KR20050112631A - 포유동물의 초유로부터 분리된초유분리유청단백(ｉｗｐ)분획, 그 제조방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포유동물의 초유에서 분리한 1 KD 내지 30 KD의 분자량을 갖는 분리유청단백(IWP; Isolated Whey Protein)분획, 그 제조방법 및 그 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 포유동물의 초유로부터 지방, 카제인,α-락토알부민 및 β-락토글로불린이 제거되고 1 KD ~ 30 KD의 분자량을 가지며, 조골세포 증식 및 파골세포 증식억제 활성을 갖는 초유분리유청단백(IWP; Isolated Whey Protein)분획, 그 제조방법 및 용도에 관한 것이다.

본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획은 조골세포 증식활성, 골형성 촉진, 조골세포의 NO 분비능 촉진활성을 나타내며, 골내 단백질, 회분함량 증가활성, 골무게 및 골밀도 증가 등의 골대사의 증진 또는 개선효과를 나타내므로, 골다공증과 같은 골대사성 질환의 치료 및 예방을 위한 치료제, 유아 및 청소년의 성장발달을 목적으로 하는 식품, 음료, 의약품 및 기능성 식품 등에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

포유동물의 초유로부터 분리된 초유분리유청단백(ＩＷＰ)분획, 그 제조방법 및 용도{Isolated Whey Protein fraction isolated from colostrum of mammalia, preparation and use thereof}

본 발명은 조골세포 증식활성을 나타내는 포유동물의 초유에서 분리한 1 KD 내지 30 KD의 분자량을 갖는 초유분리유청단백(IWP; Isolated Whey Protein)분획에 관한 것이다.

뼈는 몸을 기계적으로 지지하고, 중요장기를 보호하며, 조혈작용(hemopoeisis)에 필요한 미세 환경을 제공하고, 칼슘 및 여러 미네랄을 저장하는 역할을 한다.

뼈의 성장, 발달 및 유지는 일생을 거쳐 연속적으로 일어난다. 노화된 뼈는 파괴되고 이를 대신하여 새로운 뼈가 재형성된다. 이러한 교체는 파골세포와 조골세포로 구성된 BMU(Basic Multicellular Units)에서 주로 일어나는데, 이 과정은 성장과 스트레스로 인한 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 뼈의 기능을 유지하게 하는 역할을 한다. 노화된 뼈의 파괴 또는 흡수는 파골세포(osteoclast)가 그 일을 수행한다. 반면, 새로운 뼈의 형성은 조골세포(osteoblast)가 이를 담당한다. 파골세포는 뼈의 표면에 부착하여 산과 분해효소를 분비함으로서 뼈를 구성하는 인회석 결정 및 교원질과 같은 뼈 기질(bone matrix)을 제거하여 뼈를 파괴하고, 조골세포는 뼈 기질을 합성하여 분비하고 칼슘과 인의 농도를 조절하여 골격을 형성한다 (Stavros C. M., Endocrine Reviews, 21(2), 115-137, 2000).

골의 대사성 질환은 생체 내에서 파골세포와 조골세포의 평형이 깨어짐으로써 발생한다. 대표적인 골 대사성 질환으로는 골다공증(osteoporosis)이 있다. 골다공증은 파골세포의 활성이 조골세포에 비해 증가함으로써 총골량(total bone mass)이 감소하는 증상을 말한다. 골다공증이 발생하면 피질뼈(cortical bone)의 폭이 감소되고 골수의 공동(cavity)이 확대되며 망상조직 골주가 낮아져서 뼈가 계속해서 다공질로 된다. 골다공증이 진전됨에 따라 뼈의 물리적 강도가 저하되어 요통과 관절통이 유발되고, 약간의 충격에도 뼈가 쉽게 부서진다. 골의 대사성 질환으로는 이외에도 류마티스성 또는 퇴행성 관절염, 치주질환을 야기하는 세균에 의해 발생하여 치조골의 파괴가 일어난 치주질환, 각종 유전적인 소인에 의해 발생하는 파게트 질병 (Paget's disease) 등이 있다.

류마티스성 관절염이나 퇴행성 관절염이 있는 경우에도 면역반응에 의해 생성된 종양괴사인자 (tumor necrosis factor), 인터루킨-1, 인터루킨-6 등이 관절강에 존재하는 파골세포의 활성을 증진시켜 관절 부위에 국소적인 뼈의 파괴가 일어난다. 치주질환을 일으키는 세균이 감염되어 염증을 일으키면 면역반응의 결과, 종양괴사인자 (tumor necrosis factor), 인터루킨-1, 인터루킨-6 등 염증성 싸이토카인이 만들어지고 이들이 파골세포의 분화를 촉진시켜 치아를 지지하고 있는 치조골을 파괴하게 된다.

뼈 건강을 위해서는 칼슘 섭취가 필수적이라는 것은 잘 알려져 있지만 뼈의 신진대사에 관계하는 단백질 섭취도 중요하다. 최근의 연구 결과에 의하면, 오스테오폰틴(osteopontin) 등의 단백질들에 의해 칼슘 흡수가 활성화되는 것이 확인되고 있다(Junichi Y 등, Biochemical and Biophysical Research Communications, 261:113, (1999); Amarnani S 등, J Bone Miner Res, 8(2):157, 1993). 칼슘이 뼈에 침착되기 위해서는 오스테오폰틴(osteopontin), 카제인포스포펩티드(CPP) 등의 다양한 인자를 필요로 하며, 그 중에도 카제인포스포펩티드(CPP) 단백질이 매우 중요하다(Tsuchita H. 등, J Nutr, 126(1): 86, 1996; Yuan Y 등, J Nutr, 71(4);583, 1994). 이러한 단백질을 칼슘제제에 혼합시킬 경우, 칼슘의 흡수율은 급격히 높아질 수 있다.

초유는 포유동물이 분만 후 3일까지 모체의 유선을 통해 분비하는 유즙성분으로서, 일반원유에 비해 단백질 등의 함량이 높고, 다양한 생리활성 물질을 포함하고 있다. 초유는 일반원유에 비해 고형분 함량은 약 2배, 단백질은 약 5배 정도로 높은 반면 지방함량은 일반원유의 2/3이며, 면역증진인자나 생리조절인자, 세포분열 활성인자 등이 존재한다(Berseth 등, Am J Clin Nutr, 37(1):52, 1983; Simmen 등, Journal of Animal Science, 68;3596 1990). 특히 IGF-1 등의 성장인자들(growth factor)은 정상유에 비하여 초유에 10배 내지 500배 이상 많이 함유되어 있다(Simmen 등, Journal of Animal Science, 68;3596 1990; Donovan 등, Annual Review of Nutrtion, 14;147 1994). 이러한 성장인자들은 극히 미량으로 존재하지만, 유아의 초기성장에 적극적으로 관여하는 생리조절인자로 기능하고, 골조직, 신경조직, 내부소화기관, 근육의 성장 발달에 크게 영향을 미친다. 또한 초유 내 락토페린(Lactoferrin)이나 락토퍼옥시다제(Lactoperoxidase) 등도 뼈의 칼슘대사에 관여하고 있으며, 기타 여러 가지 펩타이드성 성분들이 직접적으로 관여하고 있다.

이상과 같이, 초유는 영양학적, 면역학적, 성장기적 모든 측면에서의 각종 생리활성 물질을 다량으로 함유하고 있으나, 그 이용방안이나 수집의 어려움, 그리고 가공에 대한 한계성 때문에 실제로는 대부분 폐기 처분되고 있는 실정이다.

본 발명자는 포유동물의 초유에 대한 연구를 수행하던 중 포유동물의 초유에서 분리한 1 KD 내지 30 KD의 분자량을 갖는 초유분리유청단백(IWP; Isolated Whey Protein)분획이 조골세포를 증식시키고, 파골세포의 증식을 억제하는 활성을 나타내어 골다공증을 비롯한 다양한 뼈 관련 질환의 예방 또는 치료에 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 포유동물의 초유에서 분리한 1 KD 내지 30 KD의 분자량을 갖는 초유분리유청단백( IWP; Isolated Whey Protein)분획을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 분획의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분획을 유효성분으로 함유하는 골대사성 질환의 치료 및 예방을 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분획을 유효성분으로 함유하는 골대사성 질환의 예방, 골대사 증진용 또는 개선을 위한 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 포유동물의 초유로부터 지방, 카제인,α-락토알부민 및 β-락토글로불린이 제거되고 1 KD ~ 30 KD의 분자량을 가지며, 조골 세포 증식 및 파골세포 증식억제 활성을 갖는 초유분리유청단백(IWP; Isolated Whey Protein)분획을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 초유분리유청단백(IWP; Isolated Whey Protein)분획의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 초유분리유청단백(IWP; Isolated Whey Protein)분획을 유효성분으로 함유하는 골대사성 질환의 치료 및 예방을 위한 약학적 조성물 및 골대사성 질환의 예방, 골대사 증진 또는 개선을 위한 식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 초유분리유청단백(IWP; Isolated Whey Protein)분획은 포유동물의 초유로부터 지방, 카제인,α-락토알부민 및 β-락토글로불린을 제거하여 수득된 것으로서 1 KD ~ 30 KD의 분자량을 갖는 분획이다.

포유동물은 소, 염소 등을 젖을 분비하는 모든 동물을 말하며, 특히 소가 바람직하다.

본 발명의 1 KD 내지 30 KD의 분자량을 갖는 초유분리유청단백(IWP)분획을 조골세포에 투여하면 본 발명의 분획을 투여하지 않은 세포에 비하여 세포증식이 농도 의존적으로 증가한다(표 1 참조). 또한, 조골세포의 표지 효소인 염기성 인산분해효소(alkaline phosphatase, 이하 ALP라 한다)의 활성도 증가한다(표 2 참조).

이로써, 본 발명의 1 KD 내지 30 KD의 분자량을 갖는 초유분리유청단백( IWP)분획이 조골세포의 증식 및 ALP 활성을 증가시켜 골 형성을 촉진함을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획은 조골세포에 작용하여 조골세포의 NO 분비량을 증가시킨다(표 3참조). 조골세포에서 분비되는 NO는 파골세포의 형성과 분화를 억제하므로(Ralstone, S. H. 등, Endocrinology, 135:330, 1994; Vant Hof R. J. 등, Immunol., 103:255, 2001; Kanamaru Y. 등, Kobe J Med Sci, 47(1):1, 2001), 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획이 조골세포로부터 NO 분비량을 증가시켜 파골세포의 분화를 억제하는 것을 알 수 있다.

또한, 난소절제에 의한 골다공증 동물모델을 이용하여 골대사와 관련된 여러 인자에 미치는 영향을 살펴보았다.

본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획을 섭취한 결과, 실험동물 대퇴골의 프롤라인을 포함한 조단백질의 함량(표 6참조) 및 칼슘과 인을 비롯한 조회분(표 7참조)의 함량이 증가되었다.

또한, 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획이 골형성을 촉진시키고 골 흡수를 감소시켜 대퇴골 무게 및 골밀도(표 5참조)가 증가하였고, 골형성의 지표 물질인 오스테오칼신의 혈청내 농도가 증가하는 경향을 나타냄(표 4참조)을 확인하였다.

이상과 같이, 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획은 조골세포를 증식시키고, ALP 활성을 증가시켜 골 형성을 촉진하며, 조골세포의 NO 분비량을 증가시켜 파골세포의 형성과 분화를 억제하는 등 골대사 개선에 탁월한 효과를 나타낸다. 또한, 뼈내 조단백질 및 조회분의 함량을 증가시켜 골무게 및 골밀도를 증가시킨다.

따라서 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획은 골다공증 등의 골대사성 질환에 효과적이며, 골대사를 증진 및 개선시켜 유아, 청소년 등의 성장발육에 효과적으로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 초유분리유청단백분획을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 초유분리유청단백분획은 지방과 카제인이 제거된 포유동물의 초유유청에서 전기영동법, 염석법 및 이온교환크로마토그래피로 구성된 군에서 선택된 단백질의 등전점을 이용한 분리방법으로 α-락토알부민과 β-락토글로불린을 제거한 다음, 한외여과 또는 겔여과에 의해 1 KD ~ 30 KD의 분자량을 갖는 분획을 수득함으로써 제조된다.

포유동물의 초유로부터 원심분리등으로 지방을 제거한 후, 카제인, α-락토알부민 및 β-락토글로불린은 전기영동법, 염석법, 이온교환크로마토그래피 등 등전점을 이용한 단백질 분리방법으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분리한다.

본 발명의 일실시례에서는 공지의 염석법을 기초로 개선하여 α-락토알부민 및 β-락토글로불린을 분리 제거하였다.

즉 포유동물의 초유를 원심분리하여 지방을 제거하여 탈지초유를 만들고, 상기 탈지초유를 pH 4.5 ~ 4.6으로 조절하여 카제인을 제거하여 초유유청을 수득한 후, 상기 초유 유청에 염기성 화합물을 가하여 pH를 5.0 ~ 7.0으로 조정한 후, 산성화합물을 가하여 pH를 2.5 ~ 4.2로 조정하여 α-락토알부민을 침전, 제거하고, 염기성 화합물을 가하여 pH를 4.5 ~ 7.0으로 조정하여 β-락토글로불린을 침전, 분리하였다. 이때 염기성 화합물로서는 모노구연산나트륨, 디구연산나트륨, 트리구연산나트륨, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨 등을 사용할 수 있으며, 산성 화합물로서 구연산, 염산, 황산 또는 질산 등을 사용할 수 있다.

상기의 제조방법에 의하면, 일반적으로 모노머로 존재하던 α-락토알부민 및 β-락토글로불린이 제조 과정 중에서 중합체 형태로 되어 침전형성이 촉진되어 보다 잘 분리된다.

초유로부터 지방, 카제인,α-락토알부민 및 β-락토글로불린을 제거한 다음, 1 KD 내지 30 KD의 분자량을 갖는 초유분리유청단백(IWP)분획을 수득하기 위해서는 단백질 등의 분자량의 크기에 기초를 둔 모든 알려진 분리방법을 이용할 수 있으나, 보다 바람직하게는 한외여과 또는 겔여과법을 사용하여 분리한다.

수득된 1 KD 내지 30 KD의 분자량을 갖는 초유분리유청단백(IWP)분획은 분무건조, 열풍건조 또는 동결건조하여 분말화하여 사용할 수 있다.

본 발명의 제조방법에 의하면, 초유에서부터 타 성분을 효과적으로 제거할 수 있으며, 골대사성 질환에 효과적이며, 골대사 증진 및 개선효과를 나타내는 초유분리유청단백(IWP; Isolated Whey Protein)분획을 선택적으로 분리할 수 있으며, 상기 분리 공정 중 파생되는 부산물인 유지방, 카제인, α-락토알부민, β-락토글로불린 및 락토즈(분자량 1 KD 이하) 등을 효율적으로 분리하여 산업적으로 이용할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 초유분리유청단백(IWP)분획을 유효성분으로 함유하는 골 대사성 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

"골 대사성 질환"이란 골의 파괴 흡수가 과대하여 생리적 병리상태를 초래하는 질병을 말한다. 골대사성 질환의 예로는 골다공증, 요통, 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염, 구루병, 골연화증, 파제트 골 질환(Paget's disease of bone), 치주질환 등이 있다.

본 발명의 치료용 약학적 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체와 혼합하여 제조할 수 있다. 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료를 혼합하여 정체, 트포키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼(wafer)등의 형태로 사용할 수 있다. 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 및 안정화제를 혼합하여 사용할 수 있으며 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 혼합하여 제조할 수 있다. 치주질환의 치료제는 서방형 약물전달체 (delayed delivery substance: DDS) 또는 치과임프란트체에 DDS를 이용하여 코팅한 형태로 사용될 수 있다.

상기와 같이 제조된 약학적 조성물은 경구투여, 정맥내, 피하, 비강내 또는 복강내 등에 비경구 투여할 수 있다. 이외에 본 발명의 약학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 투여 용량은 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별, 상태 및 치료할 질병의 중증정도에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 발명에서 '유효량'이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획의 통상적인 1일 투여량은 0.1 ~ 500 mg/kg, 바람직하게는 1 ~ 200 mg/kg 의 범위이다. 바람직한 투여량 범위 내에서 1회 또는 수회로 분할 투여할 수 있으며, 상기 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별, 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 초유분리유청단백(IWP)분획을 유효성분으로 함유하는 골대사성 질환의 예방용, 골대사 증진 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.

본 발명에서 식품 조성물로는 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강 식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강 식품으로는 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다.

또한, 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획을 유효성분으로 함유하는 식품조성물은 유아 및 청소년의 성장발달을 목적으로 하는 식품, 음료 및 기능성 식품 등에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 ~ 90%, 바람직하게는 5 ~ 50%의 비율로 함유될 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 초유분리유청단백(IWP)분획의 제조

분만 후 48시간 동안 분비되는 소의 초유를 수집하였다. 초유를 원심분리하여, 크림층을 제거함으로써 지방이 제거된 탈지초유를 만들었다. 탈지초유에 1N 염산을 가하여 pH를 4.6으로 조절하여 카제인을 응고시킨 후, 원심분리하여 상등액인 초유 유청을 수득하였다. 분리된 유청에 1.5M 트리구연산나트륨(trisodium citrate)을 가하여 pH 5.5로 조정하고, 다시 1.5M 구연산(Citric acid)을 가하여 pH 3.9로 조정한 후, 35℃에서 150분간 가온하여 α-락토알부민을 침전시켰다. 원심분리하여 α-락토알부민을 제거한 후, 상등액을 취하였다. 상등액에 1N NaOH를 가하여 pH 4.5로 조정하여 β-락토글로불린을 침전시키고, 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 수득된 상등액을 30 KD 한외여과막을 통과시켜 여과액을 얻은 후, 이 여과액을 다시 1 KD 한외여과막을 통과시켜 잔류물을 얻었다. 이 잔류물을 동결건조하여 분말 상태의 1 KD 내지 30 KD의 분자량을 갖는 초유분리유청단백(IWP; Isolated Whey Protein)분획을 수득하였다.

<실험예 1> 초유분리유청단백(IWP)분획의 조골세포 증식 효과

본 발명의 초유분리유청단백(IWP; Isolated Whey Protein)분획이 조골세포 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

쥐(murine)로부터 유도되어 폭넓게 연구에 이용되고 있는 조골세포주인 osteoblast-like MC3T3-E1 Clone 4 cell line(ATCC CRL-2593)을 웰(well) 당 1× 10⁴ 개가 되도록 접종한 후, 실시예 1에서 제조한 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획을 하기 표 1의 농도로 첨가하여 37℃, CO₂ 배양기에서 24, 48, 72 시간동안 배양하였다. 배양배지로서는 alpha-MEM 배지를 사용하였다. 그 후, MTT(3-[4,5-Dimethylthiazol -2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 첨가하여 4시간 배양하고, 20% SDS(Sodium dodecylsulfate)용액을 사용하여 용혈시킨 후, 540nm에서 흡광도를 측정함으로써 조골세포의 증식 효과를 검증하였다. 조골세포의 증식효과는 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획을 처리하지 않은 대조군에 대한 백분율로 나타내어 표 1에 나타내었다. 표 1에 나타난 바와 같이 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획의 조골세포 증식 효과는 배양 시간 및 본 발명의 초유분리유청단백분획의 농도에 의존하여 증가하였다.

조골세포는 골 형성을 담당하는 세포로서 분화하면 콜라겐 등의 골기질을 형성하는 것으로 알려져 있으므로 조골세포의 증식은 골 형성 및 뼈의 콜라겐 생성 능력이 강화되었음을 의미한다.

배양시간	초유분리유청단백(IWP)분획의 농도	증식효과(%)
24	1 μg/ml	107.97±2.2
	10 μg/ml	108.28±3.4
	100μg/ml	110.49±3.2
48	1 μg/ml	113.87±2.6
	10 μg/ml	115.72±2.3
	100 μg/ml	120.12±2.5
72	1 μg/ml	120.99±2.7
	10 μg/ml	123.47±2.3
	100 μg/ml	126.67±2.9

<비교예 1> 초유 유청의 조골세포 증식 효과

실시예 1에서 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획을 제조하기 전의 초유 유청을 사용하여 상기 실험예 1에서 기술된 방법으로 37℃, CO₂ 배양기에서 72 시간동안 배양하고 그 조골세포 증식 효과를 측정하여, 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획과 비교하여 도 1에 도시하였다. 도 1에 나타난 바와 같이 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획은 초유 유청에 비하여 조골세포 증식 효과가 현저하게 높음을 확인할 수 있었다.

<실험예 2> 초유분리유청단백(IWP)분획이 조골세포에서의 염기성 인산분해효소(ALP) 활성에 미치는 효과

Noriyoshi 등의 방법(Noriyoshi K. 등, Biochemical and Biophysical research Communications, 119(2):767, 1984)을 응용하여 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획이 조골세포에서의 염기성 인산분해효소(ALP) 활성에 미치는 영향을 측정하였다.

ALP는 뼈뿐만 아니라 간, 신장, 비장 등에서도 생성되어 골의 미세한 대사 변화를 구체적으로 반영하기에는 미흡한 점이 많았지만, 최근에는 조골세포에서 유리된 ALP에만 특이적으로 작용하는 효소를 이용하여 골-특이적 ALP(bone-specific alkaline phosphatase)의 활성도만을 측정할 수 있게 되어 골형성 지표로서 널리 이용되고 있는 효소이다.

조골세포주인 osteoblast-like MC3T3-E1 Clone 4 cell line(ATCC CRL-2593)을 웰(well) 당 5×10⁴ 개가 되도록 접종한 후, 실시예 1에서 제조한 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획을 하기 표 2의 농도로 가하여 37℃, CO₂ 배양기에서 48, 72 시간동안 배양하였다. 배양배지로서는 alpha-MEM을 사용하였다. PBS를 이용하여 배지를 세척하고, 0.2% Nonidet P-40 용액을 이용하여 세포를 모았다. 모아진 세포들을 15분간 소니케이션하고, 원심분리(10,000×g, 15 분)하여 상등액을 얻었다.

얻어진 상등액은 Metra^TM BAP 키트(Quidel Co., USA)를 이용하여 골-특이적 ALP의 활성을 측정하여 표 2에 나타내었다.

표 2에서 나타낸 바와 같이 48 시간과 72시간 동안 처리시, 골-특이적 ALP 활성은 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획의 농도 및 처리시간에 의존하여 증가하였다.

본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획의 처리가 골형성을 담당하는 조골세포의 증식과 아울러 조골세포에서의 ALP 활성을 증가시키는 것으로 보아 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획은 직접 조골세포에 작용하여 그 증식 및 분화, 즉 골형성을 돕는 것을 확인할 수 있었다.

	48 시간 처리시	72 시간 처리시
대조군	35.54±0.1μM/ml	36.77±0.2μM/ml
IWP분획 1 μg/ml처리군	35.54±0.1μM/ml	36.71±0.1μM/ml
IWP분획 10 μg/ml처리군	36.09±0.1μM/ml	37.01±0.1μM/ml
IWP분획 100 μg/ml처리군	36.40±0.1μM/ml	37.44±0.1μM/ml
IWP분획 1000 μg/ml처리군	37.01±0.1μM/ml	37.87±0.2μM/ml

< 실험예 3> 초유분리유청단백(IWP)분획이 조골세포 NO(Nitric oxide)의 분비능에 미치는 효과

조골세포가 분비하는 NO는 Griess reagent system(Yasushi AKE 등, J. Med. Sci., 40:125, 1994)을 이용하여 측정하였다.

조골세포주인 osteoblast-like MC3T3-E1 Clone 4 cell line(ATCC CRL-2593)을 웰 당 1×10⁵ 개가 되도록 접종한 후, 실시예 1에서 제조한 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획을 하기 표 3의 농도로 첨가하여 37℃, CO₂ 배양기에서 48 시간동안 배양하였다. 배양배지로서는 alpha-MEM 배지를 사용하였다. 각 웰의 상등액 100 ㎕를 취해 96 microplate로 옮긴 후 설파닐아미드(sulfanilamide) 용액과 N-1-나프틸에틸렌디아민(N-1-naphtylethylene diamine) 용액의 1:1 혼합액인 Griess 시약 100 ㎕를 첨가하고 차광하여 10분간 상온에서 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 조골세포에서 분비된 NO량은 표준곡선(standard curve)을 통해 계산하여 표 3에 나타내었다.

표 3에서 나타낸 바와 같이 48 시간 동안 처리시, 조골세포에 의해 분비된 NO의 량은 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획의 농도에 의존하여 증가하였다. 또한, 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획을 처리하지 않은 대조군에 비하여, 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획 1000 μg/ml을 처리한 군에서의 조골세포 NO 분비량은 157%나 증가하였다.

조골세포로부터 분비되는 NO는 파골세포의 분화를 억제하므로, 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획이 조골세포로부터 NO 분비량을 증가시킴으로써 파골세포의 분화를 억제할 것으로 사료된다.

	NO 분비량 (nM/ml)
대조군	104.77±12.3
IWP분획 1 μg/ml처리군	101.03±14.1
IWP분획 10 μg/ml처리군	128.47±12.5
IWP분획 100 μg/ml처리군	142.19±10.4
IWP분획 1000 μg/ml처리군	157.16±16.0

<실험예 4> 동물모델을 이용한 초유분리유청단백(IWP)분획 효과의 확인

본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획이 골다공증 등의 골대사질환의 치료 및 예방, 뼈 성장에 미치는 효과를 알아보고자 난소절제에 의한 골다공증 동물모델을 이용하여 골대사와 관련된 여러 인자에 미치는 영향을 조사하였다.

4-1)골다공증 동물모델의 제작

4 주령 Sprague-Dawley 암컷 흰쥐 30마리를 3군으로 나누어 1주간 적응시킨 뒤 난소절제 수술을 시행하였다. 난소절제수술은 다음과 같이 시행되었다. 먼저, 100 ㎎/㎏의 케타민(Ketamine, Ketara)과 2% 자이라진(Xylazine; Rompun 0.15 ㎖/㎏)으로 전신마취 후 통상의 방법에 따라 제모 및 술전 무균처리(10% povidone - iodine scrub followed by a 70% alcohol wipe)를 수행하였다. 흰쥐의 복측 중앙에 1 ㎝가량을 절개한 뒤 횡격막이나 간 등 주요 장기에 손상이 가해지지 않도록 주의를 하며 자궁을 따라 난소를 확인하였다. 봉합용 실로 난소를 결찰한 뒤 난소 절제를 양측으로 수행하였다. 난소 절제 후 각 장기를 복강내로 재위치 시킨 후 봉합용 실로 층별 봉합을 수행하였다. 수술 후 감염방지를 위해 50 ㎖/㎏의 항생제 세파졸린(cefazolin)을 주사하였다.

4-2) 초유분리유청단백(IWP)분획의 투여

상기 실험예 4-1)의 난소절제 수술 후 칼슘 결핍 식이(#113095, Dyets Inc., USA)를 3군 모두에게 5주간 제공한 뒤, 일반식이, 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획 1% 함유식이, 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획 10% 함유식이를 3군 각각에게 3주간 제공하였다.

4-3) 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획이 골대사관련인자에 미치는 효과

4-3-1) 혈청 오스테오칼신 함량

오스테오칼신은 새로운 골 형성시 골아세포의 활성을 간접적으로 반영하는 골형성 지표로 알려져 있다(Dura RJ 등, J Clin Endocrinol metab, 66:951, 1988; Bowles SA 등, Ann Clin Biochem, 33:196 1996). 상기 4-2)에서 사육된 흰쥐들을 하룻밤 절식시키고 희생시킨 후, 마취 상태에서 복부를 절개하여 복대정맥에서 채혈한 뒤 상온에서 30분간 방치하였다가 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분리하여 냉동 보관하였다. Rat-MID Osteocalcin ELISA 키트(Nordic Bioscience Diagnostics, Denmark)를 이용하여 혈청 내 오스테오칼신의 함량을 측정하고 그 결과를 표 4에 나타내었다.

표 4에서 나타낸 바와 같이 혈청 내 오스테오칼신의 함량은 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획의 섭취에 따라 증가하였다.

	오스테오칼신(ng/ml)
대조군	311.34±8.22
IWP분획-1% 투여군	317.33±6.97
IWP분획-10% 투여군	317.48±9.52

4-3-2) 골무게 및 골밀도

실험동물의 골밀도 및 골무게는 골다공증환자에 있어서 골절이 잘 일어나는 부위이며 상대적으로 측정이 용이한 대퇴부를 선택하여 측정하였다.

상기 4-3-1)에서 혈액을 채취한 후 희생된 각 군 마우스들의 좌우 대퇴골을 적출하여 뼈조직에 부착되어 있던 근육, 지방, 인대 등을 전부 제거하고 75℃ 건조오븐에서 3시간 건조시킨 후 골무게를 측정하였다. 골밀도는 골밀도 측정기(NORLAND XR SERIES X-RAY SOURCE 319A051, USA)를 이용하여 측정하였으며, 이들 골무게와 골밀도를 표 5에 나타내었다. 실험동물의 체중에 대해선 각 군 사이의 통계적 유의성을 나타내지 않았다(결과 미도시).

표 5에서 보인바와 같이 대퇴골 무게는 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획의 섭취에 따라 용량 의존적으로 증가하였다. 골밀도 또한, 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획의 섭취에 따라 용량 의존적으로 증가하였으며, 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획 10% 투여군의 골밀도는 대조군과 비교하여 8% 증가하였다.

	대퇴골 무게 (g/body weight)	골 밀도 (mg/cm2)
대조군	1.82±0.54	90.5±0.01
IWP분획-1% 투여군	2.19±0.31	95.9±0.00
IWP분획-10% 투여군	2.31±0.27*	97.4±0.00*

4-3-3) 골내 단백질 및 회분 함량

본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획의 섭취가 실험동물 대퇴골의 단백질과 회분의 함량에 미치는 영향을 고찰하였다. 특히 프롤라인은 콜라겐에 주로 존재하는 아미노산으로 콜라겐 대사 특히 골대사의 지표 인자로 사용되고 있다. 총 조단백질 함량은 Kjeltec Analyzer unit 2300(Fooss Tecator, Sweden)으로 측정하였고, 프롤라인의 함량은 Amino Acid Analyzer 430(Sykam, German)을 사용하여 측정하였으며, 조회분의 함량 및 칼슘과 인의 함량은 Inductively Coupled Plasma Emission Spectroscopy(Jobin Yvon 38 Plus, France)을 사용하여 측정하였다.

측정된 총 조단백질의 함량 및 프롤라인의 함량을 표 6에 나타내었다. 표 6에서 나타난 바와 같이 실험동물 대퇴골 내 조단백질 함량은 대조군의 경우 33.73 mg인데 반해 IWP분획- 10% 투여군의 경우는 33.97 mg으로 증가하였다. 또한, 프롤라인의 함량 또한 IWP분획- 10% 투여군의 경우 대조군과 비교하여 16% 증가하였다.

	조단백질(mg)	프롤라인(mg)
대조군	33.73±1.38	1.08±0.17
IWP분획-1% 투여군	32.82±1.54	1.03±0.06
IWP분획-10% 투여군	33.97±0.98	1.25±0.07*

측정된 총 조회분의 함량 및 칼슘과 인의 함량을 표 7에 나타내었다. 표 7에서 나타난 바와 같이 실험동물 대퇴골 내 조회분의 함량은 대조군의 경우 54.96 mg인데 반해 IWP분획- 10% 투여군의 경우는 56.01 mg으로 증가하였다. 또한, 칼슘과 인의 경우에도 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획의 섭취에 따라 그 함량이 증가하였다.

	조회분(mg)	칼슘(mg)	인(mg)
대조군	54.96±1.42	43.06±1.28	9.80±0.23
IWP분획-1% 투여군	56.18±1.87	43.80±1.29	10.54±0.47*
IWP분획-10% 투여군	56.01±1.21	44.21±0.77*	10.34±0.41*

이상과 같이 골다공증 동물 모델에서 초유분리유청단백(IWP)분획의 투여는 실험동물 대퇴골의 프롤라인을 포함한 조단백질의 함량과 칼슘과 인을 비롯한 조회분의 함량을 증가시키고, 이로써, 대퇴골의 무게와 골밀도를 증가시킴을 확인하였다.

<제조예 1> 성장촉진용 식품의 조제

실시예 1에서 제조된 초유분리유청단백(IWP)분획을 이용하여 다음과 같은 조성물로 성장촉진용 특수영양식품을 하기와 같은 조성비로 배합한 후 경질캅셀로 조제하였다.

1) 초유분리유청단백(IWP)분획분말-------------------------- 0.10%

2) 식용유청칼슘(칼슘 25%이상) ----------------------------- 19.5%

3) 홍화씨엑스분말 ----------------------------------------- 12.0%

4) 토사자분말 ---------------------------------------------- 5.0%

5) 복분자분말 ---------------------------------------------- 5.0%

6) 백복령분말 ---------------------------------------------- 5.0%

7) 프락토올리고당 ------------------------------------------ 2.3%

8) 헴 철 --------------------------------------------------- 1.5%

9) 비타민 C -------------------------------------------------0.5%

10) 분말 비타민 E(50% dl-α-초산토코페롤) ------------------ 0.5%

11) 니코틴산아미드 ----------------------------------------- 0.05%

12) 분말비타민 A ------------------------------------------- 0.05%

13) 비타민 B₂ ---------------------------------------------- 0.03%

14) 비타민 B₁ 질산염 --------------------------------------- 0.03%

15) 비타민 B₆ 염산염 ---------------------------------------- 0.03%

16) 비오틴 ------------------------------------------------- 0.01%

17) 유당-----------------------------------------------------적량

계 : 100.0%

이상과 같이, 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)은 본 발명의 제조방법에 의하여 간편하고 경제적으로 제조될 수 있으며, 조골세포 증식활성, 골형성 촉진, 조골세포의 NO 분비 촉진활성을 나타내며, 골내 단백질, 회분함량 증가활성, 골무게 및 골밀도 증가 등의 골대사의 증진 또는 개선효과를 나타내므로, 골다공증과 같은 골대사성 질환의 치료 및 예방을 위한 치료제, 유아 및 청소년의 성장발달을 목적으로 하는 식품, 음료, 의약품 및 기능성 식품 등에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 다양한 농도의 본 발명의 초유분리유청단백(IWP)분획 및 초유 유청의 조골세포 증식효과를 비교하여 도시한 것이다.

Claims (7)

1. 포유동물의 초유로부터 지방, 카제인,α-락토알부민 및 β-락토글로불린이 제거되고 1 KD ~ 30 KD의 분자량을 가지며, 조골세포 증식 및 파골세포 증식억제 활성을 갖는 초유분리유청단백(IWP; Isolated Whey Protein)분획.
2. 지방과 카제인이 제거된 포유동물의 초유유청에서 전기영동법, 염석법 및 이온교환크로마토그래피로 구성된 군에서 선택된 단백질의 등전점을 이용한 분리방법으로 α-락토알부민과 β-락토글로불린을 제거한 다음, 한외여과 또는 겔여과에 의해 1 KD ~ 30 KD의 분자량을 갖는 제 1항의 초유분리유청단백분획을 제조하는 방법.
3. 제 2항에 있어서,

   (a) 포유동물의 초유로부터, 지방 및 카제인을 제거하여 초유유청을 수득하는 단계;

   (b) 상기 초유 유청에 염기성 화합물을 가하여 pH를 5.0 ~ 7.0으로 조정한 후, 산성화합물을 가하여 pH를 2.5 ~ 4.2로 조정하여 α-락토알부민을 침전, 제거하고, 상등액을 수득하는 단계;

   (c) 상기 상등액에 염기성 화합물을 가하여 pH를 4.5 ~ 7.0으로 조정하여 β-락토글로불린을 침전, 제거하고 상등액을 수득하는 단계;

   (d) 상기 상등액을 여과하여 1 KD ~ 30 KD의 분자량을 갖는 분획을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 수득된 초유분리유청단백분획을 분무건조, 열풍건조 또는 동결건조하여 분말화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
5. 제 1항의 초유분리유청단백분획을 유효성분으로 함유하는 골대사성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 골대사성 질환이 골다공증, 요통, 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염, 구루병, 골연화증, 파제트 골 질환(Paget's disease of bone) 및 치주질환으로 구성된 군에서 선택된 하나인 조성물.
7. 제 1항의 초유분리유청단백분획을 유효성분으로 함유하는 골대사성 질환의 예방용, 골대사 증진 또는 개선용 식품조성물.