttaacccac acatggtaca tgtgattttc ttttgtgagc cttacaccaa gccaaactat 6120
tgtcaaagca tcatttctat agaaataaag ccttatcttg acctgttcta ttaaaacctg 6180
ccacatccgc cctttcctac ctagattta 6209
Claims (32)
- 대상 유래의 시료에서 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형(haplotype) 내의 하나 이상의 다형성 자리(polymorphic site)에 존재하는 뉴클레오티드를 측정하여, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형에서 하나 이상의 다형성 자리에서 상기 대상에 존재하는 뉴클레오티드에 기초하여 T-세포 제거 물질(depleting agent)을 이용한 치료에 대한 대상의 반응성을 측정하는 것을 포함하는, T-세포 제거 물질을 이용한 치료에 대한 대상의 반응성을 측정하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 T-세포 제거 물질은 Alefacept인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 CD8B1, HCR, SPR1, 및 TCF19으로 이루어진 군에서 선택된 유전자에서 일배체형인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 CD8B1 유전자에서 일배체형이며, 상기 일배체형 및 치료에 대한 반응성 사이의 연관에 대한 p-값은 약 0.005 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 SPR1 유전자에서 일배체형이며, 상기 일배체형 및 치료에 대한 반응성 사이의 연관에 대한 p-값은 약 0.005 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 TCF19 유전자에서 일배체형이며, 상기 일배체형 및 치료에 대한 반응성 사이의 연관에 대한 p-값은 약 0.010 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 HCR 유전자에서 일배체형이며, 상기 일배체형 및 치료에 대한 반응성 사이의 연관에 대한 p-값은 약 0.007 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 일배체형 마커 1이며, 상기 방법은 상기 대상 유래의 시료에서, 일배체형 마커 2, 일배체형 마커 3, 일배체형 마커 4 또는 일배체형 마커 5로부터 선택된 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형 내의 하나 이상의 다형성 자리에 존재하는 뉴클레오티드를 측정하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형 내의 하나 이상의 다형성 자리에서 상기 대상에 존재하는 뉴클레오티드를 이용하여 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형의 카피수를 측정하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- CD8B1, HCR, SPR1, 및 TCF19 유전자에서 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형의 SNP를 유전형 결정(genotyping)하는데 적합한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트로서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형의 카피수는 T 세포 관련 질환으로 고생하는 대상 그룹이 T 세포 제거 물질에 대해 반응할 것인지 또는 반응하지 않을 것인지에 대한 통계학적 유의한 연관을 제공하는 키트.
- 제 10 항에 있어서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 CD8B1 유전자에서 일배체형이며, 상기 일배체형 및 치료에 대한 반응성 사이의 연관에 대한 p-값은 약 0.005 이하인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 10 항에 있어서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 HCR 유전자에서 일배체형이며, 상기 일배체형 및 치료에 대한 반응성 사이의 연관에 대한 p-값은 약 0.007 이하인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 10 항에 있어서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 SPR1 유전자에서 일배체형이며, 상기 일배체형 및 치료에 대한 반응성 사이의 연관에 대한 p- 값은 약 0.005 이하인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 10 항에 있어서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 TCF19 유전자에서 일배체형이며, 상기 일배체형 및 치료에 대한 반응성 사이의 연관에 대한 p-값은 약 0.010 이하인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 10 항에 있어서, 상기 T-세포 제거 물질은 Alefacept인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 10 항에 있어서, 상기 T 세포 관련 질환은 건선인 것을 특징으로 하는 키트.
- T-세포 제거 물질에 대한 반응 또는 무반응과 관련된 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형의 존재를 검출하기 위한 키트로서, 상기 키트는 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형이 CD8Bl, HCR, SPR1, 및 TCF19로 이루어진 군에서 선택된 유전자에서 일배체형인, T 세포 활성화 또는 저해 일배체형 내의 다형성 자리를 유전형 결정하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 키트.
- 제 17 항에 있어서, 상기 일배체형은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키트:(a) 표 3A 및 3B에 제시된 CD8B1 일배체형;(b) 표 7A 및 7B에 제시된 HCR 일배체형;(c) 표 12에 제시된 SPR1 일배체형;(d) 표 16A 및 B에 제시된 TCF19 일배체형;(e) 하기 중의 임의의 하나에 연관된 일배체형:(i) 표 3A 및 3B에 제시된 CD8B1 일배체형,(ii) 표 7A 및 7B에 제시된 HCR 일배체형,(iii) 표 12에 제시된 SPR1 일배체형, 또는(iv) 표 16A 및 B에 제시된 TCF19 일배체형; 및(f) 하기 중의 임의의 하나에 대한 치환(substitute) 일배체형:(i) 표 3A 및 3B에 제시된 CD8B1 일배체형,(ii) 표 7A 및 7B에 제시된 HCR 일배체형,(iii) 표 12에 제시된 SPR1 일배체형, 또는(iv) 표 16A 및 B에 제시된 TCF19 일배체형.
- 제 17 항에 있어서, 상기 일배체형은 하기인 것을 특징으로 하는 키트:(a) 일배체형 마커 1, 일배체형 마커 2, 일배체형 마커 3, 일배체형 마커 4 및 일배체형 마커 5로 이루어진 군에서 선택된 일배체형 마커;(b) 일배체형 마커 1, 일배체형 마커 2, 일배체형 마커 3, 일배체형 마커 4 또는 일배체형 마커 5에 연관된 일배체형; 또는(c) 일배체형 마커 1, 일배체형 마커 2, 일배체형 마커 3, 일배체형 마커 4 또는 일배체형 마커 5에 대한 치환 일배체형.
- 제 19 항에 있어서, 상기 연관된 일배체형 마커 및 일배체형 마커 사이의 연관불균형은 0.75 이상, 0.80 이상, 0.85 이상, 0.90 이상, 0.95 이상, 및 1.0으로 이루어진 군으로부터 선택된 △2를 가지는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 20 항에 있어서, 상기 △2가 0.95 이상인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 17 항에 있어서, 상기 T 세포 제거 물질이 Alefacept인 것을 특징으로 하는 키트.
- 치료 섭생에 대한 질환으로 고생하는 대상의 반응을 진단하기 위한 CD8B1, HCR, SPR1, 및 TCF19 유전자에서 SNP의 유전형을 결정하는데 적합한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.
- 제 23 항에 있어서, 상기 SNP는 하기 위치의 다형성으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트: CD8B1 유전자에서 위치 -685, -255, 25, 8632, 15080, 19501, 28589, 28663 및 28739, HCR 유전자에서 위치 2173, 2175, 2360, 5782, 5787, 6174, 6666, 8277, 8440, 8476, 11565, 11941, 12152, 13553, 13892, 14287, SPR1 유전자에서 위치 -119, -845, -455, -384, -228, 161, 627, 739, 913 및 1171, 및 TCF19 유전자에서 위치 -303, -210, 316, 2059, 2365, 2456 및 3340.
- 제 23 항에 있어서, 사용 지시서를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 23 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 SNP에 검출가능하게 혼성화할 수 있는 것을 특징으로 하는 키트.
- CD8B1, HCR, SPR1, 또는 TCF19 유전자에서 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형에서 SNP의 유전형을 결정하는데 적합한 단일 가닥 올리고뉴클레오티드.
- 제 27 항에 있어서, 상기 SNP는 하기 위치의 다형성으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드: CD8B1 유전자에서 위치 -685, -255, 25, 8632, 15080, 19501, 28589, 28663 및 28739, HCR 유전자에서 위치 2173, 2175, 2360, 5782, 5787, 6174, 6666, 8277, 8440, 8476, 11565, 11941, 12152, 13553, 13892, 14287, SPR1 유전자에서 위치 -119, -845, -455, -384, -228, 161, 627, 739, 913 및 1171, 및 TCF19 유전자에서 위치 -303, -210, 316, 2059, 2365, 2456 및 3340.
- T 세포 활성화 또는 저해 일배체형에 대한 대상의 카피수를 측정하기 위해 상기 대상 유래의 시료를 분석하는 것을 포함하는, T 세포 제거 물질을 이용한 치료에 대한 대상의 반응성을 측정하는 방법.
- 제 29 항에 있어서, 상기 T-세포 제거 물질이 Alefacept인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 29 항에 있어서, 상기 T 세포 활성화 또는 저해 일배체형은 CD8B1, HCR, SPR1, 및 TCF19으로 이루어진 군에서 선택된 유전자에서 일배체형인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31 항에 있어서, 상기 일배체형은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:(a) 표 3A 및 3B에 제시된 CD8B1 일배체형;(b) 표 7A 및 7B에 제시된 HCR 일배체형;(c) 표 12에 제시된 SPR1 일배체형;(d) 표 16A 및 B에 제시된 TCF19 일배체형;(e) 하기 중의 임의의 하나에 연관된 일배체형:(i) 표 3A 및 3B에 제시된 CD8B1 일배체형,(ii) 표 7A 및 7B에 제시된 HCR 일배체형,(iii) 표 12에 제시된 SPR1 일배체형, 또는(iv) 표 16A 및 B에 제시된 TCF19 일배체형; 및(f) 하기 중의 임의의 하나에 대한 치환(substitute) 일배체형:(i) 표 3A 및 3B에 제시된 CD8B1 일배체형,(ii) 표 7A 및 7B에 제시된 HCR 일배체형,(iii) 표 12에 제시된 SPR1 일배체형, 또는(iv) 표 16A 및 B에 제시된 TCF19 일배체형.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PA0105 | International application |
Patent event date: 20061130 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
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Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20071009 Patent event code: PE09021S01D |
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| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20090720 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20071009 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |