KR20050078568A

KR20050078568A - High throughput device for performing continuous-flow reactions

Info

Publication number: KR20050078568A
Application number: KR1020040006740A
Authority: KR
Inventors: 한종훈; 박노경; 임관섭
Original assignee: 학교법인 포항공과대학교
Priority date: 2004-02-02
Filing date: 2004-02-02
Publication date: 2005-08-05
Anticipated expiration: 2024-02-02
Also published as: KR100593263B1

Abstract

본 발명은 시간에 따른 반복적인 온도조절이 필요한 반응에 응용하기 위한 연속 흐름상 반응 장치에 관한 것으로, 서로 다른 온도로 조절되는 둘 이상의 고체상 가열 블록, 및 유체 주입구인 제1 말단과 유체 배출구인 제2 말단을 가지며 제1 말단으로부터 제2 말단으로의 연속적인 유체의 흐름을 허용하는 모세관을 포함하고, 상기 모세관이 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록을 순차적으로 또는 반복적으로 접촉하는 것을 특징으로 하는 고성능 연속 흐름상 반응 장치를 제공한다.The present invention relates to a continuous flow bed reaction apparatus for application in a reaction requiring repeated temperature control over time, comprising: at least two solid phase heating blocks controlled at different temperatures, and a fluid inlet with a first end and a fluid outlet; A capillary tube having two ends and allowing continuous flow of fluid from the first end to the second end, wherein the capillary contacts the heating blocks sequentially or repeatedly controlled to different temperatures; Provided is a continuous flow bed reaction device.

본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치는 연속적으로 흐르는 유체를 반응시키는데 유용하게 이용될 수 있으며, 특히 중합효소 연쇄반응에 유용하게 이용될 수 있다. The continuous flow bed reaction apparatus according to the present invention may be usefully used for reacting a continuously flowing fluid, and particularly, may be usefully used for a polymerase chain reaction.

Description

HIGH THROUGHPUT DEVICE FOR PERFORMING CONTINUOUS-FLOW REACTIONS}

본 발명은 연속적으로 흐르는 유체를 반응시키기 위한 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 중합효소 연쇄반응과 같이 시간에 따른 반복적인 온도조절과 반복 반응이 요구되는 반응을 수행하는 고체상 가열 블록과 모세관을 포함하는 연속 흐름상 반응 장치에 관한 것이다.The present invention relates to a device for reacting a continuously flowing fluid, and more particularly includes a solid-phase heating block and a capillary tube for performing a reaction that requires repeated temperature control and repeated reactions over time, such as polymerase chain reaction It relates to a continuous flow bed reaction apparatus.

DNA는 다른 생체 분자들과는 달리 생체 밖에서의 인위적인 복제가 가능하다. 이는 1983년에 뮬리스 등(Mullis et al.)에 의해 개발된 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)이라는 DNA 복제 기술에 의한 것이다. PCR은 효소를 이용한 반응 방법으로 효소의 종류에 따라서 두 가지 또는 세 가지 온도의 반복적인 조절이 요구된다. DNA, unlike other biomolecules, is capable of artificial replication outside the body. This is due to a DNA replication technique called polymerase chain reaction (PCR), developed in 1983 by Mullis et al. PCR is an enzyme-based reaction method that requires repeated control of two or three temperatures depending on the type of enzyme.

일반적으로 PCR 단계는 복제할 대상인 이중가닥 주형 DNA(template DNA)를 단일가닥으로 풀어주는 변성(melting) 단계, 풀어진 단일 가닥에 반응이 시작될 곳을 지정해주며 효소 반응이 시작하는 것을 도와주는 수십 bp 정도의 프라이머를 결합시키는 어닐링(annealing) 단계, 그리고 프라이머가 붙은 위치부터 DNA를 복제해 완전한 이중 나선 구조의 DNA를 만드는 연장(extension) 단계 등 세 단계로 구분되어진다. 상기 세 단계가 완료되면 DNA는 원래의 양보다 이론적으로 2배가 증가하게 되며, 이 과정을 반복적으로 n번 수행했을 경우 최종적으로 DNA의 양은 원래의 양에 비해 이론적으로 2ⁿ배가 된다. 일반적인 PCR 장치에는 온도조절이 가능한 가열 블록(heating block)이 사용되며, 상기 가열 블록은 PCR 용기의 삽입이 가능하도록 디자인되어 있다. PCR은 상기 가열 블록에 PCR 용기를 삽입하고 일정한 시간 간격에 따른 온도의 변화를 반복적으로 조절하여 수행된다.In general, the PCR step is a denting step for releasing single-stranded template DNA to be replicated into single strands, and a position of several tens of bp to designate where the reaction is to be started on the unwrapped single strand. It is divided into three stages: annealing step that binds the primers of the primer, and extension step of replicating the DNA from the position where the primer is attached to make the DNA of the complete double helix structure. When the cleaning step is complete, the DNA is theoretically increased by 2 times than the original amount, and finally the DNA amount theoretically doubles 2 ⁿ than that of the original amount in the case where n times repeatedly performing this procedure. In a general PCR apparatus, a heating block (heating block) capable of temperature control is used, and the heating block is designed to allow insertion of a PCR vessel. PCR is performed by inserting a PCR vessel into the heating block and repeatedly adjusting the change of temperature at regular time intervals.

한편, PCR을 성공적으로 수행하기 위한 중요한 요소 중 한 가지가 온도의 조절이다. PCR의 3단계의 온도 중에서도 특히 어닐링 단계의 온도를 적절히 조절하는 것이 매우 중요한데, 이는 어닐링 단계의 온도가 적절하지 못하면 증폭의 효율이나 특이성이 매우 감소하여, 순수하며 충분한 양의 DNA를 얻을 수 없기 때문이다. 나아가, DNA 증폭 도중에 PCR 효율을 알 수 있는 실시간 검출 수단 또한 매우 중요한데, 이는 PCR 완결에 소요되는 시간이 일반적으로 수 시간임을 감안할 때 PCR의 성공 여부를 신속히, 그리고 연속적으로 판단하는 것이 매우 유리하기 때문이다.On the other hand, one of the important factors for successful PCR is the control of temperature. It is very important to adjust the temperature of the annealing step in particular among the three steps of the PCR, because if the temperature of the annealing step is not appropriate, the efficiency or specificity of the amplification is greatly reduced, and a pure and sufficient amount of DNA cannot be obtained. to be. Furthermore, real-time detection means for knowing PCR efficiency during DNA amplification are also very important, since it is very advantageous to quickly and continuously determine the success of PCR given that the time required to complete the PCR is typically several hours. to be.

1990년대 초반부터 작은 크기의 칩(chip) 상에서 물질의 분석과 반응 등 일련의 과정을 수행할 수 있는 랩온어칩(lab-on-a-chip) 기술이 발달하면서, 칩 상에서 PCR을 할 수 있는 기술들 또한 활발히 개발되고 있다(Northrup et al., Anal. Chem. 1998, 70, 918-922; Waters et al., Anal. Chem. 1998, 70, 5172-5176; Cheng et al., Nucleic Acids Res. 1996, 24, 380-385). 특히 많은 종류의 DNA에 대한 분석을 하나의 칩에서 원활히 수행하기 위해서 유체의 연속적인 흐름상에서 PCR을 수행할 수 있는 장치 및 방법의 개발이 중요하게 대두되었다.Since the early 1990s, lab-on-a-chip technology, which can perform a series of processes such as analysis and reaction of materials on small chips, has been developed. Techniques are also being actively developed (Northrup et al., Anal. Chem . 1998 , 70 , 918-922; Waters et al., Anal. Chem . 1998 , 70 , 5172-5176; Cheng et al., Nucleic Acids Res 1996 , 24 , 380-385). In particular, in order to perform analysis of many kinds of DNA on a single chip, development of an apparatus and a method capable of performing PCR on a continuous flow of fluid has emerged.

이러한 장치를 구현하기 위해 1998년 만츠 등(Manz et al., Science, 1998, 280, 1046-1048)은 온도조절이 가능하도록 제작한 세 개의 구리 블록을 일렬로 배열하여 각각의 구리 블록을 순서대로 변성, 연장 및 어닐링 단계를 수행하는 온도로 조절하고, 상기 구리 블록 위에 미세 채널을 가지는 유리 칩을 올려놓고 채널 내에 PCR 혼합 용액이 흐르게 함으로써 연속적인 유체의 흐름상에서 PCR을 구현할 수 있는 장치를 개발하였다. 그러나, 변성, 연장 및 어닐링 단계를 수행하는 구리 블록의 일렬배열이 온도의 완만한 감소(95℃ -> 72℃ -> 60℃)에는 적합할지 몰라도, 단일 가닥으로 나누어진 DNA 시료가 어닐링 온도에 다다르기 전에 상당 시간동안 연장 온도의 블록 위를 통과하게 되어 반응의 특이성을 떨어뜨리는 단점으로 작용할 수 있기 때문에 가열 블록이 변성, 어닐링 및 연장의 순으로 배열된 새로운 장치의 개발이 필요하였다.In order to implement such a device, Manz et al., Science ( 1998 , 1998 , 280, 1046-1048) in 1998 arranged three copper blocks in a row in order to control the temperature, and arranged each copper block in sequence. A device was developed to control PCR in a continuous flow of fluid by controlling the temperature to perform the denaturation, extension and annealing steps, placing a glass chip having a microchannel on the copper block, and allowing a PCR mixed solution to flow in the channel. . However, although the in-line arrangement of copper blocks performing the denaturation, extension, and annealing steps may be suitable for a gentle decrease in temperature (95 ° C.-> 72 ° C.-> 60 ° C.), DNA samples divided into single strands may be subjected to annealing temperatures. It was necessary to develop a new device in which the heating blocks were arranged in the order of denaturation, annealing and extension since they could pass over the block of extension temperature for a considerable time before reaching, which would detract from the specificity of the reaction.

이에 퀘이크 등(Quake et al., Electrophoresis, 2002, 23, 1531-1536)은 종래 가열 블록의 일렬배열 대신 변성, 어닐링 및 연장 단계를 수행하는 온도로 설정된 가열 블록의 원형 배열을 통하여 이러한 문제를 해결하고자 하였다.Quake et al. (Electrophoresis, 2002 , 23, 1531-1536) solve this problem through a circular arrangement of heating blocks set to a temperature to perform denaturation, annealing and extension steps, instead of in-line arrangement of conventional heating blocks. Was intended.

한편, 로에라드 등(Roeraade et al., J. Anal. Chem. 2003, 75, 1-7)은 서로 다른 온도로 조절되며, 원형으로 이어져 있는 수조를 제작하고 이들의 사이 벽에 조그만 구멍을 여러 개 내고, 여기에 테프론(Teflon) 튜브를 통과시켜 수조에 감는 방법을 이용하여 모세관 속에서 연속 흐름상의 PCR이 가능한 장치를 제작하였다. 그러나, 온도 조절 매체로 물을 사용함으로써 온도 조절을 위해 별도의 교반 장치가 필요하고, 덮개를 씌우지 않은 상태에서는 물의 증발로 인해 계속적인 물의 보충이 필요하며, 이러한 이유로 장치의 소형화 및 편리한 운용에 제약이 따르는 단점이 있었다.Roeraade et al. (J. Anal. Chem. 2003 , 75, 1-7), on the other hand, control the temperature at different temperatures, create a tank that runs in a circle, and make small holes in the walls between them. The dog was made, and then, a Teflon tube was passed through it and wound in a water bath to prepare a device capable of PCR in continuous flow in a capillary tube. However, by using water as the temperature control medium, a separate stirring device is required for temperature control, and continuous water replenishment is required due to the evaporation of water without the cover, which is why it is limited to miniaturization and convenient operation of the device. There was a downside to this.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 중합효소 연쇄반응과 같이 시간에 따른 반복적인 온도조절과 반복 반응이 요구되는 반응을 수행하는, 고체상 가열 블록과 모세관을 포함하는 고성능 연속 흐름상 반응 장치를 제공하는 것이다. The present invention has been made to solve the above problems, an object of the present invention includes a solid-state heating block and a capillary tube, performing a reaction that requires repeated temperature control and repeated reactions over time, such as polymerase chain reaction It is to provide a high performance continuous flow bed reaction apparatus.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 고성능 연속 흐름상 반응 장치를 이용한 고성능 연속 흐름상 핵산 증폭 방법을 제공하는 것이다. In addition, another object of the present invention is to provide a high performance continuous flow nucleic acid amplification method using the high performance continuous flow bed reaction apparatus.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서로 다른 온도로 조절되는 둘 이상의 고체상 가열 블록, 및 유체 주입구인 제1 말단과 유체 배출구인 제2 말단을 가지며 제1 말단으로부터 제2 말단으로의 연속적인 유체의 흐름을 허용하는 모세관을 포함하고, 상기 모세관이 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록을 순차적으로 또는 반복적으로 접촉하는 것을 특징으로 하는, 고성능 연속 흐름상 반응 장치를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention has two or more solid-state heating blocks that are adjusted to different temperatures, and having a first end that is a fluid inlet and a second end that is a fluid outlet, and are continuous from the first end to the second end. And a capillary tube allowing fluid flow, wherein the capillary tube is sequentially or repeatedly in contact with heating blocks controlled to different temperatures.

또한, 본 발명은 상기 반응 장치에서 상기 가열 블록과 접촉하고 각각의 가열 블록이 서로 직접적으로 접촉하지 않도록 배열된 단열 블록을 포함하는 고성능 연속 흐름상 반응 장치를 제공한다.In addition, the present invention provides a high performance continuous flow bed reaction apparatus comprising a thermal insulation block arranged in contact with the heating block in the reaction apparatus and each heating block is not in direct contact with each other.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 상기 고성능 연속 흐름상 반응 장치의 모세관의 제1 말단에 PCR 혼합용액을 주입하는 단계; 및 (2) 적정한 속도로 용액의 흐름을 제어하면서 제2 말단으로부터 배출되는 PCR 산물을 회수하는 단계를 포함하는, 고성능 연속 흐름상 핵산 증폭 방법을 제공한다.In order to achieve the above another object, the present invention comprises the steps of: (1) injecting a PCR mixed solution to the first end of the capillary of the high performance continuous flow reactor; And (2) recovering the PCR product discharged from the second end while controlling the flow of the solution at an appropriate rate.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 모세관 내에 흐르는 연속 흐름상의 유체에 대한 반응, 예컨대 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR)을 연속적이며 다중으로 수행할 수 있는 연속 흐름상 반응 장치를 제공한다는 데에 특징이 있다.The present invention is characterized by providing a continuous flow bed reaction apparatus capable of performing continuous and multiple reactions to a continuous flow fluid flowing in a capillary, such as a polymerase chain reaction (PCR).

구체적으로, 본 발명은 서로 다른 온도로 조절되는 둘 이상의 고체상 가열 블록, 및 유체 주입구인 제1 말단과 유체 배출구인 제2 말단을 가지며 제1 말단으로부터 제2 말단으로의 연속적인 유체의 흐름을 허용하는 모세관을 포함하고, 상기 모세관이 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록을 순차적으로 또는 반복적으로 접촉하는 것을 특징으로 하는, 고성능 연속 흐름상 반응 장치를 제공한다.Specifically, the present invention allows for continuous flow of fluid from a first end to a second end, having at least two solid-phase heating blocks controlled at different temperatures, and a first end that is a fluid inlet and a second end that is a fluid outlet. Comprising a capillary, and characterized in that the capillary is in contact with the heating block is controlled to different temperatures sequentially or repeatedly, provides a high performance continuous flow bed reaction apparatus.

상기 반응 장치는 상기 가열 블록과 접촉하고 각각의 가열 블록이 서로 직접적으로 접촉하지 않도록 배열된 단열 블록을 포함할 수 있다.The reactor may comprise an insulating block arranged in contact with the heating block and such that each heating block does not directly contact each other.

본 발명에 따른 장치는 구체적으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 데에 이용될 수 있다.The device according to the invention can be used specifically for carrying out polymerase chain reaction (PCR).

본 발명에 따른 장치에 있어서, 각각의 고체상 가열 블록은 모세관의 특정 부위에 열을 가하는 역할을 하며, 히터 및 온도 센서에 의해 서로 다른 온도로 조절될 수 있다. 히터와 온도 센서는 가열 블록에 부착되거나 가열 블록에 형성된 구멍에 삽입될 수 있다.In the device according to the invention, each solid-phase heating block serves to heat a specific part of the capillary and can be adjusted to different temperatures by means of a heater and a temperature sensor. The heater and temperature sensor may be attached to the heating block or inserted into a hole formed in the heating block.

상기 가열 블록의 재질로는 열전도성이 우수한 물질이면 한없이 사용될 수 있다. 구체적으로 구리, 철, 알루미늄, 황동, 금, 은, 백금 등의 금속성 물질인 것이 바람직하고, 열전도성이 높은 고분자 물질도 사용될 수 있다.As a material of the heating block, any material having excellent thermal conductivity may be used. Specifically, it is preferable that the metal material is copper, iron, aluminum, brass, gold, silver, platinum, and the like, and a high thermal conductive polymer material may also be used.

상기 단열 블록은 각각의 가열 블록간의 열전달을 방지하는 역할을 한다. 상기 단열 블록의 재질로는 열전도성이 거의 없는 절연성 물질이면 제한없이 사용될 수 있으나, 벡크라이트(bakelite) 또는 아크릴 고분자 수지를 이용하는 것이 바람직하다.The insulating block serves to prevent heat transfer between each heating block. The insulating block may be used without limitation as long as it is an insulating material having almost no thermal conductivity, but it is preferable to use bakelite or acrylic polymer resin.

상기 가열 블록과 단열 블록의 형상에 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 필요에 따라 원통형, 타원형, 각형 등의 형상으로 제조될 수 있다.There is no particular limitation on the shape of the heating block and the insulating block, and may be manufactured in the shape of a cylinder, an ellipse, a square, or the like as necessary.

상기 모세관은 유체 주입구인 제1 말단과 유체 배출구인 제2 말단을 가지고, 제1 말단으로부터 제2 말단으로의 연속적인 유체의 흐름을 가능하게 하여 유체의 이동 통로 및 반응 공간으로서의 역할을 수행한다. 상기 모세관은 상업적으로 이용가능한 모세관이면 제한없이 사용될 수 있으며, 재질은 유리, 고분자 등 다양한 종류가 가능하지만, 바람직하게는 100℃ 이상의 열에 잘 견디고, 수용액이나 유기 용매 등이 침투하지 않는 유리, 용융 실리카, 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene; PTFE, 상품명:테프론) 또는 폴리에틸렌인 것이 바람직하다.The capillary has a first end that is a fluid inlet and a second end that is a fluid outlet, and enables a continuous flow of fluid from the first end to the second end to serve as a flow passage and reaction space of the fluid. The capillary may be used without limitation as long as it is a commercially available capillary, and the material may be various kinds such as glass and polymer. Preferably, the capillary is resistant to heat of 100 ° C. or higher, and glass, fused silica does not penetrate the aqueous solution or the organic solvent. , Polytetrafluoroethylene (PTFE, trade name: Teflon) or polyethylene.

특히, 상기 모세관의 재질이 유리인 경우에는 본 발명의 일태양에 따른 장치를 제조하는 과정에서, 예컨대, 모세관을 가열 블록에 원형으로 감는 과정에서 모세관이 깨지지 않도록 모세관의 외벽을 폴리이미드 또는 PTFE 등으로 코팅하는 것이 바람직하다. 한편, 상기 모세관을 실시간 반응 검출을 위한 장치에 사용하는 경우에는 광선이 통과할 수 있도록 투명한 모세관을 사용하는 것이 바람직한데, 모세관의 외벽이 폴리이미드로 코팅된 경우에는 광선이 조사되고 형광이 나오는 부분의 코팅을 제거하는 것이 바람직하다.Particularly, when the material of the capillary is glass, the outer wall of the capillary may be made of polyimide or PTFE in order to prevent the capillary from being broken in the process of manufacturing the device according to one embodiment of the present invention, for example, in the process of winding the capillary in a circular shape to a heating block. It is preferable to coat with. On the other hand, when the capillary tube is used in a device for real-time reaction detection, it is preferable to use a transparent capillary tube to allow light to pass therethrough. When the outer wall of the capillary tube is coated with polyimide, the light beam is irradiated and fluorescence is emitted. It is desirable to remove the coating of.

또한, 상기 모세관의 내벽은 DNA나 단백질의 흡착을 방지하기 위해 실란(silane)류의 물질로 코팅하는 것이 바람직하고, 이러한 코팅은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 상기 실란류의 물질은 유리 표면과 반응하여 소수성기를 나타내는 물질들이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 트리메틸클로로실란, 디메틸디클로로실란, 메틸트리클로로실란, 트리메틸메톡시실란, 디메틸디메톡시실란 및 메틸트리메톡시실란으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질이 바람직하다.In addition, the inner wall of the capillary is preferably coated with a silane (silane) material in order to prevent the adsorption of DNA or protein, this coating can be carried out according to methods known in the art. The materials of the silanes are preferably those which react with the glass surface to show a hydrophobic group, more preferably trimethylchlorosilane, dimethyldichlorosilane, methyltrichlorosilane, trimethylmethoxysilane, dimethyldimethoxysilane and methyltrimethoxy Preference is given to at least one substance selected from the group consisting of silanes.

상기 모세관의 직경과 길이는 모세관 내에 흐르는 유체의 종류 및 수행하는 반응의 종류 등에 따라 다양하지만, 직경은 내경이 10 내지 300㎛, 외경이 50 내지 500㎛의 범위인 것이 바람직하고, 길이는 0.5m 내지 5m의 범위를 갖는 것이 바람직하다.The diameter and length of the capillary tube vary depending on the type of fluid flowing in the capillary tube and the type of reaction to be performed, but the diameter is preferably in the range of 10 to 300 µm in inner diameter and 50 to 500 µm in outer diameter, and 0.5 m in length. It is preferable to have a range of 5 m.

본 발명에 따른 반응 장치에 있어서, 모세관이 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록과 접촉하도록 하는 것은 가열 블록의 외면에 모세관을 감는 것에 의해 달성될 수 있다. 가열 블록의 외면에 모세관을 감는 방법으로는 가열 블록의 외면에 일정 크기와 일정 간격을 갖는 나선형 홈을 형성한 후, 상기 나선형 홈에 모세관을 고정하는 방법을 이용할 수 있다. 상기 나선형 홈의 크기와 간격은 고정하는 모세관의 직경에 따라 달라질 수 있지만, 대략 깊이는 100㎛ 내지 500㎛, 폭은 100㎛ 내지 500㎛, 그리고 간격은 100㎛ 내지 1000㎛를 갖도록 형성하는 것이 바람직하다. In the reaction apparatus according to the invention, bringing the capillary tube into contact with the heating block controlled to different temperatures can be achieved by winding the capillary tube on the outer surface of the heating block. As a method of winding the capillary tube on the outer surface of the heating block, a spiral groove having a predetermined size and a predetermined interval may be formed on the outer surface of the heating block, and then the capillary may be fixed to the spiral groove. The size and spacing of the helical groove may vary depending on the diameter of the capillary to be fixed, but the depth is preferably formed to have a depth of 100 μm to 500 μm, a width of 100 μm to 500 μm, and an interval of 100 μm to 1000 μm. Do.

상기 모세관은 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록에 순차적으로 1회 접촉할 수도 있고, 반복적으로 2회 이상 접촉할 수도 있다. 가열 블록에 감기는 모세관의 횟수는 반응의 종류, 반응의 정확도, 요구되는 반응 산물의 양, 반응시료의 초기 양 등에 따라 다양하지만, 10회 내지 50회, 보다 바람직하게는 20회 내지 30회 감는 것이 바람직하다.The capillary tube may be in contact with the heating block controlled to different temperatures sequentially once, or may be repeatedly contacted two or more times. The number of capillaries wound on the heating block varies depending on the type of reaction, the accuracy of the reaction, the amount of reaction product required, the initial amount of the reaction sample, etc., but may be wound 10 to 50 times, more preferably 20 to 30 times. It is preferable.

한편, 상기 고성능 연속 흐름상 반응 장치의 각각의 가열 블록의 온도를 PCR을 수행하는데 요구되는 반응 온도로 설정하고, 유체로 PCR 혼합용액을 모세관에 주입한다면, 상기 반응 장치를 이용하여 PCR을 수행할 수 있다. On the other hand, if the temperature of each heating block of the high performance continuous flow bed reaction apparatus is set to the reaction temperature required to perform PCR, and if the PCR mixed solution is injected into the capillary tube with a fluid, the reaction apparatus can be used to perform PCR Can be.

따라서, 본 발명은 (1) 상기 고성능 연속 흐름상 반응 장치의 모세관의 제1 말단에 PCR 혼합용액을 주입하는 단계; 및 (2) 적정한 속도로 용액의 흐름을 제어하면서 제2 말단으로부터 배출되는 PCR 산물을 회수하는 단계를 포함하는, 고성능 연속 흐름상 핵산 증폭 방법을 제공한다.Therefore, the present invention comprises the steps of: (1) injecting the PCR mixed solution to the first end of the capillary of the high performance continuous flow reactor; And (2) recovering the PCR product discharged from the second end while controlling the flow of the solution at an appropriate rate.

일반적으로 PCR은, (a) 주형 DNA인 이중가닥 DNA(dsDNA)를 단일가닥 DNA(ssDNA)로 나누는 변성(melting) 단계, (b) 상기 단일가닥 DNA에 프라이머가 결합하는 어닐링(annealing) 단계, 그리고 (c) 상기 프라이머가 붙은 위치부터 DNA를 합성해 이중가닥 DNA를 만드는 연장(extension) 단계의 3단계로 이루어지며, 각 단계의 반응을 수행하는데 요구되는 온도조건과 적정반응을 수행하기 위한 시간조건이 있다. 이러한 온도 및 시간조건은 주형 DNA의 염기서열과 프라이머, 그리고 사용되는 중합효소 또는 촉매의 종류 등 개별 PCR 반응조건에 따라 다를 수 있지만, 구체적으로, 변성 단계는 95~100℃에서 1~60초, 어닐링 단계는 45~65℃에서 1~120초, 그리고, 연장 단계는 주로 65~72℃에서 30~120초로 수행하는 것이 바람직하다.In general, PCR comprises: (a) a denting step of dividing double-stranded DNA (dsDNA), which is template DNA, into single-stranded DNA (ssDNA), (b) annealing step of binding a primer to the single-stranded DNA, And (c) three steps of an extension step of synthesizing DNA from a position where the primer is attached to make double-stranded DNA, and the temperature conditions and time required to perform a proper reaction required to perform each step of reaction. There is a condition. These temperature and time conditions may vary depending on individual PCR reaction conditions such as the base sequence and primer of the template DNA, and the type of polymerase or catalyst used. Specifically, the denaturation step is 1 to 60 seconds at 95 to 100 ° C, The annealing step is preferably performed at 1 to 120 seconds at 45 to 65 ° C, and the extension step is mainly at 30 to 120 seconds at 65 to 72 ° C.

상기 핵산 증폭 방법에 있어서, 고성능 연속 흐름상 반응 장치의 각각의 가열 블록의 온도는 위에서 언급한 변성, 어닐링 및 연장온도로 설정되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 각각 약 95℃, 60℃ 및 72℃로 설정되는 것이 바람직하다.In the nucleic acid amplification method, the temperature of each heating block of the high performance continuous flow bed reaction apparatus is preferably set to the above-mentioned denaturation, annealing, and extension temperatures, most preferably about 95 ° C, 60 ° C, and 72, respectively. It is preferable to set it to ° C.

상기 모세관이 변성, 어닐링 및 연장온도에 맞도록 설정된 가열 블록을 순차적으로 또는 반복적으로 접촉하게 되므로, 모세관 내에 주입된 PCR 혼합용액도 상기 온도 범위를 순차적으로 또는 반복적으로 지나면서 핵산(DNA)이 증폭되게 된다.Since the capillary tube is sequentially or repeatedly contacted with a heating block set for denaturation, annealing, and extension temperature, nucleic acid (DNA) is amplified while the PCR mixture solution injected into the capillary is sequentially or repeatedly passed through the temperature range. Will be.

상기 핵산 증폭 방법에 있어서, 상기 모세관이 가열 블록에 반복적으로 접촉하는 횟수는 PCR 싸이클 횟수가 된다. 상기 횟수는 경우에 따라 다를 수 있지만, 10회 내지 50회, 보다 바람직하게는 20회 내지 30회인 것이 바람직하다.In the nucleic acid amplification method, the number of times the capillary repeatedly contacts the heating block is the number of PCR cycles. The number of times may vary depending on the case, but is preferably 10 to 50 times, more preferably 20 to 30 times.

PCR 혼합용액은 PCR을 수행하기 위해 요구되는 반응 물질을 포함하며, 구체적으로, MgCl₂, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 혼합액, 프라이머, 내열성 DNA 중합효소, 내열성 DNA 중합효소 완충용액 및 주형 DNA를 포함한다. 한편, 실시간 PCR(real-time PCR)에서의 용이한 검출을 위하여, 상기 프라이머로는 분자 표지(molecular beacon)가 이용될 수 있고, 상기 PCR 혼합용액에 인터칼레이팅 염료(intercalating dye)가 추가로 포함될 수 있다.PCR mixed solutions include the reaction materials required to perform PCR, specifically MgCl ₂ , dNTP (dATP, dCTP, dGTP and dTTP) mixtures, primers, heat resistant DNA polymerase, heat resistant DNA polymerase buffer and template DNA. Meanwhile, for easy detection in real-time PCR, a molecular beacon may be used as the primer, and an intercalating dye is further added to the PCR mixed solution. May be included.

상기 분자 표지는 어닐링 후에 형광 검출이 가능하도록 고안된 특별한 형태의 프라이머를 말한다. 분자 표지는 보통 수십개의 염기로 이루어지며, 양쪽 말단에는 형광을 낼 수 있는 형광물질과 그 형광에 대한 소광제(quencher)가 각각 존재한다. 상기 분자 표지는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하는데, 이 때는 형광물질과 소광제가 근접해 있어 형광발생이 억제된다. 하지만, 상기 분자 표지가 PCR의 어닐링 단계에서 주형 DNA에 어닐링되면, 이 때는 형광물질과 소광제와의 거리가 멀어져 소광제에 의한 억제가 해소되므로 분자 표지상의 형광색소가 형광을 나타내게 된다. PCR을 수행함에 따라 주형 DNA의 양이 증가하게 되고 이에 따라 주형 DNA와 어닐링되는 분자 표지의 양도 증가하게 되므로, 분자 표지를 이용하여 형광 정도를 측정함으로써 PCR의 매 반응 싸이클에서의 DNA 증폭 정도를 실시간으로 관찰할 수 있게 된다.The molecular label refers to a special type of primer designed to enable fluorescence detection after annealing. Molecular labels usually consist of dozens of bases, and at both ends are fluorescent materials capable of fluorescence and quenchers for the fluorescence. The molecular label has a hairpin structure in a free state. In this case, the fluorescent material and the quencher are in close proximity to suppress fluorescence. However, when the molecular label is annealed to the template DNA in the PCR annealing step, the distance between the fluorescent material and the quencher is farther away and the suppression by the quencher is eliminated, so that the fluorescent dye on the molecular label shows fluorescence. Since the amount of template DNA increases as the PCR is performed and the amount of the molecular label annealed with the template DNA also increases, the degree of DNA amplification in each reaction cycle of the PCR is measured in real time by measuring the degree of fluorescence using the molecular label. Can be observed.

상기 인터칼레이팅 염료는 이중가닥 DNA에 특이적으로 결합하여 형광을 방출하는 것으로서, EtBr(Ethidium bromide)과 같이 당업계에서 인터칼레이팅 염료로 알려진 것이면 제한없이 사용될 수 있고, SYBR GREEN^TM과 같이 상업적으로 이용가능한 염료도 사용될 수 있다. 상기 인터칼레이팅 염료는 PCR로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다.The intercalating dye is specifically bound to double-stranded DNA to emit fluorescence, and can be used without limitation as long as it is known as an intercalating dye in the art, such as EtBr (Ethidium bromide), and commercial such as SYBR GREEN ^™ Dyes available as can also be used. The intercalating dye fluoresces by binding to double-stranded DNA synthesized by PCR and can detect the fluorescence intensity to measure the amount of amplification products produced.

본 발명에 따른 핵산 증폭 방법에 있어서, 모세관에 PCR 혼합용액을 주입하고 용액의 흐름을 제어하기 위해서는 주사기 펌프를 이용하는 것이 바람직하며, 주사기 펌프에 의해 PCR 혼합용액은 모세관의 제1 말단에서 제2 말단까지 이동하게 된다. 용액의 이동속도는 PCR 반응조건에 따라 다양하며, 최적의 PCR 결과를 얻을 수 있도록 매 반응마다 조절될 수 있다. 구체적으로, 모세관 내에 주입된 PCR 혼합용액의 이동속도는 0.1㎕/min 내지 5㎕/min의 범위인 것이 바람직하다.In the nucleic acid amplification method according to the present invention, it is preferable to use a syringe pump to inject the PCR mixed solution into the capillary and to control the flow of the solution. The PCR mixed solution is injected from the first end of the capillary to the second end by the syringe pump. Will move to. The moving speed of the solution varies according to the PCR reaction conditions, and can be adjusted for each reaction to obtain an optimal PCR result. Specifically, the moving speed of the PCR mixed solution injected into the capillary is preferably in the range of 0.1 μl / min to 5 μl / min.

상기 PCR 혼합용액은 모세관에 연속적 또는 단속적으로 주입될 수 있다, 서로 다른 조성을 갖는 PCR 혼합용액이 단속적으로 주입되는 경우 '시료 이월(carryover)'이 문제될 수 있다. '시료 이월'이란 앞에 지나간 시료에 의해 뒤에 따라가는 시료가 오염되는 것을 말한다. 이를 방지하기 위해서는 각각의 시료가 공기층이나 브로모페놀 블루(bromophenol blue)와 같이 시료와 섞이지 않는 유기 용매 등에 의해 나누어지도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 앞에 지나간 시료에 의해 뒤에 따라가는 시료가 오염되는 것을 방지하기 위해 시료의 주입 사이에는 공기층 또는 유기 용매 등과는 별도로 물 또는 완충 용액과 같은 용매를 삽입하여 먼저 지나간 시료의 잔재를 씻어주는 것이 바람직하다.The PCR mixed solution may be injected continuously or intermittently into the capillary. If a PCR mixed solution having different compositions is intermittently injected, 'carryover' may be a problem. Sample carryover refers to the contamination of a sample following it by a sample that has passed in front of it. In order to prevent this, it is preferable that each sample is divided by an organic solvent which is not mixed with the sample, such as an air layer or bromophenol blue. In addition, in order to prevent contamination of the sample to be followed by the sample past, it is preferable to insert a solvent such as water or a buffer solution separately from the air layer or the organic solvent between the injections of the sample to wash the residue of the sample past. .

이하, 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치의 구체적인 실시태양을 도면을 참조하여 설명한다.Hereinafter, specific embodiments of the continuous flow bed reaction apparatus according to the present invention will be described with reference to the drawings.

본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치는 서로 다른 온도로 조절되는 둘 이상의 고체상 가열 블록(11)의 둘레에 모세관(13)을 감아올림으로써 제조될 수 있다(도 1a 및 도1b 참조). 상기 가열 블록(11)은 병렬 또는 직렬로 나열될 수 있으며, 상기 모세관(13)은 가열 블록 둘레에 감겨서 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록과 접촉하게 된다. 도 1a에 도시된 반응 장치와 같이, 병렬로 나열된 가열 블록(11)의 둘레에 모세관(13)이 감긴 경우, 상기 모세관에 주입되는 유체는 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록을 순차적으로 또는 반복적으로 2회 이상 통과하면서 반응하게 되지만, 도 1b에 도시된 반응 장치와 같이, 직렬로 나열된 가열 블록(11)의 둘레에 모세관(13)이 감긴 경우에는 상기 모세관 내의 유체는 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록을 순차적으로 통과하면서 반응하게 된다.The continuous flow bed reaction device according to the invention can be produced by winding the capillary tube 13 around two or more solid-phase heating blocks 11 which are controlled at different temperatures (see FIGS. 1A and 1B). The heating blocks 11 may be arranged in parallel or in series, and the capillary tube 13 is wound around the heating block and is brought into contact with the heating blocks controlled to different temperatures. When the capillary tube 13 is wound around heating blocks 11 arranged in parallel, such as the reaction apparatus shown in FIG. 1A, the fluid injected into the capillary tube is sequentially or repeatedly heated heating blocks controlled to different temperatures. When the capillary tube 13 is wound around the heating block 11 arranged in series, as in the reaction apparatus shown in FIG. 1B, the reaction inside the capillary tube is controlled at different temperatures. Reactions pass through blocks sequentially.

또한, 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치에는 각각의 가열 블록의 온도 조절을 보다 용이하게 하기 위하여, 가열 블록끼리 서로 직접적으로 접촉하지 않도록 배열된 단열 블록이 포함될 수 있다. In addition, the continuous flow bed reaction apparatus according to the present invention may include an insulating block arranged so that the heating blocks do not directly contact each other, in order to more easily control the temperature of each heating block.

상기 장치의 일예로, 본 발명은 (1) 서로 다른 온도로 조절되는 세 개의 고체상 가열 블록; (2) 상기 가열 블록과 접촉하고 각각의 가열 블록이 서로 직접적으로 접촉하지 않도록 배열된 단열 블록; 및 (3) PCR 혼합용액 주입구인 제1 말단과 PCR 산물 배출구인 제2 말단을 가지며, 제1 말단으로부터 제2 말단으로의 연속적인 용액의 흐름을 허용하는 모세관을 포함하고, 상기 모세관이 서로 다른 온도로 조절되는 세 개의 가열 블록을 순차적으로 또는 반복적으로 접촉함으로써 PCR을 수행하는 장치를 제공한다.In one example of the device, the present invention provides a method for producing a solid state heating block comprising: (1) three solid-phase heating blocks controlled at different temperatures; (2) an insulating block arranged in contact with said heating block and not so that each heating block is in direct contact with each other; And (3) a capillary tube having a first end of the PCR mixed solution inlet and a second end of the PCR product outlet and allowing continuous flow of the solution from the first end to the second end, wherein the capillaries are different from each other. Provided is an apparatus for performing PCR by sequentially or repeatedly contacting three temperature controlled heating blocks.

상기 PCR을 수행하는 반응 장치의 일예가 도 2a 및 도 2b에 도시되어 있다. 도 2a에는 하나의 단열 블록(12)에 서로 다른 온도로 조절되는 세 개의 가열 블록(21, 22, 23)이 조립되고, 상기 가열 블록의 외면에 모세관이 감겨 있는 PCR 반응 장치의 개략도가 도시되어 있고, 도 2b에는 실제 제조한 장치 사진이 도시되어 있다.One example of a reaction apparatus for performing the PCR is shown in FIGS. 2A and 2B. FIG. 2A shows a schematic diagram of a PCR reaction apparatus in which three heating blocks 21, 22, and 23 controlled at different temperatures are assembled in one insulating block 12, and capillaries are wound on an outer surface of the heating block. 2b shows a photograph of the actual device manufactured.

가열 블록들(21, 22, 23)은 앞서 설명한 바와 같이, 히터와 센서가 각각 삽입될 수 있어 각각의 온도가 독립적으로 조절되어 PCR 반응의 각 단계에서 필요한 온도로 설정될 수 있다. 단열 블록(12)은 가열 블록간의 서로 다른 온도가 유지되기 용이하도록 열전도성이 매우 낮은 물질로 만들어진다. 상기 PCR 혼합용액(27)이 모세관(13)을 따라 변성, 어닐링 및 연장 온도에 맞도록 설정된 가열 블록들(21, 22, 23)과 순차적으로 또는 반복적으로 접촉하면서 주형 DNA(핵산)가 증폭되어 많은 양의 DNA(28)를 얻을 수 있게 된다.As described above, the heating blocks 21, 22, and 23 may be inserted with heaters and sensors, respectively, so that the respective temperatures may be independently adjusted and set to the temperatures required in each step of the PCR reaction. The insulating block 12 is made of a material having a very low thermal conductivity so that different temperatures between the heating blocks can be easily maintained. The template DNA (nucleic acid) is amplified while the PCR mixed solution 27 is sequentially or repeatedly contacted with the heating blocks 21, 22, and 23 set to the denaturation, annealing, and extension temperatures along the capillary tube 13. A large amount of DNA 28 can be obtained.

한편, 상기 단열 블록이 포함된 반응 장치의 다른 예로, 본 발명은 고체상 가열 블록과 단열 블록의 조립체로서, 유체 주입구인 제1 말단과 유체 배출구인 제2 말단을 가지며 제1 말단으로부터 제2 말단으로의 연속적인 유체의 흐름을 허용하는 모세관이 감겨 있는 둘 이상의 조립체가, 온도조절이 가능한 가열 블록 또는 단열 블록에 조립되어 둘 이상의 독립적인 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 다중 연속 흐름상 반응 장치를 제공한다. On the other hand, as another example of the reaction apparatus including the insulating block, the present invention is an assembly of the solid-state heating block and the insulating block, having a first end of the fluid inlet and a second end of the fluid outlet from the first end to the second end Provided is a multi-continuous flow bed reaction apparatus characterized in that the two or more assemblies, the capillary wound to allow continuous flow of the fluid, is assembled to a thermostatically controlled heating block or an insulating block to perform two or more independent reactions. do.

상기 다중 연속 흐름상 반응 장치에 있어서, 상기 온도조절이 가능한 가열 블록은 둘 이상일 수 있다.In the multiple continuous flow bed reaction apparatus, the temperature controllable heating block may be two or more.

상기 다중 연속 흐름상 반응 장치의 일예가 도 3a 내지 도 3e에 도시되어 있다. 도 3a를 참조하여 다중 연속 흐름상 반응 장치를 제조하는 방법을 설명한다. 먼저, 하나의 가열 블록(11)에 하나의 단열 블록(12)을 조립하여 가열 블록-단열 블록 조립체를 제조한 후, 상기 조립체에 모세관(13)을 감는다. 모세관이 감긴 네 개의 가열 블록-단열 블록 조립체를 별도로 존재하는 온도조절이 가능한 세 개의 가열 블록(31, 32, 33)에 각각 조립하되, 상기 세 개의 가열 블록(31, 32, 33)이 각각 둘 이상의 조립체와 접촉하도록 조립함으로써 다중 연속 흐름상 반응 장치를 완성한다. One example of the multiple continuous flow bed reaction apparatus is shown in FIGS. 3A-3E. A method of manufacturing a multiple continuous flow bed reaction apparatus will be described with reference to FIG. 3A. First, one insulating block 12 is assembled to one heating block 11 to produce a heating block-insulating block assembly, and then the capillary tube 13 is wound around the assembly. Four capillary wound heating block-insulation block assemblies are assembled into three separate thermostatically controlled heating blocks 31, 32, 33, each of which has two heating blocks 31, 32, 33. The assembly in contact with the above assembly completes the multiple continuous flow bed reaction apparatus.

위와 같은 방법으로 제작된 다중 연속 흐름상 반응 장치의 평면도와 정면도가 각각 도 3b 및 도 3c에 도시되어 있고, 실제 제조한 장치 사진이 도 3d 및 도 3e에 도시되어 있다.A plan view and a front view of the multiple continuous flow bed reaction apparatus manufactured by the above method are shown in FIGS. 3B and 3C, respectively, and the actual photograph of the apparatus is shown in FIGS. 3D and 3E.

상기 다중 반응 장치는 동시에 네 곳에서 반응을 수행할 수 있으며, 상기 장치에 조립된 7 개의 가열 블록(11x4; 31, 32, 33)은 네 곳에서의 개별적인 작동을 위해 서로 다른 온도로 조절될 수 있다. 가열 블록-단열 블록 조립체에 감겨 있는 모세관(13)은 각각의 위치에 따라 접촉하는 가열 블록이 다르게 되며, 도 3b에서 보듯이, 각 모세관(13)은 서로 다른 온도로 조절되는 세 개의 가열 블록(11, 31, 33 또는 11, 32, 33)에 반복적으로 접촉하게 된다. 가열 블록의 온도에 따라 조절되는 모세관 내부의 온도는 모세관을 지나는 유체의 온도에 곧바로 반영되며, 유체는 서로 다른 세 가지 온도 구간을 반복적으로 지나게 된다.The multiple reaction apparatus can carry out the reaction in four places at the same time, and the seven heating blocks 11x4 (31, 32, 33) assembled in the device can be adjusted to different temperatures for individual operation at four places. have. The capillary tube 13 wound on the heating block-insulating block assembly has different heating blocks in contact with each position, and as shown in FIG. 3B, each capillary tube 13 has three heating blocks (controlled to different temperatures). 11, 31, 33 or 11, 32, 33) repeatedly. The temperature inside the capillary tube, which is controlled by the temperature of the heating block, is reflected directly in the temperature of the fluid passing through the capillary tube, and the fluid passes repeatedly through three different temperature ranges.

상기 다중 연속 흐름상 반응 장치를 이용하면, 한번에 네 개의 모세관에서 반응을 수행할 수 있는 잇점이 있다.Using the multiple continuous flow bed reactor, there is an advantage that the reaction can be carried out in four capillaries at a time.

구체적으로, 상기 모세관 내부를 흐르는 유체로 DNA 증폭을 위한 PCR 혼합용액을 사용하는 경우, 상기 다중 연속 흐름상 반응 장치를 PCR에 이용할 수 있다. PCR을 수행하는 방법은 앞서 예시한 PCR을 수행하는 반응 장치에서 설명한 바와 같다(도 3c 참조). 즉, PCR 혼합용액(27)이 모세관(13)을 따라 변성(33), 어닐링(11) 및 연장(31, 32) 온도에 맞도록 설정된 가열 블록들을 반복적으로 접촉하면서 주형 DNA(핵산)가 증폭되어 많은 양의 DNA(28)를 얻을 수 있게 된다.Specifically, when using a PCR mixture solution for DNA amplification as the fluid flowing inside the capillary, the multiple continuous flow bed reaction apparatus can be used for PCR. The method of performing PCR is as described in the above-described reaction apparatus for performing PCR (see FIG. 3C). That is, the template DNA (nucleic acid) is amplified while the PCR mixed solution 27 repeatedly contacts heating blocks set to the denaturation 33, annealing 11, and extension 31 and 32 temperatures along the capillary tube 13. As a result, a large amount of DNA 28 can be obtained.

PCR 반응시 어닐링을 담당하는 가열 블록(11)은 각각의 시료에 대한 최적 어닐링 온도로 설정되는 것이 바람직하다. 최적 어닐링 온도는 프라이머와 주형 DNA의 염기서열에 따라 매 PCR 수행시마다 달라지지만, 대략 45℃에서 65℃ 사이에서 설정되는 것이 바람직하다. 변성을 담당하는 가열블록(33)은 모세관이 감긴 네 개의 가열 블록-단열 블록 조립체에 모두 접하며, 약 95℃ 정도로 설정되는 것이 바람직하다. 연장을 담당하는 가열 블록(31, 32)은 각각 모세관이 감긴 두 개의 가열 블록-단열 블록 조립체에 접하며, 사용되는 DNA 중합효소에 따라 온도가 설정되지만 보통 Taq 중합효소를 사용할 경우 72℃로 설정되는 것이 바람직하다.The heating block 11, which is responsible for annealing during the PCR reaction, is preferably set to an optimum annealing temperature for each sample. The optimum annealing temperature varies with each PCR run depending on the base sequence of the primer and template DNA, but is preferably set between approximately 45 ° C. and 65 ° C. The heating block 33 responsible for denaturation is in contact with all four heating block-insulating block assemblies in which capillaries are wound, and is preferably set at about 95 ° C. The heating blocks 31 and 32, which are in charge of the extension, are in contact with two heating block-insulation block assemblies, each of which is capillary wound, and the temperature is set according to the DNA polymerase used, but is usually set at 72 ° C using Taq polymerase. It is preferable.

또한, 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치에는 PCR에 이용시 DNA 증폭 정도를 실시간으로 조사하기 위하여 실시간 검출 장치가 결합될 수 있다.In addition, the continuous flow phase reaction apparatus according to the present invention may be combined with a real-time detection device to investigate in real time the degree of DNA amplification when used in PCR.

구체적으로 본 발명은, 상기 고성능 연속 흐름상 반응 장치에 있어서, (a) 형광을 유발하는 광원과, 형광을 검출하는 검출기, 그리고 광선을 모세관에 조사한 후 발생하는 형광을 검출기로 모아주는 광학 장치로 이루어진 형광 유발 장치; (b) 상기 형광 유발 장치와 모세관의 상대적인 위치를 변화시킬 수 있는 스캔 장치를 추가로 포함하여, 실시간 반응 검출을 할 수 있는 것을 특징으로 하는 고성능 연속 흐름상 반응 장치를 제공한다.Specifically, the present invention, in the high performance continuous flow phase reaction apparatus, (a) a light source for inducing fluorescence, a detector for detecting fluorescence, and an optical device for collecting the fluorescence generated after irradiating a capillary with a light beam to the detector Fluorescence induction device; (b) further comprising a scanning device capable of changing the relative position of the fluorescence inducing device and the capillary, to provide a high performance continuous flow reaction device characterized in that the real-time response detection is possible.

상기 형광을 유발하는 광원으로는 특정 파장의 광선을 조사하는 레이저 또는 램프 등이 사용될 수 있고, 형광을 검출하는 검출기로는 PMT 또는 다이오드 등이 사용될 수 있다. 상기 광학 장치에는 레이저 광선은 통과시키고 형광 빛은 반사시키는 역할을 수행하는 이색거울과, 레이저 광선을 모세관에 모아주고 모세관으로부터 발생하는 형광을 모아 이색거울로 전달하는 역할을 수행하는 대물렌즈가 포함될 수 있다. 한편, 상기 스캔 장치는 형광 유발 장치가 고정된 상태에서 모세관이 감겨 있는 가열 블록을 일정속도로 왕복 이동시키거나 가열 블록이 고정된 상태에서 형광 유발 장치를 일정속도로 왕복 이동시켜 형광 유발 장치와 모세관의 상대적인 위치를 변화시키는 역할을 수행한다. 상기 실시간 반응 검출을 할 수 있는 고성능 연속 흐름상 반응 장치는 실시간 PCR(real-time PCR)에 이용될 수 있다.As the light source for inducing fluorescence, a laser or a lamp for irradiating a light of a specific wavelength may be used, and a PMT or a diode may be used as a detector for detecting fluorescence. The optical device may include a dichroic mirror that passes the laser beam and reflects the fluorescent light, and an objective lens that collects the laser beam in the capillary tube and collects the fluorescence generated from the capillary tube and transfers it to the dichroic mirror. have. Meanwhile, the scanning device reciprocates the heating block in which the capillary tube is wound at a fixed speed while the fluorescence generating device is fixed, or reciprocates the fluorescence generating device at a constant speed while the heating block is fixed, thereby causing the fluorescence generating device and the capillary tube to move. It plays a role of changing the relative position of. The high performance continuous flow phase reaction apparatus capable of detecting the real time reaction may be used for real-time PCR.

도 4를 참조하여, DNA 증폭에 대한 실시간 검출방법을 설명한다. DNA가 증폭됨에 따라 형광을 발생시킬 수 있는 물질이 첨가된 PCR 혼합용액(27)을 모세관(13)에 주입한다. 이후, 특정 파장의 레이저 광선(41)을 이색거울(43)과 대물렌즈(44)를 거쳐 모세관(13)에 조사한다. 상기 모세관으로부터 발생하는 형광(42)의 양을 검출기로 측정하면 모세관 내에서 DNA의 증폭 정도를 실시간으로 검출할 수 있다. 4, a real-time detection method for DNA amplification will be described. As the DNA is amplified, a PCR mixed solution 27 to which a substance capable of generating fluorescence is added is injected into the capillary tube 13. Then, the laser beam 41 of a specific wavelength is irradiated to the capillary tube 13 through the dichroic mirror 43 and the objective lens 44. When the amount of fluorescence 42 generated from the capillary is measured by a detector, the degree of DNA amplification in the capillary can be detected in real time.

본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치는 연속적으로 흐르는 유체를 반응시키는데, 특히 PCR을 수행하는데 유용하게 이용될 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 다중 연속 흐름상 반응 장치의 경우는 서로 다른 반응 조건을 갖는 반응을 동시에 두 군데 이상에서 수행할 수 있는 장점이 있으며, 따라서 DNA 다중 증폭기기의 제작 등에 응용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 반응 장치는 그 크기를 소형으로 제작할 수 있으므로 휴대가 가능하도록 할 수 있을 뿐만 아니라, 모세관이 기존의 랩온어칩(lab-on-a-chip)의 채널의 크기와 비슷하므로 랩온어칩에 연결하여 DNA 분석 등에 응용될 수 있다.The continuous flow bed reaction apparatus according to the present invention can be usefully used for reacting a continuously flowing fluid, in particular for performing PCR. Furthermore, in the case of the multiple continuous flow bed reaction apparatus according to the present invention, there are advantages in that two or more reactions having different reaction conditions can be simultaneously performed, and thus, may be applied to the fabrication of a DNA multiple amplifier. In addition, the reaction apparatus according to the present invention can be manufactured in a small size, so that the portable device can be portable, and the capillary tube is similar to the size of a channel of a conventional lab-on-a-chip. It can be connected to lab-on-a-chip and applied to DNA analysis.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the following examples are provided only to more easily understand the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1> 연속 흐름상 반응 장치의 제작Example 1 Fabrication of Continuous Flow Reaction Device

(1-1) 연속 흐름상 PCR 장치의 제작(1-1) Production of Continuous Flow Phase PCR Apparatus

도 2a에 도시된 형상을 갖는 연속 흐름상 PCR 장치에서 세 개의 가열 블록(21, 22, 23)은 구리를 사용하여 제작하였고, 단열 블록(12)은 벡크라이트를 사용하여 제작하였다. In the continuous flow PCR apparatus having the shape shown in FIG. 2A, three heating blocks 21, 22, and 23 were manufactured by using copper, and the insulating block 12 was manufactured by using backlite.

상기 세 개의 가열 블록과 단열 블록을 조립하여 내부에 단열 블록이 존재하고 상기 단열 블록을 동일한 길이의 호를 가지는 세 개의 가열 블록이 감싸는 형태로 제작하였으며, 전체적으로 지름 30mm, 높이 65mm가 되도록 제작하였다(도 2b 참조). The three heating blocks and the insulating block were assembled to form an insulating block therein, and the insulating block was formed in such a way that three heating blocks having an arc of the same length were wrapped, and were manufactured to have an overall diameter of 30 mm and a height of 65 mm ( 2b).

각각의 가열 블록에는 가열을 위한 히터를 삽입하기 위한 구멍과 가열 블록의 온도를 측정하여 조절하기 위한 온도 센서를 삽입하기 위한 구멍을 만들었다. 구체적으로, 3.1mm 지름의 히터(지름 3.1mm, 길이 32mm, Firerod, Watlow, St. Louis, MO)를 삽입하기 위해 3.1mm 지름의 구멍을 가열 블록에 만들었고, 1mm 지름의 온도조절 센서(지름 1mm, 길이 27mm, Watlow, St. Louis, MO)를 삽입하기 위해 1mm 지름의 구멍을 만들었다.Each heating block was made with a hole for inserting a heater for heating and a hole for inserting a temperature sensor for measuring and adjusting the temperature of the heating block. Specifically, a 3.1 mm diameter hole was made in the heating block to insert a 3.1 mm diameter heater (3.1 mm diameter, 32 mm long, Firerod, Watlow, St. Louis, MO), and a 1 mm diameter temperature sensor (1 mm diameter). , 27mm long, Watlow, St. Louis, MO) to make a 1mm diameter hole.

상기 가열 블록-단열 블록 조립체의 둘레에 깊이 250㎛, 폭 250㎛의 홈을 1.5mm의 피치 차이를 두고 나선형으로 연속적으로 파내었다. 상기 나선형 홈은 모세관을 상기 가열 블록에 감을 때 모세관의 위치를 고정시켜 주며, 반응시 열전달이 용이하도록 해준다. 상기 나선형 홈이 가열 블록-단열 블록 조립체의 세로방향으로 33회전하도록 제작하였는데, 이는 DNA 증폭 반응에서 PCR 싸이클의 회수가 된다. 상기 가열 블록-단열 블록 조립체의 나선형 홈 전체를 감고, 용액 주입 및 용액 회수 등에 필요한 모든 부분을 합하여 모세관은 총 3.5미터를 사용하였다. Grooves of 250 μm deep and 250 μm wide were circumferentially excavated in a circumference of the heating block insulation block assembly with a pitch difference of 1.5 mm. The helical groove fixes the position of the capillary when the capillary tube is wound around the heating block and facilitates heat transfer during the reaction. The helical groove was made to rotate 33 turns in the longitudinal direction of the heating block-insulation block assembly, which is a recovery of the PCR cycle in the DNA amplification reaction. The entire spiral groove of the heating block insulation block assembly was wound, and all parts necessary for solution injection, solution recovery, and the like were used for a total of 3.5 meters of capillary tubes.

세 개의 가열 블록 중 특히 변성을 담당하는 가열 블록에 감기는 모세관은 초기의 변성이 완전하게 이루어지도록 초기 첫 번째 싸이클에서 반응이 시작되는 처음 부분을 길게 디자인하여 제작하였고, 연장을 담당하는 가열 블록에 감기는 모세관은 마지막 연장이 완전히 이루어지도록 최종 싸이클에서 반응이 끝나는 마지막 부분을 길게 디자인하여 제작하였다. Of the three heating blocks, especially the capillary tube wound on the heating block responsible for denaturation was designed by making the first part of the reaction cycle in the initial first cycle long so that the initial denaturation is completed, and the heating block responsible for extension The winding capillary was designed with a long design of the last part of the reaction in the final cycle so that the last extension was completed completely.

도 2a 및 도 2b에는 가열 블록-단열 블록 조립체에 모세관이 감긴 모습이 도시되어 있는데, 가열 블록의 양말단으로 모세관이 길게 돌출되어 있는 모습을 볼 수 있다. 2A and 2B, the capillary tube is wound around the heating block insulation block assembly, and the capillary tube is protruded into the sock end of the heating block.

모세관은 폴리이미드가 코팅된 외경 240㎛, 내경 100㎛의 용융 실리카 재질의 모세관을 사용하였다(Polymicro Technologies, Phoenix, AZ). DNA나 단백질 등의 생체물질의 유리 표면에 대한 흡착을 제거하기 위해 상기 모세관의 내벽을 실레인화 반응을 이용하여 코팅하였다. 먼저 모세관에 메탄올을 30분간 흘려준 후에 40℃에서 12시간 동안 건조시켰다. 이후, 0.02M 트리메틸클로로실란(trimethylchlorosilane)과 0.04M 이미다졸을 포함하는 DMF(dimethylformamide) 용액을 채워 하루동안 방치하였다. 실레인 반응이 완료된 모세관을 메탄올과 살균 증류수로 헹궈서 내벽이 코팅된 모세관을 제조하였다.The capillary tube was a fused silica capillary tube having an outer diameter of 240 μm and an inner diameter of 100 μm coated with polyimide (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ). The inner wall of the capillary was coated using a silanization reaction to remove adsorption on the glass surface of a biological material such as DNA or protein. First, methanol was poured into the capillary for 30 minutes and then dried at 40 ° C. for 12 hours. Thereafter, the solution was filled with DMF (dimethylformamide) solution containing 0.02M trimethylchlorosilane and 0.04M imidazole, and left for one day. The capillary tube with the silane reaction completed was rinsed with methanol and sterile distilled water to prepare a capillary tube coated with an inner wall.

상기 모세관을 가열 블록-단열 블록 조립체의 외면에 형성된 나선형 홈을 따라 감아올려 연속 흐름상 PCR 장치를 제작하였다. The capillary tube was wound up along a spiral groove formed on the outer surface of the heating block-insulation block assembly to prepare a continuous flow PCR apparatus.

(1-2) 다중 연속 흐름상 PCR 장치의 제작(1-2) Preparation of Multiple Continuous Flow Phase PCR Devices

도 3b 내지 도 3e에 도시된 형상을 갖는 다중 연속 흐름상 PCR 장치를 제작하였다. 상기 장치에서 가열 블록과 단열 블록의 재질로는 상기 실시예 (1-1)에서와 같이 각각 구리와 벡크라이트를 사용하였다. Multiple continuous flow phase PCR apparatuses having the shapes shown in FIGS. 3b to 3e were constructed. In the apparatus, copper and backlite were used as materials for the heating block and the insulating block, as in Example (1-1).

먼저, 하나의 가열 블록(11)에 하나의 단열 블록(13)을 조립하여 지름 20mm, 높이 40mm의 가열 블록-단열 블록 조립체를 제조하였다. 이와 같은 조립체를 네 개 제조한 후, 각각의 조립체의 둘레에 깊이 240㎛, 폭 240㎛의 홈을 1mm의 피치 차이를 두고 나선형으로 연속적으로 파내었다. 상기 나선형 홈이 각각의 조립체의 세로방향으로 34회전하도록 제작하였다. 상기 각각의 조립체의 나선형 홈 전체를 감고, 용액 주입 및 용액 회수 등에 필요한 모든 부분을 합하여 모세관은 약 2미터를 사용하였다. First, one insulating block 13 was assembled to one heating block 11 to prepare a heating block-insulating block assembly having a diameter of 20 mm and a height of 40 mm. After the four such assemblies were manufactured, grooves each having a depth of 240 µm and a width of 240 µm were circumferentially excavated spirally with a pitch difference of 1 mm around the respective assemblies. The spiral groove was made to rotate 34 in the longitudinal direction of each assembly. The entire spiral groove of each assembly was wound, and all parts necessary for solution injection, solution recovery, and the like were used for capillary tubes of about 2 meters.

상기 조립체에서 각각의 가열 블록에는 상기 실시예 (1-1)에서와 같이 히터와 온도 센서를 삽입하기 위한 구멍을 만들었고, 모세관은 상기 실시예 (1-1)에서 사용한 용융 실리카 재질의 모세관이나 PTFE 모세관(Cole-Parmer Instrument, Co.)을 사용하였다.In the assembly, each heating block was provided with a hole for inserting a heater and a temperature sensor as in Example (1-1), and the capillary tube was a capillary tube made of fused silica material or PTFE used in Example (1-1). Capillary tube (Cole-Parmer Instrument, Co.) was used.

이후, 모세관을 감아 완성된 상기 네 개의 조립체를 별도로 존재하는 세 개의 가열 블록(31, 32, 33)에 각각 조립하되, 상기 세 개의 가열 블록 중 두 개의 가열 블록(31, 32)은 두 개의 모세관과 접촉하도록 하고, 하나의 가열 블록(33)은 네 개의 모세관과 접촉하도록 조립함으로써 다중 연속 흐름상 PCR 장치를 제작하였다(도 3b, 도 3d 및 도 3e 참조).Then, the four assemblies completed by winding the capillary tube are assembled into three separate heating blocks 31, 32 and 33, respectively, wherein two heating blocks 31 and 32 of the three heating blocks are two capillary tubes. And a single heating block 33 is assembled into contact with four capillaries to construct a multiple continuous flow PCR apparatus (see FIGS. 3B, 3D and 3E).

<실시예 2> 유체의 연속적인 흐름상에서의 PCRExample 2 PCR on Continuous Flow of Fluid

상기 실시예 (1-1)에서 제조한 연속 흐름상 PCR 장치를 이용하여 모세관 내 유체(PCR 혼합용액)의 연속적인 흐름 상태에서 PCR을 수행하였다.PCR was performed in a continuous flow state of the fluid in the capillary (PCR mixed solution) using the continuous flow PCR device prepared in Example (1-1).

주형 DNA로는 박테리아 카나마이신 저항성 유전자로부터 분리한 플라스미드 DNA(promega)를 사용하였고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 상기 플라스미드 DNA 중 323bp의 단편을 증폭하였다. PCR 혼합용액은 총 50㎕ 기준에 3㎕의 25mM MgCl₂, 5㎕의 10X 내열성 DNA 중합효소 완충용액 (500mM KCl, 100mM Tris-HCl, 1% Triton™X-100), 1㎕의 10mM PCR 뉴클레오티드 혼합액(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각이 물에 10mM씩 녹아 있는 것), 각각 3.3㎕의 12μM 업스트림, 다운스트림 프라이머, 0.25㎕의 5unit/㎕ Taq DNA 중합효소, 1㎕(1ng)의 주형 DNA, 그리고 33.15㎕의 살균된 3차 증류수가 포함된다.As template DNA, plasmid DNA (promega) isolated from the bacterial kanamycin resistance gene was used, and a fragment of 323 bp in the plasmid DNA was amplified using a primer having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. PCR mixtures were prepared with 3 μl of 25 mM MgCl ₂ and 5 μl of 10 × heat resistant DNA polymerase buffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, 1% Triton ™). X-100), 1 μl of 10 mM PCR nucleotide mixture (10 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP dissolved in water), 3.3 μl of 12 μM upstream, downstream primer, 0.25 μl of 5unit / μl Taq DNA Polymerase, 1 μl (1 ng) of template DNA, and 33.15 μl of sterile tertiary distilled water.

모세관 내에 PCR 혼합 용액을 연속적으로 주입하고 0.3 - 5.0㎕/분의 일정 속도로 흐름을 조절하기 위해 주사기 펌프(22 Multiple Syringe Pump, Harvard Apparatus)를 이용하였다. 250㎕ 용량의 가스 타이트 주사기(gas tight syringe)에 PCR 혼합용액을 채우고 이를 펌프에 연결하였다. 주사기의 끝부분을 모세관의 유체 주입구 말단(변성 반응을 담당하는 가열 블록의 시작부분) 쪽에 연결한 후, 펌프를 조작하여 주사기를 밀어줌으로써 모세관에 주사기 내의 PCR 혼합용액이 주입되어 계속해서 흘러가도록 하였다. A syringe pump (22 Multiple Syringe Pump, Harvard Apparatus) was used to continuously inject the PCR mixed solution into the capillary and regulate the flow at a constant rate of 0.3-5.0 μl / min. A 250 μl gas tight syringe was filled with the PCR mixed solution and connected to the pump. The tip of the syringe was connected to the end of the fluid inlet of the capillary (the beginning of the heating block responsible for the denaturation reaction), and then the pump was operated to push the syringe so that the PCR mixed solution in the syringe was injected into the capillary and continued to flow. .

상기 연속 흐름상 PCR 장치에서 각각의 가열 블록의 온도를 95℃, 60℃ 및 72℃로 설정하였고, 상기 PCR 혼합용액이 상기 가열 블록을 반복적으로 접촉하도록 하였다. PCR 혼합용액의 이동 속도를 각각 0.3, 0.5, 1.0, 3.0, 5.0㎕/분으로 설정하고 PCR을 수행하였다.The temperature of each heating block was set to 95 ° C., 60 ° C. and 72 ° C. in the continuous flow phase PCR apparatus, and the PCR mixed solution was repeatedly contacted with the heating block. PCR was performed with the movement speeds of the PCR mixed solutions set to 0.3, 0.5, 1.0, 3.0, 5.0 μl / min, respectively.

0.3㎕/분의 속도에서는 용액 주입 후 90분 후에, 5㎕/분의 속도에서는 용액 주입 후 약 5분 30초 후에, 모세관의 유체 배출구 말단(연장 반응을 담당하는 가열 블록의 끝부분)에서 흘러나오는 용액을 수집하였다.90 minutes after solution injection at 0.3 μl / min and about 5 minutes and 30 seconds after solution injection at 5 μl / min, flows from the end of the fluid outlet of the capillary (the end of the heating block responsible for the extension reaction) The resulting solution was collected.

<실시예 3> 증폭된 DNA의 확인Example 3 Identification of Amplified DNA

PCR이 완료된 시료의 DNA 증폭 여부를 확인하기 위해서 겔 전기영동을 하였다. 상기 실시예 2에서 PCR 완료 후 수집된 시료 용액 10㎕를 2% 아가로즈 겔에 로딩하고 TBE 완충용액 상에서 전압을 걸어 전개하였다. 이 때 증폭이 원활히 진행되었는지 확인하기 위해 기존의 상업화된 기기(MBS 0.2G, Hybaid, U.K.)를 이용하여 증폭한 시료와 사이즈 마커를 함께 로딩하였다. 상업화된 기기에서의 PCR 조건은 95℃ 2분, 그리고 95℃ 30초, 60℃ 1분, 72℃ 2분의 조건을 33회 반복하였다. 그 후 72℃에서 5분간 방치하고 4℃로 냉각하여 반응을 종결하였다.Gel electrophoresis was performed to confirm DNA amplification of the PCR-completed samples. 10 μl of the sample solution collected after the completion of the PCR in Example 2 was loaded onto a 2% agarose gel and developed by applying voltage on a TBE buffer solution. At this time, in order to confirm that the amplification proceeded smoothly, the amplified sample and the size markers were loaded together using conventional commercial devices (MBS 0.2G, Hybaid, U.K.). PCR conditions in the commercialized instrument was repeated 33 times at 95 ℃ 2 minutes, and the conditions of 95 ℃ 30 seconds, 60 ℃ 1 minutes, 72 ℃ 2 minutes. Thereafter, the mixture was left at 72 ° C. for 5 minutes and cooled to 4 ° C. to terminate the reaction.

그 결과를 도 5에 도시하였다. 도 5에서 레인 1(양성대조구)은 기존의 PCR 기기를 이용하여 DNA를 증폭한 결과이고, 레인 2 내지 6은 모세관 내 PCR 혼합용액의 이동 속도에 따른 DNA 증폭 정도의 차이를 나타낸 것이며(왼쪽부터 0.3, 0.5, 1.0, 3.0, 5.0㎕/분), 레인 7(음성대조구)은 증폭 과정을 거치지 않은 DNA을, 그리고, 레인 8은 증폭된 DNA의 크기를 가늠할 수 있는 사이즈 마커(size markers)를 나타낸 것이다. 도 5에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 연속 흐름상 PCR 장치를 이용한 경우에도 DNA 증폭이 잘 이루어진다는 것을 알 수 있었고, 특히, PCR 혼합용액의 이동 속도가 느릴수록 증폭효율이 높다는 것을 알 수 있었는데, 이는 이동 속도가 느릴수록 연장(extension) 반응이 완전히 진행되기 때문인 것으로 생각된다. The results are shown in FIG. In Figure 5 lane 1 (positive control) is a result of amplifying the DNA using a conventional PCR instrument, lanes 2 to 6 shows the difference in the degree of DNA amplification according to the moving speed of the PCR mixed solution in the capillary (from the left side) 0.3, 0.5, 1.0, 3.0, 5.0 μl / min), lane 7 (negative control) for unamplified DNA, and lane 8 for size markers to estimate the size of the amplified DNA. It is shown. As shown in Figure 5, even when using a continuous flow PCR device according to the present invention was found that the DNA amplification is well performed, in particular, it was found that the slower the moving speed of the PCR mixture solution, the higher the amplification efficiency. It is thought that this is because the extension reaction proceeds completely at a slower moving speed.

<실시예 4> 서로 다른 조성을 갖는 PCR 혼합용액의 단속적 주입에 의한 DNA 증폭Example 4 DNA Amplification by Intermittent Injection of PCR Mixed Solutions Having Different Compositions

본 발명에 따른 연속 흐름상 PCR 장치가 서로 다른 조성을 갖는 PCR 혼합용액을 순차적으로 주입하였을 경우에도 각각의 주형 DNA에 대한 증폭 반응을 수행할 수 있는지 여부를 조사하였다. It was investigated whether the continuous flow PCR apparatus according to the present invention can perform the amplification reaction for each template DNA even when sequentially injecting PCR mixed solutions having different compositions.

서로 다른 종류의 주형 DNA에 대한 순차적이며 연속적인 PCR을 수행하기 위해 4가지 주형 DNA와 각각의 DNA에 대한 한 쌍의 프라이머를 준비하였다. 각각의 주형 DNA와 프라이머 쌍은 아래 표 1과 같다. Four template DNAs and a pair of primers for each DNA were prepared to perform sequential and continuous PCR on different types of template DNAs. Each template DNA and primer pair is shown in Table 1 below.

시료 No.Sample No. 주형 DNATemplate DNA 프라이머 쌍Primer pair 구입처Where to buy 1One lambda DNAlambda DNA 서열번호 1 및 서열번호 2(주형 DNA의 500 bp의 부분을 증폭하도록 디자인)SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (designed to amplify a 500 bp portion of template DNA) PromegaPromega 22 박테리아 카나마이신 저항성 유전자로부터 분리한 플라스미드 DNAPlasmid DNA isolated from the bacterial kanamycin resistance gene 서열번호 3 및 서열번호 4(주형 DNA의 323 bp의 부분을 증폭하도록 디자인)SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 (designed to amplify a portion of 323 bp of template DNA) TakaraTakara 33 PCS2HA/LM04PCS2HA / LM04 서열번호 5 및 서열번호 6(주형 DNA의 497 bp의 부분을 증폭하도록 디자인)SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 (designed to amplify a portion of 497 bp of template DNA) 포항공대생명과학과실험실Pohang University of Life Science Lab. 44 Lhx3-LIM1Lhx3-LIM1 서열번호 7 및 서열번호 8(주형 DNA의 267 bp의 부분을 증폭하도록 디자인)SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 (designed to amplify a portion of 267 bp of template DNA)

각각의 주형 DNA와 프라이머들을 포함하는 PCR 혼합용액(시료 1 내지 시료 4)을 준비하였다. 각 PCR 혼합용액의 성분은 상기 실시예 2에서 사용한 것과 동일하게 하였다. 상기 표 1의 각각의 주형 DNA와 프라이머를 포함하는 PCR 혼합용액을 시료 1, 시료 2 등으로 구분하였을 때, 주입하는 순서는 시료 1(2㎕) - 공기층(< 1cm) - 브로모페놀 블루(2㎕) - 공기층(< 1cm) - 시료 2(2㎕) - 공기층(< 1cm) - 브로모페놀 블루(2㎕) - 공기층 - 시료 3(2㎕) - 공기층 (< 1cm) - 브로모페놀 블루(2㎕) - 공기층 - 시료 4(2㎕) - 공기층 (< 1cm) - 브로모페놀 블루(2㎕) - 공기층 - 시료 1(2㎕)을 반복하여 주입하였다.PCR mixed solutions (Sample 1 to Sample 4) containing each template DNA and primers were prepared. The components of each PCR mixed solution were the same as those used in Example 2 above. When the PCR mixed solution containing the template DNA and the primer of Table 1 was divided into Sample 1, Sample 2, and the like, the injection order was Sample 1 (2 µl)-Air layer (<1 cm)-Bromophenol blue ( 2 μl)-Air layer (<1 cm)-Sample 2 (2 μl)-Air layer (<1 cm)-Bromophenol blue (2 μl)-Air layer-Sample 3 (2 μl)-Air layer (<1 cm)-Bromophenol Blue (2 µl)-Air Layer-Sample 4 (2 µl)-Air Layer (<1 cm)-Bromophenol Blue (2 µl)-Air Layer-Sample 1 (2 µl) was injected repeatedly.

상기에서 공기층과 브로모페놀 블루는 시료 이월 현상을 방지하기 위하여 주입되며, 구체적으로, 브로모페놀 블루는 브로모페놀 블루 완충용액(30% 글리세롤, 30mM EDTA, 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol)(Takara)을 사용하였다.In the air layer and bromophenol blue is injected to prevent sample carry-over phenomenon, specifically, bromophenol blue is bromophenol blue buffer solution (30% glycerol, 30mM EDTA, 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol (Takara) was used.

이 후 모세관의 유체 배출구 말단에서 PCR이 완료되어 나오는 각각의 PCR 산물을 브로모페놀 블루 용액의 색과 공기층으로 식별하여 채집하였다.Thereafter, each PCR product from which the PCR was completed at the fluid outlet end of the capillary tube was identified and collected by the color and air layer of the bromophenol blue solution.

또한, 모세관 내벽의 코팅 유무에 따른 DNA 증폭 반응의 효율을 비교하기 위하여, 모세관의 내벽이 트리메틸클로로실란(TMS)으로 코팅된 모세관과 코팅되지 않은 모세관을 각각 이용하여 PCR을 수행하였다. In addition, in order to compare the efficiency of the DNA amplification reaction according to the coating of the inner wall of the capillary, PCR was performed using capillaries coated with trimethylchlorosilane (TMS) and uncoated capillaries, respectively.

PCR이 완료된 시료의 DNA 증폭 여부를 확인하기 위해서 실시예 3과 동일한 방법으로 겔 전기영동을 하였다. 한편, DNA 증폭이 원활히 진행되었는지 확인하기 위해 기존의 상업화된 기기(MBS 0.2G, Hybaid, U.K.)를 이용하여 증폭한 시료와 사이즈 마커를 함께 로딩하였다. 상업화된 기기에서의 PCR 조건은 95℃ 2분, 그리고 95℃ 30초, 60℃ 1분, 72℃ 2분의 조건을 33회 반복하였다. 그 후 72℃에서 5분간 방치하고 4℃로 냉각하여 반응을 종결하였다.Gel electrophoresis was carried out in the same manner as in Example 3 to confirm the DNA amplification of the PCR-completed sample. Meanwhile, in order to confirm that DNA amplification proceeded smoothly, amplified samples and size markers were loaded together using conventional commercial devices (MBS 0.2G, Hybaid, U.K.). PCR conditions in the commercialized instrument was repeated 33 times at 95 ℃ 2 minutes, and the conditions of 95 ℃ 30 seconds, 60 ℃ 1 minutes, 72 ℃ 2 minutes. Thereafter, the mixture was left at 72 ° C. for 5 minutes and cooled to 4 ° C. to terminate the reaction.

그 결과를 도 6에 도시하였다. 도 6에서, 레인 1은 사이즈 마커이고, 레인 2, 4, 6 및 8 또는 레인 10, 12, 14 및 16은 시료 1 내지 시료 4에 대한 기존 상업화된 PCR 기기에서의 증폭 결과를 나타낸다. 그리고, 레인 3, 5, 7 및 9는 각각 시료 1 내지 시료 4를 내벽이 TMS로 코팅되지 않은 모세관에서 증폭한 결과를 나타내는 것이고, 레인 11, 13, 15 및 17은 시료 1 내지 시료 4를 각각 내벽이 TMS로 코팅된 모세관에서 증폭한 결과를 나타내는 것이다. The results are shown in FIG. In FIG. 6, lane 1 is the size marker and lanes 2, 4, 6 and 8 or lanes 10, 12, 14 and 16 show the results of amplification in existing commercialized PCR instruments for samples 1-4. Lanes 3, 5, 7 and 9 show the results of amplifying the samples 1 to 4 in the capillaries whose inner walls are not coated with TMS, and lanes 11, 13, 15, and 17 were samples 1 to 4, respectively. The inner wall shows the result of amplification in the capillary tube coated with TMS.

도 6의 레인 11, 13 및 15에서 보는 바와 같이, 시료 1 내지 시료 3에 대한 증폭이 잘 이루어졌음을 확인할 수 있는 바, 본 발명에 따른 연속 흐름상 PCR 장치를 이용하면 서로 다른 주형 DNA를 순차적으로 증폭할 수 있다.As shown in lanes 11, 13, and 15 of FIG. 6, it can be seen that the amplification of the samples 1 to 3 was well performed. When using the continuous flow PCR apparatus according to the present invention, different template DNAs were sequentially sequenced. Can be amplified by

이상 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치는 연속적으로 흐르는 유체를 반응시키는데 유용하게 이용될 수 있으며, 특히 중합효소 연쇄반응에 유용하게 이용될 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 다중 연속 흐름상 반응 장치의 경우는 서로 다른 반응 조건을 갖는 반응을 동시에 두 군데 이상에서 수행할 수 있는 장점이 있으며, 따라서 DNA 다중 증폭기기의 제작 등에 응용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 반응 장치는 그 크기를 소형으로 제작할 수 있으므로 휴대가 가능하도록 할 수 있을 뿐만 아니라, 모세관이 기존의 랩온어칩(lab-on-a-chip)의 채널의 크기와 비슷하므로 랩온어칩에 연결하여 DNA 분석 등에 응용될 수 있다. 또한 PCR 수행시 DNA 증폭 여부를 실시간으로 알 수 있는 실시간 검출 장치를 결합함으로써 PCR 반응 진행여부를 용이하게 확인할 수 있다.As mentioned above, the continuous flow bed reaction apparatus according to the present invention can be usefully used for reacting a continuously flowing fluid, and can be particularly useful for polymerase chain reaction. Furthermore, in the case of the multiple continuous flow bed reaction apparatus according to the present invention, there are advantages in that two or more reactions having different reaction conditions can be simultaneously performed, and thus, may be applied to the fabrication of a DNA multiple amplifier. In addition, the reaction apparatus according to the present invention can be manufactured in a small size, so that the portable device can be portable, and the capillary tube is similar to the size of a channel of a conventional lab-on-a-chip. It can be connected to lab-on-a-chip and applied to DNA analysis. In addition, by combining the real-time detection device that can know in real time whether the DNA amplification when performing the PCR can easily check whether the PCR reaction progress.

도 1a 및 도 1b는 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치의 하나의 실시태양을 도시한 것이다.1A and 1B show one embodiment of a continuous flow bed reaction apparatus according to the present invention.

도 2a 및 도 2b는 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치의 다른 하나의 실시태양을 나타낸 개략도 및 실제 제조한 사진을 각각 도시한 것이다.2A and 2B show schematic diagrams and actual manufactured pictures, respectively, showing another embodiment of the continuous flow bed reaction apparatus according to the present invention.

도 3a는 본 발명에 따른 다중 연속 흐름상 반응 장치를 제조하기 위하여 모세관이 감긴 가열 블록-단열 블록 조립체를 제조하는 과정을 나타낸 것이다.Figure 3a shows the process of manufacturing a capillary wound heating block-insulation block assembly to manufacture a multiple continuous flow bed reaction apparatus according to the present invention.

도 3b는 본 발명에 따른 예시적인 다중 연속 흐름상 반응 장치의 평면도이다.3B is a plan view of an exemplary multiple continuous flow bed reactor in accordance with the present invention.

도 3c는 본 발명에 따른 예시적인 다중 연속 흐름상 반응 장치의 정면도이다.3C is a front view of an exemplary multiple continuous flow bed reactor in accordance with the present invention.

도 3d는 일예로서 제조한 본 발명에 따른 다중 연속 흐름상 반응 장치의 사진이다.Figure 3d is a photograph of a multiple continuous flow bed reaction apparatus according to the present invention prepared as an example.

도 3e는 도 3d의 장치에 모세관을 감고 히터와 센서를 장착한 본 발명에 따른 다중 연속 흐름상 반응 장치의 사진이다.Figure 3e is a photograph of a multiple continuous flow bed reaction apparatus according to the present invention with a capillary tube wound around the apparatus of Figure 3d and equipped with a heater and a sensor.

도 4는 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치에 실시간 검출 장치를 연결한, 연속 흐름상의 실시간 반응 검출을 위한 장치의 예시도이다. 4 is an exemplary diagram of a device for real-time reaction detection in a continuous flow in which a real-time detection device is connected to a continuous flow reaction device in accordance with the present invention.

도 5는 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치로 PCR을 수행한 후, 시료의 DNA 증폭 여부를 확인한 겔 사진이다. 5 is a gel photograph confirming the DNA amplification of the sample after performing PCR in a continuous flow reactor according to the present invention.

도 6은 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치에 서로 다른 조성을 갖는 PCR 혼합용액을 순차적으로 주입하여 PCR을 수행한 후, 시료의 DNA 증폭 여부를 확인한 겔 사진이다.6 is a gel photograph confirming the DNA amplification of the sample after performing PCR by sequentially injecting a PCR mixed solution having a different composition into the continuous flow bed reaction apparatus according to the present invention.

<도면의 주요 부호에 대한 설명><Description of Major Symbols in Drawing>

11, 21, 22, 23, 31, 32, 33... 가열 블록11, 21, 22, 23, 31, 32, 33 ... heating block

12... 단열 블록 13... 모세관12 ... insulating block 13 ... capillary

27... PCR 혼합용액 28... 증폭된 DNA27 ... PCR Mixed Solution 28 ... Amplified DNA

41... 레이저 광선 42... 형광41 ... laser beam 42 ... fluorescence

43... 이색거울 44... 대물렌즈43 ... a unique mirror 44 ... objective lens

<110> Postech Foundation <120> High throughput device for performing continuous-flow reactions <130> FPD200310-0032 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR upstream primer <400> 1 gatgagttcg tgtccgtaca act 23 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR downstream primer <400> 2 ggttatcgaa atcagccaca gcgcc 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR upstream primer <400> 3 gccattctca ccggattcag tcgtc 25 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR downstream primer <400> 4 agccgccgtc ccgtcaagtc ag 22 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR upstream primer <400> 5 gccctcgaga tggtgaatcc gggcagc 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR downstream primer <400> 6 gccctcgagt cagcagacct tctggtc 27 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR upstream primer <400> 7 ggaattcatg ctgttagaa 19 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR downstream primer <400> 8 cgcggatccc cgaagcgctt aaagaagtc 29<110> Postech Foundation <120> High throughput device for performing continuous-flow reactions <130> FPD200310-0032 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> PCR upstream primer <400> 1 gatgagttcg tgtccgtaca act 23 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR downstream primer <400> 2 ggttatcgaa atcagccaca gcgcc 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> PCR upstream primer <400> 3 gccattctca ccggattcag tcgtc 25 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR downstream primer <400> 4 agccgccgtc ccgtcaagtc ag 22 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> PCR upstream primer <400> 5 gccctcgaga tggtgaatcc gggcagc 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR downstream primer <400> 6 gccctcgagt cagcagacct tctggtc 27 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> PCR upstream primer <400> 7 ggaattcatg ctgttagaa 19 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR downstream primer <400> 8 cgcggatccc cgaagcgctt aaagaagtc 29

Claims

(1) two or more solid phase heating blocks controlled to different temperatures; And

(2) a capillary tube having a first end as a fluid inlet and a second end as a fluid outlet and allowing continuous flow of fluid from the first end to the second end,

Characterized in that the capillary is sequentially or repeatedly in contact with the heating block is controlled to different temperatures,

High performance continuous flow bed reactor.

(1) two or more solid phase heating blocks controlled to different temperatures;

(2) an insulating block arranged in contact with said heating block and not so that each heating block is in direct contact with each other; And

(3) a capillary tube having a first end as a fluid inlet and a second end as a fluid outlet and allowing continuous flow of fluid from the first end to the second end,

High performance continuous flow bed reactor.

The method according to claim 1 or 2,

A device for carrying out a polymerase chain reaction (PCR).

The method according to claim 1 or 2,

Each heating block is controlled to a different temperature by a heater and a temperature sensor.

The method according to claim 1 or 2.

And the material of the heating block is an electrothermal metal material selected from the group consisting of copper, iron, aluminum, brass, gold, silver and platinum.

The method of claim 2,

The material of the insulating block is a backlite or acrylic polymer resin.

The method according to claim 1 or 2,

Wherein the material of the capillary is selected from the group consisting of glass, fused silica, polytetrafluoroethylene (PTFE) and polyethylene.

The method according to claim 1 or 2,

Wherein the outer wall of the capillary is coated with polyimide or PTFE.

The method according to claim 1 or 2,

The inner wall of the capillary is coated with at least one material selected from the group consisting of trimethylchlorosilane, dimethyldichlorosilane, methyltrichlorosilane, trimethylmethoxysilane, dimethyldimethoxysilane and methyltrimethoxysilane.

The method according to claim 1 or 2,

And a capillary tube wound around an outer surface of the heating block.

The method of claim 10,

And the capillary is fixed by a helical groove formed in the outer surface of the heating block.

The device of claim 10, wherein the capillary is wound 10 to 50 times.

The method of claim 2,

(1) three solid phase heating blocks controlled to different temperatures;

(3) a capillary tube having a first end as a PCR mixed solution inlet and a second end as a PCR product outlet, allowing a continuous flow of solution from the first end to the second end,

Apparatus for performing PCR by sequentially or repeatedly contacting three heating blocks in which the capillary is adjusted to different temperatures.

The method according to claim 1 or 2,

(a) a fluorescence generating device comprising a light source for inducing fluorescence, a detector for detecting fluorescence, and an optical device for collecting fluorescence generated after irradiating a capillary with a light beam to a detector;

and (b) a scanning device capable of changing a relative position of the fluorescence inducing device and the capillary, wherein the device can detect a real time reaction.

The method of claim 14,

And said real-time reaction is real-time PCR.

An assembly of a solid-state heating block and an insulated block, comprising: at least two assemblies having a first end as a fluid inlet and a second end as a fluid outlet, the capillary being wound to allow continuous flow of fluid from the first end to the second end; , Multiple continuous flow bed reaction apparatus characterized in that it is assembled to a temperature-controlled heating block or adiabatic block to perform two or more independent reactions.

(1) injecting the PCR mixed solution into the first end of the capillary of the high performance continuous flow reactor according to claim 1 or 2; And

(2) recovering the PCR product exiting the second end while controlling the flow of the solution at the proper rate;

High performance continuous flow nucleic acid amplification method.

The method of claim 17,

The capillary contacting the heating block sequentially or repeatedly set at 95-100 ° C., 45-65 ° C. and 65-72 ° C., respectively.

The method of claim 17,

And wherein the capillary contacts the heating block repeatedly 10 to 50 times.

The method of claim 17,

Said PCR mixed solution comprises MgCl ₂ , dNTP (dATP, dCTP, dGTP and dTTP) mixture, primer, heat resistant DNA polymerase, heat resistant DNA polymerase buffer solution and template DNA.

The method of claim 20,

Wherein said primer is a molecular beacon.

The method of claim 20,

The PCR mixed solution further comprises an intercalating dye capable of specifically binding to double-stranded DNA to emit fluorescence.

The method of claim 17,

The PCR mixed solution is moved from the first end of the capillary to the second end by a pump.

The method of claim 17,

Method of injecting the PCR mixed solution of step (1) continuously or intermittently.

The method of claim 24,

Method of injecting an organic solvent or an air layer between the PCR mixture solution of different compositions, when the PCR mixture solution is intermittently injected.