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KR20060010872A - 비색 분석 방법에 이용하는 시약 - Google Patents

비색 분석 방법에 이용하는 시약 Download PDF

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KR20060010872A
KR20060010872A KR1020067001158A KR20067001158A KR20060010872A KR 20060010872 A KR20060010872 A KR 20060010872A KR 1020067001158 A KR1020067001158 A KR 1020067001158A KR 20067001158 A KR20067001158 A KR 20067001158A KR 20060010872 A KR20060010872 A KR 20060010872A
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KR
South Korea
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group
compound
complex
bipyridyl
reagent
Prior art date
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KR1020067001158A
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KR100693899B1 (ko
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겐지 나가카와
도모미치 츠지모토
스스무 니시노
마사아키 데라모토
요시유키 가와세
Original Assignee
아크레이 인코퍼레이티드
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Publication date
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Abstract

단시간 또한 간단히 신뢰성 있는 분석을 실시할 수 있는 비색 분석 방법을 제공한다.
산화 환원 효소에 의해, 분석 대상물로부터, 미디에이터를 통하여, 환원에 의해 발색하는 발색제에 전자를 전달하고, 그 결과 발생하는 상기 발색제의 발색을 측정함으로써, 상기 분석 대상물의 정성 혹은 정량을 행한다. 이 비색 분석 방법의 효소 반응은 1 단계의 반응이며, 미디에이터를 통하여 발색 반응을 일으키기 때문에, 단시간으로 측정 가능이다. 또, 이 반응은 과산화수소 및 산소를 필요로 하지 않기 때문에, 측정치의 신뢰성도 높다.
비색 분석 방법

Description

비색 분석 방법에 이용하는 시약{Reagent for use in Colorimetry}
도 1은 본 발명의 일실시예에 있어서의 글루코오스 농도와 발색과의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 그 밖의 실시예에 있어서의 글루코오스 농도와 발색과의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 추가로 그 밖의 실시예에 있어서의 글루코오스 농도와 발색과의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 추가로 그 밖의 실시예에 있어서의 글루코오스 농도와 발색과의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 추가로 그 밖의 실시예에 있어서의 발색제의 발색을 나타내는 그래프이다.
도 6(a), 도 6(b)는 본 발명의 추가로 그 밖의 실시예에 있어서의 발색제의 발색을 나타내는 그래프이다.
도 7(a), 도 7(b)는 본 발명의 추가로 그 밖의 실시예에 있어서의 발색제의 발색을 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 추가로 그 밖의 실시예에 있어서의 발색제의 발색을 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 추가로 그 밖의 실시예에 있어서의 발색제의 발색을 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 추가로 그 밖의 실시예에 있어서의 발색제의 발색을 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 추가로 그 밖의 실시예에 있어서의 발색제의 발색을 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명의 추가로 그 밖의 실시예에 있어서의 발색제의 발색을 나타내는 그래프이다.
도 13은 본 발명의 추가로 그 밖의 실시예에 있어서의 발색제의 발색을 나타내는 그래프이다.
도 14(a), 도 14(b)는 본 발명의 추가로 그 밖의 실시예에 있어서의 발색제의 발색을 나타내는 그래프이다.
도 15는 본 발명의 추가로 그 밖의 실시예에 있어서의 발색제의 발색을 나타내는 그래프이다.
도 16(a), 도 16(b)는 본 발명의 추가로 그 밖의 실시예에 있어서의 발색제의 발색을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 비색 분석 방법 및 이것에 사용하는 시약에 관한 것이다.
임상 검사나 생화학 검사 등의 분야에 있어서, 글루코오스, 콜레스테롤 등의 성분 분석이 행하여지고 있고, 그 한 수법으로서, 비색 분석이 있다. 예를 들면, 글루코오스의 비색 분석에서는, 우선 글루코오스옥시다제를 글루코오스(기질)에 작용시켜서, 글루코노락톤 및 과산화수소를 발생시키고, 과산화수소를, 페록시다아제의 존재하, 트린더(trinder) 시약 등의 발색제에 의해 검출하는 것이 일반적이다. 이와 같이, 과산화수소를 통하여 간접적으로 기질 농도를 측정한다는 수법은 글루코오스에 한정하지 않고, 콜레스테롤 등의 다른 성분 분석에도 적용되고 있다.
그러나, 종래의 비색 분석에서는, 다음과 같은 문제가 있다. 우선, 분석 대상물을 직접 측정하는 것이 아니고, 과산화수소를 통하여, 간접적으로 측정하기 때문에, 측정에 시간이 걸리고, 예를 들면, 글루코오스의 측정의 경우, 30∼60초가 걸린다. 또, 종래의 비색 분석법에서는, 2종류의 효소 반응계를 동시에 안정화할 필요가 있어, 조건 설정이 어렵다. 그리고, 산소를 필요로 하기 때문에, 종래의 비색 분석법에서는, 산소가 불충분하면, 반응이 충분히 일어나지 않는다는 문제도 있다.
본 발명은 이러한 사정에 비추어 행하여진 것으로, 분석 시간이 단시간이고, 또한 분석값에 신뢰성이 있는 비색 분석 방법의 제공을 그 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 비색 분석 방법은 산화 환원 효소에 의해, 분석 대상물로부터, 미디에이터(mediator)를 통하여, 환원에 의해 발색하 는 발색제에 전자를 전달하고, 그 결과 발생하는 상기 발색제의 발색을 측정함으로써, 상기 분석 대상물의 정성 혹은 정량을 행하는 방법으로서, 철 착체, 루테늄 착체, 오스뮴 착체 및 구리 착체로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 적어도 1개의 착체이다.
이 방법에 따르면, 효소 반응은 1 단계의 반응이기 때문에, 반응계가 간단하고 안정성이 좋아진다. 또, 효소 반응이 1 단계인 것과, 상기 발색제의 반응에 상기 미디에이터를 사용하기 때문에, 효소 반응으로부터 발색 반응까지의 시간이 지극히 짧아져, 그 결과, 측정 시간도 짧아진다. 예를 들면, 본 발명의 비색 분석 방법에 있어서, 글루코오스를 기질로 한 경우, 약 5초 이내의 단시간으로 측정 가능이다. 또, 본 발명의 비색 분석 방법에서는 발색까지의 반응이 빠르므로, 효소를 절약할 수 있어, 비용적으로 유리하다. 그리고, 본 발명의 비색 분석 방법은 과산화수소를 통하지 않고 발색제를 발색시키고, 또한 산소를 필요로 하지 않는 점에서, 분석값의 신뢰성도 높다.
다음에, 본 발명의 시약은 상기 본 발명의 비색 분석 방법에 사용되는 시약이며, 산화 환원 효소, 미디에이터 및 환원에 의해 발색하는 발색제를 포함하는 시약이다. 또, 본 발명의 시험편은 상기 본 발명의 시약을 포함하는 시험편이다. 이 시험편은 종래의 과산화수소를 발생시키는 비색 분석용 시험편에 비해, 지극히 단시간으로 분석이 가능하고, 그 분석값의 신뢰성도 높다.
본 발명의 비색 분석 방법, 시약 및 시험편에 있어서, 상술한 바와 같이, 상기 미디에이터는 철 착체, 루테늄 착체, 오스뮴 착체 혹은 구리 착체 또는 이들 2 종류 이상의 혼합물이 바람직하다. 또, 상기 착체의 배위자의 배위 원자는 질소, 산소 및 황으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 1개인 것이 바람직하다. 상기 배위자로서는, 예를 들면, 암모니아, 비피리딜 화합물, 이미다졸 화합물, 페난트롤린(phenanthroline) 화합물, 에틸렌디아민 화합물, 아미노산, 트리아진 화합물, 비퀴놀린 화합물, 피리딜아조 화합물, 니트로소 화합물, 옥신 화합물, 벤조티아졸 화합물, 아세틸아세톤 화합물, 안트라퀴논 화합물, 크산텐 화합물, 옥살산 및 상기 각 화합물의 유도체로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 1개인 것이 바람직하다. 또, 상기 착체는 배위자를 2종류 이상 갖고 있어도 되고, 다시 말해, 혼합 배위자여도 된다. 상기 배위자의 배위 위치 이외에 있어서의 수소 원자의 적어도 1개는 치환기에 의해 치환된 배위자이어도 된다. 상기 치환기로서는, 예를 들면, 알킬기, 아릴기, 알릴기, 페닐기, 히드록시기, 알콕시기, 카르복시기, 카르보닐기, 술폰기, 술포닐기, 니트로기, 니트로소기, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, 아미노기, 아실기, 아미드기 및 할로겐기가 있다.
본 발명의 비색 분석 방법, 시약 및 시험편에 있어서, 산화 환원 효소는 탈수소 효소 혹은 산화 효소가 바람직하다. 또, 분석 대상물은, 예를 들면, 글루코오스, 콜레스테롤, 유산, 요산, 피루브산, 크레아틴, 크레아티닌이 바람직하고, 이 경우의 바람직한 산화 환원 효소는 상기 각 물질에 대응하는 탈수소 효소 혹은 산화 효소이다. 효소량을 많게 하면, 반응이 빨라지므로 바람직하다. 상기 발색제는 테트라졸륨염이 바람직하다. 상기 테트라졸륨염은 니트로페닐기, 티아졸릴(thiazolyl)기 및 벤조티아졸릴기 중의 적어도 1개의 기를 갖는 것이 바람직하다. 상기 테트라졸륨염의 구체예로서는, 예를 들면, MTT, INT, 네오-TB, 니트로-TB, TB, WST-1, WST-3, WST-4, WST-5, WST-8, 2-(2-벤조티아졸릴)-3,5-디페닐테트라졸륨브로마이드, 2-(2-벤조티아졸릴)-3-(4-니트로페닐)-5-페닐테트라졸륨브로마이드, 2,3-비스(4-니트로페닐)-5-페닐테트라졸륨클로라이드, 2,3-디(4-니트로페닐)테트라졸륨퍼클로레이트, 3-(3-니트로페닐)-5-메틸-2-페닐테트라졸륨클로라이드, 및, 3-(4-니트로페닐)-5-메틸-2-페닐테트라졸륨클로라이드가 있다.
본 발명의 시험편에 있어서, 상기 시약에 덧붙여, 추가로 무기 겔을 포함하는 것이 바람직하다. 무기 겔에 의해 산소를 차단하면, 발색제의 산화를 방지할 수 있고, 또 재산화에 의한 발색 후의 퇴색도 방지할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 있어서, 상기 미디에이터는 철 착체, 루테늄 착체, 오스뮴 착체, 구리 착체가 바람직하고, 특히 바람직하게는 오스뮴 착체이다.
(철 착체)
철 착체의 배위자로서는, 예를 들면, 암모니아, 비피리딜 화합물, 이미다졸 화합물, 페난트롤린 화합물, 에틸렌디아민 화합물, 아미노산, 트리아진 화합물, 비퀴놀린 화합물, 피리딜아조 화합물, 니트로소 화합물, 옥신 화합물, 벤조티아졸 화합물, 아세틸아세톤 화합물, 안트라퀴논 화합물, 크산텐 화합물, 옥살산 및 상기 각 화합물의 유도체 등의 배위자를 들 수 있다. 이들을 2종류 이상 조합하여 혼합 배위자로 해도 된다.
비피리딜의 경우, 배위수는 6이다. 비피리딜은 치환하고 있지 않아도 되고, 치환기를 도입해도 된다. 치환기를 도입함으로써, 예를 들면, 용해도나 산화 환원 전위 등을 조정하는 것이 가능해진다. 치환 위치로서는, 4, 4'위치 및 5, 5'위치가 있다. 치환기는, 예를 들면, 알킬기(예를 들면, 메틸기, 에틸기, 프로필기 등), 아릴기, 알릴기, 페닐기, 히드록시기, 알콕시기(예를 들면, 메톡시기, 에톡시기 등), 카르복시기, 카르보닐기, 술폰기, 술포닐기, 니트로기, 니트로소기, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, 아미노기, 아실기, 아미드기 및 할로겐기(예를 들면, 브롬, 염소, 요오드 등)가 있다.
비피리딜 철 착체의 예로서는, 예를 들면, [Fe(비피리딜)3], [Fe(4,4'-디메틸-2,2'-비피리딜)3], [Fe(4,4'-디페닐-2,2'-비피리딜)3], [Fe(4,4'-디아미노-2,2'-비피리딜)3], [Fe(4,4'-디히드록시-2,2'-비피리딜)3], [Fe(4,4'-디카르복시-2,2'-비피리딜)3], [Fe(4,4'-디브로모-2,2'-비피리딜)3], [Fe(5,5'-디메틸-2,2'-비피리딜)3], [Fe(5,5'-디페닐-2,2'-비피리딜)3], [Fe(5,5'-디아미노-2,2'-비피리딜)3], [Fe(5,5'-디히드록시-2,2'-비피리딜)3], [Fe(5,5'-디카르복시-2,2'-비피리딜)3], [Fe(5,5'-디브로모-2,2'-비피리딜)3] 등이 있다.
이미다졸의 경우, 배위수는 6이다. 이미다졸은 치환하고 있지 않아도 되고, 치환기를 도입해도 된다. 치환기를 도입함으로써, 예를 들면, 용해도나 산화 환원 전위 등을 조정하는 것이 가능해진다. 치환 위치로서는, 2위치, 4위치 및 5위치가 있다. 치환기는, 예를 들면, 알킬기(예를 들면, 메틸기, 에틸기, 프로필기 등), 아릴기, 알릴기, 페닐기, 히드록시기, 알콕시기(예를 들면, 메톡시기, 에톡시기 등 ), 카르복시기, 카르보닐기, 술폰기, 술포닐기, 니트로기, 니트로소기, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, 아미노기, 아실기, 아미드기 및 할로겐기(예를 들면, 브롬, 염소, 요오드 등)가 있다.
이미다졸 철 착체의 예로서는, 예를 들면, [Fe(이미다졸)6], [Fe(4-메틸-이미다졸)6], [Fe(4-페닐-이미다졸)6], [Fe(4-아미노-이미다졸)6], [Fe(4-히드록시-이미다졸)6], [Fe(4-카르복시-이미다졸)6], [Fe(4-브로모-이미다졸)6] 등이 있다.
아미노산으로서는, 예를 들면, 아르기닌(L-Arg)이 있다. 아르기닌 철 착체는 용해성이 높다는 이점을 일반적으로 갖는다. 또, 혼합 배위자로서, 예를 들면, 비피리딜과 이미다졸의 조합, 비피리딜과 아미노산의 조합이 있다. 예를 들면, [Fe(이미다졸)2(비피리딜)2], [Fe(L-Arg)2(비피리딜)2]이 있다. 혼합 배위자를 이용하면 착체에 여러 가지 성질을 부여할 수 있고, 예를 들면, 아르기닌을 이용하면 착체의 용해성이 향상한다.
(루테늄 착체)
루테늄 착체의 배위자로서는, 예를 들면, 암모니아, 비피리딜 화합물, 이미다졸 화합물, 페난트롤린 화합물, 에틸렌디아민 화합물, 아미노산, 트리아진 화합물, 비퀴놀린 화합물, 피리딜아조 화합물, 니트로소 화합물, 옥신 화합물, 벤조티아졸 화합물, 아세틸아세톤 화합물, 안트라퀴논 화합물, 크산텐 화합물, 옥살산 및 상기 각 화합물의 유도체 등의 배위자를 들 수 있다. 이들을 2종류 이상 조합하여 혼합 배위자로 해도 된다.
비피리딜의 경우, 배위수는 6이다. 비피리딜은 치환하고 있지 않아도 되고, 치환기를 도입해도 된다. 치환기를 도입함으로써, 예를 들면, 용해도나 산화 환원 전위 등을 조정하는 것이 가능해진다. 치환 위치로서는, 4, 4'위치 및 5, 5'위치가 있다. 치환기는, 예를 들면, 알킬기(예를 들면, 메틸기, 에틸기, 프로필기 등), 아릴기, 알릴기, 페닐기, 히드록시기, 알콕시기(예를 들면, 메톡시기, 에톡시기 등), 카르복시기, 카르보닐기, 술폰기, 술포닐기, 니트로기, 니트로소기, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, 아미노기, 아실기, 아미드기 및 할로겐기(예를 들면, 브롬, 염소, 요오드 등)가 있다.
비피리딜 루테늄 착체의 예로서는, 예를 들면, [Ru(비피리딜)3], [Ru(4,4'-디메틸-2,2'-비피리딜)3], [Ru(4,4'-디페닐-2,2'-비피리딜)3], [Ru(4,4'-디아미노-2,2'-비피리딜)3], [Ru(4,4'-디히드록시-2,2'-비피리딜)3], [Ru(4,4'-디카르복시-2,2'-비피리딜)3], [Ru(4,4'-디브로모-2,2'-비피리딜)3], [Ru(5,5'-디메틸-2,2'-비피리딜)3], [Ru(5,5'-디페닐-2,2'-비피리딜)3], [Ru(5,5'-디아미노-2,2'-비피리딜)3], [Ru(5,5'-디히드록시-2,2'-비피리딜)3], [Ru(5,5'-디카르복시-2,2'-비피리딜)3], [Ru(5,5'-디브로모-2,2'-비피리딜)3] 등이 있다.
이미다졸의 경우, 배위수는 6이다. 이미다졸은 치환하고 있지 않아도 되고, 치환기를 도입해도 된다. 치환기를 도입함으로써, 예를 들면, 용해도나 산화 환원 전위 등을 조정하는 것이 가능해진다. 치환 위치로서는, 2위치, 4위치 및 5위치가 있다. 치환기는, 예를 들면, 알킬기(예를 들면, 메틸기, 에틸기, 프로필기 등), 아릴기, 알릴기, 페닐기, 히드록시기, 알콕시기(예를 들면, 메톡시기, 에톡시기 등), 카르복시기, 카르보닐기, 술폰기, 술포닐기, 니트로기, 니트로소기, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, 아미노기, 아실기, 아미드기 및 할로겐기(예를 들면, 브롬, 염소, 요오드 등)가 있다.
이미다졸 루테늄 착체의 예로서는, 예를 들면, [Ru(이미다졸)6], [Ru(4-메틸-이미다졸)6], [Ru(4-페닐-이미다졸)6], [Ru(4-아미노-이미다졸)6], [Ru(4-히드록시-이미다졸)6], [Ru(4-카르복시-이미다졸)6], [Ru(4-브로모-이미다졸)6] 등이 있다.
아미노산으로서는, 예를 들면, 아르기닌(L-Arg)이 있다. 아르기닌 루테늄 착체는 용해성이 높다는 이점을 갖는다. 또, 혼합 배위자로서, 예를 들면, 비피리딜과 이미다졸의 조합, 비피리딜과 아미노산의 조합이 있다. 예를 들면, [Ru(이미다졸)2(비피리딜)2], [Ru(L-Arg)2(비피리딜)2]이 있다. 혼합 배위자를 이용하면 착체에 여러 가지 성질을 부여할 수 있고, 예를 들면, 아르기닌을 이용하면 착체의 용해성이 향상한다.
(오스뮴 착체)
오스뮴 착체의 배위자로서는, 예를 들면, 암모니아, 비피리딜 화합물, 이미다졸 화합물, 페난트롤린 화합물, 에틸렌디아민 화합물, 아미노산, 트리아진 화합물, 비퀴놀린 화합물, 피리딜아조 화합물, 니트로소 화합물, 옥신 화합물, 벤조티아졸 화합물, 아세틸아세톤 화합물, 안트라퀴논 화합물, 크산텐 화합물, 옥살산 및 상기 각 화합물의 유도체 등의 배위자를 들 수 있다. 이들을 2종류 이상 조합하여 혼합 배위자로 해도 된다.
비피리딜의 경우, 배위수는 6이다. 비피리딜은 치환하고 있지 않아도 되고, 치환기를 도입해도 된다. 치환기를 도입함으로써, 예를 들면, 용해도나 산화 환원 전위 등을 조정하는 것이 가능해진다. 치환 위치로서는, 4, 4'위치 및 5, 5'위치가 있다. 치환기는, 예를 들면, 알킬기(예를 들면, 메틸 기, 에틸기, 프로필기 등), 아릴기, 알릴기, 페닐기, 히드록시기, 알콕시기(예를 들면, 메톡시기, 에톡시기 등), 카르복시기, 카르보닐기, 술폰기, 술포닐기, 니트로기, 니트로소기, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, 아미노기, 아실기, 아미드기 및 할로겐기(예를 들면, 브롬, 염소, 요오드 등)가 있다.
비피리딜 오스뮴 착체의 예로서는, 예를 들면, [Os(비피리딜)3], [Os(4,4'-디메틸-2,2'-비피리딜)3], [Os(4,4'-디페닐-2,2'-비피리딜)3], [Os(4,4'-디아미노-2,2'-비피리딜)3], [Os(4,4'-디히드록시-2,2'-비피리딜)3], [Os(4,4'-디카르복시-2,2'-비피리딜)3], [Os(4,4'-디브로모-2,2'-비피리딜)3], [Os(5,5'-디메틸-2,2'-비피리딜)3], [Os(5,5'-디페닐-2,2'-비피리딜)3], [Os(5,5'-디아미노-2,2'-비피리딜)3], [Os(5,5'-디히드록시-2,2'-비피리딜)3], [Os(5,5'-디카르복시-2,2'-비피리딜)3], [Os(5,5'-디브로모-2,2'-비피리딜)3] 등이 있다.
이미다졸의 경우, 배위수는 6이다. 이미다졸은 치환하고 있지 않아도 되고, 치환기를 도입해도 된다. 치환기를 도입함으로써, 예를 들면, 용해도나 산화 환원 전위 등을 조정하는 것이 가능해진다. 치환 위치로서는, 2위치, 4위치 및 5위치가 있다. 치환기는, 예를 들면, 알킬기(예를 들면, 메틸기, 에틸기, 프로필기 등), 아릴기, 알릴기, 페닐기, 히드록시기, 알콕시기(예를 들면, 메톡시기, 에톡시기 등), 카르복시기, 카르보닐기, 술폰기, 술포닐기, 니트로기, 니트로소기, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, 아미노기, 아실기, 아미드기 및 할로겐기(예를 들면, 브롬, 염소, 요오드 등)가 있다.
이미다졸 오스뮴 착체의 예로서는, 예를 들면, [Os(이미다졸)6], [Os(4-메틸-이미다졸)6], [Os(4-페닐-이미다졸)6], [Os(4-아미노-이미다졸)6], [Os(4-히드록시-이미다졸)6], [Os(4-카르복시-이미다졸)6], [Os(4-브로모-이미다졸)6] 등이 있다.
아미노산으로서는, 예를 들면, 아르기닌(L-Arg)이 있다. 아르기닌 오스뮴 착체는 용해성이 높다는 이점을 갖는다. 또, 혼합 배위자로서, 예를 들면, 비피리딜과 이미다졸의 조합, 비피리딜과 아미노산의 조합이 있다. 예를 들면, [Os(이미다졸)2(비피리딜)2], [Os(L-Arg)2(비피리딜)2]이 있다. 혼합 배위자를 이용하면 착체에 여러 가지 성질을 부여할 수 있고, 예를 들면, 아르기닌을 이용하면 착체의 용해성이 향상한다.
(구리 착체)
구리 착체의 배위자로서는, 예를 들면, 암모니아, 비피리딜 화합물, 이미다졸 화합물, 페난트롤린 화합물, 에틸렌디아민 화합물, 아미노산, 트리아진 화합물, 비퀴놀린 화합물, 피리딜아조 화합물, 니트로소 화합물, 옥신 화합물, 벤조티아졸 화합물, 아세틸아세톤 화합물, 안트라퀴논 화합물, 크산텐 화합물, 옥살산 및 상기 각 화합물의 유도체 등의 배위자를 들 수 있다. 이들을 2종류 이상 조합하여 혼합 배위자로 해도 된다.
비피리딜의 경우, 배위수는 4 혹은 6이지만, 안정성의 견지로부터, 비피리딜은 2개 배위시키는 것이 바람직하다. 비피리딜은 치환하고 있지 않아도 되고, 치환기를 도입해도 된다. 치환기를 도입함으로써, 예를 들면, 용해도나 산화 환원 전위 등을 조정하는 것이 가능해진다. 치환 위치로서는, 4, 4'위치 및 5, 5'위치가 있다. 치환기는, 예를 들면, 알킬기(예를 들면, 메틸기, 에틸기, 프로필기 등), 아릴기, 알릴기, 페닐기, 히드록시기, 알콕시기(예를 들면, 메톡시기, 에톡시기 등), 카르복시기, 카르보닐기, 술폰기, 술포닐기, 니트로기, 니트로소기, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, 아미노기, 아실기, 아미드기 및 할로겐기(예를 들면, 브롬, 염소, 요오드 등)가 있다.
비피리딜 구리 착체의 예로서는, 예를 들면, [Cu(비피리딜)2], [Cu(4,4'-디메틸-2,2'-비피리딜)2], [Cu(4,4'-디페닐-2,2'-비피리딜)2], [Cu(4,4'-디아미노-2,2'-비피리딜)2], [Cu(4,4'-디히드록시-2,2'-비피리딜)2], [Cu(4,4'-디카르복시-2,2'-비피리딜)2], [Cu(4,4'-디브로모-2,2'-비피리딜)2], [Cu(5,5'-디메틸-2,2'-비피리딜)2], [Cu(5,5'-디페닐-2,2'-비피리딜)2], [Cu(5,5'-디아미노-2,2'-비피리딜 )2], [Cu(5,5'-디히드록시-2,2'-비피리딜)2], [Cu(5,5'-디카르복시-2,2'-비피리딜)2], [Cu(5,5'-디브로모-2,2'-비피리딜)2], [Cu(비피리딜)3], [Cu(4,4'-디메틸-2,2'-비피리딜)3], [Cu(4,4'-디페닐-2,2'-비피리딜)3], [Cu(4,4'-디아미노-2,2'-비피리딜)3], [Cu(4,4'-디히드록시-2,2'-비피리딜)3], [Cu(4,4'-디카르복시-2,2'-비피리딜)3], [Cu(4,4'-디브로모-2,2'-비피리딜)3], [Cu(5,5'-디메틸-2,2'-비피리딜)3], [Cu(5,5'-디페닐-2,2'-비피리딜)3], [Cu(5,5'-디아미노-2,2'-비피리딜)3], [Cu(5,5'-디히드록시-2,2'-비피리딜)3], [Cu(5,5'-디카르복시-2,2'-비피리딜)3], [Cu(5,5'-디브로모-2,2'-비피리딜)3] 등이 있다.
이미다졸의 경우, 배위수는 4이다. 이미다졸은 치환하고 있지 않아도 되고, 치환기를 도입해도 된다. 치환기를 도입함으로써, 예를 들면, 용해도나 산화 환원 전위 등을 조정하는 것이 가능해진다. 치환 위치로서는, 2위치, 4위치 및 5위치가 있다. 치환기는, 예를 들면, 알킬기(예를 들면, 메틸기, 에틸기, 프로필기 등), 아릴기, 알릴기, 페닐기, 히드록시기, 알콕시기(예를 들면, 메톡시기, 에톡시기 등), 카르복시기, 카르보닐기, 술폰기, 술포닐기, 니트로기, 니트로소기, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, 아미노기, 아실기, 아미드기 및 할로겐기(예를 들면, 브롬, 염소, 요오드 등)가 있다.
이미다졸 구리 착체의 예로서는, 예를 들면, [Cu(이미다졸)4], [Cu(4-메틸- 이미다졸)4], [Cu(4-페닐-이미다졸)4], [Cu(4-아미노-이미다졸)4], [Cu(4-히드록시-이미다졸)4], [Cu(4-카르복시-이미다졸)4], [Cu(4-브로모-이미다졸)4] 등이 있다.
아미노산으로서는, 예를 들면, 아르기닌(L-Arg)이 있다. 아르기닌 구리 착체는 용해성이 높다는 이점을 갖는다. 또, 혼합 배위자로서, 예를 들면, 비피리딜과 이미다졸의 조합, 비피리딜과 아미노산의 조합이 있다. 예를 들면, [Cu(이미다졸)2(비피리딜)], [Cu(L-Arg)2(비피리딜)]이 있다. 혼합 배위자를 이용하면 구리 착체에 여러 가지 성질을 부여할 수 있고, 예를 들면, 아르기닌을 이용하면 착체의 용해성이 향상한다.
이상의 전이 금속 착체의 설명은 전이 금속의 종류에 착안하여 예를 든 것이고, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다. 이하, 전이 금속 착체에 대해서, 배위자에 착안하여 설명한다.
N, O, S의 배위 원자를 갖는 배위자란 분자 내에, 예를 들면, =N-OH, -COOH, -OH, -SH, >C=O 등의 기를 갖고 있는 것을 말한다. 이러한 배위자를 갖는 금속 착체로서는, 예를 들면, NN 킬레이트, NO 킬레이트, NS 킬레이트, OO 킬레이트, OS 킬레이트, SS 킬레이트(두 자리 배위), N 킬레이트(한 자리), NNN 킬레이트(세 자리) 등이 있고, 조합은 다종에 달한다. 배위자에 이중 결합을 갖고 있는 것을 선택하면, Cu, Fe, Ru, Os의 금속은 전자 전달/수수 기능이 붙기 쉽다. 배위자로서는, 바람직하게는 방향환을 갖고 있는 것이 좋다. 상술한 바와 같이, 배위자에 여러 가지 치환기를 도입해도 된다. 예를 들면, 술폰기 등을 도입하면, 금속 착체의 용해도의 상승에 이어진다. 금속 착체를 형성시킬 때에, 배위자를 2종 이상 혼재시켜, 혼합 배위자 착체로서도 사용해도 된다. 예를 들면, 배위자의 1개로서, 아미노산을 혼재시켜 두면 효소와의 친화성이 좋아지거나 하는 경우가 있다. 또, 중심 금속의 일부의 부위에 각종 할로겐(예를 들면, Cl, F, Br, I)을 부가하는 등 하여도 된다. 이하에, 배위의 유형별의 분류한 전이 금속 착체의 일례를 나타낸다.
(NN 배위형)
페난트롤린 유도체
Cu+1,10-페난트롤린
Fe+1,10-페난트롤린
Cu+바토페난트롤린(Bathophenanthroline)
Fe+바토페난트롤린
Cu+바토페난트롤린 술폰산
Fe+바토페난트롤린 술폰산
비피리딜 유도체
Cu+2,2'-비피리딜
Fe+2,2'-비피리딜
Fe+4,4'-디아미노-2,2'-비피리딜
Ru+4,4'-디아미노-2,2'-비피리딜
트리아진 유도체
Cu+TPTZ (2,4,6-트리피리딜-S-트리아진)
Fe+TPTZ (2,4,6-트리피리딜-S-트리아진)
Fe+PDTS (3-(2-피리딜)-5,6-비스(4-술포페닐)-1,2,4-트리아진)
비퀴놀린 유도체
Cu+큐프로인(Cuproin) (2,2'-비퀴놀린)
피리딜아조 유도체
Fe+니트로-PAPS (2-(5-니트로-2-피리딜아조)-5-[N-n-프로필-N-(3-술포프로필)아미노]페놀)
(NO 배위형)
Fe+니트로소-PSAP (2-니트로소-5-[N-n-프로필-N-(3-술포프로필)아미노]페놀)
Fe+니트로소-ESAP (2-니트로소-5-[N-에틸-N-(3-술포프로필)아미노]페놀)
Fe+1-니트로소-2-나프톨
(NS 배위형)
Fe+2-아미노-4-티아졸아세트산
(OO 배위형)
Fe+1,2-나프토퀴논-4-술폰산
(혼합 배위자형)
Os+Cl, 이미다졸, 4,4'-디메틸-2,2'-비피리딜
Os+이미다졸, 4,4'-디메틸-2,2'-비피리딜
Cu+L-아르기닌, 2,2'-비피리딜
Cu+에틸렌디아민, 2,2'-비피리딜
Cu+이미다졸, 2,2'-비피리딜
다음에, 본 발명에 있어서, 상기 발색제는 특별히 제한되지 않지만, 2-(4-요오드페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-페닐-2H-테트라졸륨클로라이드(INT), 3-(4,5,-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨브로마이드(MTT), 3,3'-(1,1'-비페닐-4,4'-디일)-비스(2,5-디페닐-2H-테트라졸륨클로라이드)(네오-TB), 3,3'-[3,3'-디메톡시-(1,1'-비페닐)-4,4'-디일]-비스[2-(4-니트로페닐)-5-페닐-2H-테트라졸륨클로라이드(니트로-TB), 3,3'-[3,3'-디메톡시-(1,1'-비페닐)-4,4'-디일]-비스(2,5-디페닐-2H-테트라졸륨클로라이드)(TB), 2-(4-요오드페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨,모노나트륨염(WST-1), 2-(4-요오드페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨,모노나트륨염(WST-3), 2-벤조티아졸릴-3-(4-카르복시-2-메톡시페닐)-5-[4-(2-술포에틸카르바모일)페닐]-2H-테트라졸륨(WST-4)2,2'-디벤조티아졸릴-5,5'-비스[4-디(2-술포에틸)카르바모일페닐]-3,3'-(3,3'-디메톡시-4,4'-비페닐렌)디테트라졸륨,디나트륨염(WST-5), 2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨,모노나트륨염(WST-8), 2-(2-벤조티아졸릴)-3,5-디페닐테트라졸륨브로마이드, 2-(2-벤조티아졸릴)-3-(4-니트로페닐)-5-페닐테트라졸륨브로마이드, 2,3-비스(4-니트로페닐)-5-페닐테트라졸륨클로라이드, 2,3-디(4-니트로페닐)테트라졸륨퍼클로레이트, 3-(3-니트로페닐)-5-메틸-2-페닐테트라졸륨클로라이드, 3-(4-니트로페닐)-5-메틸-2-페닐테트라졸륨클로라이드, 철 착체, 구리 착체를 들 수 있다. 한편, 철 착체, 구리 착체도 미디에이터로서의 기능을 갖지만, 본 발명에 있어서는, 발색제로서 사용하는 것도 가능하다. 예를 들면, 구리 착체로서는, 상술한 바와 같이, 예를 들면, 비피리딜 구리 착체, 이미다졸 구리 착체, 아미노산(예를 들면, 아르기닌 등) 구리 착체, 이미다졸·비피리딜 구리 착체, 이미다졸·아미노산 구리 착체 등이 있다. 구리 착체는 전자의 전달에 의해, 청색(Cu2+)으로부터 적갈색(Cu+)으로 색조가 변화한다. 구리 착체를 발색제로서 사용하는 경우의 미디에이터로서는, 구리 이외의 전이 금속 착체가 사용되고, 오스뮴 착체, 루테늄 착체가 바람직하다.
다음에, 본 발명의 비색 분석 방법을 시험편에 적용한 예에 대해, 미디에이터로서 오스뮴 착체를 사용하고, 발색제로서 MTT를 사용하고, 또한 글루코오스를 분석 대상으로 한 경우를 예로 들어 설명한다. 한편, 콜레스테롤 등의 그 밖의 성분 분석은 그것에 따라 산화 환원 효소를 바꾸는 이외는, 기본적으로 마찬가지이다.
우선, 오스뮴 착체를 준비한다. 이것은 시판품을 사용해도 되지만, 후술의 실시예의 방법으로 자가 조제해도 된다. 오스뮴 착체는 완충액에 용해하고, 이것에 MTT, 바인더 등의 첨가제, 글루코오스디히드로게나아제(GDH)를 용해하여 시약액으로 한다. 완충액으로서는, 인산 완충액, 굿(good)의 완충액 등이 있다. 오스뮴 착체의 농도는 완충액 전체에 대하여, 예를 들면, 1∼10질량%이다. 바인더로서는, 예를 들면, 히드록시프로필셀룰로오스(HPC), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리아크릴아미드, 우(牛)혈청 알부민(BSA) 등이 있고, 이 중에서, HPC이 바람직하다. 또, 바인더의 농도는, 예를 들면, 0.5∼5질량%의 범위이다. GDH의 농도는, 예를 들면, 1000∼50000U/㎖이다. MTT의 농도는 특별히 제한되지 않는다. 그리고, 상기 시약액을 여과지 등의 다공질 시트에 함침시키고, 그 후 건조시킴으로써, 글루코오스 분석용 시험편을 작성할 수 있다. 한편, 상기 시약액의 함침에 앞서, 무기 겔 용액을 상기 다공질 시트에 함침시켜, 건조시키는 것이 바람직하다. 무기 겔로서는, 예를 들면, 스멕타이트 등이 있다. 상기 무기 겔 용액의 무기 겔 농도는, 예를 들면, 1∼5질량%, 바람직하게는 1∼3질량%, 보다 바람직하게는 1.5∼2질량%이다. 상기 무기 겔 용액에는, CHAPS 등의 양성 계면활성제를 함유시켜도 된다. 상기 무기 겔 용액 전체에 대한 상기 양성 계면활성제의 농도는, 예를 들면, 0.1∼2질량%, 바람직하게는 0.1∼1질량%, 보다 바람직하게는 0.2∼0.4질량%이다. 상기 무기 겔의 상기 다공질 시트에 대한 함침량은 다공질 시트의 공극 체적 기준으로, 예를 들면, 1∼50mg/㎤, 바람직하게는, 10∼30mg/㎤, 15∼20mg/㎤이다. 상기 다공질 시트는 구멍 직경이 두께 방향 혹은 시트면 방향에 따라 변화하는 비대칭 다공질막이어도 된다. 이 시험편에, 혈액 등의 글루코오스를 포함하는 시료를 점착하면, 그 농도에 따라, 상기 MTT가 발색한다. 이 발색의 정도를 측정함으로써, 글루코오스의 정성 혹은 정량 분석이 가능하다. 또, 분석에 필요한 시간은 시료 점착 후, 약 1∼3초이다. 이 시험편에 무기 겔을 함침시키고 있으면, 보다 균일하고 안정한 발색을 얻을 수 있다.
상기 무기 겔은, 예를 들면, 팽윤성 점토 광물을 사용하는 것이 바람직하다. 팽윤성 점토 광물 중, 더욱 바람직한 것은 벤토나이트, 스멕타이트, 버미쿨라이트 또는 합성 불소 운모이고, 특히 바람직하게는 합성 헥토라이트 혹은 합성 사포나이트 등의 합성 스멕타이트, 또는 합성 불소 운모로 대표되는 팽윤성 합성 운모(또는 Na형 운모) 등의 합성 운모(천연의 운모는 보통 비팽윤성 점토 광물이다)이다.
다음에, 본 발명의 비색 분석 방법을 액계 분석에 적용한 예를, 미디에이터로서 오스뮴 착체를 사용하고, 발색제로서 MTT를 사용하고, 또한 글루코오스를 분석 대상으로 한 경우를 예로 들어 설명한다. 한편, 콜레스테롤 등의 그 밖의 성분 분석은 그것에 따라서 산화 환원 효소를 바꾸는 이외는, 기본적으로 마찬가지이다.
다시 말해, 오스뮴 착체, GDH, MTT 및 완충액에 용해하여 시약액을 조제한다. 한편, 물에 용해하여도 되지만, 완충액에 용해하는 것이 바람직하다. 완충액의 pH는, 예를 들면, pH6∼8의 범위이며, 바람직하게는 pH6.5∼7의 범위이다. 또, 오스뮴 착체의 농도는, 예를 들면, 0.1∼60mM이며, 바람직하게는 0.2∼10mM이며, 보다 바람직하게는 0.3∼0.6mM이다. GDH의 농도는, 예를 들면, 10∼1000U/㎖이며, 바람직하게는, 50∼500U/㎖이며, 보다 바람직하게는, 100∼200U/㎖이다. MTT의 농도는 특별히 제한되지 않는다. 이 시약액에 혈액 등의 글루코오스를 포함하는 검체를 첨가하면, 예를 들면, 5초 이내의 단시간에, 상기 시약액이 검체의 글루코오스 농도에 따라 발색한다. 이 변화는 육안으로 확인해도 되고, 분광 광도계 등의 광학계 측정 장치를 이용하여 측정해도 된다.
상기 검체의 첨가량은 상기 시약액 1㎖에 대해, 예를 들면, 1∼100㎕의 범위이며, 바람직하게는 3∼10㎕의 범위이며, 보다 바람직하게는 5∼10㎕의 범위이다.
(실시예)
다음에, 본 발명의 실시예에 대하여 설명한다. 한편, 하기에 있어서, PQQ란 피롤로퀴놀린퀴논을 나타내고, 그 밖의 시약의 상세는 이하와 같다.
Figure 112006003434396-PAT00001
(실시예 1)
우선, 오스뮴 착체 [OsCl(Him)(dmbpy)2]를 합성했다. 다시 말해, 우선, (NH4)2[OsCl6] 2.00g(4.56mmol)과 디메틸비피리딜(dmbpy) 1.68g(9.11mmol)을 질소 기류하, 에틸렌글리콜(60㎖) 중에서 1시간 환류했다. 실온까지 냉각한 후, 1M 아디티온산나트륨(sodium dithionite) 수용액(120㎖)을 30분 걸쳐서 부가하고, 얼음욕 중에서 30분간 냉각했다. 얻어진 침전을 감압 여과하여, 충분히 물로 세정했다(500∼1000㎖ 사용). 추가로 디에틸에테르로 2번 세정한 후, 감압 건조했다. 이에 의해 [OsCl2(dmbpy)2]를 1.5∼1.7g 얻었다. 얻어진 [OsCl2(dmbpy)2] 1.56g(2.60mmol)과 이미다졸(Him) 0.36g(5.2mmol)을 질소 기류하, 물/메탄올 혼합 용매(50㎖) 중에서 2시간 환류했다. 실온까지 냉각한 후, 포화 NaCl 수용액(300㎖)을 가했다. 얻어진 침전을 감압 여과하고, 포화 NaCl 수용액으로 세정한 후, 감압 건조하여, [OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2를 얻었다. 얻어진 [OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2를 될 수 있는 한 소량의 아세토니트릴/메탄올(1:1 v/v)로 녹이고, 칼럼 크로마토그래피(흡착제:활성 알루미나, 전개 용매:아세토니트릴/메탄올)로 정제했다. 용매를 증발시킨 후, 소량의 아세톤에 녹여, 디에틸에테르로 재침전시켰다. 얻어진 침전을 감압 여과한 후, 감압 건조함으로써, 정제[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2를 얻었다.
상기 오스뮴 착체를 포함하는 하기 시약액을 조제했다. 광로 길이 10㎜의 마이크로 셀(재질·폴리메타크릴레이트)에, 여러 가지 농도의 글루코오스(GLU) 수용액(농도:0, 200, 400, 600mg/100㎖)을 5㎕ 넣고, 추가로 하기 시약액을 1000㎕ 넣음과 동시에 파장 600㎚로 흡광도를 측정했다. 이 결과를 도 1의 그래프에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 글루코오스 농도에 따라서, 발색한 것을 알 수 있다. 또, 반응은 신속하게 행하여지며, 기질을 다 소비할 때까지 실질적으로 2초 정도밖에 걸리지 않았다.
(시약액 조성)
MTT(도진 화학사제) 0.5mM
[OsCI(Him)(dmbpy)2]Cl2 0.1mM
PIPES (pH7.0) 40mM
PQQGDH 200U/㎖
(실시예 2)
상기 오스뮴 착체를 포함하는 하기 시약액을 조제했다. 광로 길이 10㎜의 마이크로 셀(재질·폴리메타크릴레이트)에, 여러 가지 농도의 글루코오스(GLU) 수용액(농도:0, 200, 400, 600mg/100㎖)을 5㎖ 넣고, 추가로 하기 시약액을 1000㎕ 넣음과 동시에 파장 600㎚로 흡광도를 측정했다. 이 결과를 도 2의 그래프에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 글루코오스 농도에 따라서, 발색한 것을 알 수 있다. 또, 반응은 신속하게 행하여지며, 기질을 다 소비할 때까지 실질적으로 1초 정도밖에 걸리지 않았다.
(시약액 조성)
WST-5(도진 화학사제) 0.5mM
[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2 0.1mM
PIPES (pH7.0) 40mM
PQQGDH 200U/㎖
(실시예 3)
하기 루테늄 착체를 포함하는 하기 시약액을 조제했다. 광로 길이 10㎜의 마이크로 셀(재질·폴리메타크릴레이트)에, 여러 가지 농도의 글루코오스(GLU) 수용액(농도:0, 200, 400, 600mg/100㎖)을 5㎕ 넣고, 추가로 하기 시약액을 1000㎕ 넣음과 동시에 파장 600㎚로 흡광도를 측정했다. 이 결과를 도 3의 그래프에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 글루코오스 농도에 따라서, 발색한 것을 알 수 있다. 또, 반응은 신속하게 행하여지며, 기질을 다 소비할 때까지 실질적으로 2초 정도밖 에 걸리지 않았다.
(시약액 조성)
WST-5(도진 화학사제) 0.5mM
[Ru(NH3)6]Cl3(알드리치(Aldrich) 사제) 10mM
PIPES (pH7.0) 40mM
PQQGDH 200U/㎖
(실시예 4)
CuCl2와 2,2'-비피리딜(bpy)을 몰비 1:2로 약 80℃의 온욕 중에서 혼합하고, [Cu(bpy)2]Cl2를 합성하며, 또한, 이 구리 착체를 포함하는 하기 시약액을 조제했다. 광로 길이 10㎜의 마이크로 셀(재질·폴리메타크릴레이트)에, 여러 가지 농도의 글루코오스(GLU) 수용액(농도:0, 200, 400, 600mg/100㎖)을 5㎕ 넣고, 추가로 하기 시약액을 1000㎕ 넣음과 동시에 파장 600㎚로 흡광도를 측정했다. 이 결과를 도 4의 그래프에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 글루코오스 농도에 따라서, 발색한 것을 알 수 있다. 또, 반응은 신속하게 행하여지며, 기질을 다 소비할 때까지 실질적으로 2초 정도밖에 걸리지 않았다.
(시약액 조성)
WST-5(도진 화학사제) 0.5mM
[Cu(bpy)2]Cl2 1mM
PIPES (pH7.0) 40mM
PQQGDH 200U/㎖
(실시예 5)
여러 가지 배위자를 갖는 구리 착체를 제작했다. 다시 말해, 염화구리(II)와, 이하의 배위자를 몰비 1:2로 혼합하고, 정제수로 녹여, 약 80℃의 온욕 중에서 10분간 배양하여 배위시켜, 착체 용액을 얻었다.
Figure 112006003434396-PAT00002
(실시예 6)
배위자로서, 이하에 나타내는 배위자와 비피리딜을 이용하여, 구리의 혼합 배위자 착체를 제작했다. 다시 말해, 구리:이하의 배위자:비피리딜을 몰비 1:2:1로 혼합하고, 정제수로 녹여, 약 80℃의 온욕 중에서 10분간 배양하여 배위시켜, 이하의 배위자를 얻었다.
Figure 112006003434396-PAT00003
(실시예 7)
여러 가지 배위자를 이용하여 철 착체를 제작했다. 염화철(III)과 이하의 배위자를 몰비 1:3으로 혼합하고, 정제수로 녹여, 약 80℃의 온욕 중에서 10분간 배양하여 배위시켜, 착체 용액을 얻었다.
Figure 112006003434396-PAT00004
(실시예 8)
이하와 같이 하여, 2종류의 루테늄 착체를 제작했다.
[Ru(NH3)6]
우선, 시판의 루테늄 착체(알드리치사 헥사암민루테늄(III)클로라이드)를 물에 녹여, [Ru(NH3)6]의 착체 용액을 얻었다.
[Ru(4,4'-디아미노-2,2'-비피리딜)3]
<배위자> 11.8g(63.0mmol)의 2,2'-비피리딜-N,N'-디옥사이드(알드리치사제)를 얼음욕으로 냉각한 농황산 120㎖에 천천히 녹여, 반응액을 100℃로 가열했다. 다음에 질산칼륨 64.0g(630mmol)의 100㎖ 농황산 용액을 천천히 적하하고, 그 후 1시간 가열 교반했다. 반응 후, 용액을 실온까지 방랭(放冷)하고, 쇄빙(碎氷)에 쏟고, 4,4'-디니트로-2,2'-비피리딜-N,N'-옥사이드의 고체를 여과하여 얻었다. 아르곤 기류하, 4,4'-디니트로-2,2'-비피리딜-N,N'-옥사이드 7.0g(25mM), 10% 팔라듐 탄소 6.0g을 에탄올 23㎖에 현탁시켰다. 이 용액에 히드라진 일수화물 6.3g(126mmol)의 47㎖ 에탄올 용액을 적하하여, 8 시간 환류했다. 반응액을 방랭 후, 여과하여, 여과액을 농축했다. 정제는 실리카 겔 칼럼으로 행하여, 4,4'-디아미노-2,2'-비피리딜을 얻었다.
<합성> 50㎖의 2목형 플라스크에 에틸렌글리콜(10㎖)을 넣고, DA-bpy(0.2g), RuCl3(0.1g)을 순차로, 교반 용해시키고, N2 기류하에서 강 교반하면서 맨틀 히터로 가열하여, 약 4시간 환류했다.
<정제> N2 기류하에서 교반·방랭한 후 100㎖의 가지 형상 플라스크에 옮기고, 반응액을 아세톤(5㎖)+디에틸에테르(20㎖)로 세정했다. 용매의 에틸렌글리콜이 충분히 제거되기까지, 반응액을 아세톤(5㎖)+디에틸에테르(20㎖)로 반복 세정했다. 충분히 세정한 목적물을 에탄올로 용해시키고, 디에틸에테르를 가함으로써 목적물을 침전시켰다. 디에틸에테르로 세정하면서 여과 분리하고, 감압 건조시켜, [Ru(4,4'-디아미노-2,2'-비피리딜)3]의 고체를 얻었다. 이것을 물에 녹여 착체 용 액을 얻었다.
(실시예 9)
이하와 같이 하여, 2종류의 오스뮴 착체를 제작했다.
[OsCl(Him)(dmbpy)2]
<합성> (NH4)2[OsCl6] 2.00g(4.56mmol, 알드리치)과 4,4'-디메틸-2,2'-비피리딜(dmbpy 와코 순약약(和光純約藥)) 1.68g(9.11mmol)을 질소 기류하, 에틸렌글리콜60㎖ 중에서 1h 환류했다. 실온까지 냉각한 후, 1M 아디티온산나트륨 수용액 120㎖을 30min에 걸쳐 가하고, 얼음욕 중에서 30min 냉각했다. 얻어진 침전을 감압 여과하여, 충분히 물로 세정했다(500∼1000㎖ 사용). 추가로 디에틸에테르로 2번 세정한 후, 감압 건조했다. 이것으로서 [OsCl2(dmbpy)2]를 1.5∼1.7g 얻는다. 얻어진 [OsCl2(dmbpy)2] 1.56g(2.60mmol)과 이미다졸(Him) 0.36g(5.2mmol)을 질소 기류하, 물/메탄올 혼합 용매 50㎖ 중에서 2h 환류했다. 실온까지 냉각한 후, 포화 NaCl 수용액 300㎖을 가했다. 얻어진 침전을 감압 여과하고, 포화 NaCl 수용액으로 세정한 후, 감압 건조하여, [OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2를 얻었다.
<정제> [OsCl(Him)(dmpyy)2]Cl2를 될 수 있는 한 소량의 아세토니트릴/메탄올(1:1 v/v)로 녹여, 칼럼 크로마토그래피(흡착제:활성 알루미나, 전개 용매:아세토니트릴/메탄올)로 정제했다. 용매를 증발시킨 후, 소량의 아세톤에 녹여, 디에틸에테르로 재침전시켰다. 얻어진 침전을 감압 여과한 후, 감압 건조했다. 이것 을 물에 녹여 착체 용액을 얻었다.
[Os(Him)2(dmbpy)2]
<합성> (NH4)2[OsCI6] 2.00g(4.56mmol)과 dmbpy 1.68g(9.11mmol)을 질소 기류하, 에틸렌글리콜 60㎖ 중에서 1h 환류했다. 실온까지 냉각한 후, 1M 아디티온산나트륨 수용액 120㎖을 30min에 걸쳐 가하여, 얼음욕 중에서 30min 냉각했다. 얻어진 침전을 감압 여과하여, 충분히 물로 세정했다(500∼1000㎖ 사용). 추가로 디에틸에테르로 2번 세정한 후, 감압 건조했다. 이것으로 [OsCl2(dmbpy)2]를 1.5∼1.7g 얻는다. 얻어진 [OsCl2(dmbpy)2] 1.56g(2.60mmol)과 Him 0.36g(5.2mmol)을 질소 기류하, 1,2-에탄디올 용매 50㎖ 중에서 2h 환류했다. 실온까지 냉각한 후, 포화 NaCl 수용액 300㎖를 가했다. 얻어진 침전을 감압 여과하고, 포화 NaCl 수용액으로 세정한 후, 감압 건조하여, [Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2를 얻었다.
<정제> [Os(Him)2(dmpyy)2]Cl2를 될 수 있는 한 소량의 아세토니트릴/메탄올(1:1 v/v)로 녹여, 칼럼크로마토그래피(흡착제:활성 알루미나, 전개 용매:아세토니트릴/메탄올)로 정제했다. 용매를 증발시킨 후, 소량의 아세톤에 녹여, 디에틸에테르로 재침전시켰다. 얻어진 침전을 감압 여과한 후, 감압 건조했다. 이것을 물에 녹여 착체 용액을 얻었다.
(실시예 10)
이하에 나타내는 조성으로, 착체·효소·발색제·완충액을 혼합하여 시약액 을 조제했다. 한편, 상기 착체는 상술의 실시예에서 합성한 것을 사용했다. 이하의 실시예도 마찬가지이다. 상기 시약액의 스펙트럼을 측정하여 블랭크(blank)로 하고, 추가로 상기 착체에 대하여 당량의 글루코오스를 첨가하여, 색조 변화 후의 스펙트럼을 측정했다. 이 결과를 도 5에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 금속 착체가 전자 전달제로서 작용하여 WST-5를 환원하여, 환원형 WST-5 특유의 스펙트럼을 나타냈다.
(시약액 조성)
PQQ-GDH 50U/㎖
[Ru(NH3)6] 0.8mM
WST-5 0.2mM
PIPES pH7 50mM
트리톤(Triton) X-100 0.5%
(실시예 11)
이하에 나타내는 조성으로, 착체·효소·발색제·완충액을 혼합하여 시약액을 조제하고, 이것을 스펙트럼 측정하여, 블랭크로 하고, 추가로 상기 착체에 대하여 당량의 글루코오스를 첨가하여, 색조 변화 후의 스펙트럼을 측정했다. 이 결과를 도 6(a), 도 6(b)에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 금속 착체가 전자 전달제로서 작용하여 MTT를 환원하여, 환원형 MTT 특유의 스펙트럼을 나타냈다.
(시약액 조성 1: 도 6(a))
PQQ-GDH 50U/㎖
[Cu(1,10-페난트롤린)2] 1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
트리톤 X-100 0.5%
(시약액 조성 2: 도 6(b))
PQQ-GDH 50U/㎖
[Fe(바토페난트롤린)3] 1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
트리톤 X-100 0.5%
(바토페난트롤린=4,7-디페닐페난트롤린)
(실시예 12)
이하에 나타내는 조성으로, 착체·효소·발색제·완충액을 혼합하여 시약액을 조제하고, 이것을 스펙트럼 측정하여, 블랭크로 하고, 추가로 상기 착체에 대하여 당량의 글루코오스를 첨가하여, 색조 변화 후의 스펙트럼을 측정했다. 이 결과를 도 7(a), 도 7(b)에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 금속 착체가 전자 전달제로서 작용하여 MTT를 환원하여, 환원형 MTT 특유의 스펙트럼을 나타냈다.
(시약액 조성 1: 도 7(a))
PQQ-GDH 50U/㎖
[Fe(2,2'-비피리딜)3] 1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
트리톤 X-100 0.5%
(시약액 조성 2: 도 7(b))
PQQ-GDH 50U/㎖
[Fe(4,4'-디아미노-2,2'-비피리딜)3] 0.1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
트리톤 X-100 0.5%
(실시예 13)
이하에 나타내는 조성으로, 착체·효소·발색제·완충액을 혼합하여 시약액을 조제하고, 이것을 스펙트럼 측정하여, 블랭크로 하고, 추가로 상기 착체에 대하여 당량의 글루코오스를 첨가하여, 색조 변화 후의 스펙트럼을 측정했다. 이 결과를 도 8에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 금속 착체가 전자 전달제로서 작용하여 MTT를 환원하여, 환원형 MTT 특유의 스펙트럼을 나타냈다.
(시약액 조성)
PQQ-GDH 50U/㎖
[Fe(TPTZ)3] 0.1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
트리톤 X-100 0.5%
(TPTZ=2,4,6-트리피리딜-s-트리아진)
(실시예 14)
이하에 나타내는 조성으로, 착체·효소·발색제·완충액을 혼합하여 시약액을 조제하고, 이것을 스펙트럼 측정하여, 블랭크로 하고, 추가로 상기 착체에 대하여 당량의 글루코오스를 첨가하여, 색조 변화 후의 스펙트럼을 측정했다. 이 결과를 도 9에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 금속 착체가 전자 전달제로서 작용하여 MTT를 환원하여, 환원형 MTT 특유의 스펙트럼을 나타냈다.
(시약액 조성)
PQQ-GDH 50U/㎖
[Cu(큐프로인)2] 1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
*트리톤 X-100 0.5%
(큐프로인=2,2'-비퀴놀린)
(실시예 15)
이하에 나타내는 조성으로, 착체·효소·발색제·완충액을 혼합하여 시약액 을 조제하고, 이것을 스펙트럼 측정하여, 블랭크로 하고, 추가로 상기 착체에 대하여 당량의 글루코오스를 첨가하여, 색조 변화 후의 스펙트럼을 측정했다. 이 결과를 도 10에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 금속 착체가 전자 전달제로서 작용하여 MTT를 환원하여, 환원형 MTT 특유의 스펙트럼을 나타냈다.
(시약액 조성)
PQQ-GDH 50U/㎖
[Fe(니트로-PAPS)3] 0.02mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
트리톤 X-100 0.5%
(실시예 16)
이하에 나타내는 조성으로, 착체·효소·발색제·완충액을 혼합하여 시약액을 조제하고, 이것을 스펙트럼 측정하여, 블랭크로 하고, 추가로 상기 착체에 대하여 당량의 글루코오스를 첨가하여, 색조 변화 후의 스펙트럼을 측정했다. 이 결과를 도 11에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 금속 착체가 전자 전달제로서 작용하여 MTT를 환원하여, 환원형 MTT 특유의 스펙트럼을 나타냈다.
(시약액 조성)
PQQ-GDH 50U/㎖
Fe(1-니트로소-2-나프톨)3] 0.1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
트리톤 X-100 0.5%
(실시예 17)
이하에 나타내는 조성으로, 착체·효소·발색제·완충액을 혼합하여 시약액을 조제하고, 이것을 스펙트럼 측정하여, 블랭크로 하고, 추가로 상기 착체에 대하여 당량의 글루코오스를 첨가하여, 색조 변화 후의 스펙트럼을 측정했다. 이 결과를 도 12에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 금속 착체가 전자 전달제로서 작용하여 MTT를 환원하여, 환원형 MTT 특유의 스펙트럼을 나타냈다.
(시약액 조성)
PQQ-GDH 50U/㎖
[Fe(2-아미노-4-티아졸아세트산)3] 1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
트리톤 X-100 0.5%
*(실시예 18)
이하에 나타내는 조성으로, 착체·효소·발색제·완충액을 혼합하여 시약액을 조제하고, 이것을 스펙트럼 측정하여, 블랭크로 하고, 추가로 상기 착체에 대하여 당량의 글루코오스를 첨가하여, 색조 변화 후의 스펙트럼을 측정했다. 이 결과 를 도 13에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 금속 착체가 전자 전달제로서 작용하여 MTT를 환원하여, 환원형 MTT 특유의 스펙트럼을 나타냈다.
(시약액 조성)
PQQ-GDH 50U/㎖
[Fe(1,2-나프토퀴논-4-술폰산)3] 1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
트리톤 X-100 0.5%
(실시예 19)
이하에 나타내는 조성 1, 2로, 착체·효소·발색제·완충액을 혼합하여 시약액을 조제하고, 이것을 스펙트럼 측정하여, 블랭크로 하고, 추가로 상기 착체에 대하여 당량의 글루코오스를 첨가하여, 색조 변화 후의 스펙트럼을 측정했다. 이 결과를 도 14(a), 도 14(b)에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 금속 착체가 전자 전달제로서 작용하여 MTT를 환원하여, 환원형 MTT 특유의 스펙트럼을 나타냈다.
(시약액 조성 1: 도 14(a))
PQQ-GDH 50U/㎖
[OsCI(Him)(dmbpy)2] 0.1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
트리톤 X-100 0.5%
(Him=이미다졸)
(dmbpy=4,4'-디메틸-2,2'-비피리딜)
(시약액 조성 2: 도 14(b))
PQQ-GDH 50U/㎖
[Os(Him)2(dmbpy)2] 0.1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
트리톤 X-100 0.5%
(Him=이미다졸)
(dmbpy=4,4'-디메틸-2,2'-비피리딜)
(실시예 20)
이하에 나타내는 조성으로, 착체·효소(피루브산 옥시다제)·발색제·완충액을 혼합하여 시약액을 조제하고, 이것을 스펙트럼 측정하여, 블랭크로 하고, 추가로 상기 착체에 대하여 당량의 글루코오스를 첨가하여, 색조 변화 후의 스펙트럼을 측정했다. 이 결과를 도 15에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 금속 착체가 전자 전달제로서 작용하여 MTT를 환원하여, 환원형 MTT 특유의 스펙트럼을 나타냈다.
(시약액 조성)
피루브산옥시다아제(Pyruvate Oxidase) 100U/㎖
[OsCl(Him)(dmbpy)2] 0.1mM
MTT 1mM
PIPES pH7 50mM
트리톤 X-100 0.5%
(Him=이미다졸)
(dmbpy=4,4'-디메틸-2,2'-비피리딜)
(실시예 21)
이 실시예는, 효소량을 증가시킴으로써, 시약의 반응 속도를 향상시킬 수 있는 것을 확인한 실시예이다. 우선, 2개의 망상(mesh) 섬유(10㎝×10㎝)에 대하여, 이하의 조성 1, 2의 시약액을 1㎖ 함침하여, 열풍으로 건조시켰다. 이 섬유를 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET) 필름에 부착하고, 소정 형상으로 재단하고, 효소량이 상이한 2종류의 시험편을 제작했다. 이 시험편에, 시료로서, 혈청 베이스의 글루코오스 표준액 0, 200, 400, 600mg/㎗ 점착하여, 반사율 측정 장치(LED/파장 660㎚)에 의해, 30초간의 K/S 변화를 관찰했다. 한편, 상기 혈청 베이스의 글루코오스 표준액은 완전히 해당(解糖)한 인간 전혈(whole blood)의 혈장을 동결 융해하여, 얻어진 혈청에 대하여, 글루코오스 용액을 첨가하여 조제한 것이다. 이 결과를 도 16(a), 도 16(b)에 나타낸다. 도시한 바와 같이, 효소량이 5000U/㎖의 경우는, 1000U/㎖의 경우에 비해서 반응 속도가 향상하고, 약 5초로 반응이 종국에 도달했다. 또, 반응이 종국에 도달했다고 생각되는 5초 부근의 시그널을 샘플링하면, 글루코오스 정량이 가능하고, 반응이 종국에 도달하기까지의 타임 코스 기울기 로부터도, 글루코오스 정량이 가능했다.
(시약액 조성 1: 도 16(a))
PQQ-GDH 1000U/㎖
[OsCl(Him)(dmbpy)2] 1㎖
MMT 30mM
PIPES pH6.5 80mM
MEGA-8(도진 화학사제) 1%
폴리아크릴아미드 0.1%
BSA 1%
(시약액 조성 2: 도 16(b))
PQQ-GDH 5000U/㎖
[OsCl(Him)(dmbpy)2] 1㎖
MMT 30mM
PIPES pH6.5 80mM
MEGA-8(도진 화학사제) 1%
폴리아크릴아미드 0.1%
BSA 1%
이상과 같이, 본 발명의 비색 분석 방법에 따르면, 단시간 또한 간단히 신뢰 성이 있는 분석을 실시할 수 있다.

Claims (13)

  1. 산화 환원 효소에 의해, 분석 대상물로부터, 미디에이터를 통하여, 환원에 의해 발색하는 발색제에 전자를 전달하고, 그 결과 발생하는 상기 발색제의 발색을 측정함으로써, 상기 분석 대상물의 정성 혹은 정량을 행하는 비색 분석 방법에 사용하는 시약으로서, 산화 환원 효소, 미디에이터 및 환원에 의해 발색하는 발색제를 포함하고, 상기 미디에이터가 구리 착체, 철 착체, 오스뮴 착체 및 루테늄 착체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 1개인 것을 특징으로 하는 시약.
  2. 제1항에 있어서, 착체의 배위자의 배위 원자가 질소, 산소 및 황으로 이루어지는 그룹의 적어도 1개인 것을 특징으로 하는 시약.
  3. 제2항에 있어서, 상기 착체의 배위자가 암모니아, 비피리딜 화합물, 이미다졸 화합물, 페난트롤린 화합물, 에틸렌디아민 화합물, 아미노산, 트리아진 화합물, 비퀴놀린 화합물, 피리딜아조 화합물, 니트로소 화합물, 옥신 화합물, 벤조티아졸 화합물, 아세틸아세톤 화합물, 안트라퀴논 화합물, 크산텐 화합물, 옥살산 및 상기 각 화합물의 유도체로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 1개인 것을 특징으로 하는 시약.
  4. 제3항에 있어서, 배위자의 배위 위치 이외에 있어서의 수소 원자의 적어도 1 개가 치환기에 의해 치환된 배위자인 것을 특징으로 하는 시약.
  5. 제4항에 있어서, 치환기가 알킬기, 아릴기, 알릴기, 페닐기, 히드록시기, 알콕시기, 카르복시기, 카르보닐기, 술폰기, 술포닐기, 니트로기, 니트로소기, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, 아미노기, 아실기, 아미드기 및 할로겐기로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 1개인 것을 특징으로 하는 시약.
  6. 제1항에 있어서, 착체가 배위자를 2종류 이상 갖는 것을 특징으로 하는 시약.
  7. 제1항에 있어서, 산화 환원 효소가 탈수소 효소 혹은 산화 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
  8. 제1항에 있어서, 발색제가 테트라졸륨염인 것을 특징으로 하는 시약.
  9. 제8항에 있어서, 테트라졸륨염이 니트로페닐기, 티아졸릴기 및 벤조티아졸릴기의 적어도 1개의 기를 갖는 것을 특징으로 하는 시약.
  10. 제8항에 있어서, 테트라졸륨염이 MTT, INT, 네오-TB, 니트로-TB, TB, WST-1, WST-3, WST-4, WST-5, WST-8, 2-(2-벤조티아졸릴)-3,5-디페닐테트라졸륨브로마이 드, 2-(2-벤조티아졸릴)-3-(4-니트로페닐)-5-페닐테트라졸륨브로마이드, 2,3-비스(4-니트로페닐)-5-페닐테트라졸륨클로라이드, 2,3-디(4-니트로페닐)테트라졸륨퍼클로레이트, 3-(3-니트로페닐)-5-메틸-2-페닐테트라졸륨클로라이드, 및, 3-(4-니트로페닐)-5-메틸-2-페닐테트라졸륨클로라이드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 1개의 발색제인 것을 특징으로 하는 시약.
  11. 제1항에 있어서, 분석 대상물이 글루코오스, 콜레스테롤, 요산, 피루브산, 크레아틴, 크레아티닌 혹은 유산이며, 산화 환원 효소가 상기 각 물질에 대응하는 탈수소 효소 혹은 산화 효소인 것을 특징으로 하는 시약.
  12. 제1항의 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 비색 분석용 시험편.
  13. 제12항에 있어서, 추가로, 무기 겔을 포함하는 것을 특징으로 하는 시험편.
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