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KR20050051686A - 사이클로덱스트린-기초한 재료, 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

사이클로덱스트린-기초한 재료, 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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KR20050051686A
KR20050051686A KR1020057006045A KR20057006045A KR20050051686A KR 20050051686 A KR20050051686 A KR 20050051686A KR 1020057006045 A KR1020057006045 A KR 1020057006045A KR 20057006045 A KR20057006045 A KR 20057006045A KR 20050051686 A KR20050051686 A KR 20050051686A
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KR
South Korea
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polymer
inclusion
cyclodextrin
polymer composition
linking molecule
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020057006045A
Other languages
English (en)
Inventor
나탈리에 씨. 벨로큐
마크 이. 데이비스
수지 황 펀
Original Assignee
인설트 테라페틱스, 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인설트 테라페틱스, 인코퍼레이티드 filed Critical 인설트 테라페틱스, 인코퍼레이티드
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Abstract

본 발명은 약물 및 다른 활성제, 예를 들면, 핵산을 운반하기 위한 사이클로덱스트린-변형된 재료에 관한다. 본 발명은 또한, 통제된 조건하에 이런 활성제를 방출하는 사이클로덱스트린-변형된 재료에 관한다. 본 발명은 또한, 약물의 작용 부위로의 전달을 보조하기 위하여 생체인식 분자에 결합된 사이클로덱스트린-변형된 중합체 담체의 조성물에 관한다.

Description

사이클로덱스트린-기초한 재료, 조성물 및 이의 용도{CYCLODEXTRIN-BASED MATERIALS, COMPOSITIONS AND USES RELATED THERETO}
본 발명은 약물 및 다른 활성제, 예를 들면, 핵산을 운반하기 위한 사이클로덱스트린-변형된 재료에 관한다. 본 발명은 또한, 통제된 조건하에 이런 활성제를 방출하는 사이클로덱스트린-변형된 재료에 관한다. 본 발명은 또한, 약물의 작용 부위로의 전달을 보조하기 위하여 생체인식 분자에 결합된 사이클로덱스트린-변형된 중합체 담체의 조성물에 관한다.
“당중합체(glycopolymer)”(Bioconj. Chem., 3:256(1992))라고 하는 펜던트 당 부분을 보유하는 중합체는 생물학적으로 중요한 탄수화물 분자의 다가 디스플레이를 위한 골격으로서 최근에 많은 주목을 받고 있다. 이들 당중합체는 바이러스-숙주 세포 부착과 백혈구-내피 세포 부착의 강력한 저해물질로서 사용되고 있다(FEBS, 272:209(1990); Can. J. Microbiol., 37:233(1991); J. Am. Chem. Soc., 119:3161(1997)). 당중합체는 표적된 약물과 유전자 전달을 위한 운반제(J. Hepatology, 21:806(1994)) 및 세포 부착을 위한 인공 기질(J. Cell Biol., 115:485(1991))로서도 탐구되고 있다. 생체적합성 이식 재료로서 당중합체의 적합성은 상대적으로 탐구되지 않았고 예로써 Microbiol. Chem. Phys., 195:3597(1994)에 기술된 몇몇 예에 한정된다.
생체적합성 이식 재료로서 사용되는 중합체의 경우에, 이들의 특성, 특히, 표면 조성은 매우 중요하다. 생체적합성 구성요소의 벌크 시스템(bulk system) 내부 및 이들의 표면으로의 도입이 시도되고 있다. 예로써 J. Colloid Interface Sci., 149:84(1992)에 기술된 연구에서는 공유 결합된 중성 폴리사카라이드가 존재하는 벌크 또는 표면에 1개의 펜던트 글루코오스 단위를 보유하는 공중합체가 혈소판 부착과 단백질 흡수의 감소를 보인다는 것을 확인하였다.
따라서, 용이하게 제조되는 생체적합성 중합성 재료는 약물 전달 및 다른 생물의학 분야에 유용할 수 있다.
본 발명의 요약
본 발명에서는 내포 게스트(inclusion guest)로서 내포 호스트(inclusion host)와 내포 복합체(inclusion complex)를 형성하는 적어도 2개의 기능기를 보유하는 연결 분자(linking molecule)로 내포 호스트(예, 사이클로덱스트린)를 보유하는 중합체를 가교결합시켜 형성된 재료를 제시한다. 사이클로덱스트린이 내포 호스트인 중합체의 경우에, 전형적인 내포 게스트는 나프톨, 아다만탄, 콜레스테롤, 이들의 유도체이다. 특정 구체예에서, 중합체는 내포 게스트를 보유하고, 내포 호스트, 예를 들면, 사이클로덱스트린을 보유하는 연결 분자는 중합체를 가교결합시키는데 사용된다. 상기한 설명에 따른 재료는 치료제, 예를 들면, 단백질, 핵산, 또는 약품을 전달하는데 사용할 수 있다.
도 1에서는 본 발명의 가교결합된 중합체 매트릭스를 개략적으로 도시한다.
도 2에서는 치료제 부분을 포함하는 본 발명의 매트릭스를 도시한다.
도 3에서는 중합화 시간의 함수로서 CD-PEG3400의 분자량을 도시한다.
도 4에서는 트랜스펙션 실험의 결과를 도시한다.
도 5에서는 앞서 기술된 매트릭스를 통한 세포 이동을 보여준다.
도 6에서는 가교-결합없는 CD-PEG3400 중합체의 동적 진동수 쓸기(dynamic frequency sweep)를 도시한다. 농도는 PBS에서 100 ㎎/㎖, 온도는 37℃, 변종은 0.5%이었다.
도 7에서는 가교-결합없는 CD-PEG3400 중합체의 동적 진동수 쓸기(dynamic frequency sweep)를 도시한다. 농도는 PBS에서 100 ㎎/㎖, 온도는 20℃, 변종은 0.5%이었다.
도 8에서는 36.5 ㎎/㎖ 디-아다만탄-PEG 가교 링커를 포함하는 CD-PEG3400 중합체(100 ㎎/㎖)의 동적 진동수 쓸기(dynamic frequency sweep)를 도시한다. 온도는 37℃, 변종은 0.5%이었다.
도 9에서는 36.5 ㎎/㎖ 디-아다만탄-PEG 가교 링커를 포함하는 CD-PEG3400 중합체(100 ㎎/㎖)의 동적 진동수 쓸기(dynamic frequency sweep)를 도시한다. 온도는 20℃, 변종은 0.5%이었다.
도 10에서는 2.4 ㎎/㎖에서 소 콜라겐 매트릭스의 동적 진동수 쓸기(dynamic frequency sweep)를 도시한다. 온도는 37℃, 변종은 0.5%이었다.
도 11에서는 앞서 기술된 매트릭스를 이용한 시험관내 분석의 결과를 도시한다.
도 12에서는 개별 조성물로 상처를 치료한 결과를 도시한다(12A): 매트릭스 A(좌측 상처 부위)와 매트릭스 B(우측 상처 부위)로 처리된 ICR 생쥐. 동물은 수술이후 4일 시점에 희생시켰다. 자줏빛 잉크는 매트릭스에 사용된 염료(짙은 파란색/검은색)가 아닌 외과용 펜으로부터 마킹이다. 실제 상처 부위는 염료가 거의 존재하지 않는다; 하지만, 남아있는 염료는 상처 드레싱을 적용한 이후에 발생된 상처가 없는 주변 조직으로 매트릭스의 삼출(oozing)과 확산에 기인한다. 도 12B: 매트릭스 A(좌측 상처 부위)와 매트릭스 B(우측 상처 부위)로 처리된 ICR 생쥐. 동물은 수술이후 4일 시점에 희생시켰다. 좌측과 우측 상처 부위는 매트릭스 A와 매트릭스 B가 주사이후 주변 조직으로 확산되지 않음을 보여준다.
도 13에서는 개별 조성물로 상처를 치료한 결과를 도시한다(13A): 매트릭스 A(좌측 상처 부위)와 매트릭스 B(우측 상처 부위)로 처리된 ICR 생쥐. 동물은 수술이후 4일 시점에 희생시켰다. 좌측과 우측 상처 부위에서 자연적인 상처 수축이 관찰될 수 있다. 최초 주사액으로부터 남아있는 소량의 염료가 관찰될 수 있다; 하지만, 상처가 없는 주변 조직에는 염료가 존재하지 않는다. 도 13B: 매트릭스 A(좌측 상처 부위)와 매트릭스 B(우측 상처 부위)로 처리된 ICR 생쥐. 동물은 수술이후 4일 시점에 희생시켰다. 좌측과 우측 상처 부위는 매트릭스 A와 매트릭스 B가 주사이후 주변 조직으로 확산되지 않음을 보여준다.
도 14에서는 처리된 스펀지 내에서 PDGF-B 발현 수준을 도시한다. 각 실험군의 개별 스펀지 샘플에서 QRT-PCR을 실시하였다. 데이터는 분석된 6개의 스펀지의 평균 ± 표준 편차로 표시한다.
도 15에서는 처리군 내에서 GAPDH RNA 수준을 도시한다.
도 16에서는 처리된 스펀지 내에서 바이러스 PDGF-B DNA를 도시한다. 각 실험군의 스펀지 샘플에서 QPCR 분석을 실시하였다. PCR 프라이머는 인간 PDGF-B 서열의 특이적인 발현을 표적하고 쥐 PDGF-B DNA와 교차 반응하지 않는다.
도 17에서는 스펀지 내에서 GAPDH DNA 함량을 도시한다.
도 18에서는 스펀지 처리군 내에서 바이러스 헥손 DNA를 도시한다.
도 19에서는 PVA 스펀지의 형태학적 분석을 제공한다.
I. 개요
사이클로덱스트린은 바구니-유사 형태의 고리 구조를 보유한다. 이런 형태는 사이클로덱스트린이 내부 공동에 다양한 종류의 분자를 포함할 수 있도록 한다(참조: Szejt1i, Cyclodextrins and Their Inclusion Complexes; Akademiai Klado, Budapest, 1982; Bender et al., Cyclodextrins Chemisoy, Springer-Veriag, Berlin, 1978). 사이클로덱스트린은 약물, 농약, 제초제, 살상제를 비롯한 일련의 유기 분자와 내포 복합체를 형성할 수 있다(참조: Tenjarla et al., J Pharm. Sci., 87: 425-429(1998); Zughul et al., Pharm. Technol., 3: 43-53(1998); Albers et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 12: 311-337(1995)).
선형 사이클로덱스트린-기초한 중합체(CDP)는 시험관내(여러 상이한 세포주) 및 생체내 모두에서 저독성인 것으로 밝혀졌다(Gonzalez et al. 1999 Bioconiugate Chem 10:1068-1074; Hwang et al. 2001 Bioconjugate Chem 12(2):280-290). 적어도 부분적으로, 본 발명은 도 1에 도시된 바와 같이 사이클로덱스트린과 내포 복합체를 형성하는 2개이상의 부분을 보유하는 연결 분자로 선형 가닥을 가교 결합시킴으로써 사이클로덱스트린을 보유하거나 포함하는 중합체에 기초한 생체적합성 재료에 관한다. 부가적으로, 이런 개념은 내포 게스트와 내포 복합체를 형성하는 내포 게스트를 보유하는 연결 분자와 결합된 사이클로덱스트린 이외의 내포 호스트를 보유하거나 포함하는 중합체, 또는 내포 게스트와 내포 복합체를 형성하는 내포 게스트를 보유하거나 포함하는 연결 분자와 결합된 내포 게스트를 보유하는 중합체에도 자연적으로 확대될 수 있다. 사이클로덱스트린 및 관련된 사이클로아밀로오스 이외의 내포 호스트의 예는 퍼하이드로트리페닐렌(perhydrotriphenylene)(폴리에틸렌과 내포 복합체를 형성한다), 우레아/티오우레아(지방산 및 관련된 분자와 내포 복합체를 형성한다)(U.S. Patent No. 4,776,984, 5,106,542, 4,170,601), 사이클로판(U.S. Patent No. 4,116, 955) 및 기타(U.S. Patent No. 4,841,081, 4,367,072, 4,898,654) 등이다. 실시예 19에 기술된 바와 같은 본 발명의 특정 구체예에서, 중합체는 내포 호스트와 내포 게스트 모두를 보유하고, 따라서 동일 중합체 사슬에서 호스트와 게스트 사이 및/또는 인접한 중합체 사슬에서 호스트와 게스트 사이에서 내포 복합체를 형성함으로써 자체적으로 가교결합한다. 가교결합이 진행되는 조건은 이들 2가지 유형의 내포 복합체 사이의 균형에 영향을 주게 된다. 가령, 높은 희석도에서 복합화를 실행하면 분자내 복합체의 형성이 선호되는 반면, 높은 농도에서 복합화를 실행하면 일부 경우에 카테네인(catenane)-과 로탁세인(rotaxane)-유형 구조를 비롯한 분자간 복합체의 형성이 선호된다. 이런 특정 구체예에서, 높은 수준의 분자가 상호작용은 재료의 강도(rigidity), 융점((melting point), 견고성을 증가시킨다.
본원에서, 중합체는 중합체 사슬 내에서 내포 호스트를 포함함으로써 내포 호스트, 예를 들면, 사이클로덱스트린 부분을 ‘통합’한다, 예를 들면, 중합체로부터 내포 호스트를 제거하려면 중합체 사슬의 절단이 요구된다. 이런 중합체의 예는 상기한 선형 사이클로덱스트린-기초한 중합체이다. 사이클로덱스트린 부분을 ‘보유’하는 중합체는 내포 호스트가 부착된 중합체 사슬을 보유한다, 예를 들면, 내포 호스트는 별개의 중합체 사슬에 부착된다. 폴리에틸렌이민-CD 중합체는 이런 유형의 중합체의 예이다. 내포 호스트를 ‘포함’하는 중합체는 내포 호스트를 ‘보유하거나’, ‘통합하거나’, 또는 보유하고 통합하거나, 대안으로 중합체 사슬의 일부로서 공유 결합된 내포 호스트를 소유하는 중합체이다. 특정 구체예에서, 내포 호스트를 통합하는 중합체는 선형(즉, 비-가지형) 중합체이다. 특정 구체예에서, 내포 호스트, 예를 들면, 중합체에 통합된 내포 호스트는 전체 중합체에서 또는 중합체에 따라 규칙적으로 배열된다.
생성된 재료의 물리적 특성은 다양한 견고성의 내포 복합체를 형성하는 부분을 선택함으로써 변화시킬 수 있다; 복합체가 견고할수록, 생성된 재료의 견고성과 강도가 증가한다. 유사하게, 2개 이상의 이런 부분을 보유하는 연결 분자를 이용하면, 가교결합의 수준이 증가함으로써 재료의 견고성과 강도가 증가하는데, 연결 분자 : 중합체 부피의 비율을 증가시킬 때에도 동일한 효과가 나타난다. 재료의 물리적 특성은 연결 분자 자체의 유연성을 변경하거나 사이클로덱스트린 중합체 내에서 링커의 유연성을 변경함으로써 변화시킬 수도 있다.
게다가, 생리 조건에서 불안정한 매트릭스에서 결합을 이용함으로써 이런 매트릭스의 생체내 특성을 변화시킬 수 있다. 가령, 중합체 가닥, 가교결합 분자, 또는 둘 모두 생리 조건하에 불안정성 결합, 예를 들면, 에스테르 결합과 펩티드 결합을 포함할 수 있다. 생리 조건하에 배치된 이후, 이들 결합은 서서히 절단되어 점진적으로 분해되고 구조적 일체성을 상실하게 된다. 중합체 가닥에서 이런 결합의 빈도를 변화시키거나, 불안정성 분자와 안정성 분자를 다양한 비율로 혼합하거나, 또는 상이한 견고성을 보이는 서로 다른 불안정성 결합을 선택함으로써 넓은 범위의 특성을 달성할 수 있다. 가령, 펩티드 결합은 에스테르 결합보다 절단에 더욱 강하게 저항하고, 또한 에스테르 결합은 티오에스테르 결합보다 덜 불안정하다.
치료제, 바이러스, 어쥬번트 등과 같은 화합물과 재료는 통상적인 생체적합성 중합체에 대하여 당분야에 공지된 바와 같이 내포 복합체를 형성하거나, 또는 내포 복합체를 형성하지 않으면서 단순한 혼합이나 캡슐화에 의해 중합체로 제조될 수 있다.
재료의 치료 유용성을 증가시키는 화합물, 예를 들면, 신호 펩티드, 세포 이동을 조장하는 다른 부분 또는 어쥬번트는 도 2에 도시된 바와 같이 내포 복합체 게스트를 목적 존재에 공액하고 공액체를 재료에 포함시킴으로써 가교결합된 재료에 통합시킬 수 있다. 공액체는 가교결합 과정 이전에, 동안에 또는 이후에 포함될 수 있다. 치료 화합물 역시 이런 방식으로 통합될 수 있는데, 특히 약물과 내포 게스트/호스트 사이의 부착이 생리 조건하에 불안정한 경우, 예를 들면, 에스테르 결합의 경우에 이런 방식으로 통합된다(참조: U.S. Patent Application Publication No. 20030008818, 20030017972).
Ⅱ. 정의
편의를 위하여, 본 명세서, 실시예, 첨부된 특허청구범위에 이용되는 특정 용어를 아래에 정의한다.
본 명세서에서 ‘어쥬번트’라는 용어는 자체로는 치료제적 가치가 거의 또는 전혀 없으나, 치료제의 효능을 증가시키는 화합물이다. 어쥬번트의 예는 방사능감작제, 트랜스펙션-증진제(예, 클로로퀸 및 이의 유사체), 화학주성제(chemotactic gents), 화학유인물질(chemoattractants), 세포 부착 및/또는 세포 유동성을 수정하는 펩티드, 세포 투과화 제제, 다중약물 저항 억제제 및/또는 유출 펌프 억제제 등을 포함한다.
“생체적합성 중합체” 및 “생체적합성”이라는 용어는 중합체에 관련하여 사용될 때에는 당해 분야에 공지된 것이다. 가령, 생체적합성 중합체는 자체적으로 숙주(예로써, 동물 또는 인간)에 대하여 독성을 띠지 않고, 숙주 내에서 단량체 또는 올리고머 아단위, 또는 다른 부산물을 독성 농도로 발생시키는 비율로 분해되지 않는(중합체가 분해된다면) 중합체를 의미한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 생체분해는 일반적으로 효과적으로 비-독성인 것으로 알려져 있는 중합체의 유기체 내에서 분해, 예를 들면, 단량체 아단위로 분해에 관련된다. 하지만, 이런 분해로부터 생성되는 중간물질 올리고머는 상이한 독성학적 특성을 보유하거나, 또는 생분해는 중합체의 단량체 아단위를 제외한 분자를 생성하는 산화 반응 또는 다른 생화학적 반응에 관련된다. 결과적으로, 특정 구체예에서, 환자에게 이식 또는 주사와 같은 생체내 사용을 위한 생체분해성 중합체의 독성은 1회 이상의 독성 분석이후에 결정한다. 목적 조성물이 생체적합성으로 간주되기 위해 100% 순도를 필요로 하지 않다. 이런 이유로, 목적 조성물은 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90% 85%, 80%, 75% 또는 그보다 적은 양의 생체적합성 중합체를 함유한다, 예를 들면, 중합체와 다른 재료 및 본원에 기술된 첨가제를 포함하며 여전히 생체적합성이다.
중합체 또는 다른 재료가 생체적합성인지를 결정하기 위하여, 독성 분석을 수행하는 것이 필요하다. 이런 분석평가는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 이런 분석평가의 한가지 예는 GT3TKB 종양 세포와 같은 살아있는 암종 세포를 이용하여 아래의 방식으로 수행한다: 샘플은 완전한 분해가 관찰될 때까지 1M NaOH, 37℃에서 분해한다. 이후, 용액은 1M HCl로 중화한다. 약 200㎕의 다양한 농도의 분해된 샘플 생성물은 96-웰(well) 조직 배양 평판에 위치시키고 104/웰 밀도로 인간 위암 세포(GT3TKB)로 접종하였다. 분해된 샘플 생성물은 GT3TKB 세포와 함께 48시간 동안 배양하였다. 분석 결과는 조직-배양된 웰에서의 분해된 샘플의 농도에 대한 상대적 성장율(%)로 도시하였다. 또한, 본 발명의 중합체와 제제는 이들이 피하 이식 부분에서 현저한 수준의 염증 또는 자극을 일으키지 않음을 확인하기 위하여 널리 공지된 생체내 검사, 예를 들면, 쥐에 피하 이식으로 평가한다.
“생체분해성”은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 사용하는 동안 분해되는 본원에 기술된 중합체, 조성물, 제제를 포함한다. 생체분해성 중합체는 사용하는 동안 분해된다는 점에서 생분해되지 않는 중합체와는 전형적으로 다르다. 특정 구체예에서, 이런 용도는 생체내 치료와 같은 생체내 용도에 관련되고, 다른 특정 구체예에서 시험관내 용도에 관련된다. 일반적으로, 생체분해성에 기인한 분해는 생체분해성 중합체의 구성 성분 아단위로의 분해, 또는 예로써 생화학적 과정에 의한 중합체의 더 작은 비-중합성 아단위로의 절단에 관련된다. 특정 구체예에서, 2가지 서로 다른 유형의 생분해가 일반적으로 알려져 있다. 가령, 생분해의 한 유형은 중합체 골격(backbone)에서 결합(공유결합 또는 다른 결합)의 절단에 관련된다. 이런 생분해에서 단량체와 올리고머가 전형적으로 생성되며, 더욱 전형적으로, 이런 생분해는 중합체의 하나 이상의 아단위를 연결하는 결합의 절단으로 발생한다. 대조적으로, 다른 유형의 생분해는 측쇄에 내재하거나 측쇄를 중합체 골격에 연결하는 결합(공유결합 또는 다른 결합)의 분해에 관련된다. 가령, 중합체 골격에 측쇄로서 부착된 치료제 또는 다른 화학적 부분은 생분해에 의하여 방출된다. 특정 구체예에서, 한 유형 또는 양 유형의 일반적인 생분해는 중합체가 사용되는 동안 발생한다.
본 명세서에서 “생분해”라는 용어는 양 유형의 일반적인 생분해를 모두 포함한다. 생체분해성 중합체의 분해율은 종종 이런 중합체의 분자량, 결정도, 생체안정성, 가교 결합의 정도; 이식물의 물리적 특성(예, 형태와 크기); 투여 방법과 투여 위치; 분해의 원인이 되는 결합의 화학적 성질을 비롯한 다양한 요인에 부분적으로 의존한다. 가령, 분자량이 커질수록, 결정도가 높아지며 및/또는 생체안정성이 커질수록, 생체분해성 중합체의 생분해가 대체로 지연된다. “생체분해성”은 “생체부식성”으로 정의되는 처리공정 및 재료를 포함한다.
생체분해성 중합체가 치료제 또는 이와 연관된 다른 재료를 함유하는 특정 구체예에서, 이런 중합체의 생분해율은 이런 재료의 방출 비율에 의해 결정된다. 이런 조건에서, 생분해율은 중합체의 화학적 성질과 물리적 특성뿐만 아니라, 중합체에 포함된 재료의 성질에도 의존한다. 목적 조성물의 분해는 분자내 결합의 절단(예, 산화 및/또는 가수 분해)뿐만 아니라, 외부 내포 호스트와의 경쟁적 복합체 형성에 의한 호스트/게스트 복합체의 분열과 같은 분자간 결합의 분열을 수반한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 중합성 제제는 원하는 적용에서 수용가능한 기간동안 생분해된다. 생체내 치료와 같은 특정 구체예에서, 이런 분해는 대체로 25℃-37℃ 온도, pH 6-8의 생리 용액에 노출이후 대략 1일, 3일, 5일, 15일, 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 5년 미만의 기간동안 진행된다. 다른 구체예에서, 상기 중합체는 원하는 적용예에 따라서 약 1시간 내지 몇주의 기간동안에 분해된다.
생체가수분해성 결합(예, 에스테르, 아마이드, 카보네이트, 카바메이트, 또는 이미드)은 생리학적 조건하에서 절단되는(예로써, 에스테르는 절단되어 하이드록시산 및 카르복시산을 형성한다) 결합을 말한다. 생리학적 조건은 소화관(예, 위, 장 등)의 산과 염기성 조건, 종양의 산성 조건, 효소적 절단, 신진대사 및 다른 생물학적 과정을 포함하며, 바람직하게는 포유류와 같은 척추동물에서의 생리학적 조건을 의미한다.
“건강관리 공급자”는 개인, 단체 등에 건강관리 서비스를 공급하는 개인 또는 기관을 말한다. “건강관리 공급자”의 예는 의사, 병원, 연속적 보호 체계형 노인 공동체, 숙련된 간호 시설, 아급성 간호 시설, 진료소, 다중특수 진료소, 자치 이동센터, 가정 건강 기관, HMO'S를 포함한다.
본 명세서에서 “사용설명서”는 키트에 관련된 유관한 재료 또는 방법을 설명하는 문서를 의미한다. 이들 재료는 다음의 임의의 조합을 포함할 수 있다: 배경 정보, 구성요소 리스트와 이들의 입수 정보(구매 정보 등등), 키트를 사용하기 위한 간단한 또는 상세한 프로토콜, 문제-해결, 참고문헌, 기술적 지원 및 임의의 다른 관련 문서. 사용설명서는 서류 형태 또는 컴퓨터 판독가능 기억 장치에 담겨 제공되거나 인터넷 웹사이트로부터 다운로드되는 전자 형태로 키트와 함께 또는 별개의 구성요소로서 공급되거나, 또는 기록된 프레젠테이션으로 공급될 수 있다. 사용설명서는 하나 또는 여러 문서를 포함할 수 있으며, 미래의 업데이트를 포함한다.
본 명세서에서 “키트”는 키트를 구성하는 적어도 2개의 구성요소의 집합( collection)을 의미한다. 상기 구성요소들은 협력하여 일정한 목적을 위한 기능 단위를 구성한다. 개별 구성요소들은 함께 또는 개별적으로 물리적으로 포장된다. 가령, 키트를 사용하기 위한 사용설명서를 포함하는 키트는 다른 개별적인 구성요소와 함께 사용설명서를 물리적으로 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 대신에, 사용설명서는 서류 형태 또는 컴퓨터 판독가능 기억 장치에 담겨 제공되거나 인터넷 웹사이트로부터 다운로드되는 전자 형태로 별개의 구성요소로서 공급되거나, 또는 기록된 프레젠테이션으로 공급될 수 있다.
본 명세서에서 ‘RNAi 구조체’라는 용어는 소형 간섭 RNA(siRNA), 헤어핀 RNA 및 생체내에서 절단되어 siRNA를 형성할 수 있는 다른 RNA 화학종을 포괄하는 일반 용어이다. 본 명세서에서 RNAi 구조체에는 세포에서 dsRNA 또는 헤어핀 RNA를 형성하는 전사체, 및/또는 생체내에서 siRNA를 생산할 수 있는 전사체로 발생시킬 수 있는 발현 벡터(RNAi 발현 구조체) 역시 포함된다.
본 발명의 치료 방법에 관한 목적 화합물의 ‘효과량’은 목적 화합물을 원하는 투약 섭생의 일부분서 투여되었을 때, 특정 질환의 치료 또는 예방를 위하여 임상적으로 허용되는 기준에 따른 이익을 제공하는 제제의 치료량을 의미한다.
본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 ‘환자’또는 ‘개체’는 동물, 바람직하게는 인간을 비롯한 포유동물이다.
“예방적 또는 치료적” 치료는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 하나 이상의 목적 조성물을 숙주에 투여하는 것을 포함한다. 만약 원치 않은 조건의 임상적 발현(예로써, 숙주 동물의 질병 또는 다른 원치 않은 상태)에 앞서 투여되면, 치료는 예방적 치료가 되고(즉, 원치 않는 조건의 발생으로부터 숙주를 보호한다), 반면에 원치 않는 조건의 발현이후에 투여되면, 치료는 치료적 치료가 된다(즉, 존재하는 원치 않은 조건 또는 이의 부작용을 감소시키거나, 개선하거나 안정화시킨다).
“예방”은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 국소 재발(예로써, 통증), 암과 같은 질병, 심장 마비와 같은 증후군 복합체, 또는 임의의 다른 의학적 이상과 관계하여 사용될 때에는 당해 기술분야에 널리 인식되고, 조성물이 투여되지 않은 개체와 비교하여 개체 내에서 의학적 증상의 빈도를 감소시키거나 발병을 지연시킨는 조성물의 투여를 포함한다. 따라서, 암의 예방은 치료받지 않은 대조 개체와 비교하여 예방적 치료를 받은 환자 개체군에서 감지가능한 종양의 성장을 감소시키거나 예로써 통계적 및/또는 의학적으로 유의한 양으로 치료받지 않은 대조 개체군에 대한 치료를 받은 개체군에서 감지가능한 종양 성장의 출현을 지연시키는 것을 포함한다. 가령, 감염의 예방은 치료받지 않은 대조 개체군에 대하여 치료를 받은 개체군에서 감염 진단의 수를 감소시키거나 치료받지 않은 대조 개체군에 대하여 치료를 받은 개체군에서 감염 증후의 발병을 기연시키는 것을 포함한다. 가령, 통증 예방은 치료받지 않은 대조 개체군에 대하여 치료를 받은 개체군의 개체들이 경험하는 통증 감각의 빈도 감소 또는 대안적으로 통증 감각의 지연을 포함한다.
본 명세서에서 “치료제”라는 용어는 유기체(인간 또는 인간이 아닌 동물)에 투여될 때, 국소적 및/또는 전신적 작용에 의하여 원하는 약물학적, 면역학적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 재료의 합성이나 자연 발생 생물학적 활성 화합물 또는 조성물을 포함한다. 따라서, 상기 용어는 이들 화합물; 또는 약물, 백신 및 단백질, 펩티드, 호르몬, 핵산, 유전자 구조체 등과 같은 분자를 포함하는 생물의학제제로서 전통적으로 간주되는 화학물질을 포함한다. 더욱 상세하게는, “치료제”는 어쥬번트; 항생제와 항바이러스제와 같은 항-감염제; 진통제와 진통제 조합; 식욕 감퇴제; 소염제; 항간질제; 국소 및 전신 마취제; 수면제; 진정제; 항정신병 치료제; 신경이완제; 항우울제; 항불안제; 길항제; 뉴런 차단 약물; 항콜린제와 콜린 자극제; 항무스카린제와 무스카린제; 항아드레날린제; 항부정맥제; 항고혈압제; 호르몬제; 영양제; 항관절염제와 항천식제; 항경련제; 항히스타민제; 제토제; 항암제; 항소양제; 해열제; 진경제; 심혈관 제제(칼슘 채널 길항제, β-차단제, β-항진제, 항부정맥제); 항고혈압제; 이뇨제; 혈관확장제; 중추 신경계 자극제; 기침 및 감기 제제; 소염제; 진단제; 호르몬제; 골성장 촉진제와 골 재흡수 저해제; 면역억제제; 근육 이완제; 정신자극제; 진정제; 정신안정제; 단백질, 펩티드, 이들의 단편(자연적으로 발생하거나, 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 생성되는); 핵산 분자(2개 이상의 뉴클레오티드의 중합체 형태, 이중- 및 단일-가닥 분자, 유전자 구조체, 발현 벡터, 상보적 분자 등을 비롯한 리보뉴클레오티드(RNA) 또는 디옥시리보뉴클레오티드(DNA)); 소형 분자(예로써, 독소루비신) 및 예로써 단백질과 효소와 같은 다른 생물학적 활성 거대분자를 포함하는 모든 중요 치료 분야에서 사용되는 화합물 또는 조성물을 포함한다. 치료제는 다른 분야뿐만 아니라 식물을 다루는 농업 및 수의학 분야를 비롯한 의학 분야에 사용되는 생물학적 활성 제제가 될 수 있다. “치료제”라는 용어는 또한 제한없이 약제; 비타민; 미네랄 보충제; 질환 또는 질병의 치료, 예방, 진단, 회복 또는 완화에 사용되는 물질; 신체의 기능 또는 구조에 영향을 미치는 물질; 또는 미리 결정된 생리학적 조건에 투여된 이후에 생물학적으로 더욱 활성화되는 전구-약물을 포함한다.
“치료 지수”라는 용어는 LD50/ED50으로 정의된 약물의 치료 지수를 의미다.
‘아실’은 질소 원자를 아실화시켜 아마이드 또는 카바메이트를 형성하는데 적합하거나, 탄소 원자를 아실화시켜 케톤을 형성하거나, 황 원자를 아실화시켜 티오에스테를 형성하거나, 또는 산소 원자를 아실화시켜 에스테르기를 형성하는데 적합한 작용기, 예를 들면, -C(=O)-에 부착된 탄화수소를 의미한다. 바람직한 아실기는 벤조일, 아세틸, tert-부틸 아세틸, 피발로일, 트리플루오르아세틸을 포함한다. 더욱 바람직한 아실기는 아세틸과 벤조일을 포함한다. 가장 바람직한 아실기는 아세틸이다.
‘아실아미노’는 당해 기술분야에서 공지되어 있으며, 바람직하게는 아래의 화학식으로 대표되는 부분을 의미한다:
여기서, R9와 R'11은 각각 독립적으로 수소 또는 탄화수소 치환체, 예를 들면, 알킬, 헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 탄소환 지방족, 헤테로환 지방족을 나타낸다.
‘아민’ 및 ‘아미노’라는 용어는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 암모늄 염뿐만 아니라 치환되지 않은 아민과 치환된 아민 모두를 의미하는데, 예로써 아래의 화학식으로 대표될 수 있다:
R9, R10, R'10은 각각 독립적으로 수소 또는 탄화수소 치환체를 나타내거나, 또는 R9와 R10이 N 원자와 서로 결합하여 고리 구조에서 4-8개의 원자를 가지는 완전한 헤테로사이클(heterocycle)을 형성한다. 바람직한 구체예에서, R9, R10, R'10 중에서 어느 것도 아실이 아니다. 예를 들면, R9, R10, R'10은 수소, 알킬, 헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 탄소환 지방족, 헤테로환 지방족에서 선택된다. 본 명세서에서, ‘알킬아민’은 앞서 정의된 바와 같이 적어도 하나의 치환되거나 치환되지 않은 알킬이 부착된 아민기를 의미한다. 양으로 하전된 아민기(예, R'10이 존재한다)가 ‘암모늄’기로서 선호된다. 암모늄기 이외의 아미노기에서, 아민은 가급적 염기성이다, 예를 들면, 이의 짝 산은 pKa > 7.00을 보유한다.
‘아민’ 및 ‘아미노’라는 용어는 아미노-치환된 카르보닐로서 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 아래의 화학식으로 대표될 수 있다:
R9와 R10은 앞서 정의된 바와 동일하다. 특정 구체예에서, 아마이드는 이미드를 포함한다.
‘알킬’은 1-18개, 바람직하게는 1-12개, 더욱 바람직하게는 1-6개, 이보다 더욱 바람직하게는 1-4개의 탄소 원자를 보유하는 포화되거나 불포화된 탄화수소를 의미한다. 알킬 사슬은 선형(예, n-부틸) 또는 가지형(예, sec-부틸, 이소부틸, 또는 t-부틸)이다. 바람직한 가지형 알킬은 1-2개의 가지, 바람직하게는 1개의 가지를 보유한다. 바람직한 알킬은 포화된다. 불포화된 알킬은 하나이상의 이중 결합 및/또는 하나이상의 삼중 결합, 바람직한 불포화된 알킬은 1-2개의 이중 결합 또는 1개의 삼중 결합, 더욱 바람직하게는 1개의 이중 결합을 보유한다. 알킬 사슬은 치환되지 않거나 1-4개의 치환체로 치환될 수 있다. 바람직한 알킬은 치환되지 않는다. 치환체는 할로, 할로알킬, 하이드록시, 아릴(예, 페닐, 톨릴, 알콕시페닐, 알킬옥시카르보닐페닐, 할로페닐), 헤테로사이클릴, 헤테로아릴을 포함한다.
본 명세에서‘알케닐’ 및 ‘알키닐’은 길이 및 가능 치환에서 상기한 알킬과 유사하지만 각각 적어도 1개의 이중 결합 또는 삼중 결합을 보유하는 불포화된 지방족 작용기를 의미한다. 달리 명시하지 않는 경우에, 알케닐과 알키닐은 각각 저급 알케닐과 알키닐 기를 의미한다. 한 목록에서 알케닐 및 알키닐과 함께 존재하는 알킬은 알케닐과 알키닐을 배제한 포화된 알킬을 의미한다.
본 명세서에서‘알콕시’ 및 ‘알콕시’는 -O-알킬기를 의미한다. 대표적인 알콕시기는 메톡시, 에톡시, 프로필옥시, tert-부톡시 등을 포함한다. ‘에테르’는 산소에 의해 공유 결합된 2개의 탄화수소이다. 따라서, 탄화수소를 에테르로 변화시키는 탄화수소의 치환체는 알콕시, 또는 다른 부분, 예를 들면, -O-아릴, -O-헤테로아릴, -O-헤테로알킬, O-아르알킬, -O-헤테로아르알킬, -O-탄소환 지방족, -O-헤테로환 지방족일 수 있다.
‘알킬티오’는 -S-알킬기를 의미한다. 대표적인 알킬티오기는 메틸티오, 에틸티오 등을 포함한다. ‘티오에테르’는 2개의 탄화수소 치화체에 결합된 황 원자, 예를 들면, 산소가 황원으로 치환된 에테르를 의미한다. 따라서, 탄소 원자에서 티오에테르 치환체는 탄화수소-치환된 황 원자 치환체, 예를 들면, 알킬티오, 아릴티오 등을 의미한다.
본 명세서에서 ‘아르알킬’은 아릴기로 치환된 알킬기를 의미한다.
‘아릴 고리’는 방향족 탄화수소 고리 체계를 의미한다. 방향족 고리는 단일환 또는 융합된 이중환 고리 체계, 예를 들면, 페닐, 나프틸 등이다. 단일환 방향족 고리는 고리에 대략 5-10개, 바람직하게는 5-7개, 가장 바람직하게는 5-6개의 탄소 원자를 보유한다. 이중환 방향족 고리는 고리에 8-12개, 바람직하게는 9-10개의 탄소 원자를 보유한다. ‘아릴’ 역시 이중환 고리 체계를 포함하는데, 여기서 고리중 하나만 방향족이다, 예를 들면, 다른 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 헤테로사이클릴이다. 방향족 고리는 치환되지 않거나 고리에서 대략 1-5개의 치환체로 치환될 수 있다. 바람직한 방향족 고리 치환체는 아래와 같다: 할로, 시아노, 저급 알킬, 헤테로알킬, 할로알킬, 페닐, 페녹시, 또는 이들의 임의 조합. 더욱 바람직한 치환체는 저급 알킬, 시아노, 할로, 할로알킬을 포함한다.
‘탄소환 지방족 고리’는 포화되거나 불포화된 탄화수소 고리를 의미한다. 탄소환 지방족 고리는 방향족이 아니다. 탄소환 지방족 고리는 단일환, 또는 융합된, 스피로(spiro) 또는 가교된 이중환 고리 체계이다. 단일환 탄소환 지방족 고리는 고리에 대략 4-10개, 바람직하게는 4-7개, 가장 바람직하게는 5-6개의 탄소 원자를 보유한다. 이중환 탄소환 지방족 고리는 고리에 8-12개, 바람직하게는 9-10개의 탄소 원자를 보유한다. 탄소환 지방족 고리는 치환되지 않거나 고리에서 1-4개의 치환체로 치환될 수 있다. 바람직한 탄소환 지방족 고리 치환체는 할로, 시아노, 알킬, 헤테로알킬, 할로알킬, 페닐, 페녹시, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 더욱 바람직한 치환체는 할로와 할로알킬을 포함한다. 바람직한 탄소환 지방족 고리는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸을 포함한다. 더욱 바람직한 탄소환 지방족 고리는 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸을 포함한다.
“카르보닐”은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 아래의 화학식으로 대표될 수 있는 부분을 포함한다:
X는 결합이거나 산소 또는 황을 나타내고, R11은 수소, 탄화수소 치환체, 또는 제약학적으로 수용가능한 염을 나타내고, R11'은 수소 또는 탄화수소 치환체를 나타낸다. X가 산소이고, R11 또는 R11'이 수소가 아니면, 화학식은 ‘에스테르’를 나타낸다. X가 산소이고 R11이 상기 정의된 바와 동일하면, 상기 부분은 카르복실기를 의미하고, 특히 R11이 수소이면, 화학식은 ‘카르복시산’을 나타낸다. X가 산소이고 R11'이 수소이면, 화학식은 ‘포메이트’를 나타낸다. 일반적으로, 상기 화학식의 산소 원자가 황으로 치환되면, 화학식은 ‘티오카르보닐’기를 나타낸다. X가 황이고 R11 또는 R11'이 수소가 아니면, 화학식은 ‘티오에스테르’를 나타낸다. X가 황이고 R11이 수소이면, 화학식은 ‘티오카르복시산’을 나타낸다. X가 황이고 R11'이 수소이면, 화학식은 ‘티오포메이트’를 나타낸다. 반면, X가 결합이고 R11이 수소가 아니며 카르보닐이 탄화수소에 결합하면, 상기 화학식은 ‘케톤’기를 나타낸다. X가 결합이고 R11이 수소이며 카르보닐이 탄화수소에 결합하면, 상기 화학식은 ‘알데하이드’ 또는 ‘포밀’기를 나타낸다.
‘Ci 알킬’은 i 멤버 원자를 보유하는 알킬 사슬이다. C4 알킬은 4개의 탄소 멤버 원자를 보유한다. C4 알킬은 포화되거나 1-2개의 이중 결합(cis 또는 trans) 또는 1개의 삼중 결합으로 불포화된다. 바람직한 C4 알킬은 포화된다. 바람직한 불포화된 C4 알킬은 1개의 이중 결합을 보유한다. C4 알킬은 치환되지 않거나 1-2개의 치환체로 치환될 수 있다. 바람직한 치환체는 저급 알킬, 저급 헤테로알킬, 시아노, 할로, 할로알킬을 포함한다.
‘할로겐’은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 치환체를 의미한다. 바람직한 할로는 불소, 염소 또는 브롬이다; 더욱 바람직하게는 염소와 불소이다.
‘할로알킬’은 하나이상의 할로 치환체로 치환된 선형, 가지형 또는 환형 탄화수소를 의미한다. 바람직한 할로알킬은 C1-C12이다; 더욱 바람직하게는 C1-C6이다; 더욱 바람직하게는 C1-C3이다. 바람직한 할로 치환체는 불소와 염소이다. 가장 바람직한 할로알킬은 트리플루오르메틸이다.
‘헤테로알킬’은 탄소 원자 및 적어도 하나의 헤테로원자의 포화되거나 불포화된 사슬인데, 여기서 2개의 헤테로원자는 인접하지 않는다. 헤테로알킬 사슬은 고리에 1-18개, 바람직하게는 1-12개, 더욱 바람직하게는 1-6개, 이보다 더욱 바람직하게는 1-4개의 원자(탄소와 헤테로원자)를 보유한다. 헤테로알킬 사슬은 선형이나 가지형일 수 있다. 바람직한 가지형 헤테로알킬은 1-2개, 바람직하게는 1개의 가지를 보유한다. 바람직한 헤테로알킬은 포화된다. 불포화된 헤테로알킬은 하나이상의 이중 결합 및/또는 하나이상의 삼중 결합을 보유한다. 바람직한 불포화된 헤테로알킬은 1-2개의 이중 결합 또는 1개의 삼중 결합, 더욱 바람직하게는 1개의 이중 결합을 보유한다. 달리 명시하지 않는 경우에, 헤테로알킬 사슬은 치환되지 않거나 1-4개의 치환체로 치환된다. 바람직한 헤테로알킬 치환체는 할로, 아릴(예, 페닐, 톨릴, 알콕시페닐, 알콜시카르보닐페닐, 할로페닐), 헤테로사이클릴, 헤테로아릴을 포함한다. 가령, 헤테로알킬은 아래의 치환체로 치환된 알킬 사슬이다: 알콕시(예, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 펜톡시), 아릴옥시(예, 페녹시, 클로로페녹시, 톨릴옥시, 메톡시페녹시, 벤질옥시, 알콕시카르보닐페녹시, 아실옥시페녹시), 아실옥시(예, 프로피오닐옥시, 벤조일옥시, 아세톡시), 카바모일옥시, 카르복시, 멀캡토, 알킬티오, 아실티오, 아릴티오(예, 페닐티오, 클로로페닐티오, 알킬페닐티오, 알콕시페닐티오, 벤질티오, 알콕시카르보닐페닐티오), 아미노(예, 아미노, 모노-와 디-C1-C3 알킬아미노, 메틸페닐아미노, 메틸벤질아미노, C1-C3 알킬아미도, 카바마미도, 우레이도, 구아니디노).
‘헤테로원자’는 다가 비-탄소 원자, 예를 들면, 붕소, 인, 실리콘, 질소, 황 또는 산소 원자, 바람직하게는 질소, 황 또는 산소 원자를 의미한다. 하나이상의 헤테로원자를 보유하는 작용기는 서로 다른 헤테로원자를 보유할 수 있다.
‘헤테로아릴 고리’는 고리에서 탄소 및 1-4개의 헤테로원자를 보유하는 방향족 고리 체계를 의미한다. 헤테로방향족 고리는 단일환 또는 융합된 이중환 고리 체계이다. 단일환 헤테로 방향족 고리는 고리에 대략 5-10개, 바람직하게는 5-7개, 가장 바람직하게는 5-6개의 원자(탄소와 헤테로원자)를 보유한다. 이중환 헤테로방향족 고리는 고리에 8-12개, 바람직하게는 9-10개의 원자를 보유한다. ‘헤테로아릴’ 역시 이중환 고리 체계를 포함하는데, 여기서 고리중 하나만 방향족이다, 예를 들면, 다른 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 헤테로사이클릴이다. 헤테로방향족 고리는 치환되지 않거나 고리에서 1-4개의 치환체로 치환될 수 있다. 바람직한 헤테로방향족 고리 치환체는 할로, 시아노, 저급 알킬, 헤테로알킬, 할로알킬, 페닐, 페녹시, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 바람직한 헤테로방향족 고리는 티에닐, 티아졸릴, 옥사졸릴, 피롤릴, 푸리닐, 피리미딜, 피리딜, 푸라닐을 포함한다. 더욱 바람직한 헤테로방향족 고리는 티에닐, 푸라닐, 피리딜을 포함한다.
‘헤테로환 지방족 고리’는 고리에 탄소 및 1-4개의 헤테로원자를 보유하는 비-방향족의 포화되거나 불포화된 고리인데, 여기서 2개의 헤테로원자는 고리에서 인접하지 않고, 바람직하게는 고리에서 헤테로원자에 부착된 탄소에 하이드록실, 아미노 또는 티올기가 부착되지 않는다. 헤테로환 지방족 고리는 단일환, 또는 융합되거나 가교된 이중환 고리 체계이다. 단일환 헤테로환 지방족 고리는 고리에 대략 4-10개, 바람직하게는 4-7개, 가장 바람직하게는 5-6개의 원자를 보유한다. 이중환 헤테로환 지방족 고리는 고리에 8-12개, 바람직하게는 9-10개의 원자를 보유한다. 헤테로환 지방족 고리는 치환되지 않거나 고리에서 1-4개의 치환체로 치환될 수 있다. 바람직한 헤테로환 지방족 고리 치환체는 할로, 시아노, 저급 알킬, 헤테로알킬, 할로알킬, 페닐, 페녹시, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 더욱 바람직한 치환체는 할로와 할로알킬을 포함한다. 헤테로사이클릴기는 예로써 티오펜, 티안트렌, 푸란, 피란, 이소벤조푸란, 크로멘, 잔텐, 페녹사틴, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 이소티아졸, 이속사졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 인돌리진, 이소인돌, 인돌, 인다졸, 퓨린, 퀴놀리진, 이소퀴놀린, 하이단토인, 옥사졸린, 이미다졸린트리온, 트리아졸리논, 퀴놀린, 프탈라진, 나프틸리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 퀴놀린, 프테리딘, 카바졸, 카볼린, 펜안트리딘, 아크리딘, 펜안트롤린, 펜아진, 펜알사진, 페노티아진, 푸라잔, 페녹사진, 피롤리딘, 옥솔란, 티올란, 옥사졸, 피페리딘, 피페라진, 모르폴린, 락톤, 락탐(예, 아제티디논과 피롤리디논), 설탐, 설톤 등을 포함한다. 바람직한 헤테로환 지방족 고리는 피페라질, 모르폴리닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 피페리딜을 포함한다. 헤테로환은 다중환일 수도 있다.
‘하이드록실’은 -OH를 의미한다.
‘저급 알킬’은 1-5개, 바람직하게는 1-4개, 더욱 바람직하게는 1-2개의 탄소 원자로 구성되는 알킬 사슬을 의미한다. 저급 알킬은 포화되거나 불포화된다. 바람직한 저급 알킬은 포화된다. 저급 알킬은 치환되지 않거나 1-2개의 치환체로 치환될 수 있다. 저급 알킬에서 바람직한 치환체는 시아노, 할로, 트리플루오르메틸, 아미노, 하이드록실을 포함한다. 본 명세서에서, 바람직한 알킬기는 저급 알킬이다. 바람직한 구체예에서, 알킬로 표시된 치환체는 저급 알킬이다. 유사하게, ‘저급 알케닐’ 및 ‘저급 알키닐’은 유사한 사슬 길이를 갖는다.
‘저급 헤테로알킬’은 1-4개, 바람직하게는 1-3개, 더욱 바람직하게는 1-2개의 원자로 구성되는 헤테로알킬 사슬이다. 저급 헤테로알킬은 1-2개의 인접하지 않는 헤테로원자를 보유한다. 바람직한 저급 헤테로알킬은 1개의 헤테로원자를 보유한다. 저급 헤테로알킬은 포화되거나 불포화된다. 바람직한 저급 헤테로알킬은 포화된다. 저급 헤테로알킬은 치환되지 않거나 1-2개의 치환체로 치환된다. 저급 헤테로알킬에서 바람직한 치환체는 시아노, 할로, 트리플루오르메틸, 하이드록실을 포함한다.
‘Mi 헤테로알킬’은 i 멤버 원자를 보유하는 헤테로알킬 사슬이다. M4 헤테로알킬은 1-2개의 인접하지 않는 헤테로원자 멤버 원자를 보유한다. 1개의 헤테로원자 멤버 원자를 보유하는 M4 헤테로알킬은 포화되거나 1개의 이중 결합(cis 또는 trans) 또는 1개의 삼중 결합으로 불포화된다. 2개의 헤테로원자 멤버 원자를 보유하는 바람직한 M4 알킬은 포화된다. 바람직한 불포화된 M4 알킬은 1개의 이중 결합을 보유한다. M4 알킬은 치환되지 않거나 1-2개의 치환체로 치환될 수 있다. 바람직한 치환체는 저급 알킬, 저급 헤테로알킬, 시아노, 할로, 할로알킬을 포함한다.
‘이소시아네이트’는 -NCO를 의미한다.
‘멤버 원자’는 사슬 또는 고리 체계에서 사슬 또는 고리의 일부를 구성하는 다가 원자(예, C, O, N 또는 S 원자)를 의미한다. 가령, 크레솔(cresol)에서, 6개의 탄소 원자는 고리의 멤버 원자이고, 메틸 치환기의 산소 원자와 탄소 원자는 고리의 멤버 원자가 아니다.
본 명세서에서 ‘니트로’는 N02를 의미한다;
'제약학적으로 수용가능한 염'은 임의의 산성(예, 하이드록삼산 또는 카르복실산) 기에서 형성된 양이온 염, 또는 임의의 염기성(예, 아미노 또는 구아니디노) 기에서 형성된 음이온 염을 의미한다. 이런 염은 당분야에 공지되어 있다(참조: World Patent Publication 87/05297, Johnston et al., September 11, 1987). 이들 염은 당업자에게 알려진 방법으로 제조된다. 당업자는 향상된 용해도, 안정성, 제조의 용이함, 가격 등에 기초하여 적절한 염을 선택할 수 있다. 이런 염의 결정과 최적화는 당업자의 능력 범위에 속한다. 바람직한 양이온은 알칼리 염(예, 나트륨과 칼륨)과 알칼리성 토류 금속(예, 마그네슘과 칼슘) 및 유기 양이온, 예를 들면, 트리메틸암모늄, 테트라부틸암모늄 등을 포함한다. 바람직한 음이온은 할로겐 화합물(예, 클로라이드), 설포네이트, 카르복실레이트, 포스페이트 등을 포함한다. 이런 염에는 이전에 존재하지 않았던 광학 중심을 제공하는 첨가염이 포함된다. 가령, 키랄성 타르타르산염이 본 발명의 화합물로부터 제조될 수 있다. 상기 정의는 이런 키랄성 염을 포함한다.
‘페닐’은 치환되지 않거나 1-5개 치환체로 치환된 6각형 단일환 방향족 고리이다. 치환체는 페닐 고리에서 오르토, 메타 또는 파라 위치, 또는 이들의 임의 조합에 위치할 수 있다. 바람직한 페닐 치환체는 할로, 시아노, 저급 알킬, 헤테로알킬, 할로알킬, 페닐, 페녹시 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 페닐 고리에서 더욱 바람직한 치환체는 할로와 할로알킬을 포함한다. 가장 바람직한 치환체는 할로이다.
‘폴리사이클릴’ 및 ‘다환 작용기’는 첫 번째 고리에서 2개이상의 멤버 원자가 두 번째 고리에서 멤버 원자인 2개이상의 고리(예, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 헤테로아릴, 아릴 및/또는 헤테로사이클릴)을 의미한다. 인접하지 않은 원자를 통하여 결합된 고리는 ‘가교된 고리’라고 하고, 인접한 원자를 통하여 결합된 고리는 ‘융합된 고리’라고 한다.
‘소형 유기 분자’는 대략 2500 amu 미만, 바람직하게는 1500 amu 미만의 유기 화합물을 의미한다. 상기 용어는 단백질 또는 핵산이 아닌 대부분의 약물을 포괄한다.
‘설피드릴’은 -SH를 의미하고, ‘설포닐’은 -SO2-를 의미한다.
소형 유기 분자에서 ‘치환’ 또는 ‘치환체’는 수소 이외의 부분에 결합된 다가 원자상의 위치, 예를 들면, 사슬 또는 고리의 멤버 원자를 제외한 사슬 또는 고리상의 위치를 의미한다. 이런 부분은 당분야에 공지되어 있는데, 예로써 할로겐, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아지드, 할로알킬, 하이드록실, 카르보닐(예, 카르복실, 알콕시카르보닐, 포밀, 케톤 또는 아세틸), 티오카르보닐(예, 티오에스테르, 티오아세테이트 또는 티오포르메이트), 알콕시, 포스포릴, 포스포네이트, 포스피네이트, 아민, 아마이드, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 설피드릴, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 실릴, 에테르, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 헤테로아르알킬, 아르알킬, 아릴 또는 헤테로아릴을 포함한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 특정 치환체, 예를 들면, 아릴, 헤테로아릴, 폴리사이클릴, 알콕시, 알킬아미노, 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐은 적절한 경우에 자체적으로 치환될 수 있다. 본 발명은 유기 화합물의 허용가능 치환체에 의해 한정되지 않는다. ‘치환’ 또는 ‘치환된’은 이런 치환이 치환된 원자와 치환체의 허용된 결합가에 부합되고, 이런 치환이 안정적인 화합물, 예를 들면, 재정렬, 고리화, 배제, 가수분해 등에 의해 자발적인 변환이 진행되지 않는 화합물을 결과한다는 암묵적 조건을 포함한다.
본 명세서에서 각 표현, 예를 들면, 알킬, m, n 등의 정의는 임의의 구조에서 한번 이상 나타나는 경우에 동일한 구조에서라도 그 정의는 독립적인 것으로 간주된다.
약어 Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts, Ms는 각각 메틸, 에틸, 페닐, 트리플루오르메탄설포닐, 노나플루오르부탄설포닐, p-톨루엔설포닐, 메탄설포닐을 나타낸다. 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 유기 화학자들에 의하여 이용되는 보다 포괄적인 약어 목록은 Journal of Organic Chemistry 각 권의 첫 부분에 나와 있다; 이 목록은 '약어의 표준 목록'이라는 제목의 표에 전형적으로 나와 있다. 상기 목록에 포함된 약어들 및 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 유기 화학자들에 의하여 이용되는 모든 약어들은 참고문헌으로 한다.
오르토, 메타, 파라는 각각 1,2-, 1,3-, 1,4-이중치환된 벤젠을 나타낸다. 가령, 1,2-디메틸벤젠과 오르토-디메틸벤젠은 동의어이다.
트리플릴, 토실, 메실, 노나플릴은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 각각 트리플루오로메탄설포닐, p-톨루엔설포닐, 메탄설포닐, 노나플루오로부탄설포닐기를 의미한다. 트리플레이트, 토실레이트, 메실레이트, 노나플레이트는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 각각 트리플루오로메탄설포네이트 에스테르, p-톨루엔설포네이트 에스테르, 메탄설포네이트 에스테르, 노나플루오로부탄설포네이트 에스테르 작용기 및 이런 상기 작용기를 보유하는 분자를 의미한다.
본 명세서에서 ‘보호기’는 원치않는 화학적 변형으로부터 잠재적으로 반응성 기능기를 보호하는 일시적인 치환체를 의미한다. 이런 보호기의 예는 카르복실산의 에스테르, 알코올의 실릴 에테르, 알데하이드와 케톤의 아세탈과 케탈을 포함한다. 보호기 화학 분야는 재검토되었다(Greene, T.W.; Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis, 2 ded.; Wiley: New York, 1991; Kocienski, P.J. Protecting Groups, Georg Thierne Verlag: New 5 York, 1994).
‘프로드러그’는 생리 조건하에 본 발명의 치료 활성제로 전환되는 화합물을 포괄한다. 프로드러그를 만드는 일반적인 방법은 생리 조건하에 원하는 분자를 노출시키는 선택된 부분, 예를 들면, 에스테르 또는 케탈을 포함시키는 것이다. 다른 구체예에서, 프로드러그는 숙주 동물의 효소 활성에 의해 전환된다.
본 발명에서, 화학적 원소들은 원소 주기율표(CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 67TH Ed.,1986-87)에서 확인된다. 또한, 본 발명에서, ‘탄화수소’는 적어도 하나의 탄소-수소 결합을 보유하는 수용가능한 모든 화합물이나 부분을 포괄한다. 광범위한 측면에서, 수용가능한 탄화수소는 치환되거나 치환되지 않은 비-환형과 환형, 가지형과 비-가지형, 탄소환과 헤테로환, 방향족과 비-방향족 유기 화합물을 포함한다.
상기한 화합물의 예상된 등가물은 상응하는 다른 화합물을 포함하며, 동일한 일반적 특성을 가지는 화합물을 포함하는데, 여기서 화합물의 효능에 부정적인 영향을 주지 않는 하나이상의 단순한 변이가 치환체에 가해진다. 일반적으로, 본 발명의 화합물은 예로써, 쉽게 이용가능한 출발 물질, 반응물질, 전통적인 합성 과정을 이용하여 하기에 설명된 바와 같은 일반적인 반응 설계에 예시된 방법 또는 이런 방법의 변형으로 제조할 수 있다. 이들 반응에서, 여기서 언급하지는 않았지만 이미 알려져 있는 변형 역시 사용할 수 있다.
Ⅲ. 방법과 조성물의 전형적인 적용
본 발명에 따른 치료 조성물은 치료제 및 본 발명의 재료, 예를 들면, 사이클로덱스트린-기초한 재료를 함유한다. 치료제는 당분야에 공지된 것들을 비롯한 합성이나 자연 발생 생물학적 활성 치료제이다. 적절한 치료제의 예는 항생제, 스테로이드, 폴리뉴클레오티드(예, 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드), 플라스미드, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 단편, 소형 분자(예, 독소루비신) 및 다른 생물학적 활성 거대분자, 예를 들면, 단백질과 효소를 포함한다. 특정 구체예에서, 치료제는 전달 시스템과 결합시키고, 예를 들면, 핵산을 바이러스에 포함시키거나 작용제를 리포솜 또는 미소구 내에 운반하고, 전달 시스템을 재료에 분산시킨다.
본 발명의 치료 조성물은 당분야에 공지된 수단으로 제조할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 재료, 예를 들면, 사이클로덱스트린-기초한 재료는 상기한 바와 같이 치료제와 혼합하거나 치료제의 존재하에 제조한다. 본 발명에 따라, 재료는 치료제의 전달 운반제로서 기능한다. 치료제( 및/또는 어쥬번트) 및 재료는 당업자에게 널리 알려진 수단, 예를 들면, 정전 상호작용, 수소 결합, 소수성 상호작용, 내포 호스트와 내포 복합체의 형성, 또는 가급적 에스테르 또는 탄산염과 같은 가역적 부착에 의한 중합체에 공유 결합, 특정 구체예에서, 치료제 및/또는 어쥬번트는 선택적으로 가역적 결합을 통하여, 내포 호스트, 예를 들면, 사이클로덱스트린과 내포 복합체를 형성하는 부분에 공유 결합된다. 결합의 정도는 형광 분석, DNA 이동성 분석, 광 산란, 전자 현미경을 비롯한 당분야에 공지된 기술로 결정할 수 있는데, 치료제에 따라 변한다. 전달 양식으로서, 본 발명의 재료와 DNA를 함유하는 본 발명의 치료 조성물은 트랜스펙션, 다시 말하면, DNA의 동물(예, 인간) 세포로의 흡수를 보조하는데 사용할 수 있다(Boussif, 0. Proceedings of the National Academy of Sciences, 92:7297-7301(1995); Zanta et al. Bioconjugates Chemistry, 8:839-844(1997)).
특정 구체예에서 본 발명의 치료 조성물은 주사에 적합한 형태이고, 다른 구체예에서 본 발명의 조성물은 국소 투여에 적합하다. 본 발명에 따른 치료 조성물의 다른 투여 양식은 치료 조성물의 상태에 따라, 경구 투여, 장관외, 정맥내, 비강내, 안구내, 두개내, 복강내 주사를 포함한다.
사용된 치료제의 유형에 따라, 본 발명의 치료 조성물은 선천적 질환 또는 후천적 질환, 예를 들면, 낭포성 섬유증, 고쉐병, 근육 이영양증, AIDS, 암(예, 다발성 골수종, 백혈병, 흑색종, 난소암종), 심혈관 질환(예, 진행성 심부전, 협착증, 혈우병), 신경 질환(예, 뇌의 외상)의 치료를 위한 다양한 치료 방법(DNA 백신, 항생제, 항바이러스제)에 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 목적 조성물은 상처, 예를 들면, 베인 자국, 당뇨성 궤양, 욕창, 열상, 화상 등의 치료에 사용할 수 있다.
치료제는 핵산(예, 벡터, RNAi 구조체 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드) 또는 단백질에서 소형 유기 분자까지 다양하다. 특정 구체예에서, 치료제는 항암제(예, 캄토테신 또는 관련된 유도체), 항곰팡이제, 항균제, 항진균제, 또는 항바이러스제이다. 특정 구체예에서, 치료제는 수용체 촉진제이다. 특정 구체예에서, 치료제는 수용체 길항제이다. 특정 구체예에서, 치료제는 프로테아제 저해물질이다. 더 나아가, 본 발명의 중합체는 한 종류의 치료제를 함유하거나 한 종류이상의 치료제를 함유할 수 있다. 가령, 2가지이상의 서로 다른 항암제, 또는 항암제와 면역억제제, 또는 항생제와 소염제가 조성물에 포함될 수 있다.
사용된 치료제의 유형에 따라, 본 발명의 치료 조성물은 선천적 질환 또는 후천적 질환, 예를 들면, 낭포성 섬유증, 고쉐병, 근육 이영양증, AIDS, 암(예, 다발성 골수종, 백혈병, 흑색종, 난소암종), 심혈관 질환(예, 진행성 심부전, 협착증, 혈우병), 신경 질환(예, 뇌의 외상)의 치료를 위한 다양한 치료 방법(DNA 백신, 항생제, 항바이러스제)에 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 상처를 치료하는데(즉, 상처 치료를 촉진하는데) 사용될 수 있다. 매트릭스 단독이 상처 밀폐제로서 유용하긴 하지만, 이런 조성물은 예로써 PDGF-B 또는 표적 세포에서 PDGF-B를 생산하는 발현 벡터, 세포 증식이나 분화의 자극인자, 줄기 세포 또는 선구 세포 및/또는 치료를 촉진하고 감염을 저해하는데 효과적인 다른 화합물을 함유한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료에 사용될 수 있다. 이런 조성물은 화학치료제, 혈관신생-저해제, 세포 증식 저해물질, 방사능감작제 및/또는 암의 치료에 유용한 다른 치료제를 함유한다.
가령, 암의 치료를 위한 목적 조성물에 포함될 수 있는 화합물은 아래와 같다: 아미노글루테티미드, 암사크린, 아나스트로졸, 아스파라기나아제, bcg, 비칼루타마이드, 블레오마이신, 부세렐린, 캄토테신, 카페시타빈, 칼보플라틴, 칼무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 콜히친, 사이클로포스파마이드, 시프로테론, 시타라빈, 다카르바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 디엔에스트롤, 디에틸스틸베스트롤, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에스트라디올, 에스트라무스틴, 에토포시드, 엑셈에스탄, 필그라스팀, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루오르우라실, 플루옥시메스테론, 플루타마이드, 젬시타빈, 제니스테인, 고세렐린, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파마이드, 이마티닙, 인터페론, 이리노테칸, 이로노테칸, 레트로졸, 루코보린, 레우프롤리드, 레바미솔, 로무스틴, 메클로로레타민, 메드록시프로게스테론, 메게스트롤, 멜팔란, 멀캡토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 닐루타마이드, 노코다졸, 옥트레오타이드, 옥살리플라틴, 파실리탁셀, 파미드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 포르피메르, 프로칼바진, 랄티트렉세드, 리툭시맙, 스트렙토조신, 수라민, 타목시펜, 토모졸로마이드, 테니포시드, 테스토스테론, 티오구아닌, 티오테파, 티타노센 디클로라이드, 토포테칸, 트라스투주맙, 트레티노인, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈.
이들 화학치료제는 작용 기전에 따라 아래의 군으로 분류된다: 항대사물질/항암제, 예를 들면, 피리딘 유사체(예, 5-플루오르우라실, 플룩수리딘, 카페시타빈, 젬시타빈, 시타라빈)와 퓨린 유사체, 엽산염 길항제와 관련 저해물질(멀캡토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴, 2-클로로데옥시아데노신(클라드리빈)); 항증식제/항유사분열제, 예를 들면, 빈카 알칼로이드(빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈)와 같은 자연 산물, 탁산(파실리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론, 나벨빈과 같은 미세소관 교란제, 에피디포도필로톡신(테니포시드), DNA 손상제(악티노마이신, 암사크린, 안트라사이클린, 블레오마이신, 부설판, 캄토테신, 칼보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파마이드, 시톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틸멜라민옥살리플라틴, 이포스파마이드, 멜팔란, 메르클로레타민, 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소우레아, 필카마이신, 프로칼바진, 테니포시드, 트리에틸렌티오포스포르아마이드, 에토포시드(VP 16)); 항생제, 예를 들면, 닥티노마이신(악티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신(아드리아마이신), 미토마이신; 효소(L-아스파라긴을 체계적으로 대사하고 자신의 아스파라긴을 합성할 수 없는 세포를 제거하는 L-아스파라기나아제); 할혈소판제; 항증식성/항유사분열성 알킬화제, 예를 들면, 질소 겨자(메클로레타민, 사이클로포스파마이드와 이의 유사체, 멜팔란, 클로람부실), 에틸렌이민, 메틸멜라민(헥사메틸멜라민과 티오테파), 알킬 설포네이트-부설판, 니트로소우레아(칼무스틴(BCNU)와 이의 유사체, 스트렙토조신), 트라젠-다칼바지닌(DTIC); 항증식성/항대사분열성 항대사물질, 예를 들면, 엽산 유사체(메토트렉세이트); 백금 배위 착화물(시스플라틴, 칼보플라틴), 프로칼바진, 하이드록시우레아, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬, 호르몬 유사체(에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타마이드, 닐루타마이드), 아로마타제 저해물질(레트로졸, 아나스트로졸); 항응혈제(헤파린, 합성 헤파린 염, 트롬빈의 다른 저해물질); 피브린분해제(예, 조직 플라스미노겐 활성인자, 스트렙토키나아제, 우로키나아제), 아스피린, COX-2 저해물질, 디피리다몰, 티클로피딘, 클로피도그렐, 압식시맙; 항이동제; 항분비제(브레벨딘); 면역억제제(사이클로스포린, 타크롤리무스(FK-506), 시롤리무스(라파마이신), 아자티오프린, 미코페놀레이트 모페틸); 안지오텐신 수용체 차단물질; 산화질소 공여체; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 항체(트라스투주맙); 세포 주기 저해물질과 분화 유도물질(트레티노인); mTOR 저해물질, 토포이소메라제 저해물질(독소루비신(아드리아마이신), 암사크린, 캄토테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포시드, 에피루비신, 에토포시드, 이다루비신, 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코르티코스테로이드(코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸페드니솔론, 프레드니손, 프레니솔론); 성장 인자 신호 전달 키나아제 저해물질; 미토콘드리아 기능장애 유도물질과 카스파제 활성인자; 크로마틴 교란제.
본 발명에 따른 치료 방법은 본 발명의 치료 조성물의 치료 효과량을 투여한다. 당분야에서 치료 효과량은 개별 사례에 기초하여 결정된다. 고려해야 하는 인자에는 치료되는 질환 및 이런 질환으로 고생하는 개체의 신체 특성이 포함하지만 이들에 국한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예는 농업에 사용가능한 적어도 하나의 생물학적 활성 화합물 및 본 발명의 선형 사이클로덱스트린-변형된 중합체 또는 선형 산화된 사이클로덱스트린-변형된 중합체를 함유하는 조성물이다. 농업에 사용가능한 생물학적 활성 화합물은 당분야에 공지된 화합물을 포함한다. 가령, 농업에 사용가능한 적절한 생물학적 활성 화합물에는 살균제, 제초제, 살충제, 방미제(mildewcide)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
Ⅳ. 전형적인 조성물
특정 구체예에서, 기초 중합체는 선형 사이클로덱스트린-보유 중합체이다, 예를 들면, 중합체 골격은 사이클로덱스트린 부분을 포함한다. 가령, 상기 중합체는 정확하게 두 위치 각각에 하나의 반응 부위를 보유하도록 변형된 적어도 하나의 사이클로덱스트린 유도체를 제공하고, 링커와 사이클로덱스트린 유도체간에 공유 결합을 형성하는 반응 부분과 반응 부위와의 반응을 촉진하는 중합 조건하에서 반응 부위와 공유 결합을 형성할 수 있는 정확하게 2개의 반응 부분을 보유하는 링커와 사이클로덱스트린 유도체를 반응시킴으로써 제조된 수용성의 선형 사이클로덱스트린 중합체인데, 여기서 사이클로덱스트린 유도체와 링커의 교체 단위를 포함하는 선형 중합체가 제조된다. 다수의 적절한 중합체는 U.S. 특허 출원 20020151523과 10/656,838에서 기술한다. 대안으로, 상기 중합체는 선형 중합체 골격을 보유하는 수용성의 선형 사이클로덱스트린 중합체이며, 상기 중합체는 선형 중합체 골격 내에 복수의 치환되거나 치환되지 않은 사이클로덱스트린 부분 및 링커 부분을 포함하는데, 여기서 중합체 사슬의 말단에서 사이클로덱스트린 부분을 제외한 각 사이클로덱스트린 부분이 2개의 링커 부분에 부착되며, 각 링커 부분은 2개의 사이클로덱스트린 부분을 공유 결합시킨다. 또 다른 구체예에서, 상기 중합체는 복수의 링커 부분에 의하여 서로 공유 결합된 복수의 사이클로덱스트린 부분을 포함하는 수용성의 선형 사이클로덱스트린 중합체인데, 여기서 중합체 사슬의 말단에서 사이클로덱스트린 부분을 제외한 각각의 사이클로덱스트린 부분은 2개의 링커 부분에 부착되어 선형 사이클로덱스트린 중합체를 형성한다.
링커기는 알킬렌 사슬, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬, 폴리숙신산 무수물, 폴리-L-글루탐산, 폴리(에틸렌이민), 올리고당, 아미노산 사슬, 또는 다른 적절한 연결일 수 있다, 특정 구체예에서, 링커기는 자체적으로 알킬렌 사슬처럼 생리 조건하에 안정하거나, 또는 생리 조건하에, 예를 들면, 효소에 의해(예, 연결은 펩티다아제의 기질이 되는 펩티드 서열을 보유한다) 또는 가수분해에 의해(예, 연결은 에스테르 또는 티오에스테르와 같은 가수분해기를 보유한다) 절단될 수 있다. 링커기는 PEG, 폴리글리콜산 또는 폴리락트산 사슬처럼 생물학적으로 불활성이거나, 또는 이들 부분으로부터 절단되는 경우에 수용체에 결합하고 효소를 불활성화시키는 올리고- 또는 폴리펩티드처럼 생물학적으로 활성일 수 있다. 생물학적으로 적합성 및/또는 생체부식성인 다양한 올리고머성 링커기는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 연결의 선택은 이식되는 경우에 내구성이 있는 지의 여부, 이식이후 점진적으로 수축하거나 변형되는 지의 여부, 또는 점진적으로 분해되어 체내로 흡수되는 지의 여부와 같은 재료의 궁극적인 성질에 영향을 줄 수 있다. 링커기는 탄소-탄소 결합, 에스테르, 에테르, 아마이드, 아민, 카보네이트, 카바메이트, 설폰아마이드 등을 비롯한 적절한 결합 또는 기능기에 의하여 이들 부분에 부착될 수 있다.
전형적인 구체예에서, 재료를 형성하는데 사용되는 사이클로덱스트린 중합체는 사이클로덱스트린과 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 공중합체이다. 이런 중합체는 당분야에 공지된 기술, 예를 들면, 아래의 반응식으로 예시되는 반응으로 제조할 수 있다:
여기서, 사다리꼴은 아래에 상술한 바와 같이 사이클로덱스트린 부분을 나타내고, n은 1-20, 바람직하게는 2-12의 정수를 나타낸다. 중합체는 예로써 생리 조건하에 절단되는 링커를 통한 치료제 부분의 공유 부착에 의해 변형될 수 있다.
이런 중합체에서, 사이클로덱스트린 부분은 공중합체 중량의 적어도 2%, 바람직하게는 적어도 5% 또는 10%, 더욱 바람직하게는 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 또는 90%를 구성한다.
특정 구체예에서, 재료를 형성하는데 사용되는 사이클로덱스트린 중합체는 아래의 구조식을 보유한다:
R은 각 경우에 독립적으로 H, 저급 알킬, 사이클로덱스트린 부분, 또는
를 나타내고,
m은 각 경우에 독립적으로 2-10,000, 바람직하게는 10-5,000, 또는 100-1,000의 정수를 나타낸다. 이런 유형의 적절한 중합체는 U.S. 특허 출원 10/372,732 및 PCT 출원 WO 03/072637에서 상세하게 기술한다.
특정 구체예에서, R은 사이클로덱스트린 부분인 아닌 일차 아민(즉, 2개의 R이 H를 나타낸다)인 질소 원자의 적어도 1%, 바람직하게는 적어도 3%, 5%, 10%, 20%, 35%, 또는 50%에서 사이클로덱스트린 부분을 나타낸다.
특정 구체예에서, 사이클로덱스트린 부분은 중량으로 사이클로덱스트린-변형된 중합체의 적어도 2%, 3%, 4%, 5%, 7%, 또는 10%를 구성한다.
특정 구체예에서, 중합체에서 에틸렌이민 아단위는 중량으로 적어도 2%, 3%, 4%, 5%, 7%, 또는 10%가 사이클로덱스트린 부분으로 변형된다.
사이클로덱스트린 부분으로 유도체화에 취약한 친핵성 아미노 치환체를 보유하는 폴리(에틸렌이민)의 공중합체 역시 본 발명의 범위 내에서 사이클로덱스트린-변형된 중합체를 제조하는데 사용할 수 있다.
전형적인 사이클로덱스트린 부분은 본질적으로 6 내지 9 당류 부분으로 구성되는 환형 구조, 예를 들면, 사이클로덱스트린 및 산화된 사이클로덱스트린을 포함한다. 사이클로덱스트린 부분은 중합체 골격, 바람직하게는 사슬에 1 내지 20개 원자를 보유하는 중합체 골격, 예를 들면, 디카르복실릭산 유도체(예, 글루타르산 유도체, 숙신산 유도체 등)를 비롯한 알킬 사슬 및 올리고에틸렌 글리콜 사슬과 같은 헤테로알킬 사슬과 환형 구조 사이에 공유 결합을 형성하는 링커 부분을 선택적으로 포함한다.
사이클로 덱스트린은 α-(1,4) 결합으로 자연 발생 D-(+)-글루코피라노오스 단위를 보유하는 환형 다당류이다. 가장 일반적인 사이클로덱스트린은 알파((α)-사이클로덱스트린, 베타((β)-사이클로덱스트린, 감마(γ)-사이클로 덱스트린인데, 이들은 각각 6, 7 또는 8개의 글루코피라노오스 단위를 보유한다. 구조적으로, 사이클로덱스트린의 환형 성질은 내부의 무극성 또는 소수성 공동을 보유하는 원환체 또는 도넛-유사 형태를 형성하는데, 제 2 하이드록실기는 사이클로덱스트린 원환체의 한 측면에 위치하여 제 1 하이드록실기는 다른 측면에 위치한다. 따라서, (β)-사이클로덱스트린을 표본으로 하는 사이클로덱스트린은 아래와 같이 도식된다.
제 2 하이드록실기가 배치된 측면은 제 1 하이드록실기가 배치된 측면보다 더 넓은 직경을 갖는다. 사이클로덱스트린 내부 공동의 소수성 성질은 다양한 화합물 내포를 가능하게 한다(Comprehensive Supramolecular Chemistry, Volume 3, J. L. Atwood et al. , eds., Pergamon Press (1996) ; T. Cserhati, Analytical Biochemistry, 225: 328-332 (1995); Husain et al. , Applied Spectroscopy, 46: 652-658 (1992); FR 2 665 169). 중합체를 변형시키는 다른 방법은 SuH, J. and Noh, Y. , Bioorg. Mde. Chem. Lett. 1998, 8, 1327-1330에서 개시한다.
사이클로덱스트린은 사이클로덱스트린의 소수성 공동에 적합될 수 있는 다양한 약물과 내포 복합체를 형성하거나 다른 생물학적 활성 분자, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드와 이의 유도체와 비-공유 결합 복합체를 형성함으로써 다양한 치료 화합물의 전달 운반제로서 사용되고 있다(참조: U.S. Patents 4,727,064, 5,608,015, 5,276,088, 5,691,316). 다양한 사이클로덱스트린-보유 중합체 및 이들의 제조 방법 역시 당해 기술분야에 공지되어 있다(Comprehensive Supramolecular Chemistry, Volume 3, J.L. Atwood et al., eds., Pergamon Press(1996)). 사이클로덱스트린 중합체는 중합화제, 예를 들면, 에피클로하이드린, 디이소시나네이트, 디에폭사이드로 사이클로덱스트린 또는 사이클로덱스트린 혼합물을 연결하거나 가교-결합시킴으로써 제조되었다(Insoluble cyclodextrin polymer beads, Chem. Abstr. No. 222444m, 102: 94; Zsadon and Fenyvesi, 1st. Int. Symp. on Cyclodextrins, J. Szejtli, ed., D. Reidel Publishing Co., Boston, pp. 327-336; Fenyvesi et al., 1979, Ann. Univ. Budapest, Section Chim. 15: 13 22; Wiedenhof et al., 1969, Die Stirke 21: 119-123). 이들 중합화제는 탄소 6, 2, 3에서 일차와 이차 하이드록시기와 반응할 수 있다. 사이클로덱스트린-변형된 중합체 담체는 약물의 전달을 작용 부위로 표적시키는 생체인식 분자에 결합될 수 있다(참조: U.S. Patent No. 6,180,739, 5,981,740, 5,929,131, 5,910,551, 5,792,821(중합가능 사이클로덱스트린 유도체), 6,048,736(사이클로덱스트린 중합체를 이용한 약물 전달), (중합가능 사이클로덱스트린 유도체), 5,856,416과 5,593,768(사이클로덱스트린 부분을 보유하는 단량체와 중합체), 5,608,015(중합가능 사이클로덱스트린 유도체를 제조하는 방법), 5,516,766(사이클로덱스트린 중합체의 용도)).
일반적으로, 가교결합 분자는 사이클로덱스트린 또는 다른 내포 호스트와 내포 복합체를 형성하는 2개이상의 부분을 포함하는데, 이들 부분은 서로 0.5 내지 50 nm, 바람직하게는 1 내지 30 nm 이격을 가능하게 하는 원자 사슬에 의해 공유 결합된다. 이들 부분은 사이클로덱스트린과 같은 내포 호스트와 내포 복합체를 형성하는 임의의 분자, 예를 들면, 페닐 고리, 아다만탄 폴리환, 콜레스테롤, 나프톨 유도체 등으로부터 선택될 수 있다(참조: Szejtli, Cyclodextrins and Their inclusion complexs; Akademiai Klado, Budapest, 1982; Bender et al., Cyclodexrin Chemistry, Springer-Verlag, Berlin, 1978). 사이클로덱스트린은 예로써 약물, 살충제, 제초제를 비롯한 일련의 유기 분자와 내포 복합체를 형성할 수 있다(참조: Tenjarla et al., J Pharm. Sci., 87: 425-429(1998); Zughul et al., Pharm. Dev. Technol., 3: 43-53(1998); Albers et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 12: 311-337(1995)). 가교결합 분자에서 이들 부분은 동일하거나 상이하고, 상이한 가교결합 분자는 단일 재료에 동시에 사용될 수 있다.
이들 부분 사이의 공유 결합은 임의의 적절한 연결, 예를 들면, 알킬렌 사슬, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬, 폴리(에틸렌이민), 올리고당, 아미노산 사슬, 또는 다른 적절한 연결일 수 있다, 연결은 알킬렌 사슬처럼 생리 조건하에 안정하거나, 또는 생리 조건하에, 예를 들면, 효소에 의해(예, 연결은 펩티다아제의 기질이 되는 펩티드 서열을 보유한다) 또는 가수분해에 의해(예, 연결은 에스테르 또는 티오에스테르와 같은 가수분해기를 보유한다) 절단될 수 있다. 연결은 PEG, 폴리글리콜산 또는 폴리락트산 사슬처럼 생물학적으로 불활성이거나, 또는 이들 부분으로부터 절단되는 경우에 수용체에 결합하고 효소를 불활성화시키는 올리고- 또는 폴리펩티드처럼 생물학적으로 활성일 수 있다. 생물학적으로 적합성 및/또는 생체부식성인 다양한 올리고머성 연결은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 연결의 선택은 이식되는 경우에 내구성이 있는 지의 여부, 이식이후 점진적으로 수축하거나 변형되는 지의 여부, 또는 점진적으로 분해되어 체내로 흡수되는 지의 여부와 같은 재료의 궁극적인 성질에 영향을 줄 수 있다. 연결은 탄소-탄소 결합, 에스테르, 에테르, 아마이드, 아민, 카보네이트, 카바메이트, 설폰아마이드 등을 비롯한 적절한 결합 또는 기능기에 의하여 이들 부분에 부착될 수 있다.
전형적인 구체예에서, 가교결합 분자는 생물학적으로 활성이고 생리 조건하에 가수분해되는 연결에 의해 결합된 생물학적 활성 약물 부분을 포함한다. 이식이후, 연결은 점진적으로 절단되어 활성 약물을 방출하고 재료의 구조를 부분적으로 분해시킨다. 사이클로덱스트린을 지지하는 중합체 역시 생체분해성인 경우, 재료는 점진적으로 분해되고 내포되어있던 생물학적 활성 약물을 서서히 방출하게 된다. 이런 구체예에서, 추가적인 치료제를 재료에 포함시켜 치료 효과를 달성할 수도 있다.
본 발명의 재료는 한가지이상의 생물학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다. 이런 활성제는 사이클로덱스트린과 내포 복합체를 형성하거나 재료 전체에 단순히 분산될 수 있다. 전형적인 활성제는 핵산, 바이러스, 폴리펩티드, 폴리플렉스, 제약학적 약품, 소형 유기 분자, 또는 임의의 다른 치료제를 포함한다.
특정 구체예에서, 목적 조성물은 표적 유전자의 넉다운(knockdown)을 실행하는 RNA 간섭(RNAi)을 이용하기 위하여 RNAi 구조체를 포함한다. RNAi 구조체는 표적 유전자의 발현을 특이적으로 차단할 수 있는 이중 가닥 RNA를 포함하고, 목적 조성물을 이용한 전달에 적합하다. RNAi는 시험관내에서 또는 생체내에서 유전자 발현을 저해하는데 유용한 방법을 제공한다. RNAi 구조체는 표적 핵산 서열에 동일하거나 실질적으로 동일한 긴 dsRNA 가닥, 또는 표적 핵산 서열의 한 영역에만 동일하거나 실질적으로 동일한 짧은 dsRNA 가닥을 포함할 수 있다.
선택적으로, RNAi 구조체는 세포의 생리 조건하에, 저해되는 유전자(“표적 유전자”)에 대한 mRNA 전사체의 적어도 일부분의 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 보유한다. 이중-가닥 RNA는 RNAi를 매개하는 능력을 보유할 수 있도록 고유 RNA와 충분히 유사해야 한다. 따라서, 본 발명은 유전자 돌연변이, 종 다형성 또는 진화적 분기로 인하여 예상되는 서열 변이를 관용할 수 있는 이점을 갖는다. 표적 서열과 RNAi 구조체 서열 사이에 관용된 뉴클레오티드 미스매치의 총수는 5개 염기쌍에서 1개 이하, 또는 10개 염기쌍에서 1개 이하, 또는 20개 염기쌍에서 1개 이하, 또는 50개 염기쌍에서 1개 이하이다. siRNA 이중나선의 중심에서 미스매치는 가장 중요하고, 표적 RNA의 절단을 본질적으로 소멸시킨다. 대조적으로, 표적 RNA에 상보적인 siRNA 가닥의 3' 말단에서 뉴클레오티드는 표적 인식의 특이성에 별다른 기여를 하지 않는다. 서열 상동성은 당해 기술분야에 공지된 서열 비교와 정렬 알고리즘(참조: Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991)으로 최적화시키고, 디폴트 매개변수를 이용하여 BESTFIT 소프트웨어 프로그램(예, University of Wisconsin Genetic Computing Group)에서 실행된 바와 같이 Smith-Waterman 알고리즘으로 뉴클레오티드 서열간의 차이 비율을 산정할 수 있다. 저해 RNA와 표적 유전자 일부분 사이에 90% 초과의 서열 상동성, 또는 100% 서열 상동성이 바람직하다. 대안으로, RNA의 이중나선 영역은 표적 유전자 전사체의 일부분과 혼성화(예, 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 12-16시간동안 50℃ 또는 70℃ 혼성화; 이후 5회 세척)될 수 있는 뉴클레오티드 서열로서 기능적으로 정의될 수 있다.
이중-가닥 구조는 단일 자가-상보적 RNA 가닥 또는 2개의 상보적 RNA 가닥으로 형성될 수 있다. RNA 이중나선 형성은 세포 내부 또는 외부에서 개시될 수 있다. RNA는 세포당 적어도 하나의 사본을 전달하는 양으로 도입된다. 이중-가닥 재료의 높은 용량(예, 세포당 적어도 5, 10, 100, 500 또는 1000개의 사본)은 더욱 효과적인 저해를 산출하는 반면, 낮은 용량 역시 특정 목적에 적합할 수 있다. 유전자 저해를 위하여 RNA의 이중나선 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열이 표적된다는 점에서, 저해는 서열-특이적이다.
목적 RNAi 구조체는 “소형 간섭 RNA” 또는 “siRNA”일 수 있다. 이들 핵산은 대략 19-30개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 21-23개 뉴클레오티드 길이이다. siRNA는 뉴클레아제 복합체를 동원하고, 특정 서열과 쌍을 이룸으로써 이들 복합체를 표적 mRNA로 안내하는 것으로 생각된다. 결과적으로, 표적 mRNA는 단백질 복합체에서 뉴클레아제에 의해 분해된다. 특정 구체예에서, 21-23개 뉴클레오티드 siRNA 분자는 3' 하이드록실기를 포함한다. 특정 구체예에서, siRNA 구조체는 예로써 효소 Dicer의 존재하에, 좀더 긴 이중-가닥 RNA의 가공으로 형성할 수 있다. 한 구체예에서, 초파리(Drosophila) 시험관내 시스템이 이용된다. 상기 구체예에서, dsRNA는 초파리(Drosophila) 배아로부터 유래된 가용성 추출물과 혼합하여 혼합물을 만든다. 상기 혼합물은 dsRNA가 대략 21 내지 23개의 뉴클레오티드의 RNA 분자로 가공되는 조건하에 유지시킨다. siRNA 분자는 당업자에게 알려진 다양한 기술을 이용하여 정제할 수 있다. 대안으로, 비-변성 방법, 예를 들면, 비-변성 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 siRNA를 정제할 수 있다. 이에 더하여, 크로마토그래피(예, 크기 배제 크로마토그래피), 글리콜 구배 원심분리, 항체를 이용한 친화성 정제로 siRNA를 정제할 수 있다.
RNAi 구조체의 생산은 화학적 합성 방법 또는 재조합 핵산 기술로 실행할 수 있다. 처리된 세포의 내인성 RNA 중합효소가 생체내에서 전사를 매개하거나, 클론된 RNA 중합효소가 시험관내 전사에 사용될 수 있다. RNAi 구조체는 예로써 세포 뉴클레아제에 대한 취약성을 감소시키거나, 생체이용효율을 개선하거나, 제제 특성을 개선하거나, 또는 다른 약물동역학적 특성을 변화시키기 위하여 인산염-당 골격 또는 뉴클레오시드에 변형을 포함할 수 있다. 가령, 중성 RNA의 포스포디에스테르 결합은 질소 또는 황 헤테로원자 중에서 적어도 하나를 포함하도록 변형된다. RNA 구조에서 변형은 dsRNA에 대한 전반적인 반응을 회피하면서 특이적인 유전자 저해가 가능하도록 맞춤될 수 있다. 유사하게, 아데노신 디아미나제의 활성을 차단하기 위하여 염기를 변형할 수 있다. RNAi 구조체는 효소 합성, 또는 부분 또는 전체 유기 합성으로 생산할 수 있고, 임의의 변형된 리보뉴클레오티드는 시험관내 효소 합성 또는 유기 합성으로 도입할 수 있다. RNA 분자를 화학적으로 변형하는 방법은 RNAi 구조체를 변형하는데 적용될 수 있다(참조: Heidenreich et al.(1997) Nucleic Acids Res, 25:776780; Wilson et al.(1994) J Mol Recog 7:89-98; Chen et al.(1995) Nucleic Acids Res 23:2661-2668; Hirschbein et al.(1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7:5561). 가령, RNAi 구조체의 골격은 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포디티오에이트, 키메라 메틸포스포네이트-포스포디에스테르, 펩티드 핵산, 5-프로피닐-피리미딘 보유 올리고머 또는 당 변형체(예, 2'-치환된 리보뉴클레오시드, α-배열)로 변형될 수 있다. 일부 경우에, siRNA 분자의 적어도 하나의 가닥은 1-6, 바람직하게는 2-4개 뉴클레오티드 길이의 3' 돌출(overhang)을 보유한다. 더욱 바람직하게는, 돌출은 1-3개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 구체예에서, 한 가닥은 3' 돌출을 보유하고, 다른 가닥은 평활 말단이거나 돌출을 보유한다. 돌출의 길이는 각 가닥에서 동일하거나 상이할 수 있다. siRNA의 안정성을 더욱 강화시키기 위하여, 3' 돌출은 분해로부터 안정화시킬 수 있다. 한 구체예에서, RNA는 퓨린 뉴클레오티드, 예를 들면, 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오티드를 포함함으로써 안정화된다. 대안으로, 변형된 유사체에 의한 피리미딘 뉴클레오티드의 치환, 예를 들면, 2'-디옥시티이니딘에 의한 우리딘 뉴클레오티드 3' 돌출의 치환은 관용되고 RNAi의 효능에 영향을 주지 않는다. 2' 하이드록실의 부재는 조직 배양 배지에서 돌출의 뉴클레아제 저항성을 현저하게 강화시키고 생체내에서 유익할 수 있다.
RNAi 구조체는 긴 이중-가닥 RNA 형태일 수도 있다. 특정 구체예에서, RNAi 구조체는 적어도 25, 50, 100, 200, 300 또는 400 염기 길이이다. 특정 구체예에서, RNAi 구조체는 400-800 염기 길이이다. 이중-가닥 RNA는 예로써 세포에서 siRNA 서열을 생산하기 위하여 세포내 절단된다. 하지만, 생체내에서 긴 이중-가닥 RNA의 사용은 서열-독립성 dsRNA 반응으로 야기된 유해 효과로 인하여 항상 실용적인 것은 아니다. 이런 구체예에서, 인터페론 또는 PKR의 효과를 감소시키는 국소 전달 시스템 및/또는 전달제의 사용이 선호된다.
대안으로, RNAi 구조체는 헤어핀 구조 형태(헤어핀 RNA)이다. 헤어핀 RNA는 외인성으로 합성되거나 RNA 중합효소 III 프로모터에 의해 생체내에서 형성될 수 있다. 포유동물 세포에서 유전자 침묵(gene silencing)을 위한 이런 헤어핀 RNA를 제조하고 사용하는 실례는 예로써 Paddison et al., Genes Dev, 2002, 16:948-58; McCaffrey et al., Nature, 2002, 418:38-9; McManus et al., RNA, 2002, 8:842-50; Yu et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99:6047-52에서 기술한다. 적절하게는, 이런 헤어핀 RNA는 원하는 유전자의 연속적이고 안정적인 발현을 담보하기 위하여 세포 또는 동물에서 가공한다. siRNA는 세포에서 헤어핀 RNA를 가공함으로써 생산할 수 있다.
PCT 출원 WO 01/77350에서는 진핵 세포에서 동일한 도입유전자의 센스와 안티센스 RNA 전사체를 동시에 산출하는 도입유전자의 이중방향성 전사를 위한 전형적인 벡터를 기술한다. 따라서, 특정 구체예에서 목적 조성물은 아래의 독특한 특징을 보유하는 궁극적 전달을 위한 재조합 벡터를 함유한다: 이는 반대 방향으로 정렬되고 목적하는 RNAi 구조체에 대한 도입유전자와 측면에 접하는 2개의 중복 전사 단위를 보유하는 바이러스 레플리콘을 포함하는데, 여기서 2개의 중복 전사체 단위는 숙주 세포에서 동일한 도입유전자 단편으로부터 센스와 안티센스 RNA 전사체를 모두 산출한다.
Ⅴ. 사업 방법
본 발명의 다른 측면에서는 사업을 실시하는 특정한 방법을 제시한다. 특히, 본 발명에 따른 방법의 실시는 신규한 치료 조성물 및 이의 개선된 제제를 가능하게 한다. 하나이상의 추가 단계와 결합된 이런 기술적인 단계는 제약학적 사업, 특히, 생명-과학 사업을 실시하는데 새로운 접근법을 제공한다. 가령, 본 발명의 방법에 의해 제조된 치료제는 다양한 질환 모델에서 치료제로서 효능을 평가하고, 이후 유망한 치료 조성물은 질환 치료용 제제의 제제화, 포장, 후속 시판에 앞서 독성 및 다른 안정성-프로파일링(profiling)을 검사한다. 대안으로, 이런 제제를 개발하고 시판하거나 또는 이런 단계를 실시할 수 있는 권리를 제 3자에게 인가할 수도 있다.
따라서, 특정 구체예에서, 본 발명은 제약학적 사업을 실시하기 위한 방법을 제시하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
(a) 본 발명에 개시된 화합물의 제약학적 조성물을 보유하는 제제 또는 키트를 제조하고;
(b) 질환이나 이상의 치료에서 이런 제제 또는 키트의 사용 이점을 건강관리 공급자에게 홍보한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 제약학적 사업을 실시하기 위한 방법을 제시하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
(a) 본 발명에 개시된 화합물의 제약학적 조성물을 판매하기 위한 유통망을 제공하고;
(b) 질환이나 이상의 치료에서 이런 제약학적 조성물의 사용설명서를 환자 또는 의사에게 제공한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 제약학적 사업을 실시하기 위한 방법을 제시하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
(a) 본 발명에 개시된 화합물의 제약학적 조성물의 적절한 제제와 용량을 결정하고;
(b) 동물에서 효능과 독성에 대한 (a) 단계에서 확인된 제제의 치료 프로파일링(profiling)을 실시하고;
(c) 수용가능한 치료 프로필을 갖는 (b) 단계에서 확인된 제제를 판매하기 위한 유통망을 제공한다.
상기 구체예의 추가적인 단계에서 상기 제제를 건강관리 제공자에게 홍보하기 위한 판매원을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 제약학적 사업을 실시하기 위한 방법을 제시하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
(a) 본 발명에 개시된 화합물의 제약학적 조성물의 적절한 제제와 용량을 결정하고;
(b) 상기 제제의 추가 개발과 판매 권리를 제 3자에게 인가한다.
본 발명은 아래의 실시예를 참고하면 더욱 용이하게 이해할 수 있지만, 이들 실시예는 본 발명의 특정 측면과 구체예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 한정하지 않는다.
실시예 1
폴리에틸렌이민(PEI)-사이클로덱스트린 공액체(Suh et al. 1992, J. Am. Chem. Soc. 114 7916-7917)
가지형 PEI(60 ㎎, Aldrich Mw 25,000)는 DMSO(4 ㎖)와 탈기된 물(6 ㎖) 용매 혼합물에 용해시켰다. 사이클로덱스트린 모노토실레이트(928 ㎎, Cyclodextrin Technologies Development, Inc.)를 아르곤하에 상기 용액에 첨가하였다. 흐린 용액은 혼합물을 70℃에서 1시간동안 교반한 이후, 투명하게 변하였다. 용액은 아르곤하에 상기 온도에서 48시간후 약한 황색으로 변하였다. 상기 용액은 Spectra/Por MWCO 25,000 막에 이전하고 6일동안 물에 투석하였다. 이후, 냉동 건조로 수분을 제거하였다. 용액을 냉동 건조시킨 이후 백색 분말(134 ㎎)을 수득하였다. 사이클로덱스트린/PEI 비율은 1H NMR의 양성자 통합(proton integration)에 기초하여 산정하였다.
실시예 2
가수분해성 폴리에틸렌이민(PEI)-사이클로덱스트린 공액체의 합성(Ahn et al. 2002 Journal of Controlled Release 80, 273-282)
가수분해성 PEI-PEG는 PEI-PEG는 Ahn et a]. 2002 Journal of Controlled Release 80, 273-282에 기술된 바와 같이 합성하였다. 생성된 가수분해성 PEI 중합체는 DMSO(4 ㎖)와 탈기된 물(6 ㎖) 용매 혼합물에 용해시켰다. 사이클로덱스트린 모노토실레이트(Cyclodextrin Technologies Development, Inc.)를 아르곤하에 상기 용액에 첨가하였다. 이후, 반응 혼합물은 차가운 디에틸 에테르에 침전시키고, 산물은 진공하에 하룻밤동안 건조시켰다. 사이클로덱스트린/PEI 비율은 1H NMR의 양성자 통합(proton integration)에 기초하여 산정하였다.
실시예 3
선형 사이클로덱스트린-기초한 폴리에틸렌 글리콜 중합체(CD-PEG)
CD-PEG 중합체는 이중기능화된 β-사이클로덱스트린 단량체(A)와 이중기능화된 폴리에틸렌 글리콜 공단량체(B)를 중합하여 ABAB 산물을 제공함으로써 제조하였다. 이런 합성 절차는 기존 절차(Gonzalez et al. 1999 Bioconjugate Chem. 10:1068-1074; Hwang et al. 2001 Biconjugate Chem. 12(2):280-290)에 따라 이중기능화된 β-사이클로덱스트린(6A,6D-디데옥시-6A,6D-디(2-아미노에탄티오)-β-사이클로덱스트린(디시스테아민-β-사이클로덱스트린)의 제조를 수반한다. 중합화 단계는 상업적으로 구입가능한 이중기능화된 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 실시하였다. 3가지 방법을 조사하였다.
방법 I: 이산(diacid)-폴리에틸렌 글리콜의 활용
합성:
다양한 분자량(Mw = 250, 600, 3000, 6000)을 갖는 이산-PEG는 Fluka, Milwaukee, WI로부터 구입하였다. 전형적인 실험에서, PEG600-(COOH)2(0.096 g, 0.16 mmol)는 pH 6.5에서 1 ㎖의 25 mM MES 완충액(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산)에 용해시켰다. 2 ㎖의 25 mM MES 완충액(pH 6.5)에 용해된 디시스테아민-β-사이클로덱스트린(0.2 g, 0.16 mmol)을 첨가하였다. 이후, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)(0.612 g, 3.2 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)와 N-하이드록시설포숙시니미드(설포-NHS)(0.026 g, 0.12 mmol, Pierce, Rockford, IL)를 첨가하였다. 생성된 용액은 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 그 다음, 중합체 용액은 Spectra/Por 7 MWCO 10,000 막(Spectrum, Houston, TX)에 이전하고 24시간동안 물에 투석하였다. 이후, 용액은 냉동 건조시켜 272 ㎎ 백색 고체(수율: 93%)를 수득하였다.
특성화: 광 산란과 분자량 측정
특이 굴절지수 증가(specific refractive index increment), dn/dc는 Bausch & Lomb ABBE-3L 굴절지수를 이용하여 인산염 완충액 1x(PBS)(Cellgro, Mediatech, Inc, Herndon, VA)에서 측정하였다. 이후, 중합체 샘플은 ERC-7512 RI 감지기, Precision Detectors PD2020/DLS 정적 광 산란(static light scattering) 감지기 및 0.7 ㎖/min 유속에서 인산염 완충액 1x를 용리액으로 하는 PL 아쿠아겔-OH 30(Polymer Laboratories, Amherst, MA) 칼럼이 구비된 Hitachi D6000 HPLC 장치에서 분석하였다. 각 중합체서 결정된 dn/dc, 중량 평균 분자량(weight average molecular weight) Mw, 다분산 지수(polydispersity index) Mw/Mn은 아래의 표에 보고한다.
표 1
CD-PEG 중합체의 정적 광 산란과 분자량 측정
중합체 dn/dc Mw(Da) 다분산
CD-PEG6000 0.1267 21,560 1.69
CD-PEG3000 0.1296 10,490 1.35
CD-PEG600 0.1361 28,450 1.77
CD-PEG250 0.1359 21,150 1.06
방법 Ⅱ: 디숙시니미딜 프로피오네이트 폴리에틸렌 글리콜의 활용
합성:
5 ㎖ DMSO에 녹인 디숙시니미딜 프로피오네이트 폴리에틸렌 글리콜(PEG3400-(SPA)2)(1.0854 g, 0.32 mmol, Shearwater Polymer, Inc, Huntsville, AL) 용액은 2 ㎖ DMSO에 용해된 디시스테아민-β-사이클로덱스트린(0.4 g, 0.32 mmol) 용액에 첨가하였다. 점성 용액이 즉시 형성되었다. 이후, 반응 혼합물은 아르곤하에 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 디에틸에테르를 첨가하여 중합체를 침전시키고 피펫으로 흘러 보냈다. 잔류 에테르는 증발시키고, 중합체는 물에 재용해시켰다. 생성된 용액은 10,000 MWCO Spectra/Por 막에 이전하고 24시간동안 물에 투석하였다. 그 다음, 용액은 냉동 건조시켜 1.329 g 백색 고체(수율: 95%)를 수득하였다.
특성화: 광 산란과 분자량 측정
상기 중합체는 앞서 제시된 동일한 기술을 이용하여 특성화하였다. dn/dc는 0.1316으로, 중량 평균 분자량 Mw는 184,000 Da로, 다분산 지수 Mw/Mn은 2.18로 산정되었다.
방법 Ⅲ: 디-벤조트리아졸 카보네이트 폴리에틸렌 글리콜의 활용
합성:
5 ㎖ DMSO에 녹인 디-벤조트리아졸 카보네이트 폴리에틸렌 글리콜(PEG3400-(BTC)2)(1 g, 0.32 mmol, Shearwater Polymer, Inc, Huntsville, AL) 용액은 2 ㎖ DMSO에 용해된 디시스테아민-β-사이클로덱스트린(0.4 g, 0.32 mmol) 용액에 첨가하였다. 점성 용액이 즉시 형성되었다. 이후, 반응 혼합물은 아르곤하에 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 디에틸에테르를 첨가하여 중합체를 침전시키고 피펫으로 흘러 보냈다. 잔류 에테르는 증발시키고, 중합체는 물에 재용해시켰다. 생성된 용액은 10,000 MWCO Spectra/Por 막에 이전하고 24시간동안 물에 투석하였다. 그 다음, 용액은 냉동 건조시켜 1.3 g 백색 고체(수율: 95%)를 수득하였다.
실시예 4
CD-PEG 중합체의 분자량 조절:
디시스테아민-β-사이클로덱스트린ㆍ2 HCl(0.577 g, 0.46 mmol)은 100℃에서 16시간동안 건조시켰다. 이후, 디숙시니미딜 프로피오네이트 폴리에틸렌 글리콜(PEG3400-(SPA)2)(1.565 g, 0.46 mmol, Shearwater Polymer, Inc, Huntsville, AL)을 첨가하였다. 혼합물에 건성 DMSO(8 ㎖)를 첨가하였다. 10분 교반한 이후, DIEA(176 ㎕, 1.01 mmol)을 아르곤하에 첨가하였다. 중합화 용액(1 ㎖)의 분량은 선택된 시점(15분, 30분, 60분, 1시간, 2시간, 5시간)에 옮겼다. 이후, 이들 샘플은 10,000 MWCO Spectra/por 막에 이전하고 24시간동안 물에 투석하였다. 그 다음, 용액은 냉동 건조시켰다. 생성된 고체의 Mw는 상기한 바와 같이 측정하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 중합체 Mw는 5시간 과정에서 대략 80 kDa로 증가하였다. 중합체 Mw는 50 내지 80 kDa 범위에서 조절될 수 있다.
실시예 5
가수분해성 선형 사이클로덱스트린-기초한 폴리에틸렌 글리콜 중합체(CD-PEG)의 합성
방법 I: NHS-HBA-CM-PEG3400-CM-HBA-NHS의 활용
1.5 ㎖ DMSO에 녹인 NHS-HBA-CM-PEG3400-CM-HBA-NHS(0.2 g, 0.06 mmol, Shearwater Polymers, Inc, Huntsville, AL) 용액은 2 ㎖ DMSO에 용해된 디시스테아민-β-사이클로덱스트린(0.074 g, 0.06 mmol) 용액에 첨가하였다. 이후, 반응 혼합물은 아르곤하에 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 생성된 중합체는 디에틸에테르로 침전시키고 여과하며 진공하에 건조시켰다.
방법 Ⅱ: PEG 숙시니미딜 숙시네이트(PEG-(SS)2)의 활용
합성:
5 ㎖ DMSO에 녹인 디숙시니미딜 숙시네이트 폴리에틸렌 글리콜(PEG3400-(SS)2)(SunBio, Inc., 980-5 Kwan-yang Dong, Anyang City, S. Korea)(0.3 mmol) 용액은 2 ㎖ DMSO에 용해된 디시스테아민-β-사이클로덱스트린(0.3 mmol) 용액에 첨가하였다. 이후, 반응 혼합물은 아르곤하에 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 생성된 중합체는 디에틸에테르로 침전시키고 여과하며 진공하에 건조시켰다.
실시예 6
가수분해성 선형 사이클로덱스트린-기초한 중합체의 합성
합성:
2 ㎖ DMSO에 녹인 글리콜 비스[숙시니미딜숙시네이트](EGS)(0.2 mmol, Pierce, Rockford, IL) 용액은 진공하에 100℃에서 하룻밤동안 건조되고 1.5 ㎖ DMSO에 용해된 디시스테아민-β-사이클로덱스트린(0.2 mmol) 용액에 첨가하였다. 이후, 반응 혼합물은 아르곤하에 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 생성된 혼합물은 아세톤으로 침전시키고 여과하며 진공하에 건조시켰다.
실시예 7
디아다만탄 가교링커: 비스-(2(1-아다만틸)에틸)포스페이트의 합성(Zhang et al. 1997, J. Am. Chem. Soc. H9(7):1676-1681)
합성:
무수성 피리딘(1O ㎖, Aldrich, Milwaukee, WI)은 냉각조에서 냉각시키고 메틸 디클로로포스페이트(1.488 g, 10 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)를 방울방울 첨가하였다. 혼합물은 추가로 15분동안 차게 유지시켰다. 이 기간동안, N-메틸피리디늄 디클로로포스페이트의 침전물이 형성된다. 1-아다만탄 에탄올(4.758 g, 26.4 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)을 첨가하고, 밀봉된 혼합물은 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 이후, 10% NaHCO3(50 ㎖)에 넣고 피리딘을 진공하에 증발시켰다. 연한 황색 고체는 1ℓ 물에 용해시키고 에테르(3개의 150 ㎖ 분량)로 추출하였다. 수상은 2N HCl로 pH 1로 산성화시키고, CHCl3:n-BuOH(7:3)의 3가지 150 ㎖ 분량으로 추출하였다. 모아진 유기층(에테르와 CHCl3:n-BuOH)은 물로 세척하고, 연한 황색 침전물은 혼성 용매에서 형성시키고, 이후 진공하에 용매를 증발시켰다. 형성된 연한 황색 고체는 아세톤/헥산으로부터 재결정화시켰다. 고체는 진공하에 건조시켰다(수율 60 %).
특성화:
산물은 1H NMR과 13C NMR로 특성화시켰다. 1H NMR(CDCl3): δ 1.45-1.75(m, 28H, -CH2-, 아다만틸), 1.95(m, 6H, C-H, 아다만틸), 4.07(q, 4H, -CH2-), 8.60(br, 1H, POOH). 13C NMR(CDCl3, 5OOMHz): δ 28.59, 31.77, 37.02, 42.52, 43.96, 44.02, 64.21, 64.26. 산물은 또한 질량 분광법으로 특성화시켰다: 전자분무 이온화(electrospray ionization): 421[M-H]-.
실시예 8
가수분해성 아다만탄 가교링커의 합성:
합성:
1-아다만탄메틸아민(0.152 g, 0.92 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)은 10 ㎖ 무수성 디클로로메탄에 녹인 에틸렌 글리콜 비스[숙시니미딜숙시네이트](EGS)(0.2 g, 0.43 mmol, Pierce, Rockford, IL) 용액에 첨가하였다. 생성된 용액은 실온에서 5시간동안 교반하였다. 이후, 0.1 N HCl로 산성화시키고 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기상은 MgSO4로 건조시키고 진공하에 농축 건조시켜 0.22 g 고체(수율 90%)를 수득하였다. 산물은 질량 분광법으로 특성화시켰다: 전자분무 이온화(electrospray ionization): 557[M+H]+, 579[M+Na]+, 1135[2M+Na]+.
실시예 9
디아다만탄 폴리에틸렌 글리콜 가교결합제의 합성:
다양한 방법을 조사하였다.
방법 I: 이산-폴리에틸렌 글리콜의 활용
1-아다만탄메틸아민(0.64 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)은 디클로로메탄에 용해된 PEG-이산(0.32 mmol, Fluka, Milwaukee, WI)에 첨가하였다. 1.3-디사이클로헥실카보디이미드(DCC)(3.2 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)를 첨가하고, 생성된 용액은 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 침전물(디사이클로헥실이소우레아, DCU)은 여과하고, 여과액은 18% HCl로 세척하였다. 유기상은 MgSO4에서 건조시키고, 이후 진공하에 농축 건조시켰다. 생성된 고체는 물에 재용해시켜 남아있는 DCC를 침전시켰다. DCC는 여과하고, 여과액은 냉동 건조시켰다.
방법 Ⅱ: 디숙시니미딜 프로피오네이트 폴리에틸렌 글리콜의 활용
1-아다만탄메틸아민(0.1 g, 0.60 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)은 10 ㎖ 디클로로메탄에 용해된 디숙시니미딜 프로피오네이트 폴리에틸렌 글리콜(PEG3400-(SPA)2)(1.02 g, 0.30 mmol, Shearwater Polymers, Inc, Huntsville, AL)에 첨가하였다. 생성된 용액은 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 용매는 진공하에 증발시키고, 잔류물은 물에 용해시키고 원심분리하여 과량의 1-아다만탄메틸아민을 제거하였다. 상층액은 1,000 MWCO Spectra/Por 막에 이전하고 24시간동안 물에 투석하였다. 이후, 용액은 냉동 건조시켜 0.88 g 고체(수율 84%)를 수득하였다.
방법 Ⅲ: 폴리에틸렌 글리콜의 활용(Sandier et a]. 2000, Langmuir 16:1634-1642)
폴리에틸렌 글리콜(Mw = 1000)(1g, 1 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)은 진공하에 70℃에서 하룻밤동안 가열하여 건조시켰다. 1-아다만틸 이소시아네이트(0.39 g, 2.2 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)는 무수성 디클로로메탄(25 ㎖)에 용해시킨 이후, 건조된 폴리에틸렌 글리콜에 첨가하였다. 이후, 2가지 촉매, 디부틸틴 디라우레이트(63.2 ㎎, 0.1 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)와 트리에틸아민(10.1 ㎎, 0.1 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 환류하에 7시간동안 가열하였다. 용매의 제거이후, 반응 산물은 증류수에 용해시켰다. 수용액은 활성화 탄소의 첨가 및 연속 여과로 정제하고, 이후 냉동 건조시켰다. 생성된 중합체는 70% 수율로 회수하고 1H NMR로 특성화시켰다.
방법 Ⅵ: 디-벤조트리아졸 카보네이트 폴리에틸렌 글리콜의 활용
1-아다만탄메틸아민(0.1 g, 0.60 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)은 10 ㎖ 디클로로메탄에 용해된 디벤조트리아졸 카보네이트 폴리에틸렌 글리콜(PEG3400-(BTC)2)(1.02 g, 0.30 mmol, Shearwater Polymers, Inc, Huntsville, AL)에 첨가하였다. 생성된 용액은 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 용매는 진공하에 증발시키고, 잔류물은 물에 용해시키고 원심분리하여 과량의 1-아다만탄메틸아민을 제거하였다. 상층액은 1,000 MWCO Spectra/Por 막에 이전하고 24시간동안 물에 투석하였다. 이후, 용액은 냉동 건조시켜 0.88 g 고체(수율 84%)를 수득하였다.
실시예 10
가수분해성 디아다만탄 폴리에틸렌 글리콜 가교링커의 합성.
다양한 방법을 조사하였다:
방법 I: 폴리에틸렌 글리콜의 활용
폴리에틸렌 글리콜(Mw = 1000)(1 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)은 진공하에 70℃에서 하룻밤동안 가열하여 건조시켰다. 1-아다만탄아세트산(2.2 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)은 무수성 톨루엔(15 ㎖)에 용해시킨 이후, 건조된 폴리에틸렌 글리콜에 첨가하였다. 그 다음, p-톨루엔설폰산(Aldrich, Milwaukee, WI)을 촉매량으로 첨가하였다. 생성된 혼합물은 Dean-Stark 장치를 이용하여 16시간동안 공비 환류시켰다. 반응의 완결이후, 용매는 진공하에 제거하고, 생성된 중합체는 에테르로 침전시켰다.
방법 Ⅱ: 디숙시니미딜 숙시네이트 폴리에틸렌 글리콜의 활용
1-아다만탄메틸아민(0.1 g, 0.60 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)은 10 ㎖ 디클로로메탄에 용해된 디숙시니미딜 숙시네이트 폴리에틸렌 글리콜(PEG3400-(SS)2)( SunBio, Inc., 980-5 Kwan-yang Dong, Anyang City, S. Korea)(0.30 mmol)에 첨가하였다. 생성된 용액은 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 용매는 진공하에 증발시키고, 생성된 중합체는 에테르로 침전시켰다,
실시예 11
트리아다만탄 가교링커의 합성:
1-아다만탄메틸아민(0.212 g, 1.29 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)은 10 ㎖ 무수성 디메틸포름아마이드(Aldrich, Milwaukee, WI)에 용해된 Tris-숙시니미딜 아미노트리아세테이트(TSAT)(0.2 g, 0.41 mmol, Pierce, Rockford, IL)에 첨가하였다. 생성된 혼합물은 아르곤하에 실온에서 14시간동안 교반하였다. 침전물은 여과하고 질량 분광법으로 특성화시켰다. 이온화: 633.4[M+H]+, 655.6[M+Na]+, 1265.3 [2M+H]+, 1287.1[2M+Na]+.
실시예 12
테트라아다만탄 가교링커의 합성:
1-아다만탄메틸아민(0.212 g, 1.29 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)은 5 ㎖ 무수성 디메틸포름아마이드(Aldrich, Milwaukee, WI)에 용해된 테트라키스-(N-숙시니미딜카복시프로필)펜타에리트리톨(NES-4)(0.1 g, 0.12 mmol, Molecular Biosciences, Boulder, CO)에 첨가하였다. 생성된 혼합물은 아르곤하에 실온에서 14시간동안 교반하였다. 침전물은 여과하고 질량 분광법으로 특성화시켰다: 전자분무 이온화(electrospray ionization): 1013.7 [M+H]+, 1035.8[M+Na]+.
실시예 13
테트라-아다만탄 폴리에틸렌 글리콜 가교링커의 합성:
방법 I: 펜타에리트리톨 에톡실레이트(15/4 EO/OH)의 활용
펜타에리트리톨 에톡실레이트(15/4 EO/OH)(Mn = 797)(1 mmol, Aldrich, Milwaukee, WD)는 진공하에 70℃에서 하룻밤동안 가열하여 건조시켰다. 1-아다만틸 이소시아네이트(4.4 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)는 무수성 디클로로메탄(25 ㎖)에 용해시킨 이후, 건조된 중합체에 첨가하였다. 이후, 2가지 촉매, 디부틸틴 디라우레이트(0.1 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)와 트리에틸아민(0.1 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 환류하에 7시간동안 가열하였다. 용매의 제거이후, 반응 산물은 증류수에 용해시켰다. 수용액은 활성화 탄소의 첨가 및 연속 여과로 정제하고, 이후 냉동 건조시켰다.
방법 Ⅱ: 4 분지(arm) PEG의 활용
4 분지 PEG(Mn = 10000)(Immol, Shearwater Polymers, Inc, Huntsville, AL)은 진공하에 70℃에서 하룻밤동안 가열하여 건조시켰다. 1-아다만틸 이소시아네이트(4.4 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)는 무수성 디클로로메탄(25 ㎖)에 용해시킨 이후, 건조된 중합체에 첨가하였다. 이후, 2가지 촉매, 디부틸틴 디라우레이트(0.1 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)와 트리에틸아민(0.1 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 환류하에 7시간동안 가열하였다. 용매의 제거이후, 반응 산물은 증류수에 용해시켰다. 수용액은 활성화 탄소의 첨가 및 연속 여과로 정제하고, 이후 냉동 건조시켰다.
실시예 14
가수분해성 테트라-아다만탄 폴리에틸렌 글리콜 가교링커의 합성:
방법 I: 펜타에리트리톨 에톡실레이트(15/4 EO/OH)의 활용
펜타에리트리톨 에톡실레이트(15/4 EO/OH)(Mn = 797)(1 mmol, Aldrich, Milwaukee, WD)는 진공하에 70℃에서 하룻밤동안 가열하여 건조시켰다. 1-아다만탄아세트산(4.4 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)은 무수성 톨루엔에 용해시킨 이후, 건조된 중합체에 첨가하였다. 이후, p-톨루엔설폰산(Aldrich, Milwaukee, WI)을 촉매량으로 첨가하였다. 생성된 혼합물은 Dean-Stark 장치를 이용하여 16시간동안 공비 환류시켰다. 반응의 완결이후, 용매는 진공하에 제거하고, 생성된 중합체는 에테르로 침전시켰다.
방법 Ⅱ: 4 분지 PEG의 활용
4 분지 PEG(Mn = 10000)(1 mmol, Shearwater Polymers, Inc, Huntsville, AL)은 진공하에 70℃에서 하룻밤동안 가열하여 건조시켰다. 1-아다만탄아세트산(4.4 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)은 무수성 톨루엔에 용해시킨 이후, 건조된 중합체에 첨가하였다. 이후, p-톨루엔설폰산(Aldrich, Milwaukee, WI)을 촉매량으로 첨가하였다. 생성된 혼합물은 Dean-Stark 장치를 이용하여 16시간동안 공비 환류시켰다. 반응의 완결이후, 용매는 진공하에 제거하고, 생성된 중합체는 에테르로 침전시켰다.
방법 Ⅲ: 4-분지 PEG-숙시니미딜 숙시네이트(PEG-SS)4의 활용
1-아다만탄메틸아민(0.069 g, 0.44 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)은 10 ㎖ 디클로로메탄에 앞서 용해된 1 g 디숙시니미딜 숙시네이트 폴리에틸렌 글리콜((PEG1Ok-SS)4)(SunBio, Inc., 980-5 Kwan-yang Dong, Anyang City, S. Korea)(0.1 mmol)에 첨가하였다. 생성된 용액은 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 용매는 진공하에 증발시키고, 생성된 중합체는 에테르로 침전시켰다.
실시예 15
옥타-아다만탄 폴리에틸렌 글리콜 가교링커의 합성:
8 분지 PEG(Mn = 10000)(1 mmol, Shearwater Polymers, Inc, Huntsville, AL)은 진공하에 70℃에서 하룻밤동안 가열하여 건조시켰다. 1-아다만틸 이소시아네이트(4.4 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)는 무수성 디클로로메탄(25 ㎖)에 용해시킨 이후, 건조된 중합체에 첨가하였다. 이후, 2가지 촉매, 디부틸틴 디라우레이트(0.1 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)와 트리에틸아민(0.1 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 환류하에 7시간동안 가열하였다. 용매의 제거이후, 반응 산물은 증류수에 용해시켰다. 수용액은 활성화 탄소의 첨가 및 연속 여과로 정제하고, 이후 냉동 건조시켰다.
실시예 16
가수분해성 옥타-아다만탄 폴리에틸렌 글리콜 가교링커의 합성:
8 분지 PEG(Mn = 10000)(1 mmol, Shearwater Polymers, Inc, Huntsville, AL)은 진공하에 70℃에서 하룻밤동안 가열하여 건조시켰다. 1-아다만탄아세트산(4.4 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI)은 무수성 톨루엔에 용해시킨 이후, 건조된 중합체에 첨가하였다. 이후, p-톨루엔설폰산(Aldrich, Milwaukee, WI)을 촉매량으로 첨가하였다. 생성된 혼합물은 Dean-Stark 장치를 이용하여 16시간동안 공비 환류시켰다. 반응의 완결이후, 용매는 진공하에 제거하고, 생성된 중합체는 에테르로 침전시켰다.
실시예 17
다중 아다만탄 가교링커의 합성.
방법 I: 가지형 PEI의 활용
1-아다만탄아세트산(Aldrich, Milwaukee, WI)은 MES 완충액 25 mM, pH 6.5에 용해된 PEI(Aldrich, Milwaukee, WI)에 첨가하였다. 이후, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)(Aldrich, Milwaukee,WI)와 N-하이드록시숙시니미드(NHS)(Aldrich, Milwaukee, WI)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물은 실온에서 24시간동안 교반하고, 이후 10000 MWCO Spectra/Por 막에 이전하고 24시간동안 물에 투석하였다. 용액은 냉동 건조시켰다.
방법 Ⅱ: 풀루란(pullulan)의 활용(Akiyoshi et al. 1993, Macromolecules 26:3062-3068)
1-아다만틸 이소시아네이트(Aldrich, Milwaukee, WI)는 피리딘을 함유하는 무수성 DMSO에 녹인 풀루안(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI)과 80℃에서 8시간동안 반응시켰다. 에탄올을 반응 혼합물에 첨가하고, 생성된 혼합물은 4℃에서 하룻밤동안 보관하였다. 침전물은 분리하고 물에 투석으로 정제하며 냉동 건조시켰다. 아다만탄 기에서 치환의 정도는 1H NMR로 측정하였다.
실시예 18
가수분해성 다중 아다만탄 가교링커의 합성(Sunamoto et al. 1992, Macromolecules 25:5665-5670)
풀루안(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI)은 60℃에서 무수성 DMF에 용해시켰다. 무수성 DMF에 용해된 1-아다만탄카르보닐 클로라이드(Aldrich, Milwaukee, WI) 및 무수성 피리딘을 첨가하였다. 생성된 혼합물은 60℃에서 2시간동안, 실온에서 1시간동안 교반하였다. 혼합물은 에탄올에 부어 넣었다. 침전물은 수집하고 에탄올과 디에 K 에테르로 순차적으로 세척하였다. 고체는 진공하에 50℃에서 2시간동안 건조시켰다. 아다만탄 기에서 치환의 정도는 1H NMR로 측정하였다.
실시예 19
자가-가교결합된 중합체의 합성:
사이클로덱스트린과 아다만탄 기능기를 보유하는 중합체의 합성은 3단계로 진행된다.
단계 I: 단량체 6 A ,6 D -비스-(2-아미노-2-카복실에틸티오)-6 A ,6 D -디데옥시-β-사이클로덱스트린,(CD-BisCys)의 합성
167 ㎖의 0.1 M 소디움 카보네이트 완충액은 자성 교반 막대, 응축기, 격벽이 구비된 500 ㎖ 2-목 둥근 바닥 플라스크에서 45분동안 탈기시켰다. 상기 용액에 1.96 g(16.2 mmol) L-시스테인과 10.0 g(73.8 mmol) 디-요오드-β-사이클로덱스트린(Gonzalez et al. 1999 Bioconjugate Chem. 10: 1068-1074; Hwang et al. 2001 Bioconjugate Chem. 12(2): 280-290; Gonzalez, H., Hwang, S.J., and Davis, M.E.(2000) Linear Cyclodextrin Copolymers W0001734A1)을 첨가하였다. 생성된 현탁액은 용액이 투명한 무색으로 변할 때까지 환류 온도에서 4.5시간동안 가열하였다. 이후, 실온으로 냉각하고 1 N HCl을 이용하여 pH 3으로 산성화시켰다. 산물은 아세톤의 완만한 첨가(용액의 3배 중량 비율)로 분쇄하여 9.0 g(90.0% 수율) CD-BisCys를 수득하였다. 생성된 고체는 0-0.4 M 중탄산암모늄 용액의 구배 용리를 이용한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 실시하였다. ESl/MS(mlz): 1342[M]+, 1364[M+Na]+. CD-BisCys의 순도는 HPLC로 확인하였다.
단계 Ⅱ: CD-BisCys-PEG3400 공중합체의 합성
CD-BisCys(2 g, 1.49 mmol)와 SPA-PEG3400-SPA(5.07 g, 1.49 mmol, Shearwater Inc.)는 건성 DMSO(40 ㎖)에 용해시켰다. 10분후, 디이소프로필에틸아민(DIEA, 0.571 ㎖, 2.2 eq, Aldrich)을 아르곤하에 첨가하였다. 반응 혼합물은 아르곤하에 2-6일동안 교반하였다. 점도 증가는 중합화 시간의 함수로서 관찰하였다. 활발하게 교반하면서 물(200 ㎖)을 중합화 용액에 첨가하였다. 이후, 용액은 25,000 MWCO Spectra/Por 7 막에서 2.5일동안 ca. 10 ㎎ 중합체/㎖ 물의 농도로 투석하였다. 냉동 건조이후, 백색의 솜털 분말(6.2 g, 92% 수율)을 수득하였다.
특성화: 광 산란과 분자량 측정
특이 굴절지수 증가(specific refractive index increment), dn/dc는 Bausch & Lomb ABBE-3L 굴절지수를 이용하여 인산염 완충액 1x(PBS)(Cellgro, Mediatech, Inc, Herndon, VA)에서 측정하였다. 이후, 중합체 샘플은 ERC-7512 RI 감지기, Precision Detectors PD2020/DLS 정적 광 산란(static light scattering) 감지기 및 0.7 ㎖/min 유속에서 인산염 완충액 1x를 용리액으로 하는 PL 아쿠아겔-OH 30(Polymer Laboratories, Amherst, MA) 칼럼이 구비된 Hitachi D6000 HPLC 장치에서 분석하였다. dn/dc는 0.1348로, 중량 평균 분자량 Mw는 103,500 Da로, 다분산 지수 Mw/Mn은 1.71로 산정되었다.
단계 Ⅲ. CD-BisCys-PEG 3400 공중합체에 아다만탄 공액
CD-BisCys-PEG3400 공중합체(0.32 mmol의 반복 단위)는 건성 DMSO에 용해시키고 10분동안 교반하였다. 1-아다만탄메틸아민(0.76 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI), DIEA(0.76 mmol), EDC(0.96 mmol), NHS(0.71 mmol)을 중합체 용액에 첨가하였다. 혼합물은 대략 16시간동안 교반하였다. 생성된 혼합물에 물을 첨가하여 과량의 1-아다만탄메틸아민을 제거하였다. 침전물의 여과이후, 용액은 10,000 MWCO Spectra/Por 막을 이용하여 48시간동안 물에 투석하고 냉동 건조시켰다. 아다만탄 기의 치환 정도는 1H NMR로 측정하였다.
실시예 20
RGD-변형된 아다만탄-PEG 유도체의 합성
단계 I: VS-PEG 5000 -AD(2)의 합성
비닐설폰-PEG5000-NHS(1)(Shearwater Polymers, 0.147 mmol)은 교반 막대가 구비된 둥근 바닥 플라스크에 첨가하고 5 ㎖ DMSO에 용해시켰다. 여기에 아다만탄메틸아민(Aldrich, 0.147 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액은 실온에서 1시간동안 교반하였다. 생성된 혼합물은 3500 MWCO 막(Spectra Por)에 하룻밤동안 투석하였다. 이후, 용액은 냉동 건조시켜 비닐설폰-PEG5000-AD(2)를 수득하였다.
단계 Ⅱ: RGDpep-PEG-AD 공액체 합성
Kok et al.(Bioconjugate Chemistry(2002), 13(1), 128-135)에 기술된 바와 같이 합성된 RGDpep-SH는 PBS(인산염 완충액) 1x, pH 7.2에 용해시켰다. 이후, 비닐설폰-PEG5000-AD(2)을 RGDpep-SH 용액에 첨가하였다. 생성된 용액은 실온에서 2시간동안 교반하였다. 중합체 용액은 Spectra/Por 7 MWCO 3500 막(Spectrum, Houston, TX)에 이전하고 24시간동안 물에 투석하였다. 이후, 용액은 냉동 건조시켜 RGDpep-PEG5000-AD(3)을 수득하였다.
실시예 21
재료의 준비:
내포 호스트(inclusion host)를 보유하는 중합체(실시예 1-6)는 PBS(인산염 완충액) 1x, pH 7.2에서 100 ㎎/㎖로 용해시켰다. 이후, 가교링커(실시예 7-8)(비율: 아다만탄/사이클로덱스트린: 1/1 또는 1/2)를 첨가하였다. 생성된 혼합물은 활발하게 혼합하여 가교링커 용액을 수득하였다. 점도에서 증가는 대략 10분 이내에 관찰되었다.
실시예 22
이온형 재료의 준비:
다가 이온의 활용
내포 호스트와 카르복실기를 보유하는 중합체(참조: 실시예 19, 단계 Ⅱ)는 0.1 M CaCl2 수용액에 100 ㎎/㎖로 용해시키고, 이후 가교링커(실시예 7-18)(비율: 아다만탄/사이클로덱스트린: 1/1 또는 1/2)의 혼합물을 포함하는 바이알에 첨가하였다. 생성된 혼합물은 활발하게 혼합하여 가교링커와 디아미노 화합물의 용액을 수득하였다. 점도에서 증가가 관찰되었다.
디아미노 화합물의 활용
내포 호스트와 카르복실기를 보유하는 중합체(참조: 실시예 19, 단계 Ⅱ)는 물에 100 ㎎/㎖로 용해시키고, 이후 가교링커(실시예 7-18)(비율: 아다만탄/사이클로덱스트린: 1/1 또는 1/2)의 혼합물 및 디아미노 화합물, 예를 들면, PEG3400-(NH2)2(Shearwater Polymers) 또는 CnH2n-(NH2)2(비율: NH2/COO-: 1/1 또는 1/2)를 포함하는 바이알에 첨가하였다. 생성된 혼합물은 활발하게 혼합하여 가교링커와 디아미노 화합물의 용액을 수득하였다. 점도에서 증가가 관찰되었다.
다가양이온의 활용
내포 호스트와 카르복실기를 보유하는 중합체(참조: 실시예 19, 단계 Ⅱ)는 물에 100 ㎎/㎖로 용해시키고, 이후 가교링커(실시예 7-18)(비율: 아다만탄/사이클로덱스트린: 1/1 또는 1/2)의 혼합물 및 다가양이온, 예를 들면, 폴리리신 또는 폴리에틸렌이민을 포함하는 바이알에 첨가하였다. 생성된 혼합물은 활발하게 혼합하여 가교링커와 다가양이온의 용액을 수득하였다. 점도에서 증가가 관찰되었다.
실시예 23
바이러스 또는 단백질을 함유하는 재료의 준비
내포 호스트를 보유하는 중합체(실시예 1-6)는 단백질 또는 바이러스를 함유하는 PBS(인산염 완충액) 1x, pH 7.2에 원하는 농도로 용해시켜 100 ㎎/㎖ 최종 농도의 중합체 용액을 수득하였다. 이후, 가교링커(실시예 7-18)(비율: 아다만탄/사이클로덱스트린: 1/1 또는 1/2)를 첨가하였다. 생성된 혼합물은 활발하게 혼합하여 가교링커 용액을 수득하였다. 점도에서 증가는 대략 10분 이내에 관찰되었다.
실시예 24
신호 펩티드를 함유하는 재료의 준비
내포 호스트를 보유하는 중합체(실시예 1-6)는 PBS(인산염 완충액) 1x, pH 7.2(필요한 경우, 단백질, 바이러스, 또는 다른 약물이나 약물 전달 시스템을 함유하는)에 원하는 농도로 용해시켜 100 ㎎/㎖ 최종 농도의 중합체 용액을 수득하였다. 이후, 가교링커(실시예 7-18)(비율: 아다만탄/사이클로덱스트린: 1/2) 및 신호 펩티드(실시예 20)(비율: 아다만탄/사이클로덱스트린: 1/2)를 첨가하였다. 생성된 혼합물은 활발하게 혼합하여 가교링커 용액을 수득하였다. 점도에서 증가는 대략 10분 이내에 관찰되었다.
실시예 25
매트릭스를 통한 세포 이동성에 관한 연구
a. 매트릭스(0.2 ㎖, CD-PEG3400과 비스-(2(1-아다만틸)에틸)포스페이트로 구성됨)는 실시예 21에 기술된 바와 같이 제조하고 FluoroBlok 삽입물(24 웰 양식의 경우, Falcon Catalog #351152)의 바닥에 첨가하였다.
b. CCD 세포는 PBS로 씻어내고 15-30분동안 5 μM의 Calcein-AM(형광 마커)에 노출시켰다.
c. CCD 세포는 트립신 처리하고 0.5 ㎖ 배지에 담긴 삽입물에서 매트릭스의 상부에 10,000 세포/삽입물로 도말하였다.
d. 10 ng/㎖ 인간 PDGF를 함유하는 1 ㎖ 배지를 하부 챔버에 첨가하였다.
e. 매트릭스를 통한 하부 챔버로의 세포 이동성은 형광 검경으로 3일동안 모니터하였다. 매트릭스를 통한 삽입물로의 성공적인 이동은 도 5에 도시된 바와 같이 도말이후 72시 시점에 형광 검경으로 관찰된 하부 챔버에서 세포의 존재로 확인하였다.
실시예 26
매트릭스로 제조된 CD-PEI 폴리플렉스(polyplex)로 CCD 섬유아세포에 대한 트랜스펙션 연구
24-웰 평판에서 웰 바닥은 아래와 같이 ~0.2 ㎖ 코팅하였다:
a. 코팅없음(대조)
b. 매트릭스
c. 1 ㎍ 루시페라제 유전자-포함 플라스미드를 함유하는 매트릭스
d. CDP 폴리플렉스를 함유하는 매트릭스
e. CDPEI 폴리플렉스를 함유하는 매트릭스
f. 코팅없음. 유리 CDPEI 폴리플렉스(양성 대조 I: 전통적인 트랜스펙션 절차)
g. 코팅없음. 유리 CDP 폴리플렉스(양성 대조 Ⅱ: 전통적인 트랜스펙션 절차)
CCD(섬유아세포, ATCC)는 24 웰 평판에 40,000 세포/웰로 도말하였다. 세포 도말이후 24시 시점에, 배지는 제거하고, 세포는 PBS로 씻어내고 용해시켰다. 세포 용해질은 루시페라제 분석법을 이용하여 루시페라제 단백질 활성을 분석하였다. 결과는 RLU/웰로 보고한다. 본 실험은 세포가 매트릭스로 성공적으로 이동할 수 있고 매트릭스에 포함된 폴리플렉스에 의해 트랜스펙션될 수 있음을 입증한다. 트랜스펙션 효율은 배지에서 자유로운 폴리플렉스에 의한 트랜스펙션 효율보다 약간 낮다.
주의: 매트릭스는 디아다만탄 가교링커(비스-(2(1-아다만틸)에틸)포스페이트, 참조: 실시예 7의 합성 절차)로 가교결합된 CD-PEG(참조: 실시예 3의 합성 과정에서 방법 Ⅱ)로 구성된다. 매트릭스 제조는 실시예 21에 기술한다. 폴리플렉스가 중합체에 포함되는 경우에, 폴리플렉스는 최적 전하 비율로 10 ㎕ 중합체 용액에 10 ㎕ 루시페라제 유전자-포함 플라스미드(0.1 ㎎/㎖) 용액를 첨가하여 제조한다. 폴리플렉스는 매트릭스의 CD-PEG 성분을 용해시키는데 사용되는 완충액에 포함되고, 매트릭스는 실시예 21에 기술된 바와 같이 제조된다.
양성 대조 실험을 위하여, 상기한 바와 같이 폴리플렉스를 제조하고, 이를 세포 배지에 직접 첨가하였다.
실시예 27
재료는 도 1에 개략적으로 도시된 바와 같이, 사이클로덱스트린(CD)-함유 중합체(A) 및 사이클로덱스트린-함유 중합체와 내포 복합체(inclusion complex)를 형성할 수 있는 분자로 종결된 이중 또는 다중-기능성 링커(B)의 자가-어셈블리로 제조할 수 있다. 재료(P)는 단백질, 세포, 바이러스, 폴리플렉스, 또는 다른 치료제 또는 치료제를 함유하는 전달 시스템을 포함하도록 제조할 수 있다.
전형적인 링커는 Breslow and Zhang, JACS(1996), 118, 8495-8496; Zhang and Breslow, JACS(1993), 115, 9353에 기술된 프로토콜에 따라 제조할 수 있다. 당업자는 당분야에 공지된 기술에 기초하여, 이런 프로토콜을 용이하게 수정함으로써 연결 분자로서 기능할 수 있는 여러 상이한 링커를 획득할 수 있다. 이중기능성 링커 또는 사이클로덱스트린-함유 중합체는 치료제의 방출 및/또는 재료의 분해를 조장하는 생체분해성 링커를 보유할 수 있다.
이런 재료의 치료 유용성을 증가시키는 화합물, 예를 들면, 신호 펩티드 또는 세포 이동을 조장하는 다른 부분은 도 2에 도시된 바와 같이 내포 복합체 게스트를 목적 존재에 공액하고 공액체를 재료에 포함시킴으로써 재료에 통합시킬 수 있다. 상기 공액체는 가교결합 과정 이전에, 동안에 또는 이후에 포함된다.
가령, 상기 화학식을 보유하는 반복 아단위로 구성된 중합체, 예를 들면, 대략 4800 Mw의 단량체는 PBS(인산염 완충액) 1x, pH 7.2에서 100 ㎎/㎖로 중합체 용액으로서 제조될 수 있다. 혼합물을 원심분리하고, 이후 용액을 교반하여 중합체를 용해시키는 것이 바람직하다.
디클로로메탄에서 132 ㎎/㎖로 용해된 연결 분자 용액의 33.3 ㎕ 분량은 바이알에 위치시켜 실온에서 또는 37℃ 오븐에서 디클로로메탄이 증발되도록 한다. 이후, 1 ㎖ 중합체 용액은 잔류 링커에 첨가하고, 선택적으로 용해를 조장하기 위하여 분쇄할 수 있다. 그 다음, 용액은 일정한 기간, 예를 들면, 10분동안 휴지시켜 점성이 되게 한다. 외래 물질, 예를 들면, 치료제 또는 바이러스 입자를 포함시키기 위하여, 물질은 최종 휴지기에 앞서 용액으로 존재할 수 있다. 가령, 물질은 사이클로덱스트린 중합체를 용해시키는데 사용되는 용매 또는 연결 분자의 최초 용액에 존재하거나, 또는 가교결합 반응에 앞서 구성요소 또는 최종 용액에 첨가될 수 있다.
실시예 28
재료와 방법
매트릭스 1(실시예 3, 방법 Ⅱ에 따라 제조된 60 kD 중합체 및 실시예 9, 방법 Ⅱ에 따라 제조된 가교결합제) 및 매트릭스 2(실시예 3, 방법 Ⅱ에 따라 제조된 80 kD 중합체 및 실시예 9, 방법 Ⅱ에 따라 제조된 가교결합제)를 사용하였다.
생체내에서 6OkD 매트릭스의 적용
300 ㎕의 60 kD 매트릭스는 1 ㏄ 주사기에 집어넣고, 주사기 플런저를 위아래로 이동시켜 모든 기포를 제거하였다. 23G 바늘은 매트릭스가 통과할 수 있을 만큼 충분히 컸지만 약간의 압력이 요구되었다. 2OG 바늘은 매트릭스가 쉽게 통과할 수 있을 만큼 충분히 컸다.
수컷 Sprague-Dawley 쥐는 희생시키고 털을 제거하며 등쪽에 8 ㎜ 상처를 발생시켰다. 20G 바늘이 달린 1 ㏄ 주사기를 이용하여, 100 ㎕ 부피가 남을 때까지 과량의 60 kD 매트릭스를 제거하였다. 이후, 매트릭스는 넘치지 않게 8 ㎜ 상처 부이에 적용하였다. 150 ㎕ 매트릭스 1을 제외하고 동일한 과정을 실시하였는데, 이는 쥐의 등쪽 피부에서 8 ㎜ 상처 부위에 넘칠 정도로 가득하였다.
매트릭스의 절개된 상처 부위로의 적용가능성을 탐구하였다. 쥐의 등에 대략 2 인치 길이의 전층 절개를 발생시켰다. 주사기는 200 ㎕의 60 kD 매트릭스로 충전시키고 2OG 바늘을 이용하여 절개 부위에 피내 주사하였다.
8OkD 매트릭스의 적용
쥐의 등에 2개의 8 ㎜ 전층 피부 펀치(punch)를 발생시켰다. 한쪽 펀치는 1 ㏄ 주사기와 20G 바늘을 이용하여 100 ㎕의 80 kD 매트릭스로 처리하였다. 상기 부피는 펀치를 균등하게 채웠다; 하지만, 60 kD 매트릭스에 비하여 80 kD를 전달하는데 더 많은 압력이 요구되었다. 150 ㎕의 80 kD 매트릭스는 8 ㎜ 피부 펀치에 넘칠 정도로 가득하였다. 200 ㎕의 80 kD 매트릭스는 주사를 완결하는데 실질적인 힘이 필요하긴 하지만 피내 주사에 의해 성공적으로 전달되었다.
실시예 29
디아다만탄-PEG(36.5 ㎎/㎖)(실시예 9, 방법 Ⅱ)와의 가교결합 이전과 이후에 CD-PEG3400 매트릭스(100 ㎎/㎖)(실시예 3, 방법 Ⅱ)의 최초 유동학적 데이트를 획득하기 위한 연구를 실시하였다. 이들 데이터는 전임상 모델 개발에 사용되는 표준 제형중 한가지인 2.4 ㎎/㎖의 콜라겐 매트릭스와 비교하였다.
결과
첫 번째 일련의 실험은 가교링커가 없는 100 ㎎/㎖에서 CD-PEG3400 중합체로 실시하였다. 다양한 일정 변형률(constant strain)에서 진동수 쓸기(frequency sweep)를 실시하였다.
도 7에서는 37℃에서 진동수 쓸기를 보여준다. G"는 G'보다 크고, 대략 3.2의 tanδ을 유도한다. 예상된 바와 같이, 상기 중합체 용액은 거의 점성을 보인다. 이는 진동수의 함수로서 G'의 기울기에 의해 확증된다. 순전한 점성 유체에서는 2의 이론적 기울기가 예상되는 반면, 순전한 탄성 유체에서는 특정 진동수 범위에서 0의 기울기가 예상된다. 구조적 수준에서, 이들 결과의 해석은 중합체 분자가 일종의 약한 상호작용에 의해 서로 상호작용한다는 것이다. 재료에 가해지는 에너지는 상호작용의 중심점의 이동(회전, 얽힘)으로 분자에 의해 탄성적으로 저장될 수 있다. 이런 에너지의 대부분은 열로 방출된다. 이런 중합체 용액의 측정된 복합 점성도(complex viscosity)는 10.0 rad/s에서 0.27 Pa이었다.
도 8에서는 20℃에서 동일 재료를 보여준다. 10 rad/s에서 점성도가 1.46 Pa로 증가하였다. 상기 수치는 37℃에서 점성보다 대략 7-배 높다.
도 9에서는 36.5 ㎎/㎖ 디-아다만탄-PEG로 가교결합된 CD-PEG3400 중합체에 대한 진동수 쓸기를 보여준다. 가교링커의 첨가는 매트릭스의 점성도를 대략 33.1 Pa로 100배 이상 증가시켰다. 이와 동시에, tanδ은 1.2로 대략 3배 감소하고, G' 기울기는 0.58로 감소하였다. 이들 결과는 탄성에서 증가와 일치한다. 구조적으로, 이런 재료 내에서 중합체의 움직임은 구속되고, 가해진 에너지는 네트워크 포인트 사이에 더욱 한정된 방식으로 저장될 수 있다. 이런 성질은 가라앉은 물체를 표면으로부터 끌어올릴 때 가교결합된 매트릭스가 긴 가닥을 형성하는 경향을 갖는다는 관찰 결과에 의해 더욱 확증된다. 전체적으로, 점성력이 여전히 우세하다(tan δ>1)(참조: 도 11).
도 10에서는 20℃에서 가교결합된 중합체를 보여준다. 점성도는 대략 50 Pa로 더욱 증가하지만, 모든 다른 특징은 동일하게 유지되었다.
비교를 위하여, 도 11에서는 2.4 ㎎/㎖에서 콜라겐 매트릭스에 대한 진동수 쓸기를 보여준다. 설정된 상태(즉, 37℃)에서 콜라겐 매트릭스는 0.14의 낮은 tanδ와 0.07의 G' 기울기로 전형적인 겔 성질을 보인다. 구조적으로, 이는 영구적이고 정연하게 배열된 네트워크의 지표이다. 가해진 에너지는 네트워크 중심점 사이에 한정적으로 저장될 수 있고 대부분은 반향된다. 상기 재료의 복합 점성도는 12.8 Pa이었다.
실시예 30
시험관내 생체적합성 실험
방법:
실시예 3, 방법 Ⅱ에 따라 제조된 58 kD 사이클로덱스트린(CD) 중합체 및 실시예 9, 방법 Ⅱ에 따른 가교결합제를 이용하여 매트릭스를 제조하였다. 매트릭스의 제조 직후에, pEGFP DNA 또는 GFCB 바이러스를 상기 매트릭스와 혼합하였다. 저용량과 고용량의 DNA 또는 바이러스를 모두 제조하였다. 다양한 처리군은 표 2에 기재한다. 58 kD 사이클로덱스트린 매트릭스의 최종 농도는 모든 군에서 100 ㎎/㎖이었다. 대략 100 ㎕의 각 개별 반응물은 48-웰 평편 바닥 평판에 피펫으로 계량하였다. 각 군은 이중으로 검사하였다. 검사 제제를 함유하는 48-웰 평판은 대략 30분동안 실온에 설정하였다. 2.5 x 104 CCD-1074sk 세포(인간 피부 섬유아세포)는 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 200 ㎕ 부피의 DMEM 배지에 담긴 가교-결합된 매트릭스 제제의 상부에 위치시켰다. CCD-1074sk 세포주는 트립탄 블루 염색을 통한 세포 계수(cell counting)의 시점에서 95% 초과의 세포 생존능으로 대략 70% 합류 수준이었다. 1-8 군을 포함하는 각 웰은 역상 현미경(inverted microscope)하에 세포 생존능과 GFP 형광 신호를 매일 검사하였다. 실험의 시작이후 4일과 8일 시점에 200 ㎕의 새로운 배지를 각 웰에 첨가하였다(교체하지 않음). 평판은 37℃, 5% C02에서 배양하였다.
CD-lPEI의 합성
선형 PEI25,000(500 ㎎, Polysciences, Inc.)과 6-모노토실-β-사이클로덱스트린(3.868 g, Cyclodextrin Technologies Development, Inc.)은 36 ㎖ DMSO에 용해시켰다. 생성된 혼합물은 70℃에서 6일동안 교반하였다. 용액은 연한 황색으로 변하였다. 이후, 용액은 Spectra/Por MWCO 10,000 막에 이전하고 6일동안 물에 투석하였다. 그 다음, 냉동 건조로 수분을 제거하여 연한 유색 고체를 수득하였다. 사이클로덱스트린/PEI 비율은 1H NMR의 양성자 통합에 기초하여 산정하였다:(Varian 300 MHz, D20) δ 5.08 ppm(s br., CD의 C1H), 3.3-4.1 ppm(m br. CD의 C2HC6H), 2.5-3.2 ppm(m br. PEI의 CH2).
β사이클로덱스트린 중합체(CDP-이미다졸).
βCDP는 기존 문헌에 기술된 절차에 따라 합성하였다(Gonzalez, H., Hwang, S. & Davis, M.(1999) Bioconjugate Chem. 10,1068-74). 이미다졸은 중합체의 말단에서 일차 아민을 4-이미다졸아세트산(Aldrich, St. Louis, MO)으로 아미드화시켜 βCDP 중합체에 공액시켰다(Sehgal, D. & Vijay, I.(1994) Anal Biochem. 218, 87-91). 전형적인 실험에서, 200 ㎎(33.3 μmol) βCDP는 800 ㎕의 25 mM MES(pH 6.5) 완충액에 용해시키고, 여기에 4-이미다졸아세트산, 나트륨염 수화물(49.3 ㎎, 0.333 mmol)을 첨가하였다. 상기 용액을 이용하여 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC)(0.128 g, 0.666 mmol)를 첨가하였다. 이후, 200 ㎕의 25 mM MES(pH 6.5) 완충액에 용해된 N-하이드록시숙시니미드(NHS)(3.83 ㎎, 33.3 μmol)를 중합체 용액에 즉시 첨가하였다. 생성된 용액은 실온에서 24시간동안 교반하고 Spectra Por 막 MWCO 1000을 이용하여 물에 투석하였다. 용액은 냉동 건조시켰다. 이미다졸 함량은 TNBS 분석법(Hermanson, G. T.(1996) Bioconjugate Techniques, pp. 132, Academic Press, Rockford, IL), 이후 반응하지 않은 중합체 말단기의 양을 정량하는 UV 측정으로 결정하였다. 이미다졸 공액은 73%이었다.
표 2
처리군/웰(48-웰 평편 바닥 평판)
군 처리
1 58 kD 사이클로덱스트린에서 0.25 ㎎/㎖ pEGFP + CDP-이미다졸
2 58 kD 사이클로덱스트린에서 0.025 ㎎/㎖ pEGFP + CDP-이미다졸
3 58 kD 사이클로덱스트린에서 0.25 ㎎/㎖ pEGFP + CD-lPEI
4 58 kD 사이클로덱스트린에서 0.025 ㎎/㎖ pEGFP + CD-lPEI
5 58 kD 사이클로덱스트린1 x 1010 P/㎖ GFCB
6 58 kD 사이클로덱스트린1 x 109 P/㎖ GFCB
7 빈 대조(세포 단독)
8 58 kD 사이클로덱스트린 매트릭스 단독 대조
결과:
1일: 1-4 군은 사멸하기 시작하였다. 이들은 평판에서 소멸되기 시작하였다. CCD-1074sk 세포는 형태적으로 둥글게 뭉쳐있고 표류하였다. 5-8 군은 건강해 보였다. 이들 세포는 평판에 부착되었고 형태적으로 “뻗어있었다”(섬유아세포의 전형적인 상태); 하지만, 이 시점에서 이들 군 모두 GFP 발현을 보이지 않았다.
2일: 5-8 군은 건강해 보였다. CCD-1074sk 세포는 평판에 부착되고 “뻗어있었다.” 5-6 군(GFCB 군)은 GFP 발현에 양성이었다. 고용량의 GFCB(5 군)는 저용량 GFCB(6 군)보다 높은 GFP 발현을 보였다. 1, 3, 4 군은 이 시점에서 완전히 사멸한 것으로 보였다; 하지만, 2 군(58 kD 사이클로덱스트린에서 0.025 ㎎/㎖ pEGFP + CDP-이미다졸)에서는 한 쌍의 세포가 생존하였다. 1-4 군에서 GFP 발현은 감지되지 않았다.
4일: 1-4 군에서 CCD-1074sk 세포는 사멸한 것으로 보였다. 세포는 표류하였다. 이들 군에서 GFP 발현은 감지되지 않았다. 5-8 군은 건강하였다. 5-6 군은 GFP 발현에 양성이었고, 발현은 2일에서보다 오히려 명백하게 나타났다.
5일: 1-4 군에서 CCD-1074sk 세포는 사멸하였고, GFP 발현은 관찰되지 않았다. 5-8 군은 건강하였다. 5-6 군은 GFP 발현에 양성이었고, 발현 수준은 전일보다 명백하게 나타났다.
6일: 1-4 군에서 CCD-1074sk 세포는 사멸하였고, GFP 발현은 관찰되지 않았다. 세포는 더 이상 모니터되지 않았다. 5-8 군은 건강하였다. 5-6 군은 GFP를 여전히 발현하고, 발현 수준은 전일보다 더욱 명백하게 나타났다.
8일: 5-8 군에서 CCD-1074sk 세포는 여전히 건강하게 보였다. 형태적으로, 이들 세포는 6일에서와 별다른 차이가 없었다. 이들 세포는 GFP를 여전히 발현하고 가장 명백한 강도로 나타났다.
12일: 5-8 군에서 CCD-1074sk 세포는 건강하였다. 세포 총수는 8일보다 약간 더 많은 것으로 보였다; 하지만, GFP 발현이 감소하는 것으로 나타났다.
13일: 5-8 군에서 CCD-1074sk 세포는 건강해 보였지만, GFP 발현이 감소하기 시작하였다.
실시예 31
방법:
매트릭스 A와 매트릭스 B에 대한 구성요소는 Insert Therapeutics, Inc.로부터 서면 프로토콜에 따라 제조하였다. 매트릭스 A는 PBS, 7.2에서 4.4 ㎎/㎖ 디-아다만탄 화합물 가교링커(실시예 9, 방법 Ⅱ)를 함유하는 100 ㎎/㎖ β-사이클로덱스트린-PEG3400 중합체(실시예 3, 방법 Ⅱ)이었다. 이들 두 구성요소는 분량하고 사용 때까지 별도로 보관하였다. 매트릭스 B는 PBS, 7.2에서 36.5 ㎎/㎖ 디-아다만탄 PEG3400 화합물 가교링커를 함유하는 100 ㎎/㎖ β-사이클로덱스트린-PEG3400 중합체이었다. 이들 구성요소는 분량하고 사용 때까지 별도로 보관하였다.
3가지 상이한 전달 방법을 검사하였다:
1) 외과 드레싱(surgical dressing)을 이용한 매트릭스 A의 상처 부위로의 전달 및 외과 드레싱(surgical dressing)으로 커버링에 앞서 매트릭스 B의 상처 부위로의 전달:
1마리 ICR 생쥐는 케타민과 자일라진으로 마취시켰다. 등 부분은 털을 제거하고 2개의 8 ㎜ 피부 펀치를 발생시켰다. 50 ㎕의 매트릭스 A(최종 조정 농도)는 소량의 염료와 혼합하고, 이후 OpSite 드레싱의 작은 정사각형 조각에 위치시켰다. 매트릭스는 대략 2분동안 교질화시켰다. 이 시간동안, 생쥐에서 좌측 상처 펀치를 Mastisol 드레싱 접착제로 준비하였다. 이후, 혼성 매트릭스 A를 포함하는 OpSite 드레싱은 뒤집고(“점착” 부분이 아래쪽으로 가게 한다) 좌측 상처 부위에 위치시켰다. 우측 상처 펀치를 Mastisol 드레싱 접착제로 준비하였다. 소량의 염료를 함유하는 매트릭스 B 역시 50 ㎕의 최종 조정 부피로 구성되고 우측 상처 부위에 직접 위치시켰다. 이는 대략 2분동안 교질화시키고, 이후 OpSite 드레싱으로 감쌌다. 동물은 수술로부터 회복시키고 4일후 희생시켰다.
2) 미리 적용된 외과 드레싱을 통하여 사전-혼합된 매트릭스 A와 사전-혼합되지 않은 매트릭스 B의 상처 부위로의 전달:
1마리 ICR 생쥐는 케타민과 자일라진으로 마취시켰다. 등 부분은 털을 제거하고 2개의 8 ㎜ 피부 펀치를 발생시켰다. 2개의 상처 부위는 Mastisol 접착제로 준비하고 OpSite 드레싱의 단일 시트를 상처위에 위치시켰다. 소량의 염료를 함유하는 매트릭스 A를 50 ㎕ 전체 주사 부피로 제조하였다. 매트릭스는 1 ㏄ 주사기에 직접 집어넣고 23G 바늘을 주사기에 배치하였다. 대략 50 ㎕가 남을 때까지 과량의 매트릭스를 주사기로부터 제거하였다. 이후, 상기 재료는 OpSite 드레싱을 통하여 좌측 상처 부위에 주사하였다. 우측 상처 부위를 위하여, ~100 ㎕ 전체 주사 부피로 매트릭스 B를 제조하였다. 23G 바늘을 보유하는 1 ㏄ 주사기를 이용하여 대략 82 ㎕의 매트릭스 B를 흡입하였다. 이후, 작은 공기 주머니(air pocket)를 주사기로 흡입하였다. 대략 18 ㎕의 가교링커를 동일한 주사기 바늘에 흡입하였다. 다른 소형 공기 주머니를 주사기에 흡입하였다. 최종적으로, 소량(~2-4 ㎕)의 염료를 주사기에 흡입하였다. 드레싱을 통하여 27G 바늘을 우측 상처 부위의 한 단부에 위치시켜 감싸진 상처 부위로부터 공기를 배출시켰다. 매트릭스의 분리된 구성요소를 함유하고 23G 바늘을 보유한 주사기를 드레싱을 통하여 위치시키고(구성요소의 사전-혼합 없음) 재료를 상처 부위에 주사하였다. 27G 바늘은 주사기에 소형 공기 주머니의 배출구를 제공하였다. 동물은 수술로부터 회복시키고 4일후 희생시켰다.
3) 다양한 게이지 바늘을 이용한 매트릭스 A와 B의 PVA 스펀지로의 전달:
1마리 HSD 생쥐는 케타민과 자일라진으로 마취시키고, PVA 스펀지는 쥐의 배면에 피하 이식하였다. 상처 클립으로 절개 부위를 차단하고, 동물은 4일동안 회복시켰다. 염료(~2-4 ㎕)를 함유하는 매트릭스 A는 ~200 ㎕의 조정된 주사 부피로 제조하였다. 매트릭스 혼합물은 22G 바늘을 통하여 1 ㏄ 주사기로 흡입하고 주사기 내에서 혼합하였다. 과량의 기포를 제거하였다. 혼성 매트릭스는 희생된 동물에서 PVA 스펀지의 중심으로 주사하였다. 수분후, 상처 부위는 노출시키고 스펀지 부위를 검사하였다.
~200 ㎕ 주사용으로 소량의 염료를 함유하는 매트릭스 B를 제조하였다. 상기 매트릭스는 22G 바늘을 이용하여 1 ㏄ 주사기에 흡입하고, 이후 주사를 위하여 22G 바늘을 제거하고 좀더 짧은 23G 바늘로 교체하였다. 재료는 주사기에서 혼합하고, 과량의 기포를 제거하였다. 매트릭스는 PVA 스펀지 중심으로 주사하고 수분동안 이동하지 않도록 하며, 이후 주사된 스펀지의 검사를 위하여 동물을 노출시켰다.
결과:
1) 외과 드레싱을 이용한 매트릭스 A의 상처 부위로의 전달 및 외과 드레싱으로 커버링에 앞서 매트릭스 B의 상처 부위로의 전달:
50 ㎕ 매트릭스 A(최종 조정 부피)는 소량의 염료와 혼합하고 OpSite 드레싱의 작은 정사각형 조각에 위치시키며 짧은 시간(~2분)동안 교질화시키고, 이후 뒤집어 좌측 상처 부위에 위치시켰다. 수술 4일후 동물의 희생 시점에, 상처 부위는 건조한 것으로 나타났고, 동물은 어려움없이 매트릭스 A를 견디는 것으로 관찰되었다. 매트릭스는 전달 시점에서 최초 위치, 다시 말하면, 상처가 없는 주변의 일부 조직을 비롯한 상처 부위의 상부에 그대로 유지되었다. 상처 부위에 유지되었던 매트릭스는 표면적이었고 수술 시점보다 양이 적었다. 육안 검사에서 상처 부위에서 심한 염증은 관찰되지 않았다(참조: 도 12A-12B).
소량의 염료를 함유하는 매트릭스 B는 50 ㎕의 최종 조정 부피로 구성되고 우측 상처 부위에 직접 위치시키며, 이후 OpSite 드레싱으로 감쌌다. 4일후 동물을 희생시켰을 때, 상처 부위는 건조한 것으로 나타났고, 동물은 어려움없이 매트릭스 B를 견디는 것으로 관찰되었다. 육안 검사에서 상처 부위에서 심한 염증은 관찰되지 않았다. 매트릭스는 수술이후 주변 조직으로 분산되기 보다는 최초 상처 부위에 유지되었다. 희생 시점에서 상처 부위에서 유지된 매트릭스는 표면적이었고 수술 시점보다 양이 적었다(참조: 도 12A-12B).
2) 미리 적용된 외과 드레싱을 통하여 사전-혼합된 매트릭스 A와 사전-혼합되지 않은 매트릭스 B의 상처 부위로의 전달:
50 ㎕ 매트릭스 A(최종 조정 부피)는 소량의 염료와 혼합하고 OpSite 드레싱하에 좌측 상처 부위에 직접 주사하였다. 매트릭스는 상처 부위에 집중적으로 유지되었고 상처가 없는 주변 조직으로 분산되지 않았다. 주사기에서 기포로 인하여, 투약 부피(dosing volume)의 정확한 측정은 불가능하였다. 수술 4일후 동물의 희생 시점에, 상처 부위는 건조한 것으로 나타났고, 동물은 부작용없이 매트릭스 A를 견디는 것으로 관찰되었다. 매트릭스는 전달 시점에서 최초 위치, 다시 말하면, 상처가 없는 주변의 일부 조직을 비롯한 상처 부위의 상부에 그대로 유지되었다. 매트릭스는 수술이후 다른 주변 조직으로 분산되지 않았다; 하지만, 매트릭스는 표면적이었고 수술 시점보다 양이 적었다. 육안 검사에서 상처 부위에서 심한 염증은 관찰되지 않았다(참조: 도 13A-13B).
소량의 염료를 함유하는 100 ㎕ 최종 부피의 매트릭스 B는 주사기에 흡입하였다. 매트릭스의 다양한 구성요소(중합체, 가교링커, 염료)는 개별 구성요소를 분리하는 공기 주머니를 이용하여 주사기에 개별적으로 흡입하였다. 주사기에서 공기 주머니를 제거하는 배출 바늘은 드레싱을 통하여 상처 부위의 한 단부에 위치시키고, 매트릭스 B의 분리된 구성요소는 사전 혼합없이 OpSite 드레싱을 통하여 우측 상처 부위에 직접 주사하였다. 상기 방법은 매트릭스를 상처 부위로 성공적으로 주사하기 위하여 최소한의 압력을 요하였다. 매트릭스 B의 모든 구성요소가 상처 부위에 전달되면, 매트릭스는 시각적 배제와 접촉에 의해 신속하게 교질화되었고, 드레싱으로부터 누출되지 않았다. 매트릭스는 상처 부위에 집중적으로 유지되었고 주변 부위로 확산되지 않았다. 4일후 동물을 희생시켰을 때, 상처 부위는 건조한 것으로 나타났고, 동물은 별다른 부작용없이 매트릭스 B를 견디는 것으로 관찰되었다. 육안 검사에서 상처 부위에서 염증 또는 임의의 다른 부작용은 관찰되지 않았고, 매트릭스는 최초 상처 부위에 유지되었다. 매트릭스는 상처 부위의 표면에 집중되었고 최초 주사 시점보다 적은 양으로 존재하였다(참조: 도 13A-13B).
3) 다양한 게이지 바늘을 이용한 매트릭스 A와 B의 PVA 스펀지로의 전달:
매트릭스 A는 소량의 염료로 제조하고 22G 바늘을 통하여 1 ㏄ 주사기로 흡입하였다. 대략 200 ㎕의 매트릭스를 PVA 스펀지에 주사하고 수분동안 이동하지 않도록 하며, 이후 검사를 위하여 동물을 노출시켰다. 스펀지의 검사 직후에, 매트릭스는 집중적으로 나타났고, 주변 조직으로의 분산은 미미하였다.
매트릭스 B는 소량의 염료와 혼합하여 제조하고 22G 바늘을 통하여 1 ㏄ 주사기로 흡입하였다. 이후, 22G 바늘(1½ 인치)은 23G 바늘(1 인치)로 교체하였다. 대략 200 ㎕의 매트릭스를 PVA 스펀지에 주사하고 수분동안 이동하지 않도록 하며, 이후 검사를 위하여 동물을 노출시켰다. 스펀지의 검사 직후에, 매트릭스는 집중적으로 나타났고, 주변 조직으로의 분산은 미미하였다.
결론:
매트릭스 A와 매트릭스 B 모두 매우 신속하게 교질화되고 점성이며 두껍다. 이들 매트릭스를 피하와 PVA 스펀지에 주사할 수도 있긴 하지만, 가장 쉬운 전달 방법은 매트릭스의 다양한 구성요소를 개별적으로 주사기에 흡입하고, 이후 23G 바늘을 이용하여 감싸진 진피 상처 부위에 직접 주사하는 것이었다. 상기 방법에서, 좀더 작은 게이지 바늘은 상처 드레싱으로부터 과량의 공기 배출을 보조할 수 있다.
실시예 32
혈소판 유래된 성장 인자 B(PDGF-B)는 섬유아세포 증식 및 세포외 매트릭스의 합성을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 사이클로덱스트린과 콜라겐 매트릭스에서 PDGF-B 발현은 쥐 PVA 스펀지 모델에서 RT-PCR로 비교하였다.
동물 #200 ㎕ 전체 주사 부피/스펀지 Grp 스펀지 주사 내용물
6(N = 6 스펀지/군) 1:2:3:4:5:6: 콜라겐 단독 58 kD 사이클로덱스트린(CD)-아다만탄 매트릭스 단독콜라겐에서 2 x IO10 PN PGCB CD-아다만탄 매트릭스에서 2 x 1010 PN PGCBCD-아다만탄 매트릭스에서 50 ㎍ pCTK-PD(PDGFB를 인코딩하는 플라스미드 DNA) + L-PEI CD-아다만탄 매트릭스에서 50 ㎍ pCTK-PD + CD이미다졸
방법
6개의 작은 절개(0.5 ㎝)를 실시하고 폴리비닐 알코올(PVA, MPACT®) 스펀지를 수컷 Harlan Sprague-Dawley 쥐의 배면에 피하 이식하였다. 이식이후 4일 시점에, 검사 재료와 대조 재료는 vPBS 및 액체 콜라겐(Cohesion Technologieso) 또는 상기한 58 kD 사이클로덱스트린(CD)-아다만탄 매트릭스로 희석하고 PVA 스펀지에 주사하였다. 최종 콜라겐 제제는 콜라겐 제제는 1.8 ㎎/㎖인데, NaOH로 pH를 조정하고 vPBS로 분량을 맞추었다. 최종 58 kD 사이클로덱스트린(CD)-아다만탄 매트릭스 제제는 100 ㎎/㎖이었다. 200 ㎕ 최종 부피의 검사 반응물을 각 스펀지에 전달하였다. 주사이후 2일 시점에 동물을 희생시키고 스펀지를 옮겼다. 스펀지는 3 조각으로 절단하고, 대부분의 스펀지(~70-80%)는 액체 질소에 동결시키고 QPCR과 QRT-PCR 분석을 위하여 -80℃에 보관하였다. 스펀지의 일부분은 4℃에서 18시간동안 4% PFA에 고정시키고 파라핀 포매하며 분할하였다(5 ㎛). 절편은 Masson Trichrome 염색(세포 = 검은색, 혈관 = 적색, 콜라겐 = 파란색) 및 헤마톡실린-에오신 방법으로 염색하였다. 조직 절편은 2명의 독립된 연구원이 육안 조직(gross histology)을 현미경으로 분석하였다.
결과:
이식된 PVA 스펀지는 콜라겐, 사이클로덱스트린 매트릭스(CD), 콜라겐에서 2 x 1010 PN PGCB, CD에서 2 x 1010 PN PGCB, CD에서 50 ㎍의 pCTK-PD + L-PEI, 또는 CD에서 50 ㎍의 pCTK-PD + CD이미다졸로 처리하였다. 스펀지는 처리이후 48시간 시점에 옮기고 각각 QRT-PCR과 QPCR 방법으로 인간 PDGF-B RNA와 바이러스 DNA를 분석하였다. 각 스펀지의 일부분 역시 고정시키고 파라핀 포매하며 분할하고 형태학적 육안 검사를 위하여 Masson Trichrome으로 염색하였다.
인간 PDGF-B RNA 발현에 대한 QRT-PCR(정량적 RT-PCR) 분석에서, CD에서 2 x 1O10 PN PGCB로 처리된 스펀지는 7.0 x 108 MEQ의 PDGF-B/분석된 스펀지의 최대 평균 RNA 양을 보유한다는 것으로 밝혀졌다(도 14). 콜라겐에서 2 x 1O1O PN PGCB로 처리된 스펀지는 3.2 x 108 MEQ의 PDGF-B/분석된 스펀지로 유사한 수준의 PDGF-B RNA를 보였다. CD에서 50 ㎍의 pCTK-PD + L-PEI 및 CD에서 50 ㎍ pCTK-PD CD이미다졸로 처리된 스펀지는 각각 6.8 x 105와 9.1 x104 MEQ의 PDGF-B/분석된 스펀지의 PDGF-B RNA 수준을 보였다. 최종적으로, 콜라겐 또는 사이클로덱스트린으로 처리된 스펀지는 감지가능한 수준의 PDGF-B RNA를 보이지 않았다(도 14, 표 3). 스튜던트 t-검정 분석에서, 콜라겐에서 2 x 1010 PN PGCB와 CD에서 2 x 1010 PN PGCB 사이의 스펀지 비교를 제외하고 모든 스펀지 처리군이 통계학적으로 상이하였다(p ≤ 0.05)(표 4). 또한, GAPDH QRT-PCR 대조 분석을 실시하여 RNA 특성 및 샘플당 전체 RNA를 모니터하였다. 이의 결과는 모든 처리군에서 1.9 x 107 내지 6.9 x 107 MEQ의 GAPDH/분석된 스펀지 범위의 일정한 RNA 양을 보였다(도 15).
표 3
hPDGF-B RNA 감지에 대한 QRT-PCR 결과
군 수(n) 평균 Std.Dev Std,Err.
콜라겐 6 BQL ㆍ ㆍ
58 kD CD 5 BQL ㆍ ㆍ
콜라겐에서 2 x 1010 PN PGCB 6 3.2E+8 2.0E8 8.2E+7
CD에서 2 x 1010 PN PGCB 6 7.0E+8 4.1E+8 1.7E+8
CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + L-PEI 6 6.9E+5 2.9E+5 1.2E+5
CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + CD이미다졸 6 9.1E+4 1.7E+5 7.1E+4
BQL = 정량 수준 미만(< 2 x 103 MEQ의 PDGF-B/분석된 스펀지)
MEQ = 분자 당량(Molecular Equivalent)은 양성 대조의 희석율(dilution factor)에 기초한 임으로 부여된 번호이다.
표 4
처리군 사이의 hPDGF-B RNA의 통계학적 분석
처리군의 홀 비교(unpaired comparison) p-값
콜라겐에서 2 x 1010PN PGCB vs. CD에서 2 x 1010PN PGCB 0.0699
콜라겐에서 2 x 1010 PN PGCB vs. CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + L-PEI 0.0030
콜라겐에서 2 x 1010 PN PGCB vs. CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + CD이미다졸 0.0030
CD에서 2 x 1010 PN PGCB vs. CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + L-PEI 0.0020
CD에서 2 x 1010 PN PGCB vs. CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + CD이미다졸 0.0020
CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + L-PEI vs. CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + CD이미다졸 0.0014
주의: 콜라겐과 58 kD CD 처리군에 대한 통계학적 분석은 실시할 수 없었다.
인간 PDGF-B DNA에 대한 QPCR(정량적 PCR) 분석에서, CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + L-PEI와 CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + CD이미다졸로 처리된 스펀지는 각각 2.4 x 1O12와 1.7 x 1012 MEQ의 PDGF-B/분석된 스펀지의 최대 평균 수준을 보유한다는 것으로 밝혀졌다(도 16, 표 5). 콜라겐에서 2 x 1010PN PGCB와 CD에서 2 x 1010PN PGCB로 처리된 스펀지는 각각 4.5 x 1O10과 4.1 x 1010 MEQ의 PDGF-B/분석된 스펀지의 평균 인간 PDGF-B DNA 수준을 보였다. 하지만, 콜라겐 또는 사이클로덱스트린으로 처리된 스펀지 역시 각각 9.8 x 1O8과 1.3 x 108 MEQ의 PDGF-B/분석된 스펀지의 양성 PDGF-B DNA 수준을 보였다. 스튜던트 t-검정 분석에서, 콜라겐과 사이클로덱스트린 사이 및 콜라겐에서 2 x 1010 PN PGCB 처리군과 CD에서 2 x 1010 PN PGCB 처리군 사이의 스펀지 비교를 제외하고 모든 군이 통계학적으로 상이하였다(p ≤ 0.05)(표 6). 또한, DNA 특성 및 동등량의 DNA 입력을 담보하기 위하여 생쥐 GAPDH 정량을 실시하였는데, 이의 결과는 9.4 x 108 내지 2.8 x 109 MEQ의 GAPDH/분석된 스펀지 범위이었다(도 17).
표 5
스펀지 내에서 바이러스 PDGF-B 감지에 대한 PCR 결과
군 수(n) 평균 Std.Dev Std,Err.
콜라겐 6 9.8E+8 1.5E+9 6.1E+8
58 kD CD 5 1.3E+8 2.1E+8 9.2E+7
콜라겐에서 2 x 1010 PN PGCB 6 4.5E+10 3.9E+10 1.6E+10
CD에서 2 x 1010 PN PGCB 6 4.1E+10 2.3E+10 9.2E+9
CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + L-PEI 6 2.4E+12 1.1E+11 4.6E+10
CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + CD이미다졸 6 1.7E+12 4.1E+11 1.7E+11
표 6
스펀지 내에서 인간 PDGF-B DNA 함량의 통계학적 분석
처리군의 홀 비교(unpaired comparison) p-값
콜라겐 vs. 58 kD CD 0.2382
콜라겐 vs. 콜라겐에서 2 x 1010PN PGCB 0.0207
콜라겐 vs. CD에서 2 x 1010PN PGCB 0.0015
콜라겐 vs. CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + L-PEI < 0.0001
콜라겐 vs. CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + CD이미다졸 < 0.0001
58 kD CD vs. 콜라겐에서 2 x 1010PN PGCB 0.0321
58 kD CD vs. CD에서 2 x 1010PN PGCB 0.0030
58 kD CD vs. CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + L-PEI < 0.0001
58 kD CD vs. CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + CD이미다졸 < 0.0001
콜라겐에서 2 x 1010PN PGCB vs. CD에서 2 x 1010PN PGCB 0.8197
콜라겐에서 2 x 1010 PN PGCB vs. CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + L-PEI < 0.0001
콜라겐에서 2 x 1010 PN PGCB vs. CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + CD이미다졸 < 0.0001
CD에서 2 x 1010 PN PGCB vs. CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + L-PEI < 0.0001
CD에서 2 x 1010 PN PGCB vs. CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + CD이미다졸 < 0.0001
CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + L-PEI vs. CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + CD이미다졸 0.0018
QPCR 결과는 대조 스펀지에서 콜라겐과 사이클로덱스트린에서 감지된 유의한 수준의 PDGF-B DNA를 보여준다. 이런 관찰 결과의 주요 원인은 완전히 확인되지는 않았다: 하지만, 아데노바이러스에 포함된 헥손 서열만을 감지하는 헥손 QPCR 결과는 대조 스펀지에서 감지된 DNA가 PCTK-PD 플라스미드로부터 유래되었음을 지시하였다(도 18). PDGF-B RNA가 대조 스펀지에서 감지되지 않았기 때문에, 이는 스펀지 수거 시점이나 수거 이후에 오염이 발생하였음을 암시한다.
표 7
PVA 스펀지 형태 분석 결과의 요약
군 캡슐 크기 면역 반응 과립화 조직 콜라겐 침착 맥관 구조
콜라겐 얇음 최소 최소 최소 최소
58 kD CD 얇음 내지 중간 약함 내지 중간 최소 내지 약함 최소 약함 내지 중간
콜라겐에서 2 x 1010 PN PGCB 두꺼움 중간 최소 내지 약함 약함 중간 내지 강함
CD에서 2 x 1010 PN PGCB 매우 두꺼움 심함 최소 내지 약함 약함 중간
CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + L-PEI 얇음 내지 중간 약함 내지 중간 최소 내지 약함 최소 약함 내지 중간
CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + CD이미다졸 얇음 내지 중간 약함 내지 중간 최소 내지 약함 최소 약함 내지 중간
5 ㎛의 Masson Trichrome 염색된 파라핀 절편은 2명의 독립된 관찰자가 분석하였다. 스펀지 특성은 아래의 기준으로 정성적으로 평가하였다: 캡슐 크기를 제외하고 모든 기준에서 최소 < 약함 < 중간 < 강함 < 심함. 캡슐 크기의 평가에는 아래의 기준을 이용하였다: 얇음 < 중간 < 두꺼움 < 매우 두꺼움.
스펀지의 형태학적 분석을 실시하여 숙주 면역 반응을 평가하였다. 본 연구는 유전자 발현과 염증을 일차 종점(endpoint)하여 설계되었지만, 과립화 조직형성, 콜라겐 침착, 혈관신생작용(neo-vascularization) 역시 분석하였다. 수거 직후에, CD에서 2 x 1010 PN PGCB로 처리된 스펀지는 스펀지 내부 및 주변에 관찰가능하고 상승된 양의 삼출물을 보유하였다(표 7, 도 19). 이들 스펀지는 크기에서도 다른 군보다 훨씬 컸다. 조직학적 육안 평가에서, CD에서 2 x 1010 PN PGCB로 처리된 스펀지가 두꺼운 캡슐 및 세포 침윤물의 존재로 특성화되는 심한 면역 반응을 보이는 것으로 밝혀졌다. 과립화 조직, 콜라겐, 혈관신생작용도 관찰되었다. 콜라겐에서 2 x 1010 PN PGCB로 처리된 스펀지 역시 과립화 조직형성, 콜라겐 침착, 혈관신생작용을 보였다; 하지만, 면역 반응은 CD에서 2 x 1010 PN PGCB로 처리된 스펀지만큼 심하지 않았다. 사이클로덱스트린 단독, CD에서 50 ㎍ pCTK-PD + L-PEI, 또는 CD에서 50 ㎍ CTK-PD + CD이미다졸로 처리된 스펀지는 최소량의 과립화 조직으로 유사한 결과를 보였다. 이들 처리군에서 발견된 전반적인 면역 반응은 콜라겐에서 PGCB로 처리된 스펀지에서와 유사하였다. 최종적으로, 콜라겐 단독으로 처리된 스펀지는 최소의 면역 반응뿐만 아니라 최소량의 조직, 콜라겐 또는 맥관 구조를 보유하는 것으로 밝혀졌다.
본원에 언급된 모든 문헌과 간행물은 순전히 참고로 한다.
당업자는 통상적인 실험을 이용하여 본원에 기술된 특정 구체예의 다양한 등가물을 확인할 수 있다. 이런 등가물은 아래의 특허청구범위에 포섭된다.

Claims (30)

  1. 복수의 내포 호스트(inclusion host)를 보유하는 선형 생체적합성 중합체 및 연결 분자(linking molecule)를 함유하는 중합체 조성물에 있어서, 각 연결 분자는 내포 호스트와 내포 복합체를 형성하는 적어도 2가지 부분을 포함하고, 상기 연결 분자는 중합체를 가교결합시키는 것을 특징으로 하는 중합체 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 내포 호스트는 사이클로덱스트린 부분인 것을 특징으로 하는 중합체 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 적어도 한가지 생물학적 활성 화합물 또는 이의 프로드러그(prodrug) 형태를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 중합체 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 생물학적 활성 화합물은 핵산인 것을 특징으로 하는 중합체 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 핵산은 바이러스, 중합체, 리포솜에서 선택되는 전달 시스템에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 중합체 조성물.
  6. 세포를 핵산으로 트랜스펙션시키는 방법에 있어서, 상기 세포를 제 4 항에 따른 중합체 조성물과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 3 항에 있어서, 화합물은 폴리펩티드 또는 소형 유기 분자인 것을 특징으로 하는 중합체 조성물.
  8. 생물학적 활성 화합물을 환자에 투여하는 방법에 있어서, 상기 환자에 제 3 항에 따른 중합체 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 3 항에 있어서, 화합물은 단백질 또는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 중합체 조성물.
  10. 제 3 항에 있어서, 생물학적 활성 화합물 또는 이의 프로드러그 형태는 전달 시스템에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 중합체 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 전달 시스템은 미세입자(microparticle)와 리포솜에서 선택되는 것을 특징으로 하는 중합체 조성물.
  12. 제 3 항에 있어서, 생물학적 활성 화합물은 내포 호스트와 내포 복합체를 형성하는 부분에 공유 결합되는 것을 특징으로 하는 중합체 조성물.
  13. 제 1 항에 있어서, 적어도 한가지 어쥬번트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 중합체 조성물.
  14. 제 3 항에 있어서, 생물학적 활성 성분의 효능을 증가시키는 어쥬번트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 중합체 조성물.
  15. 복수의 내포 호스트를 보유하는 생체적합성 생체분해성 중합체 및 연결 분자를 함유하는 중합체 조성물에 있어서, 각 연결 분자는 내포 호스트와 내포 복합체를 형성하는 적어도 2가지 부분을 포함하고, 상기 연결 분자는 중합체를 가교결합시키는 것을 특징으로 하는 중합체 조성물.
  16. 복수의 내포 호스트를 보유하는 생체적합성 중합체 및 연결 분자를 함유하는 중합체 조성물에 있어서, 각 연결 분자는 내포 호스트와 내포 복합체를 형성하는 적어도 3가지 부분을 포함하고, 상기 연결 분자는 중합체를 가교결합시키는 것을 특징으로 하는 중합체 조성물.
  17. 복수의 사이클로덱스트린 부분을 보유하는 생체적합성 중합체 및 연결 분자를 함유하는 중합체 조성물에 있어서, 각 연결 분자는 사이클로덱스트린 부분과 내포 복합체를 형성하는 적어도 2가지 부분을 포함하고, 각 사이클로덱스트린 부분은 중합체 골격에 2개 이하의 결합을 보유하고, 상기 연결 분자는 중합체를 가교결합시키는 것을 특징으로 하는 중합체 조성물.
  18. 아래와 같이 구성되는 치료 조성물:
    a) 복수의 내포 호스트를 보유하는 생체적합성 중합체;
    b) 연결 분자, 각 연결 분자는 내포 호스트와 내포 복합체를 형성하는 적어도 2가지 부분을 포함하고;
    c) 치료제,
    여기서, 상기 연결 분자는 중합체를 가교결합시킨다.
  19. 가교결합된 중합체를 제조하는 방법에 있어서, 상기 방법은 내포 호스트를 보유하는 선형 생체적합성 중합체를 연결 분자와 혼합하는 단계로 구성되고, 각 연결 분자는 내포 호스트와 내포 복합체를 형성하는 적어도 2가지 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 내포 호스트는 사이클로덱스트린인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 중합체와 연결 분자는 생물학적 활성제의 존재하에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 생물학적 활성제는 내포 호스트와 내포 복합체를 형성하는 부분에 공유 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 가교결합된 중합체를 제조하는 방법에 있어서, 상기 방법은 내포 게스트(inclusion guset)를 보유하는 중합체를 연결 분자와 혼합하는 단계로 구성되고, 각 연결 분자는 내포 게스트와 내포 복합체를 형성하는 적어도 2가지 내포 호스트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 내포 호스트는 사이클로덱스트린인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 중합체와 연결 분자는 생물학적 활성제의 존재하에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 질환을 치료하는 방법에 있어서, 제 1 항에 따른 중합체 조성물과 공동으로 이런 질환을 치료하는데 적합한 치료제를 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 질환은 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 상처를 치료하는 방법에 있어서, 상처 부위에 제 1 항에 따른 중합체 조성물을 적용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 조성물은 치료제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 치료제는 PDGF-B를 인코딩하는 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100809046B1 (ko) * 2006-03-10 2008-03-03 가톨릭대학교 산학협력단 풀루란을 가진 나노자가응집체 및 이의 이용방법

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2497792C (en) * 2002-09-06 2014-08-05 Insert Therapeutics, Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery
BR0315198A (pt) 2002-10-09 2005-08-30 Insert Therapeutics Inc Materiais e composições à base de ciclodextrina e usos relacionados aos mesmos
SG129240A1 (en) * 2003-01-23 2007-02-26 Agency Science Tech & Res Biodegradable copolymer and nucleic acid delivery system
US7605120B2 (en) * 2003-10-22 2009-10-20 Amgen Inc. Antagonists of the brandykinin B1 receptor
CA2551826A1 (en) 2003-12-31 2005-07-21 Cydex, Inc. Inhalant formulation containing sulfoalkyl ether .gamma.-cyclodextrin and corticosteroid
US20070020299A1 (en) * 2003-12-31 2007-01-25 Pipkin James D Inhalant formulation containing sulfoalkyl ether cyclodextrin and corticosteroid
US20070020196A1 (en) * 2003-12-31 2007-01-25 Pipkin James D Inhalant formulation containing sulfoalkyl ether cyclodextrin and corticosteroid prepared from a unit dose suspension
US20070020298A1 (en) * 2003-12-31 2007-01-25 Pipkin James D Inhalant formulation containing sulfoalkyl ether gamma-cyclodextrin and corticosteroid
WO2005088655A1 (en) * 2004-03-12 2005-09-22 The Provost Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin A magnetoresistive medium
MXPA06015148A (es) * 2004-07-01 2007-08-21 Netherlands Cancer Inst Combinacion que comprende un inhibidor de bcrp y 4-(4-metilpiperazin-1-ilmetil)-n-[4-metil-3-(4-piridin-3-il) pirimidin-2-ilamino)fenil]-benzamida.
ES2381201T3 (es) 2005-03-31 2012-05-24 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibidores de la subunidad 2 de la ribonucleótido-reductasa y utilizaciones de los mismos
JPWO2006115211A1 (ja) * 2005-04-25 2008-12-18 株式会社カネカ シクロデキストリン含有ポリエステル系重合体及びその製造方法
US20070021380A1 (en) * 2005-07-22 2007-01-25 Leonard Wiebe Novel drug delivery compositions
US20070197486A1 (en) * 2005-12-20 2007-08-23 Verus Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for the delivery of corticosteroids
US20070160542A1 (en) * 2005-12-20 2007-07-12 Verus Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for the delivery of corticosteroids having an enhanced pharmacokinetic profile
US20070249572A1 (en) * 2005-12-20 2007-10-25 Verus Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for the delivery of corticosteroids
US20070178050A1 (en) * 2005-12-20 2007-08-02 Verus Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for the delivery of corticosteroids having an increased lung depositon
US20070185066A1 (en) * 2005-12-20 2007-08-09 Verus Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for the delivery of corticosteroids
JP2007211060A (ja) * 2006-02-07 2007-08-23 Japan Advanced Institute Of Science & Technology Hokuriku 超分子ポリマー及びその合成方法
EP1988880A2 (en) * 2006-02-15 2008-11-12 Tika Läkemedel AB Stable mixture of corticosteroids
US20080027212A1 (en) * 2006-06-28 2008-01-31 Skinner Keith K Methods and compositions for improved uptake of biological molecules
JP2010514679A (ja) * 2006-12-22 2010-05-06 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 制御放出組成物及び方法
US20080176958A1 (en) 2007-01-24 2008-07-24 Insert Therapeutics, Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery
WO2008112993A1 (en) 2007-03-15 2008-09-18 Ventana Medical Systems, Inc. Stabilized hematoxylin
KR20160033792A (ko) 2007-04-27 2016-03-28 사이덱스 파마슈티칼스, 인크. 클로피도그렐 및 설포알킬 에테르 사이클로덱스트린을 함유하는 제형 및 사용 방법
US20100226987A1 (en) * 2007-06-28 2010-09-09 Capsutech Ltd. Targeting conjugates comprising active agents encapsulated in cyclodextrin-containing polymers
ITMI20071321A1 (it) * 2007-07-04 2009-01-05 Sea Marconi Technologies Di Va Nanospugne a base di ciclodestrine come veicolo per farmaci antitumorali
WO2009123764A2 (en) 2008-04-04 2009-10-08 Calando Pharmaceuticals, Inc. Compositions and use of epas1 inhibitors
US10463677B2 (en) 2008-11-07 2019-11-05 Cydex Pharmaceuticals, Inc. Composition containing sulfoalkyl ether cyclodextrin and latanoprost
US8940690B2 (en) * 2009-01-28 2015-01-27 National Institutes Of Health (Nih) Synthetic conjugates and uses thereof
WO2010088282A1 (en) * 2009-01-30 2010-08-05 Rgo Biosciences Llc Nucleic acid binding assays
US9845237B2 (en) 2009-02-26 2017-12-19 The Regents Of The University Of California Supramolecular approach for preparation of size controllable nanoparticles
WO2010132711A1 (en) 2009-05-13 2010-11-18 Cydex Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising prasugrel and cyclodextrin derivatives and methods of making and using the same
EA022890B1 (ru) 2009-05-29 2016-03-31 Сидекс Фармасьютикалз, Инк. Инъецируемые композиции мелфалана, содержащие производное циклодекстрина, и способы их применения
US11020363B2 (en) 2009-05-29 2021-06-01 Cydex Pharmaceuticals, Inc. Injectable nitrogen mustard compositions comprising a cyclodextrin derivative and methods of making and using the same
US10045937B2 (en) * 2009-06-03 2018-08-14 Case Western Reserve University Therapeutic agent delivery system and method
WO2011034583A2 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Duke University Inhibition of endosomal toll-like receptor activation
SI2501413T1 (sl) 2009-11-18 2019-06-28 Nektar Therapeutics Oblike kislinskih soli konjugatov polimer-zdravilo
WO2011063421A1 (en) 2009-11-23 2011-05-26 Cerulean Pharma Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutic delivery
WO2011090940A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Cerulean Pharma Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutic delivery
JP5881254B2 (ja) * 2010-05-18 2016-03-09 セルリアン・ファーマ・インコーポレイテッド 自己免疫疾患およびその他の疾患の治療のための組成物および方法
US20120213854A1 (en) * 2010-09-30 2012-08-23 Fetzer Oliver S Methods of treating a subject and related particles, polymers and compositions
EP2635273B1 (en) 2010-11-01 2020-01-08 MEI Pharma, Inc. Isoflavonoid compositions and methods for the treatment of cancer
US10335491B2 (en) * 2011-07-21 2019-07-02 The Regents Of The University Of California Catalytic delivery nanosubstrates (CDNS) for highly efficient delivery of biomolecules
CN103289075B (zh) * 2012-02-22 2016-01-20 天津键凯科技有限公司 聚乙二醇与纳洛酮的结合物及其药物组合物和应用
FR2989001B1 (fr) * 2012-04-06 2017-07-21 Centre Nat Rech Scient Microparticules et nanoparticules constituees de polysaccharides hydrophobises et d'une alpha-cyclodextrine
US9598503B2 (en) 2012-04-18 2017-03-21 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
US9827321B2 (en) 2012-08-14 2017-11-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Stabilizing shear-thinning hydrogels
US20140094432A1 (en) 2012-10-02 2014-04-03 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
WO2014084743A1 (en) * 2012-11-28 2014-06-05 Callaghan Innovation Research Limited Dendritic core compounds
WO2014127357A1 (en) * 2013-02-15 2014-08-21 The Regents Of The University Of California Supramolecular magnetic nanoparticles
US9321927B2 (en) 2013-02-27 2016-04-26 Crayola Llc Enhanced washability inks and methods of making the same
DE102013021060A1 (de) * 2013-12-18 2015-06-18 Rathor Ag Verfahren zur Abtrennung von Monomeren aus isocyanathaltigen Prepolymeren
WO2016006413A1 (ja) * 2014-07-08 2016-01-14 国立大学法人大阪大学 自己修復性を有する高分子材料及びその製造方法
CA2950694C (en) 2014-07-09 2019-04-02 Halliburton Energy Services, Inc. Treatment fluids for reducing subterranean formation damage
AU2016215515B2 (en) 2015-02-02 2020-04-30 Mei Pharma, Inc. Combination therapies
MY189214A (en) 2015-06-19 2022-01-31 Univ Queensland Composition
CN105999289B (zh) * 2016-04-01 2018-11-20 南开大学 一种二元超两亲性纳米粒子溶液及其制备方法和应用
CN106349396A (zh) * 2016-08-26 2017-01-25 湖南尔康制药股份有限公司 一种具有超声敏感性的交联淀粉
CN112011040B (zh) * 2020-07-20 2021-08-17 广州医科大学 一种多重纳米传递系统及其制备方法
US20230285576A1 (en) 2020-08-05 2023-09-14 Ellipses Pharma Ltd Treatment of cancer using a cyclodextrin-containing polymer-topoisomerase inhibitor conjugate and a parp inhibitor
EP4297790A4 (en) * 2021-02-25 2025-01-01 Noble Panacea Labs Inc ORGANIC SUPRAMOLECULAR CONTAINER SET FOR CONTROLLED DRUG RELEASE

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1390479A (en) 1973-09-05 1975-04-16 I Orch Sinteza Akademii Nauk L Pharmaceutical composition for treatment of parkinsonism
DE2842862A1 (de) 1978-10-02 1980-04-10 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung von ionen, polaren und/oder lipophilen substanzen in fluessigkeiten
CH663951A5 (fr) * 1984-10-10 1988-01-29 Nestle Sa Procede d'enrichissement selectif en acides gras polyinsatures d'un melange contenant des acides gras fractions enrichies obtenues et compositions les contenant.
US4841081A (en) 1985-10-16 1989-06-20 Osaka Soda Co., Ltd. Method of optically resolving a racemate or a diastereomeric mixture of glycidyl compound
GB2197720A (en) 1986-11-20 1988-05-25 Nat Res Dev Immobilisation of polynucleotides
AU624077B2 (en) 1987-06-17 1992-06-04 Institute For Child Health Research Cloning of mite allergens
US4877778A (en) 1987-07-01 1989-10-31 The Children's Medical Center Corporation Method of enhancing lipophile transport using cyclodextrin derivatives
JP2614081B2 (ja) 1988-05-27 1997-05-28 大塚化学株式会社 光学活性β−ラクタム誘導体の製造法
US4887778A (en) 1988-06-01 1989-12-19 Universal Instruments Corporation Feeder drive assembly and replaceable section for tape supplying and cover peeling
HU200913B (en) 1988-07-28 1990-09-28 Ciklodextrin Kutato Fejlesztoe Process for producing infusion stock-solution containing pharmaceutically active components of bad water solubility
US5098793A (en) * 1988-09-29 1992-03-24 Uop Cyclodextrin films on solid substrates
US5139687A (en) 1990-05-09 1992-08-18 The Proctor & Gamble Company Non-destructive carriers for cyclodextrin complexes
JPH0425505A (ja) 1990-05-21 1992-01-29 Toppan Printing Co Ltd シクロデキストリンポリマー及びシクロデキストリン膜の製造方法
KR927003647A (ko) * 1990-11-30 1992-12-18 돕빵 인사쯔 가부시끼가이샤 시클로덱스트린유도체 및 시클로덱스트린 고정화 폴리머의 제조방법
JP2976154B2 (ja) * 1991-11-27 1999-11-10 コニカ株式会社 ハロゲン化銀写真感光材料用固形処理剤
HU210922B (en) 1993-05-24 1995-09-28 Europharmaceuticals Sa Nimesulide alkali salt cyclodextrin inclusion complexes their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5880154A (en) 1994-02-01 1999-03-09 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Polymeric adamantane analogues
HU218280B (en) 1994-04-26 2000-07-28 Cyclodextrin inclusion complexes containing sin-1a which are stable intheir solid state, process for their preparation and pharmaceutical compositions containing the comlexes
US5691316A (en) * 1994-06-01 1997-11-25 Hybridon, Inc. Cyclodextrin cellular delivery system for oligonucleotides
JP3699141B2 (ja) * 1994-09-24 2005-09-28 伸彦 由井 超分子構造の生体内分解性医薬高分子集合体及びその調製方法
US5728804A (en) 1995-06-02 1998-03-17 Research Corporation Technologies, Inc. Use of cyclodextrins for protein renaturation
US6667293B1 (en) 1995-09-12 2003-12-23 Hybridon, Inc. Use of cyclodextrins to modulate gene expression with reduced immunostimulatory response
US6630351B1 (en) 1999-06-07 2003-10-07 Mirus Corporation Compositions and methods for drug delivery using pH sensitive molecules
US5844030A (en) * 1996-07-09 1998-12-01 Andros; Nicholas Charged ion cleaning devices and cleaning system
DE19629494A1 (de) * 1996-07-09 1998-01-15 Schering Ag Pseudopolyrotaxane
AU743204B2 (en) 1997-04-23 2002-01-24 University Of Otago Controlled release of ophthalmic compositions
JPH11100401A (ja) 1997-07-30 1999-04-13 Kikkoman Corp 環状オリゴ糖及びそれを含むレトロウイルス性疾患の予防または治療剤
ES2279580T3 (es) 1997-09-15 2007-08-16 Genetic Immunity, Llc Composiciones para administrar genes a celulas de la piel que presentan antigenos.
IT1298732B1 (it) 1998-03-13 2000-02-02 Recordati Chem Pharm Composizioni farmaceutiche orali assumibili senza liquidi,contenenti complessi di inclusione
US6048736A (en) 1998-04-29 2000-04-11 Kosak; Kenneth M. Cyclodextrin polymers for carrying and releasing drugs
US6509323B1 (en) 1998-07-01 2003-01-21 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US7091192B1 (en) 1998-07-01 2006-08-15 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US6261583B1 (en) * 1998-07-28 2001-07-17 Atrix Laboratories, Inc. Moldable solid delivery system
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
EP1133318B1 (en) 1998-12-04 2007-03-14 California Institute of Technology Supramolecular complexes containing therapeutic agents
US7375096B1 (en) 1998-12-04 2008-05-20 California Institute Of Technology Method of preparing a supramolecular complex containing a therapeutic agent and a multi-dimensional polymer network
US6740643B2 (en) 1999-01-21 2004-05-25 Mirus Corporation Compositions and methods for drug delivery using amphiphile binding molecules
EP1102784A4 (en) 1999-06-07 2009-12-30 Mirus Bio Corp A CONNECTION WITH A LABILES DISULFIDE TIE
WO2001037665A1 (en) 1999-11-29 2001-05-31 Mirus Corporation Compositions and methods for drug delivery using amphiphile binding molecules
SK282717B6 (sk) 2000-03-10 2002-11-06 �Stav Experiment�Lnej Farmakol�Gie Sav Spôsob prípravy ultravysokomolekulových hyalurónanov
CA2417087A1 (en) 2000-08-01 2002-02-07 Oregon Health And Science University Mammalian dna binding membrane-associated protein-encoding gene and uses
TWI321054B (en) 2000-12-19 2010-03-01 California Inst Of Techn Compositions containing inclusion complexes
US7141540B2 (en) * 2001-11-30 2006-11-28 Genta Salus Llc Cyclodextrin grafted biocompatible amphilphilic polymer and methods of preparation and use thereof
CA2497792C (en) 2002-09-06 2014-08-05 Insert Therapeutics, Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery
BR0315198A (pt) 2002-10-09 2005-08-30 Insert Therapeutics Inc Materiais e composições à base de ciclodextrina e usos relacionados aos mesmos
US20080176958A1 (en) 2007-01-24 2008-07-24 Insert Therapeutics, Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100809046B1 (ko) * 2006-03-10 2008-03-03 가톨릭대학교 산학협력단 풀루란을 가진 나노자가응집체 및 이의 이용방법

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