KR20050067371A

KR20050067371A - 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 인슐린 또는 인슐린유도체를 수득하는 방법

Info

Publication number: KR20050067371A
Application number: KR1020050044974A
Authority: KR
Inventors: 프란츠-요셉 루브뢰더; 라인홀트 켈러
Original assignee: 아벤티스 파마 도이칠란트 게엠베하
Priority date: 1997-08-18
Filing date: 2005-05-27
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2018-08-18
Also published as: DE59804121D1; CZ259898A3; US20020156234A1; HK1061870A1; EP0906918A2; CN101186940A; PT980874E; CA2245151A1; US6727346B2; EP0980874A1; HU0600287D0; JPH11130798A; CZ295679B6; ES2176870T3; HU9801886D0; RU2205836C2; PL328108A1; TR199801587A3; AR016821A1; US5986048A

Abstract

본 발명은 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드 및 카오트로픽 보조제의 존재하에 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 인슐린 또는 인슐린 유도체의 전구체를 수득하는 개선된 방법에 관한 것이다.

Description

정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 인슐린 또는 인슐린 유도체를 수득하는 방법{Process for obtaining an insulin or an insulin derivative thereof having correctly bonded cystine bridges}

사람 인슐린은 2개의 아미노산 쇄가 함께 51개 아미노산 잔기를 갖는 단백질이다. 6개의 시스테인 잔기가 2개의 아미노산 쇄에서 발견되었으며, 2개의 시스테인 잔기는 각각 디설파이드 브릿지에 의해 서로 결합된다. 생물학적으로 활성이 있는 사람 인슐린은 A 및 B 쇄가 2개의 시스틴 브릿지에 의해 서로 결합되어 있고, 추가의 시스틴 브릿지가 A 쇄에서 발견된다. 통계학적으로 살펴보면, 사람 인슐린 분자내에서 디설파이드 브릿지의 형성 가능성은 15번 존재한다. 생물학적으로 활성이 있는 사람 인슐린은 15번의 가능성 중 단지 한번만이 발견된다. 사람 인슐린에서는 하기 시스테인 잔기가 서로 연결된다: A 6 - A 11, A 7 - B 7 및 A 20 - B 19. 문자 A 및 B는 각각의 인슐린 아미노산 쇄를 나타내고, 숫자는 각각의 아미노산 쇄의 아미노 말단에서 카복시 말단까지 카운팅한 아미노산 잔기의 위치를 나타낸다. 또한, 디설파이드 브릿지는 2개의 사람 인슐린 분자 사이에서 형성되어 무수한 다른 디설파이드 브릿지를 용이하게 생성할 수 있다.

사람 인슐린을 제조하는 공지된 방법은 사람 프로인슐린의 사용에 기초하고 있다. 사람 프로인슐린은 86개 아미노산 잔기의 선형 아미노산 쇄를 갖는 단백질로서 사람 인슐린의 B 및 A 쇄는 35개 아미노산 잔기를 갖는 C 펩타이드에 의해 서로 결합되어 있다. 사람 인슐린에서 발견된 디설파이드 브릿지의 형성은 중간체에 의해 발생하며, 사람 인슐린의 시스테인 잔기가 황 보호 그룹, 예를 들어 S-설포네이트(-S-SO3-) 그룹으로 제공된다[참조: EP 0 037 255]. 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 프로인슐린을 수득하는 방법이 또한 공지되어 있으며[참조: Biochemistry, 60, (1968), pages 622-629], 이는 시스테인 잔기가 티올 잔기(-SH)로서 존재하는, 돼지 췌장으로부터 수득한 프로인슐린으로부터 출발한다. 용어 "정확하게 결합된 시스틴 브릿지"는 생물학적 활성이 있는 포유동물 인슐린에서 발견되는 디설파이드 브릿지를 의미하는 것으로 이해된다.

재조합 DNA 방법에 의해 인슐린 또는 인슐린 유도체의 전구체, 특히 아미노산 서열 및/또는 아미노산 쇄 길이가 사람 인슐린과 다른 사람 프로인슐린 또는 프로인슐린을 미생물에서 제조할 수 있게 되었다. 유전학적으로 변형된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포로부터 제조된 프로인슐린은 정확하게 결합된 어떠한 시스틴 브릿지도 가지고 있지 않다. 에스케리키아 콜라이를 사용한 사람 인슐린의 제조 방법(EP 0 055 945)은 하기 방법에 기초하고 있다: 미생물의 발효-세포 분쇄-융합 단백질의 분리-융합 단백질의 시아노겐 할라이드 분해-프로인슐린 서열을 갖는 분해 생성물의 분리-S-설포네이트 그룹에 의한 프로인슐린의 시스틴 잔기의 보호-S-설포네이트의 크로마토그래피 정제-정확하게 결합된 시스틴 브릿지의 형성-프로인슐린의 탈염-정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 프로인슐린의 크로마토그래피 정제-프로인슐린 용액의 농축-농축된 프로인슐린 용액의 크로마토그래피 정제-프로인슐린의 효소적 분해에 의한 사람 인슐린의 수득-생성된 사람 인슐린의 크로마토그래피 정제.

이러한 방법의 단점은 다수의 공정 단계와 정제 단계에서의 손실에 있으며, 이는 인슐린의 수율을 저하시킨다. 다단계 공정 경로로 인하여 상당한 손실을 감수해야만 한다. 시아노겐 할라이드 분해, 프로인슐린의 아황산염분해 및 정제에 의한 분리된 융합 단백질의 단계로부터 40% 이하의 프로인슐린의 손실이 예상된다[참조: EP 0 055 945]. 유사하게, 후속의 정제 단계로부터 최종 생성물까지의 과정에서도 고도의 손실이 발생할 수 있다.

재조합 DNA 방법에 의한 사람 인슐린 또는 인슐린 유도체의 제조에 있어서, 필요한 공정 단계의 수를 현저히 줄일 수 있다면 수율을 증가시킬 수 있을 것이다.

EP 0 600 372 A1(또는 US 5,473,049) 및 EP 0 668 292 A2는 인슐린 또는 인슐린 유도체를 수득하는 적절히 개선된 방법을 기술하고 있으며, 이 방법은 시스틴 브릿지가 정확하게 결합된 형태로 존재하지 않는 인슐린 전구체 또는 인슐린 유도체의 전구체를 머캅탄(예: 시스테인) 및 하나 이상의 카오트로픽 보조제(예: 우레아 또는 구아니딘 하이드로클로라이드)의 존재하에 반응시켜 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 인슐린 전구체 또는 인슐린 유도체의 전구체를 수득하는 것이다. 공지된 방법에 있어서, 이들 단백질은 먼저 카오트로픽 보조제 또는 각종 카오트로픽 보조제의 혼합물의 수용액에 매우 낮은 농도로 용해된다. 이어서, 단백질 혼합물을 머캅탄 수용액과 혼합한다.

놀랍게도, 본 발명에 이르러, 1단계에서 전구체를 카오트로픽 보조제에 의해 용액으로 만들지 않고 먼저 머캅탄, 즉 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드를 전구체의 수성 현탁액에 도입하고, 후속 단계에서 카오트로픽 보조제의 수용액에 도입하여 전구체를 단지 용해시키며, 최종적으로 혼합물을 적절한 양의 물에 도입하여 혼합물을 바람직한 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드 농도로 희석시켜 전구체를 정확하게 폴딩시킴으로써, 인슐린 또는 인슐린 유도체의 정확하게 폴딩된 전구체의 수율이 증가될 수 있고 폴딩 공정의 반응 시간이 감소될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

따라서, 본 발명은 (a) 인슐린 또는 인슐린 유도체의 전구체의 수성 현탁액을, 당해 전구체의 시스테인 잔기당 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드 1 내지 15 SH 잔기가 되도록 하는 양의 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드와 혼합하는 단계,

(b) 전구체의 시스테인- 또는 시스테인 하이드로클로라이드-함유 현탁액을 카오트로픽 보조제의 4 내지 9M 용액에 약 8 내지 약 11.5의 pH 및 약 15 내지 약 55℃의 온도에서 도입시키고, 수득된 혼합물을 상기 온도에서 약 10 내지 60분 동안 유지시키는 단계 및

(c) 단계(b)의 혼합물을 혼합물중의 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드의 희석 농도가 약 1 내지 5mM이고 카오트로픽 보조제의 희석 농도가 0.2 내지 1.0M이 되도록 하는 양의 물중에 약 8 내지 약 11.5의 pH 및 약 5 내지 약 30℃의 온도에서 도입시키는 단계를 연속적으로 수행함을 포함하여, 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드 및 카오트로픽 보조제의 존재하에 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 인슐린 또는 인슐린 유도체의 전구체를 수득하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 발명의 방법은 단계 (a)에서 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드의 양이 전구체의 시스테인 잔기당 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드 1 내지 6 SH 잔기를 생성하는 양에 상응하고,

단계 (b)에서 전구체의 시스테인- 또는 시스테인 하이드로클로라이드-함유 현탁액이 카오트로픽 보조제의 4 내지 9M 용액에 8 내지 11의 pH 및 30 내지 45℃의 온도에서 도입되고, 수득된 혼합물이 상기 온도에서 20 내지 40분 동안 유지되며,

단계 (c)에서 혼합물이 8 내지 11의 pH 및 15 내지 20℃의 온도에서 혼합물중 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드의 희석 농도가 약 1 내지 5mM이고 카오트로픽 보조제의 희석 농도가 0.2 내지 1.0M이 되도록 하는 양의 물에 도입되는 것이다.

카오트로픽 보조제는 수용액에서 수소 결합을 절단하는 화합물, 예를 들어 황산암모늄, 구아니딘 하이드로클로라이드, 에틸렌 카보네이트, 티오시아네이트, 디메틸 설폭사이드 및 우레아이다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 사용된 카오트로픽 보조제는 구아니딘, 구아니딘 하이드로클로라이드가 바람직하고, 특히 우레아가 바람직하다.

본 발명에 따른 방법의 단계(b)에서 카오트로픽 보조제의 농도는 7.0 내지 9M이 바람직하고, 단계 (b)에서의 온도는 40℃가 바람직하며, 단계 (b)에서의 pH는 10 내지 11이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 단계 (c)에서의 pH는 10 내지 11이 바람직하다. 본 발명에 따른 방법의 단계 (c)에 있어서, 혼합물이 도입되는 물의 양은 혼합물중 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드의 희석 농도가 2.5 내지 3mM이 되고 카오트로픽 보조제의 희석 농도가 0.5M이 되도록 선택하는 것이 바람직하다.

특히 바람직하게는 본 발명에 따른 방법은 단계 (b)에서 카오트로픽 보조제의 농도가 약 8M이고, 단계 (b)에서 온도가 약 40℃이며, 단계 (b)에서 pH가 약 10.6이고, 단계 (c)에서 pH가 약 10.6이며, 단계 (c)에서 물의 양이 혼합물중 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드의 희석 농도를 약 2.5 내지 3mM 및 카오트로픽 보조제의 희석 농도를 0.5M로 되도록 하는 것이다.

본 발명에 따른 방법의 결과는 시스틴 브릿지가 정확하게 결합되어 있는, 인슐린 또는 인슐린 유도체의 전구체, 특히 프로인슐린이다.

인슐린 유도체는 천연 인슐린, 즉 사람 인슐린[참조: 서열 번호 1=사람 인슐린의 A쇄; 서열 번호 2=사람 인슐린의 B 쇄, 서열 목록] 또는 동물 인슐린의 유도체로서, 하나 이상의 천연 아미노산 잔기의 치환 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기 및/또는 상응하는 기타 동등한 천연 인슐린의 유기 잔기의 부가에 의해 달라진다.

본 발명에 따른 방법에 의해 수득된, 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 인슐린 또는 인슐린 유도체의 전구체로부터, EP 0 600 372 A1(또는 US 5,473,049) 또는 EP 0 668 292 A2에 기술된 방법에 따라 트립신 또는 트립신-유사 효소 및 적합한 경우 추가로 카복시펩티다제 B에 의한 효소적 분해 및 후속의 흡착 수지상에서의 정제에 의해, 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 인슐린 또는 인슐린 유도체를 제조할 수 있다.

전구체로부터 제조될 수 있는 인슐린 또는 인슐린 유도체는 바람직하게는 하기 화학식 1로 기재될 수 있다:

상기식에서,

Y는 유전학적으로 암호화 가능한 아미노산 잔기이고,

Z는 a) His, Arg 및 Lys로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 잔기,

b) 펩타이드의 카복실 말단에 아미노산 잔기 Arg 또는 Lys를 포함하는, 2 또는 3개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드,

c) 1 내지 5개의 히스티딘 잔기를 포함하는, 유전학적으로 암호화 가능한 2 내지 35개의 아미노산을 갖는 펩타이드 또는

d) OH이며,

R1은 페닐알라닌 잔기(Phe) 또는 공유 결합이고,

R3은 유전학적으로 암호화 가능한 아미노산 잔기이며,

화학식 1의 간략화를 위해 도시하지 않은, 사람 인슐린 A 쇄의 아미노산 서열의 라디칼 A2 내지 A20은 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체에 상응하며, 화학식 1의 간략화를 위해 도시하지 않은 사람 인슐린 B 쇄의 아미노산 서열의 라디칼 B2 내지 B29는 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체에 상응한다.

펩타이드 및 단백질의 아미노산 서열은 아미노산 쇄의 N-말단으로부터 전방으로 나타낸다. 화학식 1에서 괄호안의 상세한 것(예: A6, A20, B1, B7 또는 B19)은 인슐린 A 또는 B 쇄에서 아미노산 잔기의 위치에 상응한다.

용어 "유전학적으로 암호화 가능한 아미노산 잔기"는 아미노산 Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro 및 셀레노시스테인을 나타낸다.

용어 동물 인슐린의 "잔기 A2 내지 A20" 및 "잔기 B2 내지 B29"는 예를 들어 소, 돼지 또는 닭으로부터의 인슐린의 아미노산 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 용어 인슐린 유도체의 "잔기 A2 내지 A20" 및 "B2 내지 B29"는 아미노산을 다른 유전학적으로 암호화 가능한 아미노산으로 치환시켜 형성된 사람 인슐린의 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다.

사람 인슐린의 A 쇄는 하기 서열(서열 번호 1)을 갖는다:

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn.

사람 인슐린의 B 쇄는 하기 서열(서열 번호 2)를 갖는다:

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr.

이 경우, 화학식 1에서 R3은 아스파라긴(Asn)이고, R1은 페닐알라닌(Phe)이며, Y는 트레오닌(Thr)이고, Z는 OH이다.

따라서, 본 발명에 따른 방법은 이의 시스틴 브릿지(화학식 2에서 도시하지 않음)가 정확하게 폴딩된 화학식 2의 인슐린 또는 인슐린 유도체의 전구체를 수득하는데 특히 적합하다:

R²-R¹-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R³

상기식에서,

R²는 a) 수소 원자,

b) 리신(Lys) 및 아르기닌(Arg)으로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 잔기 또는

c) 펩타이드의 카복실 말단에 아미노산 잔기 리신(Lys) 또는 아르기닌(Arg)를 포함하는, 2 내지 45개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이고,

R¹은 페닐알라닌 잔기(Phe) 또는 공유 결합이며,

(B2-B29)는 하나 이상의 위치가 변화되거나 변화되지 않은, 사람 인슐린, 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 B 쇄의 위치 B2 내지 B29의 아미노산 잔기이고,

Y는 유전학적으로 암호화 가능한 아미노산 잔기이며,

X는 a) 리신(Lys) 및 아르기닌(Arg)로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 잔기,

b) 펩타이드의 N-말단 및 카복실 말단에 아미노산 잔기 리신(Lys) 또는 아르기닌(Arg)을 포함하는, 2 내지 35개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드, 또는

c) 1 내지 5개의 히스티딘 잔기를 포함하는, 유전학적으로 암호화 가능한 2 내지 35개의 아미노산을 갖는 펩타이드이고,

(A2-A20)은 하나 이상의 위치가 변화되거나 변화되지 않은, 사람 인슐린, 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 A 쇄의 위치 A2 내지 A20의 아미노산 잔기이며,

R³은 유전학적으로 암호화 가능한 아미노산 잔기이다.

1, 바람직하게는 화학식 2에서,

R²는 a) 수소 원자 또는

b) 펩타이드의 카복실 말단에 아미노산 잔기 아르기닌(Arg)를 포함하는, 2 내지 25개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이고,

R¹은 페닐알라닌 잔기(Phe)이며,

(B2-B29)는 사람 인슐린 B 쇄의 위치 B2 내지 B29의 아미노산 잔기이고,

Y는 알라닌(Ala), 트레오닌(Thr) 및 세린(Ser)으로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 잔기이며,

X는 아미노산 잔기 아르기닌(Arg), 또는 사람 인슐린 C 쇄의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드이고,

(A2-A20)은 사람 인슐린 A 쇄의 위치 A2 내지 A20의 아미노산 잔기이며,

R³은 아스파라긴(Asn), 세린(Ser) 및 글리신(Gly)으로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 잔기이다.

사람 인슐린의 C 쇄는 하기 서열(서열 번호 3)을 갖는다:

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg.

2. 바람직하게는, 화학식 2에서,

R²는 a) 수소 원자 또는

b) 이의 카복실 말단에서 아르기닌 잔기(Arg)가 발견되는 2 내지 15개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이고,

R¹은 페닐알라닌 잔기(Phe)이며,

Y는 트레오닌 잔기(Thr)이며,

X는 아미노산 잔기 아르기닌(Arg) 또는 펩타이드의 처음 및 말단에 2개의 염기성 아미노산 잔기, 특히 아르기닌(Arg) 및/또는 리신(Lys)이 있는 2 내지 35개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이고,

R³은 아미노산 잔기 아스파라긴(Asn) 또는 글리신(Gly)이다.

화학식 1의 인슐린 또는 인슐린 유도체의 잔기 Z는 원칙적으로 화학식 2의 전구체의 X의 아미노산 서열 부분이고, 트립신, 트립신-유사 효소 또는 카복시펩티다제 B와 같은 프로테아제의 활성에 기인하여 생성된다. 라디칼 R3은 인슐린 A 쇄의 위치 A21에 존재하는 아미노산 잔기이다. 라디칼 Y는 인슐린 B 쇄의 위치 B30에 존재하는 아미노산 잔기이다.

트립신 또는 트립신-유사 효소는 아르기닌 또는 리신 잔기에서 아미노산 쇄를 분해하는 프로테아제이다. 카복시펩티다제 B는 아미노산 쇄의 카복시-말단에 존재하는 Arg 또는 Lys와 같은 염기성 아미노산 잔기를 제거하는 엑소프로테아제이다[참조: Kemmler et al., J. Biol. Chem. 246, pages 6786-6791].

1하에 언급된 전구체로부터, 예를 들어 Y, R¹, R², R³, A2 내지 A20 및 B2 내지 B29가 1하에 언급된 의미를 갖고 Z가 아르기닌 잔기(Arg), 펩타이드 잔기 Arg-Arg 또는 -OH인, 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 화학식 1의 인슐린 또는 인슐린 유도체를 수득할 수 있다.

2하에 언급된 전구체로부터, 예를 들어 Y, R¹, R², R³, A2 내지 A20 및 B2 내지 B29가 2하에 언급된 의미를 갖고 Z가 아르기닌 잔기(Arg), 펩타이드 잔기 Arg-Arg 또는 Lys-Lys 또는 -OH인, 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 화학식 1의 인슐린 또는 인슐린 유도체를 수득할 수 있다.

화학식 2의 전구체는 다수의 유전자 작제물에 의해 미생물에서 형성될 수 있다[참조: EP 0 489 780, EP 0 347 781, EP 0 453 969]. 유전자 작제물은 발효중에 에스케리키아 콜라이 또는 스트렙토마이세테스와 같은 미생물에서 발현된다. 형성된 단백질은 미생물 내부에 축적[참조: EP 0 489 780]되거나 발효 용액내로 분비된다.

본 발명에 따른 방법을 위해, 세포 파열 직후에 발효 용액 및 미생물로부터 기원하는 다수의 단백질로 오염되어져 있는 화학식 2의 인슐린 또는 인슐린 유도체의 전구체를 사용할 수 있다. 그러나, 화학식 2의 전구체는 예를 들어 침전 또는 크로마토그래피 정제후에 정제된 형태로 사용될 수 있다.

실시예

실시예 1(비교 실시예, 선행 기술)

유전학적으로 변형된 에스케리키아 콜라이 세포의 발효에 의해[참조: EP 0 489 780], 하기 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 제조한다.

프로인슐린 서열 1(서열 번호 4):

Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Try Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

프로인슐린 서열 1은 화학식 2에 상응하고, 이 화학식에서

X는 사람 인슐린으로부터의 C-펩타이드(서열 번호 3)이고,

Y는 Thr(B30)이며,

R1은 Phe(B1)이고,

R2는 10개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이며,

R3은 Asn(A21)이고,

A2 내지 A20은 사람 인슐린 A 쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고, B2 내지 B29는 사람 인슐린 B 쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다.

프로인슐린 서열 1을 갖는 발현된 융합 단백질은 에스케리키아 콜라이 세포에서 수집하고, 봉입체를 형성시킨다. 완전히 발효시킨 후, 세포를 원심분리에 의해 분리하고, 통상의 고압 균질화에 의해 분쇄한다. 방출된 융합 단백질 봉입체는 원심분리에 의해 분리한다.

프로인슐린 서열 1을 갖는 분리된 융합 단백질 봉입체 20kg(동결 건조후 무수 중량을 기준으로; 인슐린-함유 융합 단백질의 비율은 HPLC에 의해 측정하는데, 이는 50%이다)을 pH 10.6의 8M 우레아 용액 550L에 용해시킨다. 적합한 경우, 혼탁을 유발하는 소량의 물질을 원심분리한 후, 투명한 용액을 10.6의 pH 및 4℃의 온도에서 시스테인 수용액 9000L(시스테인 하이드로클로라이드 수화물 5kg)에서 교반한다.

약 24시간 후 폴딩 반응을 완결시킨 후, 반응 배치중의 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 프로인슐린 서열 1의 함량을 분석학적 HPLC에 의해 측정한 결과 30%의 전환에 상응하는 3.0kg이었다.

용액 9500L를 1N HCl을 사용하여 pH 5.0으로 조절하고, 분리한다. 이어서, 1N 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH 9로 고정시킨다. 트립신 3g을 용액에 도입한다. 2 카복시-말단 아르기닌 잔기를 갖는 인슐린 1.25kg을 HPLC 측정에 따라 수득한다. 카복시펩티다제 B를 사용하여 분해시킨 후 사람 인슐린을 수득하고, 크로마토그래피 방법에 의해 추가로 정제한다. 사람 인슐린은 화학식 1에 상응하고, 화학식 1에서

Y는 Thr(B30)이고,

Z는 OH이며,

R¹은 Phe(B1)이고,

R³은 Asn(A21)이며,

사람 인슐린 2는 서열 번호 1 및 2로 이루어져 있으며, 정확하게 결합된 시스틴 브릿지에 의해 서로 연결되어 있다.

EP 0 668 292에 기술된 바와 같이, 용액을 농축하고, 흡착 수지에 의해 정제한다. 인슐린 2를 함유하는 용출물은 즉시 물로 희석하여 pH를 조절한 후 크로마토그래피 컬럼상에서 추가로 정제할 수 있다.

HPLC 분석

단백질 0.5g을 6M 구아니딘 하이드로클로라이드, 50mM 트리스(pH 8.5), 5mM 에틸렌디아민 테트라아세테이트(EDTA), 1% 2-머캅토에탄올, 10mM 디티오트레이톨의 용액 40ml에 2분 동안 95℃에서 용해시키고, 이어서 20분 동안 14000g에서 원심분리한다. 투명한 상등액 0.02ml를 고압 액체 크로마토그래피 컬럼에 적용한다.

컬럼 : RNucleogel RP 300-5/46(Macherey & Nagel, Aachen, Germany)

구배 : 완충액 A : 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)

완충액 B : 아세토니트릴중의 0.09% TFA

온도 : 55℃

전체 작동 시간 : 40분

구배는 상응하는 작동 시간이 경과한 후 하기 양의 완충액 B에 의해 구별한다:

10분 25%, 12분 60%, 13분 90%, 15분 100%.

유속 : 1ml/분

검출 : 215nm

인슐린의 체류 시간 : 약 19분

실시예 2(본 발명에 따른 방법)

유전학적으로 변형된 에스케리키아 콜라이 세포의 발효[참조: EP 0 489 780]에 의해, 실시예 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 제조한다(프로인슐린 서열 1, 서열 번호 4).

프로인슐린 서열 1을 갖는 발현된 융합 단백질을 에스케리키아 콜라이 세포에서 수집하고, 봉입체를 형성시킨다. 완전히 발효시킨 후, 세포를 원심분리에 의해 분리하고 통상의 고압 균질화에 의해 분쇄한다. 방출된 융합 단백질 봉입체를 원심분리에 의해 분리한다.

시스테인 하이드로클로라이드 수화물 5kg을 융합 단백질 40kg(분액을 동결 건조시켜 측정함)을 함유하는 수성 융합 단백질 현탁액에 가한다.

프로인슐린 서열 1을 갖는 현탁액(인슐린-함유 융합 단백질의 비율은 HPLC에 의해 측정하는데, 이는 50%이다)을 pH 10.2의 8M 우레아 용액 550L에 40℃에서 용해시킨다. 투명한 용액을 물 9000L로 10.6의 pH 및 15℃의 온도에서 교반한다. 약 5시간 경과하여 폴딩 반응을 완결시킨 후, 반응 배치중에 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 프로인슐린 서열 1의 함량을 분석학적 HPLC에 의해 측정한 결과 50%의 전환에 상응하는 10.0kg이었다.

용액 9500L를 1N HCl을 사용하여 pH 5.0으로 조절하고, 분리한다. 이어서, 1N 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH를 9로 고정시킨다. 트립신 10g을 용액에 도입한다. 2개의 카복시-말단 아르기닌 잔기를 갖는 인슐린 4kg이 생성된다. 카복시펩티다제 B를 사용하여 분해시킨 후, 사람 인슐린(정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 서열 번호 1 및 2)이 생성된다.

용액을 농축하고, 흡착 수지에 의해 정제한다.

사람 인슐린을 함유하는 용출물은 즉시 물로 희석하여 pH를 조절한 후 크로마토그래피 컬럼상에서 추가로 정제할 수 있다.

실시예 3(비교 실시예, 선행 기술)

유전학적으로 변형된 에스케리키아 콜라이 세포의 발효[참조: EP 0 489 780]에 의해, 하기 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 제조한다.

프로인슐린 서열 2(서열 번호 5):

Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

프로인슐린 서열 2는 화학식 2에 상응하고, 이 화학식에서

X는 사람 인슐린의 C-펩타이드(서열 번호 3)이고,

Y는 Thr(B30)이며,

R¹은 Phe(B1)이고,

R²는 10개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이며,

R³은 Gly(A21)이고,

A2 내지 A20은 사람 인슐린 A 쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이며, B2 내지 B29는 사람 인슐린 B 쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다.

프로인슐린 서열 2를 갖는 발현된 융합 단백질을 에스케리키아 콜라이 세포에서 수집하고, 봉입체를 형성시킨다. 완전히 발효시킨 후, 세포를 원심분리에 의해 분리하고, 통상의 고압 균질화에 의해 분쇄한다. 방출된 융합 단백질 봉입체를 원심분리에 의해 분리한다.

프로인슐린 서열 2를 갖는 분리된 융합 단백질 봉입체 20kg(동결 건조후 무수 중량을 기준으로; 인슐린-함유 융합 단백질의 비율은 HPLC에 의해 측정하는데, 이는 50%이다)을 pH 10.6의 8M 우레아 용액 550L에 20℃에서 용해시킨다. 투명한 용액을 10.6의 pH 및 4℃의 온도에서 시스테인 수용액 9000L(시스테인 하이드로클로라이드 수화물 5kg)에서 교반한다.

약 24시간 후 폴딩 반응을 완결시킨 후, 반응 배치내에서 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 프로인슐린 서열 2의 함량을 분석학적 HPLC에 의해 측정한 결과 30%의 전환에 상응하는 3.0kg이었다.

용액 9500L를 1N HCl을 사용하여 pH 5.0으로 조절하고, 분리한다. 이어서, 1N 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH를 9로 고정시킨다. 트립신 3g을 용액에 도입한다. 2개의 카복시-말단 아르기닌 잔기를 갖는 인슐린 유도체 0.98kg을 HPLC 측정에 따라 수득한다. 인슐린 유도체는 화학식 1에 상응하고, 화학식 1에서

Y는 Thr(B30)이고,

Z는 Arg-Arg이며,

R¹은 Phe(B1)이고,

R³은 Gly(A21)이며,

A2 내지 A20은 사람 인슐린 A 쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고, B2 내지 B29는 사람 인슐린 B 쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이며,

서열 번호 6 및 7로 이루어져 있으며, 정확하게 결합된 시스틴 브릿지에 의해 서로 연결되어 있다.

용액을 농축하고, 흡착 수지에 의해 정제한다.

인슐린 유도체를 함유하는 용출물은 즉시 물로 희석하여 pH를 조절한 후 크로마토그래피 컬럼상에서 추가로 정제할 수 있다.

실시예 4(본 발명에 따른 방법)

유전학적으로 변형된 에스케리키아 콜라이 세포의 발효[참조: EP 0 489 780]에 의해, 실시예 3에 따라 프로인슐린 서열 2(서열 번호 5)를 갖는 융합 단백질을 제조한다.

프로인슐린 서열 2를 갖는 현탁액(인슐린-함유 융합 단백질의 비율은 HPLC에 의해 측정하는데, 이는 50%이다)을 pH 10.2의 8M 우레아 용액 550L에 40℃에서 용해시킨다. 투명한 용액을 물 9000L로 10.6의 pH 및 15℃의 온도에서 교반한다. 약 5시간 경과하여 폴딩 반응을 완결시킨 후, 반응 배치에서 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 프로인슐린 서열 1의 함량을 분석학적 HPLC에 의해 측정한 결과 50%의 전환에 상응하는 10.0kg이었다.

용액 9500L를 1N HCl을 사용하여 pH 5.0으로 조절하고, 분리한다. 이어서, 1N 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH를 9로 고정시킨다. 트립신 10g을 용액에 도입한다. 인슐린 유도체 2.8kg이 생성되는데(HPLC 측정), 이는 정확하게 결합된 시스틴 브릿지에 의해 서로 연결된 서열 번호 6 및 7로 이루어져 있다.

용액을 흡착 수지에 의해 농축하고, 정제한다.

본 발명의 방법에 의해 인슐린 또는 인슐린 유도체의 정확하게 폴딩된 전구체의 수율을 증가시키고 폴딩 공정에 대한 반응 시간을 감소시킬 수 있다.

<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH <120> Process for obtaining an insulin or an insulin derivative thereof having correctly bonded cystine bridges <130> 5-1998-084662-6 <150> DE 19735711.3 <151> 1997-08-18 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION:1..21 <400> 1 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION:1..30 <400> 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 3 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION:1..35 <400> 3 Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu 20 25 30 Gln Lys Arg 35 <210> 4 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION:1..96 <400> 4 Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu 1 5 10 15 Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg 20 25 30 Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln 35 40 45 Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln 50 55 60 Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln 65 70 75 80 Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 90 95 <210> 5 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION:1..96 <400> 5 Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu 1 5 10 15 Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg 20 25 30 Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln 35 40 45 Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln 50 55 60 Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln 65 70 75 80 Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 85 90 95 <210> 6 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION:1..32 <400> 6 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Single; linear; NAME/KEY: Protein; LOCATION:1..21 <400> 7 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Gly 20

Claims

(a) 인슐린 또는 인슐린 유도체의 전구체의 수성 현탁액을, 당해 전구체 1kg당 시스테인 하이드로클로라이드 0.096 내지 1.44kg 또는 당해 전구체 1kg당 시스테인 0.066 내지 0.99kg이 되도록 하는 양의 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드와 혼합하는 단계,

(b) 전구체의 시스테인- 또는 시스테인 하이드로클로라이드-함유 현탁액을 카오트로픽 보조제의 4 내지 9M 용액에 약 8 내지 약 11.5의 pH 및 약 15 내지 약 55℃의 온도에서 도입시키고, 수득된 혼합물을 상기 온도에서 약 10 내지 60분 동안 유지시키는 단계,

(c) 단계(b)의 혼합물을, 혼합물중의 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드의 희석 농도가 약 1 내지 5mM이고 카오트로픽 보조제의 희석 농도가 0.2 내지 1.0M이 되도록 하는 양의 물중에 약 8 내지 약 11.5의 pH 및 약 5 내지 약 30℃의 온도에서 도입시키는 단계,

(d) 이러한 과정으로 수득된 인슐린 또는 인슐린 유도체의 전구체를 트립신 또는 트립신-유사 효소를 사용하여 분해시키는 단계 및

(e) 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 인슐린 또는 인슐린 유도체를 정제하는 단계를 포함하고, 단계 (a)의 인슐린 또는 인슐린 유도체의 전구체를 미생물에서 융합 단백질을 발현시켜 수득하는, 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드 및 카오트로픽 보조제의 존재하에 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 인슐린 또는 인슐린 유도체를 수득하는 방법.
제1항에 있어서, 카오트로픽 보조제가 구아니딘 또는 구아니딘 하이드로클로라이드인 방법.
제1항에 있어서, 카오트로픽 보조제가 우레아인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (b)에서 카오트로픽 보조제의 농도가 약 7.0 내지 9M인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (b)에서 온도가 약 40℃인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (b)에서 pH가 약 10 내지 11인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)에서 pH가 약 10 내지 11인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)에서 물의 양이 혼합물 중 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드의 희석 농도 약 2.5 내지 3mM 및 카오트로픽 보조제의 희석 농도 약 0.5M를 제공하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (a)에서 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드의 양이 전구체 1kg당 시스테인 하이드로클로라이드 0.096 내지 0.576kg 또는 전구체 1kg당 시스테인 0.066 내지 0.48kg이 되도록 하는 양에 상응하고,

단계 (b)에서 전구체의 시스테인- 또는 시스테인 하이드로클로라이드-함유 현탁액을 카오트로픽 보조제의 약 4 내지 약 9M 용액에 약 8 내지 11의 pH 및 약 30 내지 45℃의 온도에서 첨가하고, 수득된 혼합물을 상기 온도에서 약 20 내지 40분 동안 유지시키며,

단계 (c)에서 pH가 약 8 내지 11이고 온도가 약 15 내지 20℃인 방법.
제9항에 있어서, 단계 (b)에서 카오트로픽 보조제의 농도가 약 8M이고, 단계 (b)에서 온도가 약 40℃이며, 단계 (b)에서 pH가 약 10.6이고, 단계 (c)에서 pH가 약 10.6이며, 단계 (c)에서 물의 양이 혼합물중 시스테인 또는 시스테인 하이드로클로라이드의 희석 농도 약 2.5 내지 3mM 및 카오트로픽 보조제의 희석 농도 약 0.5M를 제공하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (d)에서 수득된 인슐린 또는 인슐린 유도체의 전구체를 카복시펩티다제 B 또는 카복시펩티다제-유사 효소를 사용하여 분해시킴을 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 인슐린 또는 인슐린 유도체가 하기 화학식 1을 갖는 방법.

화학식 1

상기식에서,

Y는 유전학적으로 암호화 가능한 아미노산 잔기이고,

Z는 a) His, Arg 및 Lys로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 잔기,

b) 펩타이드의 카복실 말단에 아미노산 잔기 Arg 또는 Lys를 포함하는, 2 또는 3개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드,

c) 1 내지 5개의 히스티딘 잔기를 포함하는, 유전학적으로 암호화 가능한 2 내지 35개의 아미노산을 갖는 펩타이드 또는

d) OH이며,

R¹은 페닐알라닌 잔기(Phe) 또는 공유 결합이고,

R³은 유전학적으로 암호화 가능한 아미노산 잔기이며,

잔기 A2 내지 A20은 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 A 쇄의 아미노산 서열에 상응하고, 잔기 B2 내지 B29는 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 B 쇄의 아미노산 서열에 상응한다.
제1항에 있어서, 단계 (a)에서 인슐린 또는 인슐린 유도체의 전구체가 하기 화학식 2에 따른 서열을 갖는 방법.

화학식 2

R²-R¹-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R³

상기식에서,

R²는 a) 수소 원자,

b) 리신(Lys) 및 아르기닌(Arg)로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 잔기 또는

c) 펩타이드의 카복실 말단에 아미노산 잔기 리신(Lys) 또는 아르기닌(Arg)를 포함하는, 2 내지 45개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이고,

R¹은 페닐알라닌 잔기(Phe) 또는 공유 결합이며,

(B2-B29)는 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 B 쇄의 위치 B2 내지 B29의 아미노산 잔기이고,

Y는 유전학적으로 암호화 가능한 아미노산 잔기이며,

X는 a) 리신(Lys) 및 아르기닌(Arg)로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 잔기,

b) 펩타이드의 N-말단 및 카복실 말단에 아미노산 잔기 리신(Lys) 또는 아르기닌(Arg)을 포함하는, 2 내지 35개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드, 또는

c) 1 내지 5개의 히스티딘 잔기를 포함하는, 유전학적으로 암호화 가능한 2 내지 35개의 아미노산을 갖는 펩타이드이고,

(A2-A20)은 사람 인슐린, 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 A 쇄의 위치 A2 내지 A20의 아미노산 잔기이며,

R³은 유전학적으로 암호화 가능한 아미노산 잔기이다.
제13항에 있어서,

R²가 a) 수소 원자 또는

b) 펩타이드의 카복실 말단에 아미노산 잔기 아르기닌(Arg)를 포함하는, 2 내지 25개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이고,

R¹이 페닐알라닌 잔기(Phe)이며,

(B2-B29)가 사람 인슐린 B 쇄의 위치 B2 내지 B29의 아미노산 잔기이고,

Y가 알라닌(Ala), 트레오닌(Thr) 및 세린(Ser)으로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 잔기이며,

X가 아미노산 잔기 아르기닌(Arg), 또는 사람 인슐린 C 쇄의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드이고,

(A2-A20)이 사람 인슐린 A 쇄의 위치 A2 내지 A20의 아미노산 잔기이며,

R³이 아스파라긴(Asn), 세린(Ser) 및 글리신(Gly)으로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 잔기인 방법.
제14항에 있어서,

R²가 a) 수소 원자 또는

b) 이의 카복실 말단에서 아르기닌 잔기(Arg)가 발견되는 2 내지 15개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이고,

R¹이 페닐알라닌 잔기(Phe)이며,

(B2-B29)가 사람 인슐린 B 쇄의 위치 B2 내지 B29의 아미노산 잔기이고,

Y가 트레오닌 잔기(Thr)이며,

X가 아미노산 잔기 아르기닌(Arg) 또는 펩타이드의 처음 및 말단에 2개의 염기성 아미노산 잔기가 있는, 2 내지 35개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이고,

(A2-A20)이 사람 인슐린 A 쇄의 위치 A2 내지 A20의 아미노산 잔기이며,

R³이 아미노산 잔기 아스파라긴(Asn) 또는 글리신(Gly)인 방법.
제12항에 있어서, 수득된 화학식 1의 인슐린 또는 인슐린 유도체가

Y가 Thr(B30)이고,

Z가 OH이며,

R¹이 Phe(B1)이고,

R³이 Asn(A21)이며,

A2 내지 A20이 사람 인슐린 A 쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고, B2 내지 B29가 사람 인슐린 B 쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)인 사람 인슐린에 상응하는 방법.
제12항에 있어서, 수득된 화학식 1의 인슐린 또는 인슐린 유도체가

Y가 Thr(B30)이고,

Z가 Arg-Arg이며,

R¹이 Phe(B1)이고,

R³이 Gly(A21)이며,

A2 내지 A20이 사람 인슐린 A 쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고, B2 내지 B29가 사람 인슐린 B 쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)인 사람 인슐린에 상응하는 방법.
제1항에 있어서, 융합 단백질이 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 방법.
제1항에 있어서, 미생물이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인 방법.
제1항에 있어서, 융합 단백질이 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 방법.